生物学的に活性なペプチドと置換されたまたは融合された少なくとも２つのＣＤＲ領域を有する抗体またはそれらのフラグメントが記載される。このような抗体またはそれらのフラグメントを含有する組成物は、治療様相および診断様相において有用である。２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部に相当するアミノ酸残基がペプチド模倣物と置換されている領域を含む免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって、該ペプチド模倣物が、ＥＰＯ模倣物およびＴＰＯ模倣物からなる群から選択される、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国出願番号１０／００６，５９３の一部継続出願であり、米国出願番号１０／００６，５９３は、２００１年１２月５日に出願されており、これは、米国暫定特許出願番号６０／２５１，４４８（２０００年１２月５日出願）、および米国暫定特許出願番号６０／２８８，８８９（２００１年５月４日出願）、および米国暫定特許出願番号６０／２９４，０６８（２００１年５月２９日出願）に対して優先権を主張している。これらの３つの暫定出願の開示内容は、この参照によって、その全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、診断試薬および治療試薬としての抗体分子および生物学的活性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の背景）
抗体は、Ｂリンパ球によって生成され、感染に対して防御する。抗体は、数百万物の形態で生成され、これら形態は、各々、異なるアミノ酸配列を有する。抗体分子は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖で構成される。酵素パパインによって消化される場合、２つの同一のＦａｂフラグメントが、１つのＦｃフラグメントと一緒に生成される。酵素ペプシンで消化される場合、１つのＦ（ａｂ’）_２フラグメントが生成される。軽鎖および重鎖は、定常領域および可変領域からなる。可変領域内に、抗原結合部位を形成する超可変領域（ａｋａ相補性決定領域（ＣＤＲ））がある。可変領域の残りの部分は、フレームワーク領域と称される。
【０００４】
重要な生物学的機能（例えば、レセプター結合、活性化、および酵素活性）は、しばしば、より大きなタンパク質分子の不連続の領域（これは、限定された数のアミノ酸残基を含む）に起因し得る。結合、活性化、または酵素活性を示すペプチドがまた、アミノ酸残基のランダム連結により生成されたペプチドのライブラリーをスクリーニングすることによって発見された。これらのペプチドは、同様の生物学的活性を示す、より大きなタンパク質中のアミノ酸の線状の配置に対応していなくてもよく、これは、不連続ペプチドエピトープまたはミモトープと称される。特定のペプチド模倣物が記載されており、クローニングされている。例えば、以下を参照のこと：米国特許番号６，０８３，９１３（トロンボポイエチン（ＴＰＯ）模倣物）、米国特許番号５，８３５，３８２（エリスロポイエチン（ＥＰＯ）模倣物）、米国特許番号５，８３０，８５１（ＥＰＯ模倣物）およびＷｒｉｇｈｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９６）２７３：４５８−６３。ペプチドエピトープおよびミモトープは、それらの小さなサイズに起因して、おそらく、治療試薬としての使用のために、大きなタンパク質分子よりも有利である。しかし、治療薬としてこれらのペプチドを用いる結果は、しばしば、満足いくものではないことがある。治療試薬としてのペプチドの使用に対する１つの欠点は、通常、それらがインビボで不安定である（すなわち、血清からのそれらのクリアランス速度が、かなり迅速であり得る）ことである。さらに、より大きな分子に融合される場合、ペプチドの活性（治療薬またはそれ以外）を推定することが困難である。なぜなら、コンフォメーションの変化および他の分子力が、ペプチドの活性に干渉し得るか、または完全に打ち消し得るからである。抗体のＣＤＲ領域に特定のポリペプチドを導入する試みがなされている。例えば、ＰＣＴ出願 ＷＯ ９４／１８２２１を参照のこと。しかし、前に言及したように、周囲アミノ酸によって引き起こされ得るコンフォメーションの変化に起因して、活性ポリペプチドの生物学的活性は消失され得るか、または打ち消され得る。従って、本明細書中における目的は、診断試薬および治療試薬としての使用のための生物学的に活性なペプチドを含む、合理的に設計された抗体またはそのフラグメントを提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本明細書中に、生物学的に活性なペプチドの活性を模倣する生物学的に活性な組換え抗体およびそれらのフラグメント、このような抗体を作製する方法、ならびに治療および診断におけるそれらの使用のための方法が提供される。これらの抗体およびそれらのフラグメントは、単離されたペプチドの不利点のいくつかを受けない。なぜなら、抗体は、天然には、血清半減期が長く、そしてそれらの標的の結合において特異性が高いからである。驚くべきことに、抗体分子中に、組み合わされた標的ペプチドの周囲の特定アミノ酸を組み込むこが、ペプチドの生物学的活性を実際に増大させることが見出された。
【０００６】
免疫グロブリン分子またはそれらのフラグメントは、関心のあるペプチドを、抗体分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）に挿入している。抗体分子は、ペプチドの提示のための足場として働き、ペプチドに増強された安定性を付与する。必要に応じて、ペプチドは、ＣＤＲ領域のアミノ酸の全てを置換するか、または既存のＣＤＲに付加されることもあり、それにより、本来の抗原特異性が破壊される。ここで、このＣＤＲ領域は、２つの受け入れられているスキームのいずれかによって定義される（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ（１９９２）（２２７）７７６−９８を参照のこと）。さらに、ペプチドに隣接し、かつ抗体フレームワークにおいて最適なペプチド提示のスクリーニングを可能にするさらなるアミノ酸が、ランダムに導入され得る。驚くべきことに、特定の場合では、ペプチドに隣接するプロリンが、生物学的活性の増大を提供することが見出された。
【０００７】
特定の実施形態では、免疫分子またはフラグメントは、１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に相当するアミノ酸残基を、生物学的に活性な造血性ペプチドまたは血小板形成性（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｃ）ペプチドを構成するアミノ酸残基と置換している。別の特定の実施形態では、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に相当するアミノ酸残基が、各々が、このような生物学的に活性なペプチドを構成するアミノ酸残基によって置換される。１つの免疫グロブリン分子またはそのフラグメントにおいて、１つ以上の相補性決定領域が、ペプチドと置換され得る；例えば、重鎖のＣＤＲ３、軽鎖のＣＤＲ３、重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲ３、重鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または軽鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３。置換されるＣＤＲ領域の他の組み合わせもまた可能であり、これには、ＣＤＲ１の置換が含まれる。さらに、ＣＤＲの置換の代わりに、なお、元の抗原特異性を破壊しながらも、アミノ酸残基を実際に置換することなく、ペプチドをネイティブＣＤＲに付加し得る。
【０００８】
従って、１つの局面では、プロリンをそのカルボキシ末端に付加して、プロリン伸長した生物学的に活性なペプチドを形成することにより、活性が増強された生物学的に活性なペプチドが提供され、この生物学的に活性なペプチドは、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントにおける少なくとも１つのＣＤＲ領域の少なくとも一部を置換するかまたはこれに付加するために使用される。別の局面では、少なくとも１つのネイティブＣＤＲ領域に対する置換物として、ＴＰＯ模倣物ペプチドまたはＥＰＯ模倣物ペプチドのいずれかを有する、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントが提供される。この局面では、ＴＰＯ模倣物ペプチドまたはＥＰＯ模倣物ペプチドは、必要に応じて、本明細書中に記載のように、プロリン伸長され得る。
【０００９】
さらなる特定の実施形態では、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントは、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、重鎖可変領域、軽鎖、または全ＩｇＧ分子である。免疫グロブリン分子またはそのフラグメントはまた二量体化ドメインを有し得、これにより、１つのみのＣＤＲをペプチドと置換された免疫グロブリン分子が、二量体化すること、従って、活性化のために二量体化を必要とするレセプターを活性化させることができる。
【００１０】
特定の実施形態では、生物学的に活性なペプチドは、線状ペプチドエピトープまたは不連続ペプチドエピトープであり得る。さらに、生物学的に活性なペプチドは、ＣＤＲ領域に代わるように置換される場合、プロリンに加えて、ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端に直近の１つ、２つ、またはそれ以上のさらなる隣接アミノ酸残基を有し得、これらアミノ酸残基は、ペプチドと免疫グロブリンフレームワーク領域残基との間に（すなわち、ＣＤＲと、隣接するフレームワークとの間の接合があった場所に位置する。隣接アミノ酸残基は、代表的には、活性ペプチド中に存在しない。好ましい隣接アミノ酸残基が既知である場合、隣接アミノ酸残基は、それらの特定のアミノ酸残基を表示するコドンによってコードされる。しかし、複数のアミノ酸残基を表示するコドン（例えば、ＮＮＫ、ＮＮＹ、ＮＮＲ、ＮＮＳなど）を最初に使用することにより、単に隣接残基が互いに異なるペプチドのコレクションが生成される。隣接アミノ酸残基は、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントにおけるペプチドの提示を決定し得、従って、ペプチドによって示される結合および／または生物学的活性に影響し得る。隣接アミノ酸のこのランダムコレクションは、抗体フレームワーク中にペプチド配列を提示する最良の状況の選択を可能にし、この状況により、標的分子への特異的結合および最適な生物学的活性の明示を生じる。共通ペプチドを有するが異なる隣接アミノ酸残基を有する免疫グロブリンのライブラリーのスクリーニングが、当業者によって公知であり、そして本明細書中に記載されるような結合アッセイ、増殖アッセイ、および活性化アッセイを用いて実施され得る。
【００１１】
ＣＤＲを構成するアミノ酸残基を置換するペプチドは、標的分子に特異的に結合し、かつ抗体フレームワーク中への組み込みによってその有用性が変更され得る任意のペプチドであり得る。このペプチドはまた、比活性（例えば、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性など）を示し得る。特定の実施形態では、ペプチドは、細胞表面レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストである。例えば、細胞表面レセプターは、サイトカイン、増殖因子、または増殖インヒビターに対するものであり得る。
【００１２】
特に有用な実施形態では、ＣＤＲの少なくとも一部をペプチドと置換することにより、アゴニストとして作用する抗体が提供される。ＣＤＲの少なくとも一部を置換するために使用されるペプチドは、それ自体、アゴニスト特性を有し得る。あるいは、ペプチドは（（レセプターに特異的に結合するけれども）アゴニスト活性を示さないものであり得る。むしろ、アゴニスト活性は、ペプチドがＣＤＲの少なくとも一部に対して置換され、従って、操作された抗体中に存在する場合にのみ示され得る。このような実施形態では、ペプチドに隣接するプロリンの存在または不在は、決定的ではないが、いくつかの場合では、好ましいものであり得る。
【００１３】
従って、１つの局面では、本開示は、１つ以上のＣＤＲで挿入された、またはその少なくとも一部の代わりに挿入された少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドを含むように操作された抗体フレームワークを含むアゴニスト抗体を提供する。生物学的に活性なペプチドは、抗体フレームワークへの挿入前に、アゴニスト活性を示しても示さなくてもよい。特定の実施形態では、抗体フレームワークは、互いと二量体化し得る２つのペプチドを含むように操作される。
【００１４】
なお別の局面では、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部に相当するアミノ酸残基が生物学的に活性なペプチドと置換されている領域を含む免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって、それにより、該免疫グロブリン分子またはそのフラグメントがアゴニスト活性を示す、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを提供する。生物学的に活性なペプチドは、抗体フレームワークへの挿入前に、アゴニスト活性を示しても示さなくてもよい。特に有用な実施形態では、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントは、ｃ−ｍｐｌアゴニスト活性を示す。
【００１５】
なお別の局面では、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に挿入された生物学的に活性なペプチドを含む免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって、それにより、該免疫グロブリン分子またはそのフラグメントがアゴニスト活性を示す、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを提供する。
【００１６】
なお別の局面では、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部に相当するアミノ酸残基が生物学的に活性なペプチドと置換されている領域を含む免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって、それにより、該免疫グロブリン分子またはそのフラグメントがｃ−ｍｐｌアゴニスト活性を示す、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを提供する。
【００１７】
さらなる特定の実施形態では、ＣＤＲのアミノ酸を置換するペプチドは、アゴニストＴＰＯ模倣物ペプチドである。１つのこのようなアゴニストペプチドは、少なくとも配列
【００１８】
【化１】

（配列番号１）を有する。ＴＰＯアゴニスト模倣物ペプチドについて、他の配列は可能であり、これらは、当業者によって公知であり、そして本明細書中に記載されるような結合アッセイ、増殖アッセイ、および活性化アッセイを用いて見出され得る。アゴニストＴＰＯ模倣物ペプチドは、ＣＤＲ領域中に位置した場合、ペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端に、免疫グロブリンフレームワーク残基に共有結合されるようになる１つ以上のさらなるアミノ酸残基を有し得る。１つのこのようなＴＰＯ模倣物ペプチドは、さらなるプロリン残基をカルボキシル末端に付加している；
【００１９】
【化２】

（配列番号２）。他の免疫グロブリン分子またはそれらのフラグメントは、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、および４９のアミノ酸配列を含むＴＰＯ模倣物ペプチドによって置換されたＣＤＲ領域を有する（図５を参照のこと）。
【００２０】
ＣＤＲのアミノ酸残基を置換し得る別の生物学的に活性なペプチドは、アゴニストＥＰＯ模倣物ペプチドである。１つのこのようなＥＰＯアゴニストペプチドは、そのアミノ酸配列として、
【００２１】
【化３】

（配列番号３）を有する。ＥＰＯアゴニスト模倣物ペプチドについて、他のアミノ酸配列は可能であり、これらは、当業者によって公知であり、そして本明細書中に記載されるような結合アッセイ、増殖アッセイ、および活性化アッセイを用いて見出され得る。アゴニストＥＰＯ模倣物ペプチドもまた、ＣＤＲ領域中に位置した場合、ペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端に、免疫グロブリンフレームワーク残基に共有結合されるようになる１つ以上のさらなるアミノ酸残基を有し得る。従って、特定の実施形態では、本明細書中に提供されるのは、ＣＤＲ領域をＴＰＯまたはＥＰＯ模倣物ペプチドと置換している免疫グロブリン分子（ＩｇＧ）またはフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、重鎖または軽鎖）である。例えば、ＴＰＯペプチドは、少なくとも配列
【００２２】
【化４】

（配列番号１）を含み得、そして、必要に応じて、即下流の位置に、さらなるプロリンをさらに有し得る。ＥＰＯ模倣物は、少なくとも、配列
【００２３】
【化５】

（配列番号３）を包含する。同様に、それは、必要に応じて、即下流の位置に、さらなるプロリンを有し得る。
【００２４】
本開示に従って、任意の免疫グロブリン分子（抗体）またはそのフラグメントが、おそらく、フレームワークを提供し得、そしてＣＤＲをペプチドと置換し得る。治療用途またはインビボでの診断用途のために、抗体はヒト起源であるか、またはヒト化されることが好ましい（例えば、抗破傷風トキソイド免疫グロブリン）。さらに、ペプチドに結合されるさらなる隣接アミノ酸の存在とは独立して、またはその存在と共に、免疫グロブリンの他の領域（他のＣＤＲ領域（１つまたは複数）および／またはフレームワーク領域）中の１つ以上のアミノ酸残基が、免疫グロブリン分子の背景においてペプチドによって示される結合、活性、および／または発現を改変するように変更され得る。
【００２５】
生物学的に活性な組換え抗体および／またはそれらのフラグメントの構築後、このような組換え体は、抗体の生物学的活性を変更するように配列中の１つ以上の点に変異を導入するために、当該分野で公知のランダム化方法に供され得ることが企図される。ランダム化方法（例えば、本明細書中に開示された方法）を用いるこのような変異の生成後、得られた組換え体は、結合アッセイ、増殖アッセイ、発現アッセイ、および活性化アッセイを用いて、活性についてアッセイされ得る。
【００２６】
さらに、１つ以上のＣＤＲ領域のアミノ酸を生物学的に活性なペプチドによって置換している免疫グロブリン分子またはそれらのフラグメントをコードする核酸分子が提供される。これらの核酸分子は、発現ベクター中に存在し得、このベクターは、これらの分子の発現のために組換え宿主細胞中に導入（トランスフェクト）され得る。また、生物学的に活性なペプチドを含む免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを生成する方法が提供され、この方法は、細胞内に含まれる核酸が発現されるような条件下で、組換え宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００２７】
また、ＣＤＲに相当するアミノ酸残基をＴＰＯまたはＥＰＯ模倣物ペプチドを構成するアミノ酸残基と置換している免疫グロブリン分子またはそのフラグメントと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物が提供される。
【００２８】
さらに、複数のＣＤＲの置換に適したさらなる隣接残基を有するＥＰＯ模倣物ペプチドが提供される。また、これらのペプチドをコードする核酸分子が提供される。
【００２９】
さらに、アゴニスト活性を示すように免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを操作する方法であって、ここで生物学的に活性なペプチドが、軽鎖および／または重鎖の１つ以上のＣＤＲ領域の少なくとも一部を置換する、方法が、提供される。この方法は、生物学的に活性なペプチドをコードする核酸分子を、免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードする核酸分子の少なくともＣＤＲ領域の代わりに挿入する工程あるいは当該分子をネイティブＣＤＲ配列に付加する工程と、次いで免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインをその相補性可変領域ドメインと共にコードする核酸分子を、２つのドメインが会合するように、発現させる工程とを包含する。
【００３０】
さらに、生物学的に活性なＴＰＯまたはＥＰＯペプチドの活性（特性）を示すように免疫グロブリン分子またはそれらのフラグメントを操作する方法であって、ここで生物学的に活性なペプチドが、軽鎖および／または重鎖の１つ以上のＣＤＲ領域を置換する、方法が、提供される。この方法は、生物学的に活性なペプチドをコードする核酸分子を、免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードする核酸分子のＣＤＲ領域の少なくとも一部の代わりに挿入する工程、あるいは当該分子をネイティブＣＤＲ配列に付加する工程と；免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインをその相補性可変領域ドメインと共にコードする核酸分子を、２つの鎖が会合するように、発現させる工程とを包含する。
【００３１】
別の局面では、この開示は、ポリペプチド中で、予め選択された薬剤を結合し得る結合部位を生成するための方法を提供し、この方法は、当該結合部位を規定するアミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド配列を、免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子を構成する核酸のＣＤＲ領域に、免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ領域を増幅することにより導入する工程を包含し、この導入されたヌクレオチド配列は、式−Ｘ_ａ−Ｙ−Ｘ_ｂを有し、ここでＸは、各位置で同じであるかまたは異なり、そしてランダム化トリヌクレオチドを表し、ａとｂとの合計は４以下であり、そしてＹは、当該結合部位の最小認識ドメインをコードするヌクレオチド配列である。特に有用な実施形態では、増幅は、オーバーラップＰＣＲを用いて達成されるが、しかし、例えば、ＷO９４／１８２２１（この開示内容は、参考として本明細書中に援用される）に開示された方法のような任意の公知の増幅技術が用いられ得る。
【００３２】
なお別の局面では、この開示は、所望の活性についてスクリーニングされ得るモノクローナル抗体のライブラリーの作出のための方法を提供する。ライブラリーを作製するこれらの方法は、生物学的に活性なペプチドをコードする核酸分子を、免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードする核酸分子の１つ以上のＣＤＲ領域中に、またはその少なくとも一部の代わりに挿入する工程、挿入された核酸分子のいずれかの側に一対のランダム化トリヌクレオチドまでを提供する工程、およびモノクローナル抗体のライブラリーを発現させる工程を包含する。特に有用な実施形態では、一対のランダム化トリヌクレオチドが、挿入された核酸分子の両側に提供される。このようにして生成されたモノクローナル抗体のライブラリーは、次いで、所望の活性についてスクリーニングされ得る。
【００３３】
特定の実施形態では、抗体またはそれらのフラグメントが、アミノ末端およびカルボキシル末端に、ペプチドに隣接する異なるアミノ酸を有し、そこで、ペプチドが抗体足場に結合されるようになる。これは、ペプチドの提示において異なり得る抗体分子またはそれらのフラグメントの集団を生じる。集団は、ペプチドの生物学的活性を示す抗体についてスクリーニングされる。好ましい実施形態では、ペプチドに即隣接するアミノ酸は、プロリンである。
【００３４】
生物学的に活性なペプチドの活性が、標的分子を活性化することである場合、これは、２つの標的分子（例えば、造血性スーパーファミリー中のレセプター）の二量体化を必要とし得る。二量体化が生じる場合、２つのペプチドが、その各々が標的分子を結合し、次いでこれら２つの結合された標的分子が適切に会合し得るように位置されなければならない。これは、２つのペプチドを同じ抗体またはそのフラグメント上に存在させることにより、または各々が１つのペプチドを含む２つの抗体分子を一緒に結合するようにすることにより、成し遂げられ得る。従って、例えば、１つのペプチドが、ＣＤＲの少なくとも一部に挿入され得るか、またはその代わりに置換され得、次いで免疫グロブリンまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントとして発現され得る。別の例として、２つのペプチドが、１つ以上のＣＤＲの少なくとも一部に挿入され得るか、またはその代わりに置換され得、次いで任意の抗体または抗体フラグメントとして発現され得る。
【００３５】
抗体またはそれらのフラグメントのスクリーニングは、ペプチドが特異的に結合する表面分子を有する細胞でのパンニングによって成し遂げられ得る。精製標的分子またはそれらのフラグメントを用いる固相結合もまた、使用され得る。結合はまた、標識された標的分子を用いて溶液中で実施され得る。さらに、抗体またはそれらのフラグメントが、ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト活性について生物学的アッセイの使用によりスクリーニングされ得る。
【００３６】
また、異なる免疫グロブリン分子またはそれらのフラグメントのライブラリーであって、ここで相補性決定領域（ＣＤＲ）に相当するアミノ酸残基が、アミノ末端またはカルボキシル末端に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を有する生物学的に活性なペプチドを構成するアミノ酸残基と置換されており、そして当該免疫グロブリン分子またはそれらのフラグメントが、ペプチドのさらなるアミノ酸残基によって異なる、ライブラリーが提供される。
【００３７】
特定の実施形態では、生物学的に活性なペプチドは、ＴＰＯ模倣物またはＥＰＯ模倣物である。ライブラリーの抗体は、ファージ上に提示される。
【００３８】
さらに、細胞の増殖、分化、または成長を刺激する方法が提供され、この方法は、１つ以上のＣＤＲを、細胞表面上のレセプターに結合する生物学的に活性なペプチドと置換している免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの有効量と、細胞を接触させる工程を包含する。特定の実施形態では、生物学的に活性なペプチドは、ＴＰＯ模倣物またはＥＰＯ模倣物である。
【００３９】
他の特定の実施形態では、巨核球系細胞の増殖、分化、または成長を刺激する方法が提供され、この方法は、１つ以上のＣＤＲをＴＰＯ模倣物ペプチドと置換している免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの有効量と、巨核球系細胞を接触させる工程による。また、血小板生成を増大させる方法が提供され、この方法は、１つ以上のＣＤＲを、ＴＰＯ模倣物ペプチドと置換している免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの有効量と、巨核球系細胞を接触させる工程を包含する。また、患者において巨核球系細胞を刺激および／または血小板生成を増大する方法が提供され、ここでは、１つ以上のＣＤＲをＴＰＯ模倣物ペプチドと置換している免疫グロブリンまたはそのフラグメントの有効量が、その必要のある患者に投与される。また、免疫グロブリン分子と巨核球系細胞とは、インビトロで接触され得、そして得られた細胞が患者に導入され得る。さらに、少なくとも１つのＴＰＯ模倣物ペプチドをその中に組み込んだ抗体またはそのフラグメントが、血小板を提供する意図のある被験体に投与され得、このようにして、このような血小板のより多くのげっ歯類供給源を提供するように、血小板を生成するドナーの能力を増大させる。
【００４０】
また、本明細書中に、造血性細胞の増殖、分化、または成長を刺激する方法が提供され、この方法は、１つ以上のＣＤＲをＥＰＯ模倣物ペプチドと置換している免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの有効量と、当該細胞を接触させる工程を包含する。
【００４１】
また、本明細書中で、ホモ二量体レセプタータンパク質を活性化する方法が具体化され、この方法は、二量体化されているレセプターを特異的に結合する生物学的に活性なペプチドとＣＤＲ領域を置換している免疫グロブリン分子またはそのフラグメントと、当該レセプターを接触させることによる。さらなる実施形態では、レセプターは、トロンボポイエチンレセプターである。
【００４２】
（詳細な説明）
本明細書中で使用される「免疫グロブリン」は、完全免疫グロブリン分子、または全免疫グロブリン分子の免疫活性部分を含む分子をいい、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ３）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。免疫グロブリンおよび抗体との用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００４３】
有用な特性を示す任意のペプチドが、抗体フレームワークにおける挿入に適している。ペプチドの活性および用途としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：レセプターの結合、膜結合表面分子の結合、リガンドの結合、酵素または構造タンパク質の結合、レセプターの活性化または阻害、標的化薬物送達、または任意の酵素活性。免疫グロブリン分子の背景で提示された場合にそれらに付与される増強された安定性から、その有用性が増大され得るペプチドが、通常、選択される。本明細書中で使用される「生物学的活性」は、生物系における活性を有する分子に付随した任意の活性を含むことが理解されるべきであり、このような活性としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質−タンパク質相互作用により引き起こされる刺激または阻害活性、ならびにタンパク質−タンパク質複合体の安定性を含むこのような相互作用を取り囲む速度論。本明細書中における「生物学的活性」の増強または増大は、全活性の増大または全活性の任意成分の増大を含むことが意味される。ペプチドは、抗体フレームワークへの挿入前に１つの生物学的活性（例えば、単に標的への結合、のような）を示し得、そして抗体フレームワークへの挿入後に異なるまたは増強された生物学的活性（例えば、アゴニスト活性、のような）を示し得ることが理解されるべきである。
【００４４】
免疫グロブリンの背景で提示されることによって利益を有し得る多くのペプチドが、同定されており、そして当業者に公知である（例えば、ＥＰＯ模倣物ペプチドおよびＴＰＯ模倣物ペプチド）。他の例は、リガンド誘導性ホモ二量体化によって活性化されるレセプターに結合するペプチド（Ｇ−ＣＳＦ活性、ＧＨＲ活性、およびプロラクチン活性を示す活性フラグメントを含む）（ＷｈｉｔｔｙおよびＢｏｒｙｓｅｎｋｏ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．，（１９９９）Ａｐｒ ６（４）：Ｒ１０７−１８に記載されるような）を含み；適切なペプチドの他の例は、ＣＤループからの神経増殖因子模倣物（Ｚａｃｃａｒｏら，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０００）４３（１９）；３５３０−４０らに記載されるような）； ＩＬ−２模倣物（Ｅｃｋｅｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５（８）：４３１２−８に記載されるような）；グルカゴン様ペプチド−１（Ｅｖａｎｓら，Ｄｒｕｇｓ Ｒ．Ｄ．（１９９９）２（２）：７５−９４に記載されるような）；テトラペプチドＩ（Ｄ−リジン−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−チロシン）（これは、マイトジェン活性化Ｂ細胞増殖を刺激する）（Ｇａｇｎｏｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１８（１８）：１８８６−９２に記載されるような）を含む。レセプターアンタゴニスト活性を示すペプチドもまた企図される。例えば、ＨＩＶ治療のためのＣＸＣＲ４のアンタゴニストとしてのｖＭＩＰ−ＩＩのＮ末端ペプチド（Ｌｕｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９（４４）：１３５４５−５０に記載されるような）；抗血栓治療のためのトロンビンレセプターのアンタゴニストペプチドリガンド（ＡＦＬＡＲＡＡ）（Ｐａｋａｌａら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．（２０００）１００（１）：８９−９６に記載されるような）； 麻酔薬に対する耐薬性を減少させるためのペプチドＣＧＲＰレセプターアンタゴニストＣＧＲＰ（８−３７）（Ｐｏｗｅｌｌら，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０００）１３１（５）：８７５−８４に記載されるような）；漏斗隆起路ペプチド（ｔｕｂｅｒｏｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌａｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）（７−３９）として知られる副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）−１レセプターアンタゴニスト（Ｈｏａｒｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２０００）２９５（２）：７６１−７０に記載されるような）；オピオイド増殖因子（Ｚａｇｏｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．（２０００）１７（５）：１０５３−６１に記載されるような）；高アフィニティーＩ型インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（Ｙａｎｏｆｓｋｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．７３８１−７３８６，Ｊｕｌｙ １９９６およびＶｉｇｅｒｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ ２７５，Ｎｏ ４７，３６９２７−３６９３３頁，２０００に開示されるような）；および酸性線維芽細胞増殖因子結合ペプチド（Ｆａｎら，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ（２０００）４９（６）５４５−４８に記載されるような）を含む。ペプチドはまた、当業者に周知の方法を用いて発見され得る。特定の生物学的機能に関与するタンパク質の領域を同定するために、そのタンパク質を構成する、より短いペプチドフラグメントを調べることにより、原因となる線状ペプチドエピトープを明らかにし得る。あるいは、ランダムペプチドのライブラリーを調べることにより、天然タンパク質の活性を模倣する最適な線状エピトープまたは不連続エピトープを表すペプチドが、発見され得る。選択のための１つの方法は、ペプチドファージディスプレイと呼ばれる。このアプローチにおいて、ペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上に提示されるように、ランダムペプチドエピトープライブラリーが生成される。これらのペプチドのコレクションまたはライブラリーは、次いで、特定の固定化標的タンパク質に結合し得るものについて調べられ得る（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．ら，ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３０，１９９５，１１８９−１１９６；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｎ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，１９９６，４５８−４６３頁；Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，１９９７，１６９６−１６９９頁；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２６８，１９９３，２０２０５−２０２１０頁；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌ．，１３，１９９５，２６５−２７０頁；Ｈｅａｌｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，１９９５，３９４８−３９５５頁；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３０，１９９５，１１８９−１１９６頁）。細胞表面ディスプレイおよびリボソームディスプレイを含む、代替のペプチド選択システムもまた、可能である。
【００４５】
この記載に従って使用されるペプチド模倣物は、一般には、ＣＤＲ領域を構成するアミノ酸残基の数より少ないか、または等しいが、より長いこともあり得る。
【００４６】
任意の抗体が、足場配列として働き得るが、しかし、代表的には、ヒト抗体が、ヒト治療薬が最終的な目的の１つであるので選択される。ヒトまたはヒト化抗体は、ヒト患者において不利な免疫応答を引き起こす可能性がより少ない。ペプチドの挿入のためのフレームワークとして働く抗体を選択する際の主要な基準は、抗体の１つ以上のＣＤＲをペプチドと置換することが、抗原特異性を変化しなければならないことである。抗体は、完全抗体またはＦａｂ、ｓｃＦｖもしくはＦ（ａｂ’）_２フラグメントまたはそれらの部分であり得る。
あるいは、抗体のライブラリーは、１つ以上の重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲを所望のペプチドと置換させているものであり得る。得られたライブラリーは、次いで、所望の活性を有する抗体を同定するためにスクリーニングされ得る。抗体ライブラリーを生成するために、置換されたペプチド内のランダム化もまた提供され得ることが理解されるべきである。
【００４７】
有用な抗体は、抗破傷風トキソイド（ＴＴ）Ｆａｂである。これはヒト抗体であり、そしてＨＣＤＲ３の改変が、抗体の抗原特異性を変更するのに十分であるからである（Ｂａｒｂａｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，１９９４，２１６１−２１６２頁およびＢａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１９９５，２５２９−２５３３頁）。
【００４８】
抗体のＣＤＲ（１つまたは複数）をペプチド配列と置換するように、選択したペプチドのＤＮＡ配列を抗体中にグラフト化することは、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて実施される。
【００４９】
ＣＤＲ領域の代わりに生物学的活性を有する所望のペプチドをグラフト化するために使用され得る方法の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣＲオーバーラップ、制限酵素部位クローニング、部位特異的変異誘発、および完全合成手段。オーバーラップＰＣＲを包含する技術の説明については、例えば、本明細書中の実施例１を参照のこと。部位特異的変異誘発は、いくつかの方法で成し遂げられ得る。１つは、ｄｕｔ／ｕｎｇ Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発に基づく（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８５）ｖｏｌ．８２，ｐｐ．４８８−９２）。この方法論に基づくＭｕｔａ−Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットは、ＢｉｏＲａｄから入手可能である（ｃａｔ．＃１７０−３５８１または１７０−３５８０）。ＰＣＲ増幅ベースのいくつかの変異誘発アプローチもまた、市販によって入手可能である（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＫｉｔおよびＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）。別の非ＰＣＲ方法は、ＰｒｏｍｅｇａからＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍとして入手可能である。完全合成手段もまた周知であり、そして例えば、Ｄｅｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）５１：３２９−４２；Ｋｕｔｅｍｅｌｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９４）１７（２）：２４２−２４６；Ｓｈｉら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，（１９９３）３（１）：４６−５３ならびにＫｎｕｐｐｉｋら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（２０００）１１：２９６（１）：５７１−８６（その各々は本明細書中に参考として援用される）に記載される。さらに、少なくとも１つのＣＤＲ配列の全てまたは一部を置換するために使用される上記方法は、本来のＣＤＲ配列を置換することなく、少なくとも１つのネイティブＣＤＲ配列中にまたはそれに隣接して、所望のペプチドをグラフト化するために使用され得る。このようにして、ＣＤＲ／生物学的活性ペプチド模倣物融合構築物が、形成される。
【００５０】
生物学的に活性なペプチドのカルボキシル末端および／またはアミノ末端に、隣接配列が付加され得ることが企図される。隣接配列は、生物学的活性に必要なコンフォメーションをより容易にとらせるように、グラフト化ペプチドにおける構造拘束を減少するために有用であり得る。好ましい実施形態では、プロリンを含む隣接領域が、生物学的に活性なペプチドのカルボキシ末端に共有結合されて、プロリン伸長された生物学的に活性なペプチドを作出する。
【００５１】
１つの実施形態では、隣接領域は、最良配列を決定するために、ペプチドグラフトの各側で２つのアミノ酸位置をランダム化することにより生成され得る。このようにして、複数の種々の配列を有するメンバーを有するライブラリーが生成され得る。得られた構築物は、次いで、例えば、パンニング技術によって、以下に記載するように、生物学的活性について試験される。特定位置でランダムなアミノ酸を有する組換えタンパク質が生成され得る。これは、コードするＤＮＡを改変することにより成し遂げられ得る。特定のアミノ酸のコドン位置にランダム化を導入する場合、２０の全てのアミノ酸をカバーし、かつコードされる停止コドンの数を最小限にするために、好ましいデオキシリボヌクレオチド「ドーピングストラテジー（ｄｏｐｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ）」は、（ＮＮＫ）_ｘである。従って、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴであり得（名目上、等モル）、Ｋは、ＧまたはＴであり（名目上、等モル）、そしてｘは、代表的には、約５、６、７、または８以上までであり、それにより、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、クァドラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、およびオクタペプチドまたはそれより大きなペプチドのライブラリーを生じる。三番目の位置はまた、ＧまたはＣであり得、これは、「Ｓ」と称される。従って、ＮＮＫまたはＮＮＳは、（ｉ）全てのアミノ酸をコードし、（ｉｉ）１つのみの停止コドンをコードし、そして（ｉｉｉ）６：１から３：１までにコドン偏りの範囲を減少する。ＮＮＫモチーフから生じる３２の可能なコドンが存在する：１２アミノ酸の各々に付き１つ、５アミノ酸の各々に付き２つ、３アミノ酸の各々に付き３つ、そして３つの停止コドンのうちの１つのみ。他の代替には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
（ＮＮＮ）_ｘ（これは、全ての可能なアミノ酸および全ての停止を提供する）；
（ＮＮＹ）_ｘは、全ての停止を排除し、そしてなお２０アミノ酸のうち１４をカバーする；
（ＮＮＲ）_ｘは、２０アミノ酸のうち１４をカバーする；および
（ＮＮＳ）_ｘは、２０の全てのアミノ酸およびたった１つの停止をカバーする。
【００５２】
コドン中の三番目のヌクレオチド位置は、公知の縮重混合物のいずれかを用いて慣用操作され得る。しかし、ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＮＹ、ＮＮＲ、ＮＮＳのグループは、最も一般的に使用されるドーピングストラテジーおよび本明細書中で使用されるストラテジーをカバーする。
【００５３】
このプロセスの間に作出される操作抗体のコレクションは、本質的に以下に記載されるように、例えば、ファージディスプレイ抗体として、ペプチドの特性を示ものについて調べられ得る（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，ＩＩＩ、Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．，Ｌｅｒｎｅｒ Ｒ．Ａ．，およびＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．，Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｐｈａｇｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ：ｔｈｅ ｇｅｎｅ ＩＩＩ ｓｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１９９１，７９７８−７９８２頁（参考として本明細書中に援用される））。この技術は、組換え抗体（完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、またはｓｃＦｖとして）を繊維状バクテリオファージの表面上に発現させる。その同じファージが、その中に、その特異的抗体をコードする遺伝子を有する。
【００５４】
配列中にランダム化を導入するための任意の他の公知の方法が本明細書中で使用され得ることが企図される。例えば、誤りがちなＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）は、核酸配列中にランダム変異を導入し得る（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，（１９９２）２２６（３）：８８９−９６を参照のこと）。簡潔には、ＰＣＲは、複製忠実度を妥協する条件下で実施され、従って、当業者が完遂するにつれて配列中にランダム変異を導入する。このようなランダム変異体の生成後、それらは、ファージディスプレイフォーマットに配され得、パンニングされ得、そして従って、活性について評価され得る。同様に、遺伝子のランダム変異を提供することが知られる特定の細菌（例えば、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｔｉ（登録商標）ＸＬ１−Ｒｅｄ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．から市販されている）が、ランダム変異体を提供するように使用され得、次いで、本開示に従って生物学的活性についてスクリーニングされる。
【００５５】
抗体の全生物学的活性を変化させるために、抗体またはそれらのフラグメントへの活性ペプチドの組み込み後に、ヌクレオチド配列中の任意の点でランダム化が導入され得ることもまた、企図される。このようにして、ペプチドの配列内に変異をもたらすことによってペプチド模倣物の生物学的活性において変化が生じられ得るだけでなく、周囲足場において変異が組み込まれ、得られた構築物は、生物学的活性または発現における変化についてアッセイされる。確かに、このようなランダム化から生じる複数の構築物のレパートリーを有するライブラリーが生成され、そしてアッセイされ得ることが企図される。
【００５６】
単鎖ライブラリーが、本開示に従って利用され得る。なぜなら、結合ドメイン全体が、１つのポリペプチド上に含まれるからである。軽鎖可変領域は、重鎖可変領域とは、リンカー領域によって分離されている。短いリンカー（＜１１アミノ酸）の使用は、１つのＳｃＦｖのＶ_Ｈが別のＳｃＦｖ分子のＶ_Ｌと会合する（およびその反対）二量体複合体に好ましく、これらの分子は、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）と呼ばれる（Ｋｏｒｔｔ，Ａ．Ａ．，Ｍａｌｋｙ，Ｒ．Ｌ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂ．，Ｇｒｕｅｎ，Ｌ．Ｃ．，Ｉｖａｎｃｉ，Ｎ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１：１５１−１５７，１９９４）。これは、単量体ＳｃＦｖの折り畳みが１１アミノ酸未満のリンカーによって損なわれるからである（Ａｌｆｔｈａｎ，Ｋ．，Ｔａｋｋｉｎｅｎ，Ｋ．，Ｓｉｚｍａｎ，Ｄ．，Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ，Ｈ．，およびＴｅｅｒｉ，Ｔ．Ｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｅｎｇ．８：７２５−７３１，１９９５）。より長いリンカー（＞１１アミノ酸）は、単鎖抗原結合ドメインへの単量体ＳｃＦｖの折り畳みに好ましく、これにより、二量体の形成を避ける。
【００５７】
１つの有用なファージディスプレイベクターは、ｐＲＬ４であり、これはまた、ｐＣｏｍｂ ３Ｘとしても公知である（図１を参照のこと）。このベクターは、パッケージングされたファージミド粒子の表面上のキメラ発現産物の提示を可能にする。ｐＲＬ４は、ｐＣｏｍｂ３Ｈの改変バージョンである（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ＩＩＩおよびＢｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．１９９４．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ＩＩＩ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０，１９９４；Ｌａｎｇ，Ｉ．Ｍ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｌ．，Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．３ｒｄ，Ｓｃｈｌｅｅｆ，Ｒ．Ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０１２６−３０１３５，１９９６；ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ，Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００））。以下に記載するように、ｐＲＬ４の設計は、ファージ表面上における、および可溶性形態でのｓｃＦｖ抗原結合ドメインの二量体化を可能にする。プラスミドが、ｓｕｐＥ細菌宿主（例えば、ＥＲ２５３７（Ｆ’Ｓｕｐ Ｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））に形質転換される場合、アンバー変異は、その時の約５０パーセントを抑制される。このように、発現されたｓｃＦｖの半分は、繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質（アミノ酸２３０−４０６）と融合され、そして他の半分が、遺伝子ＩＩＩのちょうど前で終結され、可溶性ｓｃＦｖを生成する。ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合物および可溶性ｓｃＦｖ産物はともに、Ｏｍｐ Ａシグナル配列を有し、そしてペリプラズムに輸送され、そこでは、それらが二量体ｓｃＦｖ複合体（ディアボディと呼ばれる）を形成し得る（Ｋｏｒｔｔ，Ａ．Ａ．，Ｍａｌｂｙ，Ｒ．Ｌ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂ．，Ｇｒｕｅｎ，Ｌ．Ｃ．，Ｉｖａｎｃｉ，Ｎ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１：１５１−１５７，１９９４）。ディアボディは、１つのｓｃＦｖのＶ_Ｈが第二のｓｃＦｖ−ｐＩＩＩのＶ_Ｌと対合して、二価抗体フラグメントを生じるように折り畳まれることが期待される。非ｓｕｐ Ｅ宿主（例えば、ＴＯＰ１０Ｆ’（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），）では、アンバー停止コドンが認識されて、可溶性ｓｃＦｖディアボディを生じる。
【００５８】
ｐＲＬ４における最終単鎖発現構築物においては、単鎖抗体フラグメントが、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺプロモーター、リボソーム結合部位、およびｏｍｐ Ａリーダー配列の下流にクローニングされる。これらのエレメントは、サプレッサー株ＥＲ２５３７で発現された場合、ＩＰＴＧによる発現の誘導およびｏｍｐ Ａリーダー配列を介する細胞からの分泌を可能にする。単鎖フラグメントは、繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）配列（アミノ酸２３０−４０６）とインフレームに融合される。ｇＩＩＩタンパク質産物ｐＩＩＩは、感染性に必要なマイナーコートタンパク質である。ＩＰＴＧによるプロモーター誘導に際して、単鎖抗体−ｐＩＩＩ融合物が合成され、そして細菌周辺腔に輸送される。周辺腔では、ｓｃＦｖ−遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質が膜中に挿入される。ヘルパーファージによる重感染に際して、これらのフラグメントは、ｐＩＩＩ−抗体フラグメントとしてファージの表面上で細胞から排出される。ファージミドの表面上の融合のために使用される他の可能なタンパク質には、繊維状コートタンパク質ｐＶＩＩＩおよび他のコートタンパク質が含まれる。
【００５９】
ネイティブ抗原結合部位を維持するＦａｂフラグメントライブラリーは、アフィニティーが維持されることを確実にするために有用である。
【００６０】
ｐＲＬ４中の最終ハイブリッドＦａｂ発現構築物では、軽鎖と重鎖とが、単一のＳｆｉｌフラグメントとしてクローニングされる。このように、軽鎖フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺプロモーター、リボソーム結合部位、およびｏｍｐ Ａリーダー配列の下流にクローニングされる。これらのエレメントは、ＩＰＴＧによる発現の誘導およびｏｍｐ Ａ リーダー配列を介する細胞からの分泌を可能にする。軽鎖フラグメントの後に、停止コドン、第二のリボソーム結合部位、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｅｌ Ｂリーダー配列、および重鎖が続く。ハイブリッド重鎖遺伝子は、繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）配列（アミノ酸２３０−４０６）とインフレームに融合される。アンバー停止コドンは、融合接合部に存在する。ｓｕｐ Ｅ細菌宿主（例えば、ＥＲ２３５７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））では、アンバー変異は抑制される。プロモーター誘導の際に、１つの多シストロン性メッセージが転写され、そして２つのポリペプチド、軽鎖および重鎖−遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質として翻訳される。合成後、これらポリペプチドは、リーダー配列によって導かれるように、細菌周辺腔に輸送される。周辺腔では、重鎖−ｐＩＩＩ融合タンパク質が膜中に挿入され、そして軽鎖と重鎖とが、ジスルフィド結合による共有結合で会合されて、抗原結合部位を形成する。ヒト定常領域ＣＨ１およびＣ_Ｌ配列は、システインを含み、これらは、重鎖と軽鎖との間にジスルフィド結合を形成する。ヘルパーファージによる重感染に際して、これらのフラグメントは、Ｆａｂ−ｃｐＩＩＩ融合物としてファージの表面上で細胞から排出される。非ｓｕｐ Ｅ宿主（例えば、ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））では、アンバー停止コドンが認識され、可溶性Ｆａｂフラグメントを生じる。使用されるｐＲＬ４ファージディスプレイシステムの重要な特徴は、精製Ｈｉｓ ６タグ、重鎖の後ろのＨＡエピトープタグ、ならびに抑制性アンバー停止コドン（重鎖とファージ遺伝子ＩＩＩとの間に位置する）を含む。ＨＡタグは、ＨＡ．１１抗体（Ｂａｂｃｏ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）および１２ＣＡ５抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）によって認識される。Ｈｉｓ６タグは、ニッケル−キレートクロマトグラフ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）による抗体フラグメントのアフィニティー精製を可能にする。アンバー停止は、停止が抑制された場合の融合Ｆａｂ−ｃｐＩＩＩ産物（ファージコートにおける取り込み用）から、非サプレッサー細菌宿主において作製される可溶性Ｆａｂへの迅速な変換を可能にする。
【００６１】
選択は、ライブラリーから、ペプチド標的分子に特異的に結合し、かつ生物学的活性を示す最良候補物を単離することを包含する。
【００６２】
表面上で抗体フラグメントを発現するファージは、ライブラリーの全てのメンバーが標的分子に結合するようにされ得るように生成および濃縮され得る。標的分子は、マイクロタイター皿、全細胞、全細胞の膜上に固定化され得るか、溶液中に存在し得る。非特異的Ａｂ−ファージは洗い流され、そして結合ファージ粒子が抗原から放出される（しばしば低ｐＨの使用により）。回収されたＡｂファージは感染性であり、そして細菌宿主中で増幅され得る。代表的には、この種の選択は、多数ラウンドで実施される。個々の抗体フラグメントクローンは、次いで、標的分子を特異的に認識するものの同定のために、可溶性ＦａｂまたはｓｃＦｖとして分析され得る。
【００６３】
任意の選択ストラテジーの前に、初期ライブラリーが宿主細胞（例えば、ＥＲ２５３７）中にエレクトロポレートされる。ライブラリー培養物は、対数期まで増殖され、そしてヘルパーファージ（例えば、ＶＣＳＭ１３、市販のヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））で重感染される。重感染は、プラスミドをファージミド粒子にパッケージングするのに必要とされる残りのファージ成分を提供する。あるいは、ヘルパーファージの使用のないファージディスプレイが利用され得る。終夜増殖後、培養物上清（ｓｕｐｅｒｎａｔｅ）中のファージミドが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈殿される。ＰＥＧ沈殿ファージが、非特異的結合剤から特異的結合抗体を精製するために、パンニング（固相細胞表面、インターナリゼーション、および膜）、ＦＡＣＳ選別、または磁気選別において使用される。
【００６４】
細胞ベースパンニングでは、抗体ファージライブラリーが、標的細胞とインキュベートされ、そして非接着ファージが、多数回の洗浄によって除去される。代表的なパンニングプロトコルは、以下の通りである：
１．ファージ粒子をＰＢＳ＋１％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳ＋４％粉乳＋ＮａＮ_３でブロックする（インターナライズされた抗体がアッセイされる場合を除く）。
【００６５】
２．ブロックされたファージに標的細胞を添加する（およそ５×１０^６細胞）。
【００６６】
３．混合し、そして４℃または３７℃でゆっくりと旋回する。
【００６７】
４．１ｍｌ氷冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／ＮａＮ_３または室温ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／ＮａＮ_３で細胞を２回洗浄する。
【００６８】
５．細胞に結合された特異的抗体ファージを、低ｐＨによって（例えば、７６ｍＭクエン酸ｐｈ ２．５（ＰＢＳ中）を用いて）、室温で５〜１０分間溶出し得る。
【００６９】
６．溶出ファージを１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ ７．４で中和する。
【００７０】
７．中和後、抗体ファージを、ＥＲ２５３７細菌を感染し、次ラウンドのパンニングのために終夜増殖の間で増殖するために使用し得る。
【００７１】
一般に、各ライブラリーにおいて、３〜４ラウンドのパンニングが実施される。市販の二次抗体（ヒツジ抗Ｍ１３抗体−ＨＲＰ）を用いるファージＥＬＩＳＡまたは市販のＨＡ．１１抗体（Ｂａｂｃｏ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）（ＰＲＬ４配列から各抗体に組み込まれたＨＡタグを認識する）を用いる可溶性抗体ＥＬＩＳＡが、各ラウンドのパンニング後に実施されて、非結合剤に対する結合抗体の富化の評価を可能にし得る。最終ラウンドのパンニング後、抗体ファージは、寒天プレートからシングルコロニーとして釣り上げられ得、モノクローナル抗体−ファージとして増殖されえ、そして特異的結合剤の同定のためにＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ得る。ＦＡＣＳ分析もまた利用され得る。詳細には、抗体ファージをＴｏｐ１０Ｆ’細菌に感染し、そしてシングルコロニーについてプレートする。シングルコロニーを寒天プレートから釣り上げ、増殖し、そしてＩＰＴＧを用いて誘導する。可溶性抗体を、特異的結合剤の同定のために、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。スクリーニングは、生存細胞、インタクトな穏やかに固定された標的細胞、または組換えタンパク質（１つまたは複数）に対してなされ得る。
【００７２】
全細胞パンニングのための方法が、以前に記載されている（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｄ．Ｌ．，Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｌ．，およびＢｕｎｙａ，Ｖ．Ｙ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０６：７３−８５（本明細書中に参考として援用される））。適用され得る他の選択技術は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）を含む。ライブラリーを用いる選択のための代替法には、リボソームディスプレイおよび標識抗原に対するプラークハイブリダイゼーションが含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
高アフィニティー抗体結合剤を単離するパンニングの後、アゴニスト抗体の機能的スクリーンのためのバイオアッセイが実施され得る。二量体化は、しばしば、多くのレセプターの活性化に不可欠であり、従って、バイオアッセイは、二量体化の促進を介してレセプターを刺激するアゴニスト抗体に集中する。以前に記載されるように、リンカー設計において、単鎖多価がアプローチされている。Ｆａｂフラグメント多価は、多数の方法でアプローチされ得る。文献における多数の近年の報告は、ファージディスプレイに適用可能な二量体抗体フラグメント形成の成功を示している（ＤｅＫｒｕｉｆ，Ｊ．，およびＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｔ．１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−７６３４，Ｐａｃｋ，Ｐ．，およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．１９９２．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９−１５８４，ならびにＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．１９９３．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：４４６−４４９）。二価Ｆａｂは、少なくとも２つの方法で作出され得る。１つのアプローチでは、二量体化は、ｐＲＬ４への二量体化ドメインの付加により達成され、ｐＲＬ８を形成する（図６Ａ−Ｃ、７および８を参照のこと）。Ｆａｂフラグメントの多価を得るために、これらのベクターにおいて利用され得る多数の二量体化ドメイン（ｌｅｘＡ、Ｚｎフィンガー、ｆｏｓ、ｊｕｎなど）が存在する。二量体化ドメインは、以下から選択されるが、これらに限定されない：ｊｕｎ（ＤｅＫｒｕｉｆ，Ｊ．およびＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−７６３４，１９９６；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．，Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｓ．，およびＴｓｏ，Ｊ．Ｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３，１９９２）、ＬｅｘＡ二量体化領域（Ｋｉｍ，Ｂ．およびＬｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：２０３−２０６，１９９２），酵母ＧＣＮ４二量体化ドメイン（ｖａｎ Ｈｅｅｃｋｅｒｅｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３７２１−３７２４，１９９２）、バクテリオファージＭｕ由来Ｇｉｎインバルターゼ（Ｓｐａｅｎｙ−Ｄｅｋｋｉｎｇ，Ｌ．，Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒ，Ｅ．，Ｆｒａｎｋｅｎ，Ｋ．，ｖａｎ ｄｅ Ｐｕｔｔｅ，Ｐ．，Ｇｏｏｓｅｎ，Ｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３４：１７７９−１７８６，１９９５）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＴＲＣタンパク質二量体化ドメイン（Ｋｌｏｓｅ，Ｋ．Ｅ．，Ｎｏｒｔｈ，Ａ．Ｋ．，Ｓｔｅｄｍａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｕｓｔｕ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４１：２３３−２４５，１９９４）、およびＨＳＶ−１ ＩＣＰ４二量体化ドメイン（Ｇａｌｌｉｎａｒｉ，Ｐ．，Ｗｉｅｂａｕｅｒ，Ｋ．，Ｎａｒｄｉ，Ｍ．Ｃ．，Ｊｉｒｉｃｎｙ，Ｊ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３８０９−３８２０，１９９４）（これらの全てが参考として援用される）。また、ｔｈｅｒｍｕｓ生物由来の高温二量体ドメインが利用され得る（ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｇ．，Ｋａｓｔ，Ｐ．，Ｈｉｌｖｅｒｔ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１０００６２−７３，１９９８ならびにＭａｃＢｅａｔｈ，Ｇ．，Ｋａｓｔ，Ｐ．，Ｈｉｌｖｅｒｔ，Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：１９５８−６１，１９９８）。これらは、分子に組み込まれた場合に二量体化が生じることを可能にする機能的ドメインである。さらに、二量体化は、全ＩｇＧベクター、または二量体化ドメイン（例えば、ＣＨ３二量体化ドメイン）の使用によって細胞中で達成され得る。当業者は、これらの二量体化ドメインおよび他の二量体化ドメイン、およびタンパク質を二量体化するそれらの使用について精通している。
【００７４】
少なくとも２つの結合部位を含む抗体構築物を生成するために利用され得るさらなる方法が公知である。これらのアプローチの各々によって作出される抗体または抗体フラグメントは、哺乳動物細胞において生成される全ＩｇＧについて以下の実施例１において記載するように、アゴニスト抗体活性を試験するために利用され得る。これらの方法は、Ｆａｂの化学二量体化、ＦａｂのＰＥＧ化、Ｆａｂ’２の生成、細菌細胞における全ＩｇＧの生成、およびディアボディ（ｓｃＦｖ）の使用を含む。重要なことに、アゴニスト活性の分析のために生成された抗体形態のいずれもが、最終治療製品として使用され得る。
【００７５】
化学二量体化はまた、種々の化学架橋試薬を用いて達成され得る。例えば、ＳＭＣＣ（スクシンイミジルトランス−４（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキレート）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）から、Ｃａｔ＃Ｓ−１５３４）。この試薬は、抗体中の一級アミノ基を改変する。室温で抗体をＳＭＣＣとインキュベートした後、この反応物は、ＰＤ−１０カラムに流される。このマレイミド誘導体化Ｆａｂは、ＴＣＥＰ［（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ヒドロクロライド）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔ＃Ｔ−２５５６］で処理されてチオール基がＳＨに還元された第二のＦａｂまたは別のバッチの同じＦａｂのいずれかに、添加され得る。還元反応は、１５分間、暗所で実施される。マレイミドＦａｂとチオール還元Ｆａｂとの結合体化は、１：１比で生じる。ダイマーは、セファデックス２００ゲル濾過カラムにこの反応物を通すことにより単離される。当業者に公知の他の化学リンカーは、二量体化のために使用され得る。ヒンジ領域に１つ余分なシステイン残基を有するように操作されたＦａｂ’の生成が、例えば、以下に記載されている：米国特許５，６７７，４２５およびＣａｒｔｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １０，Ｆｅｂ．１９９２，１６３−１６７頁（これらの開示内容は、本明細書によって、参考として援用される）。そのチオール部位は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような部分への結合体化のために使用され得る。ＰＥＧ化技術は、公知である。例えば、Ｋｏｕｍｅｎｉｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（２０００）１９８（１）：８３−９５（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。これは、ＰＥＧカップリングを用いて２つのＦａｂ’分子を一緒に連結することを可能にする。
【００７６】
Ｆａｂ’２を細菌生成するための技術は、さらなるシステインを含むＦｄの一部として、ヒトＩｇＧヒンジ領域、および必要に応じて ＣＨ２の一部をクローニングすることを包含し、そして例えば、Ｂｅｔｔｅｒら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９３）９０（２）：４５７−６１（本明細書中に参考として援用される）に記載される。Ｆｄヒンジ上のさらなるチオール基が、相互作用し得、そして２つのＦａｂ’分子を二量体化させ得、Ｆａｂ’２を作出する。Ｆａｂ’２は、細菌細胞から直接的に精製され得る。さらに、細菌から二量体化されなかったＦａｂ’が単離され得、そしてＦａｂ’２に化学的に変換され得る。
【００７７】
先に記載したように、抗体の可変領域は、単鎖としてクローニングされ得、ここでは、可変軽鎖（ＶＬ）が、リンカー領域によって可変重鎖（ＶＨ）に連結される。そのリンカー領域が短い場合（例えば、５〜７アミノ酸）、ｓｃＦｖの折り畳みは、１つのｓｃＦｖのＶＬが第二のｓｃＦｖのＶＨと対合する２つのｓｃＦｖの会合に好ましい。このように、２つの抗原結合部位が、ディアボディ上に提示される。
【００７８】
２つの結合部位を含む抗体構築物は、アゴニスト活性を試験するために、かつ／または最終治療製品として使用されるために、これらの方法のいずれもを用いて生成され得る。
【００７９】
Ｆａｂライブラリーのパンニングまたは選別工程後、パンニングされた分子のライブラリーは、Ｓａｃ ＩおよびＳｐｅ Ｉで制限消化され、そしてｐＲＬ８中にクローニングされる。ＦＡＣＳ選別またはパンニング後、個々にまたはまとめてｐＲＬ８ベクターにサブクローニングすることにより、バイオアッセイにおける分析のために、二量体可溶性結合Ｆａｂの発現が可能になる。ｐＲＬ８において、抗体フラグメントは、周辺腔に輸送され、そしてそこで二量体を形成する。このアプローチの利点は、高アフィニティーＦａｂに好都合である、単量体Ｆａｂフラグメントのパンニングを許容することである。
【００８０】
別のアプローチは、二次抗体を使用する。ｐＲＬ４は、市販のＨＡ．１１抗体（Ｂａｂｃｏ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）により認識されるヘマグルチニンデカペプチドタグを有する。バイオアッセイにおいて試験される、ＦＡＣＳ選別またはパンニングにおいて同定されたＦａｂが、バイオアッセイへの添加の前にＨＡ．１１とプレインキュベートされる。これは、二量体化を促進する。
【００８１】
一旦、ｓｃＦｖまたはＦａｂの結合がパンニングまたは別の選択方法によって同定されれば、個々のクローン（各々が、ファージ表面上に独特の二量体化抗体フラグメントを発現する）が、標的細胞に対する増殖、分化、活性化、または生存の効果について試験される。さらに、可溶性二量体化抗体は、バイオアッセイにおいて調べられ得る。
【００８２】
（ＴＰＯ様活性についてのスクリーニングのための生物学的アッセイ）
１．コロニー形成アッセイ−骨髄由来の巨核球系細胞コロニー（Ｍｅｇａｃｕｌｔ Ｃ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ ＢＣ，Ｃａｎａｄａから））。
【００８３】
２．増殖アッセイ−Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖（Ｃｗｉｒｌａら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７６ １６９６−１６９９頁）。Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞株を、ＩＬ−３依存性マウスリンパ芽（ｌｙｍｐｈｏｂｉａｓｔｏｉｄ）細胞株Ｂａ／Ｆ３に全ｃＭｐｌレセプターをコードするｃＤＮＡを導入することにより、樹立した（Ｆ．ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５３３（１９９４））。種々の濃度の抗体またはＴＰＯに応じたＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞の増殖の刺激を、以前に記載されるように（Ｆ．ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅら，前出）、^３Ｈ−チミジンの取り込みの量によって測定した。
【００８４】
３．リン酸化アッセイ−ＪＡＫ２のリン酸化（Ｄｒａｃｈｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９９），Ｖｏｌ．２７４，１３４８０−１３４８４頁）。
【００８５】
４．転写ベースアッセイ−全長ｃＭｐｌレセプターをｃ−Ｆｏｓプロモータールシフェラーゼレポーター構築物で一過的に共トランスフェクトする。２４時間後トランスフェクションは、２４時間、０．５％ ＦＣＳ中で細胞を飢餓させる。細胞を刺激し、６時間後に採取し、そしてルシフェラーゼ読み取りを行う（実施例１、生物学的アッセイの節もまた参照のこと）。
【００８６】
（ＥＰＯ様活性についてのスクリーニングのための生物学的アッセイ）
１．メチルセルロースにおける骨髄エリスロイド（ｅｒｔｈｒｏｉｄ）コロニー形成（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，Ｖｏｌ．２７３、４５８−４６３頁）。
【００８７】
２．ＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞株）増殖。ＴＦ−１細胞は、Ｅｐｏ−Ｒの全長型および短縮型の両方を発現する。（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８９，Ｖｏｌ １４０，３２３−３３４頁）。
【００８８】
３．ＥＰＯレセプターは、ＪＡＫ２キナーゼに直接連結して、チロシンリン酸化を誘導する。Ｅｐｏは、ＴＦ−１細胞においてｃＦｏｓを誘導する。ｃ−Ｆｏｓ転写活性化。（Ｗｉｔｔｈｕｈｎら，Ｃｅｌｌ，（１９９３），Ｖｏｌ．７４，２２７−２３６頁）。
【００８９】
多数のバイオアッセイが、高スループットスクリーニングにおいて使用され得る。当業者は、これらおよび他の適切なバイオアッセイに精通している。いくつかの非放射性アッセイが開発されており、これらアッセイでは、ＤＮＡ合成または酵素活性のいずれかが分析され得る。例えば、Ｍｏｓｍａｎｎ（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．１９８３．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−５７（本明細書中に参考として援用される））により記載のアッセイに基づくＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が使用され得る。このプロトコルは、迅速かつ容易である。このアッセイでは、生存細胞において、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性により、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド）、テトラゾリウム塩、が、ブルーホルマザン産物に変換される。デヒドロゲナーゼ含有量、および従って生じた発色産物の量は、細胞数に比例する。発色産物は、５７０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて検出可能である。アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてまとめて、三連で実施される。簡潔には、標的細胞を、９６ウェルプレート中で培養培地中に１００μｌアリコートでプレーティングする。種々の濃度の抗体の添加後、細胞を、十分に加湿された雰囲気中で３７℃および５％ＣＯ_２で４８〜７２時間、インキュベートする。ＭＴＴを各ウェルに添加し、そしてＥＬＩＳＡプレートリーダーを介して増殖をモニタリングする。
【００９０】
例えば、ＴＦ−１細胞を用いる増殖アッセイにおいて、抗体を発現するファージミドを含む細菌細胞を、哺乳動物細胞培地および細菌培地の混合物である培地（ＴＦ−１細胞の場合：ＲＰＭＩ ２．７／ＳＢ ０．３／Ｃａｒｂ １００ｕｇ／ｍｌ）１ｍｌ中に、９６ウェル深ウェルプレートにおいて、３７℃で一晩、増殖させる。ＴＦ−１細胞は、多様なサイトカインに応答するヒト骨髄赤白血病細胞株である（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｔａｎｇｅ，Ｔ．，Ｔｅｒａｓａｗａ，Ｔ．，Ｃｈｉｂａ，Ｓ．，Ｋｕｗａｋｉ，Ｔ．，Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｋ．，Ｐｉａｏ，Ｙ．Ｆ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．，Ｕｒａｂｅ，Ａ．，Ｔａｋａｋｕ，Ｆ．，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０：３２３−３３４，１９８９；Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｔｏｊｏ，Ａ．，Ｋｕｗａｋｉ，Ｔ．，Ｃｈｉｂａ，Ｓ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．，Ｕｒａｂｅ，Ａ．，Ｔａｋａｋｕ，Ｆ．，８ｌｏｏｄ ７３：３７５− ３８０，１９８９；Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｔａｋａｋｕ，Ｆ．，Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ａ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５７１−５７７，１９９１）。後日、終夜培養物を、新鮮なトレーに１／１０で二次培養し、そして３７℃で２時間、配する。３７℃で４時間のＩＰＴＧでの誘導後、プレートを、室温で１５分間２０００ｒｐｍで遠心分離する。５０ｕｌの各培養上清を、滅菌９６ウェルアッセイプレートに対して９６ウェルフィルタートレー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において濾過する。哺乳動物細胞を事前洗浄して増殖因子を除去し、そして１×１０^５細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。５０ｕｌ細胞を各ウェルに添加する。アッセイプレートを３７℃／５％ ＣＯ_２インキュベーター中で７２時間インキュベートする。７２時間目で、ウェルあたり４０ｕｌ培地／ＭＴＳ／ＰＭＳを添加することにより、トレーを発色させる。ＭＴＳは、ＭＴＴの改善型のより可溶性のバージョンである。両アッセイとも、テトラゾリウム塩の細胞変換に基づく。ＭＴＳ増殖アッセイキット（カタログ番号Ｇ５４２１）は、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入され得る。プレートを３７℃／ＣＯ_２インキュベーターで維持し、マイクロプレートリーダーを用いて、１時間、４時間、８時間で、ＯＤ_４９０で読み取る。
【００９１】
サイトカインの活性は、しばしば相乗的である。次いで、正確なシグナルを送る２つの異なるレセプターへのリガンド結合によって、または、リガンド／レセプターの相互作用が第二のサイトカインに応答するように細胞を感作するプライミング効果を介して、相乗性が現れ得る。さらに、系統発生において早期に作用するサイトカインは、発生経路のより襲い段階で作用するサイトカインよりも頻繁に相乗的である。従って、相乗性を調べるために、最適以下の濃度の増殖因子が、これらのバイオアッセイにおいて使用され得る。最適以下濃度のための条件は、各アッセイについて決定される。これは、増殖因子（個々または混合物として）の系列希釈をアッセイに添加し、そしてそれより低いと単一因子が混合物に比較して応答を促進しないレベルおよびそれより低いと混合物がバイオ圧制において応答を促進しないレベルを決定することによってなされる。骨髄間質細胞もまた、相乗応答において役割を果たし得る他の必要な因子を提供するために、バイオアッセイにおいて添加され得る。
【００９２】
さらに、細胞増殖は、ＤＮＡ合成をモニタリングすることによって調べられ得る。５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を調べる非放射性比色アッセイは、マイクロタイタープレート形式で実施され得る。ここで、細胞は、９６ウェルプレート中で培養され、そしてＢｒｄＵおよび最適以下の濃度のサイトカインとインキュベートされる。ＢｒｄＵの量は、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体での標識後、決定される。最終結果は、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーによって分析される。
【００９３】
増殖の指標としてＤＮＡ合成速度を測定する放射性細胞分裂促進アッセイ（ＲａｉｎｅｓおよびＲｏｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０９：７４９−７７３，１９８５）もまた、使用され得る。これらのアッセイでは、標的細胞における［^３Ｈ］−チミジンの取り込みの速度の変化が調べられる。また、これらのアッセイは、多くの抗体フラグメントの同時かつ迅速なスクリーニングを許容する。それらは、多くの異なる細胞の増殖に対する刺激効果および阻害効果を評価する便利な方法として、広く使用されている。細胞は、それらが指数増殖速度に達するまで、懸濁液中に培養する。次いで、細胞を、それらを培養した培地を洗い流して、新鮮な培地中に再プレーティングする。細胞を、約１〜２×１０^５細胞／ｍｌの濃度で１００μｌの総容量で９６ウェルプレートにアリコートに分ける。ファージ上清、可溶性二量体化ＦａｂまたはＳｃＦｖ抗体の希釈液を添加し、そして細胞を、３７℃の温度で、ガス供給ＣＯ_２インキュベーター中で１８〜４８時間、インキュベートする。インキュベーション後、［^３Ｈ］チミジン（９３７ｋＢｑ）を各ウェルに添加し、さらに４時間インキュベートする。次いで、細胞をインキュベーターから取り出し、ベンチトップ型マイクロプレートシンチレーションカウンター（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ ＮＸＴ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ））で直接、計数する。あるいは、細胞を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ細胞採取器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）または同様の装置においてＧＦ／Ｃフィルターに連続的に移し得る。次いで、フィルター上に保持された酸不溶性物質と関連した放射性を決定する。市販の増殖因子の希釈液を、陽性コントロールウェルに適用する。陰性コントロールは、同様に処理した挿入物を含有していないプラスミドまたは無関係な抗体を有する細胞からの上清を含む。試験下の標準およびファージ上清の希釈液の相対増殖促進活性を比較して、サンプル中の増殖促進活性を定量する。
【００９４】
活性化は、セカンドメッセンジャーをアッセイすることにより、または転写読み出しアッセイによって、試験され得る。
【００９５】
生存は、例えば、トンネルアッセイ（ｔｕｎｎｅｌ ａｓｓａｙｓ）のようなアッセイを用いてアポトーシスをモニタリングすることによって、または当業者に公知の他の方法によって、アッセイされ得る。
細胞シグナル伝達、キナーゼおよびホスファターゼの活性、ならびに最終的にはアゴニスト活性の結果としての細胞活性を分析するための他の有用なアッセイは、セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、Ｃａ＋＋、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３））の生成の測定を包含する。高スループットスクリーニングアッセイにおける細胞内カルシウム濃度、細胞内ｐＨ、および膜ポテンシャルにおけるスパイクの測定は、ＦＬＩＰＲ Ｆｌｕｏｒｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のような装置を用いて実施され得る。セカンドメッセンジャー濃度の検査について、多数の蛍光プローブが入手可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）。セカンドメッセンジャーの濃度の測定はまた、単一細胞レベルでなされ得る（ＤｅＢｅｒｎａｒｄｉ，Ｍ．Ａ．およびＢｒｏｏｋｅｒ，Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：４５７７−４５８２，１９９６）。さらに、他のシグナリング事象（例えば、リン酸化、アポトーシス、または特定遺伝子のＲＮＡもしくはタンパク質のレベル）を調べるアッセイは有用である。例えば、ほとんどのサイトカインは、酵素ＰＩ ３−Ｋを活性化することが示されている（Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ，Ｏ．，Ｉｈｌｅ，Ｊ．Ｎ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ １９９６に概説）。さらに、チロシンキナーゼのＪａｋファミリーは、サイトカインレセプターシグナリングについて中心的なメディエーターであることが示されている（Ｉｈｌｅ，Ｊ．Ｎ．，Ｗｉｔｔｈｕｈｎ，Ｂ．Ａ．，Ｑｕｅｌｌｅ，Ｆ．W．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３６９−３９８，１９９５）。さらに、いくつかの他のチロシンキナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーのメンバー）は、特定のサイトカインの刺激に応じて活性化される。ＲＮＡもしくはタンパク質の場合、例えば、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓが、サイトカイン刺激に際して迅速かつ一過的にアップレギュレートされ、一方、ｃ−Ｍｙｃ誘導は、より緩慢である。これらのタンパク質は、Ｇ１遷移および増殖に必要とされる（Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ，Ｏ．，Ｉｈｌｅ，Ｊ．Ｎ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ １９９６に概説）。これらの転写物の増加を検出する高スループットスクリーンは、利用され得る。
【００９６】
転写読み出しアッセイにおいては、増殖因子または増殖因子模倣物（アゴニストまたは阻害抗体）への細胞の露出後に、特定遺伝子の転写における変化が観察される。例えば、ｍｙｃ読み出しアッセイでは、ＩＬ−３依存性ＦＤＣＰ−ミックス細胞株のような細胞を、８時間、ＩＬ−３増殖因子の飢餓状態に置き、その後、増殖因子模倣物またはネイティブ増殖因子に対して、３７℃で２時間露出させる。この時点で、細胞を採取し、そしてＲＮＡを単離し、そしてｍｙｃ遺伝子に対して特異的なプライマーを用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施する。ＲＴ−ＰＣＲ反応物を、ＰＣＲ産物の定量のために水平アガロースゲルにおいて電気泳動する。この場合、単一遺伝子の発現がモニタリングされる。
【００９７】
あるいは、遺伝子の発現の変化についてのアッセイが、ＣＨＩＰ技術を用いてモニタリングされ得るが、アゴニスト抗体が、高いプローブ感受性および動態範囲の条件下で同定され得る。このように、１０，０００以上までが、発現の変化について分析され得る。モニタリングされ得る所望の遺伝子は、とりわけ、ｃ− ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ＮＦ−κＢを含み得る。これらの遺伝子は、種々のシグナル伝達経路の下流にあり、そしてそれらの発現は、細胞分裂促進応答の際に変化するはずである。市販のＣＨＩＰ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の１つのタイプでは、所望の試験遺伝子由来のオリゴヌクレオチドが、ガラス表面上にプリントアウトされ得る。標的細胞を試験アゴニスト抗体に対して露出させる。ＲＮＡを、試験アゴニスト抗体に対して露出された細胞から単離し、ｃＤＮＡに複製し、そしてビオチンの存在下でインビトロ転写させる。インビトロ転写されビオチン化されたｍＲＮＡのハイブリダイゼーションが、アレイにおいてプローブとして使用される。次いで、チップを走査して、試験アゴニスト抗体への露出に際して転写の増大を示す遺伝子を決定する。ＣＨＩＰ技術の別のバージョン（Ｉｎｃｙｔｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）においては、ＤＮＡの量が、ガラス上で標準化され、従って、競合ハイブリダイゼーションを設定する。ＲＮＡを、アゴニストへの露出の前および後に、細胞から単離する。各サンプルからｃＤＮＡを作製し、それにより１つのｃＤＮＡ反応物は、１つのレベルを取り込ませ（例えば、Ｃｙ−３）、そして他方のｃＤＮＡ集団は、異なるレベルを取り込ませる（例えば、Ｃｙ−５）。シグナルを検出し、そしてデュアルレーザー走査において比較して、画像を採集する。
【００９８】
視覚アッセイもまた、使用され得る（例えば、伝統的メチルセルロースコロニー形成アッセイ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ ＢＣ，Ｃａｎａｄａ））。これらのアッセイにおいて、コロニー増殖、および形態学的変化が、光学顕微鏡によってスコア付けされる。半固体寒天培養またはメチルセルロースにおける増殖または分化効果についての視覚検査は、適切な細胞株を用いて実施され得る。Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ５（編者Ｅ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｂ．Ｓ．Ｃｏｌｌｅｒ Ｌ Ｔ．Ｊ．Ｋｉｐｐｓ），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，ｐｐ Ｌ２２−Ｌ２６，１９９５）。メチルセルロースの添加により、単一の始原細胞のクローン子孫が一緒にとどまることが可能になり、そしてこれは、別個のコロニーを認識し、そして数え上げることを容易にする。基本メチルセルロース培地に、コロニー刺激因子補充物を除いて、全ての必要成分（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＤＭ、ＢＳＡ、（−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン）を添加し、そして試験抗体（ファージ上清、可溶性抗体）を添加して、それらが増殖因子の代わりとなり得るかどうかを観察する。メチルセルロース培養中の細胞を、空気中５％ ＣＯ_２の３７℃加湿雰囲気中で、抗体の添加後、１０〜１２日間インキュベートする。１０〜１２日のインキュベーション後、倒立顕微鏡を用いて、コロニーを計数する。さらに８〜１０日後、再度、コロニーを計数する。抗体を含有する培地と増殖因子を有するおよび有しないコントロールとの間で、比較を行う。さらに、メチルセルロースからコロニーを釣り上げ得、そして個々の細胞を、Ｗｒｉｇｈｔ染料での染色によって細胞学的に調べ得る（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｇ．Ｊ．ＨａｙｈｏｅおよびＲ．Ｊ．Ｆｌｅｍａｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ １９７０を参照のこと）。
【００９９】
ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を用いて測定した会合速度定数および解離速度定数から、抗体フラグメントのレセプター結合アフィニティーが算定され得る（Ｌｆａｓ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９９０）。バイオセンサーチップは、供給者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ”’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いたｇＤ−ｍｐｌレセプターの共有結合カップリングについて活性化される。ｇＤ−ｍｐｌを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）にバッファー交換し、そして約３０μｇ／ｍＬに希釈する。約４００応答単位（ＲＵ）の共役タンパク質に達するように、アリコート（５μＬ）を流速１μＬ／分で注入する。最後に、１Ｍエタノールアミンをブロッキング剤として注入する。速度論測定のために、抗体の１．５系列希釈を、２０μＬ／分の流速を用いて２５℃でＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（リン酸緩衝生理食塩水中））中に注入する。ＳＰＲ測定値からの平衡解離定数Ｋ_ｄをｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算定する。標準偏差（ｋ_ｏｎに対してｓ_ｏｎ、およびｋ_ｏｆｆに対してｓ_ｏｆｆ）は、代表的には、４つより多くのタンパク質濃度（ｋ_ｏｎ）または７つより多くのタンパク質濃度（ｋ_ｏｆｆ）を用いた測定値から得られる。解離データは簡易なＡＢ−＞Ａ＋Ｂモデルに適合されて、ｋｏｆｆ＋／−ｓ．ｄ．（測定値の標準偏差）を得る。各解離曲線に対して偽一次速度定数（Ｐｓｅｕｄｏ−ｆｉｒｓｔ ｏｒｄｅｒ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ｋｓ）を算定し、そしてタンパク質濃度の関数としてプロットし、ｋｏｎ＋／−ｓ．ｅ．（適合の標準誤差）を得る。
【０１００】
全ＩｇＧへの抗体クローンの変換のために、軽鎖および重鎖（またはそれらのフラグメント）の両方のコード領域が、細菌ベクターから哺乳動物ベクター（１つまたは複数）に別々にクローニングされ得る。同じプラスミド中に軽鎖および重鎖の両方のカセットをクローニングする単一ベクター系（例えば、ｐＤＲ１またはその誘導体）が、使用され得る。あるいは、重鎖と軽鎖とが別々のプラスミドによって生成される二重発現ベクターが使用され得る。哺乳動物シグナル配列は、最終ベクター（１つまたは複数）中にすでに存在しているか、または軽鎖および重鎖ＤＮＡ挿入片の５’末端に付加されるかのいずれかの必要がある。これは、適切な哺乳動物リーダー配列を含むシャトルベクター（１つまたは複数）へのこれら鎖の初期移入によって成し遂げられ得る。制限酵素消化後、軽鎖領域および重鎖領域（またはそれらのフラグメント）が、ＩｇＧ１についての残りの定常領域がイントロンありまたはイントロンなしのいずれかで提供されている最終ベクター（１つまたは複数）中に導入される。イントロンが使用されるいくつかの場合、ｐＲＬ４から軽鎖および重鎖の可変領域を増幅するＰＣＲのためのプライマー設計は、適切なスプライシングおよび哺乳動物細胞における抗体の産生を得るために、エキソンスプライシングドナー部位を含むことを必要とし得る。
【０１０１】
いずれのベクター発現系（単一プラスミドまたは二重プラスミド）を用いても、抗体重鎖および軽鎖の生成は、哺乳動物細胞において作動するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＩｇＧプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない）によって駆動され得る。さらに、ベクター（１つまたは複数）は、細菌における増殖についての選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、またはゼオシン耐性が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。哺乳動物細胞のための選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ耐性、ＧＳ耐性、ｇｐｔ耐性、ネオマイシン耐性、またはハイグロマイシン耐性）もまた、ＩｇＧベクター（１つまたは複数）中に存在し得るか、または共トランスフェクションにより別のプラスミドで提供され得る。
【０１０２】
当業者は、公知の技術を用いて、他の生物（例えば、酵母、哺乳動物、昆虫、および植物）において抗体を合成し得る（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．およびＷｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２６４７−２６５０，１９８８；Ｔｒｉｌｌ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｈａｔｚｍａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５５３−５６０，１９９５；Ｈｉａｔｔ，Ａ．，Ｃａｆｆｅｒｋｅｙ，Ｒ．Ｂｏｗｄｉｓｈ，Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２：７６−７８，１９８９）。
【０１０３】
前に述べたように、本明細書中の開示に従って作製された抗体は、小ペプチドまたはペプチド模倣物（本明細書中に記載のＴＰＯ模倣物）の活性に対して増大された半減期（活性持続期間）を提供する。別の局面では、抗体の血清半減期は、ＰＥＧ化される誘導体を作製することによって、それ自体延長され得る。例えば、Ｌｅｅら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ（１９９９）１０（６）：９７３−８１（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。例えば、本明細書中に記載のＴＰＯ模倣物抗体の別の利点は、通常ＴＰＯ処理が、患者においてＴＰＯ中和抗体の生成を生じ得ることであり、この抗体は、患者の天然に存在するＴＰＯの活性に干渉する。本ＴＰＯ模倣物抗体は、有害な免疫応答がネイティブＴＰＯに対して生じる可能性を実質的に低減させる。なぜなら、これは、異なるアミノ酸配列を有するからである。
【０１０４】
請求項によって包含される分子は、診断において使用され得るが、この診断では、抗体またはそれらのフラグメントが検出マーカーに結合体化されるか、または検出マーカーに結合体化された二次抗体と共に一次抗体として使用される。検出マーカーは、放射性標識および非放射性標識を含み、そして当業者に周知である。一般の非放射性標識には、検出酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）および蛍光分子が含まれる。蛍光分子は、ある波長で光を吸収し、別の波長で光を放射し、従って、例えば、蛍光顕微鏡により可視化が可能になる。分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、およびフロー選別装置は、周知であり、そしてしばしば、蛍光染料に共有結合にてカップリングさせることにより蛍光を発するようになる特定分子を検出するために使用される。蛍光色素（例えば、緑色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質の赤色シフト変異体、アミノクマリン酢酸（ＡＭＣＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、Ｃｙ３．０、およびＣｙ５．０）は、有用標識の例である。
【０１０５】
これら分子は、蛍光マーカーが使用される場合、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のような細胞単離ストラテジーにおいて使用され得る。蛍光活性化細胞選別では、蛍光分子でタグ化された細胞が、フローサイトメーター（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ＦＡＣＳ ＩＶサイトメーターまたは等価の装置）において電子工学的に選別される。蛍光分子は、特異的細胞表面抗原を認識する抗体である。抗体は、蛍光マーカー（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ））に結合体化される。
【０１０６】
磁気選別もまた可能である。磁気選別手順では、抗体が、磁気マイクロビーズに直接または間接的に連結される。細胞を、細胞表面分子（例えば、増殖、分化、活性化、または生存に関与するレセプター）を認識する抗体で予備コーティングする。この抗体を、ペプチドを提示する一次抗体（例えば、各抗体に操作されたＨＡ分子タグ）に結合する二次免疫グロブリンと結合体化された磁気ビーズに付着させる。次いで、この細胞を、磁気で取り出す。磁気選別は、ポジティブ選択（関心のある細胞が抗体および従って磁石によって結合される）またはネガティブ選択（所望されない細胞が磁石上で単離される）であり得る。
【０１０７】
あるいは、放射性標識抗体が、診断目的のために使用され得る。
【０１０８】
本明細書中で開示された抗体およびそれらのフラグメントは、種々の臨床関連細胞型の増幅のために有用である。処置は、インビボまたはエキソビボであり得る。例えば、アゴニスト抗体は、所与の系統（１つまたは複数）の細胞が正常数未満で患者に存在する、疾患、障害、または例えば、造血の抑制に関連した処置によって引き起こされる細胞集団における欠陥を被る患者を処置するために有用である。以下は、本明細書中に開示された生物学的に活性なペプチドを含む抗体で処置され得る状態の単なるいくつかの例を表すのみであって、当業者は、このような処置で利点を得る他の疾患および状態を同定し得る。例えば、ＨＩＶ感染患者、化学療法を受けている患者、骨髄移植患者、幹細胞移植患者、および骨髄増殖性障害罹患患者は、特定の造血系統において正常以下のレベルを示す。
【０１０９】
血小板減少症は、化学療法、骨髄移植、または慢性疾患（例えば、特発性血小板減少症（ＩＴＰ））の結果であり得、これらは全て低血小板レベルを生じる。本ＴＰＯ模倣物抗体は、このような患者を処置するために使用され得る。
【０１１０】
腎透析を受けている患者は、しばしば、正常以下レベルの赤血球を伴う処置関連貧血を被る。再生不良性貧血では、骨髄抑制が、汎血球減少を引き起こし得るか、または赤血球、白血球、または血小板にのみ影響し得る。開示された抗体は、特定の細胞集団（例えば、造血細胞）における欠陥によって特徴付けられる、これらおよび他の疾患および障害のための治療剤の最大の武器を増大させる。
【０１１１】
本願発明によって包含される分子はまた、細胞のエキソビボ増殖および分化のために使用され得る。これは、遺伝子治療目的（例えば、伝統的なウイルスベクターアプローチ）、および自己骨髄移植に有用である。
【０１１２】
さらに、本開示に従う特定の抗体は、放射線免疫療法のために放射性標識され得るか、または毒素に結合体化されて、このような毒素を特定の細胞型に送達し、それらの細胞の殺傷を生じさせ得る。
【０１１３】
造血細胞の増殖、分化、および成熟を刺激し得る生物学的に活性なｃ−ｍｐｌアゴニスト抗体は、血小板の生成不良、捕捉（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）、または破壊増大に起因して血小板減少症を罹患する患者において巨核球系細胞形成（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）または血栓形成活性を刺激するために、滅菌薬剤調製または処方において使用され得る。血小板減少症関連骨髄低形成（例えば、化学療法または骨髄移植後の再生不良性貧血）は、開示された抗体で有効に処置され得る。ならびに、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、免疫血小板減少症（ＨＩＶ誘発性ＩＴＰおよび非ＨＩＶ誘発性ＩＴＰを含む）、慢性特発性血小板減少症、先天性血小板減少症、脊髄異形成、および血栓性血小板減少症のような障害も同様である。
【０１１４】
ＴＰＯ模倣物ペプチドを含む本明細書中に開示された生物学的に活性なｃ−ｍｐｌアゴニスト抗体は、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）と同じようにして、かつ同じ適応症のために用いられ得る。トロンボポイエチン（ＴＰＯ）は、巨核球系細胞形成および血小板生成を刺激する。これらの抗体は、ネイティブＴＰＯまたはＰＥＧ化ＴＰＯよりも長い半減期を有することが期待され、従って、より長い半減期が示される適応症において使用される。
【０１１５】
ＴＰＯ模倣物の活性を決定するために有用なアッセイの例は、リバウンド血小板増多症アッセイであり、これは、マウスに、ヤギ抗マウス血小板血清を単回注射で投与して、急性血小板減少症を誘発する（０日目）ことを包含する。５日目および６日目に、マウスに試験サンプルを注射する。８日目に、血小板計数を決定する（血小板への^３５Ｓ取り込み）。
【０１１６】
本明細書におけるＥＰＯ模倣物抗体は、天然に存在するＥＰＯに類似した様式で造血を刺激する。このような治療は、赤血球生成が妥協される状態（例えば、慢性腎不全におけるような）を処置する際に有用である。ＥＰＯ模倣物抗体の生物学的活性は、インビトロまたはインビボでのアッセイを用いて決定され得る。
【０１１７】
１つのインビトロアッセイは、Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｇ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１１：６４９−６６０（１９８３）の手順に従って、無傷マウス脾細胞における赤血球形成に対するエリスロポイエチン模倣物抗体の効果を測定する。ＥＰＯ模倣物抗体の種々の実施形態を例えば、インビトロまたはインビボで活性についてスクリーニングするために、ＥＰＯ模倣物抗体は、赤血球形成またはレセプター結合の程度について評価され得る。生物学的活性を決定するための試験は、当業者に周知である。例えば、エリスロポイエチンの生物学的活性は、例えば、米国特許番号５，６１４，１８４および米国特許番号５，５８０，８５３（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように測定され得る。
【０１１８】
抗体投与の経路は、公知の方法（例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋内、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入または病巣内経路による注射または注入、局部、または徐放システムによる（以下に記載するような））に従う。抗体は、好ましくは、注入またはボーラス注射によって連続的に投与される。局所様式でまたは全身様式で抗体を投与し得る。
【０１１９】
本発明の抗体は、薬学的に受容可能なキャリアとの混合物中に調製され得る。本出願の化合物の処方および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最新版において見出され得る。この治療組成物は、静脈内または鼻もしくは肺を通して、好ましくは、液体または粉末エアロゾル（凍結乾燥した）として、投与され得る。組成物はまた、所望されるように、非経口投与または皮下投与され得る。全身投与される場合、治療組成物は、滅菌で、発熱物質を含まず、そしてｐＨ、等張性、および安定性に関して期限を有する非経口で受容可能な溶液中にあるべきである。これらの条件は、当業者に公知である。
【０１２０】
簡潔には、本発明の化合物の投薬処方物は、所望の純度を有する化合物を生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤と混合することにより、貯蔵または投与のために調製される。このような物質は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そして以下を含み得る：緩衝液（例えば、ＴＲＩＳ ＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、および他の有機酸塩）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量（約１０残基未満）ペプチド（例えば、ポリアルギニン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖類、二糖類、および他の糖質（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、またはポリエチレングリコール）。
【０１２１】
インビボ投与のために使用される場合、抗体処方物は、滅菌でなければならず、そして従来の薬学的実務に従って処方され得る。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に滅菌濾過膜を通して濾過することによって、容易に成し遂げられる。抗体は、通常、凍結乾燥形態で、または溶液中に貯蔵される。他のビヒクル（例えば、天然に存在する植物油（例えば、ゴマ油、落花生油、または綿実油）または合成脂肪ビヒクル（例えば、オレイン酸エチルなど））は、所望され得る。緩衝液、防腐剤、抗酸化剤などが、受け入れられている薬学的実務に従って取り込まれ得る。
【０１２２】
使用に適した薬学的組成物は、１つ以上の合理的に設計された抗体が、それらの意図された目的を達成するために有効な量で含まれる組成物を含む。より詳細には、治療有効量は、疾患の症状を防止、緩和、もしくは改善するか、または処置されている被験体の生存を延長するのに有効な抗体量を意味する。治療有効量の決定は、特に、本明細書中に提供された詳細な開示内容を考慮して、当業者の能力の十分に範囲内である。治療有効投薬量は、インビトロの方法およびインビボの方法を用いることにより決定され得る。
【０１２３】
治療に用いられるべき抗体有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。さらに、主治医は、薬物の作用を改変することが知られる種々の要因を考慮する。このような要因には、疾患の重度およびタイプ、体重、性別、食事内容、投与時間および経路、他の医療措置、ならびに他の関連臨床要因が含まれる。従って、治療専門家にとっては、最適な治療効果を得るために必要とされるように、投薬量を力価測定し、そして投与経路を改変することが必要である。代表的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量が到達されるまで抗体を投与する。この治療の進行は、従来のアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０１２４】
ペプチドを含有する任意の抗体について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に概算され得る。例えば、用量は、細胞培養において決定されたようなＥＣ_５０（例えば、細胞増殖または分化を促進または阻害する試験分子の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０１２５】
本明細書中に記載の抗体分子の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定され得る（例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死である用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するために）。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、そしてそれは、ＬＤ_５０とＥＤ_５０との間の比として表され得る。高い治療指数を示す分子が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量範囲を処方する際に用いられ得る。このような分子の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く示さないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路、および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌら，１９７５，「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
【０１２６】
投薬量および投薬間隔は、細胞増殖または分化を促進または阻害するために十分な抗体の血漿レベル、または最小有効濃度（ＭＥＣ）を提供するために、個々に調整され得る。
【０１２７】
ＭＥＣは、各抗体について種々であるが、記載されたアッセイを用いてインビトロデータから概算され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴および投与経路に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイは、血漿濃度を決定するために使用され得る。
【０１２８】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を用いて決定され得る。抗体分子は、その時間の１０〜９０％の間、好ましくは、３０〜９０％間、そして最も好ましくは、５０〜９０％間、ＭＥＣを上回る血漿レベルを維持する処方計画を用いて投与されるべきである。
【０１２９】
局所投与または選択摂取の場合、抗体の有効局所濃度は、血漿濃度に関連するものでなくてもよい。
【０１３０】
代表的な一日投薬量は、上記の要因に依存して、１μ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲にあり得る。代表的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量が到達されるまで分子を投与する。この治療の進行は、従来のアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０１３１】
疾患のタイプおよび重度に依存して、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約（ａｂｕｔ）１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇのアゴニスト抗体が、例えば、１回以上の別個の投与によっても、または連続注入によっても、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。状態に依存して、数日間またはそれ以上長くにわたる繰り返し投与のために、処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるか、患者の状態において所望の改善が達成されるまで、繰り返される。しかし、他の投薬計画もまた有用であり得る。
【０１３２】
（実施例）
以下の実施例は、例証の目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を制限することは意図されない。
【０１３３】
（実施例１）
（ヒト抗体フレームワーク中にグラフト化したＴＰＯ模倣物配列のライブラリー構築）
アゴニストＴＰＯ模倣物ペプチド
【０１３４】
【化６】

（配列番号１）を、抗破傷風トキソイド（ＴＴ）Ｆａｂ重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）中にグラフト化し、全ＨＣＤＲ３配列
【０１３５】
【化７】

（配列番号４）を置換する。図２Ａは、用いたヒト破傷風トキソイド抗体の配列を示す。２つのグラフト化アプローチを用いた。第一のアプローチでは、アゴニストペプチドを、Ｈ−ＣＤＲ３領域に挿入し、それぞれの側に２つのグリシンを隣接した。これは、必要とされるコンフォメーションをより容易にとることができるように、グラフト化ペプチドにおける構造拘束を減少させるためであった。第二のアプローチでは、ペプチドグラフトの各側における２つのアミノ酸位置を、ペプチドの最良の提示が達成され得るようにランダム化した（図３）。これらの２つのアプローチを、抗体足場にアゴニストペプチドを適切に提示し、それにより、抗体に対してその活性を付与するために、ペプチド単独で十分であるか、または特定の残基が必要であるかを決定するために用いた。
【０１３６】
図４は、ライブラリー構築プロセスを概要する。簡潔には、抗破傷風トキソイドＦａｂを２つのフラグメントとして増幅した。フラグメントＡを、順方向プライマープライマー
【０１３７】
【化８】

（配列番号５）（これは、軽鎖のＯｍｐ Ａリーダーにアニーリングする）を、後方向プライマー
【０１３８】
【化９】

（配列番号６）（これは、重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）３の末端でアニーリングする）と合わせて用いて増幅した。逆方向プライマーは、新規ＣＤＲ３をコードするテイルを含有した。フラグメントＢを、順方向プライマー
【０１３９】
【化１０】

（配列番号７）（これは、ＦＲ４でアニーリングする）および逆方向プライマーＳｅｑ−Ｇ３Ｒｅｖ
【０１４０】
【化１１】

（配列番号８）（これは、重鎖停止シグナルの下流のプラスミドの遺伝子ＩＩＩ領域においてアニーリングする）を用いて生成した。ＴＰＯＣＤＲ３−Ｆプライマーもまた、新規ＣＤＲ３領域をコードする塩基のテイルを有した。以下のＰＣＲプログラムにおいて、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた：９４℃で３０秒、次いで３０サイクル（９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、および７２℃で９０秒）、続いて７２℃で１０分間の伸長期間、および４℃での維持。フラグメントをＰＣＲにより生成し、そしてゲル精製した後、それらを、オーバーラップ伸長ＰＣＲのために組み合わせた。新規なＣＤＲ３プライマーでコードされたこれら領域は、相補的であり、そして２３塩基の重複を提供した。プライマーＮ−ＯｍｐおよびＳｅｑＧ３ＲｅｖをオーバーラップＰＣＲプロトコルにおいて使用し、全Ｆａｂ ＤＮＡ産物を生成した。以下のＰＣＲプログラムにおいて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた：９４℃で３０秒、次いで２０サイクル（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で３分１５秒）、続いて７２℃で１５分間の伸長期間、続いて４℃での維持。Ｆａｂ産物のゲル精製後、Ｓｆｉ １消化を５０℃で５時間実施した。挿入物をＳｆｉ １消化ｐＲＬ４ベクターに一晩連結させた。連結産物をエタノール沈殿させ、Ｈ_２Ｏ中に再懸濁し、そして次いでコンピテントＥＲ２５３７細菌（サプレッサー株、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中にエレクトロポレートした。５ｍｌのＳＯＣ中で１時間振盪した後、等容量のＳＢを添加した。カルベニシリンを２０ｕｇ／ｍｌに添加し、そして培養物を、３７℃で１時間、続いて５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリン中で３７℃で１時間振盪した。ライブラリー培養物を、１００ｍｌの新鮮ＳＢ、５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリン、および１０^１２ ＶＣＳ Ｍ１３ヘルパーファージを含むフラスコ中に移した。３７℃で２時間後、カナマイシンを添加し、ヘルパーファージに感染した細菌を選択した。翌日、終夜培養物を遠心沈殿させ、そして上清中のファージを４％ＰＥＧ／０．５Ｍ ＮａＣＩを用いて氷上で沈殿させた。ファージを遠心沈殿させた後、ペレットを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁させ、濾過し、そしてＰＢＳに対して透析した。ライブラリーファージを４℃で貯蔵した。
【０１４１】
非ランダム連結ペプチドを含有するＦａｂの構築を、プライマーＴＰＯＣＤＲ３−ＢおよびＴＰＯＣＤＲ３−Ｆを代替の特異的プライマーと取り替えることにより、上記のようにして実施した。
【０１４２】
【化１２】

（配列番号２５）グラフト化抗体について、用いたプライマーは、ＴＰＯＣＤＲ３ｇ−Ｂ
【０１４３】
【化１３】

（配列番号９）およびＴＰＯＣＤＲ３ｇ−Ｆ
【０１４４】
【化１４】

（配列番号１０）であった。
【０１４５】
【化１５】

（配列番号２９）グラフト化抗体について、用いたプライマーは、ＴＰＯ−ＣＤＲ３−ｇｇＢ
【０１４６】
【化１６】

（配列番号１１）およびＴＰＯＣＤＲ３ｇ−Ｆ
【０１４７】
【化１７】

（配列番号１２）であった。
【０１４８】
（ＴＰＯ模倣物ペプチド重鎖ＣＤＲ３ライブラリーの選択）
最適なペプチドディスプレイについて選択するために、ヒト血小板においてパンニングを実施した。血小板は、それらの表面上に一細胞あたり約１８００のＴＰＯレセプターを発現するので（ｃＭｐｌレセプター）、これは、良好な細胞標的であった。さらに、血小板は、地方の血液銀行から容易に入手可能である。血液銀行から得た１ｍｌの濃縮され、ｉｎｄａｔｅされたヒト血小板に、５０ｕｌの新鮮に調製したＦａｂ−ファージを０．１％ ＮａＮ_３を有する１５ｍｌ円錐チューブ中に添加した。チューブを室温で１〜２時間混合した。代表的には、１０ｍｌの５０％ヒト血清（残存する血小板を取り除いた）＋５０％｛１ＭＤＭ／１０％ ＦＢＳ／０．１％ アジド／２ｍＭ ＥＤＴＡ｝をファージ／細胞に添加した。血小板を、室温で５分間、５５００×ｇでペレット化した。上清を排出し、そしてペレットを約５００ｕｌの洗浄液の下で２０分間静置した。血小板を、非常に穏やかに再懸濁し、そして次いで１０ｍｌの２５％ヒト血清（残存する血小板を取り除いた）＋７５％｛ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ／０．１％ アジド／２ｍＭ ＥＤＴＡ｝をファージ／細胞に添加した。血小板の遠心分離、ペレット静置、および再懸濁を繰り返した。３ラウンドおよび４ラウンド目のパンニングでは、第三の洗浄を実施した。洗浄したファージ／細胞をエッペンドルフ（ｅｐｐｉｎｄｏｒｆ）チューブに移し、そして５２００×ｇで遠心した。ファージを、酸溶出緩衝液（０．１Ｍ ＨＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、およびグリシン（ｐＨ ２．２まで））を用いて室温で１０分、血小板から溶出した。血小板を最大速度でペレット化し、そして溶出したファージを５０ｍｌ円錐チューブに移し、２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いて中和した。次いで、ファージを、新鮮なＥＲ２５３７細菌に、室温で１５分間感染させ、上記のようにして一晩増幅させた。血小板パンニングを４ラウンド実施した。
【０１４９】
４ラウンド目のパンニングの後、非サプレッサー細菌株ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において可溶性タンパク質として発現された３つのＦａｂクローンのプールを、ラット高アフィニティー抗ＨＡ、続いて抗Ｒａｔ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）と共にＦａｂのＨＡエピトープタグを利用することにより、血小板への結合について、Ｆａｃｓによって試験した。２５ｕｌのｉｎｄａｔｅされた濃縮ヒト血小板（ＰＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／２％ ＦＢＳで１回洗浄された）を、１００ｕｌの細菌上清（３つのプールされたＦａｂクローンからの６０ｕｌの細菌上清を、４℃で１５分間、４０ｕｌの５％Ｍｉｌｋ／ＰＳＳと予備インキュベートした）と、室温で２０〜３０分間、インキュベートした。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、そして細胞を、５分間、５２００ｘｇで遠心沈殿した。ペレット化した細胞を、５０ｕｌの１：１０希釈（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／０．１％ ＮａＮ_３中）した２°抗ＨＡ抗体［ラットＩｇＧ抗ＨＡ高アフィニティークローン３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）］中に再懸濁し、添加した。室温で３０分後、細胞を、上記のように１ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。遠心分離後、細胞を１００ｕｌの１：１６０希釈（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／０．１％ ＮａＮ_３中）した３°抗ラットＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、そして室温で２０分、暗所でインキュベートした。細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで、透析のために、２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。陽性コントロールとして、市販のヒツジ抗ＩＩｂ／ＩＩＩａ Ａｂ、続いて抗ヒツジＦＩＴＣを使用した。Ｆａｂの多くのプールは、Ｆａｃｓによって血小板への結合について明らかに陽性であった。次いで、追跡Ｆａｃｓ分析を実施し、血小板に結合された個々のクローンを同定した。
【０１５０】
（結合活性による個々の候補の試験）
いくつかのＦａｂを、細菌上清として、その結合特異性が保持されるかどうかを決定するために、本来の抗原破傷風トキソイドに対する反応性について試験した。抗体足場抗ＴＴ Ｆａｂは、その抗原ＴＴに結合するが、ＢＳＡには結合しない。しかし、４つのＴＰＯ模倣物ペプチドグラフト化Ｆａｂクローンは、ＴＴにもＢＳＡにも有意な結合を示さなかった。以前の実験において見られたように、抗ＴＴ Ｆａｂ ＨＣＤＲ３の置換は、抗体の特異性を変化させるのに十分であった。
【０１５１】
Ｆａｂの結合能力をさらに調べるために、Ｆａｃｓ分析を、ＣＭＫ細胞、巨核球系細胞細胞株（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手）（これもまた、ｃＭｐｌレセプターを発現する）において実施した。次いで、ＣＭＫ細胞を結合したＦａｂクローンを分析し、血小板およびＣＭＫ細胞結合がｃＭｐｌレセプターを介して生じていることを確証した。その実験のために、２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＲＴ−ＰＣＲによりＴｆ−１細胞からクローニングしておいたｃＭｐｌ−Ｒを用いて、またはこれを用いずにトランスフェクトした。１×１０^６のトランスフェクトされた細胞を、各Ｆａｂクローン（上記のように予備ブロックされた）からの細菌上清と、室温で２０〜３０分間、インキュベートした。細胞を、５分間、２０００ｒｐｍで遠心沈殿した。ペレット化された細胞を、９０ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／２％ ＦＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、次いで１０ｕｌの２°抗ＨＡ抗体［ラットＩｇＧ抗ＨＡ高アフィニティークローン３Ｆ１０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を最終１：１０希釈に添加した。室温で２０分後、細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。遠心分離後、細胞を１００ｕｌの１：５０希釈（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／０．１％ ＮａＮ_３中）した３°抗ラットＩｇＧ−ＰＥ抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＲＤＩ）中に再懸濁し、そして室温で２０分、暗所においてインキュベートした。細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで、透析のために、２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。パンニングの間に選択されたＦａｂは、ｃＭｐｌ−Ｒでトランスフェクトされた細胞に対して強い結合を示したが、ｃＭｐｌ−Ｒを欠く、コントロールベクタートランスフェクト細胞に対しては示さなかった。このことは、細胞表面結合が、ｃＭｐｌレセプターを通して特異的に生じていたことを示している。抗ＴＴ Ｆａｂは、コントロールベクターでトランスフェクトした２９３細胞にもｃＭｐｌ−Ｒでトランスフェクトした２９３細胞にも結合しない。しかし、ＦａｂクローンＸ１ｃは、コントロール（非ｃＭｐｌレセプター）トランスフェクト細胞の３％結合から、ｃＭｐｌ−Ｒを発現する細胞の９５％結合へのシフトを示す。
【０１５２】
（配列による個々の候補の試験）
ｃＭｐｌレセプターに特異的に結合されたＦａｂクローンの配列分析（図５を参照のこと）は、下流連結部位での好ましいアミノ酸の選択を明らかにした。ＤＮＡ配列データを分析した。アミノ酸配列およびＤＮＡ配列は以下の通りである：
【０１５３】
【表１】

強い結合を示した全てのクローンは、１４アミノ酸のＴＰＯ模倣物ペプチドのちょうど下流にプロリンを含むことが見出された。下流リンカー位置におけるプロリンのパンニングによる選択は、グラフト化ＴＰＯ模倣物ペプチドに改善された結合特徴を付与する、驚くべきアミノ酸選択の決定を表す。弱い結合物は、ＴＰＯ模倣物ペプチドをなお含んだが、このプロリンを含まなかった。クローンＸ７ａがこのペプチドにおいてサイレントな変異を有したこと（ＧＣＧからＧＣＡ、ペプチド中の１１位でＡｌａを保持する）、およびクローンＸ２ｃが、このペプチドにおいて、ペプチドの１１位でＡｌａの代わりにＴｈｒに変更する変異を有したことに留意されるべきである。
【０１５４】
（生物学的アッセイ）
クローンを、ｃ−Ｆｏｓプロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ活性を測定する転写ベースのアッセイを用いて、アゴニスト活性について試験した。ｃＭｐｌレセプターの二量体化は、Ｊａｋを活性化し、これは、ＭＡＰキナーゼ経路を刺激する。このように、ｃＦｏｓプロモーターを介してＭＡＰキナーゼにより刺激されたルシフェラーゼ生成および活性をアッセイすることにより、活性化が測定され得る。ｃＭｐｌレセプターの二量体化が活性化のために必要とされるので、全ＩｇＧまたは二量体化Ｆａｂフラグメント（レセプターを二量体化し得る）のいずれかが、ｃＭｐｌレセプター活性を刺激するために使用され得る。細菌において生成されたＦａｂを、１２ＣＡ５抗ＨＡ抗体を利用してＨＡタグを介して二量体化した。１２ＣＡ５の量を増大させながら細菌Ｆａｂに添加して、Ｆａｂクローンを二量体化させ、それらが順に二量体化し、そしてｃＭｐｌレセプターを活性化させた。アゴニスト活性の測定のために、１２ＣＡ５と混合したＦａｂ含有細菌上清（２ｍｌ）を、コントロールベクターまたはｃＭｐｌレセプターのいずれかおよびＦｏｓプロモーター／ルシフェラーゼレポーター構築物で共トランスフェクトしておいたＮＩＨ３Ｔ３細胞に適用した。３Ｔ３細胞の共トランスフェクションは、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を６ｃｍ皿当たり３×１０^５細胞でプレーティングし、そして次いで翌日にトランスフェクトすることにより、実施した。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、エフェクチン（Ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ）リポフェクチン試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトランスフェクトしたが、各プレートを、０．１ｕｇ ｐＥＧＦＰ（トランスフェクション効率を測定するトレーサー）、０．２ｕｇのＦｏｓプロモーター／ルシフェラーゼ構築物および０．７ｕｇの空コントロールベクターまたはｃＭｐｌレセプター発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。３Ｔ３細胞を０．５％血清中にトランスフェクションの２４時間後に配置し、そしてこの低血清培地中でさらに２４時間インキュベートし、Ｆｏｓプロモーターのバックグラウンド活性化を減少させた。次いで、抗体上清を、これらの細胞に６時間適用した。細胞を採取し、そしてルシフェラーゼアッセイを５０ｕｇの細胞溶解物を用いて実施した。ｃＭｐｌレセプター発現のない場合、抗体によって活性化は刺激されなかった。しかし、ｃＭｐｌレセプター共トランスフェクト３Ｔ３細胞において、アゴニスト活性が観察された。このことにより、本発明者らは、観察されたアゴニスト活性が、ｃＭｐｌレセプターおよび抗体とのその相互作用を通してのものであったことを実証した。データは以下の通りである：
【０１５５】
【表２】

ｃＭｐｌレセプターの活性化は、抗ＨＡ １２ＣＡ５により二量体化された細菌生成Ｆａｂよりもむしろ哺乳動物細胞の一過性または安定トランスフェクションから生成された全ＩｇＧ（本明細書中に記載のようにＦａｂから変換された）を用いて、同様に試験され得る。実験的一過性トランスフェクションは、本質的には本明細書中に記載のように実施され得る。トランスフェクションのために、各試験サンプルについて、２×１０^６細胞（例えば、２９３ ＥＢＮＡ）を６ｃｍ皿中にプレーティングする。翌日、各プレートを、エフェクチン試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、２．５ｕｇの全ＤＮＡ（２ｕｇ 軽鎖および重鎖プラスミド（１つまたは複数）の全体、０．２５ｕｇのｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、および０．２５ｕｇのｐＥＧＦＰ）でトランスフェクトする。２９３細胞を０．５％血清中にトランスフェクションの２４時間後に配置し、そしてこの低血清培地中でさらに２４時間インキュベートし、全ＩｇＧを得る。この培地中では、残余増殖因子は、コントロール実験において見られるように、レセプターを刺激するにおいて、無視できる程度である。２４時間後、上清を採集し、そして５分間、３０００ｒｐｍで遠心して残余細胞を除去する。全ＩｇＧのアゴニスト活性の測定のために、３ｍｌの馴化２９３細胞上清を上記のようにＮＩＨ３Ｔ３細胞に適用する。
【０１５６】
（実施例２）
（ヒト抗体フレームワーク中にグラフト化されたＴＰＯ模倣物配列を含むさらなるライブラリー）
抗体フレームワークにおいて２つのアゴニストペプチドを一緒に連結することに対する別のアプローチは、単一Ｆａｂフラグメント内の１つより多くの位置においてアゴニストペプチドを挿入することである。そうするために、ヒト抗体フレームワーク中にグラフト化されたＴＰＯ模倣物ペプチドを含有するさらなるライブラリーを構築した。軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３、または重鎖のＣＤＲ２の背景において適切に提示されるペプチドの選択後、結合配列を、例えば、以下の表１に列挙するように、単一Ｆａｂ分子に組み合わせ、そして増強された活性について分析した。
【０１５７】
【表３】

４つのさらなるライブラリーを構築した。これらは、重鎖ＣＤＲ２ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を、ＮＮＫドーピングストラテジーを用いて、２つのランダムアミノ酸によって隣接されるＴＰＯ模倣物ペプチドと別々に置換するものであった。これらライブラリーの生成は、重鎖ＣＤＲ３ ＴＰＯペプチドライブラリーについて記載したものと、ライブラリーを形成するように改変される鎖（重鎖または軽鎖）のみをＰＣＲによって増幅し、そして挿入片として使用したことを除いて同様であった。ＰＣＲを、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）（これは、ＴａｑポリメラーゼおよびＰｗｏポリメラーゼの混合物を含む）を用いて実施した。第一ラウンドのＰＣＲを、以下のプログラムを用いて実施した：９４℃で３０秒、次いで３０サイクル（９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、および７２℃で２分）、続いて７２℃で１０分の伸長、および４℃での保持。オーバーラップＰＣＲを、上記のプログラムを用いてプライマーなしで１０サイクル、実施し、全ＤＮＡ鋳型をポリメラーゼによって生成させた。次いで、同じ増幅プログラムを２０サイクル、プライマーをＰＣＲ反応チューブに添加した。
【０１５８】
ＨＣＤＲ２ライブラリーについて、フラグメントＡを、順方向プライマーリードＶＨ
【０１５９】
【化１８】

（配列番号１３）（これは、重鎖の前に位置するｐｅｌＢリーダーでアニーリングする）、および逆方向プライマーＨＲ２ ＣＭＰＬ ＡＮＴＩ
【０１６０】
【化１９】

（配列番号５１）（これは、重鎖ＦＲ２の末端でアニーリングする）を用いて作出した。この逆方向プライマーは、新規ＣＤＲ２をコードするテイルを含んだ。フラグメントＢを、順方向プライマーＨＲ２ ｃＭｐｌ ＣＯＤＥ
【０１６１】
【化２０】

（配列番号１４）（これは、重鎖のＦＲ３でアニーリングする）および逆方向プライマーＮ−ｄｐ
【０１６２】
【化２１】

（配列番号１５）（これは、重鎖定常領域の下流のプラスミドのＨＡエピトープタグ領域においてアニーリングする）を用いて作出した。ＨＲ２ｃＭｐｌ ＣＯＤＥプライマーもまた、新規ＣＤＲ２領域をコードする塩基のテイルを有した。フラグメントをＰＣＲによって生成し、そしてゲル精製した後、それらを、オーバーラップ伸長ＰＣＲのために合わせた。これら新規ＣＤＲ２プライマーでコードされた領域は相補的であり、そして２４塩基の重複を提供した。プライマーリードＶＨおよびＮ−ｄｐを、オーバーラップＰＣＲプロトコルにおいて使用し、全重鎖ＤＮＡ産物を生成した。重鎖産物のゲル精製後、ＸｈｏＩ／Ｓｐｅ Ｉ消化を３７℃で３時間実施した。挿入片をゲル精製し、そして次いで、抗ＴＴ軽鎖を含むＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化ｐＲＬ４ベクターに連結した。Ｆａｂ−ファージライブラリーの生成について上述したように、連結産物を沈殿させ、そしてＥＲ２５３７細菌にエレクトロポレートした。
【０１６３】
軽鎖ＣＤＲ３ライブラリーを、順方向プライマーＮ−ｏｍｐおよび逆方向プライマーＬＲ３ ｃＭｐｌ ＡＮＴＩ
【０１６４】
【化２２】

（配列番号１６）のフラグメントＡについてのプライマー、ならびに順方向プライマーＬＲ３ｃＭｐｌ ＣＯＤＥ
【０１６５】
【化２３】

（配列番号１７）および逆方向プライマーリードＢ
【０１６６】
【化２４】

（配列番号１８）のフラグメントＢについてのプライマーを用いて、同様に作製した。プライマーリードＢは、ＶＨの前に位置するｐｅｌＢリーダー配列にアニーリングした。ＬＲ３ ｃＭｐｌ ＡＮＴＩ逆方向プライマーおよびＬＲ３ ｃＭｐｌ ＣＯＤＥ順方向プライマーはそれぞれ、抗ＴＴ軽鎖のＦＲ３およびＦＲ４にアニーリングした。ＬＲ３ｃＭｐｌの両プライマーは共に、新規ＣＤＲ３ペプチドライブラリーをコードするヌクレオチドのテイルを含み、これは、フラグメントＡおよびフラグメントＢの融合ＰＣＲのための２４塩基対重複領域を提供する。軽鎖ＰＣＲ産物の精製後、ＳａｃＩ／ＸｂａＩ消化を３７℃で３時間実施した。次いで、軽鎖フラグメントを、抗ＴＴ重鎖を含むＳａｃＩ／ＸｂａＩ消化ｐＲＬ４に、室温で一晩、連結した。Ｆａｂ−ファージライブラリーの生成について上述したように、連結産物を沈殿させ、そして、ＥＲ２５３７細菌にエレクトロポレートした。
【０１６７】
軽鎖ＣＤＲ２ライブラリーの構築を、ＬＲ３ ｃＭｐｌプライマーの代わりに、特異的プライマーＬＲ２ ｃＭｐｌ ＡＮＴＩ
【０１６８】
【化２５】

（配列番号１９）（これは、軽鎖ＦＲ２の末端でアニーリングする）およびプライマーＬＲ２ ｃＭｐｌ ＣＯＤＥ
【０１６９】
【化２６】

（配列番号２０）（これは、軽鎖ＦＲ３の開始部でアニーリングする）を用いたことを除いて、軽鎖ＣＤＲ３ライブラリーについて上述したようにして実施した。
【０１７０】
軽鎖ＣＤＲ１ライブラリーの構築もまた、ＬＲ３ ｃＭｐｌプライマーの代わりに特異的プライマーＴＰＯＬＲ１ＣＯＤＥ
【０１７１】
【化２７】

（配列番号５８）（これは、軽鎖ＦＲ２の開始部でアニーリングする）およびプライマーＴＰＯＬＲ１ＡＮＴＩ
【０１７２】
【化２８】

（配列番号５９）（これは、軽鎖ＦＲ１の末端にアニーリングする）を用いたことを除いて、軽鎖ＣＤＲ３ライブラリーについて前に記載のようにして実施した。
【０１７３】
これら３つのさらなるライブラリー（これらは、重鎖ＣＤＲ２ならびに軽鎖ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を、ＮＮＫドーピングストラテジーを用いて、２つのランダムアミノ酸によって隣接されるＴＰＯ模倣物ペプチドと別々に置換する）を、重鎖ＣＤＲ３置換ライブラリーについて実施例１において前に記載したように、血小板において別々にパンニングした。前に記載したように、血小板およびｃＭｐｌレセプタートランスフェクト２９３細胞において、４ラウンドのパンニングを実施し、そしてＦＡＣＳによってクローンをスクリーニングした。これらのスクリーニングから、２つの陽性クローンを得た。これらのクローンは、重鎖ＣＤＲ２中にＴＰＯ模倣物ペプチドを有した。重鎖ＣＤＲ３クローンを用いる場合と異なり、どちらの重鎖ＣＤＲ２クローンも、下流位置にプロリンを有さなかった。代わりに、両方とも、上流位置にチロシンを含むことが見出された（図９を参照のこと−クローンＨＣ−ＣＤＲ２ Ｎｏ．２４およびＮｏ．３９）。
【０１７４】
ライブラリー（ＬＣＤＲ１を含む）を別々に、パンニングの間に血小板の代わりにｃＭｐｌレセプタートランスフェクト２９３細胞を用いるもう一方のパンニング実験に供した。それら２９３細胞は、高効率で再現可能にトランスフェクトし、そしてそれらの表面上に非常に高いレベルの機能的ｃＭｐｌレセプターを発現することが観察された。従って、これらの細胞は、パンニングにおける使用のために良好な細胞標的であった。これらの実験のために、異なる２９３細胞プレート群を、一列において４日間、別々にかつ連続してトランスフェクトした。次いで、各プレート群を、４つの別個のラウンドのパンニングのために連続して用いた。各ラウンドの細胞の採取およびパンニングは、トランスフェクションの２日後に行った。採取のために、細胞を、細胞解離緩衝液を用いてプレートから取り出し、５分間、１５００ｒｐｍで遠心沈殿し、そして１０％ ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム、および５ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＩＭＤＭ中に１×１０^６細胞／ｍｌ（ＬＣ−ＣＤＲ１については３×１０^６）の濃度で再懸濁した。ラウンド１のパンニングにおいて、各ライブラリーからの３×１０^１１のファージを、２ｍｌの細胞（ＬＣ−ＣＤＲ１については６×１０^６および他の全てについては２×１０^６細胞）に別々に適用し、そして室温で２時間、１５ｍｌ円錐チューブ中で旋回した。細胞を、１０ｍｌのＩＭＤＭ／１０％ ＦＣＳ／０．１％ アジ化ナトリウム／５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液を用いて２回洗浄した。ファージを、実施例１において前に記載したように、酸中で溶出し、そして増幅した。ラウンド２では、４×１０^６細胞（ＬＣ−ＣＤＲ１については６×１０^６）を２ｍｌの緩衝液中で使用し、そして増幅されたラウンド１溶出ファージからの３×１０^１１ファージを、パンニングされなかったライブラリーからの３×１０^１１ファージと合わせ、そしてこれらを細胞に添加した。洗浄、溶出、および増幅は、ラウンド１と同様に進行させた。ラウンド３では、４×１０^６細胞（ＬＣ−ＣＤＲ１については６×１０^６）を２ｍｌの緩衝液中で使用し、そして増幅されたラウンド２溶出ファージからの３×１０^１１ファージを使用した。細胞を、溶出前に３回洗浄した。ラウンド４では、４×１０^６細胞（ＬＣ−ＣＤＲ１については６×１０^６）を、再度、２ｍｌの緩衝液中で使用し、そして増幅されたラウンド３溶出および増幅ファージからの３×１０^１１ファージを使用した。再度、細胞を、溶出前に３回洗浄した。前に記載したように、ｃＭｐｌレセプタートランスフェクト２９３細胞において、ＦＡＣＳにより、少なくとも３０の個々のクローンをスクリーニングした。重鎖ＣＤＲ２ライブラリーから１２の陽性クローンを得、そして軽鎖ＣＤＲ２ライブラリーから２５の陽性クローンを得、そして軽鎖ＣＤＲ１ライブラリーから１４の陽性クローンを得た。クローンを、ＤＮＡ配列によってさらに分析した。陽性クローンについて選択された隣接アミノ酸残基を、添付の図９中に示す。軽鎖ＣＤＲ２グラフト化Ｆａｂが、ＴＰＯ模倣物ペプチドの上流にプロリン（Ｐｒｏ）に対して強い選択を有することに留意すると興味深い。
【０１７５】
（実施例３）
図９からのＴＰＯ模倣物ペプチドグラフト化Ｆａｂクローンの組み合わせを生成した。このように、単一抗体は、単一の軽鎖または重鎖内にＴＰＯ模倣物ペプチドの複数コピーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖の両方が、単一Ｆａｂ内に複数コピーを与えるペプチドグラフトを含み得る。同じＣＤＲライブラリーから選択された陽性クローンをプールした。１つのＴＰＯ模倣物ペプチド含有ＣＤＲのプールを、別ののプールと合わせることにより、新規ライブラリーを構築した。ＴＰＯ模倣物ペプチドの１つが軽鎖にあり、そして他方が重鎖にある組み合わせを、プールされたプラスミドＤＮＡ、および重鎖に隣接する独特制限部位（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ）および軽鎖に隣接する独特制限部位（ＳａｃＩ−ＸｂａＩ）を用いて単なるクローニング技術を用いて作製する。例えば、Ｈ−ＣＤＲ３ペプチドグラフト化重鎖についてのプラスミドＤＮＡを組み合わせ、そしてＸｈｏＩおよびＳｐｅＩにより消化した。精製された重鎖挿入片を、Ｌ−ＣＤＲ２グラフトを含むＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化プラスミドに連結した。得られたライブラリーは、ＣＤＲ３ペプチドグラフトを有する重鎖およびＣＤＲ２ペプチドグラフトを有する軽鎖を含んだ。２つのペプチド含有ＣＤＲの対合のために、クローンのプールを用いることよりもむしろ、個々のクローンがまた組み合わされ得ることが理解されるべきである。例えば、ＴＰＯ模倣物ペプチドの複数コピーを有するＦａｂを作出するために、ＣＤＲ３ペプチドグラフトを有する単一の重鎖クローンをいくつかの個々の軽鎖ＣＤＲ１クローンと対合させた。
【０１７６】
２つのＴＰＯ模倣物ペプチドが所与の重鎖内で組み合わされる組み合わせを、オーバーラップＰＣＲを用いて実施し、クローニングのためにフラグメントを生成した。ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間を結合する２つのオーバーラッププライマーと、隣接プライマー（例えば、軽鎖由来の「Ｎ ｏｍｐ」および「リードＢ」プライマーならびに重鎖について「リードＶＨ」および「Ｎｄｐ」プライマー）とを使用した。例えば、Ｈ−ＣＤＲ２とＨ−ＣＤＲ３とを合わせるために、第一のＰＣＲを、鋳型としてＨ−ＣＤＲ２プールしたプラスミドＤＮＡを用いて、リードＶＨ（重鎖ｐｅｌＢリーダーシグナルでベクターにおいてアニーリングするプライマー）および逆方向プライマー（ＦＲ３でアニーリングする）を用いて、実施した。そのプライマーの配列は、
【０１７７】
【化２９】

（配列番号６３）であった。別の反応において、Ｈ−ＣＤＲ３グラフトを含むプールしたプラスミドは、ＦＲ３にアニーリングする順方向プライマー（これは、上記ＦＲ３逆方向プライマーに対して相補的である）と、Ｎ−ｄｐ（これは、エピトープタグ配列でベクターにおいてアニーリングする）と共にＰＣＲを受けた。そのプライマーの配列は、
【０１７８】
【化３０】

（配列番号６４）であった。この第一ＰＣＲの産物を精製し、次いでオーバーラップＰＣＲ反応において合わせた。ここで、これら２つのフラグメントの融合は、相補的なＦＲ２配列を通して生じた。全重鎖産物を、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩにより、抗破傷風トキソイド軽鎖を含むプラスミドにクローニングした。全てにおいて、ＴＰＯ模倣物ペプチドの複数コピーを有する５つのクラスのＦａｂを、以下の表２中に詳述するように作出した。
【０１７９】
【表４】

各組み合わせライブラリー由来の２０のクローンと、Ｈ−ＣＤＲ３とＬ−ＣＤＲ１との４つの個々のクローンとを、前に記載のように、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて生物学的活性について試験した。図１０および１１を参照のこと。両実験において、陰性コントロールは、誘導されなかった細胞、無関係Ｆａｂ（抗破傷風トキソイド）で処理した細胞、ｃＭｐｌレセプターを弱くでしか結合しないＦａｂクローンで処理した細胞、およびＸ４ｂおよび／またはＸ１ｃ Ｆａｂ（ｃＭｐｌレセプターを結合するが、１つの結合ドメインしか持たず、そのためレセプターを活性化し得ない）で処理した細胞を含み得る。陽性コントロールは、ＴＰＯの添加であった。全ての残存するサンプルは、新たに形成された組み合わせライブラリー由来であった。観察され得るように、いくつかのクローンは、Ｆａｂとして有意な活性を有する。このことは、単一Ｆａｂ分子への複数のＴＰＯ模倣物ペプチドの組み込みが、２つのレセプターを結合し得、そしてレセプター活性化を引き起こし得ることを示している。
【０１８０】
実際、Ｆａｂ ５９を用いて、得られたアゴニスト活性は、ネイティブＴＰＯ活性と同程度に高いものであり得る。２つのＴＰＯ模倣物ペプチド（図９において同定されたＨＣ ＣＤＲ３サンプルｘ４ｃおよびＬＣ ＣＤＲ２サンプル１９）とＨｉｓ６タグとを含むクローン５９を、ニッケルカラムクロマトグラフィーを用いてＦＰＬＣによって細菌ペリプラズム調製物から部分的に精製した。このＦａｂの活性を測定したところ、既知濃度のＴＰＯに直接比較したルシフェラーゼ活性のｃＭｐｌ−Ｒ特異的誘導によって概算されるように、ＴＰＯの活性におおよそ等価であることが見い出された（図１２を参照のこと）。Ｆａｂ ５９抗体濃度を決定するために、定量的ウェスタンブロットを実施した。
【０１８１】
これらのＦａｂ（または種々の他の２つのＣＤＲ組み合わせ）は、治療製品として使用され得る。あるいは、これらのクローンは、活性が維持される限り治療剤としての使用のために、フレームワーク生殖系列配列に変換され得る（コドン最適化と共に、または用いずにのいずれかで）。
【０１８２】
（実施例４）
ＦａｂクローンＸ４ｂにおけるＴＰＯ模倣物ペプチドグラフトを、別の抗体フレームワーク５Ｇ１．１の重鎖ＣＤＲ３に移植した。５Ｇ１．１の構築は、米国出願番号０８／４８７，２８３（本明細書中に参考として援用される）中に記載されている。配列を、ネイティブＣＤＲ３を
【０１８３】
【化３１】

（配列番号６５）と置換するような様式で、５Ｇ１．１にクローニングした。アミノ酸に翻訳されたペプチドグラフトは、
【０１８４】
【化３２】

（配列番号６６）である。５Ｇ１＋ペプチドは、全ＩｇＧ抗体として生成された（図１３Ａおよび１３Ｂを参照のこと）。
【０１８５】
精製５Ｇ１．１＋ペプチド抗体ならびに親５Ｇ１．１を、ＦＡＣＳ分析によって、ｃＭｐｌレセプターに結合するそれらの能力について分析した。レセプターを発現する２９３細胞およびレセプターを発現しない２９３細胞への結合を比較した。図１４を参照のこと。ＦＡＣＳ染色を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＰＥ結合体化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを用いて検出を行ったことを除いて、本質的に本明細書中に前に記載したように実施した。３°のみの抗破傷風トキソイド無関係ＦａｂおよびＦａｂ Ｘ１ａ（これは、ｃＭｐｌレセプターに弱く結合する）の陰性コントロールは全て、非常にわずかな染色を示した。しかし、Ｆａｂ Ｘ１ｃおよびＸ４ｂの結合は、５Ｇ１．１＋ペプチドと同様の強い染色を示した。これらのクローンのいずれもが、レセプターを発現しない細胞への結合を示さなかった。このことは、細胞染色が、ｃＭｐｌレセプターの特異的認識を通して生じていることを示している。ＴＰＯ模倣物ペプチドを有さない親５Ｇ１．１は、試験した細胞のいずれに対しても染色を示さなかった。
【０１８６】
ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、５Ｇ１．１＋ペプチド全ＩｇＧがｃＭｐｌレセプターを活性化する能力を決定した（図１５を参照のこと）。本明細書中に示した結果は、全ＩｇＧの立体配置が、活性化のためにこれら２つのｃＭｐｌレセプターを生産的に一緒にする能力において構造制限を引き起こすことを示している。重鎖ＣＤＲ３位置にＴＰＯ模倣物ペプチドを含む５Ｇ１．１全ＩｇＧ構築物の活性は、弱く活性化するのみであり、等価な活性を刺激するためには、ＴＰＯに比較して約１００〜２００倍高いモル濃度が必要であった。結合実験を用いて前に観察されたように、ペプチドを含有する５Ｇ１．１による活性化は、ｃＭｐｌ−Ｒが細胞表面に発現された場合にのみ観察された。ペプチドを含まない親５Ｇ１．１を用いると、レセプター特異的結合も活性も観察されなかった。これらの結果は、ＴＰＯ模倣物ペプチドおよび選択されたアミノ酸が隣接する配列の結合および活性は、限定されないか、または破傷風トキソイド抗体フレームワークに特異的であるが、他の抗体フレームワークに適用され得ることを実証している。従って、パンニングの間に選択された隣接アミノ酸配列は、所与のＣＤＲ位置内でのＴＰＯ模倣物ペプチドの提示に対して特異的であるが、抗体フレームワークのアミノ酸配列に対しては特異的ではない。
【０１８７】
（実施例５）
（ヒト抗体フレームワーク中にグラフト化されたＥＰＯ模倣物配列のライブラリー構築）
アゴニストＥＰＯ模倣物ペプチド
【０１８８】
【化３３】

（配列番号３）（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら１９９６においてＥＭＰ２と称される）を、抗破傷風トキソイドＦａｂ重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域中に別々にグラフト化し、
【０１８９】
【化３４】

（配列番号７１）として２つの抗体ライブラリーを作出した。ＮＮＫドーピングストラテジーを用いて、ランダム化された位置を生成した。ＴＰＯ模倣物ペプチドと同様に、ＥＰＯ模倣物ペプチドに隣接する２つのアミノ酸を、ペプチドの最適な提示について選択するためにランダム化した。さらに、システイン残基（これらは、本来の環状ペプチドにおいてジスルフィド架橋を形成した）をランダム化した。これは、ＣＤＲが既にループ構造を形成し、そのためペプチドを拘束するためにジスルフィド架橋が必要でなくなったためだけでなく、これらシステインが実際に、抗体の正常なジスルフィド結合を破壊し得るため、行った。
【０１９０】
抗ＴＴ抗体重鎖のＣＤＲ３を、ＥＰＯペプチドライブラリーグラフトによって完全に置換した。ライブラリーの生成は、本質的にＴＰＯ重鎖ＣＤＲ２ライブラリーについて記載した通りであった。ＨＣＤＲ３ライブラリーについて、２つの代替プライマーを使用した：逆方向プライマーＨＲ３ ＥＰＯ ＡＮＴＩ
【０１９１】
【化３５】

（配列番号２１）（これは、重鎖ＦＲ３の末端でアニーリングする）および順方向プライマーＨＲ３ ＥＰＯ ＣＯＤＥ
【０１９２】
【化３６】

（配列番号２２）（これは、重鎖のＦＲ４でアニーリングする）。
【０１９３】
軽鎖ＣＤＲ３ ＥＰＯペプチドライブラリーを、以下のプライマーを用いて、本質的に軽鎖ＣＤＲ３ ＴＰＯペプチドライブラリーについて上述した通りに構築した：逆方向プライマーＬＲ３ ＥＰＯ ＡＮＴＩ
【０１９４】
【化３７】

（配列番号２３）（これは、軽鎖ＦＲ３の末端でアニーリングする）および順方向プライマーＬＲ３ ＥＰＯ ＣＯＤＥ
【０１９５】
【化３８】

（配列番号２４）（これは、軽鎖のＦＲ４にアニーリングする）。
【０１９６】
（ＥＰＯ模倣物ペプチド重鎖ＣＤＲ３ライブラリーおよび軽鎖ＣＤＲ３ライブラリーの選択）
ペプチド提示についての選択を、可溶性ＥＰＯレセプターにおける固相パンニングによって実施した。この方法において、１ｕｇの精製ヒトＥＰＯ可溶性Ｒ（ｈＥＰＯ−ｓＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ ｃａｔ＃３０７−ＥＲ−０５０から））を４℃で一晩、マイクロタイター皿上で固定化した。遊離ｈＥＰＯ−ｓＲを洗い流した後、プレートを、３７℃で１時間、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。上記のように調製したファージをウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。洗浄は、１回の洗浄当たり室温で５分間、ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を用いて実施した。第一のパンニングラウンドにおいて１回、第二のパンニングラウンドにおいて５回、第三のパンニングラウンド１０回、および第四のパンニングラウンドにおいて１０回の洗浄を実施した。洗浄工程が終わった後、結合されたＦａｂ−ファージを、３０ｕｌの溶出緩衝液で、室温で１０分間、溶出した。次いで、溶出されたファージを、実施例１に記載のように、中和し、そして増幅した。
【０１９７】
（実施例６）
ライブラリーを、ヒトκ遺伝子フラグメント（この場合、軽鎖のＣＤＲ２）のコレクションにＴＰＯ模倣物ペプチドおよび前に選択された隣接アミノ酸
【０１９８】
【化３９】

（配列番号６１）を挿入することによって生成した。複数のヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ドナー由来のヒトκ軽鎖のストックは、前に生成されており、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋にクローニングされている。これらの構築物を、抗体遺伝子フラグメントの供給源として供した。
【０１９９】
（抗体遺伝子バンク）
ヒトＰＢＬ由来全ＲＮＡをＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を用いて単離し、続いてキット指示書に従って、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてｍＲＮＡ精製した。第一鎖ｃＤＮＡを、改変オリゴｄＴプライマーと共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ ＩＩ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて作製した。このプライマーの配列は、
【０２００】
【化４０】

（配列番号６２）であった。サンプルを、キットの指示書に従って、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によってクリーンアップした。軽鎖産物を、逆方向「ＮｏｔＩ」プライマーおよび順方向プライマー（これは、第一鎖ｃＤＮＡ上のκ鎖のフレームワーク１（ＦＲ１）位置でアニーリングした）を用いて増幅した。「ＮｏｔＩ」プライマーは、改変オリゴｄＴプライマーの５’末端に同一である配列を有した
【０２０１】
【化４１】

（配列番号７２）。κＦＲ１プライマーのセットは以下の通りであった：
【０２０２】
【化４２−１】

【０２０３】
【化４２−２】

代表的な増幅反応は、２μｌのｃＤＮＡ反応物、ｄＮＴＰ、「ＮｏｔＩ」逆方向プライマー、ＸＶＢ順方向プライマーの１つ、Ｏｐｔｉ−ｐｒｉｍｅ緩衝液＃５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、およびＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含んだ。サンプルを２分間、９４℃に加熱し、次いで、１０サイクル（９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、および７２℃で１分）、続いて２０サイクル（９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、および７２℃で（１分＋５秒／サイクル）に供した。これらのサイクルの後に、７２℃（７分）で伸長インキュベーションを行い、その後４℃で保持した。産物をエタノール沈殿し、そして次いでゲル精製した。約８５０ｂｐのフラグメントを単離し、そして次いでＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化した。得られたκ産物を、同様にＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋に連結した。連結産物を、Ｔｏｐ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にエレクトロポレートし、そして一晩増殖させた。この細菌ペレットを使用して、ＱＩＡＧＥＮのＭＡＸＩｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キットを用いてκライブラリーＤＮＡを単離した。
【０２０４】
（ＴＰＯ模倣物ペプチドを有するフレームワークライブラリーの構築）
ＴＰＯ軽鎖フレームワークライブラリーの構築のために、４人の異なる患者由来の等量の４つのκ軽鎖ライブラリーを、ＰＣＲ反応のための出発鋳型（反応につき全体で２５ｎｇ）として使用した。ＴＰＯ模倣物ペプチドおよび選択した隣接アミノ酸を、オーバーラップＰＣＲにより軽鎖に組み込んだ。第一のＰＣＲラウンドにおいて、逆方向プライマー（ＶＫ ＡＮＴＩプライマー）のセット（これらは、κ軽鎖ＦＲ２に結合した）を、順方向Ｔ７ ｓｅｑ−Ｆプライマー
【０２０５】
【化４３】

（配列番号８６）と別々に組み合わせて、軽鎖のＮ末端片およびＬＣ ＣＤＲ２位置内のＴＰＯ模倣物ペプチドの一部を合成した。第二のセットの順方向プライマー（ＶＫ ＣＯＤＥプライマー）（これらは、ＦＲ３に結合した）を、Ｔ３逆方向プライマー
【０２０６】
【化４４】

（配列番号８７）と別々に組み合わせ、ＬＣ ＣＤＲ２位置内のＴＰＯ模倣物ペプチドの残りおよび軽鎖のＣ末端側半分をＰＣＲにより合成した。プライマー組み合わせの各対毎に、別個の反応を二連で実施した。
【０２０７】
【化４５−１】

【０２０８】
【化４５−２】

【０２０９】
【化４５−３】

第一のＰＣＲラウンドからのフラグメントをゲル精製した。次いで、それらの精製フラグメントを、オーバーラップＰＣＲ反応において、抗体ファミリー特異的様式で組み合わせて、全長鎖を生成した。各ファミリーについての反応を、各反応において軽鎖のＮ末端片およびＣ末端片の両方を４０ｎｇで用いて、三連で実施した。これら反応を、Ｔ３およびＴ７ Ｓｅｑ−Ｆプライマーを添加する前に１０サイクル実施し、続いてプライマー添加後にさらに２５サイクル実施した。全長ＬＣ融合ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、そして次いで再度ゲル精製した。次いで、軽鎖挿入片を適切なファージディスプレイベクターに連結した。このベクターは、同様にＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し、ゲル精製しておいた。使用したｐＲＬ５−κベクターは、ＬＣフラグメントと適合する制限部位を有し、そしてネイティブＳａｃＩ部位からＣ末端のＣｙｓまでの残りのκ定常領域を含んだ。さらに、抗破傷風トキソイド重鎖を、Ｆａｂ生成のためにＸｈｏＩおよびＳｐｅＩによってベクターに挿入した。
【０２１０】
連結混合物を、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）に、エレクトロポレーションによって形質転換し、そして増幅した。ライブラリーを、前に記載したのと同様にして、ｃＭｐｌ−Ｒでトランスフェクトした２９３ ＥＢＮＡ細胞において４ラウンドパンニングした。パンニングの間に得られたクローンを、前に記載したように、ｃＭｐｌ−Ｒを用いて、または用いずにトランスフェクトした２９３ ＥＢＮＡ細胞において、ＦＡＣｓ分析によって、結合についてスクリーニングした。ｃＭｐｌ−Ｒを特異的に結合した多数のクローンを得た。Ｂｓｔ Ｎ１での消化により得られた軽鎖のＤＮＡフィンガープリンティングは、クローンが、５つの異なる群に分割され得ることを示した。これらのクローンのうち８つの部分配列決定が、少なくとも２つの異なるκ軽鎖ファミリーからのフレームワークがパンニングの間に選択された（ＶＫ１およびＶＫ３）ことを示した。初期試験において、軽鎖フレームワーククローンのうち３つをＸ４ｂの重鎖と組み合わせて、２つのＴＰＯ模倣物ペプチドを有するＦａｂを作出した。これらのクローンは、前に記載されるように、ルシフェラーゼアッセイにおいてｃＭｐｌ−Ｒの活性化を誘導した。１つのこのようなクローン４２９／Ｘ４ｂの細菌上清を用いる活性化のレベル（図１６を参照のこと）は、既知濃度のＴＰＯに対して活性を比較し、そして定量的ウェスタンブロットを用いて上清中の抗体の濃度を決定することにより概算されるように、ＴＰＯを用いて観察されたよりも約１０〜２０倍低かった。さらなるクローンが、より大きな活性を有するクローンを同定するために、同様にしてスクリーニングされ得る。
【０２１１】
これらのＦａｂ（または種々の他のＬＣ、ＨＣまたは鎖内ＣＤＲ組み合わせ）は治療製品として使用され得る。あるいは、これらのクローンは、活性が維持される限り治療剤としての使用のために、フレームワーク生殖系列配列に変換され得る（コドン最適化と共に、または用いずにのいずれかで）。
【０２１２】
（ファージディスプレイベクターｐＡＸ１３１およびｐＲＬ５の改変）
ｐＡＸ１３１におけるＮｏｔＩ部位を、クレノウポリメラーゼを用いてＮｏｔＩでベクターを消化してＮｏｔＩオーバーハングをフィルインして、そして次いでこのベクターを再連結することにより、除去した。図１７を参照のこと。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでｐＡＸ１３１を消化することにより、さらなる改変を行った。このような消化により取り出されたエレメントを置換した挿入片を、以下の変更を有するオーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて生成した：ＳａｃＩ部位の新規ＸｂａＩ部位への変換（以下のプライマー配列中の一重下線）、本来のＸｂａＩ部位からＮｏｔＩ部位への変換（以下のプライマー配列中の二重下線）、およびベクターのＸｂａＩ消化生成オーバーハングと適合するＳｐｅＩオーバーハングを有する挿入片の末端化。ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断ベクターへのＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ挿入片の連結は、ＳｐｅＩ／ＸｂａＩハイブリッドを生じた。このハイブリッドは、もはやその部位でＳｐｅＩまたはＸｂａＩのいずれでも切断されない。使用したオリゴの配列は、以下の通りであった：「ＥｃｏＳｐｅ」
【０２１３】
【化４６】

（配列番号１０７）、および「ＳｐｅＥｃｏ」
【０２１４】
【化４７】

（配列番号１０８）。
【０２１５】
作出された中間体ベクターは、ｐＡＸ１３１Ｘｂａ／Ｎｏｔであった。ヒトκ定常領域をＸｂａＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入し、ｐＡＸ１３１−κを生成した（図１８を参照のこと）。上流ＸｂａＩ部位を導入したプライマー、および下流位置にＴＡＡ停止コドン続いてＮｏｔＩ部位を導入したプライマーを用いて、ヒトκ定常領域をヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した（。用いたプライマーは、ＣＫＸｂａＩ
【０２１６】
【化４８】

（配列番号１０９）およびＣＫＮｏｔＩ
【０２１７】
【化４９】

（配列番号１１０）であった。
【０２１８】
ｐＡＸ１３１−κに組み込まれた軽鎖クローニング改変物を、ＥｃｏＲＩからＸｈｏＩまでのフラグメントを移動させることによりｐＲＬ５ベクター（上記のようにそのＮｏｔＩ部位が除去されるように改変された）にシャトル挿入した。図１９および２０を参照のこと。このベクターをｐＲＬ５−κと称した。（図２１Ａ〜Ｉを参照のこと）。
【０２１９】
（実施例７）
（コアＨ−ＣＤＲ２ライブラリー）
さらなるＨＣ ＣＤＲ２ライブラリーを構築した。このライブラリーでは、各側に１つのランダムアミノ酸が隣接したＴＰＯ模倣物ペプチドのコア配列
【０２２０】
【化５０】

（配列番号１１２）を重鎖に挿入し、ＣＤＲ２
【０２２１】
【化５１】

（配列番号１１３）を部分的に置換した。重鎖部分ＣＤＲ２置換ライブラリーの構築もまた、前に記載のＨＲ２ ｃＭｐｌプライマーの代わりに特異的プライマー８ＨＣＲ２ａｎｔｉ０
【０２２２】
【化５２】

（配列番号１１４）（これは、重鎖ＦＲ２の末端でアニーリングする）およびプライマー８ＨＣＲ２ｃｏｄｅ
【０２２３】
【化５３】

（配列番号１１５）（これは、重鎖ＦＲ３の開始部でアニーリングする）を用いたことを除いて、重鎖ＣＤＲ２ライブラリーについて前に記載したようにして実施した。重鎖部分ＣＤＲ２置換ライブラリーを、前に記載のようにｃＭｐｌ−Ｒでトランスフェクトした２９３ ＥＢＮＡ細胞において４ラウンドパンニングした。これらのクローンはいまや、前に記載したように、ＦＡＣＳ分析によって、陽性結合クローンについてスクリーニングされ得る。
【０２２４】
（実施例８）
個々のクローンを、重鎖ＣＤＲ３クローンＸ４ｂ（図５および９を参照のこと）を重鎖ＣＤＲ２クローン１９（図９を参照のこと）と組み合わせて、２つのＴＰＯ模倣物ペプチドを有する新規Ｆａｂクローンを作出することにより作出した。このクローンを、コドン最適化および生殖系列配列への変換によって、さらに改変した。この新規クローン（１１６と名付けた（図２２））を、９５％均質性にまで精製した。次いで、前に記載したように、ルシフェラーゼベースのアッセイを用いて、この精製１１６ Ｆａｂの比活性を試験した。精製１１６の比活性は、ＴＰＯより約３０倍低いことが見出された（図２３）。
【０２２５】
（実施例９）
第三の重鎖ＣＤＲ２ライブラリーを構築した。これは、破傷風トキソイド（ＴＴ）重鎖ＣＤＲ２の一部を、各側に２つのランダムアミノ酸によって隣接されたＴＰＯ模倣物ペプチドと置換している。
【０２２６】
コンピューターモデリングは、本来のＴＴ ＨＣ ＣＤＲ２の４アミノ酸を保持することが、重鎖の安定性および折り畳みに対して有益であることを示した。詳細には、ＴＴ重鎖ＣＤＲ２の最初の３つのアミノ酸（ＧＬＹ−ＩＬＥ−ＰＨＥ）および重鎖ＣＤＲ２の最後のアミノ酸（ＧＬＹ）。従って、最終産物は、これら本来の４アミノ酸を、最初の３つの本来のアミノ酸と最後の本来のアミノ酸との間に位置したＴＰＯ模倣物ペプチドおよびランダム隣接アミノ酸と共に含む：
【０２２７】
【化５４】

（配列番号１１９）。
【０２２８】
重鎖部分ＣＤＲ２置換ライブラリーの構築もまた、前に記載のＨＲ２ ｃＭｐｌプライマーの代わりに特異的プライマーＨＣＲ２＋ＡＮＴＩ
【０２２９】
【化５５】

（配列番号１２０）（これは、重鎖ＦＲ２の末端でアニーリングする）およびプライマーＨＣＲ２＋ＣＯＤＥ
【０２３０】
【化５６】

（配列番号１２１）（これは、重鎖ＦＲ３の開始部にアニーリングする）を用いたことを除いて、前の２つの重鎖ＣＤＲ２ライブラリーについて記載したようにして実施した。重鎖部分ＣＤＲ２置換ライブラリーを、前に記載のように、ｃＭｐｌ−Ｒでトランスフェクトした２９３ ＥＢＮＡ細胞において４ラウンドパンニングした。強い結合特徴を有する多数のクローンを得、そして配列決定した（図２４）。
【０２３１】
パンニングからのラウンド４プールのクローンは、第二のＴＰＯ模倣物ペプチドの挿入のための出発点として使用される。例えば、このライブラリーは、サブクローニングによって、重鎖ＣＤＲ３にＴＰＯ模倣物ペプチドを含むクローンＸ４ｂと組み合わされて、２つのＴＰＯ模倣物ペプチド（重鎖ＣＤＲ２中に１つおよび重鎖ＣＤＲ３中に１つ）を含むクローンを作出する。これらの新規クローンは、ＴＰＯ模倣物活性についてスクリーニングされる。さらに、この第二のペプチドは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３、または重鎖ＣＤＲ１中に配置され得る。
【０２３２】
本明細書中に開示された実施形態に対して種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、上記説明は、限定であると解釈されるべきでなく、好ましい実施形態の単なる例示であると解釈されるべきである。当業者は、本明細書に添付した請求項の範囲および精神内の他の改変を想起する。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】図１は、ベクターｐＲＬ４の模式図である。
【図２Ａ】図２ＡおよびＢは、ヒト破傷風トキソイド抗体フレームワークの軽鎖および重鎖のそれぞれの配列を示す。
【図２Ｂ】図２ＡおよびＢは、ヒト破傷風トキソイド抗体フレームワークの軽鎖および重鎖のそれぞれの配列を示す。
【図３】図３は、破傷風トキソイドフレームワーク抗体の重鎖ＣＤＲ３領域へのＴＰＯ模倣物ペプチドＡＦ１２５０５のグラフト化を示すダイアグラムである。ＸＸは、隣接するランダムアミノ酸を表す。
【図４】図４は、重鎖ＣＤＲ３領域にクローニングされたペプチドの構築のダイアグラムである。
【図５】図５は、異なるランダム隣接残基を有するＴＰＯ模倣物ペプチドＡＦ１２０５をコードするクローンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を表す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、プラスミドｐＲＬ８の核酸配列を示す（配列番号６０）。ｐＲＬ８は、ｐＲＬ４の改変バージョンである（ｐＲＬ４はまた、ｐＣｏｍｂ ３Ｘとしても知られる）。ｐＲＬ４を、フレキシブルなリンカー（マウスκヒンジ領域）続いてＪｕｎロイシンジッパードメインを含むように、ＳｐｅＩ制限部位と近隣のＳｆｉＩ制限部位との間で改変した（下線によって示す）。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、プラスミドｐＲＬ８の核酸配列を示す（配列番号６０）。ｐＲＬ８は、ｐＲＬ４の改変バージョンである（ｐＲＬ４はまた、ｐＣｏｍｂ ３Ｘとしても知られる）。ｐＲＬ４を、フレキシブルなリンカー（マウスκヒンジ領域）続いてＪｕｎロイシンジッパードメインを含むように、ＳｐｅＩ制限部位と近隣のＳｆｉＩ制限部位との間で改変した（下線によって示す）。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、プラスミドｐＲＬ８の核酸配列を示す（配列番号６０）。ｐＲＬ８は、ｐＲＬ４の改変バージョンである（ｐＲＬ４はまた、ｐＣｏｍｂ ３Ｘとしても知られる）。ｐＲＬ４を、フレキシブルなリンカー（マウスκヒンジ領域）続いてＪｕｎロイシンジッパードメインを含むように、ＳｐｅＩ制限部位と近隣のＳｆｉＩ制限部位との間で改変した（下線によって示す）。
【図７】図７は、プラスミドｐＲＬ８の一部の模式図である。
【図８】図８は、プラスミドｐＲＬ８の一部の核酸配列（配列番号５２）を、特定の示された核酸配列に対応するアミノ酸配列（配列番号５３）と共に示す。
【図９】図９は、本明細書中における特定のＴＰＯ陽性クローンの配列を示すチャートである。
【図１０】図１０は、２つのＴＰＯ模倣物ペプチドを含む特定のＦａｂクローンの活性を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、２または３つのＴＰＯ模倣物ペプチドを含む特定のＦａｂクローンの活性を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、ルシフェラーゼ活性の誘導により反映されるように、クローン５９の活性をグラフで示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、５Ｇ１．１−ＴＰＯ重鎖のアミノ酸配列および核酸配列を示す（それぞれ配列番号６７および６８）。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、５Ｇ１．１軽鎖のアミノ酸配列および核酸配列を示す（それぞれ配列番号６９および７０）。
【図１４】図１４は、親５Ｇ１．１抗体に比較した精製５Ｇ１．１＋ＴＰＯ模倣物ペプチドのｃＭｐｌレセプター結合のＦＡＣＳ分析を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、ｃＭｐｌ−Ｒを含まないコントロールベクターでトランスフェクトした細胞およびｃＭｐｌ−Ｒを含むベクターでトランスフェクトした細胞と関連した、ＴＰＯ模倣物ペプチドを含む５Ｇ１．１抗体の比較活性を示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、クローン４２９／Ｘｂ４の配列を示す（配列番号１１６）。
【図１７】図１７は、ベクターｐＲＬ５−κを作製するための初期工程を示すフローチャートである。
【図１８】図１８は、ベクターｐＲＬ５−κを作製するためのさらなる工程を示すフローチャートである。
【図１９】図１９は、ベクターｐＲＬ５のマップである。
【図２０】図２０は、ベクターｐＲＬ５−κの模式図である。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２１Ｅ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２１Ｆ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２１Ｇ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２１Ｈ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２１Ｉ】図２１Ａ〜Ｉは、ベクターｐＲＬ５−κの核酸配列を示す。
【図２２】図２２は、クローン１１６の重鎖および軽鎖についてのアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３は、クローン１１６の活性を示す。
【図２４】図２４は、本開示内容の代替の実施形態に従う重鎖クローンの配列を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部に相当するアミノ酸残基がペプチド模倣物と置換されている領域を含む免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって、該ペプチド模倣物が、ＥＰＯ模倣物およびＴＰＯ模倣物からなる群から選択される、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項２】
前記ペプチド模倣物の少なくとも１つの末端に共有結合された少なくとも１つのアミノ酸を含む少なくとも１つの隣接配列をさらに含む、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項３】
前記少なくとも１つの隣接配列が、前記ペプチド模倣物に共有結合されているプロリンを有する隣接配列を含む、請求項２に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項４】
前記免疫グロブリン分子フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、およびＳｃＦｖフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項５】
前記免疫グロブリン分子が全ＩｇＧ分子である、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項６】
前記２つのＣＤＲが両方とも、重鎖上に位置する、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項７】
前記ＣＤＲが重鎖のＣＤＲ３と重鎖のＣＤＲ２とである、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項８】
前記ＴＰＯ模倣物が配列番号１を含む、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項９】
重鎖ＣＤＲ３およびＣＤＲ２がペプチドと置換されており、かつ該重鎖が配列番号１２５の可変領域を含む、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン分子またはそのフラグメントがヒトである、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン分子またはそのフラグメントが抗破傷風トキソイドである、請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項１２】
請求項１に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメントをコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを生成する方法であって、請求項１４に記載の宿主細胞を、該免疫グロブリンまたはそのフラグメントの発現に適した条件下で培養する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の免疫グロブリンまたはそのフラグメントと薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物。
【請求項１７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部に相当するアミノ酸残基がペプチド模倣物と置換されている領域を含む免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって、該領域が、配列番号１２６（ここで各位置のＸは、任意のアミノ酸を表す）を含む、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項１８】
前記免疫グロブリン分子またはそのフラグメントがヒトである、請求項１７に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
前記免疫グロブリン分子またはそのフラグメントが抗破傷風トキソイドである、請求項１７に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
請求項１７に記載の免疫グロブリン分子またはそのフラグメントをコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを生成する方法であって、請求項２３に記載の宿主細胞を、該免疫グロブリンまたはそのフラグメントの発現に適した条件下で培養する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項１７に記載の免疫グロブリンまたはそのフラグメントと薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】



【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２１Ｃ】

【図２１Ｄ】

【図２１Ｅ】

【図２１Ｆ】

【図２１Ｇ】

【図２１Ｈ】

【図２１Ｉ】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【公表番号】特表２００６−５１８５８５（Ｐ２００６−５１８５８５Ａ）
【公表日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５７２２１（Ｐ２００４−５５７２２１）
【出願日】平成１５年１１月１７日（２００３．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３６８９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５００１７
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン　ファーマシューティカルズ，　インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】