天然の高次構造を有する、及び／又は可溶型の膜貫通型ポリペプチドを高収率で産生する方法には、非イオン性又は双性イオンの界面活性剤で可溶化すること、並びに細菌細胞内で高収率の膜貫通型ポリペプチドを発現するためのプロモーターと発現ベクターの使用を含む。変異させたプロモーターにより細菌細胞内での膜貫通型ポリペプチドを厳密に調整できる。

【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の背景)
複合の、膜貫通型タンパク質は、宿主細胞内で発現することが困難である。通常は、これらのタンパク質は宿主に有毒であり、様々な発現系では発現されるタンパク質の量が低い。加えて、これらの膜貫通型ポリペプチドは可溶化するのが困難であり、その結果凝集及び変性により有効利用のために十分な品質かつ十分な量を産生することが難しい。
膜貫通型タンパク質の一例は、ＣＤ２０、高親和性ＩｇＥレセプターβ鎖、ＨＴｍ４などを含む４-ドメインサブファミリＡ(ＭＳ４Ａ)遺伝子ファミリーである。これらのタンパク質は、少なくとも細胞表面の４つの膜貫通ドメインに構造的に関連がある(Ishibashi 等, 2001, Gene 264:87-93)。全体のアミノ酸配列同一性がＭＳ４Ａファミリーのポリペプチドの２５〜４０％の範囲であるにもかかわらず、最初の３つの膜貫通ドメインのアミノ酸は全体のポリペプチドより高い同一性及び相同性を共有する(上掲のIshibashi 等, 2001、Liang 等, 2001 , Genomics 72: 119-127)。また、構造的に、ＭＳ４Ａポリペプチドは細胞外ループの共通のモチーフを共有する。ＭＳ４ＡポリペプチドのＮ末端及びＣ末端は細胞膜の細胞質側にみられる(上掲のIshibashi 等, 2001)。Ｎ末端及びＣ末端は、ＭＳ４Ａ遺伝子ファミリーのポリペプチドの中でも非常に大きな配列多様性を表出する(上掲Ishibashi 等, 2001)。
【０００２】
多くの構造的類似点にもかかわらず、ＭＳ４Ａ遺伝子ファミリのポリペプチドは個々の細胞型で不均一に発現される(上掲のLiang 等, 2001)。ＣＤ２０は、Ｂ細胞において、のみ発現される(Stashenko 等, 1980, J. Immunol, 125: 1678-1685)。高親和性ＩｇＥレセプターβ鎖(ＦｃεＲＩβ)は、肥満細胞及び好塩基球のみに発現される(Kinet, 1999, Annu. Rev. Immunol, 17: 931-972)。ＦｃεＲＩβはＩｇＥを結合して、抗原結合により誘発される細胞内シグナル伝達(すなわち脱顆粒)を媒介する(Dombrowicz 等, 1998, Immunity, 8: 517-529、Lin 等, 1996, Cell, 85: 985-995)。ＨＴｍ４は、造血性組織において、発現され、造血性細胞周期調節因子として働く(Donato 等, 2002, J. Clin. Invest., 109: 51-58)。これらのタンパク質は、共通の特徴である膜貫通型ペプチドの複雑な構造を共有する。この特徴は本タンパク質が宿主細胞内で発現すること、及び「天然の」高次構造の細胞膜から可溶化することを非常に困難にしている。
【０００３】
膜貫通型ポリペプチド、例えばＣＤ２０は、癌及び自己免疫性疾患などの疾患の治療法の標的となりうる。ＣＤ２０は、２０年以上前にＢ細胞のマーカーとして最初に同定され、現在では大半のＢ細胞リンパ腫に存在するマーカーとして確立されている。ＣＤ２０は非ホジキン性リンパ腫(ＮＨＬ)の治療のモノクローナル抗体治療法の標的であり、具体的には、ＮＨＬの治療のリード治療法であるキメラ抗体リツキシマブ(リツキサン(登録商標))の標的である。リツキシマブはＢ細胞に発現されるＣＤ２０を認識する。リツキシマブの結合は高次構造に依存しており、位置１６７と１８３にシステイン残基を含有する第３と第４の膜貫通らせん領域の間の従属したループ構造を有するＣＤ２０と結合する。
ＣＤ２０などの膜貫通型ポリペプチドを標的とする治療法の開発における重大な障害は、宿主細胞、特に細菌細胞内でこれらポリペプチドが十分量産生できないこと、及び、精製した組換えないしは天然に生じる膜貫通型ポリペプチドを天然の高次構造で産生できないことである。天然に生じる及び／又は組換え膜貫通型ポリペプチドを天然の高次構造で生産して、可溶化する方法が必要とされる。
【０００４】
(発明の概要)
現在、例えば単一又は複数の膜貫通ドメインからなる膜貫通型ポリペプチドは、良好な収率及び十分な天然の高次構造で、効率的に細菌細胞宿主内で産生して細菌細胞膜から可溶化することができ、例えば定量アッセイにおいて、免疫原及びリガンドとして利用可能であることが発見されている。膜貫通型ポリペプチドは、本明細書に記載の方法によって、有用な量及び有用な「天然の」高次構造で産生して、単離し、可溶化できる。
膜貫通型ポリペプチドを産生する方法は、強く、緊密に制御されるプロモーター、例えば大腸菌のｐｈｏＡプロモーター下で、細胞、例えば細菌細胞での発現を含む。実施態様では、厳しく制御されるプロモーターは、ポジティブ調節成分及びネガティブ調節成分を含み、これらの複数を含有してもよい。例えば、異種性のポジティブ又はネガティブの調節成分が挿入される場合、プロモーターは変異体プロモーターであってもよい。さらに、プロモーターは、存在しうる上流プロモーターの読み過ごしの可能性を防ぐために配置される転写終結区、例えばλ転写終結区を含みうる。大腸菌内のタンパク質の発現のために、プロモーターは、付加したｌａｃオペレーターを含有する以下の実施例に開示した変異体プロモーターであるｐｈａｃやｔｐｈａｃなどの付加したネガティブ調節成分を含有する、例えばｐｈｏＡないしはその変異体でもよい。
【０００５】
膜貫通型ポリペプチドを発現するためのベクターは、緊密に制御されるプロモーターの制御下に膜貫通型ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む。このようなポリペプチドは、例えば、少なくとも４つの膜貫通ドメインを有するもの、例えば下記の実施例に開示するＣＤ２０及びＣ２Ｓ-ＣＤ２０変異体を含む。コードされるポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ないし２４以上の膜貫通ドメインを有しうる。さらに、例えば、７つの膜貫通ドメインを有するＥＧ-ＶＥＧＦレセプターであるＧＰＲ７３、高親和性ＩｇＥレセプターβ鎖(ＦｃεＲＩβ)、ＨＴｍ4、ＭＳ４Ａ4Ａ、ＭＳ４Ａ6、ＭＳ４Ａ7及びＲＡ１ｃを含む。また、ベクターは、宿主細菌細胞の稀なコドンｔＲＮＡ遺伝子、及び／又は翻訳開始を亢進するためのリーダーペプチドをコードする、はじめのコドンに近接して位置するポリヌクレオチド配列を含みうる。リーダー配列は、一般に、強い翻訳開始配列(ＴＩＳ)及び効率的な伸長のためのスペーサー配列を含有する。翻訳開始配列は、本出願ではＴＩＳと称するが、翻訳開始領域(ＴＩＲ)とも称する。
ある実施態様では、リーダー配列は、ｔｉｐリーダー配列の少なくとも一部、例えばおよそ６〜およそ１２アミノ酸をコードする強いＴＩＳを含有する。スペーサー配列は、翻訳開始配列を第一膜貫通領域から切り離すものであって、一般に、宿主細胞内で頻繁に発現されることが知られているタンパク質の内部の小さい部分、例えば大腸菌の「Ｅ」タンパク質をコードする。スペーサ配列は、一般的に構造化されていない、主に親水性のものである。
【０００６】
ある実施態様では、可溶性の多膜貫通型タンパク質は、緊密に制御されるプロモーター、例えばｐｈｏＡプロモーターないしはその変異体、ネガティブ及び／又はポジティブ制御成分を含んでなり、ＴＩＳとタンパク質の第一膜貫通領域の間に位置する翻訳伸長スペーサー配列と強力な翻訳開始配列を含有するリーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列を含有してなる。
ベクターは、例えば、ｐｈｏＡ、ｐｈａｃ又はｔｐｈａｃプロモーター、ネガティブ調節成分、例えばｌａｃオペレーター、翻訳開始配列をコードするリーダー配列、例えば９つのアミノ酸配列KAIFVLKGSなどのｔｒｐリーダーの一部、及びｔｒｐＥ遺伝子の一部などの翻訳伸長配列をコードするスペーサー配列、例えば本明細書に記載のＬＥリーダー(配列番号25)又はｓＬＥリーダー(配列番号26)にみられるものを含みうる。
膜貫通型ポリペプチドは、収集されて、界面活性剤に可溶化することによって、宿主細胞膜から精製されてもよい。ある実施態様では、非イオン又は双性イオンの界面活性剤、例えばｎ-ドデシルホスホコリン、ＤＤＰＣを用いて膜貫通型ポリペプチドを可溶化する。ＣＤ２０などの単離された多膜貫通型ポリペプチドは、これらの界面活性剤に可溶性である。単離された、可溶性の多膜貫通型ポリペプチドは、細胞に発現される場合、ポリペプチドを認識する抗体により認識されるために十分な「天然の」構造を有しており、免疫原及びアッセイリガンドとして有用である。
【０００７】
配列の一覧

【０００８】
(詳細な説明)
Ｉ．定義
「親和性成熟」抗体は、標的抗原に対する抗体の結合親和性を亢進する1つ以上の高頻度可変領域に1つ以上の変更を有する抗体である。親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法、例えばＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリング(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783, 1992)、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発(Barbas等, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等, J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992))、及びファージディスプレイ(Lowman 等, 1991 , Biochemistry, 30: 10832-10838；Hawkins 等, 1992, J. MoI Biol, 226, 889-896；米国特許第6,172,213号)などにより生産できる。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、ヒト化の、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び抗体断片が含まれる。
【０００９】
「抗体断片」は、完全な抗体の部分、一般的には完全な抗体の抗体結合又は可変領域を含有するものである。抗体断片の例には、限定するものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、Ｆ(ａｂ‘)_２断片、ｄＡｂ断片、ヒンジレス抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、単一アーム抗原結合分子(軽鎖、重鎖及びＮ末端切断型重鎖定常領域を含むものであり、単一アーム抗原結合分子の半減期を増加することができるＦｃ領域を形成するために十分なもの)、及び直鎖抗体などがある。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が抗体産生中に生じうる変異体を除いて基本的に同一である。
「モノクローナル抗体」なる用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
【００１０】
「生物学的試料」という用語は、何れかの動物、好ましくは哺乳動物、例えばヒトからの身体試料を示す。この生物学的試料は、例えば血管性、糖尿病性、又は癌の患者に由来する。身体試料には、例えば、血清、血漿、ガラス体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊膜液、ミルク、全血、尿、脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、及び組織培養液、並びにホモジナイズされた組織などの組織抽出物、細胞性抽出物、又は全細胞ないし組織を含む。生物学的試料は、例えば血清、血漿又は尿である。
「バッファー」は、酸−塩基結合成分の挙動によるｐＨの変化に耐える緩衝溶液である。
「ＣＤ２０突然変異体」又は「ＣＤ２０変異体」なる用語は、参照するＣＤ２０アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有するか、参照するＣＤ２０核酸配列と異なる核酸配列によってコードされるＣＤ２０ポリペプチドを指す。ＣＤ２０変異体は、参照配列の一又は複数のアミノ酸の置換、欠損又は挿入によって生成されうるアミノ酸配列の変化を含む。
「捕捉試薬」という用語は、試料中の標的分子を結合して捕捉することができる試薬を指す。好適な条件化で、この捕捉試薬−標的分子の分子複合体が試料の残りの部分から分離される。捕捉試薬は固定化されているか又は固定化可能である。例えば、サンドイッチイムノアッセイにおいて、捕捉試薬は、標的抗原に対する抗体又は異なる抗体の混合物である。
【００１１】
「界面活性剤」なる用語は、長鎖脂肪族塩基ないし酸の塩類又は糖などの親水性成分を含みうる薬剤、及び親水性性質と疎水性性質を保持する薬剤を指す。親水性と疎水性の性質を有すると、界面活性剤は特定の効果を及ぼしうる。本明細書中で用いる界面活性剤は、細胞性膜を崩壊して、ポリペプチドを可溶化する能力を有する。
「検出可能な抗体」なる用語は、検出手段によって増幅される標識によって直接的に、又は標識された他の抗体などによって間接的に検出することができる抗体を指す。直接的な標識のために、抗体は、典型的には、いくつかの手段によって検出可能な成分に結合される。典型的には、抗体は、限定するものではないが、蛍光標識、放射性同位体又は酵素基質標識を含む検出可能な標識にて標識してもよい。標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな３つの分類のうちの何れかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテン(例えばジゴキシン)とコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体(例えば抗ジゴキシン抗体)とコンジュゲートさせる。
【００１２】
「検出用試薬」なる用語は、標識の存在を検出するために使用する分子又は薬剤を指し、マイクロタイタープレート上に捕捉される標識などの固定された標識を増幅する検出試薬を含む。検出手段は、例えば、蛍光又は色素産生成分により標識されるアビジンやストレプトアビジンなどの検出試薬でありうる。
「発現タグ」なる用語は、成熟ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されるか、成熟ポリペプチドの特定の残基に結合されて、発現されるポリペプチドを同定する及び／又は単離するための一手段を提供する標識ないしペプチド配列を指す。発現タグは、ベクターの成分としてコードされるか、発現ベクター内に挿入されるポリペプチドコード配列の一部を含んでもよい。発現タグの例には、限定するものではないが、ポリＨｉｓタグ(米国特許第4,569,794号)、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ビオチン、アビジンなどがある。このようなタグは公知であり、市販されている(例えば、Qiagen, Valencia, CAを参照のこと)。
「異種」という用語は、正常では見られない場合に生じる成分を指す。例えば、プロモーターは、異種性の核酸配列、例えば正常ではプロモーターに作用可能に結合して見られない配列に結合してもよい。本明細書中でプロモーター成分を表すために用いられる場合、異種は、正常では天然のプロモーターに作用可能に結合して見られるものと、配列、種又は数が異なるプロモーター成分を意味する。例えば、プロモーター配列における異種性の調節成分は、プロモーター調節を亢進するために付加された異なるプロモーターの調節／制御成分、又は同じプロモーターの付加的な調節成分でもよい。
【００１３】
本明細書中で用いる「発現を誘導する」なる句は、特定の遺伝子を含有する細胞をエフェクター試薬ないしインデューサ試薬又は条件に曝すことによって特定の遺伝子からの転写及び／又は翻訳の量や速度を増加することを意味する。
「インデューサ」は、細胞集団に与えられたとき、特定遺伝子からの転写量を増大させる化学的又は物理的薬剤である。これらは通常小分子であり、その効果は特定のオペロン又は遺伝子群に特異的であり、糖、リン酸、アルコール、金属イオン、ホルモン、熱、冷却などを含む。例えば、イソプロピル(β)-Ｄ-チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)及びラクトースはｔａｃＩＩプロモータのインデューサであり、Ｌ-アラビノースはアラビノースプロモータの好適なインデューサである。ｐｈｏＡ(Chang 等, 1987, Gene, 55: 189-196)やｐｈｏ５などのｐｈｏ遺伝子プロモーターは、培地の低リン酸濃度によって誘導される。
試薬は、試薬の官能基と固相の表面上の反応基との間で共有結合を形成することによって、支持体中、又は、指示体上に「固定されて」もよい。他の実施態様では、試薬は、吸着及びイオン結合によって固相に「固定される」か、又は固相内に、例えば細胞又は格子型ポリマー又はマイクロカプセル内に内包されてもよい(Holenberg 等, in Enzymes as Drugs, John Wiley & Sons NY (1981), pages 396-411を参照)。試薬は、基本的に、固相に固定されると、対象のポリペプチドに結合する及び／又は修飾する能力を保持する。
【００１４】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。単離されたポリペプチドは、天然で結合する少なくとも一つの成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。単離されたポリペプチドは、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
本明細書中で用いる「単離されたＣＤ２０」は、細胞又は膜から遊離しているＣＤ２０タンパク質であり、例えば、界面活性剤溶液中で可溶型となりうる。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、同定され、天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、例えば、天然で結合するすべての成分と結合していない。単離された核酸分子は、天然に見出される形態或いは設定以外のものである。
【００１５】
「ＩＰＴＧ」は、化合物「イソプロピル(β)-Ｄ-チオガラクトピラノシド」であり、ｌａｃオペロンのインデューサーとして本願明細書において、用いる。ＩＰＴＧは、ｌａｃリプレッサーの高次構造変化に作用してその結果ｌａｃオペレーターからｌａｃリプレッサーを解離するｌａｃリプレッサーに結合する。ｌａｃリプレッサーが結合しなければ、作用可能に結合したプロモーターは活性化され、下流の遺伝子は転写される。
「ｌａｃオペレーター」なる用語は、例えばJacob 等, 1961, J. MoI. Biol., 3: 318-356に記載されるように、ｌａｃリプレッサーであるｌａｃＩに結合されうる核酸配列を指す。ｌａｃリプレッサーがｌａｃオペレーターに結合する場合、プロモーターは活性化されない。ｌａｃリプレッサーが誘導されてオペレーターから解離する場合、プロモーターは活性化される。
「リーダー配列」なる用語は、対象のコード配列の上流に配置される核酸配列を指す。本願明細書に記載のリーダー配列は効率的にリボソームと結合することが知られている特定の配列を含有しており、したがっていくつかのポリヌクレオチドの翻訳開始の効率をより大きくする。本願明細書に記述されるように、リーダー配列は本明細書で定義される翻訳伸長を亢進するためのスペーサ配列及び翻訳開始配列を含有する。
【００１６】
本明細書中で用いる「低リン酸培地」又は「リン酸制限培地」なる用語は、溶液のリン酸塩を低濃度で含有する培地を指す。例えば、リン酸培地濃度がおよそ４μＭ(マイクロモル)以下に低下すると、ｐｈｏＡプロモーターは作動する。しかしながら、リン酸制限培地が４μＭ(マイクロモル)以上のリン酸を含有するように設定されると、プロモーターが作動する前に細胞が成長しうる。リン酸制限培地の例は、限定するものではないが、Simmons 等, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147に記載のＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地(微量の酵母抽出物及び他の供与源からの混入物のために、およそ１．９Ｍの初期リン酸濃度を含有する)及びChang 等, 1987, Gene 55: 189-196に記載の培地などである。
ここで用いる「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物として分類される任意の動物、例えばヒト、家畜及び農場動物、及び動物園の動物、スポーツ用動物、又は愛玩用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを指す。哺乳動物は、例えばヒトでもよい。
「ＭＳ４Ａポリペプチド」なる用語は、膜貫通型４-ドメイン、サブファミリＡ(ＭＳ４Ａ)遺伝子ファミリの遺伝子によって、コードされるポリペプチドを指す。Ishibashi 等, 2001 , Gene, 264:87-93を参照。ＭＳ４Ａポリペプチドは、天然に生じるＭＳ４Ａポリペプチド又は天然に生じるＭＳ４Ａポリペプチドの変異体でありうる。ＭＳ４Ａ遺伝子ファミリのメンバーは、構造的類似点を有するポリペプチドを有する。それぞれ、４回細胞膜を貫通し、Ｎ末端とＣ末端は細胞膜の細胞質側に位置し、ともにおよそ５０アミノ酸長の細胞外ループを含有する。ＭＳ４Ａポリペプチドは、ＣＤ２０、高親和性ＩｇＥレセプターβ鎖、ＨＴｍ４、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＭＳ４Ａ７などを含む。また、本用語は、ＭＳ４Ａ遺伝子によって、コードされるポリペプチドの変異体及びアイソフォームを含む。この遺伝子ファミリは哺乳動物に保存されており、「ＭＳ４Ａポリペプチド」はヒト、マウス、ラット及び同類ポリペプチドを含む。
【００１７】
ＭＳ４Ａポリペプチドの「変異体」は、参照配列と異なるアミノ酸配列を含有するか又は参照配列と異なる核酸配列によって、コードされるＭＳ４Ａポリペプチドを指す。参照配列は、完全長天然のＭＳ４Ａポリペプチド配列、ＭＳ４Ａポリペプチドの細胞外ドメイン又は完全長ＭＳ４Ａポリペプチド配列の他の任意の断片でありうる。いくつかの実施態様では、参照配列は、天然に生じるＣＤ２０の核酸配列又はアミノ酸配列、例えば配列番号１(アミノ酸配列)又は配列番号２(核酸配列)である。ＭＳ４Ａポリペプチド変異体は、一般に参照配列と少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性を有する。
ＭＳ４Ａポリペプチド変異体は、対立遺伝子変異体、並びに一以上のヌクレオチド又はアミノ酸の変異により調製される変異体などの「天然に生じる」変異体を含む。変異体ポリペプチドは、ＭＳ４Ａポリペプチドの核酸配列又はアミノ酸配列を修飾することにより調製されてもよい。例えば、変異体は、ヌクレオチド又はアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により調製されてもよい。本発明の方法で有用な変異体ＭＳ４Ａポリペプチドは、ＭＳ４Ａ参照配列、例えば、配列番号１などのヒトＣＤ２０の参照配列に、例えば、少なくとも８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。
【００１８】
「膜貫通型タンパク質」又は「膜貫通タンパク質」なる用語は、細胞膜のリン脂質二重層に埋め込まれる一又は複数のセグメントを含んでなるポリペプチドを指す。膜貫通型タンパク質は、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン又はその両方を更に含みうる。細胞膜は、細菌、酵母、哺乳動物細胞などの膜であってもよい。
「膜貫通型ドメイン」又は「膜貫通領域」なる用語は、細胞膜のリン脂質二重層に埋め込まれる膜貫通型タンパク質の一部を指す。
「天然の高次構造」なる用語は、その天然の状態のポリペプチドの三次元形状を指す。天然の高次構造は、ポリペプチドの三次又は四次構造を指しうる。ここで使用しているように、可溶化された膜貫通型ポリペプチドの「天然の高次構造」は、十分に可溶化されたポリペプチドであるため、細胞の膜貫通型ポリペプチドを認識する抗体を産生するための免疫原として、又は細胞の膜貫通型ポリペプチドを認識する抗体を結合する結合リガンドとして有用である。
「非イオン」なる用語は、溶液中でイオン化しない、すなわち、「イオン的に」不活発である分子を指す。
【００１９】
核酸又はポリヌクレオチドは、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠内にある。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「プラスミド」は、小文字「p」とその前後に添えた大文字および／または数字によって指定される。本明細書に記載の出発プラスミドは市販されているか、公けに無制限に入手できるか、もしくはそれらの入手可能なプラスミドから公表された方法に従って構築することができる。また、他の等価なプラスミドも当技術分野で知られており、それらは通常の当業者には明らかだろう。
【００２０】
ここで同定したポリペプチドに関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能である。
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、ＸはＡ及びＢのプログラムアラインメントの配列アラインメントプログラムによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【００２１】
「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、参照ポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ-２又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴニズムを含め、アラインメントを測定するための好適なパラメータは公知の方法によって決定することができる。
ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、ＷはプログラムアラインメントのＣ及びＤの配列アラインメントプログラムによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２２】
「ｐｈｏＡプロモーター」なる用語は、アルカリホスファターゼ(ｐｈｏＡ)の構造遺伝子のプロモーターを指す。様々な細菌、特に腸内細菌科は、ｐｈｏＡ遺伝子及びｐｈｏＡプロモーターを保持する。大腸菌ｐｈｏＡプロモーターは、本願明細書において、例証されており、配列番号5の核酸配列を有する。
「突然変異体プロモーター」又は「変異体プロモーター」なる用語は、参照配列と異なる核酸配列を有するプロモーターを指す。例えば、表５に示すように、変異体ｐｈａｃ及びｔｐｈａｃプロモーターは、ｐｈｏＡ参照プロモーターと異なる。プロモーターの核酸配列の変化は、一又は複数の核酸の置換、欠失又は挿入から生じうる。
「ｐｈｏＡ」なる用語は、アルカリホスファターゼ金属酵素をコードする遺伝子を指す。大腸菌において、ｐｈｏＡ酵素は、ｐｈｏＡ発現が無機リン酸塩が枯渇すると１００倍以上に上方制御されるリン酸レギュロンの一部である(例えば、Kriakov 等, 2003, J. Bαcteriol., 185: 4983-4991を参照)。大腸菌以外の細菌種は、ｐｈｏＡ相同性を有する(例えば、クレブシエラ菌種,赤痢菌種、マイコバクテリウム・スメグマチス)。
【００２３】
「ポリ-Ｈｉｓ」なる用語は、一般に、複数のヒスチジン残基、一般に６〜１０のヒスチジン残基を含有するアミノ酸残基を指す。発現タグとして複数のヒスチジン残基がしばしば使われる。したがって「ポリ-Ｈｉｓタグ」と称される(米国特許第4,569,794号を参照)。ポリｈｉｓタグは、例えば、ニッケルカラムなどのアフィニティーカラムに試料を適用することによって、ポリペプチドを検出して及び／又は精製するために用いてもよい。
ここで用いられる「ポリペプチド」は、一般におよそ１０以上のアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を指す。ポリペプチドは「異種性」であることを意味する「外因性」、すなわち、細菌細胞により産生されるヒトポリペプチドなどの利用されている宿主細胞に対して外来性のものでありうる。
「霊長類」は、ヒト、類人猿、サル及び関連した品種、例えばキツネザル及びメガネザルを含む任意の分類学上の哺乳動物を意味すると解釈される。
「精製する」とは、組成物から少なくとも一つの混入物を除去する(完全に又は部分的に)ことによって、例えば、組成物中の膜貫通型ポリペプチドの純度の程度を増やすことを意味する。「精製工程」は、「基本的に純粋な」組成物が生じる全体の精製方法の一部であってもよい。基本的に純粋な組成物は、組成物の総重量をもとにして、少なくともおよそ９０重量％の対象のポリペプチドを含有しており、少なくともおよそ９５重量％を含有してもよい。
【００２４】
「稀なコドン」又は「微量なｔＲＮＡ」なる用語は、特定の細胞型の発生量が低い特定のコドン又はｔＲＮＡを指す。例えば、大腸菌細胞におけるｔＲＮＡの発生量とコドン選択性について記載している、Dong 等, 1996, J. MoI. Biol., 260: 649-663を参照のこと。
「制御成分」又は「調節成分」なる用語は、転写の開始を制御しているＤＮＡ配列を指す。調節又は制御成分の例には、ＴＡＴＡボックス、オペレーター、エンハンサーなどが含まれるが、これに限定されるものではない。調節成分又制御成分は、ネガティブ調節成分とポジティブ調節成分とを含む。ネガティブ調節成分は、転写活性化のために取り除かれるものである。多くのこのようなネガティブ調節成分は公知であり、例えばオペレーター／リプレッサーシステムである。例えば、ｌａｃレプレッサーに対するＩＰＴＧの結合はｌａｃオペレーターから解離して、活性化して転写が可能となる。他のネガティブ成分には大腸菌ｔｒｐやλシステムが含まれる。ポジティブ調節成分は転写活性化のために付加されるものである。このような多くのポジティブ調節成分は公知であり、大腸菌ｐｈｏボックス及びｐｈｏＢを結合するｐｈｏボックスの変異体、ＭａＩＴ ＤＮＡ結合部位、ＡｒａＣ ＤＮＡ結合部位などが含まれる。例えば、ｐｈｏＡプロモーターのｐｈｏボックスに対するｐｈｏＢの結合はプロモーターの活性化を誘導する。
【００２５】
天然ではポジティブ調節成分とネガティブ調節成分を含有するプロモーターは稀である。ｍｅｔＥプロモーターは一つの例である。例えば、Neidhardt, Ed., 1996, Escherishia coli and Salmonella, Second Ed., pages 1300-1309を参照。公知のポジティブとネガティブの調節成分の記載は、例えば、この引用文献にみられる。いくつかの実施態様では、プロモーターは、基礎発現を直接的に調節するポジティブ及びネガティブの調節成分を有する。プロモーターの付加的な調節を達成するプロモーターの範囲内、又は、該プロモーターに近接したポジティブ又はネガティブの調節成分の配置は公知であり、例えば、Escherishia coli and Salmonella (Supra) 頁1232- 1245に記述される。
ここで言う「リツキシマブ」又は「リツキサン(登録商標)」なる用語は、一般的にＣＤ２０抗原に対する遺伝学的に操作したキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体を指し、米国特許第5,736,137号では「Ｃ２Ｂ８」と命名され、出典明記により特別にここに組み込まれる。抗体は、マウス軽鎖及び重鎖可変領域配列とヒト定常領域配列を含むＩｇＧ_１カッパイムノグロブリンである。リツキシマブはおよそ８．０ｎＭのＣＤ２０抗原に対する結合親和性を有する。
【００２６】
「可溶化する」なる用語は溶液中の分子を溶解することを指す。本発明の実施態様では、細菌宿主内で発現される組み換え膜貫通型ポリペプチドは非イオン又は双性イオンの界面活性剤中で可溶化される。
「スペーサー配列」なる用語は、翻訳開始配列と第一膜貫通領域の間に位置するアミノ酸配列をコードする一連のポリヌクレオチドを指す。
「緊密に調節されるプロモーター」又は「緊密に制御されるプロモーター」なる用語は、作用可能に結合された遺伝子をほとんど又は全く基礎発現しないプロモーターを指す。緊密な調節因子又は制御されたプロモーターは、特に定められた調節条件下で発現を活性化する。
「転写ターミネーター」なる用語は、転写を終了するようにＲＮＡポリメラーゼをシグナル伝達する核酸配列を指す。転写ターミネーターは周知であり、限定するものではないが、ラムダλ０(ｔａｏゼロ)転写ターミネーター(配列番号17)、大腸菌ｒｒｎＢ１ Ｔ１及びｒｒｎＢ２ Ｔ２転写終結区、強力なＨｉｓオペロンターミネーターなどがある。
【００２７】
本明細書中で用いられる「翻訳開始エンハンサー配列」又は「翻訳開始配列」(ＴＩＳ)なる用語は、遺伝子の翻訳の開始の部位と効率を決定しうる核酸配列を指す(例えば、McCarthy 等, 1990, Trends in Genetics, 6: 78-85を参照)。また、「翻訳開始配列」は翻訳開始領域(ＴＩＲ)とも称されうる。
「双性イオン」又は「二極性」なる用語は、反対極性の荷電基を有する分子を指す。
【００２８】
ＩＩ. 本発明を実施するための態様
Ａ．膜貫通型ポリペプチド
ＣＤ２０、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＲＡ１ｃ、ＧＰＲ７３などの膜貫通型ポリペプチドは、癌などの疾患及び疾病の治療における治療法の標的となりうる。ＣＤ２０は非ホジキン性リンパ腫の治療のリード治療法であるキメラ抗体リツキシマブ(リツキサン(登録商標))の標的である。リツキシマブはＢ細胞に発現される天然の高次構造のＣＤ２０を認識する。リツキシマブの結合は、位置１６７と１８３にシステイン残基を含有するＣＤ２０の第３と第４の膜貫通らせん領域の間のループ構造に依存する(図１参照)。
ＣＤ２０などの膜貫通型ポリペプチドを標的とする治療法の開発における重大な障害は、有用な単離されて精製された組み換えないし天然に生じる膜貫通型ポリペプチドを産生することができないことである。例えば、免疫原ないし結合抗原として有用であるためには、単離されて精製されたポリペプチドが、結合パートナーによって認識されるために十分に「天然の」高次構造でなければならない。このポリペプチドは、その結合がポリペプチドの天然の高次構造に存在する構造的な特徴に依存しているリガンドによって認識される程度に十分に天然の高次構造を保持する。本発明は、細菌宿主内で膜貫通型ポリペプチドを産生するための新規のプロモーターを含むベクター、細菌宿主内で膜貫通型ポリペプチドを産生する方法、及び細菌宿主から膜貫通型ポリペプチドを単離する方法を提供する。本発明の方法は、例えば免疫原及び結合抗原として有用である程度に十分な「天然の」高次構造を有する、高収率の膜貫通型ポリペプチドを提供する。
【００２９】
膜貫通型ポリペプチドは一又は複数の膜貫通ドメインを含んでなり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ないし２４以上のこのようなドメインを含みうる。ある実施態様では、膜貫通型ポリペプチドは少なくとも４つの膜貫通ドメインを有する。他の実施態様では、膜貫通型ポリペプチドは７つの膜貫通ドメインを有しており、例えばＥＧ-ＶＥＧＦレセプター、ＧＰＲ７３及びＲＡ１ｃレセプターである。４つの膜貫通ドメインを有する膜貫通型ポリペプチドは、例えばポリペプチドのＭＳ４Ａファミリーのメンバーを含む。他の実施態様では、膜貫通型ポリペプチドはＣＤ２０ポリペプチドないしその変異体である。
以下の記載は本発明に有用な膜貫通型ポリペプチドの一例としてＣＤ２０を用いる。以下の実施例に開示するポリペプチド並びに他の開示していない膜貫通型ポリペプチドを含む、更なるポリペプチドは本明細書中に記載の発現及び可溶化の方法に同様に有用である。
【００３０】
１．ＣＤ２０
ＣＤ２０は、末梢血又はリンパ系器官に由来するＢ細胞の９０％以上の表面にみられるおよそ３５ｋＤａのリンタンパク質である。ＣＤ２０を意味する文献中での他の名称には、「Ｂリンパ球限定抗原(B-lymphocyte-restricted antigen)」及び「Ｂｐ３５」などがある。ＣＤ２０抗原は、例としてClark等 PNAS (USA) 82:1766-1770 (1985)に記載されている。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発生中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る。Ｂ細胞が活性化されると、ＣＤ２０の発現がさらに増加する(Valentine 等, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8085-8097)。ＣＤ２０はプラズマ細胞には発現しない。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞だけでなく悪性のＢ細胞上にも存在する。
本発明は、細胞及び細胞膜から遊離しており、リツキシマブ又はその抗原結合断片を結合するために十分な天然の高次構造を保持する単離された哺乳類のＣＤ２０を提供する。哺乳類のＣＤ２０の例には、限定するものではないが、配列番号1及び3として以下の表２に示すヒトＣＤ２０及びマウスＣＤ２０が含まれる。ヒトＣＤ２０ (NCBI 登録番号 BC002807)及びマウスＣＤ２０ (NCBI 登録番号 NM_007641 )をコードする参照核酸配列は、ＮＣＢＩデータベース(www. ncbi.gov)に示される。例えば、ヒトＣＤ２０はＢ細胞中で様々なリン酸化状態で存在するが、公知のスプライシング変異体はない。
【００３１】
概略的に図１に示されるように、ＣＤ２０は細胞膜の細胞質側に両末端を有する４膜貫通型ポリペプチドである。第一細胞外ループ(ループＡ)は第１と第２の膜貫通ドメインの間で形成され、第２細胞外ループ(ループＢ)は第３と第４の膜貫通ドメインの間で形成される。ループＢはループＡより大きい。ループＡは膜貫通ドメインから大きく突出していない。ループＢはおよそ４６アミノ酸長であって、膜貫通ドメインから大きく突出している。ループＢは、およそＡｓｎ１４０からおよそＳｅｒ１８５に伸展しており、Ｃｙｓ１６７とＣｙｓ１８３間にジスルフィド結合を含有する。リツキシマブによるＣＤ２０の結合はループＢに依存している。例として、Polyak及びDeans, 2002, Blood 99:3256-3262を参照。
本発明のＣＤ２０ポリペプチドは非イオン又は双性イオンの界面活性剤に可溶性であり、リツキシマブ又は抗原結合リツキシマブ断片がポリペプチドを結合できる程度に十分、界面活性剤中で「天然の」ループＢ構造を保持する。ある実施態様では、第３と第４の膜貫通ドメイン間で形成されるループは、単離されるＣＤ２０に保持される。図１に示すように、ループは、Ｃｙｓ１６７とＣｙｓ１８３の間にジスルフィド結合を含有し、例えば、ＣＤ２０の残基Ｉ１６４からＹ１８４を含む。ループは、例えば、およそ４０〜およそ６０のアミノ酸を含有してもよく、およそ４０〜およそ５０のアミノ酸長、およそ４５〜およそ５０のアミノ酸長、又はおよそ４６のアミノ酸長であってもよい。ある実施態様では、ループは、Ａｓｎ１４０からＳｅｒ１８５まで伸展しており、Ｃｙｓ１６７とＣｙｓ１８３間にジスルフィド結合を含有する。一実施態様では、ループは、リツキシマブによって、又は、その抗原結合性断片によって結合しうる。
【００３２】
２．変異体膜貫通型ポリペプチド
また、本発明は、天然に生じるないしは組み換え体であるＣＤ２０などの膜貫通型ポリペプチドの変異体を提供する。変異体は、例えば、哺乳類の参照配列のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含む。
変異体膜貫通型ポリペプチドは、哺乳類の参照配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。例えば、ＣＤ２０参照配列はマウス又はヒトのＣＤ２０配列であってもよい。ある実施態様では、ＣＤ２０参照配列は配列番号1のものである。他の実施態様では、ＣＤ２０参照配列は配列番号3のものである。
第３と第４の膜貫通ドメイン及びこれらの間で形成されるループ(ループＢ)を含むＣＤ２０断片は例えば残基Ｋ１１６からＮ２１４を含む参照配列であってもよい。ＣＤ２０参照配列は、例えば、ループＢの残基Ｉ１６４からＹ１８４を含んでなる。ＣＤ２０断片は、例えば、配列番号1の残基ＸからＹを含んでもよく、ここでＸは、図１に示すヒトＣＤ２０の配列に対応する配列Ｔ１０４〜Ｉ１２８の任意の残基であり、Ｙは、配列Ｖ１９６からＰ２９７の任意の残基であり、非還元条件下で残基Ｃ１６７からＣ１８３間のジスルフィド結合を有するものである。例えば、ＣＤ２０断片は、図１の残基Ｎ１４０からＳ１８５を含み、非還元条件下で残基Ｃ１６７とＣ１８３の間にジスルフィド結合を有しうる。
【００３３】
膜貫通型変異体、例えばＣＤ２０の変異体は、非イオン又は双性イオンの界面活性剤、例えばＤＤＰＣに可溶性であり、ＣＤ２０変異体を結合する公知の検出用抗体、例えばリツキシマブ(例えばリツキサン(登録商標))又はその抗原結合断片を結合するために十分な「天然の」ループ構造を界面活性剤中で保持している。ある実施態様では、膜貫通型変異体は細胞外ドメインのループ、例えばＣＤ２０では、第３と第４の膜貫通ドメイン間で形成されるループを含む。ループは、およそ３０〜およそ１００のアミノ酸長、およそ４０〜およそ６０のアミノ酸長、およそ４０〜およそ５０のアミノ酸長、およそ４５〜およそ５０のアミノ酸長又はおよそ４６のアミノ酸長であってもよい。ある実施態様では、ループは、ジスルフィド結合、例えばＣＤ２０では、配列番号1のＣｙｓ１６７とＣｙｓ１８３に対応する残基のジスルフィド結合を含有する。
膜貫通型変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換、例えば、完全長ＣＤ２０又は上記の切断型変異体では、ポリペプチドの発現を改善するアミノ酸置換を含みうる。例えば、ＣＤ２０の一又は複数のＣｙｓ１１１及びＣｙｓ２２０を置換すると、ヒトＣＤ２０の発現が改善する(実施例１を参照)。したがって、有用なＣＤ２０変異体は、配列番号1のヒトＣＤ２０アミノ酸配列のＣｙｓ１１１及びＣｙｓ２２０に対応する一又は両システイン残基が置換されているアミノ酸配列を含んでなる。システイン残基は、起こりうるジスルフィド結合を妨げるように非保存的に置換されうる。下記の実施例において、ＣｙｓはＳｅｒに置換される。ＣＤ２０のＣ２Ｓ-ＣＤ２０(「Ｃ２Ｓ」とも称する)変異体(配列番号6)(表２を参照)は、二重置換Ｃｙｓ１１１Ｓｅｒ及びＣｙｓ２２０Ｓｅｒを含有する。
【００３４】
ＣＤ２０変異体は、例えばＣＤ２０をコードする核酸配列を変異させることによって、一又は複数のアミノ酸を置換させるか、欠失させるか又は、挿入する公知の方法によって生成できる。ある実施態様では、ループＢに対する抗体結合を保持するために十分な「天然の」ＣＤ２０構造が維持されている。アミノ酸挿入は、１残基からポリペプチド含有の百以上の残基にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入(すなわちＣＤ２０配列内の挿入)は、例えば、およそ１〜１０の残基、１〜５の残基又は１〜３の残基の範囲でありうる。アミノ酸配列欠失は、例えば、１〜３０の残基又は１〜１０の残基の範囲でよく、一般的に隣接しうる。
ＣＤ２０の場合のリツキシマブなどの抗体ないし抗体断片の結合に反作用することのない、挿入されるか、置換されるか、又は欠失させるアミノ酸残基(一又は複数)を決定する際の指標は、膜貫通型ポリペプチド、例えばＣＤ２０の配列を公知の相同なタンパク質分子、例えば類似の構造及び／又は機能的なドメインを有するタンパク質分子と比較して、高い相同性領域、例えば５０％、５５％又は６０％以上のアミノ酸同一性を有する領域内に作製されたアミノ酸配列変異の数を最小限にすることによって、見つけうる。例えば、ヒト及びマウスのＣＤ２０は、膜貫通ドメイン３と４の間の細胞外ループ(ループＢ)において、６３％の同一性を有する７２％のアミノ酸配列同一性を共有する。ヒトＣＤ２０(配列番号1)及びマウスＣＤ２０(配列番号3)などの参照配列を用いて、相同性の高い及び低い同一領域のアラインメントと比較を行う。
【００３５】
また、機能的なドメインは、ＣＤ２０などの膜貫通型ポリペプチドに相同性があることが知られているポリペプチドにおいて、同定できる。機能的なドメインの配列を、他の公知の配列、例えばＣＤ２０又はＭＳ４Ａファミリポリペプチドと比較して配列させることができる。ＣＤ２０、ＩｇＥレセプターβ鎖、及びＨＴｍ４は、共通のＮ末端及びＣ末端のドメインを有する４つの膜貫通構造を有する。およそ５０アミノ酸の細胞外ループは、ＭＳ４Ａ遺伝子ファミリ内の他の共通したモチーフである。加えて、この構造は、異なる種、例えばヒト及びマウスの間で共通である。これら３つの遺伝子は、ヒトでは１１ｑ１２−ｑ１３．１、マウスでは第１９染色体に位置する(Adra 等, 1989, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 91 : 10178-10182、Hupp 等, 1989, J. Immunol., 143: 3787-3791、Tedder 等, 1988, J. Immunol., 141 : 4388-4394、Tedder 等, 1989, J. Immunol, 142: 2555-2559)。３つの遺伝子は、共通の前駆体から進化したものと考えられる(上掲のLiang 等, 2001)。
アミノ酸置換の候補位置は、高いアミノ酸可変性を示す位置、すなわち、異なる配列を整列させて比較したときにある位置で少なくとも３つの異なるアミノ酸が見られるか、配列同一性が低いパーセント、すなわち９０未満の配列同一性である位置として決定される。配列が整列配置される場合、可変性を示す位置は保存的又は非保存的ななアミノ酸置換を有しうる。保存的アミノ酸置換を有する位置は、天然に生じるタンパク質の同じ位置で観察される同じタイプの置換により置換されうる。このような置換の例を表１に示す。
【００３６】
表１

【００３７】
ＣＤ２０などのポリペプチドの生物学的な性質の実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート高次構造、螺旋高次構造又はループ構造、(ｂ)標的部位の分子の疎水性の電荷、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
(２)中性の親水性：cys, ser, thr；
(３)酸性：asp, glu；
(４)塩基性：asn, gln, his, lys, arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly, Pro；及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又は残された(非保存)部位に導入されうる。
ＣＤ２０変異体などの膜貫通型ポリペプチド変異体は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、ＰＣＲ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発［Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487-6500 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］などの公知の組み換え方法を用いて作製することができる。
【００３８】
Ｂ．発現系
１．宿主細胞
本発明は、膜貫通型ポリペプチドを宿主細胞内、特に細菌細胞内で産生する方法を提供する。膜貫通型ポリペプチドを生産するために有用な細菌宿主は、エシェリヒア属、エンテロバクター属、バシラス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、霊菌属、赤痢菌属などを含む。適切な細菌宿主は、腸内細菌、例えば大腸菌、赤痢菌、肺炎桿菌などを含む。適切な大腸菌宿主は、株Ｗ３１１０ (ATCC 登録番号 27,325)、２９４(ATCC 登録番号31 ,446)、Ｂ、Ｘ１７７６ (ATCC 登録番号31 ,537)、58Ｆ3などを含む。上記の細菌の変異細胞も使用されうる。宿主細胞大腸菌株58Ｆ3 (W3110 - fhuAΔ (tonAΔ) phoAΔE15 lonΔ galE rpoHts(htpRts) ΔclpP laclq ΔompTΔ(nmpc-fepE) ΔslyD)を本願明細書において、例証する。ベクター、プロモーターなどが同様に利用されてもよく、他の細菌宿主の膜貫通型タンパク質、例えばＣＤ２０を効率的に産生できるようにするために修飾されうることが考えられる。
本発明の方法への使用のために細菌を選択する場合、細菌のレプリコンの複製能を考慮する。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＫＮ４１０などのような周知のプラスミドがレプリコンを供給するために用いられる場合、大腸菌、霊菌属及びサルモネラ種が宿主として最適に使われうる。
【００３９】
２. プロモーター
複合の膜貫通型ポリペプチドを細菌細胞などの宿主細胞内で効果的かつ効率的に産生するために、基礎活性の低さについてプロモーターを選択する。膜貫通型ポリペプチドは通常、宿主細胞に有毒であるので、プロモーターの基礎活性による低発現であっても宿主細胞の健康に影響を与え、細胞成長の低減、タンパク質産生の減少及び収率の減少が生じうる。宿主細胞が十分に成長してタンパク質を高く産生すると共に収率が良好となる一方で、プロモーターが短時間のみ作動することが望ましい。したがって、本明細書中では、プロモーターを最低の基礎活性について選択及び／又は操作する。
例えば細菌細胞において、強力で、緊密に調節されるといわれる２つの一般的に用いられるプロモーターは、天然のＴ７及びラムダＰＬプロモーターに基づく。
強力なＴ７プロモーターは、ｐＥＴベクター(Novagen, Stratagene他)において、市販されており、染色体に組み込まれるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する株(ラムダＤＥ３溶原株)で用いられる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはｌａｃプロモーター／オペレーターの調節下にあり、最終的に、対象の遺伝子に作用可能に結合されるＴ７プロモーターはＩＰＴＧにより誘導される。それ自体によるこのシステムはむしろ当てにならず、多膜貫通型タンパク質のような毒性タンパク質は誘導前の成長の不足などの問題を生じる。調節を強化して、基礎レベル発現を低減するために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであるＴ７リゾチームのインヒビターを、同じ細胞の異なる適合性プラスミド(NovagenのｐＬｙｓＳ及びｐＬｙｓＥ)に、共発現させてもよい。結果として生じたシステム(ｐＥＴ／ＤＥ３株／ｐＬｙｓ)はやはりＩＰＴＧの添加により誘導され、それによって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの高レベルはＴ７リゾチームインヒビターの低レベルに勝り、Ｔ７プロモーターを作動する。
【００４０】
ラムダＰＬプロモーターは、あまり一般的に用いられない他の強力なプロモーターである。市販のベクター、ｐＬＥＸ(Invitrogen)で利用可能である。対象の遺伝子に作用可能に結合されるＰＬプロモーターはｐＬＥＸプラスミド内に配置され、ＰＬプロモーターを調節するｃＩリプレッサーは株染色体に組み込まれる。ｃＩリプレッサーは、ｔｒｐプロモーター／オペレーターの調節下である。
公知の誘導可能な細菌性プロモーターは本発明の方法に使用することができ、本明細書中に記載のように、用いたプロモーターは基礎活性が低いか、基礎活性を低減する用に操作されている。いくつかの例は、β‐ラクタマーゼ、ラクトース、及びトリプトファンプロモーターなどがある。特定の宿主細胞システムへの使用に適切な他のプロモーターは、一般に公知で利用可能であり、本願明細書に記載のように、基礎活性を低減するように操作されうる。
【００４１】
３．調節成分
ｐｈｏＡプロモーターは、大腸菌における基礎活性が低い、緊密に調節されるプロモーターである。ｐｈｏＡプロモーターは、活性化因子ｐｈｏＢを結合するｐｈｏボックスを介してポジティブに制御される(表５を参照)。プロモーター活性は、培地中のリン酸枯渇、例えば制限されたリン酸培地に希釈することによって、作動する。その調節メカニズムにもかかわらず、ｐｈｏＡプロモーターはいくらかの基礎活性を示す。
プロモーターは、一又は複数のネガティブ調節成分と一又は複数のポジティブ調節成分を含有するように選択又は操作できる。例として、Neidhardt, Ed., 1996, Escherishia coli and Salmonella, Second Ed., ASM Press, Washington D.Cに記載のポジティブ及びネガティブの調節成分を参照のこと。
ポジティブ及びネガティブの調節成分を有するプロモーターは稀である。一例はｍｅｔＥプロモーターである。例として、Neidhardt, Ed., 1996, Escherishia coli and Salmonella, Second Ed., pages 1300-1309を参照のこと。公知のポジティブ及びネガティブの調節成分は、例えばこの引用文献にみられる。いくつかの実施態様では、プロモーターは、基礎発現を直接的に調節する少なくとも一のポジティブ調節成分と少なくとも一のネガティブ調節成分を有する。プロモーターの付加した制御を達成するプロモーターの範囲内、又は、該プロモーターに隣接したポジティブ又はネガティブの調節成分の配置は公知であり、例えば、Escherishia coli and Salmonella (Supra) 頁1232- 1245に記載されている。
【００４２】
ネガティブ調節成分は、例えば、ｌａｃリプレッサー／ｌａｃオペレーター、大腸菌ｔｒｐリプレッサー／ｔｒｐオペレーター、λリプレッサー／オペレーターなどを含む。ポジティブ調節成分は、例えば、ｐｈｏＡプロモーターのｐｈｏボックス及びｐｈｏＢを結合する変異体、マルトースオペロンプロモーターのＭａＩＴ ＤＮＡ結合部位、アラビノースオペロンプロモーターのＡｒａＣ ＤＮＡ結合部位などを含む。例えば、ポジティブ調節成分としてｐｈｏボックスを有するｐｈｏＡプロモーターは、異種性のネガティブ調節成分、例えばラックオペレーターを含むように操作されうる。ｌａｃオペレーターはＩＰＴＧの添加により誘導される。
プロモーターのための２つの一般的に用いられるポジティブ調節成分は、ＰｈｏＢ／ｐｈｏボックスとＡｒａＣ／ａｒａＩ ＤＮＡ結合部位である。これら及び多数の他のポジティブ及びネガティブの転写制御配列は、例えば上掲のNeidhardtに記述される。一般的に用いられるネガティブ調節成分は、ｌａｃリプレッサー／ｌａｃオペレーター、ｔｒｐリプレッサー／ｔｒｐオペレーター、及びλリプレッサー／オペレーターなどを含む。
【００４３】
４．転写ターミネーター
異なるプロモーターシステムからの読み過ごしを防ぐために、発現される核酸配列に作用可能に結合されるプロモーターに達する前に転写の読み過ごしを止めるために、一又は複数の転写ターミネーターを配置できる。例えば、ラムダ転写ターミネーター配列AACG CTCGGTTGCC GCCGGGCGTT TTTTATT (配列番号17)をｐｈｏＡプロモーターの上流に挿入できる。更なる転写ターミネーター配列は公知であり、Ｈｉｓオペロンターミネーターなどが使用可能である。膜貫通型ポリペプチドの発現調節のための他のプロモーター成分と作用可能に結合するように、挿入された調節成分を配置する。
また、迅速に作用し、緊密に調節して(「オン」)、宿主細胞を害さない試薬によって、プロモーターを導入することがプロモーターシステムの望ましい特徴である。大腸菌及び関連した細菌内での発現のために、ｐｈｏＡプロモーターは、発現を緊密に調節する。ネガティブ調節成分、例えばｌａｃオペレーター及び上流のラムダ転写ターミネーターを加えるように変異させた場合、下記の実施例に示すように、プロモーターからの基礎発現は実質的に取り除かれていた。
【００４４】
有用なｐｈｏＡプロモーターは、天然のｐｈｏＡプロモーター(配列番号５)と、一又は複数のネガティブ調節成分を含有する変異したｐｈｏＡ、例えば変異したプロモーターｐｈａｃ(配列番号１５)及び／又は一又は複数の上流の転写ターミネーター、例えば変異体プロモーターｔｐｈａｃ(配列番号１６)を含む。基礎プロモーター活性を低減するように操作された変異したプロモーターを使うことができる。
大腸菌以外の細菌宿主では、基礎活性の低さについて選択又は操作された、選択した細菌宿主に適合性のあることが公知である、機能的に等価な誘導性プロモーターにｐｈｏＡプロモーターを置換することが有用でありうる。適切なプロモーターは、限定するものではないが、β‐ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、トリプトファンプロモーターシステム又はハイブリドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターであり基礎プロモーター活性を低減するように変異されうるものを含む。また、選択されたプロモーターは、ポジティブ及びネガティブの調節成分を含有するように変異されてもよい。例えば、天然でネガティブ制御されるプロモーターは、−３５ボックス配列を非−３５コンセンサス配列と置換して、ｐｈｏボックスなどのポジティブ制御配列成分を付加することによって、ポジティブ制御を付加するように操作できる。任意の稀なコドンｔＲＮＡ遺伝子を、選択された細菌宿主に適合性を有することが知られている稀なコドンｔＲＮＡ遺伝子に置換することが有用でありうる。
【００４５】
５．ベクター
一般に膜貫通型ポリペプチドを発現するために有用なベクターは、膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合された緊密に調節されるプロモーターを含有する。例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＫＮ４１０などのプラスミドがベクターの主鎖(バックボーン)として使われうる。ある実施態様では、プラスミドｐＢＲ３２２は主鎖を形成する。
一般に膜貫通型ポリペプチドを発現するためのベクターは、強力なプロモーター、ネガティブ及びポジティブの調節成分、転写ターミネーター、及び緊密な調節と効率的な発現及び翻訳のための付加的な成分を含む。
ベクターは、コードされるポリペプチドのはじめのコドンの直前に位置するアミノ酸リーダーをコードする短い配列を含みうる。リーダー配列は適当な翻訳開始を促進し、一般におよそ６〜１２のアミノ酸を含有する。そして、例えば６、７、８、９、１０、１１、又は１２のアミノ酸、あるいはそれ以上を含有しうる。一例は、図２１に示すように、例えば核酸配列：(ATG)AAACACCAACACCAACAA (配列番号28)によって、コードされる配列MKHQHQQ (配列番号7)である。より長いリーダー配列、例えば３０〜５０以上のアミノ酸は、膜貫通型ポリペプチドの翻訳伸長を促すために有用である。例として、翻訳伸長を促すために翻訳開始配列(ＴＩＳ)とスペーサー配列を含有する、図２２に示すｔｒｐＬＥリーダーＬＥ及びｓＬＥを参照のこと。
また、ベクターは、宿主細胞の稀なコドンｔＲＮＡ遺伝子を含みうる。大腸菌の稀なコドンｔＲＮＡ遺伝子の例には、ａｒｇＵ、ｇｌｙＴ及びｐｒｏ２が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
６．リーダー配列
膜貫通型ポリペプチドを発現するための好ましい実施態様では、リーダー配列は、翻訳開始配列(ＴＩＳ)と第一膜貫通セグメント(ＴＭ-Ｉ)の間に位置する強い翻訳開始配列(ＴＩＳ)及びスペーサー配列を含有する。大腸菌内での多膜貫通型ポリペプチドの発現のために有用なリーダーはｔｒｐＬＥリーダーの一部を含有する。下記の実施例に開示される大腸菌ｔｒｐＥタンパク質のＮ末端領域の一部をコードするＬＥ及びｓＬＥリーダーを参照のこと。
【００４７】
７．翻訳開始配列
公知の翻訳開始配列を用いて、遺伝子の翻訳の開始の効率を亢進できる。翻訳開始エンハンサー配列は、配列５'と３'をリボソーム結合部位まで含むように伸長しうる。リボソーム結合部位は、最小では、シャイン-ダルガノ領域と開始コドンに加えてその間の任意の塩基を含むことで定義される。さらに、翻訳開始エンハンサー配列は、上流のシストロンの末端又は非翻訳リーダー、したがって翻訳停止コドンを含みうる。例として、米国特許第5,840,523号を参照。
宿主細胞内で高度に発現されるタンパク質のおよそはじめの６〜１２コドンの使用を含む、高いレベルの翻訳開始速度を得るための多くの方法がある。例えば、大腸菌では、コード配列のはじめの良好な翻訳開始領域を有するいくつかのタンパク質リーダーには、β-ガラクトシダーゼ(Ruther 等, 1983, EMBO J., 2: 1791-1794)、プロテインＡ (Nilsson 等, 1990, Methods Enzymol, 185:144-161 )、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(Smith 等, 1988, Gene, 67:31-40)などがある。他の例は、例えば核酸配列：ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCAT (配列番号34)によりコードされる配列MGSSHHHHHH(配列番号33)である。また、このようなリーダーの概要についてはLavallie 等, 1995, Current Biology, 6:501-506を参照のこと。
【００４８】
あるいは、強力なＴＩＳは、例えば、1990, Methods in Enzymol, 185:89-119に記載のように設定できる。また、強力なＴＩＳは、例えば、Yansura 等, 1992, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 4: 151-158に記載のように選択できる
「強力な翻訳開始配列」は、通常、およそ６〜およそ１２のアミノ酸(例えば６、７、８、９、１０、１１又は１２アミノ酸をコードする一連のコドンである。配列は、天然のもの又は操作されるものであり、翻訳開始の速度を高くしうる。
一実施態様では、強力な翻訳開始配列は、核酸配列：ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTCA (配列番号35)によって、コードされるｔｒｐリーダー(M)KAIFVLKGS (配列番号27)のはじめの９アミノ酸を含有する。他には、β-ガラクトシダーゼのはじめの６〜１２アミノ酸をコードするヌクレオチド配列などがある。
【００４９】
８．スペーサー配列
ＴＩＳを翻訳タンパク質のＴＭ-Ｉから分離するスペーサー配列は、膜貫通型ポリペプチドの翻訳伸長を促すために有用である。有用なスペーサー配列は、伸長にとってのわずかな障害を含有する。例えば、ごく小さいアミノ酸はリボソームと十分に結合せず、一般的に構造化されない、例えば、必要に応じて膜を通して転位置ができるようにフォールドされないために翻訳伸長の速度を速くすることができる。「スペーサー配列」は、ＴＩＳでリボソームローディングを欠失することなしに第一膜貫通セグメントでの翻訳の緩徐化に適応するために緩衝スペースとして機能すると仮定される。スペーサーは、ＴＭ-１からＴＩＳを効率的に分離できる程度に長いが、翻訳されたポリペプチドがフォールディングできるほど長くはない。スペーサー配列は、膜内への正常なタンパク質挿入を中断することなく、効率的かつ迅速な翻訳伸長を可能とする。
スペーサー配列は、例えば、一連の５０以上のアミノ酸、例えば６０以上、７０以上、８０以上のアミノ酸を含んでもよく、好ましくは１２０足らずのアミノ酸である。一実施態様では、「スペーサー配列」は親水性であり、およそ２０％〜およそ５０％の荷電アミノ酸、例えばおよそ３０％〜およそ４０％の荷電アミノ酸を含有してもよい。
他の実施態様では、スペーサー配列は、細菌遺伝子の少なくとも一部を含んでなり、宿主細胞において、天然にみられる配列、例えば大腸菌細胞内でのポリペプチドの発現のための大腸菌ｔｒｐオペロンのＥ遺伝子に由来してもよい。下記の実施例に記載のように、ＬＥ及びｓＬＥリーダーはｔｒｐＥ遺伝子の一部を含有する。
【００５０】
９．発現タグ
通常、発現タグは、ベクターの成分であるか、又は、ベクターに挿入されるポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。発現タグは、発現したタンパク質を識別して、単離させるのに役立つ。例として、限定するものではないが、ポリ-Ｈｉｓタグ(米国特許第4,569,794号)、ＨｉｓＧｌｎタグ、ビオチン、アビジンなどがある。このようなタグは周知であり、市販のされている(例として、Qiagen, Valencia, CAを参照)。ポリ-Ｈｉｓタグは、複数のヒスチジン残基、一般に６〜１０のヒスチジン残基を含んでなる。Ｈｉｓタグ付加ポリペプチドは、抗Ｈｉｓタグ抗体に結合したカラム、又は、ニッケルカラムに試料を適用することによって、検出できる。
図８、２１及び２２は、膜貫通型ポリペプチドを発現するための本発明の方法に有用な配列を含んでなる例示的な発現コンストラクトを概略的に表す。例えば、図８には、プロモーター、リーダー配列、膜貫通型タンパク質遺伝子、発現タグ、転写ターミネーター(ラムダｔ０)及びｔＲＮＡ遺伝子の作用可能な結合配列を示す。下記の実施例は、ＣＤ２０、ＲＡ１ｃ、ＧＰＲ７３及びＭＳ４Ａ４Ａの発現のためのこのような発現コンストラクトの使用を示す。
【００５１】
Ｃ．細菌細胞内での膜貫通型ポリペプチドの発現
発現された膜貫通型ポリペプチドは、天然の高次構造の細菌細胞膜に作用する。細菌細胞膜への膜貫通型ポリペプチドの局在は、例えば、密度勾配遠心分離又は他の公知の方法によって、測定できる。
細菌宿主は公知の好適な培地にて培養される。炭素、窒素及び無機リン酸塩供与源の他の任意の培地添加物は、適当な濃度で単独で導入される、又は、複合の窒素源などの培地ないしは他の添加物との混合物として含まれる。宿主細胞は好適な温度で培養される。例えば、大腸菌は、およそ２０℃からおよそ３９℃、例えば２５℃〜３７℃又はおよそ３０℃で生育できる。宿主生物に応じて、培養液のｐＨはおよそ５〜９までの任意のｐＨとしてもよい。大腸菌の培養液は、およそ６．８〜およそ７．４、例えばおよそ７．０のｐＨを有しうる。
膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の組換え体方法により調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然の供与源からの単離、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、ＰＣＲ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発［Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487-6500 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］などが含まれる。
【００５２】
膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、直接、又は、他のポリペプチドとの融合体として、又は、成熟ポリペプチドのＣ末端に特定の切断部位を有するポリペプチドとして発現されてもよい。
本発明の方法は、膜貫通型ポリペプチドを産生するために、標準的な組換え手順を利用する。膜貫通型ポリペプチドをコードする異種性のポリヌクレオチド(例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、細菌内での発現のために複製可能なベクターに挿入する。このためには多くのベクターが利用可能であり、適当なベクターの選別は主にベクターに挿入される核酸の大きさとベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能(ＤＮＡの増幅又はＤＮＡの発現)及び適合性がある特定の宿主細胞に応じて様々な成分を含有する。一般に、細菌性形質転換のためのベクター成分は、以下の一又は複数を含むが、これに限定されるものではない：複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子及び誘導性プロモーター。適切なベクターの例は本明細書に記載される。本発明の実施形態では、ベクターは、膜貫通型ポリペプチドをコードする遺伝子に作用可能に結合される高い調節機能の下にプロモーターを含有する。適切なプロモーターの例は本明細書に記載されており、ｐｈｏＡｐｈａｃ、及びｔｐｈａｃプロモーター、及び、例えばポジティブ及びネガティブの調節成分によって、緊密に調節されるこのようなプロモーターが含まれる。本明細書に記述されるように、ベクターはまた、多膜貫通型ポリペプチドの伸長を亢進するために強力な翻訳開始配列及びスペーサー配列を含有してもよい。
【００５３】
通常、細菌性宿主細胞と適合性を持つ種由来の調節配列及びレプリコンを含有するプラスミドベクターが使われる。通常、ベクターは複製部位、並びに、形質転換した細胞の表現型選択を可能とするマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は一般的に、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される(例として、Bolivar 等, 1977, Gene, 2: 95を参照)。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しているため、形質転換細胞を識別することが容易である。また、ｐＢＲ３２２プラスミド、又は他の微生物プラスミドないしファージは、一般に、選択可能なマーカー遺伝子の発現のために微生物により使用されうるプロモーターを含有するか、含有するように修飾される。
発現及びクローニングベクターは、一又は複数の選択された宿主細胞内でのベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する。通常、クローニングベクターでは、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡと独立してベクターの複製を可能にするものであって、複製開始点又は自己複製配列を含む。このような配列は様々な細菌について周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製開始点は、ほとんどのグラム陰性菌に好適である。
【００５４】
また、発現及びクローニングベクターは、一般に、選択可能なマーカーとも称される選別遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択培養液中で形質転換した宿主細胞が生存又は生育するために必要なタンパク質をコードする。選別遺伝子を含有するベクターによって、形質転換していない宿主細胞はこの培養液中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリンに耐性を与える、(b)栄養要求性欠損を補完する、(c)複合培地から得られない重要な栄養分を供給する、タンパク質をコードする。例えば、バシラス種ではＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。選択方法の一例では宿主細胞の成長を止める薬剤を利用する。異種性の遺伝子によって、成功裏に形質転換された細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生するために選択工程で生存する。
プロモーターは標準的な方法を利用して誘導できる。例としてSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を参照のこと。一般に細菌細胞は、特定の光学濃度に達するまで、つまり、インデューサーの添加、選択したプロモーターが必要とする培地成分の枯渇又はその両方によって、誘導が開始される時点まで培養される。例えば、Chang 等 , 1987, Gene, 55: 189-196、Simmons 等, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147、及び／又は米国特許第5,304,472号及び同第5,342,763号に記述されるように、ｐｈｏＡプロモーターはリン酸欠乏により誘導される。
【００５５】
プロモーターがポジティブ及びネガティブの調節成分、例えば変異体プロモーターｐｈａｃ及びｔｐｈａｃに含有されるｐｈｏボックス及びｌａｃオペレーターを含有する場合、両調節成分を介するプロモーターの誘導を調整することが望ましい。例えば、ＩＰＴＧの添加によるｌａｃオペレーターのネガティブ調節成分の除去による誘導を培地のリン酸欠乏の低点に調整して、両調節成分が同時又はできる限り遅れずにプロモーター活性を「作動する(オンにする)」。一般に、プロモーター特異的な発現の継続期間は、発現している細胞の健康を維持する時間、例えば３時間未満、２時間未満又は１〜２時間の範囲のいずれかの時間に制限される。発現の継続期間は、宿主細胞によって、そして、発現される特定のポリペプチドによって、様々であるといえる。
細胞が溶解し、可溶性分画と不溶性分画を分離し、膜貫通型ポリペプチドを不溶性膜分画から抽出する。例示的な可溶化方法を後述する。
遺伝子発現は、例えば、ｍＲＮＡの転写を数量化するための従来のノーザンブロット法によって、間接的に試料において、測定できる(Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5201-5205)。様々な標識、最も一般的には放射性同位体、特に^３２Ｐが使用されうる。ビオチン標識などの他の技術もまた使用されうる。ポリヌクレオチドに導入されるビオチン修飾ヌクレオチドは、多種多様な標識、例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤、酵素などによって、標識できるアビジン又は抗体へ結合するための部位として機能しうる。また、遺伝子発現は、例えばウェスタンブロットによって、発現されたポリペプチドを分析することによって、直接測定できる。
【００５６】
Ｄ．膜貫通型ポリペプチドの単離と精製
膜貫通型ポリペプチドは、細胞ないし細胞膜から遊離した細菌細胞などの宿主細胞から、本明細書に記載の方法によって、単離することができ、界面活性剤に可溶性であり、ポリペプチドが免疫原として認識される、ないしはリガンドにより結合されうる程度に十分「天然の」高次構造を保持している。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然の高次構造に存在する構造的特徴に結合が依存しているリガンドを結合するために十分な程度の「天然の」高次構造を保持する。例えば、ＣＤ２０のリツキシマブ結合は、ＣＤ２０の天然の高次構造の細胞外ループＢに依存している(例えばＣＤ２０が細胞膜上に発現される場合)。本明細書に記載の非イオン又は双性イオンの界面活性剤に可溶化されたＣＤ２０は、リツキシマブ又はその抗原結合断片、例えばＦａｂ断片を結合するために界面活性剤中で十分な「天然の」ループＢ構造を含有する。
【００５７】
１．宿主細胞破壊
発現した膜貫通型ポリペプチドを有する宿主細胞を、凍結-融解サイクル、超音波処理、物理的な破壊、細胞溶解剤などを含むがこれに限らず様々な理学的又は化学的な方法によって、破壊できる。膜貫通型ポリペプチドは、適切な界面活性剤を用いて又は酵素的な切断によって、細胞ないし細胞膜から遊離させることができる。膜貫通型ポリペプチドは、界面活性剤に可溶化することによって、破壊した細胞から取り戻される。
【００５８】
２．軽度の非変性界面活性剤
膜タンパク質を可溶化する一般的な方法は、軽度の非変性界面活性剤、例えばドデシル-マルトシド、ｎ-ドデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミン-Ｎ-オキシド、ｎ-ドデシルホスホコリン(ＦＯＳ-コリン-１２)、及びトリトンＸ-100の使用によるものである。この方法の変法は界面活性剤と脂質(一般的に１０:１の比率)を含んでなる混合ミセルの使用である。近年、このような方法論は、ＫｖＩ .２カリウムチャネルの単離及び結晶化に応用された。(Long 等, 2005, Science 309(5736): 897-903及びLong 等, 2005, Science 309(5736): 903-8)。好まれないが、ＳＤＳのような強力な変性界面活性剤を用いてポリペプチドを可溶化して、変性できる。次いで、典型的には、生化学的研究の前に、より緩やかな界面活性剤又はリポソームないしその他の非界面活性剤の環境に、タンパク質を再構成する。しかしながら、タンパク質を変性界面活性剤にさらした後に正常な機能を回復することは困難である。
【００５９】
３．非イオン及び双性イオンの界面活性剤
一実施態様では、膜貫通型ポリペプチドは、非イオン又は双性イオンの界面活性剤に可溶化される。ＣＤ２０などの複合の膜貫通型ポリペプチドを可溶化するために有用な非イオン性界面活性剤の例は、TRITON(登録商標)及びドデシルマルトシドなどであるが、これに限定されるものではない。ＣＤ２０などの複合の膜貫通型タンパク質を可溶化するために有用な双性イオン性界面活性剤の例は、zwittergent 3-08、3-10、3-12、3-16(CaI Bio Chem)、ASB-14、ASB-16、又はASBC80(Anatrace)、PMAL-B 100及びホスホコリン誘導体、例えばドデシルホスホコリン(ＤＤＰＣ)などであるが、これに限定されるものではない。ホスホコリン界面活性剤は、コリンを含有し、イオン性及び極性であるリン酸に結合した正電荷を有する第四級アミンを有する。誘導体は、リン酸、例えばＤＤＰＣではドデシルに付着される無極性炭化水素鎖を含有する。有用なホスホコリン誘導体は、例えば、リゾリン脂質 ＤＤＭ、ＤＭ、ＬＡＤＯ、ＤＤＰＣ、ＤＨＰＣ、ＬＯＰＣ、ＬＭＰＣ、ＤＬＰＣ、ＬＬＰＧ(Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)及び、又はAnatrace Inc. (Maumee, OH)から市販)、及びｎ-デシル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミン-Ｎ-オキシドを含む。
【００６０】
４．イオン性又は変性の界面活性剤
イオン性又は変性の界面活性剤による抽出では、十分有用な「天然の」高次構造を保持する単離された膜貫通型ポリペプチドは回収されないであろう。単離されたポリペプチドを非イオン又は双性イオンの界面活性剤に再懸濁すると、ポリペプチドの再構築と有用な「天然の」高次構造を有する膜貫通型ポリペプチドの回収が可能となる。例えば、膜貫通型ポリペプチドは、イオン性界面活性剤を用いて細胞膜から抽出できる。有用なことに、例えばイムノアッセイでは、イオン性界面活性剤は非イオン又は双性イオンの界面活性剤に交換できる。
【００６１】
５．小規模精製
可溶化及び精製の方法は、抽出と精製の規模に依存して異なりうる。小規模抽出及び精製の場合、例えば、およそ１ｇ以下の細胞では、細胞ペレットを界面活性剤中でインキュベートして、界面活性剤可溶性分画と不溶性分画は更に精製しないで回収できる。
【００６２】
６．大規模精製
大規模な抽出及び精製の場合、例えば、およそ１００ｇ以上の細胞では、細胞を界面活性剤と混合して、遠心分離できる。生じた上清を公知の方法を用いて精製できる。この方法には、限定するものではないが、イオン交換カラムによる分画化、親和性クロマトグラフィ、例えば抗Ｈｉｓ-Ｔａｇ又は抗ＣＤ２０抗体、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、二酸化ケイ素樹脂、又は、カチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィ、等電点電気泳動、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫安沈殿、例えば、Sephadex(登録商標) Ｇ-７５を用いたゲル濾過、ＩｇＧなどの混入物を除去するプロテインＡ Sepharose(登録商標)カラム、ポリペプチドのエピトープタグ付加型を結合する金属キレート化カラム、疎水親和性樹脂、基質に固定された好適なリガンドを用いたリガンド親和性、ショ糖密度勾配遠心分離などがある。タンパク質精製の様々な方法は公知であり、利用されうる。例として、Deutscher, 1990, Methods in Enzymology, 182、 Scopes, 1982, : Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York、 Ausubel 等 (編集), 1998, : Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sonsを参照のこと。
【００６３】
７．Ｈｉｓ-Ｔａｇ
ある実施態様では、膜貫通型ポリペプチドはＨｉｓタグ付加される。Ｈｉｓタグ付加ポリペプチドの精製は、例えば、可溶化された界面活性剤分画を金属キレ-トカラム、例えば金属キレ-トＮｉ-ＮＴＡカラム又は固定された抗Ｈｉｓ抗体を含有するカラムに通すことによって達成されうる。捕捉後、Ｈｉｓタグ付加ポリペプチドは適当なバッファによって溶出される。ある実施態様では、バッファは、０．１％ ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ クエン酸ナトリウム, ｐＨ３．５を含有する。
【００６４】
８．親和性精製
他の実施態様では、膜貫通型ポリペプチドは、「天然の」構造のポリペプチドを結合する固定されたリガンドを有するカラムに分画を通すことによって可溶化された界面活性剤分画から親和性精製される。例えば、ＣＤ２０は、リツキシマブを用いて界面活性剤から精製されうる。膜貫通型ポリペプチドを含有する溶出された分画をさらに濃縮して、ゲル濾過、親和性精製などによって精製することもできる。タンパク質濃度は、例えばＢＣＡ測定などの様々な公知の方法によって測定することができる(Smith 等, 1985, Anal. Biochem., 150: 76-85)。
【００６５】
９．非界面活性剤処置
タンパク質が精製されると、必要に応じて非界面活性剤の環境において操作してもよい。最も一般的な非界面活性剤の環境はリポソ-ムであり、そのリポソームは界面活性剤ミセルより密接に天然の細胞の環境を模倣する。リポソ-ムは主に長鎖脂質から成る。例として、Rigaud 等, 1995, Biochim Biophys Acta. 1231 (3): 223-46 and Ollivon 等, 2000, Biochim Biophys Acta. 1508(1- 2): 34-50を参照のこと。バイセル(bicelle)は、短鎖脂質と混合した二重層形成脂質から主に形成されるリポソ-ムの変異体である。例として、Czerski and Sanders, 2000, Anal Biochem. 284(2): 327-33を参照のこと。
【００６６】
Ｅ．単離されたタンパク質の使用方法
１．親和性成熟／抗体選別
有用な「天然の」高次構造を有する、本明細書に記載のように、発現、単離及び／又は精製された膜貫通型ポリペプチドを、ファージディスプレイを用いた抗体可変ドメインの選別及び、抗体の親和性成熟のための標的抗原として用いられてもよい。抗体可変ドメインのファージディスプレイ及び抗原の特定の結合物質の選別のための方法が知られている。「親和性成熟した」抗体は、変異(一又は複数)を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善される一又は複数の高頻度可変領域中に一又は複数の変異を含有する。親和性成熟された抗体は標的抗原に対してナノモル又はさらにピコモルの親和性を有しうる。
【００６７】
ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドが、ファージ、例えば繊維状ファージ、粒子の表面上のコートタンパク質の少なくとも一部への融合タンパク質として表出される技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異体の大きなライブラリが、高い親和性で標的抗原に結合する配列について迅速かつ効率的に分類される点にある。ファージ上のペプチド及びタンパク質ライブラリのディスプレイは、特定の結合性質を有するものについて数百万ものポリペプチドをスクリ-ニングするために用いられている。多価のファージディスプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子III又は遺伝子VIIIへの融合により小さいランダムペプチド及び小タンパク質を表出するために用いられている。Wells及びLowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992)及び本明細書中で引用する文献。一価性ファージディスプレイでは、タンパク質又はペプチドライブラリが、遺伝子III又はその一部に融合して、野生型遺伝子IIIタンパク質の存在下で低レベルに発現されるので、ファージ粒子が融合タンパク質を１コピー表出するか全く表出しないものである。活性効果が多価のファージと比較して減弱しているので、分類は内因性のリガンド親和性に基づいてなされ、ＤＮＡ操作を簡素化するファジミドベクターが用いられる。Lowman及びWells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216(1991)。抗体可変ドメインのファージディスプレイの例示的な方法は、米国出願公開番号2005-0119455-A1に見られ、それは出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
【００６８】
Marks 等, 1992, Bio/Technology, 10:779-783は、ＶＨ及びＶＬのドメインシャフリングによる親和性成熟を記述する。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発は、Barbas 等, 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91 : 3809-3813、Scier 等, 1995, Gene, 169: 147-155、Yelton 等, 1995, J. Immunol, 155: 1994-2004、Jackson 等, 1995, J. Immunol., 154: 3310-3319、及び Hawkins 等 , 1992, J. MoI. Biol., 226: 889-896に記載される。
「ファージディスプレイを用いた親和性成熟」(ＡＭＰＤ)は、Lowman 等, 1991 , Biochemistry 30(45): 10832-10838に記載の方法を指す。また、Hawkins 等, 1992, J. MoI. Biol. 226, 889-896及び米国特許第6,172,213号を参照のこと。以下の記載に厳密に限定されるものではないが、この方法は以下の通りに簡潔に記載されうる：幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子III産物への融合物として一価様式でディスプレイされる。様々な変異体を発現するファージは、数回の結合選別を経て、その後高親和性をディスプレイする変異体の単離及び配列決定を行う。また、この方法は国際公開公報92/09690に記述される。プールされた親和性ディスプレイを伴う変法は、Cunningham, 等, 1994, EMBOJ. 13(1 1), 2508-2515に記述される。
【００６９】
例えば、以下の工程を用いたファージディスプレイによる親和性成熟により、新規の結合ポリペプチドを選択する：
a) ポリペプチドをコードする第一遺伝子、第一及び第二の遺伝子が異種性である天然又は野生型のファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第二遺伝子、及び作用可能な状態で第一及び第二の遺伝子に結合される転写制御成分を含んでなる複製可能な発現ベクターを構築して、その結果、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を形成する、
b) 第一遺伝子内の一又は複数の選択した位置でベクターを変異させ、その結果、関連のプラスミドのファミリーを形成する、
c) プラスミドによって、適切な宿主細胞を形質転換する、
d) 形質転換した宿主細胞をファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージに感染させる、
e) プラスミドの少なくとも一部を含有し、宿主を形質転換できる組み換えファジミド粒子を形成するために好適な条件であって、微量のファジミド粒子が粒子の表面上に１コピー以上の融合タンパク質をディスプレイするように調節した条件下で形質転換して感染した宿主細胞を培養する、
f) 少なくとも一部のファジミド分子が標的分子と結合するように標的分子をファジミド分子と接触させる。そして、
g) 結合しなかったファジミド粒子から結合したファジミド粒子を分離する。
【００７０】
さらに、親和性成熟方法は、標的分子に結合する組み換えファジミド粒子により好適な宿主細胞を形質転換することと、d)からg)の工程を一又は複数回繰り返すことを含む。
あるいは、本方法は、複数のサブユニットから成るポリペプチドを含み、このとき、対象のサブユニットをコードするＤＮＡに作用可能に結合された転写制御成分を含む複製可能な発現ベクターはファージコートタンパク質に融合する。
あるいは、多価ファージ(McCafferty 等 ,1990, Nature 348, 552-554、Clackson 等,1991 , Nature 352, 624-628)を用いて、例えば誤差傾向があるＤＮＡポリメラーゼを用いて生成されたランダムな点突然変異体を発現させて、抗原に対する親和性によって、スクリーニングされたファージ抗体断片のライブラリを生成できる(Hawkins 等, 1992, J. MoI. Biol. 226: 889-896)。
【００７１】
２．スクリーニングアッセイ
ヒト抗体、ヒト-キメラ抗体又はヒト化抗体、ないしはこれらの抗体の断片などの対象の標的分子を識別及び／又は定量化するために、正確で非常に感度が高いスクリーニングを行うことができる。膜貫通型ポリペプチドは、例えば標的特異的な捕捉試薬として、本明細書に記述されるように調製される。
一般的に、ある有用なアッセイ方法は以下の工程を含む：(1) 試料中に存在する標的分子に膜貫通型ポリペプチドを反応させる。そして、(2) 結合した標的分子を数量化する。膜貫通型ポリペプチドは捕捉試薬として表面に固定されてもよい。
【００７２】
３．ＥＬＩＳＡ
イムノアッセイシステムは、例えば固相ＥＬＩＳＡ又は捕捉ＥＬＩＳＡである。捕捉ＥＬＩＳＡでは、固相への膜貫通型ポリペプチドの固定化は公知の方法によって達成される。ポリペプチドはアッセイ表面又はマトリックスを含む固相へ吸着されうる(例として米国特許第3,720,760号を参照)。ポリペプチドは、支持体の事前活性化の有無にかかわらず、アッセイ表面に非共有結合的に又は共有結合的にカップリングすることができる。例えば試料抗体を結合させた後に、免疫沈降法を行うことによって膜貫通型ポリペプチドを捕捉試薬として沈着することもできる。ある実施態様では、膜貫通型ポリペプチドは、臨界ミセル値以下にポリペプチド溶液を希釈することによって固定化される。アッセイ表面への可溶性タンパク質の沈着は、わずかな変性条件、例えば低度の塩基性又は酸性条件にて達成される。あるいは、タンパク質はアッセイ表面に共有結合することによって捕捉されるか、アッセイ表面上に配置された抗体などのタンパク質によって結合されうる。
ある実施態様では、捕捉試料は、本発明の方法によって産生された単離されて天然の高次構造をとるＣＤ２０などの膜貫通型ポリペプチドである。また、本ポリペプチドの断片も使用できる。膜貫通型ポリペプチドは試料からの抗体を結合する。
【００７３】
固定化のために用いられる固相は、基本的に不溶性でイムノアッセイに有用な不活性支持体又は担体であってもよく、例えば、表面、粒子、多孔性基質などの形態の支持体が含まれる。一般的に用いられる支持体の例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどから製造される試験管、アッセイプレート、微小粒子、プラスチックビーズ、ポリ塩化ビニル、セファデックス又は小シートなどが含まれる。このような支持体には、９６ウェルマイクロタイタープレート、並びに微粒子素材、例として濾紙、アガロース、架橋デキストラン及び他の多糖が含まれる。あるいは、反応性の水不溶性基質、例えば米国特許第3,969,287号；同第3,691,016号；同第4,195,128号；同第4,247,642号；同第4,229,537号；及び、同第4,330,440号において記述される反応性基質及び臭化シアン活性化炭水化物は、捕捉試薬固定化に好適に用いられる。固定された捕捉試薬はマイクロタイタープレート上にコートされうる。固相は、一度にいくつもの試料を分析するために用いることができるマルチウェルマイクロタイタープレートである。
【００７４】
固相は、所望のように、非共有的又は共有的な相互作用ないしは物理的な結合によって結合されうる捕捉試薬でコートされる。接着技術は、米国特許第4,376,110号及びこれに引用される文献において記述されるものが含まれる。
ポリスチレン又はポリプロピレンプレートが用いられる場合、プレートのウェルは、少なくともおよそ１０時間、例えば終夜で、およそ４〜２０℃、例えば４〜８℃の温度で、およそ８〜１２、例えば９〜１０、又はおよそ９．６のｐＨで、捕捉試薬(一般的に、０．０５Ｍ 炭酸ナトリウムなどの緩衝液で希釈される)にてコートされる。より短い被膜形成(コーティング)時間(１〜２時間)が望ましい場合には、プレートを３７℃でコートするか、ニトロセルロースフィルタ底を有するプレート、例えばミリポア MULTISCREEN^TM (Billerica, MA)を用いることができる。膜貫通型タンパク質を界面活性剤中で可溶性タンパク質としてアッセイ表面に適応してもよい。臨界ミセル値以下に界面活性剤を希釈すると、ポリペプチドがアッセイ表面に沈殿するであろう。
コートプレートは、一般的に、非特異的に結合して、プレートのウェル上の過剰な結合部位への自由リガンドの望ましくない結合を阻害するための結合部位を飽和する遮断剤(ブロッキング剤)にて処理する。一般的にブロッキング処理は、およそ１〜４時間、例えば１．５〜３時間、室温の条件下で行う。
【００７５】
コーティングおよびブロッキングの後、分析される血清試料は、必要に応じて希釈し、固定化プレートに加える。一般的に、希釈率は、容量にしておよそ５〜１５％、例えば１０％である。十分な感度を得るために、固定された捕捉試薬は適度に希釈した後に試料中の予想される分析物の最大モル濃度を超えるモル濃度にすることができる。試料および捕捉試薬のインキュベーションの条件はアッセイの感受性を最大にして、解離を最小にするように選択する。インキュベーション時間は主に温度に依存する。
試料は、システムから捕捉されなかった分析物を取り除くために、洗浄溶液にて固定された捕捉試薬から切り離す。通常、洗浄溶液は緩衝液である。
一般に、システムは３回洗浄しうる。一般的に、洗浄溶液の温度はおよそ０〜４０℃、例えば４〜３０℃の範囲である。自動プレート洗浄機が利用されてもよい。架橋剤又は他の好適な試薬を洗浄溶液に加え、捕捉された分析物を捕捉試薬に共有結合的に接着してもよい。
システムから捕捉されていない分析物分子を除去した後、例えば室温で、捕捉された分析物分子が抗体などの検出用試薬と接触する。
【００７６】
分析物と検出用試薬との接触時間と温度は主に用いる検出手段に依存している。例えば、ヒツジ抗マウスＩｇＧにコンジュゲートした西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)が検出手段として用いられる場合には、検出用試薬は、およそ０．５〜２時間、例えばおよそ１時間、捕捉された分析物とインキュベートすることができる。システムから結合しない検出用試薬を除去するために上記の通りにシステムを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を加えて反応させ、室温でおよそ５分間、又は色が十分に可視化されるまでプレートをインキュベートする。
結合していない分析物がシステムから洗浄された後に、過剰モルの検出用試薬がシステムに加えられる。検出用試薬はポリクローナル又はモノクローナル抗体又はその混合であってもよい。検出用試薬は、直接又は間接的に検出されうる。
少量の分析物が検出されうるように、検出用試薬の親和性は十分に高い。蛍光定量的ないしは化学発光的な標識成分は、従来の比色標識と比較してイムノアッセイの感度がより高い。選択された検出用試薬の結合親和性は、捕捉試薬の結合親和性を考慮して、検出用試薬が分析物を捕捉試薬から剥ぎ取られないようにすべきである。
【００７７】
標識成分は、検出用試薬への捕捉された分析物の結合を妨げない任意の検出可能な機能を有する。好適な標識成分の例としては、直接検出されうる成分、例えば蛍光色素、化学発光物質及び放射性標識物質、並びに、検出されるために反応するか誘導される酵素などの成分が含まれる。そのような標識物質の例として、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈおよび^１３１Ｉ、希有土類キレート又はフルオレセインのような蛍光体およびその誘導体、ロダイニン(Rhodainine)およびその誘導体、ルセリフェラーゼ(luceriferase)、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号)、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリフォスファターゼ、染料前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＰＰ、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジンなどが含まれる。
例えば抗体などの検出用試薬への標識成分のコンジュゲートは、イムノアッセイ技術の標準的操作手順である。例えば、O'Sullivan 等, 1981, Methods in Enzymology, 73: 147-166を参照のこと。従来法を利用して、タンパク質又はポリペプチドに対して標識成分を共有的に結合する。
捕捉試薬に結合した分析物の量は、固定相から結合していない検出用試薬を洗い流して、標識にふさわしい検出法を用いて分析物に結合した検出用試薬の量を計量することによって決定される。一実施態様では、標識成分は酵素である。酵素成分の場合、発色色素の量は、捕捉された分析物の量の直接の測定値である。例えば、ＨＲＰが標識成分である場合、色素は６５０ｎｍの吸光度で光学密度(Ｏ.Ｄ.)を定量化することによって検出される。他の実施態様では、捕捉試薬に結合した分析物の量は、間接的に測定される。
【００７８】
４．抗体調製
界面活性剤中に可溶化されたＣＤ２０などの膜貫通型ポリペプチドを、抗膜貫通型抗体を生成するための免疫原として直接使用することができる。また、抗体を生成するための他の方法は、本明細書中に記載のファージディスプレイ方法論を利用することができる。
抗体は第一の哺乳動物種由来の抗原に対して生じる。例えば第一の哺乳動物種はヒトでありうる。しかしながら、家畜、愛玩動物又は動物園動物など、例えば哺乳動物を治療するために抗体を用いることを意図する他の哺乳動物も考慮される。
抗体変異体を生成するために、一又は複数のアミノ酸変異(例えば、置換、欠失、付加)を公知のようにアミノ酸に加える。
【００７９】
(i) 抗原調製
抗体の産生に用いる膜貫通型抗原は、例えば、完全長ポリペプチドの可溶型ないしはその断片、例えば膜貫通型ポリペプチドの細胞外ドメインなどの可溶化完全長分子ないしその断片でありうる。
(ii) ポリクローナル抗体
一般的に、ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミンなどに関連抗原をコンジュゲートさせることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを該動物の複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。例えば、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００８０】
(iii) モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製するか、又は例えば米国特許第4,816,567号に記載の組換えＤＮＡ法や他の公知の方法によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターやマカクザルを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁, Academic Press, 1986)。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、例えば、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を含む適当な培地に蒔き、増殖させる。
【００８１】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(上掲のGoding, 1986)。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース(登録商標)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィーなどの常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて即座に単離され配列決定される。一例では、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson 等, 1980, Anal. Biochem., 107: 220に記載のようなスキャッチャード分析によって決定することができる。
【００８２】
(iv) ヒト化及びアミノ酸配列変異体
抗体のヒト化のための方法の例は、米国特許第6,037,454号 (抗CD11a抗体)、米国特許第6,329,509号 (抗IgE抗体)、米国特許第5,821,337号 (抗p185^HER2抗体)、及び国際公開公報98/45331 (抗VEGF抗体)に記載されており、出典明記によって組み込まれる。
既に記載したように、ファージディスプレイ、従来の免疫化、親和性成熟及び他の方法など、本明細書中に記載の膜貫通型タンパク質に特異的な抗体を選択するために多くの方法が利用されうる。
【００８３】
すべての文献、特許及び特許文書は、出典明記によって個々に組み込まれるのと同じように、出典明記により本明細書中に組み込まれる。開示内容は様々な具体的で好適な実施態様及び技術に関して記載されている。しかしながら、本開示内容の主旨と範囲内で多くの変更や修飾が加えられうることは理解されるであろう。
【実施例】
【００８４】
本発明は、例示的であり、いかなる場合においても本発明を限定するものではない以下の実施例を参照することによって、より理解されるであろう。
【００８５】
実施例１
ｐｈｏＡプロモーターによるＣＤ２０のクローニング及び発現
材料
すべての界面活性剤はAnatrace Inc., Maumee, OHから入手した。特に言及しない限り、すべての化学製品はSigma-Aldrich, St. Louis, MOから入手した。完全長リツキシマブ抗体は、Genentech Manufacturingから入手した。リツキシマブＦａｂは、大腸菌において、発現されて、プロテインＡ及び陽イオン交換クロマトグラフィによって、精製した。下記の実施例において、使用する発現コンストラクトを図８及び２１に概略的に示し、有効なリーダー配列を図２２に示す。特に明記しない限り、大腸菌細胞は５８Ｆ３株とした。
【００８６】
クローニング及び発現
ヒト及びマウスのＣＤ２０のｃＤＮＡを、βラクタマーゼ遺伝子及び３つの稀な大腸菌コドン(ａｒｇＵ、ｇｌｙＴ及びｐｒｏ２)のためのｔＲＮＡ遺伝子を含有するＢＲ３２２由来のプラスミド内に、標準的な分子生物学的技術(Ausubel 等 編集, 2003, Current Protocols in Molecular Biology, 4 VoIs., John Wiley & Sons)を用いてサブクローニングした。短いポリヌクレオチドは、高度な翻訳開始を確認するためのＣＤ２０のＮ末端のリーダー配列であるMKHQHQQ(配列番号7)をコードするように、そして、発現されたタンパク質の検出と精製を目的としたＣ末端のタグ配列であるオクタ-Ｈｉｓ(配列番号8)をコードするように付加した。遺伝子転写はｐｈｏＡプロモーターの制御下であり、発現はリン酸塩を制限することによって、誘導した。飽和したＬＢカルベニシリン培養物は、Ｃ. Ｒ. Ａ. Ｐ.リン酸制限培地(Simmons 等, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147)にて希釈した。次いで、培養物を３０℃で２４時間生育した。
Ｃ２Ｓ変異体を形成するために部位特異的突然変異によって、残基Ｃｙｓ１１１とＣｙｓ２２０がセリンに置換している、変異体ＣＤ２０を産生した。変異していないＣＤ２０と比較して、凝集、発現、溶解性及び天然の(未変性の)立体構造の保持を含めて、改善されたタンパク質性質について変異体を試験した。上掲のSimmons 等, 2002に記載のようにＣＤ２０の発酵槽発現を行った。
【００８７】
タンパク質単離
様々な界面活性剤の大腸菌内で発現されるＨｉｓ-タグ付加ヒトＣＤ２０を可溶化する能力を分析するために、５ｇの細胞を、ポリトロン(Brinkmann, Westbury, NY )を含む５０ｍＬのバッファＡ (20 mM Tris, pH 8.0, 5 mM EDTA)を用いて再懸濁し、１２５，０００×ｇで１時間遠心分離した。次いで、細胞ペレットをバッファＡに再懸濁して、ミクロフルイダイザー(Microfluidics Corp, Newton, MA)を用いて細胞破壊することによって、溶解して、１２５，０００×ｇで１時間遠心分離した。ペレットをＥＤＴＡを含まない同じバッファで１度洗浄して、前述の通りにペレット化した。ペレットを２０ｍＬのバッファＢ(20 mM Tris, pH 8.0, 300 mM NaCl)に再懸濁して、等分し、試験界面活性剤を以下の濃度で個々の分割量に添加した：
１％ ＳＤＳ、
１％ ｎ-ラウリルサルコシン
１％ ｎ-ドデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミン-Ｎ-オキシド(ＬＡＤＯ)、
１％ ドデシルホスホコリン(ＤＤＰＣ、Fos-Choline(登録商標) 12)、
１％ ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド(ＤＤＭ)、
１％ Triton(登録商標) X-100、
２．５％ ＣＨＡＰＳ。
室温で抽出されたＳＤＳ試料を除いて、ペレットを４０℃で終夜抽出した。次の日、試料を遠心分離して、上清を除去した。ペレット及び上清を、等しい容量に還元ＳＤＳローディングバッファに再懸濁して、西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)によって、プローブされたニトロセルロース膜上の免疫ブロット及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、分析した。
【００８８】
大規模な抽出のために、過去に記載があるように１００〜２００ｇの細胞を溶解して、不溶性分画を調製した。不溶性分画からＣＤ２０を抽出するために、はじめの湿細胞重量からおよそ１：２．５wt/volで最終のペレットをバッファＢに再懸濁し、ＤＤＰＣを１％添加して、溶液を４℃で終夜撹拌した。その翌日、界面活性剤不溶性分画を、１２５，００×ｇで１時間超遠心することによってペレット化した。上清を、バッファＢ及び５ｍＭ ＤＤＰＣで予め平衡化したNi-NTA Superflowカラム(Qiagen Inc. Valencia, CA)に流した。カラムを２０ｍＭ イミダゾールを含有する１０カラム容量のバッファＡで洗浄し、結合したタンパク質を２５０ｍＭ イミダゾールを含有するバッファＡにて溶出した。カラム負荷(ローディング)による精製の全工程は４℃で行った。
ＣＤ２０を含有する溶出液分画を濃縮して、５ｍＭ ＤＤＰＣでバッファＡ中で予め平衡化したSuperdex(登録商標) 200カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)に流した。Ｈｉｓ-タグ付加ヒトＣＤ２０及びマウスＣＤ２０は、５ｍＬのHiTrap HP Qカラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)の後にゲル濾過を行ってさらに精製した。界面活性剤交換のために、試料を、バッファＣ(0.1% DDM, 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.2.))のSuperdex 200カラムに通した。あるいは、試料を小さいNi-NTAカラムに結合して、バッファＣで洗浄し、３００ｍＭ イミダゾールを含有するバッファＣにて溶出した。次いで、これらの試料を、イミダゾールを取り除くためにバッファＣにて透析した。
【００８９】
ヒトＣＤ２０の親和性精製のために、リツキシマブを、１０ｍＬのActigel ALD Superflow樹脂(Sterogene, Carlsbad, CA.)に６ｍｇ／ｍｌで固定した。この樹脂はカラムに配置して、バッファ(0.1% DDM, 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.2)中で平衡化した。ヒト変異体ＣＤ２０であるＣ２Ｓを発現させて、上記のように天然のヒトＣＤ２０について精製した。精製されたＣ２Ｓ変異体をカラムに通し、バッファＢでしっかり洗浄することによって、結合していないタンパク質を除去した。タンパク質は、0.1% DDM, 150 mM NaCl及び20 mM クエン酸ナトリウム, pH 3.5にて溶出した。溶出された試料を直ちに中和して、濃縮して、バッファＣにて透析した。Smith 等, 1985, Anal. Biochem., 150:76-85 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL 61 101)に記載されるように、タンパク質濃度をＢＣＡで測定した。試料は使用するまで−８０℃に保存した。
【００９０】
密度勾配遠心分離
遠心チューブにおいて、150 mM NaCl及び20 mM HEPES, pH 7.2により緩衝した１．９Ｍ、１．４Ｍ及び０．８Ｍのショ糖溶液を重ねることによって、不連続なショ糖勾配を生成した。ＣＤ２０タンパク質を発現する細胞を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するバッファＡ中で細胞破壊によって溶解した。不溶性分画を３８，０００×ｇで１時間遠心することによって単離した。上清を廃棄して、ペレットを、1 : 5 wt/volで０．２５Ｍ ショ糖を添加した溶解バッファに再懸濁し、１００μＬ(マイクロリットル)のこの再懸濁液を０．９ｍＬの１．９Ｍ ショ糖溶液と混合した。その結果生じた混合物は１．７５Ｍ ショ糖の終濃度であった。次いで、この混合物を遠心チューブの底に置き、残りの１ｍＬの２つのショ糖溶液を上に重ねた。次いで、０．２５Ｍ ショ糖溶液の最後の２００μＬ(マイクロリットル)層をチューブの上部に加えた。試料をＳＷ55ローターにかけ、１００，０００×ｇで１時間回転した。次いで、チューブの上部から２００μＬ(マイクロリットル)ずつ試料を慎重に取り分け(unload)て、ニトロセルロースに転写して、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体でプローブしたＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＣＤ２０タンパク質は、１μｇ／ｍＬでＣＤ２０を含有するＰＢＳ(臨界ミセル濃度以下に希釈された可溶化界面活性剤を含有する)１００μＬ(マイクロリットル)を用いて、９６ウェルプレート上に終夜４℃でコートした。次いで、プレートを0.05% Tween-20を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＴ)にて３回洗浄し、２００μＬの０．５％ ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ(ブロッキングバッファ及びアッセイバッファ)にて室温で４５分間ブロックした。プレートを再度ＰＢＳＴにて３回洗浄した後、一次抗体でプローブした。アッセイバッファに６０μｇ／ｍＬ(マイクログラム／ｍＬ)のリツキシマブを１５０μＬ(マイクロリットル)の容量で、適当なウェルに加え、第一のウェルから５０μＬを取り出し、次のウェルと第三のウェルに１００μＬ(マイクロリットル)のアッセイバッファとともに混合して、およそ２ｎｇ／ｍＬの終濃度とすることによって、第三のウェルに３倍の段階希釈液を作成した。
室温で９０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄して、結合したリツキシマブを、アッセイバッファで１：２０００に希釈した１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＦ(ａｂ')２(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove,n PA)で検出して、ＰＢＳＴにて６回洗浄して、製造者の指示に従って混合した１００μＬ／ウェルのTMB Microwell Peroxidase Substrate System (KPL, Gaithersburg, MD)にて反応させた。１００μＬ／ウェルの１．０Ｍ リン酸を添加して反応を止め、４５０ｎｍの吸光度をプレート読み取り機を用いて測定した。
２５ｍＭ ヨードアセトアミドの添加によるアルキル化と、１０ｍＭ ＤＴＴによる還元によって、還元とアルキル化されたＣＤ２０試料を調製した。さらに１００ｍＭ ＤＴＴを添加することによって、反応を止めた。各処置後に、ｐＨ８．０で室温で、３０〜６０分置いて反応の進行を促した。還元及び再酸化のために、ＣＤ２０試料を１０ｍＭ ＤＴＴにて還元した後、プレートに広げ、抗体結合の前に、ＤＴＴの存在下にて数時間プレート上に置いて再酸化させた。
【００９２】
表面プラスモン共鳴
単離されたヒトのＣＤ２０タンパク質のリツキシマブ親和性及び結合動態を、BIAcore^TM -3000 計器(BIAcore, Inc. Piscataway, NJ)を用いて測定した。供給者の指示に従って、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドとＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドハイドロクロライドを用いてリツキシマブ又はリツキシマブ-Ｆａｂの共有的なカップリングのためにＣＭ５センサーチップを活性化した。リツキシマブ又はリツキシマブ-Ｆａｂを、10 mM sodium acetate, pH 5.0にて１００μｇ／ｍＬの濃度に５〜１０倍希釈して、活性化したチップ上に注入した。残りの活性なカップリング部位を１Ｍ エタノールアミンによって、ブロックした。完全なリツキシマブを８０００-１２０００ＲＵで沈着させ、リツキシマブ-Ｆａｂを４０００-７０００ＲＵで沈着した。
動態学的な測定のために、２５℃の0.1% DDM, 150 mM NaCl, 及び20 mM HEPES, pH 7.2に５μＭの開始濃度からのヒトＣＤ２０の７つの倍数希釈物(合計８試料)を、３０μＬ／分の流速で１００秒間注入した。結合したタンパク質を７２０秒間解離させた。各試料測定の終了後、センサー表面を、２０μＬの１０ｍＭ ＨＣｌを注入することによって、再生した。センサーグラムを参照流量からシグナルについて補正した後、BIAevaluation 3.0 (BIAcore)による単一１:１モデルを用いて動態を算出した。
【００９３】
円二色性分析法(CD)
０．１％ ＤＤＰＣ又は０．１％ ＤＤＭ中のＣＤ２０の界面活性剤溶液を、100 mM リン酸ナトリウム, pH 7.2及び０．１％ ＤＤＰＣ又は０．１％ ＤＤＭのいずれかに対して透析することによって、調製した。１ｍｍの石英キュベット内に２〜５μＭのタンパク質試料によるAVIV202計器を用いて円二色性のデータを収集した、１０秒の平均時間につき２ｎｍ増大で、示した領域について２５℃で波長スキャンを行った。データは、β-メルカプトエタノールを含有する試料を除いて１８５から２８５ｎｍの範囲についてプロットした。β-メルカプトエタノールはより低波長でデータ収集を妨げるので、これらのデータは２００ｎｍで切り捨てた。
【００９４】
正常なヒトＢ細胞へのリツキシマブＩｇＧ及びＦａｂ結合のスキャッチャード分析
放射性標識したタンパク質を用いてＢ細胞へのリツキシマブＩｇＧ及びリツキシマブＦａｂ断片結合について平衡解離定数(Ｋ_ｄ)を測定した。結合アッセイバッファ(0.5% bovine serum albumin, 25 mM HEPES, pH 7.2, 及び0.01 % sodium azideを含有するＤＭＥＭ培地)にてすべて希釈した。Iodogenでヨウ素化したリツキシマブ^１２５Ｉ-ＩｇＧ又はIodogen又はラクトペルオキシダーゼでヨウ素化した^１２５Ｉ-Ｆａｂの分割量(０．０５ｍＬ)を、それぞれ０．００５又は０．０５ｎＭの濃度でＶ底９６ウェルマイクロアッセイプレートの試験ウェルに分配した。コールド抗体の階段希釈物(０．０５ｍＬ)を加えて、混合した。次いで、精製されたヒトＢ細胞(０．０５ｍＬ中に１２５０００)をウェルに添加した。プレートを密封して、室温で２４時間インキュベートし、２５００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。上清を吸引して、細胞ペレットを洗浄し、遠心分離した。上清を再度吸引して、ペレットを１Ｎ ＮａＯＨに溶解して、γ計測のためにチューブに移した。McPherson, 1983, Comput. Programs. Biomed., 17:107-113に記載のように、プログラムLigandを用いてMunson 等, 1980, Anal. Biochem., 107:220-239にて説明したように、スキャッチャード分析にデータを用いた。
製造者のプロトコールにしたがって、RosetteSep^TM Ｂ細胞濃縮混合物(Stemcell Technologies, Vancouver, Cananda)を用いてネガティブ選別することによって、１００ｍＬのヘパリン処理した正常ヒト血液から正常なヒトＢ細胞を単離した。さらに、Ｂ細胞をFicoll-Paque (Amersham Biosciences, Peapack, NJ)により分離した後単離して、リン酸緩衝食塩水で洗浄した。任意の残りの赤血球は、低張液に３０秒間曝すことによって、溶解した。次いで、精製したＢ細胞を結合バッファミリリットル当たり１〜２百万細胞の濃度に調製した。
【００９５】
大腸菌における膜結合ヒトＣＤ２０の発現
ヒトＣＤ２０の一次構造を図１に示す。ＣＤ２０の提唱された位相幾何学は、細胞質に両末端を有するテトラ貫通型の膜タンパク質のものである。ＣＤ２０の２つの細胞外ループは、大きさが著しく異なる。ヘリックス１とヘリックス２の間の第一ループは非常に小さく、膜から広範囲に突き出ているようではない。ＭＳ４Ａファミリーの他のメンバーでは、このループの大きさは非常に保存されている(例えばIshibashi 等, 2001 , Gene, 264:87-93及びLiang 等, 2001 , Genomics, 72: 119-127を参照)。
ヘリックス３とヘリックス４の間の第二ループは、残基１４０の領域から残基１８５の領域におよぶおよそ４６アミノ酸長であって、残基１６７と１８３の間に１つの起こりうるジスルフィド結合を含有する。これらの多くの配列が細胞外ジスルフィド結合形成能を有するにもかかわらず、このループのサイズは、ＭＳ４Ａファミリーの遺伝子のアミノ酸配列の中で非常に異なる(上掲のIshibashi 等, 2001 及び上掲のLiang 等, 2001)。静止Ｂ細胞の膜の細胞質側にあるＣＤ２０はリン酸化される(Valentine 等, 1989, 1989, J. Biol. Chem., 264:11282-11287)。リン酸化は、抗体架橋に反応して増加する(Tedder 等, 1988, J. Biol. Chem., 263: 10009-10015)。ＣＤ２０に翻訳後修飾は認められておらず、ヒトタンパク質は細胞外領域に任意のコンセンサスＮ-グリコシル化部位を欠いている。
【００９６】
ＣＤ２０の構造及び抗体結合のジスルフィド結合形成の持ちうる役割を確認するために、上記のように、Ｈｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０タンパク質を大腸菌内で発現させた。大腸菌におけるタンパク質の天然の発現についての能力は、密度勾配遠心分離及び天然の界面活性剤において、タンパク質溶解性を試験することによって、膜にＣＤ２０の細胞性発現を局所化させることによって評価した。
図２は、ショ糖勾配における単離されたＣＤ２０の局在を示す。分画番号１−１６はパネルａのゲル上に示す。ショ糖勾配の分画からの分割量を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにて電気泳動した。ゲルをブロットして、抗Ｈｉｓタグ抗体にてプローブした。分画は、最も低いショ糖密度(１)から最も高いもの(１４)から得た。図２のパネルａに示されるように、細菌内で発現された総タンパク質のおよそ半分は、１．２８ｇ／ｃｍ^２未満の密度を有するショ糖分画(１２)(１．７５Ｍ ショ糖)に局在しており、残りはペレット上で観察された(分画１６)。
典型的な可溶性タンパク質は１．３３〜１．４２ｇ／ｃｍ^２の密度であり (Creighton, 1993, Proteins Structures and Molecular Properties, 2 Ed., W. H. Freeman and Company, New York, USA)、ショ糖の底の層の密度以上である(１．２８ｇ／ｃｍ２、１．７５Ｍ)。可溶性タンパク質は勾配のそこで観察される一方で、膜結合タンパク質はタンパク質周辺の脂質の存在によりより低い密度に浮遊する。大腸菌膜の密度が１．１５〜１．２５ｇ／ｃｍ^２であると報告されているので(Ishidate 等, 1986, 7. Biol Chem., 261 : 428-443)、図２のパネルａに示されるデータは、細菌の細胞性膜分画へのヒトＣＤ２０の局在と一致している。また、これらの所見は、細菌の細胞性膜における天然の立体構造の他の真核生物の膜タンパク質の発現を示す近年の報告と一致している(Bertin 等, 1992, J. Biol. Chem., 267:8200-8206、Grisshammer 等, 1993, Biochem J., 295(Pt2): 571-576)。
【００９７】
界面活性剤−ＣＤ２０の可溶化
ＣＤ２０の可溶化に有用な界面活性剤は、上記の方法を用いて、非変性及び変性の界面活性剤のアレイをスクリーニングすることによって、決定した。界面活性剤抽出の後の大腸菌細胞膜からのペレットと上清を抗Ｈｉｓ抗体でプローブした。図２のパネルｂはスクリーニングの結果を示す。ヒトＣＤ２０のウェスタンブロットでは、異なる界面活性剤による上清を(Ｓ)とラベルし、ペレットを(Ｐ)とラベルした。(ＷＣ)は全細胞抽出物(コントロール)を意味する。
膜からのタンパク質の抽出に用いた多種の界面活性剤は、SDS (1)、n-ラウリルサルコシン(2)、n-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド(LADO) (3)、n-ドデシルホスホコリン(DDPC) (4)、n-ドデシル-D-D-マルトシド(DDM) (5)、Triton-X 100 (6)、及びCHAPS (7)である。ウェスタンブロットに示されるように、多種の界面活性剤を用いて可溶性タンパク質を得た。実質的なＣＤ２０の分画は、非変性の双性イオンの界面活性剤であるドデシルホスホコリン(ＤＤＰＣ)(4)に溶解性である。この界面活性剤は、ＣＤ２０の抽出及び精製の更なる研究のために選択した。
【００９８】
Ｈｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０は、ＤＤＰＣにより大腸菌膜から抽出され、上記の通りに金属キレート剤、サイズ排除及び陰イオン交換クロマトグラフィによって、精製した。１グラムの細菌細胞からおよそ１０〜２０μｇの精製したＨｉｓタグ付加ＣＤ２０タンパク質を得た。
図３は、抽出して精製したヒトＨｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０、Ｃ２Ｓ変異体及びマウスＣＤ２０のクーマシー染色したＳＤＳゲルレーンを示す。レーン１、２及び３は非還元タンパク質である、ヒトＣＤ２０(レーン１)、Ｃ２Ｓ変異体(レーン２)及びマウスＣＤ２０(レーン３)を示す。レーン４は、分子量マーカー(Mark 12, Invitrogen)を含有する。レーン５、６及び７は、還元タンパク質である：ヒトＣＤ２０(レーン５)、Ｃ２Ｓ変異体(レーン６)及びマウスＣＤ２０(レーン７)を示す。レーン８と１０は、分子量マーカー(レーン９)に隣接する非還元(レーン８)と還元(レーン１０)のマウスＣＤ２０を示す。各レーンは、２μｇ(マイクログラム)のタンパク質を含有する。タンパク質マーカーの分子量は、２００、１１６、９７、６６、５５、３６、３０、２２、１４及び６ｋＤａである。精製されたＨｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０の代表的なＳＤＳ-ＰＡＧＥを図３(レーン１と５)に示す。タンパク質は、還元条件下でおよそ３８ｋＤａの見かけの分子量に移動する。これは算出した分子量３５ｋＤａとの妥当な一致である。
また、精製したＣＤ２０は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ上で非還元及び還元の条件下での移動度において、適度な変化を示した。注目すべきことに、還元(レーン１０)及び非還元(レーン８)のマウスＣＤ２０が隣接するレーンに走行(run)したことが図３に明らかに観察された。この変化から、非還元ＣＤ２０が、大きな細胞外ループに配位するジスルフィド結合のために、還元型のものよりより集約的に、より速く移動する構造で存在することが示唆される。このジスルフィド結合は還元剤の添加により破壊する。
【００９９】
界面活性剤であるドデシルマルトシド(ＤＤＭ)とＬＡＤＯが限定したＣＤ２０可溶化能のみを示すにもかかわらず、上記及び図２のパネルｂに示す条件を用いたウェスタンブロットにより大腸菌からの界面活性剤可溶化が実に正確に定量化されるかどうかを評価するために、ラージスケールの精製もこれらの界面活性剤により行った。簡潔に言えば、発現される大腸菌の不溶性分画であるＨｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０を、１％の示した界面活性剤によって、抽出した。試料を遠心分離して、ペレット及び上清を等量のＳＤＳバッファに懸濁した。等量の各試料を還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥ上で電気泳動した。比較するために、いかなる操作も必要としないで、溶解の後に等量の全細胞分画(ＷＣ)をＳＤＳバッファに懸濁した。
ＤＤＭ又はＬＡＤＯのいずれかを用いて精製したタンパク質は著しく純度が低く、該手順はＤＤＰＣにより行った精製よりも著しくタンパク質収率が低い。しかしながら、精製後にＣＤ２０を非イオン性界面活性剤に成功裏に交換できることから、ＤＤＰＣは特有のＣＤ２０可溶化能を有していないことが示される。
【０１００】
マウスＣＤ２０の発現
マウスＣＤ２０を発現させて、ヒトＣＤ２０の精製に用いたのと同様の条件下で精製した。この精製の結果を図３(レーン３及び７)に示す。マウスタンパク質物質はヒトＣＤ２０よりも有意に良好に移動した。これは、非還元ＳＤＳゲル上での移動が小さく(レーン１と３を比較、図３)、最終的なタンパク質収率が高いことを示す。マウス及びヒトのＣＤ２０の一次配列の観察から、ヒト配列のシステイン残基１１１(図１)がマウスタンパク質ではセリンに置換されていることが示された。この置換は、Ｃｙｓ１１１がＣＤ２０の活性に必須ではないことを示唆する。さらに、Ｃｙｓ２２０のアラニンへの置換により、真核細胞で発現される場合の野生型タンパク質と同様に、発現と抗体依存性の脂質ラフト結合が起こるので、システイン２２０はＣＤ２０に活性に必須ではない。Polyak 等, 1998, J. Immunol., 161 : 3242- 3248を参照。
【０１０１】
表２ ヒト及びマウスのＣＤ２０

【０１０２】
Ｃ２Ｓ突然変異
ＣＤ２０の発現及び抗体結合を評価するために、残基Ｃｙｓ１１１及びＣｙｓ２２０の両方を変異してこれらの位置のセリンを置換し、Ｃ２Ｓ変異体を形成した。Ｃ２Ｓ変異体を発現させ、Ｈｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０について上記の通りに精製した。Ｃ２Ｓ変異体は、凝集の減少及び収率の増加などの天然のタンパク質よりも向上したタンパク質行動を示した。
Ｈｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０の発現を示す大腸菌細胞抽出物の試料と、Ｃ２Ｓ変異体ＣＤ２０の試料を、図２のパネルｃに示す。レーン１及び４は、コントロール(空のベクター)を含有する；レーン２及び５は、ヒトのＣＤ２０を含有する；そして、レーン３及び６は、Ｃ２Ｓ変異体ＣＤ２０を含有する。レーン１、２及び３の試料は、非還元条件で行った；レーン４、５及び６の試料は、１００ｍＭ ＤＴＴで還元した。各レーンは、光学濃度で標準化した等量の細胞を含有する。
Ｃ２Ｓ変異体(レーン３及び６)は、大腸菌内でより高いレベルで発現され、天然のヒトＣＤ２０(レーン２及び５)より低いジスルフィド依存性凝集を示した。また、Ｃ２Ｓ変異体の低い凝集とおよそ２倍高いタンパク質収率を図３のパネルｃに示される。このパネルｃでは、Ｃ２Ｓを含有するレーン２及び６を天然のヒトＣＤ２０(レーン１及び５)及びマウスＣＤ２０(レーン３及び７)と比較した。
【０１０３】
リツキシマブを結合する発現されたｒＣＤ２０
精製された組換えＣＤ２０が天然の立体構造をとっているかどうかを評価するために、キメラ抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブを結合する精製タンパク質の能力を分析した。この抗体は、Ｂ細胞の表面に発現されるヒトＣＤ２０の構造的に制約を受ける細胞外ループと結合することが知られている(Polyak 等, 2002, Blood, 99:3256- 3262)。ＥＬｌＳＡアッセイは、精製したヒトＣＤ２０へのリツキシマブの結合に基づいて行った。結果を図４のグラフに示す。このグラフでは、Ｈｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０(■)、還元してアルキル化したｈＣＤ２０(●)、還元して再酸化したｈＣＤ２０(□)及びＰＢＳコントロール(○)へのジスルフィド依存性のリツキシマブ抗体結合を示す。4-パラメーターフィット分析により、リツキシマブ結合についてのポイントによる曲線を決定した。
図４に示すように、このアッセイでは、ナノモル親和性でリツキシマブはＨｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０を結合する。データを４-パラメーターフィッティングして９．４ｎＭのＥＣ５０を測定した。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡにおいてリツキシマブに結合しない還元型ｒＣＤ２０
リツキシマブ結合は、残基Ｋ１４２とＹ１８４との 間のＣＤ２０の細胞外ループに局所化された(上掲のPolyak 等, 2002)。この領域の２つの残基であるＣ１６７及びＣ１８３はジスルフィド結合を形成すると考えられている(Einfeld 等, 1988, EMBO J., 7:71 1 -717)。次に、リツキシマブ結合は、このジスルフィド結合の存在にきわめて依存すると思われる。リツキシマブの結合のためのＣＤ２０の任意のジスルフィド結合の重要性を評価するために、ＣＤ２０を還元し、アルキル化して、リツキシマブ結合についてアッセイした。この手順により、ＣＤ２０を結合するためのリツキシマブの能力は実質的に減少した。更なるコントロールとして、ＣＤ２０を還元し、ＤＴＴを除去して、タンパク質を再酸化した。リツキシマブ結合は、ＣＤ２０におけるジスルフィド結合の再形成に関係する、この手順において部分的に回復したことから、その抗体結合がジスルフィド結合形成に依存していることが示される。現在のところマウスＣＤ２０の細胞外領域のための抗体が利用できないので、マウスＣＤ２０について類似のアッセイを行うことができなかった。
【０１０５】
ｒｈＣＤ２０及びＣ２Ｓ変異体のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
上記のＣＤ２０のＥＬＩＳＡアッセイにより、抗体結合における結合活性効果考慮することができた。このような効果に非依存的なヒトＣＤ２０へのリツキシマブの結合を評価するために、表面プラスモン共鳴アッセイを行った。この技術は、動態学的な結合情報及び平衡結合定数を求める付加的な効果がある。これらの実験では、リツキシマブ又はリツキシマブＦａｂをＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップに堆積して、様々な濃度の可溶性ヒトＣＤ２０をチップに通した。完全長リツキシマブを１０，０００のＲＵで堆積して、示した濃度のヒトＣＤ２０を150ｍM NaCl、20 mM HEPES (pH 7.2)及び0.1% DDM中に２０μＬ／分の流速でセンサーチップに堆積した。
興味深いことに、ＣＤ２０がＤＤＰＣにて単離することができたにもかかわらず、固定されたリツキシマブへのＣＤ２０の結合はこの界面活性剤がある場合に有意に減少した(データは示さない)。したがって、表面プラスモン共鳴実験の親和性は、ＤＤＭ存在下で測定した。
【０１０６】
これらの実験から得た代表的なデータを図５に示す。このＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムはリツキシマブとヒトＨｉｓタグ付加ＣＤ２０との間の結合を示す。固定したリツキシマブへのヒトＣＤ２０の結合は、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６３μＭ、０．３１μＭ、０．１６μＭ、０．０８μＭ、及び０．０４μＭを含む、０．０４μＭから５．０μＭの範囲のＣＤ２０濃度で生じる。初めの４つの試料の濃度をセンサーグラムに標識した。非還元型ＣＤ２０(■)、還元してアルキル化したＣＤ２０(●)、再酸化させた還元型ＣＤ２０(□)及びコントロールＰＢＳ(○)についてのリツキシマブの結合を示す。４パラメーターフィッティング分析により結合曲線を求めた。各濃度での非共作用可能のモデルへの算出した理論的なフィットを示す。
表３では、ヒトＣＤ２０、Ｃ２Ｓ変異体及び親和性成熟したＣ２Ｓ変異体とのリツキシマブＩｇＧ又はＦａｂの結合パラメーターを示す。データは、複数の実験で代表的なものであり、単一の結合部位モデルにフィットさせた。Ｋｄ値及びＫａ値は、結合速度と解離速度から算出した。この表から、Ｈｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０とヒトＣＤ２０のＣ２Ｓ変異体が、完全長リツキシマブ抗体とＦａｂ断片の両方と同じ結合特性をおよそ表すことが示された。データから、ＣＤ２０のＣｙｓのＳｅｒへの突然変異は抗体結合を変えなかった、例えば、抗体結合に必要とされる「天然の」高次構造を変えなかったことが示唆された。
【０１０７】
表３

【０１０８】
大腸菌内で発現されるｈＣＤ２０は「天然の」高次構造をとる。
我々の製剤中に存在する、抗体結合に適切な高次構造を有するＣＤ２０の割合を決定するために、さらに我々はリツキシマブ親和性カラムによりヒトＣＤ２０のＣ２Ｓ変異体を精製した。収率が低かったにもかかわらず、親和性精製の前後の結合データは全体的に一致しており、多くの精製したヒトＣＤ２０がリツキシマブを結合することができる高次構造をとっていることを示した。抗体結合の適度な改善は、固定したリツキシマブによる親和性精製の後に示された。この向上した親和性は、ＣＤ２０の純度の向上又は不活性ＣＤ２０分子の除去のいずれかによるものでありうる。Ｆａｂと比較して、完全長抗体のＣＤ２０の親和性にわずかな違いが観察された。このわずかな相違は、センサーチップへの小Ｆａｂ断片のカップリング又はＦｃ領域の除去の後のＦａｂの構造のわずかな変化による表面効果によるものであると思われる。
【０１０９】
界面活性剤ミセルに凝集される任意のＣＤ２０はＩｇＧとＦａｂ結合の親和性に結合活性効果を寄与する可能性がある。結合活性効果の影響を除去することは難しいが、２つの理由のために、このアッセイで観察される結合に有意に寄与すると思わない。第一に、完全なリツキシマブ ＩｇＧ又はＦａｂ断片の可溶性ＣＤ２０の親和性は、２倍未満の相違を示す。たとえＦａｂ結合が、センサーチップ上でＦａｂ断片に近接していることによって、いくらかの結合活性効果を許容したとしても、Ｆａｂ断片の配向性及びランダムなカップリングが測定上近いとは考えにくい。加えて、ＩｇＧデータとＦａｂデータは、一価性結合に予測される理論上のフィットと著しく近い。理論上の一価性結合との相違は、特にＩｇＧ ＢＩＡｃｏｒｅ実験で明らかであるが、図５に示すように、リツキシマブＩｇＧへのＣＤ２０結合についての実際の実験データと理論上の一価性フィットは非常に近い。したがって、実験データを説明するために更なる結合モデルを必要としない。
第二に、ＢＩＡｃｏｒｅによって、測定した、リツキシマブＩｇＧとＦａｂ断片との親和性測定値は、正常ヒトＢ細胞上での結合のスキャッチャード分析から測定したリツキシマブＦａｂ断片の親和性測定値と近い。正常ヒトＢ細胞へのリツキシマブＩｇＧ又はＦａｂの結合を、^１２５Ｉ-ＩｇＧ又は^１２５Ｉ-Ｆａｂに対して非標識リツキシマブＩｇＧ又はＦａｂを競合させて決定した。示したデータは２つのドナーからの正常細胞による分析の平均である。リツキシマブ ＩｇＧ及びＦａｂの結合実験の典型的な置換プロットを図７に示す。ドナー１については^１２５Ｉ-ＩｇＧに対する非標識リツキシマブＩｇＧの競合(上方パネル)又はドナー４については^１２５Ｉ-Ｆａｂに対する非標識リツキシマブＦａｂの競合によって、結合を測定した。各測定値は単一のドナーから得た細胞にて３通り行ったものである。表４は各ドナーからのレセプターの数と親和性を示す。このアッセイにおいて、天然のＣＤ２０のＥＣ_５０は９．５ｎＭであった。
【０１１０】
表４

【０１１１】
このデータから、ＢＩＡｃｏｒｅによって、決定した単離したヒトＣＤ２０についてのリツキシマブＦａｂの一価性親和性と、単離したヒトＢ細胞上に発現されるＣＤ２０についてのリツキシマブＦａｂの一価性親和性とではわずかに３〜４倍の相違があったことが示された(スキャッチャード分析では５０〜６０ｎＭに対してＢＩＡｃｏｒｅ実験では１９０〜２８０ｎＭ)。このわずかな相違は、とりわけ、アッセイ方法に本来生じうる相違、タンパク質環境の物理学的な相違、界面活性剤の存在、又は単離された材料中のＣＤ２０結合パートナーの欠如を表しうる。興味深いことに、Ｂ細胞に対するリツキシマブＩｇＧとＦａｂ結合との大きな相違を注記する。これは、結合活性効果がＢ細胞へのリツキシマブの結合に作用しうることを示唆する。
ヒトＣＤ２０についてリツキシマブのＫ_ｄを予測したところ(８４〜１７０ｎＭ)、結合及び解離の結合速度は、特に２５℃で０．１５ｎＭ未満のＫ_ｄ、３．６×１０^４(Ｍ^−１ｓ^−１)のｋ_ｏｎ及び０．０５×１０^−４(ｓ^−１)以下のｋ_ｏｆｆを有する親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体(Chen 等, 1999, J. MoI. Biol., 293:865-881)などの高親和性抗体と比較して、相対的に速い。しかしながら、単離したＣＤ２０についてのＢＩＡｃｏｒｅにより決定したリツキシマブＦａｂ断片又はリツキシマブＩｇＧの親和性が正常Ｂ細胞のスキャッチャード分析から測定したリツキシマブＦａｂ親和性と近いので、低い一価性親和性値は現実的であり、単離したｈＣＤ２０調製物中に微量に存在するフォールド不全ないしは非天然の高次構造によるものではない。
【０１１２】
円二色性による二次構造の分析
さらに、ヒトＣ２Ｓ及びマウスＣＤ２０の円二色性分光法(ＣＤ)によって、ＣＤ２０の二次構造について分析した。この分析の試料スペクトルを図６に示す。
上方のパネルは、０．１％ ＤＤＰＣ存在下でのヒトＣＤ２０変異体Ｃ２Ｓ(黒色線)、０．１％ ＤＤＰＣ及び１０ｍＭ β-メルカプトエタノール存在下でのヒトＣＤ２０変異体Ｃ２Ｓ(波線)、そして１％ ＳＤＳ存在下で９５℃にサーマルスキャンした後のヒトＣＤ２０変異体Ｃ２Ｓ(点線)のスペクトルを示す。下方のパネルは、０．１％ ＤＤＰＣの存在下でのマウスＣＤ２０(波線)、０．１％ ドデシル-マルトシド(ＤＤＭ)の存在下でのマウスＣＤ２０(点線)、及び、１％ ＳＤＳ及びβ-メルカプトエタノールを添加した０．１％ ＤＤＭ中で９５℃で２分間熱した後のマウスＣＤ２０(黒色線)のスペクトルを示す。データをモル楕円率として表す。
テトラ貫通型膜タンパク質としてＣＤ２０の予測されるトポロジーに基づくと、ＣＤ２０はおよそ３５％のヘリックス含有量である。ヒトＣＤ２０(図６上方パネル)とマウスＣＤ２０(図６下方パネル)のＣ２Ｓ変異体の両方は２２２ｎｍ領域のスペクトルに有意なシグナルを示す。これから有意なヘリックス含有量を有するタンパク質が予測される。還元剤の添加により、ＤＤＰＣ(上方パネル、波線)又はＳＤＳ(上方パネル、細線)のいずれかの存在下において、マウス(下方パネルｂ、黒色線)又はヒトＣＤ２０のＣ２Ｓ変異体の二次構造が有意に変化しなかった。さらに、ＣＤ２０の二次構造は、多様な界面活性剤及び温度下で非常に安定であるようである。ＳＤＳ存在下のヒトＣＤ２０のＣ２Ｓ変異体(上方パネル、細線)、又はＳＤＳ及び還元剤存在下のマウスＣＤ２０(下方パネル、黒色線)のＣＤスペクトルは、短時間の加熱サーマルスキャン後に、天然のタンパク質のスペクトルとほぼ同じである(図６参照)。データをモル楕円率として表す。
【０１１３】
２５℃から９５℃への温度スキャンにより、ヒトＣＤ２０が９５℃で、およそ３５％の２２２ｎｍヘリックスシグナルを喪失することが示された(データは示さない)。共同性の非フォールディング又は共同性の再フォールディングの形跡がないにもかかわらず、少なくとも短時間熱した後に、試料を低温度に戻すと、ほとんどのシグナルは回復する(図６)。加熱及び非加熱のヒトＣＤ２０試料のわずかな相違は、いくつかの構造が永久に失われ、より長く熱に曝すと永久に変性したタンパク質の量が潜在的に増加することを示しうる。マウスＣＤ２０への還元剤の添加は、ＳＤＳのタンパク質の熱安定性に有意に影響しなかった(パネルｂ、黒色線)。αヘリックス構造を有することが予測されるＣＤ２０の領域の外に位置するジスルフィド結合は、ＣＤ２０の全体にわたる構造的安定性にほとんど寄与しないであろう。また、ジスルフィド結合の減少により生じるＣＤ２０の構造への変化はＣＤにより単純に観察されるものではないようである。また、ＣＤにより測定されるように、β２アドレナリンレセプターのジスルフィド結合の減少は二次構造への影響を制限していたことが既に報告されている(Lin 等, 1996, Biochemistry, 35: 14445-14441)。同様に、ジアシルグリセロールキナーゼの二次構造は、ここで使用するものと同じ条件下のＳＤＳによって、影響を受けない(Lau 等, 1997, Biochemistry, 36:5884-5892)。
【０１１４】
実施例２
ｐｈｏＡプロモーターによるＭＳ４Ａタンパク質の発現
テトラ膜貫通型ポリペプチドのＭＳ４Ａファミリーの更なるメンバーを、上記の実施例１の方法によりｐｈｏＡプロモーターの調節下で大腸菌内で発現させた。実施例１に記載の方法によって、遺伝子産物MS4A4A (配列番号10)、MS4A6A (配列番号12)及びMS4A7 (配列番号14)を大腸菌内で発現させた。抗Ｈｉｓイムノブロットを用いて検出したところ、細胞から大量のタンパク質が得られた。図８に示すように、検出されたＭＳ4Ａポリペプチドは、Liang及びTedder (2001, Genomics 72: 1 19-127)により仮定された予測分子量に近い分子量であった：
ＭＳ４Ａ４Ａ ＭＳ４Ａ６Ａ ＭＳ４Ａ７
２７ｋＤａ ２９ｋＤａ ２３ｋＤａ
【０１１５】
実施例３
ｐｈｏＡプロモーターの突然変異
大腸菌プロモーターであるｐｈｏＡは、ＣＤ２０などのテトラ膜貫通型タンパク質のＭＳ４Ａファミリーを含む複合体膜貫通型タンパク質を発現する際の使用のために選択した。以下の表５に示すように、ｐｈｏＡプロモーターは、代表的なプロモーター要素、例えば翻訳開始部位 ＡＴＧ、−１０のＴＡＴＡボックス ＴＡＴＡＧＴ、及びｐｈｏボックス GCTGTCATAAAGTTGTCAC(配列番号20)を含む。
通常、大腸菌の哺乳類の多貫通型膜タンパク質の発現は、通常、抗原曝露と考えられる(例として、Grisshammer, R., 1998, Identification and Expression of G Protein-Coupled Receptors, ppl33-150, Ed. K.R.Lynch, Wiley-Liss Inc.、Laage 等, 2001, Traffic 2:99-104を参照)。いくつかのタンパク質は非常に低レベルで発現されても細菌細胞には非常に毒性を示し、これによりその産生及び単離がより複雑になる。適切な発現株へこれらのタンパク質の発現コンストラクトを単純に形質転換することによって、異常に小さいないしは大きさの異なるコロニーが生じることがある。これはプロモーターが機能していなくても細胞に毒性があることを示唆する。また、転写レベルが低いことによるこれらのタンパク質の基礎レベル発現は、リッチ培地での細菌生育不全となり、その結果、プロモーター上で完全に変化する前に細胞の生理機能が貧弱となる。最後の結果は、一実験から次の実験まで様々な発現、並びに低タンパク質収率であることがある。以下に示すように、宿主細胞のこのようなタンパク質の産生は、細胞内の基礎タンパク質発現の程度を制限するために厳密に調節されたプロモータが必要である。
【０１１６】
基礎レベルの転写を排除するために、大腸菌のｐｈｏＡプロモーターの制御要素と基本配列から２つの新規な制御可能なプロモーターを作製した(Kikuchi, 等, 1981 , Nucl. Acids Res. 9: 5671-5678)。野生型ｐｈｏＡプロモーターは、リン酸化型のプロテインｐｈｏＢの、−１０又はPribnowボックスのすぐ上流のｐｈｏボックスへの結合によって、正常に調節される。結合により、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、このプロモーターから転写工程が開始する。次に、ＰｈｏＢは、周辺質及び培地の低リン酸濃度に応答して、細胞質膜でリン酸化される(Wanner, 1996, Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt (ed.), p.1357-1381 )。培地中の低レベルのリン酸に応答したプロモーターへのリン酸化ｐｈｏＢの結合は、ｐｈｏＡプロモーターのポジティブ調節を表す。リン酸化されたｐｈｏＢの非存在下で、ＲＮＡポリメラーゼは、代わりに接触のために−１０の配列といくらか弱い−３５の配列を用いてｐｈｏＡプロモーターにやはり弱く結合しうる。この結果、転写の基礎レベルが低くなる。
リン酸化されたｐｈｏＢの非存在下でＲＮＡポリメラーゼがｐｈｏＡプロモーターに結合するのを阻害するために、ネガティブ制御成分、ここではｌａｃオペレーター配列 AATTGTGAG CGGAT AACAA (配列番号18) (Gilbert 等, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3581-3584)を、表５に示すように、＋１転写開始位置の上流に挿入した。リン酸が培地中に有意な濃度で存在する(又は存在しない)場合、この付加によりｐｈｏＡプロモーターからの転写が減弱した。
【０１１７】
新規に作製したプロモーターであるｐｈａｃは、ポジティブ調節成分(ｐｈｏＢ結合ｐｈｏボックス)と付加したネガティブ調節成分であるｌａｃオペレーターを介してポジティブ及びネガティブの調節を有する。ｐｈａｃプロモーターは、リン酸枯渇により誘導されると同時に、イソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)などのインデューサの添加によって、ｌａｃレプレッサ調節から解放されるものである。他のプロモーターへのｌａｃオペレーター調節配列の付加は報告されているが(De Boer 等 1983, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80:21 -25、Yansura 等, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 439-443)、これらのプロモーターでは、ｌａｃオペレーター配列は、操作が困難なネガティブ調節成分を置き換えるために用いられるか、新しく調節するために構成プロモーターに付加した。
制御されるべき基礎転写の第二の有効な供与源は、対象の膜タンパク質の発現を操作するために用いたプロモーターの上流のプロモーターに由来する。このようなプロモーターは、例えばプラスミドｐＢＲ３２２上にマッピングされており、大腸菌ベクターの構築に用いられることが多い。ｐｈｏＡの上流のプロモーターにより、「リードスルー(読み過ごし)」による転写の基礎レベルが潜在的に生じうる。ｐｈａｃプロモーターといくつかの膜タンパク質のコード配列による上流の転写の進行を阻害するために、転写ターミネーター、ここではλｔ０転写ターミネーター：AACG CTCGGTTGCC GCCGGGCGTT TTTTATT (配列番号17) (Scholtissek 等, 1987, Nucl. Acids Res., 15: 3185)を、付加した上流配列：AGGCCTAACG CTCGGTTGCC GCCGGGCGTT TTTTATTGTT AACCATGGA (配列番号19)内のｐｈｏボックスの上流に正方向で挿入した。新規のプロモーターであるｔｐｈａｃは、ｐｈａｃプロモーターと同じ方法で、例えばリン酸制限培地への希釈や、ＩＰＴＧの添加により誘導される(データは示さない)。基礎レベルの転写は、ｐｈａｃと比較してｔｐｈａｃを用いるとさらに減少した。
【０１１８】
表５

【０１１９】
実施例４
ＲＡ１ｃの発現のためのｐｈｏＡとｐｈａｃ
細菌宿主細胞における複合体膜貫通型ポリペプチドの発現と収率に対するｐｈｏＡ変異体プロモーターｐｈａｃの影響を試験するために、有効な翻訳開始のためのＮ末端リーダーMKHQHQQ (配列番号7)を有する組み換えＲＡ１ｃと、Ｆｌａｇと６-Ｈｉｓの２つのＣ末端タグを発現ベクター内に遺伝子操作し、ｐｈｏＡプロモーター(ベクターpEfRA1c)とｐｈａｃプロモーター(ベクターpEfRA1cr)に操作可能に結合させた。ＲＡ１ｃは、７つの膜貫通部分を有する膜貫通型ポリペプチドである。
【０１２０】
形質転換
両プラスミドはヒトのＲＡ１ｃを発現した (Kretschmer 等, 2001 , Gene 278.41 -51 )。プラスミドを、大腸菌株５８Ｆ３(W3110 - fhuAΔ(tonAΔ) phoAΔE15 lonΔ galE rpoHts(htpRts) ΔclpP lacIq ΔompTΔ(nmpc-fepE) ΔslyD)に形質転換して、選択した形質転換体をカルベニシリン(５０μｇ／ｍＬ)を添加した５ｍＬのLuria-Bertani培地に接種し、３０℃でおよそ１４〜１６時間、培養ホイール上で生育させた。pEfRA1c(ｐｈｏＡプロモーター)による培養物のＯＤ_６００は１．５５であり、pEfRA1cr(ｐｈａｃプロモーター)による培養物のＯＤ_６００は３．５７であった。ＬＢ接種の１ＯＤ_６００-ｍＬ試料を回収した。
振とうフラスコ誘導(Shake flask induction)を行った。次いで、各培養物を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.リン酸制限培地(Simmons 等, 2002, J. Immunol. Methods 263: 133- 147)に希釈した(１：１００)。すべての培養物を２リットルの整流フラスコ中に、５００ｍＬの最終誘導容量にして、およそ２００ｒｐｍの速度のシェイカー上で３０℃で生育させた。播種の１０、１２、１４、１６、１８、２２及び２４時間後に１ＯＤ_６００-ｍＬの試料を、pEfRA1c培養物(ｐｈｏＡプロモーター)用のＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地に回収した。pEfRA1cr(ｐｈａｃプロモーター)を発現する培養物については、播種の１０及び１２時間後にＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加してｌａｃリプレッサー制御を解放した。ＩＰＴＧ誘導時の培養物の各々のＯＤ_６００は２．７９及び２．９７であった。すべてのＩＰＴＧ誘導培養物について、ＩＰＴＧ添加前及びＩＰＴＧ添加後２４時間まで２時間ごとに１ＯＤ_６００-ｍＬ試料を回収した。
【０１２１】
ウェスタンブロット分析のために、１ＯＤ_６００-ｍＬ試料の還元した全細胞溶解物を以下のように調整した：
(1) マイクロチューブにて１ＯＤ_６００-ｍＬ試料を遠心分離した。
(2) 各ペレットを１００μＬのTE (10mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA)に再懸濁した。
(3) ジスルフィド結合を減少するために、１０μＬの１Ｍ ジチオトレイトール(Sigma D-5545)を各試料に添加した。
(4) ２０μＬの２０％ ＳＤＳを各試料に添加した。
試料をボルテックスにかけて、９０℃で５分間熱した後に、再びボルテックスにかけた。試料を室温にまで冷ました後に、８００μＬのアセトンを添加してタンパク質を沈殿した。試料をボルテックスにかけて、室温に１５分間置いた。微量遠心機にて５分間遠心分離した後、各試料の上清を吸引除去し、各タンパク質ペレットを１０μＬの１Ｍ ジチオトレイトールと４０μＬのｄＨ_２Ｏ及び５０μＬの２×NOVEX SDS試料バッファに再懸濁した。次いで、試料を９０℃で５分間熱し、十分にボルテックスにかけて、室温にまで冷ました。次いで、最後に５分間遠心分離して、上清をきれいなチューブに移した。
ＳＤＳ試料調製の後、８μＬの誘導前の試料の培養物試料を１０ウェルの1.0 mm NOVEX 16% トリス-グリシン SDS-PAGEに流し、およそ１２０ボルトで約１．５時間遠心分離した。Ｃ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地(pEfRA1c)にて誘導した試料を同じ方法で調製した。Ｃ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地とＩＰＴＧ(pEfRA1cr試料)にて誘導した試料では、１５ウェルのゲルに５．３μＬを流した。次いで、結果として生じたゲルをウエスタンブロット分析に用いた。
【０１２２】
ウエスタンブロット分析
ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ, ｐＨ６．５中でニトロセルロースメンブラン(NOVEX)に電気的にブロットした。次いで、１×ＮＥＴ(150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5OmM Tris, pH 7.4, 0.05% Triton X- 100)と０．５％ ゼラチン溶液を用いて、振とう器上でおよそ３０分〜１時間かけて室温でメンブランをブロックした。ブロッキング工程後、抗Ｈｉｓウェスタンブロット分析のために、メンブランを、１×ＮＥＴ＋０．５％ ゼラチン＋抗Ｈｉｓ抗体(Roche Diagnosticsの抗ｈｉｓ６ペルオキシダーゼコンジュゲートマウスモノクローナル抗体)の溶液に置いた。抗Ｈｉｓ抗体を１：５０００に希釈して、メンブランを抗体溶液中に、振とうさせながら室温で終夜置いた。翌朝、メンブランを１×ＮＥＴにて１０分間、最低３回洗浄して、ＴＢＳ(20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl)にて１５分間、１回洗浄した。抗Ｈｉｓ抗体に結合したタンパク質バンドを、Amersham Pharmacia Biotech ECL検出機を用いて、メンブランをＸ線フィルムに曝して可視化した。
【０１２３】
ｐｈａｃプロモーターの効果は、プラスミド形質転換工程と同時期に示された。pEfRAlc (phoA)及びpEfRAlcr (phac)による形質転換体をＬＢプレートにて終夜生育させた後に比較した。pEfRAlcr (phac)で形質転換した細胞は、pEfRAlcで形質転換した細胞より有意に大きかった(データは示さない)。図９は、プレートに画線培養しておよそ１４〜１６時間LB/Carbに播種したコロニーの試料についての抗Ｈｉｓウエスタンブロット分析を示す。真ん中のレーンのブロットに示されるように、非誘導型ｐｈｏＡプロモーターからのＲＡ１ｃの発現(pEfRAlc)は、リン酸を制限しなかった場合のｐｈｏＡプロモーターからの漏出量を示す。それに対して、緊密に調節されたｐｈａｃプロモーターからはＲＡ１ｃの発現(pEfRAlcr)は検出されなかった。
ｐｈｏＡプロモーターからの多膜貫通型タンパク質ＲＡ１ｃの基礎レベルの発現は細胞に毒性があるため、ＬＢ中での成長が乏しく、その結果、細胞密度が低くなる。終夜ＬＢ培養物のＯＤ６００読み取り値はpEfRAl cでは１．５５に、pEfRAlcrでは３．５７に改善した。これはｐｈａｃプロモーターにより細胞の状態がより良好であることを示す。
pEfRAlc (ｐｈｏＡプロモーター)についての発現結果の時間的経過を図１０に示す。培養物中のリン酸は、およそ２．０ＯＤ_６００が枯渇したと予測された。およそ１０時間目に発現が検出され、ＯＤ_６００読み取り値が１．７３であった。誘導後１２時間目〜１４時間目のおよそ２時間、非常に産生が減少しはじめ、その後産生はゆっくりと消失した。誘導の２４時間後までに、発現したタンパク質の単量体バンドは完全に消失した。さらに、単量体のバンドが時間につれて消失するにつれて、非還元型の凝集物はスメアとなった。単量体のバンド中に最も多くのタンパク質を有するときの最も高い細胞密度は、１４時間目の２．５１ＯＤ_６００であった(図１０中の＊)。
【０１２４】
好ましくは、ｐｈａｃプロモーターは、C.R.A.P.培地のリン酸枯渇により誘導されるまで完全に遮断される。ＩＰＴＧ-誘導ｐｈａｃプロモーター(pEfRAlCr)培養物から生じるＲＡ１ｃ発現の時間的経過を図１１に示す。ＩＰＴＧ添加後２時間以内に最大タンパク質産生に達し、単量体のバンドとスメアの同様な発現パターンが観察された。１２時間目の誘導培養物は、１０時間目の誘導培養物よりも良好な発現を示した。これは誘導時間が重要であることを表す。最も重要なことは、ｐｈａｃプロモーターが、必要となるまで全体的にプロモーターを保持することによって、高密度にまで生育するように、細胞を良好な状態にするという利点があったことである。誘導の際に、細胞はストレスを受け、生育を止め最終的に細胞密度が低下した。ＩＰＴＧ添加前１２時間目の培養物は、おそらくリン酸枯渇によるｐｈａｃプロモーターの部分的な誘導によって、既にＲＡ１ｃを発現させていた。ＩＰＴＧが１２時間目以降に添加される場合、ｐｈａｃプロモーターの有効性が減少しうる。したがって、これらの培養条件下では、ＩＰＴＧ添加１２時間が、ｐｈａｃプロモーターを利用するには最終時点であるようである。１４時間目のＩＰＴＧ誘導(１２時間目)後２時間に最大のタンパク質産生に達した。第１４時間目のＯＤ_６００はｐｈａｃプロモーターでは２．９７であり、これはｐｈｏＡプロモーターによる２．５１よりも大きい値である。
ｐｈｏＡプロモーターとｐｈａｃプロモーターによるＲＡ１ｃの全体にわたる発現の比較を図１２に示す。ｐｈｏＡ及びｐｈａｃプロモーターからの最も良い発現結果を同じブロット上に示し、直接比較した。１２時間目のｐｈａｃプロモーターによるＲＡ１ｃの２時間の誘導(右側のレーン)は、１４時間目のｐｈｏＡプロモーターによる最も高い発現(左側のレーン)よりも細胞密度及びタンパク質発現がともに高かったことが明らかとなった。
【０１２５】
実施例５
ヒトＧプロテインカップリングレセプター７３(ＧＰＲ７３)を発現するｐｈｏＡとｐｈａｃ
さらにｐｈｏＡ変異体プロモーターｐｈａｃのＥＧ-ＶＥＧＦレセプター(ＧＰＲ７３)の発現と収率に対する影響を分析するために、プラスミドpST239. EGVEGFrI .Flag.H8.1270(ｐｈｏＡプロモーター)及びpRIFHr(ｐｈａｃプロモーター)を用いて振とうフラスコ誘導を行った。両プラスミドは、有効な翻訳開始のためのＮ末端リーダー配列(MKHQHQQ, 配列番号7)と、Ｆｌａｇとオクタ-Ｈｉｓである２つのＣ末端タグを有するヒトＧプロテインカップリングレセプター７３タンパク質(ｈＧＰＲ７３) (Lin, 等, 2002, J. Biol. Chem. 277 : 19276-19280)を発現する。プラスミドを、大腸菌株５８Ｆ３ (W3110 - fhuAΔ (tonAΔ)phoAΔE15 lonΔ galE rpoHts (htpRts) ΔclpP lacIq ΔompTΔ (nmpc-fepE) ΔslyD)に形質転換した。選択した形質転換体をカルベニシリン(５０μｇ／ｍＬ)を添加した５ｍＬのLuria-Bertani培地に接種し、３０℃でおよそ１４〜１６時間、培養ホイール上で生育させた。ｐｈｏＡプロモーターを含有するpST239. EGVEGFrI .Flag.H8.1270による終夜培養物の光学濃度(ＯＤ_６００)は０．８４であり、ｐｈａｃプロモーターを含有するpRIFHrによる培養物は３．１９であった。
【０１２６】
終夜ＬＢ培養物から１ＯＤ_６００-ｍＬ試料を回収した。次いで、各培養物を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.リン酸制限培地(Simmons 等, 2002, J. Immunol. Methods 263: 133-147)に希釈した(１：１００)。すべての培養物を２リットルの整流フラスコ中に、５００ｍＬの最終誘導容量にして、およそ２００ｒｐｍの速度のシェイカー上で２５℃で生育させた。播種の１４、１５、１６、１７及び２４時間後に１ＯＤ_６００-ｍＬの試料を、pST239.EGVEGFrl .Flag.H8.1270 (phoA)培養物についてはＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地に回収した。pRIFHr (phac)を発現する培養物については、播種の１４及び１５時間後にＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。ＩＰＴＧ誘導時の各々の培養物のＯＤ_６００は、２．３７(１４時間)及び３．２１(１５時間)であった。
１４時間目の誘導のために、ＩＰＴＧ添加前、ＩＰＴＧ添加の２、３及び１０時間後に、１ＯＤ_６００-ｍＬの試料を回収した。１５時間目の誘導のために、ＩＰＴＧ添加前、ＩＰＴＧ添加の２時間及び９時間後に１ＯＤ_６００-ｍＬの試料を回収した。
実施例４のＲＡ１ｃに関する記載の通りに、１ＯＤ_６００-ｍＬの試料の還元した全細胞溶解物を調製した。ＳＤＳ試料調製の後、８μＬの還元した全細胞溶解物のすべての試料を１０ウェルの1.0 mm NOVEX製 16% トリス-グリシン SDS-PAGEに流し、およそ１２０ボルトで約１．５時間電気泳動した。次いで、実施例３のＲＡ１ｃに関する記載の通りに、結果として生じたゲルをウエスタンブロット分析に用いた。
【０１２７】
ｐｈｏＡプロモーター及び、ｐｈａｃプロモーターによるＧＰＲ７３の発現についての抗Ｈｉｓウエスタンブロットの結果を図１３に示す。ヒトＧＰＲ７３は誘導の前(真ん中のレーン)にｐｈｏＡプロモーター(pST239.EGVEGFrl .Flag.H8.1270)から発現された。これは、リン酸を制限しない場合のｐｈｏＡプロモーターの漏出量を表す。それに対して、緊密に調節されたｐｈａｃプロモーターによって、ｈＧＰＲ７３の発現は検出されなかった(右側のレーン)。実施例３のＲＡ１ｃ発現を記載したように、ｐｈｏＡプロモーターによる多膜貫通型タンパク質の基礎レベルの発現は細胞に毒性があるため、ＬＢ中での成長が乏しく、その結果、細胞密度が低くなる。終夜ＬＢ培養物のＯＤ_６００読み取り値は、pST239. EGVEGFrI . Flag.Hδ.1270(ｐｈｏＡプロモーター)の０．８４からpRIFHr(ｐｈａｃプロモーター)の３．１９に改善した。これはｐｈａｃプロモーターを含有する細胞の成長と細胞の状態がより良好であることを示す。
ｐｈｏＡプロモーターからのＧＰＲ７３についての発現結果の時間経過を図１４に示す。１５時間目に存在する二量体のバンドにより発現を検出し、そのＯＤ_６００読み取り値は３．１４であった。このタンパク質は２４時間までに完全に消失した。それに対して、ＯＤ_６００読み取り値の増加に示されるように、細胞は成長し続けた。この継続的な成長は、ｐｈｏＡプロモーターを用いたいくつかの多膜貫通型タンパク質の発現により観察される多様な結果の一例であって、これから、細胞の中にはある様式によって、発現が下方制御されるものがあることが示唆される。いずれにしても、ＧＰＲ７３の発現パターンは、ＲＡ１ｃ又は、他の多膜貫通型タンパク質についての実施例３にみられたものと類似していた。発現は１６時間目にピークに達し、そのＯＤ_６００は３．４６であった。
【０１２８】
好ましくは、ｐｈａｃプロモーターは、C.R.A.P.培地のリン酸枯渇により誘導されるまで完全に遮断される。ＧＰＲ７３のＩＰＴＧ誘導発現を図１５に示す。ｈＧＰＲ７３の発現はＩＰＴＧ誘導なしの場合に検出されなかった。これは、ｐｈａｃプロモーターの堅固さ(tightness)を示唆する。ＩＰＴＧ添加後２時間以内に最大タンパク質産生に達した。早期に現れる二量体バンド及び単量体バンドにより類似の発現パターンが観察されたのに対して、誘導の後期ではスメアとなった。誘導の際に、細胞はストレスを受けて、生育を止め最終的に細胞密度が低下した。１５時間目の誘導された培養物は、１４時間目の誘導された培養物より良好な発現を示した。ＩＰＴＧ誘導後２時間(１５時間)で最大の産生に達し、そのＯＤ_６００は２．４１であった。
ｐｈｏＡ及びｐｈａｃのプロモーターによるｈＧＰＲ７３の全体にわたる発現を図１６において、比較する。直接比較するために、各プロモーターからの最も良好な発現結果を同じブロットに示した。より長時間曝露した場合を除き、ｐｈａｃプロモーター(右側のレーン)と比較して、ｐｈｏＡプロモーター(真ん中のレーン)によるｈＧＰＲ７３の発現は検出されなかった。１５時間目のｐｈａｃプロモーターによるｈＧＰＲ７３の２時間の誘導により非常に高いタンパク質発現が生じることが明らかとなった。また、ｐｈｏＡプロモーターを用いた発現結果は可変的な傾向があったのに対して、ｐｈａｃプロモーターを用いた発現結果は相対的に一定であった。
【０１２９】
実施例６
膜タンパク質ＭＳ４Ａ４ＡについてのｐｈｏＡとｔｐｈａｃ
変異体ｐｈｏＡプロモーターであるｔｐｈａｃのＭＳ４Ａファミリーポリペプチドの発現と収率に対する影響を分析するために、ｐｈｏＡプロモーターとプラスミドpMS4A4A.8His.32及びｔｐｈａｃプロモーターとプラスミドpMS4A4ArTを用いて振とうフラスコ誘導を行った。両プラスミドは、有効な翻訳開始のためのＮ末端リーダーMKHQHQQと、Ｃ末端の８×-Ｈｉｓタグを有するヒト免疫グロブリンＥレセプター様タンパク質(ｈＩＧＥＲＢ) (Lin, 等, 2002, J. Biol. Chem. 277 : 19276-19280)を発現する。プラスミドを、大腸菌株５８Ｆ３ (W3110 - fhuAΔ (tonAΔ)phoAΔE15 lonΔ galE rpoHts (htpRts) ΔclpP lacIq ΔompTΔ (nmpc-fepE) ΔslyD)に形質転換して、選択した形質転換体をカルベニシリン(５０μｇ／ｍＬ)を添加した５ｍＬのLuria-Bertani培地に接種し、３０℃でおよそ１４〜１６時間、培養ホイール上で生育させた。pMS4A4A.8His.32 (phoA)による培養物のＯＤ６００は２．４であり、pMS4A4ArT (tphac)による培養物は２．５であった。終夜ＬＢ培養物から１ＯＤ_６００-ｍＬ試料を回収した。
次いで、各培養物を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.リン酸制限培地(上掲のSimmons 等, 2002)に希釈した(１：１００)。すべての培養物を２リットルの整流フラスコ中に、５００ｍＬの最終誘導容量にして、およそ２００ｒｐｍの速度のシェイカー上で３０℃で生育させた。pMS4A4A.8His.32培養物 (phoA)については、播種の１０、１１、１２、１４及び１５時間後に１ＯＤ_６００-ｍＬの試料をＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地に回収した。pMS4A4ArT (tphac)を発現する培養物については、播種の１０及び１０．５時間後にＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。ＩＰＴＧ誘導時の各々の培養物のＯＤ_６００は、それぞれ２．１及び２．６であった。
【０１３０】
pMS4A4ArT培養物(１０時間目のＩＰＴＧ添加)について、ＩＰＴＧ添加前、ＩＰＴＧ添加の１時間、２時間、４時間及び５時間後に１ＯＤ_６００-ｍＬの試料を回収した。pMS4A4ArT１０．５時間目のＩＰＴＧ添加培養物については、ＩＰＴＧ添加前、ＩＰＴＧ添加の１時間及び４時間後に１ＯＤ_６００-ｍＬの試料を回収した。
実施例４の記載の通りに、１ＯＤ_６００-ｍＬの試料の還元した全細胞溶解物を調製した。ＳＤＳ試料調製の後、８μＬのpMS4A4A.8His.32 (phoA)及びpMS4A4ArT (tphac)の試料を１０ウェルの1.0 mm NOVEX製 16% トリス-グリシン SDS-PAGEに流し、およそ１２０ボルトで約１．５時間電気泳動した。Ｃ.Ｒ.Ａ.Ｐ培地中の誘導した試料を１５ウェルのゲルに流した。次いで、実施例３の記載のように、結果として生じたゲルをウエスタンブロット分析に用いた。
液体ＬＢ培地におけるpMS4A4ArT(ｔｐｈａｃ)ベクター及びpMS4A4A.8His.32(ｐｈｏＡ)によるＭＳ４Ａ４Ａの発現を示す抗Ｈｉｓウェスタンブロットの結果を図１７に示す。ヒト免疫グロブリンＥレセプター様タンパク質(ｈＩＧＥＲＢ)は、誘導していないｐｈｏＡプロモーター(pMS4A4A.8His.32)から発現された。これは、リン酸を制限しない場合のｐｈｏＡプロモーターの漏出量を示す。それに対して、緊密に調節されたｔｐｈａｃプロモーターによるｈＭＳ４Ａ４Ａの誘導の前には、タンパク質の発現は検出されなかった。終夜ＬＢ培養物のＯＤ_６００読み取り値は、pMS4A4A.8His.32 (phoA)の２．４からpMS4A4ArT (tphac)の２．５にわずかに改善した。
【０１３１】
ｐｈｏＡプロモーターからのＭＳ４Ａ４Ａ発現の時間経過を図１８に示す。１１時間目に発現が検出され、そのＯＤ_６００読み取り値は２．２４であった。タンパク質は時間に対して相対的に安定していた、しかしながら、タンパク質発現は時間につれて改善しなかった。１１時間目の１時間以内に最大の産生に達した。その後細胞密度は低下した。
pMS4A4ArT (tphac)培養物からのＩＰＴＧ誘導ＭＳ４Ａ４Ａ発現の結果を図１９に示す。ｈＩＧＥＲＢのタンパク質発現はＩＰＴＧ誘導なしの場合に検出されなかった。これは、ｔｐｈａｃプロモーターの堅固さ(tightness)を示唆する。ＩＰＴＧ誘導後１時間以内に発現が検出された。ＯＤ_６００が２．１である１０時間目に誘導した培養物はＯＤ_６００が２．６である１０．５時間目に誘導した培養物よりもわずかに良好な発現を示した。ＩＰＴＧ誘導後２時間の１２時間目(１０時間目にＩＰＴＧを添加)に最大の産生に達し、そのＯＤ_６００は２．３６であった。
図２０において、ｈＭＳ４Ａ４Ａの全体的な発現を、ｐｈｏＡプロモーターとｔｐｈａｃプロモーターの場合について比較する。ｐｈｏＡ及びｔｐｈａｃプロモーターによる最も良好な発現結果を、直接比較するために同じブロット上に示した。ＩＰＴＧ誘導pMS4A4ArT(１０時間目にＩＰＴＧを添加)の１２時間目の試料は、ｐｈｏＡプロモーターを有するpMS4A4A.8His.32の１１時間目の試料よりも発現が有意に改善していた。ｔｐｈａｃ制御培養物のＯＤ_６００が２．１９であるのに対して、ｐｈｏＡプロモーターによるピークの発現のＯＤ_６００は２．２４であった。
【０１３２】
実施例７
ｔｒｐＬＥリーダーによるＣＤ２０発現の増加
ｔｒｐＬＥ配列は、特に十分に蓄積しない問題のタンパク質を発現するためにＮ末端融合パートナーとして何年も用いられている(例として、Yansura, 1990, Methods in Enzymology, Vol. 185: 161-166, Academic Press Inc., San Diego, CAを参照)。一般に、ｔｒｐＬＥタンパク質は、ｔｒｐリーダーの一端及びｔｒｐＥ遺伝子の両末端部にインフレーム欠失を表す。ΔtrpLE1417及びΔtrpLE1413の２つの変異体が報告されている(例えば、Bertrand 等, 1976, J. MoI. Biol. 103:319-337及びMiozzari 等, 1978, J. Bacteriol. 133:1457-1466を参照)。ΔtrpLEJ413は、いくつかのヒトタンパク質の発現のためのベクターの構築に用いられている(米国特許第5,888,808号参照)。しかしながら、類似のベクターｐＨＳ94によって、膜貫通型タンパク質Ｂ型肝炎表面抗原を発現する試みは、否定的な結果が報告されている(例として、米国特許第4,803,164号及び同第4,741,901)。
【０１３３】
ｔｒｐＬＥに融合したタンパク質の高レベルの発現は、通常、強いｔｒｐプロモーター、ｔｒｐリーダーのはじめのいくつかのコドンを含む強い翻訳開始領域、及びタンパク分解性の安定な屈折小体(refractile bodies)内への異種性タンパク質の結果として生じるプッシュ(push)に貢献する。ｔｒｐＬＥリーダーが多膜貫通型タンパク質を屈折小体に押し込む、及び／又はその一方で大腸菌において、異種性の多膜貫通型膜タンパク質の発現及び収率を増やすことができるかどうかを決定するために、ｔｒｐＬＥ配列リーダー、指定のＬＥ(配列番号２５)及びｓＬＥ(配列番号２６)の２つの変異体を用いて様々なコンストラクトを用いた。上の実施例に記載のように、これらのコンストラクトは、より緊密に調節されるｐｈｏＡ及びｐｈａｃ／ｔｐｈａｃプロモーターによって、作製した。
より長い２つのリーダーであるＬＥは、まさに、図２２に示すように、例えば発現ベクターpNCV (AtrpLE1413)内に、記載した大腸菌ｔｒｐＥタンパク質のはじめの９アミノ酸((M)KAn7VLKGS, 配列番号27) (Maniatis 等, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p 426, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.)の後に、ｔｒｐＥポリペプチドのアミノ酸３３９−４０８(配列番号25)を含有する。ｔｒｐリーダーの同じはじめの９アミノ酸の後にｔｒｐＥポリペプチドからの非連続的なアミノ酸の配列(配列番号２６)を含有するより小さいｔｒｐＬＥ配列リーダー(ｓＬＥ)を図２２に示す。発現レベルはより長いＬＥリーダーによるとおよそ２倍の高さになるが、これら２つのｔｒｐＬＥリーダーは膜内挿入に関して同じように作用する。
【０１３４】
ＬＥ ＣＤ２０のクローニング及び発現
各々セリンに置換されるＣｙｓ１１１及びＣｙｓ２２０と、アラニンに置換されるＣｙｓ８１を有する変異体ＣＤ２０を、標準的な分子生物学技術(Ausubel 等 (eds.), 2003, Current Protocols in Molecular Biology, 4 VoIs., John Wiley & Sons)を用いて、β-ラクタマーゼ遺伝子及び３つの稀な大腸菌コドン(ａｒｇＵ、ｇｌｙＴ及びｐｒｏ２)のｔＲＮＡ遺伝子を含有するｐＢＲ３２２由来のプラスミド内にサブクローニングした。７９のアミノ酸ｔｒｐＬＥスペーサー配列(配列番号２５)及びＧＳリンカー配列をＮ末端に付加した。トロンビン切断認識部位を、ｔｒｐＬＥリーダーを切断するためにＣＤ２０の第９アミノ酸の後と、細胞内親水性尾部を切断するためにＣＤ２０の第２３６アミノ酸の後に付加した。Ｃ末端のタグ配列をコード化するために、発現したタンパク質の検出及び精製を促すオクタ-Ｈｉｓ(配列番号：８)を付加した。結果として生じるプラスミドをpLEfGKiSArTと称した。遺伝子転写はｐｈｏＡプロモーターの制御下とし、上記の実施例４の記載のように、大腸菌株５８Ｆ３のリン酸を制限することによって、発現を誘導した。飽和したＬＢカルベニシリン培養物を、Ｃ.Ｒ.Ａ.Ｐ.リン酸制限培地にて希釈した(Simmons 等, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133- 147)。次いで、培養物を３０℃で２４時間生育した。
発現分析のために、１ＯＤ６００-ｍＬ試料の還元した全細胞溶解物を以下のように調整した：
(5) マイクロチューブにて１ＯＤ６００-ｍＬ試料を遠心分離した。
(6) 各ペレットを７０μＬのＴＥ (10mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA)に再懸濁した。
(7) ジスルフィド結合を減少するために、１０μＬの１Ｍ ジチオトレイトール(Sigma D-5545)を各試料に添加した。
(8) ２０μＬの２０％ ＳＤＳを各試料に添加した。
試料をボルテックスにかけて、９０℃で５分間熱した後に、再びボルテックスにかけた。試料を室温にまで冷ました後に、１００μＬの２×NOVEX SDS試料バッファを添加した。次いで、試料を９０℃で５分間熱し、十分にボルテックスにかけて、室温にまで冷ました。次いで、最後に５分間遠心分離して、上清をきれいなチューブに移した。
【０１３５】
ＳＤＳ試料調製の後、１６μＬの誘導試料を１０ウェルの1.0 mm NOVEX 16% トリス-グリシン SDS-PAGEに流し、およそ１２０ボルトで約１．５時間電気泳動した。結果として生じたゲルを１０％の酢酸を添加したクーマシーブルーで染色した。ウエスタンブロット分析のために、１μＬの全細胞溶解物を流し(load)、結果として生じたゲルを、１×トリス-グリシンバッファ(Invitrogen, CA)、０．０１％ ＳＤＳ、５％ メタノール中でニトロセルロースメンブラン(NOVEX)上に電気的にブロットした。次いで、１×ＮＥＴ(150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5OmM Tris, pH 7.4, 0.05% Triton X-100)と０．５％ ゼラチン溶液を用いて、振とう器上でおよそ３０分〜１時間かけて室温でメンブランをブロックした。ブロッキング工程後、抗Ｈｉｓウェスタンブロット分析のために、メンブランを、１×ＮＥＴ、０．５％ ゼラチン、抗Ｈｉｓ抗体(Roche Diagnosticsの抗ｈｉｓ６ペルオキシダーゼコンジュゲートマウスモノクローナル抗体)を含む溶液に置いた。抗Ｈｉｓ抗体を１：５０００に希釈して、メンブランを１×ＮＥＴにて１０分間、最低３回洗浄して、ＴＢＳ(20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl)にて１５分間、１回洗浄した。抗Ｈｉｓ抗体に結合したタンパク質バンドを、Amersham Pharmacia Biotech ECL検出機を用いて、メンブランをＸ線フィルムに曝して可視化した。
図２３は、実施例１に記載のように、リーダー配列MKHQHQQ (配列番号7)を有するｐｈｏＡプロモーターの制御下にあるが、ｔｒｐＬＥリーダーを有さないＰｈｏＡプロモーターからの発現と比較した、ＬＥ.ＣＤ２０からのＬＥ.ＣＤ２０及びＣＤ２０発現結果についてのコンストラクト線図を示す。ｔｒｐＬＥを用いた大腸菌細胞におけるＣＤ２０タンパク質の発現及び産生は、クーマシーブルー染色ゲルで検出されるレベルにまで大いに亢進した。ウエスタンブロット分析により、ｔｒｐＬＥリーダーのないＣＤ２０よりもｔｒｐＬＥリーダーを有するＣＤ２０の発現収率がおよそ１０倍良好であったことが示された(データは示さない)。推定される発現レベルは、１リットルの培養物につきおよそ３０ミリグラムのｔｒｐＬＥ融合ＣＤ２０であった。
【０１３６】
ＬＥ ＣＤ２０膜タンパク質抽出
ｔｒｐＬＥ融合ＣＤ２０の溶解性を分析するために、細胞ペレットを、ポリトロン(Brinkmann, Westbury, NY)を用いて、各１ｇのペーストにつき１０ｍＬの未変性の溶解バッファ(20 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl)に再懸濁し、マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp, Newton, MA)を用いた細胞破壊によって、溶解して、超遠心分離ローターTLA-100.3(Beckman, Fullerton, CA)を用いて３９１０００×ｇで１時間遠心分離した。可溶タンパク質を含有する上清(上清１)を、膜タンパク質と不溶性タンパク質を含むペレット(ペレット１)から分離した。次いで、ペレット１を、ポリトロンを用いて非変性中性界面活性剤、１％ Fos-Choline 12を含む未変性の溶解バッファに再懸濁して、４℃で終夜抽出した。翌日、試料を再度超遠心分離して、ミセルの形態で膜結合型タンパク質を含有する上清(上清２)を不溶性タンパク質(ペレット２)から単離した。ペレット及び上清は還元型ＳＤＳローディングバッファにて等量に再懸濁して、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)でプローブしたニトロセルロース膜によるイムノブロット及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、分析した。
クーマシーブルーで染色したゲル及び免疫ブロットに示されるように、膜からほぼ完全にｔｒｐＬＥ.ＣＤ２０が抽出されたことが結果から示される(図２４)。
【０１３７】
ＬＥ ＣＤ２０密度勾配遠心分離
遠心チューブにおいて、150 mM NaCl及び20 mM HEPES, pH 7.2により緩衝した１．９Ｍ及び１．４Ｍのショ糖溶液を重ねることによって、不連続なショ糖勾配を生成した。ＬＥ ＣＤ２０タンパク質を発現する細胞を未変性の溶解バッファ中で溶解した。膜及び不溶性の分画を、超遠心分離ローターTLA100.3 (Beckman, Fullerton, CA)を用いて３９１０００×ｇ(８５Ｋｒｐｍ)にて１時間超遠心分離することによって、単離した。上清を廃棄して、ペレットを１．９Ｍのショ糖溶液に再懸濁した。１００μＬの分割量の再懸濁液を０．９ｍＬの１．９Ｍ ショ糖溶液と再び混合した。次いで、この混合物を遠心チューブの底に置き、１ｍＬの１．４Ｍ ショ糖溶液を上に重ねた。試料をSWTi55ローターに詰めて、１２８３５６×ｇ(３２．５Ｋｒｐｍ)で１時間回転させた。次いで、分画化した試料を、チューブの上部から２００μＬずつ慎重に取り分け(unload)て、各分画(１０上部、１下部)をニトロセルロースメンブランに転写して、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体でプローブしたＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。ウェスタンブロット分析によって、ｔｒｐＬＥ融合ＣＤ２０ポリペプチドは、１．４Ｍ及び１．９Ｍのショ糖溶液(分画５及び６)の作用領域に位置する膜層にみられ、そのポリペプチドの大部分は分画５にみられた(データは示さない)ことが示された。これは、ほとんどのｔｒｐＬＥ融合ＣＤ２０ポリペプチドは大腸菌膜に挿入されることを示唆する。
【０１３８】
ＬＥ ＣＤ２０トロンビン切断
トロンビンを１ｍＭ 塩化カルシウムとともに、溶解性分析からの１％ Fos-Choline 12可溶性膜抽出物に１：１０００の希釈で添加し、室温に終夜置いた。還元したＳＤＳ調製試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析した。クーマシーブルーで染色したゲルは、融合タンパク質に設定した２つのトロンビン切断部位で良好に切断された結果生じた、切断型ＣＤ２０膜貫通ドメイン(２６ｋＤａ)、ｔｒｐＬＥ(１１ｋＤａ)及びＣＤ２０の親水性のＣ末端尾部(８ｋＤａ)を含む３つのタンパク質バンドを示した(データは示さない)。各々の３つのバンドからのペプチドのＮ末端を配列決定して、相同性を確認した。
【０１３９】
実施例８
ｔｒｐＬＥリーダーによるＲＡ１ｃの発現増加
ＬＥ ＲＡ１ｃのクローニング及び発現
ＲＡ１ｃをコードするＤＮＡを、前述の標準的な分子生物学技術を用いて、β-ラクタマーゼ遺伝子及び３つの稀な大腸菌コドン(ａｒｇＵ、ｇｌｙＴ及びｐｒｏ２)のｔＲＮＡ遺伝子を含有するｐＢＲ３２２由来のプラスミド内にサブクローニングした。ｔｒｐＬＥリーダーの後にフラッグタグ(DYKDDDDK, 配列番号32)を付加し、トロンビン認識部位(thrX) (LVPRGS, 配列番号31)をＲＡ１ｃのＮ末端に付加して、高い翻訳開始、検出及び切断のそれぞれを確認した。１０のヒスチジン残基をＣ末端に付加して、発現したタンパク質の検出と精製を促した。結果として生じたプラスミドをpLEfRA1CnFcHrTと称した。上記の実施例の記載のように、遺伝子転写はｔｐｈａｃプロモーターの制御下とし、リン酸の制限と、およそ２〜３ＯＤ６００の細胞密度で１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによって発現を誘導した。飽和したＬＢカルベニシリン培養物を、Ｃ.Ｒ.Ａ.Ｐ.リン酸制限培地にて希釈した(Simmons 等, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147)。次いで、培養物をＩＰＴＧ添加後６時間、３０℃で生育した。
【０１４０】
発現分析のために、１ＯＤ_６００-ｍＬ試料の還元した全細胞溶解物を実施例７に記載のように調整した。ＳＤＳ試料調製の後、５μＬの誘導試料を１０ウェルの1.0 mm NOVEX 16% トリス-グリシン SDS-PAGEに流し、およそ１２０ボルトで約１．５時間電気泳動した。ウェスタンブロット分析のために、結果として生じたゲルを、１×トリス-グリシンバッファ(Invitrogen, CA)、０．０１％ ＳＤＳ、５％ メタノール中でニトロセルロースメンブラン(NOVEX)上に電気的にブロットした。次いで、１×ＮＥＴ(150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5OmM Tris, pH 7.4, 0.05% Triton X-100)と０．５％ ゼラチン溶液を用いて、振とう器上でおよそ３０分〜１時間かけて室温でメンブランをブロックした。ブロッキング工程後、抗Ｈｉｓウェスタンブロット分析のために、メンブランを、１×ＮＥＴ、０．５％ ゼラチン、抗Ｈｉｓ抗体(Roche Diagnosticsの抗ｈｉｓ６ペルオキシダーゼコンジュゲートマウスモノクローナル抗体)を含む溶液に置いた。抗Ｈｉｓ抗体を１：５０００に希釈して、メンブランを１×ＮＥＴにて１０分間、最低３回洗浄して、ＴＢＳ(20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl)にて１５分間、１回洗浄した。抗Ｈｉｓ抗体に結合したタンパク質バンドを、Amersham Pharmacia Biotech ECL検出機を用いて、メンブランをＸ線フィルムに曝して可視化した。
図２５はＬＥ.ＲＡ１ｃ(４７．６ｋＤａ)のコンストラクト線図を示し、ＬＥ.ＲＡ１ｃによるＲＡ１ｃ発現結果をｔｒｐＬＥリーダーを欠くコンストラクトから発現したＲＡ１ｃの結果と比較するものであり、実施例４に記載のように、ｔＰｈａｃプロモーターの制御下にリーダー配列MKHQHQQ (配列番号7)を含有する。抗ＨＩＳ抗体を用いたウェスタンブロット分析により、ｔｒｐＬＥリーダーを含まないＲＡ１ｃの発現レベルよりもＬＥリーダー配列を含有するＬＥ.ＲＡ１ｃの発現レベルが非常に改善したことが示された(図２５を参照)。
【０１４１】
ＲＡ１ｃ膜タンパク質抽出
ｔｒｐＬＥ融合ＲＡ１ｃの溶解性を分析するために、細胞ペレットを、ポリトロン(Brinkmann, Westbury, NY)を用いて、各１ｇのペーストにつき１０ｍＬの未変性の溶解バッファ(20 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl)に再懸濁し、マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp, Newton, MA)を用いた細胞破壊によって溶解して、超遠心分離ローターTLA-100.3(Beckman, Fullerton, CA)を用いて３９１０００×ｇで１時間遠心分離した。可溶タンパク質を含有する上清(上清１)を、膜タンパク質と不溶性タンパク質を含むペレット(ペレット１)から分離した。次いで、ペレット１を、ポリトロンを用いて非変性界面活性剤、１％ Fos-Choline 12を含む未変性の溶解バッファに再懸濁して、４℃で終夜抽出した。翌日、試料を再度超遠心分離して、ミセルの形態で膜結合型タンパク質を含有する上清(上清２)を不溶性タンパク質(ペレット２)から単離した。ペレット及び上清は還元型ＳＤＳローディングバッファにて等量に再懸濁して、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)でプローブしたニトロセルロース膜によるイムノブロット及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。図２６に示すように、クーマシーブルーで染色したゲル及び免疫ブロットでは、膜からほぼ完全にＬＥ.ＲＡ１ｃが抽出されたことが観察された。ＲＡ１ｃタンパク質の収率は、１％ Fos-Choline 12抽出の後にクーマシーブルーで染色したゲルで観察できる程度に十分であった。
【０１４２】
ＬＥ ＲＡ１ｃ密度勾配遠心分離
実施例７のＣＤ２０の記載の方法を用いて、ＬＥ ＲＡ１ｃを密度勾配遠心分離を行った。簡単に言えば、上記のような１．９Ｍ及び１．４Ｍのショ糖溶液を重ねることによって、不連続なショ糖勾配を生成した。実施例７と同じ方法において、ウェスタンブロット分析の結果は、ほとんどのＬＥ.ＲＡ１ｃポリペプチドが大腸菌膜に挿入されていることを示した(データは示さない)。
【０１４３】
ＬＥ ＲＡ１ｃのタンパク質単離
ＬＥ.ＲＡ１ｃタンパク質を単離するために、溶解性分析における上記の１％ Fos-Choline 12可溶性膜抽出物を、Ni-NTA PhyTipカラム(Phynexus, San Jose, CA)に流し、５０ｍＭ イミダゾールと０．５％ Fos-Choline 12を含む未変性の溶解バッファにて洗浄して、２５０ｍＭ イミダゾール及び０．７５％ Fos-Choline 12を含む溶解バッファにて溶出した。溶出液分画を、還元ＳＤＳローディングバッファに再懸濁して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは、分子量４７．６ｋＤａの精製したＬＥ.ＲＡ１ｃを示した(データは示さない)。
還元剤及びＳＤＳが存在する場合でも、Ｇタンパク質カップリングレセプターがオリゴマー形成する、例えば二量体化することが知られている (Bouvier, 2001 , Nature Reviews Neuroscience, 2: 274-286)。ゲルに示される上部バンドは、分子量から判断すると、ＲＡ１ｃの二量体及びオリゴマーであるようである(データは示さない)。Ｎ末端タンパク質アミノ酸配列決定によって、精製したタンパク質をＬＥ.ＲＡ１ｃと確認した。
クーマシーブルー染色の後のタンパク質バンドの強度から算出すると、１リットルの振とうフラスコ培養物の全細胞抽出物からおよそ１０ミリグラムのｔｒｐＬＥ ＲＡ１を単離することができた。
【０１４４】
ＬＥ ＲＡ１ｃのトロンビン切断
ＲＡ１ｃポリペプチドを単離するために、トロンビンを１ｍＭ 塩化カルシウムとともに、１：１０００の希釈で精製されたＲＡ１ｃ溶出液に加えて、トロンビン酵素活性をもたらすめに、室温に終夜置いた。試料を還元して、調製して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、分析した。結果として生じたクーマシーブルー染色ゲルにより、挿入したトロンビン切断部位で融合タンパク質が良好に切断され、切断型ＲＡ１ｃ融合(３７ｋＤａ)及びフラッグタグを有するｔｒｐＬＥ(１０．６ｋＤａ)を含む２つのタンパク質バンドが示された(データは示さない)。切断されたポリペプチドバンドの相同性は、Ｎ末端配列決定によって、確認した。
【０１４５】
実施例９
ｔｒｐＬＥリーダーによるＧＰＲ７３の発現増加
ＬＥヒトＧプロテインカップリングレセプター７３(ｈＧＰＲ７３)のクローニング及び発現
ヒトＧプロテインカップリングレセプター７３(ＧＰＲ７３)をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学的技術(Ausubel 等 (eds.), 2003, Current Protocols in Molecular Biology, 4 VoIs., John Wiley & Sons)を用いて、β-ラクタマーゼ遺伝子及び３つの稀な大腸菌コドン(ａｒｇＵ、ｇｌｙＴ及びｐｒｏ２)のｔＲＮＡ遺伝子を含有するｐＢＲ３２２由来のプラスミド内にサブクローニングした。図２５に示すように、ｔｒｐＬＥリーダーの後にフラッグタグ(DYKDDDDK, 配列番号32)を付加し、トロンビン認識部位(ThrX) (LVPRGS, 配列番号31)をＧＰＲ７３のＮ末端に付加して、高い翻訳開始、検出及び切断のそれぞれを確認した。オクタ-Ｈｉｓタグ(配列番号8)をＣ末端に付加して、発現したタンパク質の検出と精製を促した。結果として生じたプラスミドをpLEfR InFcHrTと称した。実施例８に記載のように、遺伝子転写はｔｐｈａｃプロモーターの制御下とし、リン酸の制限と、およそ２〜３ＯＤ６００の細胞密度で１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによって、発現を誘導した。飽和したＬＢカルベニシリン培養物を、Ｃ. Ｒ. Ａ. Ｐ.リン酸制限培地にて希釈した(Simmons 等, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147)。次いで、培養物をＩＰＴＧ添加後６時間、３０℃で生育した。
【０１４６】
発現分析のために、１ＯＤ_６００-ｍＬ試料の還元した全細胞溶解物を実施例７に記載のように調整した。５μＬのＳＤＳ誘導試料を１０ウェルの1.0 mm NOVEX 16% トリス-グリシン SDS-PAGEに流し、およそ１２０ボルトで約１．５時間電気泳動した。ウェスタンブロット分析のために、結果として生じたゲルを、１×トランスファバッファ(Invitrogen, CA)、０．０１％ ＳＤＳ、５％ メタノール中でニトロセルロースメンブラン(NOVEX)上に電気的にブロットした。次いで、１×ＮＥＴ(150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50mM Tris, pH 7.4, 0.05% Triton X-100)と０．５％ ゼラチン溶液を用いて、振とう器上でおよそ３０分〜１時間かけて室温でメンブランをブロックした。ブロッキング工程後、抗Ｈｉｓウェスタンブロット分析のために、メンブランを、１×ＮＥＴ、０．５％ ゼラチン、抗Ｈｉｓ抗体(Roche Diagnosticsの抗ｈｉｓ６ペルオキシダーゼコンジュゲートマウスモノクローナル抗体)を含む溶液に置いた。抗Ｈｉｓ抗体を１：５０００に希釈して、メンブランを１×ＮＥＴにて１０分間、最低３回洗浄して、ＴＢＳ(20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl)にて１５分間、１回洗浄した。抗Ｈｉｓ抗体に結合したタンパク質バンドを、Amersham Pharmacia Biotech ECL検出機を用いて、メンブランをＸ線フィルムに曝して可視化した。
図２５は、コンストラクト線図とｔｒｐＬＥリーダーを含まないＧＰＲ７３の発現結果と比較したときの発現結果を示す。ウエスタンブロットは、ｔｒｐＬＥリーダーのないものよりもＬＥ.ＧＰＲ７３レベルの発現及び収率の大幅な改善を示した。
【０１４７】
ＬＥヒトＧプロテインカップリングレセプター７３の膜タンパク質の抽出
ｔｒｐＬＥ融合ＧＰＲ７３の溶解性を分析するために、細胞性の膜からタンパク質を抽出して、実施例７及び８のＬＥ.ＣＤ２０及びＬＥ.ＲＡ１ｃの類似の分析のために上記のように分析した。可溶タンパク質を含有する上清(上清１)から、膜タンパク質(ペレット１)を分離した。次いで、ペレット１をFos- choline 12で抽出して、ミセルの膜タンパク質(上清２)を不溶性タンパク質(ペレット２)から分離した。
ペレット及び上清は還元型ＳＤＳローディングバッファにて等量に再懸濁して、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)でプローブしたニトロセルロース膜によるイムノブロット及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、分析した。免疫ブロット(図２７)に示されるように、大腸菌細胞膜からほぼ完全にＧＰＲ７３タンパク質が抽出されたことが観察された。
【０１４８】
ＬＥヒトＧプロテインカップリングレセプター７３の密度勾配遠心分離
実施例７及び８の記載のように、遠心チューブにおいて、150 mM NaCl及び20 mM HEPES, pH 7.2により緩衝した１．９Ｍ及び１．４Ｍのショ糖溶液を重ねることによって、不連続なショ糖勾配を生成し、大腸菌膜分画の分離に用いた。ＬＥ.ＧＰＲ７３タンパク質を発現する細胞を未変性の溶解バッファに溶解した。膜及び不溶性の分画を、超遠心分離ローターTLA100.3 (Beckman, Fullerton, CA)を用いて３９１０００×ｇにて１時間超遠心分離することによって、単離した。上清を廃棄して、ペレットを１．９Ｍのショ糖溶液に再懸濁した。１００μＬの分割量の再懸濁液を０．９ｍＬの１．９Ｍ ショ糖溶液と再び混合した。次いで、この混合物を遠心チューブの底に置き、１ｍＬの１．４Ｍ ショ糖溶液を上に重ねた。試料をSWTi55ローターに詰めて、１２８３５６×ｇで１時間回転させた。次いで、分画化した試料を、チューブの上部から２００μＬずつ慎重に取り分け(unload)て、ニトロセルロースメンブランに転写して、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体でプローブしたＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、分析した。結果から、大部分のｔｒｐＬＥ融合ＧＰＲ７３タンパク質が大腸菌膜に挿入されていることが示された(データは示さない)。
【０１４９】
ＬＥヒトＧプロテインカップリングレセプター７３のタンパク質単離
ＬＥ.ＧＰＲ７３タンパク質を単離するために、上記の溶解性分析の１％ Fos-Choline 12可溶性膜抽出物を、Ni-NTA PhyTipカラム(Phynexus, CA)に流し、５０ｍＭ イミダゾールと０．５％ Fos-Choline 12を含む未変性の溶解バッファにて洗浄して、２５０ｍＭ イミダゾール及び０．７５％ Fos-Choline 12を含む溶解バッファにて溶出した。溶出液分画の試料を、還元ＳＤＳローディングバッファに再懸濁して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析した。結果として生じたゲルは、分子量５６．５ｋＤａの精製したＧＰＲ７３を示した(データは示さない)。Ｎ末端配列決定によって、精製したタンパク質の相同性を確認した。タンパク質収率の算出から、１リットルの振とうフラスコ培養物の全細胞抽出物からおよそ２〜３ミリグラムのｔｒｐＬＥ ＧＰＲ７３を単離することができたことが示された。
【０１５０】
ＬＥヒトＧプロテインカップリングレセプター７３のトロンビン切断
ＧＰＲ７３タンパク質は、挿入されたトロンビン切断部位で融合タンパク質から切断された。トロンビンを１ｍＭ 塩化カルシウムとともに、１：１０００の希釈で精製されたＧＰＲ７３溶出液に加えて、酵素活性をもたらすめに、室温に終夜置いた。切断されたタンパク質の試料をＳＤＳで還元して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析したクーマシーブルーで染色したゲルにより、挿入した部位で融合タンパク質が良好に切断された結果生じた、切断型ＧＰＲ７３(４５．９ｋＤａ)とフラッグタグを有するｔｒｐＬＥ(１０．６ｋＤａ)を含む２つのタンパク質バンドが示された(データは示さない)。切断されたタンパク質の相同性をＮ末端配列決定によって確認した。
【０１５１】
実施例１０
膜タンパク質の精製
ＬＥ及びｓＬＥタグ付加ヒトＣＤ２０の精製：
実施例７、８及び９に記載のように大腸菌内で産生されるＬＥ及びｓＬＥタンパク質を単離するために、ポリトロン(Brinkmann, Westbury, NY )を用いて全細胞を１：１０wt/volで溶解バッファ(20 mM Tris, pH 7.5, 300 mM NaCl and 1 mM EDTA)に再懸濁することによって、膜分画を調製した。次いで、マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp., Newton, MA)を用いて細胞破壊することによって、細胞を溶解し、混合物を１２，０００×ｇで１時間遠心分離した。次いで、細胞ペレット(Ｐ１)を、ポリトロンを用いて、β-メルカプトエタノールの存在下又は非存在下にて、ＥＤＴＡを含まない溶解バッファに再懸濁した。ドデシルホスホコリン(DDPC, Fos-CholineR 12)を１％の濃度で添加して、試料をマイクロフルイダイザーに１〜３回通した。溶液を１２５０００×ｇでおよそ４５分〜１時間、遠心分離した。上清を、バッファ(20 mM Tris, pH 7.5, 250-300 mM NaCl及び5 mM DDPCないし0.1 % n-ドデシル-N,N-ジメチルアミン- N-オキシド(LDAO))中で予め平衡化したNi-NTA Superflow (Qiagen Inc. Valencia, CA)カラムに流した。５０ｍＭ イミダゾールを含む１０ＣＶの同バッファにてカラムを洗浄して、２５０〜３００ｍＭ イミダゾールを含む同バッファにて溶出した。カラム負荷によるすべての精製工程は４℃で行った。
還元剤の存在下にて精製したタンパク質は単量体として膜のみから単離された(データは示さない)。還元剤の非存在下で単離したタンパク質は、単量体型及びジスルフィド結合した二量体型の両方で存在した。
【０１５２】
二量体タンパク質を単量体型に変換するために、ＣＤ２０を、β-メルカプトエタノール又はＤＴＴの添加によって還元した。還元剤は、還元剤を含まない界面活性剤、20 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaClを含有するバッファによって、複数回透析することによって、除去するか、酸化型ＤＴＴ又は酸化型グルタチオンなどの酸化型還元剤の添加によって、中和した。
Ｈｉｓタグ及びＬＥないしｓＬＥリーダーをウシのトロンビンとともにインキュベートすることによって、タンパク質から切断した。任意の残存する二量体、リーダー(ＬＥないしｓＬＥ)及びＨｉｓタグから単量体のＣＤ２０を単離するために、20 mM Tris, pH 7.5, 300 mM NaCl, 及び5 mM DDPCないし0.1 % n-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド(LDAO)にて予め平衡化したSuperdex 200 カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)に切断したタンパク質を流した。サイズ排除カラムからの分画を回収し、ゲルクロマトグラフィによって、分析して、精製したタンパク質の位置を示した。精製したタンパク質を後述する結合アッセイに用いた。
【０１５３】
ＥＬＩＳＡによる活性アッセイ：
ＬＥ及びｓＬＥ配列の存在下及び非存在下で発現されたヒトＣＤ２０ポリペプチドの抗体リツキシマブ結合能によって、発現されたＣＤ２０タンパク質の機能的な完全性を評価した。リツキシマブは、システイン残基１６７と１８３との間の天然のジスルフィド結合が形成されているヒトＣＤ２０の折り畳まれた(フォールドされた)高次構造のみを認識する。リツキシマブに対するヒトＣＤ２０結合のＥＬＩＳＡアッセイを用いてＣＤ２０の天然の再折り畳み(リフォールディング)をアッセイした。
精製したＣＤ２０タンパク質をＥＬＩＳＡによって、アッセイした。１μｇ／ｍＬのＣＤ２０を含有するＰＢＳ(臨界ミセル濃度以下に希釈された可溶化界面活性剤を含有する)１００μＬ(マイクロリットル)を用いて、９６ウェルプレートを終夜４℃でコートした。次いで、プレートを0.05% Tween-20を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＴ)にて３回洗浄し、２００μＬの０．５％ ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ(ブロッキングバッファ及びアッセイバッファ)にて室温で４５分間ブロックした。プレートを再度ＰＢＳＴにて３回洗浄した後、一次抗体でプローブした。６０μｇ／ｍＬのリツキシマブを含むアッセイバッファ１５０μＬを適当なウェルに添加し、第一のウェルから５０μＬを取り出し、次のウェルと第三のウェルに１００μＬのアッセイバッファとともに混合して、およそ２ｎｇ／ｍＬの終濃度とすることによって、第三のウェルに３倍の段階希釈液を作成した。室温で９０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄して、結合したリツキシマブを、アッセイバッファで１：２０００に希釈した１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＦ(ａｂ')２(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove,n PA)で検出して、ＰＢＳＴにて６回洗浄して、製造者の指示に従って混合した１００μＬ／ウェルのTMB Microwell Peroxidase Substrate System (KPL, Gaithersburg, MD)にて反応させた。１００μＬ／ウェルの１．０Ｍ リン酸を添加して反応を止め、４５０ｎｍの吸光度をプレート読み取り機を用いて測定した。
図２８は結合アッセイの結果を示す。この図では、ＬＥないしｓＬＥ配列の非存在下で発現したヒトＣＤ２０へのリツキシマブ結合の反応を、ＬＥないしｓＬＥリーダーの存在下で発現したヒトＣＤ２０及び様々な条件下で単離されたＣＤ２０と比較した。各々のヒトＬＥ.ＣＤ２０及びｓＬＥ.ＣＤ２０ポリペプチドは、コントロールであるヒトＣＤ２０と類似の、高次構造-特異的な抗体であるリツキシマブへの結合を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】Ｂ細胞膜に存在するＣＤ２０の略図。細胞表面膜との関係で、ＣＤ２０の予測される全体のトポロジー及び配列を表す。
【図２】Ｈｉｓタグ付加ＣＤ２０の抗Ｈｉｓタグウェスタンブロット分析。パネルａは大腸菌細胞膜のショ糖勾配浮遊液に従ったＣＤ２０含有分画を示す。ショ糖勾配からの分画(上の番号で表す)の分割量をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに電気泳動した。ゲルはブロットして抗Ｈｉｓ抗体でプローブした。分画は最も低いショ糖密度から最も高いショ糖密度までである。パネルｂは、異なる界面活性剤によって大腸菌膜を抽出した後のウェスタンブロットによるＨｉｓタグ付加ＣＤ２０のレベルを示す。異なる界面活性剤抽出物の上清を(S)とラベルし、ペレットを(P)とラベルした。(WC)は全細胞抽出物(コントロール)を意味する。番号１−７は試験した異なる界面活性剤を意味し、SDS (1)、n-ラウリルサルコシン(2)、n-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド(LADO) (3)、n-ドデシルホスホコリン(DDPC) (4)、n-ドデシル-D-D-マルトシド(DDM) (5)、Triton-X 100 (6)、及びCHAPS (7)である。パネルｃは、Ｈｉｓタグ付加天然のヒトＣＤ２０とＣ２Ｓ変異体ＣＤ２０を発現する大腸菌細胞について、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットから検出されるＨｉｓタグ付加ＣＤ２０ポリペプチドのレベルを示す。レーン１及び４は、コントロール(空のベクター)を含有する；レーン２及び５は、Ｈｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０を含有する；そして、レーン３及び６はＣ２Ｓ変異体ＣＤ２０を含有する。レーン１、２及び３の試料は、非還元条件で行った；レーン４、５及び６の試料は、１００ｍＭ ＤＴＴで還元した。各レーンは、光学濃度で標準化した等量の細胞を含有する。
【図３】精製したヒトＨｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０、Ｃ２Ｓ変異体及びマウスＣＤ２０のクーマシー染色したＳＤＳゲルレーンを示す。パネルａのレーン１、２及び３は非還元タンパク質である：ヒトＣＤ２０(レーン１)、Ｃ２Ｓ変異体(レーン２)及びマウスＣＤ２０(レーン３)。レーン４は、分子量マーカー(Mark 12, Invitrogen)を含有する。レーン５、６及び７は還元タンパク質である：ヒトＣＤ２０(レーン５)、Ｃ２Ｓ変異体(レーン６)及びマウスＣＤ２０(レーン７)。レーン８と１０は、それぞれ非還元型と還元型のマウスＣＤ２０を示す。レーン９は分子量マーカーを含有する。各レーンは、２μｇ(マイクログラム)のタンパク質を含有する。タンパク質マーカーの分子量は、２００、１１６、９７、６６、５５、３６、３０、２２、１４及び６ｋＤａである。
【図４】Ｈｉｓタグ付加ヒトＣＤ２０(■)、還元してアルキル化したｈＣＤ２０(●)、還元して再酸化したｈＣＤ２０(□)及びＰＢＳコントロール(○)へのジスルフィド依存性のリツキシマブ抗体結合を示すグラフ。
【図５】リツキシマブとヒトＨｉｓタグ付加ＣＤ２０との間の結合を示すＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラム。固定したリツキシマブへのヒトＣＤ２０の結合は、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６３μＭ、０．３１μＭ、０．１６μＭ、０．０８μＭ、及び０．０４μＭのＣＤ２０濃度で生じる。初めの４つの試料の濃度をセンサーグラムにラベルした。各濃度での非共作用可能のモデルへの算出した理論的なフィットを示す。
【図６】ＣＤ２０タンパク質の遠紫外線の円二色性スペクトルを示す。上方のパネルは、０．１％ ＤＤＰＣ存在下でのヒトＣＤ２０変異体Ｃ２Ｓ(黒色線)；０．１％ ＤＤＰＣ及び１０ｍＭ β-メルカプトエタノール存在下でのヒトＣＤ２０変異体Ｃ２Ｓ(波線)、そして１％ ＳＤＳ存在下で９５℃にサーマルスキャンした後のヒトＣＤ２０変異体Ｃ２Ｓ(点線)のスペクトルを示す。下方のパネルは、０．１％ ＤＤＰＣの存在下でのマウスＣＤ２０(波線)、０．１％ ドデシル-マルトシド(ＤＤＭ)の存在下でのマウスＣＤ２０(点線)；及び、１％ ＳＤＳ及びβ-メルカプトエタノールを添加した０．１％ ＤＤＭ中で９５℃で２分間熱した後のマウスＣＤ２０(黒色線)のスペクトルを示す。データをモル楕円率として表す。
【図７】単離した正常ヒトＢ細胞へのリツキシマブ ＩｇＧ及びＦａｂの結合の典型的な置換ブロットを示す。本アッセイでの天然のＣＤ２０のＥＣ_５０は９．５ｎＭであった。ドナー１については^１２５Ｉ-ＩｇＧに対する非標識リツキシマブＩｇＧの競合(上方パネル)又はドナー４については^１２５Ｉ-Ｆａｂに対する非標識リツキシマブＦａｂの競合によって、結合を測定した。各ドナーからのレセプターの数と親和性については表４を参照のこと。
【図８】発現ベクターコンストラクトと、ＭＳ４Ａ６Ａ、ＭＳ４Ａ７及びＭＳ４Ａ４Ａのポリペプチドを含む、大腸菌のＭＳ４Ａファミリーポリペプチドの発現を示すウェスタンブロットを示す。
【図９】抗Ｈｉｓタグ抗体により検出されるように、非誘導型ｐｈｏＡプロモーター(pEfRA1C)と変異体プロモーターであるｐｈａｃ(pEfRA1Cr)からの漏出量により表されるＲＡ１ｃポリペプチドを示すウェスタンブロット。
【図１０】リン酸制限培地に希釈することによって誘導されるｐｈｏＡプロモーター(pEfRA1C)からのＲＡ１ｃポリペプチド発現の時間的経過を示すウェスタンブロット。
【図１１】リン酸制限培地への希釈及びＩＰＴＧ添加によって誘導されるｐｈａｃプロモーター(pEfRA1Cr)からのＲＡ１ｃポリペプチド発現の時間的経過を示すウェスタンブロット。
【図１２】誘導型ｐｈｏＡ及びｐｈａｃプロモーターからのＲＡ１ｃの最大の発現を比較するウェスタンブロット。
【図１３】非誘導型ｐｈｏＡプロモーター(真ん中のレーン)と変異体プロモーターであるｐｈａｃ(右側のレーン)からの漏出量により表される、大腸菌内で発現されたＥＧ-ＶＥＧＦレセプターであるＧＰＲ７３ポリペプチドを示すウェスタンブロット。
【図１４】リン酸制限培地に希釈することによって誘導されるｐｈｏＡプロモーターからのＧＰＲ７３ポリペプチド発現の時間的経過を示すウェスタンブロット。
【図１５】リン酸制限培地への希釈及びＩＰＴＧ添加によって誘導されるｐｈａｃプロモーターからのＧＰＲ７３ポリペプチド発現の時間的経過を示すウェスタンブロット。
【図１６】誘導型ｐｈｏＡ及びｐｈａｃプロモーターからのＧＰＲ７３の最大の発現を比較するウェスタンブロット。
【図１７】非誘導型ｐｈｏＡプロモーター(真ん中のレーン)と変異体プロモーターであるｐｈａｃ(右側のレーン)からの漏出量により表される、ＭＳ４Ａ４Ａポリペプチドを示すウェスタンブロット。
【図１８】リン酸制限培地に希釈することによって誘導されるｐｈｏＡプロモーターからのＭＳ４Ａ４Ａポリペプチド発現の時間的経過を示すウェスタンブロット。
【図１９】リン酸制限培地への希釈及びＩＰＴＧ添加によって誘導されるｔｐｈａｃプロモーターからのＭＳ４Ａ４Ａポリペプチド発現の時間的経過を示すウェスタンブロット。
【図２０】誘導型ｐｈｏＡ及びｔｐｈａｃプロモーターからのＭＳ４Ａ４Ａの最大の発現を比較するウェスタンブロット。
【図２１】多膜貫通型ポリペプチドを発現するための発現コンストラクトの略図。発現ベクターの例示的成分を示す。
【図２２】ｔｒｐＬＥ及びｓＬＥリーダーのアミノ酸配列。
【図２３】ＣＤ２０の発現のための発現ベクターの線図と、大腸菌細胞におけるＣＤ２０とＬＥ.ＣＤ２０の発現と産生を示すクーマシーブルー染色ゲル。
【図２４】大腸菌細胞内で発現されるＬＥ.ＣＤ２０の抽出を示すウェスタンブロットとクーマシーブルー染色ゲル。
【図２５】ＲＡ１ｃ又はＧＰＲ７３を発現するための発現ベクターの線図と、コントロールタンパク質と比較したときのＬＥ.ＲＡ１ｃとＬＥ.ＧＰＲ７３の発現を示すウェスタンブロット。
【図２６】大腸菌細胞膜で発現し抽出されたＬＥ.ＲＡ１ｃタンパク質を示すクーマシーブルー染色ゲル。
【図２７】大腸菌細胞膜から抽出されたＬＥ.ＧＰＲ７３を示すウェスタンブロット。
【図２８】実施例１０に記載のように大腸菌内で発現して抽出されたＬＥ.ＣＤ２０及びｓＬＥ.ＣＤ２０へのＣＤ２０高次構造特異的抗体であるリツキシマブの結合を示すグラフ。ｓＬＥとＬＥの試料については、トロンビンによる消化によってＬＥタグを除去し、透析によって試料を酸化した。□；ＬＥタグにより発現されたｈＣＤ２０、△；ｓＬＥタグにより発現されたｈＣＤ２０、●；ＨＱタグ(ＬＥリーダー上)により発現されたｈＣＤ２０、×；ＰＢＳコントロール。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 単一又は多膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
b) 宿主細胞内で基礎活性が低い、厳密に調節されるプロモーター；
c) 翻訳開始エンハンサーを含有するリーダー配列
を含んでなる、宿主細胞内で単一又は多膜貫通型ポリペプチドを発現するための発現コンストラクト。
【請求項２】
前記プロモーターは、
a) 少なくとも一のポジティブ制御調節成分；
b) 少なくとも一のネガティブ制御調節成分；又は
c) 少なくとも一のポジティブ制御調節成分と少なくとも一のネガティブ制御調節成分
を含んでなり、一又は複数のポジティブ又はネガティブの制御調節成分が異種性の制御調節成分である、請求項１に記載の発現コンストラクト。
【請求項３】
前記ポジティブ調節成分がｐｈｏボックス、ＭａｌＴ ＤＮＡ結合部位、又はＡｒａＣ ＤＮＡ結合部位である、請求項２に記載の発現コンストラクト。
【請求項４】
前記ネガティブ調節成分がオペレーター／レプレッサー系の細菌のオペレーターを含む、請求項２又は３に記載の発現コンストラクト。
【請求項５】
前記ネガティブ調節成分がｌａｃオペレーター、ｔｒｐオペレーター、又はλオペレーターを含んでなる、請求項２ないし４の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項６】
前記ポジティブ調節成分がｐｈｏボックスを含み、前記ネガティブ調節成分がｌａｃオペレーターを含む、請求項２に記載の発現コンストラクト。
【請求項７】
さらに、上流プロモーターからの読み過ごしを防ぐために配位する一又は複数の転写ターミネーターを含んでなる、請求項１ないし６の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項８】
前記転写ターミネーターがλ配列：AACG CTCGGTTGCC GCCGGGCGTT TTTTATT (配列番号17)、又はＨｉｓオペロンターミネーターを含んでなる、請求項７に記載の発現コンストラクト。
【請求項９】
前記プロモーターが、
a) ｐｈｏＡ、ｐｈａｃ、又はｔｐｈａｃプロモーター；
b) Ｔ７、ｍｅｔＥ、又はλＰＬプロモーター；又は
c) β-ラクタマーゼ、ラクトース、又はトリプトファンプロモーター
を含んでなり、少なくとも一の異種性制御調節成分を含有するように操作して、基礎活性を低減したものである、請求項１ないし８の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項１０】
前記プロモーターがｐｈｏＡプロモーターないしはその変異体であり、このとき、リン酸制限培地に曝すことによって発現が誘導される、請求項９に記載の発現コンストラクト。
【請求項１１】
前記プロモーターが配列番号１５(ｐｈａｃ)又は配列番号１６(ｔｐｈａｃ)のアミノ酸配列を含んでなる、請求項９に記載の発現コンストラクト。
【請求項１２】
前記翻訳開始エンハンサーが、宿主細胞内で高く発現される遺伝子のおよそはじめの６からおよそ１２コドンを含んでなるものである、請求項１ないし１１の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項１３】
前記翻訳開始エンハンサーが、βガラクトシダーゼ、プロテインＡ、又はグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼをコードする遺伝子のおよそはじめの６からおよそ１２コドンを含んでなるものである、請求項１ないし１２の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項１４】
前記翻訳開始エンハンサーが、ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCAT(配列番号34)、ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTCA(配列番号35)及びATG AAACAC CAACACCAACAA(配列番号28)からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１ないし１３の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項１５】
前記リーダー配列がアミノ酸配列MKHQHQQ (配列番号7)をコードする、請求項１６に記載の発現コンストラクト。
【請求項１６】
前記翻訳開始エンハンサーが、単一又は多膜貫通型ポリペプチドの第一アミノ酸をコードするコドンの上流に位置する、請求項１２ないし１５の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項１７】
さらに、前記リーダー配列が翻訳伸長スペーサー配列を含んでなる、請求項１ないし１６の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項１８】
前記翻訳伸長スペーサー配列が、宿主細胞内で高度に発現されることが公知である遺伝子の少なくとも一部を含んでなる、請求項１７に記載の発現コンストラクト。
【請求項１９】
前記宿主細胞が細菌細胞であり、前記翻訳伸長スペーサー配列が、高度に発現される細菌遺伝子のおよそ５０からおよそ１２０のコドンを含有するものである、請求項１７に記載の発現コンストラクト。
【請求項２０】
前記宿主細胞が細菌細胞であり、前記翻訳伸長スペーサー配列が、ｔｒｐオペロンのＥ遺伝子のおよそ５０からおよそ１２０のコドンを含有するものである、請求項１７に記載の発現コンストラクト。
【請求項２１】
前記宿主細胞が細菌細胞であり、前記翻訳伸長スペーサー配列が、配列番号29又は30のアミノ酸配列をコードする、請求項１７に記載の発現コンストラクト。
【請求項２２】
前記膜貫通型ポリペプチドが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、又は24の膜貫通領域を含有する、請求項１ないし２１の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項２３】
前記膜貫通型ポリペプチドが４つの膜貫通領域を有するＭＳ４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーである、請求項１ないし２２の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項２４】
前記膜貫通型ポリペプチドが、ＣＤ２０、高親和性ＩｇＥレセプターβ鎖(ＦｃεＲＩβ)、ＨＴｍ４、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＭＳ４Ａ６、ＭＳ４Ａ７、ＧＰＲ７３、又はＲＡ１ｃを含んでなる、請求項１ないし２２の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項２５】
前記膜貫通型ポリペプチドが、配列番号１に少なくとも８０％同一性を含むアミノ酸配列を有するＣＤ２０である、請求項１ないし２２の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項２６】
前記ＣＤ２０が残基Ｃｙｓ１１１、Ｃｙｓ２２０、又はその両方にアミノ酸置換を含有する、請求項２５に記載の発現コンストラクト。
【請求項２７】
アミノ酸置換が残基Ｃｙｓ１１１Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ、又はその両方を含む、請求項２６に記載の発現コンストラクト。
【請求項２８】
前記ＣＤ２０がアミノ酸置換Ｃｙｓ８１Ａｌａ、Ｃｙｓ１１１Ｓｅｒ及びＣｙｓ２２０Ｓｅｒを含有する、請求項２５に記載の発現コンストラクト。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号6のアミノ酸配列をコードする、請求項２５に記載の発現コンストラクト。
【請求項３０】
配列番号１の残基Ｋ１１６からＮ２１４を含有するＣＤ２０の断片をコードする、請求項１ないし２２の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項３１】
さらに、発現タグをコードする核酸配列を含んでなる、請求項１ないし３０の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項３２】
前記発現タグがポリＨｉｓタグ又はＨｉｓＧｌｎタグを含む、請求項３１に記載の発現コンストラクト。
【請求項３３】
前記宿主細胞が細菌細胞であり、前記発現コンストラクトが細菌細胞の稀なコドンをコードする一又は複数のｔＲＮＡ遺伝子をさらに含有してなる、請求項１ないし２２の何れか一に記載の発現コンストラクト。
【請求項３４】
前記細胞が大腸菌細胞であり、稀なコドンのための前記ｔＲＮＡ遺伝子が一又は複数のａｒｇＵ、ｇｌｙＴ及びｐｒｏ２を含む、請求項３３に記載の発現コンストラクト。
【請求項３５】
a) 宿主細胞に請求項１ないし３４の何れか一に記載の発現コンストラクトを導入する；そして
b) 該宿主細胞内でコンストラクトを発現させて、膜貫通型ポリペプチドを産生する
ことを含む、膜貫通型ポリペプチドの産生方法。
【請求項３６】
a) 前記ポリペプチドを発現する宿主細胞を破壊する；
b) 該破壊細胞の可溶性分画と不溶性分画を分離する；そして
c) 非イオン又は双性イオンの界面活性剤に不溶性分画を懸濁して可溶化し、該宿主細胞から前記ポリペプチドを単離する
ことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
a) 膜貫通型ポリペプチドを発現する宿主細胞を破壊する；
b) 該破壊細胞の可溶性分画と不溶性分画を分離する；そして
c) 非イオン又は双性イオンの界面活性剤に不溶性分画を懸濁して可溶化し、該宿主細胞から該ポリペプチドを単離する
ことを含む、宿主細胞からの発現された膜貫通型ポリペプチドの単離方法。
【請求項３８】
前記膜貫通型ポリペプチドが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、又は24の膜貫通領域を含有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞が請求項１ないし３８の何れか一に記載の発現コンストラクトを含んでなる、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記単離されたポリペプチドが天然の高次構造である、請求項３６ないし３９の何れか一に記載の方法。
【請求項４１】
前記界面活性剤が、
a) zwittergent(登録商標) 3-08、3-10、3-12、3-16、ASB-14、ASB-16、又はASBC80；
b) ホスホコリンの誘導体；
c) ドデシルホスホコリン(ＤＤＰＣ)、デシルマルトシド(decylmaltoside)(ＤＤＭ)、デシルマルトシド(decyl maltoside)(ＤＭ)、ｎ-ドデシル-Ｎ,Ｎ―ジメチルアミンＮ-オキシド(ＬＡＤＯ)、ｎ-デシル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミン-Ｎ-オキシド、ＤＨＰＣ、ＤＬＰＣ、ＭＰＣ、ＬＯＰＣ、ＬＬＰＧ；
d) ＮＰ４０
を含む、請求項３６ないし４０の何れか一に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドがショ糖密度勾配遠心分離によって単離される、請求項３６ないし４１の何れか一に記載の方法。
【請求項４３】
さらに、クロマトグラフィ、ゲル濾過又は沈殿法によって可溶化されたポリペプチドを精製することを含む、請求項３６ないし４２の何れか一に記載の方法。
【請求項４４】
前記クロマトグラフィが、カラムクロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、金属キレート化クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィ又はクロマトフォーカシングを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記宿主細胞が細菌細胞を含む、請求項３５ないし４４の何れか一に記載の方法。
【請求項４６】
前記細菌細胞がグラム陰性細菌を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記宿主細胞が、大腸菌属、サルモネラ属、赤痢菌属、セラチア属、クレブシエラ属、又はエンテロバクター属の細胞を含む、請求項３５ないし４６の何れか一に記載の方法。
【請求項４８】
一又は複数の異種性ネガティブ調節成分を含んでなる、変異体ｐｈｏＡプロモーター。
【請求項４９】
前記異種性ネガティブ制御調節成分がｌａｃオペレーターを含む、請求項４８に記載の変異体ｐｈｏＡプロモーター。
【請求項５０】
さらに、上流プロモーターからの読み過ごしを防ぐために配位する一又は複数の異種性の転写ターミネーターを含んでなる、請求項４８又は４９に記載の変異体ｐｈｏＡプロモーター。
【請求項５１】
配列番号１５(ｐｈａｃ)又は配列番号１６(ｔｐｈａｃ)の核酸配列を含んでなる変異体ｐｈｏＡプロモーター。
【請求項５２】
請求項１ないし３４の何れか一に記載の発現コンストラクトを含んでなる細菌細胞。
【請求項５３】
請求項３５ないし４７の何れか一に記載の方法によって産生されたか単離されたポリペプチド。
【請求項５４】
請求項１ないし３４の何れか一に記載の発現コンストラクトから発現されたポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号1に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、一又は複数の残基Ｃｙｓ８１、Ｃｙｓ１１１及びＣｙｓ２２０が置換される、ポリペプチド。
【請求項５６】
Ｃｙｓ１１１、Ｃｙｓ２２０又はその両方がセリンに置換される、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
Ｃｙｓ８１がアラニンに置換される、請求項５５又は５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
配列番号6のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
天然の高次構造を有する、単離された可溶性の組み換えＣＤ２０ポリペプチド。
【請求項６０】
請求項５５ないし５８の何れか一に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項６１】
a) 請求項５３ないし５９の何れか一に記載のポリペプチドを宿主動物に接種する；そして
b) 該宿主動物から該ポリペプチドを結合する抗体を回収する
ことを含む、単一又は多膜貫通型ポリペプチドを結合する抗体の産生方法。
【請求項６２】
a) 請求項５５ないし５９の何れか一に記載のポリペプチドを宿主動物に接種する；そして
b) 該宿主動物からＢ細胞上で発現されるＣＤ２０を結合する抗体を回収する
ことを含む、抗ＣＤ２０抗体の産生方法。
【請求項６３】
a) 請求項５３ないし５９の何れか一に記載のポリペプチドに結合する抗体を分析する；そして
b) ポリペプチドへの結合が膜ポリペプチド-結合抗体の検出と相関する
ことを含む、少なくとも４つの膜貫通型セグメントを含有する膜ポリペプチドへの抗体の結合を検出する方法。
【請求項６４】
a) 請求項５５ないし５９の何れか一に記載のポリペプチドに結合するリガンドを分析する；そして
b) ポリペプチドへの結合がＣＤ２０結合リガンドの検出と相関する
ことを含む、ＣＤ２０へのリガンドの結合を検出する方法。
【請求項６５】
前記リガンドが抗体ないし抗体断片を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記リガンドが親和性成熟抗体を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
分析する抗体結合ないしリガンド結合がＥＬＩＳＡアッセイを含む、請求項６３ないし６６の何れか一に記載の方法。
【請求項６８】
請求項５３ないし５９の何れか一に記載の固定化されたポリペプチドを含んでなるアッセイ表面。
【請求項６９】
前記表面が、マイクロタイタープレート、クロマトグラフィ樹脂、バイオセンサーチップ、又は流動化されたアッセイカードを含む、請求項６８に記載のアッセイ表面。
【請求項７０】
膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細菌細胞内で発現させることを含み、該発現が請求項４８ないし５１の何れか一に記載のプロモーターの調節下にある、細菌細胞内で膜貫通型ポリペプチドを発現する方法。
【請求項７１】
前記プロモーターが活性化されて、３時間未満の持続時間の間、２時間未満の持続時間の間、又は１から２時間の範囲の持続時間の間、前記ポリペプチドを発現する、請求項７０に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【公表番号】特表２００８−５２５０４１（Ｐ２００８−５２５０４１Ａ）
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８６２３（Ｐ２００７−５４８６２３）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４７６５３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９４０３
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】