単離された多発性硬化症関連細胞傷害性因子、および当該細胞傷害性因子の検出方法
【課題】多発性硬化症関連細胞傷害性因子、及び、その検出方法を提供すること。
【解決手段】ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４又は変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４である多発性硬化症関連細胞傷害性因子。ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４又は変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４を、生物学的サンプルから単離することによる、多発性硬化症関連細胞傷害性因子の検出および／または定量方法。
【解決手段】ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４又は変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４である多発性硬化症関連細胞傷害性因子。ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４又は変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４を、生物学的サンプルから単離することによる、多発性硬化症関連細胞傷害性因子の検出および／または定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離された多発性硬化症関連細胞傷害性因子、および当該細胞傷害性因子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症は、ヒトの中枢神経における慢性疾患であり、寛解段階および悪化段階の連続によって、または通常の進行に従って進行し、その解剖病理学的特徴は、脳および脊髄の白質の脱髄の明確に区切られた領域の形成からなる。
【０００３】
解剖学的レベルでは、これらの領域は、損傷過程の初期段階において、この脱髄に関連するグリア細胞に対する損傷に関連する軸索周囲のミエリンの分解を示す。ミクログリア細胞（中枢神経系の常駐する組織マクロファージ）、そしておそらく浸潤した血液単球から生じたマクロファージを含む炎症性マクロファージ活性化は、この脱髄過程に関連し、かつミエリン化シートの破壊に関連する。グリア細胞の相対的な枯渇は、脱髄領域の中心部に見出されるが、一方、星状細胞の増殖は、周辺部で進展し、脱髄したプラークに侵入して繊維状またはグリア状のプラークを形成し得る。これらの硬化構造は、当該疾患に与えられた名称の理由である。
【０００４】
これらのプラークの別の特徴は、それらがその周囲で進行する血管要素と、事実上全身的に関連することである。
【０００５】
解剖学的レベルでは、毛細管内皮からなる血液脳関門（ＢＢＢ）の頻繁な損傷が観察される。ＢＢＢの維持における決定因子は、星状細胞エンドフィートと呼ばれる星状細胞の細胞延長の潜在的な存在からなる。星状細胞エンドフィートは、おそらく、強固な結合構造の形成を誘発するかまたは維持を可能にし、これにより毛細管内皮関門の凝集がＢＢＢに対して具体的な発現を与えることが確証される。
【０００６】
さらに、ＭＳの損傷過程では、ＢＢＢの損傷は、血流から生じるリンパ細胞の流入により、関連する炎症応答を増幅するのに寄与する。免疫細胞と関連する炎症の寄与は、ＭＳにおいて重要であり、かつ、損傷過程に関与する。
【０００７】
ＭＳの病因学は、現在、論争の種である。なぜなら、当該疾患は、種々の原因を有する可能性があるからである。細菌および／またはウイルス起源に関する仮説が提示されてきた。さらに、特許文献１に記載されるように、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎらは、病因学的過程の１つまたはそれ以上のエフェクター因子を調査することにより、脱髄プラークの代表的な形成および星状細胞グリオーシスを結論付けた。この研究の文脈では、彼らは、ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）および血清中において、ヒトまたは動物の星状細胞またはオリゴ樹状細胞に関して傷害活性を示す少なくとも１つの因子が存在することを示した。この傷害活性は、中間フィラメントのネットワークの細胞形態学的破壊および／または当該フィラメントのタンパク質の分解および／またはグリア細胞のアポトーシスによる細胞死により特徴付けられる。彼らは、特許文献１に記載される生存細胞のメチルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を用いた定量比色アッセイにより、ＭＳ患者からのＣＳＦおよび血清サンプルにおけるこの傷害活性のインビトロでの検出と、多発性硬化症との間に、有意な相関があることを確立した。さらに、Ｃ．Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎら（非特許文献１及び２）は、この傷害性因子の活性を検出するために尿が非常に好ましい生物学的流体であることを示し、アポトーシスによって死んだ付着性グリア細胞を検出および／または定量するためのフローサイトメトリーを用いる方法を開発した。この方法に関する全ての情報は、特許文献２に記載されている。
【０００８】
この傷害性因子の同定を試みるため、ＭＳ患者由来のＣＳＦおよび尿のタンパク質画分を用いてアッセイが行われた。各画分中のタンパク質成分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ １２％ゲル上で分離し、ゲル上で銀染色した後に観察した。観察したタンパク質のうち、見かけ上の分子量が約２１ｋＤに集中したタンパク質画分が、インビトロで検出された傷害活性に関連する少量の成分であること、および見かけ上の分子量が約１７ｋＤに集中したタンパク質画分は、この傷害活性に関連する主要な成分であることを見出した。
【０００９】
ＭＳ患者のＣＳＦ由来の画分を、Ｌｅｗｉｓラットの脳に注入し、当該ラット由来の脳断片の死後解剖学的観察により、注入の３ヶ月後に、星状細胞集団のアポトーシスおよび脱髄プラークの形成を観察することが可能になった。全ての情報は、特許文献３に含まれる。これらの観察は、生検後に、ＭＳに罹患している患者の脳区域でなされ得た観察と関連する（非特許文献３）。
【００１０】
ＭＳ患者由来の生物学的サンプル中のグリア細胞に関するこの細胞傷害性と潜在的に関連するタンパク質が、特許文献４に記載されるように研究された。ＭＳおよび非ＭＳ患者の尿中で、タンパク質ＧＭ２ＡＰ（ＧＭ２ガングリオシドアクチベータ前駆体）およびサポシンＢをこのようにアッセイした。特許文献４に示される結果は、ＧＭ２ＡＰおよびサポシンＢは、ＭＳ患者の尿中で、非ＭＳ個体で見出される濃度と比較して高濃度で存在したこと、およびＭＳ患者の尿中で同時に検出されるこれらの２つのタンパク質が、病理学のマーカーを示し得たことを示した。この発明者らはまた、尿中のＧＭ２ＡＰおよびサポシンＢの検出と、ＭＴＴアッセイにより当該尿中で測定されたグリオ傷害性との間の相関性を確立し、これらの２つのタンパク質について、高い尿中濃度とグリオ傷害性との間に相関性が存在したことを示した。これらのことから、この発明者らは、ＧＭ２ＡＰおよび／またはサポシンＢタンパク質は、グリオ傷害性のメカニズムに関与し、それらはおそらく一緒になって作用し、グリオ傷害性を誘発したのではないかと結論付けた。
【００１１】
そこで、本発明者らは、ＭＴＴアッセイを用いる特許文献４で同定されるタンパク質の活性を決定すること、および多発性硬化症に罹患した患者の尿中で発見されたグリオ傷害性が、同定されたタンパク質に関連するのかどうか確認することを望んできた。
【特許文献１】特許出願ＷＯ９５／２１８５９号
【特許文献２】特許出願第ＷＯ９８／１１４３９号
【特許文献３】特許出願第ＷＯ９７／３３４６６号
【特許文献４】特許出願第ＷＯ０１／０５４２２号
【非特許文献１】Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ ｕｒｉｎａｒｙ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ［ｌｅｔｔｅｒ］．Ｌａｎｃｅｔ ３５１，１３３０．
【非特許文献２】Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｌｉａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ７，３８３−３８８，
【非特許文献３】Ｎ．Ｂｅｎｊｅｌｌｏｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，４４（４），５７９−５８３．
【発明の開示】
【００１２】
本発明者らは、全ての予測に反して、グリオ傷害性に関与するのは、特許文献４で同定されるタンパク質単独でも、ＧＭ２ＡＰ／サポシンＢタンパク質の組み合わせでもないこと、および、全く驚くべきことに、グリオ傷害活性に関与しかつ下記の実施例に記載するヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４（カルグラニュリンＢ）もしくは変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４、ＧＭ２またはガングリオシドＧＭ２に対応する細胞傷害性に関与する因子は、脳組織内に存在する複合体脂質であることを示した。
【００１３】
従って、本発明の目的は、多発性硬化症に関連する、精製単離した細胞傷害性因子であり、当該細胞傷害性因子は、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４であり、変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応することが理解されている。これらの精製単離したヘテロ複合体は、ＭＳの病理学のマーカーとして、より詳細には、当該疾患の形態、当該疾患の段階または当該疾患の活性の期間のマーカーとして有用であり、また、当該病理学の治療を受けた患者の追跡治療にも有用である。
【００１４】
従って、本発明者らは、多発性硬化症に罹患しているかまたはこの病理学の臨床的兆候を示す可能性のある個体由来のサンプル中におけるヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４を検出および／または定量するための方法、組成物および反応混合物を開発した。
【００１５】
当該方法は、生物学的サンプル中の多発性硬化症に関連する細胞傷害性因子を、当該生物学的サンプル中から、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４を単離することにより、検出および／または定量することを含む。表現「ヘテロ複合体を単離する」とは、ヘテロ複合体の特定の検出を可能にする全ての条件を意味する。当該ヘテロ複合体の単離は、任意の適切な方法で行うことができる。例えば、非変性電気泳動、カラムクロマトグラフィー、生物学的媒体中のヘテロ複合体以外の化合物を分解する方法（例、プロテイナーゼＫでの処理）、および当該ヘテロ複合体の生理化学的特性を検出するための任意の他の方法（例、分子質量または等電点）、または任意の他の適切な手段が挙げられる。
【００１６】
本発明の１つの実施態様では、ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも１つの抗体または少なくとも２つの抗体を用い、上記細胞傷害因子は、当該ヘテロ複合体と当該抗体からなる複合体の形成を示すことによりまたは当該ヘテロ複合体と当該２つの抗体からなる複合体の形成を示すことにより、検出および／または同定される。好ましくは、当該抗体の少なくとも１つは捕捉抗体であり、他の抗体の少なくとも１つは検出抗体である。
【００１７】
捕捉抗体は、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する抗体および複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する抗体から選択され、検出抗体は、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する抗体および複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する抗体から選択される。
【００１８】
別の実施態様では、ヘテロ複合体は、少なくとも２つの抗体により単離され、その少なくとも１つはヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰに特異的に結合し、その少なくとも他のものはヘテロ複合体のＭＲＰ１４に特異的に結合し、当該細胞傷害特性は、当該ヘテロ複合体と２つの抗体とからなる複合体の形成を示すことにより、検出および／または同定される。好ましくは、上記抗体の少なくとも１つは、捕捉抗体であり、上記抗体の少なくとも他方は、検出抗体である。
【００１９】
上記実施態様では、ヘテロ複合体と少なくとも１つの抗体からなる複合体の形成、またはヘテロ複合体と少なくとも２つの抗体からなる複合体の形成は、任意の適切な手段、例えば、篩分け装置を用いてサイズの関数としてスクリーニングすることにより、分離カラムを用いて分子質量の関数としてスクリーニングすることにより、または少なくとも１つの抗体の直接的または間接的な標識により、あるいは任意の他の適切な手段により、示すことができる。
【００２０】
１つの実施態様では、当該方法は、
（ｉ）試験すべき生物学的サンプルを提供すること、
（ｉｉ）当該生物学的サンプルを、ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、ＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体および複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体から選ばれる少なくとも１つの捕捉抗体、ならびにＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、ＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２および複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体から選ばれる少なくとも１つの標識された検出抗体と接触させること、ならびに
（ｉｉｉ）当該標識された検出抗体を検出および／または定量することにより、細胞傷害性因子を検出および／または定量することを含み、ここで、変異ＧＭ２ＡＰは、配列番号２に対応することが理解される。
【００２１】
好ましくは、細胞傷害性因子の検出および／または定量は、当業者に周知のＥＬＩＳＡ、ＥＬＦＡ等の種々の免疫アッセイ原理を用いて行われ、「サンドウィッチ」免疫アッセイを用いることが有利である。「サンドウィッチ」免疫アッセイは、１つまたはそれ以上の工程を用いて（すなわち、洗浄工程なしで、または１つまたはそれ以上の洗浄工程を用いて）行うことができる。
【００２２】
検出抗体（単数または複数）は、任意の適切な標識で標識される。従って、標識化は、放射標識、酵素を用いる標識、蛍光分子を用いる標識、ビタミンを用いる標識または比色標識であり得る。本発明では、標識は、好ましくはビタミン、ビオチンであり、検出は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンの添加により行われ、可視化は、オルトフェニレンジアミン二塩酸塩の添加により行われる。
【００２３】
捕捉抗体（単数または複数）は、固相上に直接的にまたは間接的に固定される。
【００２４】
本発明で用いる用語「抗体」は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、そのフラグメントおよびその誘導体を包含する。用語「抗体フラグメント」は、天然抗体のＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびｓＦｖフラグメントを意味することを意図し６，７、用語「誘導体」は、とりわけ、天然抗体のキメラ誘導体を意味することを意図する８，９。これらの抗体フラグメントおよび抗体誘導体は、標的抗原に選択的に結合する能力を保持する。ヒト化抗体を用いることが有利であり得る。非ヒト（例、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、大部分が、所望の特異性、親和性および能力を有する、レシピエントの超可変領域がマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長目のような非ヒトドナー種（ドナー抗体）の超可変領域の残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。特定の場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ領域の残基（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出せない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体の有効性を改善するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全ての超可変領域が非ヒト免疫グロブリンに対応し、かつ、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのＦＲ領域である可変ドメインを、少なくとも２つ、好ましくは２つ含むであろう。ヒト化抗体は、また、必要に応じて、ヒト免疫グロブリンなどの免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る１０，１１，１２。特に、出願第０１／０５４２２号に記載の抗ＧＭ２ＡＰおよび抗ＭＲＰ１４抗体を挙げることができる。
【００２５】
しかしながら、驚くべきことに、グリオ傷害活性に関連しかつヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４に対応する因子によって、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に、複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４にまたは複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合し得る抗ヘテロ複合体抗体の産生が可能になることを発見した。このような抗体の産生は当業者に周知である。ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４は、腹腔内注射によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化のための免疫原として用いられる。最初の注射は、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて行われる。その他の注射は、４〜８週間の間隔で、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて行われる。最終追加抗原を、生理食塩水中での融合の２、３日前に与える。この抗原追加後、免疫化マウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞を回収する。次いで、脾臓細胞と骨髄腫株との融合を行い、免疫化に用いられるヘテロ複合体をＥＬＩＳＡにおいて認識する抗体を分泌する細胞を選択する。最後に、免疫ヘテロ複合体に特異的な抗体を産生する（すなわち、ＧＭ２ＡＰ、変異ＧＭ２ＡＰまたはＭＲＰ１４をいずれも単独では認識しない）クローンを選択する。
【００２６】
上述の抗体は、単独でまたは組み合わせて、細胞傷害性因子の検出および／または定量方法に用いることができる。
【００２７】
本発明の方法の好ましい実施態様では、試験サンプルを、以下を含む前処理に供する：
サンプルのタンパク質を、プロテイナーゼＫで消化することからなる工程；当該プロテイナーゼＫを、例えば、トリクロロ酢酸で沈殿させて不活性化させることからなる工程；およびｐＨを、例えば、トリスマレイン酸緩衝液の添加により中和することからなる工程。
【００２８】
生物学的サンプルは、血清、血漿、尿または脳脊髄液であり、好ましくは尿である。
【００２９】
好ましくは、本発明の方法で用いられる抗体は、以下のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体である：１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０、２Ｇ１２Ｈ５、７９、２Ｂ９Ｈ２、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０および１９６。しかしながら、ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、ＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２、複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４または複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する特性を示す任意の抗体が本発明の一部をなすことは極めて明らかであり、そのような抗体を得る方法は、上記のように当業者に周知である。
【００３０】
好ましくは、本発明のサンドウィッチＥＬＩＳＡ検出法および／または定量アッセイに用いられる抗体は、以下のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体である：
−捕捉抗体１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、２Ｇ１２Ｈ５、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０、２Ｂ９Ｈ２および７９；
−検出抗体１０Ｅ１１Ａ１１、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０、２Ｂ９Ｈ２、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０、１３Ｄ１Ｅ５および２Ｇ１２Ｈ５。
【００３１】
有利には、捕捉抗体および検出抗体は、以下の対から選択される：
−２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１、
−１０Ｅｌ１Ａ１１／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
７９／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／２Ｂ９Ｈ２、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１０Ｅ１１Ａ１１、
４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０、
２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０、
１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／２Ｂ９Ｈ２、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１０Ｅ１１Ａ１１、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１３Ｄ１Ｅ５＋２２Ｇ１２Ｈ５、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｄ１Ｅ５＋２２Ｇ１２Ｈ５、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０。
【００３２】
上記モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は新規であり、これらもまた本発明の主題の一部をなす。これらの産生方法は、実験の章でより詳細に説明する。選択された捕捉抗体および検出抗体の対もまた新規であり、これらもまた本発明の主題の一部をなす。
【００３３】
本発明の主題はまた、生物学的試験サンプル中で上記細胞傷害性（グリオ傷害性）因子を検出および／または定量するための組成物であり、当該組成物は、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。好ましくは、当該組成物は、ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも２つの抗体を含む。
【００３４】
本発明の主題はまた、生物学的試験サンプル中で上記細胞傷害性（グリオ傷害性）因子を検出および／または定量するための組成物であり、当該組成物は、反応混合物中に、同時に、少なくとも１つの捕捉抗体および少なくとも１つの標識された検出抗体を含み、当該抗体は、ヘテロ複合体の、ＧＭ２ＡＰタンパク質に、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体およびＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する抗体から選択される。
【００３５】
好ましくは、捕捉抗体および検出抗体は、以下のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む：１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０、２Ｇ１２Ｈ５、７９、２Ｂ９Ｈ２、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０および１９６。
【００３６】
有利には、当該組成物は、抗体１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、２Ｇ１２Ｈ５、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０、２Ｂ９Ｈ２および７９から選択される少なくとも１つの捕捉抗体を含み；かつ検出抗体１０Ｅ１１Ａ１１、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０、２Ｂ９Ｈ２、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０、１３Ｄ１Ｅ５および２Ｇ１２Ｈ５から選択される少なくとも１つの検出抗体を含む。
【００３７】
好ましい組成物は、以下の捕捉抗体および検出抗体の対を含む：
−２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１、
−１０Ｅ１１Ａ１１／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／２Ｂ９Ｈ２、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１０Ｅ１１Ａ１ｌ、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／ｌ３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０、
−２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０、
−１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／２Ｂ９Ｈ２、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／ｌＯＥ１１Ａ１１、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１３Ｄ１Ｅ５＋２２Ｇ１２Ｈ５、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｄ１Ｅ５＋２２Ｇ１２Ｈ５、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０。
【００３８】
本発明の主題はまた、上記細胞傷害性（グリア傷害性）因子を検出および／または定量するための反応混合物であり、当該混合物は、少なくとも２つの抗体を含み、当該抗体の少なくとも１つはヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰタンパク質または変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合し、当該抗体の他の少なくとも１つはヘテロ複合体のＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する。用語「反応混合物」は、少なくとも上記２つの抗体を同時に含む均一または不均一な媒体を意図することを意味する。好ましくは、当該抗体の少なくとも１つは捕捉抗体であり、他の抗体の少なくとも１つは検出抗体である。
【００３９】
本発明の別の主題は、少なくとも２つの抗体に結合するヘテロ複合体を含む複合体であり、当該抗体の少なくとも１つはヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰタンパク質または変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的であり、他の少なくとも１つの抗体はヘテロ複合体のＭＲＰ１４タンパク質に特異的である。
【００４０】
配列番号１は、ＧＭ２ＡＰタンパク質の配列に対応する。
【００４１】
配列番号２は、４０位のエキソン２で変異した（アスパラギン酸がフェニルアラニンで置換された）ＧＭ２ＡＰタンパク質の配列に対応する。
【００４２】
配列番号３は、エキソン１、エキソン２およびエキソン４の両方で変異を示す変異ＧＭ２ＡＰタンパク質の配列に対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下の詳細な説明では、ＧＭ２ＡＰタンパク質を参照する場合、考慮すべき配列は、配列番号１で同定される配列である。さらに、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を参照する場合、考慮すべき配列は、配列番号２で同定される配列である；実施例３の実験の章で説明するように、配列番号１および配列番号２において、バリンまたはアラニンは、１５３位での識別を行うことなく見出すことができる。しかしながら、配列番号３で同定されるように、エキソン１、エキソン２およびエキソン４の両方で変異を示す変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を考慮に入れることにより同等の実験を行うことができる。
【００４４】
図面
添付の図面は、三元複合体ＧＭ２ＡＰ＋ＭＲＰ１４＋ＧＭ２（ＧＭ２：最終濃度５０μｇ／ｍｌ）の用量応答曲線を示す。ＭＲＰ１４の量はｘ軸（ｎｇ）に沿って表され、死んだ細胞に対応する細胞傷害百分率は、ｙ軸に沿って表される。この図では、ＧＭ２ＡＰの量（ｎｇ）は、それぞれ、以下の記号で表される：
φ：５ｎｇ、π：１０ｎｇ、Ψ：２０ｎｇ、υ：５０ｎｇおよびχ：１００ｎｇ。
【００４５】
同様の実験は、ＧＭ２タンパク質の代わりに、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を用いて行われた。得られた結果は、添付の図面に記載のものと同等である。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ＭＴＴアッセイプロトコル
（ｉ）ポリ−Ｌ−リジンを用いたプレートの「コーティング」
２５０μｌの無菌ポリ−Ｌ−リジン溶液（１２．５μｇ／ｍｌ）を、４８ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７８）の全てのウェルに入れる。３７℃で２時間インキュベーションした後、溶液を吸引により除去し、２５０μｌの無菌水で置換して、ウェルを洗浄する。ウェルを吸引により空にした後、それらを微生物学的に安全なステーションの気流下で乾燥する。
【００４７】
（ｉｉ）用いた細胞
ＣＬＴＴ１−１細胞は、ポリオーマウイルスのラージＴ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス由来の星状細胞である１３。これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２湿潤雰囲気下で、Ｄｕｂｅｌｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ Ｆ１２培地（５０／５０）、４．５ｇ／ｌのＤ−グルコース（１０％の非脱補体仔ウシ血清（ＦＣＳ）、グルタマックス（５８０ｍｇ／ｌ）、ペニシリン（５００単位／ｌ）およびストレプトマイシン（５００μｇ／ｌ）を補充）中で培養する。
【００４８】
（ｉｉｉ）細胞傷害性アッセイ
試験サンプルを、傷害性アッセイのために、入れる２４時間前に調製し、４℃でインキュベートした。
【００４９】
ポリ−Ｌ−リジンで「コーティング」された４８ウェルプレートに、ＣＬＴＴ １−１細胞を、１ウェル当たり２５０μｌの細胞懸濁液（６０００細胞／ｍｌ）の速度（すなわち、１５００細胞／ウェル）で播種した。
【００５０】
５％ＣＯ２湿潤雰囲気下、３７℃での２４時間のインキュベーション後、サンプルを細胞培地の表面に塗布する。各サンプルを３回塗布する。特定のウェルにより、細胞コントロール（Ｃ）（サンプルの沈殿なし）または「ＴＵＣ」コントロール（ＴＵＣ溶液を１０μｌ塗布する）と評価することが可能である。ＴＵＣ試薬（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭの尿素、１ｍＭのＣａＣｌ２）は、尿の化学組成を模倣する溶液である。
【００５１】
沈殿をホモジナイズし、蒸発を避けるためにプレートの上部に保護フィルムを被せる。
【００５２】
５％ＣＯ２湿潤雰囲気下、３７℃での７２時間のインキュベーション後、ＭＴＴアッセイによる可視化を行う。ウェルの底から細胞を取り出さないように留意しながら、細胞上清を吸引により除去する。２５０μｌのＭＴＴ溶液（培養培地中０．５ｍｇ／ｍｌ）を、細胞上に慎重に塗布する。３７℃での３時間のインキュベーション後、溶液をを吸引により除去し、細胞中で生じたフォルマザン結晶をイソプロパノール、１Ｎ ＨＣｌ（４０μｌ／ｍｌ）で溶解する。
【００５３】
光学濃度読み取りを行うため、４８ウェルプレートの各ウェル中の７０μ１の溶液が均一になるとすぐに９６ウェルプレートのウェルに移す。
【００５４】
吸光度を、５７０ｎｍ／６５０ｎｍで読み取る。
【００５５】
細胞傷害百分率を計算することができる：
ＭｅａｎＣ＝コントロールの吸光度の平均
σＣ＝コントロールの吸光度の標準偏差
ＣＯ＝カットオフ＝平均Ｃ＝２σＣ
ＯＤ＝サンプルの平均吸光度
傷害％＝（１−（ＯＤ／ＣＯ））×１００
【００５６】
有効であるためには、各サンプルの吸光度（３回）は、平均吸光度の１０％よりも大きい標準偏差を有してはならない。
【００５７】
実施例２：尿プールの調製
１００リットルのＭＳ尿（患者の最初の朝の排尿由来の０．２〜０．５リットル）を回収した。グリア傷害性バイオアッセイを阻害するおそれがある、細菌汚染された患者由来の尿または薬物治療を受けた患者由来の尿を除いた４。個別のサンプルについてグリア傷害性を試験し、顕著なグリア傷害性を有する４６リットルの尿の最終プールを、ＭＴＴアッセイのために選択した。平行して、グリア傷害性が陰性の正常なドナー由来の当量の尿を各サンプルについて得た。この材料の濃縮および精製、タンパク質分析ならびに同定ストラテジーからなる工程を以下に示す。
【００５８】
・尿中タンパク質の精製
高濃度のタンパク質を得るため、ＭＳ陽性およびＭＳ陰性の尿プールを精製した。
【００５９】
−（ｉ）沈殿：
−硫酸アンモニウム（Ｐｒｏｌａｂｏ−ｒｅｆ．２１ ３３３ ３６５）での沈殿を、ＭＳ陽性およびＭＳ陰性の尿プールについて行った。４０％の尿に対し６０％の飽和硫酸アンモニウムの百分率（すなわち、尿１リットル当たり３９０ｇの硫酸アンモニウム）を用いた。沈殿を改良するため、各プールを１．８リットルの画分で、２リットルのビンに分配した。沈殿を２回×８時間、周囲温度で、穏やかに撹拌しながら行った。尿プールを３０００ｒｐｍで１０分間、１０℃の温度で遠心分離した後、得られたペレットを、１ｍＭ ＣａＣｌ２および０．２５ｍ尿を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に入れる。次いで、混合物を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清は濃縮されたタンパク質を含む。これを以下の工程に直ちに用いるか、または、以下の工程を連続的に行うことができない場合は、冷凍する。
【００６０】
−（ｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー：
−次いで、タンパク質を含む溶液を、ＤＥＡＥ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（商品名、Ｐｈａｒｍａｃｉａから販売）を通した。この工程は、ゲルを充填したＰｈａｒｍａｃｉａカラム上で、低圧で行う。緩衝液を、均一な流速を可能にする蠕動ポンプによってカラム上に導入する。カラム平衡化緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）である。沈殿物上清に対応し、多すぎる量の塩を含む画分を、カラム上に装填する前に、この緩衝液に対して透析した。塩勾配溶離液により、タンパク質の回収が可能になる。溶出勾配は、カラム平衡化緩衝液中での１００、２００、３００および５００ｍＭ ＮａＣｌの工程により得られる。溶出画分を、ＭＴＴアッセイにより試験する。陽性の画分、すなわち、２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出された画分が、保持される。これらの画分を直ちに処理するか、または冷凍状態で保持する。
【００６１】
−（ｉｉｉ）精製
−溶出させるタンパク質のサイズおよび形状の違いに基づく立体排除クロマトグラフィーを用いた。２００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液に対応する画分を、カラム上に装填した。溶出の過程で、低分子量のタンパク質は残存し、次いで、より大きい分子よりも後に溶出する。精製は、ＴｏｓｏＨａａｓ ＴＳＫ Ｐｒｅｐ Ｇ ３０００ ＳＷカラム（直径２１．５ｍｍ、長さ３００ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ上で行った。分子体積排除限界は、５０００００ダルトンである。用いる溶出緩衝液は、ｐＨ６．８で、１００ｍＭのリン酸、１００ｍＭの硫酸ナトリウムを含む。タンパク質の混合物の分離は、６０分間で行った。１５〜２０，０００ダルトンの質量に対応する画分のみを保持した。この画分を、２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（０．２ｍＭ ＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．２）で透析し、次いで冷凍した。
【００６２】
各工程において、顕著な傷害活性を示す画分を、引き続く工程のために保持した。タンパク質の傷害活性のコントロールを、ＭＴＴアッセイを用いて、各工程において行った。顕著な傷害活性を示す画分のみを、さらなる精製工程のために保持した。
【００６３】
−（ｉｖ）逆相クロマトグラフィーによる尿中タンパク質のさらなる精製
−精製後に得られた、ＭＳ患者由来の尿のプール（ＭＳ陽性プール）および非ＭＳ患者由来の尿のプール（ＭＳ陰性プール）を蒸留水中に入れ、次いで、０．２％ＴＦＡ／１０％のアセトニトリル溶液で希釈して、約１３０〜１４０μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００６４】
Ｃ８逆相ＨＰＬＣによる分離を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社から販売されているＢｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅカラム（商品名）（カラム特性：３００Å／７μｍ／（１００×４．６）ｍｍ）上で行った。陽性プールおよび陰性プールについて、２つの異なるカラムをそれぞれ用いた。注入は、２５０μｍの複数注入により行った。タンパク質を、５％〜１５％の緩衝液Ａの直線勾配で溶出し、次いで、１５％〜１００％の緩衝液Ｂの直線勾配で９５分、０．５ｍｌ／分の流速で溶出した。用いた緩衝液ＡおよびＢは、それぞれ、０．１％ＴＦＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｏ．２８９０４）／ＭｉｌｌｉＱ水緩衝液および０．０９％ＴＦＡ／８０％アセトニトリル（Ｂａｋｅｒ）緩衝液である。検出は、ＵＶ吸光度を２０５ｎｍおよび２８０ｎｍで測定することにより行った。画分を、１．５ｍｌおよび０．５−１ｍｌの目的とする領域にある画分として回収した。回収後、画分を、ドライアイス中で冷凍した。
【００６５】
次いで、回収した画分を、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ中で乾燥させ、１００μｍの０．１％ＴＦＡ／３０％アセトニトリル中に入れた。２０μｌの画分を５００μｌのエッペンドルフ管中に移し、１００μｌのＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄し、次いで再び乾燥させた。
【００６６】
溶出後回収した各画分中に含まれるタンパク質の細胞傷害性を、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。ＭＳ陽性プール中の画分Ｘ７６／４３のみが、インビトロで傷害活性を示す。この画分の数は、実施例で述べる溶出条件の関数としての溶出の順番に対応する。その細胞傷害性は、出願第ＷＯ９８／１１４３９号に記載されるように、マウス星状細胞のＦＡＣＳによりインビトロで確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるそのプロファイルは、５５ｋＤａ、３５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１８ｋＤａ、１４ｋＤａおよび８ｋＤａにおけるタンパク質のバンドを明らかにした。コントロール尿から得られたＭＳ陰性プールの対応する画分Ｘ７６／４３は、ＭＴＴアッセイによっていかなる細胞傷害性も示さなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるそのプロファイルは、５５ｋＤａ、３５ｋＤａおよび２０ｋＤａにおけるバンドを示した。
【００６７】
・ＳＤＳ−ＴＲＩＣＩＮＥゲルにおけるＨＰＬＣ上での分離により得られるタンパク質の分析
ＭＳ陰性プールの画分Ｘ７６／４３のタンパク質含有量およびＭＳ陽性プールの画分Ｘ７６／４３のタンパク質含有量を、ＳＤＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ １６％ゲル上での分離およびゲルの亜鉛／イミダゾール染色後に観察した。
【００６８】
ＨＰＬＣにより得られた画分Ｘ７６／４３回収プールを、予め注いだＳＤＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ １６％ゲル（１０ウェル、厚み１ｍｍ）（Ｎｏｖｅｘ社より販売されている）上に充填した。これらのゲルの使用条件は、供給者の推奨する条件に対応する。サンプルを７５μｌの一回濃縮したサンプル緩衝液（ＳＤＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ Ｎｏ．ＬＣ １６７６、１ｍｌを２回濃縮＋水中で１／２に希釈した５０μｌのβ−メルカプトエタノール（Ｐｉｅｒｃｅ））中に入れ、２５μｌのサンプルを、ゲル上に３回充填した。ＭＳ陰性プール由来の画分Ｘ７６／４３回収プールを、ＭＳ陽性プールについて説明したのと同じ条件下で、ゲル上に装填した。２つのゲル上での移動を、同一の移動タンク（ＸＣＥＬＬ ＩＩ ＮＯＶＥＸ（商品名））中で、１２５ｍＶの一定電圧で２時間行った。タンクを、氷を含む容器中に置いた。移動の直後に、ゲルを、亜鉛／イミダゾール染色（Ｂｉｏｒａｄ社により販売される染色キット１６１−０４４０）により染色し、可逆的ネガティブ染色を得た。
【００６９】
・ゲルバンドのトリプシン消化
画分Ｘ７６／４３の装填により可視化された全てのタンパク質バンドを切り出し、トリプシン溶液中で一晩タンパク質分解に供した。ゲルバンドを、メスを用いて１ｍｍの切片に切り出し、エッペンドルフ管に移した。エッペンドルフ管を遠心分離スパイクにかけて、ゲル片を沈めさせ、遠心分離後、１００μｌの洗浄緩衝液（１００ｍＭ ＮＨ４ＣＯ３／５０％ＣＨ３ＣＮ）をゲル片に加えた。周囲温度で３０分撹拌した後、上清を２０μｌ画分だけ除去し、洗浄工程を２回繰り返した。エッペンドルフ管を、５分間、スピードバク（ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）で乾燥させた。２０μｇのトリプシン（変性配列グレードＰＲＯＭＥＧＡ Ｖ５１１１）（商品名）を２００μｌの消化緩衝液（５ｍＭトリス、ｐＨ８）に入れ、間欠的に撹拌しながら周囲温度で３０分撹拌し、２０〜３０μｌの再懸濁したトリプシンを、ゲル片に添加した。エッペンドルフ管を遠心分離し、温室で２８℃で一晩保存した。消化後、ゲルバンドは、すぐに質量測定または引き続く使用のための冷凍に用いることができる。より高い見かけ分子量のタンパク質は、２つの画分で観察された。一方、見かけ分子が８、１４および１８ｋＤａのバンドは、ＭＳ陽性プールの画分Ｘ７６／４３中でのみ観察可能である。
【００７０】
実施例３：タンパク質のマススペクトル分析および配列決定
・タンパク質分解フラグメントのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析による分析
３０μｌの抽出緩衝液（２％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル）をサンプルに添加する。分析すべきエッペンドルフ管を５分間遠心分離に供し、次いで、５分間超音波処理に供し、最後に、１分間遠心分離に供する。
【００７１】
０．５μｌのマトリックス（アセトン中で飽和したα−シアノ−４−ヒドロキシトランス桂皮酸）の１４個の堆積物を、ステンレス鋼ディスク上で作製する。薄い均一の微結晶層を得る。０．５μｌの２％ＴＦＡ／水の溶液を、この１４個の堆積物上の下塗り層上に堆積し、次いで、分析すべきサンプルを０．５μｌ添加する。０．５μｌのα−シアノ−４−ヒドロキシトランス桂皮酸の５０％アセトニトリル／水中飽和溶液を、このように形成したこの液滴に添加する。周囲温度で３０分乾燥した後、結晶堆積物を２μｌの水で洗浄し、すぐに空気ブラストで除去する。全てのスペクトルは、リフレクトロンを備えたＢＲＵＫＥＲ ＢＩＦＬＥＸマススペクトル分析器（商品名）で得る。マトリックスサンプルサンドウィッチ中に存在する全てのペプチドのうち最も代表的なマススペクトルを得るために、測定（全堆積物に対し、９０〜１２０回のレーザー発射）を蓄積して、１００ｐｐｍ未満の測定精度を用いることを可能にするため、各堆積物について、トリプシン自動分解ペプチドを用いて校正を行った。
【００７２】
マススペクトル分析の結果を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ）のＭ５−ＦＩＴアルゴリズムを用いるデータバンクによりサーチした。
【００７３】
・消化ペプチドのＮ−末端配列決定
−（ｉ）消化ペプチドのＨＰＬＣによる抽出および分離
トリプシンでの消化後に得られたペプチドを、超音波処理浴中で、０．１％ＴＦＡ／６０％アセトニトリルを用いて、３回、３０分間抽出した。抽出溶液を合わせ、スピードバック中で乾燥させて２０μｌにした。８０μ１の緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）中で希釈した後、トリプシンで消化したゲルバンドの抽出物を、Ｃ１８／ＭＺ−Ｖｙｄａｃ／（１２５×１．６）ｍｍ／５μｍカラム（商品名）に注入した。ペプチドを、１５０μｌ／分の流速および５％の緩衝液Ｂ（０．０９％ＴＦＡ／８０％アセトニトリル）〜４０％の緩衝液Ｂの範囲内の勾配で４０分間溶出し、次いで、４０％の緩衝液Ｂ〜１００％の緩衝液Ｂの勾配で１０分間溶出した。２０５ｎｍをＵＶ吸光度で測定することにより、検出を行った。ピークを５００μｌのエッペンドルフ管中に集めた。次いで、集めた個々のペプチドのピークを、Ｎ−末端アミノ酸配列分析に供した。
【００７４】
−（ｉｉ）Ｎ−末端配列決定：
単一のマスピークに対応する画分を、配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒモデル４７７Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのＥｄｍａｎ分解により分析した。配列決定条件は、製造者により記載されたとおりであった。サンプルを装填するためにマイクロカートリッジを用い、ＰＴＨ−アミノ酸を、オンラインＨＰＬＣシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒモデル１２０Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて同定した。
【００７５】
・結果
マススペクトル分析および配列決定による分析の結果を、下記の表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
ＭＷ：平均分子量
ＩＭＳ：マススペクトル分析による同定
ＩＳ：配列決定による同定
ＮＩ：同定されない残りのピーク
ＮＤ：検出されず
＊：尿中の完全な４６７ｋＤａタンパク質の前タンパク質分解から、または精製工程の間におそらく得られるであろうパールカンの２０ｋＤａ Ｃ−末端フラグメントと同一である。
【００７８】
共に精製されたタンパク質の混合物もまた、最終ＭＳ精製画分中および対応するコントロール画分中の両方に存在した。これらの２つの画分にグリア傷害活性が存在しないことにより、これらの２つのサンプル中で同定されたタンパク質は無関係であると考えられた。
【００７９】
結果として、ＧＭ２ＡＰ（１８ｋＤａ）、ＭＲＰ１４またはカルグラニュリンＢ（１４ｋＤａ）、およびサポシンＢ（１０ｋＤａ）は、グリア傷害活性についての可能性のある候補と考えられた。
【００８０】
さらに、ＭＳ画分中の１８ｋＤａバンドのトリプシン消化されたフラグメントのＮ−末端配列決定は、ＧＭ２ＡＰの種々の位置における多形の存在を示した；アラニンがトレオニンで置換されている、ＧＭ２ＡＰアミノ酸配列の１９位におけるエキソン１での変異；アスパラギン酸がフェニルアラニンで置換されている、ＧＭ２ＡＰアミノ酸配列の４０位におけるエキソン２での変異。この変異は、正常または罹患したドナーのゲノムＤＮＡで観察されたことはなかった；ＧＭ２ＡＰアミノ酸配列のそれぞれ５９位および６９位におけるエキソン２での他の２つの変異は、イソロイシンのバリンでの置換およびメチオニンのバリンでの置換にそれぞれ対応する。正常個体（血液ドナー）および多発性硬化症に罹患した患者由来のリンパ球のゲノムＤＮＡの種々のラウンドの配列決定の後、ＧＭ２ＡＰアミノ酸配列の１５３位でのバリンのアラニンでの置換からなるエキソン４での変異は、これまで記載されていない新規な多形であることが見出された。このエキソン４での変異は、試験した２７名のＭＳ患者のうち３名で見出され、２７名のコントロール個体のうち８名でも見出されたが、正常多形を示唆する。他の変異は、リジンがグルタミンで置換されたＧＭ２ＡＰアミノ酸配列の１７１位のエキソン４で見出された。
【００８１】
ＧＭ２ＡＰおよび変異ＧＭ２ＡＰのアミノ酸配列は、それぞれ、配列同定装置により配列番号１および配列番号２で表され、これらの２つの配列番号１および配列番号２において、バリンまたはアラニンは、１５３位において識別することなく見出すことができることが理解される。なぜなら、この位置でのエキソン４の変異は、正常多形を示唆するからである。
【００８２】
実施例４：組み換えタンパク質
組み換えタンパク質（購入するか、または形質転換で産生した）を用いて、候補タンパク質のグリア傷害性の可能性を評価した。
【００８３】
以下の「非ヒト」タンパク質、すなわち、発現すべきインサートを含むプラスミドを用いた形質転換により、または発現すべきインサートと一体化した、バキュロウイルスに感染した酵母または昆虫細胞における真核生物発現系により、原核生物発現系（大腸菌）において産生した組み換えタンパク質：
【００８４】
大腸菌中で産生した、Ｎ−末端位置でヒスチジン尾部と融合したＭＲＰ１４タンパク質（またはカルグラニュリンＢまたはＳ１００Ａ９）；大腸菌中で産生した、ＭＲＰ８タンパク質（またはカルグラニュリンＡまたはＳ１００Ａ８）；およびＣ．Ｋｅｒｋｈｏｆｆ博士（Ｍｕｎｓｔｅｒ大学、ドイツ）から購入した天然ヒトヘテロ複合体ＭＲＰ１４／ＭＲＰ８（またはカルプロテクチン）。
【００８５】
Ｋ Ｓａｎｄｈｏｆｆ教授（Ｋｅｋｕｌｅ研究所、Ｂｏｎｎ大学、ドイツ）から購入した、酵母中で産生した、Ｎ−末端位置でヒスチジン尾部と融合したＧＭ２ＡＰタンパク質（ガングリオシドＧＭ２−活性化前駆体）およびＳａｐＢ（サポシンＢ）タンパク質。
【００８６】
これらのタンパク質は、文献に記載の自らの生理学的活性を有する。
【００８７】
「ヒト」タンパク質（すなわち、発現すべきインサートと一体化した、適切なプラスミドを用いて形質転換したヒト細胞の真核生物発現系により産生した組み換えタンパク質）は、下記のプロトコールに従って産生された。
【００８８】
２９３Ｔ細胞（ラージＴ抗原を発現する、５型アデノウイルスを用いて形質転換した一次ヒト胚腎細胞）を、３７℃、湿潤雰囲気下、５％ＣＯ２で、ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌのＤ−グルコース（１０％の脱補体仔ウシ血清（ＦＣＳ）、グルタマックス（５８０ｍｇ／ｌ）、ペニシリン（５００単位／ｌ）およびストレプトマイシン（５５０μｇ／ｌ）を補充）中で培養した。
【００８９】
一時的な形質転換を行うため、目的のタンパク質のｃＤＮＡを含む適切なプラスミド、ＭＲＰ１４、ＧＭ２ＡＰ、およびＮ−末端位置の分泌ペプチド（ＩｇＫ）から始まる変異ＧＭ２ＡＰ（アスパラギン酸／フェニルアラニン／４０位）を用いた。
【００９０】
２９３Ｔ細胞を、脂質から構成され、ＤＮＡを複合体化しかつ細胞内に輸送する「形質転換物」試薬を用いて形質転換した。２９３Ｔ細胞をトリプシン化し、７５ｃｍ２フラスコ１つ当たり２００万個の細胞を播種し、３７℃で、５％ＣＯ２湿潤雰囲気で、１０ｍｌの培養培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌのＤ−グルコース、１０％の脱補体仔ウシ血清（ＦＣＳ）、グルタマックス（５８０ｍｇ／１）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充）中で一晩インキュベートした。
【００９１】
３／２［形質転換物の体積（μｌ）／プラスミドＤＮＡの量（μｇ）］の比で、１ｍｌのＦＣＳ非含有媒体を用いて、形質転換溶液をその場で調製する。
【００９２】
周囲温度での接触の４５分後、形質転換溶液を、非コンフルエントな細胞層に滴下する。
【００９３】
５％ＣＯ２湿潤雰囲気中での３７℃での７２時間のインキュベーション後、上清を回収し、１０分間、２５００ｒｐｍで遠心分離する。
【００９４】
次いで、タンパク質の定量を、ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＡＧ，Ａｕｇｓｔ（スイス）から販売されているＭＲＦ Ｅｎｚｙｍｅ免疫アッセイキット（商品名）を用いて、ヒト組み換えＭＲＰ１４タンパク質に関するインフォメーションシートに従って行うか、または抗ＧＭ２ＡＰウサギポリクローナル抗体を用いる準定量的Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング技術を用いて行った。これらの技術は、相対比較のための表示値を与える。
【００９５】
この産生に由来する粗上清は、特に、傷害活性および検出アッセイに用いられる。
【００９６】
実施例５：「非ヒト」タンパク質の傷害性
「非ヒト」組み換えタンパク質ＭＲＰ１４、ＭＲＰ８、ＧＭ２ＡＰおよびＳａｐＢの傷害性を、ＭＴＴアッセイにより評価した。
【００９７】
タンパク質を、種々の尿中の各タンパク質の濃度の評価から規定される範囲内で試験した。範囲は、種々の緩衝液中（ＴＵＣ溶液中、または２つの型の尿（ＭＴＴアッセイで傷害性であった、多発性硬化症に罹患した患者由来の尿（ＭＳ尿）、およびＭＴＴアッセイで傷害性ではなかった、非ＭＳドナーの採用者由来の尿（正常尿））中のいずれか）で、作製した。尿は、予め５６℃で３０分間処理し、濾過した。
【００９８】
結果は、それぞれ、ＴＵＣ溶液中および正常尿中で試験したタンパク質が、ＭＴＴアッセイにより傷害性ではないことを示す。ＧＭ２ＡＰ、ＭＲＰ１４およびサポシンＢタンパク質の顕著な効果は、ＭＳ尿中で、ＭＴＴアッセイによっては示されない。傷害性の阻害は、３ｎｇまたはそれ以上のＭＲＰ８用量により記録される。
【００９９】
これらの結果を、表２に示す。
表２Ａ：ＴＵＣ溶液の範囲
表２Ｂ：尿中の範囲
【０１００】
【表２Ａ】
【０１０１】
【表２Ｂ】
【０１０２】
ＭＲＰ１４およびＭＲＰ８については、細胞傷害百分率は、２回のアッセイの平均細胞傷害百分率である
ＮＤ：測定されず
＊他のＭＳ尿については、同等の傷害性の阻害が観察される。
【０１０３】
次いで、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４、サポシンＢ／ＭＲＰ１４およびサポシンＢ／ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４タンパク質の組み合わせは、ＴＵＣ溶液中および上記の２つのタイプの尿中でで調製した。「コントロール」の組み合わせでは、種々のＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／８、サポシンＢ／ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ８の組み合わせ中のＭＲＰ１４タンパク質を、ヘテロ複合体ＭＲＰ１４／８またはＭＲＰ８タンパク質で置き換えた。「コントロール」の組み合わせは、同様の様式で調製した。全ての組み合わせを、ＭＴＴアッセイを用いてそれらの傷害性を試験する前に、一晩、４℃でインキュベートした。
【０１０４】
結果を表３に示す。
表３Ａ：ＴＵＣ溶液の範囲
【０１０５】
【表３Ａ】
【０１０６】
ＭＲＰ１４／８：ヒト天然へテロ複合体
Ｓａｐ．Ｂ：サポシンＢ
＊２つのアッセイの平均
【０１０７】
表３Ａに示す結果は、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／８、サポシンＢ／ＭＲＰ１４およびＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／サポシンＢの組み合わせは、試験した量にかかわらず、ＴＵＣ中で傷害性効果を有しないことを示す。ＧＭ２ＡＰ（１０ｎｇ）／ＭＲＰ１４（０．５ｎｇ）の組み合わせのみが、傷害性を示すように思われるが、この傷害活性は、２回の追加の比較アッセイでは引き続いて見出されなかった。さらに、追加のアッセイを、種々の量のＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４を用いる組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４を用いて行われた。得られた結果は、組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４が、試験した量にかかわらず、ＴＵＣ中で傷害性効果を有しないことを示す。
表３Ｂ：正常尿中での範囲
【０１０８】
【表３Ｂ】
【０１０９】
Ｓａｐ．Ｂ：サポシンＢ
表３Ｂから明らかなように、組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４は、正常尿中で傷害性である。なぜなら、傷害性は、ＧＭ２ＡＰタンパク質の量の増加の関数として増加するからである。しかしながら、この傷害性は、比較的不安定でかつ比較的再現しにくいように思われ、また、尿サンプルに依存するように思われる（表３Ｂにおける正常尿１と正常尿２との間での細胞傷害百分率の比較を参照されたい）。
【０１１０】
組み合わせサポシンＢ／ＭＲＰ１４は、正常尿の有意性の限界にある。
【０１１１】
組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／サポシンＢを用いて得られた結果は、解釈するのが難しい。
【０１１２】
ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４およびサポシン／ＭＲＰ１４タンパク質の組み合わせの傷害性もまた、正常尿および多発性硬化症に罹患した患者由来の傷害性尿（ＭＳ尿）に関して試験した。
【０１１３】
結果を表３Ｃに示す。
表３Ｃ：非ＭＳ尿およびＭＳ尿中の範囲
【０１１４】
【表３Ｃ】
【０１１５】
Ｓａｐ．Ｂ：サポシンＢ
組み合わせサポシンＢ／ＭＲＰ１４は、試験した量にかかわらず正常尿中およびＭＳ尿中で傷害性効果を有しない。
【０１１６】
組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４は、正常尿１に関してはいかなる傷害性効果も示さないが、正常尿２に関して傷害性効果を示す（ＧＭ２ＡＰが増加すると、尿の傷害性が増加する）。さらに、ＭＳ尿については逆の効果がみられた。ＭＲＰ１４の量が増加すると、尿の傷害性は減少する。
【０１１７】
実施例６：「ヒト」タンパク質の傷害性
実施例３に記載のように産生したタンパク質ＧＭ２ＡＰ、エキソン２で変異したＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４を、それらを含む２９３Ｔ細胞由来の培養上清を用いて、ＭＴＴアッセイにより、それらの傷害性を試験した。
【０１１８】
２９３Ｔ細胞培養上清を用いて、以下の組み合わせもまた実施した：ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰｌ４、変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰｌ４、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／ＭＲＰ８。調製した組み合わせを、引き続いて４℃で一晩インキュベートし、次いで、それらの傷害性を、ＭＴＴアッセイにより試験した。
結果を表４に示す。
【０１１９】
【表４Ａ】
【０１２０】
％Ｃ：細胞傷害百分率
ＮＤ：測定されず
上清中のタンパク質のおよその濃度：ＭＲＰ１４バッチ１および２：３５０ｎｇ／ｍｌ；ＧＭ２ＡＰバッチ１：３００ｎｇ／ｍｌ、バッチ２：２００ｎｇ／ｍｌ
【０１２１】
太字で示した特定の値については、いくつかのＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４の組み合わせは、細胞傷害性が弱く（２０〜３０％の細胞傷害性）、組み合わせＧＭ２ＡＰ（２０ｎｇ）／ＭＲＰ１４（０．５ｎｇ）に最適である。
【０１２２】
ＭＲＰ１４は、単独では、細胞傷害性ではない。バッチ２で行われたアッセイ１および２では、非常に弱い傷害性が観察されるが、ＧＭ２ＡＰ単独では細胞傷害性であるとは考えられない。なぜなら、再現可能性が上清産生バッチに依存するので、完全ではあり得ないからである。
【０１２３】
【表４Ｂ】
【０１２４】
％Ｃ：細胞傷害百分率
ＮＤ：測定されず
ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４の上清中でのおよその濃度：２μｇ／ｍ１
拒絶：サンプルのＯＤ値の標準偏差が５０より大きいために拒絶された、％細胞傷害百分率
＊：サンプルのＯＤ値の標準偏差が１６と１１との間にある
コメントなし：サンプルのＯＤ値の標準偏差が１０未満である
【０１２５】
結果は、タンパク質単独では、上清中で、非常に多い量（１００ｎｇのＭＲＰ１４）での非特異的様式を除いては、傷害性ではないことを示す。組み合わせＧＭ２ＡＰ（１００ｎｇ）／ＭＲＰ１４（１００ｎｇ）のみが、相対的な細胞傷害性を示すと考えることができる。
【０１２６】
ＧＭ２ＡＰタンパク質をこの組み合わせで変異ＧＭ２ＡＰタンパク質と置き換えた場合、下記に示すように、特定の混合物について同じタイプの傷害性が得られる。
【０１２７】
【表４Ｃ】
【０１２８】
％Ｃ：細胞傷害百分率
＊：ＯＤの標準偏差が１４と１１との間にある
コメントなし：サンプルのＯＤ値の標準偏差が１０未満である
上清中でのタンパク質のおよその濃度：変異ＧＭ２ＡＰ：２００ｎｇ／ｍｌ；ＭＲＰ１４：３５０ｎｇ／ｍｌ
【０１２９】
太字で示した多くの値について、組み合わせ変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４は傷害性である。変異ＧＭ２ＡＰタンパク質単独では、細胞傷害性効果を有しない。ＭＲＰ１４単独では、細胞傷害活性を示すとは考えられない。
【０１３０】
ヒト組み換えタンパク質、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４および変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４を含む上清の組み合わせの細胞傷害性は、規模が同じであり、タンパク質産生バッチの関数として、非ヒト組み換えタンパク質よりも高い安定性を示すことが見出される。しかしながら、これは、ＭＳ患者の生物学的流体中で見出されるグリア傷害活性の安定性、再現可能性および強度に対応しない。
【０１３１】
【表４Ｄ】
【０１３２】
％Ｃ：細胞傷害百分率
上清中のタンパク質のおよその濃度：ＧＭ２ＡＰ（バッチ１）：３００ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ２ＡＰ（バッチ２）：２００ｎｇ／ｍｌ。天然ＭＲＰ１４／８の濃度：１．３ｍｇ／ｍｌ。
【０１３３】
表４Ｄの結果から、ＧＭ２ＡＰ単独では細胞傷害活性を有しないこと、および太字で示した特定の値については、組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／ＭＲＰ８は細胞傷害性効果を有することがわかる。この細胞傷害性は、用いる上清バッチに依存する。
【０１３４】
【表４Ｅ】
％Ｃ：細胞傷害百分率
上清中のタンパク質のおよその濃度：変異ＧＭ２ＡＰ：２００ｎｇ／ｍｌ。天然ＭＲＰ１４／８の濃度：１．３ｍｇ／ｍｌ。
【０１３５】
表４Ｅから、組み合わせ変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／ＭＲＰ８は細胞傷害活性を全く示さないことが明らかである。
【０１３６】
これらの研究は、再生されたＭＳ尿のみから精製されたグリア傷害性画分中では、所望のグリア傷害活性を有するタンパク質は単独で同定されず、また、目的とするグリア傷害活性および「非ヒト」または「ヒト」組み換えの形態で産生されるタンパク質の組み合わせは、弱くかつ比較的再現不可能な（たとえ、改善が「ヒト」組み合わせについて見出されても）グリア傷害活性しか示さないことを示す。得られた結果は、グリア傷害活性（高い活性、安定性、再現可能性、用量−応答効果）を特徴付ける全ての基準に適合していない。
【０１３７】
結果は、タンパク質分析で同定されなかった必須成分が欠けていることを示す。
【０１３８】
次いで、本発明者らは、驚くべきことに、特定の複合体脂質中の脂質は、本文脈で有利な候補であることを見出した。これを実証するため、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＭ２およびスルファチドを試験した。以下の実施例に示すように、これらの脂質のなかでも、ガングリオシドＧＭ２は、唯一の証明力となるものであったことが判明した。
【０１３９】
実施例７：ガングリオシドＧＭ２との組み合わせにおける「ヒト」組み換えタンパク質の傷害性
ガングリオシドＧＭ２（Ｊ．Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ教授（Ｌｙｏｎ、フランス）により提供された）を、最終濃度５０μｇ／ｍｌで、既に調製したＭＲＰ１４、ＧＭ２ＡＰおよび変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を含む「ヒト」組み換えタンパク質の組み合わせに添加した。
【０１４０】
組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４および変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４を、ＧＭ２ＡＰおよび変異ＧＭ２ＡＰ組み換えタンパク質についてタンパク質範囲：０、５、１０、２０、５０、１００ｎｇで、およびＭＲＰ１４タンパク質について２００ｎｇまでのタンパク質範囲で、試験した。これらの範囲は、ガングリオシドＧＭ２との組み合わせで、または組み合わせにすることなく、調製した。
【０１４１】
混合した後、組み合わせを一晩４℃でインキュベートし、次いで、それらの傷害性をＭＴＴアッセイを用いて評価した。
【０１４２】
得られた結果を、表５および添付の図面に記載する。
表５Ａ：
ガングリオシドＧＭ２と組み合わせられかつ関連する「ヒト」タンパク質のグリア傷害活性の測定（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）
【０１４３】
【表５Ａ】
【０１４４】
％Ｃ：細胞傷害性百分率
ｇＧＭ２：ガングリオシドＧＭ２
＊：サンプルの標準偏差ＯＤが１３と１１との間にある
コメントなし：サンプルの標準偏差ＯＤが１０未満
上清中のおよその濃度：ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４：２μｇ／ｍ１
【０１４５】
一定濃度のガングリオシドと組み合わせた組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４は、ＭＲＰ１４タンパク質の量と平行して増加するグリア傷害性効果を示す。さらに、ＧＭ２ＡＰタンパク質の量（２０および１０ｎｇ）を増加させるため、段階的に増加する典型的な用量応答効果が得られる。しかしながら、終点では、十分なＭ２ＡＰタンパク質がない場合（５ｎｇ）、傷害性はみられない。逆に、ＧＭ２ＡＰタンパク質が多すぎる場合（５０ｎｇおよび１００ｎｇ）、６０％付近で水平状態にある傷害性の飽和がみられる。事実として、グリア傷害性因子に曝露する間の培養における増殖を受けるＣＬＴＴ１−１細胞のみが感受性である。このことは、グリア傷害性の水平状態が１００％に到達しない理由を説明する。
表５Ｂ：
ガングリオシドＧＭ２と組み合わせたまたは組み合わせていない、組み合わせ「ヒト」タンパク質のグリア傷害活性の測定（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）
【０１４６】
【表５Ｂ】
【０１４７】
％Ｃ：細胞傷害百分率
ｇＧＭ２：ガングリオシドＧＭ２
＊：サンプルの標準偏差ＯＤが１３と１１との間にある
コメントなし：サンプルの標準偏差ＯＤが１０未満
【０１４８】
ガングリオシドＧＭ２なしでは、組み合わせ変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４はグリア傷害性ではない。ガングリオシドなしの組み合わせと比べて、ガングリオシドＧＭ２を有する混合物の細胞傷害性には全体的な増加が観察される。測定の変動性は、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を用いたときのほうが明らかに大きい。全体的に、活性は顕著であり、２つの変数（変異ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４）を用いた用量効果に従って最大濃度の水平状態（例：上述した、アッセイの間の増殖を受けた細胞のプールで到達する最大値）に到達するように思われる。
【０１４９】
ガングリオシドＧＭ２の作用が、ヒト組み換えタンパク質ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４（５ｎｇのＭＲＰ１４および５０ｎｇまたは１００ｎｇのＧＭ２ＡＰ）の組み合わせの傷害性に実際に特異的であるかどうかを決定するため、他の脂質：（ガングリオシドＧＭ１およびスルファチド）を並行して試験した。用いた濃度範囲は、最終濃度が０、１０、２０、３０および５０μｇ／ｍｌである。脂質を添加すると、組み合わせを４℃で一晩インキュベートし、次いで、それらの傷害性をＭＴＴアッセイにおいて評価する。表５Ｃおよび５Ｄに示す結果は、用量が３０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４については、ガングリオシドＧＭ２との組み合わせのみが、グリア細胞に対する傷害性（それぞれ２７％および３０％）を示した。他の脂質は、タンパク質組み合わせを用いて傷害性を示さない。
表５Ｃ：組み合わせ「ヒト」組み換えタンパクＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４のグリア傷害活性におけるガングリオシドＧＭ２の影響
【０１５０】
【表５Ｃ】
【０１５１】
１００ｎｇ ＧＭ２ＡＰについては、これは２回のアッセイの平均である。
ｇＧＭ２：ガングリオシドＧＭ２
【０１５２】
表５Ｄ：組み合わせ「ヒト」組み換えタンパク質のグリア傷害活性におけるガングリオシドＧＭ２の影響
【０１５３】
【表５Ｄ】
【０１５４】
研究の結果は、
活性が、ＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４タンパク質を含むタンパク質ヘテロ複合体と関連すること；
ガングリオシドＧＭ２のような脂質の添加が、目的とするグリア傷害活性の産生と適合した活性、再現可能性および用量応答効果のレベルを得ることを可能にすること；
ＧＭ２ＡＰタンパク質に見いだされる変異は、インビトロでのグリア傷害性の決定論に必須ではないことを示す。
【０１５５】
しかしながら、これは、インビボでは、ＧＭ２ＡＰタンパク質のバイオアベイラビリティーのプロセスに必要かどうかを決定するものとなり得る（例、中枢神経系の細胞外媒体）。
【０１５６】
従って、これらの因子は、ガングリオシドＧＭ２と組み合わせたヘテロ複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２ＡＰまたはＭＲＰ１４／変異ＧＭ２ＡＰは、主に、または単独であっても、グリア傷害活性のベクターであることを示す。
【０１５７】
実施例８：グリア傷害性複合体の免疫アッセイの開発−ＥＬＩＳＡアッセイの前のサンプルの調製
（ｉ）試験したサンプル
試験したサンプルは：
最初に、活性の組み換え複合体を検出するための、可能ならば正常尿中で希釈された、ガングリオシドＧＭ２と組み合わせたまたは組み合わせていない、ヒト組み換えタンパク質（ＧＭ２ＡＰ＋ＭＲＰ１４）であり、
次に、尿中での直接検出のための正常尿およびＭＳ尿である。
【０１５８】
サンプルを調製するとすぐに、検出アッセイのために４℃で２４時間インキュベートした。
【０１５９】
「ヒト」組み換えタンパク質を粗製上清の形態で用い、２９３Ｔ細胞を適切なネガティブコントロールを用いて平行に一時的に形質転換した後に回収する。ＭＲＰ１４およびＧＭ２ＡＰタンパク質をアッセイするのに用いられるシステムは、準定量的であり、特定される量は指示的である。結果を以下の実施例に示す。
【０１６０】
（ｉｉ）サンプルの処理
以下の実施例に示すように、「サンドウィッチ」ＥＬＩＳＡ様式で抗ＭＲＰ１４および抗ＧＭ２ＡＰ抗体を用いる検出方法により、陽性の結果を得ることが可能になる。
【０１６１】
しかしながら、本発明者らは、タンパク質をプロテイナーゼＫの存在下で消化することからなる工程、次いでトリクロロ酢酸を用いて沈殿させる元の方法により、このプロテイナーゼを不活性化することからなる工程、次いで、ｐＨをトリス−マレイン酸緩衝液（引き続くサンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイとの適合性を有するために選択された）で中和することからなる工程を含むサンプルの前処理を行うことにより、この検出方法を最適化した。
【０１６２】
このサンプルの処理は、その種々の工程により独自のものであるが、引き続いて以下の実施例で示される分析に適用され、これを以下に詳細に説明する。
【０１６３】
複合体の検出の前に、以下のプロトコールに従い、サンプル（組み換えタンパク質または尿の混合物）をプロテイナーゼＫで処理する：
【０１６４】
サンプル１００μｌ当たり０．３ｍｇのプロテイナーゼＫを添加する。３７℃で１時間の消化後、プロテイナーゼＫの活性を阻害するため、トリクロロ酢酸を用いて沈殿を行う。９０％トリクロロ酢酸（４８ｍｌの蒸留水当たり９０ｇのトリクロロ酢酸）をサンプルに添加する（サンプルの初期体積の１５％）。混合物を４℃で３０分インキュベートした。
【０１６５】
１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、ペレットを、サンプルの初期体積と等しい体積で、０．２ｍトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．２）（濃度ファクターなしのアッセイの場合）と共に、または（体積の観点から、消化されていないタンパク質の濃縮を実施するための）任意の最小体積で取り出す。
【０１６６】
プロテイナーゼＫで処理したサンプルをＷｅｓｔｅｒｎブロッティング技術により確認した後、観察を行うことができ、処理はプロテイナーゼＫの量およびその作用時間を増加させることにより最適化することができる。
【０１６７】
実施例９：サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイにおいてヘテロ複合体を検出するためのプロトコール
（ｉ）抗体の産生：下記のプロトコールに従い、以下の抗体を産生した：
−ポリクローナル抗体（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）：
−ウサギポリクローナル抗体１９６（抗ＭＲＰ１４ペプチド）
−ウサギポリクローナル抗体７９（抗組み換えＧＭ２ＡＰタンパク質）
−モノクローナル抗体（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）：
−４Ａ７Ｂ１０
−５Ｈ７Ｃ１０
−２Ｂ９Ｈ２
−１０Ｅ１１Ａ１１
−１３Ｈ９Ｃ９
−１９Ｃ１１Ｃ１０
−１３Ｄ１Ｅ５
−２Ｇ１２Ｈ５。
【０１６８】
抗ＧＭ２ＡＰモノクローナル抗体：１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０および２Ｇ１２Ｈ５。
マウスを、以下のプロトコールに従って免疫化した：第０日に、７５μｇの複合体ＧＭ２ＡＰ−ＭＲＰ１４を、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下で腹腔内注射した。第２３日および第３７日に、同量の複合体ＧＭ２ＡＰ−ＭＲＰ１４を、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下でさらに腹腔内注射した。融合の４日前に、生理食塩水中で希釈した５０μｇのＧＭ２ＡＰ抗原を静脈内注射した。
【０１６９】
１９００の上清を、間接的ＥＬＩＳＡ技術によりスクリーニングした。プレートを、１００μｌの抗原（複合体ＧＭ２ＡＰ−ＭＲＰ１４）を用いて、１μｇ／ｍｌで、０．０５ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で「コーティング」した。「コーティング」されたプレートを、１８−２２℃の温度で一晩インキュベートした。プレートを、２００μ１のＰＢＳ−ｌ％牛乳で飽和させ、３７℃＋／−２℃で１時間インキュベーションに供した。１００μｌの上清またはＰＢＳ緩衝液−０．０５％ツイーン２０中の腹水流体を添加し、プレートを３７℃＋／−２℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液−ｌ％ＢＳＡ中で１／２０００に希釈したアルカリフォスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｆ：１１５−０５５−０６２）に複合体化した１００μｌのヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体を添加し、次いで、プレートを、３７℃＋／−２℃で１時間インキュベートした。ＤＥＡ−ＨＣｌ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ｒｅｆ ６０００２９８９）中で２ｍｇ／ｍｌの濃度（ｐＨ＝９．８）の１００μｌのＰＮＰＰ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ｒｅｆ ６０００２９９０）を添加した。プレートを３７℃＋／−２℃で３０分インキュベーションに供した。１００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加することにより、反応をブロックした。各工程間で、３００μｌのＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０を用いて、３回の洗浄を行った。ＰＮＰＰを添加する前に。蒸留水中で追加の洗浄を行った。
【０１７０】
１５０個の上清は、間接的ＥＬＩＳＡにより、ＯＤ＞０．９の陽性であることが見出された。特異的アッセイ後、上記５つの抗体が産生される。
【０１７１】
抗ＭＲＰ１４モノクローナル抗体：２Ｂ９Ｈ２、４Ａ７Ｂ１０および５Ｈ７Ｃ１０。
マウスを、以下のプロトコールに従って免疫化した：第０日に、７５μｇの複合体ＧＭ２ＡＰ−ＭＲＰ１４を、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下で腹腔内注射した。第２３日および第３７日に、同量の複合体を、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下で腹腔内注射した。融合の４日前に、生理食塩水中で希釈した５０μｇのＭＲＰ１４抗原を静脈内注射した。
【０１７２】
１１００個の上清を、上述のように、間接的ＥＬＩＳＡ技術により試験およびスクリーニングした。３００個の上清は、ＯＤ＞１の陽性であることが見出された。特異的アッセイ後、上記３つの抗体が産生された。
【０１７３】
ウサギポリクローナル抗体７９（抗組み換えＧＭ２ＡＰタンパク質）。
ウサギを、以下のプロトコールに従って免疫化した：第０日に、１０ｍｌの第一の血液サンプルを取り、７５μｇのＧＭ２ＡＰを、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）（７５μｇの免疫原＋ｑｓ ０．５ｍｌの９°／００生理学的食塩水＋０．５ｍｌ ＣＦＡ）の存在下で腹腔内注射した。第２８日および第５６日に、同量の免疫原を、０．５ｍｌの不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）の存在下、同様の条件下で腹腔内注射した。第６３日に、３０ｍｌの第二の血液サンプルを、抗凝固剤なしで耳から採取した。第７０日に、第三の血液サンプルを、同様の条件下で採取した。
【０１７４】
ウサギポリクローナル抗体１９６（抗ＭＲＰ１４ペプチド）。
ウサギを、以下のプロトコールに従って免疫化した：
第０日に、１０ｍｌの第一の血液サンプルを取り、８０μｇの免疫原を、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）（８０μｇの免疫原＋ｑｓ ０．５ｍｌの９°／００生理学的食塩水＋０．５ｍｌ ＣＦＡ）の存在下で腹腔内注射した。第２８日および第５６日に、同量の免疫原を、０．５ｍｌの不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）の存在下、同様の条件下で腹腔内注射した。第６３日に、３０ｍｌの第二の血液サンプルを、抗凝固剤なしで耳から採取した。第７０日に、第三の血液サンプルを、同様の条件下で採取した。
【０１７５】
これらの抗体を、捕捉または検出のために用いる。これらをサンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイにおける検出に用いる場合、抗体をビオチニル化する。
【０１７６】
（ｉｉ）サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイ：
サンプル（プロテイナーゼＫおよびＴＣＡ沈殿物）の処理を行う場合、４℃での一晩のインキュベーションの後でかつサンドウィッチＥＬＩＳＡ検出アッセイの前に行う。
【０１７７】
捕捉抗体を、炭酸−重炭酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．５）中、１μｇで「コーティング」する；１００μｌを、９６−ウェルマイクロプレートのウェルに入れる。プレートを保護フィルムで覆い、周囲温度で一晩インキュベートする。ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）−０．０５％ツイーン中での３回の洗浄後、非特異的部位をＰＢＳ−０．０５％ツイーン、モノクローナル抗体用のヤギ血清（１／１０）またはポリクローナル抗体用の１００μｌのカゼイン加水分解物でブロックする。ＰＢＳ−０．０５％ツイーンでの３回の洗浄後、処理したまたは非処理のサンプルを、ウェル当たり１００μｌの割合で入れ、撹拌しながら３７℃で１時間３０分インキュベートした。
【０１７８】
ＰＢＳ−０．０５％ツイーンでの３回の洗浄後、１００μｌのビオチニル化検出抗体を、１μｇ／ｍｌで各ウェルに入れ、３７℃で１時間３０分インキュベートする。
【０１７９】
ＰＢＳ−０．０５％ツイーンでの３回の洗浄後、シグナルを増幅するため、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）に結合した１００μｌのストレプトアビジンを０．２μｇ／ｍｌで各ウェルに入れ、３７℃で１時間３０分インキュベートする。
【０１８０】
ＰＢＳ−０．０５％ツイーンでの３回の洗浄後、１００μｌのＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン二塩酸）溶液を、２ｇ／ｌで各ウェルに入れ、周囲温度で１０分インキュベートする。反応を１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止する。光学密度を４９２ｎｍで読み取る。
【０１８１】
同様に、抗ヘテロ複合体抗体、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４の産物を、ＢＡＬＥ／ｃマウスを腹腔内注射により免疫化するための免疫原として用いる。第一の注射は、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて行う。他の注射は、４〜８週の間隔で、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて行う。最終追加抗原を、生理食塩水中での融合の数日前に与える。この抗原追加後、免疫化マウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞を回収する。次いで、脾臓細胞と骨髄腫株との融合を行い、免疫化に用いられるヘテロ複合体をＥＬＩＳＡにより認識する抗体を分泌する細胞を選択する。最後に、免疫ヘテロ複合体に特異的な抗体を産生する、すなわち、ＧＭ２ＡＰ、変異ＧＭ２ＡＰまたはＭＲＰ１４はいずれも単独では認識しない、クローンを選択する。
【０１８２】
実施例１０：ヒト組み換えヘテロ複合体の検出
以前の実施例で分子的に特徴付けられたグリア傷害活性の酵素免疫アッセイは、関与するタンパク質（ＧＭ２ＡＰ、変異ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４タンパク質）のみを用いる抗原／抗体系、およびこの分子複合体を検出し得る（単独または組み合わせの）抗体を含む。
【０１８３】
組み換え複合体は、最終濃度５０μｇ／ｍｌのガングリオシドＧＭ２と組み合わせた組み換えタンパク質ＧＭ２ＡＰ（１０００ｎｇ）およびＭＲＰ１４（５０ｎｇ）の上清の組み合わせに対応する。
【０１８４】
（ｉ）プロテイナーゼＫ処理を行わない、組み換えグリア傷害性ヘテロ複合体の検出
傷害性の組み合わせが直接検出可能であったかどうかを決定するため、「ヒト」組み換えタンパク質ＭＲＰ１４およびＧＭ２ＡＰをガングリオシドＧＭ２と組み合わせ、４℃で一晩インキュベートし、抗ＭＲＰ１４および抗ＧＭ２ＡＰ抗体を用いて、サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイにより試験する。
【０１８５】
組み合わせ［ＭＲＰ１４、ＧＭ２ＡＰおよびガングリオシドＧＭ２］を正常尿（ＭＴＴ傷害性アッセイでグリア傷害性ではない）中で希釈する。結果を表６に示す。これらの結果は、抗ＧＭ２ＡＰ捕捉抗体／抗ＭＲＰ１４検出抗体対が、非常に再現可能な様式で組み換え複合体を認識することを示す。結果を表６に示す。
【０１８６】
【表６】
【０１８７】
陽性アッセイ：陽性アッセイの数
アッセイ合計：アッセイの総数
【０１８８】
（ｉｉ）プロテイナーゼＫ処理後の、組み換えグリア傷害性ヘテロ複合体の検出
上記のように、グリア傷害活性はプロテイナーゼＫに耐える。従って、サンプル（組み合わせＧＭ２ＡＰ＋ＭＲＰ１４＋ＧＭ２）をプロテイナーゼＫで処理することにより、非複合体タンパク質は破壊され、バックグラウンドノイズが減少する。
【０１８９】
前述の章と同様に、組み合わせを４℃で一晩インキュベートする。しかしながら、それらを試験する前に、実施例８（ｉｉ）に記載のプロトコールに従い、サンプルをプロテイナーゼＫで処理し、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）で沈殿させる。
【０１９０】
結果を表７に示す。これらの結果は、特に、抗ＭＲＰ１４捕捉抗体／抗ＧＮ２ＡＰ検出抗体対［４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７ＣｌＯ］／［１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１ｌＣｌＯ］、［４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０］／１０Ｅ１１Ａ１１、２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１および２Ｂ９Ｈ２／［１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０］が、プロテイナーゼＫ処理後に、尿中で希釈された上清中の組み換え複合体を、非常に再現可能な様式で検出することを示す。バックグラウンドノイズは顕著に減少する。
【０１９１】
【表７】
【０１９２】
陽性アッセイ：陽性アッセイの数
アッセイ合計：アッセイの総数
【０１９３】
実施例１１：患者の尿中のヘテロ複合体の検出
患者の尿中の複合体の直接的な検出を、２つの代表的な尿：ＭＳ尿および正常尿で試験した。
【０１９４】
結果を表８に記載する。これらの結果は、抗ＭＲＰ１４捕捉抗体／抗ＧＭ２ＡＰ検出抗体対［４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０］／［１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５］、［４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｇ１０］／１０Ｅ１１Ａ１１、２Ｂ９Ｈ２／［１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５］および２Ｂ９Ｈ２／［１３Ｈ９Ｇ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０］が複合体を検出することを示す。
【０１９５】
【表８】
【０１９６】
プロテイナーゼＫで処理した尿については、ＴＣＡを用いた濃縮は行わない。
【０１９７】
グリア傷害活性と臨床的状況との間の相関は非常に良好であることが判明しているので１、３、４、実施例に記載の方法は、多発性硬化症の生物学的マーカーのアッセイ用の診断ツールとして有用である。
【０１９８】
参考文献目録：
１．Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ ｕｒｉｎａｒｙ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ［ｌｅｔｔｅｒ］．Ｌａｎｃｅｔ ３５１，１３３０．
２．Ｍｅｎａｒｄ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｌｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｉｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４１３，４７７−８５．
３．Ｍｅｎａｒｄ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２４５，４９−５２．
４．Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｌｉａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ７，３８３−３８８，
５．Ｎ．Ｂｅｎｊｅｌｌｏｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，４４（４），５７９−５８３．
６．Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５９：５８２１−５８３３．
７．Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６．
８．Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １２０：６５７−６６２．
９．Ｃｈａｕｄｒａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４−３９７．
１０．Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）．
１１．Ｒｅｉｃｈｍａｎ．．ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）．
１２．Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２；５９３−５９６（１９９２）．
１３．Ｇａｌｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（１９９０）２６ ２６９−２７７．
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】三元複合体ＧＭ２ＡＰ＋ＭＲＰ１４＋ＧＭ２（ＧＭ２：最終濃度５０μｇ／ｍｌ）の用量応答曲線を示す。ＭＲＰ１４の量はｘ軸（ｎｇ）に沿って表され、死んだ細胞に対応する細胞傷害百分率は、ｙ軸に沿って表される。この図では、ＧＭ２ＡＰの量（ｎｇ）は、それぞれ、以下の記号で表される：φ：５ｎｇ、π：１０ｎｇ、Ψ：２０ｎｇ、υ：５０ｎｇおよびχ：１００ｎｇ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離された多発性硬化症関連細胞傷害性因子、および当該細胞傷害性因子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症は、ヒトの中枢神経における慢性疾患であり、寛解段階および悪化段階の連続によって、または通常の進行に従って進行し、その解剖病理学的特徴は、脳および脊髄の白質の脱髄の明確に区切られた領域の形成からなる。
【０００３】
解剖学的レベルでは、これらの領域は、損傷過程の初期段階において、この脱髄に関連するグリア細胞に対する損傷に関連する軸索周囲のミエリンの分解を示す。ミクログリア細胞（中枢神経系の常駐する組織マクロファージ）、そしておそらく浸潤した血液単球から生じたマクロファージを含む炎症性マクロファージ活性化は、この脱髄過程に関連し、かつミエリン化シートの破壊に関連する。グリア細胞の相対的な枯渇は、脱髄領域の中心部に見出されるが、一方、星状細胞の増殖は、周辺部で進展し、脱髄したプラークに侵入して繊維状またはグリア状のプラークを形成し得る。これらの硬化構造は、当該疾患に与えられた名称の理由である。
【０００４】
これらのプラークの別の特徴は、それらがその周囲で進行する血管要素と、事実上全身的に関連することである。
【０００５】
解剖学的レベルでは、毛細管内皮からなる血液脳関門（ＢＢＢ）の頻繁な損傷が観察される。ＢＢＢの維持における決定因子は、星状細胞エンドフィートと呼ばれる星状細胞の細胞延長の潜在的な存在からなる。星状細胞エンドフィートは、おそらく、強固な結合構造の形成を誘発するかまたは維持を可能にし、これにより毛細管内皮関門の凝集がＢＢＢに対して具体的な発現を与えることが確証される。
【０００６】
さらに、ＭＳの損傷過程では、ＢＢＢの損傷は、血流から生じるリンパ細胞の流入により、関連する炎症応答を増幅するのに寄与する。免疫細胞と関連する炎症の寄与は、ＭＳにおいて重要であり、かつ、損傷過程に関与する。
【０００７】
ＭＳの病因学は、現在、論争の種である。なぜなら、当該疾患は、種々の原因を有する可能性があるからである。細菌および／またはウイルス起源に関する仮説が提示されてきた。さらに、特許文献１に記載されるように、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎらは、病因学的過程の１つまたはそれ以上のエフェクター因子を調査することにより、脱髄プラークの代表的な形成および星状細胞グリオーシスを結論付けた。この研究の文脈では、彼らは、ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）および血清中において、ヒトまたは動物の星状細胞またはオリゴ樹状細胞に関して傷害活性を示す少なくとも１つの因子が存在することを示した。この傷害活性は、中間フィラメントのネットワークの細胞形態学的破壊および／または当該フィラメントのタンパク質の分解および／またはグリア細胞のアポトーシスによる細胞死により特徴付けられる。彼らは、特許文献１に記載される生存細胞のメチルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を用いた定量比色アッセイにより、ＭＳ患者からのＣＳＦおよび血清サンプルにおけるこの傷害活性のインビトロでの検出と、多発性硬化症との間に、有意な相関があることを確立した。さらに、Ｃ．Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎら（非特許文献１及び２）は、この傷害性因子の活性を検出するために尿が非常に好ましい生物学的流体であることを示し、アポトーシスによって死んだ付着性グリア細胞を検出および／または定量するためのフローサイトメトリーを用いる方法を開発した。この方法に関する全ての情報は、特許文献２に記載されている。
【０００８】
この傷害性因子の同定を試みるため、ＭＳ患者由来のＣＳＦおよび尿のタンパク質画分を用いてアッセイが行われた。各画分中のタンパク質成分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ １２％ゲル上で分離し、ゲル上で銀染色した後に観察した。観察したタンパク質のうち、見かけ上の分子量が約２１ｋＤに集中したタンパク質画分が、インビトロで検出された傷害活性に関連する少量の成分であること、および見かけ上の分子量が約１７ｋＤに集中したタンパク質画分は、この傷害活性に関連する主要な成分であることを見出した。
【０００９】
ＭＳ患者のＣＳＦ由来の画分を、Ｌｅｗｉｓラットの脳に注入し、当該ラット由来の脳断片の死後解剖学的観察により、注入の３ヶ月後に、星状細胞集団のアポトーシスおよび脱髄プラークの形成を観察することが可能になった。全ての情報は、特許文献３に含まれる。これらの観察は、生検後に、ＭＳに罹患している患者の脳区域でなされ得た観察と関連する（非特許文献３）。
【００１０】
ＭＳ患者由来の生物学的サンプル中のグリア細胞に関するこの細胞傷害性と潜在的に関連するタンパク質が、特許文献４に記載されるように研究された。ＭＳおよび非ＭＳ患者の尿中で、タンパク質ＧＭ２ＡＰ（ＧＭ２ガングリオシドアクチベータ前駆体）およびサポシンＢをこのようにアッセイした。特許文献４に示される結果は、ＧＭ２ＡＰおよびサポシンＢは、ＭＳ患者の尿中で、非ＭＳ個体で見出される濃度と比較して高濃度で存在したこと、およびＭＳ患者の尿中で同時に検出されるこれらの２つのタンパク質が、病理学のマーカーを示し得たことを示した。この発明者らはまた、尿中のＧＭ２ＡＰおよびサポシンＢの検出と、ＭＴＴアッセイにより当該尿中で測定されたグリオ傷害性との間の相関性を確立し、これらの２つのタンパク質について、高い尿中濃度とグリオ傷害性との間に相関性が存在したことを示した。これらのことから、この発明者らは、ＧＭ２ＡＰおよび／またはサポシンＢタンパク質は、グリオ傷害性のメカニズムに関与し、それらはおそらく一緒になって作用し、グリオ傷害性を誘発したのではないかと結論付けた。
【００１１】
そこで、本発明者らは、ＭＴＴアッセイを用いる特許文献４で同定されるタンパク質の活性を決定すること、および多発性硬化症に罹患した患者の尿中で発見されたグリオ傷害性が、同定されたタンパク質に関連するのかどうか確認することを望んできた。
【特許文献１】特許出願ＷＯ９５／２１８５９号
【特許文献２】特許出願第ＷＯ９８／１１４３９号
【特許文献３】特許出願第ＷＯ９７／３３４６６号
【特許文献４】特許出願第ＷＯ０１／０５４２２号
【非特許文献１】Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ ｕｒｉｎａｒｙ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ［ｌｅｔｔｅｒ］．Ｌａｎｃｅｔ ３５１，１３３０．
【非特許文献２】Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｌｉａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ７，３８３−３８８，
【非特許文献３】Ｎ．Ｂｅｎｊｅｌｌｏｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，４４（４），５７９−５８３．
【発明の開示】
【００１２】
本発明者らは、全ての予測に反して、グリオ傷害性に関与するのは、特許文献４で同定されるタンパク質単独でも、ＧＭ２ＡＰ／サポシンＢタンパク質の組み合わせでもないこと、および、全く驚くべきことに、グリオ傷害活性に関与しかつ下記の実施例に記載するヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４（カルグラニュリンＢ）もしくは変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４、ＧＭ２またはガングリオシドＧＭ２に対応する細胞傷害性に関与する因子は、脳組織内に存在する複合体脂質であることを示した。
【００１３】
従って、本発明の目的は、多発性硬化症に関連する、精製単離した細胞傷害性因子であり、当該細胞傷害性因子は、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４であり、変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応することが理解されている。これらの精製単離したヘテロ複合体は、ＭＳの病理学のマーカーとして、より詳細には、当該疾患の形態、当該疾患の段階または当該疾患の活性の期間のマーカーとして有用であり、また、当該病理学の治療を受けた患者の追跡治療にも有用である。
【００１４】
従って、本発明者らは、多発性硬化症に罹患しているかまたはこの病理学の臨床的兆候を示す可能性のある個体由来のサンプル中におけるヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４を検出および／または定量するための方法、組成物および反応混合物を開発した。
【００１５】
当該方法は、生物学的サンプル中の多発性硬化症に関連する細胞傷害性因子を、当該生物学的サンプル中から、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４を単離することにより、検出および／または定量することを含む。表現「ヘテロ複合体を単離する」とは、ヘテロ複合体の特定の検出を可能にする全ての条件を意味する。当該ヘテロ複合体の単離は、任意の適切な方法で行うことができる。例えば、非変性電気泳動、カラムクロマトグラフィー、生物学的媒体中のヘテロ複合体以外の化合物を分解する方法（例、プロテイナーゼＫでの処理）、および当該ヘテロ複合体の生理化学的特性を検出するための任意の他の方法（例、分子質量または等電点）、または任意の他の適切な手段が挙げられる。
【００１６】
本発明の１つの実施態様では、ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも１つの抗体または少なくとも２つの抗体を用い、上記細胞傷害因子は、当該ヘテロ複合体と当該抗体からなる複合体の形成を示すことによりまたは当該ヘテロ複合体と当該２つの抗体からなる複合体の形成を示すことにより、検出および／または同定される。好ましくは、当該抗体の少なくとも１つは捕捉抗体であり、他の抗体の少なくとも１つは検出抗体である。
【００１７】
捕捉抗体は、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する抗体および複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する抗体から選択され、検出抗体は、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する抗体および複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する抗体から選択される。
【００１８】
別の実施態様では、ヘテロ複合体は、少なくとも２つの抗体により単離され、その少なくとも１つはヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰに特異的に結合し、その少なくとも他のものはヘテロ複合体のＭＲＰ１４に特異的に結合し、当該細胞傷害特性は、当該ヘテロ複合体と２つの抗体とからなる複合体の形成を示すことにより、検出および／または同定される。好ましくは、上記抗体の少なくとも１つは、捕捉抗体であり、上記抗体の少なくとも他方は、検出抗体である。
【００１９】
上記実施態様では、ヘテロ複合体と少なくとも１つの抗体からなる複合体の形成、またはヘテロ複合体と少なくとも２つの抗体からなる複合体の形成は、任意の適切な手段、例えば、篩分け装置を用いてサイズの関数としてスクリーニングすることにより、分離カラムを用いて分子質量の関数としてスクリーニングすることにより、または少なくとも１つの抗体の直接的または間接的な標識により、あるいは任意の他の適切な手段により、示すことができる。
【００２０】
１つの実施態様では、当該方法は、
（ｉ）試験すべき生物学的サンプルを提供すること、
（ｉｉ）当該生物学的サンプルを、ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、ＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体および複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体から選ばれる少なくとも１つの捕捉抗体、ならびにＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、ＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２および複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体から選ばれる少なくとも１つの標識された検出抗体と接触させること、ならびに
（ｉｉｉ）当該標識された検出抗体を検出および／または定量することにより、細胞傷害性因子を検出および／または定量することを含み、ここで、変異ＧＭ２ＡＰは、配列番号２に対応することが理解される。
【００２１】
好ましくは、細胞傷害性因子の検出および／または定量は、当業者に周知のＥＬＩＳＡ、ＥＬＦＡ等の種々の免疫アッセイ原理を用いて行われ、「サンドウィッチ」免疫アッセイを用いることが有利である。「サンドウィッチ」免疫アッセイは、１つまたはそれ以上の工程を用いて（すなわち、洗浄工程なしで、または１つまたはそれ以上の洗浄工程を用いて）行うことができる。
【００２２】
検出抗体（単数または複数）は、任意の適切な標識で標識される。従って、標識化は、放射標識、酵素を用いる標識、蛍光分子を用いる標識、ビタミンを用いる標識または比色標識であり得る。本発明では、標識は、好ましくはビタミン、ビオチンであり、検出は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンの添加により行われ、可視化は、オルトフェニレンジアミン二塩酸塩の添加により行われる。
【００２３】
捕捉抗体（単数または複数）は、固相上に直接的にまたは間接的に固定される。
【００２４】
本発明で用いる用語「抗体」は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、そのフラグメントおよびその誘導体を包含する。用語「抗体フラグメント」は、天然抗体のＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびｓＦｖフラグメントを意味することを意図し６，７、用語「誘導体」は、とりわけ、天然抗体のキメラ誘導体を意味することを意図する８，９。これらの抗体フラグメントおよび抗体誘導体は、標的抗原に選択的に結合する能力を保持する。ヒト化抗体を用いることが有利であり得る。非ヒト（例、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、大部分が、所望の特異性、親和性および能力を有する、レシピエントの超可変領域がマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長目のような非ヒトドナー種（ドナー抗体）の超可変領域の残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。特定の場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ領域の残基（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出せない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体の有効性を改善するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全ての超可変領域が非ヒト免疫グロブリンに対応し、かつ、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのＦＲ領域である可変ドメインを、少なくとも２つ、好ましくは２つ含むであろう。ヒト化抗体は、また、必要に応じて、ヒト免疫グロブリンなどの免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る１０，１１，１２。特に、出願第０１／０５４２２号に記載の抗ＧＭ２ＡＰおよび抗ＭＲＰ１４抗体を挙げることができる。
【００２５】
しかしながら、驚くべきことに、グリオ傷害活性に関連しかつヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４に対応する因子によって、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に、複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４にまたは複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合し得る抗ヘテロ複合体抗体の産生が可能になることを発見した。このような抗体の産生は当業者に周知である。ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４は、腹腔内注射によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化のための免疫原として用いられる。最初の注射は、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて行われる。その他の注射は、４〜８週間の間隔で、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて行われる。最終追加抗原を、生理食塩水中での融合の２、３日前に与える。この抗原追加後、免疫化マウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞を回収する。次いで、脾臓細胞と骨髄腫株との融合を行い、免疫化に用いられるヘテロ複合体をＥＬＩＳＡにおいて認識する抗体を分泌する細胞を選択する。最後に、免疫ヘテロ複合体に特異的な抗体を産生する（すなわち、ＧＭ２ＡＰ、変異ＧＭ２ＡＰまたはＭＲＰ１４をいずれも単独では認識しない）クローンを選択する。
【００２６】
上述の抗体は、単独でまたは組み合わせて、細胞傷害性因子の検出および／または定量方法に用いることができる。
【００２７】
本発明の方法の好ましい実施態様では、試験サンプルを、以下を含む前処理に供する：
サンプルのタンパク質を、プロテイナーゼＫで消化することからなる工程；当該プロテイナーゼＫを、例えば、トリクロロ酢酸で沈殿させて不活性化させることからなる工程；およびｐＨを、例えば、トリスマレイン酸緩衝液の添加により中和することからなる工程。
【００２８】
生物学的サンプルは、血清、血漿、尿または脳脊髄液であり、好ましくは尿である。
【００２９】
好ましくは、本発明の方法で用いられる抗体は、以下のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体である：１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０、２Ｇ１２Ｈ５、７９、２Ｂ９Ｈ２、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０および１９６。しかしながら、ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体、ＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２、複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２に特異的に結合する抗体、複合体ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４または複合体変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４に特異的に結合する特性を示す任意の抗体が本発明の一部をなすことは極めて明らかであり、そのような抗体を得る方法は、上記のように当業者に周知である。
【００３０】
好ましくは、本発明のサンドウィッチＥＬＩＳＡ検出法および／または定量アッセイに用いられる抗体は、以下のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体である：
−捕捉抗体１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、２Ｇ１２Ｈ５、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０、２Ｂ９Ｈ２および７９；
−検出抗体１０Ｅ１１Ａ１１、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０、２Ｂ９Ｈ２、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０、１３Ｄ１Ｅ５および２Ｇ１２Ｈ５。
【００３１】
有利には、捕捉抗体および検出抗体は、以下の対から選択される：
−２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１、
−１０Ｅｌ１Ａ１１／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
７９／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／２Ｂ９Ｈ２、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１０Ｅ１１Ａ１１、
４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０、
２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０、
１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／２Ｂ９Ｈ２、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１０Ｅ１１Ａ１１、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１３Ｄ１Ｅ５＋２２Ｇ１２Ｈ５、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｄ１Ｅ５＋２２Ｇ１２Ｈ５、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０。
【００３２】
上記モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は新規であり、これらもまた本発明の主題の一部をなす。これらの産生方法は、実験の章でより詳細に説明する。選択された捕捉抗体および検出抗体の対もまた新規であり、これらもまた本発明の主題の一部をなす。
【００３３】
本発明の主題はまた、生物学的試験サンプル中で上記細胞傷害性（グリオ傷害性）因子を検出および／または定量するための組成物であり、当該組成物は、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。好ましくは、当該組成物は、ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも２つの抗体を含む。
【００３４】
本発明の主題はまた、生物学的試験サンプル中で上記細胞傷害性（グリオ傷害性）因子を検出および／または定量するための組成物であり、当該組成物は、反応混合物中に、同時に、少なくとも１つの捕捉抗体および少なくとも１つの標識された検出抗体を含み、当該抗体は、ヘテロ複合体の、ＧＭ２ＡＰタンパク質に、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体およびＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する抗体から選択される。
【００３５】
好ましくは、捕捉抗体および検出抗体は、以下のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む：１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０、２Ｇ１２Ｈ５、７９、２Ｂ９Ｈ２、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０および１９６。
【００３６】
有利には、当該組成物は、抗体１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、２Ｇ１２Ｈ５、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０、２Ｂ９Ｈ２および７９から選択される少なくとも１つの捕捉抗体を含み；かつ検出抗体１０Ｅ１１Ａ１１、４Ａ７Ｂ１０、５Ｈ７Ｃ１０、２Ｂ９Ｈ２、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０、１３Ｄ１Ｅ５および２Ｇ１２Ｈ５から選択される少なくとも１つの検出抗体を含む。
【００３７】
好ましい組成物は、以下の捕捉抗体および検出抗体の対を含む：
−２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１、
−１０Ｅ１１Ａ１１／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／２Ｂ９Ｈ２、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１０Ｅ１１Ａ１ｌ、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／ｌ３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０、
−２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０、
−１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５／４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０、
−７９／２Ｂ９Ｈ２、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／ｌＯＥ１１Ａ１１、
−４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０／１３Ｄ１Ｅ５＋２２Ｇ１２Ｈ５、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｄ１Ｅ５＋２２Ｇ１２Ｈ５、
−２Ｂ９Ｈ２／１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０。
【００３８】
本発明の主題はまた、上記細胞傷害性（グリア傷害性）因子を検出および／または定量するための反応混合物であり、当該混合物は、少なくとも２つの抗体を含み、当該抗体の少なくとも１つはヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰタンパク質または変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的に結合し、当該抗体の他の少なくとも１つはヘテロ複合体のＭＲＰ１４タンパク質に特異的に結合する。用語「反応混合物」は、少なくとも上記２つの抗体を同時に含む均一または不均一な媒体を意図することを意味する。好ましくは、当該抗体の少なくとも１つは捕捉抗体であり、他の抗体の少なくとも１つは検出抗体である。
【００３９】
本発明の別の主題は、少なくとも２つの抗体に結合するヘテロ複合体を含む複合体であり、当該抗体の少なくとも１つはヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰタンパク質または変異ＧＭ２ＡＰタンパク質に特異的であり、他の少なくとも１つの抗体はヘテロ複合体のＭＲＰ１４タンパク質に特異的である。
【００４０】
配列番号１は、ＧＭ２ＡＰタンパク質の配列に対応する。
【００４１】
配列番号２は、４０位のエキソン２で変異した（アスパラギン酸がフェニルアラニンで置換された）ＧＭ２ＡＰタンパク質の配列に対応する。
【００４２】
配列番号３は、エキソン１、エキソン２およびエキソン４の両方で変異を示す変異ＧＭ２ＡＰタンパク質の配列に対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下の詳細な説明では、ＧＭ２ＡＰタンパク質を参照する場合、考慮すべき配列は、配列番号１で同定される配列である。さらに、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を参照する場合、考慮すべき配列は、配列番号２で同定される配列である；実施例３の実験の章で説明するように、配列番号１および配列番号２において、バリンまたはアラニンは、１５３位での識別を行うことなく見出すことができる。しかしながら、配列番号３で同定されるように、エキソン１、エキソン２およびエキソン４の両方で変異を示す変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を考慮に入れることにより同等の実験を行うことができる。
【００４４】
図面
添付の図面は、三元複合体ＧＭ２ＡＰ＋ＭＲＰ１４＋ＧＭ２（ＧＭ２：最終濃度５０μｇ／ｍｌ）の用量応答曲線を示す。ＭＲＰ１４の量はｘ軸（ｎｇ）に沿って表され、死んだ細胞に対応する細胞傷害百分率は、ｙ軸に沿って表される。この図では、ＧＭ２ＡＰの量（ｎｇ）は、それぞれ、以下の記号で表される：
φ：５ｎｇ、π：１０ｎｇ、Ψ：２０ｎｇ、υ：５０ｎｇおよびχ：１００ｎｇ。
【００４５】
同様の実験は、ＧＭ２タンパク質の代わりに、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を用いて行われた。得られた結果は、添付の図面に記載のものと同等である。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ＭＴＴアッセイプロトコル
（ｉ）ポリ−Ｌ−リジンを用いたプレートの「コーティング」
２５０μｌの無菌ポリ−Ｌ−リジン溶液（１２．５μｇ／ｍｌ）を、４８ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７８）の全てのウェルに入れる。３７℃で２時間インキュベーションした後、溶液を吸引により除去し、２５０μｌの無菌水で置換して、ウェルを洗浄する。ウェルを吸引により空にした後、それらを微生物学的に安全なステーションの気流下で乾燥する。
【００４７】
（ｉｉ）用いた細胞
ＣＬＴＴ１−１細胞は、ポリオーマウイルスのラージＴ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス由来の星状細胞である１３。これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２湿潤雰囲気下で、Ｄｕｂｅｌｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ Ｆ１２培地（５０／５０）、４．５ｇ／ｌのＤ−グルコース（１０％の非脱補体仔ウシ血清（ＦＣＳ）、グルタマックス（５８０ｍｇ／ｌ）、ペニシリン（５００単位／ｌ）およびストレプトマイシン（５００μｇ／ｌ）を補充）中で培養する。
【００４８】
（ｉｉｉ）細胞傷害性アッセイ
試験サンプルを、傷害性アッセイのために、入れる２４時間前に調製し、４℃でインキュベートした。
【００４９】
ポリ−Ｌ−リジンで「コーティング」された４８ウェルプレートに、ＣＬＴＴ １−１細胞を、１ウェル当たり２５０μｌの細胞懸濁液（６０００細胞／ｍｌ）の速度（すなわち、１５００細胞／ウェル）で播種した。
【００５０】
５％ＣＯ２湿潤雰囲気下、３７℃での２４時間のインキュベーション後、サンプルを細胞培地の表面に塗布する。各サンプルを３回塗布する。特定のウェルにより、細胞コントロール（Ｃ）（サンプルの沈殿なし）または「ＴＵＣ」コントロール（ＴＵＣ溶液を１０μｌ塗布する）と評価することが可能である。ＴＵＣ試薬（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭの尿素、１ｍＭのＣａＣｌ２）は、尿の化学組成を模倣する溶液である。
【００５１】
沈殿をホモジナイズし、蒸発を避けるためにプレートの上部に保護フィルムを被せる。
【００５２】
５％ＣＯ２湿潤雰囲気下、３７℃での７２時間のインキュベーション後、ＭＴＴアッセイによる可視化を行う。ウェルの底から細胞を取り出さないように留意しながら、細胞上清を吸引により除去する。２５０μｌのＭＴＴ溶液（培養培地中０．５ｍｇ／ｍｌ）を、細胞上に慎重に塗布する。３７℃での３時間のインキュベーション後、溶液をを吸引により除去し、細胞中で生じたフォルマザン結晶をイソプロパノール、１Ｎ ＨＣｌ（４０μｌ／ｍｌ）で溶解する。
【００５３】
光学濃度読み取りを行うため、４８ウェルプレートの各ウェル中の７０μ１の溶液が均一になるとすぐに９６ウェルプレートのウェルに移す。
【００５４】
吸光度を、５７０ｎｍ／６５０ｎｍで読み取る。
【００５５】
細胞傷害百分率を計算することができる：
ＭｅａｎＣ＝コントロールの吸光度の平均
σＣ＝コントロールの吸光度の標準偏差
ＣＯ＝カットオフ＝平均Ｃ＝２σＣ
ＯＤ＝サンプルの平均吸光度
傷害％＝（１−（ＯＤ／ＣＯ））×１００
【００５６】
有効であるためには、各サンプルの吸光度（３回）は、平均吸光度の１０％よりも大きい標準偏差を有してはならない。
【００５７】
実施例２：尿プールの調製
１００リットルのＭＳ尿（患者の最初の朝の排尿由来の０．２〜０．５リットル）を回収した。グリア傷害性バイオアッセイを阻害するおそれがある、細菌汚染された患者由来の尿または薬物治療を受けた患者由来の尿を除いた４。個別のサンプルについてグリア傷害性を試験し、顕著なグリア傷害性を有する４６リットルの尿の最終プールを、ＭＴＴアッセイのために選択した。平行して、グリア傷害性が陰性の正常なドナー由来の当量の尿を各サンプルについて得た。この材料の濃縮および精製、タンパク質分析ならびに同定ストラテジーからなる工程を以下に示す。
【００５８】
・尿中タンパク質の精製
高濃度のタンパク質を得るため、ＭＳ陽性およびＭＳ陰性の尿プールを精製した。
【００５９】
−（ｉ）沈殿：
−硫酸アンモニウム（Ｐｒｏｌａｂｏ−ｒｅｆ．２１ ３３３ ３６５）での沈殿を、ＭＳ陽性およびＭＳ陰性の尿プールについて行った。４０％の尿に対し６０％の飽和硫酸アンモニウムの百分率（すなわち、尿１リットル当たり３９０ｇの硫酸アンモニウム）を用いた。沈殿を改良するため、各プールを１．８リットルの画分で、２リットルのビンに分配した。沈殿を２回×８時間、周囲温度で、穏やかに撹拌しながら行った。尿プールを３０００ｒｐｍで１０分間、１０℃の温度で遠心分離した後、得られたペレットを、１ｍＭ ＣａＣｌ２および０．２５ｍ尿を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に入れる。次いで、混合物を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清は濃縮されたタンパク質を含む。これを以下の工程に直ちに用いるか、または、以下の工程を連続的に行うことができない場合は、冷凍する。
【００６０】
−（ｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー：
−次いで、タンパク質を含む溶液を、ＤＥＡＥ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（商品名、Ｐｈａｒｍａｃｉａから販売）を通した。この工程は、ゲルを充填したＰｈａｒｍａｃｉａカラム上で、低圧で行う。緩衝液を、均一な流速を可能にする蠕動ポンプによってカラム上に導入する。カラム平衡化緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）である。沈殿物上清に対応し、多すぎる量の塩を含む画分を、カラム上に装填する前に、この緩衝液に対して透析した。塩勾配溶離液により、タンパク質の回収が可能になる。溶出勾配は、カラム平衡化緩衝液中での１００、２００、３００および５００ｍＭ ＮａＣｌの工程により得られる。溶出画分を、ＭＴＴアッセイにより試験する。陽性の画分、すなわち、２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出された画分が、保持される。これらの画分を直ちに処理するか、または冷凍状態で保持する。
【００６１】
−（ｉｉｉ）精製
−溶出させるタンパク質のサイズおよび形状の違いに基づく立体排除クロマトグラフィーを用いた。２００ｍＭ ＮａＣｌ溶出液に対応する画分を、カラム上に装填した。溶出の過程で、低分子量のタンパク質は残存し、次いで、より大きい分子よりも後に溶出する。精製は、ＴｏｓｏＨａａｓ ＴＳＫ Ｐｒｅｐ Ｇ ３０００ ＳＷカラム（直径２１．５ｍｍ、長さ３００ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ上で行った。分子体積排除限界は、５０００００ダルトンである。用いる溶出緩衝液は、ｐＨ６．８で、１００ｍＭのリン酸、１００ｍＭの硫酸ナトリウムを含む。タンパク質の混合物の分離は、６０分間で行った。１５〜２０，０００ダルトンの質量に対応する画分のみを保持した。この画分を、２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（０．２ｍＭ ＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．２）で透析し、次いで冷凍した。
【００６２】
各工程において、顕著な傷害活性を示す画分を、引き続く工程のために保持した。タンパク質の傷害活性のコントロールを、ＭＴＴアッセイを用いて、各工程において行った。顕著な傷害活性を示す画分のみを、さらなる精製工程のために保持した。
【００６３】
−（ｉｖ）逆相クロマトグラフィーによる尿中タンパク質のさらなる精製
−精製後に得られた、ＭＳ患者由来の尿のプール（ＭＳ陽性プール）および非ＭＳ患者由来の尿のプール（ＭＳ陰性プール）を蒸留水中に入れ、次いで、０．２％ＴＦＡ／１０％のアセトニトリル溶液で希釈して、約１３０〜１４０μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００６４】
Ｃ８逆相ＨＰＬＣによる分離を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社から販売されているＢｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅカラム（商品名）（カラム特性：３００Å／７μｍ／（１００×４．６）ｍｍ）上で行った。陽性プールおよび陰性プールについて、２つの異なるカラムをそれぞれ用いた。注入は、２５０μｍの複数注入により行った。タンパク質を、５％〜１５％の緩衝液Ａの直線勾配で溶出し、次いで、１５％〜１００％の緩衝液Ｂの直線勾配で９５分、０．５ｍｌ／分の流速で溶出した。用いた緩衝液ＡおよびＢは、それぞれ、０．１％ＴＦＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｏ．２８９０４）／ＭｉｌｌｉＱ水緩衝液および０．０９％ＴＦＡ／８０％アセトニトリル（Ｂａｋｅｒ）緩衝液である。検出は、ＵＶ吸光度を２０５ｎｍおよび２８０ｎｍで測定することにより行った。画分を、１．５ｍｌおよび０．５−１ｍｌの目的とする領域にある画分として回収した。回収後、画分を、ドライアイス中で冷凍した。
【００６５】
次いで、回収した画分を、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ中で乾燥させ、１００μｍの０．１％ＴＦＡ／３０％アセトニトリル中に入れた。２０μｌの画分を５００μｌのエッペンドルフ管中に移し、１００μｌのＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄し、次いで再び乾燥させた。
【００６６】
溶出後回収した各画分中に含まれるタンパク質の細胞傷害性を、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。ＭＳ陽性プール中の画分Ｘ７６／４３のみが、インビトロで傷害活性を示す。この画分の数は、実施例で述べる溶出条件の関数としての溶出の順番に対応する。その細胞傷害性は、出願第ＷＯ９８／１１４３９号に記載されるように、マウス星状細胞のＦＡＣＳによりインビトロで確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるそのプロファイルは、５５ｋＤａ、３５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１８ｋＤａ、１４ｋＤａおよび８ｋＤａにおけるタンパク質のバンドを明らかにした。コントロール尿から得られたＭＳ陰性プールの対応する画分Ｘ７６／４３は、ＭＴＴアッセイによっていかなる細胞傷害性も示さなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるそのプロファイルは、５５ｋＤａ、３５ｋＤａおよび２０ｋＤａにおけるバンドを示した。
【００６７】
・ＳＤＳ−ＴＲＩＣＩＮＥゲルにおけるＨＰＬＣ上での分離により得られるタンパク質の分析
ＭＳ陰性プールの画分Ｘ７６／４３のタンパク質含有量およびＭＳ陽性プールの画分Ｘ７６／４３のタンパク質含有量を、ＳＤＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ １６％ゲル上での分離およびゲルの亜鉛／イミダゾール染色後に観察した。
【００６８】
ＨＰＬＣにより得られた画分Ｘ７６／４３回収プールを、予め注いだＳＤＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ １６％ゲル（１０ウェル、厚み１ｍｍ）（Ｎｏｖｅｘ社より販売されている）上に充填した。これらのゲルの使用条件は、供給者の推奨する条件に対応する。サンプルを７５μｌの一回濃縮したサンプル緩衝液（ＳＤＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ Ｎｏ．ＬＣ １６７６、１ｍｌを２回濃縮＋水中で１／２に希釈した５０μｌのβ−メルカプトエタノール（Ｐｉｅｒｃｅ））中に入れ、２５μｌのサンプルを、ゲル上に３回充填した。ＭＳ陰性プール由来の画分Ｘ７６／４３回収プールを、ＭＳ陽性プールについて説明したのと同じ条件下で、ゲル上に装填した。２つのゲル上での移動を、同一の移動タンク（ＸＣＥＬＬ ＩＩ ＮＯＶＥＸ（商品名））中で、１２５ｍＶの一定電圧で２時間行った。タンクを、氷を含む容器中に置いた。移動の直後に、ゲルを、亜鉛／イミダゾール染色（Ｂｉｏｒａｄ社により販売される染色キット１６１−０４４０）により染色し、可逆的ネガティブ染色を得た。
【００６９】
・ゲルバンドのトリプシン消化
画分Ｘ７６／４３の装填により可視化された全てのタンパク質バンドを切り出し、トリプシン溶液中で一晩タンパク質分解に供した。ゲルバンドを、メスを用いて１ｍｍの切片に切り出し、エッペンドルフ管に移した。エッペンドルフ管を遠心分離スパイクにかけて、ゲル片を沈めさせ、遠心分離後、１００μｌの洗浄緩衝液（１００ｍＭ ＮＨ４ＣＯ３／５０％ＣＨ３ＣＮ）をゲル片に加えた。周囲温度で３０分撹拌した後、上清を２０μｌ画分だけ除去し、洗浄工程を２回繰り返した。エッペンドルフ管を、５分間、スピードバク（ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）で乾燥させた。２０μｇのトリプシン（変性配列グレードＰＲＯＭＥＧＡ Ｖ５１１１）（商品名）を２００μｌの消化緩衝液（５ｍＭトリス、ｐＨ８）に入れ、間欠的に撹拌しながら周囲温度で３０分撹拌し、２０〜３０μｌの再懸濁したトリプシンを、ゲル片に添加した。エッペンドルフ管を遠心分離し、温室で２８℃で一晩保存した。消化後、ゲルバンドは、すぐに質量測定または引き続く使用のための冷凍に用いることができる。より高い見かけ分子量のタンパク質は、２つの画分で観察された。一方、見かけ分子が８、１４および１８ｋＤａのバンドは、ＭＳ陽性プールの画分Ｘ７６／４３中でのみ観察可能である。
【００７０】
実施例３：タンパク質のマススペクトル分析および配列決定
・タンパク質分解フラグメントのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析による分析
３０μｌの抽出緩衝液（２％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル）をサンプルに添加する。分析すべきエッペンドルフ管を５分間遠心分離に供し、次いで、５分間超音波処理に供し、最後に、１分間遠心分離に供する。
【００７１】
０．５μｌのマトリックス（アセトン中で飽和したα−シアノ−４−ヒドロキシトランス桂皮酸）の１４個の堆積物を、ステンレス鋼ディスク上で作製する。薄い均一の微結晶層を得る。０．５μｌの２％ＴＦＡ／水の溶液を、この１４個の堆積物上の下塗り層上に堆積し、次いで、分析すべきサンプルを０．５μｌ添加する。０．５μｌのα−シアノ−４−ヒドロキシトランス桂皮酸の５０％アセトニトリル／水中飽和溶液を、このように形成したこの液滴に添加する。周囲温度で３０分乾燥した後、結晶堆積物を２μｌの水で洗浄し、すぐに空気ブラストで除去する。全てのスペクトルは、リフレクトロンを備えたＢＲＵＫＥＲ ＢＩＦＬＥＸマススペクトル分析器（商品名）で得る。マトリックスサンプルサンドウィッチ中に存在する全てのペプチドのうち最も代表的なマススペクトルを得るために、測定（全堆積物に対し、９０〜１２０回のレーザー発射）を蓄積して、１００ｐｐｍ未満の測定精度を用いることを可能にするため、各堆積物について、トリプシン自動分解ペプチドを用いて校正を行った。
【００７２】
マススペクトル分析の結果を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ）のＭ５−ＦＩＴアルゴリズムを用いるデータバンクによりサーチした。
【００７３】
・消化ペプチドのＮ−末端配列決定
−（ｉ）消化ペプチドのＨＰＬＣによる抽出および分離
トリプシンでの消化後に得られたペプチドを、超音波処理浴中で、０．１％ＴＦＡ／６０％アセトニトリルを用いて、３回、３０分間抽出した。抽出溶液を合わせ、スピードバック中で乾燥させて２０μｌにした。８０μ１の緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）中で希釈した後、トリプシンで消化したゲルバンドの抽出物を、Ｃ１８／ＭＺ−Ｖｙｄａｃ／（１２５×１．６）ｍｍ／５μｍカラム（商品名）に注入した。ペプチドを、１５０μｌ／分の流速および５％の緩衝液Ｂ（０．０９％ＴＦＡ／８０％アセトニトリル）〜４０％の緩衝液Ｂの範囲内の勾配で４０分間溶出し、次いで、４０％の緩衝液Ｂ〜１００％の緩衝液Ｂの勾配で１０分間溶出した。２０５ｎｍをＵＶ吸光度で測定することにより、検出を行った。ピークを５００μｌのエッペンドルフ管中に集めた。次いで、集めた個々のペプチドのピークを、Ｎ−末端アミノ酸配列分析に供した。
【００７４】
−（ｉｉ）Ｎ−末端配列決定：
単一のマスピークに対応する画分を、配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒモデル４７７Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのＥｄｍａｎ分解により分析した。配列決定条件は、製造者により記載されたとおりであった。サンプルを装填するためにマイクロカートリッジを用い、ＰＴＨ−アミノ酸を、オンラインＨＰＬＣシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒモデル１２０Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて同定した。
【００７５】
・結果
マススペクトル分析および配列決定による分析の結果を、下記の表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
ＭＷ：平均分子量
ＩＭＳ：マススペクトル分析による同定
ＩＳ：配列決定による同定
ＮＩ：同定されない残りのピーク
ＮＤ：検出されず
＊：尿中の完全な４６７ｋＤａタンパク質の前タンパク質分解から、または精製工程の間におそらく得られるであろうパールカンの２０ｋＤａ Ｃ−末端フラグメントと同一である。
【００７８】
共に精製されたタンパク質の混合物もまた、最終ＭＳ精製画分中および対応するコントロール画分中の両方に存在した。これらの２つの画分にグリア傷害活性が存在しないことにより、これらの２つのサンプル中で同定されたタンパク質は無関係であると考えられた。
【００７９】
結果として、ＧＭ２ＡＰ（１８ｋＤａ）、ＭＲＰ１４またはカルグラニュリンＢ（１４ｋＤａ）、およびサポシンＢ（１０ｋＤａ）は、グリア傷害活性についての可能性のある候補と考えられた。
【００８０】
さらに、ＭＳ画分中の１８ｋＤａバンドのトリプシン消化されたフラグメントのＮ−末端配列決定は、ＧＭ２ＡＰの種々の位置における多形の存在を示した；アラニンがトレオニンで置換されている、ＧＭ２ＡＰアミノ酸配列の１９位におけるエキソン１での変異；アスパラギン酸がフェニルアラニンで置換されている、ＧＭ２ＡＰアミノ酸配列の４０位におけるエキソン２での変異。この変異は、正常または罹患したドナーのゲノムＤＮＡで観察されたことはなかった；ＧＭ２ＡＰアミノ酸配列のそれぞれ５９位および６９位におけるエキソン２での他の２つの変異は、イソロイシンのバリンでの置換およびメチオニンのバリンでの置換にそれぞれ対応する。正常個体（血液ドナー）および多発性硬化症に罹患した患者由来のリンパ球のゲノムＤＮＡの種々のラウンドの配列決定の後、ＧＭ２ＡＰアミノ酸配列の１５３位でのバリンのアラニンでの置換からなるエキソン４での変異は、これまで記載されていない新規な多形であることが見出された。このエキソン４での変異は、試験した２７名のＭＳ患者のうち３名で見出され、２７名のコントロール個体のうち８名でも見出されたが、正常多形を示唆する。他の変異は、リジンがグルタミンで置換されたＧＭ２ＡＰアミノ酸配列の１７１位のエキソン４で見出された。
【００８１】
ＧＭ２ＡＰおよび変異ＧＭ２ＡＰのアミノ酸配列は、それぞれ、配列同定装置により配列番号１および配列番号２で表され、これらの２つの配列番号１および配列番号２において、バリンまたはアラニンは、１５３位において識別することなく見出すことができることが理解される。なぜなら、この位置でのエキソン４の変異は、正常多形を示唆するからである。
【００８２】
実施例４：組み換えタンパク質
組み換えタンパク質（購入するか、または形質転換で産生した）を用いて、候補タンパク質のグリア傷害性の可能性を評価した。
【００８３】
以下の「非ヒト」タンパク質、すなわち、発現すべきインサートを含むプラスミドを用いた形質転換により、または発現すべきインサートと一体化した、バキュロウイルスに感染した酵母または昆虫細胞における真核生物発現系により、原核生物発現系（大腸菌）において産生した組み換えタンパク質：
【００８４】
大腸菌中で産生した、Ｎ−末端位置でヒスチジン尾部と融合したＭＲＰ１４タンパク質（またはカルグラニュリンＢまたはＳ１００Ａ９）；大腸菌中で産生した、ＭＲＰ８タンパク質（またはカルグラニュリンＡまたはＳ１００Ａ８）；およびＣ．Ｋｅｒｋｈｏｆｆ博士（Ｍｕｎｓｔｅｒ大学、ドイツ）から購入した天然ヒトヘテロ複合体ＭＲＰ１４／ＭＲＰ８（またはカルプロテクチン）。
【００８５】
Ｋ Ｓａｎｄｈｏｆｆ教授（Ｋｅｋｕｌｅ研究所、Ｂｏｎｎ大学、ドイツ）から購入した、酵母中で産生した、Ｎ−末端位置でヒスチジン尾部と融合したＧＭ２ＡＰタンパク質（ガングリオシドＧＭ２−活性化前駆体）およびＳａｐＢ（サポシンＢ）タンパク質。
【００８６】
これらのタンパク質は、文献に記載の自らの生理学的活性を有する。
【００８７】
「ヒト」タンパク質（すなわち、発現すべきインサートと一体化した、適切なプラスミドを用いて形質転換したヒト細胞の真核生物発現系により産生した組み換えタンパク質）は、下記のプロトコールに従って産生された。
【００８８】
２９３Ｔ細胞（ラージＴ抗原を発現する、５型アデノウイルスを用いて形質転換した一次ヒト胚腎細胞）を、３７℃、湿潤雰囲気下、５％ＣＯ２で、ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌのＤ−グルコース（１０％の脱補体仔ウシ血清（ＦＣＳ）、グルタマックス（５８０ｍｇ／ｌ）、ペニシリン（５００単位／ｌ）およびストレプトマイシン（５５０μｇ／ｌ）を補充）中で培養した。
【００８９】
一時的な形質転換を行うため、目的のタンパク質のｃＤＮＡを含む適切なプラスミド、ＭＲＰ１４、ＧＭ２ＡＰ、およびＮ−末端位置の分泌ペプチド（ＩｇＫ）から始まる変異ＧＭ２ＡＰ（アスパラギン酸／フェニルアラニン／４０位）を用いた。
【００９０】
２９３Ｔ細胞を、脂質から構成され、ＤＮＡを複合体化しかつ細胞内に輸送する「形質転換物」試薬を用いて形質転換した。２９３Ｔ細胞をトリプシン化し、７５ｃｍ２フラスコ１つ当たり２００万個の細胞を播種し、３７℃で、５％ＣＯ２湿潤雰囲気で、１０ｍｌの培養培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌのＤ−グルコース、１０％の脱補体仔ウシ血清（ＦＣＳ）、グルタマックス（５８０ｍｇ／１）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充）中で一晩インキュベートした。
【００９１】
３／２［形質転換物の体積（μｌ）／プラスミドＤＮＡの量（μｇ）］の比で、１ｍｌのＦＣＳ非含有媒体を用いて、形質転換溶液をその場で調製する。
【００９２】
周囲温度での接触の４５分後、形質転換溶液を、非コンフルエントな細胞層に滴下する。
【００９３】
５％ＣＯ２湿潤雰囲気中での３７℃での７２時間のインキュベーション後、上清を回収し、１０分間、２５００ｒｐｍで遠心分離する。
【００９４】
次いで、タンパク質の定量を、ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＡＧ，Ａｕｇｓｔ（スイス）から販売されているＭＲＦ Ｅｎｚｙｍｅ免疫アッセイキット（商品名）を用いて、ヒト組み換えＭＲＰ１４タンパク質に関するインフォメーションシートに従って行うか、または抗ＧＭ２ＡＰウサギポリクローナル抗体を用いる準定量的Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング技術を用いて行った。これらの技術は、相対比較のための表示値を与える。
【００９５】
この産生に由来する粗上清は、特に、傷害活性および検出アッセイに用いられる。
【００９６】
実施例５：「非ヒト」タンパク質の傷害性
「非ヒト」組み換えタンパク質ＭＲＰ１４、ＭＲＰ８、ＧＭ２ＡＰおよびＳａｐＢの傷害性を、ＭＴＴアッセイにより評価した。
【００９７】
タンパク質を、種々の尿中の各タンパク質の濃度の評価から規定される範囲内で試験した。範囲は、種々の緩衝液中（ＴＵＣ溶液中、または２つの型の尿（ＭＴＴアッセイで傷害性であった、多発性硬化症に罹患した患者由来の尿（ＭＳ尿）、およびＭＴＴアッセイで傷害性ではなかった、非ＭＳドナーの採用者由来の尿（正常尿））中のいずれか）で、作製した。尿は、予め５６℃で３０分間処理し、濾過した。
【００９８】
結果は、それぞれ、ＴＵＣ溶液中および正常尿中で試験したタンパク質が、ＭＴＴアッセイにより傷害性ではないことを示す。ＧＭ２ＡＰ、ＭＲＰ１４およびサポシンＢタンパク質の顕著な効果は、ＭＳ尿中で、ＭＴＴアッセイによっては示されない。傷害性の阻害は、３ｎｇまたはそれ以上のＭＲＰ８用量により記録される。
【００９９】
これらの結果を、表２に示す。
表２Ａ：ＴＵＣ溶液の範囲
表２Ｂ：尿中の範囲
【０１００】
【表２Ａ】
【０１０１】
【表２Ｂ】
【０１０２】
ＭＲＰ１４およびＭＲＰ８については、細胞傷害百分率は、２回のアッセイの平均細胞傷害百分率である
ＮＤ：測定されず
＊他のＭＳ尿については、同等の傷害性の阻害が観察される。
【０１０３】
次いで、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４、サポシンＢ／ＭＲＰ１４およびサポシンＢ／ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４タンパク質の組み合わせは、ＴＵＣ溶液中および上記の２つのタイプの尿中でで調製した。「コントロール」の組み合わせでは、種々のＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／８、サポシンＢ／ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ８の組み合わせ中のＭＲＰ１４タンパク質を、ヘテロ複合体ＭＲＰ１４／８またはＭＲＰ８タンパク質で置き換えた。「コントロール」の組み合わせは、同様の様式で調製した。全ての組み合わせを、ＭＴＴアッセイを用いてそれらの傷害性を試験する前に、一晩、４℃でインキュベートした。
【０１０４】
結果を表３に示す。
表３Ａ：ＴＵＣ溶液の範囲
【０１０５】
【表３Ａ】
【０１０６】
ＭＲＰ１４／８：ヒト天然へテロ複合体
Ｓａｐ．Ｂ：サポシンＢ
＊２つのアッセイの平均
【０１０７】
表３Ａに示す結果は、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／８、サポシンＢ／ＭＲＰ１４およびＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／サポシンＢの組み合わせは、試験した量にかかわらず、ＴＵＣ中で傷害性効果を有しないことを示す。ＧＭ２ＡＰ（１０ｎｇ）／ＭＲＰ１４（０．５ｎｇ）の組み合わせのみが、傷害性を示すように思われるが、この傷害活性は、２回の追加の比較アッセイでは引き続いて見出されなかった。さらに、追加のアッセイを、種々の量のＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４を用いる組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４を用いて行われた。得られた結果は、組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４が、試験した量にかかわらず、ＴＵＣ中で傷害性効果を有しないことを示す。
表３Ｂ：正常尿中での範囲
【０１０８】
【表３Ｂ】
【０１０９】
Ｓａｐ．Ｂ：サポシンＢ
表３Ｂから明らかなように、組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４は、正常尿中で傷害性である。なぜなら、傷害性は、ＧＭ２ＡＰタンパク質の量の増加の関数として増加するからである。しかしながら、この傷害性は、比較的不安定でかつ比較的再現しにくいように思われ、また、尿サンプルに依存するように思われる（表３Ｂにおける正常尿１と正常尿２との間での細胞傷害百分率の比較を参照されたい）。
【０１１０】
組み合わせサポシンＢ／ＭＲＰ１４は、正常尿の有意性の限界にある。
【０１１１】
組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／サポシンＢを用いて得られた結果は、解釈するのが難しい。
【０１１２】
ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４およびサポシン／ＭＲＰ１４タンパク質の組み合わせの傷害性もまた、正常尿および多発性硬化症に罹患した患者由来の傷害性尿（ＭＳ尿）に関して試験した。
【０１１３】
結果を表３Ｃに示す。
表３Ｃ：非ＭＳ尿およびＭＳ尿中の範囲
【０１１４】
【表３Ｃ】
【０１１５】
Ｓａｐ．Ｂ：サポシンＢ
組み合わせサポシンＢ／ＭＲＰ１４は、試験した量にかかわらず正常尿中およびＭＳ尿中で傷害性効果を有しない。
【０１１６】
組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４は、正常尿１に関してはいかなる傷害性効果も示さないが、正常尿２に関して傷害性効果を示す（ＧＭ２ＡＰが増加すると、尿の傷害性が増加する）。さらに、ＭＳ尿については逆の効果がみられた。ＭＲＰ１４の量が増加すると、尿の傷害性は減少する。
【０１１７】
実施例６：「ヒト」タンパク質の傷害性
実施例３に記載のように産生したタンパク質ＧＭ２ＡＰ、エキソン２で変異したＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４を、それらを含む２９３Ｔ細胞由来の培養上清を用いて、ＭＴＴアッセイにより、それらの傷害性を試験した。
【０１１８】
２９３Ｔ細胞培養上清を用いて、以下の組み合わせもまた実施した：ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰｌ４、変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰｌ４、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／ＭＲＰ８。調製した組み合わせを、引き続いて４℃で一晩インキュベートし、次いで、それらの傷害性を、ＭＴＴアッセイにより試験した。
結果を表４に示す。
【０１１９】
【表４Ａ】
【０１２０】
％Ｃ：細胞傷害百分率
ＮＤ：測定されず
上清中のタンパク質のおよその濃度：ＭＲＰ１４バッチ１および２：３５０ｎｇ／ｍｌ；ＧＭ２ＡＰバッチ１：３００ｎｇ／ｍｌ、バッチ２：２００ｎｇ／ｍｌ
【０１２１】
太字で示した特定の値については、いくつかのＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４の組み合わせは、細胞傷害性が弱く（２０〜３０％の細胞傷害性）、組み合わせＧＭ２ＡＰ（２０ｎｇ）／ＭＲＰ１４（０．５ｎｇ）に最適である。
【０１２２】
ＭＲＰ１４は、単独では、細胞傷害性ではない。バッチ２で行われたアッセイ１および２では、非常に弱い傷害性が観察されるが、ＧＭ２ＡＰ単独では細胞傷害性であるとは考えられない。なぜなら、再現可能性が上清産生バッチに依存するので、完全ではあり得ないからである。
【０１２３】
【表４Ｂ】
【０１２４】
％Ｃ：細胞傷害百分率
ＮＤ：測定されず
ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４の上清中でのおよその濃度：２μｇ／ｍ１
拒絶：サンプルのＯＤ値の標準偏差が５０より大きいために拒絶された、％細胞傷害百分率
＊：サンプルのＯＤ値の標準偏差が１６と１１との間にある
コメントなし：サンプルのＯＤ値の標準偏差が１０未満である
【０１２５】
結果は、タンパク質単独では、上清中で、非常に多い量（１００ｎｇのＭＲＰ１４）での非特異的様式を除いては、傷害性ではないことを示す。組み合わせＧＭ２ＡＰ（１００ｎｇ）／ＭＲＰ１４（１００ｎｇ）のみが、相対的な細胞傷害性を示すと考えることができる。
【０１２６】
ＧＭ２ＡＰタンパク質をこの組み合わせで変異ＧＭ２ＡＰタンパク質と置き換えた場合、下記に示すように、特定の混合物について同じタイプの傷害性が得られる。
【０１２７】
【表４Ｃ】
【０１２８】
％Ｃ：細胞傷害百分率
＊：ＯＤの標準偏差が１４と１１との間にある
コメントなし：サンプルのＯＤ値の標準偏差が１０未満である
上清中でのタンパク質のおよその濃度：変異ＧＭ２ＡＰ：２００ｎｇ／ｍｌ；ＭＲＰ１４：３５０ｎｇ／ｍｌ
【０１２９】
太字で示した多くの値について、組み合わせ変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４は傷害性である。変異ＧＭ２ＡＰタンパク質単独では、細胞傷害性効果を有しない。ＭＲＰ１４単独では、細胞傷害活性を示すとは考えられない。
【０１３０】
ヒト組み換えタンパク質、ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４および変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４を含む上清の組み合わせの細胞傷害性は、規模が同じであり、タンパク質産生バッチの関数として、非ヒト組み換えタンパク質よりも高い安定性を示すことが見出される。しかしながら、これは、ＭＳ患者の生物学的流体中で見出されるグリア傷害活性の安定性、再現可能性および強度に対応しない。
【０１３１】
【表４Ｄ】
【０１３２】
％Ｃ：細胞傷害百分率
上清中のタンパク質のおよその濃度：ＧＭ２ＡＰ（バッチ１）：３００ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ２ＡＰ（バッチ２）：２００ｎｇ／ｍｌ。天然ＭＲＰ１４／８の濃度：１．３ｍｇ／ｍｌ。
【０１３３】
表４Ｄの結果から、ＧＭ２ＡＰ単独では細胞傷害活性を有しないこと、および太字で示した特定の値については、組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／ＭＲＰ８は細胞傷害性効果を有することがわかる。この細胞傷害性は、用いる上清バッチに依存する。
【０１３４】
【表４Ｅ】
％Ｃ：細胞傷害百分率
上清中のタンパク質のおよその濃度：変異ＧＭ２ＡＰ：２００ｎｇ／ｍｌ。天然ＭＲＰ１４／８の濃度：１．３ｍｇ／ｍｌ。
【０１３５】
表４Ｅから、組み合わせ変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４／ＭＲＰ８は細胞傷害活性を全く示さないことが明らかである。
【０１３６】
これらの研究は、再生されたＭＳ尿のみから精製されたグリア傷害性画分中では、所望のグリア傷害活性を有するタンパク質は単独で同定されず、また、目的とするグリア傷害活性および「非ヒト」または「ヒト」組み換えの形態で産生されるタンパク質の組み合わせは、弱くかつ比較的再現不可能な（たとえ、改善が「ヒト」組み合わせについて見出されても）グリア傷害活性しか示さないことを示す。得られた結果は、グリア傷害活性（高い活性、安定性、再現可能性、用量−応答効果）を特徴付ける全ての基準に適合していない。
【０１３７】
結果は、タンパク質分析で同定されなかった必須成分が欠けていることを示す。
【０１３８】
次いで、本発明者らは、驚くべきことに、特定の複合体脂質中の脂質は、本文脈で有利な候補であることを見出した。これを実証するため、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＭ２およびスルファチドを試験した。以下の実施例に示すように、これらの脂質のなかでも、ガングリオシドＧＭ２は、唯一の証明力となるものであったことが判明した。
【０１３９】
実施例７：ガングリオシドＧＭ２との組み合わせにおける「ヒト」組み換えタンパク質の傷害性
ガングリオシドＧＭ２（Ｊ．Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ教授（Ｌｙｏｎ、フランス）により提供された）を、最終濃度５０μｇ／ｍｌで、既に調製したＭＲＰ１４、ＧＭ２ＡＰおよび変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を含む「ヒト」組み換えタンパク質の組み合わせに添加した。
【０１４０】
組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４および変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４を、ＧＭ２ＡＰおよび変異ＧＭ２ＡＰ組み換えタンパク質についてタンパク質範囲：０、５、１０、２０、５０、１００ｎｇで、およびＭＲＰ１４タンパク質について２００ｎｇまでのタンパク質範囲で、試験した。これらの範囲は、ガングリオシドＧＭ２との組み合わせで、または組み合わせにすることなく、調製した。
【０１４１】
混合した後、組み合わせを一晩４℃でインキュベートし、次いで、それらの傷害性をＭＴＴアッセイを用いて評価した。
【０１４２】
得られた結果を、表５および添付の図面に記載する。
表５Ａ：
ガングリオシドＧＭ２と組み合わせられかつ関連する「ヒト」タンパク質のグリア傷害活性の測定（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）
【０１４３】
【表５Ａ】
【０１４４】
％Ｃ：細胞傷害性百分率
ｇＧＭ２：ガングリオシドＧＭ２
＊：サンプルの標準偏差ＯＤが１３と１１との間にある
コメントなし：サンプルの標準偏差ＯＤが１０未満
上清中のおよその濃度：ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４：２μｇ／ｍ１
【０１４５】
一定濃度のガングリオシドと組み合わせた組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４は、ＭＲＰ１４タンパク質の量と平行して増加するグリア傷害性効果を示す。さらに、ＧＭ２ＡＰタンパク質の量（２０および１０ｎｇ）を増加させるため、段階的に増加する典型的な用量応答効果が得られる。しかしながら、終点では、十分なＭ２ＡＰタンパク質がない場合（５ｎｇ）、傷害性はみられない。逆に、ＧＭ２ＡＰタンパク質が多すぎる場合（５０ｎｇおよび１００ｎｇ）、６０％付近で水平状態にある傷害性の飽和がみられる。事実として、グリア傷害性因子に曝露する間の培養における増殖を受けるＣＬＴＴ１−１細胞のみが感受性である。このことは、グリア傷害性の水平状態が１００％に到達しない理由を説明する。
表５Ｂ：
ガングリオシドＧＭ２と組み合わせたまたは組み合わせていない、組み合わせ「ヒト」タンパク質のグリア傷害活性の測定（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）
【０１４６】
【表５Ｂ】
【０１４７】
％Ｃ：細胞傷害百分率
ｇＧＭ２：ガングリオシドＧＭ２
＊：サンプルの標準偏差ＯＤが１３と１１との間にある
コメントなし：サンプルの標準偏差ＯＤが１０未満
【０１４８】
ガングリオシドＧＭ２なしでは、組み合わせ変異ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４はグリア傷害性ではない。ガングリオシドなしの組み合わせと比べて、ガングリオシドＧＭ２を有する混合物の細胞傷害性には全体的な増加が観察される。測定の変動性は、変異ＧＭ２ＡＰタンパク質を用いたときのほうが明らかに大きい。全体的に、活性は顕著であり、２つの変数（変異ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４）を用いた用量効果に従って最大濃度の水平状態（例：上述した、アッセイの間の増殖を受けた細胞のプールで到達する最大値）に到達するように思われる。
【０１４９】
ガングリオシドＧＭ２の作用が、ヒト組み換えタンパク質ＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４（５ｎｇのＭＲＰ１４および５０ｎｇまたは１００ｎｇのＧＭ２ＡＰ）の組み合わせの傷害性に実際に特異的であるかどうかを決定するため、他の脂質：（ガングリオシドＧＭ１およびスルファチド）を並行して試験した。用いた濃度範囲は、最終濃度が０、１０、２０、３０および５０μｇ／ｍｌである。脂質を添加すると、組み合わせを４℃で一晩インキュベートし、次いで、それらの傷害性をＭＴＴアッセイにおいて評価する。表５Ｃおよび５Ｄに示す結果は、用量が３０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの組み合わせＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４については、ガングリオシドＧＭ２との組み合わせのみが、グリア細胞に対する傷害性（それぞれ２７％および３０％）を示した。他の脂質は、タンパク質組み合わせを用いて傷害性を示さない。
表５Ｃ：組み合わせ「ヒト」組み換えタンパクＧＭ２ＡＰ／ＭＲＰ１４のグリア傷害活性におけるガングリオシドＧＭ２の影響
【０１５０】
【表５Ｃ】
【０１５１】
１００ｎｇ ＧＭ２ＡＰについては、これは２回のアッセイの平均である。
ｇＧＭ２：ガングリオシドＧＭ２
【０１５２】
表５Ｄ：組み合わせ「ヒト」組み換えタンパク質のグリア傷害活性におけるガングリオシドＧＭ２の影響
【０１５３】
【表５Ｄ】
【０１５４】
研究の結果は、
活性が、ＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４タンパク質を含むタンパク質ヘテロ複合体と関連すること；
ガングリオシドＧＭ２のような脂質の添加が、目的とするグリア傷害活性の産生と適合した活性、再現可能性および用量応答効果のレベルを得ることを可能にすること；
ＧＭ２ＡＰタンパク質に見いだされる変異は、インビトロでのグリア傷害性の決定論に必須ではないことを示す。
【０１５５】
しかしながら、これは、インビボでは、ＧＭ２ＡＰタンパク質のバイオアベイラビリティーのプロセスに必要かどうかを決定するものとなり得る（例、中枢神経系の細胞外媒体）。
【０１５６】
従って、これらの因子は、ガングリオシドＧＭ２と組み合わせたヘテロ複合体ＭＲＰ１４／ＧＭ２ＡＰまたはＭＲＰ１４／変異ＧＭ２ＡＰは、主に、または単独であっても、グリア傷害活性のベクターであることを示す。
【０１５７】
実施例８：グリア傷害性複合体の免疫アッセイの開発−ＥＬＩＳＡアッセイの前のサンプルの調製
（ｉ）試験したサンプル
試験したサンプルは：
最初に、活性の組み換え複合体を検出するための、可能ならば正常尿中で希釈された、ガングリオシドＧＭ２と組み合わせたまたは組み合わせていない、ヒト組み換えタンパク質（ＧＭ２ＡＰ＋ＭＲＰ１４）であり、
次に、尿中での直接検出のための正常尿およびＭＳ尿である。
【０１５８】
サンプルを調製するとすぐに、検出アッセイのために４℃で２４時間インキュベートした。
【０１５９】
「ヒト」組み換えタンパク質を粗製上清の形態で用い、２９３Ｔ細胞を適切なネガティブコントロールを用いて平行に一時的に形質転換した後に回収する。ＭＲＰ１４およびＧＭ２ＡＰタンパク質をアッセイするのに用いられるシステムは、準定量的であり、特定される量は指示的である。結果を以下の実施例に示す。
【０１６０】
（ｉｉ）サンプルの処理
以下の実施例に示すように、「サンドウィッチ」ＥＬＩＳＡ様式で抗ＭＲＰ１４および抗ＧＭ２ＡＰ抗体を用いる検出方法により、陽性の結果を得ることが可能になる。
【０１６１】
しかしながら、本発明者らは、タンパク質をプロテイナーゼＫの存在下で消化することからなる工程、次いでトリクロロ酢酸を用いて沈殿させる元の方法により、このプロテイナーゼを不活性化することからなる工程、次いで、ｐＨをトリス−マレイン酸緩衝液（引き続くサンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイとの適合性を有するために選択された）で中和することからなる工程を含むサンプルの前処理を行うことにより、この検出方法を最適化した。
【０１６２】
このサンプルの処理は、その種々の工程により独自のものであるが、引き続いて以下の実施例で示される分析に適用され、これを以下に詳細に説明する。
【０１６３】
複合体の検出の前に、以下のプロトコールに従い、サンプル（組み換えタンパク質または尿の混合物）をプロテイナーゼＫで処理する：
【０１６４】
サンプル１００μｌ当たり０．３ｍｇのプロテイナーゼＫを添加する。３７℃で１時間の消化後、プロテイナーゼＫの活性を阻害するため、トリクロロ酢酸を用いて沈殿を行う。９０％トリクロロ酢酸（４８ｍｌの蒸留水当たり９０ｇのトリクロロ酢酸）をサンプルに添加する（サンプルの初期体積の１５％）。混合物を４℃で３０分インキュベートした。
【０１６５】
１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、ペレットを、サンプルの初期体積と等しい体積で、０．２ｍトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．２）（濃度ファクターなしのアッセイの場合）と共に、または（体積の観点から、消化されていないタンパク質の濃縮を実施するための）任意の最小体積で取り出す。
【０１６６】
プロテイナーゼＫで処理したサンプルをＷｅｓｔｅｒｎブロッティング技術により確認した後、観察を行うことができ、処理はプロテイナーゼＫの量およびその作用時間を増加させることにより最適化することができる。
【０１６７】
実施例９：サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイにおいてヘテロ複合体を検出するためのプロトコール
（ｉ）抗体の産生：下記のプロトコールに従い、以下の抗体を産生した：
−ポリクローナル抗体（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）：
−ウサギポリクローナル抗体１９６（抗ＭＲＰ１４ペプチド）
−ウサギポリクローナル抗体７９（抗組み換えＧＭ２ＡＰタンパク質）
−モノクローナル抗体（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）：
−４Ａ７Ｂ１０
−５Ｈ７Ｃ１０
−２Ｂ９Ｈ２
−１０Ｅ１１Ａ１１
−１３Ｈ９Ｃ９
−１９Ｃ１１Ｃ１０
−１３Ｄ１Ｅ５
−２Ｇ１２Ｈ５。
【０１６８】
抗ＧＭ２ＡＰモノクローナル抗体：１０Ｅ１１Ａ１１、１３Ｄ１Ｅ５、１３Ｈ９Ｃ９、１９Ｃ１１Ｃ１０および２Ｇ１２Ｈ５。
マウスを、以下のプロトコールに従って免疫化した：第０日に、７５μｇの複合体ＧＭ２ＡＰ−ＭＲＰ１４を、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下で腹腔内注射した。第２３日および第３７日に、同量の複合体ＧＭ２ＡＰ−ＭＲＰ１４を、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下でさらに腹腔内注射した。融合の４日前に、生理食塩水中で希釈した５０μｇのＧＭ２ＡＰ抗原を静脈内注射した。
【０１６９】
１９００の上清を、間接的ＥＬＩＳＡ技術によりスクリーニングした。プレートを、１００μｌの抗原（複合体ＧＭ２ＡＰ−ＭＲＰ１４）を用いて、１μｇ／ｍｌで、０．０５ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で「コーティング」した。「コーティング」されたプレートを、１８−２２℃の温度で一晩インキュベートした。プレートを、２００μ１のＰＢＳ−ｌ％牛乳で飽和させ、３７℃＋／−２℃で１時間インキュベーションに供した。１００μｌの上清またはＰＢＳ緩衝液−０．０５％ツイーン２０中の腹水流体を添加し、プレートを３７℃＋／−２℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液−ｌ％ＢＳＡ中で１／２０００に希釈したアルカリフォスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｆ：１１５−０５５−０６２）に複合体化した１００μｌのヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体を添加し、次いで、プレートを、３７℃＋／−２℃で１時間インキュベートした。ＤＥＡ−ＨＣｌ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ｒｅｆ ６０００２９８９）中で２ｍｇ／ｍｌの濃度（ｐＨ＝９．８）の１００μｌのＰＮＰＰ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ｒｅｆ ６０００２９９０）を添加した。プレートを３７℃＋／−２℃で３０分インキュベーションに供した。１００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加することにより、反応をブロックした。各工程間で、３００μｌのＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０を用いて、３回の洗浄を行った。ＰＮＰＰを添加する前に。蒸留水中で追加の洗浄を行った。
【０１７０】
１５０個の上清は、間接的ＥＬＩＳＡにより、ＯＤ＞０．９の陽性であることが見出された。特異的アッセイ後、上記５つの抗体が産生される。
【０１７１】
抗ＭＲＰ１４モノクローナル抗体：２Ｂ９Ｈ２、４Ａ７Ｂ１０および５Ｈ７Ｃ１０。
マウスを、以下のプロトコールに従って免疫化した：第０日に、７５μｇの複合体ＧＭ２ＡＰ−ＭＲＰ１４を、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下で腹腔内注射した。第２３日および第３７日に、同量の複合体を、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下で腹腔内注射した。融合の４日前に、生理食塩水中で希釈した５０μｇのＭＲＰ１４抗原を静脈内注射した。
【０１７２】
１１００個の上清を、上述のように、間接的ＥＬＩＳＡ技術により試験およびスクリーニングした。３００個の上清は、ＯＤ＞１の陽性であることが見出された。特異的アッセイ後、上記３つの抗体が産生された。
【０１７３】
ウサギポリクローナル抗体７９（抗組み換えＧＭ２ＡＰタンパク質）。
ウサギを、以下のプロトコールに従って免疫化した：第０日に、１０ｍｌの第一の血液サンプルを取り、７５μｇのＧＭ２ＡＰを、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）（７５μｇの免疫原＋ｑｓ ０．５ｍｌの９°／００生理学的食塩水＋０．５ｍｌ ＣＦＡ）の存在下で腹腔内注射した。第２８日および第５６日に、同量の免疫原を、０．５ｍｌの不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）の存在下、同様の条件下で腹腔内注射した。第６３日に、３０ｍｌの第二の血液サンプルを、抗凝固剤なしで耳から採取した。第７０日に、第三の血液サンプルを、同様の条件下で採取した。
【０１７４】
ウサギポリクローナル抗体１９６（抗ＭＲＰ１４ペプチド）。
ウサギを、以下のプロトコールに従って免疫化した：
第０日に、１０ｍｌの第一の血液サンプルを取り、８０μｇの免疫原を、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）（８０μｇの免疫原＋ｑｓ ０．５ｍｌの９°／００生理学的食塩水＋０．５ｍｌ ＣＦＡ）の存在下で腹腔内注射した。第２８日および第５６日に、同量の免疫原を、０．５ｍｌの不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）の存在下、同様の条件下で腹腔内注射した。第６３日に、３０ｍｌの第二の血液サンプルを、抗凝固剤なしで耳から採取した。第７０日に、第三の血液サンプルを、同様の条件下で採取した。
【０１７５】
これらの抗体を、捕捉または検出のために用いる。これらをサンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイにおける検出に用いる場合、抗体をビオチニル化する。
【０１７６】
（ｉｉ）サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイ：
サンプル（プロテイナーゼＫおよびＴＣＡ沈殿物）の処理を行う場合、４℃での一晩のインキュベーションの後でかつサンドウィッチＥＬＩＳＡ検出アッセイの前に行う。
【０１７７】
捕捉抗体を、炭酸−重炭酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．５）中、１μｇで「コーティング」する；１００μｌを、９６−ウェルマイクロプレートのウェルに入れる。プレートを保護フィルムで覆い、周囲温度で一晩インキュベートする。ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）−０．０５％ツイーン中での３回の洗浄後、非特異的部位をＰＢＳ−０．０５％ツイーン、モノクローナル抗体用のヤギ血清（１／１０）またはポリクローナル抗体用の１００μｌのカゼイン加水分解物でブロックする。ＰＢＳ−０．０５％ツイーンでの３回の洗浄後、処理したまたは非処理のサンプルを、ウェル当たり１００μｌの割合で入れ、撹拌しながら３７℃で１時間３０分インキュベートした。
【０１７８】
ＰＢＳ−０．０５％ツイーンでの３回の洗浄後、１００μｌのビオチニル化検出抗体を、１μｇ／ｍｌで各ウェルに入れ、３７℃で１時間３０分インキュベートする。
【０１７９】
ＰＢＳ−０．０５％ツイーンでの３回の洗浄後、シグナルを増幅するため、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）に結合した１００μｌのストレプトアビジンを０．２μｇ／ｍｌで各ウェルに入れ、３７℃で１時間３０分インキュベートする。
【０１８０】
ＰＢＳ−０．０５％ツイーンでの３回の洗浄後、１００μｌのＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン二塩酸）溶液を、２ｇ／ｌで各ウェルに入れ、周囲温度で１０分インキュベートする。反応を１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止する。光学密度を４９２ｎｍで読み取る。
【０１８１】
同様に、抗ヘテロ複合体抗体、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４または変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４の産物を、ＢＡＬＥ／ｃマウスを腹腔内注射により免疫化するための免疫原として用いる。第一の注射は、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて行う。他の注射は、４〜８週の間隔で、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて行う。最終追加抗原を、生理食塩水中での融合の数日前に与える。この抗原追加後、免疫化マウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞を回収する。次いで、脾臓細胞と骨髄腫株との融合を行い、免疫化に用いられるヘテロ複合体をＥＬＩＳＡにより認識する抗体を分泌する細胞を選択する。最後に、免疫ヘテロ複合体に特異的な抗体を産生する、すなわち、ＧＭ２ＡＰ、変異ＧＭ２ＡＰまたはＭＲＰ１４はいずれも単独では認識しない、クローンを選択する。
【０１８２】
実施例１０：ヒト組み換えヘテロ複合体の検出
以前の実施例で分子的に特徴付けられたグリア傷害活性の酵素免疫アッセイは、関与するタンパク質（ＧＭ２ＡＰ、変異ＧＭ２ＡＰおよびＭＲＰ１４タンパク質）のみを用いる抗原／抗体系、およびこの分子複合体を検出し得る（単独または組み合わせの）抗体を含む。
【０１８３】
組み換え複合体は、最終濃度５０μｇ／ｍｌのガングリオシドＧＭ２と組み合わせた組み換えタンパク質ＧＭ２ＡＰ（１０００ｎｇ）およびＭＲＰ１４（５０ｎｇ）の上清の組み合わせに対応する。
【０１８４】
（ｉ）プロテイナーゼＫ処理を行わない、組み換えグリア傷害性ヘテロ複合体の検出
傷害性の組み合わせが直接検出可能であったかどうかを決定するため、「ヒト」組み換えタンパク質ＭＲＰ１４およびＧＭ２ＡＰをガングリオシドＧＭ２と組み合わせ、４℃で一晩インキュベートし、抗ＭＲＰ１４および抗ＧＭ２ＡＰ抗体を用いて、サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイにより試験する。
【０１８５】
組み合わせ［ＭＲＰ１４、ＧＭ２ＡＰおよびガングリオシドＧＭ２］を正常尿（ＭＴＴ傷害性アッセイでグリア傷害性ではない）中で希釈する。結果を表６に示す。これらの結果は、抗ＧＭ２ＡＰ捕捉抗体／抗ＭＲＰ１４検出抗体対が、非常に再現可能な様式で組み換え複合体を認識することを示す。結果を表６に示す。
【０１８６】
【表６】
【０１８７】
陽性アッセイ：陽性アッセイの数
アッセイ合計：アッセイの総数
【０１８８】
（ｉｉ）プロテイナーゼＫ処理後の、組み換えグリア傷害性ヘテロ複合体の検出
上記のように、グリア傷害活性はプロテイナーゼＫに耐える。従って、サンプル（組み合わせＧＭ２ＡＰ＋ＭＲＰ１４＋ＧＭ２）をプロテイナーゼＫで処理することにより、非複合体タンパク質は破壊され、バックグラウンドノイズが減少する。
【０１８９】
前述の章と同様に、組み合わせを４℃で一晩インキュベートする。しかしながら、それらを試験する前に、実施例８（ｉｉ）に記載のプロトコールに従い、サンプルをプロテイナーゼＫで処理し、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）で沈殿させる。
【０１９０】
結果を表７に示す。これらの結果は、特に、抗ＭＲＰ１４捕捉抗体／抗ＧＮ２ＡＰ検出抗体対［４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７ＣｌＯ］／［１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１ｌＣｌＯ］、［４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０］／１０Ｅ１１Ａ１１、２Ｂ９Ｈ２／１０Ｅ１１Ａ１１および２Ｂ９Ｈ２／［１３Ｈ９Ｃ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０］が、プロテイナーゼＫ処理後に、尿中で希釈された上清中の組み換え複合体を、非常に再現可能な様式で検出することを示す。バックグラウンドノイズは顕著に減少する。
【０１９１】
【表７】
【０１９２】
陽性アッセイ：陽性アッセイの数
アッセイ合計：アッセイの総数
【０１９３】
実施例１１：患者の尿中のヘテロ複合体の検出
患者の尿中の複合体の直接的な検出を、２つの代表的な尿：ＭＳ尿および正常尿で試験した。
【０１９４】
結果を表８に記載する。これらの結果は、抗ＭＲＰ１４捕捉抗体／抗ＧＭ２ＡＰ検出抗体対［４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｃ１０］／［１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５］、［４Ａ７Ｂ１０＋５Ｈ７Ｇ１０］／１０Ｅ１１Ａ１１、２Ｂ９Ｈ２／［１３Ｄ１Ｅ５＋２Ｇ１２Ｈ５］および２Ｂ９Ｈ２／［１３Ｈ９Ｇ９＋１９Ｃ１１Ｃ１０］が複合体を検出することを示す。
【０１９５】
【表８】
【０１９６】
プロテイナーゼＫで処理した尿については、ＴＣＡを用いた濃縮は行わない。
【０１９７】
グリア傷害活性と臨床的状況との間の相関は非常に良好であることが判明しているので１、３、４、実施例に記載の方法は、多発性硬化症の生物学的マーカーのアッセイ用の診断ツールとして有用である。
【０１９８】
参考文献目録：
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３．Ｍｅｎａｒｄ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２４５，４９−５２．
４．Ｍａｌｃｕｓ−Ｖｏｃａｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｌｉａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ７，３８３−３８８，
５．Ｎ．Ｂｅｎｊｅｌｌｏｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，４４（４），５７９−５８３．
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９．Ｃｈａｕｄｒａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４−３９７．
１０．Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）．
１１．Ｒｅｉｃｈｍａｎ．．ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）．
１２．Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２；５９３−５９６（１９９２）．
１３．Ｇａｌｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（１９９０）２６ ２６９−２７７．
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】三元複合体ＧＭ２ＡＰ＋ＭＲＰ１４＋ＧＭ２（ＧＭ２：最終濃度５０μｇ／ｍｌ）の用量応答曲線を示す。ＭＲＰ１４の量はｘ軸（ｎｇ）に沿って表され、死んだ細胞に対応する細胞傷害百分率は、ｙ軸に沿って表される。この図では、ＧＭ２ＡＰの量（ｎｇ）は、それぞれ、以下の記号で表される：φ：５ｎｇ、π：１０ｎｇ、Ψ：２０ｎｇ、υ：５０ｎｇおよびχ：１００ｎｇ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症に関連する、単離した細胞傷害性因子であって、
ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４から選択され、変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応するものであることを特徴とする細胞障害性因子。
【請求項２】
多発性硬化症に関連する細胞傷害性因子を、生物学的サンプル中において検出および／または定量する方法であって
ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４（変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応する）から選択されるヘテロ複合体を、前記生物学的サンプルから単離することを特徴とする方法。
【請求項３】
ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を用いてヘテロ複合体を単離し、
前記ヘテロ複合体と前記抗体とからなる複合体の形成を示すことにより、前記細胞障害性因子を検出および／または同定することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも２つの抗体を用いてヘテロ複合体を単離し、
前記ヘテロ複合体と前記２つの抗体とからなる複合体の形成を示すことにより、前記細胞障害性因子を検出および／または同定することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの抗体は捕捉抗体であり、少なくとも他方の抗体は検出抗体であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２つの抗体を用いてヘテロ複合体を単離し、そのうち少なくとも１つはヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰに特異的に結合し、少なくとも他方はヘテロ複合体のＭＲＰ１４に特異的に結合し、前記ヘテロ複合体と前記２つの抗体とからなる複合体の形成を示すことにより、前記細胞障害性因子を検出および／または同定することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの抗体は捕捉抗体であり、少なくとも他方の抗体は検出抗体であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
試験サンプルを、以下を含む前処理に供することを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
サンプルのタンパク質を、プロテイナーゼＫで消化することからなる工程；
前記プロテイナーゼＫを不活性化させることからなる工程；および
ｐＨを中和することからなる工程。
【請求項９】
プロテイナーゼＫを不活性化させることからなる工程は、トリクロロ酢酸を用いた沈殿により行われ、ｐＨを中和することからなる工程は、トリスマレイン酸緩衝液の添加により行われる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルは、血清、血漿、尿及び脳脊髄液から選択される請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
発性硬化症に関連する細胞傷害性因子を検出および／または定量するための組成物であって、
前記細胞障害性因子は、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４（変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応する）から選択されるものであり、
ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも２つの抗体を含むことを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
発性硬化症に関連する細胞傷害性因子を検出および／または定量するための反応混合物であって、
前記細胞障害性因子は、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４（変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応する）から選択されるものであり、
少なくとも２つの抗体（そのうち少なくとも１つの抗体はヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰに特異的に結合し、少なくとも他方の抗体はヘテロ複合体のＭＲＰ１４に特異的に結合する）を含むことを特徴とする反応混合物。
【請求項１４】
少なくとも１つの抗体は捕捉抗体であり、少なくとも他方の抗体は検出抗体であることを特徴とする請求項１３記載の反応混合物。
【請求項１５】
少なくとも２つの抗体に結合しているヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４又は変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４を含む複合体であって、
そのうち少なくとも１つの抗体はＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰに特異的であり、少なくとも他方の抗体はＭＲＰ１４に特異的であることを特徴とする複合体。
【請求項１】
多発性硬化症に関連する、単離した細胞傷害性因子であって、
ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４から選択され、変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応するものであることを特徴とする細胞障害性因子。
【請求項２】
多発性硬化症に関連する細胞傷害性因子を、生物学的サンプル中において検出および／または定量する方法であって
ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４（変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応する）から選択されるヘテロ複合体を、前記生物学的サンプルから単離することを特徴とする方法。
【請求項３】
ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を用いてヘテロ複合体を単離し、
前記ヘテロ複合体と前記抗体とからなる複合体の形成を示すことにより、前記細胞障害性因子を検出および／または同定することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも２つの抗体を用いてヘテロ複合体を単離し、
前記ヘテロ複合体と前記２つの抗体とからなる複合体の形成を示すことにより、前記細胞障害性因子を検出および／または同定することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの抗体は捕捉抗体であり、少なくとも他方の抗体は検出抗体であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２つの抗体を用いてヘテロ複合体を単離し、そのうち少なくとも１つはヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰに特異的に結合し、少なくとも他方はヘテロ複合体のＭＲＰ１４に特異的に結合し、前記ヘテロ複合体と前記２つの抗体とからなる複合体の形成を示すことにより、前記細胞障害性因子を検出および／または同定することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの抗体は捕捉抗体であり、少なくとも他方の抗体は検出抗体であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
試験サンプルを、以下を含む前処理に供することを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
サンプルのタンパク質を、プロテイナーゼＫで消化することからなる工程；
前記プロテイナーゼＫを不活性化させることからなる工程；および
ｐＨを中和することからなる工程。
【請求項９】
プロテイナーゼＫを不活性化させることからなる工程は、トリクロロ酢酸を用いた沈殿により行われ、ｐＨを中和することからなる工程は、トリスマレイン酸緩衝液の添加により行われる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルは、血清、血漿、尿及び脳脊髄液から選択される請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
発性硬化症に関連する細胞傷害性因子を検出および／または定量するための組成物であって、
前記細胞障害性因子は、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４（変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応する）から選択されるものであり、
ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
ヘテロ複合体に特異的に結合する少なくとも２つの抗体を含むことを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
発性硬化症に関連する細胞傷害性因子を検出および／または定量するための反応混合物であって、
前記細胞障害性因子は、ヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４及び変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４（変異ＧＭ２ＡＰは配列番号２に対応する）から選択されるものであり、
少なくとも２つの抗体（そのうち少なくとも１つの抗体はヘテロ複合体のＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰに特異的に結合し、少なくとも他方の抗体はヘテロ複合体のＭＲＰ１４に特異的に結合する）を含むことを特徴とする反応混合物。
【請求項１４】
少なくとも１つの抗体は捕捉抗体であり、少なくとも他方の抗体は検出抗体であることを特徴とする請求項１３記載の反応混合物。
【請求項１５】
少なくとも２つの抗体に結合しているヘテロ複合体ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４又は変異ＧＭ２ＡＰ／ＧＭ２／ＭＲＰ１４を含む複合体であって、
そのうち少なくとも１つの抗体はＧＭ２ＡＰまたは変異ＧＭ２ＡＰに特異的であり、少なくとも他方の抗体はＭＲＰ１４に特異的であることを特徴とする複合体。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５０５０５３（Ｐ２００８−５０５０５３Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４６２８６（Ｐ２００６−５４６２８６）
【出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５０７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６３８１０
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【出願人】（５０２０２１５５６）アンスティテュート ナシオナル ド ラ サント エ ド ラ ルシェルシュ メディカル （アンセルム） (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５０７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６３８１０
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【出願人】（５０２０２１５５６）アンスティテュート ナシオナル ド ラ サント エ ド ラ ルシェルシュ メディカル （アンセルム） (2)
【Ｆターム（参考）】
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