卵細胞の培養装置及びその方法
【課題】卵細胞の培養に好適な物理的刺激を負荷することのできる簡易構成の培養装置及びこの培養装置を用いた培養方法を提供する。
【解決手段】培養器としてのシャーレ２０を保持する保持部としての揺動プレート３と、この揺動プレート３を揺動させる揺動部としてのモータ１３と、このモータ１３の動作を制御する制御部１５と、を備え、この制御部１５は、シャーレ２０中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、モータ１３を制御して揺動プレート３を揺動させる
【解決手段】培養器としてのシャーレ２０を保持する保持部としての揺動プレート３と、この揺動プレート３を揺動させる揺動部としてのモータ１３と、このモータ１３の動作を制御する制御部１５と、を備え、この制御部１５は、シャーレ２０中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、モータ１３を制御して揺動プレート３を揺動させる
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養装置及び培養方法に関する。さらに詳しくは、生殖医療または再生医療において重要な受精卵の培養に特に適した培養装置及びこの装置を用いた培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物、特に哺乳動物の精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製し、卵割、桑実胚、胞胚、さらには後期胞胚の段階まで培養する技術が開発されている。そして、この卵割から胞胚の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る技術が開発され、家畜における品種改良に用いられ、さらには、ヒトの不妊治療にも応用されている。
【０００３】
しかし、生殖医療、とりわけ不妊治療の一手段として行われている体外受精による妊娠成功率は高くない。この成功率は、約３０年前の英国における世界初の挙児以来、依然として約２５%程度にとどまっており、その成功率の向上が望まれている。不妊治療には、一般的には、卵子の採取（未成熟の場合は、体外成熟が必要となる）、体外受精、受精卵を子宮内に戻す過程が必要である。そして、最も重要な過程は、受精卵を、移植に適した発育段階（４〜８細胞期、胚盤胞期）まで発生させる過程である。
【０００４】
卵細胞成熟効率および妊娠効率を上昇させるために種々の検討が従来よりなされてきた（非特許文献１〜３参照）。
これらの文献で紹介されている技術は、いずれも卵細胞に物理的刺激（メカニカルストレス）を負荷させることにより、その培養促進を図っている。
【０００５】
【非特許文献１】「Gamete Research」誌，ｖｏｌ．１２５，１９８４年，ｐ４９８４
【非特許文献２】「Journal of Experimental Zoology」誌，ｖｏｌ．２６６，１９９３年，ｐ１４６
【非特許文献３】「Ｂｉｏｌｏｇｙ of Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」誌，ｖｏｌ．７５，２００６年，ｐ４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、卵細胞の培養にとっていかなる物理的刺激が最適であるか未だ明確に解明されていない。その結果、物理的刺激を負荷するための好適な装置も上市されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、卵細胞を培養する際に負荷すべき物理的刺激の態様について鋭意検討を重ねてきた結果、卵細胞を充填した培養器を揺動させればよいことを見出し、本発明を想到するに至った。
即ち、この発明の第１の局面の発明は次のように規定される。
培養器を保持する保持部と、
該保持部を揺動させる揺動部と、
該揺動部の揺動を制御する制御部と、を備え、
該制御部は、前記培養器中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、前記揺動部を制御して前記保持部を揺動させる、ことを特徴とする卵細胞の培養装置。
【０００８】
このように構成された卵細胞の培養装置によれば、培養器を保持する保持部を揺動させるという簡易な構成により、培養器内の卵細胞へ物理的刺激を与えることができる。これにより、安価な培養装置を提供可能となる。
【０００９】
保持部を揺動させる態様として、本発明者らによる実験の結果、この発明の第２の局面で規定されるように、前記保持部を一方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、その後反対方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、以下これを繰返す、ことが好ましい（図１参照）。これにより、卵細胞へ回転＋すべりの物理的刺激を与えることができる。
更には、この発明の第３の局面で規定されるように、培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が卵細胞に負荷されるように、保持部を揺動させることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この発明で用いられる培養器は、卵細胞を培養できるものであれば特に限定されない。シャーレの底面に培養液のマイクロドロップを形成し、このマイクロドロップ内に卵細胞を封入するタイプや、チャンバに小径の孔を複数形成し、各孔に培養液を充填してそこへ卵細胞を沈めたものなどを挙げることができる。
図２及び図３に培養装置１の構成を示す。
この培養装置１は揺動プレート３と本体部１１とを備えて成る。
保持部としての揺動プレート３は樹脂製のプレートからなり、その上面に防滑層としてシリコンラバー５が貼付されている。このシリコンラバー５はシャーレ等の培養器２０に吸着する。これにより、揺動プレート３が傾斜しても培養器２０は不動であり、揺動プレート３から滑り落ちることはない。なお、培養器２０の滑落をより確実に防止するためには、培養器２０の底壁を挟む凸部を揺動プレート３に形成することができる。
【００１１】
本体部１１には揺動部としてのモータ１３が収納されており、このモータ１３の回転軸１４に揺動プレート３が固定されている。符号１５は制御部でありモータ１３の回転軸１４の回転を制御する。オペレータは入力部１６を介してモータ１３の制御パラメター（回転角度、回転速度、休止時間等）を入力可能であり、入力された制御パラメターに従って制御部１５はモータ１３の動作を制御する。
図２及び図３に示す例では、揺動プレート３のほぼ中央にモータの回転軸１４が固定され、揺動プレート３はその中央を中心にして揺動する構成を採用しているが、揺動プレート３の端部へモータの回転軸１４を連結してもよい。
また、その可動子が上下方向へ移動可能なリニアモータを一対準備して、その一対の可動子で揺動プレート３の両端を支持し、可動子の上下移動を制御することにより揺動プレートの揺動を制御することもできる。
更には、揺動プレートを下方から複数の柱で支え、各柱の高さを変えることで揺動プレートの揺動を制御することもできる。この場合、少なくとも３つの柱で揺動プレートを支持すれば、揺動プレートを任意の方向へ傾斜させることができる。
【００１２】
上記構成の培養装置によれば、従来の静置培養系の実験器具をそのまま使用できる。具体的には、培養器としてのシャーレ２０上に作製したマイクロドロップ２１、または、4-well培養プレートに卵細胞を添加し、揺動培養を行うことができる。
本培養法は、哺乳類卵細胞の受精前の体外成熟、体外受精、単為発生、体外培養などに適用できる。更には、胚性幹細胞その他の細胞の培養にも適用することができる。
受精卵としては、接合子、卵割、桑実胚、胞胚のいずれの段階のものでもよいが、受精卵以外のライフサイクルにある卵子（例えば、卵胞内卵子、排卵卵子など）を培養容器内で培養し、受精させて用いてもよい。さらに、凍結・融解後の受精卵を用いてもよい。
好ましくは、哺乳動物由来の受精卵が用いられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒヒ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどが挙げられる。
【００１３】
培養液は培養対象の細胞に応じて任意に選択することができる。例えば、ＧＩＢＣＯ社のα―ＭＥＭ、メディカルト社のＩＶＣ、アーバイン社のＨＴＦなどの培養液を用いることができる。培養液中には、さらに培養のための有用物質を含んでいてもよい。例えば、気相中の酸素による過酸化による発生阻害を防止するためのβメルカプトエタノールが挙げられる。培養条件は、受精卵の培養に当業者が通常用いる条件が採用される。例えば温度は、約３７〜３８℃、浸透圧は、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
以下、この発明の実施例について説明する。
【実施例１】
【００１４】
Ｍ１６培地（コスモバイオ社製）の直径１０mm、容量80μlのマイクロドロップを35 mmシャーレ（イワキ社製）上に準備した。そのドロップ内に、C57BL6とICRを掛け合わせたＦ１マウス受精卵８個を入れた。図２及び図３に示す揺動培養装置上にマイクロドロップを含むシャーレを準備し、その移動を実体顕微鏡(ZEISS社製)で観察した。揺動培養装置を最大傾斜角度10度、傾斜変化速度0.37 ｒｐｍ、傾斜保持時間１分間で運転した。即ち、一方へ傾けその傾斜角度が１０度になった時点で１分間停止し、１分経過ごに角速度０．３７ｒｐｍで反対方向へ傾斜させてその傾斜角度が１０度になった時点で１分間停止し、以降これを繰返した。傾斜角を変化させる際には、受精卵の観察された最大移動速度は0.16 mm/secであり、観察された最大移動距離は1.4 mmと計算された。傾斜を維持している際におけるそれらの値は、それぞれ0.006 mm/sec、0.3 mmと概算された。従って、この揺動培養条件では、培地移動による最大0.033 dyne/cm2のずり応力が負荷されていると見積もられた。この負荷量および胚の観察された最大移動速度は、非特許文献３における値1.2 dyne/cm2 および2 mm/secよりも小さいこと、および、文献で記載されている強度のストレスが継続的に負荷されていないことから、卵細胞を死滅させない範囲にあると言える。
【００１５】
幾つかの傾斜角速度を変化させてマウス受精卵の移動を観察し、上記のずり応力を検討した結果を表１に示す。この表では、傾斜角を変化させている際の見積もられた値を記す。いずれの条件においても、卵細胞を死滅させない範囲にあると考えられる。
【表１】
【実施例２】
【００１６】
ブタ卵母細胞‐卵丘細胞塊（OCCs）は、28〜37℃に保温した抗生物質（GIBCO社、）添加0.9％生理食塩水中に浸漬して屠畜場より持ち帰った卵巣表層に存在する直径3〜6mmの中卵胞を10-mlディスポ注射筒（ニプロ社製）に装着した18Ｇ注射針（ニプロ社製）によって卵胞液とともに吸引することでディスポ50-ml遠心管（住友ベークライト社製）中に採取した。OCCsを含む回収細胞片をディスポ50-ml遠心管中でTL-HEPES-PVA培養液にて3回洗浄後、OCCsだけを直径35mmの培養用シャーレ（グライナー社製）内の3mlの修正TL-HEPES-PVA培養液中に採取した。同液でさらに3回洗浄したものを実験に使用した。
【００１７】
成熟基礎培地は、ブタ用完全成熟培地POM（ペプチド研究所製）にβメルカプトエタノール（SIGMA社製）を50μMとなるように添加した液を使用した。成熟培養には4-well培養プレート（NUNC社製）に修正POM を500μlずつ分注した培地を５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器（タバイ社製）内で一晩平衡させたものを使用した。
回収したOCCsは、直径35mmの培養用シャーレ（グライナー社製）内の3mlの修正POM でさらに洗浄した後、ウェル（500μl）あたり45〜50個となるように、一晩平衡させた成熟培地に入れ、その後、純水中にeCG（1,000iu/ml濃度）、ｈCG（1,000iu/ml濃度）およびジブチリルサイクリックAMP（100ｍM）を溶解した液をウェル（500μl）あたり5μl添加後、５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内に入れることで成熟培養を開始した。
【００１８】
実験区の揺動培養区は、５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内に設置した揺動培養器の揺動プレート上にOCCｓを入れた4-well培養プレートを置いた。揺動条件は、揺動プレートが20度の傾きを1分間維持した後に、ゆっくり反転し、逆に20度傾く状態を1分間維持することを繰り返す条件下で実施した。プレートが傾く速度は、約0.1rpmであった。
対照区の静置培養区は、５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内の揺動培養器と同じトレイ上に静置することとした。
OCCｓは、これらの条件下で20時間培養後、卵丘細胞塊の構造を壊さないように注意しながら、eCG（1,000iu/ml濃度）、ｈCG（1,000iu/ml濃度）およびジブチリルサイクリックAMP（100ｍM）を添加していない新鮮な修正POM3ml（直径35mmの培養用シャーレ内）で3回洗浄後に、4-well培養プレートにeCG（1,000iu/ml濃度）、ｈCG（1,000iu/ml濃度）およびジブチリルサイクリックAMP（100ｍM）を添加していない新鮮な修正POM を500μlずつ分注した培地（５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの）に移し、同様の培養条件下でさらに24時間培養した。
【００１９】
eCG（1,000iu/ml濃度）、ｈCG（1,000iu/ml濃度）およびジブチリルサイクリックAMP（100ｍM）を添加した最初の20時間の培養後に、それぞれの区のOCCｓの一部を実体顕微鏡（ニコン社製）下でデジタルカメラ（ニコン社製）にて撮影し、同倍率で撮影したマイクロメーター（ニコン社製）の目盛をもとにOCCｓの直径を測定した。一つのOCCｓの直径は、ｘ軸およびｙ軸方向の直径を測定した数値の平均値とした。（図４）
図５に、平均卵丘径および平均卵母細胞径を測定したグラフを示す。静置培養区と比較して、揺動培養区では、平均卵丘径は増加しており、平均卵母細胞径は静置培養区とほぼ同じであった。従って、揺動培養によって卵丘細胞膨化が促進されることが示唆された。
【実施例３】
【００２０】
成熟培養を終えたOCCｓを修正TL-HEPES-PVA 中に0.1%ヒアルロニダーゼ（SIGMA社製）を含む液中でピペッティングすることによって卵丘細胞を除去し、卵母細胞を裸化した。卵母細胞は、純水中に250.3mMソルビトール、0.3mM HEPES、0.2％(w/v)牛血清アルブミン、0.1mM Ca-lactate、0.1mM グルタチオンを含む融合培地中で、1mm間隔の白金電極間に卵母細胞を置き、それらの電極間に5Vの交流電流を5秒間付与後、100Vの直流電流を30μ秒間付与し、その1分後に再度100Vの直流電流を30μ秒間付与することで電気的に卵母細胞を活性化した（ＢＴＸ社製、ECM2001Mを使用）。
その後、それらの卵母細胞を2.2μg/ml サイトカラシンＢを含むＮＣＳＵ３７培養液500μl（4-well培養プレート中、５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの）に移して2時間培養することで、活性化された卵の第２極体の放出を抑制して2倍体化した。
【００２１】
その後、直径35mmの培養用シャーレ（グライナー社製）内の3mlのサイトカラシンＢを含まない修正ＮＣＳＵ３７培養液にメルカプトエタノール（SIGMA社製）を50μMとなるように添加した液（５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの）中で3回洗浄後、4-well培養プレート（NUNC社製）に500μlずつ分注した新鮮な同液（５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの）に移し、成熟培養と同じ培養条件下で6日間培養を継続し、初期発生の状況を実体顕微鏡（ニコン社製）下で観察した。
その結果を表２に示す。揺動培養区では卵割率および胚盤胞到達率が上昇した。χ2検定により有意確率を計算したところ、有意差があると判断した。
【表２】
Pab<0.01,
Pcd<0.05 (χ2検定)
【実施例４】
【００２２】
ヒト未受精卵の通常体外受精法に関して、揺動培養器有無条件下で検討した。4-well培養プレート（NUNC社製）に培地（HTF medium、Irvine Scientific社製）を添加し、未受精卵をいれた。５％二酸化炭素炭酸、5%の酸素、95％空気の気相条件、37℃に保たれているガス培養器（アステック社製）内の培養条件下で、未受精卵の前培養３時間行った。精子濃度が10万個/mlになるように洗浄精液を添加した。実験区では、図２及び図３に示した揺動培養装置のポリカーボネ−ト製皿の上に上記の4-well培養プレートを設置し、傾斜角度10度、傾斜変化速度0.2ｒｐｍ、傾斜保持時間なしで運転した。対照区では、上記のチャンバーを恒温器内に静置した。媒精後１８から２０時間後に、前核形成を実体顕微鏡（Leica社製）で確認した。その結果を表３に示す。統計処理後、有意確率が0.05より大きかったため、有意差は認められなかったものの、受精率が上昇したことが確認された。
【表３】
受精率は （２前核形成胚数）x100/（（２前核形成胚数）＋（前核非形成胚数））で計算した。有意確率=0.859
【実施例５】
【００２３】
ヒト体外受精胚成熟を揺動培養器有無条件下で比較した。4-well培養プレート（ＮＵＮＣ社製）に0.8 mlの培地(Blast Ａssist、Medicult社製）を添加し、５％二酸化炭素炭酸、5%の酸素、95％空気の気相条件、37℃に保たれているガス培養器（アステック社製）内の培養条件下で受精が確認された胚を培養した。揺動培養区では、図２及び図３に示す揺動培養装置を傾斜角度10度、傾斜変化速度3.3 ｒｐｍ、傾斜保持時間１分間で運転した。対照区では、上記のチャンバーを恒温器内に静置した。受精確認から４日後にその胚の成熟具合を実態顕微鏡（Leica社製）で確認した。その結果を表４に示す。有意差は認められなかったものの、胚盤胞到達率が上昇したことが示された。
【表４】
有意確率=0.70
【００２４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】この発明の培養装置の動作と卵細胞に負荷される物理的刺激の関係を示す図である。
【図２】この発明の実施例の培養装置の正面図である。
【図３】同じく側面図である。
【図４】実施例の２のブタの卵母細胞‐卵丘細胞塊である。
【図５】同じくブタ体外成熟における平均卵丘径および平均卵母細胞径を測定したグラフである。
【００２６】
１ 培養装置、３ 揺動プレート、１３ モータ、１５ 制御部、２０ 培養器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養装置及び培養方法に関する。さらに詳しくは、生殖医療または再生医療において重要な受精卵の培養に特に適した培養装置及びこの装置を用いた培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物、特に哺乳動物の精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製し、卵割、桑実胚、胞胚、さらには後期胞胚の段階まで培養する技術が開発されている。そして、この卵割から胞胚の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る技術が開発され、家畜における品種改良に用いられ、さらには、ヒトの不妊治療にも応用されている。
【０００３】
しかし、生殖医療、とりわけ不妊治療の一手段として行われている体外受精による妊娠成功率は高くない。この成功率は、約３０年前の英国における世界初の挙児以来、依然として約２５%程度にとどまっており、その成功率の向上が望まれている。不妊治療には、一般的には、卵子の採取（未成熟の場合は、体外成熟が必要となる）、体外受精、受精卵を子宮内に戻す過程が必要である。そして、最も重要な過程は、受精卵を、移植に適した発育段階（４〜８細胞期、胚盤胞期）まで発生させる過程である。
【０００４】
卵細胞成熟効率および妊娠効率を上昇させるために種々の検討が従来よりなされてきた（非特許文献１〜３参照）。
これらの文献で紹介されている技術は、いずれも卵細胞に物理的刺激（メカニカルストレス）を負荷させることにより、その培養促進を図っている。
【０００５】
【非特許文献１】「Gamete Research」誌，ｖｏｌ．１２５，１９８４年，ｐ４９８４
【非特許文献２】「Journal of Experimental Zoology」誌，ｖｏｌ．２６６，１９９３年，ｐ１４６
【非特許文献３】「Ｂｉｏｌｏｇｙ of Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」誌，ｖｏｌ．７５，２００６年，ｐ４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、卵細胞の培養にとっていかなる物理的刺激が最適であるか未だ明確に解明されていない。その結果、物理的刺激を負荷するための好適な装置も上市されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、卵細胞を培養する際に負荷すべき物理的刺激の態様について鋭意検討を重ねてきた結果、卵細胞を充填した培養器を揺動させればよいことを見出し、本発明を想到するに至った。
即ち、この発明の第１の局面の発明は次のように規定される。
培養器を保持する保持部と、
該保持部を揺動させる揺動部と、
該揺動部の揺動を制御する制御部と、を備え、
該制御部は、前記培養器中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、前記揺動部を制御して前記保持部を揺動させる、ことを特徴とする卵細胞の培養装置。
【０００８】
このように構成された卵細胞の培養装置によれば、培養器を保持する保持部を揺動させるという簡易な構成により、培養器内の卵細胞へ物理的刺激を与えることができる。これにより、安価な培養装置を提供可能となる。
【０００９】
保持部を揺動させる態様として、本発明者らによる実験の結果、この発明の第２の局面で規定されるように、前記保持部を一方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、その後反対方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、以下これを繰返す、ことが好ましい（図１参照）。これにより、卵細胞へ回転＋すべりの物理的刺激を与えることができる。
更には、この発明の第３の局面で規定されるように、培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が卵細胞に負荷されるように、保持部を揺動させることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この発明で用いられる培養器は、卵細胞を培養できるものであれば特に限定されない。シャーレの底面に培養液のマイクロドロップを形成し、このマイクロドロップ内に卵細胞を封入するタイプや、チャンバに小径の孔を複数形成し、各孔に培養液を充填してそこへ卵細胞を沈めたものなどを挙げることができる。
図２及び図３に培養装置１の構成を示す。
この培養装置１は揺動プレート３と本体部１１とを備えて成る。
保持部としての揺動プレート３は樹脂製のプレートからなり、その上面に防滑層としてシリコンラバー５が貼付されている。このシリコンラバー５はシャーレ等の培養器２０に吸着する。これにより、揺動プレート３が傾斜しても培養器２０は不動であり、揺動プレート３から滑り落ちることはない。なお、培養器２０の滑落をより確実に防止するためには、培養器２０の底壁を挟む凸部を揺動プレート３に形成することができる。
【００１１】
本体部１１には揺動部としてのモータ１３が収納されており、このモータ１３の回転軸１４に揺動プレート３が固定されている。符号１５は制御部でありモータ１３の回転軸１４の回転を制御する。オペレータは入力部１６を介してモータ１３の制御パラメター（回転角度、回転速度、休止時間等）を入力可能であり、入力された制御パラメターに従って制御部１５はモータ１３の動作を制御する。
図２及び図３に示す例では、揺動プレート３のほぼ中央にモータの回転軸１４が固定され、揺動プレート３はその中央を中心にして揺動する構成を採用しているが、揺動プレート３の端部へモータの回転軸１４を連結してもよい。
また、その可動子が上下方向へ移動可能なリニアモータを一対準備して、その一対の可動子で揺動プレート３の両端を支持し、可動子の上下移動を制御することにより揺動プレートの揺動を制御することもできる。
更には、揺動プレートを下方から複数の柱で支え、各柱の高さを変えることで揺動プレートの揺動を制御することもできる。この場合、少なくとも３つの柱で揺動プレートを支持すれば、揺動プレートを任意の方向へ傾斜させることができる。
【００１２】
上記構成の培養装置によれば、従来の静置培養系の実験器具をそのまま使用できる。具体的には、培養器としてのシャーレ２０上に作製したマイクロドロップ２１、または、4-well培養プレートに卵細胞を添加し、揺動培養を行うことができる。
本培養法は、哺乳類卵細胞の受精前の体外成熟、体外受精、単為発生、体外培養などに適用できる。更には、胚性幹細胞その他の細胞の培養にも適用することができる。
受精卵としては、接合子、卵割、桑実胚、胞胚のいずれの段階のものでもよいが、受精卵以外のライフサイクルにある卵子（例えば、卵胞内卵子、排卵卵子など）を培養容器内で培養し、受精させて用いてもよい。さらに、凍結・融解後の受精卵を用いてもよい。
好ましくは、哺乳動物由来の受精卵が用いられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒヒ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどが挙げられる。
【００１３】
培養液は培養対象の細胞に応じて任意に選択することができる。例えば、ＧＩＢＣＯ社のα―ＭＥＭ、メディカルト社のＩＶＣ、アーバイン社のＨＴＦなどの培養液を用いることができる。培養液中には、さらに培養のための有用物質を含んでいてもよい。例えば、気相中の酸素による過酸化による発生阻害を防止するためのβメルカプトエタノールが挙げられる。培養条件は、受精卵の培養に当業者が通常用いる条件が採用される。例えば温度は、約３７〜３８℃、浸透圧は、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
以下、この発明の実施例について説明する。
【実施例１】
【００１４】
Ｍ１６培地（コスモバイオ社製）の直径１０mm、容量80μlのマイクロドロップを35 mmシャーレ（イワキ社製）上に準備した。そのドロップ内に、C57BL6とICRを掛け合わせたＦ１マウス受精卵８個を入れた。図２及び図３に示す揺動培養装置上にマイクロドロップを含むシャーレを準備し、その移動を実体顕微鏡(ZEISS社製)で観察した。揺動培養装置を最大傾斜角度10度、傾斜変化速度0.37 ｒｐｍ、傾斜保持時間１分間で運転した。即ち、一方へ傾けその傾斜角度が１０度になった時点で１分間停止し、１分経過ごに角速度０．３７ｒｐｍで反対方向へ傾斜させてその傾斜角度が１０度になった時点で１分間停止し、以降これを繰返した。傾斜角を変化させる際には、受精卵の観察された最大移動速度は0.16 mm/secであり、観察された最大移動距離は1.4 mmと計算された。傾斜を維持している際におけるそれらの値は、それぞれ0.006 mm/sec、0.3 mmと概算された。従って、この揺動培養条件では、培地移動による最大0.033 dyne/cm2のずり応力が負荷されていると見積もられた。この負荷量および胚の観察された最大移動速度は、非特許文献３における値1.2 dyne/cm2 および2 mm/secよりも小さいこと、および、文献で記載されている強度のストレスが継続的に負荷されていないことから、卵細胞を死滅させない範囲にあると言える。
【００１５】
幾つかの傾斜角速度を変化させてマウス受精卵の移動を観察し、上記のずり応力を検討した結果を表１に示す。この表では、傾斜角を変化させている際の見積もられた値を記す。いずれの条件においても、卵細胞を死滅させない範囲にあると考えられる。
【表１】
【実施例２】
【００１６】
ブタ卵母細胞‐卵丘細胞塊（OCCs）は、28〜37℃に保温した抗生物質（GIBCO社、）添加0.9％生理食塩水中に浸漬して屠畜場より持ち帰った卵巣表層に存在する直径3〜6mmの中卵胞を10-mlディスポ注射筒（ニプロ社製）に装着した18Ｇ注射針（ニプロ社製）によって卵胞液とともに吸引することでディスポ50-ml遠心管（住友ベークライト社製）中に採取した。OCCsを含む回収細胞片をディスポ50-ml遠心管中でTL-HEPES-PVA培養液にて3回洗浄後、OCCsだけを直径35mmの培養用シャーレ（グライナー社製）内の3mlの修正TL-HEPES-PVA培養液中に採取した。同液でさらに3回洗浄したものを実験に使用した。
【００１７】
成熟基礎培地は、ブタ用完全成熟培地POM（ペプチド研究所製）にβメルカプトエタノール（SIGMA社製）を50μMとなるように添加した液を使用した。成熟培養には4-well培養プレート（NUNC社製）に修正POM を500μlずつ分注した培地を５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器（タバイ社製）内で一晩平衡させたものを使用した。
回収したOCCsは、直径35mmの培養用シャーレ（グライナー社製）内の3mlの修正POM でさらに洗浄した後、ウェル（500μl）あたり45〜50個となるように、一晩平衡させた成熟培地に入れ、その後、純水中にeCG（1,000iu/ml濃度）、ｈCG（1,000iu/ml濃度）およびジブチリルサイクリックAMP（100ｍM）を溶解した液をウェル（500μl）あたり5μl添加後、５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内に入れることで成熟培養を開始した。
【００１８】
実験区の揺動培養区は、５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内に設置した揺動培養器の揺動プレート上にOCCｓを入れた4-well培養プレートを置いた。揺動条件は、揺動プレートが20度の傾きを1分間維持した後に、ゆっくり反転し、逆に20度傾く状態を1分間維持することを繰り返す条件下で実施した。プレートが傾く速度は、約0.1rpmであった。
対照区の静置培養区は、５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内の揺動培養器と同じトレイ上に静置することとした。
OCCｓは、これらの条件下で20時間培養後、卵丘細胞塊の構造を壊さないように注意しながら、eCG（1,000iu/ml濃度）、ｈCG（1,000iu/ml濃度）およびジブチリルサイクリックAMP（100ｍM）を添加していない新鮮な修正POM3ml（直径35mmの培養用シャーレ内）で3回洗浄後に、4-well培養プレートにeCG（1,000iu/ml濃度）、ｈCG（1,000iu/ml濃度）およびジブチリルサイクリックAMP（100ｍM）を添加していない新鮮な修正POM を500μlずつ分注した培地（５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの）に移し、同様の培養条件下でさらに24時間培養した。
【００１９】
eCG（1,000iu/ml濃度）、ｈCG（1,000iu/ml濃度）およびジブチリルサイクリックAMP（100ｍM）を添加した最初の20時間の培養後に、それぞれの区のOCCｓの一部を実体顕微鏡（ニコン社製）下でデジタルカメラ（ニコン社製）にて撮影し、同倍率で撮影したマイクロメーター（ニコン社製）の目盛をもとにOCCｓの直径を測定した。一つのOCCｓの直径は、ｘ軸およびｙ軸方向の直径を測定した数値の平均値とした。（図４）
図５に、平均卵丘径および平均卵母細胞径を測定したグラフを示す。静置培養区と比較して、揺動培養区では、平均卵丘径は増加しており、平均卵母細胞径は静置培養区とほぼ同じであった。従って、揺動培養によって卵丘細胞膨化が促進されることが示唆された。
【実施例３】
【００２０】
成熟培養を終えたOCCｓを修正TL-HEPES-PVA 中に0.1%ヒアルロニダーゼ（SIGMA社製）を含む液中でピペッティングすることによって卵丘細胞を除去し、卵母細胞を裸化した。卵母細胞は、純水中に250.3mMソルビトール、0.3mM HEPES、0.2％(w/v)牛血清アルブミン、0.1mM Ca-lactate、0.1mM グルタチオンを含む融合培地中で、1mm間隔の白金電極間に卵母細胞を置き、それらの電極間に5Vの交流電流を5秒間付与後、100Vの直流電流を30μ秒間付与し、その1分後に再度100Vの直流電流を30μ秒間付与することで電気的に卵母細胞を活性化した（ＢＴＸ社製、ECM2001Mを使用）。
その後、それらの卵母細胞を2.2μg/ml サイトカラシンＢを含むＮＣＳＵ３７培養液500μl（4-well培養プレート中、５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの）に移して2時間培養することで、活性化された卵の第２極体の放出を抑制して2倍体化した。
【００２１】
その後、直径35mmの培養用シャーレ（グライナー社製）内の3mlのサイトカラシンＢを含まない修正ＮＣＳＵ３７培養液にメルカプトエタノール（SIGMA社製）を50μMとなるように添加した液（５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの）中で3回洗浄後、4-well培養プレート（NUNC社製）に500μlずつ分注した新鮮な同液（５％二酸化炭素炭酸、95％空気の気相条件、39℃に保たれているガス培養器内で一晩平衡したもの）に移し、成熟培養と同じ培養条件下で6日間培養を継続し、初期発生の状況を実体顕微鏡（ニコン社製）下で観察した。
その結果を表２に示す。揺動培養区では卵割率および胚盤胞到達率が上昇した。χ2検定により有意確率を計算したところ、有意差があると判断した。
【表２】
Pab<0.01,
Pcd<0.05 (χ2検定)
【実施例４】
【００２２】
ヒト未受精卵の通常体外受精法に関して、揺動培養器有無条件下で検討した。4-well培養プレート（NUNC社製）に培地（HTF medium、Irvine Scientific社製）を添加し、未受精卵をいれた。５％二酸化炭素炭酸、5%の酸素、95％空気の気相条件、37℃に保たれているガス培養器（アステック社製）内の培養条件下で、未受精卵の前培養３時間行った。精子濃度が10万個/mlになるように洗浄精液を添加した。実験区では、図２及び図３に示した揺動培養装置のポリカーボネ−ト製皿の上に上記の4-well培養プレートを設置し、傾斜角度10度、傾斜変化速度0.2ｒｐｍ、傾斜保持時間なしで運転した。対照区では、上記のチャンバーを恒温器内に静置した。媒精後１８から２０時間後に、前核形成を実体顕微鏡（Leica社製）で確認した。その結果を表３に示す。統計処理後、有意確率が0.05より大きかったため、有意差は認められなかったものの、受精率が上昇したことが確認された。
【表３】
受精率は （２前核形成胚数）x100/（（２前核形成胚数）＋（前核非形成胚数））で計算した。有意確率=0.859
【実施例５】
【００２３】
ヒト体外受精胚成熟を揺動培養器有無条件下で比較した。4-well培養プレート（ＮＵＮＣ社製）に0.8 mlの培地(Blast Ａssist、Medicult社製）を添加し、５％二酸化炭素炭酸、5%の酸素、95％空気の気相条件、37℃に保たれているガス培養器（アステック社製）内の培養条件下で受精が確認された胚を培養した。揺動培養区では、図２及び図３に示す揺動培養装置を傾斜角度10度、傾斜変化速度3.3 ｒｐｍ、傾斜保持時間１分間で運転した。対照区では、上記のチャンバーを恒温器内に静置した。受精確認から４日後にその胚の成熟具合を実態顕微鏡（Leica社製）で確認した。その結果を表４に示す。有意差は認められなかったものの、胚盤胞到達率が上昇したことが示された。
【表４】
有意確率=0.70
【００２４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】この発明の培養装置の動作と卵細胞に負荷される物理的刺激の関係を示す図である。
【図２】この発明の実施例の培養装置の正面図である。
【図３】同じく側面図である。
【図４】実施例の２のブタの卵母細胞‐卵丘細胞塊である。
【図５】同じくブタ体外成熟における平均卵丘径および平均卵母細胞径を測定したグラフである。
【００２６】
１ 培養装置、３ 揺動プレート、１３ モータ、１５ 制御部、２０ 培養器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養器を保持する保持部と、
該保持部を揺動させる揺動部と、
該揺動部の動作を制御する制御部と、を備え、
該制御部は、前記培養器中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、前記揺動部を制御して前記保持部を揺動させる、ことを特徴とする卵細胞の培養装置。
【請求項２】
前記制御部は、前記保持部を一方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、その後反対方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、以下これを繰返す、ことを特徴とする請求項１に記載の卵細胞の培養装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が前記卵細胞に負荷されるように、前記保持部を揺動させることを特徴とする請求項１又は２に記載の卵細胞の培養装置。
【請求項４】
前記保持部は板状であり、その表面に防滑層が形成され、該防滑層の上に載置された前記培養器は、前記保持部が傾斜状態においても、前記保持部に対して不動である、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の卵細胞の培養装置。
【請求項５】
卵細胞を充填した培養器を保持部に保持し、該保持部を揺動させることにより前記卵細胞へ物理的刺激を負荷させる、ことを特徴とする卵細胞の培養方法。
【請求項６】
前記保持部を一方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、その後反対方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、以下これを繰返す、ことを特徴とする請求項５に記載の卵細胞の培養方法。
【請求項７】
前記培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が前記卵細胞に負荷されるように、前記保持部を揺動させることを特徴とする請求項５又は６に記載の卵細胞の培養方法。
【請求項１】
培養器を保持する保持部と、
該保持部を揺動させる揺動部と、
該揺動部の動作を制御する制御部と、を備え、
該制御部は、前記培養器中の卵細胞へ物理的刺激を負荷させるように、前記揺動部を制御して前記保持部を揺動させる、ことを特徴とする卵細胞の培養装置。
【請求項２】
前記制御部は、前記保持部を一方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、その後反対方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、以下これを繰返す、ことを特徴とする請求項１に記載の卵細胞の培養装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が前記卵細胞に負荷されるように、前記保持部を揺動させることを特徴とする請求項１又は２に記載の卵細胞の培養装置。
【請求項４】
前記保持部は板状であり、その表面に防滑層が形成され、該防滑層の上に載置された前記培養器は、前記保持部が傾斜状態においても、前記保持部に対して不動である、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の卵細胞の培養装置。
【請求項５】
卵細胞を充填した培養器を保持部に保持し、該保持部を揺動させることにより前記卵細胞へ物理的刺激を負荷させる、ことを特徴とする卵細胞の培養方法。
【請求項６】
前記保持部を一方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、その後反対方向へ傾斜させ、その後一定時間静止させ、以下これを繰返す、ことを特徴とする請求項５に記載の卵細胞の培養方法。
【請求項７】
前記培養器中の卵細胞が2 mm/sec以下の速度で移動し、かつ1.2 dynes/cm2以下のずり応力が前記卵細胞に負荷されるように、前記保持部を揺動させることを特徴とする請求項５又は６に記載の卵細胞の培養方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２７９７３（Ｐ２００９−２７９７３Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９４９６８（Ｐ２００７−１９４９６８）
【出願日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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