制御性Ｔ細胞の製造方法

【課題】哺乳動物、特にヒト等の霊長類の制御性Ｔ細胞を製造する方法を提供すること
【解決手段】ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法が提供される。該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は抗原刺激下で培養され得る。当該方法によれば、インビトロで哺乳動物の制御性Ｔ細胞を製造することが可能であり、抗原特異的な制御性Ｔ細胞を製造することも可能である。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫調節薬として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御性Ｔ細胞の製造方法、該方法により製造された制御性Ｔ細胞、該制御性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる免疫調節剤、免疫調節剤の製造方法、制御性Ｔ細胞製造用キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植の術後、拒絶反応を抑制するために免疫抑制剤が使用される。ところが、免疫抑制剤により感染症が惹起されることがしばしばあり、移植後の患者の死亡原因の一番は、感染症である。このように、現在の移植医療は、その外科的手技は確立されたものの、拒絶抑制対策と感染症対策とが治療戦略上の矛盾を生み、この両者を両立させることが緊急の課題となっている。こうした状況下で、免疫寛容―すなわち免疫抑制剤を使用せずに移植臓器が十分に機能する状態―がどのようなメカニズムで成立するのか、また免疫寛容をどのようにして積極的に誘導するのかについての研究が移植医療の領域では大きな柱となってきている。これは、移植医療の研究が、臓器保存や手術法の改良というレベルを終了し、明瞭に第二層に入ったことを意味するものである。
近年、CD25⁺CD4⁺制御性Ｔ細胞（制御性Ｔ細胞をTreg(s)という場合がある）が臓器移植後の免疫寛容に重要な働きをしているとの知見が、動物実験のレベルで、急速に集積されつつある。本発明者らは、生体肝移植後に免疫寛容が自然に成立した患者において同細胞が増加していることを確認した（非特許文献１）。また、マウスの系では、本発明者らにより、制御性Ｔ細胞をいったん分離して試験管内でドナー抗原特異的に培養し、再度体内に戻すいわゆる細胞養子免疫の手法を用いることで皮膚移植片が拒絶されないことが示されている（非特許文献２）。これらのことから、ヒトの移植医療においても、免疫寛容を積極的に誘導する有効な方法として、制御性Ｔ細胞の試験管内での増殖、患者への移入、すなわち細胞養子免疫療法が考えられる。試験管内で制御性Ｔ細胞を増殖させた場合に、その制御能が維持されるということは細胞養子免疫療法を行ううえで、必須であるが（Nat Rev Immunol., Mar;3(3), 199-210, 2003）、ヒトでは制御性Ｔ細胞を制御能を失うことなく試験管内で高倍率に増殖させたという報告がない。
ヒトCD25⁺CD4⁺制御性Ｔ細胞は、インビボで、内在性の自己抗原に対する免疫寛容において、そしてより最近では臓器移植後の移植免疫寛容において、必須な役割を果たしていることが報告されている（Annu Rev Immunol., 22, 531-562, 2004、Nat Rev Immunol., 2, 389-400, 2002、Nat Rev Immunol., 3, 199-210, 2003）。インビボにおいて、ヒトTregsは、細胞表面CD4⁺及びCD25^high+、Foxp3発現、細胞内CTLA-4、細胞表面GITR、TNFRII、及び自己及びアロ抗原に対する不応答性／免疫抑制能等の特性に加えて、メモリー表現型−CD45RO⁺によって特徴付けられる（J Immunol., 167, 1245-1253, 2001、J Exp Med., 193, 1285-1294, 2001、J Exp Med., 193, 1295-1302, 2001、Blood, 98, 2736-2744, 2001、Eur J Immunol., 32, 1621-1630, 2002、Int Immunol., 16, 1643-1656, 2004、Exp Hematol, 32, 622-629, 2004）。実験的には、胸腺細胞からのCD25^＋CD4⁺細胞を除去したものを免疫不全宿主に対して養子移入すると、自己免疫疾患を発症し（J Immunol., 162, 5317-5326, 1999）、また、あるげっ歯類モデルにおいては、移植前の胸腺摘出により、Tregs介在性の移植免疫寛容が成立しなくなる（Transplantation, 76, 588-596, 2003）。これらの実験的証拠に一致して、高いレベルのFoxp3を発現しているCD25⁺CD4⁺Ｔ細胞がヒト胸腺中に存在している（Blood, 102, 4107-4114, 2003、Eur J Immunol, 35, 383-390, 2005）。これらの観察に基づけば、Tregsは胸腺内に起源し、末梢に向かって移出し、末梢免疫寛容の成立に寄与しているようである。ヒト胸腺中のCD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、Foxp3を発現し、不応答性／免疫抑制能の特性を示すにも関わらず、CD45ROの代わりに、ナイーブ細胞の表現型であるCD45RAを呈する（非特許文献３−７）。これは、末梢中のTregsと胸腺内のCD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は表現型として異なっていることを意味する。従って、胸腺由来のナイーブ表現型を呈するTregは、メモリー表現型を呈するTregsに発生するはずである。しかしながら、末梢におけるTregsの分化カスケードは、動物モデルにおいてもヒトにおいても理解されないままである。従って、胸腺由来の「ナイーブタイプ：未成熟Tregs」が、どのように、そしてどこで、「メモリータイプ：成熟Tregs」の特性を獲得するのかということについての疑問が生じる。
末梢血中のCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、これまでTregsからは異なる存在と考えられていた。なぜなら、この集団は不応答性の特性も抑制性の特性も示さず、むしろ、アロ抗原及び作動性抗ＣＤ３抗体の刺激により増殖を示すからである（非特許文献８）。その代わりに、末梢では、不応答性／免疫抑制能の特性を示すCD45RA^-CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞がTregsを代表している。しかしながら、以下に言及する点は興味深い；
（１）末梢血中のCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、胸腺、または臍帯血中のCD25⁺CD4⁺Ｔ細胞の有するナイーブ細胞の表現型であるCD45RA⁺を共有する（非特許文献７、９）。
（２）幾つかの研究が、末梢血から単離された時点でのみ、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞の機能的な面をみているが（非特許文献８、１０、１１）、インビトロ培養後のその機能の変化や、遺伝子的特徴は、いまだ詳細には研究されていない。
【非特許文献１】Am J Transpl, 4巻, 2118頁, 2004
【非特許文献２】Int Immunol., 16巻, 1189-1201頁, 2004
【非特許文献３】Blood, 102巻, 4107-4114頁, 2003
【非特許文献４】Eur J Immunol., 35巻, 383-390頁, 2005
【非特許文献５】Eur J Immunol., 31巻, 1247-1254頁, 2001
【非特許文献６】J Exp Med, 196巻, 379-387頁, 2002
【非特許文献７】Immunology, 106巻, 190-199頁, 2002
【非特許文献８】Int Immunol., 16巻, 1643-1656頁, 2004
【非特許文献９】Exp Hematol., 32巻, 622-629頁. 2004
【非特許文献１０】J Exp Med., 193巻, 1285-1294頁, 2001
【非特許文献１１】Eur J Immunol. 32巻, 1621-1630頁, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記事情に鑑み、本発明は、哺乳動物、特にヒト等の霊長類の制御性Ｔ細胞を製造する新たな方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、末梢血中のCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞の性質に焦点をあて、上記目的を達成すべく鋭意研究を進めた結果、以下の知見を見出した。
即ち、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、多くのナイーブ表現型を呈し、その頻度は年齢依存的な様式で徐々に低下した。末梢のTregsとは異なる表現型を呈するにも関わらず、この集団は非常に高いFoxp3レベルを発現し、Tregsと同様に、細胞内にCLTA-4と細胞表面にTNFRIIを発現していた。末梢血から分離された時点では、Tregsとは異なり、この集団は不応答性の特質も免疫抑制能の特質も示さず、しかしむしろ、作動性抗CD3抗体の存在下で、アロ抗原に対して増殖を示した。そして、重要なことには、該集団は、アロ抗原と培養・増殖された後に、Tregsの有する不応答性／抗原特異的免疫抑制能の特性を獲得した。
これらの観察結果に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下に関する。
（１）ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。
（２）該ナイーブ表現型がCD45RA⁺、CD45RO^low+、CD45RB^high+、CD62L^high+、及びCD38⁺からなる群から選択される少なくともいずれかである、上記（１）記載の方法。
（３）該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞はFoxp3⁺、細胞内CTLA-4⁺、及びTNFRII⁺からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有する、上記（１）記載の方法。
（４）該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は霊長類由来である、上記（１）記載の方法。
（５）該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は抗原存在下で培養される、上記（１）記載の方法。
（６）該抗原は免疫学的非自己細胞である、上記（５）記載の方法。
（７）該免疫学的非自己細胞は同種異系細胞である、上記（６）記載の方法。
（８）得られ得る制御性Ｔ細胞が該抗原特異的である、上記（５）記載の方法。
（９）該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞はＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、上記（１）記載の方法。
（１０）該制御性Ｔ細胞は、CD45RO^mid+、CD45RB^high+、CD62L^low+、及びGITR⁺からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有する、上記（１）記載の方法。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞。
（１２）CD45RO^mid+、CD45RB^high+、CD62L^low+、及びGITR⁺からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有するCD25⁺CD4⁺制御性Ｔ細胞。
（１３）上記（１１）又は（１２）に記載の制御性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる、免疫調節剤。
（１４）免疫寛容誘導用である、上記（１３）記載の剤。
（１５）以下の工程を含む、免疫調節剤の製造方法：
（１）ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）該制御性Ｔ細胞を医薬として許容される担体と混合し、免疫調節剤を製造する工程。
（１６）ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を提供するための試薬を含む、制御性Ｔ細胞製造用キット。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の方法を用いれば、インビトロで哺乳動物の制御性Ｔ細胞を効率よく製造することが可能であり、抗原特異的な制御性Ｔ細胞を製造することも可能である。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫調節薬として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法を提供するものである。
【０００７】
制御性Ｔ細胞とは、細胞接触が許容される条件で反応性Ｔ細胞（例えば全CD4⁺Ｔ細胞、CD25^-CD4⁺Ｔ細胞等）と共に培養され、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、当該反応性Ｔ細胞の活性化（増殖、サイトカイン産生等）を阻害し得る能力（免疫抑制能）を有するＴ細胞を意味する。制御性Ｔ細胞は、通常CD25^＋CD4⁺Ｔ細胞分画内に存在する。制御性Ｔ細胞自体は、Ｔ細胞受容体を介する刺激に対しては実質的な増殖反応を示さず、不応答性であり得る。
【０００８】
本発明の方法においては、まずナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が提供される。該細胞は、哺乳動物由来であり得る。哺乳動物としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞が製造され得る範囲において特に限られないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オラウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくは霊長類であり、より好ましくはヒトである。
【０００９】
本発明の方法に供される該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、「末梢」のCD25⁺CD4⁺Ｔ細胞である。「末梢」とは「胸腺外」であり、且つ「臍帯血でない」ことを意味する。従って、本発明に供される該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、末梢組織（胸腺及び臍帯血以外の組織：例えば末梢血液、脾臓、リンパ節、腸管、肝臓等）に存在している細胞であれば特に限定されないが、調製が容易であることを考慮すれば、末梢血液又は脾臓中の細胞が用いられ得る。
【００１０】
本発明の方法に供される該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、ナイーブ表現型を有する。「ナイーブ表現型」とは、胸腺から移出し、抗原刺激を受けていないＴ細胞（ナイーブＴ細胞）が有する表現型をいう。ナイーブ表現型としては、例えばヒト細胞の場合、CD45RA陽性（CD45RA⁺）、CD45RO弱陽性又は陰性（CD45RO^low+又は CD45RO^-）、CD45RB強陽性（CD45RB^high+）、CD62L強陽性（CD62L^high+）、CD38陽性（CD38⁺）等の表現型を挙げることが出来るが、これらに限定されない。本発明の方法に供される該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、例えばヒトの場合、好ましくはCD45RA⁺、CD45RO^low+、CD45RB^high+、CD62L^high+、及びCD38⁺からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有し、より好ましくはそれら全ての表現型を有し得る。該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞がヒト以外の哺乳動物由来である場合においても、当該表現型はヒトと同様であり得るが、動物種が生来的に保有していないマーカー分子により表現型が定義されている場合には、当該表現型は解析から除外されるなど、種差が考慮され得る。
【００１１】
本明細書において、細胞の表現型をマーカー分子（抗原）発現の有無や強弱で表す場合、特に断りのない限り、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合の有無や強弱で細胞の表現型が表記される。マーカー分子の発現の有無や強弱による細胞の表現型の決定は、通常、当該マーカー分子に対する特異的抗体等を用いたフローサイトメトリー解析等により行われる。マーカー分子の発現が「陽性」とは、該マーカー分子が細胞表面上（或いは細胞内）に発現しており、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合が確認できることをいう。このうち「強陽性」とは、比較対照である他の細胞（又は細胞集団）と比べて、マーカー分子の発現量が相対的に高い、マーカー分子の発現量の高い細胞集団が相対的に多い、マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に多いこと等をいう。「弱陽性」とは、比較対照である他の細胞（又は細胞集団）と比べて、マーカー分子の発現量が相対的に低い、マーカー分子の発現量の低い細胞集団が相対的に多い、マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に少ないこと等をいう。
【００１２】
ナイーブ表現型として、CD45RO弱陽性（CD45RO^low+）、CD45RB強陽性（CD45RB^high+）、CD62L強陽性（CD62L^high+）と表される場合、比較対照の細胞としてメモリーＴ細胞（胸腺から移出し、抗原刺激を受けた後に、生存しているＴ細胞）が意図される。比較対照のメモリーＴ細胞としては、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞（例えば図１Ｃ中bでゲートされた領域に含まれるＴ細胞等）等を挙げることができる。
【００１３】
また、本発明の方法に供されるナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、Foxp3陽性（Foxp3⁺）、細胞内CTLA-4陽性（CTLA-4⁺）、及びTNFRII⁺からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有し得る。これらの表現型は、上述の制御性Ｔ細胞（例えばCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞等）の表現型であり得る。このうち、本発明の方法において用いられるCD25⁺CD4⁺Ｔ細胞のFoxp3の発現強度は、mRNAの発現量として、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞のそれと同等（約0.5〜2.0倍程度）か、それ以上であり得る。なお、Foxp3を用いた表現型の解析は、通常mRNA発現量をRT-PCR等で測定することにより行われる。
【００１４】
本発明の方法に供されるナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、上述のように制御性Ｔ細胞の表現型を有し得るにも関わらず、後述の実施例等で示される様に、機能的には制御性Ｔ細胞の機能的特性である不応答性及び免疫抑制能の特性を示さず、又は該特性が極めて弱く、むしろ作動性抗CD3抗体の存在下で、抗原刺激に対して増殖を示す。この点において、末梢のナイーブ表現型を有するCD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、胸腺内或いは臍帯血中のナイーブ表現型を有するCD25⁺CD4⁺Ｔ細胞においてこれまで報告されている性質とは異なる。
【００１５】
本発明の方法に供されるナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、単離・精製されていることが好ましい。該細胞の単離・精製は、上述の哺乳動物の末梢組織（胸腺及び臍帯血以外の組織）から、上述の表現型等に基づき、自体公知の方法により行うことができる。
例えば、ヒトのナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を単離・精製する場合、先ず、末梢組織（例えば末梢血液等）より、単核球分画が調製される。単核球分画の調製は、例えば、Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences-Uppsala)等を用いた密度勾配遠心や、アフェレーシス等により行われる。次に、蛍光色素や磁気ビーズ等により標識された、目的とする細胞の細胞表面に特異的に発現している抗原（CD25、CD4、上述のナイーブ表現型のマーカー抗原(CD45RA等)等）に対する特異的抗体により単核球分画を染色し、セルソーターや磁性カラム等を用いて目的とする分画を単離・精製する。高い精製度を達成するため、好ましくは、セルソーターが用いられる。
【００１６】
次に、提供されたナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が培養される。
細胞培養は、リンパ球培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ_２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。
【００１７】
本発明の方法における培養に用いられる培地の基礎培地は、自体公知のものを用いることができ、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＨＡＭ等を挙げることができる。また、リンパ球培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
【００１８】
当該培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えば、有機酸（例えばピルビン酸ナトリウム等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
【００１９】
また、当該培地は、血清を含むことができる。血清としては、哺乳動物由来の血清であれば、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清、ヒト血清等）である。また血清の代替添加物（例えばKnockout Serum Replacement (KSR)（Invitrogen社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常、0.1〜30 (v/v) %の範囲である。
【００２０】
制御性Ｔ細胞の製造効率を上げるため、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子の存在下で培養され得る。Ｔ細胞増殖因子としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ等を挙げることが出来る。培地中に添加されるＴ細胞増殖因子の濃度は、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、例えばＩＬ−２を用いる場合であれば、通常0.1〜10000 U/ml、例えば1〜5000 U/ml、好ましくは10〜2500 U/ml程度の濃度が例示される。
【００２１】
また、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、抗原存在下で培養され得る。抗原存在下で培養することにより、該抗原に特異的な制御性Ｔ細胞が製造され得る。
抗原とは、培養細胞上の抗原受容体（例えばＴ細胞受容体）に認識され、該受容体を介して細胞を刺激し得る物質を包括的に意味する。抗原としては、例えばペプチド、タンパク質、脂質、糖脂質等の抗原分子のみならず、免疫学的非自己細胞、抗原受容体の構成分子（CD3、TCRβ、TCRα等）や補刺激分子（CD28等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトCD3抗体であるOKT-3等）やスーパー抗原などの抗原ミミックをも含む。ここで、免疫学的非自己細胞とは、同種同系（syngenic）細胞以外の細胞をいい、同種異系（allogenic）細胞及び異種（xenogenic）細胞が含まれる。免疫学的非自己細胞は、好ましくは、同種異系（allogenic）細胞である。
【００２２】
抗原刺激に用いられる抗原は、目的に応じて所望のものを選択することが可能である。
例えば、ある特定の免疫学的非自己細胞に特異的な制御性Ｔ細胞を製造しようとする場合は、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が、免疫学的非自己細胞の存在下で培養される。該免疫学的非自己細胞は、自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。免疫学的非自己細胞の種類は特に限定されず、所望の組織由来の細胞（例えば末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）等）を使用することが可能である。例えば、同種異系のドナーからの移植に先立ち、当該ドナー由来細胞に特異的なレシピエント制御性Ｔ細胞の製造が意図されている場合には、レシピエント由来のナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が、ドナー由来の細胞の存在下で培養される。この場合、該ドナー由来の細胞は、移植されうる臓器と同一臓器由来の細胞であっても、異なる組織由来の細胞であってもよい。
【００２３】
また、ある特定の抗原分子（ペプチド、タンパク質、脂質、糖脂質等）に特異的な制御性Ｔ細胞を製造しようとする場合は、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が、当該抗原分子の存在下で培養される。抗原分子としては、例えば、組織適合抗原など細胞及び組織由来抗原、アレルギー疾患の原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原（食品由来抗原、抗原性を示すことが予想される薬剤若しくは製剤中に共存する物質、又は人工臓器関連物質、又はそれらの変性物（例えば熱変性物等））などが挙げられる。組織適合抗原としては主要組織適合抗原（ＭＨＣ抗原）や非主要組織適合抗原が挙げられる。アレルギーの原因物質には環境・花粉抗原、真菌抗原、食物抗原、人工抗原等が含まれ、例えば、環境・花粉抗原としてはダニ、ハウスダスト、スギ花粉、ブタクサ等、真菌抗原としてはカンジダ、アルテルナリア、アスペルギルス、クラドスポリウム、ペニシリウム等、食物抗原としては卵白、牛乳、大豆、小麦粉、ソバ粉、サバ、イワシ、アジ、エビ、カニ、ブタ肉、牛肉、トリ肉等、人工抗原としては薬剤、人工臓器等が挙げられる。また、自己免疫疾患の原因物質としては、疾患の原因となる自己抗体の対応抗原等が挙げられる。
【００２４】
この場合、該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞に対する抗原提示を確実に達成する目的で、抗原提示細胞の存在下で培養が行われてもよい。抗原提示細胞としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、通常は、培養に供されるナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞と同種同系の抗原提示細胞（例えば、該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が由来する個体から得られた抗原提示細胞）が用いられる。また、抗原提示細胞の種類は、抗原提示能を有し、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えばPBMC、樹状細胞等が用いられる。抗原提示細胞は、自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。
【００２５】
一方、培養に供される上記CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞の集団が有している抗原受容体のレパートリーの多様性を保持し、当該多様性を反映した制御性Ｔ細胞集団を製造しようとする場合には、該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が、抗原受容体の構成分子（CD3、TCRβ、TCRα等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトCD3抗体であるOKT-3等）、補刺激分子（CD28等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトCD28抗体）、スーパー抗原などの抗原ミミックによる刺激下で培養される（Blood, 104, p. 895-903, 2004、Blood, 104, p. 453-61, 2004）。当該抗原ミミックは複数種類を組合せて用いることも可能であり、例えばCD3を認識する作動性抗体と、CD28を認識する作動性抗体との組み合わせ等が用いられ得る。当該抗原ミミックを使用することで、多様性を有する制御性Ｔ細胞集団を製造することが出来る。
【００２６】
また、複数種類の抗原を組合せて用いることも可能であり、例えば免疫学的非自己細胞と抗原受容体の構成分子を認識する作動性抗体との組み合わせ（同種異系細胞と抗ＣＤ３抗体との組み合わせ等）を用いることが可能である。
【００２７】
上述の様に培養することにより、培養物中のナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は増殖し、８０日間以上もの長期間に渡り、数として１００倍以上にも増殖し得る。
【００２８】
培養の結果、培養物中に制御性Ｔ細胞が獲得される。
即ち、後述の実施例に示される様に、本発明の方法により獲得され得る細胞は、細胞接触が許容される条件で反応性Ｔ細胞と共に培養され、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、当該反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し得る能力（免疫抑制能）を有する。さらに、獲得される細胞は、不応答性の特性をも有し得る。
重要なことに、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が、抗原存在下で培養された場合、獲得され得る制御性Ｔ細胞は、培養時に用いられた抗原に特異的であり得る。
【００２９】
獲得された細胞が、制御性Ｔ細胞としての機能を有しているか否かを確認してもよい。例えば、細胞接触が許容される条件で、獲得された細胞が反応性Ｔ細胞（例えば全CD4⁺Ｔ細胞）と共に培養され、抗原により刺激され、反応性Ｔ細胞の活性化が測定される。反応性Ｔ細胞の活性化の指標としては、通常、細胞増殖（例えば［³H］タイミジンの取込み）やサイトカイン（IL-2、IL-4、IFNγ等）産生が用いられる。試験の結果、反応性Ｔ細胞の活性化が抑制された場合には、獲得された細胞が制御性Ｔ細胞としての機能を有していると判断することが出来る。また、刺激に用いられる抗原として、制御性Ｔ細胞の製造過程で使用された抗原と同一の抗原と、該抗原とは異なる抗原とを組合せて用いることにより、製造された制御性Ｔ細胞が、該抗原特異的であるか否かを確認することも可能である。
【００３０】
また、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、CD25⁺CD4⁺の表現型を有するが、末梢中で自然に存在している制御性Ｔ細胞（例えば、ヒトCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞等）とは異なる表現型を有し得る。即ち、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞と、末梢で天然に存在している制御性Ｔ細胞との中間的なレベルのCD45ROを発現し得る（即ちCD45RO^mid+）。例えばフローサイトメトリー解析において、蛍光標識抗CD45RO抗体を用いて細胞表面CD45RO発現レベルを比較した場合、本発明の方法により製造され得るヒト制御性Ｔ細胞のCD45ROの発現レベルは、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞と比較して通常約２〜１０倍（例えば約５〜８倍）程度であり、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞と比較して通常約１／２０〜１／２倍（例えば約１／６〜１／３倍）程度であり得る。なお、フローサイトメトリー解析による発現レベルの比較は、縦軸に細胞数を、横軸に発現強度（蛍光強度）を取ったグラフ中のヒストグラムのピークにおける発現強度を比較することにより行うものとする。
また、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺ Ｔ細胞と比較するとCD62Lの発現が弱く（CD62L弱陽性（CD62L^low+）：発現レベルはCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞の通常約１／３〜１／３０倍程度）、またGITR陽性（GITR⁺）の表現型を有し得る。
また、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺ Ｔ細胞と比較するとCD45RBの発現が強く（CD45RB強陽性（CD45RB^high+））、発現レベルはCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞の通常約１．５〜８倍（例えば２．５〜４．５倍）程度で有り得る。
従って、本発明はCD45RO^mid+、CD45RB^high+、CD62L^low+、及びGITR⁺からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有するCD25⁺CD4⁺制御性Ｔ細胞を提供するものである。
【００３１】
本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、強力な免疫抑制能を有するので、何らかの原因により生体内で免疫反応が異常に亢進している場合、生体内で望ましくない免疫反応が起こっている場合、あるいは望ましくない免疫応答が起こることが将来的に予測される場合等に、患者に該制御性Ｔ細胞を投与すること等によって、患者の体内における異常に亢進した免疫反応を抑制し、望ましくない免疫反応を抑制し、あるいは望ましくない免疫反応を回避することが出来る。
【００３２】
例えば、同種異系のドナーからの臓器移植に先立ち、まず、レシピエント由来のナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を、ドナー由来の細胞の存在下で培養することで、当該ドナー由来細胞に特異的な制御性Ｔ細胞を製造する。そして、当該制御性Ｔ細胞を移植の前後にレシピエントに投与することで、移植片に対する免疫寛容を誘導し、移植片に対する拒絶反応を回避し、移植片の生着を促進することが出来る。従って、本発明の免疫調節剤は現行の免疫抑制剤による副作用、細菌・ウイルス感染、特にC型肝炎患者において肝移植後C型肝炎再発を回避し得る。
【００３３】
また、自己免疫疾患の患者において、当該患者由来のナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を、当該自己免疫疾患の原因抗原の存在下で培養することで、当該原因抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を製造する。そして、当該制御性Ｔ細胞を患者に投与することで、自己免疫反応を抑制することが出来る。
【００３４】
更に、アレルギー疾患の患者において、当該患者由来のナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を、アレルギーの原因抗原の存在下で培養することで、当該原因抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を製造する。そして、当該制御性Ｔ細胞を患者に投与することで、アレルギー反応を抑制することが出来る。
【００３５】
不妊症の患者においては、当該患者由来のナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を、パートナー由来の細胞の存在下で培養することで、当該パートナー由来細胞（又は抗原）に特異的な制御性Ｔ細胞を製造する。そして、当該制御性Ｔ細胞を患者に投与することで、パートナー由来細胞（又は抗原）或いは、当該パートナー由来抗原を保持する胎児に対する免疫寛容を誘導し、胎児に対する拒絶反応を回避し、妊娠の維持を促進することができる。
【００３６】
即ち、本発明は、上記方法により製造され得る制御性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる、免疫調節剤を提供する。本発明の免疫調節剤は、臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患（花粉症、食品アレルギー、薬剤アレルギー、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎）、自己免疫疾患（多発性筋炎、慢性リュウマチ、全身性エリテマトーシス、全身性硬化症、水ほう症、皮膚エリテマトーシス、乾癬症、クローンズ病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、１型糖尿病等）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。
【００３７】
本発明の免疫調節剤は、常套手段に従って、有効量の上記制御性Ｔ細胞を医薬として許容される担体と混合する等して、経口／非経口製剤として製造することが出来る。本発明の免疫調節剤は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることが出来る。本発明の免疫調節剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００３８】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト等の上述の哺乳動物に対して投与することができる。
本発明の制御性Ｔ細胞の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重６０Ｋｇとして）においては、例えば非経口投与の場合、一日につき約６ｘ１０^９個程度を上限とする有効量を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００３９】
また、本発明は、ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を提供するための試薬を含む、制御性Ｔ細胞製造用キットを提供する。該試薬としては、上述の方法においてナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を提供するための種々の試薬（例えばCD25、CD4、ナイーブ表現型のマーカー抗原に対する標識抗体等）が含まれ得る。当該キットは、更に上述の方法において用いられ得る種々の試薬（抗原を提供するための試薬、Ｔ細胞増殖因子、培地、反応容器、試験プロトコールを記載した指示書など）を含むことが出来る。当該キットを用いれば、上述の方法に従い、簡便に制御性Ｔ細胞を製造することが可能である。
【００４０】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
〔１〕材料及び方法
（細胞調製）
０〜６９歳の範囲の異なる年齢の健常ボランティアから静脈血が獲得された。２０歳より若い対象者は、軽度の先天性の心疾患のため、京都大学病院小児科にてフォローされ、該対象者のために親の許可を得た。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）がFicoll-Hypaque (Amersham Biosciences-Uppsala)密度勾配遠心により単離された。細胞は、アロフィコシアニン（APC）抱合抗CD4モノクローナル抗体（mAb）、フィコエリスリン（PE）抱合抗CD25 mAb、及びフルオレッセインイソチオシアナート（FITC）抱合抗CD45RA mAbにより、３０分間、４℃にて暗中で染色された後に、以下の６つの異なる細胞分画が、BD FACSAriaセルソーター（Becton Dickinson）を用いて単離された（図１参照）。
(a) CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺ Ｔ細胞
(b) CD45RA^-CD25^high+CD4⁺ Ｔ細胞
(c) CD45RA^-CD25^low+CD4⁺ Ｔ細胞
(d) CD45RA^-CD25^-CD4⁺ Ｔ細胞
(e) CD45RA⁺CD25^-CD4⁺ Ｔ細胞、及び
(f) 全CD4⁺ Ｔ細胞
上述の(a)〜(e)に示された細胞分画は、図１Ｃ中に示された定義に従って単離された。
全てのmAbsはBecton Dickinsonから購入された。それぞれの分画の純度は＞９８％であった。機能アッセイをするための細胞分離のために、CD4⁺細胞が、プレートに結合した細胞を除去した後に、抗CD4 mAbマイクロビーズ及び磁性細胞ソーティング（MACS）システム磁性カラム（Miltenyi Biotec GmbH）を用いて、積極（positively）単離された。CD4⁺ 細胞の純度は＞９５％であった。
【００４２】
（FACS解析）
対象者由来のPBMC、或いは増殖されたＴ細胞株が、３０分間、４℃、暗中にて、多様な抗体とインキュベートされ、洗浄され、BD FACSAriaセルソーター及びFACSDiVA ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて解析された。使用された抗体は、perCP抱合抗CD4 mAb、ビオチン抱合抗CD25 mAb、FITC抱合抗CD45RA mAb、PE抱合抗CD45RB mAb、抗CD45RO mAb、抗CD62L mAb、抗CD38 mAb、抗GITR mAb、及び抗TNFRII mAbを含む。CTLA-4の細胞内染色を行うために、細胞は、細胞表面染色、固定、及びCytofix/Cytoperm溶液（Becton Dickinson）による浸透化処理の後に、PE抱合抗CTLA-4により細胞内染色された。
全てのmAb、ストレプトアビジン−APCは、Beckton Dickinson、Immunotech、又はGenzyme/Techneより購入された。
【００４３】
（細胞培養）
上述の様にセルソーターで分離されたCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺又はCD45RA⁺CD25^-CD4⁺ Ｔ細胞（1 x 10^5 細胞／well）が、96ウェルプレートに、１ウェルあたり130μlの増殖培地（10% FBS又はヒトAB型血清、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、2-ME、及び抗生物質・抗真菌薬（antibiotics-antimycotics）が補充されたRPMI-1640）中で、200 U/mlヒトIL-2の存在下、2 x 10^5 細胞／wellの放射線照射（40Gy）された同種異系のPBMCで刺激された。３〜４日毎に、培地の半分がIL-2を含有する新鮮な増殖培地と交換された。必要であれば、細胞が分けられ、繰り返し同種異系のPBMCで、７〜１０日毎に再刺激された。細胞数が十分増加したら、細胞が回収され、４８ウェルプレート中で放射線照射された同種異系のPBMC(1 x 10^6 細胞／well)と共に培養された（0.5 x 10^5 細胞／well）。増殖されたＴ細胞株は３回洗浄された後で機能アッセイのために使用された。
【００４４】
（混合リンパ球反応（MLR））
表示された数の、単離されたばかりのCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞、又は増殖されたＴ細胞株が、5 x 10^4 個の単離されたCD4⁺ Ｔ細胞及び1 x 10^5 個の放射線照射（40Gy）された同種異系のPBMCと、0.5μg/mlの抗ヒトCD3抗体（OKT-3）と共に、あるいはそれなしで、丸底９６ウェルマイクロプレート中、１０％ＦＢＳを含む増殖培地中で、それぞれ、刺激された。中和アッセイのために、IL-10R（5μg/ml）、TGF-β（0.5μg/ml）、CTLA-4（5μg/ml）、又はPD-1（5μg/ml）に対する中和抗体が添加された。トランスウェル試験のために、等しい数の、単離されたばかりのCD4⁺Ｔ細胞と1 x 10^6 個のＴ細胞株が共培養されるか、CD4⁺Ｔ細胞とＴ細胞株が同種異系PBMC（3 x 10^6個）と共にチャンバーの底と上に分離培養された。培養物は５日又は７日間（それぞれ、OKT-3と共に、あるいはそれなしで）インキュベートされ、最後の１６時間の間に［3H］タイミジンでラベルされた。培養物が回収され、［3H］タイミジン取込が1450 Microbeta TriLux(Wallac)により測定された。
【００４５】
（定量的RT-PCR）
全ＲＮＡが、CD4⁺Ｔ細胞分画から、Isogen試薬（Nippon Gene）を用いて、製造者提供の指示書に従い抽出され、そして、10 mM DTT、0.5 mM dNTPs、1 x M-MLV RT緩衝液、40 ngランダムプライマー p(dN)6、6U リボヌクレアーゼインヒビター、及び40U M-MLV逆転写酵素 (Invitrogen)を含む、20μl 反応溶液中で、３７℃で１時間インキュベートし、引き続き70℃で10分間加熱することによりｃＤＮＡが合成された。FOXP3 mRNAの発現レベルは、ABI/PRISM7700シークエンス検出システム（Applied Biosystems）及びQuantiTect Probe PCR kit（Quiagen）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより定量された。FOXP3特異的プライマー及び内部蛍光Taqmanプローブが、既述のようにデザインされた（非特許文献８参照）。20xプライマー及びHPRTのためのプローブ混合液は、Applied Biosystemsより購入された。FOXP3 mRNAの発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるHPRT mRNAのそれにより標準化された。データはトリプリケイトウェルからの平均値で表された。標準偏差は＜５％であった。
【００４６】
〔１〕結果
（異なる世代におけるCD4でゲートされたCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞の割合）
図１ＡにCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞分画の代表的なFACSプロファイルを示す。２０歳未満の子供では、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞分画は、大きく、密集したクラスターを示したが（図１Ａ；左上及び右上）、２０歳を超えた成人においては、子供と比較して、同一の細胞のより小さく、密度の低いクラスターを示した（図１Ａ；左下及び右下）。
図１Ｂに示されるように、CD4⁺Ｔ細胞中のCD45RA⁺CD25⁺細胞の割合は、５歳未満の幼児において最も高く、年齢依存的な様式で徐々に低下し、６０歳を超えた成人において最も低かった。
【００４７】
（CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は高いFoxp3 mRNAレベルを発現する）
Foxp3の発現レベルが以下の６つの異なる細胞分画について測定された。
(a) CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞
(b) CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞
(c) CD45RA^-CD25^low+CD4⁺Ｔ細胞
(d) CD45RA^-CD25^-CD4⁺Ｔ細胞
(e) CD45RA⁺CD25^-CD4⁺Ｔ細胞、及び
(f) 全CD4⁺Ｔ細胞
これらの細胞は、セルソーターを用いて、図１Ｃに示されたゲートに従ってPBMCから単離された。CD45RA^-CD25^high+CD4⁺(b)及びCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺(a)Ｔ細胞分画が、CD45RA^-CD25^low+CD4⁺(c)、CD45RA^-CD25^-CD4⁺(d)、CD45RA⁺CD25^-CD4⁺(e)、及び全CD4⁺(f)Ｔ細胞分画と比較してより高いFoxp3レベルを発現していた（図１Ｄ）。CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺細胞分画は、Tregsからは異なるものと考えられてきたにもかかわらず、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺細胞分画のそれよりさえも高いFoxp3レベルを発現していた。異なった個体からの２回以上の試験が行われ、同様の結果が得られた。
【００４８】
（CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は表現型としてはナイーブであるが、細胞内CTLR-4及びTNFRIIの発現を認める）
CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺(a)、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺(b)、及びCD45RA⁺CD25^-CD4⁺(e)Ｔ細胞（図１Ｃ参照）が、ナイーブ／メモリー細胞表現型、並びに細胞内CTLR-4及びTNFRII（図２）について調べられた。CD45RA^-CD25^high+CD4⁺(b)Ｔ細胞はCD45RO⁺、CD45RB^low+、CD62L^low+、及びCD38^-を示した。これは、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞は、表現型としてはメモリー型であることを示している。しかしながら、全体としては反対の傾向がCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺(a)Ｔ細胞において観察された。例えば、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞はCD45RO^low+、CD45RB^high+、CD62L^high+、及びCD38⁺であった。これは、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、表現型としてはナイーブであることを示す。CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞におけるこれらの４つのナイーブ／メモリー細胞表現型は、典型的なナイーブ細胞であるCD45RA⁺CD25^-CD4⁺Ｔ細胞(e)のそれと同等であった。CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、表現型としてはナイーブであったが、この細胞はTregs（これはCD45RA^-CD25^high+CD4⁺細胞に相当する）に特異的な細胞内CTLR-4及びTNFRIIを示した。これらの２つの細胞分画とは異なり、典型的なナイーブ細胞であるCD45RA⁺CD25^-CD4⁺細胞は、細胞内CTLA-4及びTNFRIIを示さなかった。異なった個体からの２回以上の試験が行われ、同様の結果が得られた。
【００４９】
（分離されたCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞の機能的特性）
PBMCから単離されたときの、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞分画の機能的特性が詳細に調べられた（図３）。分離されたCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、同種異系PBMC及び作動性抗CD3抗体の存在中では、不応答性ではなく、むしろ増殖性であった（図３Ａ、レーン３、黒色カラム）。一方、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞は、その分画が単離された時点では、明らかに不応答性であった（図３Ａ、レーン３、白色カラム）。
更に、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、アロ抗原の存在中で１：１の比率で共培養されたときの同系（syngenic）CD4⁺Ｔ細胞の増殖をほとんど抑制しなかった(図３Ａ、レーン４、黒色カラム)が、一方、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞は、全CD4⁺Ｔ細胞単独でのMLR(図３Ａ、レーン２)と比較して、著しく全CD4⁺Ｔ細胞の増殖を抑制し、免疫抑制能を示した（図３Ａ、レーン４、白色カラム）。
同様の試験が作動性抗ＣＤ３抗体の存在しない条件で行われた（図３Ｂ）。作動性抗CD3抗体の不在中では、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞及びCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞の両方とも、アロPBMCに対して不応答性であった（図３Ｂ、第３レーン）。抗CD3抗体が存在しているときと同様に、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞は、CD4⁺Ｔ細胞の増殖を抑制したが（図３Ｂ、第４〜７レーン、白色カラム）、CD4⁺Ｔ細胞単独のMLR(図３Ｂ、第２レーン)と比較すると、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞はわずかに抑制した（図３Ｂ、第４〜７レーン、黒色カラム）。
【００５０】
（CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞が生体外（ex vivo）で、IL-2の存在中、同種異系のPBMCの繰り返しの刺激により増殖する能力）
CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は、IL-2の存在中、10% FBSを含有する増殖培地中で、同種異系のPBMCの繰り返しの刺激により、４０日間で、１００倍以上の数に増殖した。10% ヒト血清を含有する増殖培地を用いたこの分画の培養は、細胞の数を８０日間で約１００倍に増加させた（図４Ａ）。
【００５１】
（増殖されたCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の機能的特性）
CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞分画から獲得された、増殖された細胞株（CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株という）は、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞自体とは異なり、不応答性及び抑制性の特性を示した。増殖培養で使用された同種異系PBMCにより刺激されたときの同系全CD4⁺Ｔ細胞の増殖を、増殖された細胞株は用量依存的に抑制した（図４Ｂ）。
一方、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株を樹立する際に使用された同種異系PBMCとは異なる同種異系PBMC（第三者のPBMC）により刺激されたときの同系全CD4⁺Ｔ細胞の増殖は、該CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株によってほとんど抑制されなかった（図４Ｃ）。このことは、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の免疫抑制能は抗原特異的であることを示す。
また、同系全CD4⁺Ｔ細胞が、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株と、５：１の割合で、同種異系PBMC（増殖培養に用いられたもの）の存在中で共培養され、IL-10R、TGF-β、CTLA-4、又はPD-1に対する抗体が共培養物に添加された。しかし、いずれの抗体もCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の免疫抑制能を、解除させなかった。（図４Ｄ）。
CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株及び同系全CD4⁺Ｔ細胞の同種異系PBMCとの共培養の間、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の同系全CD4⁺Ｔ細胞への接触をトランスウェルチャンバー系を用いて回避した。同種異系PBMCをCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株とともに配置したか否かに関わらず、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の免疫抑制能は、細胞−細胞接触の回避によりなくなった（図４Ｅ）。この結果は、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の抑制性特性は細胞−細胞接触を要することを示唆する。
【００５２】
（増殖されたCD45RA⁺CD25^-CD4⁺Ｔ細胞株と、増殖されたCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の表現型解析）
典型的なナイーブ細胞であるCD45RA⁺CD25^-CD4⁺Ｔ細胞分画、又はCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞分画に起源する増殖された細胞株のために、表現型解析が行われた（図５）。CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株上のCD25、GITR、及びCTLA-4の強度は、CD45RA⁺CD25^-CD4⁺Ｔ細胞株と比較して明らかに高かった。CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞上のCD62Lの強度も、実質的に高かった。これは、CD45RA⁺CD25^-CD4⁺Ｔ細胞上のCD62Lが不在であることとは対照をなしている。従って、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の表現型特性は、Tregsのそれと類似しているが、ナイーブＴ細胞のそれとは異なっていることが示唆された。
CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株のCD45ROの発現レベルは、培養前の末梢CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞と比較すると、約6.7倍に上昇しているが、末梢血で自然に存在しているTregs（CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞）と比較すると発現レベルは低く、約0.2倍であった。また、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株のCD45RBの発現レベルは、末梢に自然に存在しているTregs(CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞)に比較して高く、約3.6倍であった。（なお、発現レベルの比較は、縦軸に細胞数を、横軸に発現強度（蛍光強度）を取ったグラフ中のヒストグラムのピークにおける発現強度を比較することにより行った。）
従って、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株は、機能的には制御性Ｔ細胞の要件を満たしているが、末梢血に自然に存在しているTregとは表現型が異なることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の方法を用いれば、インビトロで哺乳動物の制御性Ｔ細胞を効率よく製造することが可能であり、抗原特異的な制御性Ｔ細胞を製造することも可能である。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫調節薬として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞の解析結果を示す図である。(A)異なる世代におけるCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞分画のFACSプロファイルを示す図である。CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞分画の代表的なFACSプロファイルを示す（４ヶ月齢：左上、１０歳：右上、２２歳：左下、及び３５歳：右下）。(B)年齢（Ｘ軸）とCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞の割合（Ｙ軸）との相関を示すグラフである。(C)CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞(a)、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞(b)、CD45RA^-CD25^low+CD4⁺Ｔ細胞(c)、CD45RA^-CD25^-CD4⁺Ｔ細胞(d)、及びCD45RA⁺CD25^-CD4⁺Ｔ細胞(e)の定義を示す図である。(D)各細胞分画におけるFOXP3発現レベルを示すグラフである。
【図２】CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺、CD45RA^-CD25^high+CD4⁺及びCD45RA⁺CD25^-CD4⁺細胞分画のナイーブ／メモリー及びTreg特異的表現型のヒストグラム解析を示す図である。表示された抗原に対する特異的抗体を用いた解析結果を実線で示す。それぞれの表現型のためのアイソタイプコントロールを点線で示す。
【図３】末梢血から単離された時点での、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞分画とCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞分画との機能的特性の比較を示す図である。縦軸に［3H］タイミジンの取込み(cpm(x 10^3))を示す。黒色カラムはCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を、白色カラムはCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞をそれぞれ示す。(A) 作動性抗ＣＤ３抗体の存在中での、全CD4⁺Ｔ細胞の増殖に対する、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞又はCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞の効果を示す図である。レーン１（APC）：同種異系PBMCのみ、レーン２（CD4）：同種異系PBMC＋全CD4⁺Ｔ細胞、レーン３（CD25）：同種異系PBMC＋CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞又はCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞、レーン４（1/1）：同種異系PBMC＋全CD4⁺Ｔ細胞＋CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞又はCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞 (B) 作動性抗ＣＤ３抗体の不在中での、全CD4⁺Ｔ細胞の増殖に対する、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞又はCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞の効果を示す図である。レーン１（APC）：同種異系PBMCのみ、レーン２（CD4）：同種異系PBMC＋全CD4⁺Ｔ細胞、レーン３（CD25）：同種異系PBMC＋CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞又はCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞、レーン４〜７：同種異系PBMC＋全CD4⁺Ｔ細胞＋CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞又はCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞（表示された割合（全CD4⁺Ｔ細胞数に対する割合）の数のCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞又はCD45RA^-CD25^high+CD4⁺Ｔ細胞が添加されている）
【図４】CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の機能的特性の解析結果を示す図である。(A)CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の増殖を示す図である。縦軸は、細胞数を、培養開始時の細胞数を１としたときの相対値として示し、横軸は培養開始後の日数を示す。(B)作動性抗ＣＤ３抗体の存在中での、全CD4⁺Ｔ細胞の増殖に対する、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の効果を示す図である。レーン１（APC）：同種異系PBMCのみ、レーン２（CD4）：同種異系PBMC＋全CD4⁺Ｔ細胞、レーン３（Line）：同種異系PBMC＋CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株、レーン４〜８：同種異系PBMC＋全CD4⁺Ｔ細胞＋CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株（表示された割合（全CD4⁺Ｔ細胞数に対する割合）の数のCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株が添加されている）(C) CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の抗原特異的な抑制性特性を示す図である。レーン１（APC）：同種異系PBMCのみ、レーン２（CD4）：同種異系PBMC＋全CD4⁺Ｔ細胞、レーン３（Line）：同種異系PBMC＋CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株、レーン４〜８：同種異系PBMC＋全CD4⁺Ｔ細胞＋CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株（表示された割合（全CD4⁺Ｔ細胞数に対する割合）の数のCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株が添加されている）黒色カラムは、増殖培養に使用された同種異系PBMCと同一の同種異系PBMCを、白色カラムは増殖培養に使用された同種異系PBMCとは異なる同種異系PBMC（第三者のPBMC）を、それぞれ示す。(D)CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の抑制性特性に対する、IL-10R、TGF-β、CTLA-4、又はPD-1に対する抗体の効果を示す図である。(E)細胞−細胞接触の回避の、CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株の抑制性特性に対する効果を示す図である。図中、APCは同種異系PBMCを、CD4は全CD4⁺Ｔ細胞を、LineはCD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株を、それぞれ示す。四角で囲まれた細胞が、トランスウェルチャンバー上部に配置されている。
【図５】CD45RA⁺CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞株及びCD45RA⁺CD25^-CD4⁺Ｔ細胞株についての、Tregsに特異的な表現型のヒストグラム解析を示す図である。表示された抗原に対する特異的抗体を用いた解析結果を実線で示す。それぞれの表現型のためのアイソタイプコントロールを点線で示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。
【請求項２】
該ナイーブ表現型がCD45RA⁺、CD45RO^low+、CD45RB^high+、CD62L^high+、及びCD38⁺からなる群から選択される少なくともいずれかである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞はFoxp3⁺、細胞内CTLA-4⁺、及びTNFRII⁺からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は霊長類由来である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞は抗原存在下で培養される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該抗原は免疫学的非自己細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該免疫学的非自己細胞は同種異系細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
得られ得る制御性Ｔ細胞が該抗原特異的である、請求項５記載の方法。
【請求項９】
該CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞はＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該制御性Ｔ細胞は、CD45RO^mid+、CD45RB^high+、CD62L^low+、及びGITR⁺からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞。
【請求項１２】
CD45RO^mid+、CD45RB^high+、CD62L^low+、及びGITR⁺からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有するCD25⁺CD4⁺制御性Ｔ細胞。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の制御性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる、免疫調節剤。
【請求項１４】
免疫寛容誘導用である、請求項１３記載の剤。
【請求項１５】
以下の工程を含む、免疫調節剤の製造方法：
（１）ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）該制御性Ｔ細胞を医薬として許容される担体と混合し、免疫調節剤を製造する工程。
【請求項１６】
ナイーブ表現型を有する末梢CD25⁺CD4⁺Ｔ細胞を提供するための試薬を含む、制御性Ｔ細胞製造用キット。

【図１】