効率を改善したチップ分析
チップは、基板上の電極を含む。電極は、作用電極、参照電極、および対電極を含む。参照電極は、固有電位を持たないように構築される。自己組織化単分子膜は参照電極上に配置される。自己組織化単分子膜はスペーサーおよびアクティブプローブを含む。アクティブプローブが有する捕捉プローブに対する親和性が、スペーサーが有する捕捉プローブに対する親和性よりも高いように構成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願]
本出願は、２００７年７月２日に出願された、表題「効率を改善したチップ分析」の米国仮特許出願第６０／９５８，２７７号の利益を主張し、その全体を本明細書に組み入れる。
【０００２】
[技術分野]
本発明は分析に関し、より詳細には分析による使用のためのセンサーに関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な分析は、基板上に配置された１つまたは複数のセンサーを含む分析チップを使用して実行することができる。センサーの各々は、基板上に配置された作用電極、参照電極および対（カウンタ）電極を含むことができる。参照電極は、典型的には参照電極が他の電極の電位を測定できる固有電位を有するように、互いに接触する２つの金属層を含むかまたはそれからなる。
【０００４】
いくつかの実例において、参照電極は、参照電極の製造に関連する課題を減少させるために金属の単層により作製される。しかしながら、参照電極の電位が浮遊しうるので、これらのセンサーはしばしば一貫しない結果を生ずる。その結果として、一貫した結果を提供することができる製造可能なセンサーの必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
チップは、基板上に電極を含む。電極は、作用電極、参照電極および対（カウンタ）電極を含む。参照電極は固有電位を持たないように構築される。自己組織化単分子膜は参照電極に配置される。自己組織化単分子膜はスペーサーおよびアクティブプローブを含む。アクティブプローブは、アクティブプローブが有する捕捉プローブに対する親和性が、スペーサーが有する捕捉プローブに対する親和性よりも高くなるように構成される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】標的因子の存在および／または量の検出のためのセンサーを有する分析チップの平面視である。
【図１Ｂ】Ｂと標識したラインに沿って得られる、図１Ａ中に図示される分析チップの横断面図である。
【図１Ｃ】複数のセンサーを有する分析チップを図示した図である。
【図２】図１Ａのセンサー上に検査体積を配置するセンサーシステムを説明した図である。
【図３Ａ】図１Ａにおいて図示される分析チップの使用に適切な分析の一般化例を図示した図である。分析は、作用電極に検査プローブを結合する粘着層を使用する。粘着層が有する捕捉プローブに対する親和性は、作用電極が有する捕捉プローブに対する親和性よりも高い。
【図３Ｂ】粘着層として働くのに適切な不均一な自己組織化単分子膜を図示した図である。
【図３Ｃ】図３Ａの検査プローブと併用して使用される図３Ｂの不均一な自己組織化単分子膜を図示した図である。
【図４】スペーサーとしてＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）および１１−メルカプト−１−ウンデカノールに結合するストレプトアビジンを備えたアクティブプローブを含む自己組織化単分子膜を有するセンサーを説明した図である。
【図５Ａ】遺伝物質の特定の鎖の存在の検出に適応させた図３Ａの分析を図示した図である。
【図５Ｂ】図５Ａにおいて図示された分析による使用に適切な反応機構の特定の例を図示した図である。
【図６】タンパク質および細胞を含むが、これらに限定されない、標的因子の存在の検出に適応させた図３Ａの分析を説明した図である。
【図７】センサーチップ上の１６のセンサーについての実験の電流ｖｓ時間の結果を示した図である。
【図８】実験の電流ｖｓ濃度の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
チップセンサーは、基板上に１つまたは複数のセンサーを有する。センサーの各々は、基板上に作用電極、参照電極および対電極を含む。参照電極は固有電位なしで構築される。例えば、参照電極は、金属の単層を含むことができる。自己組織化単分子膜は、少なくとも参照電極および／または少なくとも作用電極上にある。
【０００８】
自己組織化単分子膜は、アクティブプローブとの間にスペーサーを含む不均一な自己組織化単分子膜である。アクティブプローブは、捕捉プローブに対する親和性がスペーサーよりも高くなるように構成される。その結果として、捕捉プローブは、スペーサーを超えてアクティブプローブに優先的に結合する。捕捉プローブは、分析によって捜し求められている標的因子に結合する。従って、アクティブプローブは電極への標的因子の連結に参加するが、スペーサーは電極に標的因子を連結しない。本発明者は、アクティブプローブとの間のスペーサーの存在が参照電極のインピーダンスを増加し、従ってセンサーの操作の間の参照電極電位の浮遊を停止または減少することを明らかにした。
【０００９】
スペーサーは、分析結果におけるシグナル対ノイズ比もまた減少することができる。例えば、分析のいくつかの実例は、メディエーターと作用電極との間の反応に由来する作用電極を介する電流を測定することによって、標的因子の存在を決定する。その結果として、メディエーターからでない作用電極での電流源は、分析結果におけるノイズ源である。本発明者は、作用電極上にスペーサーを含む自己組織化単分子膜が、作用電極上で誘電体層として働くことができることを明らかにした。その結果として、自己組織化単分子膜は、メディエーター以外の源からの電流源が、作用電極を介して通過することを防ぐことができる。しかしながら、同じ自己組織化単分子膜は、メディエーターと作用電極との間のレドックス反応の継続を可能にする。メディエーターと作用電極との間の継続的なレドックス反応についての１つの可能性な説明は、自己組織化単分子膜中でメディエーターを捕らえることができ、自己組織化単分子膜を介するシグナルのトンネル効果を可能にすることができるということである。
【００１０】
スペーサーおよびアクティブプローブを含む自己組織化単分子膜が、参照電極電位の浮遊を停止もしくは減少することができる、および／または分析結果におけるシグナル対ノイズ比を減少することができるので、自己組織化単分子膜はセンサーによって提供される結果の一貫性および／または効率を増加させる。
【００１１】
図１Ａおよび図１Ｂは、センサー１２を有する分析チップ１０の一部分の例を図示する。図１Ａはチップ１０の平面視であり、図１Ｂは、Ｂと標識したラインで得られる図１Ａ中に示されるチップ１０の横断面図である。チップ１０は、基板１６上に配置された複数の電極１４を含む。適切な基板１６はシリコン基板１６を含むが、これらに限定されない。基板１６は単一材料から構築されるものとして示されるが、基板１６は複合構造を有することができる。電極１４は、参照電極１８および作用電極２２に隣接して配置した対電極２０を含む。いくつかの実例において、対電極２０および参照電極１８は、作用電極２２の反対側に配置される。対電極２０および参照電極１８は、同じ形を有することができるか、または異なる形を有することができる。作用電極２２の一部分が、対電極２０の異なる領域の間におよび／または参照電極１８の異なる領域の間に配置するように、対電極２０および／または参照電極１８は配置することができる。作用電極２２は円形状であるとして示されるが、作用電極２２は矩形形状を含むがこれに限定されない様々な他の形状でありえる。
【００１２】
参照電極１８は、金属などの導体材料の単層を含みうる。例えば、参照電極は、金、銀、銅、白金、クロミウム、アルミニウム、チタンおよびニッケルなどの金属の単層からなることができる。作用電極２２、対電極２０および参照電極１８は、同一素材から、または異素材から構築することができる。他の適切な電極１４は、金、銀、銅、白金、クロミウム、アルミニウム、チタンおよびニッケルを含むが、これらに限定されない。
【００１３】
作用電極２２の最大の寸法が４ｍｍ、１ｍｍ、１００μｍまたは５０μｍ未満であるように、作用電極２２は構築することができる。対電極２０および参照電極１８に適切な幅は、２０μｍ、１００μｍ、０．５ｍｍまたは３ｍｍ未満の幅を含むが、これらに限定されない。作用電極２２と参照電極１８との間のギャップおよび／または作用電極２２と対電極との間のギャップに適切な寸法は、１μｍ、１００μｍ、０．５ｍｍまたは２ｍｍ未満のギャップを含むが、これらに限定されない。これらの寸法は、現場分析装置における使用に適切な小型のセンサー１２を提供することができる。
【００１４】
作用電極２２は粘着層２８を含む。より詳細に以下に記述されるように、検査プローブの一部分が有する粘着層２８に対する親和性は、作用電極２２に対する親和性よりも大きい。その結果として、粘着層２８は、検査プローブ４０の一部分の作用電極２２に対する親和性を増加させることができる。
【００１５】
図１Ａおよび図１Ｂは、チップ１０が単一センサー１２を有するとして図示するが、チップ１０は図１Ｃ中に図示されるような複数のセンサー１２を含むことができる。センサー１２は、チップ１０上でアレイにアレンジすることができる。センサー１２の各々は、作用電極２２、参照電極１８および対電極２０を含む。チップ１０上の異なるセンサー１２は、同時にまたは連続的に使用することができる。各センサー１２を使用して異なる標的因子の存在について検査することができる。その結果として、チップ１０は、複数の異なる標的因子について高度に効率的な検査を提供することができる。あるいは、複数のセンサー１２を使用して同じ標的因子の存在について検査することができる。複数の検査はリダンダンシーチェックとして働くことができるか、または各々のセンサー１２上で行なわれた検査は異なる源からの標的因子についてのものでありえる。
【００１６】
図２中に図示されるように、センサーシステム２９はチップ１０の操作の間に形成される。粘着層２８は電極の少なくとも１つの上に存在するが、粘着層２８は図２中に図示されない。センサーシステム２９は、センサー１２上に配置された検査体積３０を含む。検査体積３０は、同時に作用電極２２、参照電極１８および対電極２０を覆って配置される。いくつかの実例において、表面張力は、電極１４を覆って配置される検査体積３０を維持することに加えて、検査体積３０の形状を維持する。
【００１７】
図３Ａは、図２に記載のセンサーシステム２９の一般化例を提供する。図３Ａは、図２中に図示されたセンサーシステム２９の横断面図の一部分である。
【００１８】
センサーシステム２９は、作用電極上の粘着層２８に結合する検査プローブ４０を含む。単一検査プローブ４０を図解のために示すが、作用電極２２一帯の検査プローブ４０の密度は一般的にはるかに高い。検査プローブ４０は、捕捉プローブ４４とシグナリングプローブ４６との間の標的因子４２の一部分を含む。分析は、標的因子４２の存在を示す。適切な標的因子４２は、ＤＮＡまたはＲＮＡおよび抗体などの、多糖、核酸、細胞および遺伝物質の鎖を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
粘着層２８は、捕捉プローブ４４が有する粘着層２８なしの作用電極２２に対する親和性以上に、捕捉プローブ４４の作用電極２２に対する親和性を増加させることができる。捕捉プローブ４４は、作用電極２２を標的因子４２に連結するように働く。以下に明らかになるように、適切な捕捉プローブ４４は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、および抗体などのタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
レポーター５０はシグナリングプローブ４６に結合される。シグナリングプローブ４６は、標的因子４２をレポーター５０と連結するように構成される。少なくとも１つのメディエーター５２が検査体積中にある。メディエーター５２およびレポーター５０は各々検査体積３０中に１つの状態以上で存在することができる。異なる状態の例は、酸化が異なる状態を含む。
【００２１】
チップ１０の操作の間に、チップ１０は、作用電極２２、検査体積３０およびその回路の対電極２０を含む回路を介する電流の通過をモニタリングしながら、作用電極２２とセンサー１２の参照電極１８との間の電位を適用するように構成された電子機器（まかれない）を備えた電気通信中にある。
【００２２】
メディエーター５２が第１のメディエーター状態５２Ａから第２のメディエーター状態５２Ｂに変換し、レポーター５０が第１のレポーター状態から第２のレポーター状態に変換するように、メディエーター５２とレポーター５０は相互作用する。Ａと標識した破線は、レポーター５０へ拡散し、ここで第２のメディエーター状態５２Ｂに変換される、第１のメディエーター状態５２Ａを図示する。Ｂと標識した破線は、検査体積３０を介して作用電極２２へ拡散する第２のメディエーター状態５２Ｂを図示する。作用電極２２と参照電極１８との間に適用された電位は、作用電極２２と第２のメディエーター状態５２Ｂとの間で電子伝達を生じさせるレベルまで上昇される。電子伝達は、作用電極２２、検査体積３０および対電極２０を含む回路を介して電流が流れることを可能にする。その結果として、作用電極２２および対電極２０を介する電流の流れは、メディエーター５２が、第１のメディエーター状態５２Ａから第２のメディエーター状態５２Ｂに変換されていることを示す。
【００２３】
標的因子４２が存在しない場合、以下に明らかなように、レポーター５０は検査体積３０中に存在しない。レポーター５０が存在しない場合、メディエーター５２は、第１のメディエーター状態５２Ａから第２のメディエーター状態５２Ｂに変換されない。その結果として、標的因子４２が検査体積３０中に存在しない場合、作用電極を介する電流は存在しない。標的因子４２が存在する場合電流が存在するが、標的因子４２が存在しない場合は存在しないので、電流は検査体積３０中で標的因子４２の存在を示す。
【００２４】
図３Ｂは、電極１４上の粘着層２８を含むセンサーの横断面図である。図示された粘着層２８および電極１４は、作用電極、参照電極、および／または対電極上のアレンジを示すことができる。粘着層２８は、自己組織化単分子膜が電極１４上に存在しない場合、電極１４が有する捕捉プローブ４４に対する親和性よりも高い捕捉プローブ４４に対する親和性を有する自己組織化単分子膜を含むかまたはそれからなる。
【００２５】
自己組織化単分子膜は、１分子厚の二次元フィルムであり、各分子は表面へ共有結合される。自己組織化単分子膜の古典的な例は、金表面とのアルカンチオールの反応である。官能基化されたシラン化合物もまたシリコン表面上で自己組織化することができる。通常は表面に直接結合されない分子を洗浄することができるので、自己組織化単分子膜は表面上に固定化された１分子厚フィルムを提供することができる。
【００２６】
図示された自己組織化単分子膜は、自己組織化単分子膜中に異なる化合物を含む不均一な自己組織化単分子膜である。例えば、図示された自己組織化単分子膜はアクティブプローブ５４およびスペーサー５６を含む。アクティブプローブ５４は電極リンカー５８を含む。電極リンカー５８は、アクティブプローブ５４を電極１４に連結するように構成される。アクティブプローブ５４はプローブリンカー６０もまた含む。プローブリンカー６０は、アクティブプローブ５４を捕捉プローブ４４に連結するように構成される。例えば、プローブリンカーは、捕捉プローブを結合するように各々が構成される、１つまたは複数の結合部位を含むことができる。いくつかの実例において、プローブリンカー６０はアクティブプローブ５４の末端端部で配置される。各スペーサー５６は、スペーサー５６を電極１４に連結するように構成された電極リンカー６２を含む。
【００２７】
スペーサー５６は末端端部６４もまた含む。末端端部６４が有する捕捉プローブ４４に対する親和性は、プローブリンカー６０が有する捕捉プローブ４４に対する親和性よりも小さい。いくつかの実例において、スペーサー５６が有する捕捉プローブ４４に対する親和性が実質的にはないように、末端端部６４は構成される。従って、捕捉プローブ４４は、スペーサー５６ではなくアクティブプローブ５４に結合する。
【００２８】
図３Ｃは、図３Ｂの検査プローブおよびレポーターと併用して使用される図３Ａのセンサーを図示する。アクティブプローブ５４は検査プローブに連結されるが、スペーサー５６は検査プローブに連結されない。
【００２９】
アクティブプローブ５４として働く化合物の各々は同一のものでありえるか、またはアクティブプローブ５４は、アクティブプローブ５４として各々が働く複数の異なる化合物を含みうる。スペーサー５６として働く化合物の各々は同一のものでありえるか、またはスペーサー５６は、スペーサー５６として各々が働く複数の異なる化合物を含みうる。自己組織化単分子膜中のスペーサー５６対アクティブプローブ５４の比率は、分析のパフォーマンスに影響を与えうる。スペーサー５６対アクティブプローブ５４の比率は、好ましくは１００：１〜１：１００または１０：１〜１：１０または５：１〜１：５の範囲である。
【００３０】
アクティブプローブ５４との使用に適切な電極リンカー５８は、チオール基を含むが、これに限定されない。その結果として、アクティブプローブ５４はチオール化アクティブプローブ５４でありえる。チオール化アクティブプローブが電極１４に連結される場合、チオール化アクティブプローブは電極１４に直接連結される硫黄を含む。電極表面が金を含むかまたはそれからなる場合、チオール電極リンカー５８は、電極リンカー５８としての使用に適切である。
【００３１】
スペーサー５６との使用に適切な電極リンカー６２は、チオール基を含むが、これに限定されない。その結果として、アクティブプローブ５４はチオール化スペーサー５６でありえる。チオール化スペーサーが電極１４に連結される場合、チオール化スペーサーは電極１４に直接連結される硫黄を含む。電極表面が金を含むかまたはそれからなる場合、チオール電極リンカー６２は、電極リンカー６２としての使用に適切である。スペーサー５６中で使用される電極リンカー６２は、アクティブプローブ５４に対して使用された電極リンカー６２と同一のもの、またはそれとは異なるものでありえる。
【００３２】
プローブリンカー６０は、捕捉プローブ４４の構造に依存しうる。プローブリンカー６０の例は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミン基（−ＮＨ2、ＮＨＲ（式中Ｒはアルキル基などの有機基を示す））、およびこれらの基を含む化合物などの基を含むが、これらに限定されない。スペーサー５６のための末端端部６４の例は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）およびアミン基（−ＮＨ2、ＮＨＲ（式中Ｒはアルキル基などの有機基を示す））などのアルキル基および他の基を含むが、これらに限定されない。スペーサー５６の末端端部６４は、プローブリンカー６０とは異なることができる。例えば、プローブリンカー６０がアミンである場合、スペーサー５６の末端端部６４はヒドロキシル基でありえる。
【００３３】
いくつかの実例において、プローブリンカー６０がスペーサー５６の末端端部６４の上方に配置されるように、アクティブプローブ５４を構築することができる。例えば、アクティブプローブ５４はスペーサー５６よりも長くなりえる。その結果として、プローブリンカー６０は、センサー上に配置された溶液中に含まれる捕捉プローブ４４に容易に結合することができる。
【００３４】
適切なアクティブプローブ５４は、１つまたは複数のアルキレン部分を含む。アルキレン部分の各々は、１つもしくは複数の炭素、２つもしくは複数の炭素または３つもしくは複数の炭素、または４つもしくは複数の炭素を備えた骨格を有することができる。例えば、アクティブプローブ５４は、−（ＣＨ2）n−（式中、ｎは１以上、２以上、３以上、または４以上である）によって示される、１つまたは複数の部分を含むことができる。アクティブプローブ５４中の１つまたは複数のアルキレン部分は、置換することおよび／または分岐させることができる。例えば、適切なアクティブプローブ５４は、完全にまたは部分的にハロゲン化された１つまたは複数のアルキレン部分を含むことができる。アクティブプローブ５４が複数のアルキレン部分を含む場合、異なるアルキレン部分は、エーテル結合（−Ｏ−）、チオエーテル結合（−Ｓ−）、アミン結合（−ＮＲ−（式中Ｒは水素またはアルキル基などの有機基である））、ケトン結合（−ＣＯ−）、エステル結合（−ＣＯ−Ｏ−）、チオエステル結合（−Ｓ−ＣＯ−）、またはアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ）によって相互に連結することができる。
【００３５】
適切なスペーサー５６は１つまたは複数のアルキレン部分を含む。アルキレン部分の各々は、１つもしくは複数の炭素、２つもしくは複数の炭素、３つもしくは複数の炭素、または４つもしくは複数の炭素を備えた骨格を有することができる。例えば、スペーサー５６は、−（ＣＨ2）n−（式中ｎは１以上、２以上、３以上、または４以上である）によって示される、１つまたは複数の部分を含むことができる。１つまたは複数、スペーサー５６中のアルキレン部分は、置換することおよび／または分岐させることができる。例えば、適切なスペーサー５６は、完全にまたは部分的にハロゲン化される１つまたは複数のアルキレン部分を含むことができる。スペーサー５６が複数のアルキレン部分を含む場合、異なるアルキレン部分は、酸素（−Ｏ−）、チオエーテル結合（−Ｓ−）、アミン結合（−ＮＲ−（式中Ｒは水素またはアルキル基などの有機基である））、ケトン結合（−ＣＯ−）またはエステル結合（−ＣＯＯ−）によって相互に連結することができる。
【００３６】
適切なアクティブプローブ５４の例は、置換されたビオチン、ストレプトアビジンに結合する置換されたビオチン、デキストラン、およびＭＵＤＡ（メルカプトウンデカン酸）を含むが、これらに限定されない。例えば、分析を使用してＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝物質の存在を同定し、そしてアクティブプローブ５４が結合される電極１４が金である場合、適切なアクティブプローブ５４はストレプトアビジンに結合するビオチン化チオールを含む。適切なビオチン化チオールの例は、ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）を含むが、これに限定されない。適切なスペーサー５６の例は、チオールおよび６−メルカプト−１−ヘキサノールなどのヒドロキシル化チオールを含むが、これらに限定されない。図４は、スペーサー５６としてＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）および１１−メルカプト−１−ウンデカノールに結合する、ストレプトアビジンを備えたアクティブプローブ５４を含む自己組織化単分子膜を有するセンサーを示す。ストレプトアビジンは、ビオチン化捕捉プローブのための結合部位として働く、結合ループ（残基４５〜５２）によって示された複数のプローブリンカーを含む。
【００３７】
図５Ａは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝物質７２の鎖の検出に適応させた、図３Ａ中で図示される検査体積３０を図示する。捕捉プローブ４４、標的因子４２、シグナリングプローブ４６は、遺伝物質７２の各鎖である。捕捉プローブ４４の一部分は、捕捉プローブ４４の相補的な一部分と標的因子４２との間の塩基対を提供する標的因子４２の一部分に相補的である。標的因子４２の一部分は、標的因子４２の相補的な一部分とシグナリングプローブ４６との間の塩基対を提供するシグナリングプローブ４６の一部分に相補的である。
【００３８】
図５の分析コンポーネントとの使用に適切なレポーター５０は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＡＰ（アルカリフォスファターゼ）およびグルコースペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されない。ＨＲＰとの使用に適切なメディエーター５２は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含むが、これに限定されない。ＡＰとの使用に適切なメディエーター５２は、ナイアシン誘導体（ＮＡＤ）を含むが、これに限定されない。グルコースペルオキシダーゼとの使用に適切なメディエーター５２は、ルテニウム（ＩＩ）ヘキサミンを含むが、これに限定されない。
【００３９】
いくつかの実例において、シグナリングプローブ４６を修飾してレポーター５０の結合を促進する。例えば、レポーター５０がホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む場合、シグナリングプローブ４６の１つまたは複数の塩基を修飾して、シグナリングプローブ４６のＨＲＰへの結合を促進することができる。例えば、シグナリングプローブ４６の５’末端は、ＨＲＰにリンカー７０として働くことができるフルオレセインにより修飾することができる。
【００４０】
いくつかの実例において、捕捉プローブ４４は、捕捉プローブ４４の粘着層２８への結合を促進するリンカー７６により修飾される。例えば、自己組織化単分子膜がストレプトアビジンを含む場合、捕捉プローブ４４は、ストレプトアビジン結合部位と容易に結合するビオチンにより修飾することができる。いくつかの実例において、捕捉プローブ４４の５’末端はビオチンにより修飾される。
【００４１】
図５Ｂは、レポーター５０としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を含む水溶液中のメディエーター５２としてＴＭＢを使用する、図５Ａに記載の分析の機構を図示する。この機構は、第１のレポーター状態５０Ａ、第２のレポーター状態５０Ｂおよび第３のレポーター状態５０Ｃで存在するＨＲＰを図示する。第１のレポーター状態５０ＡはＨＲＰの酸化状態であり、第２のレポーター状態５０ＢはＨＲＰの別の酸化状態である。この機構は、第１のメディエーター状態５２Ａおよび第２のメディエーター状態５２Ｂで存在するＴＭＢもまた図示する。
【００４２】
Ａと標識した矢印は、過酸化水素と反応して第２のレポーター状態５０Ｂを生成している、第１のレポーター状態５０Ａを図示する。Ｂと標識した矢印は、第２のレポーター状態５０Ｂによって酸化されて第２のメディエーター状態５２Ｂを形成している、第１のメディエーター状態５２Ａを図示する。Ｃと標識した矢印は、還元されて第１のレポーター状態５０Ａ（図中の・ＡＨはＴＭＢの酸化状態である）を形成している、第３のレポーター５０状態Ｃを図示する。
【００４３】
Ｄと標識した矢印は、作用電極２２に拡散する第２のメディエーター状態５２Ｂを図示する。Ｅと標識した矢印は、第１のメディエーター状態５２Ａに第２のメディエーター状態５２Ｂを戻すように作用電極２２で起こる電子伝達を図示する。Ｆと標識した矢印は、検査体積３０を介して拡散して戻り、第２のレポーター状態５０Ｂと相互作用している、第１のメディエーター状態５２Ａを図示する。
【００４４】
図６で図示されるように、図３Ａ中で図示された分析は、細胞７４またはタンパク質の存在の検出のためにも適応させることができる。例えば、捕捉プローブ４４はサンドイッチ分析の一次抗体でありえる。さらに、シグナリングプローブ４６はサンドイッチ分析の二次抗体でありえる。サンドイッチ分析のために適切な標的因子４２は、抗体に特異的な結合部位を有するタンパク質、多糖および核酸、または抗体に特異的な結合部位を有するタンパク質を備えた細胞を含むが、これらに限定されない。図６の分析コンポーネントとの使用に適切なレポーター５０は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＡＰ（アルカリフォスファターゼ）およびグルコースペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
ＨＲＰとの使用に適切なメディエーター５２は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含むが、これに限定されない。ＡＰとの使用に適切なメディエーター５２は、ナイアシン誘導体（ＮＡＤ）を含むが、これに限定されない。グルコースペルオキシダーゼとの使用に適切なメディエーター５２は、ルテニウム（ＩＩ）ヘキサミンを含むが、これに限定されない。
【００４６】
一次抗体を修飾して粘着層２８への結合を促進するリンカーを含むことができる。例えば、粘着層２８が露出したストレプトアビジンを含む場合、一次抗体は、ストレプトアビジン結合部位と容易に結合するビオチンにより修飾することができる。
【００４７】
二次抗体を修飾してレポーター５０への結合を促進することができる。例えば、レポーター５０がＨＲＰを含む場合、二次抗体を修飾してシグナリングプローブ４６のＨＲＰへの結合を促進することができる。例えば、二次抗体は、ＨＲＰに対してリンカー７０として働くことができるフルオレセインにより修飾することができる。
【００４８】
いくつかの実例において、捕捉プローブ４４は、捕捉プローブ４４の粘着層２８への結合を促進するリンカー７６により修飾される。例えば、自己組織化単分子膜がストレプトアビジンを含む場合、捕捉プローブ４４は、ストレプトアビジン結合部位と容易に結合するビオチンにより修飾することができる。
【００４９】
自己組織化単分子膜は、十分な摂動をともなう化学的インキュベーションによって合成することができる。
【００５０】
記述された方法は作用電極、参照電極および対電極上に自己組織化単分子膜を形成するが、この方法は自己組織化単分子膜の形成の間に特定の電極をマスクすることによって、電極の一部分の上に自己組織化単分子膜を形成するために使用することができる。その結果として、センサーは、少なくとも参照電極上にありえるか、または少なくとも作用電極上にありえる、自己組織化単分子膜を有することができる。マスクは、センサーの操作の前に除去することができる。交互に、マスクを除去した後、別の自己組織化単分子膜を以前にマスクした電極上に形成することができる。その結果として、異なる自己組織化単分子膜を関電極上に配置することができる。
【００５１】
作用電極２２上に一連の溶液を配置することによって、検査体積３０を、自己組織化単分子膜を有するセンサー１２上に生成することができる。サンプル溶液は、標的因子４２を有するサンプルまたは有していないサンプルから調製することができる。標的因子４２がサンプル中の細胞の内側に位置するか、または細胞膜中にある場合、適切な存在条件下で、溶解剤をサンプルに追加する。サンプル溶液中で検査プローブ４０の形成を可能にする条件下で、捕捉プローブ４４およびシグナリングプローブ４６をサンプル溶液に追加する。検査プローブ４０が粘着層２８と結合することを可能にする条件下で、サンプル溶液を作用電極２２に適用する。サンプル溶液は、参照電極１８および対電極２０を覆うように適用することができる。あるいは、表面張力を使用して作用電極２２に対してサンプル溶液を制限することができる。次にサンプル溶液を少なくとも作用電極２２から洗い流す。標的因子４２がサンプル溶液中に存在する場合、検査プローブ４０は自己組織化単分子膜中のアクティブプローブ５４に結合されたままである。
【００５２】
レポーター５０を有するレポーター溶液は、少なくとも作用電極２２上に配置される。レポーター５０がシグナリングプローブ４６と結合することを可能にする条件下で、レポーター溶液を作用電極２２上に配置する。レポーター溶液は、参照電極１８および対電極２０を覆うように適用することができる。あるいは、表面張力を使用して作用電極２２に対してレポーター溶液を制限することができる。次にセンサー１２を洗浄溶液により洗浄する。残存するレポーター５０は洗浄されるが、レポーター５０は、少なくとも作用電極２２上に存在する検査プローブ４０に結合されたままである。その結果として、標的因子４２がサンプル中に存在しない場合、レポーター５０は存在しない。
【００５３】
作用電極２２、参照電極１８および対電極２０の各々が、メディエーター溶液によって覆われるように、メディエーター５２を有するメディエーター溶液をセンサー１２上に配置する。作用電極２２上に存在するコンポーネント、および作用電極２２に適用されたメディエーター溶液の一部分は、検査体積３０として働く。
【００５４】
２００１年１１月２日に出願された、表題「統合されたサンプル調製システム」の米国仮特許出願第６０／３３９，７６６号（その全体を本明細書に組み入れる）；２００３年１２月０９日に出願された、表題「電気化学センサーによる使用のためのカートリッジ」の米国仮特許出願第６０／５２８，５６６号（その全体を本明細書に組み入れる）；および２００６年１２月６日に出願された、表題「センサーへの液体の送達のためのシステム」の米国仮特許出願第６０／８７３，０７８号（その全体を本明細書に組み入れる）の各々は、センサー上への溶液の輸送に適切な構造を開示する。
【実施例１】
【００５５】
１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド（ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ、ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ ＧｍＢＨ）、ドイツ）の自己組織化単分子膜を、金表面上に形成した。露出した金表面を洗浄し、４．５×１０-4Ｍ １１−メルカプト−１−ウンデカノール（アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、４４、７５２−８）を含有するエタノール中のビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨの５０ｍＭ溶液において１８時間インキュベートした。結果のものをエタノールおよび水によりリンスした。
【実施例２】
【００５６】
アクティブプローブおよび捕捉プローブを自己組織化単分子膜上に形成した。各作用電極を、２．５μＬの１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび４００ｍＭ Ｎ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドにより１０分間インキュベートした。センサーを、ビオチン（５０ｍＭ酢酸ナトリウム中で５ｍｇ／ｍｌ；ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、ロックフォード、イリノイ）中で１０分間インキュベートした。ビオチン化センサーを、４μＬのＲＮａｓｅ不含有Ｈ２Ｏ（カタログ番号８２１７３９；ＭＰバイオメディカルズ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社、オーロラ、オハイオ）中の０．５Ｕ／ｍｌのストレプトアビジンの中で１０分間インキュベートした。ストレプトアビジン被覆センサーを、ビオチン化捕捉プローブ（４μＬ；１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で１μＭ）により３０分間インキュベートした。
【実施例３】
【００５７】
アクティブプローブおよび捕捉プローブは、実施例１に従って構築された自己組織化単分子膜上に形成された。検査体積をセンサー上に形成し、標的因子について検査した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの混合物をバイアル中に置き、ボルテックスにより撹拌した。各作用電極を混合物により覆った。覆って加湿したガラスのペトリ皿の中で、混合物をセンサー上で１０〜１５分間室温でインキュベートした。インキュベーション期間の完了時に、センサーチップを脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥させ、次にペトリ皿中にセンサーチップを戻す。
【００５８】
標的因子に対する抗体の純度および親和性に依存して（ここでより高い親和性はより低い濃度を可能にする）、０．０１〜１（ｍｇ／ｍＬ）にわたる濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中のモノクローナル抗体捕捉プローブにより、捕捉プローブ溶液を作製した。各作用電極を捕捉プローブ溶液により覆った。ペトリ皿を覆って、抗体濃度に依存して、１０〜９０分間室温でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、センサーチップを脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥し、ペトリ皿の中に戻して配置した。
【００５９】
作用電極または各々のセンサーの３つの電極すべてを１Ｍエタノールアミンにより覆い、ペトリ皿を覆った。センサーチップを１５分間室温でインキュベートした。このエタノールアミンのインキュベーションの終了時に、センサーチップを脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥し、ペトリ皿中に戻して配置し、室温の窒素雰囲気中の乾燥条件で保存した。
【００６０】
各作用電極を覆って、標的因子を含みうる標的溶液を作用電極の各々の上に配置した。軽く湿らせたフィルター紙をセンサーチップの下でペトリ皿中に配置してサンプルの乾燥を阻害し、ペトリ皿を覆った。標的溶液を、標的因子の濃度に依存して、５〜３０分間インキュベートした。例えば、ｐｇ／ｍＬについて３０分間およびｎｇ／ｍＬ以上について５分間標的溶液をインキュベートすることができる。標的溶液インキュベーション後に、センサーチップを脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥し、ペトリ皿中に戻して配置した。
【００６１】
各作用電極は、ビオチンコンジュゲートモノクローナルシグナリング抗体を含むシグナリング溶液により覆った。シグナリング溶液を、標的濃度に依存して、５〜３０分間インキュベートし、脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥した。各作用電極を、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを有するレポーター溶液により覆った。レポーター溶液を３０分間室温でインキュベートし、脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥した。
【００６２】
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ基質）を冷蔵庫から取り出し、アルミホイルにより覆った清浄なトラフの中へ置いた。チップをＤＩ水によりリンスし、窒素により乾燥した。各センサー上の３つの電極はすべてＴＭＢ基質により覆った。
【００６３】
電流測定は−１５０ｍＶで実行し、結果は図７および図８中に提供される。図７は、チップ上の１６のセンサーすべてについての時間ｖｓ電流の結果を示す。図８は、電流ｖｓ標的因子の濃度を示す。電流は標的因子濃度の関数であり、従って濃度の指標として使用することができる。
【００６４】
上で言及されるように、チップは複数のセンサーを含むことができる。いくつかの実例において、センサーを同時に使用して異なる標的因子の存在について検査する。多くの実例において、異なる標的因子についての検査は、同じレポーター溶液および同じメディエーター溶液を使用するが、異なる捕捉プローブ４４および／または異なるシグナリングプローブを使用できる。その結果として、異なるサンプル溶液は、検査されている各標的因子について調製される。いくつかの実例において、異なるレポーター溶液および／またはメディエーター溶液は、異なる標的因子について使用することができる。
【００６５】
いくつかの実例において、チップ上の異なるセンサーは、同じ異なる標的因子の存在について検査するために同時に使用される。標的因子が同じサンプルから生じる場合、異なるレポーター溶液および／またはメディエーター溶液を、異なるセンサーにより使用することができる。これらの実例において、あるセンサーでの結果は、別のセンサーの結果に対するチェックとして働くことができる。検査される標的因子が同一であるが、異なるサンプルから生じる場合、各センサーによる使用のために調製されたサンプル溶液は異なる。
【００６６】
本発明の他の実施形態、組合せおよび修飾は、これらの教示を考慮して当業者に容易に思いつくだろう。従って、本発明は以下の請求項によってのみ限定されるべきであり、上述の明細書および添付の図面と併用して考察した場合、それはかかる実施形態および修飾をすべて含む。
【符号の説明】
【００６７】
１０ チップ； １４ 電極； 基板１６；
１８ 参照電極； ２０ 対電極； ２２ 作用電極２２；
２８ 粘着層； ２９ センサーシステム； ３０ 検査体積；
４２ 標的因子； ４４ 捕捉プローブ； ５０ レポーター；
５２ メディエーター； ５４ アクティブプローブ； ５６ スペーサー５６。
【技術分野】
【０００１】
[関連出願]
本出願は、２００７年７月２日に出願された、表題「効率を改善したチップ分析」の米国仮特許出願第６０／９５８，２７７号の利益を主張し、その全体を本明細書に組み入れる。
【０００２】
[技術分野]
本発明は分析に関し、より詳細には分析による使用のためのセンサーに関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な分析は、基板上に配置された１つまたは複数のセンサーを含む分析チップを使用して実行することができる。センサーの各々は、基板上に配置された作用電極、参照電極および対（カウンタ）電極を含むことができる。参照電極は、典型的には参照電極が他の電極の電位を測定できる固有電位を有するように、互いに接触する２つの金属層を含むかまたはそれからなる。
【０００４】
いくつかの実例において、参照電極は、参照電極の製造に関連する課題を減少させるために金属の単層により作製される。しかしながら、参照電極の電位が浮遊しうるので、これらのセンサーはしばしば一貫しない結果を生ずる。その結果として、一貫した結果を提供することができる製造可能なセンサーの必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
チップは、基板上に電極を含む。電極は、作用電極、参照電極および対（カウンタ）電極を含む。参照電極は固有電位を持たないように構築される。自己組織化単分子膜は参照電極に配置される。自己組織化単分子膜はスペーサーおよびアクティブプローブを含む。アクティブプローブは、アクティブプローブが有する捕捉プローブに対する親和性が、スペーサーが有する捕捉プローブに対する親和性よりも高くなるように構成される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】標的因子の存在および／または量の検出のためのセンサーを有する分析チップの平面視である。
【図１Ｂ】Ｂと標識したラインに沿って得られる、図１Ａ中に図示される分析チップの横断面図である。
【図１Ｃ】複数のセンサーを有する分析チップを図示した図である。
【図２】図１Ａのセンサー上に検査体積を配置するセンサーシステムを説明した図である。
【図３Ａ】図１Ａにおいて図示される分析チップの使用に適切な分析の一般化例を図示した図である。分析は、作用電極に検査プローブを結合する粘着層を使用する。粘着層が有する捕捉プローブに対する親和性は、作用電極が有する捕捉プローブに対する親和性よりも高い。
【図３Ｂ】粘着層として働くのに適切な不均一な自己組織化単分子膜を図示した図である。
【図３Ｃ】図３Ａの検査プローブと併用して使用される図３Ｂの不均一な自己組織化単分子膜を図示した図である。
【図４】スペーサーとしてＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）および１１−メルカプト−１−ウンデカノールに結合するストレプトアビジンを備えたアクティブプローブを含む自己組織化単分子膜を有するセンサーを説明した図である。
【図５Ａ】遺伝物質の特定の鎖の存在の検出に適応させた図３Ａの分析を図示した図である。
【図５Ｂ】図５Ａにおいて図示された分析による使用に適切な反応機構の特定の例を図示した図である。
【図６】タンパク質および細胞を含むが、これらに限定されない、標的因子の存在の検出に適応させた図３Ａの分析を説明した図である。
【図７】センサーチップ上の１６のセンサーについての実験の電流ｖｓ時間の結果を示した図である。
【図８】実験の電流ｖｓ濃度の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
チップセンサーは、基板上に１つまたは複数のセンサーを有する。センサーの各々は、基板上に作用電極、参照電極および対電極を含む。参照電極は固有電位なしで構築される。例えば、参照電極は、金属の単層を含むことができる。自己組織化単分子膜は、少なくとも参照電極および／または少なくとも作用電極上にある。
【０００８】
自己組織化単分子膜は、アクティブプローブとの間にスペーサーを含む不均一な自己組織化単分子膜である。アクティブプローブは、捕捉プローブに対する親和性がスペーサーよりも高くなるように構成される。その結果として、捕捉プローブは、スペーサーを超えてアクティブプローブに優先的に結合する。捕捉プローブは、分析によって捜し求められている標的因子に結合する。従って、アクティブプローブは電極への標的因子の連結に参加するが、スペーサーは電極に標的因子を連結しない。本発明者は、アクティブプローブとの間のスペーサーの存在が参照電極のインピーダンスを増加し、従ってセンサーの操作の間の参照電極電位の浮遊を停止または減少することを明らかにした。
【０００９】
スペーサーは、分析結果におけるシグナル対ノイズ比もまた減少することができる。例えば、分析のいくつかの実例は、メディエーターと作用電極との間の反応に由来する作用電極を介する電流を測定することによって、標的因子の存在を決定する。その結果として、メディエーターからでない作用電極での電流源は、分析結果におけるノイズ源である。本発明者は、作用電極上にスペーサーを含む自己組織化単分子膜が、作用電極上で誘電体層として働くことができることを明らかにした。その結果として、自己組織化単分子膜は、メディエーター以外の源からの電流源が、作用電極を介して通過することを防ぐことができる。しかしながら、同じ自己組織化単分子膜は、メディエーターと作用電極との間のレドックス反応の継続を可能にする。メディエーターと作用電極との間の継続的なレドックス反応についての１つの可能性な説明は、自己組織化単分子膜中でメディエーターを捕らえることができ、自己組織化単分子膜を介するシグナルのトンネル効果を可能にすることができるということである。
【００１０】
スペーサーおよびアクティブプローブを含む自己組織化単分子膜が、参照電極電位の浮遊を停止もしくは減少することができる、および／または分析結果におけるシグナル対ノイズ比を減少することができるので、自己組織化単分子膜はセンサーによって提供される結果の一貫性および／または効率を増加させる。
【００１１】
図１Ａおよび図１Ｂは、センサー１２を有する分析チップ１０の一部分の例を図示する。図１Ａはチップ１０の平面視であり、図１Ｂは、Ｂと標識したラインで得られる図１Ａ中に示されるチップ１０の横断面図である。チップ１０は、基板１６上に配置された複数の電極１４を含む。適切な基板１６はシリコン基板１６を含むが、これらに限定されない。基板１６は単一材料から構築されるものとして示されるが、基板１６は複合構造を有することができる。電極１４は、参照電極１８および作用電極２２に隣接して配置した対電極２０を含む。いくつかの実例において、対電極２０および参照電極１８は、作用電極２２の反対側に配置される。対電極２０および参照電極１８は、同じ形を有することができるか、または異なる形を有することができる。作用電極２２の一部分が、対電極２０の異なる領域の間におよび／または参照電極１８の異なる領域の間に配置するように、対電極２０および／または参照電極１８は配置することができる。作用電極２２は円形状であるとして示されるが、作用電極２２は矩形形状を含むがこれに限定されない様々な他の形状でありえる。
【００１２】
参照電極１８は、金属などの導体材料の単層を含みうる。例えば、参照電極は、金、銀、銅、白金、クロミウム、アルミニウム、チタンおよびニッケルなどの金属の単層からなることができる。作用電極２２、対電極２０および参照電極１８は、同一素材から、または異素材から構築することができる。他の適切な電極１４は、金、銀、銅、白金、クロミウム、アルミニウム、チタンおよびニッケルを含むが、これらに限定されない。
【００１３】
作用電極２２の最大の寸法が４ｍｍ、１ｍｍ、１００μｍまたは５０μｍ未満であるように、作用電極２２は構築することができる。対電極２０および参照電極１８に適切な幅は、２０μｍ、１００μｍ、０．５ｍｍまたは３ｍｍ未満の幅を含むが、これらに限定されない。作用電極２２と参照電極１８との間のギャップおよび／または作用電極２２と対電極との間のギャップに適切な寸法は、１μｍ、１００μｍ、０．５ｍｍまたは２ｍｍ未満のギャップを含むが、これらに限定されない。これらの寸法は、現場分析装置における使用に適切な小型のセンサー１２を提供することができる。
【００１４】
作用電極２２は粘着層２８を含む。より詳細に以下に記述されるように、検査プローブの一部分が有する粘着層２８に対する親和性は、作用電極２２に対する親和性よりも大きい。その結果として、粘着層２８は、検査プローブ４０の一部分の作用電極２２に対する親和性を増加させることができる。
【００１５】
図１Ａおよび図１Ｂは、チップ１０が単一センサー１２を有するとして図示するが、チップ１０は図１Ｃ中に図示されるような複数のセンサー１２を含むことができる。センサー１２は、チップ１０上でアレイにアレンジすることができる。センサー１２の各々は、作用電極２２、参照電極１８および対電極２０を含む。チップ１０上の異なるセンサー１２は、同時にまたは連続的に使用することができる。各センサー１２を使用して異なる標的因子の存在について検査することができる。その結果として、チップ１０は、複数の異なる標的因子について高度に効率的な検査を提供することができる。あるいは、複数のセンサー１２を使用して同じ標的因子の存在について検査することができる。複数の検査はリダンダンシーチェックとして働くことができるか、または各々のセンサー１２上で行なわれた検査は異なる源からの標的因子についてのものでありえる。
【００１６】
図２中に図示されるように、センサーシステム２９はチップ１０の操作の間に形成される。粘着層２８は電極の少なくとも１つの上に存在するが、粘着層２８は図２中に図示されない。センサーシステム２９は、センサー１２上に配置された検査体積３０を含む。検査体積３０は、同時に作用電極２２、参照電極１８および対電極２０を覆って配置される。いくつかの実例において、表面張力は、電極１４を覆って配置される検査体積３０を維持することに加えて、検査体積３０の形状を維持する。
【００１７】
図３Ａは、図２に記載のセンサーシステム２９の一般化例を提供する。図３Ａは、図２中に図示されたセンサーシステム２９の横断面図の一部分である。
【００１８】
センサーシステム２９は、作用電極上の粘着層２８に結合する検査プローブ４０を含む。単一検査プローブ４０を図解のために示すが、作用電極２２一帯の検査プローブ４０の密度は一般的にはるかに高い。検査プローブ４０は、捕捉プローブ４４とシグナリングプローブ４６との間の標的因子４２の一部分を含む。分析は、標的因子４２の存在を示す。適切な標的因子４２は、ＤＮＡまたはＲＮＡおよび抗体などの、多糖、核酸、細胞および遺伝物質の鎖を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
粘着層２８は、捕捉プローブ４４が有する粘着層２８なしの作用電極２２に対する親和性以上に、捕捉プローブ４４の作用電極２２に対する親和性を増加させることができる。捕捉プローブ４４は、作用電極２２を標的因子４２に連結するように働く。以下に明らかになるように、適切な捕捉プローブ４４は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、および抗体などのタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
レポーター５０はシグナリングプローブ４６に結合される。シグナリングプローブ４６は、標的因子４２をレポーター５０と連結するように構成される。少なくとも１つのメディエーター５２が検査体積中にある。メディエーター５２およびレポーター５０は各々検査体積３０中に１つの状態以上で存在することができる。異なる状態の例は、酸化が異なる状態を含む。
【００２１】
チップ１０の操作の間に、チップ１０は、作用電極２２、検査体積３０およびその回路の対電極２０を含む回路を介する電流の通過をモニタリングしながら、作用電極２２とセンサー１２の参照電極１８との間の電位を適用するように構成された電子機器（まかれない）を備えた電気通信中にある。
【００２２】
メディエーター５２が第１のメディエーター状態５２Ａから第２のメディエーター状態５２Ｂに変換し、レポーター５０が第１のレポーター状態から第２のレポーター状態に変換するように、メディエーター５２とレポーター５０は相互作用する。Ａと標識した破線は、レポーター５０へ拡散し、ここで第２のメディエーター状態５２Ｂに変換される、第１のメディエーター状態５２Ａを図示する。Ｂと標識した破線は、検査体積３０を介して作用電極２２へ拡散する第２のメディエーター状態５２Ｂを図示する。作用電極２２と参照電極１８との間に適用された電位は、作用電極２２と第２のメディエーター状態５２Ｂとの間で電子伝達を生じさせるレベルまで上昇される。電子伝達は、作用電極２２、検査体積３０および対電極２０を含む回路を介して電流が流れることを可能にする。その結果として、作用電極２２および対電極２０を介する電流の流れは、メディエーター５２が、第１のメディエーター状態５２Ａから第２のメディエーター状態５２Ｂに変換されていることを示す。
【００２３】
標的因子４２が存在しない場合、以下に明らかなように、レポーター５０は検査体積３０中に存在しない。レポーター５０が存在しない場合、メディエーター５２は、第１のメディエーター状態５２Ａから第２のメディエーター状態５２Ｂに変換されない。その結果として、標的因子４２が検査体積３０中に存在しない場合、作用電極を介する電流は存在しない。標的因子４２が存在する場合電流が存在するが、標的因子４２が存在しない場合は存在しないので、電流は検査体積３０中で標的因子４２の存在を示す。
【００２４】
図３Ｂは、電極１４上の粘着層２８を含むセンサーの横断面図である。図示された粘着層２８および電極１４は、作用電極、参照電極、および／または対電極上のアレンジを示すことができる。粘着層２８は、自己組織化単分子膜が電極１４上に存在しない場合、電極１４が有する捕捉プローブ４４に対する親和性よりも高い捕捉プローブ４４に対する親和性を有する自己組織化単分子膜を含むかまたはそれからなる。
【００２５】
自己組織化単分子膜は、１分子厚の二次元フィルムであり、各分子は表面へ共有結合される。自己組織化単分子膜の古典的な例は、金表面とのアルカンチオールの反応である。官能基化されたシラン化合物もまたシリコン表面上で自己組織化することができる。通常は表面に直接結合されない分子を洗浄することができるので、自己組織化単分子膜は表面上に固定化された１分子厚フィルムを提供することができる。
【００２６】
図示された自己組織化単分子膜は、自己組織化単分子膜中に異なる化合物を含む不均一な自己組織化単分子膜である。例えば、図示された自己組織化単分子膜はアクティブプローブ５４およびスペーサー５６を含む。アクティブプローブ５４は電極リンカー５８を含む。電極リンカー５８は、アクティブプローブ５４を電極１４に連結するように構成される。アクティブプローブ５４はプローブリンカー６０もまた含む。プローブリンカー６０は、アクティブプローブ５４を捕捉プローブ４４に連結するように構成される。例えば、プローブリンカーは、捕捉プローブを結合するように各々が構成される、１つまたは複数の結合部位を含むことができる。いくつかの実例において、プローブリンカー６０はアクティブプローブ５４の末端端部で配置される。各スペーサー５６は、スペーサー５６を電極１４に連結するように構成された電極リンカー６２を含む。
【００２７】
スペーサー５６は末端端部６４もまた含む。末端端部６４が有する捕捉プローブ４４に対する親和性は、プローブリンカー６０が有する捕捉プローブ４４に対する親和性よりも小さい。いくつかの実例において、スペーサー５６が有する捕捉プローブ４４に対する親和性が実質的にはないように、末端端部６４は構成される。従って、捕捉プローブ４４は、スペーサー５６ではなくアクティブプローブ５４に結合する。
【００２８】
図３Ｃは、図３Ｂの検査プローブおよびレポーターと併用して使用される図３Ａのセンサーを図示する。アクティブプローブ５４は検査プローブに連結されるが、スペーサー５６は検査プローブに連結されない。
【００２９】
アクティブプローブ５４として働く化合物の各々は同一のものでありえるか、またはアクティブプローブ５４は、アクティブプローブ５４として各々が働く複数の異なる化合物を含みうる。スペーサー５６として働く化合物の各々は同一のものでありえるか、またはスペーサー５６は、スペーサー５６として各々が働く複数の異なる化合物を含みうる。自己組織化単分子膜中のスペーサー５６対アクティブプローブ５４の比率は、分析のパフォーマンスに影響を与えうる。スペーサー５６対アクティブプローブ５４の比率は、好ましくは１００：１〜１：１００または１０：１〜１：１０または５：１〜１：５の範囲である。
【００３０】
アクティブプローブ５４との使用に適切な電極リンカー５８は、チオール基を含むが、これに限定されない。その結果として、アクティブプローブ５４はチオール化アクティブプローブ５４でありえる。チオール化アクティブプローブが電極１４に連結される場合、チオール化アクティブプローブは電極１４に直接連結される硫黄を含む。電極表面が金を含むかまたはそれからなる場合、チオール電極リンカー５８は、電極リンカー５８としての使用に適切である。
【００３１】
スペーサー５６との使用に適切な電極リンカー６２は、チオール基を含むが、これに限定されない。その結果として、アクティブプローブ５４はチオール化スペーサー５６でありえる。チオール化スペーサーが電極１４に連結される場合、チオール化スペーサーは電極１４に直接連結される硫黄を含む。電極表面が金を含むかまたはそれからなる場合、チオール電極リンカー６２は、電極リンカー６２としての使用に適切である。スペーサー５６中で使用される電極リンカー６２は、アクティブプローブ５４に対して使用された電極リンカー６２と同一のもの、またはそれとは異なるものでありえる。
【００３２】
プローブリンカー６０は、捕捉プローブ４４の構造に依存しうる。プローブリンカー６０の例は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミン基（−ＮＨ2、ＮＨＲ（式中Ｒはアルキル基などの有機基を示す））、およびこれらの基を含む化合物などの基を含むが、これらに限定されない。スペーサー５６のための末端端部６４の例は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）およびアミン基（−ＮＨ2、ＮＨＲ（式中Ｒはアルキル基などの有機基を示す））などのアルキル基および他の基を含むが、これらに限定されない。スペーサー５６の末端端部６４は、プローブリンカー６０とは異なることができる。例えば、プローブリンカー６０がアミンである場合、スペーサー５６の末端端部６４はヒドロキシル基でありえる。
【００３３】
いくつかの実例において、プローブリンカー６０がスペーサー５６の末端端部６４の上方に配置されるように、アクティブプローブ５４を構築することができる。例えば、アクティブプローブ５４はスペーサー５６よりも長くなりえる。その結果として、プローブリンカー６０は、センサー上に配置された溶液中に含まれる捕捉プローブ４４に容易に結合することができる。
【００３４】
適切なアクティブプローブ５４は、１つまたは複数のアルキレン部分を含む。アルキレン部分の各々は、１つもしくは複数の炭素、２つもしくは複数の炭素または３つもしくは複数の炭素、または４つもしくは複数の炭素を備えた骨格を有することができる。例えば、アクティブプローブ５４は、−（ＣＨ2）n−（式中、ｎは１以上、２以上、３以上、または４以上である）によって示される、１つまたは複数の部分を含むことができる。アクティブプローブ５４中の１つまたは複数のアルキレン部分は、置換することおよび／または分岐させることができる。例えば、適切なアクティブプローブ５４は、完全にまたは部分的にハロゲン化された１つまたは複数のアルキレン部分を含むことができる。アクティブプローブ５４が複数のアルキレン部分を含む場合、異なるアルキレン部分は、エーテル結合（−Ｏ−）、チオエーテル結合（−Ｓ−）、アミン結合（−ＮＲ−（式中Ｒは水素またはアルキル基などの有機基である））、ケトン結合（−ＣＯ−）、エステル結合（−ＣＯ−Ｏ−）、チオエステル結合（−Ｓ−ＣＯ−）、またはアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ）によって相互に連結することができる。
【００３５】
適切なスペーサー５６は１つまたは複数のアルキレン部分を含む。アルキレン部分の各々は、１つもしくは複数の炭素、２つもしくは複数の炭素、３つもしくは複数の炭素、または４つもしくは複数の炭素を備えた骨格を有することができる。例えば、スペーサー５６は、−（ＣＨ2）n−（式中ｎは１以上、２以上、３以上、または４以上である）によって示される、１つまたは複数の部分を含むことができる。１つまたは複数、スペーサー５６中のアルキレン部分は、置換することおよび／または分岐させることができる。例えば、適切なスペーサー５６は、完全にまたは部分的にハロゲン化される１つまたは複数のアルキレン部分を含むことができる。スペーサー５６が複数のアルキレン部分を含む場合、異なるアルキレン部分は、酸素（−Ｏ−）、チオエーテル結合（−Ｓ−）、アミン結合（−ＮＲ−（式中Ｒは水素またはアルキル基などの有機基である））、ケトン結合（−ＣＯ−）またはエステル結合（−ＣＯＯ−）によって相互に連結することができる。
【００３６】
適切なアクティブプローブ５４の例は、置換されたビオチン、ストレプトアビジンに結合する置換されたビオチン、デキストラン、およびＭＵＤＡ（メルカプトウンデカン酸）を含むが、これらに限定されない。例えば、分析を使用してＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝物質の存在を同定し、そしてアクティブプローブ５４が結合される電極１４が金である場合、適切なアクティブプローブ５４はストレプトアビジンに結合するビオチン化チオールを含む。適切なビオチン化チオールの例は、ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）を含むが、これに限定されない。適切なスペーサー５６の例は、チオールおよび６−メルカプト−１−ヘキサノールなどのヒドロキシル化チオールを含むが、これらに限定されない。図４は、スペーサー５６としてＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）および１１−メルカプト−１−ウンデカノールに結合する、ストレプトアビジンを備えたアクティブプローブ５４を含む自己組織化単分子膜を有するセンサーを示す。ストレプトアビジンは、ビオチン化捕捉プローブのための結合部位として働く、結合ループ（残基４５〜５２）によって示された複数のプローブリンカーを含む。
【００３７】
図５Ａは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝物質７２の鎖の検出に適応させた、図３Ａ中で図示される検査体積３０を図示する。捕捉プローブ４４、標的因子４２、シグナリングプローブ４６は、遺伝物質７２の各鎖である。捕捉プローブ４４の一部分は、捕捉プローブ４４の相補的な一部分と標的因子４２との間の塩基対を提供する標的因子４２の一部分に相補的である。標的因子４２の一部分は、標的因子４２の相補的な一部分とシグナリングプローブ４６との間の塩基対を提供するシグナリングプローブ４６の一部分に相補的である。
【００３８】
図５の分析コンポーネントとの使用に適切なレポーター５０は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＡＰ（アルカリフォスファターゼ）およびグルコースペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されない。ＨＲＰとの使用に適切なメディエーター５２は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含むが、これに限定されない。ＡＰとの使用に適切なメディエーター５２は、ナイアシン誘導体（ＮＡＤ）を含むが、これに限定されない。グルコースペルオキシダーゼとの使用に適切なメディエーター５２は、ルテニウム（ＩＩ）ヘキサミンを含むが、これに限定されない。
【００３９】
いくつかの実例において、シグナリングプローブ４６を修飾してレポーター５０の結合を促進する。例えば、レポーター５０がホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む場合、シグナリングプローブ４６の１つまたは複数の塩基を修飾して、シグナリングプローブ４６のＨＲＰへの結合を促進することができる。例えば、シグナリングプローブ４６の５’末端は、ＨＲＰにリンカー７０として働くことができるフルオレセインにより修飾することができる。
【００４０】
いくつかの実例において、捕捉プローブ４４は、捕捉プローブ４４の粘着層２８への結合を促進するリンカー７６により修飾される。例えば、自己組織化単分子膜がストレプトアビジンを含む場合、捕捉プローブ４４は、ストレプトアビジン結合部位と容易に結合するビオチンにより修飾することができる。いくつかの実例において、捕捉プローブ４４の５’末端はビオチンにより修飾される。
【００４１】
図５Ｂは、レポーター５０としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を含む水溶液中のメディエーター５２としてＴＭＢを使用する、図５Ａに記載の分析の機構を図示する。この機構は、第１のレポーター状態５０Ａ、第２のレポーター状態５０Ｂおよび第３のレポーター状態５０Ｃで存在するＨＲＰを図示する。第１のレポーター状態５０ＡはＨＲＰの酸化状態であり、第２のレポーター状態５０ＢはＨＲＰの別の酸化状態である。この機構は、第１のメディエーター状態５２Ａおよび第２のメディエーター状態５２Ｂで存在するＴＭＢもまた図示する。
【００４２】
Ａと標識した矢印は、過酸化水素と反応して第２のレポーター状態５０Ｂを生成している、第１のレポーター状態５０Ａを図示する。Ｂと標識した矢印は、第２のレポーター状態５０Ｂによって酸化されて第２のメディエーター状態５２Ｂを形成している、第１のメディエーター状態５２Ａを図示する。Ｃと標識した矢印は、還元されて第１のレポーター状態５０Ａ（図中の・ＡＨはＴＭＢの酸化状態である）を形成している、第３のレポーター５０状態Ｃを図示する。
【００４３】
Ｄと標識した矢印は、作用電極２２に拡散する第２のメディエーター状態５２Ｂを図示する。Ｅと標識した矢印は、第１のメディエーター状態５２Ａに第２のメディエーター状態５２Ｂを戻すように作用電極２２で起こる電子伝達を図示する。Ｆと標識した矢印は、検査体積３０を介して拡散して戻り、第２のレポーター状態５０Ｂと相互作用している、第１のメディエーター状態５２Ａを図示する。
【００４４】
図６で図示されるように、図３Ａ中で図示された分析は、細胞７４またはタンパク質の存在の検出のためにも適応させることができる。例えば、捕捉プローブ４４はサンドイッチ分析の一次抗体でありえる。さらに、シグナリングプローブ４６はサンドイッチ分析の二次抗体でありえる。サンドイッチ分析のために適切な標的因子４２は、抗体に特異的な結合部位を有するタンパク質、多糖および核酸、または抗体に特異的な結合部位を有するタンパク質を備えた細胞を含むが、これらに限定されない。図６の分析コンポーネントとの使用に適切なレポーター５０は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＡＰ（アルカリフォスファターゼ）およびグルコースペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
ＨＲＰとの使用に適切なメディエーター５２は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含むが、これに限定されない。ＡＰとの使用に適切なメディエーター５２は、ナイアシン誘導体（ＮＡＤ）を含むが、これに限定されない。グルコースペルオキシダーゼとの使用に適切なメディエーター５２は、ルテニウム（ＩＩ）ヘキサミンを含むが、これに限定されない。
【００４６】
一次抗体を修飾して粘着層２８への結合を促進するリンカーを含むことができる。例えば、粘着層２８が露出したストレプトアビジンを含む場合、一次抗体は、ストレプトアビジン結合部位と容易に結合するビオチンにより修飾することができる。
【００４７】
二次抗体を修飾してレポーター５０への結合を促進することができる。例えば、レポーター５０がＨＲＰを含む場合、二次抗体を修飾してシグナリングプローブ４６のＨＲＰへの結合を促進することができる。例えば、二次抗体は、ＨＲＰに対してリンカー７０として働くことができるフルオレセインにより修飾することができる。
【００４８】
いくつかの実例において、捕捉プローブ４４は、捕捉プローブ４４の粘着層２８への結合を促進するリンカー７６により修飾される。例えば、自己組織化単分子膜がストレプトアビジンを含む場合、捕捉プローブ４４は、ストレプトアビジン結合部位と容易に結合するビオチンにより修飾することができる。
【００４９】
自己組織化単分子膜は、十分な摂動をともなう化学的インキュベーションによって合成することができる。
【００５０】
記述された方法は作用電極、参照電極および対電極上に自己組織化単分子膜を形成するが、この方法は自己組織化単分子膜の形成の間に特定の電極をマスクすることによって、電極の一部分の上に自己組織化単分子膜を形成するために使用することができる。その結果として、センサーは、少なくとも参照電極上にありえるか、または少なくとも作用電極上にありえる、自己組織化単分子膜を有することができる。マスクは、センサーの操作の前に除去することができる。交互に、マスクを除去した後、別の自己組織化単分子膜を以前にマスクした電極上に形成することができる。その結果として、異なる自己組織化単分子膜を関電極上に配置することができる。
【００５１】
作用電極２２上に一連の溶液を配置することによって、検査体積３０を、自己組織化単分子膜を有するセンサー１２上に生成することができる。サンプル溶液は、標的因子４２を有するサンプルまたは有していないサンプルから調製することができる。標的因子４２がサンプル中の細胞の内側に位置するか、または細胞膜中にある場合、適切な存在条件下で、溶解剤をサンプルに追加する。サンプル溶液中で検査プローブ４０の形成を可能にする条件下で、捕捉プローブ４４およびシグナリングプローブ４６をサンプル溶液に追加する。検査プローブ４０が粘着層２８と結合することを可能にする条件下で、サンプル溶液を作用電極２２に適用する。サンプル溶液は、参照電極１８および対電極２０を覆うように適用することができる。あるいは、表面張力を使用して作用電極２２に対してサンプル溶液を制限することができる。次にサンプル溶液を少なくとも作用電極２２から洗い流す。標的因子４２がサンプル溶液中に存在する場合、検査プローブ４０は自己組織化単分子膜中のアクティブプローブ５４に結合されたままである。
【００５２】
レポーター５０を有するレポーター溶液は、少なくとも作用電極２２上に配置される。レポーター５０がシグナリングプローブ４６と結合することを可能にする条件下で、レポーター溶液を作用電極２２上に配置する。レポーター溶液は、参照電極１８および対電極２０を覆うように適用することができる。あるいは、表面張力を使用して作用電極２２に対してレポーター溶液を制限することができる。次にセンサー１２を洗浄溶液により洗浄する。残存するレポーター５０は洗浄されるが、レポーター５０は、少なくとも作用電極２２上に存在する検査プローブ４０に結合されたままである。その結果として、標的因子４２がサンプル中に存在しない場合、レポーター５０は存在しない。
【００５３】
作用電極２２、参照電極１８および対電極２０の各々が、メディエーター溶液によって覆われるように、メディエーター５２を有するメディエーター溶液をセンサー１２上に配置する。作用電極２２上に存在するコンポーネント、および作用電極２２に適用されたメディエーター溶液の一部分は、検査体積３０として働く。
【００５４】
２００１年１１月２日に出願された、表題「統合されたサンプル調製システム」の米国仮特許出願第６０／３３９，７６６号（その全体を本明細書に組み入れる）；２００３年１２月０９日に出願された、表題「電気化学センサーによる使用のためのカートリッジ」の米国仮特許出願第６０／５２８，５６６号（その全体を本明細書に組み入れる）；および２００６年１２月６日に出願された、表題「センサーへの液体の送達のためのシステム」の米国仮特許出願第６０／８７３，０７８号（その全体を本明細書に組み入れる）の各々は、センサー上への溶液の輸送に適切な構造を開示する。
【実施例１】
【００５５】
１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド（ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ、ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ ＧｍＢＨ）、ドイツ）の自己組織化単分子膜を、金表面上に形成した。露出した金表面を洗浄し、４．５×１０-4Ｍ １１−メルカプト−１−ウンデカノール（アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、４４、７５２−８）を含有するエタノール中のビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨの５０ｍＭ溶液において１８時間インキュベートした。結果のものをエタノールおよび水によりリンスした。
【実施例２】
【００５６】
アクティブプローブおよび捕捉プローブを自己組織化単分子膜上に形成した。各作用電極を、２．５μＬの１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび４００ｍＭ Ｎ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドにより１０分間インキュベートした。センサーを、ビオチン（５０ｍＭ酢酸ナトリウム中で５ｍｇ／ｍｌ；ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、ロックフォード、イリノイ）中で１０分間インキュベートした。ビオチン化センサーを、４μＬのＲＮａｓｅ不含有Ｈ２Ｏ（カタログ番号８２１７３９；ＭＰバイオメディカルズ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社、オーロラ、オハイオ）中の０．５Ｕ／ｍｌのストレプトアビジンの中で１０分間インキュベートした。ストレプトアビジン被覆センサーを、ビオチン化捕捉プローブ（４μＬ；１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で１μＭ）により３０分間インキュベートした。
【実施例３】
【００５７】
アクティブプローブおよび捕捉プローブは、実施例１に従って構築された自己組織化単分子膜上に形成された。検査体積をセンサー上に形成し、標的因子について検査した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの混合物をバイアル中に置き、ボルテックスにより撹拌した。各作用電極を混合物により覆った。覆って加湿したガラスのペトリ皿の中で、混合物をセンサー上で１０〜１５分間室温でインキュベートした。インキュベーション期間の完了時に、センサーチップを脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥させ、次にペトリ皿中にセンサーチップを戻す。
【００５８】
標的因子に対する抗体の純度および親和性に依存して（ここでより高い親和性はより低い濃度を可能にする）、０．０１〜１（ｍｇ／ｍＬ）にわたる濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中のモノクローナル抗体捕捉プローブにより、捕捉プローブ溶液を作製した。各作用電極を捕捉プローブ溶液により覆った。ペトリ皿を覆って、抗体濃度に依存して、１０〜９０分間室温でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、センサーチップを脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥し、ペトリ皿の中に戻して配置した。
【００５９】
作用電極または各々のセンサーの３つの電極すべてを１Ｍエタノールアミンにより覆い、ペトリ皿を覆った。センサーチップを１５分間室温でインキュベートした。このエタノールアミンのインキュベーションの終了時に、センサーチップを脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥し、ペトリ皿中に戻して配置し、室温の窒素雰囲気中の乾燥条件で保存した。
【００６０】
各作用電極を覆って、標的因子を含みうる標的溶液を作用電極の各々の上に配置した。軽く湿らせたフィルター紙をセンサーチップの下でペトリ皿中に配置してサンプルの乾燥を阻害し、ペトリ皿を覆った。標的溶液を、標的因子の濃度に依存して、５〜３０分間インキュベートした。例えば、ｐｇ／ｍＬについて３０分間およびｎｇ／ｍＬ以上について５分間標的溶液をインキュベートすることができる。標的溶液インキュベーション後に、センサーチップを脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥し、ペトリ皿中に戻して配置した。
【００６１】
各作用電極は、ビオチンコンジュゲートモノクローナルシグナリング抗体を含むシグナリング溶液により覆った。シグナリング溶液を、標的濃度に依存して、５〜３０分間インキュベートし、脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥した。各作用電極を、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを有するレポーター溶液により覆った。レポーター溶液を３０分間室温でインキュベートし、脱イオン水によりリンスし、窒素により乾燥した。
【００６２】
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ基質）を冷蔵庫から取り出し、アルミホイルにより覆った清浄なトラフの中へ置いた。チップをＤＩ水によりリンスし、窒素により乾燥した。各センサー上の３つの電極はすべてＴＭＢ基質により覆った。
【００６３】
電流測定は−１５０ｍＶで実行し、結果は図７および図８中に提供される。図７は、チップ上の１６のセンサーすべてについての時間ｖｓ電流の結果を示す。図８は、電流ｖｓ標的因子の濃度を示す。電流は標的因子濃度の関数であり、従って濃度の指標として使用することができる。
【００６４】
上で言及されるように、チップは複数のセンサーを含むことができる。いくつかの実例において、センサーを同時に使用して異なる標的因子の存在について検査する。多くの実例において、異なる標的因子についての検査は、同じレポーター溶液および同じメディエーター溶液を使用するが、異なる捕捉プローブ４４および／または異なるシグナリングプローブを使用できる。その結果として、異なるサンプル溶液は、検査されている各標的因子について調製される。いくつかの実例において、異なるレポーター溶液および／またはメディエーター溶液は、異なる標的因子について使用することができる。
【００６５】
いくつかの実例において、チップ上の異なるセンサーは、同じ異なる標的因子の存在について検査するために同時に使用される。標的因子が同じサンプルから生じる場合、異なるレポーター溶液および／またはメディエーター溶液を、異なるセンサーにより使用することができる。これらの実例において、あるセンサーでの結果は、別のセンサーの結果に対するチェックとして働くことができる。検査される標的因子が同一であるが、異なるサンプルから生じる場合、各センサーによる使用のために調製されたサンプル溶液は異なる。
【００６６】
本発明の他の実施形態、組合せおよび修飾は、これらの教示を考慮して当業者に容易に思いつくだろう。従って、本発明は以下の請求項によってのみ限定されるべきであり、上述の明細書および添付の図面と併用して考察した場合、それはかかる実施形態および修飾をすべて含む。
【符号の説明】
【００６７】
１０ チップ； １４ 電極； 基板１６；
１８ 参照電極； ２０ 対電極； ２２ 作用電極２２；
２８ 粘着層； ２９ センサーシステム； ３０ 検査体積；
４２ 標的因子； ４４ 捕捉プローブ； ５０ レポーター；
５２ メディエーター； ５４ アクティブプローブ； ５６ スペーサー５６。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極が作用電極、参照電極および対電極を含み、且つ、参照電極が固有電位を持たないように構築される、基板上の電極と；
自己組織化単分子膜が化合物の不均一な選択を含む、参照電極上の自己組織化単分子膜と
を含む電気化学センサー装置。
【請求項２】
前記化合物の選択がスペーサーおよびアクティブプローブを含み、アクティブプローブが有する捕捉プローブに対する親和性が、スペーサーが有する捕捉プローブに対する親和性よりも高いように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記アクティブプローブが、前記スペーサーよりも前記基板のさらに上方に及ぶ、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記アクティブプローブが、前記スペーサーよりも長い、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記アクティブプローブがビオチン化チオールを含み、前記スペーサーがヒドロキシル化チオールを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記ビオチン化チオールがストレプトアビジンに結合される、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記アクティブプローブが１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミドを含み、前記スペーサーが１１−メルカプト−１−ウンデカノールを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記アクティブプローブが、前記参照電極に直接連結された硫黄を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記アクティブプローブが、前記参照電極に直接連結された硫黄を含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記アクティブプローブが前記参照電極に直接結合された硫黄の反対に末端端部を含み、前記アクティブプローブの末端端部がアミンおよびヒドロキシル基からなる群から選択されたコンポーネントを含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記スペーサーが前記参照電極に直接結合された硫黄の反対に末端端部を含み、当該末端端部がアクティブプローブの末端端部とは異なっており、当該末端端部がアルキル基、アミンおよびヒドロキシル基からなる群から選択されたコンポーネントを含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記参照電極が金属の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記参照電極が金の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記参照電極、前記作用電極、および前記対電極の各々が、金属の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記参照電極、前記作用電極、および前記対電極の各々が、金の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記参照電極および前記対電極の各々が、前記作用電極の形状とは異なる形状を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記センサーが１６０μｍ2〜２５ｍｍ2の領域を占める、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
前記参照電極、前記作用電極および前記対電極の各々が、導電性材料の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
前記自己組織化単分子膜が作用電極上にある、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
前記作用電極の一部分が前記参照電極の異なる領域の間に配置されるように、前記参照電極が前記作用電極の周囲のまわりでアレンジされる、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
前記作用電極の一部分が前記参照電極の異なる領域の間に配置されるように、前記対電極が前記作用電極の周囲のまわりでアレンジされる、請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
電極が作用電極、参照電極および対電極を含み、且つ、参照電極が固有電位を持たないように構築され、導体材料の単層を含む、基板上の電極を備え；
スペーサーおよびアクティブプローブを含む自己組織化単分子膜を備えており；
前記アクティブプローブが有する捕捉プローブに対する親和性が、スペーサーが有する捕捉プローブに対する親和性よりも高いように構成され、
前記アクティブプローブがスペーサーよりも基板のさらに上方に及び、
前記アクティブプローブおよびスペーサーの各々が参照電極に直接結合する硫黄を含み、
前記アクティブプローブおよびスペーサーの各々が１つまたは複数のアルキレン部分を含み、
前記アクティブプローブが参照電極に直接結合された硫黄の反対に末端端部を含み、前記アクティブプローブの末端端部がアミンおよびヒドロキシル基からなる群から選択されたコンポーネントを含み、
前記スペーサーが参照電極に直接結合された硫黄の反対に末端端部を含み、前記スペーサーの末端端部が前記アクティブプローブの末端端部とは異なり、前記スペーサーの末端端部がアルキル基、アミンおよびヒドロキシル基からなる群から選択されたコンポーネントを含む、
電気化学センサー装置。
【請求項２３】
電極が作用電極、参照電極および対電極を含み、且つ、参照電極が固有電位を持たないように構築される、基板上の電極と、化合物の不均一な選択を含む、参照電極上の自己組織化単分子膜とを含む装置を準備し、
電極を使用して、標的因子が溶液中に存在するかどうかおよび／または溶液中の標的因子の量を決定する
ことを含む方法。
【請求項１】
電極が作用電極、参照電極および対電極を含み、且つ、参照電極が固有電位を持たないように構築される、基板上の電極と；
自己組織化単分子膜が化合物の不均一な選択を含む、参照電極上の自己組織化単分子膜と
を含む電気化学センサー装置。
【請求項２】
前記化合物の選択がスペーサーおよびアクティブプローブを含み、アクティブプローブが有する捕捉プローブに対する親和性が、スペーサーが有する捕捉プローブに対する親和性よりも高いように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記アクティブプローブが、前記スペーサーよりも前記基板のさらに上方に及ぶ、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記アクティブプローブが、前記スペーサーよりも長い、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記アクティブプローブがビオチン化チオールを含み、前記スペーサーがヒドロキシル化チオールを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記ビオチン化チオールがストレプトアビジンに結合される、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記アクティブプローブが１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミドを含み、前記スペーサーが１１−メルカプト−１−ウンデカノールを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記アクティブプローブが、前記参照電極に直接連結された硫黄を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記アクティブプローブが、前記参照電極に直接連結された硫黄を含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記アクティブプローブが前記参照電極に直接結合された硫黄の反対に末端端部を含み、前記アクティブプローブの末端端部がアミンおよびヒドロキシル基からなる群から選択されたコンポーネントを含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記スペーサーが前記参照電極に直接結合された硫黄の反対に末端端部を含み、当該末端端部がアクティブプローブの末端端部とは異なっており、当該末端端部がアルキル基、アミンおよびヒドロキシル基からなる群から選択されたコンポーネントを含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記参照電極が金属の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記参照電極が金の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記参照電極、前記作用電極、および前記対電極の各々が、金属の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記参照電極、前記作用電極、および前記対電極の各々が、金の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記参照電極および前記対電極の各々が、前記作用電極の形状とは異なる形状を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記センサーが１６０μｍ2〜２５ｍｍ2の領域を占める、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
前記参照電極、前記作用電極および前記対電極の各々が、導電性材料の単層からなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
前記自己組織化単分子膜が作用電極上にある、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
前記作用電極の一部分が前記参照電極の異なる領域の間に配置されるように、前記参照電極が前記作用電極の周囲のまわりでアレンジされる、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
前記作用電極の一部分が前記参照電極の異なる領域の間に配置されるように、前記対電極が前記作用電極の周囲のまわりでアレンジされる、請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
電極が作用電極、参照電極および対電極を含み、且つ、参照電極が固有電位を持たないように構築され、導体材料の単層を含む、基板上の電極を備え；
スペーサーおよびアクティブプローブを含む自己組織化単分子膜を備えており；
前記アクティブプローブが有する捕捉プローブに対する親和性が、スペーサーが有する捕捉プローブに対する親和性よりも高いように構成され、
前記アクティブプローブがスペーサーよりも基板のさらに上方に及び、
前記アクティブプローブおよびスペーサーの各々が参照電極に直接結合する硫黄を含み、
前記アクティブプローブおよびスペーサーの各々が１つまたは複数のアルキレン部分を含み、
前記アクティブプローブが参照電極に直接結合された硫黄の反対に末端端部を含み、前記アクティブプローブの末端端部がアミンおよびヒドロキシル基からなる群から選択されたコンポーネントを含み、
前記スペーサーが参照電極に直接結合された硫黄の反対に末端端部を含み、前記スペーサーの末端端部が前記アクティブプローブの末端端部とは異なり、前記スペーサーの末端端部がアルキル基、アミンおよびヒドロキシル基からなる群から選択されたコンポーネントを含む、
電気化学センサー装置。
【請求項２３】
電極が作用電極、参照電極および対電極を含み、且つ、参照電極が固有電位を持たないように構築される、基板上の電極と、化合物の不均一な選択を含む、参照電極上の自己組織化単分子膜とを含む装置を準備し、
電極を使用して、標的因子が溶液中に存在するかどうかおよび／または溶液中の標的因子の量を決定する
ことを含む方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５３２４７５（Ｐ２０１０−５３２４７５Ａ）
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１４７５４（Ｐ２０１０−５１４７５４）
【出願日】平成２０年５月２８日（２００８．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００５５６７
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５０６１９８３３３）ジーンフルイディクス・インコーポレーテッド (3)
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２８日（２００８．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００５５６７
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５０６１９８３３３）ジーンフルイディクス・インコーポレーテッド (3)
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