分光蛍光光度計、分光蛍光光度計の測定方法および試料セル切替え装置
【課題】
自己吸収の影響が問題となる高濃度試料の透過方向への蛍光測定において、試料を希釈せずに、自己吸収の影響を低減可能な分光蛍光光度計を提供する。
【解決手段】
処理１にて反射方向への蛍光スペクトルを測定し、判定１にてピーク波長を検出する。ピーク波長があった場合、試料は蛍光を有するものとして、処理２にて処理１で得た反射方向への蛍光スペクトルから識別波長を算出する。次に、処理３にて光路長を変化させた際の透過スペクトルを測定し、判定２にて、透過方向への蛍光スペクトルを測定するために適した光路長を有したセルを判定する。最終的に、処理４にて、判定２で合格した光路長を有するセルにおける透過方向への蛍光スペクトルを測定することで解決する。
自己吸収の影響が問題となる高濃度試料の透過方向への蛍光測定において、試料を希釈せずに、自己吸収の影響を低減可能な分光蛍光光度計を提供する。
【解決手段】
処理１にて反射方向への蛍光スペクトルを測定し、判定１にてピーク波長を検出する。ピーク波長があった場合、試料は蛍光を有するものとして、処理２にて処理１で得た反射方向への蛍光スペクトルから識別波長を算出する。次に、処理３にて光路長を変化させた際の透過スペクトルを測定し、判定２にて、透過方向への蛍光スペクトルを測定するために適した光路長を有したセルを判定する。最終的に、処理４にて、判定２で合格した光路長を有するセルにおける透過方向への蛍光スペクトルを測定することで解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分光蛍光光度計に係り、特に溶液試料の透過方向への蛍光スペクトルの測定、更には試料セルの切替え装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
分光蛍光光度計は、光度計部、データ処理部、操作・処理部から構成される。光源からの連続光を励起側分光器で分光された励起光として測定試料に照射する。試料から放出された蛍光は、蛍光側分光器にて単色光に分光され、検知器にて光を検出した電気信号をアナログデジタル変換機を経てコンピュータに信号強度として取り込まれ、ディスプレイに測定結果が表示される。
【０００３】
測定試料に対し、固定波長の励起光を照射し、蛍光波長を変化させた際の波長毎の蛍光強度を測定する蛍光スペクトルは、固定波長に設定された励起側分光器からの励起光を測定試料に照射し、その時の蛍光を蛍光側分光器にて、測定開始波長から測定終了波長まで変化させ波長毎の蛍光の変化を検知器で検出した電気信号をアナログデジタル変換機を経てコンピュータに信号強度として取り込まれ、ディスプレイに測定結果が蛍光波長と蛍光強度の２次元のスペクトルが表示される。
【０００４】
ここで、蛍光は、励起光とは異なる波長として、励起波長より長波長側に出現するため、励起光に起因する透過光、反射光、散乱光は不要な光となる。そのため、例えば、非特許文献１にて示されるように、一般的な蛍光光度計の溶液試料測定においては、４面が透明のセルに試料を入れて、励起光に対して９０度の方向に検出光学系を設置して、励起光の透過光、反射光、散乱光を最小にする位置で側方への蛍光を検出する。この試料設置方法は、励起波長における吸光度０.５以下の低濃度領域の試料であれば、試料の濃度と蛍光強度の関係を得ることができる。
【０００５】
しかしながら、一般的な蛍光光度計は、試料セルの中央部から発光する蛍光を検出しているため、吸光度０.５以上の高濃度領域では、発光部分が試料セルの中央部よりも励起光照射表面近郊にて発光する内部遮へい効果が生じるため、試料の濃度と蛍光強度の関係には誤差が生まれる。
【０００６】
そこで、試料セルを励起光に対して傾けて設置することで、反射方向への蛍光を検出することがなされている。この反射方向への蛍光検出は、励起光を透過しない高濃度試料の測定に有用な方法である。しかしながら、励起光を透過する低濃度試料の測定の際は、励起光に起因する反射光と散乱光の影響は側方蛍光の検出位置に比べて大きいため、あまり用いられない。
【０００７】
一方、励起光をミラーなどの反射板で９０度方向に折り返し、反射板と検出光学系の間に試料セルを設置することで、透過方向への蛍光を測定することもなされている。この透過方向への蛍光検出は、励起光に起因する透過光と散乱光の影響は、側方蛍光の検出位置に比べて大きく、また、励起光を透過しない高濃度試料の測定の際は、透過方向への蛍光は、透過の過程で試料自身に吸収されるので蛍光スペクトル形状が試料濃度と吸収スペクトルによって変化するため、あまり用いられていない。
【０００８】
しかしながら、透過方向への蛍光は、試料が放射する蛍光の総量を把握する上で重要な測定データとなる。溶液試料の蛍光は、四方八方に放射状に現れるが、一般的な蛍光測定においては、４面が透明のセルにおいて、側方・反射・透過方向へのある法線方向のみの相対的な蛍光強度のスペクトル分布を測定されているためである。
【０００９】
同一測定系内であれば、相対的な蛍光強度や蛍光スペクトル形状の把握という目的だけであれば、ある法線方向のみの測定にて、試料間の比較は可能である。しかしながら、四方八方に放射状に現れる蛍光の総量を測定することは、この測定系では不可である。
【００１０】
この場合、試料の設置には積分球を用いる。積分球は、内面に高反射率の白色材料が塗布されており、試料からの光は拡散反射され四方八方に生じる光を均一化させて検出光学系へと導く効果がある。例えば特許文献１に記載されているように、粉末や基板といった固体試料の蛍光を測定する際に、積分球の出射ポートの位置に試料を設置して、固体試料特有の試料表面の凹凸の影響によって生じる蛍光の方向依存性を均一化して検出光学系へ導くことが出来る。
【００１１】
しかし、溶液試料の場合は、励起光を透過するため、透過方向への蛍光が生じるので、透過蛍光を正確に測定することが難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００８-７０１７２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】木下・御橋編「日本分光学会測定法シリーズ３ 蛍光測定-生物科学への応用」（.４５頁〜６３頁），学会出版センター（1983年1月20日初版発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前述したように、透過方向への蛍光スペクトル測定において、励起光を透過しない高濃度試料の測定の際は、透過方向への蛍光は、透過の過程で試料自身が吸収する自己吸収によって蛍光スペクトル形状が試料濃度と吸収スペクトルによって変化する。これを解決するためには、試料を希釈して自己吸収の影響の少ない濃度に調製する方法があるが、希釈の手間がかかること、希釈することで蛍光強度が減少し測定精度が低下すること、目的の濃度における蛍光スペクトルの評価ができない等の課題がある。
【００１５】
本発明は、自己吸収の影響が問題となる高濃度試料の透過方向への蛍光測定において、その目的とするところは試料の希釈をせずに、自己吸収の影響を低減可能な透過方向への蛍光スペクトルを得る分光蛍光光度計、およびその測定方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、透過方向における３次元蛍光スペクトルを網羅的に把握する測定方法、更には簡単な機構で試料セルの切替えが可能となる試料セル切替え装置等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の特徴は、試料設置部に積分球と光路長の異なる複数のセルを設置したセル切替え装置を搭載した分光蛍光光度計において、反射方向への蛍光スペクトルを測定する第１の処理と、第１の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータを基にピーク波長の検出をする第1の判定と、第1の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータからピークの波長に対して、任意の係数を掛け合わせた蛍光強度を有した蛍光ピークよりも短波長側の識別波長を算出する第２の処理と、セル切替え装置にて複数の光路長における透過スペクトルを測定する第３の処理と、第３の処理で得た透過スペクトルから、前記第２の処理で得た処理識別波長における透過率が該当する光路長のセルにて任意の値以上となるかどうかを判定する第２の判定と、判定２で合格した光路長を有するセルにおいて透過方向への蛍光スペクトルを測定する第４の処理を行う機構、更にはその操作の手順にある。
【００１８】
本発明の他の特徴は、光路長の異なる複数のセルにおける透過方向への蛍光スペクトルを測定して、X軸に蛍光波長、Y軸に光路長、Z軸に蛍光強度を表示する３次元蛍光スペクトルを測定すること、更には試料セルを切替えるための機構等にあるが、その詳細は以下に述べる発明の実施の形態で明らかにする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、自己吸収の影響が生じる高濃度試料の透過方向への蛍光測定において、試料の希釈をせずに、自己吸収の影響を低減した蛍光スペクトルの測定が可能となり、また、その為に好適な試料セル切替え装置等を簡単な機構で実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第１の実施例に係る分光蛍光光度計の構成図
【図２】図１のセル切替え装置の詳細を示す構成図
【図３】図１のセル切替え装置の他の例を示す構成図
【図４】本実施例に係る透過方向への蛍光スペクトル測定のフローチャート
【図５】本実施例に係る反射方向への蛍光スペクトルの構成を示す構成図
【図６】本実施例の反射方向への蛍光スペクトルの一例を示すグラフ
【図７】本実施例の透過スペクトルの一例を示すグラフ
【図８】本実施例の３次元透過スペクトルの一例を示すグラフ
【図９】本実施例の透過方向への蛍光スペクトルを測定した一例を示すグラフ
【図１０】本実施例の透過方向への蛍光スペクトルを測定した一例を示すグラフ
【図１１】本発明の第２の実施例に係る３次元蛍光スペクトルの一例を示すグラフ
【図１２】本実施例の３次元蛍光スペクトルを実施する際のフローチャート
【図１３】本発明の第３の実施例に係るペンタ配置試料セル切替え装置の構成図
【図１４】本実施例のベルト式試料セル切替え装置の構成図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について、図を参照して詳細に説明する。
【実施例１】
【００２２】
図１に本発明の第１の実施例に係る分光蛍光光度計の構成図を示す。
先ず分光蛍光光度計の基本構成部分について説明する。図１に示すように、分光蛍光光度計１００は、光度計部１１０、データ処理部１２０、操作・表示部１３０から構成される。更に、光度計部１１０は、励起側光学系１１１、試料室１１２、蛍光側光学系１１３及び駆動部１１４に大別される。ここで、矢印は光の受け渡しの流れを示し、実線は電気信号のつながりを示す。光源１から生じた連続光を励起側分光器２で励起光として分光し、ビームスプリッタ３を経て透過蛍光用試料セル１６内に入れた測定試料６に照射される。
【００２３】
この時、ビームスプリッタ３で一部の分光された励起光は、モニタ検知器４にて光量を測定し光源の変動の補正がなされている。試料から放出された蛍光は、蛍光側分光器７にて単色光に分光され、検知器８にて光を検出し、アナログデジタル変換器９を経てコンピュータ１０に信号強度として取り込まれ、表示ディスプレイ１３にて測定結果が表示される。
【００２４】
次に、波長駆動系について説明する。コンピュータ１０の指令によって、励起側パルスモータ１２が駆動することで、目的の波長位置に励起側分光器２がセットされる。また、蛍光側分光器７は、コンピュータ１０の指令によって蛍光側パルスモータ１１が駆動することで、目的の波長位置にセットされる。励起側分光器２や蛍光側分光器７については、回折格子やプリズムなどの光学素子が用いられており、励起側パルスモータ１２や蛍光側パルスモータ１１を動力とし、ギヤとカムによって、それらを回転運動させることでスペクトルスキャンされる。
【００２５】
このような基本構成において、本実施例の特徴は、透過蛍光を検出するための構成にある。透過蛍光用透過蛍光について、背面に生じる蛍光は背面方向に対してあらゆる方向に生じることから、試料室１１２に積分球１５を用いている。試料６は、背面に透過する蛍光を効率よく積分球に入射させるために、積分球１５の開口部よりも大きな面積を有する透過蛍光用試料セル１６に入れる。透過蛍光用試料セル１６は、円板上に光路長が異なる複数の試料セルが設置される試料セル切替え装置１８に設置している。
【００２６】
図２はセル切替え装置１８の構成を示した構成図であり、図２（Ａ）に正面図、図２（Ｂ）に側面図を示す。本実施例における試料セル切替え装置１８は、コンピュータ１０を通じて試料セル切替えパルスモータ１９によって、セル切替え装置を回転させることで、任意のセルを選択可能な機能を有する。
【００２７】
図２の試料セル切替え装置は、セル台５１から５６まで６つのセル設置台を有している。セル台の個数は試料室１１２の大きさによって決められる。今回はセル台を６つ搭載した例を示す。ここでは、予め透過蛍光用試料セル１６の光路長をコンピュータ１０に登録する。
【００２８】
透過蛍光用試料セル１６は、蛍光を効率よく積分球１５に入射させるために、積分球１５の開口部に密着する必要がある。そのため、試料セル切替え装置１８は、コンピュータ１０を通じて位置調整パルスモータ２０と位置調整タレット回転軸２１によって、セル切替え装置１８を移動し、透過蛍光用試料セル１６を積分球の開口部に密着する機能を有する。透過蛍光用試料セル１６を密着させるために調整する距離を距離L（mm）する。
【００２９】
また、セル切替え装置１８の図２に示す原点位置として距離O（mm）を予めコンピュータに登録する。この時、透過蛍光用試料セル１６の光路長をD（mm）とした場合、距離L（mm）は、原点位置の距離O（mm）から光路長D（mm）を差し引いた値となる。
【００３０】
例えば、積分球１５の開口部と原点位置の距離Oを２０mmとし、透過蛍光用試料セル１６の光路長Dを５mmとした場合、調整すべき距離Lは１５mmとなる。この距離Lを得ることで透過蛍光用試料セル１６への過剰の負荷からの破損を避けることができる。
【００３１】
また、透過蛍光用試料セル１６とセル切替え装置１８の距離が十分でない場合、セル切替え装置１８の回転により、積分球１５と透過蛍光用試料セル１６が物理的に接触し透過蛍光用試料セル１６の脱落や破損の恐れがあるので、セル切替え装置１８が回転する際には、一旦、セル切替え装置１８は原点位置に戻してから回転することとする。
【００３２】
図３は、励起光が入射する開口部に対して対の位置となる開口部にセル切替え装置１８を設置した際の構成図であり、図３（Ａ）に正面図、図３（Ｂ）に側面図を示す。反射方向への蛍光スペクトルを測定する際、セル切替え装置１８にて、試料６を入れた反射蛍光用試料セル１７とブランク溶媒を入れた反射蛍光用試料セル１７をそれぞれ設置し、任意に切り替えて測定するために用いる。
【００３３】
図４は、本実施例に係る透過方向への蛍光スペクトル測定におけるフローチャートである。蛍光は、ストークスの法則より励起波長よりも必ず長波長に出現する。このことは、蛍光波長よりも短い波長に試料の吸収波長が存在し、長波長側の透過スペクトルは夾雑物の影響が無い限り透過率１００%に近い結果が得られる。つまり、光路長を変化させて吸収が開始される波長を見出せば、それよりも長波長側における吸収の影響は無く、透過方向の蛍光スペクトルを正確に測定することにつながる。
【００３４】
これを実現するためのフローチャートが図４であり、それぞれの処理と判定内容は次の通りである。処理１は、反射方向への蛍光スペクトルの測定である。判定１は、処理１で得た反射方向への蛍光スペクトルからのピーク波長の検出である。ピーク波長があった場合、試料は蛍光を有するものとして、処理２へ進む。ピーク波長が無かった場合、試料は蛍光を有していないとして、シーケンスは終了する。処理２は処理１で得た反射方向への蛍光スペクトルから識別波長λｒｆを算出する処理である。
【００３５】
処理３は、光路長を変化させた際の透過スペクトルの測定である。判定２は、透過方向への蛍光スペクトルを測定するために適した光路長を有したセルの判定である。処理４は、判定２で合格した光路長を有するセルにおける透過方向への蛍光スペクトルの測定である。
【００３６】
以下、それぞれの処理と判定内容の詳細について、図面を用いて説明する。
先ず、処理１について詳細説明する。処理１は、反射方向への蛍光スペクトルの測定である。処理１においては、試料６の測定および試料６のブランク溶媒の測定を実施する。
図５は本実施例に係る反射方向への蛍光スペクトルの構成を示した構成図である。処理１の反射方向への蛍光スペクトルを測定する際には、試料室１１２に設置した積分球１５において、励起光が入射する開口部に対して対の位置となる開口部に、セル切替え装置１８に試料６もしくはブランク溶媒を入れた反射蛍光用試料セル１７を設置する。
【００３７】
図６は反射方向への蛍光スペクトルの一例を示したグラフである。縦軸は相対蛍光強度、横軸は波長(nm)で表される。
【００３８】
判定１について詳細説明をする。判定１は、処理１で得た反射方向への蛍光スペクトルからのピーク検出である。ここで、試料６の反射方向への蛍光スペクトルのピークトップの蛍光強度Frfとし、ブランク溶媒の同じ波長の蛍光強度Fbkgとした場合、蛍光強度Frfは、この蛍光強度Fbkgに対して、十分に大きい必要条件がある。一般的には、蛍光強度Fbkgの複数回測定の標準偏差σbkgに対して、試料６の蛍光強度が３倍以上得られている場合をピークとみなすとされている。理想的には１０倍以上の蛍光強度が得られていることが望ましい。
【００３９】
ここで、ピーク判定のための係数をkとすると、蛍光強度Fbkg×kよりも蛍光強度Frfが大きい波長をピーク波長とみなし、複数ある場合は、最も蛍光強度が大きい波長を反射方向への蛍光スペクトルのピークを蛍光波長波長λftとする。この蛍光波長λftが存在する場合、判定合格となり、次の処理２へと進む。一方、この蛍光波長λftが存在しない場合、試料からの蛍光は確認されないということなので判定は不合格となり、シーケンスは終了する。
【００４０】
処理２について説明する。判定１にて確認された反射方向への蛍光スペクトルのピーク蛍光波長λftにおける蛍光強度Frfに対して、感度係数となるαを掛け合わせたFrf×αとなる蛍光強度を有する蛍光波長を識別波長λｒｆとする。ここで、感度係数αは、１よりも小さい正数とする。識別波長λｒｆは、ピークトップの蛍光波長λftから短波長側にサーチし、蛍光スペクトルデータと最初にFrf×αの値が一致した波長とする。これは、測定を開始した短波長側からサーチしていくと、蛍光強度が微弱でノイズが大きいスペクトルの場合、蛍光が生じていない領域を識別波長λｒｆとして誤った結果を防ぐためである。
【００４１】
ピークトップの蛍光波長λftから短波長側にサーチすれば、上記のような誤認の影響が少なく高い精度で反射方向への蛍光スペクトルの立ち上がりの波長を認識することができる。感度係数αについては、反射方向への蛍光スペクトルの立ち上がりの波長を認識するという目的から、０.１〜０.０１程度の範囲で設定することが望ましい。例えば、感度係数α＝０.１とすると、ピークトップの蛍光強度Frfの０.１倍となる蛍光強度の波長が識別波長λｒｆが得られる。
【００４２】
処理３について説明する。処理３は、光路長の異なる複数のセルにて透過スペクトルを測定する処理である。透過スペクトルは、励起側分光器２と蛍光側分光器７を同一波長にてスキャンする同期スペクトルから得る。まず、セル切替え装置１８に試料６のブランク溶媒を入れたそれぞれの光路長のセルを設置し、波長毎の光量を透過率１００%としたベースラインをそれぞれの光路長のセルに対して装置に記憶させておく。セルは、例えば光路長は、５０mm程度の長光路セルも適用可能だが、一般的な光路長１０mm以下を用い、試料セル切替え装置１８を用いる場合には、６つのセルを設置可能であるから、０.５mm, １mm, ３mm, ５mm, ７mm, １０mm程度の間隔でセルの光路長を選択することが望ましい。次に、セル切替え装置に試料６を入れたそれぞれの光路長のセルを設置し、波長毎の光量をベースラインの光量で割り算することで、透過スペクトルを得る。
【００４３】
図７は、透過スペクトルの一例を示したグラフである。縦軸は透過率（%）、横軸は波長(nm)である。それぞれの光路長にて得たスペクトルは、(1)〜(6)として重ねて表示している。
【００４４】
判定２について説明をする。判定２は、透過方向への蛍光スペクトルを測定するために適した光路長γの判定である。光路長γは、処理２で得た識別波長λｒｆにおける透過率で決定される。この透過率を識別透過率βする。それぞれの光路長で得た透過スペクトルが判定対象となり、識別波長λｒｆにおける識別透過率がβ%以上となる場合、判定は合格となり、次の処理４へと進む。一方、識別透過率がβ%以下の場合、蛍光が生じる領域にて光が透過しないということであり、透過方向への蛍光が試料自身によって吸収される可能性があるので、判定は不合格となり、該当する光路長のセルにおけるシーケンスは終了する。この時の光路長γは透過方向の蛍光スペクトルを測定する際に適した光路長となる。例えば、図７であれば、(1)と(2)の光路長が該当する。識別透過率βは、百分率(%)で表され、０〜１００の数値とする。試料の吸収される割合を把握することから、βは、８０〜１００の数値であることが望ましい。
【００４５】
図８は、３次元透過スペクトルの一例を示したグラフである。３次元透過スペクトルは等高線図や鳥瞰図にて描く。ここで、得られた透過スペクトルは、透過率(%)、波長(nm)、光路長(mm)という３つの事象で得られており、３次元表示することが可能である。X軸に波長（nm）、Y軸に光路長(mm)、Z軸に透過率(%)を示す。ここで、図６は、X軸とY軸に対して、同一の透過率となる測定値をZ軸として等高線にて描画している。３次元表示することで、識別波長λrfと識別波長β%の交点から、最適な光路長γを得ることができ、その情報を視覚的にも捕らえることが可能である。この時、３次元表示の際、例えば０.５mm, １mm, ３mm, ５mm, ７mm, １０mm程度の間隔でセルの光路長を変化させた場合、それぞれの光路長間のデータを補間することで、実際に取得していない光路長の透過スペクトルを演算にて把握できる。このような点から、光路長を変化させた際の３次元透過スペクトルは、最適な光路長γを詳細に得るために有用である。
【００４６】
処理４について説明する。処理４は、判定２で合格した光路長γのセルにおける透過方向の蛍光スペクトルの測定である。
【００４７】
図９は、透過方向への蛍光スペクトルを測定した一例を示したグラフである。図７に示すように光路長γのセルを用いることでで、自己吸収の影響を受けずに透過方向の蛍光スペクトルを得ることが可能となる。なお、光路長γを極端に小さくすると、試料からの蛍光量が不足し、ノイズが大きいスペクトルとなることが懸念されるので、やみくもに光路長が小さいセルを用いれば良いという訳ではない。
【００４８】
図１０は、透過方向への蛍光スペクトルを測定した一例を示したグラフである。判定２で合格と不合格となった光路長のセルを用いた際の一例である。図１０に示すように、光路長がγよりも大きいセルを用いた場合、蛍光ピークの短波長側が自己吸収されるので、長波長側にシフトしたようなスペクトル形状となる。
【００４９】
以上のように、本実施例によれば、これらの処理と判定を実行することで、透過方向への蛍光スペクトルを測定する際に試料を希釈せずに測定することが可能となる。
【実施例２】
【００５０】
本発明の第２の実施例として、処理３と判定２の間に処理５を追加した例を示す。
処理５について説明する。処理５は、透過方向への蛍光スペクトルを試料セル切替え装置１８にてそれぞれ光路長を変化させて測定し、X軸に蛍光波長（nm）、Y軸に光路長(mm)、Z軸に蛍光強度(任意単位)を示す透過方向における３次元蛍光スペクトル測定である。
【００５１】
図１１は、光路長を変化させた際の３次元蛍光スペクトルの一例を示したグラフである。３次元蛍光スペクトルは等高線図や鳥瞰図にて描く。光路長毎にて蛍光強度が異なる場合には、ピークトップを規格化すると異なる強度においても比較しやすくなる。
【００５２】
図１２は、光路長を変化させた際の３次元蛍光スペクトルを実施する際のフローチャートである。処理３と判定２の間に処理５が追加されている。処理５の後に判定２を実行するが、この時、３次元蛍光スペクトル上における判定２にて導き出す光路長γmmに着目する。例えば、３次元蛍光スペクトルにおいて光路長γmm以下であれば識別波長λｒｆnmからスペクトルが立ち上がる一定間隔の等高線が得られる。一方、光路長γmmよりも光路長が大きくなるとスペクトルは短波長の蛍光が吸収されるので、識別波長λｒｆ nmよりも長波長にスペクトルの立ち上がりがシフトした等高線となる。
【００５３】
なお、光路長γ以下であれば該当する光路長を有するセルは複数存在することがあるが、これについては、透過方向への蛍光スペクトル測定においてスペクトル形状は変化しないので、測定上の問題は無い。また、光路長γmmを極端に小さくすると、試料からの蛍光量が不足し、ノイズが大きいスペクトルとなることがあるので、３次元蛍光スペクトルからそのノイズを評価し、更に最適な光路長を見出すこともできる。
【００５４】
この透過方向における３次元蛍光スペクトルは、識別波長λｒｆ nmおよび光路長γmmの妥当性の確認に対しても有用であり、光路長毎の蛍光スペクトルの変化を網羅的に把握することが可能となる。
【実施例３】
【００５５】
本発明の第３の実施例として、セル切替え装置１８の他の例を示す。
図１３は、ペンタ配置試料セル切替え装置２２の構成を示した構成図であり、図１３（Ａ）に正面図、図１３（Ｂ）に側面図を示す。積分球１５の開口部は、励起光入射口とその対極、および蛍光出射口とその対極として合計４箇所ある。このうち、励起光入射口は、透過スペクトル測定及び透過方向への蛍光スペクトル測定のための試料設置に用いる。また、励起光入射光の対極の開口部は反射方向への蛍光スペクトル測定のための試料設置に用いる。蛍光出射口については、蛍光を蛍光側分光器および検知器に導くため、常に空けた状態となっている。また、蛍光側出射口の対極の開口部は、本測定では使用しないので、酸化アルミニウムの白板などで覆われている。
【００５６】
ここで、ペンタ配置試料セル切替え装置２２の構成について説明する。ペンタ配置試料セル切替え装置２２は、積分球１５の底面に回転軸を有する。また、試料設置台は、セル台５１からセル台５５までの５つ搭載しており、積分球１５を内接円とする正五角形の各辺の中央に位置する。それぞれのセル台は積分球１５に透過蛍光用試料セル１６もしくは
反射蛍光用試料セル１７が密着する位置に設置されている。積分球１５の開口部は、積分球１５を内接円とする正方形の各辺の中央部に位置している。
【００５７】
励起光入射口に試料設置する際には、他の４つのセル台は、積分球１５の他の３つの開口部とは重複しない位置となり、測定の妨害とならない。同様に、励起光入射口の対極の開口部にセル台が移動した際にも、他の４つのセル台は、積分球１５の他の３つの開口部とは重複しない位置となり、測定の妨害とならない。ペンタ配置試料セル切替え装置２２は、セルを設置できる数は５つと限られるが、積分球１５の底面を回転軸としており、試料セルは定められた半径で回転するので、どんな光路長のセルを用いても積分球の開口部と試料セルを密着した状態で設置される利点がある。また、試料セル切替え装置１８で用いている位置調整パルスモータ２０および位置調整タレット回転軸２１が不要である利点もある。
【００５８】
図１４は、ベルト式試料セル切替え装置２３の構成を示した構成図である。ベルト式試料セル切替え装置２３は、試料セル切替えパルスモータ１９を動力として、例えばセル台５１から５７の７つの試料台が設置されたベルトが動く。励起光入射口に試料設置する場合には、図１４に記載の励起光入射の積分球開口部における原点１の位置まで例えばセル台５２をベルト式試料セル切替え装置２３が運び、次いで透過蛍光用試料セルローディング用パルスモータ２４を動力としてベルトが動き、セル台５２を励起光入射の積分球開口部に運ぶ。
【００５９】
同様に、励起光入射口の対極の開口部にセル台を運ぶ際には、反射蛍光用試料セルローディング用パルスモータ２５を動力としてベルトが動き、セル台５２を励起光入射口の対極の積分球開口部に運ぶ。このベルト式試料セル切替え装置２３は、部品点数は多いが、ベルトの長さを調節することでセル台の個数は増減させることができる特徴がある。
【符号の説明】
【００６０】
１・・・光源
２・・・励起側分光器
３・・・ビームスプリッタ
４・・・モニタ検知器
５・・・試料セル
６・・・測定試料
７・・・蛍光側分光器
８・・・検知器
９・・・Ａ／Ｄ変換器
１０・・・コンピュータ
１１・・・蛍光側パルスモータ
１２・・・励起側パルスモータ
１３・・・表示ディスプレイ
１４・・・操作パネル
１５・・・積分球
１６・・・透過蛍光用試料セル
１７・・・反射蛍光用試料セル
１８・・・タレット式試料セル切替え装置
１９・・・試料セル切替えパルスモータ
２０・・・位置調整パルスモータ
２１・・・位置調整タレット回転軸
２２・・・ペンタ配置試料セル切替え装置
２３・・・ベルト式試料セル切替え装置
２４・・・透過蛍光用試料セルローディング用パルスモータ
２５・・・反射蛍光用試料セルローディング用パルスモータ
５１〜５７・・・セル台
１００・・・分光蛍光光度計
１１０・・・光度計部
１１１・・・励起側光学系
１１２・・・試料室
１１３・・・蛍光側光学系
１１４・・・駆動部
１２０・・・データ処理部
１３０・・・操作・表示部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分光蛍光光度計に係り、特に溶液試料の透過方向への蛍光スペクトルの測定、更には試料セルの切替え装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
分光蛍光光度計は、光度計部、データ処理部、操作・処理部から構成される。光源からの連続光を励起側分光器で分光された励起光として測定試料に照射する。試料から放出された蛍光は、蛍光側分光器にて単色光に分光され、検知器にて光を検出した電気信号をアナログデジタル変換機を経てコンピュータに信号強度として取り込まれ、ディスプレイに測定結果が表示される。
【０００３】
測定試料に対し、固定波長の励起光を照射し、蛍光波長を変化させた際の波長毎の蛍光強度を測定する蛍光スペクトルは、固定波長に設定された励起側分光器からの励起光を測定試料に照射し、その時の蛍光を蛍光側分光器にて、測定開始波長から測定終了波長まで変化させ波長毎の蛍光の変化を検知器で検出した電気信号をアナログデジタル変換機を経てコンピュータに信号強度として取り込まれ、ディスプレイに測定結果が蛍光波長と蛍光強度の２次元のスペクトルが表示される。
【０００４】
ここで、蛍光は、励起光とは異なる波長として、励起波長より長波長側に出現するため、励起光に起因する透過光、反射光、散乱光は不要な光となる。そのため、例えば、非特許文献１にて示されるように、一般的な蛍光光度計の溶液試料測定においては、４面が透明のセルに試料を入れて、励起光に対して９０度の方向に検出光学系を設置して、励起光の透過光、反射光、散乱光を最小にする位置で側方への蛍光を検出する。この試料設置方法は、励起波長における吸光度０.５以下の低濃度領域の試料であれば、試料の濃度と蛍光強度の関係を得ることができる。
【０００５】
しかしながら、一般的な蛍光光度計は、試料セルの中央部から発光する蛍光を検出しているため、吸光度０.５以上の高濃度領域では、発光部分が試料セルの中央部よりも励起光照射表面近郊にて発光する内部遮へい効果が生じるため、試料の濃度と蛍光強度の関係には誤差が生まれる。
【０００６】
そこで、試料セルを励起光に対して傾けて設置することで、反射方向への蛍光を検出することがなされている。この反射方向への蛍光検出は、励起光を透過しない高濃度試料の測定に有用な方法である。しかしながら、励起光を透過する低濃度試料の測定の際は、励起光に起因する反射光と散乱光の影響は側方蛍光の検出位置に比べて大きいため、あまり用いられない。
【０００７】
一方、励起光をミラーなどの反射板で９０度方向に折り返し、反射板と検出光学系の間に試料セルを設置することで、透過方向への蛍光を測定することもなされている。この透過方向への蛍光検出は、励起光に起因する透過光と散乱光の影響は、側方蛍光の検出位置に比べて大きく、また、励起光を透過しない高濃度試料の測定の際は、透過方向への蛍光は、透過の過程で試料自身に吸収されるので蛍光スペクトル形状が試料濃度と吸収スペクトルによって変化するため、あまり用いられていない。
【０００８】
しかしながら、透過方向への蛍光は、試料が放射する蛍光の総量を把握する上で重要な測定データとなる。溶液試料の蛍光は、四方八方に放射状に現れるが、一般的な蛍光測定においては、４面が透明のセルにおいて、側方・反射・透過方向へのある法線方向のみの相対的な蛍光強度のスペクトル分布を測定されているためである。
【０００９】
同一測定系内であれば、相対的な蛍光強度や蛍光スペクトル形状の把握という目的だけであれば、ある法線方向のみの測定にて、試料間の比較は可能である。しかしながら、四方八方に放射状に現れる蛍光の総量を測定することは、この測定系では不可である。
【００１０】
この場合、試料の設置には積分球を用いる。積分球は、内面に高反射率の白色材料が塗布されており、試料からの光は拡散反射され四方八方に生じる光を均一化させて検出光学系へと導く効果がある。例えば特許文献１に記載されているように、粉末や基板といった固体試料の蛍光を測定する際に、積分球の出射ポートの位置に試料を設置して、固体試料特有の試料表面の凹凸の影響によって生じる蛍光の方向依存性を均一化して検出光学系へ導くことが出来る。
【００１１】
しかし、溶液試料の場合は、励起光を透過するため、透過方向への蛍光が生じるので、透過蛍光を正確に測定することが難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００８-７０１７２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】木下・御橋編「日本分光学会測定法シリーズ３ 蛍光測定-生物科学への応用」（.４５頁〜６３頁），学会出版センター（1983年1月20日初版発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前述したように、透過方向への蛍光スペクトル測定において、励起光を透過しない高濃度試料の測定の際は、透過方向への蛍光は、透過の過程で試料自身が吸収する自己吸収によって蛍光スペクトル形状が試料濃度と吸収スペクトルによって変化する。これを解決するためには、試料を希釈して自己吸収の影響の少ない濃度に調製する方法があるが、希釈の手間がかかること、希釈することで蛍光強度が減少し測定精度が低下すること、目的の濃度における蛍光スペクトルの評価ができない等の課題がある。
【００１５】
本発明は、自己吸収の影響が問題となる高濃度試料の透過方向への蛍光測定において、その目的とするところは試料の希釈をせずに、自己吸収の影響を低減可能な透過方向への蛍光スペクトルを得る分光蛍光光度計、およびその測定方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、透過方向における３次元蛍光スペクトルを網羅的に把握する測定方法、更には簡単な機構で試料セルの切替えが可能となる試料セル切替え装置等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の特徴は、試料設置部に積分球と光路長の異なる複数のセルを設置したセル切替え装置を搭載した分光蛍光光度計において、反射方向への蛍光スペクトルを測定する第１の処理と、第１の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータを基にピーク波長の検出をする第1の判定と、第1の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータからピークの波長に対して、任意の係数を掛け合わせた蛍光強度を有した蛍光ピークよりも短波長側の識別波長を算出する第２の処理と、セル切替え装置にて複数の光路長における透過スペクトルを測定する第３の処理と、第３の処理で得た透過スペクトルから、前記第２の処理で得た処理識別波長における透過率が該当する光路長のセルにて任意の値以上となるかどうかを判定する第２の判定と、判定２で合格した光路長を有するセルにおいて透過方向への蛍光スペクトルを測定する第４の処理を行う機構、更にはその操作の手順にある。
【００１８】
本発明の他の特徴は、光路長の異なる複数のセルにおける透過方向への蛍光スペクトルを測定して、X軸に蛍光波長、Y軸に光路長、Z軸に蛍光強度を表示する３次元蛍光スペクトルを測定すること、更には試料セルを切替えるための機構等にあるが、その詳細は以下に述べる発明の実施の形態で明らかにする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、自己吸収の影響が生じる高濃度試料の透過方向への蛍光測定において、試料の希釈をせずに、自己吸収の影響を低減した蛍光スペクトルの測定が可能となり、また、その為に好適な試料セル切替え装置等を簡単な機構で実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第１の実施例に係る分光蛍光光度計の構成図
【図２】図１のセル切替え装置の詳細を示す構成図
【図３】図１のセル切替え装置の他の例を示す構成図
【図４】本実施例に係る透過方向への蛍光スペクトル測定のフローチャート
【図５】本実施例に係る反射方向への蛍光スペクトルの構成を示す構成図
【図６】本実施例の反射方向への蛍光スペクトルの一例を示すグラフ
【図７】本実施例の透過スペクトルの一例を示すグラフ
【図８】本実施例の３次元透過スペクトルの一例を示すグラフ
【図９】本実施例の透過方向への蛍光スペクトルを測定した一例を示すグラフ
【図１０】本実施例の透過方向への蛍光スペクトルを測定した一例を示すグラフ
【図１１】本発明の第２の実施例に係る３次元蛍光スペクトルの一例を示すグラフ
【図１２】本実施例の３次元蛍光スペクトルを実施する際のフローチャート
【図１３】本発明の第３の実施例に係るペンタ配置試料セル切替え装置の構成図
【図１４】本実施例のベルト式試料セル切替え装置の構成図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について、図を参照して詳細に説明する。
【実施例１】
【００２２】
図１に本発明の第１の実施例に係る分光蛍光光度計の構成図を示す。
先ず分光蛍光光度計の基本構成部分について説明する。図１に示すように、分光蛍光光度計１００は、光度計部１１０、データ処理部１２０、操作・表示部１３０から構成される。更に、光度計部１１０は、励起側光学系１１１、試料室１１２、蛍光側光学系１１３及び駆動部１１４に大別される。ここで、矢印は光の受け渡しの流れを示し、実線は電気信号のつながりを示す。光源１から生じた連続光を励起側分光器２で励起光として分光し、ビームスプリッタ３を経て透過蛍光用試料セル１６内に入れた測定試料６に照射される。
【００２３】
この時、ビームスプリッタ３で一部の分光された励起光は、モニタ検知器４にて光量を測定し光源の変動の補正がなされている。試料から放出された蛍光は、蛍光側分光器７にて単色光に分光され、検知器８にて光を検出し、アナログデジタル変換器９を経てコンピュータ１０に信号強度として取り込まれ、表示ディスプレイ１３にて測定結果が表示される。
【００２４】
次に、波長駆動系について説明する。コンピュータ１０の指令によって、励起側パルスモータ１２が駆動することで、目的の波長位置に励起側分光器２がセットされる。また、蛍光側分光器７は、コンピュータ１０の指令によって蛍光側パルスモータ１１が駆動することで、目的の波長位置にセットされる。励起側分光器２や蛍光側分光器７については、回折格子やプリズムなどの光学素子が用いられており、励起側パルスモータ１２や蛍光側パルスモータ１１を動力とし、ギヤとカムによって、それらを回転運動させることでスペクトルスキャンされる。
【００２５】
このような基本構成において、本実施例の特徴は、透過蛍光を検出するための構成にある。透過蛍光用透過蛍光について、背面に生じる蛍光は背面方向に対してあらゆる方向に生じることから、試料室１１２に積分球１５を用いている。試料６は、背面に透過する蛍光を効率よく積分球に入射させるために、積分球１５の開口部よりも大きな面積を有する透過蛍光用試料セル１６に入れる。透過蛍光用試料セル１６は、円板上に光路長が異なる複数の試料セルが設置される試料セル切替え装置１８に設置している。
【００２６】
図２はセル切替え装置１８の構成を示した構成図であり、図２（Ａ）に正面図、図２（Ｂ）に側面図を示す。本実施例における試料セル切替え装置１８は、コンピュータ１０を通じて試料セル切替えパルスモータ１９によって、セル切替え装置を回転させることで、任意のセルを選択可能な機能を有する。
【００２７】
図２の試料セル切替え装置は、セル台５１から５６まで６つのセル設置台を有している。セル台の個数は試料室１１２の大きさによって決められる。今回はセル台を６つ搭載した例を示す。ここでは、予め透過蛍光用試料セル１６の光路長をコンピュータ１０に登録する。
【００２８】
透過蛍光用試料セル１６は、蛍光を効率よく積分球１５に入射させるために、積分球１５の開口部に密着する必要がある。そのため、試料セル切替え装置１８は、コンピュータ１０を通じて位置調整パルスモータ２０と位置調整タレット回転軸２１によって、セル切替え装置１８を移動し、透過蛍光用試料セル１６を積分球の開口部に密着する機能を有する。透過蛍光用試料セル１６を密着させるために調整する距離を距離L（mm）する。
【００２９】
また、セル切替え装置１８の図２に示す原点位置として距離O（mm）を予めコンピュータに登録する。この時、透過蛍光用試料セル１６の光路長をD（mm）とした場合、距離L（mm）は、原点位置の距離O（mm）から光路長D（mm）を差し引いた値となる。
【００３０】
例えば、積分球１５の開口部と原点位置の距離Oを２０mmとし、透過蛍光用試料セル１６の光路長Dを５mmとした場合、調整すべき距離Lは１５mmとなる。この距離Lを得ることで透過蛍光用試料セル１６への過剰の負荷からの破損を避けることができる。
【００３１】
また、透過蛍光用試料セル１６とセル切替え装置１８の距離が十分でない場合、セル切替え装置１８の回転により、積分球１５と透過蛍光用試料セル１６が物理的に接触し透過蛍光用試料セル１６の脱落や破損の恐れがあるので、セル切替え装置１８が回転する際には、一旦、セル切替え装置１８は原点位置に戻してから回転することとする。
【００３２】
図３は、励起光が入射する開口部に対して対の位置となる開口部にセル切替え装置１８を設置した際の構成図であり、図３（Ａ）に正面図、図３（Ｂ）に側面図を示す。反射方向への蛍光スペクトルを測定する際、セル切替え装置１８にて、試料６を入れた反射蛍光用試料セル１７とブランク溶媒を入れた反射蛍光用試料セル１７をそれぞれ設置し、任意に切り替えて測定するために用いる。
【００３３】
図４は、本実施例に係る透過方向への蛍光スペクトル測定におけるフローチャートである。蛍光は、ストークスの法則より励起波長よりも必ず長波長に出現する。このことは、蛍光波長よりも短い波長に試料の吸収波長が存在し、長波長側の透過スペクトルは夾雑物の影響が無い限り透過率１００%に近い結果が得られる。つまり、光路長を変化させて吸収が開始される波長を見出せば、それよりも長波長側における吸収の影響は無く、透過方向の蛍光スペクトルを正確に測定することにつながる。
【００３４】
これを実現するためのフローチャートが図４であり、それぞれの処理と判定内容は次の通りである。処理１は、反射方向への蛍光スペクトルの測定である。判定１は、処理１で得た反射方向への蛍光スペクトルからのピーク波長の検出である。ピーク波長があった場合、試料は蛍光を有するものとして、処理２へ進む。ピーク波長が無かった場合、試料は蛍光を有していないとして、シーケンスは終了する。処理２は処理１で得た反射方向への蛍光スペクトルから識別波長λｒｆを算出する処理である。
【００３５】
処理３は、光路長を変化させた際の透過スペクトルの測定である。判定２は、透過方向への蛍光スペクトルを測定するために適した光路長を有したセルの判定である。処理４は、判定２で合格した光路長を有するセルにおける透過方向への蛍光スペクトルの測定である。
【００３６】
以下、それぞれの処理と判定内容の詳細について、図面を用いて説明する。
先ず、処理１について詳細説明する。処理１は、反射方向への蛍光スペクトルの測定である。処理１においては、試料６の測定および試料６のブランク溶媒の測定を実施する。
図５は本実施例に係る反射方向への蛍光スペクトルの構成を示した構成図である。処理１の反射方向への蛍光スペクトルを測定する際には、試料室１１２に設置した積分球１５において、励起光が入射する開口部に対して対の位置となる開口部に、セル切替え装置１８に試料６もしくはブランク溶媒を入れた反射蛍光用試料セル１７を設置する。
【００３７】
図６は反射方向への蛍光スペクトルの一例を示したグラフである。縦軸は相対蛍光強度、横軸は波長(nm)で表される。
【００３８】
判定１について詳細説明をする。判定１は、処理１で得た反射方向への蛍光スペクトルからのピーク検出である。ここで、試料６の反射方向への蛍光スペクトルのピークトップの蛍光強度Frfとし、ブランク溶媒の同じ波長の蛍光強度Fbkgとした場合、蛍光強度Frfは、この蛍光強度Fbkgに対して、十分に大きい必要条件がある。一般的には、蛍光強度Fbkgの複数回測定の標準偏差σbkgに対して、試料６の蛍光強度が３倍以上得られている場合をピークとみなすとされている。理想的には１０倍以上の蛍光強度が得られていることが望ましい。
【００３９】
ここで、ピーク判定のための係数をkとすると、蛍光強度Fbkg×kよりも蛍光強度Frfが大きい波長をピーク波長とみなし、複数ある場合は、最も蛍光強度が大きい波長を反射方向への蛍光スペクトルのピークを蛍光波長波長λftとする。この蛍光波長λftが存在する場合、判定合格となり、次の処理２へと進む。一方、この蛍光波長λftが存在しない場合、試料からの蛍光は確認されないということなので判定は不合格となり、シーケンスは終了する。
【００４０】
処理２について説明する。判定１にて確認された反射方向への蛍光スペクトルのピーク蛍光波長λftにおける蛍光強度Frfに対して、感度係数となるαを掛け合わせたFrf×αとなる蛍光強度を有する蛍光波長を識別波長λｒｆとする。ここで、感度係数αは、１よりも小さい正数とする。識別波長λｒｆは、ピークトップの蛍光波長λftから短波長側にサーチし、蛍光スペクトルデータと最初にFrf×αの値が一致した波長とする。これは、測定を開始した短波長側からサーチしていくと、蛍光強度が微弱でノイズが大きいスペクトルの場合、蛍光が生じていない領域を識別波長λｒｆとして誤った結果を防ぐためである。
【００４１】
ピークトップの蛍光波長λftから短波長側にサーチすれば、上記のような誤認の影響が少なく高い精度で反射方向への蛍光スペクトルの立ち上がりの波長を認識することができる。感度係数αについては、反射方向への蛍光スペクトルの立ち上がりの波長を認識するという目的から、０.１〜０.０１程度の範囲で設定することが望ましい。例えば、感度係数α＝０.１とすると、ピークトップの蛍光強度Frfの０.１倍となる蛍光強度の波長が識別波長λｒｆが得られる。
【００４２】
処理３について説明する。処理３は、光路長の異なる複数のセルにて透過スペクトルを測定する処理である。透過スペクトルは、励起側分光器２と蛍光側分光器７を同一波長にてスキャンする同期スペクトルから得る。まず、セル切替え装置１８に試料６のブランク溶媒を入れたそれぞれの光路長のセルを設置し、波長毎の光量を透過率１００%としたベースラインをそれぞれの光路長のセルに対して装置に記憶させておく。セルは、例えば光路長は、５０mm程度の長光路セルも適用可能だが、一般的な光路長１０mm以下を用い、試料セル切替え装置１８を用いる場合には、６つのセルを設置可能であるから、０.５mm, １mm, ３mm, ５mm, ７mm, １０mm程度の間隔でセルの光路長を選択することが望ましい。次に、セル切替え装置に試料６を入れたそれぞれの光路長のセルを設置し、波長毎の光量をベースラインの光量で割り算することで、透過スペクトルを得る。
【００４３】
図７は、透過スペクトルの一例を示したグラフである。縦軸は透過率（%）、横軸は波長(nm)である。それぞれの光路長にて得たスペクトルは、(1)〜(6)として重ねて表示している。
【００４４】
判定２について説明をする。判定２は、透過方向への蛍光スペクトルを測定するために適した光路長γの判定である。光路長γは、処理２で得た識別波長λｒｆにおける透過率で決定される。この透過率を識別透過率βする。それぞれの光路長で得た透過スペクトルが判定対象となり、識別波長λｒｆにおける識別透過率がβ%以上となる場合、判定は合格となり、次の処理４へと進む。一方、識別透過率がβ%以下の場合、蛍光が生じる領域にて光が透過しないということであり、透過方向への蛍光が試料自身によって吸収される可能性があるので、判定は不合格となり、該当する光路長のセルにおけるシーケンスは終了する。この時の光路長γは透過方向の蛍光スペクトルを測定する際に適した光路長となる。例えば、図７であれば、(1)と(2)の光路長が該当する。識別透過率βは、百分率(%)で表され、０〜１００の数値とする。試料の吸収される割合を把握することから、βは、８０〜１００の数値であることが望ましい。
【００４５】
図８は、３次元透過スペクトルの一例を示したグラフである。３次元透過スペクトルは等高線図や鳥瞰図にて描く。ここで、得られた透過スペクトルは、透過率(%)、波長(nm)、光路長(mm)という３つの事象で得られており、３次元表示することが可能である。X軸に波長（nm）、Y軸に光路長(mm)、Z軸に透過率(%)を示す。ここで、図６は、X軸とY軸に対して、同一の透過率となる測定値をZ軸として等高線にて描画している。３次元表示することで、識別波長λrfと識別波長β%の交点から、最適な光路長γを得ることができ、その情報を視覚的にも捕らえることが可能である。この時、３次元表示の際、例えば０.５mm, １mm, ３mm, ５mm, ７mm, １０mm程度の間隔でセルの光路長を変化させた場合、それぞれの光路長間のデータを補間することで、実際に取得していない光路長の透過スペクトルを演算にて把握できる。このような点から、光路長を変化させた際の３次元透過スペクトルは、最適な光路長γを詳細に得るために有用である。
【００４６】
処理４について説明する。処理４は、判定２で合格した光路長γのセルにおける透過方向の蛍光スペクトルの測定である。
【００４７】
図９は、透過方向への蛍光スペクトルを測定した一例を示したグラフである。図７に示すように光路長γのセルを用いることでで、自己吸収の影響を受けずに透過方向の蛍光スペクトルを得ることが可能となる。なお、光路長γを極端に小さくすると、試料からの蛍光量が不足し、ノイズが大きいスペクトルとなることが懸念されるので、やみくもに光路長が小さいセルを用いれば良いという訳ではない。
【００４８】
図１０は、透過方向への蛍光スペクトルを測定した一例を示したグラフである。判定２で合格と不合格となった光路長のセルを用いた際の一例である。図１０に示すように、光路長がγよりも大きいセルを用いた場合、蛍光ピークの短波長側が自己吸収されるので、長波長側にシフトしたようなスペクトル形状となる。
【００４９】
以上のように、本実施例によれば、これらの処理と判定を実行することで、透過方向への蛍光スペクトルを測定する際に試料を希釈せずに測定することが可能となる。
【実施例２】
【００５０】
本発明の第２の実施例として、処理３と判定２の間に処理５を追加した例を示す。
処理５について説明する。処理５は、透過方向への蛍光スペクトルを試料セル切替え装置１８にてそれぞれ光路長を変化させて測定し、X軸に蛍光波長（nm）、Y軸に光路長(mm)、Z軸に蛍光強度(任意単位)を示す透過方向における３次元蛍光スペクトル測定である。
【００５１】
図１１は、光路長を変化させた際の３次元蛍光スペクトルの一例を示したグラフである。３次元蛍光スペクトルは等高線図や鳥瞰図にて描く。光路長毎にて蛍光強度が異なる場合には、ピークトップを規格化すると異なる強度においても比較しやすくなる。
【００５２】
図１２は、光路長を変化させた際の３次元蛍光スペクトルを実施する際のフローチャートである。処理３と判定２の間に処理５が追加されている。処理５の後に判定２を実行するが、この時、３次元蛍光スペクトル上における判定２にて導き出す光路長γmmに着目する。例えば、３次元蛍光スペクトルにおいて光路長γmm以下であれば識別波長λｒｆnmからスペクトルが立ち上がる一定間隔の等高線が得られる。一方、光路長γmmよりも光路長が大きくなるとスペクトルは短波長の蛍光が吸収されるので、識別波長λｒｆ nmよりも長波長にスペクトルの立ち上がりがシフトした等高線となる。
【００５３】
なお、光路長γ以下であれば該当する光路長を有するセルは複数存在することがあるが、これについては、透過方向への蛍光スペクトル測定においてスペクトル形状は変化しないので、測定上の問題は無い。また、光路長γmmを極端に小さくすると、試料からの蛍光量が不足し、ノイズが大きいスペクトルとなることがあるので、３次元蛍光スペクトルからそのノイズを評価し、更に最適な光路長を見出すこともできる。
【００５４】
この透過方向における３次元蛍光スペクトルは、識別波長λｒｆ nmおよび光路長γmmの妥当性の確認に対しても有用であり、光路長毎の蛍光スペクトルの変化を網羅的に把握することが可能となる。
【実施例３】
【００５５】
本発明の第３の実施例として、セル切替え装置１８の他の例を示す。
図１３は、ペンタ配置試料セル切替え装置２２の構成を示した構成図であり、図１３（Ａ）に正面図、図１３（Ｂ）に側面図を示す。積分球１５の開口部は、励起光入射口とその対極、および蛍光出射口とその対極として合計４箇所ある。このうち、励起光入射口は、透過スペクトル測定及び透過方向への蛍光スペクトル測定のための試料設置に用いる。また、励起光入射光の対極の開口部は反射方向への蛍光スペクトル測定のための試料設置に用いる。蛍光出射口については、蛍光を蛍光側分光器および検知器に導くため、常に空けた状態となっている。また、蛍光側出射口の対極の開口部は、本測定では使用しないので、酸化アルミニウムの白板などで覆われている。
【００５６】
ここで、ペンタ配置試料セル切替え装置２２の構成について説明する。ペンタ配置試料セル切替え装置２２は、積分球１５の底面に回転軸を有する。また、試料設置台は、セル台５１からセル台５５までの５つ搭載しており、積分球１５を内接円とする正五角形の各辺の中央に位置する。それぞれのセル台は積分球１５に透過蛍光用試料セル１６もしくは
反射蛍光用試料セル１７が密着する位置に設置されている。積分球１５の開口部は、積分球１５を内接円とする正方形の各辺の中央部に位置している。
【００５７】
励起光入射口に試料設置する際には、他の４つのセル台は、積分球１５の他の３つの開口部とは重複しない位置となり、測定の妨害とならない。同様に、励起光入射口の対極の開口部にセル台が移動した際にも、他の４つのセル台は、積分球１５の他の３つの開口部とは重複しない位置となり、測定の妨害とならない。ペンタ配置試料セル切替え装置２２は、セルを設置できる数は５つと限られるが、積分球１５の底面を回転軸としており、試料セルは定められた半径で回転するので、どんな光路長のセルを用いても積分球の開口部と試料セルを密着した状態で設置される利点がある。また、試料セル切替え装置１８で用いている位置調整パルスモータ２０および位置調整タレット回転軸２１が不要である利点もある。
【００５８】
図１４は、ベルト式試料セル切替え装置２３の構成を示した構成図である。ベルト式試料セル切替え装置２３は、試料セル切替えパルスモータ１９を動力として、例えばセル台５１から５７の７つの試料台が設置されたベルトが動く。励起光入射口に試料設置する場合には、図１４に記載の励起光入射の積分球開口部における原点１の位置まで例えばセル台５２をベルト式試料セル切替え装置２３が運び、次いで透過蛍光用試料セルローディング用パルスモータ２４を動力としてベルトが動き、セル台５２を励起光入射の積分球開口部に運ぶ。
【００５９】
同様に、励起光入射口の対極の開口部にセル台を運ぶ際には、反射蛍光用試料セルローディング用パルスモータ２５を動力としてベルトが動き、セル台５２を励起光入射口の対極の積分球開口部に運ぶ。このベルト式試料セル切替え装置２３は、部品点数は多いが、ベルトの長さを調節することでセル台の個数は増減させることができる特徴がある。
【符号の説明】
【００６０】
１・・・光源
２・・・励起側分光器
３・・・ビームスプリッタ
４・・・モニタ検知器
５・・・試料セル
６・・・測定試料
７・・・蛍光側分光器
８・・・検知器
９・・・Ａ／Ｄ変換器
１０・・・コンピュータ
１１・・・蛍光側パルスモータ
１２・・・励起側パルスモータ
１３・・・表示ディスプレイ
１４・・・操作パネル
１５・・・積分球
１６・・・透過蛍光用試料セル
１７・・・反射蛍光用試料セル
１８・・・タレット式試料セル切替え装置
１９・・・試料セル切替えパルスモータ
２０・・・位置調整パルスモータ
２１・・・位置調整タレット回転軸
２２・・・ペンタ配置試料セル切替え装置
２３・・・ベルト式試料セル切替え装置
２４・・・透過蛍光用試料セルローディング用パルスモータ
２５・・・反射蛍光用試料セルローディング用パルスモータ
５１〜５７・・・セル台
１００・・・分光蛍光光度計
１１０・・・光度計部
１１１・・・励起側光学系
１１２・・・試料室
１１３・・・蛍光側光学系
１１４・・・駆動部
１２０・・・データ処理部
１３０・・・操作・表示部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料設置部に積分球と光路長の異なる複数のセルを設置したセル切替え装置を搭載した分光蛍光光度計において、反射方向への蛍光スペクトルを測定する第１の処理と、第１の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータを基にピーク波長の検出をする第1の判定と、第1の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータからピークの波長に対して、任意の係数を掛け合わせた蛍光強度を有した蛍光ピークよりも短波長側の識別波長を算出する第２の処理と、セル切替え装置にて複数の光路長における透過スペクトルを測定する第３の処理と、第３の処理で得た透過スペクトルから、前記第２の処理で得た処理識別波長における透過率が該当する光路長のセルにて任意の値以上となるかどうかを判定する第２の判定と、判定２で合格した光路長を有するセルにおいて透過方向への蛍光スペクトルを測定する第４の処理を行うことを特徴とする分光蛍光光度計。
【請求項２】
反射方向への蛍光スペクトルを測定する第１の処理をして、第１の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータを基にピーク波長の検出をする第1の判定をし、第1の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータからピークの波長に対して、任意の係数を掛け合わせた蛍光強度を有した蛍光ピークよりも短波長側の識別波長を算出する第２の処理をし、セル切替え装置にて複数の光路長における透過スペクトルの測定する第３の処理をして、第３の処理で得た透過スペクトルから、前記第２の処理で得た処理識別波長における透過率が該当する光路長のセルにて任意の値以上となるかどうかを判定する第２の判定をし、判定２で合格した光路長を有するセルにおいて透過方向への蛍光スペクトルを測定する第４の処理を行うことを特徴とする分光蛍光光度計の測定方法。
【請求項３】
試料設置部に積分球と光路長の異なる複数のセルを設置したセル切替え装置を搭載した分光蛍光光度計において、試料セル切替え装置にて光路長の異なる複数のセルにおける透過方向への蛍光スペクトルを測定して、X軸に蛍光波長、Y軸に光路長、Z軸に蛍光強度を表示する透過方向における３次元蛍光スペクトルを測定することを特徴とする分光蛍光光度計の測定方法。
【請求項４】
円周上に配置された光路長の異なる複数の透過蛍光用試料セルおよび反射蛍光用試料セルを設置するセル台と、回転することでセル台を移動してセルを切り替える動力となる試料セル切替えパルスモータと、積分球の開口部と透過蛍光用試料セルおよび反射蛍光用試料セルを密着させるための動力となる位置調整パルスモータと、位置調整のための位置調整タレット回転軸と、これらを制御するコンピュータを搭載し、コンピュータに入力された原点位置情報と試料セルの光路長を差し引きすることで、積分球開口部に密着する距離を算出し、位置調整パルスモータと位置調整タレット回転軸によって積分球開口部に試料セルを密着することを特徴とする試料セル切り替え装置。
【請求項５】
積分球を内接円とする正五角形の各辺の中央に位置した透過蛍光用試料セルもしくは
反射蛍光用試料セルが積分球に密着して設置される５つのセル台と、セル台を回転するための動力となる試料セル切替えパルスモータと、これらを制御するコンピュータを搭載したことを特徴とする試料セル切替え装置。
【請求項６】
ベルト上に設置された複数のセル台と、ベルト移動の動力となる試料セル切替えパルスモータと、積分球の透過蛍光を測定する試料位置にセル台を移動させる動力となる透過蛍光用試料セルローディング用パルスモータと、積分球の反射蛍光を測定する試料位置にセル台を移動させる動力となる反射蛍光用試料セルローディング用パルスモータと、これらを制御するコンピュータを搭載したことを特徴とする試料セル切替え装置。
【請求項１】
試料設置部に積分球と光路長の異なる複数のセルを設置したセル切替え装置を搭載した分光蛍光光度計において、反射方向への蛍光スペクトルを測定する第１の処理と、第１の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータを基にピーク波長の検出をする第1の判定と、第1の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータからピークの波長に対して、任意の係数を掛け合わせた蛍光強度を有した蛍光ピークよりも短波長側の識別波長を算出する第２の処理と、セル切替え装置にて複数の光路長における透過スペクトルを測定する第３の処理と、第３の処理で得た透過スペクトルから、前記第２の処理で得た処理識別波長における透過率が該当する光路長のセルにて任意の値以上となるかどうかを判定する第２の判定と、判定２で合格した光路長を有するセルにおいて透過方向への蛍光スペクトルを測定する第４の処理を行うことを特徴とする分光蛍光光度計。
【請求項２】
反射方向への蛍光スペクトルを測定する第１の処理をして、第１の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータを基にピーク波長の検出をする第1の判定をし、第1の処理で得た反射方向への蛍光スペクトルデータからピークの波長に対して、任意の係数を掛け合わせた蛍光強度を有した蛍光ピークよりも短波長側の識別波長を算出する第２の処理をし、セル切替え装置にて複数の光路長における透過スペクトルの測定する第３の処理をして、第３の処理で得た透過スペクトルから、前記第２の処理で得た処理識別波長における透過率が該当する光路長のセルにて任意の値以上となるかどうかを判定する第２の判定をし、判定２で合格した光路長を有するセルにおいて透過方向への蛍光スペクトルを測定する第４の処理を行うことを特徴とする分光蛍光光度計の測定方法。
【請求項３】
試料設置部に積分球と光路長の異なる複数のセルを設置したセル切替え装置を搭載した分光蛍光光度計において、試料セル切替え装置にて光路長の異なる複数のセルにおける透過方向への蛍光スペクトルを測定して、X軸に蛍光波長、Y軸に光路長、Z軸に蛍光強度を表示する透過方向における３次元蛍光スペクトルを測定することを特徴とする分光蛍光光度計の測定方法。
【請求項４】
円周上に配置された光路長の異なる複数の透過蛍光用試料セルおよび反射蛍光用試料セルを設置するセル台と、回転することでセル台を移動してセルを切り替える動力となる試料セル切替えパルスモータと、積分球の開口部と透過蛍光用試料セルおよび反射蛍光用試料セルを密着させるための動力となる位置調整パルスモータと、位置調整のための位置調整タレット回転軸と、これらを制御するコンピュータを搭載し、コンピュータに入力された原点位置情報と試料セルの光路長を差し引きすることで、積分球開口部に密着する距離を算出し、位置調整パルスモータと位置調整タレット回転軸によって積分球開口部に試料セルを密着することを特徴とする試料セル切り替え装置。
【請求項５】
積分球を内接円とする正五角形の各辺の中央に位置した透過蛍光用試料セルもしくは
反射蛍光用試料セルが積分球に密着して設置される５つのセル台と、セル台を回転するための動力となる試料セル切替えパルスモータと、これらを制御するコンピュータを搭載したことを特徴とする試料セル切替え装置。
【請求項６】
ベルト上に設置された複数のセル台と、ベルト移動の動力となる試料セル切替えパルスモータと、積分球の透過蛍光を測定する試料位置にセル台を移動させる動力となる透過蛍光用試料セルローディング用パルスモータと、積分球の反射蛍光を測定する試料位置にセル台を移動させる動力となる反射蛍光用試料セルローディング用パルスモータと、これらを制御するコンピュータを搭載したことを特徴とする試料セル切替え装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−５８０４７（Ｐ２０１２−５８０４７Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２００５４７（Ｐ２０１０−２００５４７）
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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