初代肝細胞の機能を維持する環境
細胞培養に有用な表面は、ＣＡＲ材料が結合している支持体と、そのＣＡＲ材料に結合しているエラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、およびコラーゲンＶＩのようなＥＣＭタンパク質、または生物学的に活性なその断片もしくは変異体とを含む。また、活性因子、好ましくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）もしくはポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）のようなポリカチオン性ポリマーまたは生物学的に活性なその断片もしくは変異体が任意選択でその表面上に存在する。この表面は細胞培養に使用され、初代肝細胞の細胞の付着、生存、機能の維持、および／または増殖を促進する。本発明は、細胞の付着、生存、機能の維持、および／または増殖のための方法のように、この表面を利用する方法にも関する。無血清培地と共に細胞培養にその表面を使用することをさらに開示する。本発明の表面を使用するスクリーニング方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代肝細胞を培養するために有用な表面およびそれらの表面を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養のために概して血清を補充した培養培地に細胞を分散させ、次にその培養培地を組織培養等級ポリスチレン（ＰＳ）のような細胞培養用合成基材でできた容器に分注する。これらの条件で、ＰＳ表面へのタンパク質の非特異的吸着が速やかに起こり、ほぼ天然から高度に変性したものまで一連のコンホメーション状態の多くの異なる血清タンパク質からなるタンパク質層が発生する。静置培養において細胞はその後表面に沈降し、それらの表面の細胞インテグリン、プロテオグリカンおよびセレクチンを介して、このあまり組織化されていない界面に「応答指令信号」を送り始める。このランダムに吸着したタンパク質層との相互作用によって、細胞付着（または接着）、拡散、増殖、移動および分化を含めた多様なプロセスに影響する任意の生物学的応答がもたらされる。それに反して、ｉｎ ｖｉｖｏでは特異的で組織化されたリガンド−受容体相互作用を介して通常の生物学的反応が生じ、その相互作用は、順番に高度に組織化されたシグナル伝達プロセスを誘発する。
【０００３】
このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養時に細胞の所望の生物学的活性をより効果的に支えるために生物学的イベントのｉｎ ｖｉｖｏ特異性を模倣する高度に画定した細胞培養表面の必要がある。
【０００４】
細胞培養に従来使用される血清は、血清のロットによって変動する特定できないタンパク質混合物を含み、さらに望ましくない煩雑さを生み出しうる。例えば細胞がヒトにおける細胞療法のようなｉｎ ｖｉｖｏ使用のために調製されるとき、培養に血清を先行して使用することによって、細胞調製物に（１）生物学的有害物質および（２）レシピエントに望ましくない免疫応答を誘導できる動物成産物を導入することがある。
【０００５】
このように、培養時に血清と同様の利益をもたらす無血清の化学的に画定した培養培地を採用する細胞培養方法の必要がある。初代肝細胞に関して無血清細胞培養およびその方法のさらなる必要があり、初代肝細胞の多くはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養すると自然の機能のいくつかを失う。例えば初代肝臓細胞は、健康細胞の機能であるタンパク質アルブミンを生成する能力を失っている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６１２９９５６号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１０／２５９７９７号明細書
【特許文献３】米国特許出願第１０／２６０７３７号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１０／２５９８１５号明細書
【特許文献５】米国特許出願第１０／６４１２８６号明細書
【特許文献６】米国特許出願第１０／６６０７８１号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１０／２５９８１７号明細書
【特許文献８】米国特許第４７８９６０１号明細書
【特許文献９】米国特許第４８２２７４１号明細書
【特許文献１０】米国特許第４８３９２８０号明細書
【特許文献１１】米国特許第６０３７１４１号明細書
【特許文献１２】米国特許第６０４８７２３号明細書
【特許文献１３】米国特許第６２１８１７８号明細書
【特許文献１４】米国特許第６０５７１５０号明細書
【特許文献１５】米国特許第６１０７０８１号明細書
【特許文献１６】米国特許出願第１０／６６０７６０号明細書
【特許文献１７】米国特許出願第１０／６６０７５９号明細書
【特許文献１８】米国特許出願第１０／２５９８１６号明細書
【特許文献１９】米国特許第６０４３０９２号明細書
【非特許文献１】E. D. Hay, ed., Cell Biology of Extracellular Matrix, 2nd ed., Plenum Press, New York, 1991
【非特許文献２】Chen et al. (2000), Advanced Materials 12: 455-457
【非特許文献３】Hubbell, J. A., Biomaterials in Tissue Engineering, Biotechnology, 1995. 13: p. 565-76
【非特許文献４】Cytochrome P450, Structure, Mechanism and Biochemistry, 2nd edition, Edt Paul R. Oritz de Montellano, Plenum Press, New York and London, 1995
【非特許文献５】Block GD, Locker J, Bowen WC, Petersen BE, Katyal S, Strom SC, Riley T, Howard TA, Michalopoulos GK, Population expansion, clonal growth, and specific differentiation patterns in primary cultures of hepatocytes induced by HGF/SF, EGF and TGF alpha in a chemically defined (HGM) medium, J Cell Biol. 1996 Mar; 132(6): 1133-49
【非特許文献６】J Steroid Biochem Mol Biol. 2000 Sep; 74(1-2): 57-62
【非特許文献７】J Cell Biol. 1980 Oct; 87(1): 255-63
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、とりわけ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質および活性因子を含む高度に画定した細胞培養表面を提供することによって上記の必要を満たすことを意図する。これらの新しい表面の利点の中には、それらの表面がｉｎ ｖｉｔｒｏで血清濃度の減少または血清の完全な回避を可能にすることがある。
【０００８】
哺乳動物細胞、特に初代肝細胞の培養に適した組成物および方法を提供することが本発明の目的である。本発明に使用するのに好ましい細胞は、初代肝臓細胞のような肝細胞である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料、ならびにそのＣＡＲ材料に結合した１つもしくは複数のＥＣＭタンパク質またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体、および任意選択で１つもしくは複数の活性因子またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、細胞培養に使用するために特に適した表面を提供する。「生物学的に活性な」とは、その断片または変異体が細胞の付着の促進および機能の維持に完全長未修飾ＥＣＭタンパク質または活性因子と本質的に同じ活性を有することを意味する。細胞の「付着」は、細胞が従来の洗浄または取り扱い手順によって溶離しないような、表面への細胞の結合を意味する。
【００１０】
「機能を維持」または「機能状態を維持」するとは、細胞が例えば予想される形態および正常な代謝活性（例えば酵素活性、タンパク質および／またはＲＮＡの生成、ビリルビン分泌、アルブミン分泌、薬物輸送など）を含めた正常な細胞活性および特徴を表すことを意味する。状況に応じて、１つまたは複数のそのような特徴および当業者に公知の他の特徴を細胞が機能的に維持されているかの指標として使用してもよい。好ましい実施形態では、細胞はアルブミンを生成し、および／またはチトクロムＰ４５０活性を維持する。
【００１１】
「ＥＣＭタンパク質」とは、細胞の付着および成長を仲介するために使用できる細胞外マトリックスタンパク質を意味する。（ＥＣＭタンパク質のさらなる記述については非特許文献１を参照のこと）。本方法におけるＥＣＭタンパク質の例には、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、およびコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、またはコラーゲンＶＩのようなコラーゲンがある。特に好ましいのはエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩである。最も特に好ましいのはコラーゲンＩおよびコラーゲＩＶである。
【００１２】
好ましい実施形態では、活性因子はＥＣＭタンパク質と共に細胞に提示されたときに細胞の付着、生存または機能を促進する天然もしくは非天然ポリカチオン性ポリマー、またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体である。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）またはポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）のようなポリカチオン性ポリマーを使用できる。特に好ましい実施形態では、活性因子はポリ−Ｌ−リジンおよびポリ−Ｄ−オルニチンである。
【００１３】
本発明者らは、驚くことに本表面が従来の条件を使用した標準的な培養表面（例えば血清を有するか、または有さないかのいずれかである市販の培養培地を使用した従来の組織培養用ポリスチレン上でのインキュベーション）と同様に、そしてしばしばそれよりも良好に初代肝細胞の付着および機能の維持を促進することを見出した。追加的に、ある組合せのＥＣＭタンパク質および／または活性因子（ＥＣＭタンパク質組成物）は、他の組合せよりもよく細胞の付着および機能を促進した。これらの改善した効果は、化学的に画定した無血清培地を使用して好ましくは成し遂げられる。
【００１４】
本発明の利点には、以下がある：
１）画定した哺乳動物細胞培養条件の使用（それは、培養基材上に層を形成している非特異的（ランダムおよび任意に）吸着した血清タンパク質よりもむしろ細胞培養基材に結合しているＥＣＭタンパク質により制御される細胞付着プロセスを可能にし、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のようにキャラクタリゼーションされていない未精製の他の動物性製品を使用する必要を減らす）、
２）特異的細胞プロセスを特異的ＥＣＭに起因するとする能力（それによって、従来の血清補充培養培地に存在する他の生物学的因子と混ざったＥＣＭタンパク質の生物学的作用が排除される）、
３）（受動吸着しているよりもむしろ）表面に付着した共有結合しているＥＣＭおよび／または活性因子の使用（それによって、基材へのＥＣＭおよび／または活性因子が限定され、液相（培養培地）への脱着を防止し、受動的コーティング上の可溶性ＥＣＭおよび／または活性因子が懸濁細胞上の付着部位を遮断するのを防止することによって細胞の付着も増加する）、ならびに
４）血清が大きく減少または除去されることから、規制認可をより速やかに獲得する能力（それは、生物学的有害物質、免疫原性産物またはさもなければ有害な産物を排除または大きく減少させる）。
【００１５】
本発明の一態様は、（ａ）細胞接着抵抗性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（または抵抗性（ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ））（ＣＡＲ）材料、ならびに（ｂ）そのＣＡＲ材料に結合している１つもしくは複数のＥＣＭタンパク質または生物学的に活性なその断片もしくは変異体、および任意選択で１つもしくは複数の活性因子または生物学的に活性なその断片もしくは変異体を含む表面である。ＥＣＭタンパク質の例は、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶもしくはコラーゲンＶＩのようなコラーゲンである。特に好ましくはコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩである。
【００１６】
本明細書において使用する用語「ＣＡＲ材料」は、表面に存在する場合に支持体への細胞または細胞表面にみられるタンパク質もしくはポリペプチドの非特異的結合（接着）を防止、阻害、または低減する材料を指す。ＣＡＲ材料および表面は、哺乳動物細胞に抵抗性であり、好ましくは微生物にも抵抗性である。ＣＡＲ材料および表面は、時に「非汚損基材」、「不活性コーティング」、「低親和性試薬」、または「非接着性コーティング」と称される。ＣＡＲ材料の例には、ヒアルロン酸（ＨＡ）もしくはその誘導体、アルギン酸（ＡＡ）もしくはその誘導体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリムもしくはその誘導体、ポリプロピルアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、またはこれらの化合物の組合せがある。好ましくはＣＡＲ材料はＨＡである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプロテオグリカン、ビグリカン、グリコサミノグリカン、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）をＣＡＲ材料に結合させてもよい。
【００１８】
ＥＣＭタンパク質および活性因子を、ＣＡＲ表面に共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合させてもよいが、好ましくは共有結合させる。
【００１９】
一実施形態では、支持体を酸化プラズマで処理すること、およびその処理された支持体にＣＡＲ材料を結合させることによって、ＣＡＲ材料をその支持体に付着させる。別の実施形態では、支持体を酸化プラズマで処理すること、アミノ基を有するポリカチオン性ポリマーにその処理された支持体を曝露し中間層を形成させること、およびその中間層にＣＡＲ材料を結合させることによって、ＣＡＲ材料をその支持体に付着させる。好ましくはポリカチオン性ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）である。（例えばＭｏｒｒａらの特許文献１を参照のこと）。
【００２０】
支持体は、天然もしくは合成有機ポリマーまたは無機コンポジットであってもよい。適切な支持体にはポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリラクチド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）もしくは他のケイ素ベースのポリマー、セルロース、ガラスまたはセラミックがある。好ましくは支持体はＰＳである。
【００２１】
本発明は、選択的な細胞の付着および機能に有用なＥＣＭ修飾ポリマー組成物を製造するための方法も含み、その方法は、（ａ）ポリマー表面を提供する段階と、（ｂ）前記表面を処理してＣＡＲ表面を生成させる段階と、（ｃ）前記ＣＡＲ表面を、細胞の付着および機能を促進する少なくとも１つのＥＣＭタンパク質および任意選択で活性因子で処理する段階とを含み、それにより前記タンパク質および活性因子がそれに共有結合するようになることによって、前記ＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させる。
【００２２】
本発明は、肝細胞の付着または機能の維持を促進するために有用な細胞接着促進（ＣＡＰ）ＥＣＭ修飾組成物も含み、その組成物は、１つまたは複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が共有結合して修飾されたＣＡＰ表面を形成している細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料でできている／作られたポリマー表面を含み、そのタンパク質／表面は、（ａ）前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面に実質的に付着しない細胞の付着、および（ｂ）任意選択で、ＥＣＭ修飾表面に付着し、前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面に及ぼす機能を実質的に維持しない細胞の機能の維持を促進する。
【００２３】
本発明は、上記または本明細書のどこか他に記載するような本発明の表面および細胞を含む細胞培養も目的とする。スライド、マルチウェル平板、培養皿、培養フラスコ、培養瓶などのような細胞培養容器で培養物を成長させることができる。フレキシブル基材または三次元（３Ｄ）足場に培養物を成長させることもできる。好ましい一実施形態では、細胞は肝細胞、特にヒト初代肝細胞である。特に好ましい実施形態では、チトクロムＰ４５０酵素、特にＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性が細胞において維持されている。
【００２４】
本発明の別の態様は、培養中の初代肝細胞の付着および機能の維持を促進するための方法である。その方法は、培養培地中の細胞を、その細胞の付着および機能の維持に効果的な条件で本発明の表面と接触させることを含む。表面の例は、（ａ）ＣＡＲ材料が結合している支持体、および（ｂ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質（またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体）を含むものである。本方法におけるＥＣＭタンパク質の例には、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ならびにコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩのようなコラーゲンがある。また、ＣＡＲ表面に任意選択で結合しているのは、（ｃ）１つまたは複数の活性因子、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）またはポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）のようなポリカチオン性ポリマーである。ＣＡＲ表面に結合している活性因子の添加は、ＣＡＲ表面に付着したＥＣＭタンパク質組成物を生み出す。
【００２５】
好ましい実施形態では、本方法は、ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合しているＣＡＲ材料を含むことによって細胞接着促進表面を形成しているポリマー表面を提供すること、および（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすることを含み、それにより肝細胞が表面に付着して機能状態に維持されることを含む。特に好ましい一実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される。
【００２６】
本発明の別の態様は、培養初代肝細胞の付着または機能を刺激または阻害する被験薬剤を同定するための方法であり、その方法は、（ａ）培養培地中の細胞を本発明の表面および被験薬剤と接触させること、（ｂ）これらの細胞の付着および機能を、被験試料を有さない対照細胞の付着および機能と比較して測定することを含む。被験薬剤の存在下で増加した付着または機能は、細胞の付着または機能を刺激する因子が存在することを示し、被験薬剤の存在下で減少した付着および機能は、細胞の付着および機能を阻害する因子が存在することを示す。この方法を、薬物の潜在的な標的を同定するため、細胞の性質に及ぼす薬剤の効果を決定するため、または潜在的薬剤が細胞に有毒であるかどうかを決定するためなどに使用できる。
【００２７】
一実施形態では、本方法は、（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合しているＣＡＲ材料を含むことによって細胞接着促進表面を形成しているポリマー表面を提供する段階、（ｂ）前記肝細胞を、前記細胞の成長／維持を支える培地中で前記表面上で培養する段階であって、被験薬剤はその培地に含まれるか、またはその表面に結合している段階、（ｃ）培養の開始後の時間ｔで特異的細胞機能を定量する段階、および（ｄ）段階ｃで得られた値を前記被験薬剤の非存在下で実施された同一の培養における値と比較する段階であって、被験薬剤存在下での値の増加は前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、減少は前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示す段階を含む。培養物中の酵素活性の総レベル、その特徴（例えば形態または染色）を表す細胞数のように当業者に公知の任意の手段によって特異的細胞機能を定量できる。培養を開始後の一定時間での一時点を測定でき、また変化速度を決定するために２つ以上の時点を測定できる。
【００２８】
被験薬剤を同定するときに測定する適切な特徴には、形態、酵素活性、タンパク質の産生、ＲＮＡの産生、ビリルビン分泌、アルブミン分泌、および薬物輸送がある。
【００２９】
当業者に明らかであろうように、本発明により培養された肝細胞を細胞療法に適した装置または足場の中または上に収容させてもよい。
【００３０】
上述の実施形態および本明細書全体は、初代肝細胞を用いた使用に特に好ましい。使用できる肝細胞の種類には、任意の種からの初代肝臓細胞がある。ラットおよびヒトの初代肝臓細胞を本明細書に記載する。
【００３１】
本発明の実施形態では、培養培地に血清を補充できるが、好ましくは培養培地は無血清である。適切な画定した無血清培地であるＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地を本明細書に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、新規な細胞培養表面を使用して初代肝細胞における薬物代謝酵素のレベルを維持する。細胞の挙動および機能は、細胞に作用する環境シグナルに関係する。本明細書に記載した新規な表面は、代謝酵素の持続性発現に必要なシグナルを提供する。
【００３３】
本発明の表面は、ＣＡＲ性質を有する固体の、好ましくはポリマーの支持体を含む。その支持体は、任意の多様な形をとることができる。その支持体は、正方形、長方形、円形または多角形のような任意の適切な形状であることができ、二次元または三次元であることができる。その支持体は、天然ポリマー、合成ポリマーおよび無機コンポジットを含めた任意の多様な材料でできていることができる。天然ポリマーには、例えばコラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ベースの材料がある。合成ポリマーには、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびそれらの共重合体（ＰＧＬＡ）のようなポリａ−ヒドロキシ酸、ポリ（オルトエステル）、ポリウレタン、ならびにポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリＨＥＭＡ）またはポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体のようなヒドロゲルがある。天然由来ポリマー材料および合成ポリマー材料を含有するハイブリッド材料も使用できる。そのような材料の非限定的な例は、非特許文献２に開示されている。無機コンポジットには、例えばリン酸カルシウムセラミック、バイオガラスおよび生体活性ガラス−セラミック、特にカルシウムヒドロキシアパタイトとケイ素安定化リン酸トリカルシウムとを組み合わせたコンポジットがある。好ましい支持体の中には、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリ−またはポリテトラ−フルオロエチレン、ポリヘキサフルオロプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニリジンフルオリド、ポリラクチド、セルロース、ガラス、またはセラミックがある。好ましい実施形態では、支持体はＰＳ組織培養皿またはマルチウェル平板のような組織培養容器の部分である。
【００３４】
あるいは、例えば当技術分野で公知であり特許文献２に記載されているプラズマ処理を使用して表面を処理できる。その多くが当業者に公知である任意の適切なＣＡＲ材料を支持体に結合させることができる。典型的なＣＡＲ材料には、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその誘導体、アルギン酸（ＡＡ）またはその誘導体、ポリ−ＨＥＭＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリムまたはその誘導体、ポリプロピルアクリルアミド、およびポリイソプロピルアクリルアミドがある。ＣＡＲ材料の組合せも使用できる。好ましい実施形態では、ＣＡＲ材料はＨＡである。
【００３５】
ＣＡＲ材料は、共有結合によって支持体に好ましくは結合している。多様な種類の共有結合を形成でき、そのいくつかは、同時係属の、本願の譲受人に譲渡された米国特許出願明細書であり、そのすべてが本明細書によって参照により組み込まれているＡｎｄｒｅａ Ｌｉｅｂｍａｎｎ−ＶｉｎｓｏｎおよびＲ．Ｃｌａｒｋによる２００２年９月３０日出願の特許文献２、Ｍｏｈａｍｍａｄ Ａ．ＨｅｉｄａｒａｎおよびＭａｒｙ Ｋ．Ｍｅｙｅｒによる「Method and Apparatuses for the Integrated Discovery of Cell Culture Environments」という名称で２００３年９月３０日出願の特許文献３、Ｊｏｈｎ Ｊ．Ｈｅｍｐｅｒｌｙによる「Proliferation and Differentiation of Stem Cell from Bone Marrow and Other Cells Using Extracellular Matrix and other Molecules」という名称で２００２年９月３０日出願の特許文献４、２００３年８月１５日出願の特許文献５、および２００３年９月１２日出願の特許文献６に、より詳細に論じられている。これらの出願は、結合したＣＡＲ材料およびＥＣＭタンパク質を有する支持体を含む表面を製造および使用する他の態様も開示する。
【００３６】
一実施形態では、１つまたは複数のＥＣＭタンパク質（または生物学的に活性なその断片もしくは変異体）および任意選択で１つまたは複数の活性因子（生物学的に活性なその断片または変異体）をＣＡＲ材料に結合させる。以下の組合せ：コラーゲンＩ＋ポリ−Ｌ−オルニチン（ＣＡＲ Ａ）、およびコラーゲンＩＶ＋ポリ−Ｌ−オルニチン（ＣＡＲ Ｂ）、およびコラーゲンＶＩおよびエラスチンが好ましい。これらを、例えばヒアルロン酸または他のＣＡＲ表面に結合させてもよい。
【００３７】
ＥＣＭタンパク質は、天然ポリペプチド（タンパク質）、組換えポリペプチド、または合成もしくは半合成ポリペプチドの形態、あるいはそれらの任意の組合せの形であることができる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【００３８】
ＥＣＭタンパク質のようなポリペプチドのクローニング、発現および精製を行う方法は、合成または半合成ポリペプチドを発生させる方法のように従来法である。ＥＣＭタンパク質を市販の供給源から得ることもできる。
【００３９】
他のＥＣＭタンパク質および活性因子の生物学的に活性な断片または変異体もＣＡＲ材料に結合させることができる。本明細書に使用する用語「生物学的に活性な断片または変異体」は、野生型ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを含む。例えば、（ＥＣＭタンパク質の）生物学的に活性な断片または変異体は、ＣＡＲ材料と結合できる一方で、本発明の方法に使用したときに細胞の付着および機能を促進する能力を保持しているものである。
【００４０】
ＣＡＲ表面に結合するための、および本明細書における使用のための好ましいＥＣＭタンパク質には、エラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩがある。好ましい活性因子には、ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−オルニチンがある。
【００４１】
ＥＣＭタンパク質および活性因子を共有結合または非共有結合（例えば静電力、イオン結合もしくは水素結合、親水性相互作用もしくは疎水性相互作用、ファンデルワールス力などのような受動吸着）のいずれかでＣＡＲ材料に結合させることができる。好ましい実施形態では、その結合は共有結合である。同時係属の特許文献２、特許文献３および特許文献４は、ＣＡＲ表面への分子のそのような共有結合について記載している。
【００４２】
ＣＡＲ材料が支持体に結合し、かつＥＣＭタンパク質がそのＣＡＲ材料に結合している表面を製造する方法は、同時係属の特許文献２、特許文献３および特許文献４に詳細に記載されている。簡潔には、支持体にＣＡＲ材料を付着させる一方法は、酸化プラズマでその支持体を処理すること、およびその処理後の支持体にＣＡＲ材料を結合させることを含む。支持体にＣＡＲ材料を付着させる別の方法は、酸化プラズマでその支持体を処理すること、その処理後の支持体に、（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）、ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）またはポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ）、好ましくはＰＥＩまたはＰＬＬのような）アミノ基を有するポリカチオン性ポリマーを曝露して中間層を形成させること、およびその中間層にＣＡＲ材料を結合させることを含む。ＣＡＲ材料にＥＣＭまたはポリカチオン性ポリマーを結合させる方法は、従来法である。これらには、例えば過酸化ナトリウムによる酸化および還元アミノ化などがある。
【００４３】
本発明の特定の実施形態では、Ｍｏｒｒａらの特許文献１に記載しているような方法を使用してＨＡをＰＳに結合させてＣＡＲ表面を生み出すことができる。ポリスチレン培養皿、９６ウェル平板またはスライドに酸化高周波プラズマ処理を受けさせ、その後ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液を曝露して表面に反応性アミン基を導入する。カルボジイミド／スクシンイミドが支える一次アミンとカルボン酸との縮合反応を使用してＰＥＩコーティングと多糖との間に共有結合を形成させる。あるいは、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）プラズマ処理中にポリスチレン表面に導入されたか、または（ＰＥＩの代わりに）ポリリジンコーティング上に導入されたアミン基を使用できる。
【００４４】
次に、過酸化ナトリウム酸化および還元アミノ化を含めた従来の生物コンジュゲーション法を使用して不活性ＨＡにＥＣＭタンパク質を共有結合的に連結する。任意の非共有結合的に付着した細胞外マトリックスタンパク質を塩−酸洗浄によって除去し、その後水で厳密にすすぐ。このプロセスによって、ＨＡによって提供される非汚損性（＝非特異的細胞付着を除去した）バックグラウンドに共有結合的に固定化された細胞外マトリックスタンパク質からなる十分に画定した表面が生み出される。
【００４５】
あるいは、アルギネート（アルギン酸としても知られる）を非接着性バックグラウンドとして使用でき、ＥＣＭタンパク質をＨＡに関して上述したのと同じ化学反応を使用してこの表面に固定化できる。また、ポリ−ＨＥＭＡまたは（ＰＥＯとしても知られている）ＰＥＧのような他の一般に知られている非接着性表面を、文献に記載されている、ＥＣＭタンパク質を連結するための多様な化学反応と組み合わせて使用できるであろう（非特許文献３を参照）。
【００４６】
多様な物品が本発明の表面を含むことができる。適切な物品は当業者に明らかであろう。そのような物品には、スライド（例えば組織スライド、顕微鏡スライドなど）、平板（例えばマイクロプレートを含めた培養平板またはマルチウェル平板）、フラスコ（例えば静置フラスコまたはスピナーフラスコ）、瓶（例えばローラーボトル）、バイオリアクターなどのような細胞培養容器がある。
【００４７】
より旧来の上記の二次元培養表面および培養容器以外に、本発明はＥＣＭタンパク質と共に本発明の組成物を（候補ペプチドがＣＡＲ表面上にあるときにＣＡＰ活性に関してそれらのペプチドを試験することを含めて）使用するための三次元（３Ｄ）足場の使用を含む。「三次元足場」は、本明細書においてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏいずれかの最初の細胞付着およびその後の組織形成に使用できる３Ｄ有孔テンプレートを指す。本発明による３Ｄ足場は、天然ポリマー、合成ポリマー、無機コンポジットおよびこれらの材料の組合せのような母材、ＣＡＲ層およびそれに結合したＥＣＭタンパク質、ならびに任意選択で細胞の付着および機能を促進または増強する活性因子を含む。３Ｄ足場は、同時係属の、本願の譲受人に譲渡された２００３年８月１５日出願の特許文献５および２００２年９月３０日出願の特許文献７にさらに詳細に論じられている。
【００４８】
本発明は、培養へのフレキシブル基材の使用も含む。例えば、Ｆｌｅｘｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ培養システムは、培養細胞に引張応力、圧縮応力または剪断応力を適用できる。（例えば、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２および特許文献１３を参照のこと）。特許文献１４は、細胞外マトリックスタンパク質でコートし培養細胞で覆うことのできる弾性膜への二軸歪の適用を開示している。特許文献１５は、弾性ストリップを備える単方向細胞伸展装置に細胞外マトリックスをコートし、その上に細胞を培養し伸展させる別のシステムを開示している。フレキシブル基材を容易に制御されたやり方で変形でき、その基材は従来の細胞培養基材に匹敵する細胞の接着および成長を支える。ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）のようなシリコーンは、高度に柔軟であるだけではなく細胞培養の顕微鏡観察を可能にする光学的な透明性も供することから、この適用に特に適している。フレキシブル基材は、同時係属で２００３年９月１２日出願の特許文献１６および特許文献１７にも記載されている。これらは、ＰＤＭＳ基材上にＣＡＲ表面を有する方法および物品を教示している。
【００４９】
本発明は、培養培地中の細胞に本発明の表面を接触させることを含む、培養初代肝細胞の付着および機能を促進する方法に関する。
【００５０】
任意の適切な手段によって細胞は表面に「接触」していることができ、また表面と接触させることができる。例えば表面を含む培養容器に培養培地中の細胞を流し入れる、ピペットで移す、分注することなどができ、また表面を含む医用装置または足場を、細胞が懸濁している培養培地に沈下させることができる。
【００５１】
本明細書に記載する本発明の任意の表面は、本方法に適する。一実施形態ではその表面は、ＨＡおよび任意選択でＣＡＲ表面に付着した活性因子に結合しているＥＣＭタンパク質を含む。好ましい実施形態では支持体はＰＳであり、ＣＡＲ材料はＨＡであり、ＥＣＭタンパク質は１つまたは複数のエラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩであり、ＥＣＭタンパク質はＨＡに共有結合している。さらに好ましい実施形態では、活性因子であるポリ−Ｌ−オルニチンまたはポリ−Ｄ−リジンはＣＡＲ表面に結合しており、ＨＡに共有結合しているＥＣＭタンパク質組成物を生み出す。本明細書の実施例は、本方法のＥＣＭタンパク質および活性因子のいくつかの組合せの使用を記載している。もちろん他の組合せも使用できる。
【００５２】
任意の多様な培養培地を本方法における発明の表面と共に使用できる。ＤＭＥＭ、Ｆ１２、αＭＥＭ、Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）、ＲＰＭＩまたはそれらの組合せのような市販入手可能な培地を、血清の存在下または不在下のいずれかで使用できる。適切な血清には子ウシ血清、ウシ胎仔血清、ウマ血清などがある。好ましくは合成の化学的に画定した無血清培地を使用する。多様な適切な化学的に画定した培地は、熟練作業者には明らかであろう。そのような培地の１つであるＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂ Ｗａｒｅ）培地を実施例に採用する。
【００５３】
上記の方法において、細胞の付着および機能の維持に効果的な条件で、細胞を本発明の表面と接触させる。「効果的な」条件は、測定可能な量の細胞付着および機能の維持を招く条件を意味する。熟練作業者は、効果的な条件を従来の方法を使用して容易に決定および／または最適化できる。変更する因子の中には例えば容器、培養培地、温度、Ｏ２／ＣＯ２濃度などがある。典型的な効果的な条件のいくつかを実施例に述べる。
【００５４】
本発明の別の態様は、培養物中の細胞の付着を変調（例えば刺激、阻害、強化など）する被験薬剤を同定するための方法であり、その方法は、（ａ）その細胞を本発明の表面および被験薬剤と接触させること、（ｂ）その細胞の付着を被験薬剤の不在下での類似した細胞の付着と比較して測定することを含み、（ｉ）被験薬剤の存在下での増加した付着は被験試料中に細胞の付着を刺激する因子が存在することを示し、（ｉｉ）被験薬剤の存在下で減少した付着はその試料中に細胞の付着を阻害する因子が存在することを示す。被験薬剤と平行して成長させた、被験薬剤を添加していない細胞と比較を行うことができ、または参照データベースと比較を行うことができる。好ましくは使用する培地は無血清である。
【００５５】
当業者の１人は、本方法で試験できる多様な種類の薬剤を認識しているであろう。例えば関心対象の細胞の活性（例えば細胞内シグナル伝達カスケード、代謝経路など）に影響する推定上薬物（例えばタンパク質、ペプチド、低分子、アンチセンス分子のような核酸、リボザイムまたはＲＮＡｉなど）を試験するために本方法を使用できる。薬物スクリーニング、創薬および潜在的薬物標的の同定以外に、潜在的薬剤が細胞に有毒であり、測定可能な有害作用を有し、無秩序な増殖（癌遺伝子形質転換）を誘導するかどうかを決定するために本方法を使用できる。
【００５６】
別の実施形態では、試験される薬剤は、関心対象のマーカーを誘導、増強または維持できるか、または望ましい細胞機能の維持に重要な推定上因子である。典型的には肝細胞で研究できるそのようなマーカー／機能には、（１）重要な肝臓細胞の機能であるチトクロムＰ４５０ファミリーの薬物／毒素代謝酵素（ＣＹＰ）の誘導、または（２）肝細胞の初代培養の際に通常は失われる機能であるアルブミンの生成がある。ＣＹＰの構造および機能についてのさらなる情報を、非特許文献４に見出すことができる。
【００５７】
試験できる薬剤の種類の中には、アンギオポイエチン２、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、エリスロポイエチン、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、幹細胞因子、ＧＤＦ６、ＣＳＦ、ＦＨ３／Ｆ２、ＴＧＦβなどのような増殖因子がある。あるいは、従来のコンビナトリアルケミストリーによって発生した低分子またはペプチドライブラリーを試験できる（例えば同時係属の特許文献３および特許文献１８を参照のこと）。他の種類の薬剤も熟練作業者に明らかであろう。
【００５８】
肝細胞の付着、生存、および／または増殖を促進するために有用なキットも提供され、そのキットは、本発明の表面と、細胞の培養ならびに細胞の付着、生存、および／または増殖を可能にすることに適した１つまたは複数の構成要素または試薬とを含む。培養物中の細胞の接着、生存および／または増殖（または任意の他の細胞挙動）を変調する因子の同定に有用な別のキット実施形態も本明細書に提供され、そのキットは、本発明の表面ならびに（ａ）細胞の付着、成長または細胞の生存の促進と、（ｂ）細胞の付着、生存および／もしくは増殖の測定とに適した１つまたは複数の構成要素または試薬を含む。
【００５９】
本発明を全般的に記載したが、以下の実施例を参照することによって同発明はより容易に理解されるであろう。実施例は例示の目的で提供され、明記しない限り本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００６０】
材料と方法
下記の本実施例に使用する表面を、必要に応じてコラーゲンＩＶの代わりにコラーゲンＩおよびコラーゲンＶＩを用いて特許文献３に記載する方法によって製造し、使用する表面を獲得した。
【００６１】
ラット初代肝細胞は、Ｘｅｎｏ Ｔｅｃｈ，ＬＬＣ（レネクサ、カンサス州）から入手され、単離から３時間以内にＢＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに発送された。ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ（ウォーバーン、マサチューセッツ州）がヒト初代肝臓細胞を単離し、その細胞は市販の器官保存培地（ＶｉａＳｐａｎ（商標））に入った状態で１２〜１５時間以内に発送された。懸濁状態のヒト細胞またはラット細胞を標準コラゲナーゼ消化法を使用して単離した。
【００６２】
完全に補充したＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国、ｃａｔ＃３５５０５６）に入れて細胞を再懸濁し、完全に補充したＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れて細胞２００００個／ウェルの初発密度で蒔き、非汚損表面と共有結合的に連結した多様な組合せの細胞外マトリックスタンパク質を有する平板に配置した。５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーターに平板を配置し、１〜７日間インキュベートした。平板から半分の容積の培地を除き、同容積の新鮮培地を加えることによってＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地を１日おきに交換した。
【００６３】
第６日または７日のいずれかに、下記のように３回繰り返しの平板をアッセイ用に採取した。同平板で３つのアッセイを行った：７−エトキシレゾルフィンを使用したＣＹＰ１Ａ活性、アルブミン分泌についてのアルブミン酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、および細胞数を決定するためのアッセイ（ＭＴＴ、核計数またはピコグリーンアッセイ）。２つの別々のラット肝臓調製物および１つのヒト肝臓調製物を用いて実験を繰り返した。
【００６４】
ＣＹＰ１Ａ活性アッセイおよび核染色を用いた細胞数えあげ
すべての培地を別々の平板に移し、アルブミン分泌についてのＥＬＩＳＡアッセイを行うことができるまで培地試料を−２０℃で凍結させた（下記参照）。５μＭ７−エトキシレゾルフィンおよび８０μＭジクメロール（ｄｉｃｕｍｅｒｏｌ）を細胞を有するすべてのウェルに加え、１分間隔で３０分間励起＝５４０ｎｍおよび発光＝５９０ｎｍでＢＭＧ Ｐｏｌａｒｓｔａｒ分光蛍光計で読み取り、ＣＹＰ１Ａ活性を検出した。
【００６５】
ＣＹＰ１Ａ活性アッセイの直後にレゾルフィン溶液を除去し、以下の方法の１つまたは複数を使用して細胞数を決定した。
【００６６】
１）核染色による細胞数：７−エトキシレゾルフィンを吸引し、ＢＤＴ基礎培地に溶かした１０μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３３４染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、ｃａｔ＃３５７０）および２ｍＭエチジウムホモダイマー−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、Ｄｅａｄ ｓｔａｉｎ ｃａｔ＃Ｌ−３３２４）を有する核染料を各ウェルに加えた。平板を室温で３０分間インキュベートし、ＨＴ Ｉｍａｇｅｒ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓの子会社、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ、ペンシルベニア州）で、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料については励起４０５ｎｍおよび発光４８０ｎｍで、エチジウムホモダイマー染料については励起５３５ｎｍおよび発光７５０ｎｍで（倍率×１０、ウェル１個あたり４か所）で蛍光画像を記録した。ＵＩＣ Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（商標）分析ソフトウェアを細胞計数に使用した。生細胞数を、総細胞から死細胞を引き算することによって決定した（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色−死染色）。データを３０分での総シグナルを細胞数で割った値として示す。ＣＹＰ１Ａ活性データを図１および図２に示す。
【００６７】
２）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を使用してＭＴＴアッセイによる細胞数を決定した。
【００６８】
３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（ユージーン、オレゴン州、米国、ｃａｔ．＃Ｐ７５８９）からのＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（商標）ＤＮＡ ｄｓＤＮＡ定量キットを使用してピコグリーンＤＮＡアッセイによる細胞数を決定した。
【００６９】
アルブミンＥＬＩＳＡアッセイ：
培地試料中のアルブミン分泌を測定するために、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝９．６）に溶かした２μｇ／ｍｌヒツジＩＧＧ抗ラットアルブミン抗体（未コンジュゲート、Ｃａｐｐｅｌ ｃａｔ＃５５７２９）をＰｒｏｂｉｎｄ Ａｓｓａｙ平板（Ｆａｌｃｏｎ３５３９１５）にコートし、４℃で一晩インキュベートした。抗体平板をＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０に溶かした１％ゼラチン（Ｂ型、７５ブルーム、Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｇ６６５０）で３７℃で３０分間ブロッキングした。ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０およびＥＣＭ被験平板からの１：４００に希釈したアルブミン（培地試料）で３回ブロッキング溶液をすすいだ。平板を３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０に溶かしたコンジュゲート抗アルブミン抗体をすべてのウェルに加えた。平板を３７℃で１時間（ペルオキシダーゼコンジュゲートヒツジＩｇＧ抗ラットアルブミン抗体Ｃａｐｐｅｌ＃５５７７６については３６．６ｍｇ／ｍｌから１：５００に希釈した）インキュベートし、再びＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ９９４１）に対する０．２５ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ基質（２，２‘−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩）を、０．０１％過酸化水素を有するクエン酸基質緩衝液（ｐＨ５．０）に添加してから、発色用の抗体平板に暗条件で室温で４０分間加えた。ペルオキシダーゼ反応を０．３２％フッ化ナトリウム溶液で停止させ、ＢＭＧ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダーを使用して吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【００７０】
下記の実施例に論じる対照条件を以下のように定義する：
１）ＨＳ＋ＭＧ＝Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上のＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地、
２）ＨＳ＋ＴＣＰＳ＝組織培養用ポリスチレン上のＢＤ Ｈｅｐｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地、
３）ブロックＴＣＰＳ：組織培養用ポリスチレン上のブロック培地（実施例１および３のみ）
ブロック培地は、非特許文献５による雑誌論文および特許文献１９に記載されている培地配合である。
【００７１】
（実施例１）
３つのＥＣＭ組成物のＣＹＰ１Ａ活性を、上記のように培養７日後のヒト初代肝臓細胞について７−エトキシレゾルフィンを使用して評価した。図１は、評価の結果を示す。図１に示すように、ヒアルロン酸上の細胞外マトリックスタンパク質の組合せは、市販の対照に比べてヒト初代肝臓細胞のＣＹＰ活性の維持のための等しいかまたはよりよい環境を提供する。３つのＥＣＭタンパク質組成物のＣＹＰ活性は標準組織培養用ポリスチレン上に配置した細胞に匹敵するか、それよりも良好であり、コラーゲンＩ＋ポリ−Ｌ−オルニチン（ＣＡＲ Ａ）は最高レベルの活性を示す。機能的活性は概して培養３日以内に失われることから、第７日のＣＹＰ活性は細胞機能の維持を示す。
【００７２】
（実施例２）
３つのＥＣＭ組成物のＣＹＰ１Ａ活性を、上記の方法を使用して第６日のラット初代肝臓細胞について７−エトキシレゾルフィンを使用して評価した。図２に、評価の結果を示す。総ＣＹＰ蛍光は図１における大部分のヒットよりも低かった。この場合も、３つのＥＣＭ組成物に関するＣＹＰ１Ａ活性は、ＨＡ単独または７−エトキシレゾルフィン単独のいずれかであるベースライン蛍光よりも一貫して高い。図の対照ウェルは、ＨＳ＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＨＳ＋ＴＣＰＳである。このように、ヒアルロン酸上の細胞外マトリックスタンパク質の組合せは、市販の対照に比べてラット初代肝細胞のＣＹＰ１Ａ活性の維持について等しいか、またはよりよい環境を提供する。
【００７３】
（実施例３）
ヒト初代肝臓細胞のアルブミン分泌レベルを上記のアッセイを使用して第７日に得た。図３に、３つのＥＣＭタンパク質組成物に関するこのデータを示す。データは、ＥＣＭタンパク質組成物を有するウェルでアルブミンの分泌が維持され、アルブミンレベルが組織培養ポリスチレンの対照ウェルに匹敵することを示す。機能的活性は概して培養３日以内に失われることから、第７日のアルブミン活性は細胞機能の維持を示している。このデータは、ＣＹＰ活性の維持も示す。このように、ヒアルロン酸上の細胞外マトリックスタンパク質の組合せは、市販の対照に比べてヒト初代肝細胞のアルブミン分泌の維持について等しいか、またはよりよい環境を提供する。
【００７４】
（実施例４）
３つのＥＣＭタンパク質組成物に関するラット初代肝臓細胞のアルブミン分泌レベルを、上記のように第６日に得た。図４に示すように、ヒアルロン酸上の細胞外マトリックスタンパク質の組合せは、市販の対照に比べてラット初代肝細胞のアルブミン分泌の維持について等しいか、またはよりよい環境を提供する。再び、ＥＣＭ組成物の活性のレベルは対照に匹敵するか、またはそれよりも優れ、アルブミン分泌の維持、よって細胞機能の維持を示している。
【００７５】
（実施例５）
コラーゲンＩ単独、ポリ−Ｌ−オルニチン単独、およびポリ−Ｌ−オルニチンを伴うコラーゲンＩの活性を比較する形態研究を初代肝細胞で行った。図５Ａ〜５Ｃは、第４日の細胞の形態を示す。図５Ａは、ＨＡ表面に共有結合的に連結したコラーゲンＩ単独を、図５Ｂは、ＨＡ表面に共有結合的に連結したポリ−Ｌ−オルニチン単独を、図５Ｃは、ＨＡ表面に共有結合的に連結したコラーゲンＩ＋ポリ−Ｌ−オルニチン（ＣＡＲ Ａ）を示す。コラーゲンＩ単独（図５Ａ）上で培養した細胞は拡散し、ポリ−Ｌ−オルニチン単独（図５Ｂ）上で培養した細胞は拡散も生存もしない。しかし、コラーゲンＩとポリ−Ｌ−オルニチンとの組合せ（図５Ｃ）は、生化学の結果（ＣＹＰおよびアルブミン、図１〜４）および形態が示すように、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で凝集する肝臓細胞と同じくらい多数の、肝機能を維持する多細胞凝集体の形成を引き起こす。このデータは、ＥＣＭ組成物が個別のＥＣＭおよび活性因子構成要素単独よりも優れていることを示す。機能の維持に重要なのはＥＣＭの組合せである。
【００７６】
（実施例６）
画定した細胞培養環境中でのチトクロムＰ４５０酵素の保存
チトクロムＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰＩＡ２の発現および誘導についてＣＡＲ ＡおよびＣＡＲ Ｂを試験した。ヒト肝臓細胞を上記のように成長させた。細胞の形態および付着、ＣＹＰ ｍＲＮＡの発現および誘導、ならびにテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性を測定した。
【００７７】
ヒト肝臓細胞をＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）に入れてＣＡＲ Ａ上で２０、４４および７２時間、コラーゲンＩ上で２０時間成長させた。図６に示すようにＣＡＲ Ａ表面はヒト肝臓細胞の付着および三次元構造の形成を可能にする。この種の三次元構造は、分化した肝臓の機能を維持するのに適していると予想される。
【００７８】
（実施例７）
ヒト肝臓細胞をＨｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ上で一晩成長させ、その後ＧＡＰＤＨ、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡレベルの測定を行った。Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，Ｉｎｃ．、フリーモント、カリフォルニア州からのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）ｂＤＮＡアッセイを使用してＲＮＡの測定を行った。ｂＤＮＡアッセイ用のヒトＣＹＰ３Ａ４および１Ａ２特異的プローブセットをＸｅｎｏ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、レネクサ、カンサス州から得た。図７Ａおよび７Ｂに示すように、これらのＲＮＡ種の初発レベルは、蒔いた初発細胞数を反映して３種の表面の間で類似している。パネルＡおよびＢは、種々の表面上のＣＹＰ ＲＮＡ種の比較を可能にする２つの異なる目盛りを示す。さらに長時間培養する間に細胞はＣＡＲ表面にあまり接着せず、細胞−細胞相互作用および形態変化を可能にし、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ転写体に対して標準化したＣＹＰ ＲＮＡレベルのよりよい維持を招く。
【００７９】
（実施例８）
２つの調製物からのヒト肝臓細胞をＨｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ上で成長させ、ＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの基礎レベルを経時的に測定した。ＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの基礎レベルをハウスキーピングＧＡＰＤＨ転写体に対して標準化した後に記録する。図８Ａおよび８Ｂに示すように、ＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの基礎レベルは上昇し、より長時間維持される。これは薬物代謝を決定するために細胞をより長時間使用できることを示している。
【００８０】
（実施例９）
ヒト肝臓細胞をＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ上で成長させ、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの基礎レベルを経時的に測定した。図９Ａおよび９Ｂに示した結果は、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの基礎レベルも上昇し、コラーゲンＩよりもＣＡＲ表面上で長時間維持されることを実証している。ヒトの薬物代謝の最も重要なアイソフォームであるＣＹＰ３Ａ４は標準培養条件では速やかに失われるが、ＣＡＲ ＡおよびＣＡＲ Ｂ表面では維持される。
【００８１】
（実施例１０）
ヒト肝臓細胞をＨｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で成長させた。培養５日後に細胞をＣＹＰ３Ａ４の公知の誘導剤である薬物リファンピシン（２０μＭ）で２４時間処理するか、または未処理対照のいずれかとした。対照およびリファンピシン誘導ヒト肝臓細胞におけるＧＡＰＤＨおよびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡの相対レベルを培養第６日に測定した。図１０Ａ〜１０Ｃに示した結果は、ＣＡＲ表面がＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの誘導を維持することを実証している。さらに、前の実施例に記載したように細胞はＣＡＲ表面にあまり接着せず、細胞−細胞相互作用および形態変化を可能にして、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ転写体に対して標準化したＣＹＰ ＲＮＡレベルのよりよい維持を招く。このように、表面上の細胞数を反映するように標準化した後で、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの基礎レベルおよび誘導レベルは、標準的なコラーゲン１表面よりもＣＡＲ表面の場合の方が高い。
【００８２】
（実施例１１）
ヒト肝臓細胞の２つの調製物をＨｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れて、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で成長させた。培養時間に細胞を２０ｕＭリファンピシンで２４時間誘導し、次いでＣＹＰ３Ａ４およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定した。アッセイする細胞数を反映するようにＧＡＰＤＨ転写体に対して標準化した後でＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベルを記録する。図１１Ａおよび１１Ｂに示す結果は、ＣＡＲ ＡおよびＣＡＲ Ｂが誘導されたＣＹＰ３Ａ４レベルの維持にコラーゲンよりも優れていることを実証している。
【００８３】
（実施例１２）
ヒト肝臓細胞をＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴｌＭ（商標）培地に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ上で４日間成長させた。追加の７２時間１０μＭリファンピシンで培養物を誘導し、対照培養物にはリファンピシンを含有させなかった。テストステロン（２００μＭ）を添加し、インキュベーション３０分後にテストステロンから６β−ヒドロキシ−テストステロンへの変換を高速液体クロマトグラフィーを使用して測定した（非特許文献６）。図１２は、ＣＡＲ表面上でのテストステロン６β−ヒドロキシラーゼの酵素活性の誘導および特にＣＡＲ−Ｂ表面上での誘導活性のレベルの改善を示す（＊、Ｐ＜０．０５）。
【００８４】
（実施例１３）
表Ｉに示すように多様な濃度のコラーゲンＩおよびポリ−オルニチンを使用して誘導体化したＣＡＲ表面を調製した。ラット肝臓細胞をウェル１個あたり細胞５００００個となるようにウェルに蒔き、６日間成長させた。表面上の種々の形態を観察した（図１３）。上記のように７−エトキシレゾルフィンを使用して各ウェル中のＣＹＰ１Ａ測定した。表１の第４列に示す相対生物学的活性は、３０分での蛍光シグナルをゼロ時間での蛍光シグナルで割った値を表す。これらの結果は、ＣＡＲ表面上のＥＣＭ（コラーゲンＩ）および活性因子（ポリ−オルニチン）の濃度を調整して細胞の形態および相対的な細胞機能を改善し釣り合わせることができることを示している。
【００８５】
【表１】
【００８６】
結果は、２つの酵素であるチトクロムＰ４５０ １Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）およびチトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）の維持を実証している。その維持は、ＣＹＰ１Ａ２についてはｍＲＮＡレベルで、ＣＹＰ３Ａ４についてはｍＲＮＡおよび酵素活性のレベルで観察される。さらに、その表面は、細胞が化学薬剤の曝露に応答してＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４両方のレベルを増加させる、誘導として知られるプロセスの能力を維持する。
【００８７】
本明細書に記載された方法および表面の使用によって、組織培養用に処理されたポリスチレン上のＩ型コラーゲンのような現在使用されている表面上で可能であるよりも長時間組織培養でＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４を維持することが可能になる（非特許文献７）。誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性がコラーゲンＩ上よりもＣＡＲ−Ｂ表面上で大きかったことは、予想外であった。ＣＹＰ１ＡおよびＣＹＰ３Ａ４両方のＲＮＡレベルが６日間ＣＡＲ表面上で維持されたことも予想外であった。
【００８８】
本発明の表面は、肝細胞を培養するときに普通みられる細胞の形状および細胞−細胞相互作用の変化を防止する。おそらく標準的な培養でみられる細胞の形状における変化（いわゆる玉石状形態）は酵素活性の維持に有害で、ＢＤ表面上にみられる細胞クラスターの形態は酵素活性の維持を助けている。
【００８９】
新規な細胞培養表面を市販入手可能な多くの標準二次元細胞培養形式で発生させることができる。これらには６ウェルから９６ウェル平板形式およびフラスコ形式がある。本明細書で使用した表面は、組織足場およびバイオリアクターを含めた三次元培養形式にも使用できる。さらに新規な細胞培養表面を含む構成要素の濃度を変動させて所望の酵素活性および細胞対表面の細胞接着を果たすことができる。
【００９０】
本明細書において引用したすべての参照および特許は、本明細書により参照により組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】１）ヒアルロン酸上のコラーゲンＶＩおよびエラスチン（Ｃｏｌ ＶＩ＋エラスチン）、２）ヒアルロン酸上のコラーゲンＩＶおよびポリ−Ｌ−オルニチン（Ｃｏｌ ＩＶ＋Ｏｒｎ＝ＣＡＲ Ｂ）、３）ヒアルロン酸上のコラーゲンＩおよびポリ−Ｌ−オルニチン（Ｃｏｌ Ｉ＋Ｏｒｎ＝ＣＡＲ Ａ）、４）組織培養用ポリスチレン上のブロック培地（Ｂｌｏｃｋ ＴＣＰＳ）、５）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上のＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地（ＨＳ＋ＭＧ）、６）組織培養用ポリスチレン上のＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地（ＨＳ ＴＣＰＳ）の上でのヒト初代肝臓細胞の付着および細胞機能（ＣＹＰ活性）の維持を示す図である。比は、総ＣＹＰ１Ａ活性を細胞数で割った値を表す。
【図２】ラット初代肝臓細胞の付着および細胞機能（ＣＹＰ活性）の維持を示す図である。比は、総ＣＹＰ１Ａ活性を細胞数で割った値を表す。
【図３】ヒト初代肝臓細胞の付着およびアルブミン分泌の維持を示す図である。
【図４】ラット初代肝臓細胞の付着およびアルブミン分泌の維持を示す図である。
【図５Ａ】ＣＡＲ表面上のコラーゲンＩ上で培養した初代肝臓細胞の形態を示す図である。
【図５Ｂ】ＣＡＲ表面上のオルニチン上で培養した初代肝臓細胞の形態を示す図である。
【図５Ｃ】ＣＡＲ表面上のコラーゲンＩ＋オルニチン上で培養した初代肝臓細胞の形態を示す図である。
【図６】ＡからＤは、ＣＡＲ Ａ上で平板培養した２０、４４および７２時間後の、ならびにコラーゲンＩ表面上で平板培養した２０時間後のヒト肝臓細胞の形態を示す図である。
【図７】ＡおよびＢは、第１日でのＣＡＲ Ａ表面およびＣＡＲ Ｂ表面上でのチトクロムＰ４５０ ｍＲＮＡの発現を標準的なコラーゲン１表面と比較して示す図である。Ａは、Ｂの発展版である。
【図８】ＡおよびＢは、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上の２つのヒト肝細胞調製物のＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの基礎レベルを経時的に示す図である。測定された値は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較したものである。
【図９】ＡおよびＢは、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で培養したヒト肝細胞のＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの基礎レベルを経時的に示す図である。測定された値は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較したものである。
【図１０】ＡからＣは、ＣＡＲ表面が誘導を維持することを示す図である。（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔａアッセイを使用して第６日にＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡを測定）
【図１１】ＡおよびＢは、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で培養した細胞から誘導されたＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡのレベルを経時的に示す図である。
【図１２】ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で成長した細胞における１０μＭリファンピシンによるテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性の誘導を示す図である。
【図１３】表１に記載する種々の表面上での細胞形態を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代肝細胞を培養するために有用な表面およびそれらの表面を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養のために概して血清を補充した培養培地に細胞を分散させ、次にその培養培地を組織培養等級ポリスチレン（ＰＳ）のような細胞培養用合成基材でできた容器に分注する。これらの条件で、ＰＳ表面へのタンパク質の非特異的吸着が速やかに起こり、ほぼ天然から高度に変性したものまで一連のコンホメーション状態の多くの異なる血清タンパク質からなるタンパク質層が発生する。静置培養において細胞はその後表面に沈降し、それらの表面の細胞インテグリン、プロテオグリカンおよびセレクチンを介して、このあまり組織化されていない界面に「応答指令信号」を送り始める。このランダムに吸着したタンパク質層との相互作用によって、細胞付着（または接着）、拡散、増殖、移動および分化を含めた多様なプロセスに影響する任意の生物学的応答がもたらされる。それに反して、ｉｎ ｖｉｖｏでは特異的で組織化されたリガンド−受容体相互作用を介して通常の生物学的反応が生じ、その相互作用は、順番に高度に組織化されたシグナル伝達プロセスを誘発する。
【０００３】
このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養時に細胞の所望の生物学的活性をより効果的に支えるために生物学的イベントのｉｎ ｖｉｖｏ特異性を模倣する高度に画定した細胞培養表面の必要がある。
【０００４】
細胞培養に従来使用される血清は、血清のロットによって変動する特定できないタンパク質混合物を含み、さらに望ましくない煩雑さを生み出しうる。例えば細胞がヒトにおける細胞療法のようなｉｎ ｖｉｖｏ使用のために調製されるとき、培養に血清を先行して使用することによって、細胞調製物に（１）生物学的有害物質および（２）レシピエントに望ましくない免疫応答を誘導できる動物成産物を導入することがある。
【０００５】
このように、培養時に血清と同様の利益をもたらす無血清の化学的に画定した培養培地を採用する細胞培養方法の必要がある。初代肝細胞に関して無血清細胞培養およびその方法のさらなる必要があり、初代肝細胞の多くはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養すると自然の機能のいくつかを失う。例えば初代肝臓細胞は、健康細胞の機能であるタンパク質アルブミンを生成する能力を失っている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６１２９９５６号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１０／２５９７９７号明細書
【特許文献３】米国特許出願第１０／２６０７３７号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１０／２５９８１５号明細書
【特許文献５】米国特許出願第１０／６４１２８６号明細書
【特許文献６】米国特許出願第１０／６６０７８１号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１０／２５９８１７号明細書
【特許文献８】米国特許第４７８９６０１号明細書
【特許文献９】米国特許第４８２２７４１号明細書
【特許文献１０】米国特許第４８３９２８０号明細書
【特許文献１１】米国特許第６０３７１４１号明細書
【特許文献１２】米国特許第６０４８７２３号明細書
【特許文献１３】米国特許第６２１８１７８号明細書
【特許文献１４】米国特許第６０５７１５０号明細書
【特許文献１５】米国特許第６１０７０８１号明細書
【特許文献１６】米国特許出願第１０／６６０７６０号明細書
【特許文献１７】米国特許出願第１０／６６０７５９号明細書
【特許文献１８】米国特許出願第１０／２５９８１６号明細書
【特許文献１９】米国特許第６０４３０９２号明細書
【非特許文献１】E. D. Hay, ed., Cell Biology of Extracellular Matrix, 2nd ed., Plenum Press, New York, 1991
【非特許文献２】Chen et al. (2000), Advanced Materials 12: 455-457
【非特許文献３】Hubbell, J. A., Biomaterials in Tissue Engineering, Biotechnology, 1995. 13: p. 565-76
【非特許文献４】Cytochrome P450, Structure, Mechanism and Biochemistry, 2nd edition, Edt Paul R. Oritz de Montellano, Plenum Press, New York and London, 1995
【非特許文献５】Block GD, Locker J, Bowen WC, Petersen BE, Katyal S, Strom SC, Riley T, Howard TA, Michalopoulos GK, Population expansion, clonal growth, and specific differentiation patterns in primary cultures of hepatocytes induced by HGF/SF, EGF and TGF alpha in a chemically defined (HGM) medium, J Cell Biol. 1996 Mar; 132(6): 1133-49
【非特許文献６】J Steroid Biochem Mol Biol. 2000 Sep; 74(1-2): 57-62
【非特許文献７】J Cell Biol. 1980 Oct; 87(1): 255-63
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、とりわけ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質および活性因子を含む高度に画定した細胞培養表面を提供することによって上記の必要を満たすことを意図する。これらの新しい表面の利点の中には、それらの表面がｉｎ ｖｉｔｒｏで血清濃度の減少または血清の完全な回避を可能にすることがある。
【０００８】
哺乳動物細胞、特に初代肝細胞の培養に適した組成物および方法を提供することが本発明の目的である。本発明に使用するのに好ましい細胞は、初代肝臓細胞のような肝細胞である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料、ならびにそのＣＡＲ材料に結合した１つもしくは複数のＥＣＭタンパク質またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体、および任意選択で１つもしくは複数の活性因子またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、細胞培養に使用するために特に適した表面を提供する。「生物学的に活性な」とは、その断片または変異体が細胞の付着の促進および機能の維持に完全長未修飾ＥＣＭタンパク質または活性因子と本質的に同じ活性を有することを意味する。細胞の「付着」は、細胞が従来の洗浄または取り扱い手順によって溶離しないような、表面への細胞の結合を意味する。
【００１０】
「機能を維持」または「機能状態を維持」するとは、細胞が例えば予想される形態および正常な代謝活性（例えば酵素活性、タンパク質および／またはＲＮＡの生成、ビリルビン分泌、アルブミン分泌、薬物輸送など）を含めた正常な細胞活性および特徴を表すことを意味する。状況に応じて、１つまたは複数のそのような特徴および当業者に公知の他の特徴を細胞が機能的に維持されているかの指標として使用してもよい。好ましい実施形態では、細胞はアルブミンを生成し、および／またはチトクロムＰ４５０活性を維持する。
【００１１】
「ＥＣＭタンパク質」とは、細胞の付着および成長を仲介するために使用できる細胞外マトリックスタンパク質を意味する。（ＥＣＭタンパク質のさらなる記述については非特許文献１を参照のこと）。本方法におけるＥＣＭタンパク質の例には、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、およびコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、またはコラーゲンＶＩのようなコラーゲンがある。特に好ましいのはエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩである。最も特に好ましいのはコラーゲンＩおよびコラーゲＩＶである。
【００１２】
好ましい実施形態では、活性因子はＥＣＭタンパク質と共に細胞に提示されたときに細胞の付着、生存または機能を促進する天然もしくは非天然ポリカチオン性ポリマー、またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体である。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）またはポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）のようなポリカチオン性ポリマーを使用できる。特に好ましい実施形態では、活性因子はポリ−Ｌ−リジンおよびポリ−Ｄ−オルニチンである。
【００１３】
本発明者らは、驚くことに本表面が従来の条件を使用した標準的な培養表面（例えば血清を有するか、または有さないかのいずれかである市販の培養培地を使用した従来の組織培養用ポリスチレン上でのインキュベーション）と同様に、そしてしばしばそれよりも良好に初代肝細胞の付着および機能の維持を促進することを見出した。追加的に、ある組合せのＥＣＭタンパク質および／または活性因子（ＥＣＭタンパク質組成物）は、他の組合せよりもよく細胞の付着および機能を促進した。これらの改善した効果は、化学的に画定した無血清培地を使用して好ましくは成し遂げられる。
【００１４】
本発明の利点には、以下がある：
１）画定した哺乳動物細胞培養条件の使用（それは、培養基材上に層を形成している非特異的（ランダムおよび任意に）吸着した血清タンパク質よりもむしろ細胞培養基材に結合しているＥＣＭタンパク質により制御される細胞付着プロセスを可能にし、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のようにキャラクタリゼーションされていない未精製の他の動物性製品を使用する必要を減らす）、
２）特異的細胞プロセスを特異的ＥＣＭに起因するとする能力（それによって、従来の血清補充培養培地に存在する他の生物学的因子と混ざったＥＣＭタンパク質の生物学的作用が排除される）、
３）（受動吸着しているよりもむしろ）表面に付着した共有結合しているＥＣＭおよび／または活性因子の使用（それによって、基材へのＥＣＭおよび／または活性因子が限定され、液相（培養培地）への脱着を防止し、受動的コーティング上の可溶性ＥＣＭおよび／または活性因子が懸濁細胞上の付着部位を遮断するのを防止することによって細胞の付着も増加する）、ならびに
４）血清が大きく減少または除去されることから、規制認可をより速やかに獲得する能力（それは、生物学的有害物質、免疫原性産物またはさもなければ有害な産物を排除または大きく減少させる）。
【００１５】
本発明の一態様は、（ａ）細胞接着抵抗性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（または抵抗性（ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ））（ＣＡＲ）材料、ならびに（ｂ）そのＣＡＲ材料に結合している１つもしくは複数のＥＣＭタンパク質または生物学的に活性なその断片もしくは変異体、および任意選択で１つもしくは複数の活性因子または生物学的に活性なその断片もしくは変異体を含む表面である。ＥＣＭタンパク質の例は、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶもしくはコラーゲンＶＩのようなコラーゲンである。特に好ましくはコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩである。
【００１６】
本明細書において使用する用語「ＣＡＲ材料」は、表面に存在する場合に支持体への細胞または細胞表面にみられるタンパク質もしくはポリペプチドの非特異的結合（接着）を防止、阻害、または低減する材料を指す。ＣＡＲ材料および表面は、哺乳動物細胞に抵抗性であり、好ましくは微生物にも抵抗性である。ＣＡＲ材料および表面は、時に「非汚損基材」、「不活性コーティング」、「低親和性試薬」、または「非接着性コーティング」と称される。ＣＡＲ材料の例には、ヒアルロン酸（ＨＡ）もしくはその誘導体、アルギン酸（ＡＡ）もしくはその誘導体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリムもしくはその誘導体、ポリプロピルアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、またはこれらの化合物の組合せがある。好ましくはＣＡＲ材料はＨＡである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプロテオグリカン、ビグリカン、グリコサミノグリカン、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）をＣＡＲ材料に結合させてもよい。
【００１８】
ＥＣＭタンパク質および活性因子を、ＣＡＲ表面に共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合させてもよいが、好ましくは共有結合させる。
【００１９】
一実施形態では、支持体を酸化プラズマで処理すること、およびその処理された支持体にＣＡＲ材料を結合させることによって、ＣＡＲ材料をその支持体に付着させる。別の実施形態では、支持体を酸化プラズマで処理すること、アミノ基を有するポリカチオン性ポリマーにその処理された支持体を曝露し中間層を形成させること、およびその中間層にＣＡＲ材料を結合させることによって、ＣＡＲ材料をその支持体に付着させる。好ましくはポリカチオン性ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）である。（例えばＭｏｒｒａらの特許文献１を参照のこと）。
【００２０】
支持体は、天然もしくは合成有機ポリマーまたは無機コンポジットであってもよい。適切な支持体にはポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリラクチド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）もしくは他のケイ素ベースのポリマー、セルロース、ガラスまたはセラミックがある。好ましくは支持体はＰＳである。
【００２１】
本発明は、選択的な細胞の付着および機能に有用なＥＣＭ修飾ポリマー組成物を製造するための方法も含み、その方法は、（ａ）ポリマー表面を提供する段階と、（ｂ）前記表面を処理してＣＡＲ表面を生成させる段階と、（ｃ）前記ＣＡＲ表面を、細胞の付着および機能を促進する少なくとも１つのＥＣＭタンパク質および任意選択で活性因子で処理する段階とを含み、それにより前記タンパク質および活性因子がそれに共有結合するようになることによって、前記ＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させる。
【００２２】
本発明は、肝細胞の付着または機能の維持を促進するために有用な細胞接着促進（ＣＡＰ）ＥＣＭ修飾組成物も含み、その組成物は、１つまたは複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が共有結合して修飾されたＣＡＰ表面を形成している細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料でできている／作られたポリマー表面を含み、そのタンパク質／表面は、（ａ）前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面に実質的に付着しない細胞の付着、および（ｂ）任意選択で、ＥＣＭ修飾表面に付着し、前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面に及ぼす機能を実質的に維持しない細胞の機能の維持を促進する。
【００２３】
本発明は、上記または本明細書のどこか他に記載するような本発明の表面および細胞を含む細胞培養も目的とする。スライド、マルチウェル平板、培養皿、培養フラスコ、培養瓶などのような細胞培養容器で培養物を成長させることができる。フレキシブル基材または三次元（３Ｄ）足場に培養物を成長させることもできる。好ましい一実施形態では、細胞は肝細胞、特にヒト初代肝細胞である。特に好ましい実施形態では、チトクロムＰ４５０酵素、特にＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性が細胞において維持されている。
【００２４】
本発明の別の態様は、培養中の初代肝細胞の付着および機能の維持を促進するための方法である。その方法は、培養培地中の細胞を、その細胞の付着および機能の維持に効果的な条件で本発明の表面と接触させることを含む。表面の例は、（ａ）ＣＡＲ材料が結合している支持体、および（ｂ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質（またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体）を含むものである。本方法におけるＥＣＭタンパク質の例には、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ならびにコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩのようなコラーゲンがある。また、ＣＡＲ表面に任意選択で結合しているのは、（ｃ）１つまたは複数の活性因子、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）またはポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）のようなポリカチオン性ポリマーである。ＣＡＲ表面に結合している活性因子の添加は、ＣＡＲ表面に付着したＥＣＭタンパク質組成物を生み出す。
【００２５】
好ましい実施形態では、本方法は、ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合しているＣＡＲ材料を含むことによって細胞接着促進表面を形成しているポリマー表面を提供すること、および（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすることを含み、それにより肝細胞が表面に付着して機能状態に維持されることを含む。特に好ましい一実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される。
【００２６】
本発明の別の態様は、培養初代肝細胞の付着または機能を刺激または阻害する被験薬剤を同定するための方法であり、その方法は、（ａ）培養培地中の細胞を本発明の表面および被験薬剤と接触させること、（ｂ）これらの細胞の付着および機能を、被験試料を有さない対照細胞の付着および機能と比較して測定することを含む。被験薬剤の存在下で増加した付着または機能は、細胞の付着または機能を刺激する因子が存在することを示し、被験薬剤の存在下で減少した付着および機能は、細胞の付着および機能を阻害する因子が存在することを示す。この方法を、薬物の潜在的な標的を同定するため、細胞の性質に及ぼす薬剤の効果を決定するため、または潜在的薬剤が細胞に有毒であるかどうかを決定するためなどに使用できる。
【００２７】
一実施形態では、本方法は、（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合しているＣＡＲ材料を含むことによって細胞接着促進表面を形成しているポリマー表面を提供する段階、（ｂ）前記肝細胞を、前記細胞の成長／維持を支える培地中で前記表面上で培養する段階であって、被験薬剤はその培地に含まれるか、またはその表面に結合している段階、（ｃ）培養の開始後の時間ｔで特異的細胞機能を定量する段階、および（ｄ）段階ｃで得られた値を前記被験薬剤の非存在下で実施された同一の培養における値と比較する段階であって、被験薬剤存在下での値の増加は前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、減少は前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示す段階を含む。培養物中の酵素活性の総レベル、その特徴（例えば形態または染色）を表す細胞数のように当業者に公知の任意の手段によって特異的細胞機能を定量できる。培養を開始後の一定時間での一時点を測定でき、また変化速度を決定するために２つ以上の時点を測定できる。
【００２８】
被験薬剤を同定するときに測定する適切な特徴には、形態、酵素活性、タンパク質の産生、ＲＮＡの産生、ビリルビン分泌、アルブミン分泌、および薬物輸送がある。
【００２９】
当業者に明らかであろうように、本発明により培養された肝細胞を細胞療法に適した装置または足場の中または上に収容させてもよい。
【００３０】
上述の実施形態および本明細書全体は、初代肝細胞を用いた使用に特に好ましい。使用できる肝細胞の種類には、任意の種からの初代肝臓細胞がある。ラットおよびヒトの初代肝臓細胞を本明細書に記載する。
【００３１】
本発明の実施形態では、培養培地に血清を補充できるが、好ましくは培養培地は無血清である。適切な画定した無血清培地であるＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地を本明細書に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、新規な細胞培養表面を使用して初代肝細胞における薬物代謝酵素のレベルを維持する。細胞の挙動および機能は、細胞に作用する環境シグナルに関係する。本明細書に記載した新規な表面は、代謝酵素の持続性発現に必要なシグナルを提供する。
【００３３】
本発明の表面は、ＣＡＲ性質を有する固体の、好ましくはポリマーの支持体を含む。その支持体は、任意の多様な形をとることができる。その支持体は、正方形、長方形、円形または多角形のような任意の適切な形状であることができ、二次元または三次元であることができる。その支持体は、天然ポリマー、合成ポリマーおよび無機コンポジットを含めた任意の多様な材料でできていることができる。天然ポリマーには、例えばコラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ベースの材料がある。合成ポリマーには、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびそれらの共重合体（ＰＧＬＡ）のようなポリａ−ヒドロキシ酸、ポリ（オルトエステル）、ポリウレタン、ならびにポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリＨＥＭＡ）またはポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体のようなヒドロゲルがある。天然由来ポリマー材料および合成ポリマー材料を含有するハイブリッド材料も使用できる。そのような材料の非限定的な例は、非特許文献２に開示されている。無機コンポジットには、例えばリン酸カルシウムセラミック、バイオガラスおよび生体活性ガラス−セラミック、特にカルシウムヒドロキシアパタイトとケイ素安定化リン酸トリカルシウムとを組み合わせたコンポジットがある。好ましい支持体の中には、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリ−またはポリテトラ−フルオロエチレン、ポリヘキサフルオロプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニリジンフルオリド、ポリラクチド、セルロース、ガラス、またはセラミックがある。好ましい実施形態では、支持体はＰＳ組織培養皿またはマルチウェル平板のような組織培養容器の部分である。
【００３４】
あるいは、例えば当技術分野で公知であり特許文献２に記載されているプラズマ処理を使用して表面を処理できる。その多くが当業者に公知である任意の適切なＣＡＲ材料を支持体に結合させることができる。典型的なＣＡＲ材料には、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその誘導体、アルギン酸（ＡＡ）またはその誘導体、ポリ−ＨＥＭＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリムまたはその誘導体、ポリプロピルアクリルアミド、およびポリイソプロピルアクリルアミドがある。ＣＡＲ材料の組合せも使用できる。好ましい実施形態では、ＣＡＲ材料はＨＡである。
【００３５】
ＣＡＲ材料は、共有結合によって支持体に好ましくは結合している。多様な種類の共有結合を形成でき、そのいくつかは、同時係属の、本願の譲受人に譲渡された米国特許出願明細書であり、そのすべてが本明細書によって参照により組み込まれているＡｎｄｒｅａ Ｌｉｅｂｍａｎｎ−ＶｉｎｓｏｎおよびＲ．Ｃｌａｒｋによる２００２年９月３０日出願の特許文献２、Ｍｏｈａｍｍａｄ Ａ．ＨｅｉｄａｒａｎおよびＭａｒｙ Ｋ．Ｍｅｙｅｒによる「Method and Apparatuses for the Integrated Discovery of Cell Culture Environments」という名称で２００３年９月３０日出願の特許文献３、Ｊｏｈｎ Ｊ．Ｈｅｍｐｅｒｌｙによる「Proliferation and Differentiation of Stem Cell from Bone Marrow and Other Cells Using Extracellular Matrix and other Molecules」という名称で２００２年９月３０日出願の特許文献４、２００３年８月１５日出願の特許文献５、および２００３年９月１２日出願の特許文献６に、より詳細に論じられている。これらの出願は、結合したＣＡＲ材料およびＥＣＭタンパク質を有する支持体を含む表面を製造および使用する他の態様も開示する。
【００３６】
一実施形態では、１つまたは複数のＥＣＭタンパク質（または生物学的に活性なその断片もしくは変異体）および任意選択で１つまたは複数の活性因子（生物学的に活性なその断片または変異体）をＣＡＲ材料に結合させる。以下の組合せ：コラーゲンＩ＋ポリ−Ｌ−オルニチン（ＣＡＲ Ａ）、およびコラーゲンＩＶ＋ポリ−Ｌ−オルニチン（ＣＡＲ Ｂ）、およびコラーゲンＶＩおよびエラスチンが好ましい。これらを、例えばヒアルロン酸または他のＣＡＲ表面に結合させてもよい。
【００３７】
ＥＣＭタンパク質は、天然ポリペプチド（タンパク質）、組換えポリペプチド、または合成もしくは半合成ポリペプチドの形態、あるいはそれらの任意の組合せの形であることができる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【００３８】
ＥＣＭタンパク質のようなポリペプチドのクローニング、発現および精製を行う方法は、合成または半合成ポリペプチドを発生させる方法のように従来法である。ＥＣＭタンパク質を市販の供給源から得ることもできる。
【００３９】
他のＥＣＭタンパク質および活性因子の生物学的に活性な断片または変異体もＣＡＲ材料に結合させることができる。本明細書に使用する用語「生物学的に活性な断片または変異体」は、野生型ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを含む。例えば、（ＥＣＭタンパク質の）生物学的に活性な断片または変異体は、ＣＡＲ材料と結合できる一方で、本発明の方法に使用したときに細胞の付着および機能を促進する能力を保持しているものである。
【００４０】
ＣＡＲ表面に結合するための、および本明細書における使用のための好ましいＥＣＭタンパク質には、エラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩがある。好ましい活性因子には、ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−オルニチンがある。
【００４１】
ＥＣＭタンパク質および活性因子を共有結合または非共有結合（例えば静電力、イオン結合もしくは水素結合、親水性相互作用もしくは疎水性相互作用、ファンデルワールス力などのような受動吸着）のいずれかでＣＡＲ材料に結合させることができる。好ましい実施形態では、その結合は共有結合である。同時係属の特許文献２、特許文献３および特許文献４は、ＣＡＲ表面への分子のそのような共有結合について記載している。
【００４２】
ＣＡＲ材料が支持体に結合し、かつＥＣＭタンパク質がそのＣＡＲ材料に結合している表面を製造する方法は、同時係属の特許文献２、特許文献３および特許文献４に詳細に記載されている。簡潔には、支持体にＣＡＲ材料を付着させる一方法は、酸化プラズマでその支持体を処理すること、およびその処理後の支持体にＣＡＲ材料を結合させることを含む。支持体にＣＡＲ材料を付着させる別の方法は、酸化プラズマでその支持体を処理すること、その処理後の支持体に、（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）、ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）またはポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ）、好ましくはＰＥＩまたはＰＬＬのような）アミノ基を有するポリカチオン性ポリマーを曝露して中間層を形成させること、およびその中間層にＣＡＲ材料を結合させることを含む。ＣＡＲ材料にＥＣＭまたはポリカチオン性ポリマーを結合させる方法は、従来法である。これらには、例えば過酸化ナトリウムによる酸化および還元アミノ化などがある。
【００４３】
本発明の特定の実施形態では、Ｍｏｒｒａらの特許文献１に記載しているような方法を使用してＨＡをＰＳに結合させてＣＡＲ表面を生み出すことができる。ポリスチレン培養皿、９６ウェル平板またはスライドに酸化高周波プラズマ処理を受けさせ、その後ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液を曝露して表面に反応性アミン基を導入する。カルボジイミド／スクシンイミドが支える一次アミンとカルボン酸との縮合反応を使用してＰＥＩコーティングと多糖との間に共有結合を形成させる。あるいは、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）プラズマ処理中にポリスチレン表面に導入されたか、または（ＰＥＩの代わりに）ポリリジンコーティング上に導入されたアミン基を使用できる。
【００４４】
次に、過酸化ナトリウム酸化および還元アミノ化を含めた従来の生物コンジュゲーション法を使用して不活性ＨＡにＥＣＭタンパク質を共有結合的に連結する。任意の非共有結合的に付着した細胞外マトリックスタンパク質を塩−酸洗浄によって除去し、その後水で厳密にすすぐ。このプロセスによって、ＨＡによって提供される非汚損性（＝非特異的細胞付着を除去した）バックグラウンドに共有結合的に固定化された細胞外マトリックスタンパク質からなる十分に画定した表面が生み出される。
【００４５】
あるいは、アルギネート（アルギン酸としても知られる）を非接着性バックグラウンドとして使用でき、ＥＣＭタンパク質をＨＡに関して上述したのと同じ化学反応を使用してこの表面に固定化できる。また、ポリ−ＨＥＭＡまたは（ＰＥＯとしても知られている）ＰＥＧのような他の一般に知られている非接着性表面を、文献に記載されている、ＥＣＭタンパク質を連結するための多様な化学反応と組み合わせて使用できるであろう（非特許文献３を参照）。
【００４６】
多様な物品が本発明の表面を含むことができる。適切な物品は当業者に明らかであろう。そのような物品には、スライド（例えば組織スライド、顕微鏡スライドなど）、平板（例えばマイクロプレートを含めた培養平板またはマルチウェル平板）、フラスコ（例えば静置フラスコまたはスピナーフラスコ）、瓶（例えばローラーボトル）、バイオリアクターなどのような細胞培養容器がある。
【００４７】
より旧来の上記の二次元培養表面および培養容器以外に、本発明はＥＣＭタンパク質と共に本発明の組成物を（候補ペプチドがＣＡＲ表面上にあるときにＣＡＰ活性に関してそれらのペプチドを試験することを含めて）使用するための三次元（３Ｄ）足場の使用を含む。「三次元足場」は、本明細書においてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏいずれかの最初の細胞付着およびその後の組織形成に使用できる３Ｄ有孔テンプレートを指す。本発明による３Ｄ足場は、天然ポリマー、合成ポリマー、無機コンポジットおよびこれらの材料の組合せのような母材、ＣＡＲ層およびそれに結合したＥＣＭタンパク質、ならびに任意選択で細胞の付着および機能を促進または増強する活性因子を含む。３Ｄ足場は、同時係属の、本願の譲受人に譲渡された２００３年８月１５日出願の特許文献５および２００２年９月３０日出願の特許文献７にさらに詳細に論じられている。
【００４８】
本発明は、培養へのフレキシブル基材の使用も含む。例えば、Ｆｌｅｘｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ培養システムは、培養細胞に引張応力、圧縮応力または剪断応力を適用できる。（例えば、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２および特許文献１３を参照のこと）。特許文献１４は、細胞外マトリックスタンパク質でコートし培養細胞で覆うことのできる弾性膜への二軸歪の適用を開示している。特許文献１５は、弾性ストリップを備える単方向細胞伸展装置に細胞外マトリックスをコートし、その上に細胞を培養し伸展させる別のシステムを開示している。フレキシブル基材を容易に制御されたやり方で変形でき、その基材は従来の細胞培養基材に匹敵する細胞の接着および成長を支える。ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）のようなシリコーンは、高度に柔軟であるだけではなく細胞培養の顕微鏡観察を可能にする光学的な透明性も供することから、この適用に特に適している。フレキシブル基材は、同時係属で２００３年９月１２日出願の特許文献１６および特許文献１７にも記載されている。これらは、ＰＤＭＳ基材上にＣＡＲ表面を有する方法および物品を教示している。
【００４９】
本発明は、培養培地中の細胞に本発明の表面を接触させることを含む、培養初代肝細胞の付着および機能を促進する方法に関する。
【００５０】
任意の適切な手段によって細胞は表面に「接触」していることができ、また表面と接触させることができる。例えば表面を含む培養容器に培養培地中の細胞を流し入れる、ピペットで移す、分注することなどができ、また表面を含む医用装置または足場を、細胞が懸濁している培養培地に沈下させることができる。
【００５１】
本明細書に記載する本発明の任意の表面は、本方法に適する。一実施形態ではその表面は、ＨＡおよび任意選択でＣＡＲ表面に付着した活性因子に結合しているＥＣＭタンパク質を含む。好ましい実施形態では支持体はＰＳであり、ＣＡＲ材料はＨＡであり、ＥＣＭタンパク質は１つまたは複数のエラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩであり、ＥＣＭタンパク質はＨＡに共有結合している。さらに好ましい実施形態では、活性因子であるポリ−Ｌ−オルニチンまたはポリ−Ｄ−リジンはＣＡＲ表面に結合しており、ＨＡに共有結合しているＥＣＭタンパク質組成物を生み出す。本明細書の実施例は、本方法のＥＣＭタンパク質および活性因子のいくつかの組合せの使用を記載している。もちろん他の組合せも使用できる。
【００５２】
任意の多様な培養培地を本方法における発明の表面と共に使用できる。ＤＭＥＭ、Ｆ１２、αＭＥＭ、Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）、ＲＰＭＩまたはそれらの組合せのような市販入手可能な培地を、血清の存在下または不在下のいずれかで使用できる。適切な血清には子ウシ血清、ウシ胎仔血清、ウマ血清などがある。好ましくは合成の化学的に画定した無血清培地を使用する。多様な適切な化学的に画定した培地は、熟練作業者には明らかであろう。そのような培地の１つであるＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂ Ｗａｒｅ）培地を実施例に採用する。
【００５３】
上記の方法において、細胞の付着および機能の維持に効果的な条件で、細胞を本発明の表面と接触させる。「効果的な」条件は、測定可能な量の細胞付着および機能の維持を招く条件を意味する。熟練作業者は、効果的な条件を従来の方法を使用して容易に決定および／または最適化できる。変更する因子の中には例えば容器、培養培地、温度、Ｏ２／ＣＯ２濃度などがある。典型的な効果的な条件のいくつかを実施例に述べる。
【００５４】
本発明の別の態様は、培養物中の細胞の付着を変調（例えば刺激、阻害、強化など）する被験薬剤を同定するための方法であり、その方法は、（ａ）その細胞を本発明の表面および被験薬剤と接触させること、（ｂ）その細胞の付着を被験薬剤の不在下での類似した細胞の付着と比較して測定することを含み、（ｉ）被験薬剤の存在下での増加した付着は被験試料中に細胞の付着を刺激する因子が存在することを示し、（ｉｉ）被験薬剤の存在下で減少した付着はその試料中に細胞の付着を阻害する因子が存在することを示す。被験薬剤と平行して成長させた、被験薬剤を添加していない細胞と比較を行うことができ、または参照データベースと比較を行うことができる。好ましくは使用する培地は無血清である。
【００５５】
当業者の１人は、本方法で試験できる多様な種類の薬剤を認識しているであろう。例えば関心対象の細胞の活性（例えば細胞内シグナル伝達カスケード、代謝経路など）に影響する推定上薬物（例えばタンパク質、ペプチド、低分子、アンチセンス分子のような核酸、リボザイムまたはＲＮＡｉなど）を試験するために本方法を使用できる。薬物スクリーニング、創薬および潜在的薬物標的の同定以外に、潜在的薬剤が細胞に有毒であり、測定可能な有害作用を有し、無秩序な増殖（癌遺伝子形質転換）を誘導するかどうかを決定するために本方法を使用できる。
【００５６】
別の実施形態では、試験される薬剤は、関心対象のマーカーを誘導、増強または維持できるか、または望ましい細胞機能の維持に重要な推定上因子である。典型的には肝細胞で研究できるそのようなマーカー／機能には、（１）重要な肝臓細胞の機能であるチトクロムＰ４５０ファミリーの薬物／毒素代謝酵素（ＣＹＰ）の誘導、または（２）肝細胞の初代培養の際に通常は失われる機能であるアルブミンの生成がある。ＣＹＰの構造および機能についてのさらなる情報を、非特許文献４に見出すことができる。
【００５７】
試験できる薬剤の種類の中には、アンギオポイエチン２、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、エリスロポイエチン、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、幹細胞因子、ＧＤＦ６、ＣＳＦ、ＦＨ３／Ｆ２、ＴＧＦβなどのような増殖因子がある。あるいは、従来のコンビナトリアルケミストリーによって発生した低分子またはペプチドライブラリーを試験できる（例えば同時係属の特許文献３および特許文献１８を参照のこと）。他の種類の薬剤も熟練作業者に明らかであろう。
【００５８】
肝細胞の付着、生存、および／または増殖を促進するために有用なキットも提供され、そのキットは、本発明の表面と、細胞の培養ならびに細胞の付着、生存、および／または増殖を可能にすることに適した１つまたは複数の構成要素または試薬とを含む。培養物中の細胞の接着、生存および／または増殖（または任意の他の細胞挙動）を変調する因子の同定に有用な別のキット実施形態も本明細書に提供され、そのキットは、本発明の表面ならびに（ａ）細胞の付着、成長または細胞の生存の促進と、（ｂ）細胞の付着、生存および／もしくは増殖の測定とに適した１つまたは複数の構成要素または試薬を含む。
【００５９】
本発明を全般的に記載したが、以下の実施例を参照することによって同発明はより容易に理解されるであろう。実施例は例示の目的で提供され、明記しない限り本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００６０】
材料と方法
下記の本実施例に使用する表面を、必要に応じてコラーゲンＩＶの代わりにコラーゲンＩおよびコラーゲンＶＩを用いて特許文献３に記載する方法によって製造し、使用する表面を獲得した。
【００６１】
ラット初代肝細胞は、Ｘｅｎｏ Ｔｅｃｈ，ＬＬＣ（レネクサ、カンサス州）から入手され、単離から３時間以内にＢＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに発送された。ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ（ウォーバーン、マサチューセッツ州）がヒト初代肝臓細胞を単離し、その細胞は市販の器官保存培地（ＶｉａＳｐａｎ（商標））に入った状態で１２〜１５時間以内に発送された。懸濁状態のヒト細胞またはラット細胞を標準コラゲナーゼ消化法を使用して単離した。
【００６２】
完全に補充したＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国、ｃａｔ＃３５５０５６）に入れて細胞を再懸濁し、完全に補充したＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れて細胞２００００個／ウェルの初発密度で蒔き、非汚損表面と共有結合的に連結した多様な組合せの細胞外マトリックスタンパク質を有する平板に配置した。５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーターに平板を配置し、１〜７日間インキュベートした。平板から半分の容積の培地を除き、同容積の新鮮培地を加えることによってＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地を１日おきに交換した。
【００６３】
第６日または７日のいずれかに、下記のように３回繰り返しの平板をアッセイ用に採取した。同平板で３つのアッセイを行った：７−エトキシレゾルフィンを使用したＣＹＰ１Ａ活性、アルブミン分泌についてのアルブミン酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、および細胞数を決定するためのアッセイ（ＭＴＴ、核計数またはピコグリーンアッセイ）。２つの別々のラット肝臓調製物および１つのヒト肝臓調製物を用いて実験を繰り返した。
【００６４】
ＣＹＰ１Ａ活性アッセイおよび核染色を用いた細胞数えあげ
すべての培地を別々の平板に移し、アルブミン分泌についてのＥＬＩＳＡアッセイを行うことができるまで培地試料を−２０℃で凍結させた（下記参照）。５μＭ７−エトキシレゾルフィンおよび８０μＭジクメロール（ｄｉｃｕｍｅｒｏｌ）を細胞を有するすべてのウェルに加え、１分間隔で３０分間励起＝５４０ｎｍおよび発光＝５９０ｎｍでＢＭＧ Ｐｏｌａｒｓｔａｒ分光蛍光計で読み取り、ＣＹＰ１Ａ活性を検出した。
【００６５】
ＣＹＰ１Ａ活性アッセイの直後にレゾルフィン溶液を除去し、以下の方法の１つまたは複数を使用して細胞数を決定した。
【００６６】
１）核染色による細胞数：７−エトキシレゾルフィンを吸引し、ＢＤＴ基礎培地に溶かした１０μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３３４染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、ｃａｔ＃３５７０）および２ｍＭエチジウムホモダイマー−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、Ｄｅａｄ ｓｔａｉｎ ｃａｔ＃Ｌ−３３２４）を有する核染料を各ウェルに加えた。平板を室温で３０分間インキュベートし、ＨＴ Ｉｍａｇｅｒ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓの子会社、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ、ペンシルベニア州）で、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料については励起４０５ｎｍおよび発光４８０ｎｍで、エチジウムホモダイマー染料については励起５３５ｎｍおよび発光７５０ｎｍで（倍率×１０、ウェル１個あたり４か所）で蛍光画像を記録した。ＵＩＣ Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（商標）分析ソフトウェアを細胞計数に使用した。生細胞数を、総細胞から死細胞を引き算することによって決定した（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色−死染色）。データを３０分での総シグナルを細胞数で割った値として示す。ＣＹＰ１Ａ活性データを図１および図２に示す。
【００６７】
２）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を使用してＭＴＴアッセイによる細胞数を決定した。
【００６８】
３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（ユージーン、オレゴン州、米国、ｃａｔ．＃Ｐ７５８９）からのＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（商標）ＤＮＡ ｄｓＤＮＡ定量キットを使用してピコグリーンＤＮＡアッセイによる細胞数を決定した。
【００６９】
アルブミンＥＬＩＳＡアッセイ：
培地試料中のアルブミン分泌を測定するために、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝９．６）に溶かした２μｇ／ｍｌヒツジＩＧＧ抗ラットアルブミン抗体（未コンジュゲート、Ｃａｐｐｅｌ ｃａｔ＃５５７２９）をＰｒｏｂｉｎｄ Ａｓｓａｙ平板（Ｆａｌｃｏｎ３５３９１５）にコートし、４℃で一晩インキュベートした。抗体平板をＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０に溶かした１％ゼラチン（Ｂ型、７５ブルーム、Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｇ６６５０）で３７℃で３０分間ブロッキングした。ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０およびＥＣＭ被験平板からの１：４００に希釈したアルブミン（培地試料）で３回ブロッキング溶液をすすいだ。平板を３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０に溶かしたコンジュゲート抗アルブミン抗体をすべてのウェルに加えた。平板を３７℃で１時間（ペルオキシダーゼコンジュゲートヒツジＩｇＧ抗ラットアルブミン抗体Ｃａｐｐｅｌ＃５５７７６については３６．６ｍｇ／ｍｌから１：５００に希釈した）インキュベートし、再びＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ９９４１）に対する０．２５ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ基質（２，２‘−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩）を、０．０１％過酸化水素を有するクエン酸基質緩衝液（ｐＨ５．０）に添加してから、発色用の抗体平板に暗条件で室温で４０分間加えた。ペルオキシダーゼ反応を０．３２％フッ化ナトリウム溶液で停止させ、ＢＭＧ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダーを使用して吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【００７０】
下記の実施例に論じる対照条件を以下のように定義する：
１）ＨＳ＋ＭＧ＝Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上のＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地、
２）ＨＳ＋ＴＣＰＳ＝組織培養用ポリスチレン上のＢＤ Ｈｅｐｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地、
３）ブロックＴＣＰＳ：組織培養用ポリスチレン上のブロック培地（実施例１および３のみ）
ブロック培地は、非特許文献５による雑誌論文および特許文献１９に記載されている培地配合である。
【００７１】
（実施例１）
３つのＥＣＭ組成物のＣＹＰ１Ａ活性を、上記のように培養７日後のヒト初代肝臓細胞について７−エトキシレゾルフィンを使用して評価した。図１は、評価の結果を示す。図１に示すように、ヒアルロン酸上の細胞外マトリックスタンパク質の組合せは、市販の対照に比べてヒト初代肝臓細胞のＣＹＰ活性の維持のための等しいかまたはよりよい環境を提供する。３つのＥＣＭタンパク質組成物のＣＹＰ活性は標準組織培養用ポリスチレン上に配置した細胞に匹敵するか、それよりも良好であり、コラーゲンＩ＋ポリ−Ｌ−オルニチン（ＣＡＲ Ａ）は最高レベルの活性を示す。機能的活性は概して培養３日以内に失われることから、第７日のＣＹＰ活性は細胞機能の維持を示す。
【００７２】
（実施例２）
３つのＥＣＭ組成物のＣＹＰ１Ａ活性を、上記の方法を使用して第６日のラット初代肝臓細胞について７−エトキシレゾルフィンを使用して評価した。図２に、評価の結果を示す。総ＣＹＰ蛍光は図１における大部分のヒットよりも低かった。この場合も、３つのＥＣＭ組成物に関するＣＹＰ１Ａ活性は、ＨＡ単独または７−エトキシレゾルフィン単独のいずれかであるベースライン蛍光よりも一貫して高い。図の対照ウェルは、ＨＳ＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＨＳ＋ＴＣＰＳである。このように、ヒアルロン酸上の細胞外マトリックスタンパク質の組合せは、市販の対照に比べてラット初代肝細胞のＣＹＰ１Ａ活性の維持について等しいか、またはよりよい環境を提供する。
【００７３】
（実施例３）
ヒト初代肝臓細胞のアルブミン分泌レベルを上記のアッセイを使用して第７日に得た。図３に、３つのＥＣＭタンパク質組成物に関するこのデータを示す。データは、ＥＣＭタンパク質組成物を有するウェルでアルブミンの分泌が維持され、アルブミンレベルが組織培養ポリスチレンの対照ウェルに匹敵することを示す。機能的活性は概して培養３日以内に失われることから、第７日のアルブミン活性は細胞機能の維持を示している。このデータは、ＣＹＰ活性の維持も示す。このように、ヒアルロン酸上の細胞外マトリックスタンパク質の組合せは、市販の対照に比べてヒト初代肝細胞のアルブミン分泌の維持について等しいか、またはよりよい環境を提供する。
【００７４】
（実施例４）
３つのＥＣＭタンパク質組成物に関するラット初代肝臓細胞のアルブミン分泌レベルを、上記のように第６日に得た。図４に示すように、ヒアルロン酸上の細胞外マトリックスタンパク質の組合せは、市販の対照に比べてラット初代肝細胞のアルブミン分泌の維持について等しいか、またはよりよい環境を提供する。再び、ＥＣＭ組成物の活性のレベルは対照に匹敵するか、またはそれよりも優れ、アルブミン分泌の維持、よって細胞機能の維持を示している。
【００７５】
（実施例５）
コラーゲンＩ単独、ポリ−Ｌ−オルニチン単独、およびポリ−Ｌ−オルニチンを伴うコラーゲンＩの活性を比較する形態研究を初代肝細胞で行った。図５Ａ〜５Ｃは、第４日の細胞の形態を示す。図５Ａは、ＨＡ表面に共有結合的に連結したコラーゲンＩ単独を、図５Ｂは、ＨＡ表面に共有結合的に連結したポリ−Ｌ−オルニチン単独を、図５Ｃは、ＨＡ表面に共有結合的に連結したコラーゲンＩ＋ポリ−Ｌ−オルニチン（ＣＡＲ Ａ）を示す。コラーゲンＩ単独（図５Ａ）上で培養した細胞は拡散し、ポリ−Ｌ−オルニチン単独（図５Ｂ）上で培養した細胞は拡散も生存もしない。しかし、コラーゲンＩとポリ−Ｌ−オルニチンとの組合せ（図５Ｃ）は、生化学の結果（ＣＹＰおよびアルブミン、図１〜４）および形態が示すように、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で凝集する肝臓細胞と同じくらい多数の、肝機能を維持する多細胞凝集体の形成を引き起こす。このデータは、ＥＣＭ組成物が個別のＥＣＭおよび活性因子構成要素単独よりも優れていることを示す。機能の維持に重要なのはＥＣＭの組合せである。
【００７６】
（実施例６）
画定した細胞培養環境中でのチトクロムＰ４５０酵素の保存
チトクロムＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰＩＡ２の発現および誘導についてＣＡＲ ＡおよびＣＡＲ Ｂを試験した。ヒト肝臓細胞を上記のように成長させた。細胞の形態および付着、ＣＹＰ ｍＲＮＡの発現および誘導、ならびにテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性を測定した。
【００７７】
ヒト肝臓細胞をＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）に入れてＣＡＲ Ａ上で２０、４４および７２時間、コラーゲンＩ上で２０時間成長させた。図６に示すようにＣＡＲ Ａ表面はヒト肝臓細胞の付着および三次元構造の形成を可能にする。この種の三次元構造は、分化した肝臓の機能を維持するのに適していると予想される。
【００７８】
（実施例７）
ヒト肝臓細胞をＨｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ上で一晩成長させ、その後ＧＡＰＤＨ、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡレベルの測定を行った。Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，Ｉｎｃ．、フリーモント、カリフォルニア州からのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）ｂＤＮＡアッセイを使用してＲＮＡの測定を行った。ｂＤＮＡアッセイ用のヒトＣＹＰ３Ａ４および１Ａ２特異的プローブセットをＸｅｎｏ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、レネクサ、カンサス州から得た。図７Ａおよび７Ｂに示すように、これらのＲＮＡ種の初発レベルは、蒔いた初発細胞数を反映して３種の表面の間で類似している。パネルＡおよびＢは、種々の表面上のＣＹＰ ＲＮＡ種の比較を可能にする２つの異なる目盛りを示す。さらに長時間培養する間に細胞はＣＡＲ表面にあまり接着せず、細胞−細胞相互作用および形態変化を可能にし、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ転写体に対して標準化したＣＹＰ ＲＮＡレベルのよりよい維持を招く。
【００７９】
（実施例８）
２つの調製物からのヒト肝臓細胞をＨｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ上で成長させ、ＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの基礎レベルを経時的に測定した。ＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの基礎レベルをハウスキーピングＧＡＰＤＨ転写体に対して標準化した後に記録する。図８Ａおよび８Ｂに示すように、ＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの基礎レベルは上昇し、より長時間維持される。これは薬物代謝を決定するために細胞をより長時間使用できることを示している。
【００８０】
（実施例９）
ヒト肝臓細胞をＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ上で成長させ、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの基礎レベルを経時的に測定した。図９Ａおよび９Ｂに示した結果は、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの基礎レベルも上昇し、コラーゲンＩよりもＣＡＲ表面上で長時間維持されることを実証している。ヒトの薬物代謝の最も重要なアイソフォームであるＣＹＰ３Ａ４は標準培養条件では速やかに失われるが、ＣＡＲ ＡおよびＣＡＲ Ｂ表面では維持される。
【００８１】
（実施例１０）
ヒト肝臓細胞をＨｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で成長させた。培養５日後に細胞をＣＹＰ３Ａ４の公知の誘導剤である薬物リファンピシン（２０μＭ）で２４時間処理するか、または未処理対照のいずれかとした。対照およびリファンピシン誘導ヒト肝臓細胞におけるＧＡＰＤＨおよびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡの相対レベルを培養第６日に測定した。図１０Ａ〜１０Ｃに示した結果は、ＣＡＲ表面がＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの誘導を維持することを実証している。さらに、前の実施例に記載したように細胞はＣＡＲ表面にあまり接着せず、細胞−細胞相互作用および形態変化を可能にして、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ転写体に対して標準化したＣＹＰ ＲＮＡレベルのよりよい維持を招く。このように、表面上の細胞数を反映するように標準化した後で、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの基礎レベルおよび誘導レベルは、標準的なコラーゲン１表面よりもＣＡＲ表面の場合の方が高い。
【００８２】
（実施例１１）
ヒト肝臓細胞の２つの調製物をＨｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地に入れて、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で成長させた。培養時間に細胞を２０ｕＭリファンピシンで２４時間誘導し、次いでＣＹＰ３Ａ４およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定した。アッセイする細胞数を反映するようにＧＡＰＤＨ転写体に対して標準化した後でＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベルを記録する。図１１Ａおよび１１Ｂに示す結果は、ＣＡＲ ＡおよびＣＡＲ Ｂが誘導されたＣＹＰ３Ａ４レベルの維持にコラーゲンよりも優れていることを実証している。
【００８３】
（実施例１２）
ヒト肝臓細胞をＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴｌＭ（商標）培地に入れてＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ上で４日間成長させた。追加の７２時間１０μＭリファンピシンで培養物を誘導し、対照培養物にはリファンピシンを含有させなかった。テストステロン（２００μＭ）を添加し、インキュベーション３０分後にテストステロンから６β−ヒドロキシ−テストステロンへの変換を高速液体クロマトグラフィーを使用して測定した（非特許文献６）。図１２は、ＣＡＲ表面上でのテストステロン６β−ヒドロキシラーゼの酵素活性の誘導および特にＣＡＲ−Ｂ表面上での誘導活性のレベルの改善を示す（＊、Ｐ＜０．０５）。
【００８４】
（実施例１３）
表Ｉに示すように多様な濃度のコラーゲンＩおよびポリ−オルニチンを使用して誘導体化したＣＡＲ表面を調製した。ラット肝臓細胞をウェル１個あたり細胞５００００個となるようにウェルに蒔き、６日間成長させた。表面上の種々の形態を観察した（図１３）。上記のように７−エトキシレゾルフィンを使用して各ウェル中のＣＹＰ１Ａ測定した。表１の第４列に示す相対生物学的活性は、３０分での蛍光シグナルをゼロ時間での蛍光シグナルで割った値を表す。これらの結果は、ＣＡＲ表面上のＥＣＭ（コラーゲンＩ）および活性因子（ポリ−オルニチン）の濃度を調整して細胞の形態および相対的な細胞機能を改善し釣り合わせることができることを示している。
【００８５】
【表１】
【００８６】
結果は、２つの酵素であるチトクロムＰ４５０ １Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）およびチトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）の維持を実証している。その維持は、ＣＹＰ１Ａ２についてはｍＲＮＡレベルで、ＣＹＰ３Ａ４についてはｍＲＮＡおよび酵素活性のレベルで観察される。さらに、その表面は、細胞が化学薬剤の曝露に応答してＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４両方のレベルを増加させる、誘導として知られるプロセスの能力を維持する。
【００８７】
本明細書に記載された方法および表面の使用によって、組織培養用に処理されたポリスチレン上のＩ型コラーゲンのような現在使用されている表面上で可能であるよりも長時間組織培養でＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４を維持することが可能になる（非特許文献７）。誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性がコラーゲンＩ上よりもＣＡＲ−Ｂ表面上で大きかったことは、予想外であった。ＣＹＰ１ＡおよびＣＹＰ３Ａ４両方のＲＮＡレベルが６日間ＣＡＲ表面上で維持されたことも予想外であった。
【００８８】
本発明の表面は、肝細胞を培養するときに普通みられる細胞の形状および細胞−細胞相互作用の変化を防止する。おそらく標準的な培養でみられる細胞の形状における変化（いわゆる玉石状形態）は酵素活性の維持に有害で、ＢＤ表面上にみられる細胞クラスターの形態は酵素活性の維持を助けている。
【００８９】
新規な細胞培養表面を市販入手可能な多くの標準二次元細胞培養形式で発生させることができる。これらには６ウェルから９６ウェル平板形式およびフラスコ形式がある。本明細書で使用した表面は、組織足場およびバイオリアクターを含めた三次元培養形式にも使用できる。さらに新規な細胞培養表面を含む構成要素の濃度を変動させて所望の酵素活性および細胞対表面の細胞接着を果たすことができる。
【００９０】
本明細書において引用したすべての参照および特許は、本明細書により参照により組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】１）ヒアルロン酸上のコラーゲンＶＩおよびエラスチン（Ｃｏｌ ＶＩ＋エラスチン）、２）ヒアルロン酸上のコラーゲンＩＶおよびポリ−Ｌ−オルニチン（Ｃｏｌ ＩＶ＋Ｏｒｎ＝ＣＡＲ Ｂ）、３）ヒアルロン酸上のコラーゲンＩおよびポリ−Ｌ−オルニチン（Ｃｏｌ Ｉ＋Ｏｒｎ＝ＣＡＲ Ａ）、４）組織培養用ポリスチレン上のブロック培地（Ｂｌｏｃｋ ＴＣＰＳ）、５）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上のＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地（ＨＳ＋ＭＧ）、６）組織培養用ポリスチレン上のＢＤ Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ（商標）培地（ＨＳ ＴＣＰＳ）の上でのヒト初代肝臓細胞の付着および細胞機能（ＣＹＰ活性）の維持を示す図である。比は、総ＣＹＰ１Ａ活性を細胞数で割った値を表す。
【図２】ラット初代肝臓細胞の付着および細胞機能（ＣＹＰ活性）の維持を示す図である。比は、総ＣＹＰ１Ａ活性を細胞数で割った値を表す。
【図３】ヒト初代肝臓細胞の付着およびアルブミン分泌の維持を示す図である。
【図４】ラット初代肝臓細胞の付着およびアルブミン分泌の維持を示す図である。
【図５Ａ】ＣＡＲ表面上のコラーゲンＩ上で培養した初代肝臓細胞の形態を示す図である。
【図５Ｂ】ＣＡＲ表面上のオルニチン上で培養した初代肝臓細胞の形態を示す図である。
【図５Ｃ】ＣＡＲ表面上のコラーゲンＩ＋オルニチン上で培養した初代肝臓細胞の形態を示す図である。
【図６】ＡからＤは、ＣＡＲ Ａ上で平板培養した２０、４４および７２時間後の、ならびにコラーゲンＩ表面上で平板培養した２０時間後のヒト肝臓細胞の形態を示す図である。
【図７】ＡおよびＢは、第１日でのＣＡＲ Ａ表面およびＣＡＲ Ｂ表面上でのチトクロムＰ４５０ ｍＲＮＡの発現を標準的なコラーゲン１表面と比較して示す図である。Ａは、Ｂの発展版である。
【図８】ＡおよびＢは、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上の２つのヒト肝細胞調製物のＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの基礎レベルを経時的に示す図である。測定された値は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較したものである。
【図９】ＡおよびＢは、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で培養したヒト肝細胞のＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの基礎レベルを経時的に示す図である。測定された値は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較したものである。
【図１０】ＡからＣは、ＣＡＲ表面が誘導を維持することを示す図である。（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔａアッセイを使用して第６日にＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡを測定）
【図１１】ＡおよびＢは、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で培養した細胞から誘導されたＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡのレベルを経時的に示す図である。
【図１２】ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ ＢおよびコラーゲンＩ表面上で成長した細胞における１０μＭリファンピシンによるテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性の誘導を示す図である。
【図１３】表１に記載する種々の表面上での細胞形態を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
初代肝細胞を付着および／または維持するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が前記表面に付着して機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＣＭがエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、およびコラーゲンＶＩからなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＡＲ材料に結合している活性因子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記活性因子がポリカチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）およびポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が非共有結合していることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が共有結合していることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＣＭタンパク質がエラスチンおよびコラーゲンＶＩであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩＶであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＡＲ材料がヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、およびポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
修飾されたＥＣＭタンパク質組成物が三次元（３Ｄ）足場の形であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾されたポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記フレキシブル材料がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または他のシリコーンベースのポリマーであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法によって成長させることを特徴とする細胞培養物。
【請求項１８】
ヒト初代肝細胞を含むことを特徴とする請求項１７に記載の細胞培養物。
【請求項１９】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の細胞培養物。
【請求項２０】
前記ＥＣＭがエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩからなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の細胞培養物。
【請求項２１】
前記ＣＡＲ表面に結合している活性因子をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の培養物。
【請求項２２】
前記活性因子がポリカチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２３】
前記ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）およびポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載の培養物。
【請求項２４】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が前記ＣＡＲ表面に非共有結合していることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２５】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が前記ＣＡＲ表面に共有結合していることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２６】
前記ＥＣＭタンパク質がエラスチンおよびコラーゲンＶＩであることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２７】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２８】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩＶであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２９】
被験薬剤を、肝細胞の細胞機能に及ぼす被験薬剤の影響についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供する段階と、
（ｂ）前記細胞の成長／維持を支える培地中で前記表面上で前記肝細胞を培養する段階であって、被験薬剤が前記培地に含まれるか、または前記表面に結合している段階と、
（ｃ）前記培養の開始後の時間ｔで特異的細胞機能を定量して値を得る段階と、
（ｄ）段階ｃで得られた値を前記被験薬剤の不在下の同一の培養における値と比較する段階と
を含み、前記被験薬剤の存在下での値の増加は前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、減少は前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示すことを特徴とする方法。
【請求項３０】
前記細胞機能が酵素活性、タンパク質の増加または減少した産生、ＲＮＡの増加または減少した産生、増加または減少したビリルビン分泌、増加または減少したアルブミン分泌、および増加または減少した薬物輸送からなる群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞機能が増加または減少したＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリマー表面がＨＡ、ＡＡ、ＰＥＧおよびポリ−ＨＥＭＡからなる群から選択されるＣＡＲ材料を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマー表面が３Ｄマトリックス足場であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記肝細胞が細胞療法に適した装置または足場の中または上に収容されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
選択的な細胞の付着および機能の維持に有用なＥＣＭ組成物を生成させるための方法であって、細胞の付着および機能の維持を促進する１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および活性因子をＣＡＲ表面に適用し、その結果、前記タンパク質および活性因子がそれに共有結合するようになり、これによって、前記ＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させる段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
選択的な細胞の付着および機能に有用なＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させるための方法であって、
（ａ）ポリマー表面を提供する段階と、
（ｂ）前記表面を処理してＣＡＲ表面を生成させる段階と、
（ｃ）前記ＣＡＲ表面を、細胞の付着および機能を促進する少なくとも１つのＥＣＭタンパク質および任意選択で活性因子で処理し、その結果、前記タンパク質および活性因子がそれに共有結合するようになる段階と
を含み、それにより前記ＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させることを特徴とする方法。
【請求項３９】
肝細胞の付着または機能の維持を促進するために有用な細胞接着促進（ＣＡＰ）ＥＣＭ修飾組成物であって、１つまたは複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が共有結合して修飾ＣＡＰ表面を形成している細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料でできた／作られたポリマー表面を含み、前記タンパク質／表面が、
（ａ）細胞の付着であって、細胞が前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面に実質的に付着しない、細胞の付着、および
（ｂ）任意選択で、ＥＣＭ修飾表面に付着している細胞の機能の維持であって、細胞が前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面上で実質的に機能を維持しない、細胞の機能の維持
を促進することを特徴とする組成物。
【請求項４０】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ＥＣＭがエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩからなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
活性因子が前記ＣＡＲ表面に付着／結合していることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
前記活性因子がポリカチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）およびポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が前記ＣＡＲ表面に非共有結合していることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が前記ＣＡＲ表面に共有結合していることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ＥＣＭタンパク質がエラスチンおよびコラーゲンＶＩであることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項４４に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩＶであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項４４に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＣＡＲ材料がヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、およびポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記修飾ＥＣＭ組成物が三次元（３Ｄ）足場の形であることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記修飾ポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５４】
前記フレキシブル材料がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または別のシリコーンベースのポリマーであることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５５】
ＥＣＭ修飾ＣＡＲポリマー表面に細胞を付着させるための方法であって、
（ａ）請求項３９に記載の組成物を提供すること、
（ｂ）接着細胞を前記組成物と接触させること、
（ｃ）前記細胞を前記ＥＣＭ修飾表面に付着させること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
初代肝細胞を付着および／または維持するための方法であって、
（ａ）コラーゲンＩおよびポリ−Ｌ−オルニチンが結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項５７】
初代肝細胞を付着および／または維持するための方法であって、
（ａ）コラーゲンＩＶおよびポリ−Ｌ−オルニチンが結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項５８】
初代肝細胞を付着および／または維持するための方法であって、
（ａ）コラーゲンＶＩおよびエラスチンが結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項５９】
ラット初代肝細胞またはヒト初代肝細胞の培養物であることを特徴とする請求項１５に記載の細胞培養物。
【請求項６０】
前記細胞がラット初代肝細胞またはヒト初代肝細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
前記肝細胞においてチトクロムＰ４５０酵素が維持されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
ＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性の少なくとも一方が維持されていることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞においてＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性の少なくとも一方が維持されていることを特徴とする請求項１８に記載の培養物。
【請求項６４】
前記細胞においてチトクロムＰ４５０酵素が維持されていることを特徴とする請求項１８に記載の培養物。
【請求項６５】
適切な培養培地を配合するための組成物および／または使用説明書を任意選択で含む、請求項３９から５４の一項に記載の組成物を含むことを特徴とするキット。
【請求項６６】
培養物中の細胞の付着を変調する被験薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）培養培地中で細胞を、１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面および前記被験薬剤と接触させること、
（ｂ）前記細胞の付着を、前記被験薬剤の不在下での類似した培養物中の細胞の付着と比較して測定すること
を含み、
（ｉ）前記被験薬剤の存在下での増加した付着は、前記被験試料中に前記細胞の付着を刺激する因子が存在することを示し、かつ
（ｉｉ）前記被験薬剤の存在下での減少した付着は、前記試料中に前記細胞の付着を阻害する因子が存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項６７】
前記細胞が初代肝細胞であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記培地が無血清であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記表面がＣＡＲ ＡまたはＣＡＲ Ｂを含むことを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
被験薬剤を、肝細胞の細胞機能に及ぼす被験薬剤の影響について前記被験薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供する段階と、
（ｂ）前記細胞の成長／維持を支える培地中で前記表面上で肝細胞を培養し、さらにそれに試験薬剤を提供し、前記試験薬剤が前記培地中に存在するか、または前記ポリマー表面に結合している段階と、
（ｃ）前記被験薬剤の不在下で前記細胞の成長／維持を支える培地中で前記表面上で肝細胞を培養する段階と、
（ｄ）段階（ｂ）における培養の開始後の時点で特異的細胞機能の値を測定する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られた特異的細胞機能の値を、段階（ｃ）の培養物から定量された同一の特異的細胞機能の値と比較する段階と
を含み、段階（ｅ）の細胞特異的機能の値の相対的な増加は、前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、段階（ｅ）の細胞特異的機能の値の相対的な減少は、前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示すことを特徴とする方法。
【請求項７１】
前記細胞機能が酵素活性、タンパク質の増加または減少した産生、ＲＮＡの増加または減少した産生、増加または減少したビリルビン分泌、増加または減少したアルブミン分泌、および増加または減少した薬物輸送からなる群から選択されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞機能が増加または減少したＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリマー表面がＨＡ、ＡＡ、ＰＥＧおよびポリ−ＨＥＭＡからなる群から選択されるＣＡＲ材料を含むことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリマー表面が３Ｄマトリックス足場であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項１】
初代肝細胞を付着および／または維持するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が前記表面に付着して機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＣＭがエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、およびコラーゲンＶＩからなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＡＲ材料に結合している活性因子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記活性因子がポリカチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）およびポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が非共有結合していることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が共有結合していることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＣＭタンパク質がエラスチンおよびコラーゲンＶＩであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩＶであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＡＲ材料がヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、およびポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
修飾されたＥＣＭタンパク質組成物が三次元（３Ｄ）足場の形であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾されたポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記フレキシブル材料がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または他のシリコーンベースのポリマーであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法によって成長させることを特徴とする細胞培養物。
【請求項１８】
ヒト初代肝細胞を含むことを特徴とする請求項１７に記載の細胞培養物。
【請求項１９】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の細胞培養物。
【請求項２０】
前記ＥＣＭがエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶＩからなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の細胞培養物。
【請求項２１】
前記ＣＡＲ表面に結合している活性因子をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の培養物。
【請求項２２】
前記活性因子がポリカチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２３】
前記ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）およびポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載の培養物。
【請求項２４】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が前記ＣＡＲ表面に非共有結合していることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２５】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が前記ＣＡＲ表面に共有結合していることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２６】
前記ＥＣＭタンパク質がエラスチンおよびコラーゲンＶＩであることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２７】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２８】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩＶであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項２１に記載の培養物。
【請求項２９】
被験薬剤を、肝細胞の細胞機能に及ぼす被験薬剤の影響についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供する段階と、
（ｂ）前記細胞の成長／維持を支える培地中で前記表面上で前記肝細胞を培養する段階であって、被験薬剤が前記培地に含まれるか、または前記表面に結合している段階と、
（ｃ）前記培養の開始後の時間ｔで特異的細胞機能を定量して値を得る段階と、
（ｄ）段階ｃで得られた値を前記被験薬剤の不在下の同一の培養における値と比較する段階と
を含み、前記被験薬剤の存在下での値の増加は前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、減少は前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示すことを特徴とする方法。
【請求項３０】
前記細胞機能が酵素活性、タンパク質の増加または減少した産生、ＲＮＡの増加または減少した産生、増加または減少したビリルビン分泌、増加または減少したアルブミン分泌、および増加または減少した薬物輸送からなる群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞機能が増加または減少したＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリマー表面がＨＡ、ＡＡ、ＰＥＧおよびポリ−ＨＥＭＡからなる群から選択されるＣＡＲ材料を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマー表面が３Ｄマトリックス足場であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記肝細胞が細胞療法に適した装置または足場の中または上に収容されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
選択的な細胞の付着および機能の維持に有用なＥＣＭ組成物を生成させるための方法であって、細胞の付着および機能の維持を促進する１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および活性因子をＣＡＲ表面に適用し、その結果、前記タンパク質および活性因子がそれに共有結合するようになり、これによって、前記ＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させる段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
選択的な細胞の付着および機能に有用なＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させるための方法であって、
（ａ）ポリマー表面を提供する段階と、
（ｂ）前記表面を処理してＣＡＲ表面を生成させる段階と、
（ｃ）前記ＣＡＲ表面を、細胞の付着および機能を促進する少なくとも１つのＥＣＭタンパク質および任意選択で活性因子で処理し、その結果、前記タンパク質および活性因子がそれに共有結合するようになる段階と
を含み、それにより前記ＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させることを特徴とする方法。
【請求項３９】
肝細胞の付着または機能の維持を促進するために有用な細胞接着促進（ＣＡＰ）ＥＣＭ修飾組成物であって、１つまたは複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が共有結合して修飾ＣＡＰ表面を形成している細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料でできた／作られたポリマー表面を含み、前記タンパク質／表面が、
（ａ）細胞の付着であって、細胞が前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面に実質的に付着しない、細胞の付着、および
（ｂ）任意選択で、ＥＣＭ修飾表面に付着している細胞の機能の維持であって、細胞が前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面上で実質的に機能を維持しない、細胞の機能の維持
を促進することを特徴とする組成物。
【請求項４０】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ＥＣＭがエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩからなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
活性因子が前記ＣＡＲ表面に付着／結合していることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
前記活性因子がポリカチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）およびポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が前記ＣＡＲ表面に非共有結合していることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が前記ＣＡＲ表面に共有結合していることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ＥＣＭタンパク質がエラスチンおよびコラーゲンＶＩであることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項４４に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩＶであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項４４に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＣＡＲ材料がヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、およびポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記修飾ＥＣＭ組成物が三次元（３Ｄ）足場の形であることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記修飾ポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５４】
前記フレキシブル材料がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または別のシリコーンベースのポリマーであることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項５５】
ＥＣＭ修飾ＣＡＲポリマー表面に細胞を付着させるための方法であって、
（ａ）請求項３９に記載の組成物を提供すること、
（ｂ）接着細胞を前記組成物と接触させること、
（ｃ）前記細胞を前記ＥＣＭ修飾表面に付着させること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
初代肝細胞を付着および／または維持するための方法であって、
（ａ）コラーゲンＩおよびポリ−Ｌ−オルニチンが結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項５７】
初代肝細胞を付着および／または維持するための方法であって、
（ａ）コラーゲンＩＶおよびポリ−Ｌ−オルニチンが結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項５８】
初代肝細胞を付着および／または維持するための方法であって、
（ａ）コラーゲンＶＩおよびエラスチンが結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項５９】
ラット初代肝細胞またはヒト初代肝細胞の培養物であることを特徴とする請求項１５に記載の細胞培養物。
【請求項６０】
前記細胞がラット初代肝細胞またはヒト初代肝細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
前記肝細胞においてチトクロムＰ４５０酵素が維持されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
ＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性の少なくとも一方が維持されていることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞においてＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性の少なくとも一方が維持されていることを特徴とする請求項１８に記載の培養物。
【請求項６４】
前記細胞においてチトクロムＰ４５０酵素が維持されていることを特徴とする請求項１８に記載の培養物。
【請求項６５】
適切な培養培地を配合するための組成物および／または使用説明書を任意選択で含む、請求項３９から５４の一項に記載の組成物を含むことを特徴とするキット。
【請求項６６】
培養物中の細胞の付着を変調する被験薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）培養培地中で細胞を、１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面および前記被験薬剤と接触させること、
（ｂ）前記細胞の付着を、前記被験薬剤の不在下での類似した培養物中の細胞の付着と比較して測定すること
を含み、
（ｉ）前記被験薬剤の存在下での増加した付着は、前記被験試料中に前記細胞の付着を刺激する因子が存在することを示し、かつ
（ｉｉ）前記被験薬剤の存在下での減少した付着は、前記試料中に前記細胞の付着を阻害する因子が存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項６７】
前記細胞が初代肝細胞であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記培地が無血清であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記表面がＣＡＲ ＡまたはＣＡＲ Ｂを含むことを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
被験薬剤を、肝細胞の細胞機能に及ぼす被験薬剤の影響について前記被験薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー表面を提供する段階と、
（ｂ）前記細胞の成長／維持を支える培地中で前記表面上で肝細胞を培養し、さらにそれに試験薬剤を提供し、前記試験薬剤が前記培地中に存在するか、または前記ポリマー表面に結合している段階と、
（ｃ）前記被験薬剤の不在下で前記細胞の成長／維持を支える培地中で前記表面上で肝細胞を培養する段階と、
（ｄ）段階（ｂ）における培養の開始後の時点で特異的細胞機能の値を測定する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られた特異的細胞機能の値を、段階（ｃ）の培養物から定量された同一の特異的細胞機能の値と比較する段階と
を含み、段階（ｅ）の細胞特異的機能の値の相対的な増加は、前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、段階（ｅ）の細胞特異的機能の値の相対的な減少は、前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示すことを特徴とする方法。
【請求項７１】
前記細胞機能が酵素活性、タンパク質の増加または減少した産生、ＲＮＡの増加または減少した産生、増加または減少したビリルビン分泌、増加または減少したアルブミン分泌、および増加または減少した薬物輸送からなる群から選択されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞機能が増加または減少したＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリマー表面がＨＡ、ＡＡ、ＰＥＧおよびポリ−ＨＥＭＡからなる群から選択されるＣＡＲ材料を含むことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリマー表面が３Ｄマトリックス足場であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００７−５１３６０３（Ｐ２００７−５１３６０３Ａ）
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６９３９（Ｐ２００６−５２６９３９）
【出願日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９４６６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２８６３９
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９４６６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２８６３９
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
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