双極性障害と統合失調症の判別方法
【課題】患者血液を試料として高い精度で客観的に統合失調症と双極性障害とを区別して診断できる手段を提供すること。
【解決手段】統合失調症と双極性障害の判別方法は、生体から分離された試料における、特定の１２種類の遺伝子群の発現量を指標とする。
【効果】高い精度で客観的に統合失調症と双極性障害とを区別して診断することができる。検出の感度（真陽性率）及び特異度（真陰性率）が両方とも８０％以上となることが実際の多数の検体を用いて確認された。血液を検体として利用できるので、簡便に実施することができる。
【解決手段】統合失調症と双極性障害の判別方法は、生体から分離された試料における、特定の１２種類の遺伝子群の発現量を指標とする。
【効果】高い精度で客観的に統合失調症と双極性障害とを区別して診断することができる。検出の感度（真陽性率）及び特異度（真陰性率）が両方とも８０％以上となることが実際の多数の検体を用いて確認された。血液を検体として利用できるので、簡便に実施することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、双極性障害と統合失調症を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本国内における統合失調症の発症率は人口の約０．８％であり、主に青年期に発症する。該疾患の予後は多様である。概ね全体の1/3の患者については、顕著で継続的な改善をみる。1/3はいくらか改善するが，間欠性再発と残遺性障害を残す。残りの1/3は重篤で，永久的に能力が失われ、社会的機能遂行に支障をきたす重大な精神疾患である。
【０００３】
双極性障害（躁鬱病）は、統合失調症と並び発症率の高い精神疾患であり、躁状態とうつ状態を繰り返す。双極性障害の生涯有病率は0.2〜1.6%といわれており、再発することが多く、生涯にわたる薬物投与による治療が必要となる場合が多いといわれている。
【０００４】
双極性障害と統合失調症のいずれも、早期に適切な治療を行うことが重要である。従来、これらの精神疾患の診断は、米国精神医学会(APA)が制定した精神疾患の診断・統計マニュアルであるDSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV)による包括的評価に基いて下される。しかし、このような方法は、診断医の主観や技量に大きく依存する。双極性障害の躁状態が統合失調症の陽性症状に、双極性障害のうつ状態が統合失調症の陰性症状に類似することから、ときに該疾患を客観的かつ早期に診断することは困難であり、適切な治療が施されずに重症化するケースも少なくない。
【０００５】
統合失調症や双極性障害の生物学的マーカー等を用いた客観的な診断方法が確立すれば、早期診断、早期治療が可能になり、重症化の回避や治癒率の向上が可能になる。現在までに報告されている、生物学的マーカーを用いた診断方法としては、例えば、上皮細胞成長因子の血清中濃度を指標として精神分裂病（統合失調症）を診断する方法（特許文献１）や、血液を試料として用い、特定の遺伝子の発現量を指標とする方法がある（特許文献２）。しかしながら、これらの方法では、統合失調症と双極性障害とを精度良く区別して診断することはできない。
【０００６】
【特許文献１】特許第3706913号公報
【特許文献２】特開2004-135667号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、患者血液を試料として高い精度で客観的に統合失調症と双極性障害とのいずれであるかを診断することができる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、血液を試料として用い、約55000種類の遺伝子の発現量を双極性患者と統合失調症患者の間で比較し、発現量が有意に変動する遺伝子を選び、さらに後述する本願発明者らが独自に考え出した基準でかなりの数の分類予測候補遺伝子を絞り込み、これら遺伝子群を搭載した低コストで汎用性の高いマイクロアレイを作製し、これを用いて測定した発現データをニューラルネットワークを駆使した変数増加法とcross validation法にかけて分類予測アルゴリズムを構築し、実際に多数の検体を用いて検出の感度（真陽性率）及び特異度（真陰性率）が８０％以上になるアルゴリズムを見出すことにより、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、生体から分離された試料における下記(1)〜(12)の遺伝子群の発現量を指標とする、双極性障害と統合失調症の判別方法を提供する。
(1) FLJ21881（配列番号1）
(2) DLGAP3（配列番号2）
(3) FAM20A（配列番号3）
(4) MAX（配列番号4）
(5) ZNF74（配列番号5）
(6) DIAPH2（配列番号6）
(7) CR1（配列番号7）
(8) RAD54B（配列番号8）
(9) GPR30（配列番号9）
(10) SCD5（配列番号10）
(11) IMAGE:5785888（配列番号11）
(12) INSL3（配列番号12）
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、双極性障害と統合失調症とのいずれであるかを高い精度で客観的に診断できる手段が初めて提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上記の通り、本発明は、(1)〜(12)の遺伝子群の発現量を指標とする。各遺伝子の発現量を測定する試料は、生体から分離された試料であれば特に限定されるわけではないが、下記実施例で詳述するとおり、上記遺伝子群は、血液を試料として用いて選定されたものであるので、血液を試料とすることが好ましい。なお、上記遺伝子群には、統合失調症患者において双極性障害患者よりも発現量が増大しているものも減少しているものも含まれる。また、下記実施例において、検出の感度（真陽性率）及び特異度（真陰性率）が８０％以上となることが確認された上記１２種類の遺伝子のみの発現量に基づいて判定することが好ましい。なお、下記実施例に具体的に記載するように、測定の精度を確保する等のために、正規化のための種々の遺伝子等の他の遺伝子の発現量を同時に測定することは好ましいことであり、「上記１２種類の遺伝子のみの発現量に基づく」とは、上記１２種類の遺伝子のみの発現量を分類予測の直接的な変数として用いるという意味である。また、感度を表わす真陽性率は、下記表１におけるa/(a+b)、特異度を表わす真陰性率は、１−偽陽性＝d/(c+d)である。また、正答率は、(a+d)/(a+b+c+d)である。
【００１２】
【表１】
【００１３】
上記１２種類の遺伝子の配列は、上記した各配列番号に記載されているが、各遺伝子のGenBankアクセション番号、遺伝子産物、下記実施例で用いた、各遺伝子の発現量の測定に用いたプローブ番号及びその配列番号を下記表２に示す。
【００１４】
【表２】
【００１５】
試料中の各遺伝子の発現量の測定自体は公知の方法により行なうことができる。測定方法は、特に限定されないが、各遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ、好ましくはDNAプローブが固定化されたDNAアレイを用いる方法が簡便で好ましい。例えば、下記実施例に具体的に記載するように、血液から全mRNAを抽出し、抽出したmRNAから、ビオチン等で標識されたcRNAを調製し、各遺伝子由来のcRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定化されたアレイにcRNAを施してcRNAとプローブとをハイブリダイズさせ、アレイを洗浄後、基板上に残留する標識量を測定することによりcRNA量、ひいてはmRNA量、すなわち遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１６】
なお、固定化されるプローブは、cRNAと特異的にハイブリダイズするサイズを有するものであり、通常、１８塩基〜５０塩基、好ましくは２０塩基〜４０塩基程度のサイズを有する。また、固定化するプローブは、それがハイブリダイズするRNAの領域と完全に相補的であることが好ましいが、下記実施例に具体的に記載するような、DNAアレイを用いる際の通常のハイブリダイズ条件下でハイブリダイズするものであれば少数（通常、１個か２個）のミスマッチがあっても許容できる。従って、遺伝子に天然のSNPが生じている場合でも、同じDNAアレイを用いて測定可能である。
【００１７】
下記実施例では、前記遺伝子群の発現量は、配列番号18、配列番号44、配列番号61、配列番号90、配列番号97、配列番号120、配列番号125、配列番号161、配列番号167、配列番号195、配列番号218及び配列番号220に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて測定されており、これらのプローブを固定化したDNAアレイを好ましく利用することができる。なお、これらのプローブを用いた測定値によると、１２個のプローブのうちの10個は統合失調症と健常者との間で発現量に有意差（p<0.05、t検定）が認められるプローブであった。
【００１８】
上記遺伝子群の発現量に基づく判定は、基本的には前記遺伝子群の発現量を、あらかじめ測定した、既知の統合失調症患者及び双極性障害患者における前記遺伝子群の発現量と対比することにより行われる。この対比は、既知の統合失調症患者及び双極性障害患者における前記遺伝子群の発現量を用いて変数増加法により学習させたニューラルネットワークにより行なうことが好ましい。構築した学習済みのニューラルネットワーク（構築方法は後述）に測定した上記１２種類の遺伝子の発現量を入力し、該ニューラルネットワークに分類される群の予測確率を出力させ、この予測確率を判定基準として統合失調症か双極性障害かを判別することができる。
【００１９】
あるいはまた、上記対比は、重回帰分析により行なうことも好ましい。測定した上記１２種類の遺伝子の発現量を説明変数とし、既知の統合失調症患者及び双極性障害患者における前記遺伝子群の発現量を重回帰分析すると、予測式（重回帰式）を得ることができる。得られた予測式に、疾患を判別すべき被検者における上記遺伝子群の発現量を入力して従属変数を求め、この従属変数の数値を既知の統合失調症患者及び双極性障害患者の従属変数と対比することで、該被検者が統合失調症か双極性障害かを判別することができる。この対比は、例えば、既知の統合失調症患者群と双極性障害患者群の各患者について計算された従属変数をもとに、両群を好ましく分類できる従属変数の値をカットオフ値として定め、被検者の従属変数をこのカットオフ値と対比することにより行なうことができる。例えば、統合失調症患者で従属変数が大きくなるように設定して発現量を分析した場合、被検者について計算された従属変数の数値がカットオフ値よりも大きければ、該被検者は統合失調症であると予測することができる。カットオフ値は、既知の統合失調症患者及び双極性障害患者について計算された従属変数をもとに、常法の統計処理により適宜定めることができる。重回帰分析の手法自体は周知であり、重回帰分析を行なうソフトウェア等も種々のものが公知で、市販品も多く存在する。本発明ではいずれのソフトウェアを用いてもよい。なお、予測式は、既知の患者についての分析を一度行なえば定めることができるので、実施の都度既知の患者群についての分析を行なう必要はなく、一旦得られた予測式をその後に実施する際にも用いることができる。
【００２０】
なお、本発明において「重回帰分析」といった場合には、得られた重回帰式を用いて試料の従属変数を求める工程を含む分析方法を広く包含し、重回帰式を得るための分析工程は必ずしも含まれない。従って、上記したように、既に求められた重回帰式を用いて疾患の判別を行う方法であれば、本発明にいう「重回帰分析により対比を行なう判別方法」に包含される。
【００２１】
本発明で用いる発現量の測定値は、下記実施例に記載される通り、測定されるシグナル強度をグローバルノーマライゼーション(global normalization)法により正規化したものであることが好ましい。ここで、グローバルノーマライゼーション法とは、DNAマイクロアレイ上に搭載した全遺伝子の発現量の中央値を求め、この中央値で各遺伝子の発現量を除することで相対的発現量を算出する方法である。
【００２２】
ニューラルネットワークを用いて本発明の方法を実施する場合、ニューラルネットワーク自体は周知であり、市販のニューラルネットワークを用いることができる。もっとも、ニューラルネットワーク自体は市販品を利用できるが、本発明では、ニューラルネットワークに学習させるデータに特徴があり、いかなるデータを学習させることにより感度（真陽性率）及び特異度（真陰性率）の両者を８０％以上にできるかは工夫が必要である（後述）。
【００２３】
ニューラルネットワークを用いた分類予測モデルの最適モデルは、例えば下記実施例に詳述する方法により構築することができる。簡単に説明すると、例えば、次のようにして最適モデルを決定することができる。まず、多数の統合失調症患者、双極性障害患者及び健常者から採取した試料を用い、種々の遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量は、上記の通り、DNAマイクロアレイを用いて行なうことができる。下記実施例では、約55000種類のヒト遺伝子のDNAプローブが搭載された市販のDNAマイクロアレイを用いた。
【００２４】
次に、DNAマイクロアレイを用いて測定した発現量をデータクレンジングする。ここで、データクレンジングは、例えば、全体の発現量の30%tile未満の遺伝子のプローブや98%tile以上の遺伝子のプローブを除外することにより行なうことができる。
【００２５】
多数の統合失調症患者及び双極性障害患者のDNAマイクロアレイのデータを、学習例と、学習例と独立した試験例とに分け、学習例をニューラルネットワークに学習させ、構築された分類予測モデルによりどの程度の感度及び特異度が達成されるかを試験例を用いて算出、評価を行うHold out cross validation法により構築した。分類予測モデル構築には、ニューラルネットワークのパラメーターを変更して行い、学習例と試験例に振り分けた検体の独立性は担保して検証を続け、最も良い成績のモデルを採用した。
【００２６】
まず、ニューラルネットワークに学習させる学習用データを準備する。下記実施例では、Quality Flag "Good"以外のプローブ、Y染色体上に座位する遺伝子のプローブ、mRNA 3'末端から遠位に設定されているプローブなどを除外し、約55000個のプローブから10,498個のプローブに絞り込んだ。ここで、Quality Flagが "Good"とは、測定された発現量がスポット周囲のバックグラウンドの1.5SDより大きく、測定値として信頼できるということを意味する。またＹ染色体上に座位する遺伝子は男性にしか存在しないため、女性の検査を行った際に検出の感度及び／又は特異度が下がる恐れがあるので除外した。また、mRNA 3'末端から遠位に設定されているプローブは、cRNAの調製におけるバイアスを受けやすいため、測定値の大きな変動要因であるため除外した。さらに、予備分析により、欠損値が２５％以上あるもの、男女間の発現量の差が大きいもの、アレイ製造時のバッチ間差が大きいものも除外した。
【００２７】
次にこのようにして選択した各プローブについて測定された、各プローブがハイブリダイズするRNAが由来する遺伝子の発現量をニューラルネットワークに入力し、２群間検定（ｔ検定）、すなわち、学習例の統合失調症（未投薬）と双極性障害群の間で有意差検定（ｔ検定）を行なう。下記実施例では、統合失調症群−双極性障害群間、統合失調症群−健常者群間、及び双極性障害群−健常者群間でそれぞれ有意差検定を行ない、各群間で有意差のあるプローブを合計216個絞り込んだ。なお、下記実施例では、試料の絞込みも行なった。すなわち、健常者５６例の中央値をプローブごとに計算し、そのデータセットを対象として各試料の相関を調べ、近似曲線のパラメータやシグナル強度比が大きく隔たったものは分析対象から除外した。
【００２８】
有意差検定により有意差が認められたプローブについて、変数増加法(forward selection)による選択を行なう。変数増加法自体は周知であり、説明変数（各プローブの測定結果）を１つずつ足していき、目的変数（正答率）との相関が高い組合せを得ることにより行なう。コンピューターにインストールされたニューラルネットワークを用いて変数増加法を行ない、最も正答率が高いプローブ数を選択する。この際、N-fold cross validation法を組み合わせて上記選択を行うことが好ましい。cross validation法自体も周知である。N-fold cross validationでは、データ（各プローブの測定結果）をほぼ同サイズのN個のサブセットに分割し、１つのサブセットを除外しながらニューラルネットワークの学習（訓練）を合計N回行う。下記実施例では、学習例のデータセットを3つのサブセットに分割し、データセットを入れ替えながら有意差のあったプローブを１つずつ使ってニューラルネットワークに分類予測を行わせ、最も正答率が高いプローブの組み合わせを同定した。
【００２９】
ここで、本願発明者らは、実用化のための低コストのマイクロアレイとして、上記２１６種類のプローブを基板に搭載した実用化マイクロアレイを作製した。該実用化アレイには、さらに、グローバルノーマライゼーションに用いるプローブ及び管理用プローブ（位置合わせ用）も搭載した（詳細は下記実施例）。グローバルノーマライゼーションには、アレイ間での変動が小さなものを選択した。この実用化アレイは、１枚の基板上に複数（下記実施例では１６個）のチャンバーを形成することができ、すなわち、１枚のアレイで１６検体の検査を同時に行なうことができる。約55000種類のプローブを搭載したDNAマイクロアレイは高価であり、１枚のマイクロアレイで１検体しか処理できないが、該実用化アレイによれば、アレイ作製のコスト並びに検査のコスト及び手間を大幅に下げることができる。
【００３０】
上記実用化アレイを用いた測定値を利用して、コンピューターにインストールされたニューラルネットワークを用いて、上記した通りcross validation法及び変数増加法を駆使して、正答率が最高となるプローブの組合せを求めた。その結果、上記した１２種類の遺伝子が特定された。
【００３１】
上記した１２種類の遺伝子のプローブの測定値を説明変数として学習済みニューラルネットワークに入力し、試験例について感度及び特異度を算出すると、統合失調症及び双極性障害のいずれも感度及び特異度が８０％を超え、高感度及び高特異度で統合失調症と双極性障害の判別が可能であることが確認された。
【００３２】
また、上記した１２種類の遺伝子のプローブの測定値を説明変数として用いて重回帰分析を行ない、試験例について感度及び特異度を算出した場合にも、統合失調症及び双極性障害のいずれも感度及び特異度が８０％を超えた。重回帰分析によっても、上記１２種類の遺伝子発現量を用いて、高感度及び高特異度で統合失調症と双極性障害の判別が可能であることが確認された。
【００３３】
本発明の方法は、精神疾患、特に統合失調症ないしは双極性障害が疑われる患者について、統合失調症か双極性障害かを調べるために好ましく実施することができる。例えば、統合失調症の検出方法（すなわち、統合失調症か健常者かを判別する方法）と組み合わせて本発明の方法を用いると、より精度の高い診断が可能になる。統合失調症の検出方法は種々のものが公知である（例えば上記特許文献参照）。
【００３４】
なお、本発明において、「塩基配列を有する」とは、塩基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ」とは、配列番号１８に示されるattttgcctt cacataccag acatgagacaの塩基配列を持つ、３０塩基のサイズのオリゴヌクレオチドプローブを意味する。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。
【００３６】
1. プローブの絞込み
採血および試料の保管
統合失調症患者 抗精神病薬 未投薬群58例、健常者56例、双極性障害患者41例より、PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) を用いて採血及びRNA抽出を行なった。PAXgene Blood RNA Tubes 2本に2.5mlづつ採血し、転倒混和したあと凍結し、実験室への搬送を行った。保管は-80℃とした。
【００３７】
RNA抽出
-80℃に保管しておいたPAXgene Blood RNA Tubesを室温で融解し、製造者の指示書に従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAは、-80℃で保管した。
【００３８】
抽出したRNAの濃度、クォリティーの確認
抽出したtotal RNAを10mM Tris-HCl(pH7.5)で50倍に希釈し、230, 260, 280nmの吸光度を測定し、total RNAの濃度を測定した。抽出したRNAのクォリティーは、Agilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA, USA)で確認を行った。
【００３９】
cRNAの調製
抽出したtotal RNA 0.5μgを用いてcRNAを調製した。iExpress kit(GE Healthcare Bioscience, Chandler, CA, USA)を用い、製造者の指示書に従ってBiotin標識したcRNAを調製した。
【００４０】
調製したcRNAの定量およびクォリティーの確認は、抽出したtotal RNAの定量及びクォリティーの確認と同様に行った。すなわち、50倍に希釈したcRNA溶液の230, 260, 280 nmの吸光度を測定し、total RNAの濃度を測定した。cRNAのクォリティーの確認は、Agilent 2100バイオアナライザーで行った。
【００４１】
アレイへのハイブリダイゼーションと洗浄
マイクロアレイとして、Codelink（商標） 55K Bioarray（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）を用いた。Codelink（商標） 55K Bioarrayは、スライドガラス表面を特殊な化学修飾を施したアクリルアミドでコーティングし、30merのプローブが3次元的に固定されているため、ハイブリダイズの効率が良く、再現性や感度に優れたマイクロアレイであり、ヒトの約約55000遺伝子に対応するプローブが固定されている。
【００４２】
10μgのcRNAを最終容量が20μlになるようRNase-Free H2Oで調製し、iExpress kit の5×Fragmentation Bufferを5μl添加した後、94℃で20分間インキュベートしてcRNAを断片化した。
【００４３】
10μgの断片化したcRNA(25μl)、78μlのiExpress kitのHybridization Buffer A、130μlのiExpress kit のHybridization Buffer Bを混合し、計260μlになるように調製した。90℃で5分間インキュベートした後、氷上で5〜30分間インキュベートした。
【００４４】
250μlのハイブリダイゼーション溶液をCodeLink（商標） 55K Bioarray(GE Healthcare Bioscience, Chandler, CA, USA)のチャンバーへ注入し、CodeLink（商標） INNOVAシェイカー(GE Healthcare Bioscience, Chandler, CA, USA)を用いて、アレイを300rpmで旋回させながら、37℃で18〜24時間インキュベートした。
【００４５】
Hybridization Removal Toolを使用してアレイを固定し、ハイブリダイゼーションチャンバーを引き剥がし、Bioarray Rackにアレイをセットした。アレイをセットしたBioarray Rackを46℃の0.75×TNT Bufferの入ったLarge Reagentリザーバーに移し、46℃で1時間インキュベーションした。
【００４６】
Bioarray Rackを3.4 mlのStreptavidin-Cy5希釈溶液で満たしたSmall Reagentリザーバーに移し、室温で30分間インキュベートした。染色後、Bioarray Rack を240mlの1×TNT Bufferで満たしたLarge Reagentリザーバーに移し、室温で5分間インキュベートする操作を4回繰り返して洗浄した。次にBioarray Rackを0.1×SSC/0.05% Tween 20で満たしたLarge Reagentリザーバーに移し、30秒間洗浄し、アレイを遠心して乾燥した後、スキャニングまで遮光して保存した。
【００４７】
アレイのスキャニング
洗浄後乾燥させたアレイをAgilent Scanner (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)にてスキャニングした。スキャナーの設定は、Red PMT [%] を70%、 Dye ChannelをRed (RedはCy5)とした。これ以外の設定はデフォルトとした。スキャンしたアレイデータはTIFファイルで保存し、数値化を行った。
【００４８】
アレイデータの数値化
製造者の指示書に従い、CodeLink（商標） Expression AnalysisによりTIFファイルで保存したアレイデータの数値化とグローバルノーマライゼーションによる正規化を行った。
【００４９】
プローブの絞込み
上記で得られた実験結果から、Quality Flag "Good"以外のプローブ、Y染色体上に座位するプローブ、mRNA 3’末端から遠位に設定されているプローブなどを除外した。さらに、さらに、予備分析により、欠損値が２５％以上あるもの、男女間の発現量の差が大きいもの、アレイ製造時のバッチ間差が大きいものも除外した。これらにより、約55000個のプローブから10,498個のプローブに絞り込んだ。
【００５０】
2. 統計処理
以上のような条件で絞り込んだプローブから、統合失調症患者 抗精神病薬 未投薬群43検体、健常者38検体の2群間での有意差および双極性障害患者32検体と統合失調症患者 抗精神病薬 未投薬群40検体の間で統計学的有意差の認められたプローブ、さらに双極性障害患者32検体と健常者38検体の間で統計学的有意差の認められたプローブを216個抽出した。これらのプローブの配列を配列表の配列番号１３〜２２８に示す。また、各プローブが由来する遺伝子名及びGenBank Accession No.を下記表３に示す。
【００５１】
【表３−１】
【００５２】
【表３−２】
【００５３】
【表３−３】
【００５４】
【表３−４】
【００５５】
【表３−５】
【００５６】
【表３−６】
【００５７】
【表３−７】
【００５８】
【表３−８】
【００５９】
【表３−９】
【００６０】
【表３−１０】
【００６１】
3. 実用化アレイの設計
CodeLink（商品名） 55K Bioarrayは、非常に高価であり、1枚で1検体しか処理、解析ができない。実用化をはかるためには、より低コストで解析が可能なマイクロアレイが必要となる。そこで、CodeLink（商品名） 55K Bioarrayと全く同一の表面処理を施し、これを16個のチャンバーで区切ることで、一度に最大で16検体の処理、解析が可能なCodeLink（商品名） 16-Assay Bioarray（Applied Microarrays社）をベースにした実用化アレイを設計した。上記216遺伝子のプローブの他にグローバルノーマライゼーション用に使用するプローブ（配列番号２２９〜５２７）やメーカーによる管理用プローブなど追加して、以下のようなアレイを設計した。
【００６２】
CodeLink（商品名） 16-Assay Bioarray プローブの内訳
(合計 1714スポット/チャンバー)
・分類予測候補プローブ : 216プローブ × 4重スポット
・ノーマライゼーション用追加プローブ : 299プローブ × 2重スポット
・メーカーによる管理用プローブ : 96プローブ × 各1スポット
・ 規格上の予約プローブ : グリッド (32) , Positive Control (60) , Negative Control (64)
【００６３】
4. CodeLink（商品名） 16-Assay Bioarrayによる測定結果を基にした分類予測（ニューラルネットワーク）
未治療統合失調症患者（統合失調症患者 抗精神病薬 未投薬群）60例、双極性障害患者 48例の遺伝子発現情報を基に、分類予測に優れたニューラルネットワークによる分類予測モデルの構築を試みた。
【００６４】
分類予測モデルを構築するにあたって、未治療統合失調症患者40検体、双極性障害患者32検体を学習例として分類予測モデルの構築に用い、モデルの構築に関与していない、残りの検体を試験例（未治療統合失調症患者20検体、双極性障害患者16検体）としてモデルの評価を行うHold out cross validation法により検証を行った。
【００６５】
(1) 遺伝子発現情報の取得
216プローブを含む上記実用化アレイを用いて、未治療統合失調症患者60例、双極性障害患者48例の遺伝子発現情報を取得した。採血、RNAの抽出、cRNAの調製、アレイへのハイブリダイゼーション、蛍光シグナル（蛍光色素Cy5）のスキャニングは、上記と同様に行なった。スキャナーで読み取った1714スポットの画像データは、CodeLink（商標） Expression Analysisソフトウェアを用いて数値化及びグローバルノーマライゼーションによる正規化を行なった。
【００６６】
(2) ニューラルネットワークによる分類予測モデルの構築
市販の解析ソフトArrayAssist（登録商標）（STRATAGENE社）に搭載されているニューラルネットワークを用いて、正規化したデータの解析を行ない、分類予測アルゴリズムの構築を試みた。分類予測アルゴリズムとは、あらかじめ属性が明らかになっているデータセットを入力し「学習、訓練」を行なうことで、最適な解を出力することができるようになる一連のアルゴリズムであり、ニューラルネットワークは、学習効果の高さから高い分類精度のアルゴリズムが構築できるとされている。
【００６７】
正規化されたデータの一部（未治療統合失調症患者40検体、双極性障害患者32検体）を学習例として、ArrayAssistのニューラルネットワークに入力し、アルゴリズムの構築を行なった。Feature Selectionは変数増加法（Forward Selection）により行ない、学習データを３組に分けたcross validation（N-fold cross validation (N=3)）により分類予測アルゴリズムを構築した。具体的には、学習例のデータセットを３分割し、データセットを入れ替えながら、216個のプローブのうちで有意差のあったプローブを一つずつ使って分類予測を行ない、最も正しく分類できたプローブを分類予測に用いるプローブとして採用することとし、これを順次繰り返して採用するプローブを追加していった。このようにして、徐々に用いるプローブを増やしていき、正しく分類できた割合（Number of Class Accuracy(%)）がプラトーに達したところで学習を終了させた。
【００６８】
次いで、このようにして学習させたアルゴリズムを用いて、試験例のデータセットを分析した。Number of Class Accuracyがプラトーに達した点で使用されているプローブセットについての正規化データを上記学習済みアルゴリズムに入力し、試験例についての該アルゴリズムによる分類が臨床診断とどの程度一致するかを検証した。
【００６９】
ニューラルネットワークの各種パラメーター（学習効率、Momentum、繰り返し数、レイヤー数、ニューロン数）を種々に変化させて多数のアルゴリズムを構築し、それぞれについて上記したcross validationによる学習及び試験例を用いた診断精度の検証を行なった。
【００７０】
その結果、パラメーターを下記の通りに設定したアルゴリズムにおいて、試験例を最も正しく分類することができた。
学習効率：0.45
Momentum：0.3
繰り返し数：150
レイヤー数：1
ニューロン数：3
【００７１】
このアルゴリズムによる学習例及び試験例についての予測結果を表４及び表５に示す。また、このアルゴリズムについてのForward Selectionの結果を図１に示す。
【００７２】
【表４】
【００７３】
【表５】
【００７４】
図１に示される通り、構築されたアルゴリズムによれば、12個のプローブ（表２、前掲）による発現データを用いて統合失調症と双極性障害とを精度良く分類することができる。
【００７５】
5. CodeLink（商品名） 16-Assay Bioarrayによる測定結果を基にした分類予測（重回帰分析）
上記と同様に、未治療統合失調症患者60例、双極性障害患者48例の遺伝子発現情報を用いて、重回帰分析による分類予測を試みた。上記12個のプローブによる発現データを説明変数として用いて、上記学習例について市販のソフトウェア（SPSS）を用いて重回帰分析を行ない、予測式を構築した。重回帰分析は、統合失調症患者で従属変数が大きくなるように設定して行った。次いで、構築された予測式を用いて、上記試験例について従属変数を計算した。なお、得られた予測式は以下の通りである。
Y=(A1X1+A2X2+A3X3+A4X4+A5X5+A6X6+A7X7+A8X8+A9X9+A10X10+A11X11+A12X12+C)×100
X1は、FLJ21881（GE492524 配列番号18）の遺伝子発現量
X2は、DLGAP3（GE54859 配列番号44）の遺伝子発現量
X3は、FAM20A （GE56606 配列番号61）の遺伝子発現量
X4は、MAX （GE59858 配列番号90）の遺伝子発現量
X5は、ZNF74（GE60153 配列番号97）の遺伝子発現量
X6は、DIAPH2 （GE62680 配列番号120）の遺伝子発現量
X7は、CR1 （GE62914 配列番号125）の遺伝子発現量
X8は、RAD54B （GE79729 配列番号161）の遺伝子発現量
X9は、GPR30 （GE80129 配列番号167）の遺伝子発現量
X10は、SCD5 （GE82995 配列番号195）の遺伝子発現量
X11はIMAGE:5785888 （GE878897 配列番号218）の遺伝子発現量
X12は、INSL3 （GE88024 配列番号220）の遺伝子発現量
をそれぞれ指す。
各遺伝子の発現量に乗ずる係数は、それぞれ、
A1は、-0.166864749248881
A2は、0.578595208826776
A3は、-0.251720387137894
A4は、0.285088434152454
A5は、0.149134281702735
A6は、-0.581754365047968
A7は、0.965099433225613
A8は、-0.237927470298808
A9は、0.724852821407317
A10は、0.467110697687733
A11は、1.55443576023811
A12は、-0.0695649776248728
定数Cは、-1.20827077326351
である。
【００７６】
従属変数５０をカットオフ値として集計した結果を表６及び表７に示す。また、学習例及び試験例の各検体について計算された従属変数を図２に示す。
【００７７】
【表６】
感度：95.0% (38/40)、特異度：87.5% (28/32)、正答率：91.7% (66/72)
【００７８】
【表７】
感度：85.0% (17/20)、特異度：81.3% (13/16)、正答率：83.3% (30/36)
【００７９】
以上の通り、カットオフ値を５０とすると、試験例において感度・特異度ともに８０％を超える結果となった。重回帰分析によっても、上記１２種類の遺伝子発現量を用いて統合失調症と双極性障害とを精度良く分類することができた。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明の実施例で行なった、ニューラルネットワークによる分類予測モデルにおける、プローブ数と正答率の関係を示す図である。
【図２】重回帰分析により求めた学習例及び試験例の各検体の従属変数を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、双極性障害と統合失調症を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本国内における統合失調症の発症率は人口の約０．８％であり、主に青年期に発症する。該疾患の予後は多様である。概ね全体の1/3の患者については、顕著で継続的な改善をみる。1/3はいくらか改善するが，間欠性再発と残遺性障害を残す。残りの1/3は重篤で，永久的に能力が失われ、社会的機能遂行に支障をきたす重大な精神疾患である。
【０００３】
双極性障害（躁鬱病）は、統合失調症と並び発症率の高い精神疾患であり、躁状態とうつ状態を繰り返す。双極性障害の生涯有病率は0.2〜1.6%といわれており、再発することが多く、生涯にわたる薬物投与による治療が必要となる場合が多いといわれている。
【０００４】
双極性障害と統合失調症のいずれも、早期に適切な治療を行うことが重要である。従来、これらの精神疾患の診断は、米国精神医学会(APA)が制定した精神疾患の診断・統計マニュアルであるDSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV)による包括的評価に基いて下される。しかし、このような方法は、診断医の主観や技量に大きく依存する。双極性障害の躁状態が統合失調症の陽性症状に、双極性障害のうつ状態が統合失調症の陰性症状に類似することから、ときに該疾患を客観的かつ早期に診断することは困難であり、適切な治療が施されずに重症化するケースも少なくない。
【０００５】
統合失調症や双極性障害の生物学的マーカー等を用いた客観的な診断方法が確立すれば、早期診断、早期治療が可能になり、重症化の回避や治癒率の向上が可能になる。現在までに報告されている、生物学的マーカーを用いた診断方法としては、例えば、上皮細胞成長因子の血清中濃度を指標として精神分裂病（統合失調症）を診断する方法（特許文献１）や、血液を試料として用い、特定の遺伝子の発現量を指標とする方法がある（特許文献２）。しかしながら、これらの方法では、統合失調症と双極性障害とを精度良く区別して診断することはできない。
【０００６】
【特許文献１】特許第3706913号公報
【特許文献２】特開2004-135667号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、患者血液を試料として高い精度で客観的に統合失調症と双極性障害とのいずれであるかを診断することができる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、血液を試料として用い、約55000種類の遺伝子の発現量を双極性患者と統合失調症患者の間で比較し、発現量が有意に変動する遺伝子を選び、さらに後述する本願発明者らが独自に考え出した基準でかなりの数の分類予測候補遺伝子を絞り込み、これら遺伝子群を搭載した低コストで汎用性の高いマイクロアレイを作製し、これを用いて測定した発現データをニューラルネットワークを駆使した変数増加法とcross validation法にかけて分類予測アルゴリズムを構築し、実際に多数の検体を用いて検出の感度（真陽性率）及び特異度（真陰性率）が８０％以上になるアルゴリズムを見出すことにより、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、生体から分離された試料における下記(1)〜(12)の遺伝子群の発現量を指標とする、双極性障害と統合失調症の判別方法を提供する。
(1) FLJ21881（配列番号1）
(2) DLGAP3（配列番号2）
(3) FAM20A（配列番号3）
(4) MAX（配列番号4）
(5) ZNF74（配列番号5）
(6) DIAPH2（配列番号6）
(7) CR1（配列番号7）
(8) RAD54B（配列番号8）
(9) GPR30（配列番号9）
(10) SCD5（配列番号10）
(11) IMAGE:5785888（配列番号11）
(12) INSL3（配列番号12）
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、双極性障害と統合失調症とのいずれであるかを高い精度で客観的に診断できる手段が初めて提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上記の通り、本発明は、(1)〜(12)の遺伝子群の発現量を指標とする。各遺伝子の発現量を測定する試料は、生体から分離された試料であれば特に限定されるわけではないが、下記実施例で詳述するとおり、上記遺伝子群は、血液を試料として用いて選定されたものであるので、血液を試料とすることが好ましい。なお、上記遺伝子群には、統合失調症患者において双極性障害患者よりも発現量が増大しているものも減少しているものも含まれる。また、下記実施例において、検出の感度（真陽性率）及び特異度（真陰性率）が８０％以上となることが確認された上記１２種類の遺伝子のみの発現量に基づいて判定することが好ましい。なお、下記実施例に具体的に記載するように、測定の精度を確保する等のために、正規化のための種々の遺伝子等の他の遺伝子の発現量を同時に測定することは好ましいことであり、「上記１２種類の遺伝子のみの発現量に基づく」とは、上記１２種類の遺伝子のみの発現量を分類予測の直接的な変数として用いるという意味である。また、感度を表わす真陽性率は、下記表１におけるa/(a+b)、特異度を表わす真陰性率は、１−偽陽性＝d/(c+d)である。また、正答率は、(a+d)/(a+b+c+d)である。
【００１２】
【表１】
【００１３】
上記１２種類の遺伝子の配列は、上記した各配列番号に記載されているが、各遺伝子のGenBankアクセション番号、遺伝子産物、下記実施例で用いた、各遺伝子の発現量の測定に用いたプローブ番号及びその配列番号を下記表２に示す。
【００１４】
【表２】
【００１５】
試料中の各遺伝子の発現量の測定自体は公知の方法により行なうことができる。測定方法は、特に限定されないが、各遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ、好ましくはDNAプローブが固定化されたDNAアレイを用いる方法が簡便で好ましい。例えば、下記実施例に具体的に記載するように、血液から全mRNAを抽出し、抽出したmRNAから、ビオチン等で標識されたcRNAを調製し、各遺伝子由来のcRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定化されたアレイにcRNAを施してcRNAとプローブとをハイブリダイズさせ、アレイを洗浄後、基板上に残留する標識量を測定することによりcRNA量、ひいてはmRNA量、すなわち遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１６】
なお、固定化されるプローブは、cRNAと特異的にハイブリダイズするサイズを有するものであり、通常、１８塩基〜５０塩基、好ましくは２０塩基〜４０塩基程度のサイズを有する。また、固定化するプローブは、それがハイブリダイズするRNAの領域と完全に相補的であることが好ましいが、下記実施例に具体的に記載するような、DNAアレイを用いる際の通常のハイブリダイズ条件下でハイブリダイズするものであれば少数（通常、１個か２個）のミスマッチがあっても許容できる。従って、遺伝子に天然のSNPが生じている場合でも、同じDNAアレイを用いて測定可能である。
【００１７】
下記実施例では、前記遺伝子群の発現量は、配列番号18、配列番号44、配列番号61、配列番号90、配列番号97、配列番号120、配列番号125、配列番号161、配列番号167、配列番号195、配列番号218及び配列番号220に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて測定されており、これらのプローブを固定化したDNAアレイを好ましく利用することができる。なお、これらのプローブを用いた測定値によると、１２個のプローブのうちの10個は統合失調症と健常者との間で発現量に有意差（p<0.05、t検定）が認められるプローブであった。
【００１８】
上記遺伝子群の発現量に基づく判定は、基本的には前記遺伝子群の発現量を、あらかじめ測定した、既知の統合失調症患者及び双極性障害患者における前記遺伝子群の発現量と対比することにより行われる。この対比は、既知の統合失調症患者及び双極性障害患者における前記遺伝子群の発現量を用いて変数増加法により学習させたニューラルネットワークにより行なうことが好ましい。構築した学習済みのニューラルネットワーク（構築方法は後述）に測定した上記１２種類の遺伝子の発現量を入力し、該ニューラルネットワークに分類される群の予測確率を出力させ、この予測確率を判定基準として統合失調症か双極性障害かを判別することができる。
【００１９】
あるいはまた、上記対比は、重回帰分析により行なうことも好ましい。測定した上記１２種類の遺伝子の発現量を説明変数とし、既知の統合失調症患者及び双極性障害患者における前記遺伝子群の発現量を重回帰分析すると、予測式（重回帰式）を得ることができる。得られた予測式に、疾患を判別すべき被検者における上記遺伝子群の発現量を入力して従属変数を求め、この従属変数の数値を既知の統合失調症患者及び双極性障害患者の従属変数と対比することで、該被検者が統合失調症か双極性障害かを判別することができる。この対比は、例えば、既知の統合失調症患者群と双極性障害患者群の各患者について計算された従属変数をもとに、両群を好ましく分類できる従属変数の値をカットオフ値として定め、被検者の従属変数をこのカットオフ値と対比することにより行なうことができる。例えば、統合失調症患者で従属変数が大きくなるように設定して発現量を分析した場合、被検者について計算された従属変数の数値がカットオフ値よりも大きければ、該被検者は統合失調症であると予測することができる。カットオフ値は、既知の統合失調症患者及び双極性障害患者について計算された従属変数をもとに、常法の統計処理により適宜定めることができる。重回帰分析の手法自体は周知であり、重回帰分析を行なうソフトウェア等も種々のものが公知で、市販品も多く存在する。本発明ではいずれのソフトウェアを用いてもよい。なお、予測式は、既知の患者についての分析を一度行なえば定めることができるので、実施の都度既知の患者群についての分析を行なう必要はなく、一旦得られた予測式をその後に実施する際にも用いることができる。
【００２０】
なお、本発明において「重回帰分析」といった場合には、得られた重回帰式を用いて試料の従属変数を求める工程を含む分析方法を広く包含し、重回帰式を得るための分析工程は必ずしも含まれない。従って、上記したように、既に求められた重回帰式を用いて疾患の判別を行う方法であれば、本発明にいう「重回帰分析により対比を行なう判別方法」に包含される。
【００２１】
本発明で用いる発現量の測定値は、下記実施例に記載される通り、測定されるシグナル強度をグローバルノーマライゼーション(global normalization)法により正規化したものであることが好ましい。ここで、グローバルノーマライゼーション法とは、DNAマイクロアレイ上に搭載した全遺伝子の発現量の中央値を求め、この中央値で各遺伝子の発現量を除することで相対的発現量を算出する方法である。
【００２２】
ニューラルネットワークを用いて本発明の方法を実施する場合、ニューラルネットワーク自体は周知であり、市販のニューラルネットワークを用いることができる。もっとも、ニューラルネットワーク自体は市販品を利用できるが、本発明では、ニューラルネットワークに学習させるデータに特徴があり、いかなるデータを学習させることにより感度（真陽性率）及び特異度（真陰性率）の両者を８０％以上にできるかは工夫が必要である（後述）。
【００２３】
ニューラルネットワークを用いた分類予測モデルの最適モデルは、例えば下記実施例に詳述する方法により構築することができる。簡単に説明すると、例えば、次のようにして最適モデルを決定することができる。まず、多数の統合失調症患者、双極性障害患者及び健常者から採取した試料を用い、種々の遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量は、上記の通り、DNAマイクロアレイを用いて行なうことができる。下記実施例では、約55000種類のヒト遺伝子のDNAプローブが搭載された市販のDNAマイクロアレイを用いた。
【００２４】
次に、DNAマイクロアレイを用いて測定した発現量をデータクレンジングする。ここで、データクレンジングは、例えば、全体の発現量の30%tile未満の遺伝子のプローブや98%tile以上の遺伝子のプローブを除外することにより行なうことができる。
【００２５】
多数の統合失調症患者及び双極性障害患者のDNAマイクロアレイのデータを、学習例と、学習例と独立した試験例とに分け、学習例をニューラルネットワークに学習させ、構築された分類予測モデルによりどの程度の感度及び特異度が達成されるかを試験例を用いて算出、評価を行うHold out cross validation法により構築した。分類予測モデル構築には、ニューラルネットワークのパラメーターを変更して行い、学習例と試験例に振り分けた検体の独立性は担保して検証を続け、最も良い成績のモデルを採用した。
【００２６】
まず、ニューラルネットワークに学習させる学習用データを準備する。下記実施例では、Quality Flag "Good"以外のプローブ、Y染色体上に座位する遺伝子のプローブ、mRNA 3'末端から遠位に設定されているプローブなどを除外し、約55000個のプローブから10,498個のプローブに絞り込んだ。ここで、Quality Flagが "Good"とは、測定された発現量がスポット周囲のバックグラウンドの1.5SDより大きく、測定値として信頼できるということを意味する。またＹ染色体上に座位する遺伝子は男性にしか存在しないため、女性の検査を行った際に検出の感度及び／又は特異度が下がる恐れがあるので除外した。また、mRNA 3'末端から遠位に設定されているプローブは、cRNAの調製におけるバイアスを受けやすいため、測定値の大きな変動要因であるため除外した。さらに、予備分析により、欠損値が２５％以上あるもの、男女間の発現量の差が大きいもの、アレイ製造時のバッチ間差が大きいものも除外した。
【００２７】
次にこのようにして選択した各プローブについて測定された、各プローブがハイブリダイズするRNAが由来する遺伝子の発現量をニューラルネットワークに入力し、２群間検定（ｔ検定）、すなわち、学習例の統合失調症（未投薬）と双極性障害群の間で有意差検定（ｔ検定）を行なう。下記実施例では、統合失調症群−双極性障害群間、統合失調症群−健常者群間、及び双極性障害群−健常者群間でそれぞれ有意差検定を行ない、各群間で有意差のあるプローブを合計216個絞り込んだ。なお、下記実施例では、試料の絞込みも行なった。すなわち、健常者５６例の中央値をプローブごとに計算し、そのデータセットを対象として各試料の相関を調べ、近似曲線のパラメータやシグナル強度比が大きく隔たったものは分析対象から除外した。
【００２８】
有意差検定により有意差が認められたプローブについて、変数増加法(forward selection)による選択を行なう。変数増加法自体は周知であり、説明変数（各プローブの測定結果）を１つずつ足していき、目的変数（正答率）との相関が高い組合せを得ることにより行なう。コンピューターにインストールされたニューラルネットワークを用いて変数増加法を行ない、最も正答率が高いプローブ数を選択する。この際、N-fold cross validation法を組み合わせて上記選択を行うことが好ましい。cross validation法自体も周知である。N-fold cross validationでは、データ（各プローブの測定結果）をほぼ同サイズのN個のサブセットに分割し、１つのサブセットを除外しながらニューラルネットワークの学習（訓練）を合計N回行う。下記実施例では、学習例のデータセットを3つのサブセットに分割し、データセットを入れ替えながら有意差のあったプローブを１つずつ使ってニューラルネットワークに分類予測を行わせ、最も正答率が高いプローブの組み合わせを同定した。
【００２９】
ここで、本願発明者らは、実用化のための低コストのマイクロアレイとして、上記２１６種類のプローブを基板に搭載した実用化マイクロアレイを作製した。該実用化アレイには、さらに、グローバルノーマライゼーションに用いるプローブ及び管理用プローブ（位置合わせ用）も搭載した（詳細は下記実施例）。グローバルノーマライゼーションには、アレイ間での変動が小さなものを選択した。この実用化アレイは、１枚の基板上に複数（下記実施例では１６個）のチャンバーを形成することができ、すなわち、１枚のアレイで１６検体の検査を同時に行なうことができる。約55000種類のプローブを搭載したDNAマイクロアレイは高価であり、１枚のマイクロアレイで１検体しか処理できないが、該実用化アレイによれば、アレイ作製のコスト並びに検査のコスト及び手間を大幅に下げることができる。
【００３０】
上記実用化アレイを用いた測定値を利用して、コンピューターにインストールされたニューラルネットワークを用いて、上記した通りcross validation法及び変数増加法を駆使して、正答率が最高となるプローブの組合せを求めた。その結果、上記した１２種類の遺伝子が特定された。
【００３１】
上記した１２種類の遺伝子のプローブの測定値を説明変数として学習済みニューラルネットワークに入力し、試験例について感度及び特異度を算出すると、統合失調症及び双極性障害のいずれも感度及び特異度が８０％を超え、高感度及び高特異度で統合失調症と双極性障害の判別が可能であることが確認された。
【００３２】
また、上記した１２種類の遺伝子のプローブの測定値を説明変数として用いて重回帰分析を行ない、試験例について感度及び特異度を算出した場合にも、統合失調症及び双極性障害のいずれも感度及び特異度が８０％を超えた。重回帰分析によっても、上記１２種類の遺伝子発現量を用いて、高感度及び高特異度で統合失調症と双極性障害の判別が可能であることが確認された。
【００３３】
本発明の方法は、精神疾患、特に統合失調症ないしは双極性障害が疑われる患者について、統合失調症か双極性障害かを調べるために好ましく実施することができる。例えば、統合失調症の検出方法（すなわち、統合失調症か健常者かを判別する方法）と組み合わせて本発明の方法を用いると、より精度の高い診断が可能になる。統合失調症の検出方法は種々のものが公知である（例えば上記特許文献参照）。
【００３４】
なお、本発明において、「塩基配列を有する」とは、塩基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ」とは、配列番号１８に示されるattttgcctt cacataccag acatgagacaの塩基配列を持つ、３０塩基のサイズのオリゴヌクレオチドプローブを意味する。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。
【００３６】
1. プローブの絞込み
採血および試料の保管
統合失調症患者 抗精神病薬 未投薬群58例、健常者56例、双極性障害患者41例より、PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) を用いて採血及びRNA抽出を行なった。PAXgene Blood RNA Tubes 2本に2.5mlづつ採血し、転倒混和したあと凍結し、実験室への搬送を行った。保管は-80℃とした。
【００３７】
RNA抽出
-80℃に保管しておいたPAXgene Blood RNA Tubesを室温で融解し、製造者の指示書に従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAは、-80℃で保管した。
【００３８】
抽出したRNAの濃度、クォリティーの確認
抽出したtotal RNAを10mM Tris-HCl(pH7.5)で50倍に希釈し、230, 260, 280nmの吸光度を測定し、total RNAの濃度を測定した。抽出したRNAのクォリティーは、Agilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA, USA)で確認を行った。
【００３９】
cRNAの調製
抽出したtotal RNA 0.5μgを用いてcRNAを調製した。iExpress kit(GE Healthcare Bioscience, Chandler, CA, USA)を用い、製造者の指示書に従ってBiotin標識したcRNAを調製した。
【００４０】
調製したcRNAの定量およびクォリティーの確認は、抽出したtotal RNAの定量及びクォリティーの確認と同様に行った。すなわち、50倍に希釈したcRNA溶液の230, 260, 280 nmの吸光度を測定し、total RNAの濃度を測定した。cRNAのクォリティーの確認は、Agilent 2100バイオアナライザーで行った。
【００４１】
アレイへのハイブリダイゼーションと洗浄
マイクロアレイとして、Codelink（商標） 55K Bioarray（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）を用いた。Codelink（商標） 55K Bioarrayは、スライドガラス表面を特殊な化学修飾を施したアクリルアミドでコーティングし、30merのプローブが3次元的に固定されているため、ハイブリダイズの効率が良く、再現性や感度に優れたマイクロアレイであり、ヒトの約約55000遺伝子に対応するプローブが固定されている。
【００４２】
10μgのcRNAを最終容量が20μlになるようRNase-Free H2Oで調製し、iExpress kit の5×Fragmentation Bufferを5μl添加した後、94℃で20分間インキュベートしてcRNAを断片化した。
【００４３】
10μgの断片化したcRNA(25μl)、78μlのiExpress kitのHybridization Buffer A、130μlのiExpress kit のHybridization Buffer Bを混合し、計260μlになるように調製した。90℃で5分間インキュベートした後、氷上で5〜30分間インキュベートした。
【００４４】
250μlのハイブリダイゼーション溶液をCodeLink（商標） 55K Bioarray(GE Healthcare Bioscience, Chandler, CA, USA)のチャンバーへ注入し、CodeLink（商標） INNOVAシェイカー(GE Healthcare Bioscience, Chandler, CA, USA)を用いて、アレイを300rpmで旋回させながら、37℃で18〜24時間インキュベートした。
【００４５】
Hybridization Removal Toolを使用してアレイを固定し、ハイブリダイゼーションチャンバーを引き剥がし、Bioarray Rackにアレイをセットした。アレイをセットしたBioarray Rackを46℃の0.75×TNT Bufferの入ったLarge Reagentリザーバーに移し、46℃で1時間インキュベーションした。
【００４６】
Bioarray Rackを3.4 mlのStreptavidin-Cy5希釈溶液で満たしたSmall Reagentリザーバーに移し、室温で30分間インキュベートした。染色後、Bioarray Rack を240mlの1×TNT Bufferで満たしたLarge Reagentリザーバーに移し、室温で5分間インキュベートする操作を4回繰り返して洗浄した。次にBioarray Rackを0.1×SSC/0.05% Tween 20で満たしたLarge Reagentリザーバーに移し、30秒間洗浄し、アレイを遠心して乾燥した後、スキャニングまで遮光して保存した。
【００４７】
アレイのスキャニング
洗浄後乾燥させたアレイをAgilent Scanner (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)にてスキャニングした。スキャナーの設定は、Red PMT [%] を70%、 Dye ChannelをRed (RedはCy5)とした。これ以外の設定はデフォルトとした。スキャンしたアレイデータはTIFファイルで保存し、数値化を行った。
【００４８】
アレイデータの数値化
製造者の指示書に従い、CodeLink（商標） Expression AnalysisによりTIFファイルで保存したアレイデータの数値化とグローバルノーマライゼーションによる正規化を行った。
【００４９】
プローブの絞込み
上記で得られた実験結果から、Quality Flag "Good"以外のプローブ、Y染色体上に座位するプローブ、mRNA 3’末端から遠位に設定されているプローブなどを除外した。さらに、さらに、予備分析により、欠損値が２５％以上あるもの、男女間の発現量の差が大きいもの、アレイ製造時のバッチ間差が大きいものも除外した。これらにより、約55000個のプローブから10,498個のプローブに絞り込んだ。
【００５０】
2. 統計処理
以上のような条件で絞り込んだプローブから、統合失調症患者 抗精神病薬 未投薬群43検体、健常者38検体の2群間での有意差および双極性障害患者32検体と統合失調症患者 抗精神病薬 未投薬群40検体の間で統計学的有意差の認められたプローブ、さらに双極性障害患者32検体と健常者38検体の間で統計学的有意差の認められたプローブを216個抽出した。これらのプローブの配列を配列表の配列番号１３〜２２８に示す。また、各プローブが由来する遺伝子名及びGenBank Accession No.を下記表３に示す。
【００５１】
【表３−１】
【００５２】
【表３−２】
【００５３】
【表３−３】
【００５４】
【表３−４】
【００５５】
【表３−５】
【００５６】
【表３−６】
【００５７】
【表３−７】
【００５８】
【表３−８】
【００５９】
【表３−９】
【００６０】
【表３−１０】
【００６１】
3. 実用化アレイの設計
CodeLink（商品名） 55K Bioarrayは、非常に高価であり、1枚で1検体しか処理、解析ができない。実用化をはかるためには、より低コストで解析が可能なマイクロアレイが必要となる。そこで、CodeLink（商品名） 55K Bioarrayと全く同一の表面処理を施し、これを16個のチャンバーで区切ることで、一度に最大で16検体の処理、解析が可能なCodeLink（商品名） 16-Assay Bioarray（Applied Microarrays社）をベースにした実用化アレイを設計した。上記216遺伝子のプローブの他にグローバルノーマライゼーション用に使用するプローブ（配列番号２２９〜５２７）やメーカーによる管理用プローブなど追加して、以下のようなアレイを設計した。
【００６２】
CodeLink（商品名） 16-Assay Bioarray プローブの内訳
(合計 1714スポット/チャンバー)
・分類予測候補プローブ : 216プローブ × 4重スポット
・ノーマライゼーション用追加プローブ : 299プローブ × 2重スポット
・メーカーによる管理用プローブ : 96プローブ × 各1スポット
・ 規格上の予約プローブ : グリッド (32) , Positive Control (60) , Negative Control (64)
【００６３】
4. CodeLink（商品名） 16-Assay Bioarrayによる測定結果を基にした分類予測（ニューラルネットワーク）
未治療統合失調症患者（統合失調症患者 抗精神病薬 未投薬群）60例、双極性障害患者 48例の遺伝子発現情報を基に、分類予測に優れたニューラルネットワークによる分類予測モデルの構築を試みた。
【００６４】
分類予測モデルを構築するにあたって、未治療統合失調症患者40検体、双極性障害患者32検体を学習例として分類予測モデルの構築に用い、モデルの構築に関与していない、残りの検体を試験例（未治療統合失調症患者20検体、双極性障害患者16検体）としてモデルの評価を行うHold out cross validation法により検証を行った。
【００６５】
(1) 遺伝子発現情報の取得
216プローブを含む上記実用化アレイを用いて、未治療統合失調症患者60例、双極性障害患者48例の遺伝子発現情報を取得した。採血、RNAの抽出、cRNAの調製、アレイへのハイブリダイゼーション、蛍光シグナル（蛍光色素Cy5）のスキャニングは、上記と同様に行なった。スキャナーで読み取った1714スポットの画像データは、CodeLink（商標） Expression Analysisソフトウェアを用いて数値化及びグローバルノーマライゼーションによる正規化を行なった。
【００６６】
(2) ニューラルネットワークによる分類予測モデルの構築
市販の解析ソフトArrayAssist（登録商標）（STRATAGENE社）に搭載されているニューラルネットワークを用いて、正規化したデータの解析を行ない、分類予測アルゴリズムの構築を試みた。分類予測アルゴリズムとは、あらかじめ属性が明らかになっているデータセットを入力し「学習、訓練」を行なうことで、最適な解を出力することができるようになる一連のアルゴリズムであり、ニューラルネットワークは、学習効果の高さから高い分類精度のアルゴリズムが構築できるとされている。
【００６７】
正規化されたデータの一部（未治療統合失調症患者40検体、双極性障害患者32検体）を学習例として、ArrayAssistのニューラルネットワークに入力し、アルゴリズムの構築を行なった。Feature Selectionは変数増加法（Forward Selection）により行ない、学習データを３組に分けたcross validation（N-fold cross validation (N=3)）により分類予測アルゴリズムを構築した。具体的には、学習例のデータセットを３分割し、データセットを入れ替えながら、216個のプローブのうちで有意差のあったプローブを一つずつ使って分類予測を行ない、最も正しく分類できたプローブを分類予測に用いるプローブとして採用することとし、これを順次繰り返して採用するプローブを追加していった。このようにして、徐々に用いるプローブを増やしていき、正しく分類できた割合（Number of Class Accuracy(%)）がプラトーに達したところで学習を終了させた。
【００６８】
次いで、このようにして学習させたアルゴリズムを用いて、試験例のデータセットを分析した。Number of Class Accuracyがプラトーに達した点で使用されているプローブセットについての正規化データを上記学習済みアルゴリズムに入力し、試験例についての該アルゴリズムによる分類が臨床診断とどの程度一致するかを検証した。
【００６９】
ニューラルネットワークの各種パラメーター（学習効率、Momentum、繰り返し数、レイヤー数、ニューロン数）を種々に変化させて多数のアルゴリズムを構築し、それぞれについて上記したcross validationによる学習及び試験例を用いた診断精度の検証を行なった。
【００７０】
その結果、パラメーターを下記の通りに設定したアルゴリズムにおいて、試験例を最も正しく分類することができた。
学習効率：0.45
Momentum：0.3
繰り返し数：150
レイヤー数：1
ニューロン数：3
【００７１】
このアルゴリズムによる学習例及び試験例についての予測結果を表４及び表５に示す。また、このアルゴリズムについてのForward Selectionの結果を図１に示す。
【００７２】
【表４】
【００７３】
【表５】
【００７４】
図１に示される通り、構築されたアルゴリズムによれば、12個のプローブ（表２、前掲）による発現データを用いて統合失調症と双極性障害とを精度良く分類することができる。
【００７５】
5. CodeLink（商品名） 16-Assay Bioarrayによる測定結果を基にした分類予測（重回帰分析）
上記と同様に、未治療統合失調症患者60例、双極性障害患者48例の遺伝子発現情報を用いて、重回帰分析による分類予測を試みた。上記12個のプローブによる発現データを説明変数として用いて、上記学習例について市販のソフトウェア（SPSS）を用いて重回帰分析を行ない、予測式を構築した。重回帰分析は、統合失調症患者で従属変数が大きくなるように設定して行った。次いで、構築された予測式を用いて、上記試験例について従属変数を計算した。なお、得られた予測式は以下の通りである。
Y=(A1X1+A2X2+A3X3+A4X4+A5X5+A6X6+A7X7+A8X8+A9X9+A10X10+A11X11+A12X12+C)×100
X1は、FLJ21881（GE492524 配列番号18）の遺伝子発現量
X2は、DLGAP3（GE54859 配列番号44）の遺伝子発現量
X3は、FAM20A （GE56606 配列番号61）の遺伝子発現量
X4は、MAX （GE59858 配列番号90）の遺伝子発現量
X5は、ZNF74（GE60153 配列番号97）の遺伝子発現量
X6は、DIAPH2 （GE62680 配列番号120）の遺伝子発現量
X7は、CR1 （GE62914 配列番号125）の遺伝子発現量
X8は、RAD54B （GE79729 配列番号161）の遺伝子発現量
X9は、GPR30 （GE80129 配列番号167）の遺伝子発現量
X10は、SCD5 （GE82995 配列番号195）の遺伝子発現量
X11はIMAGE:5785888 （GE878897 配列番号218）の遺伝子発現量
X12は、INSL3 （GE88024 配列番号220）の遺伝子発現量
をそれぞれ指す。
各遺伝子の発現量に乗ずる係数は、それぞれ、
A1は、-0.166864749248881
A2は、0.578595208826776
A3は、-0.251720387137894
A4は、0.285088434152454
A5は、0.149134281702735
A6は、-0.581754365047968
A7は、0.965099433225613
A8は、-0.237927470298808
A9は、0.724852821407317
A10は、0.467110697687733
A11は、1.55443576023811
A12は、-0.0695649776248728
定数Cは、-1.20827077326351
である。
【００７６】
従属変数５０をカットオフ値として集計した結果を表６及び表７に示す。また、学習例及び試験例の各検体について計算された従属変数を図２に示す。
【００７７】
【表６】
感度：95.0% (38/40)、特異度：87.5% (28/32)、正答率：91.7% (66/72)
【００７８】
【表７】
感度：85.0% (17/20)、特異度：81.3% (13/16)、正答率：83.3% (30/36)
【００７９】
以上の通り、カットオフ値を５０とすると、試験例において感度・特異度ともに８０％を超える結果となった。重回帰分析によっても、上記１２種類の遺伝子発現量を用いて統合失調症と双極性障害とを精度良く分類することができた。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明の実施例で行なった、ニューラルネットワークによる分類予測モデルにおける、プローブ数と正答率の関係を示す図である。
【図２】重回帰分析により求めた学習例及び試験例の各検体の従属変数を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された試料における下記(1)〜(12)の遺伝子群の発現量を指標とする、双極性障害と統合失調症の判別方法。
(1) FLJ21881（配列番号1）
(2) DLGAP3（配列番号2）
(3) FAM20A（配列番号3）
(4) MAX（配列番号4）
(5) ZNF74（配列番号5）
(6) DIAPH2（配列番号6）
(7) CR1（配列番号7）
(8) RAD54B（配列番号8）
(9) GPR30（配列番号9）
(10) SCD5（配列番号10）
(11) IMAGE:5785888（配列番号11）
(12) INSL3（配列番号12）
【請求項２】
上記(1)〜(12)の遺伝子群の発現量のみを指標とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子群の発現量は、配列番号18、配列番号44、配列番号61、配列番号90、配列番号97、配列番号120、配列番号125、配列番号161、配列番号167、配列番号195、配列番号218及び配列番号220に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブにより測定される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記試料における前記遺伝子群の発現量を、あらかじめ測定した、既知の双極性障害患者及び統合失調症患者における前記遺伝子群の発現量と対比する工程を含む、請求項１ないし３ののいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記対比は、既知の双極性障害患者及び統合失調症患者における前記遺伝子群の発現量を用いて変数増加法により学習させたニューラルネットワークにより行なわれる請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記対比は、前記遺伝子群の発現量を説明変数として用いた重回帰分析により行なわれる請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記試料について計算された従属変数を、既知の双極性障害患者及び統合失調症患者について計算された従属変数に基づいて定められたカットオフ値と対比することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子群の発現量は、配列番号13〜228に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブがスポットされたアレイにより測定される遺伝子発現量のシグナル強度をグローバルノーマライゼーション法により正規化したものである、請求項３ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アレイは配列番号229〜527に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記試料は血液である請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
生体から分離された試料における下記(1)〜(12)の遺伝子群の発現量を指標とする、双極性障害と統合失調症の判別方法。
(1) FLJ21881（配列番号1）
(2) DLGAP3（配列番号2）
(3) FAM20A（配列番号3）
(4) MAX（配列番号4）
(5) ZNF74（配列番号5）
(6) DIAPH2（配列番号6）
(7) CR1（配列番号7）
(8) RAD54B（配列番号8）
(9) GPR30（配列番号9）
(10) SCD5（配列番号10）
(11) IMAGE:5785888（配列番号11）
(12) INSL3（配列番号12）
【請求項２】
上記(1)〜(12)の遺伝子群の発現量のみを指標とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子群の発現量は、配列番号18、配列番号44、配列番号61、配列番号90、配列番号97、配列番号120、配列番号125、配列番号161、配列番号167、配列番号195、配列番号218及び配列番号220に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブにより測定される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記試料における前記遺伝子群の発現量を、あらかじめ測定した、既知の双極性障害患者及び統合失調症患者における前記遺伝子群の発現量と対比する工程を含む、請求項１ないし３ののいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記対比は、既知の双極性障害患者及び統合失調症患者における前記遺伝子群の発現量を用いて変数増加法により学習させたニューラルネットワークにより行なわれる請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記対比は、前記遺伝子群の発現量を説明変数として用いた重回帰分析により行なわれる請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記試料について計算された従属変数を、既知の双極性障害患者及び統合失調症患者について計算された従属変数に基づいて定められたカットオフ値と対比することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子群の発現量は、配列番号13〜228に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブがスポットされたアレイにより測定される遺伝子発現量のシグナル強度をグローバルノーマライゼーション法により正規化したものである、請求項３ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アレイは配列番号229〜527に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記試料は血液である請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−５７４０７（Ｐ２０１０−５７４０７Ａ）
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２６０３１（Ｐ２００８−２２６０３１）
【出願日】平成２０年９月３日（２００８．９．３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）この特許は産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願である。
【出願人】（３９００３７００６）株式会社エスアールエル (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月３日（２００８．９．３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）この特許は産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願である。
【出願人】（３９００３７００６）株式会社エスアールエル (29)
【Ｆターム（参考）】
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