動物の感染症を治療または予防するための免疫原組成物
本発明の開示はイヌジステンパーウィルス、イヌアデノウィルス（１型又は２型）、イヌパラインフルエンザウィルス、イヌパルボウィルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ、及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの１つ以上により誘発される、又は関連する、イヌにおける疾患又は障害を治療又は防止するための多価免疫原組成物に関する。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ組成物は又、イヌ、ブタ、及びウシにおけるレプトスピラ症疾患又は障害を治療又は防止するために使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物におけるウィルス及び細菌の感染症に対抗する治療又は保護を与える組成物及び方法に関する。より特定すれば、本発明はイヌジステンパーウィルス、イヌアデノウィルス（１型又は２型）、イヌパラインフルエンザウィルス、イヌパルボウィルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ、及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの１つ以上により誘発される、又はそれに関連する、イヌにおける疾患又は障害を治療又は防止するための多価ワクチン組成物に関する。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ組成物は又、イヌ、ブタ、及びウシにおける疾患又は障害を治療又は防止するために使用できる。
【背景技術】
【０００２】
レプトスピラ症は動物及びヒトの両方が罹患する感染性の疾患である。感染症はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａと称される細菌病原体により誘発される。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属の細菌はスピロヘータ属であり、これは病原性であり、そして幾つかの既知の種及び多数の血液亜型を包含する場合がある。例示される病原性の種にはＬ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌ．ｉｎａｄａｉ、Ｌ．ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｓａｎｔａｒｏｓａｉ、Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ、Ｌ ｗｅｉｌｉｉまたはＬ．ｎｏｇｕｃｈｉｉが包含される。病原性のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型は多数種の家畜動物、愛玩動物、野生動物、及びヒトにおいて天然に存在する。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型の宿主の範囲は一般的に極めて広範であるが、感染した宿主に応じて異なる症状が生じる。例えばイヌにおけるレプトスピラ症は慢性の肝臓及び腎臓の疾患、及び死亡をもたらす場合がある。
【０００３】
レプトスピラ疾患の経過及び重症度は感染の原因である血液亜型に依存する場合が多い。肝臓の感染症及び尿の変色及び／又は黄疸、上昇した肝酵素値、及び胃腸症状に関連する血液亜型はＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａを包含する。血液亜型Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａは血液亜型Ｌ．ｐｏｍｏｎａと同様、腎不全の症状を伴っている。１９８０年代もの近年において、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬ．ｃａｎｉｃｏｌａはイヌにおいてレプトスピラ症を誘発する最も蔓延した血液亜型として発見された。しかしながら１９９０年代までに、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ及びＬ．ｐｏｍｏｎａの上昇した発生率がレプトスピラ症の復活と組み合わさって観察され、この疾患の疫学的特徴の変化しやすい傾向を示唆していた。幾つかの追加的な病原性のレプトスピラ血液亜型が医学的に関連するものとして出現しつつあり、例えばＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓが挙げられる。
【０００４】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａの血液亜型はそれらの表面上の抗原の型（即ち抗体生産を誘発する細胞表面マーカー）に基づいて分類されるが、これらの細胞表面抗原は血液亜型間の交差免疫性を殆ど呈さない。即ち、特定の血液亜型に対抗したワクチン接種は他の血液亜型に対抗する保護をもたらさない。更に又、幾つかの血液亜型に由来する抗原又は他の生物（又はウィルス）に由来する抗原を複合化したワクチンは抗原干渉をもたらす場合があり、即ち、組成物中の他の抗原により誘発された作用の「マスキング」のために、複合化抗原の１つ以上が免疫応答を誘発できなくなる。
【０００５】
従って、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ感染により誘発される、又はそれに関連する疾患又は障害を治療及び防止するための効果的な組成物及び方法の開発が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの不活性化された全又は部分細胞調製品を含む免疫原カクテル組成物を提供する。特定の実施形態においては、本発明のカクテル組成物はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及び／又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓから誘導された外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）１つ以上を含む。本発明は又、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの不活性化された全又は部分細胞調製品を含み、更にイヌジステンパー（ＣＤ）ウィルス、イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、及びイヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の不活性化株よりなる群から選択されるウィルス免疫原１つ以上を含む、免疫原カクテル組成物を提供する。本発明の免疫原カクテル組成物は、特定の実施形態においては又、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原又はＬ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｐｏｍｏｎａ、及びＬ．ｈａｒｄｊｏよりなる群から選択されるＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ株１つ以上から誘導された不活性化された全又は部分細胞調製品を含んでよい。特定の実施形態においては、本発明の免疫原カクテル組成物は、少なくとも１つのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの免疫原、例えばｐ６８Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ表面蛋白を包含してよい。
【０００７】
これら及び他の本開示の実施形態、特徴、及び利点は後述する詳細な説明及び添付請求項から明らかにされる。出願全体に渡って引用される全ての論文及び特許参照文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（詳細な説明）
本開示は細菌の感染又は細菌及びウィルス感染の両方を治療又は防止するための種々の多価の免疫原組成物を提供する。従って本開示は一般的には、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａの細胞表面免疫原の異なる組み合わせを複合化することにより抗原性の干渉をもたらさない免疫原カクテル組成物を作成できるという意外な発見に基づいている。即ち、カクテル組成物の各々個々の免疫原は免疫応答、特に防御免疫応答を誘発することができ、この活性は他の抗原の存在により影響されない。より特定すれば、免疫原カクテル組成物の１つの実施形態は、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓのＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を含む。更に又、これらのＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ免疫原は他のウィルス抗原、例えばイヌジステンパー（ＣＤ）ウィルス抗原、イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）抗原、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルス抗原、イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）抗原、イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）抗原、及びこれらの何れかの組み合わせと複合化された場合に免疫原性となる。更に又、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ由来の抗原、例えばｐ６８（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ表面蛋白）もまた免疫原カクテル組成物に添加することができる。これらの免疫原カクテル組成物はまた種々のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ感染及び種々のウィルス感染を治療又は緩解又は防止するためのワクチンとして使用できる。以下により詳細に考察するものは本発明の開示内における使用に適する多価免疫原組成物、並びに代表的な治療用又は獣医科用の用途である。
【０００９】
より詳細な開示を記載する前に、以後使用されることになる特定の用語の定義を説明することがその理解を容易にするために有益であると考えられる。
【００１０】
本明細書に記載する通り、何れかの濃度の範囲、パーセントの範囲、比の範囲又は整数の範囲は、特段の記載が無い限り、記載した範囲内の何れかの整数の値、及び、適宜、その分数（例えばある整数の１０分の１及び１００分の１）を包含するものと理解しなければならない。本明細書においては、「約」又は「本質的に含む」とは、特段の記載が無い限り、記載した値又は範囲の平均±１５％を意味する。代替物表記の使用（例えば「又は」）は何れか１つ、両方、又は表記代替物の何れかの組み合わせを意味すると理解しなければならない。
【００１１】
「免疫原」又は「抗原」という用語は、本明細書においては、対象内に導入された場合に免疫系により認識され、そして免疫応答を誘発することができる物質をさす。特定の実施形態においては、免疫応答は防御免疫応答を発生させる。免疫原は微生物（例えば病原体）の表面、又は感染細胞の表面、又は腫瘍細胞の表面上に天然に発現される「表面抗原」を包含する。
【００１２】
本明細書においては、「免疫原カクテル組成物」という用語はイヌ又はブタ又はウシのような治療すべき対象において防御免疫応答を誘導できる２つ以上の免疫原（抗原）を意味する。病原体１つ以上に対抗する免疫原カクテル組成物の防御作用は通常は免疫応答、細胞媒介又は体液性の免疫応答、又は両方の組み合わせ、そして好ましくは防御免疫応答を動物対象において誘導することにより達成される。
【００１３】
「外膜莢膜ポリペプチド免疫原」又は「ＯＭＣ免疫原」という用語は未損傷のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞から単離又は実質的に除去される外膜蛋白の調製品を指す。ＯＭＣ免疫原を製造するための代表的な方法は例えばＹａｎｇ等、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３：２０３７−２０４５（２００２）に記載されている。
【００１４】
「防御免疫」という用語は本明細書においては、対象が免疫原に曝露されている場合に免疫原に対抗して獲得される免疫を指し、これは対象における免疫応答（活性／後天的または、不活性／先天的のいずれか、または両方）であり、病原体の不活性化及び／又は減量をもたらし、免疫学的記憶（例えばメモリーＴ又はＢ細胞）を生じさせる。ワクチンにより与えられる防御免疫は体液性免疫（抗体媒介）又は細胞性免疫又は両方の形態であることができる。例えば、防御免疫はウィルス又は細菌の脱落の低減、感染の発生率又は持続期間の減少、低減した急性期血清蛋白レベル、低減した直腸温度、又は摂食又は成長の増大をもたらす場合がある。
【００１５】
本明細書においては、「ワクチン」とはレシピエントにおいて防御免疫を誘発するために使用できる組成物である。免疫原によりワクチン接種されている対象は、ワクチン接種されていない対象と比べて、免疫原に曝露された対象において疾患又は障害の発症又は重症度を防止、遅延、又は低下させる免疫応答を発生させる。ワクチン接種は例えば、病原体又は感染細胞の数を排除又は減少させる免疫応答を誘導してよく、或いは、何れかの他の臨床的に計測可能な感染軽減をもたらしてよい。
【００１６】
本明細書においては、「アジュバント」とはその最も広範な意味において理解されるべきであり、そして如何なる免疫刺激性の化合物も包含する。特定の好ましい実施形態においては、アジュバントはミョウバン、ポリアリルスクロースと交差結合したアクリル酸の水溶性重合体（例えばＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、又は何れかのこれらの組み合わせである。何れかのアジュバントを１つ以上の追加的アジュバントと共に使用してよい。他の例示されるアジュバントは油脂エマルジョン及び乳化剤系のアジュバント、例えば油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＭＦ５９、又はＳＡＦ；鉱物性のゲル、例えば水酸化アルミニウム（ミョウバン、例えばＡｌ（ＯＨ）３リヒドラゲル、Ｒｅｈｅｉｓ、Ｂｅｒｋｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪより入手可能）、アルミニウム塩（例えばリン酸アルミニウム）又はカルシウム塩（例えばリン酸カルシウム）；微生物から誘導されたアジュバント、例えばコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素、エシェリシア・コリ易熱性毒素（ＬＴ）、突然変異体毒素（例えばＬＴＫ６３又はＬＴＲ７２）、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、マイコバクテリウム、破傷風毒素、コリネバクテリウム・パルブム、ＤＮＡＣｐＧモチーフ、ムラミルジペプチド、又はモノホスホリル脂質Ａ；粒子状アジュバント、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、生体分解性微小球、又はサポニン（例えばＱＳ−２１）；サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２又はＧＭ−ＣＳＦ；合成アジュバント、例えばノニオン系ブロック共重合体又は界面活性剤、ムラミルペプチド類縁体（例えばＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン［ｔｈｒ−ＭＤＰ］、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−［１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ］−エチルアミン）、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、分子量４５０，０００Ｄの部分エステル化ポリアクリル酸（Ｃａｒｂｏｐｏｌ９０７（ＰＡＡ）、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ；米国特許第６，３４０，４６４号及び第６，６１０，３１０号開示）及び表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、炭化水素エマルジョン、又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を包含する。その他のアジュバントはＣＭＣ（カルボキシルメチルセルロース）及びＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を包含する。
【００１７】
本明細書においては、「血清群」及び「血液亜型」という用語は血清学的タイピングデータ、特に顕微鏡凝集反応試験（ＭＡＴ）のような凝集反応試験を用いて得られるデータに基づくＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの分類に関連する。例示されるＭＡＴは本明細書において実施例１に示す。例えば「血清群」及び「血液亜型」とは、自身のメンバーが共有する群の抗原とは交差凝集反応するが、他の群のメンバーとは交差凝集反応せず、そしてその結果、血清群（血液亜型）のメンバーは単純な交差凝集反応により相互で概ね近似した抗原的関連性を有する。更に又、異なる種に属するＬｅｐｔｏｓｐｉｒａは、それらが抗原決定基により区別することが不可能であることから、同じ血液亜型又は血清群に分類されてよい。
【００１８】
「抗体」という用語は本明細書においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａの血液亜型、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、又はウィルスにより生産される表面分子又は表面ポリペプチド又は他の分子のＢ細胞又はＴ細胞エピトープを含むか、それを模倣するか、又はそれと交差反応する分子とも又特異的反応性を有するそれらのフラグメントも包含することを意図している。抗体は従来の手法を用いてフラグメント化できる。例えばＦ（ａｂ’）２フラグメントはペプシンで抗体を処理することにより形成できる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントをジスルフィド架橋が還元されるように処理すれば、Ｆａｂ’フラグメントを形成できる。
【００１９】
「治療有効量」又は「有効量」という用語は免疫原カクテル組成物を投与する対象（例えばイヌ又はブタ又はウシ）において防御免疫応答を誘発するために十分なその量を指す。本明細書に記載する通り、免疫応答は細胞性又は体液性の免疫の誘導をもたらしてよい。治療上有効である多価の免疫原組成物の量は組成物中で使用される特定の抗原、治療される対象の年齢及び状態、又は感染症を有する場合はその程度に応じて変動してよい。
免疫原カクテル組成物
１つの特徴において、本開示は一般的にＬｅｐｔｏｓｐｉｒａから誘導された単離された外膜莢膜（ＯＭＣ）ポリペプチド免疫原又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの不活性化された全又は部分細胞調製品を含む組成物に関する。従って、本開示の１つの実施形態はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓを含む免疫原カクテル組成物に関する。別の実施形態においては、４つのＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの細胞表面免疫原を有する免疫原カクテル組成物は更にＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの免疫原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においてはＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２０】
特定の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はヒト又は家畜又は愛玩動物、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、ラクダ、イヌ又はネコにおいて免疫応答を誘発することができる。好ましい実施形態においては、誘発される免疫応答は防御免疫応答である。
【００２１】
本開示の別の特徴において、有効なカクテル組成物の免疫原成分は更に１つ以上のウィルス免疫原を含んでよい。
【００２２】
ウィルス免疫原は、非感染性及び主に非兆候性とするために継代又は予備処理されている完全な弱毒化ウィルス免疫原であってよい。本明細書に記載した免疫原カクテル組成物を包含する組成物の形成において使用してよい免疫原は生存性の、弱毒化された（例えばＣＤ、ＣＡＶ−２、ＣＰＩ、及びＣＰＶ）、又は殺菌（不活性化）されたビリオン（例えばＣＣＶ）であってよい。次に使用可能な技術を用いてウィルスの弱毒化による一連の継代培養を行うことにより、その免疫原性を保持しつつ有毒性を低下することが推奨される。全又はサブユニットのインフルエンザビリオンは従来の手段、例えば１つ以上の化学的不活性化在、例えば限定しないが、１つ以上のバイナリエチレンイミン、ベータプロピオラクトン、ホルマリン、グルタルアルデヒド、及び／又はドデシル硫酸ナトリウムにより不活性化してよい。ビリオンは又、紫外線の存在下において熱又はソラレンにより不活性化してよい。これらのウィルスの有毒性を有する株を弱毒化する方法及び不活性化されたウィルス調製品を作成する方法は当該分野で知られており、そして例えば米国特許第４，５６７，０４２号及び第４，５６７，０４３号に記載されている。本発明のワクチン組成物における使用のためのこれらの病原体に由来する抗原は修飾された生存性のウィルス調製品又は不活性化されたウィルス調製品の形態であることができる。
【００２３】
１つの実施形態において、本開示の免疫原カクテル組成物はイヌジステンパー（ＣＤ）ウィルス、イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルス及びイヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化された株；イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の不活性化された調製品；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に３つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、５種のウィルス免疫原及び７種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２４】
本開示の別の特徴において、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に３つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、４種のウィルス免疫原及び７種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２５】
本開示の更に別の特徴において、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、及びＣＰＶの弱毒化株；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に３つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、３種のウィルス免疫原及び７種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２６】
本開示の又別の特徴において、免疫原カクテル組成物はＣＰＩウィルスの弱毒化株；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に３つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、１種のウィルス免疫原及び７種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２７】
本開示の特定の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、及びＣＰＩウィルスの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び３種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に２つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、５種のウィルス免疫原及び５種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２８】
本開示の別の実施形態において、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び５種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｐｏｍｏｎａ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態において、５種のウィルス免疫原及び５種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はブタ又はイヌ科、例えばブタ又はイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２９】
本発明のさらに別の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｐｏｍｏｎａ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態において、５種のウィルス免疫原及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００３０】
本発明の別の特徴においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｐｏｍｏｎａ）の細胞表面免疫原を包含する。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はブタ科、例えばブタにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００３１】
本発明の又別の特徴においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び５種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｈａｒｄｊｏ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｐｏｍｏｎａ）の細胞表面免疫原を包含する。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はウシ科、例えばウシにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００３２】
本発明の又別の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及びＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を包含する。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００３３】
本発明は又、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原が組成物から特に除外される上記免疫原カクテル組成物の何れかを包含する。例えば、本発明はイヌジステンパー（ＣＤ）ウィルスの弱毒化株、イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の不活性化又は部分的な細胞調製品及びＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ抗原（例えばＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ外膜莢膜（ＯＭＣ）蛋白）のウィルス免疫原を含む免疫原カクテル組成物を包含し、ここで組成物はＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原を包含しない。
【００３４】
例示される免疫原カクテル組成物は又表１に示す通りである。
【００３５】
【表１−１】
【００３６】
【表１−２】
【００３７】
【表１−３】
【００３８】
【表１−４】
【００３９】
【表１−５】
【００４０】
【表１−６】
【００４１】
【表１−７】
【００４２】
【表１−８】
【００４３】
【表１−９】
【００４４】
【表１−１０】
【００４５】
【表１−１１】
上記表１に示した例示される組み合わせは非限定的であることを意図している。本発明は表１に記載した例示される組み合わせの全てを包含することを意図しており、この場合、「ｘ」を伴った表１に特に示したものの他に、追加的な成分を組成物中に包含してよい。本発明は又「ｘ」を伴って表記されていない成分１つ以上が組成物から特に除外されている表１に記載した例示される組み合わせの全てを包含する。例えば、表１に示す組み合わせ１はＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓに由来する抗原、並びに表に明示しない他の免疫原性の成分を含有する免疫原カクテルを包含することを意味している。更に又、組み合わせ１は又、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓに由来する抗原を含有し、そして組み合わせ１の「ｘ」を付記されていない表１に列挙した免疫原性の成分の１つ以上を特に包含しない免疫原カクテルを指すことも意図している。
【００４６】
上記した例示される免疫原カクテル組成物は特に記載したＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ株から誘導された細胞表面免疫原（例えばＯＭＣ免疫原）の使用を包含するが、本発明は又Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種に由来する不活性化された全又は部分細胞調製品をＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原の代わりに、又はそれに追加して使用する本明細書において言及するカクテル組成物の何れも包含する。即ち、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ株の細胞表面免疫原を使用する本明細書において言及する何れの場合においても、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ株に由来する不活性化された全又は部分細胞調製品を代わりに使用できる。不活性化された全又は部分のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞調製品を作成するための例示される方法は当該分野で知られており、例えばＭａｃｋｉｎｔｏｓｈ等、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｖｅｔ．Ｊ．２８：１７４−１７７（１９８０）；及びＢｏｌｉｎ等、Ａｍ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５０：１６１−１６５（１９８９）に記載されている。
【００４７】
本明細書に記載する教示内容を鑑みれば、追加的な組み合わせは当業者により容易に作成され、そして試験されることができ、そして本発明の範囲内に包含される。
【００４８】
本開示に記載する免疫原カクテル組成物の実施形態の何れも更に１つ以上の薬学的又は獣医学的に許容される担体又は希釈剤を有してよい。他の実施形態において、免疫原カクテル組成物は更に少なくとも１つのアジュバント又は少なくとも１つの保存料又は何れかのこれらの組み合わせを含んでよい。好ましくは、これらの実施形態による免疫原カクテル組成物はワクチン調製品である。特定の実施形態においては、組成物は、ヒト又は動物の対象、好ましくはイヌ、ブタ又はウシに投与された場合に、１つ以上のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型、１つ以上のウィルス免疫原、又はＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの免疫原に対抗する体液性の免疫応答を誘導する。
【００４９】
本発明の更に別の好ましい組み合わせのワクチンはＣＤウィルスの弱毒化株、ＣＡＶ−２の弱毒化株、ＣＰＩウィルスの弱毒化株、ＣＰＶの弱毒化株、及び組み換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を包含する。
製剤及び使用
本明細書に記載する通り、本開示は免疫応答を誘発するためのイヌ、ブタ又はウシのような対象への投与に適する免疫原カクテル組成物を提供する。本開示の免疫原カクテル組成物は更にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、例えばｐ６８又は組み換えｐ６８も包含することができ、そのような組成物は例えばイヌ、ブタ又はウシにおける免疫応答を誘導することができる。本開示の別の実施形態はイヌ病原体により誘発される疾患に対抗してイヌにおける免疫応答を誘導することができる、そのような病原体に由来する抗原２つ以上を含む組成物を包含する。
【００５０】
本開示の免疫原カクテル組成物は更に、例えば１つ以上のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ病原体、１つ以上のウィルス病原体、又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａによる感染の防止において、優れた治療活性を示すことを意図している。好ましくは、多価の免疫原組成物は、動物、例えばヒト又は家畜又は愛玩動物、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、ラクダ、イヌ、ネコ等に投与した場合に防御免疫応答を媒介する場合に有効である。
【００５１】
組成物は好都合な態様、例えば経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻内、皮内又は坐薬経路により、又は移植により（例えば緩徐放出分子を使用）投与してよい。投与経路に応じて、内部に含有される免疫原は、別様には免疫原を不活性化する可能性のある酵素、酸及び他の天然の条件の作用から保護されるために物質内にコーティングされることが必要となる場合がある。非経口投与以外により組成物を投与するためには、その不活性化を防止する物質でコーティングするか、又はそれとともに投与することになる。例えば、免疫原はアジュバントとともに投与するか、酵素阻害剤とともに、又はリポソーム中で同時投与してよい。
【００５２】
本発明の組成物は又非経口又は腹腔内に投与してよい。免疫原成分の分散体もまたグリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、及び油脂中において製造できる。保存及び使用の通常の条件下、これらの調製品は微生物の生育を防止するための保存料、例えばゲンタマイシンを含有してよい。
【００５３】
本明細書においては、「製薬上許容しうる又は獣医学上許容しうる担体及び／又は希釈剤」とは如何なる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等も包含する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は当該分野で良く知られている。補助的活性成分、例えば抗微生物剤も又組成物に配合できる。
【００５４】
担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散体の場合は所要の粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により行うことができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを包含させることが好ましくなる。注射用の組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによりもたらすことができる。
【００５５】
滅菌注射用組成物は、必要に応じて本明細書に列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒の必要量中に本開示の多価の免疫原組成物を配合し、その後、熱滅菌、放射線照射、又は他の適当な滅菌手段を用いることにより製造される。一般的に、分散体は、基剤となる分散媒体及び上記列挙したものに属する必要な他の成分を含有する滅菌ベヒクル内に種々の滅菌活性成分を配合することにより製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌粉末の場合は、製造の好ましい方法は、活性成分及び何れかの追加的な所望の成分の粉末を、それらの予め滅菌濾過された溶液から製造する真空乾燥及び凍結乾燥の手法である。
【００５６】
投与の容易さ及び用量の均一性のために、単位剤型中に非経口組成物を製剤することが特に好都合である。単位剤型とは本明細書においては、治療すべき哺乳類対象に対する単位投薬に適する物理的に個別の単位を指し；各々の単位は、所要の製薬上又は獣医学的に許容しうる担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された活性物質の所定量を含有する。
【００５７】
本開示は本明細書に記載した通り多価の免疫原組成物を投与することにより、細菌又はウィルスの感染に対抗して、イヌ、ブタ、又はウシのような対象を保護する方法を提供する。
【００５８】
別の実施形態においては、開示は、例えばイヌへの投与に適しており、そしてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより誘発された疾患、例えば感染性気管気管支炎（ケンネルコフ）に対抗してイヌを保護することができる、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を更に含有する本明細書に記載する免疫原カクテル組成物を提供する。
【００５９】
本発明によれば、本発明における使用に適するｐ６８抗原はネイティブのｐ６８蛋白（即ちＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａから精製される天然に存在するｐ６８蛋白）及び組み換え製造されたｐ６８蛋白の両方を包含する。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａからのネイティブｐ６８の精製は当該分野で知られている（例えばＭｏｎｔａｒａｚ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７：７４４−７５１，１９８５、及び米国特許公開２００４／０１８５０６２参照）。ｐ６８の組み換え製造は当該分野で知られた分子クローニング及び組み換え発現の手法の何れか１つを用いながら達成できる。例えば、ｐ６８をコードする核酸分子は適切な宿主細胞、例えば細菌、酵母細胞（例えばＰｉｃｈｉａ細胞）、昆虫細胞又は哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）内に導入できる。
【００６０】
好ましくは、免疫原カクテル組成物は約０．１〜５ｍｌの単位投薬容量において、好ましくは約０．５〜約２．５ｍｌの単位投薬容量において、又は更に好ましくは約１ｍｌの単位投薬容量において、注射により投薬されるように製剤される。特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物はよく知られた操作法により滅菌状態としなければならない。
【００６１】
免疫原カクテル組成物中のＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの抗原の量は、免疫応答を誘発する場合に有効である必要があり、そして一般的には用量当たり約０．５〜約１０００μｇの範囲において提供される。好ましくは、ｐ６８抗原の量は用量あたり約１μｇ〜約２６０μｇの範囲である。より好ましくは、ｐ６８抗原の量は用量あたり約１０μｇ〜約１００μｇの範囲である。更により好ましくは、ｐ６８抗原の量は用量あたり約１５〜約２５μｇの範囲である。
【００６２】
開示した免疫原を含む医薬組成物は従来の混合、溶解、顆粒化、ドラジェ製造、混合均質化、乳化、カプセル化、捕獲封入又は凍結乾燥の処理加工により製造してよい。医薬組成物は、活性な抗微生物リポペプチド誘導体を薬学的に使用できる調製品に製剤化することを容易にする１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を用いながら従来の態様において製剤してよい。多価の免疫原組成物は１つ以上の生物学的に活性な物質と組み合わせることができ、そして、製薬上許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤とともに製剤することにより本開示の薬学的又は獣医科用の組成物を作成してよい。
【００６３】
治療用途のための製薬上許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤は医薬品分野で良く知られており、そして本明細書において、そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１８版、１９９０）において、そしてＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ（Ｓ．Ｃ．Ｓｍｏｌｉｎｓｋｉ編、１９９２）において記載される通りである。特定の実施形態においては、免疫原カクテル組成物は、水性の、例えば水又はマンニトールの溶液（例えば約１％〜約２０％）、疎水性（例えば油脂又は脂質）又はこれらの組み合わせ（例えば油脂と水のエマルジョン）中において、製薬上又は獣医学上許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤と共に製剤してよい。特定の実施形態においては、本明細書に記載した医薬組成物の何れかは保存料又は安定化剤（例えば抗生物質）を有するか、又は滅菌状態である。
【００６４】
本開示の医薬組成物はその内部に含有されている免疫原が対象への組成物の投与時に生体利用性となるように製剤できる。投与後の血清及び他の組織中の免疫原のレベルは種々の十分樹立された手法、例えばクロマトグラフィー又は抗体（例えばＥＬＩＳＡ）系の試験によりモニタリングできる。他の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はそれを必要とする対象（例えばグラム陽性細菌感染症を有するもの）、例えば動物又はヒトに対する非経口投与のために製剤される。好ましい投与経路は皮下及び筋肉内の投与を包含する。
【００６５】
適切な製剤は当該分野で知られる通り選択された投与経路に応じたものとなる。例えば、全身投与用の製剤は注射、例えば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内の注射による投与のために設計されたもの、並びに経皮、経粘膜、経口、鼻内、又は肺内の投与のために設計されたものを包含する実施形態である。１つの実施形態において、全身投与用の製剤は滅菌されている。注射用の実施形態においては、本開示の免疫原カクテル組成物は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性のある溶液又は緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、マンニトール溶液又は生理食塩水緩衝液中に製剤してよい。特定の実施形態においては、本明細書に記載した免疫原カクテル組成物の何れも、懸濁化剤、安定化剤又は分散剤のような製剤用試薬を含有してよい。或いは、免疫原カクテル組成物は、使用前に適当なベヒクル（例えば滅菌発熱物質非含有水）で構成するための固体（例えば粉末）形態であってよい。経粘膜投与の実施形態においては、浸透すべき障壁に対して適切である浸透剤、可溶化剤又は柔軟剤を製剤中に使用してよい。例えば、１−ドデシルヘキサヒドロ−２Ｈ−アゼピン−２−オン（Ａｚｏｎｅ（登録商標））、オレイン酸、プロピレングリコール、メントール、ジエチレングリコール、エトキシグリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標））、ポリソルベートポリエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）及び薬剤７−クロロ−１−メチル−５−フェニル−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（ジアゼパム）、イソプロピルミリステート、及び一般的に当該分野で知られた他のこのような浸透剤、可溶化剤又は柔軟剤を本開示の組成物の何れかにおいて使用してよい。投与は経路の組み合わせ、例えば非経口経路を用いた最初の投与及び粘膜経路を用いたその後の投与を用いながら達成することができる。
【００６６】
別の特徴において、本開示は、本明細書に記載した細菌又はウィルスの感染に対抗して対象を保護する方法を提供する。本開示によれば、免疫原カクテル組成物はイヌに対して、少なくとも約４か月、好ましくは少なくとも約６か月、又は更に好ましくは約１年の長期間の免疫を与える。
【００６７】
本発明の免疫原カクテル組成物は少なくとも６週齢、好ましくは少なくとも７週齢、そしてより好ましくは少なくとも８又は９週齢のイヌに投与できる。イヌは１用量、又は１用量より多くの免疫原カクテル組成物を用いてワクチン接種できる。好ましくは２用量の免疫原カクテル組成物を、２投薬の間で約２〜４週間、好ましくは約３週間の間隔を設けながらイヌに投与する。イヌを４か月齢よりも前にワクチン接種する場合は、母系の抗体が４か月齢未満の幼若イヌにおいて十分な免疫応答の発生を妨害する場合があるため、４か月齢に到達した時点で単回用量で再ワクチン接種することが推奨される。イヌは又単回用量で毎年再ワクチン接種できる。繁殖、輸送及び展示の状況のようにＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ曝露が想定される場合は、そのような事例の発生から１年以内、又は好ましくは６か月以内に、追加的なブースター用量を与えてよい。
【００６８】
本開示によれば、免疫原カクテル組成物は一般的に獣医学的に許容される担体を包含する。本明細書に記載した通り、獣医学上許容される担体は如何なる溶媒、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存料、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等も包含する。希釈剤は水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を包含できる。等張剤は塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及び乳糖を特に包含できる。安定化剤は特にアルブミンを包含する。
【００６９】
好ましくは、免疫原カクテル組成物はそれが約０．１〜５ｍｌ、又は好ましくは約０．５〜２．５ｍｌの用量、又は更に好ましくは約１ｍｌの用量において注射によりイヌのような対象に投与できるように製剤される。
【００７０】
免疫原カクテル組成物は、弱毒化ウィルス株の凍結乾燥調製品（又は噴霧乾燥又はデシケーションなどのような他の方法により作成された調製品）及びウィルス調製品を液体調製品で再水和させることにより製造してよく、この場合の液体調製品は滅菌食塩溶液中に溶解され、そしてアジュバント付与されたＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｌ抗原を含む。そのような免疫原カクテル組成物は又、弱毒化ウィルス株の凍結乾燥調製品及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａウィルス調製品（又は噴霧乾燥又はデシケーションなどのような他の方法により作成された調製品）を滅菌溶液で再水和するか、又は凍結乾燥調製品をＣＣＶ＋希釈剤で再水和することにより製造してよい。
【００７１】
本発明によれば、免疫原カクテル組成物は少なくとも６週齢、好ましくは少なくとも７週齢、そしてより好ましくは少なくとも８又は９週齢のイヌに投与できる。複合ワクチンは２〜４用量において、好ましくは２〜３用量において投与できる。用量は各投薬の間２〜６週間、好ましくは各投薬の間２〜４週間で投与できる。
【００７２】
弱毒化ＣＤウィルスは用量当たり約１０２〜約１０９ＴＣＩＤ５０（組織培養物感染用量５０％細胞変性作用）の量、そして好ましくは用量当たり約１０４〜約１０６ＴＣＩＤ５０の範囲でなければならない。弱毒化ＣＡＶ−２は用量当たり少なくとも約１０２ＴＣＩＤ５０〜約１０９ＴＣＩＤ５０の量、好ましくは用量当たり１０４〜約１０６ＴＣＩＤ５０の範囲でなければならない。弱毒化ＣＰＩウィルスは用量当たり少なくとも約１０２ＴＣＩＤ５０〜約１０９ＴＣＩＤ５０の量、好ましくは用量当たり１０６〜約１０８ＴＣＩＤ５０の範囲でなければならない。弱毒化ＣＰＶは用量当たり少なくとも約１０２ＴＣＩＤ５０〜約１０９ＴＣＩＤ５０の量、好ましくは用量当たり１０７〜約１０９ＴＣＩＤ５０の量でなければならない。不活性化ウィルス調製品中のＣＣＶの量は用量当たり少なくとも約１００相対単位、そして好ましくは用量当たり１０００〜４５００相対単位の範囲でなければならない。ワクチン中の各Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種はワクチン用量当たり約１００〜３５００ＮＵ（比濁計単位）の範囲、そして好ましくは用量当たり２００〜２０００ＮＵの範囲でなければならない。特定の実施形態においては、投薬単位は少なくとも約１ｘ１０６ＴＣＩＤ５０、又は少なくとも約１ｘ１０７ＴＣＩＤ５０、又は少なくとも約５ｘ１０７ＴＣＩＤ５０の殺傷又は不活性化された全又はサブユニットのビリオン又はその部分を含む。これらの実施形態の特定の特徴においては、投薬単位は１ｘ１０９ＴＣＩＤ５０以上もの殺傷又は不活性化された全又はサブユニットのビリオン又はその部分を含んでよい。即ち、殺傷又は不活性化された全又はサブユニットのビリオン又はその部分の適当な範囲は約１ｘ１０４ＴＣＩＤ５０及び１ｘ１０９ＴＣＩＤ５０の間である。
【００７３】
別の特徴において、本開示は本明細書に定義する免疫原カクテル組成物を含む部品の医薬品キットを提供する。キットは更にイヌ、ブタ、又はウシの疾患（例えば本明細書に記載する通りレプトスピラ症）の治療における使用のための説明書を含んでよい。免疫原カクテル組成物の活性剤は単位剤型中に同時パッケージしてよい。
【００７４】
以下の非限定的な実施例は本開示の種々の特徴を説明するために提示した。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
複合ワクチン中のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａの免疫原性／薬効
序論
本実施例はＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの免疫原性及びＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａを複合ワクチンに添加した場合の抗原ブロックの欠如を説明するものである。
【００７６】
ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰは弱毒化イヌジステンパーウィルス（ＣＤウィルス）、弱毒化イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）、弱毒化イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）、弱毒化イヌパラインフルエンザウィルス（ＣＰＩウィルス）、及び弱毒化イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）を含有する複合ワクチン製品を指す表記である。Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａから誘導した外膜莢膜（ＯＭＣ）蛋白をＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰに添加することにより、ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢと表記される新しい複合品を製造した。
【００７７】
本実施例に示す通り、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａＯＭＣ蛋白はＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰと混合した場合、有毒性Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃に対抗した幼若イヌにおける防御免疫の誘導において有効であった。
材料及び方法
動物の選択
被験動物
６週齢〜６週６日齢の合計３４匹のビーグル犬（２２匹にワクチン接種、１２匹は対照）を本試験において使用した。全幼若イヌをＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、混合ワクチンの画分に対して陰性であることを確認した。齢の範囲に基づいて、３４匹の幼若イヌをワクチン化のための２バッチに分割した。各バッチの幼若イヌをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｅｌの乱数発生機能を用いてワクチン接種及び対照群に無作為に割りつけた。全てのワクチン接種は２１日の間隔をおいて２回ワクチン接種した。全幼若イヌが同時に攻撃されるようにするため、最初のバッチの幼若イヌは２回目ワクチン接種後（ＤＰＶ２）２８日に攻撃し、そして第２のバッチの幼若イヌは２１ＤＰＶ２に攻撃した。
動物の収容及び飼育
全動物を試験終了時までケージに収容した。収容場所の空間は動物保護の該当規則に準拠した。
被験ワクチン
ワクチンの組成
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａＯＭＣ蛋白をＣｖＫ／ＬＣＩＧＰと表記される複合品（イヌコロナウィルス（不活性化）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｐｏｍｏｎａを含有）に添加することによりＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢと表記される新しい複合品を製造した。イヌジステンパーウィルス、イヌアデノウィルス２型、イヌパラインフルエンザウィルス及びイヌパルボウィルスを含有するＤＡ２ＰＰをＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢと複合化することによりＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢと表記される新しい複合パッケージ品を製造した。最終複合品中のＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａＯＭＣ蛋白の濃度は５０μｇ／１ｍｌ用量であった。
保存
ワクチンは２℃〜７℃で保存した。
実験設計
各同腹仔に属する幼若イヌを同腹仔に従ってＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｅｌの乱数発生機能を用いて以下の表２に示す通り無作為に２つの群に割りつけた。
【００７８】
【表２】
ワクチン接種
被験群の各動物に２用量（１ｍＬ／用量）の割り付けワクチンを３週間の間隔をあけて首の反対側に皮下投与した。
【００７９】
コード化されたワクチン及び試料を用いることにより試験の盲検性を確保した。
実験攻撃
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃株はＢ２６Ｐ２（入手元：Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ、ＩＡ）とした。十分な量及び良好な生存性を得るために、攻撃生物をＴ−８０培地（Ｓｕｌｚｅｒ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ，Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．（ＣＤＣ）７６−８２７５，ｐｐ．１２−１５，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）中において２８（±２）℃において培養した。攻撃直前に運動性の生物を計数し、そして生物数を攻撃のための用量当たり１ｘ１０１０生物に調節した。被験群及び対照群の幼若イヌを有毒性を有するＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａで腹腔内（ＩＰ）経路により攻撃した。攻撃物質の容量は２．０ｍＬ攻撃用量に調節した。
観察及び試料収集
攻撃前観察
健康状態を確認するために攻撃前の３連続日に直腸温度及び臨床兆候をモニタリングして記録した。
攻撃後観察
攻撃後、動物の直腸温度を毎日モニタリングし、そして２週間に渡りＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａに関連する如何なる可能性のある臨床兆候も観察し、結果を記録した。
【００８０】
試験終了時に幼若イヌを安楽死させ、そしてＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ感染に関連する潜在的な巨視的患部があるかどうか肝臓及び腎臓を検査した。
血液学的プロファイル
攻撃の後、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎｅ（血球計）が使用不能であった１３及び１４ＤＰＣを除き、１５ＤＰＣまで総白血球数をモニタリングするために各幼若イヌから毎日、抗凝固処理された血液試料（２ｍＬ）を収集した。
【００８１】
血小板及び白血球分画をＡｂｂｏｔｔのＣｅｌｌ−Ｄｙｎｅ血球計又は自動化細胞計数器を用いて計数した。
血液試料からのＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの単離
血液試料を用いてＴ−８０半固体Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ生育培地に接種した。接種試験管は４週間の期間、２８（±２）℃でインキュベートした。陰性の培養物は全て新しい培地中に継代し、陰性として廃棄する前に更に２週間の追加的期間、インキュベートした。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａの存在に関して暗視野顕微鏡を用いながら毎週全ての培養物を検査し、結果を記録した。
微小凝集反応試験（ＭＡＴ）
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ全細胞抗原に対する血清凝集抗体を微小凝集反応試験を用いて計測した。簡潔には、血清の２倍連続希釈物を平底マイクロタイタープレート中に調製した。各希釈血清に、等容量（０．０５ｍＬ）の生Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｏｐｈｙｓａ、またはＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ｐｏｍｏｎａ懸濁液（比濁計読み取り値２０と等しい）を添加した。適切な対照を各プレートに包含させた。プレートを３０秒間振とうし、そして２時間室温でインキュベートした後に結果を記録した。各血清の力価は少なくとも５０％凝集をもたらした血清の最高希釈度の逆数として定義した。
データ分析
実験単位は個体別の動物とした。一次的帰結はスピロヘータ血症及び抗体力価とした。各群の動物のスピロヘータ血症のパーセント及び抗体力価を計算した。
結果及び考察
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ抗原レベル
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ外膜莢膜（ＯＭＣ）蛋白の用量当たり５０マイクログラム（５０μｇ）を免疫原ワクチン中に負荷した。
血清学的応答
個体別の幼若イヌの抗体力価を記録し、そして分析した。０ＤＰＶ１において、全幼若イヌは陰性であり、抗体力価は２未満であった。１匹のワクチン接種幼若イヌを除き、全ての他のワクチン接種は、０ＤＰＶ２までにＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａに対してセロポジティブとなり、幾何平均の力価（ＧＭＴ）は１７であった。他のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型と同様、ＧＭＴは７ＤＰＶ２には７４１まで上昇し、これは２回のワクチン接種後の最高値であり、そしてその後は徐々に低下し、１４及び２１ＤＰＶ２にはそれぞれ４０５及び２２２となった。抗体力価は対照及びワクチン接種群の両方において７ＤＰＣでは実質的に上昇していた。これらの結果はワクチン接種群における強力なブースト作用及び対照の免疫応答を示している。１２対照全てが攻撃日である２１ＤＰＶ２まで陰性のままであった。これらのデータは複合品ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢにおけるＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ画分がインビボで血清学的な免疫応答を誘導する場合に高度に免疫原性であることを示していた。
臨床観察
直腸温度、臨床兆候、白血球数及び血小板数を全幼若イヌについて試験した。１匹の幼若イヌでは一日において眼部の分泌物を観察した。別の幼若イヌは一日において抑鬱／傾眠を示していた。２匹の別の幼若イヌは一日の下痢を示し、そして１匹の幼若イヌが一日の結膜炎を有していた。他の幼若イヌは有毒性攻撃後に臨床上は正常であった。何れの幼若イヌも試験中に直腸温度、白血球数、又は血小板数の上昇又は低下を示さなかった。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、ｐｏｍｏｎａ及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ等の他のイヌのレプトスピラ症と同様、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ単独ではスピロヘータ血症により顕在化される特異的病原体非含有のイヌにおける最小限の臨床的疾患を誘発する。しかしながらこれを他の病原体、ストレス、免疫無防備状態、及び／又は不良な野外環境と複合化された場合、より長く認識されているイヌのレプトスピラ症の血液亜型による場合と同様、イヌの健康に対してより顕著な、又はむしろ致命的な影響さえ誘発する可能性がある。試験終了時において、腎臓及び肝臓において観察された肉視的患部は無かった。
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの単離
有毒性Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃後のスピロヘータ血症はＴ８０培地中の全血培養により計測した。１匹の幼若イヌを除き、全ての対照幼若イヌ（１２幼若イヌ中１１匹、又は対照幼若イヌの９２％）がＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａに関して陽性であった。これとは対照的に、ワクチン接種群の幼若イヌは１匹のみが陽性であり、スピロヘータ血症を有していた。換言すればワクチン接種群の約９５％（幼若イヌ２２匹中２１匹）が有毒性Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃後スピロヘータ血症を有することなく存続していた。これらのデータは、ワクチンが防御免疫の誘導及び攻撃後の有毒性Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの複製からの幼若イヌの保護において免疫学的に強力であることを示している。結果は明らかにＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ外膜抗原が他の画分と混合された場合に有効であることを示している。
結論
最近の報告によれば、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ曝露に関して調査したイヌにおける抗体陽性試験結果の優勢性が上昇している。症例試験によれば更に野外におけるイヌのＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａと腎臓及び肝臓の疾患との間の関連性が裏付けられている。腎臓及び肝臓の疾患に伝統的に関連付けられている大部分のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの血液亜型について、保護のための重要な点はスピロヘータ血症の防止であった。本試験は、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａのワクチン接種がイヌの健康状態に対して同様の利益をもたらすことを期待できることを明らかにした。
【００８２】
本試験の結果は、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの外膜蛋白は、ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰの画分と混合した場合（これによりＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢを形成）に、６週齢の幼若イヌにおいて強力な薬効を有することを明らかにしている。最低抗原負荷量（５０μｇ／用量）は有毒性のＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃によるスピロヘータ血症からのワクチン接種群の保護を誘導するために十分であった。ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢ複合品におけるＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの薬効はワクチン接種群で１００％及び対照群で皆無であった血清変換、及びワクチン接種群の９５％及び対照群の僅か８％における有毒性攻撃後のスピロヘータ血症の非存在により明らかにされた。対照群と比較した場合のワクチン接種群における血清変換と組み合わせた場合の血液スピロヘータ血症の低減は、他の９画分、即ち殺傷された、又は修飾され生存している抗原の両方とも、ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢにおけるＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの殺傷バクテリンの薬効を妨害しなかったことを示している。
（実施例２）
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓを含むワクチン
本実施例においては、複合ワクチンを製造するために、先ず当該分野で使用可能な標準的な方法を用いながらＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの各々から単離された外膜莢膜（ＯＭＣ）ポリペプチドを得る。次に、１ｍｌ用量当たり各ＯＭＣポリペプチド調製品約５０μｇの最終濃度において獣医学的に許容される希釈剤の存在下、ＯＭＣポリペプチドを混合する。
【００８３】
実験群における４０匹のビーグル幼若イヌに第０日及び第２１日に腹腔内経路により複合ワクチン２用量を投与し、対照群における４０匹のビーグル幼若イヌには同じ時点において希釈剤のみを投与する。
【００８４】
第２のワクチン接種の２１日後、実験群及び対照群の両方の幼若イヌを各々１０匹の４つのサブグループに分割する。サブグループはＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと表記する。各サブグループの幼若イヌを以下の表に示す通りＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの有毒性株で攻撃する。
【００８５】
【表３】
攻撃後、両方の群の幼若イヌの直腸温度及びＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの何れかによる感染に関連する可能性のある臨床兆候を毎日モニタリングする。更に又、攻撃後２１日間両方の群の各幼若イヌから毎日血液試料を収集する。血液試料は細菌細胞（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）に関して、そしてＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの全細胞抗原に対する血清凝集抗体に関してミクロ凝集試験を用いながら試験した。
【００８６】
本実施例による有効な複合ワクチンは以下の作用、即ち：（ａ）二回目ワクチン接種後０〜２１日（攻撃前）において少なくとも１０〜５００の抗体力価を有するＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの少なくとも１つに対する抗体の存在；（ｂ）複合ワクチンを投与されていない対照幼若イヌにおいて観察された臨床症状と比較した場合に対応する有毒性株で攻撃した後のＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ感染のより低値の臨床症状；及び／又は（ｃ）対照幼若イヌの血液から単離された生存細胞の量と比較した場合の攻撃幼若イヌの血液に由来するＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの生細胞の低減した単離の１つ以上をもたらすことになる。
参考文献
【００８７】
【化１】
上記した本発明は理解を明確化する目的のために解説及び例示により幾分詳細に説明してきたが、本発明は開示した特定の実施形態に限定されるのではなく、添付する請求項により定義されるとおり本発明の精神及び範囲内に包含される全ての変更及び改変を含むことを意図している。
【００８８】
本明細書において言及した全ての公開物及び特許は本発明が関係する技術分野における当業者の技術レベルを示すものである。全ての公開物及び特許は、各々個々の公開物又は特許が参考により組み込まれることを特定的及び個別的に示す場合と同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物におけるウィルス及び細菌の感染症に対抗する治療又は保護を与える組成物及び方法に関する。より特定すれば、本発明はイヌジステンパーウィルス、イヌアデノウィルス（１型又は２型）、イヌパラインフルエンザウィルス、イヌパルボウィルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ、及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの１つ以上により誘発される、又はそれに関連する、イヌにおける疾患又は障害を治療又は防止するための多価ワクチン組成物に関する。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ組成物は又、イヌ、ブタ、及びウシにおける疾患又は障害を治療又は防止するために使用できる。
【背景技術】
【０００２】
レプトスピラ症は動物及びヒトの両方が罹患する感染性の疾患である。感染症はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａと称される細菌病原体により誘発される。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属の細菌はスピロヘータ属であり、これは病原性であり、そして幾つかの既知の種及び多数の血液亜型を包含する場合がある。例示される病原性の種にはＬ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌ．ｉｎａｄａｉ、Ｌ．ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ、Ｌ．ｓａｎｔａｒｏｓａｉ、Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ、Ｌ ｗｅｉｌｉｉまたはＬ．ｎｏｇｕｃｈｉｉが包含される。病原性のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型は多数種の家畜動物、愛玩動物、野生動物、及びヒトにおいて天然に存在する。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型の宿主の範囲は一般的に極めて広範であるが、感染した宿主に応じて異なる症状が生じる。例えばイヌにおけるレプトスピラ症は慢性の肝臓及び腎臓の疾患、及び死亡をもたらす場合がある。
【０００３】
レプトスピラ疾患の経過及び重症度は感染の原因である血液亜型に依存する場合が多い。肝臓の感染症及び尿の変色及び／又は黄疸、上昇した肝酵素値、及び胃腸症状に関連する血液亜型はＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａを包含する。血液亜型Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａは血液亜型Ｌ．ｐｏｍｏｎａと同様、腎不全の症状を伴っている。１９８０年代もの近年において、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬ．ｃａｎｉｃｏｌａはイヌにおいてレプトスピラ症を誘発する最も蔓延した血液亜型として発見された。しかしながら１９９０年代までに、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ及びＬ．ｐｏｍｏｎａの上昇した発生率がレプトスピラ症の復活と組み合わさって観察され、この疾患の疫学的特徴の変化しやすい傾向を示唆していた。幾つかの追加的な病原性のレプトスピラ血液亜型が医学的に関連するものとして出現しつつあり、例えばＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓが挙げられる。
【０００４】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａの血液亜型はそれらの表面上の抗原の型（即ち抗体生産を誘発する細胞表面マーカー）に基づいて分類されるが、これらの細胞表面抗原は血液亜型間の交差免疫性を殆ど呈さない。即ち、特定の血液亜型に対抗したワクチン接種は他の血液亜型に対抗する保護をもたらさない。更に又、幾つかの血液亜型に由来する抗原又は他の生物（又はウィルス）に由来する抗原を複合化したワクチンは抗原干渉をもたらす場合があり、即ち、組成物中の他の抗原により誘発された作用の「マスキング」のために、複合化抗原の１つ以上が免疫応答を誘発できなくなる。
【０００５】
従って、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ感染により誘発される、又はそれに関連する疾患又は障害を治療及び防止するための効果的な組成物及び方法の開発が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの不活性化された全又は部分細胞調製品を含む免疫原カクテル組成物を提供する。特定の実施形態においては、本発明のカクテル組成物はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及び／又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓから誘導された外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）１つ以上を含む。本発明は又、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの不活性化された全又は部分細胞調製品を含み、更にイヌジステンパー（ＣＤ）ウィルス、イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、及びイヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の不活性化株よりなる群から選択されるウィルス免疫原１つ以上を含む、免疫原カクテル組成物を提供する。本発明の免疫原カクテル組成物は、特定の実施形態においては又、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原又はＬ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｐｏｍｏｎａ、及びＬ．ｈａｒｄｊｏよりなる群から選択されるＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ株１つ以上から誘導された不活性化された全又は部分細胞調製品を含んでよい。特定の実施形態においては、本発明の免疫原カクテル組成物は、少なくとも１つのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの免疫原、例えばｐ６８Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ表面蛋白を包含してよい。
【０００７】
これら及び他の本開示の実施形態、特徴、及び利点は後述する詳細な説明及び添付請求項から明らかにされる。出願全体に渡って引用される全ての論文及び特許参照文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（詳細な説明）
本開示は細菌の感染又は細菌及びウィルス感染の両方を治療又は防止するための種々の多価の免疫原組成物を提供する。従って本開示は一般的には、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａの細胞表面免疫原の異なる組み合わせを複合化することにより抗原性の干渉をもたらさない免疫原カクテル組成物を作成できるという意外な発見に基づいている。即ち、カクテル組成物の各々個々の免疫原は免疫応答、特に防御免疫応答を誘発することができ、この活性は他の抗原の存在により影響されない。より特定すれば、免疫原カクテル組成物の１つの実施形態は、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓのＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を含む。更に又、これらのＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ免疫原は他のウィルス抗原、例えばイヌジステンパー（ＣＤ）ウィルス抗原、イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）抗原、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルス抗原、イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）抗原、イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）抗原、及びこれらの何れかの組み合わせと複合化された場合に免疫原性となる。更に又、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ由来の抗原、例えばｐ６８（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ表面蛋白）もまた免疫原カクテル組成物に添加することができる。これらの免疫原カクテル組成物はまた種々のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ感染及び種々のウィルス感染を治療又は緩解又は防止するためのワクチンとして使用できる。以下により詳細に考察するものは本発明の開示内における使用に適する多価免疫原組成物、並びに代表的な治療用又は獣医科用の用途である。
【０００９】
より詳細な開示を記載する前に、以後使用されることになる特定の用語の定義を説明することがその理解を容易にするために有益であると考えられる。
【００１０】
本明細書に記載する通り、何れかの濃度の範囲、パーセントの範囲、比の範囲又は整数の範囲は、特段の記載が無い限り、記載した範囲内の何れかの整数の値、及び、適宜、その分数（例えばある整数の１０分の１及び１００分の１）を包含するものと理解しなければならない。本明細書においては、「約」又は「本質的に含む」とは、特段の記載が無い限り、記載した値又は範囲の平均±１５％を意味する。代替物表記の使用（例えば「又は」）は何れか１つ、両方、又は表記代替物の何れかの組み合わせを意味すると理解しなければならない。
【００１１】
「免疫原」又は「抗原」という用語は、本明細書においては、対象内に導入された場合に免疫系により認識され、そして免疫応答を誘発することができる物質をさす。特定の実施形態においては、免疫応答は防御免疫応答を発生させる。免疫原は微生物（例えば病原体）の表面、又は感染細胞の表面、又は腫瘍細胞の表面上に天然に発現される「表面抗原」を包含する。
【００１２】
本明細書においては、「免疫原カクテル組成物」という用語はイヌ又はブタ又はウシのような治療すべき対象において防御免疫応答を誘導できる２つ以上の免疫原（抗原）を意味する。病原体１つ以上に対抗する免疫原カクテル組成物の防御作用は通常は免疫応答、細胞媒介又は体液性の免疫応答、又は両方の組み合わせ、そして好ましくは防御免疫応答を動物対象において誘導することにより達成される。
【００１３】
「外膜莢膜ポリペプチド免疫原」又は「ＯＭＣ免疫原」という用語は未損傷のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞から単離又は実質的に除去される外膜蛋白の調製品を指す。ＯＭＣ免疫原を製造するための代表的な方法は例えばＹａｎｇ等、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３：２０３７−２０４５（２００２）に記載されている。
【００１４】
「防御免疫」という用語は本明細書においては、対象が免疫原に曝露されている場合に免疫原に対抗して獲得される免疫を指し、これは対象における免疫応答（活性／後天的または、不活性／先天的のいずれか、または両方）であり、病原体の不活性化及び／又は減量をもたらし、免疫学的記憶（例えばメモリーＴ又はＢ細胞）を生じさせる。ワクチンにより与えられる防御免疫は体液性免疫（抗体媒介）又は細胞性免疫又は両方の形態であることができる。例えば、防御免疫はウィルス又は細菌の脱落の低減、感染の発生率又は持続期間の減少、低減した急性期血清蛋白レベル、低減した直腸温度、又は摂食又は成長の増大をもたらす場合がある。
【００１５】
本明細書においては、「ワクチン」とはレシピエントにおいて防御免疫を誘発するために使用できる組成物である。免疫原によりワクチン接種されている対象は、ワクチン接種されていない対象と比べて、免疫原に曝露された対象において疾患又は障害の発症又は重症度を防止、遅延、又は低下させる免疫応答を発生させる。ワクチン接種は例えば、病原体又は感染細胞の数を排除又は減少させる免疫応答を誘導してよく、或いは、何れかの他の臨床的に計測可能な感染軽減をもたらしてよい。
【００１６】
本明細書においては、「アジュバント」とはその最も広範な意味において理解されるべきであり、そして如何なる免疫刺激性の化合物も包含する。特定の好ましい実施形態においては、アジュバントはミョウバン、ポリアリルスクロースと交差結合したアクリル酸の水溶性重合体（例えばＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、又は何れかのこれらの組み合わせである。何れかのアジュバントを１つ以上の追加的アジュバントと共に使用してよい。他の例示されるアジュバントは油脂エマルジョン及び乳化剤系のアジュバント、例えば油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＭＦ５９、又はＳＡＦ；鉱物性のゲル、例えば水酸化アルミニウム（ミョウバン、例えばＡｌ（ＯＨ）３リヒドラゲル、Ｒｅｈｅｉｓ、Ｂｅｒｋｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪより入手可能）、アルミニウム塩（例えばリン酸アルミニウム）又はカルシウム塩（例えばリン酸カルシウム）；微生物から誘導されたアジュバント、例えばコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素、エシェリシア・コリ易熱性毒素（ＬＴ）、突然変異体毒素（例えばＬＴＫ６３又はＬＴＲ７２）、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、マイコバクテリウム、破傷風毒素、コリネバクテリウム・パルブム、ＤＮＡＣｐＧモチーフ、ムラミルジペプチド、又はモノホスホリル脂質Ａ；粒子状アジュバント、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、生体分解性微小球、又はサポニン（例えばＱＳ−２１）；サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２又はＧＭ−ＣＳＦ；合成アジュバント、例えばノニオン系ブロック共重合体又は界面活性剤、ムラミルペプチド類縁体（例えばＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン［ｔｈｒ−ＭＤＰ］、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−［１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ］−エチルアミン）、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、分子量４５０，０００Ｄの部分エステル化ポリアクリル酸（Ｃａｒｂｏｐｏｌ９０７（ＰＡＡ）、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ；米国特許第６，３４０，４６４号及び第６，６１０，３１０号開示）及び表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、炭化水素エマルジョン、又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を包含する。その他のアジュバントはＣＭＣ（カルボキシルメチルセルロース）及びＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を包含する。
【００１７】
本明細書においては、「血清群」及び「血液亜型」という用語は血清学的タイピングデータ、特に顕微鏡凝集反応試験（ＭＡＴ）のような凝集反応試験を用いて得られるデータに基づくＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの分類に関連する。例示されるＭＡＴは本明細書において実施例１に示す。例えば「血清群」及び「血液亜型」とは、自身のメンバーが共有する群の抗原とは交差凝集反応するが、他の群のメンバーとは交差凝集反応せず、そしてその結果、血清群（血液亜型）のメンバーは単純な交差凝集反応により相互で概ね近似した抗原的関連性を有する。更に又、異なる種に属するＬｅｐｔｏｓｐｉｒａは、それらが抗原決定基により区別することが不可能であることから、同じ血液亜型又は血清群に分類されてよい。
【００１８】
「抗体」という用語は本明細書においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａの血液亜型、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、又はウィルスにより生産される表面分子又は表面ポリペプチド又は他の分子のＢ細胞又はＴ細胞エピトープを含むか、それを模倣するか、又はそれと交差反応する分子とも又特異的反応性を有するそれらのフラグメントも包含することを意図している。抗体は従来の手法を用いてフラグメント化できる。例えばＦ（ａｂ’）２フラグメントはペプシンで抗体を処理することにより形成できる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントをジスルフィド架橋が還元されるように処理すれば、Ｆａｂ’フラグメントを形成できる。
【００１９】
「治療有効量」又は「有効量」という用語は免疫原カクテル組成物を投与する対象（例えばイヌ又はブタ又はウシ）において防御免疫応答を誘発するために十分なその量を指す。本明細書に記載する通り、免疫応答は細胞性又は体液性の免疫の誘導をもたらしてよい。治療上有効である多価の免疫原組成物の量は組成物中で使用される特定の抗原、治療される対象の年齢及び状態、又は感染症を有する場合はその程度に応じて変動してよい。
免疫原カクテル組成物
１つの特徴において、本開示は一般的にＬｅｐｔｏｓｐｉｒａから誘導された単離された外膜莢膜（ＯＭＣ）ポリペプチド免疫原又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの不活性化された全又は部分細胞調製品を含む組成物に関する。従って、本開示の１つの実施形態はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓを含む免疫原カクテル組成物に関する。別の実施形態においては、４つのＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの細胞表面免疫原を有する免疫原カクテル組成物は更にＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの免疫原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においてはＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２０】
特定の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はヒト又は家畜又は愛玩動物、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、ラクダ、イヌ又はネコにおいて免疫応答を誘発することができる。好ましい実施形態においては、誘発される免疫応答は防御免疫応答である。
【００２１】
本開示の別の特徴において、有効なカクテル組成物の免疫原成分は更に１つ以上のウィルス免疫原を含んでよい。
【００２２】
ウィルス免疫原は、非感染性及び主に非兆候性とするために継代又は予備処理されている完全な弱毒化ウィルス免疫原であってよい。本明細書に記載した免疫原カクテル組成物を包含する組成物の形成において使用してよい免疫原は生存性の、弱毒化された（例えばＣＤ、ＣＡＶ−２、ＣＰＩ、及びＣＰＶ）、又は殺菌（不活性化）されたビリオン（例えばＣＣＶ）であってよい。次に使用可能な技術を用いてウィルスの弱毒化による一連の継代培養を行うことにより、その免疫原性を保持しつつ有毒性を低下することが推奨される。全又はサブユニットのインフルエンザビリオンは従来の手段、例えば１つ以上の化学的不活性化在、例えば限定しないが、１つ以上のバイナリエチレンイミン、ベータプロピオラクトン、ホルマリン、グルタルアルデヒド、及び／又はドデシル硫酸ナトリウムにより不活性化してよい。ビリオンは又、紫外線の存在下において熱又はソラレンにより不活性化してよい。これらのウィルスの有毒性を有する株を弱毒化する方法及び不活性化されたウィルス調製品を作成する方法は当該分野で知られており、そして例えば米国特許第４，５６７，０４２号及び第４，５６７，０４３号に記載されている。本発明のワクチン組成物における使用のためのこれらの病原体に由来する抗原は修飾された生存性のウィルス調製品又は不活性化されたウィルス調製品の形態であることができる。
【００２３】
１つの実施形態において、本開示の免疫原カクテル組成物はイヌジステンパー（ＣＤ）ウィルス、イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルス及びイヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化された株；イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の不活性化された調製品；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に３つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、５種のウィルス免疫原及び７種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２４】
本開示の別の特徴において、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に３つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、４種のウィルス免疫原及び７種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２５】
本開示の更に別の特徴において、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、及びＣＰＶの弱毒化株；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に３つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、３種のウィルス免疫原及び７種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２６】
本開示の又別の特徴において、免疫原カクテル組成物はＣＰＩウィルスの弱毒化株；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に３つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、１種のウィルス免疫原及び７種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２７】
本開示の特定の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、及びＣＰＩウィルスの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び３種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態においては、この免疫原カクテル組成物は更に２つの別のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。又別の実施形態において、５種のウィルス免疫原及び５種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２８】
本開示の別の実施形態において、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び５種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｐｏｍｏｎａ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態において、５種のウィルス免疫原及び５種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はブタ又はイヌ科、例えばブタ又はイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００２９】
本発明のさらに別の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｐｏｍｏｎａ）の細胞表面免疫原を包含する。別の実施形態において、５種のウィルス免疫原及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原を有するこの免疫原カクテル組成物は更に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を含む。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００３０】
本発明の別の特徴においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び４種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｐｏｍｏｎａ）の細胞表面免疫原を包含する。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はブタ科、例えばブタにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００３１】
本発明の又別の特徴においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及び５種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｈａｒｄｊｏ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｐｏｍｏｎａ）の細胞表面免疫原を包含する。特定の好ましい実施形態においては、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原はＯＭＣ免疫原である。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はウシ科、例えばウシにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００３２】
本発明の又別の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はＣＤウィルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウィルス、及びＣＰＶの弱毒化株；ＣＣＶの不活性化調製品；及びＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、好ましくはｐ６８抗原を包含する。他の好ましい実施形態においては、免疫原カクテル組成物はイヌ科、例えばイヌにおける免疫応答、そしてより好ましくは防御免疫応答を誘発することができる。
【００３３】
本発明は又、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原が組成物から特に除外される上記免疫原カクテル組成物の何れかを包含する。例えば、本発明はイヌジステンパー（ＣＤ）ウィルスの弱毒化株、イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の不活性化又は部分的な細胞調製品及びＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ抗原（例えばＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ外膜莢膜（ＯＭＣ）蛋白）のウィルス免疫原を含む免疫原カクテル組成物を包含し、ここで組成物はＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原を包含しない。
【００３４】
例示される免疫原カクテル組成物は又表１に示す通りである。
【００３５】
【表１−１】
【００３６】
【表１−２】
【００３７】
【表１−３】
【００３８】
【表１−４】
【００３９】
【表１−５】
【００４０】
【表１−６】
【００４１】
【表１−７】
【００４２】
【表１−８】
【００４３】
【表１−９】
【００４４】
【表１−１０】
【００４５】
【表１−１１】
上記表１に示した例示される組み合わせは非限定的であることを意図している。本発明は表１に記載した例示される組み合わせの全てを包含することを意図しており、この場合、「ｘ」を伴った表１に特に示したものの他に、追加的な成分を組成物中に包含してよい。本発明は又「ｘ」を伴って表記されていない成分１つ以上が組成物から特に除外されている表１に記載した例示される組み合わせの全てを包含する。例えば、表１に示す組み合わせ１はＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓに由来する抗原、並びに表に明示しない他の免疫原性の成分を含有する免疫原カクテルを包含することを意味している。更に又、組み合わせ１は又、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓに由来する抗原を含有し、そして組み合わせ１の「ｘ」を付記されていない表１に列挙した免疫原性の成分の１つ以上を特に包含しない免疫原カクテルを指すことも意図している。
【００４６】
上記した例示される免疫原カクテル組成物は特に記載したＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ株から誘導された細胞表面免疫原（例えばＯＭＣ免疫原）の使用を包含するが、本発明は又Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種に由来する不活性化された全又は部分細胞調製品をＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原の代わりに、又はそれに追加して使用する本明細書において言及するカクテル組成物の何れも包含する。即ち、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ株の細胞表面免疫原を使用する本明細書において言及する何れの場合においても、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ株に由来する不活性化された全又は部分細胞調製品を代わりに使用できる。不活性化された全又は部分のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞調製品を作成するための例示される方法は当該分野で知られており、例えばＭａｃｋｉｎｔｏｓｈ等、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｖｅｔ．Ｊ．２８：１７４−１７７（１９８０）；及びＢｏｌｉｎ等、Ａｍ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５０：１６１−１６５（１９８９）に記載されている。
【００４７】
本明細書に記載する教示内容を鑑みれば、追加的な組み合わせは当業者により容易に作成され、そして試験されることができ、そして本発明の範囲内に包含される。
【００４８】
本開示に記載する免疫原カクテル組成物の実施形態の何れも更に１つ以上の薬学的又は獣医学的に許容される担体又は希釈剤を有してよい。他の実施形態において、免疫原カクテル組成物は更に少なくとも１つのアジュバント又は少なくとも１つの保存料又は何れかのこれらの組み合わせを含んでよい。好ましくは、これらの実施形態による免疫原カクテル組成物はワクチン調製品である。特定の実施形態においては、組成物は、ヒト又は動物の対象、好ましくはイヌ、ブタ又はウシに投与された場合に、１つ以上のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型、１つ以上のウィルス免疫原、又はＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの免疫原に対抗する体液性の免疫応答を誘導する。
【００４９】
本発明の更に別の好ましい組み合わせのワクチンはＣＤウィルスの弱毒化株、ＣＡＶ−２の弱毒化株、ＣＰＩウィルスの弱毒化株、ＣＰＶの弱毒化株、及び組み換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を包含する。
製剤及び使用
本明細書に記載する通り、本開示は免疫応答を誘発するためのイヌ、ブタ又はウシのような対象への投与に適する免疫原カクテル組成物を提供する。本開示の免疫原カクテル組成物は更にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、例えばｐ６８又は組み換えｐ６８も包含することができ、そのような組成物は例えばイヌ、ブタ又はウシにおける免疫応答を誘導することができる。本開示の別の実施形態はイヌ病原体により誘発される疾患に対抗してイヌにおける免疫応答を誘導することができる、そのような病原体に由来する抗原２つ以上を含む組成物を包含する。
【００５０】
本開示の免疫原カクテル組成物は更に、例えば１つ以上のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ病原体、１つ以上のウィルス病原体、又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａによる感染の防止において、優れた治療活性を示すことを意図している。好ましくは、多価の免疫原組成物は、動物、例えばヒト又は家畜又は愛玩動物、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、ラクダ、イヌ、ネコ等に投与した場合に防御免疫応答を媒介する場合に有効である。
【００５１】
組成物は好都合な態様、例えば経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻内、皮内又は坐薬経路により、又は移植により（例えば緩徐放出分子を使用）投与してよい。投与経路に応じて、内部に含有される免疫原は、別様には免疫原を不活性化する可能性のある酵素、酸及び他の天然の条件の作用から保護されるために物質内にコーティングされることが必要となる場合がある。非経口投与以外により組成物を投与するためには、その不活性化を防止する物質でコーティングするか、又はそれとともに投与することになる。例えば、免疫原はアジュバントとともに投与するか、酵素阻害剤とともに、又はリポソーム中で同時投与してよい。
【００５２】
本発明の組成物は又非経口又は腹腔内に投与してよい。免疫原成分の分散体もまたグリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、及び油脂中において製造できる。保存及び使用の通常の条件下、これらの調製品は微生物の生育を防止するための保存料、例えばゲンタマイシンを含有してよい。
【００５３】
本明細書においては、「製薬上許容しうる又は獣医学上許容しうる担体及び／又は希釈剤」とは如何なる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等も包含する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は当該分野で良く知られている。補助的活性成分、例えば抗微生物剤も又組成物に配合できる。
【００５４】
担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散体の場合は所要の粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により行うことができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを包含させることが好ましくなる。注射用の組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによりもたらすことができる。
【００５５】
滅菌注射用組成物は、必要に応じて本明細書に列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒の必要量中に本開示の多価の免疫原組成物を配合し、その後、熱滅菌、放射線照射、又は他の適当な滅菌手段を用いることにより製造される。一般的に、分散体は、基剤となる分散媒体及び上記列挙したものに属する必要な他の成分を含有する滅菌ベヒクル内に種々の滅菌活性成分を配合することにより製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌粉末の場合は、製造の好ましい方法は、活性成分及び何れかの追加的な所望の成分の粉末を、それらの予め滅菌濾過された溶液から製造する真空乾燥及び凍結乾燥の手法である。
【００５６】
投与の容易さ及び用量の均一性のために、単位剤型中に非経口組成物を製剤することが特に好都合である。単位剤型とは本明細書においては、治療すべき哺乳類対象に対する単位投薬に適する物理的に個別の単位を指し；各々の単位は、所要の製薬上又は獣医学的に許容しうる担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された活性物質の所定量を含有する。
【００５７】
本開示は本明細書に記載した通り多価の免疫原組成物を投与することにより、細菌又はウィルスの感染に対抗して、イヌ、ブタ、又はウシのような対象を保護する方法を提供する。
【００５８】
別の実施形態においては、開示は、例えばイヌへの投与に適しており、そしてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより誘発された疾患、例えば感染性気管気管支炎（ケンネルコフ）に対抗してイヌを保護することができる、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を更に含有する本明細書に記載する免疫原カクテル組成物を提供する。
【００５９】
本発明によれば、本発明における使用に適するｐ６８抗原はネイティブのｐ６８蛋白（即ちＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａから精製される天然に存在するｐ６８蛋白）及び組み換え製造されたｐ６８蛋白の両方を包含する。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａからのネイティブｐ６８の精製は当該分野で知られている（例えばＭｏｎｔａｒａｚ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７：７４４−７５１，１９８５、及び米国特許公開２００４／０１８５０６２参照）。ｐ６８の組み換え製造は当該分野で知られた分子クローニング及び組み換え発現の手法の何れか１つを用いながら達成できる。例えば、ｐ６８をコードする核酸分子は適切な宿主細胞、例えば細菌、酵母細胞（例えばＰｉｃｈｉａ細胞）、昆虫細胞又は哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）内に導入できる。
【００６０】
好ましくは、免疫原カクテル組成物は約０．１〜５ｍｌの単位投薬容量において、好ましくは約０．５〜約２．５ｍｌの単位投薬容量において、又は更に好ましくは約１ｍｌの単位投薬容量において、注射により投薬されるように製剤される。特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物はよく知られた操作法により滅菌状態としなければならない。
【００６１】
免疫原カクテル組成物中のＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの抗原の量は、免疫応答を誘発する場合に有効である必要があり、そして一般的には用量当たり約０．５〜約１０００μｇの範囲において提供される。好ましくは、ｐ６８抗原の量は用量あたり約１μｇ〜約２６０μｇの範囲である。より好ましくは、ｐ６８抗原の量は用量あたり約１０μｇ〜約１００μｇの範囲である。更により好ましくは、ｐ６８抗原の量は用量あたり約１５〜約２５μｇの範囲である。
【００６２】
開示した免疫原を含む医薬組成物は従来の混合、溶解、顆粒化、ドラジェ製造、混合均質化、乳化、カプセル化、捕獲封入又は凍結乾燥の処理加工により製造してよい。医薬組成物は、活性な抗微生物リポペプチド誘導体を薬学的に使用できる調製品に製剤化することを容易にする１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を用いながら従来の態様において製剤してよい。多価の免疫原組成物は１つ以上の生物学的に活性な物質と組み合わせることができ、そして、製薬上許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤とともに製剤することにより本開示の薬学的又は獣医科用の組成物を作成してよい。
【００６３】
治療用途のための製薬上許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤は医薬品分野で良く知られており、そして本明細書において、そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１８版、１９９０）において、そしてＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ（Ｓ．Ｃ．Ｓｍｏｌｉｎｓｋｉ編、１９９２）において記載される通りである。特定の実施形態においては、免疫原カクテル組成物は、水性の、例えば水又はマンニトールの溶液（例えば約１％〜約２０％）、疎水性（例えば油脂又は脂質）又はこれらの組み合わせ（例えば油脂と水のエマルジョン）中において、製薬上又は獣医学上許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤と共に製剤してよい。特定の実施形態においては、本明細書に記載した医薬組成物の何れかは保存料又は安定化剤（例えば抗生物質）を有するか、又は滅菌状態である。
【００６４】
本開示の医薬組成物はその内部に含有されている免疫原が対象への組成物の投与時に生体利用性となるように製剤できる。投与後の血清及び他の組織中の免疫原のレベルは種々の十分樹立された手法、例えばクロマトグラフィー又は抗体（例えばＥＬＩＳＡ）系の試験によりモニタリングできる。他の実施形態においては、免疫原カクテル組成物はそれを必要とする対象（例えばグラム陽性細菌感染症を有するもの）、例えば動物又はヒトに対する非経口投与のために製剤される。好ましい投与経路は皮下及び筋肉内の投与を包含する。
【００６５】
適切な製剤は当該分野で知られる通り選択された投与経路に応じたものとなる。例えば、全身投与用の製剤は注射、例えば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内の注射による投与のために設計されたもの、並びに経皮、経粘膜、経口、鼻内、又は肺内の投与のために設計されたものを包含する実施形態である。１つの実施形態において、全身投与用の製剤は滅菌されている。注射用の実施形態においては、本開示の免疫原カクテル組成物は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性のある溶液又は緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、マンニトール溶液又は生理食塩水緩衝液中に製剤してよい。特定の実施形態においては、本明細書に記載した免疫原カクテル組成物の何れも、懸濁化剤、安定化剤又は分散剤のような製剤用試薬を含有してよい。或いは、免疫原カクテル組成物は、使用前に適当なベヒクル（例えば滅菌発熱物質非含有水）で構成するための固体（例えば粉末）形態であってよい。経粘膜投与の実施形態においては、浸透すべき障壁に対して適切である浸透剤、可溶化剤又は柔軟剤を製剤中に使用してよい。例えば、１−ドデシルヘキサヒドロ−２Ｈ−アゼピン−２−オン（Ａｚｏｎｅ（登録商標））、オレイン酸、プロピレングリコール、メントール、ジエチレングリコール、エトキシグリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標））、ポリソルベートポリエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）及び薬剤７−クロロ−１−メチル−５−フェニル−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（ジアゼパム）、イソプロピルミリステート、及び一般的に当該分野で知られた他のこのような浸透剤、可溶化剤又は柔軟剤を本開示の組成物の何れかにおいて使用してよい。投与は経路の組み合わせ、例えば非経口経路を用いた最初の投与及び粘膜経路を用いたその後の投与を用いながら達成することができる。
【００６６】
別の特徴において、本開示は、本明細書に記載した細菌又はウィルスの感染に対抗して対象を保護する方法を提供する。本開示によれば、免疫原カクテル組成物はイヌに対して、少なくとも約４か月、好ましくは少なくとも約６か月、又は更に好ましくは約１年の長期間の免疫を与える。
【００６７】
本発明の免疫原カクテル組成物は少なくとも６週齢、好ましくは少なくとも７週齢、そしてより好ましくは少なくとも８又は９週齢のイヌに投与できる。イヌは１用量、又は１用量より多くの免疫原カクテル組成物を用いてワクチン接種できる。好ましくは２用量の免疫原カクテル組成物を、２投薬の間で約２〜４週間、好ましくは約３週間の間隔を設けながらイヌに投与する。イヌを４か月齢よりも前にワクチン接種する場合は、母系の抗体が４か月齢未満の幼若イヌにおいて十分な免疫応答の発生を妨害する場合があるため、４か月齢に到達した時点で単回用量で再ワクチン接種することが推奨される。イヌは又単回用量で毎年再ワクチン接種できる。繁殖、輸送及び展示の状況のようにＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ曝露が想定される場合は、そのような事例の発生から１年以内、又は好ましくは６か月以内に、追加的なブースター用量を与えてよい。
【００６８】
本開示によれば、免疫原カクテル組成物は一般的に獣医学的に許容される担体を包含する。本明細書に記載した通り、獣医学上許容される担体は如何なる溶媒、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存料、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等も包含する。希釈剤は水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を包含できる。等張剤は塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及び乳糖を特に包含できる。安定化剤は特にアルブミンを包含する。
【００６９】
好ましくは、免疫原カクテル組成物はそれが約０．１〜５ｍｌ、又は好ましくは約０．５〜２．５ｍｌの用量、又は更に好ましくは約１ｍｌの用量において注射によりイヌのような対象に投与できるように製剤される。
【００７０】
免疫原カクテル組成物は、弱毒化ウィルス株の凍結乾燥調製品（又は噴霧乾燥又はデシケーションなどのような他の方法により作成された調製品）及びウィルス調製品を液体調製品で再水和させることにより製造してよく、この場合の液体調製品は滅菌食塩溶液中に溶解され、そしてアジュバント付与されたＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｌ抗原を含む。そのような免疫原カクテル組成物は又、弱毒化ウィルス株の凍結乾燥調製品及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａウィルス調製品（又は噴霧乾燥又はデシケーションなどのような他の方法により作成された調製品）を滅菌溶液で再水和するか、又は凍結乾燥調製品をＣＣＶ＋希釈剤で再水和することにより製造してよい。
【００７１】
本発明によれば、免疫原カクテル組成物は少なくとも６週齢、好ましくは少なくとも７週齢、そしてより好ましくは少なくとも８又は９週齢のイヌに投与できる。複合ワクチンは２〜４用量において、好ましくは２〜３用量において投与できる。用量は各投薬の間２〜６週間、好ましくは各投薬の間２〜４週間で投与できる。
【００７２】
弱毒化ＣＤウィルスは用量当たり約１０２〜約１０９ＴＣＩＤ５０（組織培養物感染用量５０％細胞変性作用）の量、そして好ましくは用量当たり約１０４〜約１０６ＴＣＩＤ５０の範囲でなければならない。弱毒化ＣＡＶ−２は用量当たり少なくとも約１０２ＴＣＩＤ５０〜約１０９ＴＣＩＤ５０の量、好ましくは用量当たり１０４〜約１０６ＴＣＩＤ５０の範囲でなければならない。弱毒化ＣＰＩウィルスは用量当たり少なくとも約１０２ＴＣＩＤ５０〜約１０９ＴＣＩＤ５０の量、好ましくは用量当たり１０６〜約１０８ＴＣＩＤ５０の範囲でなければならない。弱毒化ＣＰＶは用量当たり少なくとも約１０２ＴＣＩＤ５０〜約１０９ＴＣＩＤ５０の量、好ましくは用量当たり１０７〜約１０９ＴＣＩＤ５０の量でなければならない。不活性化ウィルス調製品中のＣＣＶの量は用量当たり少なくとも約１００相対単位、そして好ましくは用量当たり１０００〜４５００相対単位の範囲でなければならない。ワクチン中の各Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種はワクチン用量当たり約１００〜３５００ＮＵ（比濁計単位）の範囲、そして好ましくは用量当たり２００〜２０００ＮＵの範囲でなければならない。特定の実施形態においては、投薬単位は少なくとも約１ｘ１０６ＴＣＩＤ５０、又は少なくとも約１ｘ１０７ＴＣＩＤ５０、又は少なくとも約５ｘ１０７ＴＣＩＤ５０の殺傷又は不活性化された全又はサブユニットのビリオン又はその部分を含む。これらの実施形態の特定の特徴においては、投薬単位は１ｘ１０９ＴＣＩＤ５０以上もの殺傷又は不活性化された全又はサブユニットのビリオン又はその部分を含んでよい。即ち、殺傷又は不活性化された全又はサブユニットのビリオン又はその部分の適当な範囲は約１ｘ１０４ＴＣＩＤ５０及び１ｘ１０９ＴＣＩＤ５０の間である。
【００７３】
別の特徴において、本開示は本明細書に定義する免疫原カクテル組成物を含む部品の医薬品キットを提供する。キットは更にイヌ、ブタ、又はウシの疾患（例えば本明細書に記載する通りレプトスピラ症）の治療における使用のための説明書を含んでよい。免疫原カクテル組成物の活性剤は単位剤型中に同時パッケージしてよい。
【００７４】
以下の非限定的な実施例は本開示の種々の特徴を説明するために提示した。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
複合ワクチン中のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａの免疫原性／薬効
序論
本実施例はＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの免疫原性及びＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａを複合ワクチンに添加した場合の抗原ブロックの欠如を説明するものである。
【００７６】
ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰは弱毒化イヌジステンパーウィルス（ＣＤウィルス）、弱毒化イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）、弱毒化イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）、弱毒化イヌパラインフルエンザウィルス（ＣＰＩウィルス）、及び弱毒化イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）を含有する複合ワクチン製品を指す表記である。Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａから誘導した外膜莢膜（ＯＭＣ）蛋白をＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰに添加することにより、ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢと表記される新しい複合品を製造した。
【００７７】
本実施例に示す通り、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａＯＭＣ蛋白はＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰと混合した場合、有毒性Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃に対抗した幼若イヌにおける防御免疫の誘導において有効であった。
材料及び方法
動物の選択
被験動物
６週齢〜６週６日齢の合計３４匹のビーグル犬（２２匹にワクチン接種、１２匹は対照）を本試験において使用した。全幼若イヌをＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、混合ワクチンの画分に対して陰性であることを確認した。齢の範囲に基づいて、３４匹の幼若イヌをワクチン化のための２バッチに分割した。各バッチの幼若イヌをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｅｌの乱数発生機能を用いてワクチン接種及び対照群に無作為に割りつけた。全てのワクチン接種は２１日の間隔をおいて２回ワクチン接種した。全幼若イヌが同時に攻撃されるようにするため、最初のバッチの幼若イヌは２回目ワクチン接種後（ＤＰＶ２）２８日に攻撃し、そして第２のバッチの幼若イヌは２１ＤＰＶ２に攻撃した。
動物の収容及び飼育
全動物を試験終了時までケージに収容した。収容場所の空間は動物保護の該当規則に準拠した。
被験ワクチン
ワクチンの組成
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａＯＭＣ蛋白をＣｖＫ／ＬＣＩＧＰと表記される複合品（イヌコロナウィルス（不活性化）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｐｏｍｏｎａを含有）に添加することによりＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢと表記される新しい複合品を製造した。イヌジステンパーウィルス、イヌアデノウィルス２型、イヌパラインフルエンザウィルス及びイヌパルボウィルスを含有するＤＡ２ＰＰをＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢと複合化することによりＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢと表記される新しい複合パッケージ品を製造した。最終複合品中のＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａＯＭＣ蛋白の濃度は５０μｇ／１ｍｌ用量であった。
保存
ワクチンは２℃〜７℃で保存した。
実験設計
各同腹仔に属する幼若イヌを同腹仔に従ってＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｅｌの乱数発生機能を用いて以下の表２に示す通り無作為に２つの群に割りつけた。
【００７８】
【表２】
ワクチン接種
被験群の各動物に２用量（１ｍＬ／用量）の割り付けワクチンを３週間の間隔をあけて首の反対側に皮下投与した。
【００７９】
コード化されたワクチン及び試料を用いることにより試験の盲検性を確保した。
実験攻撃
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃株はＢ２６Ｐ２（入手元：Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ、ＩＡ）とした。十分な量及び良好な生存性を得るために、攻撃生物をＴ−８０培地（Ｓｕｌｚｅｒ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ，Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．（ＣＤＣ）７６−８２７５，ｐｐ．１２−１５，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）中において２８（±２）℃において培養した。攻撃直前に運動性の生物を計数し、そして生物数を攻撃のための用量当たり１ｘ１０１０生物に調節した。被験群及び対照群の幼若イヌを有毒性を有するＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａで腹腔内（ＩＰ）経路により攻撃した。攻撃物質の容量は２．０ｍＬ攻撃用量に調節した。
観察及び試料収集
攻撃前観察
健康状態を確認するために攻撃前の３連続日に直腸温度及び臨床兆候をモニタリングして記録した。
攻撃後観察
攻撃後、動物の直腸温度を毎日モニタリングし、そして２週間に渡りＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａに関連する如何なる可能性のある臨床兆候も観察し、結果を記録した。
【００８０】
試験終了時に幼若イヌを安楽死させ、そしてＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ感染に関連する潜在的な巨視的患部があるかどうか肝臓及び腎臓を検査した。
血液学的プロファイル
攻撃の後、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎｅ（血球計）が使用不能であった１３及び１４ＤＰＣを除き、１５ＤＰＣまで総白血球数をモニタリングするために各幼若イヌから毎日、抗凝固処理された血液試料（２ｍＬ）を収集した。
【００８１】
血小板及び白血球分画をＡｂｂｏｔｔのＣｅｌｌ−Ｄｙｎｅ血球計又は自動化細胞計数器を用いて計数した。
血液試料からのＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの単離
血液試料を用いてＴ−８０半固体Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ生育培地に接種した。接種試験管は４週間の期間、２８（±２）℃でインキュベートした。陰性の培養物は全て新しい培地中に継代し、陰性として廃棄する前に更に２週間の追加的期間、インキュベートした。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａの存在に関して暗視野顕微鏡を用いながら毎週全ての培養物を検査し、結果を記録した。
微小凝集反応試験（ＭＡＴ）
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ全細胞抗原に対する血清凝集抗体を微小凝集反応試験を用いて計測した。簡潔には、血清の２倍連続希釈物を平底マイクロタイタープレート中に調製した。各希釈血清に、等容量（０．０５ｍＬ）の生Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｏｐｈｙｓａ、またはＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ｐｏｍｏｎａ懸濁液（比濁計読み取り値２０と等しい）を添加した。適切な対照を各プレートに包含させた。プレートを３０秒間振とうし、そして２時間室温でインキュベートした後に結果を記録した。各血清の力価は少なくとも５０％凝集をもたらした血清の最高希釈度の逆数として定義した。
データ分析
実験単位は個体別の動物とした。一次的帰結はスピロヘータ血症及び抗体力価とした。各群の動物のスピロヘータ血症のパーセント及び抗体力価を計算した。
結果及び考察
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ抗原レベル
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ外膜莢膜（ＯＭＣ）蛋白の用量当たり５０マイクログラム（５０μｇ）を免疫原ワクチン中に負荷した。
血清学的応答
個体別の幼若イヌの抗体力価を記録し、そして分析した。０ＤＰＶ１において、全幼若イヌは陰性であり、抗体力価は２未満であった。１匹のワクチン接種幼若イヌを除き、全ての他のワクチン接種は、０ＤＰＶ２までにＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａに対してセロポジティブとなり、幾何平均の力価（ＧＭＴ）は１７であった。他のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血液亜型と同様、ＧＭＴは７ＤＰＶ２には７４１まで上昇し、これは２回のワクチン接種後の最高値であり、そしてその後は徐々に低下し、１４及び２１ＤＰＶ２にはそれぞれ４０５及び２２２となった。抗体力価は対照及びワクチン接種群の両方において７ＤＰＣでは実質的に上昇していた。これらの結果はワクチン接種群における強力なブースト作用及び対照の免疫応答を示している。１２対照全てが攻撃日である２１ＤＰＶ２まで陰性のままであった。これらのデータは複合品ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢにおけるＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ画分がインビボで血清学的な免疫応答を誘導する場合に高度に免疫原性であることを示していた。
臨床観察
直腸温度、臨床兆候、白血球数及び血小板数を全幼若イヌについて試験した。１匹の幼若イヌでは一日において眼部の分泌物を観察した。別の幼若イヌは一日において抑鬱／傾眠を示していた。２匹の別の幼若イヌは一日の下痢を示し、そして１匹の幼若イヌが一日の結膜炎を有していた。他の幼若イヌは有毒性攻撃後に臨床上は正常であった。何れの幼若イヌも試験中に直腸温度、白血球数、又は血小板数の上昇又は低下を示さなかった。Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、ｐｏｍｏｎａ及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ等の他のイヌのレプトスピラ症と同様、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ単独ではスピロヘータ血症により顕在化される特異的病原体非含有のイヌにおける最小限の臨床的疾患を誘発する。しかしながらこれを他の病原体、ストレス、免疫無防備状態、及び／又は不良な野外環境と複合化された場合、より長く認識されているイヌのレプトスピラ症の血液亜型による場合と同様、イヌの健康に対してより顕著な、又はむしろ致命的な影響さえ誘発する可能性がある。試験終了時において、腎臓及び肝臓において観察された肉視的患部は無かった。
Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの単離
有毒性Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃後のスピロヘータ血症はＴ８０培地中の全血培養により計測した。１匹の幼若イヌを除き、全ての対照幼若イヌ（１２幼若イヌ中１１匹、又は対照幼若イヌの９２％）がＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａに関して陽性であった。これとは対照的に、ワクチン接種群の幼若イヌは１匹のみが陽性であり、スピロヘータ血症を有していた。換言すればワクチン接種群の約９５％（幼若イヌ２２匹中２１匹）が有毒性Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃後スピロヘータ血症を有することなく存続していた。これらのデータは、ワクチンが防御免疫の誘導及び攻撃後の有毒性Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの複製からの幼若イヌの保護において免疫学的に強力であることを示している。結果は明らかにＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ外膜抗原が他の画分と混合された場合に有効であることを示している。
結論
最近の報告によれば、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ曝露に関して調査したイヌにおける抗体陽性試験結果の優勢性が上昇している。症例試験によれば更に野外におけるイヌのＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａと腎臓及び肝臓の疾患との間の関連性が裏付けられている。腎臓及び肝臓の疾患に伝統的に関連付けられている大部分のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの血液亜型について、保護のための重要な点はスピロヘータ血症の防止であった。本試験は、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａのワクチン接種がイヌの健康状態に対して同様の利益をもたらすことを期待できることを明らかにした。
【００８２】
本試験の結果は、Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの外膜蛋白は、ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰの画分と混合した場合（これによりＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢを形成）に、６週齢の幼若イヌにおいて強力な薬効を有することを明らかにしている。最低抗原負荷量（５０μｇ／用量）は有毒性のＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ攻撃によるスピロヘータ血症からのワクチン接種群の保護を誘導するために十分であった。ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢ複合品におけるＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの薬効はワクチン接種群で１００％及び対照群で皆無であった血清変換、及びワクチン接種群の９５％及び対照群の僅か８％における有毒性攻撃後のスピロヘータ血症の非存在により明らかにされた。対照群と比較した場合のワクチン接種群における血清変換と組み合わせた場合の血液スピロヘータ血症の低減は、他の９画分、即ち殺傷された、又は修飾され生存している抗原の両方とも、ＤＡ２ＰＰ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰＢにおけるＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａの殺傷バクテリンの薬効を妨害しなかったことを示している。
（実施例２）
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓを含むワクチン
本実施例においては、複合ワクチンを製造するために、先ず当該分野で使用可能な標準的な方法を用いながらＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの各々から単離された外膜莢膜（ＯＭＣ）ポリペプチドを得る。次に、１ｍｌ用量当たり各ＯＭＣポリペプチド調製品約５０μｇの最終濃度において獣医学的に許容される希釈剤の存在下、ＯＭＣポリペプチドを混合する。
【００８３】
実験群における４０匹のビーグル幼若イヌに第０日及び第２１日に腹腔内経路により複合ワクチン２用量を投与し、対照群における４０匹のビーグル幼若イヌには同じ時点において希釈剤のみを投与する。
【００８４】
第２のワクチン接種の２１日後、実験群及び対照群の両方の幼若イヌを各々１０匹の４つのサブグループに分割する。サブグループはＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと表記する。各サブグループの幼若イヌを以下の表に示す通りＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの有毒性株で攻撃する。
【００８５】
【表３】
攻撃後、両方の群の幼若イヌの直腸温度及びＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの何れかによる感染に関連する可能性のある臨床兆候を毎日モニタリングする。更に又、攻撃後２１日間両方の群の各幼若イヌから毎日血液試料を収集する。血液試料は細菌細胞（Ｌ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）に関して、そしてＬｅｐｔｏｓｐｉｒａの全細胞抗原に対する血清凝集抗体に関してミクロ凝集試験を用いながら試験した。
【００８６】
本実施例による有効な複合ワクチンは以下の作用、即ち：（ａ）二回目ワクチン接種後０〜２１日（攻撃前）において少なくとも１０〜５００の抗体力価を有するＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの少なくとも１つに対する抗体の存在；（ｂ）複合ワクチンを投与されていない対照幼若イヌにおいて観察された臨床症状と比較した場合に対応する有毒性株で攻撃した後のＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ感染のより低値の臨床症状；及び／又は（ｃ）対照幼若イヌの血液から単離された生存細胞の量と比較した場合の攻撃幼若イヌの血液に由来するＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ又はＬ．ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの生細胞の低減した単離の１つ以上をもたらすことになる。
参考文献
【００８７】
【化１】
上記した本発明は理解を明確化する目的のために解説及び例示により幾分詳細に説明してきたが、本発明は開示した特定の実施形態に限定されるのではなく、添付する請求項により定義されるとおり本発明の精神及び範囲内に包含される全ての変更及び改変を含むことを意図している。
【００８８】
本明細書において言及した全ての公開物及び特許は本発明が関係する技術分野における当業者の技術レベルを示すものである。全ての公開物及び特許は、各々個々の公開物又は特許が参考により組み込まれることを特定的及び個別的に示す場合と同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａの細胞表面免疫原、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓの細胞表面免疫原、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓの細胞表面免疫原、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの細胞表面免疫原を含む免疫原組成物。
【請求項２】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａの該細胞表面免疫原がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）である請求項１記載の免疫原組成物。
【請求項３】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓの該細胞表面免疫原がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）である請求項１又は２記載の免疫原組成物。
【請求項４】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓの該細胞表面免疫原がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）である請求項１〜３の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項５】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの該細胞表面免疫原がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）である請求項１〜４の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項６】
製薬上又は獣医学上許容しうる担体、賦形剤、又は希釈剤を更に含む請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項７】
（ｉ）イヌジステンパー（ＣＤ）ウィルスの弱毒化株のウィルス免疫原、（ｉｉ）イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、（ｉｉｉ）イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、（ｉｖ）イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、及び（ｖ）イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の株の不活性化された全又は部分細胞調製品よりなる群から選択される追加的成分少なくとも１つを更に含む請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項８】
（ｉ）イヌジステンパー（ＣＤ）ウィルスの弱毒化株のウィルス免疫原、（ｉｉ）イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、（ｉｉｉ）イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、（ｉｖ）イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、及び（ｖ）イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の株の不活性化された全又は部分細胞調製品を更に含む請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原が各々独立して宿主における防御免疫応答を誘発することができる請求項１〜８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
宿主がイヌ、ブタ、又はウシである請求項９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原及び該追加的成分が各々独立して宿主における防御免疫応答を誘発することができる請求項８記載の組成物。
【請求項１２】
宿主がイヌである請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
保存料を更に含む請求項１〜１２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
アジュバントを更に含む請求項１〜１２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
保存料が抗生物質である請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの細胞表面免疫原を更に含む請求項１〜１５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
動物にワクチン接種する方法であって、該方法が請求項１〜１６の何れか１項に記載の免疫原組成物を動物に投与することを含む方法。
【請求項１８】
動物にワクチン接種する方法であって、該方法がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａの細胞表面免疫原、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓの細胞表面免疫原、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓの細胞表面免疫原、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの細胞表面免疫原を含む免疫原組成物を動物に投与することを含む上記方法。
【請求項１９】
該免疫原組成物が更に（ｉ）イヌジステンパー（ＣＤ）ウィルスの弱毒化株のウィルス免疫原、（ｉｉ）イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、（ｉｉｉ）イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、（ｉｖ）イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、及び（ｖ）イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の株の不活性化された全又は部分細胞調製品よりなる群から選択される追加的成分１つ以上を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
動物がイヌ、ブタ、又はウシである請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項１】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａの細胞表面免疫原、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓの細胞表面免疫原、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓの細胞表面免疫原、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの細胞表面免疫原を含む免疫原組成物。
【請求項２】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａの該細胞表面免疫原がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）である請求項１記載の免疫原組成物。
【請求項３】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓの該細胞表面免疫原がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）である請求項１又は２記載の免疫原組成物。
【請求項４】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓの該細胞表面免疫原がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）である請求項１〜３の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項５】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの該細胞表面免疫原がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ外膜莢膜蛋白（ＯＭＣ）である請求項１〜４の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項６】
製薬上又は獣医学上許容しうる担体、賦形剤、又は希釈剤を更に含む請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項７】
（ｉ）イヌジステンパー（ＣＤ）ウィルスの弱毒化株のウィルス免疫原、（ｉｉ）イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、（ｉｉｉ）イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、（ｉｖ）イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、及び（ｖ）イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の株の不活性化された全又は部分細胞調製品よりなる群から選択される追加的成分少なくとも１つを更に含む請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項８】
（ｉ）イヌジステンパー（ＣＤ）ウィルスの弱毒化株のウィルス免疫原、（ｉｉ）イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、（ｉｉｉ）イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、（ｉｖ）イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、及び（ｖ）イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の株の不活性化された全又は部分細胞調製品を更に含む請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原が各々独立して宿主における防御免疫応答を誘発することができる請求項１〜８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
宿主がイヌ、ブタ、又はウシである請求項９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞表面免疫原及び該追加的成分が各々独立して宿主における防御免疫応答を誘発することができる請求項８記載の組成物。
【請求項１２】
宿主がイヌである請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
保存料を更に含む請求項１〜１２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
アジュバントを更に含む請求項１〜１２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
保存料が抗生物質である請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの細胞表面免疫原を更に含む請求項１〜１５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
動物にワクチン接種する方法であって、該方法が請求項１〜１６の何れか１項に記載の免疫原組成物を動物に投与することを含む方法。
【請求項１８】
動物にワクチン接種する方法であって、該方法がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａの細胞表面免疫原、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓの細胞表面免疫原、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓの細胞表面免疫原、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓの細胞表面免疫原を含む免疫原組成物を動物に投与することを含む上記方法。
【請求項１９】
該免疫原組成物が更に（ｉ）イヌジステンパー（ＣＤ）ウィルスの弱毒化株のウィルス免疫原、（ｉｉ）イヌアデノウィルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、（ｉｉｉ）イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウィルスの弱毒化株、（ｉｖ）イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、及び（ｖ）イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）の株の不活性化された全又は部分細胞調製品よりなる群から選択される追加的成分１つ以上を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
動物がイヌ、ブタ、又はウシである請求項１８又は１９記載の方法。
【公表番号】特表２０１０−５１８８７５（Ｐ２０１０−５１８８７５Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１７９６（Ｐ２００９−５５１７９６）
【出願日】平成２０年２月２５日（２００８．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５４８６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０６３９３
【国際公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２５日（２００８．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５４８６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０６３９３
【国際公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
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