卵巣癌用のバイオマーカー
本発明は、患者における卵巣癌の症状を認定するのに有用な、タンパク質ベースのバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせを提供する。特に、本発明のバイオマーカーは、対象のサンプルを卵巣癌、悪性度の低い見込みの卵巣癌、良性の卵巣疾患又は他の悪性の症状として分類するのに有用である。バイオマーカーは、ＳＥＬＤＩ質量分析により検出することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年６月２４日出願の米国特許仮出願第６０／６９３，７５５号及び２００６年３月２２日出願の同第６０／７８５，０３１号に関連し、その全てを参照して本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（発明の分野）
発明は一般的に、臨床診断、特に卵巣癌の臨床診断に関連したものである。
【背景技術】
【０００３】
卵巣癌は、先進国において最も死亡率の高い婦人科の悪性腫瘍の一つである。アメリカ合衆国だけでも年間に、約２３，０００名の女性が本疾病であると診断され、ほぼ１４，０００名が本疾病により死亡している（Jamal, A., et al., CA Cancer J. Clin., 52:23-47 (2002)）。癌治療法の進歩に拘らず、卵巣癌の死亡率は、過去２０年間実質的には変化がないままである（同上の文献）。疾病が診断された段階に応じた生存率の急勾配を考慮するならば、早期検出は、卵巣癌患者の長期生存率の改善に最も重要な要素であり続けている。
【０００４】
後期段階に診断された卵巣癌の予後不良、確証的診断手段に関連した費用とリスク並びに一般の母集団における比較的少ない患者数が相俟って、一般母集団における卵巣癌患者のスクリ−ニングに適用する検査の感度及び特異性に極めて厳しい要件が求められている。
【０００５】
癌の初期検出及び診断に適した腫瘍マーカーの識別により、患者の臨床成績の改善が大きく期待できる。曖昧な症状を示す患者、全く症状を示さない患者又は検診において比較的判断しにくい癌を有する患者にとって、腫瘍マーカーは特に重要である。初期段階における検出を目指して大きな努力が払われているにも拘らず、対費用効果の高い検査は開発されておらず（Paley, Curr. Opin. Oncol., 13(5):399-402 (2001)）、女性は一般に、診断時に播腫性の疾患の症状を示す（「婦人科腫瘍の本質と実際(Hoskins WJ, Perez CA, Young RC, editors., 3rd ed. Philadeiphia: Lippincott, Williams and Wilkins; pages981-1057 (2000))」の「上皮性卵巣癌（Ozols RF, et al.）」）。
【０００６】
最も良く特徴が知られている腫瘍マーカーであるＣＡ１２５は、ステージＩの卵巣癌のおよそ３０％から４０％では陰性であり、多くの良性の疾患ではその割合は上昇する（Meyer et al., Br. J. Cancer, 82(9):1535-8 (2000); Buamah, J. Surg. Oncol., 75(4):264-5 (2000); Tuxen, et al., Cancer Treat. Rev., 21(3):215-45 (1995)）。卵巣癌の初期段階での検出の集団ベースのスクリ−ニングの手段として並びに診断としてのそれの使用は、感度及び特異性が低いため無理である（「MacDonald et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 82(2):155-7 (1999)」；「Jacobs et al., Hum. Reprod., 4(1):1-12 (1989)」；「腫瘍マーカーの生理学的、病理生物学的、技術工学的並びに臨床的適用（Diamandis, Fritsche, Lilja, Chan, and Schwartz, editor, Philadelphia: AACC Press; in press)」における「卵巣癌における腫瘍マーカー（Shih et al.)」）。骨盤及び更に近年では膣の超音波検査が、リスクの高い患者をスクリ−ニングするために使用されているが、いずれも一般集団に適用するためには技術的に感度及び選択性が十分ではなかった。（MacDonald et al., supra）。癌モデルの長期リスク（Skates et al., Cancer, 76(10 Suppl);2004-10 (1995)）において、別の腫瘍マーカーとＣＡ１２５との併用（「Woolas et al., J. National Cancer Inst., 85(21):1748-51 (1993)」；「Woolas et al., Gynecol. Oncol., 59(1):111-6 (1995)」；「Zhang et al., Gynecol. Oncol., 73(1):56-61 (1999)」；「ステージＩの上皮卵巣癌を検出するための複数マーカーの利用：ニューラル・ネットワーク解析による性能の向上（Zhang et al., American Society of Clinical Oncology 2001）；年会の要旨」）、並びに２次検査として超音波検査と平行してのＣＡ１２５の使用（「Jacobs et al., Br. Med. J., 306(6884):1030-34 (1993)」及び「Menson et al., British Journal of Obstetrics and Gynecology, 107(2):165-69 (2000)」）での近年の試みでは、比較的低い有病率を示す卵巣癌のような疾病にとって極めて重要な、検査全体の特異性の改善に繋がる有望な結果が得られている。
【０００７】
後期卵巣癌の悲惨な予後のために、最小の陽性予測値が１０％の検査でさえも臨床医は受け入れるであろうということは、一般的なコンセンサスである。（Bast et al., Cancer Treatment and Research, 107:61-97 (2002)）。これを一般の集団に拡張するには、一般スクリ−ニング検査の感度は７０％を超え、選択性は９９．６％を超える必要がある。近年、ＣＡ１２５、ＣＡ７２−４又はＭ−ＣＳＦ等の現存の血清マーカーは、何れも一つ一つではそのような性能を有していない（Bast et al., Int. J. Biol. Markers, 13:179-87 (1998)）。
【０００８】
従って、それ自体で又は他のマーカー若しくは診断モダリティーとの併用で卵巣癌の初期検出において必要な感度及び特異性を示す、新しい血清マーカーが切実に求められている（「卵巣癌：卵巣癌の初期検出、展望と実現性」（Bast et al.,：ISIS Medical Media Ltd., Oxford, UK (2001), in press））。許容されるスクリーニング検査がない状態での初期検出は、卵巣癌患者の長期生存率を改善させる最も重要な要因を依然として残したままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、患者の卵巣癌の症状を判定するための信頼できる且つ正確な方法の確保が、望まれており、その様な方法の結果を用いると対象の治療が管理可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、卵巣癌を診断するのに有用な新規なバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせ、更に卵巣癌の診断にバイオマーカーを使用する方法及びキットを提供することにより、これらの要望を満たすものである。
【００１１】
より具体的には、一態様として、本発明は、（ａ）対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおける少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）を測定すること、そして、（ｂ）その測定結果を卵巣癌の症状と関連付けること、を含んでなる、対象の卵巣癌の症状を認定する方法を提供するものである。一態様として、バイオマーカーの少なくとも一つは、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ、カルサイクリン、トランスサイレチン（二重荷電）及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる。別な態様では、前記方法は、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ、カルサイクリン、トランスサイレチン及びＩｇＧ重鎖の各々を測定することを含む。別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５のような幾つかの他の公知の卵巣癌のバイオマーカーを測定することも、更に包含する。
【００１２】
別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５のような幾つかの他の公知の卵巣癌のバイオマーカーを測定することも、更に包含する。別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５、トランスフェリン、ハプトグロビン、ＡｐｏＡ１、トランスサイレチン、ＩＴＩＨ４内部フラグメント、β２ミクログロブリン、ヘプシジン、プロスタチン（prostatin）、オステオポンチン（osteopontin）、エソイノフィル（esoinophil）由来の神経毒、レプチン、プロラクチン、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘモグロビン及びそれらの修飾型よりなる群から選ばれる少なくとも１つのバイオマーカーを測定し、関連付けることを更に包含する。更なる別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５ＩＩ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９５、腫瘍関連のトリプシン抑制剤（ＴＡＴＩ）、ＣＥＡ、胎盤のアルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、シアリルＴＮ、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、上皮成長因子受容体の対象の細胞外領域の１１０ｋＤ成分（ｐ１１０ＥＧＦＲ）、組織カリクレイン（例えば、カリクレイン６及びカリクレイン１０（ＮＥＳ−１））、プロスタチン、ＨＥ４、クレアチンキナーゼＢ（ＣＫＢ）、ＬＡＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅ、尿ゴナドトロピン・ペプチド、Ｄｉａｎｏｎ ＮＢ７０／Ｋ、組織ペプチド抗原（ＴＰＡ）、ＳＭＲＰ、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子Ｉ及びインスリン様成長因子ＩＩを更に包含する。これら追加のバイオマーカーもまた、本発明の他の方法、キット及びソフトウェアを用いて、測定し、関連付けることができる。
【００１３】
上記方法の一態様において、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＥＬＤＩプローブの吸着体表面に当該バイオマーカーを捕捉すること、そしてレーザー脱離−イオン化質量分析計で捕捉のバイオマーカーを検出することにより測定される。別な態様では、少なくとも１つのバイオマーカーは、免疫学的測定で測定される。後者の方法は、バイオマーカーが識別されている場合、特に有用である。一態様では、サンプルは、卵巣嚢胞液である。関連する態様では、吸収体は、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤よりなる群から選ばれる部材である。更なる別な態様では、吸着体は、陽イオン交換吸着剤である。
【００１４】
別な態様において、本発明のバイオマーカーは、質量分析又はバイオマーカーの質量測定に基づく方法、以外の方法で測定される。例えば、ある特定の態様では、本発明のバイオマーカーは、免疫学的測定で測定される。
【００１５】
示唆されるように、上記方法は、卵巣癌の症状を認定することを指向している。一態様では、関連付けは、ソフトウェア分類アルゴリズムにより実施する。一般に、本発明の方法において、卵巣癌の症状は、良性の卵巣疾患、悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状から選ばれる。一態様では、卵巣癌の症状は、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状に対して、良性の卵巣疾患及び悪性レベルの低い見込みの卵巣癌から選ばれる。別な態様では、卵巣癌の症状は、良性の卵巣疾患に対する悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状から選ばれる。更なる別な態様では、卵巣癌の症状は、良性の卵巣疾患の可能性がないものである。更なる態様では、卵巣癌の症状は、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状の可能性がないものである。
【００１６】
別な態様において、本明細書に記載のバイオマーカーを検出し、その測定値を卵巣癌の症状と関連付けることには、症状に基づく対象の治療を管理することを更に包含する。関連する態様では、測定値を卵巣癌と関連付ける場合、対象の治療の管理とは、対象に化学療法薬を投与することを包含する。別な態様では、前記方法は、対象の管理の後少なくとも１つのバイオマーカーを測定し、その測定値を疾患の進行速度の測定を含む、疾患の進行と関連付けることを更に包含する。
【００１７】
本発明はまた、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおける少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）を測定することを包含する方法も提供する。
【００１８】
本発明の別の態様では、（ａ）１回目に、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおける少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）を測定すること、そして（ｂ）２回目に、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定し、（ｃ）１回目の測定値と２回目の測定値を比較し、その測定値の比較から卵巣癌の経過を判定することからなる、卵巣癌の経過を判定するための方法が、提供される。
【００１９】
更なる別な態様において、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる。更なる態様では、方法は、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を測定することを包含する。関連する態様では、前記方法は、ＣＡ１２５を測定することを更に包含する。
【００２０】
更なる別な態様では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）よりなる群から選ばれる。別の態様では、前記方法は、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）の各々を測定することを含む。別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５のような卵巣癌の幾つかの他の公知のバイオマーカーを測定することを更に包含する。
【００２１】
本明細書に記載の方法に加えて、本発明はまた、表１、３及び４に記載のバイオマーカーから選ばれる精製した生体分子を包含する組成物も提供する。別な態様では、本発明は、生体特異的な捕捉剤、例えば、表１、３及び４に記載のバイオマーカーから選ばれる生体分子と特異的に結合する抗体を包含する組成物を提供する。関連する態様では、生体特異的な捕捉剤は、固体担体に結合している。更なる別な態様では、本発明は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーに結合する生体特異的な捕捉剤を包含する組成物を提供する。
【００２２】
その他の態様では、本発明は、キットを提供する。例えば、一態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの捕捉剤（ここにおける捕捉剤は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる第一の群からの少なくとも１つのバイオマーカーと結合する）を付着している固体担体、及び（ｂ）この固体担体を、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを検出するために使用する説明書、からなるキットを提供する。関連する態様では、キットは、この固体担体を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、バイオマーカーを検出するために使用する説明書を更に包含する。別な態様では、キットは、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を検出するために使用する説明書を包含する。更なる別な態様では、キットは、固体担体をＣＡ１２５を検出するために使用する説明書を更に包含する。
【００２３】
更に別な関連の態様では、キットは、当該固体担体を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）よりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを検出するために使用する説明書を包含する。別な態様では、キットは、当該固体担体を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）の各々を検出するために使用する説明書を包含する。別な態様では、キットは、固体担体をＣＡ１２５のような卵巣癌の幾つかの他の公知のバイオマーカーを検出するために使用する説明書を包含する。
【００２４】
別な関連の態様では、捕捉剤（ここにおける捕捉剤は、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤である）を包含するキットの固体単体が、ＳＥＬＤＩプローブである。更なる別な態様では、キットは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの少なくとも１つを含む容器を更に包含する。更なる別な態様では、前記キットは、陽イオン交換クロマトグラフィー吸着剤を更に包含する。
【００２５】
別な態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの捕捉剤（ここにおける捕捉剤は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる少なくとも１つのバイオマーカーと結合する）を包含する固体担体、及び（ｂ）少なくとも１つのバイオマーカーを含む容器を包含するキットを提供する。関連の態様では、容器は、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを含む。更なる別な態様では、容器は、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を含む。関連の態様では、前記容器は、ＣＡ１２５を更に含む。
【００２６】
更なる別の関連の態様では、容器は、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）よりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを含む。別な態様では、容器は、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）の各々を含む。別な態様では、容器はＣＡ１２５を更に含む。
【００２７】
更なる別な態様では、捕捉剤（ここにおける捕捉剤は、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤である）を包含するキットの固体単体が、ＳＥＬＤＩプローブである。更なる別な態様では、キットは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの少なくとも１つを含む容器を更に包含する。
【００２８】
本発明は、サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおけるバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）の測定値を包含する、サンプルに起因するデータにアクセスするコードを含んでなる、及びサンプルの卵巣癌の症状を、測定値の関数として分類する、分類アルゴリズムを実行するコードを更に含んでなるソフトウエア製品を更に提供する。関連の態様として、ソフトウェア製品は、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれるバイオマーカーの測定値の関数として分類する。更なる別な態様では、分類アルゴリズムは、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々の測定値の関数として分類する。更なる別な態様では、分類アルゴリズムは、サンプルの卵巣癌の症状を、ＣＡ１２５の測定値の関数として更に分類する。
【００２９】
関連の態様として、ソフトウェア製品は、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）よりなる群から選ばれるバイオマーカーの測定値の関数として分類する。別な態様では、分類アルゴリズムは、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）のバイオマーカーの各々の測定値の関数として分類する。別な態様では、分類アルゴリズムは、サンプルの卵巣癌の症状を、ＣＡ１２５の測定値の関数として更に分類する。
【００３０】
本発明は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを、質量分析又は免疫学的測定により検出することを包含する方法を更に提供する。
【００３１】
別な態様では、本発明は、対象からのサンプル中の複数のバイオマーカー（ここにおけるバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）の相関関係から判定される卵巣癌の症状に関係する診断を、対象に伝達することを含んでなる方法を提供する。関連の態様では、診断は、コンピューター処理した媒体を介して対象に伝達される。
【００３２】
別な態様では、本発明は、（ａ）表１、３及び４に記載のバイオマーカーにテスト化合物を接触させること、及び（ｂ）テスト化合物が、表１、３及び４に記載のバイオマーカーと相互作用するかを判定することを含んでなる、表１、３及び４に記載のバイオマーカーと相互作用する化合物を同定する方法を提供する。
【００３３】
別な態様では、本発明は、細胞中のカルグラヌリンＣの濃度を調節する方法を提供する。この場合の方法は、当該細胞に、カルグラヌリンＣの開裂を防止する抑制剤を接触させることを包含する。
【００３４】
本発明は、対象の症状を治療する方法を更に提供する。この場合の方法は、対象に、カルグラヌリンＣの開裂を防止する、カルグラヌリンＣの抑制剤の治療有効量を投与することを包含する。関連の態様では、前記症状は、卵巣癌である。
【００３５】
本発明のその他の特徴、目的及び利点、並びにその好ましい態様は、以下の詳細な記述、実施例、請求の範囲から認識されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
（発明の詳細な説明）
１． 緒言
バイオマーカーは、別の表現型状態（例：疾病なし）と比較して、ある表現型状態（例：疾病あり）の対象から採取したサンプルに特異的に存在する有機生体分子である。異なったグループにおけるバイオマーカーの発現の平均又は中央値が、統計学的に有意であると算定された場合には、バイオマーカーは異なった表現型状態に対して特異的に存在している。統計学的有意に対する一般的な検定は多くあるが、特に、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、クラスカル・ウォリス検定（Kruskal-Wallis）、ウィルコクソン検定（Wilcoxon）、マン・ホイットニー検定（Mann-Whiteney）及びオッズ比（odds ratio）が挙げられる。バイオマーカーは、それ自体又は他との併用で、対象がある表現型又は別の表現型の状態に属していることを示す相対危険率の指標を提供する。従って、バイオマーカーは、疾患（診断）、医薬品の治療効果（治療的診断法）及び薬剤の毒性のためのマーカーとして有用である。
【００３７】
本発明は、卵巣癌、特に卵巣癌（侵襲性上皮卵巣癌のような悪性癌）、悪性度の低い見込みの卵巣癌（ＬＭＰ、不明確な疾患）、良性の卵巣疾患及び他の悪性症状（転移性癌（例えば、胃癌の卵巣への転移）、中皮腫、間質卵巣癌等を含む、侵襲性上皮卵巣癌以外の悪性腫瘍）を有する対象に異なって存在するポリペプチドベースのバイオマーカーを提供する。本発明のバイオマーカーは、質量分析により測定される質量対電荷の比、飛行時間型質量分析でのスペクトルピークの形、及び吸着体表面に結合する特性によって、特徴付けられる。これらの特徴は、特別に検出されるバイオマーカーが本発明のバイオマーカーであるかどうかを決定する方法を提供する。これらの特徴は、生体分子の特有の特徴を示し、バイオマーカーを識別する方法を限定するものではない。一態様では、本発明は、これらのバイオマーカーを単離された形態で提供する。
【００３８】
本発明のバイオマーカーは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社（Fremont, CA、「Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ」）のプロテインチップアレイを採用するＳＥＬＤＩ法を用いて見いだされた。卵巣嚢胞液は、卵巣癌（侵襲性上皮卵巣癌）、悪性度の低い見込みの卵巣癌（不明確な疾患）、他の悪性症状及び良性の卵巣疾患で、診断される対象から採取された。サンプルの一部は、分別しないで残し、他のサンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分別した。分別しないサンプル及び分別したサンプルを、ＳＥＬＤＩバイオチップに適用し、サンプルのポリペプチドのスペクトルを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰＢＳＩＩ質量分析計による飛行時間型質量分析によって得た。従って得られたスペクトルは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のバイオマーカーＷｉｚａｒｄ付きのＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア及びバイオマーカーパターン・ソフトウェアにより分析した。各々のグループの質量分析は、散布図分析にかけた。マン・ホイットニー検定分析は、散布図の各タンパク質クラスターの卵巣癌と対照グループを比較するために用い、タンパク質を２つのグループ間で有意に（ｐ＜０．０００１）異なることで選択した。この方法は、実施例のところで詳細に記述する。
【００３９】
このように見い出されたバイオマーカーを、表１に示す。「プロテインチップアレイ」欄は、実施例で記述のように、該当する場合バイオマーカーが見い出されたクロマトグラフィーの画分、バイオマーカーが結合するバイオチップの型及びバイオマーカーが卵巣癌を上方又は下方制御するのかどうかを示す。
【００４０】
【表１】
１）ヘモグロビンα及びヘモグロビンβが、実施例でのＳＥＬＤＩ検出アッセイで二重荷電されていることは注目されたい。
２）「悪性腫瘍での上方」は、バイオマーカーが、良性の卵巣疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌（ＬＭＰ、不明確な疾患）に対して、卵巣癌及び他の悪性症状（転移性癌（例えば、胃癌の卵巣への転移）、中皮腫、間質卵巣癌等を含む、侵襲性上皮卵巣癌以外の悪性腫瘍のような）を上方制御することを意味する。
３）「ＬＭＰでの下方」は、バイオマーカーが、その他の３つのグループ（つまり、良性の卵巣疾患、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状）に対して、悪性度の低い見込みの卵巣癌を下方制御することを意味する。
４）「ｒ／ｏ良性」は、バイオマーカーの存在が、良性の疾患の見込みであることを除くことを意味するが、単独でその他の３つのグループ（卵巣癌ＬＭＰ、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状）間の診断をするには適当ではない。
５）「ｒ／ｏ悪性」は、バイオマーカーの存在が、悪性の疾患の見込みであることを除くことを意味するが、それだけで良性の卵巣疾患の診断をするには適当ではない。
６）「悪性腫瘍の下方」は、バイオマーカーが、良性の卵巣疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌（ＬＭＰ、不明確な疾患）に対して、卵巣癌及び他の悪性症状を上方制御することを意味する。
【００４１】
本発明のバイオマーカーは、質量分析で測定されるようにそれらの質量対電荷の比によって特徴付けられる。各バイオマーカーの質量対電荷の比は、上記の表１、及び下記の表２＆３の「Ｍ」のあとに示す。例えば、「Ｍ６４２０」は、６４２０の質量対電荷の比の測定値である。質量対電荷の比は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＰＢＳＩＩ質量分析計での質量スペクトルから決定した。本機器は、約±０．１５％の質量精度を有する機器である。更に、本機器は、約４００〜１０００ｍ／ｄｍ（ここで、ｍは質量を、ｄｍは質量分析ピークの半値幅を示す）の質量分解能を有している。バイオマーカーの質量対電荷の比は、バイオマーカーＷｉｚａｒｄ（登録商標）ソフトウェア（Ciphergen Biosystems, Inc.）を用いて決定した。バイオマーカーＷｉｚａｒｄでは、ＰＢＳＩＩで決定したように、すべての解析スペクトルにおける同一ピークの質量対電荷の比をクラスター化すること、クラスターにおける質量対電荷の比の最大値及び最小値を選ぶこと、そして２で割ること、により質量対電荷の比がバイオマーカーに割り付けられる。従って、質量は、これらの特徴を反映している。
【００４２】
本発明のバイオマーカーは更に、飛行時間型質量分析におけるスペクトルのピークの形状によっても特徴付けられる。
【００４３】
本発明のバイオマーカーはまた、それらのクロマトグラフィー表面への結合特性によっても特徴付けられる。本発明のバイオマーカーが結合するクロマトグラフィー表面の例として、これらに限定されないが、疎水性の吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｈ５０プロテインチップ（登録商標）アレイ）、陰イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｑ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）、陽イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＣＭ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）及び金属キレート吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＩＭＡＣ−３０プロテインチップ（登録商標）アレイ）が挙げられる。数多くのバイオマーカーが、１０％のアセトニトリルの結合及び洗浄緩衝液を用いて、疎水性吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｈ５０プロテインチップ（登録商標）アレイ）に結合する。幾つかのバイオマーカーは、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の結合及び洗浄緩衝液を用いて、陰イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｑ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）に結合する。数多くのバイオマーカーは、例えば、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／５００ｍＭのＮａＣｌ溶液の結合及び洗浄緩衝液を用いて、金属キレート吸着剤（例えば、銅と結合したＣｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＩＭＡＣ−３０プロテインチップ（登録商標）アレイ）に結合する。殆どのバイオマーカーは、１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４）で洗浄後、陽イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＣＭ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）に結合する。
【００４４】
本発明のある特定のバイオマーカーは、測定して同定され、表１に示す。測定に用いる方法は、実施例で記載する。同定されたバイオマーカーについては、バイオマーカーの存在を、当該技術分野で公知の他の方法（例えば、免疫学的測定）によって測定することができる。
【００４５】
本発明のバイオマーカーは、質量対電荷の比、結合特性及びスペクトル形状によって特徴付けられるので、それらの明確な同定を知ることなく質量分析で検出することができる。しかしながら、望むならば、同定されていないバイオマーカーは、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を測定することにより決定することができる。例えば、バイオマーカーは、トリプシン又はＶ８プロテアーゼのような多くの酵素でペプチドをマッピングすることができ、そして種々の酵素で産生される分解フラグメントの分子量を用いて、一致するデータベースの配列を探すことができる。あるいは、タンパク質のバイオマーカーは、タンデム質量分析法を用いて配列を決定することができる。この方法では、タンパク質は、例えば、ゲル電気泳動法により単離されている。バイオマーカーを含むバンドは、切り取られ、タンパク質はプロテアーゼ消化に供される。個々のタンパク質フラグメントは、第一の質量分析計で分けられる。その後、フラグメントは、衝突誘導の冷却での処理をし、ペプチドを寸断して、ポリペプチド・ラダー（polypeptide ladder）を産生する。その後、ポリペプチド・ラダーは、タンデム質量分析の第二の質量分析計で分析される。ポリペプチド・ラダーの数の質量の違いにより配列のアミノ酸を同定する。タンパク質全体は、この方法で配列を決定することができるか、又は配列フラグメントは、候補を同定するのにデータベース発掘処理することができる。
【００４６】
バイオマーカーを検出するための好ましい生体供給源は、卵巣嚢胞液である。しかしながら、他の態様では、バイオマーカーは、その他の体液、例えば、血清、血液又は尿から検出される。
【００４７】
本発明のバイオマーカーは、生体分子である。従って、本発明は、単離された形態でこれらのバイオマーカーを提供する。バイオマーカーは、尿又は血清のような生体液から単離することができる。それらは、質量及び結合特性の両方に基づいて、当該技術分野で公知の何れかの方法で単離することができる。例えば、生体分子を含むサンプルは、本明細書に記載のクロマトグラフィーの分別処理をし、更に、例えば、アクリルアミド・ゲル電気泳動法により分離処理することができる。バイオマーカーが同定されていると、免疫親和性のクロマトグラフィーにより処理することもできる。
【００４８】
３． バイオマーカー及びタンパク質の異なった形態
タンパク質は、しばしば検出可能な異なった質量を特徴とする複数の異なった形態でサンプル中に存在する。これらの形態は、転写前及び転写後修飾の何れか又は両方の結果によるものである。転写前の修飾形態には、対立遺伝子多型、スプライス変異体及びＲＮＡ編集形態等がある。転写後の修飾形態には、タンパク質分解的切断（例えば、親タンパク質のフラグメント）、グリコシル化、リン酸化、リピド化、酸化、メチル化、システイン化、スルフォン化及びアセチル化等がある。サンプル中のタンパク質を検出又は測定する場合に、タンパク質の異なる形態間を区別する能力は、形態の異なる性質及び検出又は測定に用いる方法に依存する。例えば、モノクローナル抗体を用いる免疫学的測定は、抗原決定基を含有するすべてのタンパク質形態を検出し、それらを識別しない。しかしながら、タンパク質上の異なる抗原決定基を指向した２種類の抗体を使用するサンドイッチ免疫学的測定では、両抗原決定基を含有するタンパク質のすべての形態を検出するが、抗原決定基の一方のみを含有する形態は検出しない。診断アッセイでは、特別な方法を用いて検出された形態が、特別な形態として同等の良好なバイオマーカーであるならば、タンパク質の形態の識別ができなくとも殆ど問題にはならない。しかしながら、タンパク質の特別な形態（又は特別な形態のサブセット）が、特別な方法で同時に検出される異なった形態の集合体よりもバイオマーカーとして良好である場合には、アッセイの検出力は劣る可能性がある。この場合には、タンパク質の形態を相互に識別し、且つタンパク質の形態（複数を含む）を特異的に検出し、測定するアッセイを採用することが有効である。分析対象物の異なった形態を識別すること、又は分析対象物の特殊な形態を特異的に検出することを、分析対象物を「分離すること（resolving）」と称する。
【００４９】
質量分析は、異なった形態のタンパク質が、一般的には質量分析計で分離可能な異なる質量を有しているため、異なった形態を分離するためには特に強力な方法である。従って、タンパク質の一つの形態が、他の形態のバイオマーカーよりもある疾患に対して優れたバイオマーカーでありながら、従来の免疫学的測定がその形態を識別できず且つその有用なバイオマーカーを特異的に検出できない場合にも、質量分析では有用な形態を特異的に検出し測定できる可能性がある。
【００５０】
有用な方法の一つは、質量分析と免疫学的測定を組み合わせたものである。先ず、生体特異的な捕捉剤（例えば、バイオマーカーとそのバイオマーカーの他の形態を認識する抗体、アプタマー又はＡｆｆｉｂｏｄｙ）を、目標のバイオマーカーの捕捉のために使用する。好ましくは、生体特異的な捕捉剤は、ビーズ、プレート、膜又はチップのような固相に結合させる。非結合の物質を洗い去った後、捕捉された分析対象物を、質量分析にて検出及び／又は測定する。（この方法では、タンパク質と結合する又は場合によっては抗体により認識される、及びそれ自体がバイオマーカーとなり得る、タンパク質相互作用物が、捕捉されることになる。） 従来のＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩのようなレーザー脱離法及びエレクトロスプレーイオン化法を含めた種々の形の質量分析が、タンパク質の形態を検出するために有用である。
【００５１】
従って、特定のタンパク質の検出又は特定のタンパク質の定量について述べる時、それは種々の形態のタンパク質を分離して或いは分離せずに、そのタンパク質を検出及び測定することを意味する。例えば、「カルグラヌリンＣを測定すること」という段階は、サンプル中の種々の形態のタンパク質を区別しない方法（例えば、免疫学的測定）、更にある形態を他の形態から区別する方法又はタンパク質の特定の形態を測定する方法（例えば、質量分析）、によるカルグラヌリンＣの全ての形態及び／又はその何れかの形態を測定することを含む。対照的に、タンパク質の特定の形態（複数を含む）（例えば、切断、リン酸化、グリコシル化反応等により修飾された形態を含むカルグラヌリンＣの特定の形態）を測定することが望まれる場合には、その特定の形態（又は複数の形態）が特定される。例えば、「Ｍ１０４３０を測定すること」ということは、１０４３０Ｄａの見掛け分子量を有するポリペプチドを測定し、それでＭ１０４３０形態を他の形態のカルグラヌリンＣから区別することを意味する。
【００５２】
４． 卵巣癌に関するバイオマーカーの検出
本発明のバイオマーカーは、すべての適切な方法により検出可能である。検出法の例として、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及び電流測定法）、原子間力顕微鏡及び例えば多極共鳴スペクトロスコピー等の高周波法がある。共焦点及び非共焦点の顕微鏡検査に加えて、光学的方法の実例としては、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、グレーティングカプラ導波管法（grating coupler waveguide method）又は干渉分光法）による検出がある。
【００５３】
一態様では、サンプルは、バイオチップを用いて分析される。バイオチップは一般に、捕捉剤（吸着剤又は親和性試薬とも称される）が付着する、一般に平らな表面を有する固定基質を包含する。しばしばバイオチップの表面は、それぞれが捕捉剤と結合する複数のアドレス可能な部位を包含する。
【００５４】
プロテインバイオチップは、ポリペプチドの捕捉に適応したバイオチップである。多くのプロテインバイオチップが、当該技術分野で記載されている。これらには、例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Fremont, CA）、Ｚｙｏｍｙｘ（Hayward, CA）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad, CA）、Ｂｉａｃｏｒｅ（Uppsala, Sweden）及びＰｒｏｃｏｇｎｉａ（Berkshire, UK）により製造されているプロテインバイオチップがある。その様なプロテインバイオチップの例が、以下の特許又は公開特許出願に記載されている：ＵＳ特許第６，２２５，０４７号（Hutchens et al.）、ＵＳ特許第６，５３７，７４９号（Kuimelis et al.）、ＵＳ特許第６，３２９，２０９号（Wagner et al.）、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／５６９３４号公報（Englert et al.）、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０３／０４８７６８号公報（Boutell et al.）並びにＵＳ特許第５，２４２，８２８号（Bergstrom et al.）。
【００５５】
質量分析による検出
好ましい態様では、本発明のバイオマーカーは、気相イオンを検出するための質量分析計を用いる方法である、質量分析により検出される。質量分析計の例としては、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオン・トラップ型、イオンサイクロトロン共鳴、静電場型（electrostatic sector）分析計及びこれらの複合型がある。
【００５６】
更なる好ましい方法では、質量分析計は、レーザー脱離／イオン化質量分析計である。レーザー脱離／イオン化質量分析計では、分析対象物を、質量分析プローブの表面に置くが、このブローブは、質量分析計のプローブ・インターフェイス作動のために適合させ、且つイオン化及び質量分析計への導入のために分析対象物をイオン化エネルギーに曝露するものである。レーザー脱離質量分析計では、表面から分析対象物を離脱、揮発、イオン化させて、質量分析計のイオン光学系にそれらを曝露させるために、赤外線レーザーも用いられるが主として紫外線レーザー由来のレーザー・エネルギーが用いられる。ＬＤＩによるタンパク質の分析では、ＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩの形式を採用することができる。
【００５７】
単一のＴＯＦ機器のレーザー脱離／イオン化は、一般に直列抽出様式で実施される。タンデム質量分析では、直交抽出様式を用いることができる。
【００５８】
ＳＥＬＤＩ
本発明において使用される好ましい質量分析技術は、例えば、ＵＳ特許第５，７１９，０６０号及び同第６，２２５，０４７号（共に「Hutchens et al.」）に記載されているように「表面増強レーザー脱離イオン化質量分析法」又は「ＳＥＬＤＩ」である。これは、分析対象物（ここでは、１つ又はそれ以上のバイオマーカー）がＳＥＬＤＩ質量分析計プローブの表面に捕捉されている、脱離／イオン化気相イオン分析計（例えば、質量分析計）の方法を意味する。
【００５９】
ＳＥＬＤＩの一つのバージョンは、「親和性捕捉質量分析計」であり、「表面増強親和性捕捉」又は「ＳＥＡＣ」とも称される。当該バージョンには、物質と分析対象物間の非共有結合の親和性相互作用（吸着）を介して、分析対象物を捕捉する物質をプローブ表面に有しているプローブの使用が含まれる。この物質は、「吸着剤」、「捕捉剤」、「親和剤」又は「結合部」とさまざまに称されている。その様なプローブは、「親和性捕捉プローブ」として、及び「吸着表面」を有しているものを示すことができる。捕捉剤には、分析対象物と結合可能であれば何れの物質でもよい。捕捉剤は、物理吸着又は化学吸着によりプローブ表面に付着する。ある態様では、プローブは、表面に既に付着されている捕捉剤を有するものである。他の態様では、プローブは、予め活性化され、例えば、共有結合又は配位結合を形成する反応を介して、捕捉剤を結合できる反応部を有している。エポキシド及びアシル−イミダゾールが、抗体又は細胞受容体のようなポリペプチド捕捉剤と共有結合する有用な反応部である。ニトリロ三酢酸及びイミノ二酢酸は、ヒスチジン含有のペプチドと非共有結合的に相互作用する金属イオンと結合する、キレート剤として機能する有用な反応部である。吸着剤は一般に、クロマトグラフィー用吸着剤と生体特異的な吸着剤に類別される。
【００６０】
「クロマトグラフィー用吸着剤」は、クロマトグラフィーで一般的に使用される吸着剤を指す。クロマトグラフィー吸着剤としては、例えば、イオン交換物質、金属キレート剤（例えば、ニトリロ三酢酸及びイミノ二酢酸）、固定化金属キレート剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、単純生体分子（例えば、核酸、アミノ酸、単糖及び脂肪酸）及び混合モードの吸着剤（例えば、疎水性吸引／静電反発力吸着剤）がある。
【００６１】
「生体特異的な吸着剤」とは、例えば核酸分子（例：アプタマー）、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイド又はこれら物質の抱合体（例：糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、核酸（例えば、ＤＮＡ）−タンパク質抱合体）を示す。ある例においては、生体特異的な吸着剤は、多タンパク質複合体、生体膜又はウイルスのような巨大分子構造である場合もある。生体特異的な吸着剤の例としては、抗体、受容体タンパク質及び核酸がある。一般に生体特異的な吸着剤は、クロマトグラフィー吸着剤より高い特異性を有している。ＳＥＬＤＩに使用される吸着剤の更なる例は、ＵＳ特許第６，２２５，０４７号に見い出すことができる。「生体選択的な吸着剤」とは、少なくとも１０−８Ｍの親和性で分析対象物に結合する吸着剤を示す。
【００６２】
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社が製造したプロテインバイオチップは、アドレス可能な部位に付着されるクロマトグラフィー吸着剤又は生体特異的な吸着剤を有する表面を包含する。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップ（登録商標）アレイには、ＮＰ２０（親水性）；Ｈ４及びＨ５０（疎水性）；ＳＡＸ−２、Ｑ−１０及びＬＳＡＸ−３０（陰イオン交換）；ＷＣＸ−２、ＣＭ−１０及びＬＷＣＸ−３０（陽イオン交換）；ＩＭＡＣ−３、ＩＭＡＣ−３０及びＩＭＡＣ−５０（金属キレート）；並びにＰＳ−１０、ＰＳ−２０（アシル−イミダゾール、エポキシドを有する反応性表面）及びＰＧ−２０（アシルイミダゾールを介して結合したプロテインＧ）が含まれる。疎水性プロテインチップアレイは、イソプロピル又はノニルフェノキシ-ポリ（エチレングリコール）メタクリル樹脂官能基を有している。陰イオン交換プロテインチップアレイは、四級アンモニウム官能基を有する。陽イオン交換プロテインチップアレイは、カルボン酸官能基を有する。固定化金属キレートプロテインチップアレイは、キレートを作ることにより銅、ニッケル、亜鉛及びガリウム等の遷移金属イオンを吸着するニトリロ三酢酸官能基（ＩＭＡＣ３及びＩＭＡＣ３０）又はＯ−メタクリロイル-Ｎ，Ｎ-ビス-カルボキシメチルチロシン官能基（ＩＭＡＣ５０）を有する。予め活性化されたプロテインチップアレイは、タンパク質上の基と反応し共有結合できる、アシル−イミダゾール又はエポキシド官能基を有する。
【００６３】
この様なバイオチップに関しては更に、ＵＳ特許第６，５７９，７１９号（Ｈｕｔｃｈｅｎｓらの「Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ」、２００３年６月１７日）、ＵＳ特許第６，８９７，０７２号（Ｒｉｃｈらの「気相イオン分光計のプローブ」、２００５年５月２４日）、ＵＳ特許第６，５５５，８１３号（Ｂｅｅｃｈｅｒｅｔらの「気相質量分析計における疎水性被覆含有サンプルホルダー」、２００３年４月２９日）、ＵＳ特許公開第ＵＳ２００３-００３２０４３Ａ１号公報（Ｐｏｈｌらの「ラテックスをベースとする吸着剤チップ」、２００２年７月１６日）、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ０３/０４０７００号公報（Ｕｍらの「疎水性表面チップ」、２００３年５月１５日）、ＵＳ特許公開第ＵＳ２００３／０２１８１３０Ａ１号公報（Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉらの「多糖をベースとするヒドロゲルで被覆された表面を有するバイオチップ」、２００３年４月１４日）及びＵＳ特許第７，０４５，３６６号（Ｈｕａｎｇらの「光架橋ヒドロゲル表面被覆」、２００６年５月１６日）に記載されている。
【００６４】
一般に、吸着剤表面を有するプローブは、サンプル中に存在しているバイオマーカー（複数を含む）が吸着剤に結合するに十分な時間でサンプルと接触させる。インキュベーション後、非結合の物質を除去するために基質を洗浄する。適切な洗浄溶液は、すべて使用可能であるが、水溶性溶液を用いることが好ましい。分子が結合して残存する割合は、洗浄の程度を調整することにより操作可能である。洗浄溶液の溶離特性は、例えばｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピズムの程度、洗浄の強度、及び温度に依存する。プローブが、ＳＥＡＣ及びＳＥＮＤの特性の何れも有していない場合には（ここに記載されているように）、分子を吸収するエネルギーが、結合バイオマーカーを有する基質に適用される。
【００６５】
別の方法においては、バイオマーカーに結合する抗体を有している固相結合の免疫吸着剤によりバイオマーカーが捕捉され得る。非結合物質を除去するために吸着剤を洗浄した後、バイオマーカーを固相から溶出し、バイオマーカーに結合するＳＥＬＤＩチップに添加し、ＳＥＬＤＩにて分析する。
【００６６】
基質に結合したバイオマーカーは、飛行時間型質量分析計のような気相イオン分光計にて検出される。バイオマーカーは、レーザーのようなイオン化源によりイオン化され、生成したイオンはイオン光学アセンブリにて集束させ、続いて質量分析計にて通過イオンを分散させて、通過イオンを分析する。続いて検出器により検出イオンの情報を質量対電荷の比に変換する。一般に、バイオマーカーの検出には、シグナル強度の検出が含まれる。従って、バイオマーカーの量及び質量を、共に測定することができる。
【００６７】
ＳＥＮＤ
レーザー脱離質量分析計を用いた別の方法は、表面増強Ｎｅａｔ脱離法（ＳＥＮＤ）と称される。ＳＥＮＤには、プローブの表面に化学的に結合するエネルギー吸収分子から成るプローブ（ＳＥＮＤプローブ）の使用が含まれる。「エネルギー吸収分子」（ＥＡＭ）という語句は、レーザー脱離/イオン化源からエネルギーを吸収でき、続いてその後直ちに接触して分析対象物分子の脱離及びイオン化に寄与できる分子を意味する。ＥＡＭカテゴリーには、しばしば「マトリックス」と称されるＭＡＬＤＩに使用される分子が含まれ、実例として桂皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ）、シアノ水酸化桂皮酸（ＣＨＣＡ）及び二水酸化安息香酸、フェルラ酸及び水酸化アセトフェノン誘導体がある。ある態様においては、エネルギー吸収分子は、例えばポリメタクリレート等の直鎖又は架橋ポリマーに組み込まれている。例えば、その組成物が、α-シアノ-４-メタクリロイルオキシ桂皮酸及びアクリレートの共重合体である場合もある。別の態様では、その組成物は、α-シアノ-４-メタクリロイルオキシ桂皮酸、アクリレート及び３−（トリエトキシ）シリルプロピルメタクリレートの共重合体である。また、別の態様では、その組成物は、α-シアノ-４-メタクリロイルオキシ桂皮酸及びオクタデシルメタクリレート（Ｃ１８ＳＥＮＤ）の共重合体である。ＳＥＮＤは更に、ＵＳ特許第６,１２４,１３７号及びＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ０３/６４５９４号（キタガワらの「分析対象物の脱離/イオン化に使用するエネルギー吸収部位を有するモノマー及びポリマー」２００３年８月７日）に記載されている。
【００６８】
ＳＥＡＣ/ＳＥＮＤは、捕捉剤及びエネルギー吸収分子の両方が、サンプルの存在する表面に付着している、レーザー脱離質量分析計のバージョンである。従って、外部マトリックスを適用することを必要としないで、親和性捕捉及びイオン化/脱離を介してＳＥＡＣ/ＳＥＮＤプローブに分析対象物を捕捉することが可能となる。Ｃ１８のＳＥＮＤバイオチップは、捕捉剤として機能するＣ１８及びエネルギー吸収部位として機能するＣＨＣＡ部分からなるＳＥＡＣ/ＳＥＮＤのバージョンである。
【００６９】
ＳＥＰＡＲ
ＬＤＩの別のバージョンは、表面増強感光付加及び脱離（Surface-Enhanced Photolabile Attachment and Release）（ＳＥＰＡＲ）と称される。ＳＥＰＡＲには、分析対象物と共有結合でき、続いて光（例えば、レーザー光（ＵＳ特許第５，７１９，０６０号を参照されたい））に曝露された後その部分の光に不安定な結合が開裂することにより分析対象物を脱離する、表面に付着する部分を有するプローブの使用が含まれる。ＳＥＰＡＲ及びその他のＳＥＬＤＩの形態は、本発明に従ってバイオマーカー又はバイオマーカー・プロフィールを検出するのに容易に適応する。
【００７０】
ＭＡＬＤＩ
ＭＡＬＤＩは、タンパク質及び核酸のような生体分子を分析するために使用されるレーザー脱離／イオン化の従来からの方法である。ＭＡＬＤＩの一方法において、サンプルをマトリックスと混合し、直接ＭＡＬＤＩチップ上に置く。しかしながら、血清又は尿のような生体サンプルの複雑性により、サンプルを予め分別しない場合にはこの方法は最適とはならない。従って、ある態様では、生体特異的な物質（例えば抗体）又は樹脂のような固体担体に結合したクロマトグラフィー材料（例えば、スピン・カラムで）で、バイオマーカーを先ず捕捉させる。本発明のバイオマーカーに結合する特異的な親和性物質に関しては、上述の通りである。親和性物質上での精製後、バイオマーカーを溶出し、続いてＭＡＬＤＩにより検出する。
【００７１】
別な質量分析法では、バイオマーカーは、先ずバイオマーカーと結合するクロマトグラフィー性質を有するクロマトグラフィー樹脂上で捕捉される。本発明の実施例では、これには、種々の方法が含まれる。例えば、一つの方法は、バイオマーカーをＣＭセラミックＨｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂のような陽イオン交換樹脂上に捕捉し、樹脂を洗浄し、バイオマーカーを溶出し、そしてＭＡＬＤＩにより検出することができる。あるいは、この方法に先行して、陽イオン交換樹脂の処理前に陰イオン交換樹脂でサンプルを分別する。別にまた、陰イオン交換樹脂で分別して、直接ＭＡＬＤＩにより検出する方法もある。更なる別な方法では、バイオマーカーと結合する抗体を包含する免疫クロマトグラフィー樹脂上にバイオマーカーを捕捉し、非結合の物質を洗い流し、バイオマーカーを樹脂から溶出し、そして溶出したバイオマーカーをＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩにより検出する。
【００７２】
質量分析計におけるイオン化のその他の形態
別の方法では、バイオマーカーを、ＬＣ−ＭＳ又はＬＣ−ＬＣ−ＭＳにて検出する。この方法には、液体クロマトグラフィーを１回又は２回通過させてサンプル中のタンパク質を分離し、次いで一般的にはエレクトロスプレーイオン化にて質量分析する過程が含まれる。
【００７３】
データ解析
飛行時間型質量分析法による分析対象物の分析では、飛行時間スペクトルが得られる。最終的に解析された飛行時間スペクトルは一般的に、サンプルに対するイオン化エネルギーの単一パルスからのシグナルを示すのではなく、複数のパルスからのシグナルの総計を示している。これによりノイズが減少し、ダイナミックレンジが高くなる。次にこの飛行時間型データを、データ処理にかける。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎのプロテインチップ（登録商標）ソフトウエアでは、データ処理にはマススペクトル作成のためのＴＯＦ-ｔｏ-Ｍ/Ｚ変換処理、機器オフセットを除外するためのベースラインの減算処理及び高周波数雑音を減少させるための高周波数雑音フィルター処理が含まれる。
【００７４】
バイオマーカーの脱離及び検出により作成されるデータは、プログラムを組むことができるデジタル・コンピュータを使用して解析可能である。コンピュータプログラムを用いて、検出されたバイオマーカーの数を示すデータ、並びに場合に応じてシグナル強度及び検出された各バイオマーカーの分子の質量を決定する。データ解析には、バイオマーカーのシグナル強度を決定する段階、及び予め定めておいた統計的分布から外れたデータを除外する段階を組み込むことができる。例えば、幾つかの標準に対する各ピークの高さを計算することにより、観察されるピークを正規化することができる。
【００７５】
コンピュータは、得られたデータを表示のために種々のフォーマットに変換することができる。標準的なスペクトルが表示可能であるが、一つの有用なフォーマットではピークの高さ及び質量の情報のみがスペクトル図に保持され、その結果見易い画像が得られ、ほぼ同等の分子量を有するバイオマーカーがより容易に認識できる。別の有用なフォーマットでは、２つ又はそれ以上のスペクトルを比較し、固有のバイオマーカー及びサンプル間で上方又は下方制御されるバイオマーカーを都合良く強調表示されている。これらのフォーマットの何れかを用いることにより、特定のバイオマーカーがサンプル中に存在しているか否かを、容易に判定できる。
【００７６】
一般に分析には、分析対象物からのシグナルを示すスペクトルのピークの同定も含まれる。ピークの選択は目視で行うが、ピークの検出を自動で行えるＣｉｐｈｅｒｇｅｎのプロテインチップ（登録商標）ソフトウエア・パッケージの一部としてソフトウエアを入手できる。一般に、このソフトウエアは、選択した閾値を越えるシグナル対ノイズの比を示すシグナルを同定し、そしてピークシグナルの質量中心にあるピークの質量を標識する機能がある。有用な適用の一つでは、多くのスペクトルを比較して、マススペクトルにおいて或る選択された割合で存在している同一ピークを同定する。このソフトウエアのバージョンの一つでは、種々のスペクトルに出現するすべてのピークを、規定された範囲内にクラスター化し、そして質量（Ｍ/Ｚ）クラスターの中心点に近いすべてのピークの質量（Ｍ／Ｚ）を決定する。
【００７７】
データを解析するために用いられるソフトウエアには、シグナルが本発明によるバイオマーカーに対応するシグナル内にピークを示しているか否かを判定するために、シグナルの分析にアルゴリズムを適用するコードを含めることができる。またそのソフトウエアにより、検査中の特定の臨床パラメータの状態を示す、バイオマーカーピーク又はバイオマーカーピークの組み合わせが存在しているか否かを判定するために、観察されたバイオマーカーのピークに関するデータを分類ツリー解析又はＡＮＮ解析することができる。データの解析には、直接的又は間接的の何れかでサンプルの質量分析から得られる種々のパラメータが「重要（keyed）」となる可能性がある。これらのパラメータには、１つ又はそれ以上のピークが存在するか否か、１つのピーク又は１群のピークの形状、１つ又はそれ以上のピークの高さ、１つ又はそれ以上のピークの高さの対数、及びその他のピークの高さに関するデータの算術乗算が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
卵巣癌に対するバイオマーカーのＳＥＬＤＩ検出のための一般的なプロトコール
本発明のバイオマーカーの検出に関する好ましいプロトコールは、以下の通りである。別な態様では、例えば、卵巣嚢胞液等の検査される生体サンプルは、ＳＥＬＤＩ分析の前に予備分別することが好ましい。この予備分別工程が、サンプルを簡素化し、感度を向上させる。予備分別の好ましい方法には、Ｑ ＨｙｐｅｒＤ（BioSepra, SA）のような陰イオン交換クロマトグラフィー材料にサンプルを接触させることが含まれる。続いて結合物質を、ｐＨ９、ｐＨ７、ｐＨ５及びｐＨ４の緩衝液を用いて段階的なｐＨでの溶出を実施する。（バイオマーカーが溶出される画分も、表１に示した。） バイオマーカーを含有している種々の画分を採取する。別な態様では、例えば、卵巣嚢胞液サンプル等の検査される生体サンプルは、予備分別の工程を経ずに、分別しないままでチップ結合工程に使用される。
【００７９】
検査されるサンプル（分別しない又は予備分別する）を、次いで親和性の捕捉プローブに接触させる。本発明のバイオマーカーが結合するクロマトグラフィー表面の親和性の捕捉プローブの例として、これらに限定されないが、疎水性の吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｈ５０プロテインチップ（登録商標）アレイ）、陰イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｑ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）、陽イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＣＭ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）及び金属キレート吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＩＭＡＣ−３０プロテインチップ（登録商標）アレイ）が挙げられる。プローブは、非結合分子は洗い流すがバイオマーカーを保持するように、緩衝液で洗浄する。各々のバイオマーカーに適した洗浄液は、実施例で同定されている緩衝液である。バイオマーカーは、レーザー脱離／イオン化質量分析計にて検出される。
【００８０】
あるいは、変性させた又は変性させていないサンプルを、各分析対象物を検出するための最適条件下で、適切なアレイ結合緩衝液に希釈し、結合させ、そして洗浄する。
【００８１】
あるいは、例えば、アポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）、ヘモグロビンα、ヘモグロビンβ、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡｐｏＡＩＩ）、アポリポタンパク質ＣＩＩ（ＡｐｏＣＩＩ）、カルグラヌリンＣ（全長及び切断型の両方）、カルグラヌリンＡ、ＩｇＧ重鎖、カルサイクリン及びトランスサイレチンのケースでバイオマーカーを認識する抗体が入手可能な場合には、これらを予め活性化したＰＳ１０又はＰＳ２０プロテインチップアレイ（Ciphergen Biosystems, Inc.）のようなプローブの表面に結合させることができる。これらの抗体は、サンプルからバイオマーカーをプローブ表面に捕捉することができる。続いてバイオマーカーは、例えば、レーザー脱離／イオン化質量分析等にて検出できる。
【００８２】
流体工学的操作を行うすべてのロボットが、これらのアッセイには使用可能であり、それらは、例えば、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ及びＨａｍｉｌｔｏｎ等から入手可能である。
【００８３】
免疫学的測定による検出
本発明の別な態様において、本発明のバイオマーカーは、質量分析又はバイオマーカーの質量測定に基づく方法以外によって、測定される。別な態様では、本発明のバイオマーカーは、免疫学的測定により測定される。免疫学的測定では、バイオマーカーを捕捉するために、抗体のような生体特異的な捕捉剤が必要である。抗体は、例えば動物をバイオマーカーで免疫化する等の、当該技術分野において広く知られた方法により作成可能である。バイオマーカーは、それらの結合特性に基づいてサンプルから単離可能である。あるいは、ポリペプチド・バイオマーカーのアミノ酸配列が既知の場合には、ポリペプチドは合成可能であり、当該技術分野で良く知られている方法により抗体の産生に利用できる。
【００８４】
本発明では、例えば、ＥＬＩＳＡ又は蛍光ベースの免疫学的測定等を含むサンドイッチ免疫学的測定、更に他の酵素免疫学的測定を含めた従来の免疫学的測定も考慮に入れている。比濁分析は、液層で行われるアッセイであり、その場合には抗体は溶液に存在している。抗原が抗体に結合すると吸着能が変化するが、それを測定する。ＳＥＬＤＩベースの免疫学的測定では、バイオマーカーに対する生体特異的な捕捉剤は、予め活性化されたプロテインチップアレイのようなＭＳプローブの表面に付着している。従って、バイオマーカーは、この試薬を介してバイオチップに特異的に捕捉され、捕捉されたバイオマーカーが質量分析計にて検出される。
【００８５】
５． 対象の卵巣癌症状の判定
本発明のバイオマーカーは、例えば卵巣癌を診断するために対象における卵巣癌の症状を評価するための診断検査に使用できる。「卵巣癌の症状」という語句は、疾患のすべての識別可能な徴候が含まれる。例えば、卵巣癌の症状には、疾患の有無（例えば、卵巣癌（悪性）、悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、良性の卵巣疾患、他の悪性症状のそれぞれの比較）、疾患の進行リスク、疾患の段階、疾患の経過（例えば、経時的な疾患の悪化又は緩解）及び疾患治療に対する有効性又は応答が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような症状をベースにして、追加の診療検査又は治療手段を含む、更なる治療方法を示すことができる。
【００８６】
検査結果と卵巣癌の症状との相関には、幾つかの分類アルゴリズムをその症状を惹起する結果に適用することが含まれる。分類アルゴリズムは、所定のバイオマーカーの測定量が、特定のカットオフ番号より大きいか又は小さいかを判定するだけという単純な場合もある。複数のバイオマーカーを利用する場合には、分類アルゴリズムは線形回帰式である場合もある。あるいは、分類アルゴリズムは本明細書に記載されている多くの学習アルゴリズムの何れかの産物であってもよい。
【００８７】
複雑な分類アルゴリズムの場合には、データに関してアルゴリズムを実施することが必要となる場合もあり、これにより、コンピュータ、例えばプログラム可能なデジタル・コンピュータ等を用いて分類を決定する。何れの場合においても、メモリー・ドライブ、ディスク又は紙に印刷されている等のコンピュータの読み取り可能なフォーマットにおいて有形の表現媒体上にその症状を記録できる。結果はまた、コンピュータのスクリ−ン上に報告することも可能であろう。
【００８８】
単一のマーカー
症状を正しく予測する診断検査の検出力は、アッセイの感度、アッセイの特異性又は受診者動作特性（ＲＯＣ）分析曲線下面積として通常測定される。感度は、陽性であると検査で予測される真陽性の割合であるが、特異性は、陰性であると検査で予測される真陰性の割合である。ＲＯＣ曲線は、（１−特異性）の関数として検査の感度を与える。ＲＯＣ曲線下面積が大きければ大きいほど、検査の予測値はより正確となる。検査の効用に関する他の有用な尺度は、陽性予測値及び陰性予測値である。陽性予測値は検査で陽性であり、実際に陽性であった人の割合である。陰性予測値は検査で陰性であり、実際に陰性であった人の割合である。
【００８９】
本発明のバイオマーカーは、異なった卵巣癌の症状において統計学的な差異を、少なくともＰ≦０．０５、Ｐ≦１０−２、Ｐ≦１０−３、Ｐ≦１０−４又はＰ≦１０−５で示す。これらのバイオマーカーを単独又は組み合わせて使用する診断検査は、感度及び特異性が少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％及びおよそ１００％であることを示す。
【００９０】
表１、３及び４に示した各バイオマーカーは、卵巣癌（悪性）、卵巣癌ＬＭＰ、良性の卵巣疾患又は他の悪性症状に、異なって存在し、従ってそれぞれが個々に卵巣癌の症状を判定する際の補助として有用である。その方法には、第一に例えば、ＳＥＬＤＩバイオチップに捕捉し、次いで質量分析計にて検出する等の、本明細書に記載されている方法を用いて対象のサンプル中の選択されたバイオマーカーを測定すること、第二に陽性の卵巣癌の症状を陰性の卵巣癌の症状と識別する診断量又はカットオフ値と測定値を比較することが含まれる。診断量は、バイオマーカーの測定量がその診断量より大きい又は小さいかで、対象が特定の卵巣癌症状にあるとして識別される量を表す。例えば、バイオマーカーが、正常に比較して卵巣癌では上方に制御されることから、測定量が診断カットオフ値より大きい場合には卵巣癌と診断される。あるいは、バイオマーカーが、正常に比較して卵巣癌では下方に制御されることから、測定量が診断カットオフ値より小さい場合には卵巣癌と診断される。当該技術分野で良く理解されているように、アッセイにおいて用いられる特定の診断カットオフ値を調整することにより、診断者の選択に基づいて診断アッセイの感度及び特異性を良くすることは可能である。特定の診断カットオフ値は、例えば本明細書で実施したように、異なった卵巣癌の症状にある対象からの統計学的に有意な数のサンプルにおけるバイオマーカーの量を測定し、そして診断者の望むレベルの特異性及び感度に合ったカットオフ値を描くことにより決定できる。
【００９１】
マーカーの組み合わせ
個々のバイオマーカーは有用な診断バイオマーカーであるが、バイオマーカーの組み合わせは、単一のバイオマーカーを単独で使用するよりも特定の症状に対してより大きな予測値を与えることが見出されている。具体的には、サンプル中の多数のバイオマーカーの検出により、検査の感度及び／又は特異性を増加させることができる。少なくとも２つのバイオマーカーの組み合わせは、場合によっては「バイオマーカー・プロフィール」又は「バイオマーカー・フィンガープリント」と称される。表１、３及び４で説明のバイオマーカーの組み合わせが検出することができる。同様に、表１、３及び４で説明のバイオマーカーの１つ又はそれ以上が、ＣＡ１２５のような他の公知の卵巣癌のバイオマーカーと組み合わせて検出することができる。本発明のバイオマーカーと組み合わせて有用な公知の卵巣癌バイオマーカーの例では、これらに限定されないが、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ０３／０５７０１４号公報及び同第ＷＯ２００４／０１２５８８号公報に記載のものが挙げられ、これらの両方共を、全ての目標のために本明細書に参照して取り込む。
【００９２】
以下の実施例に記載のプロトコールは、６５名の患者のサンプルからのマススペクトルを作成するために使用した。その内３０名が卵巣癌と診断され、３５名には卵巣癌が存在しなかった。ピークの質量及び高さは、開示のデータセットに纏めた。このデータセットは、分類回帰ツリー解析（ＣＡＲＴ：classification and regression tree analysis）（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標））を用いる学習アルゴリズムをならすのに使用した。特に、ＣＡＲＴは、ランダムに多くのピークのサブセットを選んだ。各々のサブセットに対して、ＣＡＲＴは、卵巣癌（悪性）、卵巣癌ＬＭＰ、良性の卵巣疾患又は他の悪性症状としてサンプルを分類する、最良の又は最良に近い決定ツリーを作成した。ＣＡＲＴで作成した多くの決定ツリーでは、良性の卵巣疾患に対して悪性レベルの低い見込みの卵巣癌と卵巣癌（侵襲性の上皮卵巣癌のような悪性）を区別するのに、幾つかが極めて優秀な感度及び特異性を有していた。
【００９３】
決定ツリーの詳細、特に分岐の決定に用いられるカットオフ値は、開示データセットを作成するのに使用するアッセイの詳細に依存することは、注目される。本分析に使用するアッセイのデータ取得パラメーターは、実施例で提供される。例えば、新しいサンプルセット又は異なるアッセイプロトコールからの分類アルゴリズムの開発では、操作者は、これらのバイオマーカーを検出するプロトコールを用い、それらを含むように学習アルゴリズムに入力する。
【００９４】
本発明のバイオマーカーの何れかの測定値を含む卵巣癌の症状の診断検査は、表２に同定される以下の卵巣癌のバイオマーカー（それらの適切な修飾型を含む）の何れかと組み合わせる：
【００９５】
【表２】
【００９６】
本発明のバイオマーカーと組み合わせることのできる他のバイオマーカーには、これらに限定されないが、ＣＴＡＰ３、ＣＡ１２５ＩＩ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９５、腫瘍関連のトリプシン抑制剤（ＴＡＴＩ）、ＣＥＡ、胎盤のアルカリフォスファターゼ（ＬＡＰ）、シアリルＴＮ、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）、 リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、上皮成長因子受容体の細胞外領域の１１０ｋＤ成分（ｐ１１０ＥＧＦＲ）、組織カリクレイン（例えば、カリクレイン６及びカリクレイン１０（ＮＥＳ−１））、プロスタシン、ＨＥ４、クレアチンキナーゼＢ（ＣＫＢ）、ＬＡＳＡ，ＨＥＲ−２/ｎｅｕ，尿ゴナドトロピン・ペプチド、Ｄｉａｎｏｎ ＮＢ７０／Ｋ、組織ペプチド抗原（ＴＰＡ）、ＳＭＲＰ、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子Ｉ又はＩＩが含まれる。
【００９７】
卵巣癌症状
卵巣癌症状を判定するには、診断検査結果に基づき２又はそれ以上のグループ（症状）の一つに個体を通常分類する。本明細書に記述した診断検査は、幾つかの異なった症状に分類するのに用いることができる。
【００９８】
卵巣癌の存在
一態様では、本発明は、対象における卵巣癌の存在又は非存在（症状：卵巣癌対悪性レベルの低い見込みの卵巣癌又は良性の卵巣疾患）を判定する方法を提供する。卵巣癌の存在又は非存在は、関連のバイオマーカー（複数を含む）を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定のリスクレベルと関連するバイオマーカーの参考量及び／又はパターンと比較することにより判定される。
【００９９】
発症リスクの判定
一態様では、本発明は、対象に於ける疾患の発症リスクを判定する方法を提供する。バイオマーカー量又はパターンは、種々なリスク状態（例えば、高い、中程度又は低い）の特性である。発症のリスクは、関連のバイオマーカー（複数を含む）を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定のリスクレベルと関連するバイオマーカーの参考量及び／又はパターンと比較することにより判定される。
【０１００】
疾患の段階の判定
一態様では、本発明は、対象に於ける疾患の段階を判定する方法を提供する。疾患の各段階において、バイオマーカーの特徴的な量又はバイオマーカーのセット（パターン）の相対量が存在する。疾患の段階は、関連バイオマーカー（複数を含む）を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定の段階と関連するバイオマーカーの参考量及び／又はパターンと比較することにより判定される。例えば、初期卵巣癌と、非卵巣癌又はステージＩの卵巣癌、ステージＩＩの卵巣癌及びステージＩＩＩの卵巣癌とを区別をすることができる。
【０１０１】
疾患の経過（進行／緩解）の判定
一態様では、本発明は、対象での疾患の経過を判定する方法を提供する。疾患の経過とは、疾患の進行（悪化）、緩解（改善）を含む経時的変化を言う。時間の経過と共に、バイオマーカーの量又は相対的な量（例えば、パターン）が変化する。そこで、これらのマーカーの傾向（例えば、疾患又は無疾患に関連して経時的に増加又は減少のどちらか）が、疾患の経過を示すことになる。従って、この方法では、対象での１つ又はそれ以上のバイオマーカーを少なくとも２つの異なる時点（例えば、１回目、２回目）で測定し、変化が存在すればそれを比較する。疾患の経過は、これら比較に基づいて判定される。
同様に、疾患の進行（又は、緩解）の変化の違いがバイオマーカー量（例えば、表１のペプチドのバイオマーカー）を、異なった時点で測定し、そしてバイオマーカー量の変化の速度を計算することによりモニターできる。疾患の症状又は疾患の進行の速度を測定できることは、治療を通して疾患の進行を緩める又は停止させることが目的の治療薬剤の検討に重要である。
【０１０２】
症状の報告
本発明の追加の態様は、アッセイ結果若しくは診断結果の何れか又はそれらの両方を、例えば技師、医者又は患者に伝えることに関する。ある態様では、アッセイ結果又は診断結果の何れか又はそれらの両方を、関心を有する者、例えば医者とその患者に伝えるのにコンピュータが用いられる。幾つかの態様では、結果又は診断が報告される国又は法域とは異なった国又は法域で、アッセイ又はアッセイ結果の分析が行われる。
【０１０３】
本発明の好ましい態様では、表１、３及び４に記載のペプチド・バイオマーカーの何れかの検査対象における差別的な存在に基づいた診断を、その診断後できるだけ早くその対象に伝える。診断は、その対象を治療している医者から伝えるか、あるいは検査の対象に電子メール又は電話で伝えてもよい。電子メール又は電話で診断を伝えるのにコンピュータを用いてもよい。ある態様では、診断検査の結果を含むメッセージを作成し、電気通信業界の当業者にはよく知られたコンピュータソフト及びハードの組み合わせを用い、対象に自動的に送られる。ヘルスケア指向のコミュニケーションシステムの一例が、米国特許第６，２８３，７６１号に記述されているが、本発明はこの特定のコミュニケーションシステムを用いる方法に限られるものではない。本発明の方法のある態様では、サンプルのアッセイ、疾患の診断及びアッセイ結果又は診断の伝達を含む方法の全てのステップ又は一部が、種々な法域（例えば、外国）で実施される。
【０１０４】
対象の管理
卵巣癌症状を認定する方法のある態様では、症状に応じて対象の治療を管理することが方法に含まれる。そのような管理には、卵巣癌症状の判定に続いて取られる医師又は臨床医の活動が含まれる。例えば、医者が卵巣癌の診断をすれば、例えば、処方又は抗化学療法薬剤の投与のようなある特定の治療が実施される。あるいは、卵巣癌ＬＭＰ又は良性の卵巣疾患の診断では、患者が罹っている特定の疾患を判定するために更に検査が行われる。また、診断検査で卵巣癌であるとの結論が得られない際は、更なる検査が必要となる。
【０１０５】
本発明の追加の態様は、アッセイ結果若しくは診断結果の何れか又はそれらの両方を、例えば技師、医者又は患者に伝えることに関する。ある態様では、アッセイ結果又は診断結果の何れか又はそれらの両方を、関心を有する者、例えば医者とその患者に伝えるのにコンピュータが用いられる。幾つかの態様では、結果又は診断が報告される国又は法域とは異なった国又は法域で、アッセイ又はアッセイ結果の分析が行われる。
【０１０６】
本発明の好ましい態様では、表１に記載のバイオマーカーの何れかの検査対象における存在する又は存在しないことに基づいた診断を、その診断後できるだけ早くその対象に伝える。診断は、その対象を治療している医者から伝えるか、あるいは検査の対象に電子メール又は電話で伝えてもよい。電子メール又は電話で診断を伝えるのにコンピュータを用いてもよい。ある態様では、診断検査の結果を含むメッセージを作成し、電気通信業界の当業者にはよく知られたコンピュータソフト及びハードの組み合わせを用い、対象に自動的に送られる。ヘルスケア指向のコミュニケーションシステムの一例が、米国特許第６，２８３，７６１号に記述されているが、本発明はこの特定のコミュニケーションシステムを用いる方法に限られるものではない。本発明の方法のある態様では、サンプルのアッセイ、疾患の診断及びアッセイ結果又は診断の伝達を含む方法の全てのステップ又は一部が、種々な法域（例えば、外国）で実施される。
【０１０７】
６． 製剤の治療効果の判定
別な態様では、本発明は、製剤の治療効果を判定する方法を提供する。これらの方法は、薬剤の臨床治験の実施、更にその薬剤の投与を受けている患者の進行をモニターするのに有用である。治療又は臨床治験では、薬剤を特定の投薬計画に基づき投与する。投薬計画としては、薬剤の単回投与量、又はある期間にわたる反復投与量が含まれうる。医者又は臨床研究者が、投与期間中の患者又は対象に対する薬の効果をモニターする。薬剤が、症状に薬理効果を有するならば、本発明のバイオマーカーの量又は相対量（例えば、パターン、又はプロフィール）は、疾患ではないプロフィールへと変化する。例えば、ＡｐｏＣＩ及びヘモグロビンのバイオマーカーは、疾患と共に増大し、Ｍ３２６００のバイオマーカーは疾患と共に減少する。そこで、治療期間中に対象でのこれらバイオマーカー量の経過をフォローできる。従って、この方法では、薬剤治療を受けている対象での１つ又はそれ以上のバイオマーカーを測定し、対象の病状とバイオマーカー量を関連付けることが含まれる。本方法の一態様では、薬剤治療期間中の少なくとも２つの異なる時点（例えば、１回目及び２回目）での複数のバイオマーカーのレベルを判定し、バイオマーカー量の変化（もしあるとすれば）を比較する。例えば、複数のバイオマーカーを、薬剤投与の前後で、又は薬剤投与の２つの異なる時点で測定する。治療の効果は、これら比較に基づき判定する。もし治療が効果をあげているならば、複数のバイオマーカーは正常に向かい、もし治療効果がなければ、複数のバイオマーカーは疾患を示す方向に変化する。もし治療が効果をあげているならば、複数のバイオマーカーは正常に向かい、もし治療効果がなければ、複数のバイオマーカーは疾患を示す方向に変化する。
【０１０８】
７． 卵巣癌症状の認定のための分類アルゴリズムの作成
ある態様では、「公知のサンプル」のようなサンプルを用いて得られたスペクトル（例えば、マススペクトル又は飛行時間型スペクトル）から得られたデータは、分類モデルを「トレーニングする（train）」ために利用できる。「公知のサンプル」とは、前もって分類されたサンプルである。スペクトルから得られ、そして分類モデルを作成するために用いられるデータは、「トレーニングデータセット」と称する。一旦トレーニングされると、分類モデルは、未知のサンプルから得られたスペクトルから導かれたデータのパターンを認識できる。そこで、分類モデルは、未知のサンプルをクラスに分類するのに用いられる。これは、例えば、ある特別な生体サンプルをある特定の生体の状態に関連しているか又はそうでないのか（疾患対疾患でない）を、予想するに有用である。
【０１０９】
分類モデルを作成するのに用いるトレーニングデータは、生のデータ又は前もって処理したデータで構成される。幾つかの態様では、生のデータは飛行時間型スペクトル又はマススペクトルから直接得られ、その後上記のように任意に「前もって処理される」であってもよい。
【０１１０】
分類モデルは、データ中に存在する客観的パラメータに基づくクラスに、データ集団を分離することを試みる適切な統計的分類（又は「学習（learning）」）法を用い作成できる。分類方法は、監督又は不監督（監督されていない）どちらでもよい。監督又は不監督分類過程の例は、Ｊａｉｎの「統計的パターン認識：概説」（IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, No.1, January 2000）に記述されており、その教えるところは、参照することにより取り込まれている。
【０１１１】
監督下分類では、公知のカテゴリーの例を含むトレーニングデータが、学習機構に提供され、それが公知のクラスの各々を定義する１つ又はそれ以上のセットの関係を学ぶ。その後、新しいデータを学習機構に適用し、それは学んだ関係を用いて新しいデータを分類する。監督下分類過程の例としては、線形回帰過程（例えば、多重線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰及び主構成要素回帰（ＰＣＲ））、二分岐決定ツリー（例えば、ＣＡＲＴ−分類、回帰ツリーのような再帰形分割過程）、バック・プロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、ベイジアン分類子又はフィッシャー分析）、ロジスティク分類子、及びサポートベクター分類子（サポートベクターマシン）が挙げられる。
【０１１２】
より好ましい監督下分類法は、再帰形分割過程である。再帰形分割過程では、未知のサンプルから誘導されるスペクトルを分類するために再帰形分割ツリーを利用する。再帰形分割過程の更なる詳細は、米国特許出願第２００２／０１３８２０８Ａ１号公報（Ｐａｕｌｓｅらの「マススペクトルの分析法」）に記されている。
【０１１３】
他の態様例では、作成される分類モデルは、不監督の学習法を用いて作成される。不監督の分類では、トレーニングデータセットを得たスペクトルを前もって分類すること無しに、トレーニングデータセットの類似性に基づき分類を学ぶことを試みるものである。不監督の学習法には、クラスター分析が含まれる。クラスター分析では、理想的には互いに非常に類似し、そして他のクラスターのメンバーとは相違した「クラスター」又はグループに、データを分割することが試みられる。類似性は、次にデータ項目間の距離を測定するある距離関数を用いて測定し、そして互いに近いデータ項目を一緒にしてクラスター化する。クラスター化技術としては、ＭａｃＱｕｅｅｎのＫ平均アルゴリズム及びＫｏｈｏｎｅｎの自己組織化マップアルゴリズムがある。
【０１１４】
生体情報を分類することに用いるよう主張される学習アルゴリズムは、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０１／３１５８０号公報（Ｂａｒｎｈｉｌｌらの「生体システムのパターン認定法及びその装置並びにその使用法」）、米国特許出願第２００２／０１９３９５０Ａ１号（Ｇａｖｉｎらの「マススペクトル法及び分析」）、米国特許出願第２００３／０００４４０２Ａ１号（Ｈｉｔｔらの「生体データからの隠れたパターンに基づき生体の状態間を区別する工程」）、米国特許出願第２００３００５５６１５Ａ１号（Ｚｈａｎｇらの「生体発現データの処理システム及び方法」）が挙げられる。
【０１１５】
分類モデルは、適切なディジタルコンピュータで作成、また使用できる。適切なディジタルコンピュータとしては、Ｕｎｉｘ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）又はＬｉｎｕｘ（登録商標）ベースのオペレーティングシステムのような、標準又は特殊オペレーティングシステムの何れかを利用するマイクロ、ミニ、又は大型コンピュータが含まれる。用いるディジタルコンピュータは、目的のスペクトルを得るために用いる質量分析計から、物理的に分離しているか、又は質量分析計と結合していてもよい。
【０１１６】
本発明の態様によるトレーニングデータセット及び分類モデルは、ディジタルコンピュータで実施又は使用できるコンピュータでコード化できる。コンピュータコードは、オプティカル、又は磁気ディスク、スティック、テープ、その他のコンピュータで読み取り可能な適切な媒体に保存することができ、またＣ、Ｃ＋＋、ビジュアルベーシック等適切なコンピュータ言語で書くことができる。
【０１１７】
上記の学習アルゴリズムは、既に見いだされたバイオマーカーの分類アルゴリズムの開発、及び卵巣癌の新しいバイオマーカーの発見の両方に有用である。また分類アルゴリズムは、単独又は組み合わせで用いられたバイオマーカーの診断値（例えば、カットオフポイント）を提供し、診断検査の基礎を形成する。
【０１１８】
８． 画像のためのバイオマーカーの使用
陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）又は単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）の画像のような非侵襲性の医療画像法は、癌、冠動脈疾患及び脳疾患の検出に有効である。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの画像は、他の画像技術（Ｘ線、ＣＴ及びＭＲＩのような）が構造を示すのに比べて、器官及び組織の化学的な機能を示す。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの画像の利用は、アルツハイマー病のような脳疾患の発症を認定したり、モニターすることへの利用が増加している。幾つかの事例では、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの画像の利用で、アルツハイマー病をその発症より数年早く検出することが可能となる。例えば、Ｖａｓｓａｕｘ及びＧｒｏｏｔ−ｗａｓｓｉｎｋの「遺伝子治療のためのインビボ非侵襲性画像」（J. Biomedicine and Biotechnology, 2: 92-101 (2003)）を参照されたい。
【０１１９】
異なった方策では、ヒトの脳でのアミロイド沈着のインビボ画像に適した化合物の開発に使用される。Ａ−β及びペプチドフラグメントに対するモノクロナール抗体は、ＡＤの患者の検査では脳への取り込みが制限されている。アミロイド画像の小分子の進入は、以下に記載のように最も成功したものである。例えば、「Nordberg A, Lancet Neurol., 3(9): 519-27 (2004)」、「Kung MP et al, Brain Res., 1025(1-2): 98-105 (2004)」、「Herholz K et al., Mol Imaging Biol., 6(4): 239-69 (2004)」、「Neuropsychol Rev., Zakzanis KK et al., 13(1): 1-18 (2003)」及び「Herholz K, Ann Nucl Med., 17(2): 79-89 (2003)」を参照されたい。
【０１２０】
本明細書で開示のペプチドバイオマーカー又はそのフラグメントは、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの画像への適用の状況で使用されている。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの適用に適したトレーサー残留物で修飾した後、アミロイドプラークタンパク質と相互作用するペプチドバイオマーカーを、アルツハイマー病患者のアミロイドプラークの沈着を画像化するのに使用することができる。
【０１２１】
アンチセンス技術は、転写物の翻訳が、本明細書で同定されるバイオマーカーで関連付けられるその転写物の発現を検出するのに使用される。例えば、１１１Ｉｎのような適当な放射性核種で標識され、そして生体膜バリアを横切って輸送できる脳の薬剤標的システムに包合されたアンチセンスペプチド核酸（ＰＮＡ）が、脳癌での内生の遺伝子発現の画像化の実証に使用される。鈴木らの「Jounal of Nuclear Medicine, 10: 1766-1775 (2004)」を参照されたい。鈴木らは、血液脳関門で移送受容体を標的とし、そしてＰＮＡがバリアを横断するのを容易にする、モノクロナール抗体を包含するデリバリーシステムを利用した。
【０１２２】
９． 物質の組成
他の態様として、本発明は、本発明のバイオマーカーをベースにした物質の組成物を提供する。
【０１２３】
一態様では、本発明は精製した形態で本発明のバイオマーカーを提供する。精製のバイオマーカーは、抗体を増大させる抗原として有用である。精製のバイオマーカーは、アッセイ方法での標準としても有用である。本明細書で用いられる「精製のバイオマーカー」とは、バイオマーカーが見出される生体サンプルからの、他のタンパク質、ペプチド及び／又は他の物質から単離されたバイオマーカーである。バイオマーカーは、機械的分離（例えば、遠心分離）、硫酸アンモニウム沈殿、透析（サイズ排除の透析を含む）、サイズ排除のクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び金属キレートクロマトグラフィーを含む、当該技術分野で公知の方法で精製されるが、これらに限定されるものではない。そのような方法は例えば、クロマトグラフィーカラム又はバイオチップ等の何れか適当なスケールで実施できる。
【０１２４】
別な態様では、本発明は、本発明のバイオマーカーに特異的に結合する生体特異的な捕捉剤を提供する。一態様では、生体特異的な捕捉剤は、抗体である。そのような組成物は、検出アッセイ、例えば、診断でバイオマーカーを検出するのに有効である。
【０１２５】
別な態様では、本発明は、本発明のバイオマーカーを結合する生体特異的な捕捉剤（ここにおける捕捉剤は固体相に結合する）を提供する。例えば、本発明では、生体特異的な捕捉剤で被覆されるビーズ、チップ、膜、モノリス又はマイクロタイタープレートからなる装置が考えられる。そのような物体は、バイオマーカー検知アッセイで有用である。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、本発明のバイオマーカーに結合する抗体のような生体特異的な捕捉剤からなる組成物（精製した形態であってもよい）を提供する。そのような組成物は、バイオマーカーの精製又はバイオマーカーを検出するアッセイで有用である。
【０１２７】
別な態様では、本発明は、吸着剤、例えば、クロマトグラフィー吸着剤又は生体特異的な捕捉剤に付着する固体基質（本発明のバイオマーカーに更に結合する）からなる物体を提供する。一態様では、その物体は、バイオチップ又は質量分析プローブ、例えば、ＳＥＬＤＩプローブである。そのような物体は、バイオマーカーの精製又は検出に有用である。
【０１２８】
１０． 卵巣癌のバイオマーカーの検出キット
別な態様として、本発明は、卵巣癌の症状を認定するためのキットを提供し、そのキットは本発明によるバイオマーカーの検出に用いられる。一態様では、キットは、捕捉剤が付着したチップ、マイクロタイタープレート、ビーズ又は樹脂のような固体担体からなり、ここにおいて、捕捉剤は本発明のバイオマーカーを結合する。従って、例えば、本発明のキットは、プロテインチップ（登録商標）アレイのようなＳＥＬＤＩ用の質量分析プローブを包含できる。生体特異的な捕捉剤の場合、キットは、反応性表面を有する固体担体及び生体特異的な捕捉剤を包含する容器を含んでなる。
【０１２９】
前記キットは、洗浄液又は洗浄液を作るための説明書も包含し、捕捉剤と洗浄液の組み合わせは、例えば質量分析計でのその後の検出のための固体担体上にバイオマーカー（複数を含む）の捕捉を可能にする。このキットでは、異なった固体担体上に、それぞれ存在する、より多くのタイプの吸着剤を含むことができる。
【０１３０】
更なる態様では、このようなキットは、ラベル又は別個の挿入物の形態で、適切な操作パラメータの説明書を包含できる。例えば、その説明書で使用者にサンプルの採取法、プローブの洗浄法、又は検出すべき特定のバイオマーカーについての情報を提供することができる。
【０１３１】
更なる別な態様では、キットは、較正用の標準（複数を含む）として用いられるバイオマーカーのサンプルを有している１つ又はそれ以上の容器を包含できる。
【０１３２】
１１． スクリーニングアッセイでの卵巣癌用バイオマーカーの使用及び卵巣癌の治療法
本発明の方法には、更に他の適用もある。例えば、バイオマーカーは、インビトロ又はインビボでのバイオマーカーの発現を調節する化合物のスクリーニングに用いられ、この化合物は、患者の卵巣癌の治療又は防止に有用である。別の例では、バイオマーカーは、卵巣癌に対する治療の応答をモニターするために使用できる。他の実施例では、バイオマーカーは、対象が卵巣癌を発症するリスクがあるかを判定する遺伝検討に用いることができる。
【０１３３】
従って、例えば、本発明のキットは、プロテインバイオチップ（例えば、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＨ５０プロテインチップアレイ、例えば、プロテインチップアレイ）のような疎水性機能を有する固体基質、及び基質を洗浄するための酢酸ナトリウム緩衝液、更にチップ上の本発明のバイオマーカーを測定し、そしてこれらの測定値を卵巣癌の診断に用いるプロトコールを提供する説明書を含むことができる。
【０１３４】
治療治験に適した化合物は、表１、３及び４に記載の１つ又はそれ以上のバイオマーカーと反応する化合物を同定することで、まずスクリーニングされる。例示として、スクリーニングには、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを組み換え発現させること、バイオマーカーを精製すること、バイオマーカーを基質に接着させることが含まれる。次に、テスト化合物を基質に接触させ（通常、水溶液条件下で）、テスト化合物とそのバイオマーカー間の相互作用を、例えば、塩濃度の関数として流出率を測定することで、測定する。ある特定のタンパク質は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの１つ又はそれ以上を認識し、開裂しうるが、そのような場合には、そのタンパク質は、標準アッセイ、例えばタンパク質のゲル電気泳動によって、１つ又はそれ以上のバイオマーカーの消化をモニターすることにより検出できる。
【０１３５】
関連した態様では、表１、３及び４に記載の１つ又はそれ以上のバイオマーカーの活性を抑制するテスト化合物の能力が測定される。当業者は、特定のバイオマーカーの活性を測定する技術がバイオマーカーの機能及び特性に依存して変動することを認めている。例えば、バイオマーカーの酵素活性は、適切な基質が利用でき、また基質の濃度又は反応生成物が容易に測定できるならば、アッセイできる。所与のバイオマーカーの活性を抑制する又は強化する潜在的に治療効果のあるテスト化合物の能力は、テスト化合物の存在下又は非存在下で触媒の率を測定し判定できる。表１、３及び４に記載の１つ又はそれ以上のバイオマーカーの、非酵素（例えば、構造的）機能又は活性に干渉するテスト化合物の能力が測定できる。例えば、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを含む多タンパク質複合体の自己集合は、テスト化合物の存在下又は非存在下で分光法でモニターできる。あるいは、バイオマーカーが転写の非酵素的なエンハンサーであるなら、転写を強化するバイオマーカーの能力に干渉するテスト化合物を、テスト化合物の存在下又は非存在下でのインビボ又はインビトロでのバイオマーカー依存の転写レベルを測定することによって同定できる。
【０１３６】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーの何れかの活性を調節できるテスト化合物は、卵巣癌又は他の癌を患っている又はそのリスクのある患者に投与できる。例えば、特定のバイオマーカーの活性を増大させるテスト化合物の投与は、もしその特定のバイオマーカーの活性が卵巣癌のタンパク質の蓄積をインビボで防止するならば、患者での卵巣癌のリスクを低減するであろう。また特定のバイオマーカーの活性を低減させるテスト化合物の投与は、そのバイオマーカーの活性の増大が、少なくとも一部、卵巣癌の発症の原因であれば、患者での卵巣癌のリスクを減少させることができる。
【０１３７】
更に追加の態様では、本発明は、カルグラヌリンＣの修飾した形態のレベルの増大と関連する卵巣癌のような疾患の治療に有用な化合物を同定するための方法を提供する。例えば、一態様では、細胞抽出物又は発現ライブラリーが、全長のカルグラヌリンＣ（Ｍ１０４３０）の開裂で先を切断した形のカルグラヌリンＣ（Ｍ１０２１０）を形成する触媒となる化合物のスクリーニングに利用できる。そのようなスクリーニングアッセイの一態様として、カルグラヌリンＣの開裂は、カルグラヌリンＣが開裂されていないときは抑制された状態で、そのタンパク質が開裂したときは蛍光を発する蛍光プローブをカルグラヌリンＣに結合して、検出できる。あるいは、アミノ酸ｘとｙの間に開裂できないアミノ結合を提供するように修飾した全長カルグラヌリンＣが、インビボでのサイトで全長カルグラヌリンＣを開裂する細胞プロテアーゼを選択的に結合又は「トラップ」するのに用いられる。プロテアーゼ及びそれらのターゲットをスクリーニングし、同定する方法は、科学文献に詳しく記述されている。例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｔｉｎらの「Nature Reviews, 3:509-519 (2002)」を参照されたい。
【０１３８】
更に、別な態様では、本発明は、疾患、例えば、卵巣癌（これは、先を切断したカルグラヌリンＣのレベル増大と関連している）の進行若しくは可能性を治療又は低減する方法を提供する。例えば、全長のカルグラヌリンＣを開裂する１つ又はそれ以上のタンパク質を同定した後、同定したタンパク質の開裂活性を抑制する化合物について組み合わせライブラリーをスクリーニングする。その様な化合物の化学ライブラリーをスクリーニングする方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ(２００２)らの文献を参照されたい。あるいは、抑制化合物は、カルグラヌリンＣの構造に基づいて理知的に設計できるであろう。
【０１３９】
臨床レベルでは、テスト化合物のスクリーニングは、テスト化合物に対象を曝露する前後に、検査対象からサンプルを得ることが含まれる。表１、３及び４に記載のバイオマーカーの１つ又はそれ以上のサンプルのレベルを測定し、テスト化合物に曝露後のバイオマーカーのレベルが変化するかどうかを判定するために、分析する。本明細書に記したように、質量分析でサンプルを分析してもよいし、又は当業者に公知の他の方法の何れかで分析しても良い。例えば、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの１つ又はそれ以上のレベルは、それらバイオマーカーに特異的に結合する放射性標識又は蛍光標識の抗体を用いる、ウエスタンブロットで直接測定できる。あるいは、バイオマーカーの１つ又はそれ以上をコードするｍＲＮＡのレベルの変化を測定し、対象に投与した所定のテスト化合物と相関付けられる。更なる態様では、バイオマーカーの１つ又はそれ以上の発現レベルの変化を、インビトロでの方法及び材料を用いて測定する。例えば、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの１つ又はそれ以上を発現する又は発現できるヒト組織培養の細胞に、テスト化合物を接触しても良い。テスト化合物で処置された対象は、その治療による生理的効果につき定期的に検査を受ける。特に、対象での疾患可能性を低減する能力について、テスト化合物を評価する。あるいは、卵巣癌と先に診断された対象にテスト化合物を投与する際は、その疾患の進行を遅延する又は停止する能力について、テスト化合物をスクリーニングする。
１２． 実施例
【実施例１】
【０１４０】
卵巣癌に対するバイオマーカーの発見
サンプル
卵巣嚢胞液サンプルは、ケンタッキー大学より入手した。サンプルは、患者の手術中に採取され、−８０℃に保存された。サンプルの分布は以下の通りである：侵襲性の卵巣癌（ＯｖＣａ） １２症例；悪性度の低い見込み（不明確な）卵巣癌 １３症例；他の悪性腫瘍 ６症例；及び良性 ３９症例。
【０１４１】
サンプル：血清プロファイリング
卵巣嚢胞プロファイリングは、直接のチップ結合方法及び陰イオン交換分別後のチップ結合方法の両方を用いて実施した。プロファイリングするサンプルを含むランダム化テンプレートが、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアプログラムを用い作成された。サンプルを氷上で解凍し、９６個のウェルプレートに加えて（アレンジメント用テンプレートに従い）、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。嚢胞液のアリコートを、新しい９６個のウェルプレートに入れ、使用まで−８０ｏＣで保存した。血清サンプルは、２００４年１０月６日にＩＭＡＣ−Ｃｕ＋＋、及び２００４年１０月１４日にＱ１０（以下のプロトコールを参照されたい）よりトリプリケート（３組）のプロテインチップアレイでプロファイリングした。同一日に全ての複製を調製し、ＰＣＳ４０００で読み込んだ。アレイは、Ｂｉｏｍｅｋ２０００又はＴｅｃａｎ Ａｑｕａｒｉｕｓロボットを用い、サンプルで処理した。
【０１４２】
直接のチップ結合プロトコール：
１．５μｌのサンプルを、７．５μｌのＵ９緩衝液で変性する
２．４℃にて２０分間振って混合する
３．５０ｍＭのトリス（ｐＨ９）緩衝液１１２．５μｌを加えて、最終容量を１２５μｌとする
４．５μｌの変性サンプルを４つのチップタイプの全てに適用する
チップ結合：
ＩＭＡＣ３０：ＩＭＡＣ３０プロテインチップアレイは銅と結合させる。結合及び洗浄緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）／５００ｍＭのＮａＣｌ溶液である。
ＣＭ１０：結合及び洗浄緩衝液は、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）溶液である。
Ｈ５０：結合及び洗浄緩衝液は、１０％のアセトニトリル緩衝液である。
Ｑ１０：結合及び洗浄緩衝液は、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）である。
結合処理時間：室温で６０分間である。
マトリックスは、シナピニン酸である。
【０１４３】
１． 陰イオン交換分別プロトコール：
緩衝液リスト：
１．Ｕ９（９Ｍの尿素、２％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９）
２．Ｕ１（１Ｍの尿素、０．２２％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ９）
３．０．１％のＯＧＰを有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９）（洗浄緩衝液１）
４．０．１％のＯＧＰを有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７）（洗浄緩衝液２）
５．０．１％のＯＧＰを有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５）（洗浄緩衝液３）
６．０．１％のＯＧＰを有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４）（洗浄緩衝液４）
７．０．１％のＯＧＰを有する５０ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ３）（洗浄緩衝液５）
８．３３．３％のイソプロパノール／１６．７％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸（洗浄緩衝液６）
注意：洗浄緩衝液５が樹脂に適用されるまでは、洗浄緩衝液６を緩衝液トレイに等分しない。これにより、揮発性の有機溶媒の蒸発が問題にはならない。
【０１４４】
物質リスト：
フィルタープレート
Ｆ１〜Ｆ６に標識された６ｖのウェルの９６個ウェル皿
【０１４５】
Ａ．洗浄樹脂
ＨｙｐｅｒＱ ＤＦ樹脂を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）の５倍のベッド容量で３回洗浄して樹脂を準備する。その後５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ溶液（ｐＨ９）中に５０％の懸濁状態で保存する。
【０１４６】
Ｂ．変性の血清タンパク質
冷凍血清を解凍し、４℃にて２００００ｇで１０分間遠心分離する
９６個のウェルプレートのそれぞれのウェルに２０μｌの血清を等分する
３０μｌのＵ９をそれぞれのサンプルに加える
４℃にて２０分間よく攪拌する
【０１４７】
Ｃ．樹脂の平衡化
１８０μｌ（ラット血清に対しては２４０μｌ）のＨｙｐｅｒＱ ＤＦをフィルタープレート中のそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
２００μｌのＵ１をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
２００μｌのＵ１をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
２００μｌのＵ１をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
【０１４８】
Ｄ．血清と樹脂の結合
各ウェルから５０μｌのサンプルをピペットでフィルタープレート中の対応するウェルに加える
５０μｌのＵ１をサンプルプレートのそれぞれのウェルに加える
５回混合する
サンプルプレートの各ウェルから５０μｌをピペットでフィルタープレート中の対応するウェルに加える
「この工程は、ロボットでピペット採取する場合デッド容量がある（ロボットが最初にサンプルを採取する時、全ての物質を採取しない）ために含まれる。５０μｌのＵ１を加えて混合することにより、残留物を得て最初の５０μｌに加えることができる。」
４℃にて３０分間よく攪拌する
【０１４９】
Ｅ．画分の採取
フィルタープレートの下にプレートＦ１のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ１に通過液を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液１をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ１にｐＨ９の流出液を採取する
画分１は通過液とｐＨ９の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液２をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ２のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ２に画分２を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液２をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ２に画分２の残りを採取する
画分２はｐＨ７の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液３をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ３のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ３に画分３を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液３をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ３に画分３の残りを採取する
画分３はｐＨ５の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液４をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ４のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ４に画分４を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液４をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ４に画分４の残りを採取する
画分４はｐＨ４の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液５をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ５のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ５に通過液を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液５をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ５に画分５の残りを採取する
画分５はｐＨ３の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液６をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ６のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ６に画分６を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液６をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ６に画分６の残りを採取する
画分６は有機溶媒の流出液を含む
チップ結合のプロトコールを進めるまで冷凍する
【０１５０】
チップ結合のプロトコール
緩衝液リスト：
ＩＭＡＣ３０チップ：
１．１００ｍＭのリン酸ナトリウム＋０．５ＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．０）
２．１００ｍＭのＣｕＳＯ４
３．１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）
ＣＭ１０チップ：
１．１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）
【０１５１】
物質リスト：
バイオ処理装置（bioprocessors）
ＩＭＡＣ３０チップ
ＣＭ１０チップ
バイオ処理装置にチップをおく
【０１５２】
Ａ．ＩＭＡＣチップの銅負荷
５０μｌのＣｕＳＯ４をＩＭＡＣ３チップ上の各々の部位に負荷する
バイオ処理装置を７００ｒｐｍで１分間遠心分離する
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後ＣｕＳＯ４を除く
水洗浄する
【０１５３】
Ｂ．ＩＭＡＣチップの中性化
５０μｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）をＩＭＡＣ３チップ上の各々の部位に負荷する
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後酢酸ナトリウムを除く
水洗浄する
【０１５４】
Ｃ．チップの平衡化
１５０μｌの適当なチップ結合緩衝液をそれぞれのウェルに加える
ＣＭ１０のためにバイオ処理装置を７００ｒｐｍで１分間遠心分離する
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
１５０μｌの適当な緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
【０１５５】
Ｄ．チップへの画分の結合
各ウェルに９０μｌの対応する緩衝液を加える
１０μｌのＱカラム画分を加える
ＣＭ１０のためにバイオ処理装置を７００ｒｐｍで１分間遠心分離する
室温（ＲＴ）で６０分間よく攪拌する
攪拌後サンプルと緩衝液を除く
【０１５６】
Ｅ．チップの洗浄
１５０μｌの対応する緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
１５０μｌの対応するチップ結合緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
１５０μｌの対応する緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
２回水洗浄する
【０１５７】
Ｆ．マトリックスの追加
バイオ処理装置の上部とガスケットを除く
部位から水を真空下で除く
チップを１０分間乾燥する
ペン（a pap pen）を用いて各スポットの周りに円を描く
ＳＰＡに対して
４００μｌの５０％のＡＣＮ、０．５％のＴＦＡをＳＰＡチューブに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
１．０μｌを各スポットに加える
１０分間風乾する
１．０μｌを各スポットに加える
風乾する
【０１５８】
データ分析：
データは、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓを用いて得た。質量較正は、外部較正試薬を用いて実施し、強度の正規化は、外部の正規化要因を用いて、総イオン電流に基づき実施し、またベースラインを差し引くことを行った。ピーク検出は、ピークがシグナル／ノイズ比３：１を有し、スペクトルの２０％に存在することを基準として用い、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓで実施した。統計解析は、マン・ホイットニー検定（２グループ、例えば、良性対卵巣癌に対して）又はクラスカル・ウォリス検定（多重グループ比較で、良性の卵巣疾患、卵巣癌、悪性度の低い見込みの卵巣癌（ＬＭＰ）、他の悪性腫瘍（転移性癌（例えば、胃癌の卵巣への転移）、中皮腫、間質卵巣癌等を含む、侵襲性上皮卵巣癌以外の悪性腫瘍）のそれぞれの比較）を用い、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓで実施した。
【０１５９】
結果／結論：
クラスカル・ウォリス検定を用いて、４通りの比較を実施した。４つのグループは、良性の卵巣疾患、侵襲性上皮卵巣癌、不明確な卵巣癌（悪性度の低い見込みの卵巣癌とも呼ばれる）、及び他の悪性腫瘍（間質卵巣腫瘍、転移性疾患及び子宮癌を含む）である。
【０１６０】
上記の方法で卵巣嚢胞液で同定される卵巣癌のバイオマーカーは、表１に示す。もっとも注目すべきは、ほとんどの顕著なピークが、同じように疾患の悪性腫瘍（又は非悪性腫瘍）の特徴に基づいて上方又は下方制御されている。良性疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌（不明確な疾患と呼ばれる）は、ピーク強度の同じ分布を有する傾向があり、一方侵襲性の卵巣癌及び他の悪性の疾患はピーク強度の同じ分布を有する傾向にある。本発明のこれらのバイオマーカーは、単独で、又は卵巣癌の重要なバイオマーカーである以前に同定されている他のタンパク質と一緒に用いることができる。
【実施例２】
【０１６１】
マーカーの精製及び同定（ＩＤ）
バイオマーカーは、ある範囲のＢｉｏｓｅｐｒａ吸着剤を用いるクロマトグラフィー技術、そして続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理する組み合わせで精製される。精製のスキームは、目的のバイオマーカーを追跡するプロテインチップ読み込み器（Reader）を用いてモニターされる。３０ｋＤａより小さいタンパク質に対しては、目的の無傷のバンドをゲルから抽出し、プロテインチッップ読取り器で再分析して元のバイオマーカーと一致するそれらの正確な質量を確認する。ゲル抽出のタンパク質は、溶液中でトリプシンで消化し、３０ｋＤａより大きいタンパク質はゲル中で消化される。トリプシンの消化物は、プロテインチップ読取り器を用いてペプチドマッピングし、ＰＣＩ−１０００プロテインチップ接触面を合わせたＱ−ＳＴＡＲ（Applied Biosysrtems）装置を用いるタンデムＭＳによって分析する。４ｋＤａより小さいバイオマーカーは、クロマトグラフィー技術の組み合わせにより濃縮して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製及び／又はトリプシン消化なしにタンデムＭＳで直接同定される。幾つかの事例（例えば、リゾチームＣ）では、バイオマーカーは、抗体を用いて同定される。
【０１６２】
先の段落で記載の技術で、表１に記載のバイオマーカーの同定が可能となる。
【実施例３】
【０１６３】
バイオマーカーの発見
方法
タンパク質発現のプロファイリングは、卵巣腫瘍の７４名の患者の卵巣嚢胞液（１６症例の悪性、１３症例の悪性度の低い見込み、４５症例の良性）でプロテインチップバイオマーカーシステム（登録商標）（Ciphergen Biosystems）である表面増強レーザー脱離イオン化時間又は飛行型質量分析計を用いて実施した。卵巣嚢胞液は、無分別及び陰イオン交換分別後に分析した。各々の画分のアリコートは、ＮＰ２０、ＩＭＡＣ３０、ＣＭ１０、Ｈ５０及びＱ１０のプロテインチップアレイで２通り分析した。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＥｘＰｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェアは、ｍ／ｚピークの同定及び診断のグループ間のピーク強度比較のために用いた。診断のグループ間のピーク強度の統計的に有意な違いは、クラスカル・ウォリス検定及びＲＯＣ曲線分析により判定した。
【０１６４】
結果
卵巣嚢胞液からの１００以上のタンパク質ピークは、良性、悪性及び悪性度の低い見込みの卵巣腫瘍の間でピーク強度が有意に異なった（下記の表２及び３を参照されたい）。これらの卵巣嚢胞液で、以下のものが、ＭＳ／ＭＳ又は免疫学的測定の評価を有するＭＳ／ＭＳにより同定される：アポリポタンパク質ＣI（ｍ／ｚ＝６５２０、ｐ＝０．０００３）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ｍ／ｚ＝８６９０、ｐ＝０．００００６）及びアポリポタンパク質ＣＩＩ（ｍ／ｚ＝８９１８、ｐ＝０．０００２）；カルグラヌリンＡ（ｍ／ｚ＝１０８４０、Ｐ＝０．００００１）及びカルグラヌリンＣ（ｍ／ｚ＝１０４３０、Ｐ＝０．００００４）；トランスサイレチン（二重荷電）（ｍ／ｚ＝６８８０、Ｐ＝０．００００５）；及びカルサイクリン（ｍ／ｚ＝１０２１０、Ｐ＝０．００００２）。
【０１６５】
表３
ＣＭ１０プロテインチップアレイに吸収され、高いレーザー強度で読み込まれた個々の患者からの陰イオン交換分別した嚢胞液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析値は、悪性の上皮卵巣腫瘍に対して良性及び悪性度の低い見込みの腫瘍を有する患者で違いのある、３５個のバイオマーカーを同定した。クラスカル・ウォリスのＰ値（複数を含む）及びＲＯＣ分析のＡＵＣ値を示した。
【表３】
【０１６６】
表４
ＣＭ１０プロテインチップアレイに吸収され、低いレーザー強度で読み込まれた個々の患者からの陰イオン交換分別した嚢胞液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析値は、悪性の上皮卵巣腫瘍に対して良性及び悪性度の低い見込みの腫瘍を有する患者で違いのある、２８個のバイオマーカーを同定した。クラスカル・ウォリスのＰ値（複数を含む）及びＲＯＣ分析のＡＵＣ値を示した。
【表４】
【０１６７】
結論
卵巣嚢胞液は、卵巣癌の診断のタンパク質バイオマーカーの豊富な供給源である。これらのバイオマーカーの幾つかが急性期反応物である。本明細書で実証したように、嚢胞液のタンパク質は、卵巣癌の診断検査に有用なバイオマーカーの優れた供給源である。
【０１６８】
本明細書に記した実施例及び態様は、例示のためのみであり、それらに基づく種々の修正及び変更は当業者には示唆されるものであり、それらは本出願及び添付の特許請求の範囲の精神及び範疇に含められるものであることを理解されたい。本明細書に参照した出版物、特許及び特許出願の全ては、全ての目的のためにそれらの全てを参照して本明細書に取り込む。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】図１は、良性（ａ、ａ’）、悪性の上皮卵巣癌（ｂ、ｂ’）及び悪性レベルの低い見込みの腫瘍を有する、個々の患者からの嚢胞液の代表的なスペクトル（Ａ）及び対応するゲル模様（Ｂ）を示す。漸減したｐＨ（ｐＨ９．０、７．０、５．０、４．０、３．０）の陰イオン交換で分別し、その後有機溶媒、ＣＭ１０プロテインチップアレイに吸収させ、そして低いレーザー強度で読み込む。各々の患者のｐＨ９．０流出画分を示した。代表的な散布及び四角のプロット（Ｃ）は、ｍ／ｚ：１０，８４０の「ピーク強度」（カルグラヌリンＡ）で変動を示す。ｍ／ｚ：１０，８４０ピークは、悪性の上皮卵巣癌を有する患者で極めて大きな「ピーク強度」を示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年６月２４日出願の米国特許仮出願第６０／６９３，７５５号及び２００６年３月２２日出願の同第６０／７８５，０３１号に関連し、その全てを参照して本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（発明の分野）
発明は一般的に、臨床診断、特に卵巣癌の臨床診断に関連したものである。
【背景技術】
【０００３】
卵巣癌は、先進国において最も死亡率の高い婦人科の悪性腫瘍の一つである。アメリカ合衆国だけでも年間に、約２３，０００名の女性が本疾病であると診断され、ほぼ１４，０００名が本疾病により死亡している（Jamal, A., et al., CA Cancer J. Clin., 52:23-47 (2002)）。癌治療法の進歩に拘らず、卵巣癌の死亡率は、過去２０年間実質的には変化がないままである（同上の文献）。疾病が診断された段階に応じた生存率の急勾配を考慮するならば、早期検出は、卵巣癌患者の長期生存率の改善に最も重要な要素であり続けている。
【０００４】
後期段階に診断された卵巣癌の予後不良、確証的診断手段に関連した費用とリスク並びに一般の母集団における比較的少ない患者数が相俟って、一般母集団における卵巣癌患者のスクリ−ニングに適用する検査の感度及び特異性に極めて厳しい要件が求められている。
【０００５】
癌の初期検出及び診断に適した腫瘍マーカーの識別により、患者の臨床成績の改善が大きく期待できる。曖昧な症状を示す患者、全く症状を示さない患者又は検診において比較的判断しにくい癌を有する患者にとって、腫瘍マーカーは特に重要である。初期段階における検出を目指して大きな努力が払われているにも拘らず、対費用効果の高い検査は開発されておらず（Paley, Curr. Opin. Oncol., 13(5):399-402 (2001)）、女性は一般に、診断時に播腫性の疾患の症状を示す（「婦人科腫瘍の本質と実際(Hoskins WJ, Perez CA, Young RC, editors., 3rd ed. Philadeiphia: Lippincott, Williams and Wilkins; pages981-1057 (2000))」の「上皮性卵巣癌（Ozols RF, et al.）」）。
【０００６】
最も良く特徴が知られている腫瘍マーカーであるＣＡ１２５は、ステージＩの卵巣癌のおよそ３０％から４０％では陰性であり、多くの良性の疾患ではその割合は上昇する（Meyer et al., Br. J. Cancer, 82(9):1535-8 (2000); Buamah, J. Surg. Oncol., 75(4):264-5 (2000); Tuxen, et al., Cancer Treat. Rev., 21(3):215-45 (1995)）。卵巣癌の初期段階での検出の集団ベースのスクリ−ニングの手段として並びに診断としてのそれの使用は、感度及び特異性が低いため無理である（「MacDonald et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 82(2):155-7 (1999)」；「Jacobs et al., Hum. Reprod., 4(1):1-12 (1989)」；「腫瘍マーカーの生理学的、病理生物学的、技術工学的並びに臨床的適用（Diamandis, Fritsche, Lilja, Chan, and Schwartz, editor, Philadelphia: AACC Press; in press)」における「卵巣癌における腫瘍マーカー（Shih et al.)」）。骨盤及び更に近年では膣の超音波検査が、リスクの高い患者をスクリ−ニングするために使用されているが、いずれも一般集団に適用するためには技術的に感度及び選択性が十分ではなかった。（MacDonald et al., supra）。癌モデルの長期リスク（Skates et al., Cancer, 76(10 Suppl);2004-10 (1995)）において、別の腫瘍マーカーとＣＡ１２５との併用（「Woolas et al., J. National Cancer Inst., 85(21):1748-51 (1993)」；「Woolas et al., Gynecol. Oncol., 59(1):111-6 (1995)」；「Zhang et al., Gynecol. Oncol., 73(1):56-61 (1999)」；「ステージＩの上皮卵巣癌を検出するための複数マーカーの利用：ニューラル・ネットワーク解析による性能の向上（Zhang et al., American Society of Clinical Oncology 2001）；年会の要旨」）、並びに２次検査として超音波検査と平行してのＣＡ１２５の使用（「Jacobs et al., Br. Med. J., 306(6884):1030-34 (1993)」及び「Menson et al., British Journal of Obstetrics and Gynecology, 107(2):165-69 (2000)」）での近年の試みでは、比較的低い有病率を示す卵巣癌のような疾病にとって極めて重要な、検査全体の特異性の改善に繋がる有望な結果が得られている。
【０００７】
後期卵巣癌の悲惨な予後のために、最小の陽性予測値が１０％の検査でさえも臨床医は受け入れるであろうということは、一般的なコンセンサスである。（Bast et al., Cancer Treatment and Research, 107:61-97 (2002)）。これを一般の集団に拡張するには、一般スクリ−ニング検査の感度は７０％を超え、選択性は９９．６％を超える必要がある。近年、ＣＡ１２５、ＣＡ７２−４又はＭ−ＣＳＦ等の現存の血清マーカーは、何れも一つ一つではそのような性能を有していない（Bast et al., Int. J. Biol. Markers, 13:179-87 (1998)）。
【０００８】
従って、それ自体で又は他のマーカー若しくは診断モダリティーとの併用で卵巣癌の初期検出において必要な感度及び特異性を示す、新しい血清マーカーが切実に求められている（「卵巣癌：卵巣癌の初期検出、展望と実現性」（Bast et al.,：ISIS Medical Media Ltd., Oxford, UK (2001), in press））。許容されるスクリーニング検査がない状態での初期検出は、卵巣癌患者の長期生存率を改善させる最も重要な要因を依然として残したままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、患者の卵巣癌の症状を判定するための信頼できる且つ正確な方法の確保が、望まれており、その様な方法の結果を用いると対象の治療が管理可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、卵巣癌を診断するのに有用な新規なバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせ、更に卵巣癌の診断にバイオマーカーを使用する方法及びキットを提供することにより、これらの要望を満たすものである。
【００１１】
より具体的には、一態様として、本発明は、（ａ）対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおける少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）を測定すること、そして、（ｂ）その測定結果を卵巣癌の症状と関連付けること、を含んでなる、対象の卵巣癌の症状を認定する方法を提供するものである。一態様として、バイオマーカーの少なくとも一つは、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ、カルサイクリン、トランスサイレチン（二重荷電）及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる。別な態様では、前記方法は、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ、カルサイクリン、トランスサイレチン及びＩｇＧ重鎖の各々を測定することを含む。別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５のような幾つかの他の公知の卵巣癌のバイオマーカーを測定することも、更に包含する。
【００１２】
別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５のような幾つかの他の公知の卵巣癌のバイオマーカーを測定することも、更に包含する。別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５、トランスフェリン、ハプトグロビン、ＡｐｏＡ１、トランスサイレチン、ＩＴＩＨ４内部フラグメント、β２ミクログロブリン、ヘプシジン、プロスタチン（prostatin）、オステオポンチン（osteopontin）、エソイノフィル（esoinophil）由来の神経毒、レプチン、プロラクチン、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘモグロビン及びそれらの修飾型よりなる群から選ばれる少なくとも１つのバイオマーカーを測定し、関連付けることを更に包含する。更なる別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５ＩＩ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９５、腫瘍関連のトリプシン抑制剤（ＴＡＴＩ）、ＣＥＡ、胎盤のアルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、シアリルＴＮ、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、上皮成長因子受容体の対象の細胞外領域の１１０ｋＤ成分（ｐ１１０ＥＧＦＲ）、組織カリクレイン（例えば、カリクレイン６及びカリクレイン１０（ＮＥＳ−１））、プロスタチン、ＨＥ４、クレアチンキナーゼＢ（ＣＫＢ）、ＬＡＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅ、尿ゴナドトロピン・ペプチド、Ｄｉａｎｏｎ ＮＢ７０／Ｋ、組織ペプチド抗原（ＴＰＡ）、ＳＭＲＰ、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子Ｉ及びインスリン様成長因子ＩＩを更に包含する。これら追加のバイオマーカーもまた、本発明の他の方法、キット及びソフトウェアを用いて、測定し、関連付けることができる。
【００１３】
上記方法の一態様において、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＥＬＤＩプローブの吸着体表面に当該バイオマーカーを捕捉すること、そしてレーザー脱離−イオン化質量分析計で捕捉のバイオマーカーを検出することにより測定される。別な態様では、少なくとも１つのバイオマーカーは、免疫学的測定で測定される。後者の方法は、バイオマーカーが識別されている場合、特に有用である。一態様では、サンプルは、卵巣嚢胞液である。関連する態様では、吸収体は、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤よりなる群から選ばれる部材である。更なる別な態様では、吸着体は、陽イオン交換吸着剤である。
【００１４】
別な態様において、本発明のバイオマーカーは、質量分析又はバイオマーカーの質量測定に基づく方法、以外の方法で測定される。例えば、ある特定の態様では、本発明のバイオマーカーは、免疫学的測定で測定される。
【００１５】
示唆されるように、上記方法は、卵巣癌の症状を認定することを指向している。一態様では、関連付けは、ソフトウェア分類アルゴリズムにより実施する。一般に、本発明の方法において、卵巣癌の症状は、良性の卵巣疾患、悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状から選ばれる。一態様では、卵巣癌の症状は、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状に対して、良性の卵巣疾患及び悪性レベルの低い見込みの卵巣癌から選ばれる。別な態様では、卵巣癌の症状は、良性の卵巣疾患に対する悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状から選ばれる。更なる別な態様では、卵巣癌の症状は、良性の卵巣疾患の可能性がないものである。更なる態様では、卵巣癌の症状は、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状の可能性がないものである。
【００１６】
別な態様において、本明細書に記載のバイオマーカーを検出し、その測定値を卵巣癌の症状と関連付けることには、症状に基づく対象の治療を管理することを更に包含する。関連する態様では、測定値を卵巣癌と関連付ける場合、対象の治療の管理とは、対象に化学療法薬を投与することを包含する。別な態様では、前記方法は、対象の管理の後少なくとも１つのバイオマーカーを測定し、その測定値を疾患の進行速度の測定を含む、疾患の進行と関連付けることを更に包含する。
【００１７】
本発明はまた、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおける少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）を測定することを包含する方法も提供する。
【００１８】
本発明の別の態様では、（ａ）１回目に、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおける少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）を測定すること、そして（ｂ）２回目に、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定し、（ｃ）１回目の測定値と２回目の測定値を比較し、その測定値の比較から卵巣癌の経過を判定することからなる、卵巣癌の経過を判定するための方法が、提供される。
【００１９】
更なる別な態様において、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる。更なる態様では、方法は、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を測定することを包含する。関連する態様では、前記方法は、ＣＡ１２５を測定することを更に包含する。
【００２０】
更なる別な態様では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）よりなる群から選ばれる。別の態様では、前記方法は、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）の各々を測定することを含む。別な態様では、前記方法は、ＣＡ１２５のような卵巣癌の幾つかの他の公知のバイオマーカーを測定することを更に包含する。
【００２１】
本明細書に記載の方法に加えて、本発明はまた、表１、３及び４に記載のバイオマーカーから選ばれる精製した生体分子を包含する組成物も提供する。別な態様では、本発明は、生体特異的な捕捉剤、例えば、表１、３及び４に記載のバイオマーカーから選ばれる生体分子と特異的に結合する抗体を包含する組成物を提供する。関連する態様では、生体特異的な捕捉剤は、固体担体に結合している。更なる別な態様では、本発明は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーに結合する生体特異的な捕捉剤を包含する組成物を提供する。
【００２２】
その他の態様では、本発明は、キットを提供する。例えば、一態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの捕捉剤（ここにおける捕捉剤は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる第一の群からの少なくとも１つのバイオマーカーと結合する）を付着している固体担体、及び（ｂ）この固体担体を、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを検出するために使用する説明書、からなるキットを提供する。関連する態様では、キットは、この固体担体を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、バイオマーカーを検出するために使用する説明書を更に包含する。別な態様では、キットは、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を検出するために使用する説明書を包含する。更なる別な態様では、キットは、固体担体をＣＡ１２５を検出するために使用する説明書を更に包含する。
【００２３】
更に別な関連の態様では、キットは、当該固体担体を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）よりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを検出するために使用する説明書を包含する。別な態様では、キットは、当該固体担体を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）の各々を検出するために使用する説明書を包含する。別な態様では、キットは、固体担体をＣＡ１２５のような卵巣癌の幾つかの他の公知のバイオマーカーを検出するために使用する説明書を包含する。
【００２４】
別な関連の態様では、捕捉剤（ここにおける捕捉剤は、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤である）を包含するキットの固体単体が、ＳＥＬＤＩプローブである。更なる別な態様では、キットは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの少なくとも１つを含む容器を更に包含する。更なる別な態様では、前記キットは、陽イオン交換クロマトグラフィー吸着剤を更に包含する。
【００２５】
別な態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの捕捉剤（ここにおける捕捉剤は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる少なくとも１つのバイオマーカーと結合する）を包含する固体担体、及び（ｂ）少なくとも１つのバイオマーカーを含む容器を包含するキットを提供する。関連の態様では、容器は、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを含む。更なる別な態様では、容器は、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を含む。関連の態様では、前記容器は、ＣＡ１２５を更に含む。
【００２６】
更なる別の関連の態様では、容器は、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）よりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを含む。別な態様では、容器は、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）の各々を含む。別な態様では、容器はＣＡ１２５を更に含む。
【００２７】
更なる別な態様では、捕捉剤（ここにおける捕捉剤は、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤である）を包含するキットの固体単体が、ＳＥＬＤＩプローブである。更なる別な態様では、キットは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの少なくとも１つを含む容器を更に包含する。
【００２８】
本発明は、サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおけるバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）の測定値を包含する、サンプルに起因するデータにアクセスするコードを含んでなる、及びサンプルの卵巣癌の症状を、測定値の関数として分類する、分類アルゴリズムを実行するコードを更に含んでなるソフトウエア製品を更に提供する。関連の態様として、ソフトウェア製品は、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれるバイオマーカーの測定値の関数として分類する。更なる別な態様では、分類アルゴリズムは、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々の測定値の関数として分類する。更なる別な態様では、分類アルゴリズムは、サンプルの卵巣癌の症状を、ＣＡ１２５の測定値の関数として更に分類する。
【００２９】
関連の態様として、ソフトウェア製品は、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）よりなる群から選ばれるバイオマーカーの測定値の関数として分類する。別な態様では、分類アルゴリズムは、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチン（二重荷電）のバイオマーカーの各々の測定値の関数として分類する。別な態様では、分類アルゴリズムは、サンプルの卵巣癌の症状を、ＣＡ１２５の測定値の関数として更に分類する。
【００３０】
本発明は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを、質量分析又は免疫学的測定により検出することを包含する方法を更に提供する。
【００３１】
別な態様では、本発明は、対象からのサンプル中の複数のバイオマーカー（ここにおけるバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）の相関関係から判定される卵巣癌の症状に関係する診断を、対象に伝達することを含んでなる方法を提供する。関連の態様では、診断は、コンピューター処理した媒体を介して対象に伝達される。
【００３２】
別な態様では、本発明は、（ａ）表１、３及び４に記載のバイオマーカーにテスト化合物を接触させること、及び（ｂ）テスト化合物が、表１、３及び４に記載のバイオマーカーと相互作用するかを判定することを含んでなる、表１、３及び４に記載のバイオマーカーと相互作用する化合物を同定する方法を提供する。
【００３３】
別な態様では、本発明は、細胞中のカルグラヌリンＣの濃度を調節する方法を提供する。この場合の方法は、当該細胞に、カルグラヌリンＣの開裂を防止する抑制剤を接触させることを包含する。
【００３４】
本発明は、対象の症状を治療する方法を更に提供する。この場合の方法は、対象に、カルグラヌリンＣの開裂を防止する、カルグラヌリンＣの抑制剤の治療有効量を投与することを包含する。関連の態様では、前記症状は、卵巣癌である。
【００３５】
本発明のその他の特徴、目的及び利点、並びにその好ましい態様は、以下の詳細な記述、実施例、請求の範囲から認識されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
（発明の詳細な説明）
１． 緒言
バイオマーカーは、別の表現型状態（例：疾病なし）と比較して、ある表現型状態（例：疾病あり）の対象から採取したサンプルに特異的に存在する有機生体分子である。異なったグループにおけるバイオマーカーの発現の平均又は中央値が、統計学的に有意であると算定された場合には、バイオマーカーは異なった表現型状態に対して特異的に存在している。統計学的有意に対する一般的な検定は多くあるが、特に、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、クラスカル・ウォリス検定（Kruskal-Wallis）、ウィルコクソン検定（Wilcoxon）、マン・ホイットニー検定（Mann-Whiteney）及びオッズ比（odds ratio）が挙げられる。バイオマーカーは、それ自体又は他との併用で、対象がある表現型又は別の表現型の状態に属していることを示す相対危険率の指標を提供する。従って、バイオマーカーは、疾患（診断）、医薬品の治療効果（治療的診断法）及び薬剤の毒性のためのマーカーとして有用である。
【００３７】
本発明は、卵巣癌、特に卵巣癌（侵襲性上皮卵巣癌のような悪性癌）、悪性度の低い見込みの卵巣癌（ＬＭＰ、不明確な疾患）、良性の卵巣疾患及び他の悪性症状（転移性癌（例えば、胃癌の卵巣への転移）、中皮腫、間質卵巣癌等を含む、侵襲性上皮卵巣癌以外の悪性腫瘍）を有する対象に異なって存在するポリペプチドベースのバイオマーカーを提供する。本発明のバイオマーカーは、質量分析により測定される質量対電荷の比、飛行時間型質量分析でのスペクトルピークの形、及び吸着体表面に結合する特性によって、特徴付けられる。これらの特徴は、特別に検出されるバイオマーカーが本発明のバイオマーカーであるかどうかを決定する方法を提供する。これらの特徴は、生体分子の特有の特徴を示し、バイオマーカーを識別する方法を限定するものではない。一態様では、本発明は、これらのバイオマーカーを単離された形態で提供する。
【００３８】
本発明のバイオマーカーは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社（Fremont, CA、「Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ」）のプロテインチップアレイを採用するＳＥＬＤＩ法を用いて見いだされた。卵巣嚢胞液は、卵巣癌（侵襲性上皮卵巣癌）、悪性度の低い見込みの卵巣癌（不明確な疾患）、他の悪性症状及び良性の卵巣疾患で、診断される対象から採取された。サンプルの一部は、分別しないで残し、他のサンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分別した。分別しないサンプル及び分別したサンプルを、ＳＥＬＤＩバイオチップに適用し、サンプルのポリペプチドのスペクトルを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰＢＳＩＩ質量分析計による飛行時間型質量分析によって得た。従って得られたスペクトルは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のバイオマーカーＷｉｚａｒｄ付きのＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア及びバイオマーカーパターン・ソフトウェアにより分析した。各々のグループの質量分析は、散布図分析にかけた。マン・ホイットニー検定分析は、散布図の各タンパク質クラスターの卵巣癌と対照グループを比較するために用い、タンパク質を２つのグループ間で有意に（ｐ＜０．０００１）異なることで選択した。この方法は、実施例のところで詳細に記述する。
【００３９】
このように見い出されたバイオマーカーを、表１に示す。「プロテインチップアレイ」欄は、実施例で記述のように、該当する場合バイオマーカーが見い出されたクロマトグラフィーの画分、バイオマーカーが結合するバイオチップの型及びバイオマーカーが卵巣癌を上方又は下方制御するのかどうかを示す。
【００４０】
【表１】
１）ヘモグロビンα及びヘモグロビンβが、実施例でのＳＥＬＤＩ検出アッセイで二重荷電されていることは注目されたい。
２）「悪性腫瘍での上方」は、バイオマーカーが、良性の卵巣疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌（ＬＭＰ、不明確な疾患）に対して、卵巣癌及び他の悪性症状（転移性癌（例えば、胃癌の卵巣への転移）、中皮腫、間質卵巣癌等を含む、侵襲性上皮卵巣癌以外の悪性腫瘍のような）を上方制御することを意味する。
３）「ＬＭＰでの下方」は、バイオマーカーが、その他の３つのグループ（つまり、良性の卵巣疾患、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状）に対して、悪性度の低い見込みの卵巣癌を下方制御することを意味する。
４）「ｒ／ｏ良性」は、バイオマーカーの存在が、良性の疾患の見込みであることを除くことを意味するが、単独でその他の３つのグループ（卵巣癌ＬＭＰ、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状）間の診断をするには適当ではない。
５）「ｒ／ｏ悪性」は、バイオマーカーの存在が、悪性の疾患の見込みであることを除くことを意味するが、それだけで良性の卵巣疾患の診断をするには適当ではない。
６）「悪性腫瘍の下方」は、バイオマーカーが、良性の卵巣疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌（ＬＭＰ、不明確な疾患）に対して、卵巣癌及び他の悪性症状を上方制御することを意味する。
【００４１】
本発明のバイオマーカーは、質量分析で測定されるようにそれらの質量対電荷の比によって特徴付けられる。各バイオマーカーの質量対電荷の比は、上記の表１、及び下記の表２＆３の「Ｍ」のあとに示す。例えば、「Ｍ６４２０」は、６４２０の質量対電荷の比の測定値である。質量対電荷の比は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＰＢＳＩＩ質量分析計での質量スペクトルから決定した。本機器は、約±０．１５％の質量精度を有する機器である。更に、本機器は、約４００〜１０００ｍ／ｄｍ（ここで、ｍは質量を、ｄｍは質量分析ピークの半値幅を示す）の質量分解能を有している。バイオマーカーの質量対電荷の比は、バイオマーカーＷｉｚａｒｄ（登録商標）ソフトウェア（Ciphergen Biosystems, Inc.）を用いて決定した。バイオマーカーＷｉｚａｒｄでは、ＰＢＳＩＩで決定したように、すべての解析スペクトルにおける同一ピークの質量対電荷の比をクラスター化すること、クラスターにおける質量対電荷の比の最大値及び最小値を選ぶこと、そして２で割ること、により質量対電荷の比がバイオマーカーに割り付けられる。従って、質量は、これらの特徴を反映している。
【００４２】
本発明のバイオマーカーは更に、飛行時間型質量分析におけるスペクトルのピークの形状によっても特徴付けられる。
【００４３】
本発明のバイオマーカーはまた、それらのクロマトグラフィー表面への結合特性によっても特徴付けられる。本発明のバイオマーカーが結合するクロマトグラフィー表面の例として、これらに限定されないが、疎水性の吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｈ５０プロテインチップ（登録商標）アレイ）、陰イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｑ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）、陽イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＣＭ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）及び金属キレート吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＩＭＡＣ−３０プロテインチップ（登録商標）アレイ）が挙げられる。数多くのバイオマーカーが、１０％のアセトニトリルの結合及び洗浄緩衝液を用いて、疎水性吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｈ５０プロテインチップ（登録商標）アレイ）に結合する。幾つかのバイオマーカーは、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の結合及び洗浄緩衝液を用いて、陰イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｑ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）に結合する。数多くのバイオマーカーは、例えば、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／５００ｍＭのＮａＣｌ溶液の結合及び洗浄緩衝液を用いて、金属キレート吸着剤（例えば、銅と結合したＣｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＩＭＡＣ−３０プロテインチップ（登録商標）アレイ）に結合する。殆どのバイオマーカーは、１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４）で洗浄後、陽イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＣＭ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）に結合する。
【００４４】
本発明のある特定のバイオマーカーは、測定して同定され、表１に示す。測定に用いる方法は、実施例で記載する。同定されたバイオマーカーについては、バイオマーカーの存在を、当該技術分野で公知の他の方法（例えば、免疫学的測定）によって測定することができる。
【００４５】
本発明のバイオマーカーは、質量対電荷の比、結合特性及びスペクトル形状によって特徴付けられるので、それらの明確な同定を知ることなく質量分析で検出することができる。しかしながら、望むならば、同定されていないバイオマーカーは、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を測定することにより決定することができる。例えば、バイオマーカーは、トリプシン又はＶ８プロテアーゼのような多くの酵素でペプチドをマッピングすることができ、そして種々の酵素で産生される分解フラグメントの分子量を用いて、一致するデータベースの配列を探すことができる。あるいは、タンパク質のバイオマーカーは、タンデム質量分析法を用いて配列を決定することができる。この方法では、タンパク質は、例えば、ゲル電気泳動法により単離されている。バイオマーカーを含むバンドは、切り取られ、タンパク質はプロテアーゼ消化に供される。個々のタンパク質フラグメントは、第一の質量分析計で分けられる。その後、フラグメントは、衝突誘導の冷却での処理をし、ペプチドを寸断して、ポリペプチド・ラダー（polypeptide ladder）を産生する。その後、ポリペプチド・ラダーは、タンデム質量分析の第二の質量分析計で分析される。ポリペプチド・ラダーの数の質量の違いにより配列のアミノ酸を同定する。タンパク質全体は、この方法で配列を決定することができるか、又は配列フラグメントは、候補を同定するのにデータベース発掘処理することができる。
【００４６】
バイオマーカーを検出するための好ましい生体供給源は、卵巣嚢胞液である。しかしながら、他の態様では、バイオマーカーは、その他の体液、例えば、血清、血液又は尿から検出される。
【００４７】
本発明のバイオマーカーは、生体分子である。従って、本発明は、単離された形態でこれらのバイオマーカーを提供する。バイオマーカーは、尿又は血清のような生体液から単離することができる。それらは、質量及び結合特性の両方に基づいて、当該技術分野で公知の何れかの方法で単離することができる。例えば、生体分子を含むサンプルは、本明細書に記載のクロマトグラフィーの分別処理をし、更に、例えば、アクリルアミド・ゲル電気泳動法により分離処理することができる。バイオマーカーが同定されていると、免疫親和性のクロマトグラフィーにより処理することもできる。
【００４８】
３． バイオマーカー及びタンパク質の異なった形態
タンパク質は、しばしば検出可能な異なった質量を特徴とする複数の異なった形態でサンプル中に存在する。これらの形態は、転写前及び転写後修飾の何れか又は両方の結果によるものである。転写前の修飾形態には、対立遺伝子多型、スプライス変異体及びＲＮＡ編集形態等がある。転写後の修飾形態には、タンパク質分解的切断（例えば、親タンパク質のフラグメント）、グリコシル化、リン酸化、リピド化、酸化、メチル化、システイン化、スルフォン化及びアセチル化等がある。サンプル中のタンパク質を検出又は測定する場合に、タンパク質の異なる形態間を区別する能力は、形態の異なる性質及び検出又は測定に用いる方法に依存する。例えば、モノクローナル抗体を用いる免疫学的測定は、抗原決定基を含有するすべてのタンパク質形態を検出し、それらを識別しない。しかしながら、タンパク質上の異なる抗原決定基を指向した２種類の抗体を使用するサンドイッチ免疫学的測定では、両抗原決定基を含有するタンパク質のすべての形態を検出するが、抗原決定基の一方のみを含有する形態は検出しない。診断アッセイでは、特別な方法を用いて検出された形態が、特別な形態として同等の良好なバイオマーカーであるならば、タンパク質の形態の識別ができなくとも殆ど問題にはならない。しかしながら、タンパク質の特別な形態（又は特別な形態のサブセット）が、特別な方法で同時に検出される異なった形態の集合体よりもバイオマーカーとして良好である場合には、アッセイの検出力は劣る可能性がある。この場合には、タンパク質の形態を相互に識別し、且つタンパク質の形態（複数を含む）を特異的に検出し、測定するアッセイを採用することが有効である。分析対象物の異なった形態を識別すること、又は分析対象物の特殊な形態を特異的に検出することを、分析対象物を「分離すること（resolving）」と称する。
【００４９】
質量分析は、異なった形態のタンパク質が、一般的には質量分析計で分離可能な異なる質量を有しているため、異なった形態を分離するためには特に強力な方法である。従って、タンパク質の一つの形態が、他の形態のバイオマーカーよりもある疾患に対して優れたバイオマーカーでありながら、従来の免疫学的測定がその形態を識別できず且つその有用なバイオマーカーを特異的に検出できない場合にも、質量分析では有用な形態を特異的に検出し測定できる可能性がある。
【００５０】
有用な方法の一つは、質量分析と免疫学的測定を組み合わせたものである。先ず、生体特異的な捕捉剤（例えば、バイオマーカーとそのバイオマーカーの他の形態を認識する抗体、アプタマー又はＡｆｆｉｂｏｄｙ）を、目標のバイオマーカーの捕捉のために使用する。好ましくは、生体特異的な捕捉剤は、ビーズ、プレート、膜又はチップのような固相に結合させる。非結合の物質を洗い去った後、捕捉された分析対象物を、質量分析にて検出及び／又は測定する。（この方法では、タンパク質と結合する又は場合によっては抗体により認識される、及びそれ自体がバイオマーカーとなり得る、タンパク質相互作用物が、捕捉されることになる。） 従来のＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩのようなレーザー脱離法及びエレクトロスプレーイオン化法を含めた種々の形の質量分析が、タンパク質の形態を検出するために有用である。
【００５１】
従って、特定のタンパク質の検出又は特定のタンパク質の定量について述べる時、それは種々の形態のタンパク質を分離して或いは分離せずに、そのタンパク質を検出及び測定することを意味する。例えば、「カルグラヌリンＣを測定すること」という段階は、サンプル中の種々の形態のタンパク質を区別しない方法（例えば、免疫学的測定）、更にある形態を他の形態から区別する方法又はタンパク質の特定の形態を測定する方法（例えば、質量分析）、によるカルグラヌリンＣの全ての形態及び／又はその何れかの形態を測定することを含む。対照的に、タンパク質の特定の形態（複数を含む）（例えば、切断、リン酸化、グリコシル化反応等により修飾された形態を含むカルグラヌリンＣの特定の形態）を測定することが望まれる場合には、その特定の形態（又は複数の形態）が特定される。例えば、「Ｍ１０４３０を測定すること」ということは、１０４３０Ｄａの見掛け分子量を有するポリペプチドを測定し、それでＭ１０４３０形態を他の形態のカルグラヌリンＣから区別することを意味する。
【００５２】
４． 卵巣癌に関するバイオマーカーの検出
本発明のバイオマーカーは、すべての適切な方法により検出可能である。検出法の例として、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及び電流測定法）、原子間力顕微鏡及び例えば多極共鳴スペクトロスコピー等の高周波法がある。共焦点及び非共焦点の顕微鏡検査に加えて、光学的方法の実例としては、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、グレーティングカプラ導波管法（grating coupler waveguide method）又は干渉分光法）による検出がある。
【００５３】
一態様では、サンプルは、バイオチップを用いて分析される。バイオチップは一般に、捕捉剤（吸着剤又は親和性試薬とも称される）が付着する、一般に平らな表面を有する固定基質を包含する。しばしばバイオチップの表面は、それぞれが捕捉剤と結合する複数のアドレス可能な部位を包含する。
【００５４】
プロテインバイオチップは、ポリペプチドの捕捉に適応したバイオチップである。多くのプロテインバイオチップが、当該技術分野で記載されている。これらには、例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Fremont, CA）、Ｚｙｏｍｙｘ（Hayward, CA）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad, CA）、Ｂｉａｃｏｒｅ（Uppsala, Sweden）及びＰｒｏｃｏｇｎｉａ（Berkshire, UK）により製造されているプロテインバイオチップがある。その様なプロテインバイオチップの例が、以下の特許又は公開特許出願に記載されている：ＵＳ特許第６，２２５，０４７号（Hutchens et al.）、ＵＳ特許第６，５３７，７４９号（Kuimelis et al.）、ＵＳ特許第６，３２９，２０９号（Wagner et al.）、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／５６９３４号公報（Englert et al.）、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０３／０４８７６８号公報（Boutell et al.）並びにＵＳ特許第５，２４２，８２８号（Bergstrom et al.）。
【００５５】
質量分析による検出
好ましい態様では、本発明のバイオマーカーは、気相イオンを検出するための質量分析計を用いる方法である、質量分析により検出される。質量分析計の例としては、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオン・トラップ型、イオンサイクロトロン共鳴、静電場型（electrostatic sector）分析計及びこれらの複合型がある。
【００５６】
更なる好ましい方法では、質量分析計は、レーザー脱離／イオン化質量分析計である。レーザー脱離／イオン化質量分析計では、分析対象物を、質量分析プローブの表面に置くが、このブローブは、質量分析計のプローブ・インターフェイス作動のために適合させ、且つイオン化及び質量分析計への導入のために分析対象物をイオン化エネルギーに曝露するものである。レーザー脱離質量分析計では、表面から分析対象物を離脱、揮発、イオン化させて、質量分析計のイオン光学系にそれらを曝露させるために、赤外線レーザーも用いられるが主として紫外線レーザー由来のレーザー・エネルギーが用いられる。ＬＤＩによるタンパク質の分析では、ＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩの形式を採用することができる。
【００５７】
単一のＴＯＦ機器のレーザー脱離／イオン化は、一般に直列抽出様式で実施される。タンデム質量分析では、直交抽出様式を用いることができる。
【００５８】
ＳＥＬＤＩ
本発明において使用される好ましい質量分析技術は、例えば、ＵＳ特許第５，７１９，０６０号及び同第６，２２５，０４７号（共に「Hutchens et al.」）に記載されているように「表面増強レーザー脱離イオン化質量分析法」又は「ＳＥＬＤＩ」である。これは、分析対象物（ここでは、１つ又はそれ以上のバイオマーカー）がＳＥＬＤＩ質量分析計プローブの表面に捕捉されている、脱離／イオン化気相イオン分析計（例えば、質量分析計）の方法を意味する。
【００５９】
ＳＥＬＤＩの一つのバージョンは、「親和性捕捉質量分析計」であり、「表面増強親和性捕捉」又は「ＳＥＡＣ」とも称される。当該バージョンには、物質と分析対象物間の非共有結合の親和性相互作用（吸着）を介して、分析対象物を捕捉する物質をプローブ表面に有しているプローブの使用が含まれる。この物質は、「吸着剤」、「捕捉剤」、「親和剤」又は「結合部」とさまざまに称されている。その様なプローブは、「親和性捕捉プローブ」として、及び「吸着表面」を有しているものを示すことができる。捕捉剤には、分析対象物と結合可能であれば何れの物質でもよい。捕捉剤は、物理吸着又は化学吸着によりプローブ表面に付着する。ある態様では、プローブは、表面に既に付着されている捕捉剤を有するものである。他の態様では、プローブは、予め活性化され、例えば、共有結合又は配位結合を形成する反応を介して、捕捉剤を結合できる反応部を有している。エポキシド及びアシル−イミダゾールが、抗体又は細胞受容体のようなポリペプチド捕捉剤と共有結合する有用な反応部である。ニトリロ三酢酸及びイミノ二酢酸は、ヒスチジン含有のペプチドと非共有結合的に相互作用する金属イオンと結合する、キレート剤として機能する有用な反応部である。吸着剤は一般に、クロマトグラフィー用吸着剤と生体特異的な吸着剤に類別される。
【００６０】
「クロマトグラフィー用吸着剤」は、クロマトグラフィーで一般的に使用される吸着剤を指す。クロマトグラフィー吸着剤としては、例えば、イオン交換物質、金属キレート剤（例えば、ニトリロ三酢酸及びイミノ二酢酸）、固定化金属キレート剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、単純生体分子（例えば、核酸、アミノ酸、単糖及び脂肪酸）及び混合モードの吸着剤（例えば、疎水性吸引／静電反発力吸着剤）がある。
【００６１】
「生体特異的な吸着剤」とは、例えば核酸分子（例：アプタマー）、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイド又はこれら物質の抱合体（例：糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、核酸（例えば、ＤＮＡ）−タンパク質抱合体）を示す。ある例においては、生体特異的な吸着剤は、多タンパク質複合体、生体膜又はウイルスのような巨大分子構造である場合もある。生体特異的な吸着剤の例としては、抗体、受容体タンパク質及び核酸がある。一般に生体特異的な吸着剤は、クロマトグラフィー吸着剤より高い特異性を有している。ＳＥＬＤＩに使用される吸着剤の更なる例は、ＵＳ特許第６，２２５，０４７号に見い出すことができる。「生体選択的な吸着剤」とは、少なくとも１０−８Ｍの親和性で分析対象物に結合する吸着剤を示す。
【００６２】
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社が製造したプロテインバイオチップは、アドレス可能な部位に付着されるクロマトグラフィー吸着剤又は生体特異的な吸着剤を有する表面を包含する。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップ（登録商標）アレイには、ＮＰ２０（親水性）；Ｈ４及びＨ５０（疎水性）；ＳＡＸ−２、Ｑ−１０及びＬＳＡＸ−３０（陰イオン交換）；ＷＣＸ−２、ＣＭ−１０及びＬＷＣＸ−３０（陽イオン交換）；ＩＭＡＣ−３、ＩＭＡＣ−３０及びＩＭＡＣ−５０（金属キレート）；並びにＰＳ−１０、ＰＳ−２０（アシル−イミダゾール、エポキシドを有する反応性表面）及びＰＧ−２０（アシルイミダゾールを介して結合したプロテインＧ）が含まれる。疎水性プロテインチップアレイは、イソプロピル又はノニルフェノキシ-ポリ（エチレングリコール）メタクリル樹脂官能基を有している。陰イオン交換プロテインチップアレイは、四級アンモニウム官能基を有する。陽イオン交換プロテインチップアレイは、カルボン酸官能基を有する。固定化金属キレートプロテインチップアレイは、キレートを作ることにより銅、ニッケル、亜鉛及びガリウム等の遷移金属イオンを吸着するニトリロ三酢酸官能基（ＩＭＡＣ３及びＩＭＡＣ３０）又はＯ−メタクリロイル-Ｎ，Ｎ-ビス-カルボキシメチルチロシン官能基（ＩＭＡＣ５０）を有する。予め活性化されたプロテインチップアレイは、タンパク質上の基と反応し共有結合できる、アシル−イミダゾール又はエポキシド官能基を有する。
【００６３】
この様なバイオチップに関しては更に、ＵＳ特許第６，５７９，７１９号（Ｈｕｔｃｈｅｎｓらの「Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ」、２００３年６月１７日）、ＵＳ特許第６，８９７，０７２号（Ｒｉｃｈらの「気相イオン分光計のプローブ」、２００５年５月２４日）、ＵＳ特許第６，５５５，８１３号（Ｂｅｅｃｈｅｒｅｔらの「気相質量分析計における疎水性被覆含有サンプルホルダー」、２００３年４月２９日）、ＵＳ特許公開第ＵＳ２００３-００３２０４３Ａ１号公報（Ｐｏｈｌらの「ラテックスをベースとする吸着剤チップ」、２００２年７月１６日）、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ０３/０４０７００号公報（Ｕｍらの「疎水性表面チップ」、２００３年５月１５日）、ＵＳ特許公開第ＵＳ２００３／０２１８１３０Ａ１号公報（Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉらの「多糖をベースとするヒドロゲルで被覆された表面を有するバイオチップ」、２００３年４月１４日）及びＵＳ特許第７，０４５，３６６号（Ｈｕａｎｇらの「光架橋ヒドロゲル表面被覆」、２００６年５月１６日）に記載されている。
【００６４】
一般に、吸着剤表面を有するプローブは、サンプル中に存在しているバイオマーカー（複数を含む）が吸着剤に結合するに十分な時間でサンプルと接触させる。インキュベーション後、非結合の物質を除去するために基質を洗浄する。適切な洗浄溶液は、すべて使用可能であるが、水溶性溶液を用いることが好ましい。分子が結合して残存する割合は、洗浄の程度を調整することにより操作可能である。洗浄溶液の溶離特性は、例えばｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピズムの程度、洗浄の強度、及び温度に依存する。プローブが、ＳＥＡＣ及びＳＥＮＤの特性の何れも有していない場合には（ここに記載されているように）、分子を吸収するエネルギーが、結合バイオマーカーを有する基質に適用される。
【００６５】
別の方法においては、バイオマーカーに結合する抗体を有している固相結合の免疫吸着剤によりバイオマーカーが捕捉され得る。非結合物質を除去するために吸着剤を洗浄した後、バイオマーカーを固相から溶出し、バイオマーカーに結合するＳＥＬＤＩチップに添加し、ＳＥＬＤＩにて分析する。
【００６６】
基質に結合したバイオマーカーは、飛行時間型質量分析計のような気相イオン分光計にて検出される。バイオマーカーは、レーザーのようなイオン化源によりイオン化され、生成したイオンはイオン光学アセンブリにて集束させ、続いて質量分析計にて通過イオンを分散させて、通過イオンを分析する。続いて検出器により検出イオンの情報を質量対電荷の比に変換する。一般に、バイオマーカーの検出には、シグナル強度の検出が含まれる。従って、バイオマーカーの量及び質量を、共に測定することができる。
【００６７】
ＳＥＮＤ
レーザー脱離質量分析計を用いた別の方法は、表面増強Ｎｅａｔ脱離法（ＳＥＮＤ）と称される。ＳＥＮＤには、プローブの表面に化学的に結合するエネルギー吸収分子から成るプローブ（ＳＥＮＤプローブ）の使用が含まれる。「エネルギー吸収分子」（ＥＡＭ）という語句は、レーザー脱離/イオン化源からエネルギーを吸収でき、続いてその後直ちに接触して分析対象物分子の脱離及びイオン化に寄与できる分子を意味する。ＥＡＭカテゴリーには、しばしば「マトリックス」と称されるＭＡＬＤＩに使用される分子が含まれ、実例として桂皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ）、シアノ水酸化桂皮酸（ＣＨＣＡ）及び二水酸化安息香酸、フェルラ酸及び水酸化アセトフェノン誘導体がある。ある態様においては、エネルギー吸収分子は、例えばポリメタクリレート等の直鎖又は架橋ポリマーに組み込まれている。例えば、その組成物が、α-シアノ-４-メタクリロイルオキシ桂皮酸及びアクリレートの共重合体である場合もある。別の態様では、その組成物は、α-シアノ-４-メタクリロイルオキシ桂皮酸、アクリレート及び３−（トリエトキシ）シリルプロピルメタクリレートの共重合体である。また、別の態様では、その組成物は、α-シアノ-４-メタクリロイルオキシ桂皮酸及びオクタデシルメタクリレート（Ｃ１８ＳＥＮＤ）の共重合体である。ＳＥＮＤは更に、ＵＳ特許第６,１２４,１３７号及びＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ０３/６４５９４号（キタガワらの「分析対象物の脱離/イオン化に使用するエネルギー吸収部位を有するモノマー及びポリマー」２００３年８月７日）に記載されている。
【００６８】
ＳＥＡＣ/ＳＥＮＤは、捕捉剤及びエネルギー吸収分子の両方が、サンプルの存在する表面に付着している、レーザー脱離質量分析計のバージョンである。従って、外部マトリックスを適用することを必要としないで、親和性捕捉及びイオン化/脱離を介してＳＥＡＣ/ＳＥＮＤプローブに分析対象物を捕捉することが可能となる。Ｃ１８のＳＥＮＤバイオチップは、捕捉剤として機能するＣ１８及びエネルギー吸収部位として機能するＣＨＣＡ部分からなるＳＥＡＣ/ＳＥＮＤのバージョンである。
【００６９】
ＳＥＰＡＲ
ＬＤＩの別のバージョンは、表面増強感光付加及び脱離（Surface-Enhanced Photolabile Attachment and Release）（ＳＥＰＡＲ）と称される。ＳＥＰＡＲには、分析対象物と共有結合でき、続いて光（例えば、レーザー光（ＵＳ特許第５，７１９，０６０号を参照されたい））に曝露された後その部分の光に不安定な結合が開裂することにより分析対象物を脱離する、表面に付着する部分を有するプローブの使用が含まれる。ＳＥＰＡＲ及びその他のＳＥＬＤＩの形態は、本発明に従ってバイオマーカー又はバイオマーカー・プロフィールを検出するのに容易に適応する。
【００７０】
ＭＡＬＤＩ
ＭＡＬＤＩは、タンパク質及び核酸のような生体分子を分析するために使用されるレーザー脱離／イオン化の従来からの方法である。ＭＡＬＤＩの一方法において、サンプルをマトリックスと混合し、直接ＭＡＬＤＩチップ上に置く。しかしながら、血清又は尿のような生体サンプルの複雑性により、サンプルを予め分別しない場合にはこの方法は最適とはならない。従って、ある態様では、生体特異的な物質（例えば抗体）又は樹脂のような固体担体に結合したクロマトグラフィー材料（例えば、スピン・カラムで）で、バイオマーカーを先ず捕捉させる。本発明のバイオマーカーに結合する特異的な親和性物質に関しては、上述の通りである。親和性物質上での精製後、バイオマーカーを溶出し、続いてＭＡＬＤＩにより検出する。
【００７１】
別な質量分析法では、バイオマーカーは、先ずバイオマーカーと結合するクロマトグラフィー性質を有するクロマトグラフィー樹脂上で捕捉される。本発明の実施例では、これには、種々の方法が含まれる。例えば、一つの方法は、バイオマーカーをＣＭセラミックＨｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂のような陽イオン交換樹脂上に捕捉し、樹脂を洗浄し、バイオマーカーを溶出し、そしてＭＡＬＤＩにより検出することができる。あるいは、この方法に先行して、陽イオン交換樹脂の処理前に陰イオン交換樹脂でサンプルを分別する。別にまた、陰イオン交換樹脂で分別して、直接ＭＡＬＤＩにより検出する方法もある。更なる別な方法では、バイオマーカーと結合する抗体を包含する免疫クロマトグラフィー樹脂上にバイオマーカーを捕捉し、非結合の物質を洗い流し、バイオマーカーを樹脂から溶出し、そして溶出したバイオマーカーをＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩにより検出する。
【００７２】
質量分析計におけるイオン化のその他の形態
別の方法では、バイオマーカーを、ＬＣ−ＭＳ又はＬＣ−ＬＣ−ＭＳにて検出する。この方法には、液体クロマトグラフィーを１回又は２回通過させてサンプル中のタンパク質を分離し、次いで一般的にはエレクトロスプレーイオン化にて質量分析する過程が含まれる。
【００７３】
データ解析
飛行時間型質量分析法による分析対象物の分析では、飛行時間スペクトルが得られる。最終的に解析された飛行時間スペクトルは一般的に、サンプルに対するイオン化エネルギーの単一パルスからのシグナルを示すのではなく、複数のパルスからのシグナルの総計を示している。これによりノイズが減少し、ダイナミックレンジが高くなる。次にこの飛行時間型データを、データ処理にかける。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎのプロテインチップ（登録商標）ソフトウエアでは、データ処理にはマススペクトル作成のためのＴＯＦ-ｔｏ-Ｍ/Ｚ変換処理、機器オフセットを除外するためのベースラインの減算処理及び高周波数雑音を減少させるための高周波数雑音フィルター処理が含まれる。
【００７４】
バイオマーカーの脱離及び検出により作成されるデータは、プログラムを組むことができるデジタル・コンピュータを使用して解析可能である。コンピュータプログラムを用いて、検出されたバイオマーカーの数を示すデータ、並びに場合に応じてシグナル強度及び検出された各バイオマーカーの分子の質量を決定する。データ解析には、バイオマーカーのシグナル強度を決定する段階、及び予め定めておいた統計的分布から外れたデータを除外する段階を組み込むことができる。例えば、幾つかの標準に対する各ピークの高さを計算することにより、観察されるピークを正規化することができる。
【００７５】
コンピュータは、得られたデータを表示のために種々のフォーマットに変換することができる。標準的なスペクトルが表示可能であるが、一つの有用なフォーマットではピークの高さ及び質量の情報のみがスペクトル図に保持され、その結果見易い画像が得られ、ほぼ同等の分子量を有するバイオマーカーがより容易に認識できる。別の有用なフォーマットでは、２つ又はそれ以上のスペクトルを比較し、固有のバイオマーカー及びサンプル間で上方又は下方制御されるバイオマーカーを都合良く強調表示されている。これらのフォーマットの何れかを用いることにより、特定のバイオマーカーがサンプル中に存在しているか否かを、容易に判定できる。
【００７６】
一般に分析には、分析対象物からのシグナルを示すスペクトルのピークの同定も含まれる。ピークの選択は目視で行うが、ピークの検出を自動で行えるＣｉｐｈｅｒｇｅｎのプロテインチップ（登録商標）ソフトウエア・パッケージの一部としてソフトウエアを入手できる。一般に、このソフトウエアは、選択した閾値を越えるシグナル対ノイズの比を示すシグナルを同定し、そしてピークシグナルの質量中心にあるピークの質量を標識する機能がある。有用な適用の一つでは、多くのスペクトルを比較して、マススペクトルにおいて或る選択された割合で存在している同一ピークを同定する。このソフトウエアのバージョンの一つでは、種々のスペクトルに出現するすべてのピークを、規定された範囲内にクラスター化し、そして質量（Ｍ/Ｚ）クラスターの中心点に近いすべてのピークの質量（Ｍ／Ｚ）を決定する。
【００７７】
データを解析するために用いられるソフトウエアには、シグナルが本発明によるバイオマーカーに対応するシグナル内にピークを示しているか否かを判定するために、シグナルの分析にアルゴリズムを適用するコードを含めることができる。またそのソフトウエアにより、検査中の特定の臨床パラメータの状態を示す、バイオマーカーピーク又はバイオマーカーピークの組み合わせが存在しているか否かを判定するために、観察されたバイオマーカーのピークに関するデータを分類ツリー解析又はＡＮＮ解析することができる。データの解析には、直接的又は間接的の何れかでサンプルの質量分析から得られる種々のパラメータが「重要（keyed）」となる可能性がある。これらのパラメータには、１つ又はそれ以上のピークが存在するか否か、１つのピーク又は１群のピークの形状、１つ又はそれ以上のピークの高さ、１つ又はそれ以上のピークの高さの対数、及びその他のピークの高さに関するデータの算術乗算が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
卵巣癌に対するバイオマーカーのＳＥＬＤＩ検出のための一般的なプロトコール
本発明のバイオマーカーの検出に関する好ましいプロトコールは、以下の通りである。別な態様では、例えば、卵巣嚢胞液等の検査される生体サンプルは、ＳＥＬＤＩ分析の前に予備分別することが好ましい。この予備分別工程が、サンプルを簡素化し、感度を向上させる。予備分別の好ましい方法には、Ｑ ＨｙｐｅｒＤ（BioSepra, SA）のような陰イオン交換クロマトグラフィー材料にサンプルを接触させることが含まれる。続いて結合物質を、ｐＨ９、ｐＨ７、ｐＨ５及びｐＨ４の緩衝液を用いて段階的なｐＨでの溶出を実施する。（バイオマーカーが溶出される画分も、表１に示した。） バイオマーカーを含有している種々の画分を採取する。別な態様では、例えば、卵巣嚢胞液サンプル等の検査される生体サンプルは、予備分別の工程を経ずに、分別しないままでチップ結合工程に使用される。
【００７９】
検査されるサンプル（分別しない又は予備分別する）を、次いで親和性の捕捉プローブに接触させる。本発明のバイオマーカーが結合するクロマトグラフィー表面の親和性の捕捉プローブの例として、これらに限定されないが、疎水性の吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｈ５０プロテインチップ（登録商標）アレイ）、陰イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）Ｑ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）、陽イオン交換吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＣＭ１０プロテインチップ（登録商標）アレイ）及び金属キレート吸着剤（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ（登録商標）ＩＭＡＣ−３０プロテインチップ（登録商標）アレイ）が挙げられる。プローブは、非結合分子は洗い流すがバイオマーカーを保持するように、緩衝液で洗浄する。各々のバイオマーカーに適した洗浄液は、実施例で同定されている緩衝液である。バイオマーカーは、レーザー脱離／イオン化質量分析計にて検出される。
【００８０】
あるいは、変性させた又は変性させていないサンプルを、各分析対象物を検出するための最適条件下で、適切なアレイ結合緩衝液に希釈し、結合させ、そして洗浄する。
【００８１】
あるいは、例えば、アポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）、ヘモグロビンα、ヘモグロビンβ、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡｐｏＡＩＩ）、アポリポタンパク質ＣＩＩ（ＡｐｏＣＩＩ）、カルグラヌリンＣ（全長及び切断型の両方）、カルグラヌリンＡ、ＩｇＧ重鎖、カルサイクリン及びトランスサイレチンのケースでバイオマーカーを認識する抗体が入手可能な場合には、これらを予め活性化したＰＳ１０又はＰＳ２０プロテインチップアレイ（Ciphergen Biosystems, Inc.）のようなプローブの表面に結合させることができる。これらの抗体は、サンプルからバイオマーカーをプローブ表面に捕捉することができる。続いてバイオマーカーは、例えば、レーザー脱離／イオン化質量分析等にて検出できる。
【００８２】
流体工学的操作を行うすべてのロボットが、これらのアッセイには使用可能であり、それらは、例えば、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ及びＨａｍｉｌｔｏｎ等から入手可能である。
【００８３】
免疫学的測定による検出
本発明の別な態様において、本発明のバイオマーカーは、質量分析又はバイオマーカーの質量測定に基づく方法以外によって、測定される。別な態様では、本発明のバイオマーカーは、免疫学的測定により測定される。免疫学的測定では、バイオマーカーを捕捉するために、抗体のような生体特異的な捕捉剤が必要である。抗体は、例えば動物をバイオマーカーで免疫化する等の、当該技術分野において広く知られた方法により作成可能である。バイオマーカーは、それらの結合特性に基づいてサンプルから単離可能である。あるいは、ポリペプチド・バイオマーカーのアミノ酸配列が既知の場合には、ポリペプチドは合成可能であり、当該技術分野で良く知られている方法により抗体の産生に利用できる。
【００８４】
本発明では、例えば、ＥＬＩＳＡ又は蛍光ベースの免疫学的測定等を含むサンドイッチ免疫学的測定、更に他の酵素免疫学的測定を含めた従来の免疫学的測定も考慮に入れている。比濁分析は、液層で行われるアッセイであり、その場合には抗体は溶液に存在している。抗原が抗体に結合すると吸着能が変化するが、それを測定する。ＳＥＬＤＩベースの免疫学的測定では、バイオマーカーに対する生体特異的な捕捉剤は、予め活性化されたプロテインチップアレイのようなＭＳプローブの表面に付着している。従って、バイオマーカーは、この試薬を介してバイオチップに特異的に捕捉され、捕捉されたバイオマーカーが質量分析計にて検出される。
【００８５】
５． 対象の卵巣癌症状の判定
本発明のバイオマーカーは、例えば卵巣癌を診断するために対象における卵巣癌の症状を評価するための診断検査に使用できる。「卵巣癌の症状」という語句は、疾患のすべての識別可能な徴候が含まれる。例えば、卵巣癌の症状には、疾患の有無（例えば、卵巣癌（悪性）、悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、良性の卵巣疾患、他の悪性症状のそれぞれの比較）、疾患の進行リスク、疾患の段階、疾患の経過（例えば、経時的な疾患の悪化又は緩解）及び疾患治療に対する有効性又は応答が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような症状をベースにして、追加の診療検査又は治療手段を含む、更なる治療方法を示すことができる。
【００８６】
検査結果と卵巣癌の症状との相関には、幾つかの分類アルゴリズムをその症状を惹起する結果に適用することが含まれる。分類アルゴリズムは、所定のバイオマーカーの測定量が、特定のカットオフ番号より大きいか又は小さいかを判定するだけという単純な場合もある。複数のバイオマーカーを利用する場合には、分類アルゴリズムは線形回帰式である場合もある。あるいは、分類アルゴリズムは本明細書に記載されている多くの学習アルゴリズムの何れかの産物であってもよい。
【００８７】
複雑な分類アルゴリズムの場合には、データに関してアルゴリズムを実施することが必要となる場合もあり、これにより、コンピュータ、例えばプログラム可能なデジタル・コンピュータ等を用いて分類を決定する。何れの場合においても、メモリー・ドライブ、ディスク又は紙に印刷されている等のコンピュータの読み取り可能なフォーマットにおいて有形の表現媒体上にその症状を記録できる。結果はまた、コンピュータのスクリ−ン上に報告することも可能であろう。
【００８８】
単一のマーカー
症状を正しく予測する診断検査の検出力は、アッセイの感度、アッセイの特異性又は受診者動作特性（ＲＯＣ）分析曲線下面積として通常測定される。感度は、陽性であると検査で予測される真陽性の割合であるが、特異性は、陰性であると検査で予測される真陰性の割合である。ＲＯＣ曲線は、（１−特異性）の関数として検査の感度を与える。ＲＯＣ曲線下面積が大きければ大きいほど、検査の予測値はより正確となる。検査の効用に関する他の有用な尺度は、陽性予測値及び陰性予測値である。陽性予測値は検査で陽性であり、実際に陽性であった人の割合である。陰性予測値は検査で陰性であり、実際に陰性であった人の割合である。
【００８９】
本発明のバイオマーカーは、異なった卵巣癌の症状において統計学的な差異を、少なくともＰ≦０．０５、Ｐ≦１０−２、Ｐ≦１０−３、Ｐ≦１０−４又はＰ≦１０−５で示す。これらのバイオマーカーを単独又は組み合わせて使用する診断検査は、感度及び特異性が少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％及びおよそ１００％であることを示す。
【００９０】
表１、３及び４に示した各バイオマーカーは、卵巣癌（悪性）、卵巣癌ＬＭＰ、良性の卵巣疾患又は他の悪性症状に、異なって存在し、従ってそれぞれが個々に卵巣癌の症状を判定する際の補助として有用である。その方法には、第一に例えば、ＳＥＬＤＩバイオチップに捕捉し、次いで質量分析計にて検出する等の、本明細書に記載されている方法を用いて対象のサンプル中の選択されたバイオマーカーを測定すること、第二に陽性の卵巣癌の症状を陰性の卵巣癌の症状と識別する診断量又はカットオフ値と測定値を比較することが含まれる。診断量は、バイオマーカーの測定量がその診断量より大きい又は小さいかで、対象が特定の卵巣癌症状にあるとして識別される量を表す。例えば、バイオマーカーが、正常に比較して卵巣癌では上方に制御されることから、測定量が診断カットオフ値より大きい場合には卵巣癌と診断される。あるいは、バイオマーカーが、正常に比較して卵巣癌では下方に制御されることから、測定量が診断カットオフ値より小さい場合には卵巣癌と診断される。当該技術分野で良く理解されているように、アッセイにおいて用いられる特定の診断カットオフ値を調整することにより、診断者の選択に基づいて診断アッセイの感度及び特異性を良くすることは可能である。特定の診断カットオフ値は、例えば本明細書で実施したように、異なった卵巣癌の症状にある対象からの統計学的に有意な数のサンプルにおけるバイオマーカーの量を測定し、そして診断者の望むレベルの特異性及び感度に合ったカットオフ値を描くことにより決定できる。
【００９１】
マーカーの組み合わせ
個々のバイオマーカーは有用な診断バイオマーカーであるが、バイオマーカーの組み合わせは、単一のバイオマーカーを単独で使用するよりも特定の症状に対してより大きな予測値を与えることが見出されている。具体的には、サンプル中の多数のバイオマーカーの検出により、検査の感度及び／又は特異性を増加させることができる。少なくとも２つのバイオマーカーの組み合わせは、場合によっては「バイオマーカー・プロフィール」又は「バイオマーカー・フィンガープリント」と称される。表１、３及び４で説明のバイオマーカーの組み合わせが検出することができる。同様に、表１、３及び４で説明のバイオマーカーの１つ又はそれ以上が、ＣＡ１２５のような他の公知の卵巣癌のバイオマーカーと組み合わせて検出することができる。本発明のバイオマーカーと組み合わせて有用な公知の卵巣癌バイオマーカーの例では、これらに限定されないが、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ０３／０５７０１４号公報及び同第ＷＯ２００４／０１２５８８号公報に記載のものが挙げられ、これらの両方共を、全ての目標のために本明細書に参照して取り込む。
【００９２】
以下の実施例に記載のプロトコールは、６５名の患者のサンプルからのマススペクトルを作成するために使用した。その内３０名が卵巣癌と診断され、３５名には卵巣癌が存在しなかった。ピークの質量及び高さは、開示のデータセットに纏めた。このデータセットは、分類回帰ツリー解析（ＣＡＲＴ：classification and regression tree analysis）（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐａｔｔｅｒｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標））を用いる学習アルゴリズムをならすのに使用した。特に、ＣＡＲＴは、ランダムに多くのピークのサブセットを選んだ。各々のサブセットに対して、ＣＡＲＴは、卵巣癌（悪性）、卵巣癌ＬＭＰ、良性の卵巣疾患又は他の悪性症状としてサンプルを分類する、最良の又は最良に近い決定ツリーを作成した。ＣＡＲＴで作成した多くの決定ツリーでは、良性の卵巣疾患に対して悪性レベルの低い見込みの卵巣癌と卵巣癌（侵襲性の上皮卵巣癌のような悪性）を区別するのに、幾つかが極めて優秀な感度及び特異性を有していた。
【００９３】
決定ツリーの詳細、特に分岐の決定に用いられるカットオフ値は、開示データセットを作成するのに使用するアッセイの詳細に依存することは、注目される。本分析に使用するアッセイのデータ取得パラメーターは、実施例で提供される。例えば、新しいサンプルセット又は異なるアッセイプロトコールからの分類アルゴリズムの開発では、操作者は、これらのバイオマーカーを検出するプロトコールを用い、それらを含むように学習アルゴリズムに入力する。
【００９４】
本発明のバイオマーカーの何れかの測定値を含む卵巣癌の症状の診断検査は、表２に同定される以下の卵巣癌のバイオマーカー（それらの適切な修飾型を含む）の何れかと組み合わせる：
【００９５】
【表２】
【００９６】
本発明のバイオマーカーと組み合わせることのできる他のバイオマーカーには、これらに限定されないが、ＣＴＡＰ３、ＣＡ１２５ＩＩ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９５、腫瘍関連のトリプシン抑制剤（ＴＡＴＩ）、ＣＥＡ、胎盤のアルカリフォスファターゼ（ＬＡＰ）、シアリルＴＮ、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）、 リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、上皮成長因子受容体の細胞外領域の１１０ｋＤ成分（ｐ１１０ＥＧＦＲ）、組織カリクレイン（例えば、カリクレイン６及びカリクレイン１０（ＮＥＳ−１））、プロスタシン、ＨＥ４、クレアチンキナーゼＢ（ＣＫＢ）、ＬＡＳＡ，ＨＥＲ−２/ｎｅｕ，尿ゴナドトロピン・ペプチド、Ｄｉａｎｏｎ ＮＢ７０／Ｋ、組織ペプチド抗原（ＴＰＡ）、ＳＭＲＰ、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子Ｉ又はＩＩが含まれる。
【００９７】
卵巣癌症状
卵巣癌症状を判定するには、診断検査結果に基づき２又はそれ以上のグループ（症状）の一つに個体を通常分類する。本明細書に記述した診断検査は、幾つかの異なった症状に分類するのに用いることができる。
【００９８】
卵巣癌の存在
一態様では、本発明は、対象における卵巣癌の存在又は非存在（症状：卵巣癌対悪性レベルの低い見込みの卵巣癌又は良性の卵巣疾患）を判定する方法を提供する。卵巣癌の存在又は非存在は、関連のバイオマーカー（複数を含む）を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定のリスクレベルと関連するバイオマーカーの参考量及び／又はパターンと比較することにより判定される。
【００９９】
発症リスクの判定
一態様では、本発明は、対象に於ける疾患の発症リスクを判定する方法を提供する。バイオマーカー量又はパターンは、種々なリスク状態（例えば、高い、中程度又は低い）の特性である。発症のリスクは、関連のバイオマーカー（複数を含む）を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定のリスクレベルと関連するバイオマーカーの参考量及び／又はパターンと比較することにより判定される。
【０１００】
疾患の段階の判定
一態様では、本発明は、対象に於ける疾患の段階を判定する方法を提供する。疾患の各段階において、バイオマーカーの特徴的な量又はバイオマーカーのセット（パターン）の相対量が存在する。疾患の段階は、関連バイオマーカー（複数を含む）を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定の段階と関連するバイオマーカーの参考量及び／又はパターンと比較することにより判定される。例えば、初期卵巣癌と、非卵巣癌又はステージＩの卵巣癌、ステージＩＩの卵巣癌及びステージＩＩＩの卵巣癌とを区別をすることができる。
【０１０１】
疾患の経過（進行／緩解）の判定
一態様では、本発明は、対象での疾患の経過を判定する方法を提供する。疾患の経過とは、疾患の進行（悪化）、緩解（改善）を含む経時的変化を言う。時間の経過と共に、バイオマーカーの量又は相対的な量（例えば、パターン）が変化する。そこで、これらのマーカーの傾向（例えば、疾患又は無疾患に関連して経時的に増加又は減少のどちらか）が、疾患の経過を示すことになる。従って、この方法では、対象での１つ又はそれ以上のバイオマーカーを少なくとも２つの異なる時点（例えば、１回目、２回目）で測定し、変化が存在すればそれを比較する。疾患の経過は、これら比較に基づいて判定される。
同様に、疾患の進行（又は、緩解）の変化の違いがバイオマーカー量（例えば、表１のペプチドのバイオマーカー）を、異なった時点で測定し、そしてバイオマーカー量の変化の速度を計算することによりモニターできる。疾患の症状又は疾患の進行の速度を測定できることは、治療を通して疾患の進行を緩める又は停止させることが目的の治療薬剤の検討に重要である。
【０１０２】
症状の報告
本発明の追加の態様は、アッセイ結果若しくは診断結果の何れか又はそれらの両方を、例えば技師、医者又は患者に伝えることに関する。ある態様では、アッセイ結果又は診断結果の何れか又はそれらの両方を、関心を有する者、例えば医者とその患者に伝えるのにコンピュータが用いられる。幾つかの態様では、結果又は診断が報告される国又は法域とは異なった国又は法域で、アッセイ又はアッセイ結果の分析が行われる。
【０１０３】
本発明の好ましい態様では、表１、３及び４に記載のペプチド・バイオマーカーの何れかの検査対象における差別的な存在に基づいた診断を、その診断後できるだけ早くその対象に伝える。診断は、その対象を治療している医者から伝えるか、あるいは検査の対象に電子メール又は電話で伝えてもよい。電子メール又は電話で診断を伝えるのにコンピュータを用いてもよい。ある態様では、診断検査の結果を含むメッセージを作成し、電気通信業界の当業者にはよく知られたコンピュータソフト及びハードの組み合わせを用い、対象に自動的に送られる。ヘルスケア指向のコミュニケーションシステムの一例が、米国特許第６，２８３，７６１号に記述されているが、本発明はこの特定のコミュニケーションシステムを用いる方法に限られるものではない。本発明の方法のある態様では、サンプルのアッセイ、疾患の診断及びアッセイ結果又は診断の伝達を含む方法の全てのステップ又は一部が、種々な法域（例えば、外国）で実施される。
【０１０４】
対象の管理
卵巣癌症状を認定する方法のある態様では、症状に応じて対象の治療を管理することが方法に含まれる。そのような管理には、卵巣癌症状の判定に続いて取られる医師又は臨床医の活動が含まれる。例えば、医者が卵巣癌の診断をすれば、例えば、処方又は抗化学療法薬剤の投与のようなある特定の治療が実施される。あるいは、卵巣癌ＬＭＰ又は良性の卵巣疾患の診断では、患者が罹っている特定の疾患を判定するために更に検査が行われる。また、診断検査で卵巣癌であるとの結論が得られない際は、更なる検査が必要となる。
【０１０５】
本発明の追加の態様は、アッセイ結果若しくは診断結果の何れか又はそれらの両方を、例えば技師、医者又は患者に伝えることに関する。ある態様では、アッセイ結果又は診断結果の何れか又はそれらの両方を、関心を有する者、例えば医者とその患者に伝えるのにコンピュータが用いられる。幾つかの態様では、結果又は診断が報告される国又は法域とは異なった国又は法域で、アッセイ又はアッセイ結果の分析が行われる。
【０１０６】
本発明の好ましい態様では、表１に記載のバイオマーカーの何れかの検査対象における存在する又は存在しないことに基づいた診断を、その診断後できるだけ早くその対象に伝える。診断は、その対象を治療している医者から伝えるか、あるいは検査の対象に電子メール又は電話で伝えてもよい。電子メール又は電話で診断を伝えるのにコンピュータを用いてもよい。ある態様では、診断検査の結果を含むメッセージを作成し、電気通信業界の当業者にはよく知られたコンピュータソフト及びハードの組み合わせを用い、対象に自動的に送られる。ヘルスケア指向のコミュニケーションシステムの一例が、米国特許第６，２８３，７６１号に記述されているが、本発明はこの特定のコミュニケーションシステムを用いる方法に限られるものではない。本発明の方法のある態様では、サンプルのアッセイ、疾患の診断及びアッセイ結果又は診断の伝達を含む方法の全てのステップ又は一部が、種々な法域（例えば、外国）で実施される。
【０１０７】
６． 製剤の治療効果の判定
別な態様では、本発明は、製剤の治療効果を判定する方法を提供する。これらの方法は、薬剤の臨床治験の実施、更にその薬剤の投与を受けている患者の進行をモニターするのに有用である。治療又は臨床治験では、薬剤を特定の投薬計画に基づき投与する。投薬計画としては、薬剤の単回投与量、又はある期間にわたる反復投与量が含まれうる。医者又は臨床研究者が、投与期間中の患者又は対象に対する薬の効果をモニターする。薬剤が、症状に薬理効果を有するならば、本発明のバイオマーカーの量又は相対量（例えば、パターン、又はプロフィール）は、疾患ではないプロフィールへと変化する。例えば、ＡｐｏＣＩ及びヘモグロビンのバイオマーカーは、疾患と共に増大し、Ｍ３２６００のバイオマーカーは疾患と共に減少する。そこで、治療期間中に対象でのこれらバイオマーカー量の経過をフォローできる。従って、この方法では、薬剤治療を受けている対象での１つ又はそれ以上のバイオマーカーを測定し、対象の病状とバイオマーカー量を関連付けることが含まれる。本方法の一態様では、薬剤治療期間中の少なくとも２つの異なる時点（例えば、１回目及び２回目）での複数のバイオマーカーのレベルを判定し、バイオマーカー量の変化（もしあるとすれば）を比較する。例えば、複数のバイオマーカーを、薬剤投与の前後で、又は薬剤投与の２つの異なる時点で測定する。治療の効果は、これら比較に基づき判定する。もし治療が効果をあげているならば、複数のバイオマーカーは正常に向かい、もし治療効果がなければ、複数のバイオマーカーは疾患を示す方向に変化する。もし治療が効果をあげているならば、複数のバイオマーカーは正常に向かい、もし治療効果がなければ、複数のバイオマーカーは疾患を示す方向に変化する。
【０１０８】
７． 卵巣癌症状の認定のための分類アルゴリズムの作成
ある態様では、「公知のサンプル」のようなサンプルを用いて得られたスペクトル（例えば、マススペクトル又は飛行時間型スペクトル）から得られたデータは、分類モデルを「トレーニングする（train）」ために利用できる。「公知のサンプル」とは、前もって分類されたサンプルである。スペクトルから得られ、そして分類モデルを作成するために用いられるデータは、「トレーニングデータセット」と称する。一旦トレーニングされると、分類モデルは、未知のサンプルから得られたスペクトルから導かれたデータのパターンを認識できる。そこで、分類モデルは、未知のサンプルをクラスに分類するのに用いられる。これは、例えば、ある特別な生体サンプルをある特定の生体の状態に関連しているか又はそうでないのか（疾患対疾患でない）を、予想するに有用である。
【０１０９】
分類モデルを作成するのに用いるトレーニングデータは、生のデータ又は前もって処理したデータで構成される。幾つかの態様では、生のデータは飛行時間型スペクトル又はマススペクトルから直接得られ、その後上記のように任意に「前もって処理される」であってもよい。
【０１１０】
分類モデルは、データ中に存在する客観的パラメータに基づくクラスに、データ集団を分離することを試みる適切な統計的分類（又は「学習（learning）」）法を用い作成できる。分類方法は、監督又は不監督（監督されていない）どちらでもよい。監督又は不監督分類過程の例は、Ｊａｉｎの「統計的パターン認識：概説」（IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, No.1, January 2000）に記述されており、その教えるところは、参照することにより取り込まれている。
【０１１１】
監督下分類では、公知のカテゴリーの例を含むトレーニングデータが、学習機構に提供され、それが公知のクラスの各々を定義する１つ又はそれ以上のセットの関係を学ぶ。その後、新しいデータを学習機構に適用し、それは学んだ関係を用いて新しいデータを分類する。監督下分類過程の例としては、線形回帰過程（例えば、多重線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰及び主構成要素回帰（ＰＣＲ））、二分岐決定ツリー（例えば、ＣＡＲＴ−分類、回帰ツリーのような再帰形分割過程）、バック・プロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、ベイジアン分類子又はフィッシャー分析）、ロジスティク分類子、及びサポートベクター分類子（サポートベクターマシン）が挙げられる。
【０１１２】
より好ましい監督下分類法は、再帰形分割過程である。再帰形分割過程では、未知のサンプルから誘導されるスペクトルを分類するために再帰形分割ツリーを利用する。再帰形分割過程の更なる詳細は、米国特許出願第２００２／０１３８２０８Ａ１号公報（Ｐａｕｌｓｅらの「マススペクトルの分析法」）に記されている。
【０１１３】
他の態様例では、作成される分類モデルは、不監督の学習法を用いて作成される。不監督の分類では、トレーニングデータセットを得たスペクトルを前もって分類すること無しに、トレーニングデータセットの類似性に基づき分類を学ぶことを試みるものである。不監督の学習法には、クラスター分析が含まれる。クラスター分析では、理想的には互いに非常に類似し、そして他のクラスターのメンバーとは相違した「クラスター」又はグループに、データを分割することが試みられる。類似性は、次にデータ項目間の距離を測定するある距離関数を用いて測定し、そして互いに近いデータ項目を一緒にしてクラスター化する。クラスター化技術としては、ＭａｃＱｕｅｅｎのＫ平均アルゴリズム及びＫｏｈｏｎｅｎの自己組織化マップアルゴリズムがある。
【０１１４】
生体情報を分類することに用いるよう主張される学習アルゴリズムは、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０１／３１５８０号公報（Ｂａｒｎｈｉｌｌらの「生体システムのパターン認定法及びその装置並びにその使用法」）、米国特許出願第２００２／０１９３９５０Ａ１号（Ｇａｖｉｎらの「マススペクトル法及び分析」）、米国特許出願第２００３／０００４４０２Ａ１号（Ｈｉｔｔらの「生体データからの隠れたパターンに基づき生体の状態間を区別する工程」）、米国特許出願第２００３００５５６１５Ａ１号（Ｚｈａｎｇらの「生体発現データの処理システム及び方法」）が挙げられる。
【０１１５】
分類モデルは、適切なディジタルコンピュータで作成、また使用できる。適切なディジタルコンピュータとしては、Ｕｎｉｘ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）又はＬｉｎｕｘ（登録商標）ベースのオペレーティングシステムのような、標準又は特殊オペレーティングシステムの何れかを利用するマイクロ、ミニ、又は大型コンピュータが含まれる。用いるディジタルコンピュータは、目的のスペクトルを得るために用いる質量分析計から、物理的に分離しているか、又は質量分析計と結合していてもよい。
【０１１６】
本発明の態様によるトレーニングデータセット及び分類モデルは、ディジタルコンピュータで実施又は使用できるコンピュータでコード化できる。コンピュータコードは、オプティカル、又は磁気ディスク、スティック、テープ、その他のコンピュータで読み取り可能な適切な媒体に保存することができ、またＣ、Ｃ＋＋、ビジュアルベーシック等適切なコンピュータ言語で書くことができる。
【０１１７】
上記の学習アルゴリズムは、既に見いだされたバイオマーカーの分類アルゴリズムの開発、及び卵巣癌の新しいバイオマーカーの発見の両方に有用である。また分類アルゴリズムは、単独又は組み合わせで用いられたバイオマーカーの診断値（例えば、カットオフポイント）を提供し、診断検査の基礎を形成する。
【０１１８】
８． 画像のためのバイオマーカーの使用
陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）又は単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）の画像のような非侵襲性の医療画像法は、癌、冠動脈疾患及び脳疾患の検出に有効である。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの画像は、他の画像技術（Ｘ線、ＣＴ及びＭＲＩのような）が構造を示すのに比べて、器官及び組織の化学的な機能を示す。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの画像の利用は、アルツハイマー病のような脳疾患の発症を認定したり、モニターすることへの利用が増加している。幾つかの事例では、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの画像の利用で、アルツハイマー病をその発症より数年早く検出することが可能となる。例えば、Ｖａｓｓａｕｘ及びＧｒｏｏｔ−ｗａｓｓｉｎｋの「遺伝子治療のためのインビボ非侵襲性画像」（J. Biomedicine and Biotechnology, 2: 92-101 (2003)）を参照されたい。
【０１１９】
異なった方策では、ヒトの脳でのアミロイド沈着のインビボ画像に適した化合物の開発に使用される。Ａ−β及びペプチドフラグメントに対するモノクロナール抗体は、ＡＤの患者の検査では脳への取り込みが制限されている。アミロイド画像の小分子の進入は、以下に記載のように最も成功したものである。例えば、「Nordberg A, Lancet Neurol., 3(9): 519-27 (2004)」、「Kung MP et al, Brain Res., 1025(1-2): 98-105 (2004)」、「Herholz K et al., Mol Imaging Biol., 6(4): 239-69 (2004)」、「Neuropsychol Rev., Zakzanis KK et al., 13(1): 1-18 (2003)」及び「Herholz K, Ann Nucl Med., 17(2): 79-89 (2003)」を参照されたい。
【０１２０】
本明細書で開示のペプチドバイオマーカー又はそのフラグメントは、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの画像への適用の状況で使用されている。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴの適用に適したトレーサー残留物で修飾した後、アミロイドプラークタンパク質と相互作用するペプチドバイオマーカーを、アルツハイマー病患者のアミロイドプラークの沈着を画像化するのに使用することができる。
【０１２１】
アンチセンス技術は、転写物の翻訳が、本明細書で同定されるバイオマーカーで関連付けられるその転写物の発現を検出するのに使用される。例えば、１１１Ｉｎのような適当な放射性核種で標識され、そして生体膜バリアを横切って輸送できる脳の薬剤標的システムに包合されたアンチセンスペプチド核酸（ＰＮＡ）が、脳癌での内生の遺伝子発現の画像化の実証に使用される。鈴木らの「Jounal of Nuclear Medicine, 10: 1766-1775 (2004)」を参照されたい。鈴木らは、血液脳関門で移送受容体を標的とし、そしてＰＮＡがバリアを横断するのを容易にする、モノクロナール抗体を包含するデリバリーシステムを利用した。
【０１２２】
９． 物質の組成
他の態様として、本発明は、本発明のバイオマーカーをベースにした物質の組成物を提供する。
【０１２３】
一態様では、本発明は精製した形態で本発明のバイオマーカーを提供する。精製のバイオマーカーは、抗体を増大させる抗原として有用である。精製のバイオマーカーは、アッセイ方法での標準としても有用である。本明細書で用いられる「精製のバイオマーカー」とは、バイオマーカーが見出される生体サンプルからの、他のタンパク質、ペプチド及び／又は他の物質から単離されたバイオマーカーである。バイオマーカーは、機械的分離（例えば、遠心分離）、硫酸アンモニウム沈殿、透析（サイズ排除の透析を含む）、サイズ排除のクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び金属キレートクロマトグラフィーを含む、当該技術分野で公知の方法で精製されるが、これらに限定されるものではない。そのような方法は例えば、クロマトグラフィーカラム又はバイオチップ等の何れか適当なスケールで実施できる。
【０１２４】
別な態様では、本発明は、本発明のバイオマーカーに特異的に結合する生体特異的な捕捉剤を提供する。一態様では、生体特異的な捕捉剤は、抗体である。そのような組成物は、検出アッセイ、例えば、診断でバイオマーカーを検出するのに有効である。
【０１２５】
別な態様では、本発明は、本発明のバイオマーカーを結合する生体特異的な捕捉剤（ここにおける捕捉剤は固体相に結合する）を提供する。例えば、本発明では、生体特異的な捕捉剤で被覆されるビーズ、チップ、膜、モノリス又はマイクロタイタープレートからなる装置が考えられる。そのような物体は、バイオマーカー検知アッセイで有用である。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、本発明のバイオマーカーに結合する抗体のような生体特異的な捕捉剤からなる組成物（精製した形態であってもよい）を提供する。そのような組成物は、バイオマーカーの精製又はバイオマーカーを検出するアッセイで有用である。
【０１２７】
別な態様では、本発明は、吸着剤、例えば、クロマトグラフィー吸着剤又は生体特異的な捕捉剤に付着する固体基質（本発明のバイオマーカーに更に結合する）からなる物体を提供する。一態様では、その物体は、バイオチップ又は質量分析プローブ、例えば、ＳＥＬＤＩプローブである。そのような物体は、バイオマーカーの精製又は検出に有用である。
【０１２８】
１０． 卵巣癌のバイオマーカーの検出キット
別な態様として、本発明は、卵巣癌の症状を認定するためのキットを提供し、そのキットは本発明によるバイオマーカーの検出に用いられる。一態様では、キットは、捕捉剤が付着したチップ、マイクロタイタープレート、ビーズ又は樹脂のような固体担体からなり、ここにおいて、捕捉剤は本発明のバイオマーカーを結合する。従って、例えば、本発明のキットは、プロテインチップ（登録商標）アレイのようなＳＥＬＤＩ用の質量分析プローブを包含できる。生体特異的な捕捉剤の場合、キットは、反応性表面を有する固体担体及び生体特異的な捕捉剤を包含する容器を含んでなる。
【０１２９】
前記キットは、洗浄液又は洗浄液を作るための説明書も包含し、捕捉剤と洗浄液の組み合わせは、例えば質量分析計でのその後の検出のための固体担体上にバイオマーカー（複数を含む）の捕捉を可能にする。このキットでは、異なった固体担体上に、それぞれ存在する、より多くのタイプの吸着剤を含むことができる。
【０１３０】
更なる態様では、このようなキットは、ラベル又は別個の挿入物の形態で、適切な操作パラメータの説明書を包含できる。例えば、その説明書で使用者にサンプルの採取法、プローブの洗浄法、又は検出すべき特定のバイオマーカーについての情報を提供することができる。
【０１３１】
更なる別な態様では、キットは、較正用の標準（複数を含む）として用いられるバイオマーカーのサンプルを有している１つ又はそれ以上の容器を包含できる。
【０１３２】
１１． スクリーニングアッセイでの卵巣癌用バイオマーカーの使用及び卵巣癌の治療法
本発明の方法には、更に他の適用もある。例えば、バイオマーカーは、インビトロ又はインビボでのバイオマーカーの発現を調節する化合物のスクリーニングに用いられ、この化合物は、患者の卵巣癌の治療又は防止に有用である。別の例では、バイオマーカーは、卵巣癌に対する治療の応答をモニターするために使用できる。他の実施例では、バイオマーカーは、対象が卵巣癌を発症するリスクがあるかを判定する遺伝検討に用いることができる。
【０１３３】
従って、例えば、本発明のキットは、プロテインバイオチップ（例えば、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＨ５０プロテインチップアレイ、例えば、プロテインチップアレイ）のような疎水性機能を有する固体基質、及び基質を洗浄するための酢酸ナトリウム緩衝液、更にチップ上の本発明のバイオマーカーを測定し、そしてこれらの測定値を卵巣癌の診断に用いるプロトコールを提供する説明書を含むことができる。
【０１３４】
治療治験に適した化合物は、表１、３及び４に記載の１つ又はそれ以上のバイオマーカーと反応する化合物を同定することで、まずスクリーニングされる。例示として、スクリーニングには、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを組み換え発現させること、バイオマーカーを精製すること、バイオマーカーを基質に接着させることが含まれる。次に、テスト化合物を基質に接触させ（通常、水溶液条件下で）、テスト化合物とそのバイオマーカー間の相互作用を、例えば、塩濃度の関数として流出率を測定することで、測定する。ある特定のタンパク質は、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの１つ又はそれ以上を認識し、開裂しうるが、そのような場合には、そのタンパク質は、標準アッセイ、例えばタンパク質のゲル電気泳動によって、１つ又はそれ以上のバイオマーカーの消化をモニターすることにより検出できる。
【０１３５】
関連した態様では、表１、３及び４に記載の１つ又はそれ以上のバイオマーカーの活性を抑制するテスト化合物の能力が測定される。当業者は、特定のバイオマーカーの活性を測定する技術がバイオマーカーの機能及び特性に依存して変動することを認めている。例えば、バイオマーカーの酵素活性は、適切な基質が利用でき、また基質の濃度又は反応生成物が容易に測定できるならば、アッセイできる。所与のバイオマーカーの活性を抑制する又は強化する潜在的に治療効果のあるテスト化合物の能力は、テスト化合物の存在下又は非存在下で触媒の率を測定し判定できる。表１、３及び４に記載の１つ又はそれ以上のバイオマーカーの、非酵素（例えば、構造的）機能又は活性に干渉するテスト化合物の能力が測定できる。例えば、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを含む多タンパク質複合体の自己集合は、テスト化合物の存在下又は非存在下で分光法でモニターできる。あるいは、バイオマーカーが転写の非酵素的なエンハンサーであるなら、転写を強化するバイオマーカーの能力に干渉するテスト化合物を、テスト化合物の存在下又は非存在下でのインビボ又はインビトロでのバイオマーカー依存の転写レベルを測定することによって同定できる。
【０１３６】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーの何れかの活性を調節できるテスト化合物は、卵巣癌又は他の癌を患っている又はそのリスクのある患者に投与できる。例えば、特定のバイオマーカーの活性を増大させるテスト化合物の投与は、もしその特定のバイオマーカーの活性が卵巣癌のタンパク質の蓄積をインビボで防止するならば、患者での卵巣癌のリスクを低減するであろう。また特定のバイオマーカーの活性を低減させるテスト化合物の投与は、そのバイオマーカーの活性の増大が、少なくとも一部、卵巣癌の発症の原因であれば、患者での卵巣癌のリスクを減少させることができる。
【０１３７】
更に追加の態様では、本発明は、カルグラヌリンＣの修飾した形態のレベルの増大と関連する卵巣癌のような疾患の治療に有用な化合物を同定するための方法を提供する。例えば、一態様では、細胞抽出物又は発現ライブラリーが、全長のカルグラヌリンＣ（Ｍ１０４３０）の開裂で先を切断した形のカルグラヌリンＣ（Ｍ１０２１０）を形成する触媒となる化合物のスクリーニングに利用できる。そのようなスクリーニングアッセイの一態様として、カルグラヌリンＣの開裂は、カルグラヌリンＣが開裂されていないときは抑制された状態で、そのタンパク質が開裂したときは蛍光を発する蛍光プローブをカルグラヌリンＣに結合して、検出できる。あるいは、アミノ酸ｘとｙの間に開裂できないアミノ結合を提供するように修飾した全長カルグラヌリンＣが、インビボでのサイトで全長カルグラヌリンＣを開裂する細胞プロテアーゼを選択的に結合又は「トラップ」するのに用いられる。プロテアーゼ及びそれらのターゲットをスクリーニングし、同定する方法は、科学文献に詳しく記述されている。例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｔｉｎらの「Nature Reviews, 3:509-519 (2002)」を参照されたい。
【０１３８】
更に、別な態様では、本発明は、疾患、例えば、卵巣癌（これは、先を切断したカルグラヌリンＣのレベル増大と関連している）の進行若しくは可能性を治療又は低減する方法を提供する。例えば、全長のカルグラヌリンＣを開裂する１つ又はそれ以上のタンパク質を同定した後、同定したタンパク質の開裂活性を抑制する化合物について組み合わせライブラリーをスクリーニングする。その様な化合物の化学ライブラリーをスクリーニングする方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ(２００２)らの文献を参照されたい。あるいは、抑制化合物は、カルグラヌリンＣの構造に基づいて理知的に設計できるであろう。
【０１３９】
臨床レベルでは、テスト化合物のスクリーニングは、テスト化合物に対象を曝露する前後に、検査対象からサンプルを得ることが含まれる。表１、３及び４に記載のバイオマーカーの１つ又はそれ以上のサンプルのレベルを測定し、テスト化合物に曝露後のバイオマーカーのレベルが変化するかどうかを判定するために、分析する。本明細書に記したように、質量分析でサンプルを分析してもよいし、又は当業者に公知の他の方法の何れかで分析しても良い。例えば、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの１つ又はそれ以上のレベルは、それらバイオマーカーに特異的に結合する放射性標識又は蛍光標識の抗体を用いる、ウエスタンブロットで直接測定できる。あるいは、バイオマーカーの１つ又はそれ以上をコードするｍＲＮＡのレベルの変化を測定し、対象に投与した所定のテスト化合物と相関付けられる。更なる態様では、バイオマーカーの１つ又はそれ以上の発現レベルの変化を、インビトロでの方法及び材料を用いて測定する。例えば、表１、３及び４に記載のバイオマーカーの１つ又はそれ以上を発現する又は発現できるヒト組織培養の細胞に、テスト化合物を接触しても良い。テスト化合物で処置された対象は、その治療による生理的効果につき定期的に検査を受ける。特に、対象での疾患可能性を低減する能力について、テスト化合物を評価する。あるいは、卵巣癌と先に診断された対象にテスト化合物を投与する際は、その疾患の進行を遅延する又は停止する能力について、テスト化合物をスクリーニングする。
１２． 実施例
【実施例１】
【０１４０】
卵巣癌に対するバイオマーカーの発見
サンプル
卵巣嚢胞液サンプルは、ケンタッキー大学より入手した。サンプルは、患者の手術中に採取され、−８０℃に保存された。サンプルの分布は以下の通りである：侵襲性の卵巣癌（ＯｖＣａ） １２症例；悪性度の低い見込み（不明確な）卵巣癌 １３症例；他の悪性腫瘍 ６症例；及び良性 ３９症例。
【０１４１】
サンプル：血清プロファイリング
卵巣嚢胞プロファイリングは、直接のチップ結合方法及び陰イオン交換分別後のチップ結合方法の両方を用いて実施した。プロファイリングするサンプルを含むランダム化テンプレートが、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアプログラムを用い作成された。サンプルを氷上で解凍し、９６個のウェルプレートに加えて（アレンジメント用テンプレートに従い）、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。嚢胞液のアリコートを、新しい９６個のウェルプレートに入れ、使用まで−８０ｏＣで保存した。血清サンプルは、２００４年１０月６日にＩＭＡＣ−Ｃｕ＋＋、及び２００４年１０月１４日にＱ１０（以下のプロトコールを参照されたい）よりトリプリケート（３組）のプロテインチップアレイでプロファイリングした。同一日に全ての複製を調製し、ＰＣＳ４０００で読み込んだ。アレイは、Ｂｉｏｍｅｋ２０００又はＴｅｃａｎ Ａｑｕａｒｉｕｓロボットを用い、サンプルで処理した。
【０１４２】
直接のチップ結合プロトコール：
１．５μｌのサンプルを、７．５μｌのＵ９緩衝液で変性する
２．４℃にて２０分間振って混合する
３．５０ｍＭのトリス（ｐＨ９）緩衝液１１２．５μｌを加えて、最終容量を１２５μｌとする
４．５μｌの変性サンプルを４つのチップタイプの全てに適用する
チップ結合：
ＩＭＡＣ３０：ＩＭＡＣ３０プロテインチップアレイは銅と結合させる。結合及び洗浄緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）／５００ｍＭのＮａＣｌ溶液である。
ＣＭ１０：結合及び洗浄緩衝液は、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）溶液である。
Ｈ５０：結合及び洗浄緩衝液は、１０％のアセトニトリル緩衝液である。
Ｑ１０：結合及び洗浄緩衝液は、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）である。
結合処理時間：室温で６０分間である。
マトリックスは、シナピニン酸である。
【０１４３】
１． 陰イオン交換分別プロトコール：
緩衝液リスト：
１．Ｕ９（９Ｍの尿素、２％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９）
２．Ｕ１（１Ｍの尿素、０．２２％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ９）
３．０．１％のＯＧＰを有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９）（洗浄緩衝液１）
４．０．１％のＯＧＰを有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７）（洗浄緩衝液２）
５．０．１％のＯＧＰを有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５）（洗浄緩衝液３）
６．０．１％のＯＧＰを有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４）（洗浄緩衝液４）
７．０．１％のＯＧＰを有する５０ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ３）（洗浄緩衝液５）
８．３３．３％のイソプロパノール／１６．７％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸（洗浄緩衝液６）
注意：洗浄緩衝液５が樹脂に適用されるまでは、洗浄緩衝液６を緩衝液トレイに等分しない。これにより、揮発性の有機溶媒の蒸発が問題にはならない。
【０１４４】
物質リスト：
フィルタープレート
Ｆ１〜Ｆ６に標識された６ｖのウェルの９６個ウェル皿
【０１４５】
Ａ．洗浄樹脂
ＨｙｐｅｒＱ ＤＦ樹脂を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）の５倍のベッド容量で３回洗浄して樹脂を準備する。その後５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ溶液（ｐＨ９）中に５０％の懸濁状態で保存する。
【０１４６】
Ｂ．変性の血清タンパク質
冷凍血清を解凍し、４℃にて２００００ｇで１０分間遠心分離する
９６個のウェルプレートのそれぞれのウェルに２０μｌの血清を等分する
３０μｌのＵ９をそれぞれのサンプルに加える
４℃にて２０分間よく攪拌する
【０１４７】
Ｃ．樹脂の平衡化
１８０μｌ（ラット血清に対しては２４０μｌ）のＨｙｐｅｒＱ ＤＦをフィルタープレート中のそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
２００μｌのＵ１をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
２００μｌのＵ１をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
２００μｌのＵ１をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
【０１４８】
Ｄ．血清と樹脂の結合
各ウェルから５０μｌのサンプルをピペットでフィルタープレート中の対応するウェルに加える
５０μｌのＵ１をサンプルプレートのそれぞれのウェルに加える
５回混合する
サンプルプレートの各ウェルから５０μｌをピペットでフィルタープレート中の対応するウェルに加える
「この工程は、ロボットでピペット採取する場合デッド容量がある（ロボットが最初にサンプルを採取する時、全ての物質を採取しない）ために含まれる。５０μｌのＵ１を加えて混合することにより、残留物を得て最初の５０μｌに加えることができる。」
４℃にて３０分間よく攪拌する
【０１４９】
Ｅ．画分の採取
フィルタープレートの下にプレートＦ１のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ１に通過液を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液１をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ１にｐＨ９の流出液を採取する
画分１は通過液とｐＨ９の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液２をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ２のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ２に画分２を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液２をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ２に画分２の残りを採取する
画分２はｐＨ７の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液３をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ３のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ３に画分３を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液３をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ３に画分３の残りを採取する
画分３はｐＨ５の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液４をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ４のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ４に画分４を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液４をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ４に画分４の残りを採取する
画分４はｐＨ４の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液５をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ５のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ５に通過液を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液５をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ５に画分５の残りを採取する
画分５はｐＨ３の流出液を含む
１００μｌの洗浄緩衝液６をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートＦ６のｖ−ウェルの９６個ウェルをおく
プレートＦ６に画分６を採取する
１００μｌの洗浄緩衝液６をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で１０分間よく攪拌する
プレートＦ６に画分６の残りを採取する
画分６は有機溶媒の流出液を含む
チップ結合のプロトコールを進めるまで冷凍する
【０１５０】
チップ結合のプロトコール
緩衝液リスト：
ＩＭＡＣ３０チップ：
１．１００ｍＭのリン酸ナトリウム＋０．５ＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．０）
２．１００ｍＭのＣｕＳＯ４
３．１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）
ＣＭ１０チップ：
１．１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）
【０１５１】
物質リスト：
バイオ処理装置（bioprocessors）
ＩＭＡＣ３０チップ
ＣＭ１０チップ
バイオ処理装置にチップをおく
【０１５２】
Ａ．ＩＭＡＣチップの銅負荷
５０μｌのＣｕＳＯ４をＩＭＡＣ３チップ上の各々の部位に負荷する
バイオ処理装置を７００ｒｐｍで１分間遠心分離する
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後ＣｕＳＯ４を除く
水洗浄する
【０１５３】
Ｂ．ＩＭＡＣチップの中性化
５０μｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）をＩＭＡＣ３チップ上の各々の部位に負荷する
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後酢酸ナトリウムを除く
水洗浄する
【０１５４】
Ｃ．チップの平衡化
１５０μｌの適当なチップ結合緩衝液をそれぞれのウェルに加える
ＣＭ１０のためにバイオ処理装置を７００ｒｐｍで１分間遠心分離する
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
１５０μｌの適当な緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
【０１５５】
Ｄ．チップへの画分の結合
各ウェルに９０μｌの対応する緩衝液を加える
１０μｌのＱカラム画分を加える
ＣＭ１０のためにバイオ処理装置を７００ｒｐｍで１分間遠心分離する
室温（ＲＴ）で６０分間よく攪拌する
攪拌後サンプルと緩衝液を除く
【０１５６】
Ｅ．チップの洗浄
１５０μｌの対応する緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
１５０μｌの対応するチップ結合緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
１５０μｌの対応する緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
２回水洗浄する
【０１５７】
Ｆ．マトリックスの追加
バイオ処理装置の上部とガスケットを除く
部位から水を真空下で除く
チップを１０分間乾燥する
ペン（a pap pen）を用いて各スポットの周りに円を描く
ＳＰＡに対して
４００μｌの５０％のＡＣＮ、０．５％のＴＦＡをＳＰＡチューブに加える
室温（ＲＴ）で５分間よく攪拌する
１．０μｌを各スポットに加える
１０分間風乾する
１．０μｌを各スポットに加える
風乾する
【０１５８】
データ分析：
データは、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓを用いて得た。質量較正は、外部較正試薬を用いて実施し、強度の正規化は、外部の正規化要因を用いて、総イオン電流に基づき実施し、またベースラインを差し引くことを行った。ピーク検出は、ピークがシグナル／ノイズ比３：１を有し、スペクトルの２０％に存在することを基準として用い、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓで実施した。統計解析は、マン・ホイットニー検定（２グループ、例えば、良性対卵巣癌に対して）又はクラスカル・ウォリス検定（多重グループ比較で、良性の卵巣疾患、卵巣癌、悪性度の低い見込みの卵巣癌（ＬＭＰ）、他の悪性腫瘍（転移性癌（例えば、胃癌の卵巣への転移）、中皮腫、間質卵巣癌等を含む、侵襲性上皮卵巣癌以外の悪性腫瘍）のそれぞれの比較）を用い、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓで実施した。
【０１５９】
結果／結論：
クラスカル・ウォリス検定を用いて、４通りの比較を実施した。４つのグループは、良性の卵巣疾患、侵襲性上皮卵巣癌、不明確な卵巣癌（悪性度の低い見込みの卵巣癌とも呼ばれる）、及び他の悪性腫瘍（間質卵巣腫瘍、転移性疾患及び子宮癌を含む）である。
【０１６０】
上記の方法で卵巣嚢胞液で同定される卵巣癌のバイオマーカーは、表１に示す。もっとも注目すべきは、ほとんどの顕著なピークが、同じように疾患の悪性腫瘍（又は非悪性腫瘍）の特徴に基づいて上方又は下方制御されている。良性疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌（不明確な疾患と呼ばれる）は、ピーク強度の同じ分布を有する傾向があり、一方侵襲性の卵巣癌及び他の悪性の疾患はピーク強度の同じ分布を有する傾向にある。本発明のこれらのバイオマーカーは、単独で、又は卵巣癌の重要なバイオマーカーである以前に同定されている他のタンパク質と一緒に用いることができる。
【実施例２】
【０１６１】
マーカーの精製及び同定（ＩＤ）
バイオマーカーは、ある範囲のＢｉｏｓｅｐｒａ吸着剤を用いるクロマトグラフィー技術、そして続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理する組み合わせで精製される。精製のスキームは、目的のバイオマーカーを追跡するプロテインチップ読み込み器（Reader）を用いてモニターされる。３０ｋＤａより小さいタンパク質に対しては、目的の無傷のバンドをゲルから抽出し、プロテインチッップ読取り器で再分析して元のバイオマーカーと一致するそれらの正確な質量を確認する。ゲル抽出のタンパク質は、溶液中でトリプシンで消化し、３０ｋＤａより大きいタンパク質はゲル中で消化される。トリプシンの消化物は、プロテインチップ読取り器を用いてペプチドマッピングし、ＰＣＩ−１０００プロテインチップ接触面を合わせたＱ−ＳＴＡＲ（Applied Biosysrtems）装置を用いるタンデムＭＳによって分析する。４ｋＤａより小さいバイオマーカーは、クロマトグラフィー技術の組み合わせにより濃縮して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製及び／又はトリプシン消化なしにタンデムＭＳで直接同定される。幾つかの事例（例えば、リゾチームＣ）では、バイオマーカーは、抗体を用いて同定される。
【０１６２】
先の段落で記載の技術で、表１に記載のバイオマーカーの同定が可能となる。
【実施例３】
【０１６３】
バイオマーカーの発見
方法
タンパク質発現のプロファイリングは、卵巣腫瘍の７４名の患者の卵巣嚢胞液（１６症例の悪性、１３症例の悪性度の低い見込み、４５症例の良性）でプロテインチップバイオマーカーシステム（登録商標）（Ciphergen Biosystems）である表面増強レーザー脱離イオン化時間又は飛行型質量分析計を用いて実施した。卵巣嚢胞液は、無分別及び陰イオン交換分別後に分析した。各々の画分のアリコートは、ＮＰ２０、ＩＭＡＣ３０、ＣＭ１０、Ｈ５０及びＱ１０のプロテインチップアレイで２通り分析した。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＥｘＰｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェアは、ｍ／ｚピークの同定及び診断のグループ間のピーク強度比較のために用いた。診断のグループ間のピーク強度の統計的に有意な違いは、クラスカル・ウォリス検定及びＲＯＣ曲線分析により判定した。
【０１６４】
結果
卵巣嚢胞液からの１００以上のタンパク質ピークは、良性、悪性及び悪性度の低い見込みの卵巣腫瘍の間でピーク強度が有意に異なった（下記の表２及び３を参照されたい）。これらの卵巣嚢胞液で、以下のものが、ＭＳ／ＭＳ又は免疫学的測定の評価を有するＭＳ／ＭＳにより同定される：アポリポタンパク質ＣI（ｍ／ｚ＝６５２０、ｐ＝０．０００３）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ｍ／ｚ＝８６９０、ｐ＝０．００００６）及びアポリポタンパク質ＣＩＩ（ｍ／ｚ＝８９１８、ｐ＝０．０００２）；カルグラヌリンＡ（ｍ／ｚ＝１０８４０、Ｐ＝０．００００１）及びカルグラヌリンＣ（ｍ／ｚ＝１０４３０、Ｐ＝０．００００４）；トランスサイレチン（二重荷電）（ｍ／ｚ＝６８８０、Ｐ＝０．００００５）；及びカルサイクリン（ｍ／ｚ＝１０２１０、Ｐ＝０．００００２）。
【０１６５】
表３
ＣＭ１０プロテインチップアレイに吸収され、高いレーザー強度で読み込まれた個々の患者からの陰イオン交換分別した嚢胞液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析値は、悪性の上皮卵巣腫瘍に対して良性及び悪性度の低い見込みの腫瘍を有する患者で違いのある、３５個のバイオマーカーを同定した。クラスカル・ウォリスのＰ値（複数を含む）及びＲＯＣ分析のＡＵＣ値を示した。
【表３】
【０１６６】
表４
ＣＭ１０プロテインチップアレイに吸収され、低いレーザー強度で読み込まれた個々の患者からの陰イオン交換分別した嚢胞液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析値は、悪性の上皮卵巣腫瘍に対して良性及び悪性度の低い見込みの腫瘍を有する患者で違いのある、２８個のバイオマーカーを同定した。クラスカル・ウォリスのＰ値（複数を含む）及びＲＯＣ分析のＡＵＣ値を示した。
【表４】
【０１６７】
結論
卵巣嚢胞液は、卵巣癌の診断のタンパク質バイオマーカーの豊富な供給源である。これらのバイオマーカーの幾つかが急性期反応物である。本明細書で実証したように、嚢胞液のタンパク質は、卵巣癌の診断検査に有用なバイオマーカーの優れた供給源である。
【０１６８】
本明細書に記した実施例及び態様は、例示のためのみであり、それらに基づく種々の修正及び変更は当業者には示唆されるものであり、それらは本出願及び添付の特許請求の範囲の精神及び範疇に含められるものであることを理解されたい。本明細書に参照した出版物、特許及び特許出願の全ては、全ての目的のためにそれらの全てを参照して本明細書に取り込む。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】図１は、良性（ａ、ａ’）、悪性の上皮卵巣癌（ｂ、ｂ’）及び悪性レベルの低い見込みの腫瘍を有する、個々の患者からの嚢胞液の代表的なスペクトル（Ａ）及び対応するゲル模様（Ｂ）を示す。漸減したｐＨ（ｐＨ９．０、７．０、５．０、４．０、３．０）の陰イオン交換で分別し、その後有機溶媒、ＣＭ１０プロテインチップアレイに吸収させ、そして低いレーザー強度で読み込む。各々の患者のｐＨ９．０流出画分を示した。代表的な散布及び四角のプロット（Ｃ）は、ｍ／ｚ：１０，８４０の「ピーク強度」（カルグラヌリンＡ）で変動を示す。ｍ／ｚ：１０，８４０ピークは、悪性の上皮卵巣癌を有する患者で極めて大きな「ピーク強度」を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおける少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）を測定すること；そして
（ｂ）測定結果を卵巣癌の症状と関連付けること：
を含んでなる、対象における卵巣癌の症状を認定する方法。
【請求項２】
バイオマーカーの少なくとも一つが、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖の各々を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バイオマーカーの少なくとも一つが、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、マルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンの各々を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＡ１２５を測定することを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣＡ１２５、トランスフェリン、ハプトグロビン、ＡｐｏＡ１、トランスサイレチン、ＩＴＩＨ４内部フラグメント、β２ミクログロブリン、ヘプシジン、プロスタチン（prostatin）、オステオポンチン、エソイノフィル（esoinophil）由来の神経毒、レプチン、プロラクチン、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘモグロビン及びそれらの修飾型よりなる群から選ばれる、バイオマーカーの少なくとも一つを測定すること、そして関連付けることを更に含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ＣＡ１２５ＩＩ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９５、腫瘍関連のトリプシン抑制剤（ＴＡＴＩ）、ＣＥＡ、胎盤のアルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、シアリルＴＮ、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、上皮成長因子受容体の対象の細胞外領域の１１０ｋＤ成分（ｐ１１０ＥＧＦＲ）、組織カリクレイン（例えば、カリクレイン６及びカリクレイン１０（ＮＥＳ−１））、プロスタチン、ＨＥ４、クレアチンキナーゼＢ（ＣＫＢ）、ＬＡＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、尿ゴナドトロピン・ペプチド、Ｄｉａｎｏｎ ＮＢ７０／Ｋ、組織ペプチド抗原（ＴＰＡ）、ＳＭＲＰ、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子Ｉ及びインスリン様成長因子ＩＩよりなる群から選ばれる、バイオマーカーの少なくとも一つを測定すること、そして関連付けることを更に含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのバイオマーカーが、ＳＥＬＤＩプローブの吸着体表面に当該バイオマーカーを捕捉して、レーザー脱離−イオン化質量分析計で捕捉のバイオマーカーを検出することにより測定される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのバイオマーカーを、免疫学的測定で測定する、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、卵巣嚢胞液である、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記関連付けが、ソフトウェアの分類アルゴリズムによって実施される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
卵巣癌の症状が、良性の卵巣疾患、悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状から選ばれる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
卵巣癌の症状が、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状に対して良性の卵巣疾患及び悪性レベルの低い見込みの卵巣癌から選ばれる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
卵巣癌の症状が、良性の卵巣疾患に対する悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状から選ばれる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
卵巣癌の症状が、良性の卵巣疾患の可能性がない、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
卵巣癌の症状が、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状の可能性がない、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｃ）症状に基づく対象の治療を管理すること、
を更に含んでなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｃ）対象に症状を報告すること、
を更に含んでなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）具体的な媒体に症状を記録すること、
を更に含んでなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記吸着体が、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤から選ばれる部材である、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記吸着体が、陽イオン交換吸着剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
測定が卵巣癌と関連付けられる場合、前記の対象の治療を管理することが、化学療法薬を対象に投与することを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
（ｄ）対象の管理の後、少なくとも１つのバイオマーカーを測定すること、そして測定値を疾患の進行に関連付けること、を更に含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのバイオマーカーが表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる、対象からのサンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含んでなる方法。
【請求項２６】
（ａ）１回目に、少なくとも１つのバイオマーカーが表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定すること、
（ｂ）２回目に、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定すること、
（ｃ）１回目の測定値と２回目の測定値を比較すること、
（ここにおいて、比較された測定値が卵巣癌の経過を判定する）
を含んでなる、卵巣癌の経過を判定する方法。
【請求項２７】
少なくとも１つのバイオマーカーが、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖（ａ）のバイオマーカーの各々を測定することを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのバイオマーカーが、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンのバイオマーカーの各々を測定することを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＡ１２５を測定することを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーから選ばれる、精製した生体分子を含んでなる組成物。
【請求項３３】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーから選ばれる生体分子と特異的に結合する、生体特異的な捕捉剤を含んでなる組成物。
【請求項３４】
前記生体特異的な捕捉剤が、抗体である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記生体特異的な捕捉剤が、固体担体に結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーに結合する生体特異的な捕捉剤を、含んでなる組成物。
【請求項３７】
（ａ）当該担体に付着している少なくとも１つの捕捉剤（ここにおける捕捉剤が、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる第一の群からの少なくとも１つのバイオマーカーと結合している）を含んでなる固体担体、及び
（ｂ）前記固体担体を、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを検出するために使用する説明書、
を含んでなる、キット。
【請求項３８】
ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、バイオマーカーを検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、バイオマーカーを検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンのバイオマーカーの各々を検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４２】
ＣＡ１２５を検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３９に記載のキット。
【請求項４３】
捕捉剤を包含する前記固体担体が、ＳＥＬＤＩプローブである、請求項３７、３８又は３９の何れかに記載のキット。
【請求項４４】
前記捕捉剤が、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤である、請求項３７、３８又は３９の何れかに記載のキット。
【請求項４５】
（ｃ）表１、３及び４に記載のバイオマーカーの少なくとも１つを含む容器、
を追加して含んでなる、請求項３７、３８又は３９の何れかに記載のキット。
【請求項４６】
（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー吸着剤、
を追加して含んでなる、請求項３７、３８又は３９の何れかに記載のキット。
【請求項４７】
（ａ）当該担体に付着している少なくとも１つの捕捉剤（ここにおける捕捉剤が、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる第一の群からの少なくとも１つのバイオマーカーと結合している）を含んでなる固体担体、及び
（ｂ）バイオマーカーの少なくとも１つを含む容器、
を含んでなる、キット。
【請求項４８】
前記容器が、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記容器が、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
前記容器が、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
前記容器が、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンのバイオマーカーの各々を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
前記容器が、ＣＡ１２５を更に含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５３】
捕捉剤を包含する前記固体担体が、ＳＥＬＤＩプローブである、請求項４７、４８又は４９の何れかに記載のキット。
【請求項５４】
（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー吸着剤、
を追加して含んでなる、請求項４７、４８又は４９の何れかに記載のキット。
【請求項５５】
前記捕捉剤が、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤よりなる群から選ばれる部材である、請求項４７、４８又は４９の何れかに記載のキット。
【請求項５６】
ａ．サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおけるバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）の測定値を包含する、サンプルに起因するデータにアクセスするコード、及び
ｂ．サンプルの卵巣癌の症状を、測定値の関数として分類する分類アルゴリズムを実行するコード、
を含んでなる、ソフトウェア製品。
【請求項５７】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、バイオマーカーの測定値の関数として分類する、請求項５６に記載のソフトウェア製品。
【請求項５８】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々の測定値の関数として分類する、請求項５６に記載のソフトウェア製品。
【請求項５９】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、バイオマーカーの測定値の関数として分類する、請求項５６に記載のソフトウェア製品。
【請求項６０】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンのバイオマーカーの各々の測定値の関数として分類する、請求項５６に記載のソフトウェア製品。
【請求項６１】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、更にＣＡ１２５の測定値の関数として分類する、請求項５８に記載のソフトウェア製品。
【請求項６２】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーを、質量分析又は免疫学的測定によって検出することを含んでなる方法。
【請求項６３】
対象からのサンプル中の複数のバイオマーカー（ここにおけるバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）の相関関係から判定される、卵巣癌の症状に関する診断を、対象に伝達することを含んでなる方法。
【請求項６４】
前記診断が、コンピューター処理した媒体を介して対象に伝達される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ａ）表１、３及び４に記載のバイオマーカーにテスト化合物を接触させること、及び
ｂ）テスト化合物が表１、３及び４に記載のバイオマーカーと相互作用するかを判定すること、
を含んでなる、表１、３及び４に記載のバイオマーカーと相互作用する化合物を同定する方法。
【請求項６６】
ａ）当該細胞に、カルグラヌリンＣの開裂を防止する抑制剤を接触させること、
を含んでなる、細胞中のカルグラヌリンＣの濃度を調節する方法。
【請求項６７】
前記方法が、対象にカルグラヌリンＣの開裂を防止する抑制剤の治療有効量を投与すること、
を含んでなる、対象の症状を治療する方法。
【請求項６８】
前記症状が、卵巣癌である、請求項６７に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおける少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）を測定すること；そして
（ｂ）測定結果を卵巣癌の症状と関連付けること：
を含んでなる、対象における卵巣癌の症状を認定する方法。
【請求項２】
バイオマーカーの少なくとも一つが、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖の各々を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バイオマーカーの少なくとも一つが、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、マルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンの各々を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＡ１２５を測定することを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣＡ１２５、トランスフェリン、ハプトグロビン、ＡｐｏＡ１、トランスサイレチン、ＩＴＩＨ４内部フラグメント、β２ミクログロブリン、ヘプシジン、プロスタチン（prostatin）、オステオポンチン、エソイノフィル（esoinophil）由来の神経毒、レプチン、プロラクチン、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘモグロビン及びそれらの修飾型よりなる群から選ばれる、バイオマーカーの少なくとも一つを測定すること、そして関連付けることを更に含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ＣＡ１２５ＩＩ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９５、腫瘍関連のトリプシン抑制剤（ＴＡＴＩ）、ＣＥＡ、胎盤のアルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、シアリルＴＮ、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、上皮成長因子受容体の対象の細胞外領域の１１０ｋＤ成分（ｐ１１０ＥＧＦＲ）、組織カリクレイン（例えば、カリクレイン６及びカリクレイン１０（ＮＥＳ−１））、プロスタチン、ＨＥ４、クレアチンキナーゼＢ（ＣＫＢ）、ＬＡＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、尿ゴナドトロピン・ペプチド、Ｄｉａｎｏｎ ＮＢ７０／Ｋ、組織ペプチド抗原（ＴＰＡ）、ＳＭＲＰ、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子Ｉ及びインスリン様成長因子ＩＩよりなる群から選ばれる、バイオマーカーの少なくとも一つを測定すること、そして関連付けることを更に含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのバイオマーカーが、ＳＥＬＤＩプローブの吸着体表面に当該バイオマーカーを捕捉して、レーザー脱離−イオン化質量分析計で捕捉のバイオマーカーを検出することにより測定される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのバイオマーカーを、免疫学的測定で測定する、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、卵巣嚢胞液である、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記関連付けが、ソフトウェアの分類アルゴリズムによって実施される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
卵巣癌の症状が、良性の卵巣疾患、悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状から選ばれる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
卵巣癌の症状が、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状に対して良性の卵巣疾患及び悪性レベルの低い見込みの卵巣癌から選ばれる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
卵巣癌の症状が、良性の卵巣疾患に対する悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状から選ばれる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
卵巣癌の症状が、良性の卵巣疾患の可能性がない、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
卵巣癌の症状が、卵巣癌（悪性）及び他の悪性症状の可能性がない、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｃ）症状に基づく対象の治療を管理すること、
を更に含んでなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｃ）対象に症状を報告すること、
を更に含んでなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）具体的な媒体に症状を記録すること、
を更に含んでなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記吸着体が、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤から選ばれる部材である、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記吸着体が、陽イオン交換吸着剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
測定が卵巣癌と関連付けられる場合、前記の対象の治療を管理することが、化学療法薬を対象に投与することを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
（ｄ）対象の管理の後、少なくとも１つのバイオマーカーを測定すること、そして測定値を疾患の進行に関連付けること、を更に含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのバイオマーカーが表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる、対象からのサンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含んでなる方法。
【請求項２６】
（ａ）１回目に、少なくとも１つのバイオマーカーが表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定すること、
（ｂ）２回目に、対象からの生体サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定すること、
（ｃ）１回目の測定値と２回目の測定値を比較すること、
（ここにおいて、比較された測定値が卵巣癌の経過を判定する）
を含んでなる、卵巣癌の経過を判定する方法。
【請求項２７】
少なくとも１つのバイオマーカーが、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖（ａ）のバイオマーカーの各々を測定することを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのバイオマーカーが、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンのバイオマーカーの各々を測定することを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＡ１２５を測定することを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーから選ばれる、精製した生体分子を含んでなる組成物。
【請求項３３】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーから選ばれる生体分子と特異的に結合する、生体特異的な捕捉剤を含んでなる組成物。
【請求項３４】
前記生体特異的な捕捉剤が、抗体である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記生体特異的な捕捉剤が、固体担体に結合している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーに結合する生体特異的な捕捉剤を、含んでなる組成物。
【請求項３７】
（ａ）当該担体に付着している少なくとも１つの捕捉剤（ここにおける捕捉剤が、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる第一の群からの少なくとも１つのバイオマーカーと結合している）を含んでなる固体担体、及び
（ｂ）前記固体担体を、表１、３及び４に記載のバイオマーカーを検出するために使用する説明書、
を含んでなる、キット。
【請求項３８】
ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、バイオマーカーを検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、バイオマーカーを検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンのバイオマーカーの各々を検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４２】
ＣＡ１２５を検出するために前記固体担体を使用する説明書を含んでなる、請求項３９に記載のキット。
【請求項４３】
捕捉剤を包含する前記固体担体が、ＳＥＬＤＩプローブである、請求項３７、３８又は３９の何れかに記載のキット。
【請求項４４】
前記捕捉剤が、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤である、請求項３７、３８又は３９の何れかに記載のキット。
【請求項４５】
（ｃ）表１、３及び４に記載のバイオマーカーの少なくとも１つを含む容器、
を追加して含んでなる、請求項３７、３８又は３９の何れかに記載のキット。
【請求項４６】
（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー吸着剤、
を追加して含んでなる、請求項３７、３８又は３９の何れかに記載のキット。
【請求項４７】
（ａ）当該担体に付着している少なくとも１つの捕捉剤（ここにおける捕捉剤が、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる第一の群からの少なくとも１つのバイオマーカーと結合している）を含んでなる固体担体、及び
（ｂ）バイオマーカーの少なくとも１つを含む容器、
を含んでなる、キット。
【請求項４８】
前記容器が、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記容器が、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
前記容器が、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
前記容器が、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンのバイオマーカーの各々を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
前記容器が、ＣＡ１２５を更に含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５３】
捕捉剤を包含する前記固体担体が、ＳＥＬＤＩプローブである、請求項４７、４８又は４９の何れかに記載のキット。
【請求項５４】
（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー吸着剤、
を追加して含んでなる、請求項４７、４８又は４９の何れかに記載のキット。
【請求項５５】
前記捕捉剤が、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤よりなる群から選ばれる部材である、請求項４７、４８又は４９の何れかに記載のキット。
【請求項５６】
ａ．サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカー（ここにおけるバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）の測定値を包含する、サンプルに起因するデータにアクセスするコード、及び
ｂ．サンプルの卵巣癌の症状を、測定値の関数として分類する分類アルゴリズムを実行するコード、
を含んでなる、ソフトウェア製品。
【請求項５７】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖よりなる群から選ばれる、バイオマーカーの測定値の関数として分類する、請求項５６に記載のソフトウェア製品。
【請求項５８】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ヘモグロビンα／β、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＣ、カルグラヌリンＣ（切断型）、カルグラヌリンＡ及びＩｇＧ重鎖のバイオマーカーの各々の測定値の関数として分類する、請求項５６に記載のソフトウェア製品。
【請求項５９】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンよりなる群から選ばれる、バイオマーカーの測定値の関数として分類する、請求項５６に記載のソフトウェア製品。
【請求項６０】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡＩＩ、ＡｐｏＣＩＩ、カルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ、カルサイクリン及びトランスサイレチンのバイオマーカーの各々の測定値の関数として分類する、請求項５６に記載のソフトウェア製品。
【請求項６１】
前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、更にＣＡ１２５の測定値の関数として分類する、請求項５８に記載のソフトウェア製品。
【請求項６２】
表１、３及び４に記載のバイオマーカーを、質量分析又は免疫学的測定によって検出することを含んでなる方法。
【請求項６３】
対象からのサンプル中の複数のバイオマーカー（ここにおけるバイオマーカーは、表１、３及び４に記載のバイオマーカーよりなる群から選ばれる）の相関関係から判定される、卵巣癌の症状に関する診断を、対象に伝達することを含んでなる方法。
【請求項６４】
前記診断が、コンピューター処理した媒体を介して対象に伝達される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ａ）表１、３及び４に記載のバイオマーカーにテスト化合物を接触させること、及び
ｂ）テスト化合物が表１、３及び４に記載のバイオマーカーと相互作用するかを判定すること、
を含んでなる、表１、３及び４に記載のバイオマーカーと相互作用する化合物を同定する方法。
【請求項６６】
ａ）当該細胞に、カルグラヌリンＣの開裂を防止する抑制剤を接触させること、
を含んでなる、細胞中のカルグラヌリンＣの濃度を調節する方法。
【請求項６７】
前記方法が、対象にカルグラヌリンＣの開裂を防止する抑制剤の治療有効量を投与すること、
を含んでなる、対象の症状を治療する方法。
【請求項６８】
前記症状が、卵巣癌である、請求項６７に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５４７０２８（Ｐ２００８−５４７０２８Ａ）
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１８４７８（Ｐ２００８−５１８４７８）
【出願日】平成１８年６月２３日（２００６．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２４６９３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００２５３５
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
【出願人】（５０７３１６４７９）サイファージェン バイオシステムズ， インコーポレイテッド (2)
【出願人】（５０７４２１００５）ザ ユニバーシティ オブ ケンタッキー リサーチ ファンデーション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２３日（２００６．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２４６９３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００２５３５
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
【出願人】（５０７３１６４７９）サイファージェン バイオシステムズ， インコーポレイテッド (2)
【出願人】（５０７４２１００５）ザ ユニバーシティ オブ ケンタッキー リサーチ ファンデーション (1)
【Ｆターム（参考）】
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