分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼおよびその使用
【課題】 感度を向上させる、少ない細胞数または低い基質濃度を用いるためのＭＬｕｃ７の使用に関する。
【解決手段】 分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびに活性および使用に関する。
【解決手段】 分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびに活性および使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびに活性および使用、ならびに分泌型ルシフェラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼ
発光とは、可視スペクトル範囲内での光子の放出を指し、その放出は、励起エミッター分子による。蛍光とは対照的に、エネルギーは、より短い波長の放射線の形で外部からここに供給されることはない。
【０００３】
化学発光と生物発光の間は区別される。化学発光とは、励起分子を生じ、励起電子が基底状態に戻る時、その分子自体が発光を示す化学反応を指す。この反応が酵素によって触媒される場合には、これは生物発光と呼ばれる。反応に関与する酵素は、一般的に、ルシフェラーゼと呼ばれる。
【０００４】
発光性生物の概説は、Wilson & Hastings、1998に見出すことができる。
【０００５】
ルシフェラーゼはペルオキシダーゼ、またはモノオキシゲナーゼおよびジオキシゲナーゼである。光放出生成物についての出発物質である酵素基質は、ルシフェリンと呼ばれる。それらは種によって異なる。系の量子収率は、変換される基質分子１個あたり０．１〜０．９光子の間である。
【０００６】
ルシフェラーゼは、それらの起源またはそれらの酵素的特性に基づいて分類することができる。同様に、ルシフェラーゼは、それらの基質特異性によってお互い区別することができる。最も重要な基質としては、セレンテラジンおよびルシフェリン、ならびにその２つの物質の誘導体も挙げられる。
【０００７】
ルシフェラーゼ基質
いくつかのルシフェラーゼ基質の構造は、例として下に示されている：
【０００８】
【化１】
【０００９】
【化２】
【００１０】
分泌型ルシフェラーゼ
宿主生物によってサイトゾルから周囲培地へ組換え型または野生型タンパク質の形で放出されるルシフェラーゼは、分泌型ルシフェラーゼと呼ばれる。表１は分泌性ルシフェラーゼの概要を示す：
【００１１】
【表１】
【００１２】
同様に、分泌型Ｌｕ１６４ルシフェラーゼは、Markovaら、2004に記載されている。
【００１３】
レポーター系
レポーター遺伝子または指標遺伝子は、一般的に、遺伝子産物が簡単な生化学的または組織化学的方法を用いて容易に検出することができる遺伝子を指す。レポーター遺伝子の少なくとも２つの型が区別される。
１．耐性遺伝子。耐性遺伝子とは、抗生物質を始めとする物質に対する耐性を発現によって細胞に与える遺伝子を指し、それらの物質は増殖培地に存在すると、耐性遺伝子を欠く場合には、細胞死を引き起こすものである。
２．レポーター遺伝子。レポーター遺伝子の産物は、融合型または非融合型指標として遺伝子操作に用いられる。最もよく用いられるレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ（Alamら、1990）、アルカリホスファターゼ（Yangら、1997；Cullenら、1992）、ルシフェラーゼ、および他の発光タンパク質（Shinomura、1985；Phillips GN、1997；Snowdowneら、1984）が挙げられる。
【００１４】
発光とは、可視スペクトル範囲内での光子の放出を指し、その放出は、励起エミッター分子による。蛍光とは対照的に、エネルギーは、より短い波長の放射線の形で外部からここに供給されることはない。
【００１５】
化学発光と生物発光の間は区別される。化学発光とは、励起分子を生じ、励起電子が基底状態に戻る時、その分子自体が発光を示す、化学反応を指す。この反応が酵素によって触媒される場合には、これは生物発光と呼ばれる。反応に関与する酵素は、一般的に、ルシフェラーゼと呼ばれる。
【００１６】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼ
驚くべきことに、メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）から新しいルシフェラーゼをスクリーニングしたとき、その生化学的および物理化学的特性が以前に同定されたルシフェラーゼとは明らかに異なる新しいルシフェラーゼ（以下、ＭＬｕｃ７と呼ぶ）を同定およびクローン化した。これらの特性は下に記載されている。
【００１７】
動態（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼが発現したとき、驚くべきことに、それは、生物発光反応の時間分解能（動態）が改変されることが見出された。動態の違いは、試験した基質について基質非依存性であり、図８および図９に示されている。図１０は、ＭＬｕｃ７およびＬｕ１６４についての生物発光反応の経過を示す。ＭＬｕｃ７の実質的により速い動態は明らかに目に見える。ＭＬｕｃ７は、Ｌｕ１６４と比較して、数秒後でも、１秒あたりに測定されうる発光の減少を示す。６０秒後、３００秒間の積分シグナルの７０〜８０％がすでに記録されている。Ｌｕ１６４は、１秒あたりの生物発光シグナルの実質的により遅い減少を示し、結果として、３００秒後でもバックグラウンドに対して測定可能である明瞭なシグナルを生じる。それゆえに、ＭＬｕｃ７は、以前に記載されたメトリディア・ロンガの分泌型ルシフェラーゼとは動態学的に異なる。驚くべきことに、この特性によって、動態学的区別が可能であるので、ＭＬｕｃ７を他のセレンテラジン依存性またはセレンテラジン非依存性ルシフェラーゼと組み合わせて利用することができる。
【００１８】
活性
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼが発現したとき、驚くべきことに、それは、動態学的特性の変化によって生物発光反応の活性分布が変化することが見出された。生物発光反応の開始時点において、１秒あたりに測定されうるＭＬｕｃ７活性は、Ｌｕ１６４のそれより明らかに高い。このより高い生物発光によって、より少数の細胞、ＭＬｕｃ７発現のより低い活性化、またはより低い基質濃度で、バックグラウンドシグナルより明らかに上の測定値が可能となるので、用いられる測定方法のより高い感度が可能となる。
【００１９】
本発明は、感度を向上させる、少ない細胞数または低い基質濃度を用いるためのＭＬｕｃ７の使用に関する。
【００２０】
動態学的評価
ＭＬｕｃ７の動態学的特性の変化によって、生物発光の差別化された動態学的評価が可能となる。（例えば）３００秒間に渡る連続測定に関して、様々な間隔を評価に用いることができる。図１３は、各場合１０秒間の間隔についての生物発光シグナル合計を示す。ＭＬｕｃ７は、最初の６０秒以内に（正確な時間は、用いられるルシフェラーゼおよび基質の量に依存する）Ｌｕ１６４より明らかに高い生物発光を示す。この期間後、ＭＬｕｃ７の生物発光は、Ｌｕ１６４のそれより速く減少し、結果として、Ｌｕ１６４はより高い生物発光シグナルを生じることになる。それゆえに、測定ウィンドウを選択することによってルシフェラーゼ間を区別することが可能である。図１４は、選択された実験条件下での３００秒間の時間についてのＭＬｕｃ７およびＬｕ１６４ルシフェラーゼの生物発光合計を示す。
【００２１】
図１５は、各場合６０秒間の間隔についての生物発光シグナル合計を示す。ここでもまた、ルシフェラーゼは、測定ウィンドウを選択することによって区別することができる。それゆえに、測定間隔の長さおよび選択が特定の実験条件に適応することができ、柔軟な形で用いることができる。示されたデータによって、総測定時間もまた、柔軟な形で選択することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開０２４２４７０号パンフレット
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem. 1990 Aug 1; 188 (2): 245-54
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、ＭＬｕｃ７の生物発光活性の測定値の動態学的評価に関する。
【００２５】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２の生物発光活性の測定値の動態学的評価に関する。
【００２６】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼの生物発光活性の測定値の動態学的評価に関する。
【００２７】
本発明は、本発明によるタンパク質の生物発光活性の測定値の動態学的評価に関する。
【００２８】
多重化
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼが発現したとき、驚くべきことに、それは、その特性の変化に起因して、多重反応に特に適していることが見出された。ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、他のルシフェラーゼと比較して明らかにより速い動態を示し、それによって、他の発光性または非発光性測定方法（読み出し）との組合せが可能となる。
【００２９】
発光性測定方法を組み合わせるために、発光系は、お互い阻害してはならず、または特定のシグナルより多い光を放射してはならない。（例えば、基質を加えることにより）第１の系を活性化した後、発光は、第２の反応を開始できるようになる前に、出発レベルに戻っていなければならない。これはまた、両方の系が非依存的な基質を用いる場合にも必要である。Ｍｌｕｃ７は、その速い動態によって、測定間の時間を著しく短縮する。反応の不活性化は必要でない。ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは分泌型ルシフェラーゼであるので、それを（例えば、ホタルルシフェラーゼなどの）細胞内の系と組み合わせてもよい。
【００３０】
他のメトリディア・ロンガのルシフェラーゼもまた、ホタルルシフェラーゼなどの細胞内の系と組み合わせることができる。しかしながら、これは、残存する生物発光を低レベルまで低下させるために不活性化段階を必要とする。
【００３１】
本発明は、ＭＬｕｃ７と１つまたは複数のレポーター遺伝子または測定技術（読み取り）との組合せが用いられる多重反応混合物におけるＭＬｕｃ７の使用に関する。本発明はまた、複数の標的遺伝子を測定するための反応混合物におけるＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００３２】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２と１つまたは複数のレポーター遺伝子または測定技術（読み取り）との組合せが用いられる多重反応混合物におけるＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２の使用に関する。本発明はまた、複数の標的遺伝子を測定するための反応混合物におけるＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２の使用に関する。
【００３３】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼと１つまたは複数のレポーター遺伝子または測定技術（読み取り）との組合せが用いられる多重反応混合物における分泌型ルシフェラーゼの使用に関する。本発明はまた、複数の標的遺伝子を測定するための反応混合物における分泌型ルシフェラーゼの使用に関する。
【００３４】
本発明は、本発明によるタンパク質と１つまたは複数のレポーター遺伝子または測定技術（読み取り）との組合せが用いられる多重反応混合物における本発明によるタンパク質の使用に関する。本発明はまた、複数の標的遺伝子を測定するための反応混合物における本発明によるタンパク質の使用に関する。
【００３５】
基質特異性
ＭＬｕｃ７基質特異性を、標準条件下で様々なセレンテラジンをアッセイすることによって試験した。この試験では、ＣＨＯ細胞のＬｕ１６４、Ｌｕ２２、およびＭＬｕｃ７ルシフェラーゼでの一過性トランスフェクションからの上清を用いた。選択された条件下で、基質セレンテラジンｎおよびセレンテラジンｃｂは、Ｌｕ１６４によるよりＭＬｕｃ７による変換の方が乏しくなり、基質セレンテラジンｆはＬｕ１６４によるよりＭｌｕｃによる方が良く変換される。結果は、反応を最適化することができること、または基質および反応条件に基づいてルシフェラーゼを用いることができることを一例として実証している。ホタルルシフェリンおよびウミホタルルシフェリンの基質がすべての３つのルシフェラーゼによって基質として用いられることは、選択された反応条件下で、たとえあったとしてもほんのわずかな程度にすぎない。
【００３６】
本発明は、ＭＬｕｃ７による生物発光を生じるための異なる基質の使用および組合せに関する。
【００３７】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２による生物発光を生じるための異なる基質の使用および組合せに関する。
【００３８】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼによる生物発光を生じるための異なる基質の使用および組合せに関する。
【００３９】
本発明は、本発明によるタンパク質による生物発光を生じるための異なる基質の使用および組合せに関する。
【００４０】
温度依存性
ＭＬｕｃ７反応の温度依存性を、１０℃から５０℃の間の温度で生物発光反応を測定することによって試験した。この試験では、ＣＨＯ細胞のＭＬｕｃ７での一過性トランスフェクションからの上清を用いた。結果は、ＭＬｕｃ７生物発光反応が反応温度の関数であることを示す。この依存性は、レポーター遺伝子適用において反応を最適化して適応させるためにも、様々な生物発光系を区別して組み合わせるためにも用いることができる。
【００４１】
本発明は、ＭＬｕｃ７に関する測定方法を開発して最適化するための温度依存性の使用および組合せに関する。
【００４２】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２に関する測定方法を開発して最適化するための温度依存性の使用および組合せに関する。
【００４３】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼに関する測定方法を開発して最適化するための温度依存性の使用および組合せに関する。
【００４４】
本発明は、本発明によるタンパク質に関する測定方法を開発して最適化するための温度依存性の使用および組合せに関する。
【００４５】
イオン濃度の関数としての生物発光反応
イオン濃度の関数としてのＭＬｕｃ７反応を、１ｍＭから４００ｍＭの間のＫＣｌ濃度で生物発光反応を測定することによって試験した。この試験では、ＣＨＯ細胞のＭＬｕｃ７での一過性トランスフェクションからの上清を用いた。結果は、ＭＬｕｃ７生物発光反応が反応媒質におけるイオン濃度の関数であることを示す。この依存性は、レポーター遺伝子適用において反応を最適化して適応させるためにも、様々な生物発光系を区別して組み合わせるためにも用いることができる。
【００４６】
本発明は、ＭＬｕｃ７に関する測定方法を開発し、最適化し、用いるための生物発光反応のイオン依存性の使用および組合せに関する。
【００４７】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２に関する測定方法を開発し、最適化し、用いるための生物発光反応のイオン依存性の使用および組合せに関する。
【００４８】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼに関する測定方法を開発し、最適化し、用いるための生物発光反応のイオン依存性の使用および組合せに関する。
【００４９】
本発明は、本発明によるタンパク質に関する測定方法を開発し、最適化し、用いるための生物発光反応のイオン依存性の使用および組合せに関する。
【００５０】
ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの同定
メトリディア・ロンガ種の生物発光活性を研究するために、標本を白海（Ｗｈｉｔｅ Ｓｅａ）（生物学的基地カレリヤ（Ｋａｒｔｅｓｈ）、ロシア）で採取し、液体窒素中に保存した。他の動物種または植物種による混入を防ぐために、メトリディア・ロンガの発生段階Ｖの２００個の標本を同定し、上記のように保存した。「ノープリウス（Ｎａｕｐｉｌｕｓ）」形態および成体形態の他に、メトリディア・ロンガのさらに５つの発生形態が記載されており、増加する発生段階におけるＣＩからＣＶまでの形態がその命名によって記載されている。選択および同定を、双眼顕微鏡およびホールピペットを用いて行った。標本は、生物学的調査基地「カレリヤ」（ロシア）の領域の白海で採取した。
【００５１】
メトリディア・ロンガ個体は、とりわけそれらの発生段階によって異なる深度で見出すことができる。この依存性は図１９にプロットされている。
【００５２】
季節、塩類含有量、温度、および食糧供給（組成および多様性）による変動に加えて、他の因子もまた、メトリディア・ロンガの生息地に影響する。これらの因子が生物発光性タンパク質の代謝過程または発現に影響するかどうかは現在、わかっていない。生物発光性タンパク質の発生段階特異的発現についても推測できるにすぎないが、予想されることではある。
【００５３】
それゆえに、選択された発生段階の個体の特定研究は、他の発生段階において明らかにより低い程度で発現し、または全く発現せず、それゆえに、制限を付けるだけで発現クローン化に利用しやすい生物発光性タンパク質の同定をもたらすことができる。
【００５４】
本発明は、新しい生物発光性タンパク質を同定するための特定の発生段階の生物発光性生物の研究に関する。
【００５５】
ＲＮＡを、製造会社の使用説明書に従ってＳｔｒａｉｇｈｔ Ａ’ｓ ｍＲＮＡ単離キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いることにより、メトリディア・ロンガから単離した。単離されたポリＡ ｍＲＮＡを、製造会社の使用説明書に従って、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ｃＤＮＡへ転写した。用いられた発現ベクターはｐＴｒｉｐｌＥｘ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であり、ｃＤＮＡ断片は、ＳｆｉＩ Ａ−Ｂ切断部位へ組み込まれた。
【００５６】
得られた発現ベクターを、エレクトロポレーションを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した。大腸菌形質転換体を標準条件下で培養した。
【００５７】
非増幅ｃＤＮＡライブラリーを、１プレートあたり約１５００コロニーのコロニー密度で蒔き、標準条件下で一晩、インキュベートした。乾いたニトロセルロース膜を当てることによって、細菌プレートのコピーを作製した。レプリカを標準条件下でインキュベートした。滅菌ガラス棒を用いてレプリカプレートからコロニーを採取し、ＬＢ培地に移した。培養物を、標準条件下で１（６００ｎｍにおける）の最適密度までインキュベートした。この後、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを加えることによって遺伝子発現を誘導し、続いて、３７℃で１時間、インキュベートした。３ｍｌの誘導された細菌培養物を遠心分離によって収集し、ペレットを２５０μｌのＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン）に再懸濁した。その後、細菌を０℃で超音波処理によって破壊した。その後、粗抽出物を試験した。
【００５８】
この目的を達成するために、セレンテラジン（天然）を１０μＭの最終濃度まで加え、生物発光をルミノメータで決定した。生物発光陽性クローンのｃＤＮＡを、製造会社の使用説明書に従ってＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓ ＩＩシステム（ＴｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙ５ダイターミネーターキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて配列決定した。
【００５９】
驚くべきことに、この方法を用いて、ＭＬｕｃ７と呼ばれる、発生段階Ｖのメトリディア・ロンガのルシフェラーゼを同定することが可能であった。
【００６０】
本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに関する。同様に、本発明は、配列番号１に示される核酸分子に関する。
【００６１】
本発明はまた、分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの機能的等価物に関する。機能的等価物は、匹敵する物理化学的または生化学的特性を有するタンパク質である。
【００６２】
同様に、本発明は、ＭＬｕｃ７タンパク質の機能性断片、およびそのような断片をコードする核酸に関する。
【００６３】
同様に、本発明は、ＭＬｕｃ７タンパク質の突然変異体、およびそのような突然変異体をコードする核酸に関する。
【００６４】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、「ハイコンテントスクリーニング」（ＨＣＳ）技術についてのレポーター遺伝子として適している。ＨＣＳは、細胞分析のための現代の顕微鏡技術についての一般名称である。ＨＣＳ方法は、細胞レベルまたは細胞下レベルで複数のパラメータを定量的に記録することを特徴とする。
【００６５】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、細胞系、特に、受容体、イオンチャネル、輸送体、転写因子、または誘導系についてのレポーター遺伝子として適している。
【００６６】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、細菌系および真核生物系、特に、哺乳動物細胞、細菌、酵母、バキュロ（ｂａｋｕｌｏ）、植物におけるレポーター遺伝子として適している。
【００６７】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、生物発光系または化学発光系、特にルシフェラーゼ、オキシゲナーゼ、ホスファターゼを含む系と組み合わせた、細胞系についてのレポーター遺伝子として適している。
【００６８】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、生物発光系または化学発光系、特に発光タンパク質およびイオン指示薬、特にエクオリン、クリチン（ｃｌｙｔｉｎ）、オベリン（ｏｂｅｌｉｎ）、ベロビン（ｂｅｒｏｖｉｎ）、およびボリノプシン（ｂｏｌｉｎｏｐｓｉｎ）を含む系と組み合わせた、細胞系についてのレポーター遺伝子として適している。
【００６９】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、マーカータンパク質として、特にＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）ソーティングにおけるマーカータンパク質として適している。
【００７０】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、融合タンパク質として、特に、受容体、イオンチャネル、輸送体、転写因子、プロテイナーゼ、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、膜タンパク質、糖タンパク質として適している。
【００７１】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、固定化、特に、抗体、ビオチン、磁気支持体または磁化可能支持体による固定化に適している。
【００７２】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、エネルギー移動系、特に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ））系、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ））系、ＦＥＴ（電界効果トランジスタ（ｆｉｅｌｄ ｅｆｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒｓ））系、ＦＰ（蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ））系、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ））系に適している。
【００７３】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、基質またはリガンド、特に、プロテアーゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼ、輸送体、イオンチャネルおよび受容体についての基質またはリガンドを標識するのに適している。
【００７４】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、細菌系における発現に、特に、力価を決定するのに、生化学系、特にプロテイナーゼおよびキナーゼについての基質として適している。
【００７５】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、マーカーとして、特に、抗体に結合した、酵素に結合した、受容体に結合した、イオンチャネルおよび他のタンパク質に結合したマーカーとして適している。
【００７６】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、薬理学的薬物スクリーニング、特にＨＴＳ（高処理量スクリーニング）におけるレポーター遺伝子として適している。
【００７７】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、検出系、特に、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、免疫組織化学法、ウェスタンブロット、共焦点顕微鏡法についての検出系の構成要素として適している。
【００７８】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、相互作用、特に、タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用を分析するためのマーカーとして適している（ＤＮＡ：デオキシリボ核酸；ＲＮＡ：リボ核酸）。
【００７９】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、トランスジェニック生物、特に、マウス、ラット、ハムスターおよび他の哺乳動物、霊長類、魚類、虫、植物における発現に関するマーカーまたは融合タンパク質として適している。
【００８０】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、胚発生を分析するためのマーカーまたは融合タンパク質として適している。
【００８１】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、結合媒介物、特に、ビオチン、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）、ＣＮ−Ｂｒを介するマーカーとして適している。
【００８２】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、核酸、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡに結合したレポーターとして適している。
【００８３】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、タンパク質またはペプチドに結合したレポーターとして適している。
【００８４】
結合したＭＬｕｃ７タンパク質の核酸またはペプチドは、プローブとして、特に、ノーザンブロット、サザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、核酸配列決定反応、タンパク質分析、チップ分析についてのプローブとして適している。
【００８５】
ＭＬｕｃ７タンパク質は、薬理学的製剤、特に、感染病原体、抗体、小分子の標識として適している。
【００８６】
ＭＬｕｃ７タンパク質は、地質学的研究、特に、海、地下水、および川の流れに関する地質学的研究に適している。
【００８７】
ＭＬｕｃ７タンパク質は、発現系、特に、インビトロ翻訳系、細菌系、酵母系、バキュロ系、ウイルス系、真核生物系における発現に適している。
【００８８】
本発明はまた、ＭＬｕｃ７タンパク質を、特に、野生型タンパク質として、融合タンパク質として、突然変異を誘発されたタンパク質として、精製することに関する。
【００８９】
本発明はまた、化粧品、特に、入浴剤、ローション、セッケン、ボディペイント、練り歯磨き、ボディパウダーの分野におけるＭＬｕｃ７の使用に関する。
【００９０】
本発明はまた、染色、特に、食材、入浴剤、インク、織物、プラスチックの染色のためのＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００９１】
本発明はまた、紙、特に、グリーティングカード、紙製品、壁紙、手工芸品の染色のためのＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００９２】
本発明はまた、液体、特に、水鉄砲、噴水、飲料、氷についての液体の染色のためのＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００９３】
本発明はまた、おもちゃ、特に、フィンガーペイント、メーキャップ、水鉄砲の製造のためのＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００９４】
本発明は、本発明によるベクターを有する生物に関する。
【００９５】
本発明は、本発明によるポリペプチドを発現する生物に関する。
【００９６】
本発明は、ＭＬｕｃ７の機能的等価物を発現する生物に関する。
【００９７】
本発明は、細菌、真核細胞、またはインビトロ発現系において本発明による蛍光ポリペプチドを発現させる方法に関する。
【００９８】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドを精製／単離する方法に関する。
【００９９】
本発明は、本発明による蛍光タンパク質に対する抗体によって免疫学的に認識される５個を超える連続したアミノ酸を有するペプチドに関する。
【０１００】
本発明は、マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子としての、特に薬理学的薬物スクリーニングおよび診断法のための、本発明による蛍光タンパク質の使用に関する。
【０１０１】
本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列および配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに関する。
【０１０２】
本発明によれば、ＭＬｕｃ７タンパク質は、その配列が、配列番号２に示される配列およびその機能性断片を含むことを特徴とする。
【０１０３】
本発明はさらに、配列番号１に示される配列およびその機能性断片を含む、タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【０１０４】
前の段落で記載された核酸を含む組換えＲＮＡまたはＤＮＡベクターは、本発明の一部である。
【０１０５】
細菌、真核細胞、またはインビトロ翻訳系において本発明によるポリペプチドを発現させる方法は、本発明の一部である。
【０１０６】
マーカーまたはレポーター遺伝子としての、そのうえ、１つまたは複数の他のマーカーまたはレポーター遺伝子も組み合わせた、本発明による核酸の使用は、本発明の一部である。
【０１０７】
同様に、マーカーまたはレポーター遺伝子としての、そのうえ、１つまたは複数の他のマーカーまたはレポーター遺伝子タンパク質も組み合わせた、本発明によるタンパク質の使用は、本発明の一部である。
【０１０８】
分泌性ルシフェラーゼの突然変異体および誘導体
図３は、ルシフェラーゼＭＬｕ７、メトリディアルシフェラーゼ（Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２）、およびガウシアルシフェラーゼのアラインメントを示す。ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、分析された他のルシフェラーゼより明らかに短いポリペプチドである。同様に、ルシフェラーゼＬｕ２２およびガウシアルシフェラーゼは、明らかにより短いポリペプチドを含む。
【０１０９】
本発明は、発光反応の動態学的特性が変化している、ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼの突然変異体または誘導体に関する。
【０１１０】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸２３〜７８位の領域にある、発光反応の動態学的特性が変化している突然変異体または誘導体に関する。
【０１１１】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸２３〜７８位の領域にある、発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する突然変異体または誘導体に関する。
【０１１２】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸１３〜８８位の領域にある、発光反応の動態学的特性が変化している突然変異体または誘導体に関する。
【０１１３】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸１３〜８８位の領域にある、発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する突然変異体または誘導体に関する。
【０１１４】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸３３〜６８位の領域にある、発光反応の動態学的特性が変化している突然変異体または誘導体に関する。
【０１１５】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸３３〜６８位の領域にある、発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する突然変異体または誘導体に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ｐｃＤＮＡ３−ＭＬｕｃ７構築物のベクターマップを示す図である。
【図２】ｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７構築物のベクターマップを示す図である。
【図３】アミノ酸レベルでの様々な分泌型ルシフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図４】Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、およびＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの基質特異性を示す図である。
【図５】ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの温度依存性を示す図である。
【図６】反応緩衝液における塩化カルシウム濃度へのＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの依存性を示す図である。
【図７】一定量のＭＬｕｃ７および異なるセレンテラジン濃度でのＭＬｕｃ７の生物発光測定値を示す図である。
【図８】３つの異なるセレンテラジンでのＭＬｕｃ７生物発光反応の動態を示す図である。
【図９】３つの異なるセレンテラジンでのＬｕ１６４生物発光反応の動態を示す図である。
【図１０】１．５秒間の積分時間による、３００秒間の測定についてのＭＬｕｃ７（黒色）およびＬｕ１６４（灰色）の生物発光測定の結果を示す図である。
【図１１】一定基質濃度および細胞上清の希釈による減少性Ｍｌｕｃ７濃度でのＭＬｕｃ７の生物発光測定の結果を示す図である。
【図１２】一定基質濃度および細胞上清の希釈による減少性Ｌｕ１６４濃度でのＬｕ１６４の生物発光測定の結果を示す図である。
【図１３】各場合１０秒間の積分時間の区分におけるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す図である。
【図１４】３００秒間の積分時間によるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４の生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す図である。
【図１５】各場合６０秒間の積分時間の区分におけるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す図である。
【図１６】発生段階の関数としてメトリディア・ロンガ種の個体により好まれる水深を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
本発明は特に、以下に関する：
１．以下からなる群より選択される核酸分子：
ａ）配列番号２により開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号１に示された配列を含む核酸分子；
ｃ）相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ルシフェラーゼをコードする核酸分子；核酸分子のストリンジェントなハイブリダイゼーションは、例えば、６８℃で０．２×ＳＳＣ（１×標準生理食塩水−クエン酸＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）を含む水溶液中で行うことができる（Sambrookら、1989）；
ｄ）遺伝暗号の縮重によりｃ）の下の核酸分子とは異なる核酸分子；
ｅ）配列が配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９８％、９９％同一であり、タンパク質産物がルシフェラーゼである核酸分子；
ｆ）配列が配列番号１と少なくとも６５％同一であり、ルシフェラーゼをコードする核酸分子；
ｇ）機能性ルシフェラーゼをコードする、ａ）〜ｆ）に記載の核酸分子の断片。
【０１１８】
２．発光タンパク質をコードする配列の５’側に機能性プロモーターを含む、ポイント１に記載の核酸。
【０１１９】
３．ポイント２に記載の核酸を含む、組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター。
【０１２０】
４．ポイント３に記載のベクターを含む、生物。
【０１２１】
５．ポイント１に記載の核酸分子の部分配列と同一または相補的である１０個を超える連続したヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【０１２２】
６．ポイント１に記載の核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【０１２３】
７．細菌、真核細胞、またはインビトロ発現系においてポイント６に記載のルシフェラーゼポリペプチドを発現させる方法。
【０１２４】
８．ポイント６に記載のルシフェラーゼポリペプチドを精製／単離する方法。
【０１２５】
９．ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに対する抗体によって免疫学的に認識される５個を超える連続したアミノ酸を有するペプチド。
【０１２６】
１０．マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての、ポイント１〜３に記載のルシフェラーゼをコードする核酸の使用。
【０１２７】
１１．マーカーまたはレポーターとしての、ポイント６に記載のルシフェラーゼの使用。
【０１２８】
１２．ポイント６に記載のルシフェラーゼを特異的に認識する抗体。
【０１２９】
１３．ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに加えて少なくとも１つのさらなるレポーター遺伝子が用いられる、ポイント１０または１１に記載の使用。
【０１３０】
１４．さらなる（１つまたは複数の）レポーター遺伝子が分泌型および／または細胞性ルシフェラーゼである、ポイント１３に記載の使用。
【０１３１】
１５．さらなる（１つまたは複数の）レポーター遺伝子が分泌型ルシフェラーゼである、ポイント１４に記載の使用。
【０１３２】
１６．さらなる（１つまたは複数の）レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼまたはメトリディア・ロンガ生物由来のルシフェラーゼである、ポイント１４に記載の使用。
【０１３３】
１７．さらなる分泌型ルシフェラーゼが、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２からなる群より選択されるルシフェラーゼである、ポイント１５に記載の使用。
【０１３４】
１８．発光測定値が動態学的に評価される、ポイント１０、１１、または１３に記載の方法。
【０１３５】
１９．複数の標的タンパク質が測定される、ポイント１０、１１、１３、または１８に記載の方法。
【０１３６】
２０．発光反応の動態学的特性が変化している、ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体。
【０１３７】
２１．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸２３〜７８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【０１３８】
２２．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸２３〜７８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【０１３９】
２３．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜８８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【０１４０】
２４．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜８８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【０１４１】
２５．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜６８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【０１４２】
２６．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜６８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【０１４３】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
配列番号１（ＭＬｕｃ７−ヌクレオチド配列−コーディング）
【０１４４】
【化３】
【０１４５】
これは以下のアミノ酸配列を生じる：
配列番号２（ＭＬｕｃ７−アミノ酸配列）
【０１４６】
【化４】
【０１４７】
配列番号３（Ｌｕ１６４−ヌクレオチド配列−コーディング）
【０１４８】
【化５】
【０１４９】
これは以下のアミノ酸配列を生じる：
配列番号４（Ｌｕ１６４−アミノ酸配列）
【０１５０】
【化６】
【０１５１】
配列番号５（ＭＬｕｃ７−ヌクレオチド配列−クローン化配列）
【０１５２】
【化７】
【０１５３】
図面の説明
図１ 図１はｐｃＤＮＡ３−ＭＬｕｃ７構築物のベクターマップを示す。
【０１５４】
図２ 図２はｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７構築物のベクターマップを示す。
【０１５５】
図３ 図３はアミノ酸レベルでの様々な分泌型ルシフェラーゼのアラインメントを示す。
【０１５６】
図４ 図４はＬｕ１６４、Ｌｕ２２、およびＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの基質特異性を示す。Ｘ軸：セレンテラジン、Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。各場合、ＣＨＯの一過性トランスフェクションからの同量の分泌型ルシフェラーゼを用いて、活性を決定した。セレンテラジンを並行して加え、これに続いて、測定を開始した。
【０１５７】
図５ 図５はＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの温度依存性を示す。Ｘ軸：℃での温度、Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。各場合、ＣＨＯの一過性トランスフェクションからの同量の分泌型ルシフェラーゼを用いて、活性を決定した。示された温度は反応温度に対応する。６０秒間の生物発光測定値の積分がプロットされている。
【０１５８】
図６ 図６は、反応緩衝液における塩化カルシウム濃度へのＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの依存性を示す。Ｘ軸：ｍＭでのＫＣｌ濃度、Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。各場合、ＣＨＯの一過性トランスフェクションからの同量の分泌型ルシフェラーゼを用いて、活性を決定した。示された濃度は、反応緩衝液におけるＫＣｌの濃度に対応する。６０秒間の生物発光測定値の積分がプロットされている。
【０１５９】
図７ 図７は、一定量のＭＬｕｃ７および異なるセレンテラジン濃度でのＭＬｕｃ７の生物発光測定値を示す。Ｘ軸：μＭでのセレンテラジン濃度。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６０】
図８ 図は、３つの異なるセレンテラジンでのＭＬｕｃ７生物発光反応の動態を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。黒色：天然セレンテラジン、薄い灰色：セレンテラジンｆ、濃い灰色：セレンテラジンｉ。
【０１６１】
図９ 図は、３つの異なるセレンテラジンでのＬｕ１６４生物発光反応の動態を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。黒色：天然セレンテラジン、薄い灰色：セレンテラジンｆ、濃い灰色：セレンテラジンｉ。
【０１６２】
図１０ 図１０は、１．５秒間の積分時間による、３００秒間の測定についてのＭＬｕｃ７（黒色）およびＬｕ１６４（灰色）の生物発光測定の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６３】
図１１ 図１１は、一定基質濃度および細胞上清の希釈による減少性Ｍｌｕｃ７濃度でのＭＬｕｃ７の生物発光測定の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。四角形：希釈因子（非希釈上清から始まる）の表示および割り当て。
【０１６４】
図１２ 図１２は、一定基質濃度および細胞上清の希釈による減少性Ｌｕ１６４濃度でのＬｕ１６４の生物発光測定の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。四角形：希釈因子（非希釈上清から始まる）の表示および割り当て。
【０１６５】
図１３ 図１３は、各場合１０秒間の積分時間の区分におけるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６６】
図１４ 図１４は、３００秒間の積分時間によるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４の生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６７】
図１５ 図１５は、各場合６０秒間の積分時間の区分におけるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６８】
図１６ 図１６は、発生段階の関数としてメトリディア・ロンガ種の個体により好まれる水深を示す。Ｘ軸：メートル（ｍ）での水深；Ｙ軸：発生段階；黒色棒：２５〜６５ｍ、灰色棒：１０〜２５ｍ、白色棒：０〜１０ｍ。図は海洋データセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＵＳＡ）の情報による。
【実施例】
【０１６９】
例１
構築物の調製および使用
下記の構築物を調製するために用いられたベクターは、恒常的発現用のｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であった。細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を検出するために、ＭＬｕｃ７ ｃＤＮＡをｐＡＳＭベクターへクローン化した。ｐＡＳＭベクターは、ｃＡＭＰ濃度に応じてプロモーター活性を制御するｃＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）を含む。前記ベクターの誘導体をｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７と呼んだ。ｐｃＤＮＡ３ベクターの誘導体をｐｃＤＮＡ３−ＭＬｕｃ７と呼んだ。クローン化反応を、分子生物学的標準方法を用いて行った。真核生物系でＭＬｕｃ７を発現させるためにｐｃＤＮＡ３−Ｍｌｕｃ７ベクターおよびｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７ベクターを用いた。
【０１７０】
図１はｐｃＤＮＡ３−Ｍｌｕｃ７ベクターのプラスミドマップを示す。
【０１７１】
図２はｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７ベクターのプラスミドマップを示す。
【０１７２】
例２
真核生物発現
一過性実験においてＣＨＯ細胞に発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＭＬｕｃ７、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、およびｐｃＤＮＡ３（ｃＤＮＡ挿入断片を含まない）をトランスフェクトすることにより、恒常的真核生物発現を行った。この目的を達成するために、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中１ウェルあたり１０，０００個の細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートに蒔き、３７℃で一晩、インキュベートした。トランスフェクションを、Ｆｕｇｅｎｅ ６キット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造会社の使用説明書に従って行った。トランスフェクトされた細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中、３７℃で一晩、インキュベートした。基質の添加後、イメージング系を用いて生物発光を測定した。希釈された上清を以下の組成を有する緩衝液Ａ（ｐＨ７．４）中で測定した：１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、および５ｍＭ ＮａＨＣＯ３。
【０１７３】
トランスフェクトされた細胞を２ｍｇ／ｍｌジェネテシンで選択し、クローンおよび上清の生物発光活性をそれぞれ決定することにより安定な細胞系を調製した。
【０１７４】
例３
配列比較
分泌型ルシフェラーゼの配列を比較し示すことができるように、アミノ酸配列アラインメントを行った。図３は、アミノ酸レベルでの分泌型ルシフェラーゼのアラインメントを示す。ウミホタルルシフェラーゼについては、その他のルシフェラーゼとの配列同一性が低すぎるため、アラインメントに含めなかった。
文献／特許
【０１７５】
【表２】
【０１７６】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびに活性および使用、ならびに分泌型ルシフェラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼ
発光とは、可視スペクトル範囲内での光子の放出を指し、その放出は、励起エミッター分子による。蛍光とは対照的に、エネルギーは、より短い波長の放射線の形で外部からここに供給されることはない。
【０００３】
化学発光と生物発光の間は区別される。化学発光とは、励起分子を生じ、励起電子が基底状態に戻る時、その分子自体が発光を示す化学反応を指す。この反応が酵素によって触媒される場合には、これは生物発光と呼ばれる。反応に関与する酵素は、一般的に、ルシフェラーゼと呼ばれる。
【０００４】
発光性生物の概説は、Wilson & Hastings、1998に見出すことができる。
【０００５】
ルシフェラーゼはペルオキシダーゼ、またはモノオキシゲナーゼおよびジオキシゲナーゼである。光放出生成物についての出発物質である酵素基質は、ルシフェリンと呼ばれる。それらは種によって異なる。系の量子収率は、変換される基質分子１個あたり０．１〜０．９光子の間である。
【０００６】
ルシフェラーゼは、それらの起源またはそれらの酵素的特性に基づいて分類することができる。同様に、ルシフェラーゼは、それらの基質特異性によってお互い区別することができる。最も重要な基質としては、セレンテラジンおよびルシフェリン、ならびにその２つの物質の誘導体も挙げられる。
【０００７】
ルシフェラーゼ基質
いくつかのルシフェラーゼ基質の構造は、例として下に示されている：
【０００８】
【化１】
【０００９】
【化２】
【００１０】
分泌型ルシフェラーゼ
宿主生物によってサイトゾルから周囲培地へ組換え型または野生型タンパク質の形で放出されるルシフェラーゼは、分泌型ルシフェラーゼと呼ばれる。表１は分泌性ルシフェラーゼの概要を示す：
【００１１】
【表１】
【００１２】
同様に、分泌型Ｌｕ１６４ルシフェラーゼは、Markovaら、2004に記載されている。
【００１３】
レポーター系
レポーター遺伝子または指標遺伝子は、一般的に、遺伝子産物が簡単な生化学的または組織化学的方法を用いて容易に検出することができる遺伝子を指す。レポーター遺伝子の少なくとも２つの型が区別される。
１．耐性遺伝子。耐性遺伝子とは、抗生物質を始めとする物質に対する耐性を発現によって細胞に与える遺伝子を指し、それらの物質は増殖培地に存在すると、耐性遺伝子を欠く場合には、細胞死を引き起こすものである。
２．レポーター遺伝子。レポーター遺伝子の産物は、融合型または非融合型指標として遺伝子操作に用いられる。最もよく用いられるレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ（Alamら、1990）、アルカリホスファターゼ（Yangら、1997；Cullenら、1992）、ルシフェラーゼ、および他の発光タンパク質（Shinomura、1985；Phillips GN、1997；Snowdowneら、1984）が挙げられる。
【００１４】
発光とは、可視スペクトル範囲内での光子の放出を指し、その放出は、励起エミッター分子による。蛍光とは対照的に、エネルギーは、より短い波長の放射線の形で外部からここに供給されることはない。
【００１５】
化学発光と生物発光の間は区別される。化学発光とは、励起分子を生じ、励起電子が基底状態に戻る時、その分子自体が発光を示す、化学反応を指す。この反応が酵素によって触媒される場合には、これは生物発光と呼ばれる。反応に関与する酵素は、一般的に、ルシフェラーゼと呼ばれる。
【００１６】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼ
驚くべきことに、メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）から新しいルシフェラーゼをスクリーニングしたとき、その生化学的および物理化学的特性が以前に同定されたルシフェラーゼとは明らかに異なる新しいルシフェラーゼ（以下、ＭＬｕｃ７と呼ぶ）を同定およびクローン化した。これらの特性は下に記載されている。
【００１７】
動態（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼが発現したとき、驚くべきことに、それは、生物発光反応の時間分解能（動態）が改変されることが見出された。動態の違いは、試験した基質について基質非依存性であり、図８および図９に示されている。図１０は、ＭＬｕｃ７およびＬｕ１６４についての生物発光反応の経過を示す。ＭＬｕｃ７の実質的により速い動態は明らかに目に見える。ＭＬｕｃ７は、Ｌｕ１６４と比較して、数秒後でも、１秒あたりに測定されうる発光の減少を示す。６０秒後、３００秒間の積分シグナルの７０〜８０％がすでに記録されている。Ｌｕ１６４は、１秒あたりの生物発光シグナルの実質的により遅い減少を示し、結果として、３００秒後でもバックグラウンドに対して測定可能である明瞭なシグナルを生じる。それゆえに、ＭＬｕｃ７は、以前に記載されたメトリディア・ロンガの分泌型ルシフェラーゼとは動態学的に異なる。驚くべきことに、この特性によって、動態学的区別が可能であるので、ＭＬｕｃ７を他のセレンテラジン依存性またはセレンテラジン非依存性ルシフェラーゼと組み合わせて利用することができる。
【００１８】
活性
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼが発現したとき、驚くべきことに、それは、動態学的特性の変化によって生物発光反応の活性分布が変化することが見出された。生物発光反応の開始時点において、１秒あたりに測定されうるＭＬｕｃ７活性は、Ｌｕ１６４のそれより明らかに高い。このより高い生物発光によって、より少数の細胞、ＭＬｕｃ７発現のより低い活性化、またはより低い基質濃度で、バックグラウンドシグナルより明らかに上の測定値が可能となるので、用いられる測定方法のより高い感度が可能となる。
【００１９】
本発明は、感度を向上させる、少ない細胞数または低い基質濃度を用いるためのＭＬｕｃ７の使用に関する。
【００２０】
動態学的評価
ＭＬｕｃ７の動態学的特性の変化によって、生物発光の差別化された動態学的評価が可能となる。（例えば）３００秒間に渡る連続測定に関して、様々な間隔を評価に用いることができる。図１３は、各場合１０秒間の間隔についての生物発光シグナル合計を示す。ＭＬｕｃ７は、最初の６０秒以内に（正確な時間は、用いられるルシフェラーゼおよび基質の量に依存する）Ｌｕ１６４より明らかに高い生物発光を示す。この期間後、ＭＬｕｃ７の生物発光は、Ｌｕ１６４のそれより速く減少し、結果として、Ｌｕ１６４はより高い生物発光シグナルを生じることになる。それゆえに、測定ウィンドウを選択することによってルシフェラーゼ間を区別することが可能である。図１４は、選択された実験条件下での３００秒間の時間についてのＭＬｕｃ７およびＬｕ１６４ルシフェラーゼの生物発光合計を示す。
【００２１】
図１５は、各場合６０秒間の間隔についての生物発光シグナル合計を示す。ここでもまた、ルシフェラーゼは、測定ウィンドウを選択することによって区別することができる。それゆえに、測定間隔の長さおよび選択が特定の実験条件に適応することができ、柔軟な形で用いることができる。示されたデータによって、総測定時間もまた、柔軟な形で選択することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開０２４２４７０号パンフレット
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem. 1990 Aug 1; 188 (2): 245-54
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、ＭＬｕｃ７の生物発光活性の測定値の動態学的評価に関する。
【００２５】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２の生物発光活性の測定値の動態学的評価に関する。
【００２６】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼの生物発光活性の測定値の動態学的評価に関する。
【００２７】
本発明は、本発明によるタンパク質の生物発光活性の測定値の動態学的評価に関する。
【００２８】
多重化
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼが発現したとき、驚くべきことに、それは、その特性の変化に起因して、多重反応に特に適していることが見出された。ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、他のルシフェラーゼと比較して明らかにより速い動態を示し、それによって、他の発光性または非発光性測定方法（読み出し）との組合せが可能となる。
【００２９】
発光性測定方法を組み合わせるために、発光系は、お互い阻害してはならず、または特定のシグナルより多い光を放射してはならない。（例えば、基質を加えることにより）第１の系を活性化した後、発光は、第２の反応を開始できるようになる前に、出発レベルに戻っていなければならない。これはまた、両方の系が非依存的な基質を用いる場合にも必要である。Ｍｌｕｃ７は、その速い動態によって、測定間の時間を著しく短縮する。反応の不活性化は必要でない。ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは分泌型ルシフェラーゼであるので、それを（例えば、ホタルルシフェラーゼなどの）細胞内の系と組み合わせてもよい。
【００３０】
他のメトリディア・ロンガのルシフェラーゼもまた、ホタルルシフェラーゼなどの細胞内の系と組み合わせることができる。しかしながら、これは、残存する生物発光を低レベルまで低下させるために不活性化段階を必要とする。
【００３１】
本発明は、ＭＬｕｃ７と１つまたは複数のレポーター遺伝子または測定技術（読み取り）との組合せが用いられる多重反応混合物におけるＭＬｕｃ７の使用に関する。本発明はまた、複数の標的遺伝子を測定するための反応混合物におけるＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００３２】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２と１つまたは複数のレポーター遺伝子または測定技術（読み取り）との組合せが用いられる多重反応混合物におけるＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２の使用に関する。本発明はまた、複数の標的遺伝子を測定するための反応混合物におけるＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２の使用に関する。
【００３３】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼと１つまたは複数のレポーター遺伝子または測定技術（読み取り）との組合せが用いられる多重反応混合物における分泌型ルシフェラーゼの使用に関する。本発明はまた、複数の標的遺伝子を測定するための反応混合物における分泌型ルシフェラーゼの使用に関する。
【００３４】
本発明は、本発明によるタンパク質と１つまたは複数のレポーター遺伝子または測定技術（読み取り）との組合せが用いられる多重反応混合物における本発明によるタンパク質の使用に関する。本発明はまた、複数の標的遺伝子を測定するための反応混合物における本発明によるタンパク質の使用に関する。
【００３５】
基質特異性
ＭＬｕｃ７基質特異性を、標準条件下で様々なセレンテラジンをアッセイすることによって試験した。この試験では、ＣＨＯ細胞のＬｕ１６４、Ｌｕ２２、およびＭＬｕｃ７ルシフェラーゼでの一過性トランスフェクションからの上清を用いた。選択された条件下で、基質セレンテラジンｎおよびセレンテラジンｃｂは、Ｌｕ１６４によるよりＭＬｕｃ７による変換の方が乏しくなり、基質セレンテラジンｆはＬｕ１６４によるよりＭｌｕｃによる方が良く変換される。結果は、反応を最適化することができること、または基質および反応条件に基づいてルシフェラーゼを用いることができることを一例として実証している。ホタルルシフェリンおよびウミホタルルシフェリンの基質がすべての３つのルシフェラーゼによって基質として用いられることは、選択された反応条件下で、たとえあったとしてもほんのわずかな程度にすぎない。
【００３６】
本発明は、ＭＬｕｃ７による生物発光を生じるための異なる基質の使用および組合せに関する。
【００３７】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２による生物発光を生じるための異なる基質の使用および組合せに関する。
【００３８】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼによる生物発光を生じるための異なる基質の使用および組合せに関する。
【００３９】
本発明は、本発明によるタンパク質による生物発光を生じるための異なる基質の使用および組合せに関する。
【００４０】
温度依存性
ＭＬｕｃ７反応の温度依存性を、１０℃から５０℃の間の温度で生物発光反応を測定することによって試験した。この試験では、ＣＨＯ細胞のＭＬｕｃ７での一過性トランスフェクションからの上清を用いた。結果は、ＭＬｕｃ７生物発光反応が反応温度の関数であることを示す。この依存性は、レポーター遺伝子適用において反応を最適化して適応させるためにも、様々な生物発光系を区別して組み合わせるためにも用いることができる。
【００４１】
本発明は、ＭＬｕｃ７に関する測定方法を開発して最適化するための温度依存性の使用および組合せに関する。
【００４２】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２に関する測定方法を開発して最適化するための温度依存性の使用および組合せに関する。
【００４３】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼに関する測定方法を開発して最適化するための温度依存性の使用および組合せに関する。
【００４４】
本発明は、本発明によるタンパク質に関する測定方法を開発して最適化するための温度依存性の使用および組合せに関する。
【００４５】
イオン濃度の関数としての生物発光反応
イオン濃度の関数としてのＭＬｕｃ７反応を、１ｍＭから４００ｍＭの間のＫＣｌ濃度で生物発光反応を測定することによって試験した。この試験では、ＣＨＯ細胞のＭＬｕｃ７での一過性トランスフェクションからの上清を用いた。結果は、ＭＬｕｃ７生物発光反応が反応媒質におけるイオン濃度の関数であることを示す。この依存性は、レポーター遺伝子適用において反応を最適化して適応させるためにも、様々な生物発光系を区別して組み合わせるためにも用いることができる。
【００４６】
本発明は、ＭＬｕｃ７に関する測定方法を開発し、最適化し、用いるための生物発光反応のイオン依存性の使用および組合せに関する。
【００４７】
本発明は、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２に関する測定方法を開発し、最適化し、用いるための生物発光反応のイオン依存性の使用および組合せに関する。
【００４８】
本発明は、分泌型ルシフェラーゼに関する測定方法を開発し、最適化し、用いるための生物発光反応のイオン依存性の使用および組合せに関する。
【００４９】
本発明は、本発明によるタンパク質に関する測定方法を開発し、最適化し、用いるための生物発光反応のイオン依存性の使用および組合せに関する。
【００５０】
ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの同定
メトリディア・ロンガ種の生物発光活性を研究するために、標本を白海（Ｗｈｉｔｅ Ｓｅａ）（生物学的基地カレリヤ（Ｋａｒｔｅｓｈ）、ロシア）で採取し、液体窒素中に保存した。他の動物種または植物種による混入を防ぐために、メトリディア・ロンガの発生段階Ｖの２００個の標本を同定し、上記のように保存した。「ノープリウス（Ｎａｕｐｉｌｕｓ）」形態および成体形態の他に、メトリディア・ロンガのさらに５つの発生形態が記載されており、増加する発生段階におけるＣＩからＣＶまでの形態がその命名によって記載されている。選択および同定を、双眼顕微鏡およびホールピペットを用いて行った。標本は、生物学的調査基地「カレリヤ」（ロシア）の領域の白海で採取した。
【００５１】
メトリディア・ロンガ個体は、とりわけそれらの発生段階によって異なる深度で見出すことができる。この依存性は図１９にプロットされている。
【００５２】
季節、塩類含有量、温度、および食糧供給（組成および多様性）による変動に加えて、他の因子もまた、メトリディア・ロンガの生息地に影響する。これらの因子が生物発光性タンパク質の代謝過程または発現に影響するかどうかは現在、わかっていない。生物発光性タンパク質の発生段階特異的発現についても推測できるにすぎないが、予想されることではある。
【００５３】
それゆえに、選択された発生段階の個体の特定研究は、他の発生段階において明らかにより低い程度で発現し、または全く発現せず、それゆえに、制限を付けるだけで発現クローン化に利用しやすい生物発光性タンパク質の同定をもたらすことができる。
【００５４】
本発明は、新しい生物発光性タンパク質を同定するための特定の発生段階の生物発光性生物の研究に関する。
【００５５】
ＲＮＡを、製造会社の使用説明書に従ってＳｔｒａｉｇｈｔ Ａ’ｓ ｍＲＮＡ単離キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いることにより、メトリディア・ロンガから単離した。単離されたポリＡ ｍＲＮＡを、製造会社の使用説明書に従って、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ｃＤＮＡへ転写した。用いられた発現ベクターはｐＴｒｉｐｌＥｘ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であり、ｃＤＮＡ断片は、ＳｆｉＩ Ａ−Ｂ切断部位へ組み込まれた。
【００５６】
得られた発現ベクターを、エレクトロポレーションを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した。大腸菌形質転換体を標準条件下で培養した。
【００５７】
非増幅ｃＤＮＡライブラリーを、１プレートあたり約１５００コロニーのコロニー密度で蒔き、標準条件下で一晩、インキュベートした。乾いたニトロセルロース膜を当てることによって、細菌プレートのコピーを作製した。レプリカを標準条件下でインキュベートした。滅菌ガラス棒を用いてレプリカプレートからコロニーを採取し、ＬＢ培地に移した。培養物を、標準条件下で１（６００ｎｍにおける）の最適密度までインキュベートした。この後、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを加えることによって遺伝子発現を誘導し、続いて、３７℃で１時間、インキュベートした。３ｍｌの誘導された細菌培養物を遠心分離によって収集し、ペレットを２５０μｌのＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン）に再懸濁した。その後、細菌を０℃で超音波処理によって破壊した。その後、粗抽出物を試験した。
【００５８】
この目的を達成するために、セレンテラジン（天然）を１０μＭの最終濃度まで加え、生物発光をルミノメータで決定した。生物発光陽性クローンのｃＤＮＡを、製造会社の使用説明書に従ってＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓ ＩＩシステム（ＴｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙ５ダイターミネーターキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて配列決定した。
【００５９】
驚くべきことに、この方法を用いて、ＭＬｕｃ７と呼ばれる、発生段階Ｖのメトリディア・ロンガのルシフェラーゼを同定することが可能であった。
【００６０】
本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに関する。同様に、本発明は、配列番号１に示される核酸分子に関する。
【００６１】
本発明はまた、分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの機能的等価物に関する。機能的等価物は、匹敵する物理化学的または生化学的特性を有するタンパク質である。
【００６２】
同様に、本発明は、ＭＬｕｃ７タンパク質の機能性断片、およびそのような断片をコードする核酸に関する。
【００６３】
同様に、本発明は、ＭＬｕｃ７タンパク質の突然変異体、およびそのような突然変異体をコードする核酸に関する。
【００６４】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、「ハイコンテントスクリーニング」（ＨＣＳ）技術についてのレポーター遺伝子として適している。ＨＣＳは、細胞分析のための現代の顕微鏡技術についての一般名称である。ＨＣＳ方法は、細胞レベルまたは細胞下レベルで複数のパラメータを定量的に記録することを特徴とする。
【００６５】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、細胞系、特に、受容体、イオンチャネル、輸送体、転写因子、または誘導系についてのレポーター遺伝子として適している。
【００６６】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、細菌系および真核生物系、特に、哺乳動物細胞、細菌、酵母、バキュロ（ｂａｋｕｌｏ）、植物におけるレポーター遺伝子として適している。
【００６７】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、生物発光系または化学発光系、特にルシフェラーゼ、オキシゲナーゼ、ホスファターゼを含む系と組み合わせた、細胞系についてのレポーター遺伝子として適している。
【００６８】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、生物発光系または化学発光系、特に発光タンパク質およびイオン指示薬、特にエクオリン、クリチン（ｃｌｙｔｉｎ）、オベリン（ｏｂｅｌｉｎ）、ベロビン（ｂｅｒｏｖｉｎ）、およびボリノプシン（ｂｏｌｉｎｏｐｓｉｎ）を含む系と組み合わせた、細胞系についてのレポーター遺伝子として適している。
【００６９】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、マーカータンパク質として、特にＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）ソーティングにおけるマーカータンパク質として適している。
【００７０】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、融合タンパク質として、特に、受容体、イオンチャネル、輸送体、転写因子、プロテイナーゼ、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、膜タンパク質、糖タンパク質として適している。
【００７１】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、固定化、特に、抗体、ビオチン、磁気支持体または磁化可能支持体による固定化に適している。
【００７２】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、エネルギー移動系、特に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ））系、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ））系、ＦＥＴ（電界効果トランジスタ（ｆｉｅｌｄ ｅｆｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒｓ））系、ＦＰ（蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ））系、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ））系に適している。
【００７３】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、基質またはリガンド、特に、プロテアーゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼ、輸送体、イオンチャネルおよび受容体についての基質またはリガンドを標識するのに適している。
【００７４】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、細菌系における発現に、特に、力価を決定するのに、生化学系、特にプロテイナーゼおよびキナーゼについての基質として適している。
【００７５】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、マーカーとして、特に、抗体に結合した、酵素に結合した、受容体に結合した、イオンチャネルおよび他のタンパク質に結合したマーカーとして適している。
【００７６】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、薬理学的薬物スクリーニング、特にＨＴＳ（高処理量スクリーニング）におけるレポーター遺伝子として適している。
【００７７】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、検出系、特に、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、免疫組織化学法、ウェスタンブロット、共焦点顕微鏡法についての検出系の構成要素として適している。
【００７８】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、相互作用、特に、タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用を分析するためのマーカーとして適している（ＤＮＡ：デオキシリボ核酸；ＲＮＡ：リボ核酸）。
【００７９】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、トランスジェニック生物、特に、マウス、ラット、ハムスターおよび他の哺乳動物、霊長類、魚類、虫、植物における発現に関するマーカーまたは融合タンパク質として適している。
【００８０】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、胚発生を分析するためのマーカーまたは融合タンパク質として適している。
【００８１】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、結合媒介物、特に、ビオチン、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）、ＣＮ−Ｂｒを介するマーカーとして適している。
【００８２】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、核酸、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡに結合したレポーターとして適している。
【００８３】
分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、タンパク質またはペプチドに結合したレポーターとして適している。
【００８４】
結合したＭＬｕｃ７タンパク質の核酸またはペプチドは、プローブとして、特に、ノーザンブロット、サザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、核酸配列決定反応、タンパク質分析、チップ分析についてのプローブとして適している。
【００８５】
ＭＬｕｃ７タンパク質は、薬理学的製剤、特に、感染病原体、抗体、小分子の標識として適している。
【００８６】
ＭＬｕｃ７タンパク質は、地質学的研究、特に、海、地下水、および川の流れに関する地質学的研究に適している。
【００８７】
ＭＬｕｃ７タンパク質は、発現系、特に、インビトロ翻訳系、細菌系、酵母系、バキュロ系、ウイルス系、真核生物系における発現に適している。
【００８８】
本発明はまた、ＭＬｕｃ７タンパク質を、特に、野生型タンパク質として、融合タンパク質として、突然変異を誘発されたタンパク質として、精製することに関する。
【００８９】
本発明はまた、化粧品、特に、入浴剤、ローション、セッケン、ボディペイント、練り歯磨き、ボディパウダーの分野におけるＭＬｕｃ７の使用に関する。
【００９０】
本発明はまた、染色、特に、食材、入浴剤、インク、織物、プラスチックの染色のためのＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００９１】
本発明はまた、紙、特に、グリーティングカード、紙製品、壁紙、手工芸品の染色のためのＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００９２】
本発明はまた、液体、特に、水鉄砲、噴水、飲料、氷についての液体の染色のためのＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００９３】
本発明はまた、おもちゃ、特に、フィンガーペイント、メーキャップ、水鉄砲の製造のためのＭｌｕｃ７の使用に関する。
【００９４】
本発明は、本発明によるベクターを有する生物に関する。
【００９５】
本発明は、本発明によるポリペプチドを発現する生物に関する。
【００９６】
本発明は、ＭＬｕｃ７の機能的等価物を発現する生物に関する。
【００９７】
本発明は、細菌、真核細胞、またはインビトロ発現系において本発明による蛍光ポリペプチドを発現させる方法に関する。
【００９８】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドを精製／単離する方法に関する。
【００９９】
本発明は、本発明による蛍光タンパク質に対する抗体によって免疫学的に認識される５個を超える連続したアミノ酸を有するペプチドに関する。
【０１００】
本発明は、マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子としての、特に薬理学的薬物スクリーニングおよび診断法のための、本発明による蛍光タンパク質の使用に関する。
【０１０１】
本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列および配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する分泌型ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに関する。
【０１０２】
本発明によれば、ＭＬｕｃ７タンパク質は、その配列が、配列番号２に示される配列およびその機能性断片を含むことを特徴とする。
【０１０３】
本発明はさらに、配列番号１に示される配列およびその機能性断片を含む、タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【０１０４】
前の段落で記載された核酸を含む組換えＲＮＡまたはＤＮＡベクターは、本発明の一部である。
【０１０５】
細菌、真核細胞、またはインビトロ翻訳系において本発明によるポリペプチドを発現させる方法は、本発明の一部である。
【０１０６】
マーカーまたはレポーター遺伝子としての、そのうえ、１つまたは複数の他のマーカーまたはレポーター遺伝子も組み合わせた、本発明による核酸の使用は、本発明の一部である。
【０１０７】
同様に、マーカーまたはレポーター遺伝子としての、そのうえ、１つまたは複数の他のマーカーまたはレポーター遺伝子タンパク質も組み合わせた、本発明によるタンパク質の使用は、本発明の一部である。
【０１０８】
分泌性ルシフェラーゼの突然変異体および誘導体
図３は、ルシフェラーゼＭＬｕ７、メトリディアルシフェラーゼ（Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２）、およびガウシアルシフェラーゼのアラインメントを示す。ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼは、分析された他のルシフェラーゼより明らかに短いポリペプチドである。同様に、ルシフェラーゼＬｕ２２およびガウシアルシフェラーゼは、明らかにより短いポリペプチドを含む。
【０１０９】
本発明は、発光反応の動態学的特性が変化している、ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼの突然変異体または誘導体に関する。
【０１１０】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸２３〜７８位の領域にある、発光反応の動態学的特性が変化している突然変異体または誘導体に関する。
【０１１１】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸２３〜７８位の領域にある、発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する突然変異体または誘導体に関する。
【０１１２】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸１３〜８８位の領域にある、発光反応の動態学的特性が変化している突然変異体または誘導体に関する。
【０１１３】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸１３〜８８位の領域にある、発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する突然変異体または誘導体に関する。
【０１１４】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸３３〜６８位の領域にある、発光反応の動態学的特性が変化している突然変異体または誘導体に関する。
【０１１５】
本発明は、改変または欠失がルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼのアミノ酸３３〜６８位の領域にある、発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する突然変異体または誘導体に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ｐｃＤＮＡ３−ＭＬｕｃ７構築物のベクターマップを示す図である。
【図２】ｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７構築物のベクターマップを示す図である。
【図３】アミノ酸レベルでの様々な分泌型ルシフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図４】Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、およびＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの基質特異性を示す図である。
【図５】ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの温度依存性を示す図である。
【図６】反応緩衝液における塩化カルシウム濃度へのＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの依存性を示す図である。
【図７】一定量のＭＬｕｃ７および異なるセレンテラジン濃度でのＭＬｕｃ７の生物発光測定値を示す図である。
【図８】３つの異なるセレンテラジンでのＭＬｕｃ７生物発光反応の動態を示す図である。
【図９】３つの異なるセレンテラジンでのＬｕ１６４生物発光反応の動態を示す図である。
【図１０】１．５秒間の積分時間による、３００秒間の測定についてのＭＬｕｃ７（黒色）およびＬｕ１６４（灰色）の生物発光測定の結果を示す図である。
【図１１】一定基質濃度および細胞上清の希釈による減少性Ｍｌｕｃ７濃度でのＭＬｕｃ７の生物発光測定の結果を示す図である。
【図１２】一定基質濃度および細胞上清の希釈による減少性Ｌｕ１６４濃度でのＬｕ１６４の生物発光測定の結果を示す図である。
【図１３】各場合１０秒間の積分時間の区分におけるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す図である。
【図１４】３００秒間の積分時間によるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４の生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す図である。
【図１５】各場合６０秒間の積分時間の区分におけるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す図である。
【図１６】発生段階の関数としてメトリディア・ロンガ種の個体により好まれる水深を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
本発明は特に、以下に関する：
１．以下からなる群より選択される核酸分子：
ａ）配列番号２により開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号１に示された配列を含む核酸分子；
ｃ）相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ルシフェラーゼをコードする核酸分子；核酸分子のストリンジェントなハイブリダイゼーションは、例えば、６８℃で０．２×ＳＳＣ（１×標準生理食塩水−クエン酸＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）を含む水溶液中で行うことができる（Sambrookら、1989）；
ｄ）遺伝暗号の縮重によりｃ）の下の核酸分子とは異なる核酸分子；
ｅ）配列が配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９８％、９９％同一であり、タンパク質産物がルシフェラーゼである核酸分子；
ｆ）配列が配列番号１と少なくとも６５％同一であり、ルシフェラーゼをコードする核酸分子；
ｇ）機能性ルシフェラーゼをコードする、ａ）〜ｆ）に記載の核酸分子の断片。
【０１１８】
２．発光タンパク質をコードする配列の５’側に機能性プロモーターを含む、ポイント１に記載の核酸。
【０１１９】
３．ポイント２に記載の核酸を含む、組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター。
【０１２０】
４．ポイント３に記載のベクターを含む、生物。
【０１２１】
５．ポイント１に記載の核酸分子の部分配列と同一または相補的である１０個を超える連続したヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【０１２２】
６．ポイント１に記載の核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【０１２３】
７．細菌、真核細胞、またはインビトロ発現系においてポイント６に記載のルシフェラーゼポリペプチドを発現させる方法。
【０１２４】
８．ポイント６に記載のルシフェラーゼポリペプチドを精製／単離する方法。
【０１２５】
９．ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに対する抗体によって免疫学的に認識される５個を超える連続したアミノ酸を有するペプチド。
【０１２６】
１０．マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての、ポイント１〜３に記載のルシフェラーゼをコードする核酸の使用。
【０１２７】
１１．マーカーまたはレポーターとしての、ポイント６に記載のルシフェラーゼの使用。
【０１２８】
１２．ポイント６に記載のルシフェラーゼを特異的に認識する抗体。
【０１２９】
１３．ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに加えて少なくとも１つのさらなるレポーター遺伝子が用いられる、ポイント１０または１１に記載の使用。
【０１３０】
１４．さらなる（１つまたは複数の）レポーター遺伝子が分泌型および／または細胞性ルシフェラーゼである、ポイント１３に記載の使用。
【０１３１】
１５．さらなる（１つまたは複数の）レポーター遺伝子が分泌型ルシフェラーゼである、ポイント１４に記載の使用。
【０１３２】
１６．さらなる（１つまたは複数の）レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼまたはメトリディア・ロンガ生物由来のルシフェラーゼである、ポイント１４に記載の使用。
【０１３３】
１７．さらなる分泌型ルシフェラーゼが、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２からなる群より選択されるルシフェラーゼである、ポイント１５に記載の使用。
【０１３４】
１８．発光測定値が動態学的に評価される、ポイント１０、１１、または１３に記載の方法。
【０１３５】
１９．複数の標的タンパク質が測定される、ポイント１０、１１、１３、または１８に記載の方法。
【０１３６】
２０．発光反応の動態学的特性が変化している、ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体。
【０１３７】
２１．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸２３〜７８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【０１３８】
２２．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸２３〜７８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【０１３９】
２３．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜８８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【０１４０】
２４．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜８８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【０１４１】
２５．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜６８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【０１４２】
２６．ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜６８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【０１４３】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
配列番号１（ＭＬｕｃ７−ヌクレオチド配列−コーディング）
【０１４４】
【化３】
【０１４５】
これは以下のアミノ酸配列を生じる：
配列番号２（ＭＬｕｃ７−アミノ酸配列）
【０１４６】
【化４】
【０１４７】
配列番号３（Ｌｕ１６４−ヌクレオチド配列−コーディング）
【０１４８】
【化５】
【０１４９】
これは以下のアミノ酸配列を生じる：
配列番号４（Ｌｕ１６４−アミノ酸配列）
【０１５０】
【化６】
【０１５１】
配列番号５（ＭＬｕｃ７−ヌクレオチド配列−クローン化配列）
【０１５２】
【化７】
【０１５３】
図面の説明
図１ 図１はｐｃＤＮＡ３−ＭＬｕｃ７構築物のベクターマップを示す。
【０１５４】
図２ 図２はｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７構築物のベクターマップを示す。
【０１５５】
図３ 図３はアミノ酸レベルでの様々な分泌型ルシフェラーゼのアラインメントを示す。
【０１５６】
図４ 図４はＬｕ１６４、Ｌｕ２２、およびＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの基質特異性を示す。Ｘ軸：セレンテラジン、Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。各場合、ＣＨＯの一過性トランスフェクションからの同量の分泌型ルシフェラーゼを用いて、活性を決定した。セレンテラジンを並行して加え、これに続いて、測定を開始した。
【０１５７】
図５ 図５はＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの温度依存性を示す。Ｘ軸：℃での温度、Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。各場合、ＣＨＯの一過性トランスフェクションからの同量の分泌型ルシフェラーゼを用いて、活性を決定した。示された温度は反応温度に対応する。６０秒間の生物発光測定値の積分がプロットされている。
【０１５８】
図６ 図６は、反応緩衝液における塩化カルシウム濃度へのＭＬｕｃ７ルシフェラーゼの依存性を示す。Ｘ軸：ｍＭでのＫＣｌ濃度、Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。各場合、ＣＨＯの一過性トランスフェクションからの同量の分泌型ルシフェラーゼを用いて、活性を決定した。示された濃度は、反応緩衝液におけるＫＣｌの濃度に対応する。６０秒間の生物発光測定値の積分がプロットされている。
【０１５９】
図７ 図７は、一定量のＭＬｕｃ７および異なるセレンテラジン濃度でのＭＬｕｃ７の生物発光測定値を示す。Ｘ軸：μＭでのセレンテラジン濃度。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６０】
図８ 図は、３つの異なるセレンテラジンでのＭＬｕｃ７生物発光反応の動態を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。黒色：天然セレンテラジン、薄い灰色：セレンテラジンｆ、濃い灰色：セレンテラジンｉ。
【０１６１】
図９ 図は、３つの異なるセレンテラジンでのＬｕ１６４生物発光反応の動態を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。黒色：天然セレンテラジン、薄い灰色：セレンテラジンｆ、濃い灰色：セレンテラジンｉ。
【０１６２】
図１０ 図１０は、１．５秒間の積分時間による、３００秒間の測定についてのＭＬｕｃ７（黒色）およびＬｕ１６４（灰色）の生物発光測定の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６３】
図１１ 図１１は、一定基質濃度および細胞上清の希釈による減少性Ｍｌｕｃ７濃度でのＭＬｕｃ７の生物発光測定の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。四角形：希釈因子（非希釈上清から始まる）の表示および割り当て。
【０１６４】
図１２ 図１２は、一定基質濃度および細胞上清の希釈による減少性Ｌｕ１６４濃度でのＬｕ１６４の生物発光測定の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。四角形：希釈因子（非希釈上清から始まる）の表示および割り当て。
【０１６５】
図１３ 図１３は、各場合１０秒間の積分時間の区分におけるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６６】
図１４ 図１４は、３００秒間の積分時間によるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４の生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６７】
図１５ 図１５は、各場合６０秒間の積分時間の区分におけるＭｌｕｃ７およびＬｕ１６４生物発光測定値の動態学的評価の結果を示す。Ｘ軸：秒での時間。Ｙ軸：相対光単位（ＲＬＵ）。
【０１６８】
図１６ 図１６は、発生段階の関数としてメトリディア・ロンガ種の個体により好まれる水深を示す。Ｘ軸：メートル（ｍ）での水深；Ｙ軸：発生段階；黒色棒：２５〜６５ｍ、灰色棒：１０〜２５ｍ、白色棒：０〜１０ｍ。図は海洋データセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＵＳＡ）の情報による。
【実施例】
【０１６９】
例１
構築物の調製および使用
下記の構築物を調製するために用いられたベクターは、恒常的発現用のｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であった。細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を検出するために、ＭＬｕｃ７ ｃＤＮＡをｐＡＳＭベクターへクローン化した。ｐＡＳＭベクターは、ｃＡＭＰ濃度に応じてプロモーター活性を制御するｃＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）を含む。前記ベクターの誘導体をｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７と呼んだ。ｐｃＤＮＡ３ベクターの誘導体をｐｃＤＮＡ３−ＭＬｕｃ７と呼んだ。クローン化反応を、分子生物学的標準方法を用いて行った。真核生物系でＭＬｕｃ７を発現させるためにｐｃＤＮＡ３−Ｍｌｕｃ７ベクターおよびｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７ベクターを用いた。
【０１７０】
図１はｐｃＤＮＡ３−Ｍｌｕｃ７ベクターのプラスミドマップを示す。
【０１７１】
図２はｐＡＳＭ−ＭＬｕｃ７ベクターのプラスミドマップを示す。
【０１７２】
例２
真核生物発現
一過性実験においてＣＨＯ細胞に発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＭＬｕｃ７、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、およびｐｃＤＮＡ３（ｃＤＮＡ挿入断片を含まない）をトランスフェクトすることにより、恒常的真核生物発現を行った。この目的を達成するために、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中１ウェルあたり１０，０００個の細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートに蒔き、３７℃で一晩、インキュベートした。トランスフェクションを、Ｆｕｇｅｎｅ ６キット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造会社の使用説明書に従って行った。トランスフェクトされた細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中、３７℃で一晩、インキュベートした。基質の添加後、イメージング系を用いて生物発光を測定した。希釈された上清を以下の組成を有する緩衝液Ａ（ｐＨ７．４）中で測定した：１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、および５ｍＭ ＮａＨＣＯ３。
【０１７３】
トランスフェクトされた細胞を２ｍｇ／ｍｌジェネテシンで選択し、クローンおよび上清の生物発光活性をそれぞれ決定することにより安定な細胞系を調製した。
【０１７４】
例３
配列比較
分泌型ルシフェラーゼの配列を比較し示すことができるように、アミノ酸配列アラインメントを行った。図３は、アミノ酸レベルでの分泌型ルシフェラーゼのアラインメントを示す。ウミホタルルシフェラーゼについては、その他のルシフェラーゼとの配列同一性が低すぎるため、アラインメントに含めなかった。
文献／特許
【０１７５】
【表２】
【０１７６】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される核酸分子：
ａ）配列番号２により開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号１に示された配列を含む核酸分子；
ｃ）相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ルシフェラーゼをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝暗号の縮重によりｃ）の下の核酸分子とは異なる核酸分子；
ｅ）配列が配列番号１と少なくとも９５％同一であり、タンパク質産物がルシフェラーゼである核酸分子；
ｆ）配列が配列番号１と少なくとも６５％同一であり、ルシフェラーゼをコードする核酸分子；
ｇ）機能性ルシフェラーゼをコードする、ａ）〜ｆ）による核酸分子の断片。
【請求項２】
発光タンパク質をコードする配列の５’側に機能性プロモーターを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含む、組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む、真核細胞もしくは原核細胞、または非ヒト生物。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子の部分配列と同一または相補的である、１０個を超える連続したヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項７】
細菌、真核細胞、またはインビトロ発現系において請求項６に記載のルシフェラーゼポリペプチドを発現させる方法。
【請求項８】
請求項６に記載のルシフェラーゼポリペプチドを精製／単離する方法。
【請求項９】
ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに対する抗体によって免疫学的に認識される、５個を超える連続したアミノ酸を有するペプチド。
【請求項１０】
マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての、請求項１から３に記載のルシフェラーゼをコードする核酸の使用。
【請求項１１】
マーカーまたはレポーターとしての、請求項６に記載のルシフェラーゼの使用。
【請求項１２】
請求項６に記載のルシフェラーゼを特異的に認識する抗体。
【請求項１３】
ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに加えて少なくとも１つのさらなるレポーター遺伝子が用いられる、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１４】
さらなる１つまたは複数のレポーター遺伝子が分泌型および／または細胞性ルシフェラーゼである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
さらなる１つまたは複数のレポーター遺伝子が分泌型ルシフェラーゼである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
さらなる１つまたは複数のレポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼまたはメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）生物由来のルシフェラーゼである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
さらなる分泌型ルシフェラーゼが、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２からなる群より選択されるルシフェラーゼである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
発光測定値が動態学的に評価される、請求項１０、１１、または１３に記載の方法。
【請求項１９】
複数の標的タンパク質が測定される、請求項１０、１１、１３、または１８に記載の方法。
【請求項２０】
発光反応の動態学的特性が変化している、ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体。
【請求項２１】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸２３〜７８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【請求項２２】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸２３〜７８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【請求項２３】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜８８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【請求項２４】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜８８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【請求項２５】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜６８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【請求項２６】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜６８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【請求項１】
以下からなる群より選択される核酸分子：
ａ）配列番号２により開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号１に示された配列を含む核酸分子；
ｃ）相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ルシフェラーゼをコードする核酸分子；
ｄ）遺伝暗号の縮重によりｃ）の下の核酸分子とは異なる核酸分子；
ｅ）配列が配列番号１と少なくとも９５％同一であり、タンパク質産物がルシフェラーゼである核酸分子；
ｆ）配列が配列番号１と少なくとも６５％同一であり、ルシフェラーゼをコードする核酸分子；
ｇ）機能性ルシフェラーゼをコードする、ａ）〜ｆ）による核酸分子の断片。
【請求項２】
発光タンパク質をコードする配列の５’側に機能性プロモーターを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含む、組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む、真核細胞もしくは原核細胞、または非ヒト生物。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子の部分配列と同一または相補的である、１０個を超える連続したヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項７】
細菌、真核細胞、またはインビトロ発現系において請求項６に記載のルシフェラーゼポリペプチドを発現させる方法。
【請求項８】
請求項６に記載のルシフェラーゼポリペプチドを精製／単離する方法。
【請求項９】
ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに対する抗体によって免疫学的に認識される、５個を超える連続したアミノ酸を有するペプチド。
【請求項１０】
マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての、請求項１から３に記載のルシフェラーゼをコードする核酸の使用。
【請求項１１】
マーカーまたはレポーターとしての、請求項６に記載のルシフェラーゼの使用。
【請求項１２】
請求項６に記載のルシフェラーゼを特異的に認識する抗体。
【請求項１３】
ＭＬｕｃ７ルシフェラーゼに加えて少なくとも１つのさらなるレポーター遺伝子が用いられる、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１４】
さらなる１つまたは複数のレポーター遺伝子が分泌型および／または細胞性ルシフェラーゼである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
さらなる１つまたは複数のレポーター遺伝子が分泌型ルシフェラーゼである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
さらなる１つまたは複数のレポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼまたはメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）生物由来のルシフェラーゼである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
さらなる分泌型ルシフェラーゼが、Ｌｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、およびＬｕ５２からなる群より選択されるルシフェラーゼである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
発光測定値が動態学的に評価される、請求項１０、１１、または１３に記載の方法。
【請求項１９】
複数の標的タンパク質が測定される、請求項１０、１１、１３、または１８に記載の方法。
【請求項２０】
発光反応の動態学的特性が変化している、ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体。
【請求項２１】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸２３〜７８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【請求項２２】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸２３〜７８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【請求項２３】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜８８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【請求項２４】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜８８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【請求項２５】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜６８位の領域における改変または欠失を有し、発光反応の動態学的特性が変化している、突然変異体または誘導体。
【請求項２６】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、Ｌｕ２２、ＬｕＡＬ、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ１６、Ｌｕ５２、およびガウシアルシフェラーゼからなる群より選択されるルシフェラーゼの突然変異体または誘導体であって、アミノ酸１３〜６８位の領域における改変または欠失、および発光反応の変化した生化学的または物理化学的特性を有する、突然変異体または誘導体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５１７５４３（Ｐ２０１０−５１７５４３Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４８６０３（Ｐ２００９−５４８６０３）
【出願日】平成２０年１月２６日（２００８．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０００６２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９５６２２
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０４１３２０８７）アクザム ソシエタ ペル アチオニ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２６日（２００８．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０００６２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９５６２２
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０４１３２０８７）アクザム ソシエタ ペル アチオニ (5)
【Ｆターム（参考）】
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