【課題】寛容を誘導する方法。
【解決手段】レシピエントに、補助減縮治療の短期コースを施与するか又は免疫抑制剤の短期コースを施与することにより移植片の受容を延長する短期コース及び方法を施与することを含む寛容誘導方法。

【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
この発明は、組織及び器官の移植に関するものである。
【０００２】
発明の要約
この発明は、外来抗原例えば同種又は異種の組織若しくは器官の移植片上の抗原に対する寛容を誘導する幾つかの方法を提供する。これらの方法は、個別に用いても互いに組合せて用いてもよい。例えば、補助減縮剤の短期投与例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の短期高投与量のコースが移植片の受容を有意に延長し得ることが見出されている。この発明の短期の補助減縮方法は、移植片受容を延長させるための他の１つ以上の方法と組合せることが出来る。例えば、不一致（unmatched）のドナーのクラスＩ及び他のマイナーな不一致のドナー抗原に対する寛容を誘導するための高投与量のシクロスポリン治療の短期コースをレトロウイルスでトランスフォームした骨髄細胞の移植と組合せて不一致のドナーのクラスIIに対する寛容を誘導することが出来る。不一致のドナーのクラスＩ及び他のマイナー抗原に対する寛容を誘導するために投与する高投与量シクロスポリンの短期コースを、ドナーの骨髄細胞の移植と組合せて、不一致のドナーのクラスIIに対する寛容を誘導することも出来る。
【０００３】
従って、この発明は、一面において、レシピエント哺乳動物例えば霊長類例えばヒトにおいて、ドナー霊長類からの同種移植片に対する寛容を誘導する方法であって、移植片をレシピエント中に移植して、補助減縮治療の短期コース例えば高投与量シクロスポリンの短期コースをレシピエントに施与することを含む上記の方法を特徴とする。この補助減縮治療の短期コースを、一般に、移植片をレシピエント中に導入した頃に施与する。
【０００４】
好ましくは、レシピエントは、移植片の拒絶に影響する第１の遺伝子座、例えばＭＨＣクラスＩ若しくはII遺伝子座又はマイナー抗原遺伝子座においてミスマッチであり、且つ移植片の拒絶に影響する第２の遺伝子座、例えばＭＨＣクラスＩ若しくはII遺伝子座又はマイナー抗原遺伝子座においてマッチする（又は、ミスマッチ寛容である）。第２の遺伝子座におけるマッチングは、適当な遺伝子型のレシピエント又はドナーの選択により達成することが出来る。レシピエントを、任意の寛容誘導方法例えばドナーの骨髄組織をレシピエントに投与してドナーの骨髄において発現されたドナー抗原に対する寛容を誘導すること、レシピエントの幹細胞からドナーのＭＨＣ抗原を発現させてドナー抗原に対する寛容を誘導すること、又は移植片の免疫学的特性を例えば移植片の細胞表面分子をマスクし、開裂させ若しくは改変することにより変えることによって第２の遺伝子座でミスマッチの寛容にすることが出来る。好適具体例において、第２の遺伝子座をマッチさせ又は該遺伝子座に対する寛容を誘導するために利用出来る任意の方法を用いて、移植片の拒絶に影響する第３の遺伝子座例えばＭＨＣクラスＩ若しくはII遺伝子座又はマイナー抗原遺伝子座をマッチさせ又は該遺伝子座に対する寛容を誘導することが出来る。
【０００５】
好適具体例において、レシピエント及びドナーは、クラスII遺伝子座においてマッチし且つ補助減縮治療の短期コースは、移植片における不一致のクラスＩ及び／又はマイナー抗原に対する寛容を誘導する。好適具体例において、クラスII抗原に対する寛容は、補助減縮治療の短期コース以外の方法により誘導され、補助減縮治療の短期コースは、移植片における不一致のクラスＩ及びマイナー抗原に対する寛容を誘導する。
【０００６】
好適具体例において、補助減縮治療の短期コースの持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後でその抗原の拒絶を開始するのに必要とされる期間とほぼ等しいかそれより短く、一層好適な具体例においては、この持続は、レシピエントの成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後でその抗原の拒絶を開始するのに必要とされる期間の２、３、４、５若しくは１０倍にほぼ等しいか又はそれより短い。
【０００７】
他の好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、レシピエントにおける成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する治療の不在において、例えば、補助減縮治療の所望の効果を打ち消すのに十分な濃度のステロイド剤の不在、例えば、レシピエントにおける成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する濃度のプレドニゾン（１７，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，１１、２０−トリオン）の不在において投与する。好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、ステロイド剤の不在、例えばプレドニゾンの不在において施与する。
【０００８】
好適具体例において、補助減縮治療を、移植片を導入する前又は導入した頃に開始し、短期コースは手術中又は手術後であり、或はドナー及びレシピエントはクラスＩマッチする。
【０００９】
補助減縮剤の短期投与、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の短期高投与量コースによる寛容の誘導方法を、寛容を誘導するための他の方法、例えば抗原に対する寛容を誘導するための形質導入された骨髄細胞の移植方法、例えば米国特許出願第００８／１２６，１２２号（１９９３年９月２３日出願）と組合せることが出来る。
【００１０】
従って、他の面において、この発明は、第１の種のレシピエント哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトにおける、第２の種の哺乳動物、例えばブタ、例えばミニブタからの移植片に対する寛容を誘導する方法を特徴とし、好ましくは、この移植片は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原を発現する。この方法は、第２の種のＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを、レシピエント哺乳動物の造血幹細胞例えば骨髄造血幹細胞中に挿入し、ＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡをレシピエントにおいて発現させ、好ましくは移植片をそのレシピエントに移植し、そして好ましくはそのレシピエントに補助減縮治療の短期コース例えば高投与量シクロスポリン治療の短期コースを施与することを含む。補助減縮治療の短期コースを、一般に、移植片をレシピエントに導入した頃に施与する。
【００１１】
好適具体例において、補助減縮治療の短期コースはＭＨＣ抗原の発現に続いてレシピエントに導入された移植片の不一致のクラスＩ及び／又はマイナー抗原に対する寛容を誘導する。
【００１２】
好適具体例において、補助減縮治療の短期コースの持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後でその抗原の拒絶を開始するのに要する期間とほぼ等しいか又はそれより短く、一層好適な具体例においては、この持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間の２、３、４、５若しくは１０倍とほぼ等しいか又はそれより短い。
【００１３】
他の好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、レシピエントにおける成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する治療の不在において、例えば、補助減縮治療の所望の効果を打ち消すのに十分な濃度のステロイド剤の不在、例えばレシピエントにおける成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する濃度のプレドニゾン（１７，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，１１，２０−トリオン）の不在において投与する。好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、ステロイド剤の不在、例えばプレドニゾンの不在において施与する。
【００１４】
好適具体例において、補助減縮治療を、移植片を導入する前若しくは導入する頃に開始し、短期コースは、手術中又は手術後である。
【００１５】
好適具体例は、ＤＮＡ挿入前にレシピエント哺乳動物から細胞を取り出し、ＤＮＡ挿入後にレシピエント哺乳動物に戻すもの、ＤＮＡを移植片を得た哺乳動物個体から得るもの、ＤＮＡを移植片を得た哺乳動物個体と同系である哺乳動物個体から得るもの、ＤＮＡを移植片を得た哺乳動物個体とＭＨＣマッチした好ましくは同一の哺乳動物個体から得るもの、ＤＮＡがＭＨＣクラスＩ遺伝子を含むもの、ＤＮＡがＭＨＣクラスII遺伝子を含むもの、ＤＮＡを例えばレトロウイルス例えばMoloneyに基づくレトロウイルスにより形質導入により細胞に挿入するもの及びＤＮＡをレシピエントに導入した後に少なくとも１４日、好ましくは３０日、一層好ましくは６０日、最も好ましくは１２０日にわたってレシピエントの骨髄細胞及び／又は末梢血液細胞においてそのＤＮＡが発現されるものを含む。
【００１６】
他の好適具体例は、造血幹細胞の移植前に、例えばレシピエント哺乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで照射すること（レシピエントの骨髄を涸渇又は部分的に涸渇させるための全身照射）により造血空間を創るステップ、造血幹細胞移植前に、レシピエント哺乳動物を１回以上約７００ラドの胸腺照射で照射するか又はここに記載したように免疫抑制剤の短期コースをレシピエントに施与することによる胸腺Ｔ細胞の不活性化を含む。
【００１７】
他の好適具体例は、移植片の移植前に、例えば第２の種の哺乳動物から得た器官、例えば肝臓及び腎臓を血液灌流させることにより、レシピエント哺乳動物の血液から天然の抗体を涸渇させるステップを含む（器官の血液灌流中に、血液中の抗体は期間の細胞表面の抗原に結合し、それ故、血液から除去される）。
【００１８】
他の好適具体例において、この方法は、更に、造血幹細胞移植前に、レシピエント中に該レシピエント哺乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体を導入することを含む。
【００１９】
他の好適具体例は、更に、ドナーから得た移植片例えば肝臓又は腎臓をレシピエント中に導入するステップを含む。
【００２０】
他の面において、この発明は、レシピエント哺乳動物、好ましくは霊長類例えばヒトにおいて、同種のドナーから得られた移植片に対する寛容を誘導する方法を特徴とし、その移植片は好ましくはＭＨＣ抗原を発現する。この方法は、ドナーのＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡをレシピエントの造血幹細胞、例えば骨髄造血幹細胞中に挿入し、このＭＨＣをコードするＤＮＡをレシピエント中で発現させ、好ましくはこの移植片をレシピエントに移植し、そして好ましくはレシピエントに補助減縮治療の短期コース例えば高投与量シクロスポリンの短期コースを施与することを含む。この補助減縮治療の短期コースを、一般に、移植片をレシピエント中に導入した頃に施与する。
【００２１】
好適具体例において、この補助減縮治療の短期コースは、ＭＨＣ抗原の発現に続いてレシピエント中に導入された移植片の不一致のクラスＩ及び／又はマイナー抗原に対する寛容を誘導する。
【００２２】
好適具体例において、補助減縮治療の短期コースの持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間とほぼ同じかそれより短く、一層好適な具体例においては、この持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間の２、３、４、５若しくは１０倍にほぼ等しいか又はそれより短い。
【００２３】
他の好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、レシピエントにおける成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する治療の不在において、例えば補助減縮治療の所望の効果を打ち消すのに十分な濃度のステロイド剤の不在、例えばレシピエントにおける成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する濃度のプレドニゾン（１７，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，１１，２０−トリオン）の不在において投与する。好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、ステロイド剤の不在、例えばプレドニゾンの不在において施与する。
【００２４】
好適具体例において、補助減縮治療を、移植片を導入する前又は導入した頃に開始し、短期コースは手術中であるか又は手術後であり、或はドナー及びレシピエントはクラスＩマッチする。
【００２５】
好適具体例は、ＤＮＡ挿入前に細胞をレシピエントから取り出してＤＮＡ挿入後にレシピエントに戻すもの、ＤＮＡがＭＨＣクラスＩ遺伝子を含むもの、ＤＮＡがＭＨＣクラスII遺伝子を含むもの、ＤＮＡを例えばレトロウイルス例えばMoloneyに基づくレトロウイルスにより形質導入により細胞中に挿入するもの及びＤＮＡをレシピエント中に導入してから少なくとも１４日、好ましくは３０日、一層好ましくは６０日、最も好ましくは１２０日後に、ＤＮＡがレシピエントの骨髄細胞及び／又は末梢血液細胞において発現されるものを含む。
【００２６】
他の好適具体例において、この方法は、更に、造血幹細胞の移植前に、レシピエント中に該レシピエント哺乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体を導入することを含む。
【００２７】
好適具体例において、移植片は、肝臓又は腎臓である。
【００２８】
他の好適具体例は、造血幹細胞の移植前に、例えばレシピエント哺乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで照射すること（レシピエントの骨髄を涸渇させ又は部分的に涸渇させるための全身照射）により造血空間を創るステップ、造血幹細胞の移植前に１回以上レシピエント哺乳動物を例えば約７００ラドの胸腺照射で照射し又は上記のように免疫抑制剤の短期コースをレシピエントに施与することによる胸腺Ｔ細胞の不活性化を含む。
【００２９】
他の好適具体例は、移植片の移植前に、例えば第２の種の哺乳動物から得た器官、例えば肝臓又は腎臓を血液灌流することにより、レシピエント哺乳動物の血液から天然の抗体を涸渇させることを含む（器官の血液灌流において、血液中の抗体は、器官の細胞表面の抗原と結合し、それ故、血液から除去される）。
【００３０】
補助減縮剤の短期間投与、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の短期の高投与量コースで寛容を誘導する方法を、他の寛容を誘導するための方法、例えば抗原に対する寛容を誘導するためのドナー幹細胞の移植を用いる寛容を誘導する方法、例えば１９９２年２月１９日に出願された米国特許出願第０７／８３８，５９５号に記載された方法と組合せることが出来る。
【００３１】
従って、他の面において、この発明は、第１の種のレシピエント哺乳動物、例えば霊長類例えばヒトにおいて第２の哺乳動物好ましくは不調和の種例えばブタ例えばミニブタ又は不調和の霊長類種から得た移植片に対する寛容を誘導する方法を特徴とする。この方法は、好ましくは移植片の移植前又は移植と同時に、例えば静脈注射によりレシピエント哺乳動物に、第２の種の造血幹細胞例えば骨髄細胞又は胎児の肝若しくは脾臓細胞を導入すること（好ましくは、これらの造血幹細胞は、レシピエント哺乳動物中の部位に向かう）、（適宜に）例えば造血幹細胞をレシピエント哺乳動物中に導入する前に該レシピエント哺乳動物のナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体をそのレシピエント哺乳動物中に導入することによりレシピエント哺乳動物のナチュラルキラー細胞を不活性化すること、好ましくは移植片をそのレシピエント中に移植すること及び好ましくはレシピエントに補助減縮治療の短期コース例えば高投与量シクロスポリンの短期コースを施与することを含む。補助減縮治療の短期コースを、一般に、移植片をレシピエント中に導入した時点で施与する。
【００３２】
好適具体例において、補助減縮治療の短期コースは、レシピエント中に導入された移植片の不一致のクラスＩ及び／又はマイナー抗原に対する寛容を誘導する。
【００３３】
好適具体例において、補助減縮治療の短期コースの持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間とほぼ同じか又はそれより短く、一層好適な具体例においては、この持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間の２、３、４、５若しくは１０倍とほぼ同じか又はそれより短い。
【００３４】
他の好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、レシピエントの成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する治療の不在において、例えば補助減縮治療の所望の効果を打ち消すのに十分な濃度のステロイド剤の不在、例えばレシピエントの成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する濃度のプレドニゾン（１７，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，１１，２０−トリオン）の不在において投与する。好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、ステロイド剤の不在、例えばプレドニゾンの不在において施与する。
【００３５】
好適具体例において、補助減縮治療を、移植片を導入する前又は導入する頃に開始し、又は短期コースは手術中であり、短期コースは手術後である。
【００３６】
下記において一層詳細に説明するように、これらの造血細胞は、レシピエントに、Ｂ細胞及びＴ細胞レベルの両方における寛容を誘導することによって、後に続く移植片に対する準備をさせる。好ましくは、造血細胞は、胎児の肝若しくは脾臓細胞、又は未成熟細胞を含む骨髄細胞（即ち、未分化造血幹細胞、これらの所望の細胞を投与前に骨髄から分離することが出来る）であり、又はかかる細胞を含む複合骨髄試料を用いることが出来る。
【００３７】
抗ＮＫ抗体の１つの源は、抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清である。下記で論ずるように、好ましくは、Ｔ細胞並びにＮＫ細胞を溶解させる第２の抗成熟Ｔ細胞抗体をも投与することが出来る。Ｔ細胞を溶解させることは、骨髄及び異種移植片生存の両者にとって有利である。抗Ｔ細胞抗体は、抗ＮＫ抗体と共に抗胸腺細胞抗血清中に存在する。抗ＮＫ又は抗Ｔ細胞抗体の反復投与が好ましい。モノクローナル調製物をこの発明の方法で用いることが出来る。
【００３８】
他の好適具体例は、レシピエント哺乳動物へドナー種特異的間質組織、好ましくは造血間質組織例えば胎児の肝又は胸腺を導入するステップを含む。好適具体例において、間質組織を、造血幹細胞と同時に又はそれより前に導入し、造血幹細胞を、抗体と同時に又はそれより前に導入する。
【００３９】
他の好適具体例は、第２の種と同じ哺乳動物が移植片及び造血細胞の一方又は両方のドナーであるもの、及び抗体が例えばウマ又はブタから得られた抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清であるものを含む。
【００４０】
他の好適具体例は、造血幹細胞の移植前に、例えばレシピエント哺乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで照射すること（レシピエントの骨髄を涸渇させ又は部分的に涸渇させるための全身照射）により造血空間を創るステップ、造血幹細胞移植前に、レシピエント哺乳動物を１回以上約７００ラドの胸腺照射で照射するか又はここに記載したように免疫抑制剤の短期コースをレシピエントに施与することによる胸腺Ｔ細胞の不活性化を含む。
【００４１】
他の好適具体例は、造血幹細胞の移植前に、例えば第２の種の哺乳動物から得た器官、例えば肝臓又は腎臓を血液灌流することにより、レシピエント哺乳動物の血液から天然の抗体を涸渇させるステップを含む（器官の血液灌流において、血液中の抗体は、器官の細胞表面の抗原と結合し、それ故、血液から除去される）。
【００４２】
他の好適具体例において、この方法は、更に、造血幹細胞移植前に、レシピエント中に該レシピエント哺乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体を導入することを含む。
【００４３】
好適具体例において、この方法は、レシピエント中にドナーから得た移植片（それは、造血幹細胞とは異なる器官、例えば肝臓又は腎臓から得られる）を導入するステップを含む。
【００４４】
他の面において、この発明は、レシピエント哺乳動物、好ましくは霊長類、好ましくはヒトにおいて、例えば同種のドナーから得た移植片に対する寛容を誘導する方法を特徴とする。この方法は、好ましくは移植片の移植前又は移植と同時に、例えば静脈注射によりレシピエント中に、哺乳動物好ましくはドナーの造血幹細胞例えば骨髄細胞又は胎児の肝若しくは脾臓細胞を導入すること（好ましくは、造血幹細胞は、レシピエント中の部位に向かう）、（適宜に）レシピエントのＴ細胞を、例えばレシピエントに造血幹細胞を導入する前に、そのレシピエントのＴ細胞に結合し得る抗体をそのレシピエントに導入することにより不活性化すること、好ましくは、移植片をそのレシピエントに移植すること及び、好ましくは補助減縮治療の短期コース、例えば高投与量シクロスポリンの短期コースをレシピエントに施与することを含む。補助減縮治療の短期コースを、一般に、移植片をレシピエントに導入する時点で施与する。
【００４５】
好適具体例において、補助減縮治療の短期コースは、レシピエントに導入された移植片の不一致のクラスＩ及びマイナー抗原に対する寛容を誘導する。
【００４６】
好適具体例において、補助減縮治療の短期コースの持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間とほぼ同じか又はそれより短く、一層好適な具体例においては、その持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間の２、３、４、５若しくは１０倍とほぼ同じか又はそれより短い。
【００４７】
他の好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、レシピエントの成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する治療の不在において、例えば補助減縮治療の所望の効果を打ち消すのに十分な濃度のステロイド剤の不在、例えばレシピエントの成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する濃度のプレドニゾン（１７，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，１１，２０−トリオン）の不在において投与する。好適具体例において、補助減縮治療の短期コースを、ステロイド剤の不在、例えばプレドニゾンの不在において施与する。
【００４８】
好適具体例において、補助減縮治療を、移植片を導入する前又は導入する頃に開始し、短期コースは手術中であり、短期コースは手術後であり、ドナー及びレシピエントはクラスＩマッチする。
【００４９】
好適具体例において、造血幹細胞を抗体の投与と同時に又は投与前に導入し、この抗体は抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清であり、そしてこの抗血清はウマ又はブタから得られる。
【００５０】
他の好適具体例は、造血幹細胞移植前に、レシピエントのＮＫ細胞を、例えばレシピエント中にレシピエント哺乳動物のＮＫ細胞に結合し得る抗体を導入することにより不活性化又は涸渇させる更なるステップを含み及び同じ個体が移植片及び骨髄の両者のドナーであるものを含む。
【００５１】
他の好適具体例は、造血幹細胞移植前に、例えばレシピエント哺乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで照射すること（レシピエントの骨髄を涸渇させ又は部分的に涸渇させるための全身照射）により造血空間を創るステップ、造血幹細胞移植前に１回以上レシピエント哺乳動物を例えば約７００ラドの胸腺照射で照射し又はここに記載のようにレシピエントに免疫抑制剤の短期コースを施与することにより胸腺Ｔ細胞を不活性化することを含む。
【００５２】
他の好適具体例は、骨髄移植前に、ドナーから得た器官例えば肝臓又は腎臓を血液灌流することにより、レシピエントの血液から天然の抗体を吸収する更なるステップを含む。
【００５３】
好適具体例は、レシピエント哺乳動物にドナー種特異的間質組織好ましくは造血間質組織例えば胎児の肝又は胸腺を導入するステップを含む。
【００５４】
好適具体例において、この方法は、レシピエント中に造血幹細胞と異なる期間例えば肝臓又は腎臓から得た移植片を導入するステップを含む。
【００５５】
補助減縮剤の短期投与例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の短期高投与量コースによる寛容を誘導する方法は、更に他の寛容を誘導する方法、例えば異種胸腺移植片の移植を利用して寛容を誘導する方法例えば１９９３年１２月７日出願の米国特許出願第０８／１６３，９１２号に記載された方法、寛容促進若しくはＧＶＨＤ阻止性サイトカインの活性レベルを増大させ又は寛容阻止若しくはＧＶＨＤ促進性サイトカインの活性レベルを減少させる方法例えば１９９３年８月３０日出願の米国特許出願第０８／１１４，０７２号に記載された方法、臍帯血液細胞を用いて寛容を誘導する方法例えば１９９３年１１月１０日出願の米国特許出願第０８／１５０，７３９号に記載された方法、及び１９９４年２月１４日出願のSykes及びSachsのＰＣＴ／ＵＳ９４／０１６１６号に開示された寛容を誘導するための方法と組合せることが出来る。
【００５６】
免疫抑制剤例えばシクロスポリンの短期コースを用いてそうしなければ同種移植片又は異種移植片の拒絶を促進するＴ細胞活性を減少させ又は阻害することが出来るということも発見された。
【００５７】
従って、他の面において、この発明は、レシピエント哺乳動物例えば霊長類例えばヒトにおいて、Ｔ細胞活性好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞の活性を減じ又は阻害する方法を特徴とする。この方法は、移植片に対する寛容を誘導し、レシピエントにＴ細胞好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な免疫抑制剤例えばシクロスポリンの短期コースを施与し、そして好ましくはこの移植片をこのレシピエントに移植することを含む。
【００５８】
移植片に対する寛容を、如何なる方法例えばここで論じた方法の何れによって誘導してもよい。例えば、寛容を、ドナー同種若しくは異種の造血幹細胞の投与、補助減縮剤の短期コースの施与、又は移植片の免疫学的特性を、その細胞表面分子マスクし、開裂させ若しくは改変することにより変えることによって誘導することが出来る。
【００５９】
好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースの持続は、３０日にほぼ等しいか、８〜１２日にほぼ等しいか又はそれより短い（好ましくは、約１０日）か、８〜１２日又は１０日間の２、３、４、５若しくは１０倍にほぼ等しいか又はそれより短い。
【００６０】
好適具体例において、短期コースを、寛容を誘導するための治療を開始する前又は開始する頃に、例えば異種、同種、遺伝子操作した同系の又は遺伝子操作した自己の幹細胞をレシピエントに導入する頃に開始する。短期コースを、寛容を誘導するための治療を開始する日に、例えば異種、同種、遺伝子操作した同系の又は遺伝子操作した自己の幹細胞をレシピエントに導入する日に開始する。短期コースを、寛容を誘導するための治療を開始する前又は開始後１、２、４、６、８又は１０日以内に、例えば異種、同種、遺伝子操作した同系の又は遺伝子操作した自己の幹細胞をレシピエントに導入する前又は導入後１、２、４、６、８又は１０日以内に開始する。
【００６１】
他の好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースを抗Ｔ細胞抗体と共に施与し、免疫抑制剤の短期コースは、Ｔ細胞の抗体に基づく不活性化例えばＡＴＧ抗体若しくは類似の調製物の静脈投与による不活性化によっては不活性化されないＴ細胞例えば胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分である。
【００６２】
好適具体例において、レシピエント哺乳動物は、マウス又はラット以外である。
【００６３】
この発明のＴ細胞好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化する方法は、Ｔ細胞の不活性化が望ましい寛容を誘導する方法と組合せることが出来る。この発明の抗Ｔ細胞法を、かかる寛容を誘導する方法において要求され若しくは有用であるＴ細胞の不活性化のための方法の代りに又はそれに加えて用いることが出来る。例えば、この発明の抗胸腺又はリンパ節Ｔ細胞法を、形質導入された骨髄細胞の移植のための方法例えば１９９３年９月２３日出願の米国特許出願第００８／１２６，１２２号に開示された方法と共に用いて抗原に対する寛容を誘導することが出来る。
【００６４】
従って、他の面において、この発明は、第１の種のレシピエント哺乳動物における第２の種のドナー哺乳動物からの移植片の受容を促進する方法を特徴とし、好ましくはこの移植片は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原を発現する。この方法は、第２の種のＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡをレシピエント哺乳動物の造血幹細胞例えば骨髄造血幹細胞中に挿入すること、ＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡをレシピエント中で発現させること、及び好ましくは、レシピエントに免疫抑制剤の短期コース例えばレシピエントのＴ細胞好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分なシクロスポリン治療の短期コースを施与する（そうでなければ、胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞は移植片又は操作した（engineered）細胞の生存を阻害する）ことを含む。
【００６５】
好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースの持続は、３０日にほぼ等しいか、８〜１２日にほぼ等しいか又はそれより短いか（好ましくは、約１０日）、８〜１２日又は１０日間の２、３、４、５若しくは１０倍にほぼ等しいか又はそれより短い。
【００６６】
好適具体例において、レシピエント哺乳動物は、霊長類、例えばヒトであり、ドナー哺乳動物はブタ、例えばミニブタである。
【００６７】
好適具体例において、短期コースを、遺伝子操作した幹細胞をレシピエントに導入する前又は導入する頃に開始し、短期コースを、遺伝子操作した幹細胞をレシピエントに導入する前又は導入後１、２、４、６、８又は１０日以内に開始する。
【００６８】
他の好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースを抗Ｔ細胞抗体と共に施与し、免疫抑制剤の短期コースは、抗体に基づくＴ細胞の不活性化例えばＡＴＧ若しくは類似の抗体調製物の静脈投与による不活性化によっては不活性化されないＴ細胞例えば胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分である。
【００６９】
好適具体例は、細胞を、ＤＮＡ挿入前にレシピエント哺乳動物から取り出してＤＮＡ挿入後にレシピエント哺乳動物に戻すもの、ＤＮＡを移植片を得た哺乳動物個体から得るもの、ＤＮＡを移植片を得た哺乳動物個体と同系である哺乳動物個体から得るもの、ＤＮＡを移植片を得た哺乳動物個体とＭＨＣマッチした好ましくは同一の哺乳動物個体から得るもの、ＤＮＡがＭＨＣクラスＩ遺伝子を含むもの、ＤＮＡがＭＨＣクラスII遺伝子を含むもの、ＤＮＡを形質導入により、例えばレトロウイルス例えばMoloneyに基づくレトロウイルスにより細胞に挿入するもの、及びＤＮＡが、そのＤＮＡをレシピエントに導入した後に、レシピエントの骨髄細胞及び／又は末梢血液細胞中で少なくとも１４日、好ましくは３０日、一層好ましくは６０日、最も好ましくは１２０日間にわたって発現されるものを含む。
【００７０】
他の好適具体例は、造血幹細胞移植前に、移植した幹細胞の植付け及び生存を促進するために、例えばレシピエント哺乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで照射すること（レシピエントの骨髄を涸渇させ又は部分的に涸渇させるための全身照射）によりレシピエント中に造血空間を創るステップを含む。
【００７１】
好適具体例において、この方法は更に、レシピエントへの胸腺照射例えば７００ラドの胸腺照射の施与を含む。
【００７２】
他の好適具体例は、例えば第２の種の哺乳動物から得た器官例えば肝臓又は腎臓を血液灌流することにより、レシピエント哺乳動物の血液から天然の抗体を涸渇させるステップを含む（器官の血液灌流において、血液中の抗体はその器官の細胞表面の抗原と結合し、それ故、血液から除去される）。
【００７３】
他の好適具体例は、更に、レシピエント中に、ドナーから得た移植片例えば肝臓又は腎臓を導入するステップを含む。
【００７４】
他の面において、この発明は、レシピエント哺乳動物、好ましくは霊長類例えばヒトにおける同種のドナーから得た移植片の受容を促進する方法を特徴とし、その移植片はＭＨＣ抗原を発現する。この方法は、ドナーのＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡをレシピエントの造血幹細胞例えば骨髄造血幹細胞中に挿入し、そのＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡをレシピエント中で発現させ、そして好ましくは、そのレシピエントに、レシピエントのＴ細胞好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な免疫抑制剤の短期コース例えばシクロスポリン治療の短期コースを施与する（そうしなければ、胸腺若しくはリンパ節のＴ細胞は移植片又は操作した細胞の生存を阻害する）ことを含む。
【００７５】
好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースの持続は、３０日にほぼ等しいか、８〜１２日（好ましくは、約１０日）にほぼ等しいか又はそれより短いか、８〜１２日又は１０日間の２、３、４、５若しくは１０倍にほぼ等しいか又はそれより短い。
【００７６】
好適具体例において、短期コースを、遺伝子操作した幹細胞をレシピエントに導入する前又は導入する頃に開始し、短期コースを、遺伝子操作した幹細胞をレシピエントに導入する日に開始し、短期コースを、遺伝子操作した幹細胞をレシピエントに導入する前又は導入後１、２、４、６、８又は１０日以内に開始する。
【００７７】
他の好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースを抗Ｔ細胞抗体と共に施与し、免疫抑制剤の短期コースは抗体に基づくＴ細胞の不活性化例えばＡＴＧ若しくは類似の抗体調製物の静脈投与による不活性化によっては不活性化されないＴ細胞例えば胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分である。
【００７８】
好適具体例は、細胞をＤＮＡ挿入前にレシピエントから取り出してＤＮＡ挿入後にレシピエントに戻すもの、ＤＮＡがＭＨＣクラスＩ遺伝子を含むもの、ＤＮＡがＭＨＣクラスII遺伝子を含むもの、ＤＮＡを形質導入により、例えばレトロウイルス例えばMoloneyに基づくレトロウイルスにより細胞に挿入するもの及びＤＮＡが、そのＤＮＡをレシピエント中に導入した後、レシピエントの骨髄細胞及び／又は末梢血液細胞において、少なくとも１４日、好ましくは３０日、一層好ましくは６０日、最も好ましくは１２０日発現されるものを含む。
【００７９】
他の好適具体例は、造血幹細胞移植前に、移植した幹細胞の植付け及び生存を促進するために、例えばレシピエント哺乳動物を低線量例えば１００〜４００ラドで照射すること（レシピエントの骨髄を涸渇させ又は部分的に涸渇させるための全身照射）により、レシピエント中に造血空間を創るステップを含む。
【００８０】
好適具体例において、この方法は、更に、レシピエントに対する胸腺照射例えば７００ラドの胸腺照射の施与を含む。
【００８１】
他の好適具体例は、例えば第２の種の哺乳動物から得た器官例えば肝臓又は腎臓を血液灌流することによりレシピエント哺乳動物の血液から天然の抗体を涸渇させるステップを含む（器官の血液灌流において、血液中の抗体は器官の細胞表面の抗原に結合し、それ故、血液から除去される）。
【００８２】
他の好適具体例は、更に、レシピエント中に、ドナーから得た移植片例えば肝臓又は腎臓を導入するステップを含む。
【００８３】
この発明のＴ細胞好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化する方法は、抗原に対する寛容を誘導するためにドナーの幹細胞の移植を用いる寛容を誘導する方法例えば１９９２年２月１９日出願の米国特許出願第０７／８３８，５９５号に記載された方法（参考として本明細書中に援用する）と組合せることが出来る。
【００８４】
従って、他の面において、この発明は、第１の種のレシピエント哺乳動物例えば霊長類例えばヒトにおける第２の哺乳動物好ましくは調和しない種、例えばブタ例えばミニブタ又は調和しない霊長類種から得た移植片の受容を促進する方法を特徴とする。この方法は、例えば静脈注射によって、レシピエント哺乳動物中に第２の種の造血幹細胞例えば骨髄細胞又は胎児の肝若しくは脾臓細胞を導入し（好ましくは、これらの造血幹細胞はレシピエント哺乳動物中の部位に向かう）、（適宜に）レシピエント哺乳動物のナチュラルキラー細胞を、例えば造血幹細胞をレシピエント哺乳動物中に導入する前にそのレシピエント哺乳動物中に該レシピエント哺乳動物のナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体を導入することによって不活性化し、（適宜に）レシピエント哺乳動物のＴ細胞を、例えば造血幹細胞をレシピエント哺乳動物中に導入する前にそのレシピエント哺乳動物中に該レシピエント哺乳動物のＴ細胞に結合し得る抗体を導入することによって不活性化し、そして好ましくは、レシピエントに、レシピエントのＴ細胞好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な免疫抑制剤の短期コース例えばシクロスポリン治療の短期コースを施与する（そうしないと、胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞は操作した細胞の植付け又は生存を阻害するかも知れない）ことを含む。
【００８５】
好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースの持続は、３０日にほぼ等しいか、８〜１２日（好ましくは、約１０日）にほぼ等しいか又はそれより短いか、上記の８〜１２又は１０日間の２、３、４、５若しくは１０倍にほぼ等しいか又はそれより短い。
【００８６】
好適具体例において、短期コースを、幹細胞をレシピエント中に導入する前又は導入する頃に開始し、短期コースを、幹細胞をレシピエントに導入する日に開始し、短期コースを、幹細胞をレシピエントに導入する前又は導入後１、２、４、６、８若しくは１０日以内に開始する。
【００８７】
他の好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースを抗Ｔ細胞抗体又は胸腺照射例えば７００ラドの胸腺照射の一方又は両方と共に施与し、免疫抑制の短期コースは、抗体に基づくＴ細胞の不活性化例えばＡＴＧ抗体調製物の静脈投与による不活性化では不活性化されないＴ細胞例えば胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分である。
【００８８】
下記に一層詳細に説明するように、造血細胞は、これらの造血細胞は、レシピエントに、Ｂ細胞及びＴ細胞レベルの両方における寛容を誘導することによって、後に続く移植片に対する準備をさせる。好ましくは、造血細胞は、胎児の肝若しくは脾臓細胞、又は未成熟細胞を含む骨髄細胞（即ち、未分化造血幹細胞、これらの所望の細胞を投与前に骨髄から分離することが出来る）であり、又はかかる細胞を含む複合骨髄試料を用いることが出来る。
【００８９】
抗ＮＫ抗体の１つの源は、抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清である。下記で論ずるように、好ましくは、Ｔ細胞並びにＮＫ細胞を溶解させる第２の抗成熟Ｔ細胞抗体をも投与することが出来る。Ｔ細胞を溶解させることは、骨髄及び異種移植片生存の両者にとって有利である。抗Ｔ細胞抗体は、抗ＮＫ抗体と共に抗胸腺細胞抗血清中に存在する。抗ＮＫ又は抗Ｔ細胞抗体の反復投与が好ましい。モノクローナル調製物をこの発明の方法で用いることが出来る。
【００９０】
他の好適具体例は、レシピエント哺乳動物へドナー種特異的間質組織、好ましくは造血間質組織例えば胎児の肝又は胸腺を導入するステップを含む。好適具体例において、間質組織を、造血幹細胞と同時に又はそれより前に導入し、造血幹細胞を、抗ＮＫ若しくはＴ細胞抗体と同時に又はそれより前に導入する。
【００９１】
他の好適具体例は、第２の種と同じ哺乳動物が移植片及び造血細胞の一方又は両方のドナーであるもの、及び抗Ｔ若しくは抗ＮＫ細胞抗体が例えばウマ又はブタから得られた抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清であるものを含む。
【００９２】
他の好適具体例は、造血幹細胞移植前に、移植した幹細胞の植付け及び生存を促進するために、例えばレシピエント哺乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで照射すること（レシピエントの骨髄を涸渇させ又は部分的に涸渇させるための全身照射）により、レシピエント中に造血空間を創るステップを含む。
【００９３】
好適具体例において、この方法は、更に、レシピエントに対する胸腺照射例えば３００〜７００ラドの胸腺照射の施与を含む。
【００９４】
他の好適具体例は、造血幹細胞の移植前に、例えば第２の種の哺乳動物から得た器官、例えば肝臓又は腎臓を血液灌流することにより、レシピエント哺乳動物の血液から天然の抗体を涸渇させるステップを含む（器官の血液灌流において、血液中の抗体は、器官の細胞表面の抗原と結合し、それ故、血液から除去される）。
【００９５】
他の好適具体例は、更に、レシピエント中に、ドナーから得た移植片、例えば造血幹細胞とは異なる器官例えば肝臓又は腎臓から得た移植片を導入するステップを含む。
【００９６】
好適具体例において、幹細胞を、移植片の移植の前に又は移植と同時にレシピエント中に導入する。
【００９７】
他の面において、この発明は、レシピエント哺乳動物好ましくは霊長類例えばヒトにおける同種のドナーから得た移植片の受容を促進する方法を特徴とする。この方法は、例えばレシピエントへの静脈注射により、哺乳動物好ましくはドナーの造血幹細胞例えば骨髄細胞又は胎児の肝若しくは脾臓細胞を導入すること（好ましくは、これらの造血幹細胞は、レシピエント中の部位に向かう）、（適宜に）レシピエントのＴ細胞を、例えば造血幹細胞をレシピエントに導入する前にそのレシピエント中にそのレシピエントのＴ細胞に結合し得る抗体を導入することにより不活性化すること、及び好ましくは、レシピエントに、レシピエントのＴ細胞好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な免疫抑制剤の短期コース例えばシクロスポリン治療の短期コースを施与する（そうしないと、胸腺又はリンパ節Ｔ細胞は操作した細胞の植付け又は生存を阻害するかも知れない）ことを含む。
【００９８】
好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースの持続は、３０日にほぼ等しいか、８〜１２日（好ましくは、約１０日）にほぼ等しいかそれより短いか、上記の８〜１２日又は１０日間の２、３、４、５若しくは１０倍にほぼ等しいか又はそれより短い。
【００９９】
好適具体例において、短期コースを、幹細胞をレシピエント中に導入する前又は導入する頃に開始し、短期コースを、幹細胞をレシピエント中に導入する日に開始し、短期コースを、幹細胞をレシピエント中に導入する前又は導入後１、２、４、６、８若しくは１０日以内に開始する。
【０１００】
他の好適具体例において、免疫抑制剤の短期コースを抗Ｔ細胞抗体又は胸腺照射例えば７００ラドの胸腺照射の一方又は両方と共に施与し、免疫抑制の短期コースは抗体に基づくＴ細胞の不活性化例えばＡＴＧ抗体調製物の静脈投与による不活性化では不活性化されないＴ細胞例えば胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分である。
【０１０１】
好適具体例において、抗Ｔ細胞又はＮＫ細胞抗体は、抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清であり、この抗血清はウマ又はブタから得られる。
【０１０２】
他の好適具体例は、造血幹細胞移植前に、レシピエントのＮＫ細胞を、例えばそのレシピエント哺乳動物中にそのレシピエント哺乳動物のＮＫ細胞に結合し得る抗体を導入することによって不活性化する更なるステップを含み、及び同じ個体が移植片と骨髄の両者のドナーであるものを含む。
【０１０３】
他の好適具体例は、造血幹細胞移植前に、移植した幹細胞の植付け及び生存を促進するために、例えばレシピエント哺乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで照射すること（レシピエントの骨髄を涸渇させ又は部分的に涸渇させるための全身照射）によって、レシピエント中に造血空間を創るステップを含む。
【０１０４】
好適具体例において、この方法は、更に、レシピエントに対する胸腺照射例えば７００ラドの胸腺照射を施与することを含む。
【０１０５】
他の好適具体例は、骨髄移植前に、ドナーから得た器官例えば肝臓又は腎臓を血液灌流することによって、レシピエントの血液から天然の抗体を吸収する更なるステップを含む。
【０１０６】
好適具体例は、レシピエント哺乳動物中に、ドナー種特異的な間質組織、好ましくは造血間質組織例えば胎児の肝若しくは胸腺を導入するステップを含む。
【０１０７】
他の好適具体例は、更に、レシピエント中に、ドナーから得た移植片、例えば造血幹細胞と異なる器官例えば肝臓又は腎臓から得た移植片を導入するステップを含む。
【０１０８】
好適具体例において、幹細胞を、移植片の移植前又は移植と同時にレシピエントに導入する。
【０１０９】
この発明のＴ細胞好ましくは胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞を不活性化する方法を、胸腺若しくはリンパ節Ｔ細胞の不活性化が望ましい更に他の寛容を誘導する方法と共に用いることが出来る。例えば、この発明の抗胸腺又はリンパ節Ｔ細胞法を、寛容を誘導すために異種胸腺移植片の移植を用いる方法例えば１９９３年１２月７日出願の米国特許出願第０８／１６３，９１２号に記載された方法、寛容促進若しくはＧＶＨＤ阻止性サイトカインの活性レベルを増大させ又は寛容阻止若しくはＧＶＨＤ促進性サイトカインの活性レベルを減少させる方法例えば１９９３年８月３０日出願の米国特許出願第０８／１１４，０７２号に記載された方法、臍帯血液細胞を用いて寛容を誘導する方法例えば１９９３年１１月１０日出願の米国特許出願第０８／１５０，７３９号に記載された方法、及び１９９４年２月１４日出願のSykes及びSachsのＰＣＴ／ＵＳ９４／０１６１６号に開示された寛容を誘導するための方法と共に用いることが出来る。
【０１１０】
「胸腺又はリンパ節Ｔ細胞を不活性化することの出来る免疫抑制剤」とは、ここで用いる場合、適当な投与量で投与した場合に、胸腺又はリンパ節Ｔ細胞の不活性化を生じる薬剤、例えば化学剤例えば薬物をいう。かかる薬剤の例は、シクロスポリン、ＦＫ−５０６及びラパマイシンである。抗Ｔ細胞抗体は薬剤として使用するのに好適でない（それらは胸腺又はリンパ節Ｔ細胞を不活性化する効果が比較的低いので）。薬剤を、抗Ｔ細胞抗体例えば抗ＡＴＧ調製物の投与によっては不活性化されない胸腺又はリンパ節Ｔ細胞の有意の不活性化を生じるのに十分な投与量で投与すべきである。推定の薬剤及びそれらの有効濃度を、イン・ビトロ又はイン・ビボ試験により、例えば推定の薬剤を試験動物に投与し、胸腺又はリンパ節の試料を取り出して、活性Ｔ細胞の存在についてイン・ビトロ又はイン・ビボで試験することによって予備スクリーニングすることが出来る。かかる予備スクリーニングした推定の薬剤を、次いで、更に、移植アッセイにおいて試験することが出来る。
【０１１１】
「免疫抑制剤の短期コース」とは、ここで用いる場合、一時的な長期でない治療のコースを意味する。この治療は、寛容を誘導するための治療を開始する前又は開始する頃に、例えば異種、同種、遺伝子操作した同系の又は遺伝子操作した自己の幹細胞をレシピエントに導入する頃に開始すべきである。例えば、短期コースを、寛容を誘導するための治療を開始する日、例えば異種、同種、遺伝子操作した同系の又は遺伝子操作した自己の幹細胞をレシピエントに導入する日に開始することが出来、或は、短期コースを、寛容を誘導するための治療を開始する前又は開始後１、２、４、６、８若しくは１０日以内に、例えば異種、同種、遺伝子操作した同系の又は遺伝子操作した自己の幹細胞をレシピエントに導入する前又は導入後１、２、４、６、８若しくは１０日以内に開始することが出来る。この短期コースを、約８〜１２日（好ましくは、約１０日）以下の期間、又は８〜１２日又は１０日間の２、３、４、５若しくは１０倍に等しいか又はそれより短い時間続ける。最適には、この短期コースを、約３０日続ける。投与量は、胸腺又はリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な血中レベルを維持するのに十分であるべきである。約１５／ｍｇ／ｋｇ／日の投与量が有効であることが霊長類において見出されている。
【０１１２】
「リンパ節又は胸腺Ｔ細胞」とは、ここで用いる場合、Ｔ細胞不活性化の従来法例えば抗Ｔ細胞抗体例えばＡＴＧ調製物の単独での静脈投与による不活性化に耐性であるＴ細胞のことをいう。
【０１１３】
「補助減縮」とは、ここで用いる場合、寛容が望まれる抗原への最初の曝露の際のレシピエントのＴ細胞からの少なくとも１種のサイトカイン例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ガンマーインターフェロン又はＴＮＦの何れかの放出を阻止することによるＴ細胞補助の減縮を意味する。レシピエントのＴ細胞のサイトカイン分泌において誘導される阻止は、補助の減縮中に投与される抗原に対してレシピエントが寛容化されるだけ十分でなければならない。理論に縛られる訳ではないが、減縮のレベルは、外来抗原の最初の認識に伴うＩＬ−２の初期バーストを実質的に排除するが寛容の教育及び生成に重要なすべての成熟Ｔ細胞を排除するのではないものであると考えられる。
【０１１４】
「補助減縮剤」とは、ここで用いる場合、サイトカイン放出の減縮を生じる薬剤例えば免疫抑制剤である。補助減縮剤の例はシクロスポリン、ＦＫ−５０６及びラパマイシンである。抗Ｔ細胞抗体は、Ｔ細胞を排除するので、補助減縮剤として用いるのに好ましくない。補助減縮剤は、寛容を生じるサイトカイン放出の阻止のレベルを与えるのに十分な投与量で投与しなければならない。この補助減縮剤は、サイトカイン例えばＩＬ−２の放出を促進する治療の不在において投与すべきである。推定の薬剤補助減縮剤を、イン・ビトロ又はイン・ビボ試験により、例えば推定の薬剤をＴ細胞と接触させ、処理したＴ細胞のサイトカイン例えばＩＬ−２を放出する能力を測定することにより予備スクリーニングすることが出来る。サイトカイン放出の阻止は、その推定の薬剤の補助減縮剤としての効力を示している。かかる予備スクリーニングした推定の薬剤を、次いで、更に、腎臓移植アッセイにおいて試験することが出来る。腎臓移植アッセイにおいて、推定の補助減縮剤を、その推定の薬剤をレシピエントのサルに投与し、次いで、クラスIIマッチしクラスＩ及びマイナー抗原ミスマッチしたドナーのサルからの腎臓をそのレシピエント中に移植することにより、効力について試験することが出来る。ドナーのサルに対する寛容（移植片の延長された受容による指示）はその推定の薬剤が試験した投与量において補助減縮剤であることを示す。
【０１１５】
「補助減縮剤の短期コース」とは、ここで用いる場合、一時的な長期でない治療のコースを意味する。この治療は、移植片の移植前又は移植の頃に開始すべきである。或は、この治療をレシピエントのドナーの抗原への曝露の前又は曝露の頃に開始することが出来る。最適には、この治療を、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間とほぼ同じか又はそれより短期間続ける。この治療の持続を、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間の２、３、４、５若しくは１０倍にほぼ等しいか又はそれより短い時間まで延長することが出来る。この持続は、通常、少なくとも、レシピエント種の成熟Ｔ細胞について最初に抗原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する時間に等しい。ブタとサルにおいて、約１２日の治療は十分である。サルにおける他の実験は、シクロスポリンＡ治療の８、９又は１０日目において投与したＩＬ−２が移植された組織の拒絶を生じることを示す。従って、８、９又は１０日は、恐らく、ブタにおいて十分でない。サルにおいて、１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン投与量（血中レベル約５００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）は、クラスIIマッチしクラスＩ及びマイナー抗原ミスマッチした腎臓に対する寛容を誘導するのに十分である。同じ血中レベル５００〜１０００ｎｇ／ｍｌは、ブタにおいて寛容を誘導するのに十分である。５ｍｇ／ｋｇの長期投与は、（長期免疫抑制により）拒絶を防ぐが寛容を生じない。
【０１１６】
「寛容」とは、ここで用いる場合、例えば、非自己ＭＨＣ抗原のレシピエントへの導入に応じて阻止しなければ生じたであろう移植片レシピエントの免疫応答の阻止をいう。寛容は、体液性、細胞性又はその両者の応答を含み得る。
【０１１７】
「造血幹細胞」とは、ここで用いる場合、成熟ミエロイド及び／又はリンパ様細胞に分化することの出来る細胞例えば骨髄細胞をいう。レシピエント又はドナーの臍帯血液から導いた幹細胞をこの発明の方法において用いることが出来る。米国特許第５，１９２，５５３号（参考として本明細書中に援用する）及び米国特許第５，００４，６８１号（参考として本明細書中に援用する）を参照されたい。
【０１１８】
「ＭＨＣ抗原」とは、ここで用いる場合、１つ以上のＭＨＣ遺伝子の蛋白質生成物をいう。この用語は、レシピエント生物において免疫応答を喚起することの出来るＭＨＣ遺伝子の生成物の断片又はアナログを含む。ＭＨＣ抗原の例は、ヒトＭＨＣ遺伝子例えばＨＬＡ遺伝子の生成物（及びそれらの断片及びアナログ）を含む。ブタ例えばミニブタのＭＨＣ遺伝子は、ＳＬＡ遺伝子例えばＤＲＢ遺伝子の生成物（及びそれらの断片及びアナログ）を含む。
【０１１９】
「ミニブタ」とは、ここで用いる場合、完全に又は部分的に、同系交配の動物をいう。
【０１２０】
「移植片」とは、ここで用いる場合、身体の一部、器官、組織又は細胞のことをいう。移植片は、器官例えば肝臓、腎臓、心臓又は肺；身体の部分例えば骨又は骨格マトリックス；組織例えば皮膚、腸、内分泌腺；又は種々の型の始原幹細胞からなってよい。
【０１２１】
「不調和種の組合せ」とは、ここで用いる場合、一方から他方へ移植片を移植したときに超急性拒絶が起きる２種をいう。一般に、不調和種は異なる目であるが、他方、不調和でない種は同じ目である。例えば、ラット及びマウスは、不調和でない種であり、即ち、それらのＭＨＣ抗原は実質的に類似しており且つそれらは同じ目、ゲッ歯類のメンバーである。
【０１２２】
「間質組織」とは、ここで用いる場合、機能性要素又は実質組織から区別される器官の支持組織又はマトリックスをいう。
【０１２３】
この発明の補助抑制方法は、移植においてしばしば用いられる広いスペクトルの免疫抑制剤の望ましくない長期又は慢性的投与の副作用を回避する。プレドニゾン、イムラン、ＣｙＡ及び最近ではＦＫ５０６等の薬物の長期又は慢性的投与は、移植の分野に重大なインパクトを与えた。しかしながら、これらのすべての薬物は、完全には免疫機能を排除しないが拒絶を回避するのに十分なだけ滴定されなければならない免疫系の非特異的抑制を引き起こす。人生の残りの間中慢性的免疫抑制治療を続けなければならない患者は、過剰又は過小の免疫抑制から起きそれぞれ感染及び拒絶により引き起こされる主要な合併症に直面する。この発明の補助抑制方法は、補助減縮剤治療の一時的な短期高投与量コースの施与に基づいている。
【０１２４】
レシピエントの胸腺又はリンパ節Ｔ細胞は、移植された移植片例えば移植された造血細胞又は移植された器官に対する有意の抵抗の原因である。通常のＴ細胞涸渇又は不活性化方法例えば抗Ｔ細胞抗体の投与は、しばしば、Ｔ細胞涸渇又は不活性化の最適レベルに達しないことが見出されている。特に、かかる方法は、胸腺又はリンパ節Ｔ細胞の涸渇又は不活性化の最適レベルを与えることが出来ない。レシピエントの胸腺又はリンパ節Ｔ細胞を不活性化することの出来る免疫抑制剤例えばシクロスポリンの短期コースをレシピエントに施与するこの発明の方法は、更に徹底した胸腺又はリンパ節Ｔ細胞の不活性化を生じ、それ故、移植片組織の改善された受容を生じる。
【０１２５】
この発明のレトロウイルス方法は、同種又は異種ＭＨＣ遺伝子を発現するトランスジェニック自己骨髄細胞を用いる移植されたレシピエントの骨髄の再構築を与える。トランスジェニックＭＨＣ遺伝子の発現は、これらの又は密接に関連するＭＨＣ遺伝子の生成物を示す移植片に対する寛容を与える。従って、これらの方法は、ＭＨＣ遺伝子の体細胞トランスファーにより、特異的移植寛容の誘導を与える。この発明のレトロウイルス方法は、移植においてしばしば用いられる広いスペクトルの免疫抑制剤の望ましくない副作用を回避する。
【０１２６】
骨髄移植（ＢＭＴ）によるリンパ造血キメリズムの誘導を介して、移植抗原に対する寛容を達成することが出来る。ＭＨＣバリヤーを横切るＢＭＴは、２つの主要な危険を与える：即ち、もし成熟Ｔ細胞が骨髄接種物から除去されていないと、レシピエントは重症の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症し得るし、これらの細胞の除去はしばしば植付けの失敗へと導く。この発明のレトロウイルス方法は、（同種異系又は異種に対して）自己の骨髄細胞を用いるレシピエントの骨髄の再構成により特異的寛容を誘導し、ＧＶＨＤの最小の危険しか有さず且つ骨髄接種物からＴ細胞を除去する最小の必要性しか有しない寛容を与える。
【０１２７】
この発明のレトロウイルス方法は、この発明の補助抑制及びＴ細胞不活性化方法と組み合わせて移植片の受容を延長させることが出来る。
【０１２８】
この発明の造血細胞移植方法は、移植においてしばしば用いられる広いスペクトルの免疫抑制剤の望ましくない副作用を回避する。この発明の造血細胞移植方法は、この発明の補助抑制及びＴ細胞排除方法と組み合わせて移植片の受容を延長させることが出来る。
【０１２９】
この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
【０１３０】
詳細な説明
最初に図面を簡単に説明する。
【０１３１】
図面
図１は、ＧＳ４．５レトロウイルス構築物の図解である。
図２は、ＧＳ４．５プロウイルスゲノム及び予想される転写物の図解である。
図３ａ及び３ｂは、形質導入細胞のフローサイトメトリープロフィルの表示である。
図４は、形質導入アッセイの図解である。
図５は、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｂ１０．ＡＫＭ及びＢ１０．ＭＢＲ株の遺伝地図の図解である。
図６は、形質導入した骨髄のレシピエントからの脾臓細胞のＦＡＣＳプロフィルの図解である。
図７ａ及び７ｂは、皮膚移植実験における生存対時間のグラフである。
図８ａ〜ｄは、移植片拒絶者及び対照からの胸腺細胞のＦＡＣＳ分析の図解である。
図９は、Ｎ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂベクターの図解である。
【０１３２】
概観
この発明は、外来抗原例えば同種又は異種の組織若しくは器官移植片上の抗原に対する寛容を誘導する幾つかの方法を提供する。これらの方法は、個別に又は組み合わせて利用することが出来る。例えば、補助減縮剤の短期投与例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の短期高投与量コースが移植片の受容を有意に延長することが見出された。（好ましくは、この発明の補助減縮養生法は、最初の抗原認識に伴うＩＬ−２の初期バーストを実質的に排除するが、成熟Ｔ細胞を排除しない。これは、成熟Ｔ細胞を排除する抗Ｔ細胞抗体治療と区別される。）
免疫抑制剤例えばシクロスポリンの短期コースを用いて、さもなければ移植片の拒絶を促進するであろうＴ細胞を不活性化することが出来ることも見出された。
【０１３３】
霊長類における腎臓の同種移植片に対するシクロスポリン誘導された寛容の効果を示す実験を下記の第Ｉ節に記載する。この発明の補助抑制方法を、移植片の受容を延長させるための他の方法と組み合わせることが出来る。下記の第II節は、ＭＨＣ不同に対する寛容を誘導するためのレトロウイルスによりトランスフォームした骨髄細胞の移植を論ずる。この方法は、この発明の補助抑制方法例えばクラスＩ及び他のマイナー不同に対する寛容を誘導するためのシクロスポリンの高投与量の短期コースと組み合わせることが出来る。
【０１３４】
下記の第III節は、ＭＨＣ不同に対する寛容を誘導するための骨髄細胞の移植を論ずる。この方法は、クラスＩ及び他のマイナー不同に対する寛容を誘導するための高投与量シクロスポリン投与の短期コースと組み合わせることが出来る。Ｔ細胞を排除するためにシクロスポリンの短期コースを骨髄移植と組み合わせることも出来る。
【０１３５】
Ｉ．高投与量シクロスポリンの短期移植後コース（サイトカイン放出を刺激する薬剤の不在にて施与する）は、霊長類において部分的にマッチする同種移植片の受容を延長させる。
Ｔ細胞補助排除免疫抑制の短期コース（高投与量シクロスポリンの短期コースの形態）を伴って又は伴わないで、カニクイザル間で腎臓移植を行なった。この養生法は、移植片の受容を有意に延長させた。高投与量シクロスポリン（プレドニゾンを伴わない）の移植後コースを受けたサルは、ＭＬＣ（混合リンパ球倍容アッセイ）非反応性クラスＩ及びマイナー抗原マッチしたドナーからの腎臓移植片に対して６５日間にわたって寛容であった（下記参照）。移植後シクロスポリンを受けなかったサルは同じ不同の移植片を２０日未満で拒絶した。この仕事を、下記において一層詳細に論ずる。
【０１３６】
動物。カニクイザルは、Charles River Research Laboratoriesから購入した。これらの動物を、隔離し、病原体の全試験を行ない、次いで、ＡＡＡＬＡＣ公認の設備内で、実験動物の世話及び使用のためのＮ．Ｉ．Ｈ．ガイドに厳密に適合した環境制御された室内に収容した。
【０１３７】
分類。動物を、標準的な補体媒介の細胞毒性アッセイによりクラスＩ抗原について、及びＭＬＣ非反応性によりクラスIIマッチングについて分類した。
【０１３８】
免疫抑制。ＣｓＡの静脈投与用調製物（Sandimmune,i.v.）をニュージャージー、Hanover在、Sndoz PharmaceuticalsCorporationより入手した。サルは、約１０ｍｇ／ｋｇの１２回投与を受けた（最初の投与を、移植片の血管再生の４時間前に与えた）。ＣｓＡを２５０ｍｌの通常の塩溶液にて希釈して１時間にわたって静脈から注入した。ＣｓＡを他の免疫抑制剤を伴わずに投与した。治療の持続は１２日であった。ブタにおける適当な投与量は、筋肉内送達で、約１５ｍｇ／ｋｇである。何れの動物における投与も、血中レベルが約５００〜１０００ｎｇ／ｍｌに維持されるようにすべきである。
【０１３９】
腎臓の機能、拒絶及び病理学。腎臓の機能を血清中のクレアチニン及びＢＵＮレベルにより追跡した。病理はバイオプシーによった。バイオプシーを、７日目に行ない、次いで、２か月間１週毎に行ない、次いで、１か月毎に行なった。
【０１４０】
結果。対照レシピエント（シクロスポリンなし）は、移植された腎臓を１５日未満で拒絶した。６匹のシクロスポリン処理した動物での結果は、次の通りであった：動物１は、６５日目（即ち、移植後６５日目）に死亡し、移植物は拒絶された（この動物の血中シクロスポリンレベルが移植後の最初の７日間において５００ｎｇ／ｍｌより低かったことに注意すべきである）；動物２は、バイオプシーの出血から６５日目に死亡し、移植された腎臓は死亡時に正常であった；動物３は、８２日目に死亡し、５５日目に幾らかの拒絶が見られた；動物４は、７０日目において依然として正常であった（その時点で実験は未だ進行中であった）；動物５は、４０日目において依然として正常であった（その時点において実験は未だ進行中であった）；及び動物６は２６日目において依然として正常であった（その時点において実験は未だ進行中であった）。
【０１４１】
II．クラスII不同に対する寛容を誘導するためのレトロウイルスでトランスフォームした骨髄細胞の移植と組み合わせたクラスＩ及び他のマイナー不同に対する寛容を誘導するための高投与量シクロスポリンの短期コース（サイトカインの放出を刺激する治療の不在例えばプレドニゾンの不在にて施与する）。
レトロウイルスでのトランスフォーメーション
レトロウイルスでのトランスフォーメーションは、同種又は異種ＭＨＣ遺伝子を発現するトランスジェニック骨髄細胞好ましくは自己骨髄細胞を用いる移植されたレシピエントの骨髄の再構築を与える。トランスジェニックＭＨＣ遺伝子の発現は、これらの又は密接に関連したＭＨＣ遺伝子の生成物を示す移植片に対する寛容を与える。従って、これらの方法は、ＭＨＣ遺伝子の体細胞トランスファーにより特異的移植寛容の誘導を与える。ＭＨＣ遺伝子のレトロウイルスによる導入は、単独で又はここに記載のＴ細胞補助減縮方法と組み合わせて用いることが出来る。このアプローチを以下において詳細に論じる。
【０１４２】
ＭＨＣ遺伝子：様々な種のＭＨＣ遺伝子はよく研究されている。例えば、ヒトのＨＬＡ遺伝子（Hansen等、1989、The Major Histocompatibility Complex,Fundamental Immunology第二版 W.E. Paul編、New York在、Raven Press Ltd.,中を参照されたい。参考として本明細書中に援用する。）及びブタのＳＬＡ遺伝子（Sachs等、1988、Immunogenetics 28:22-29参照。参考として本明細書中に援用する）がクローン化され、特性決定されている。
【０１４３】
ＭＨＣ抗原をコードする遺伝子をこの発明の方法において用いて、その又は密接に関連したＭＨＣ抗原を示す移植片に対する寛容を与えることが出来る。この発明の方法を用いて、同種移植片（例えば、移植片のドナー及びレシピエントの両者がヒト）及び異種移植片（例えば、移植片のドナーが非ヒト動物例えばブタ例えばミニブタであり、移植片のレシピエントがヒト）に対する寛容を与えることが出来る。
【０１４４】
ＭＨＣ遺伝子を供給する個体は、特にＭＨＣ遺伝子に関して、移植片を与える個体と出来るだけ遺伝的に類似しているべきである。例えば、移植片ドナーがヒトであり且つ移植片レシピエントがヒトである同種移植片においては、ドナーからのＭＨＣ遺伝子を用いるのが好ましい。この具体例において、ＭＨＣプローブ例えば第三者からのプローブ又は合成の共通プローブを用いて、ＭＨＣ遺伝子又は移植片ドナー個体の遺伝子をコードするＤＮＡを単離することが出来る。これは、寛容を与えるために使用する遺伝子及び移植片上にＭＨＣ抗原を発現する遺伝子間に最も近いマッチを与える。
【０１４５】
異種移植片において、移植片のドナー個体と寛容を与えるＤＮＡを与える個体とは同一個体であるべきであり又は出来るだけ密接に関連しているべきである。例えば、移植片組織を高度に同系交配のドナー集団から得ることは好ましく、ＭＨＣ遺伝子についてホモ接合であると一層好ましい。これは、多くの移植片レシピエントに対して単一クローン化ＭＨＣ配列を使用することを可能にする。
【０１４６】
骨髄細胞のトランスフォーメーション：ＭＨＣ遺伝子を、これらの遺伝子の発現を寛容を与えるのに十分なレベル及び期間で与える任意の方法によって骨髄細胞中に導入することが出来る。これらの方法は、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子銃及びウイルスベクター例えばレトロウイルスによる形質導入を含む。
【０１４７】
組換えレトロウイルスは、好適な送達システムである。それらは、過去数年にわたって、遺伝子トランスファー用のビヒクルとして大規模に開発された。例えば、Eglitis等、1988,Adv.Exp.Med.Biol.241:19を参照されたい。最も簡単なレトロウイルスベクター構築物は、ウイルスの構造遺伝子を単一遺伝子で置換したものであり、次いで、該単一遺伝子をウイルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）中に含まれる制御要素の制御下で転写する。Mologeyマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）を含む種々の単一遺伝子ベクター主鎖が用いられてきた。選択可能マーカー及び第２の関心ある遺伝子等の種々の遺伝子の複数の挿入が可能なレトロウイルスをこの型の主鎖から導くことが出来る。Gilboa,1988,Adv.Exp.Med.Biol.241:29参照。
【０１４８】
蛋白質生成物の発現のためのベクターの構築物の要素例えばプロモーターの選択は、当業者には公知である。レトロウイルスベクターからの最も効率的な発現は、「強い」プロモーター例えばＳＶ４０プロモーター又はＬＴＲプロモーターを用いて転写を制御した場合に見られる。Chang等、1989、Int.J.Cell Cloning 7:264に総説あり。これらのプロモーターは、構成的であり、一般に、組織特異的発現を可能にしない。しかしながら、通常すべての組織で発現されるクラスＩ遺伝子の場合には、遍在的発現は機能的目的について許容される。ハウスキーピング遺伝子プロモーター例えばチミジンキナーゼプロモーターは、クラスII遺伝子の発現用に適したプロモーターである。
【０１４９】
効率的パッケージングの細胞系統の使用は、生成した組換えビリオンの感染効率及び感染スペクトルの両者を増大させることが出来る。Miller,1990,Human Gene Therapy 1:5を参照されたい。マウスレトロウイルスベクターは、遺伝子を効率よくマウスの胚細胞（例えば、Wagner等、1985、EMBO J.4:663;Griedley等、1987 Trends Genet.3:162を参照されたい）及び造血幹細胞（例えば、Lemischka等、1986,Cell 45:917-927;Dick等、1986,Trends in Genetics 2:165-170）にトランスファーするために用いられてきた。
【０１５０】
以前に可能であったよりずっと高いウイルス力価の達成を可能にする最近のレトロウイルス技術における改良は、いわゆる「ピンポン」法と呼ばれる環境栄養性及び両栄養性パッケージング細胞系統間での連続的トランスファーによる増幅を含む。Kozak等、1990J.Virol.64:3500-3508;Bodine等、1989,Prog.Clin.Biol.Res.319:589-600を参照されたい。
【０１５１】
形質導入の効率は、レシピエントへの導入前の感染骨髄の予備選択（選択可能遺伝子を高レベルで発現する骨髄細胞を豊富にすること）によって増大させることが出来る。Bick等、1985,Cell 42:71-79;Keller等、1985,Nature 318:149-154を参照されたい。更に、ウイルス力価を増大させる最近の技術は、ウイルス生成細胞系統との直接的インキュベーションではなく、ウイルス含有上清の利用により効率的形質導入を達成することを可能にする。例えば、Bodine等、1989,Prog.Clin.Biol.Res.319:589-600を参照されたい。細胞性ＤＮＡの複製がレトロウイルスベクターの宿主ゲノム中へのインテグレーションに必要であるので、例えばイン・ビトロで成長因子で処理することにより標的細胞の分裂を誘導することによって標的幹細胞が活発に細胞周期を巡る頻度を増すことは望ましく（例えば、Lemischka等、1986,Cell 45:917-927を参照されたい）、ＩＬ−３とＩＬ−６の組合せは、明らかに最も効力があり（例えば、Bodine等、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.86:8897-8901を参照されたい）、或は、骨髄採取前にレシピエントを５−フルオロウラシルにさらすこと（例えば、Mori等、1984,Jpn.J.Clin.Oncol.14前出1:457-463参照）は望ましい。例えば、Lemischka等、1986,Cell 45:917-927;Chang等、1989,Int.J.Cell Cloning 7:264-280を参照されたい。
【０１５２】
Ｎ２Ａ又は他のMoloneyに基づくベクターは、ヒト骨髄細胞を形質導入するための好適なレトロウイルスベクターである。
【０１５３】
トランスフォームした骨髄細胞導入用の調製用養生法骨髄細胞を調製するために、レシピエントは、除去しないと植付けに抵抗するかも知れない免疫応答の除去を受けなければならない。
【０１５４】
改変した自己の造血幹細胞の植付けを可能にするのに必要な調製用養生法は、同種の骨髄移植に必要とされるものよりずっと低毒性であってよく、好ましくは、最近マウスモデルにおいて示されたように、モノクローナル抗体を用いる成熟Ｔ細胞の涸渇のみを必要とする。Sharabi等、1989,J.Exp.Med.169:493-502参照。一時的発現が寛容を誘導するのに十分であり、混合異種骨髄移植物モデルにおいて心臓移植物について見られたように、たとえ造血細胞における発現が失われても移植物により維持され得ることはあり得る。Ildstad等、1985,Transplant.Proc.17:535-538。
【０１５５】
移植片及び補助減縮：上記の補助減縮方法を、上記のようにして移植片の移植と共に施与することが出来る。
【０１５６】
レトロウイルス媒介の遺伝子トランスファーによるマウス骨髄造血細胞におけるブタクラスII遺伝子の持続的発現
概観：ミニブタモデルにおける移植寛容の誘導への遺伝子トランスファーアプローチの効率を、薬剤耐性マーカー（ネオマイシン）及びブタクラスIIＤＲＢｃＤＮＡを発現するように処理した二重コピーレトロウイルスベクターを用いることによって示した。これらのベクターを含む感染性粒子を、環境栄養性及び両栄養性パッケージング細胞系統の両者を用いて、＞１×１０⁶のＧ４１８耐性コロニー形成単位／ｍｌの力価にて生成した。ＤＲＡトランスフェクトし続いてウイルス含有上清で形質導入したマウス繊維芽細胞のフローサイトメトリー分析は、トランスファーされた配列がＤＲ表面発現を生じるのに十分であることを示した。マウス骨髄の高力価生成系統との同時培養は、Ｇ４１８選択下でのコロニー形成頻度で測定して、顆粒細胞／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）４０％の形質導入へと導く。長期骨髄培養にて５週間近く後に、ウイルスにさらした骨髄は依然Ｇ４１８耐性ＣＦＵ−ＧＭを２５％の頻度で含有した。更に、事実上すべての形質導入し且つ選択したコロニーは、ＤＲＢ特異的な転写物を含んだ。これらの結果は、非常に原始的な骨髄造血前駆細胞の有意の割合がＤＲＢ組換えベクターで形質導入され得ること及びベクター配列がこれらの細胞の分化した子孫において発現されることを示している。これらの実験を下記に詳細に記載する。
【０１５７】
ヒトにおけるＳＬＡ−ＤＲＢ組換えレトロウイルスの構築及びスクリーニング、Lee等、1982,Nature 299:750-752,Das等、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3543-3547 ブタＤＲＡ遺伝子の配列は最小限に多型である。それ故、同種のＤＲＢｃＤＮＡの骨髄細胞中への形質導入は、同種のクラスIIＤＲ分子の発現を、この抗原を発現することを託された細胞に与えるのに十分であるべきである。
【０１５８】
レトロウイルス構築物の詳細を図１に与える。２つの型のレトロウイルス構築物ＧＳ４．４及びＧＳ４．５を調製した。図１の図解は、ＧＳ４．５レトロウイルス構築物を描写している。図１の矢印は、転写の向きを示している。ＧＳ４．５において、ＤＲＢｃＤＮＡ転写の向きはウイルスの転写と同じである。ＧＳ４．４において（示してない）、ＴＫプロモーター及びＤＲＢｃＤＮＡを、ウイルス転写に関する転写の逆向きでＮ２Ａの３’ＬＴＲ中に挿入し、シミアンウイルス４０の３’ＲＮＡプロセッシングシグナルを加えた。ｐＢＳｔとは、Bluescriptベクター配列（Stratagene）のことをいう。チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子からの２１５塩基対（ｂｐ）のＰｖｕII−ＰｓｔＩ断片内に含んだ。McKnight,1980 Nucleic Acids Res.8:5949-5964。シミアンウイルス４０の３’ＲＮＡプロセッシングシグナルをｐＢＬＣＡＴ３プラスミッドからの１４２ｂｐのＨｐａＩ−ＳｍａＩ断片内に含んだ。Luckow等、(1987)Nucleic Acids Res.15:5490-5497（図１参照）。プロモーターの結合部、クラスIIｃＤＮＡ及びベクター配列の配列分析は、これらの構築物が適当に結合されたことを確実にした。
【０１５９】
これらのレトロウイルス構築物を、両栄養性パッケージング細胞系統ＰＡ３１７中にトランスフェクトし、トランスフェクタントをＧ４１８含有培地にて選択した。全部で２４及び３６の、それぞれＧＳ４．４及びＧＳ４．５組換えプラスミッドでトランスフェクトしたクローンを、培養上清のＰＥＧ沈殿及びウイルスＲＮＡのスロットブロット分析により試験した。これらの内のそれぞれ８及び１２クローンは、ＧＳ４．４から得たクローンのＤＲＢシグナルの方が一貫して弱かったが、ＤＲＢについて陽性であることが見出された。ゲノム及びスプライスされたＧＳ４．５細胞からの転写物のＰＥＧ沈殿した粒子のドットブロット分析による分析は、ＧＳ４．５によりトランスフェクトされた種々のクローン中のウイルス転写物中の異質性を示した。一実験において、２つのクローンはＤＲＢ⁺／Ｎｅｏ⁺ウイルスＲＮＡを含み、２つはＤＲＢ⁺／Ｎｅｏ^-ＲＮＡを含み、２つはＤＲＢ^-／Ｎｅｏ⁺ＲＮＡを含み、そして１つはクラスII又はＮｅｏシグナルを示さなかった。ＤＲＢ陽性クローンの上清のＧ４１８耐性（Ｇ４１８^r）力価測定は、ＧＳ４．５トランスフェクトしたクローンにより生成した平均力価（１０³〜１０⁴ＣＦＵ／ｍｌ）がＧＳ４．４トランスフェクトしたクローンのそれ（１０²〜１０³ＣＦＵ／ｍｌ）より有意に高いことを確実にした。それ故、更なる形質導入実験をＧＳ４．５Ｃ４と命名した最良のクローン（３×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの初期Ｇ４１８^r力価を生じた）を用いて行なった。
【０１６０】
プラスミッドの調製、クローニング手順、ＤＮＡ配列決定、ＲＮＡ調製、ノーザンブロット及びＲＮＡスロットブロットは、標準的方法Sambrook等、1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第二版（Cold Spring Harbor在、Cold Spring Harbor Lab.）により行なった。ブロットの最後の洗浄を、０．１×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝０．１８Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４／１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて、６０℃で３０分間行なった。
【０１６１】
パケージング細胞系統ＰＡ３１７（Miller等、1986,Mol.Cell.Biol.6:2895-2902）、ＧＰ＋Ｅ−８６（Markowitz等、1988,J.Virol 62:1120-124）、ｐｓｉＣＲＩＰ（Danos等、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464）及びこれらの派生物を３７℃で、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Whittaker Bioproducts）、抗生物質ペニシリン（５単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ）を補った１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ）にて維持した。
【０１６２】
Ｃ４クローンのウイルス力価の改良
最近のデータは、高レトロウイルス力価を含む上清が骨髄細胞を形質導入するための最良の候補であることを示した（Bodine等、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3738-3742）ので、Ｃ４生成クローンの力価を、「ピンポン」増幅（Bestwick等、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5404-5408）によって増大させた。ほぼ集密なＣ４培養の上清を用いてＧＰ＋Ｅ−８６環境栄養性パッケージング細胞を形質導入してＧ４１８選択を適用した。４８クローンを単離し、ウイルス粒子の生成についてＰＥＧ沈殿によりスクリーニングした。これらのクローンの１８からの上清は、ウイルスＲＮＡのドットブロット分析によりＤＲＢ陽性であり、０．５〜３．５×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌのＧ４１８^r力価を有した。１つの陽性クローンを、次いで、両栄養性ヒグロマイシン耐性パッケージング細胞系統ｐｓｉＣＲＩＰを用いるピンポン技術により増幅した。４８のヒグロマイシン耐性クローンからの上清をＤＲＢ陽性ウイルスＲＮＡの存在についてＰＥＧ沈殿により試験し、Ｇ４１８^r力価を測定した。すべてのクローンは、ＤＲＢプローブを用いるドットブロット分析により陽性であり、生成した力価は、１×１０⁵〜１×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌであった。最大力価を生じた両栄養性クローンＧＳ４．５Ａ４を、ヘルパーウイルスの存在についてＳ＋Ｌアッセイにより試験した。複製能力のあるヘルパーウイルスは検出されなかった。
【０１６３】
ウイルス力価の増幅を、ピンポン技術により達成した。ｐｓｉＣＲＩＰパッケージング細胞は、ある型のベクターを用いるとＰＡ３１７よりヘルパーウイルスを生成しない傾向があるという証拠（Miller,1990,Hum.GeneTherapy 1:5-14）があるので、ＤＲＢ組換えウイルスをｐｓｉＣＲＩＰ／ＧＰ−Ｅ−８６プロデューサーの組合せを用いて調製した。検出可能なヘルパーウイルスを伴わない＞１×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌの力価が得られ、この戦略がイン・ビボ実験に適した安全なウイルス粒子を生成することを確実にした。それぞれ異なるパッケージング細胞系統から導いたＧＳ４．５生成クローンＣ４、Ａ９及びＡ４のノーザンブロット分析は、保存されたハイブリダイゼーションパターンを示した。完全長ウイルスゲノム、スプライスされたＮｅｏ転写物及びＤＲＢ転写単位に対応するＲＮＡ種が、更なるＲＮＡ種を伴って見られた。これらの実験において認められた高分子量サイズの種は、ＴＫプロモーターから始まり他方のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）内で終るリードスルー転写物を構成し得る。不規則なＤＲＢ転写物を与えたトランスフェクションにより得られたビリオンプロデューサークローンの多くと対照的に、形質導入により得られたものは、安定なＤＲＢハイブリダイゼーションパターンを示し、増幅手順中に組換え事象が起きなかったことをを示唆した。
【０１６４】
レトロウイルス力価を以下のようにして測定した。複製欠損レトロウイルス粒子を、標準的リン酸カルシウム沈殿法（Wigler等、1978,Cell 14:725-733）を用いて、初期に組換え構築物でトランスフェクトしたパッケージング細胞系統から生成した。レトロウイルス生成を、薬物耐性力価（Ｇ４１８耐性コロニー形成単位／ｍｌ、ＣＦＵ／ｍｌ）により、記載されたようにして評価した。Bodine等、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3738-3742。ｐｓｉＣＲＩＰ系統を除いて、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ）選択を、活性成分中（５００μｇ／ｍｌ）にて１０〜１２日間行なった。ヒグロマイシンＢ選択を、活性薬物を含む培地（５０μｇ／ｍｌ）にて１０日間、ｐｓｉＣＲＩＰ誘導したパッケージングクローンに適用した。複製能力のあるヘルパーウイルス力価をＰＧ４ネコ細胞においてＳ⁺Ｌ^-法によりアッセイした。Bassen等、1971,Nature 229:564-566。
【０１６５】
ウイルス粒子のＰＥＧ沈殿を下記のように行なった。１ｍｌの培養上清中に含まれるビリオンを、０．５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、３０分間４℃で沈殿させた。遠心分離の後に、ペレットを、ＲＮアーゼ阻害剤（バナジルリボヌクレアーゼ複合体、BRL）の混合物で処理し、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿した。次いで、ペレットを、１５．７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド中に再懸濁し、連続希釈物をニトロセルロース膜上に点状に付着させた。
【０１６６】
パッケージング細胞クローンにおけるＤＲＢ転写の分析
種々のプロデューサークローン内の導入されたＤＲＢｃＤＮＡの正確な転写について試験するために、これらのクローンから単離したＲＮＡを含むノーザンブロットをＤＲＢ及びＮｅｏプローブとハイブリダイズさせた。図２は、プロウイルスゲノムの構造及びウイルスのＬＴＲ又はＴＫプロモーターの何れかから開始した転写物の予想されるサイズを描いている。ＰＡ３１７（クローンＣ４）、ＧＰ＋Ｅ−８６（クローンＡ９）及びｐｓｉＣＲＩＰ（クローンＡ４）細胞から得られた３つのＧＳ４．５含有クローンの各々は、ＤＲＢ陽性転写物を示した。報告されたように（Hantzopoulos等、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3519-3523）、スプライスされてないゲノムＲＮＡ（バンドａ）及びスプライスされたＮｅｏ転写物（バンドｂ）が認められた。更に、ＤＲＢプローブとユニークにハイブリダイズし得る、ＤＲＢｃＤＮＡ転写単位について予想されるサイズ（１７００塩基、バンドｃ）に対応する転写物が検出された。
【０１６７】
形質導入した繊維芽細胞上のＳＬＡ−ＤＲ抗原の表面発現
イン・ビトロアッセイを開発して、マウス繊維芽細胞上のＳＬＡ−ＤＲ抗原の表面発現を試験した。図３に示したフローサイトメトリー（ＦＣＭ）プロフィルは、３×１０⁴のＧ４１８^r力価（クローンＣ４）が、形質導入されたＤＲＡトランスフェクタントの細胞表面でのＤＲ抗原の発現を促進するのに十分であったことを示している。図３において、実線はＤＲ細胞表面発現（抗ＤＲ抗体結合）（ＧＳ４．５Ｃ４（Ｂ）及びＧＳ４．５Ａ４（Ｃ）のそれぞれでの形質導入の３日後の細胞の細胞のバルク集団の２２％及び７５％）を示し、破線は抗マウスクラスＩ抗体結合を示し（陽性対照）、点線は抗ブタＣＤ８抗体結合を示す（陰性対照）。形質導入した細胞のバルク集団の２２％はＤＲ陽性であり、サブクローンはクラスII発現を５か月より長く維持した。力価の増大（クローンＡ４）は形質導入された細胞数の増加（形質導入した集団の７５％がＤＲ陽性であった）及びＤＲシグナルの輝度と相関した。
【０１６８】
クラスII形質導入アッセイを、図４に図解したように行なった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、プラスミッド発現ベクター（Okayama等、1982,Mol.Cell.Biol.2:161-170）に挿入したＳＬＡ−ＤＲＡ^dｃＤＮＡでトランスフェクトした。高レベルのＤＲＡｍＲＮＡを発現する約３×１０⁴細胞の安定ＤＲＡトランスフェクタント（クローン１１／１２．２Ｆ）を、次いで、１ｍｌのＤＲＢ含有レトロウイルス上清で一晩形質導入した。細胞を、続いて、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質を補った新鮮なＤＭＥＭ中で更に２日間培養し、ＤＲ抗原の細胞表面発現をＦＣＭ分析により試験した。
【０１６９】
ここに記載したクラスII形質導入アッセイは、レトロウイルス構築物の発現と機能力価の両者を試験する迅速で簡単な方法を提供する。ＤＲＡでトランスフェクトした細胞を用いることにより、２つの別々のベクターによる形質導入の後の長々しい二重の選択（Yang等、1987,Mol.Cell Biol.1:3923-3928;Korman等、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2150-2154）は不要となる。ＤＲヘテロ二量体の細胞表面発現をＦＣＭ分析により形質導入の３日後に示し、トランスファーされた配列が有意のレベルのＤＲβ鎖を生成するのに十分であるという直接的証拠を与えた。一層重要なことには、この試験は、独立に制御される薬物耐性マーカーの発現ではなく、関心ある遺伝子の発現に基づいて「機能」力価の測定を与える。
【０１７０】
ＳＬＡ−ＤＲＢプローブは、ＤＲβ鎖の完全なコード配列を含むＥｃｏＲＩｃＤＮＡ断片（Gustafsson等、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9798-9802）であった。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）プローブは、Ｎ２ＡレトロウイルスプラスミッドのＢｃｌＩ−ＸｈｏＩ断片であった。Hantzopoulos等、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3519-3523。
【０１７１】
マウス骨髄前駆細胞に形質導入されたブタＤＲＢｃＤＮＡの発現
ミエロイドクローン原性前駆細胞が形質導入される効率を、ＧＳ４．５由来のビリオンに骨髄細胞をさらした後に選択量のＧ４１８を用いて及び用いないでＣＦＵ−ＧＭについてアッセイすることにより測定した。この薬物の存在及び不在において、２つの実験について形成されたコロニー数の比較は、ミエロイド前駆細胞の初期集団の約４０％が形質導入されることを示した。Ｇ４１８^rＣＦＵ−ＧＭの頻度を、形質導入した骨髄試料を３３日間にわたって長期培養条件下で発達させた後に再度測定した。培養の３３日後に存在した前駆細胞の２５％は、依然として、Ｇ４１８選択下でコロニーを生じた。ＣＦＵ−ＧＭから生じた細胞のコロニーを、ＤＲＢ特異的転写物の存在について、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し次いでここ及びShafer等、1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9670に記載されたようにＰＣＲ増幅を行なうことによって試験した。３６０ｂｐのＤＲＢ特異的生成物が、新たに形質導入された骨髄からの６つのＧ４１８選択したコロニーの５つにおいて検出され、３３日間の培養の後に存在した形質導入された前駆細胞から得られた６つのコロニーはすべて陽性であった。これらの試料の幾つかにおいて認められた１００ｂｐの更なるバンドは、恐らく、非特異的プライミング事象のストイキャスティック（stoichastic）な性質を反映する。ＤＲＢ特異的な転写物は又、薬物耐性コロニーのバルク集団及びプロデューサー細胞においても検出されたが、対照例えば未形質導入コロニーのバルク集団、キャリアーＲＮＡを供給するために用いられた繊維芽細胞及び上記のように処理したが逆転写酵素を用いなかった形質導入したコロニーのバルク集団においては検出されなかった。これらの後者のデータは、ＰＣＲシグナルがｃＤＮＡの合成に依存したことを示し、ウイルスメッセージではなくプロウイルスが増幅された断片の原因である可能性を排除している。
【０１７２】
ウイルスデザインの改変、ウイルス力価の増加、前駆細胞を刺激する成長因子の利用、及び形質導入前の幹細胞の選択を含む最近の改良は、造血区画における形質導入された遺伝子の長期発現を改善することを示した。Bodine等、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3738-3742;Bodine等、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8897-8901;Wilson等、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:439-443;Kang等、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9803-9807;Bender等、1989, Mol.Cell.Biol.9:1426-1434。これらの実験は、造血細胞中にトランスファーされた主要組織適合性複合クラスII遺伝子の発現の達成におけるレトロウイルスによる遺伝子トランスファー技術の利用可能性を示す。発生的に原始的な造血細胞が形質導入される効率を測定するために、３３日間の長期培養に維持した感染骨髄細胞を発達させた後に、Ｇ４１８^rＣＦＵ−ＧＭの頻度を評価した。外来のＤＲＢｃＤＮＡの発現も又、感染直後又は延長した培養期間の後に存在する形質導入されたＣＦＵ−ＧＭから得た細胞においてモニターした。事実上すべての個別に試験したコロニーはＤＲＢ特異的転写物について陽性であり、ＤＲＢ組換えベクターがマウス造血細胞における発現に適していることを示唆している。
【０１７３】
骨髄細胞を、６〜１２週齢の雌のＣ５７ＢＬ／１０マウスの大腿骨から得て、記載されたようにして調製した。Ildstad等、1984,Nature 307:168-170。顆粒細胞／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）についてのメチルセルロースコロニーアッセイ（Eaves 等、1978,Blood 52:1196-1210）を、５％（ｖ／ｖ）マウスインターロイキン３培養上清(Collaborative Research)を用いて、記載されたようにして行なった。長期デクスター型骨髄培養を、６０ｍｍ培養皿にて、２×１０⁷の有核細胞を用いて開始した。Eaves等、1987,CRC Crit.Rev.Oncol.Hematol.7:125-138。
【０１７４】
骨髄細胞を、本質的にBodine等、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8897-8901に記載されたようにして、形質導入した。簡単に言えば、骨髄細胞を、２日間５−フルオロウラシル（１５０ｍｇ／ｋｇ）で処理した６〜１２週齢の雌のＣ５７ＢＬ／１０ドナーから採取した。予備刺激を、１×１０⁶細胞／ｍｌを、２日間、７．５％インターロイキン３培養補充物及び組換えヒトインターロイキン６（２００単位／ｍｌ；メリーランド、Bethesda在、National Institute of HealthのJ.Juleより寄贈）を加えた長期デクスター型骨髄培養培地中でインキュベートすることにより行なった。骨髄細胞を、４８時間、ほぼ集密なウイルスプロデューサー、ポリブレン（８ｍｇ／ｍｌ）及び上記のサイトカインを含む１０ｃｍプレート当り５×１０⁶細胞を加えることにより形質導入した。
【０１７５】
ＣＦＵ−誘導したコロニーにおけるＤＲＢ特異的転写物の検出を下記のようにして行なった。個々のＣＦＵコロニー及び全プレート（バルク）上に存在するコロニーに対応する細胞を、最初に、メチルセルロース培養から、リン酸緩衝塩溶液中での希釈及び遠心分離によって抽出した。次いで、これらの細胞を、１×１０⁶のＮＩＨ３Ｔ３細胞（キャリアーＲＮＡ供給用）と合わせて、全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート／ＣｓＣｌ法を用いて調製した。第１鎖ｃＤＮＡを、Invitrogen Red Module キットを用いて、２０μｇの全ＲＮＡから調製した。次いで、ｃＤＮＡを、ＳＬＡ ＤＲＢ特異的オリゴヌクレオチド０４（5'-CCACAGGCCTGATCCCTAATGG）（SEQ ID NO:１）及び１７（5'-AGCATAGCAGGAGCCTTCTCATG）（SEQ ID NO:２）の存在下で、Cetus GeneAmpキットを、勧められるように（Perkin-Elmer/Cetus）用いる５０サイクルのＰＣＲ増幅にかけた。反応生成物を、３％NuSieveアガロースゲル（ＦＭＣ）上での電気泳動後にエチジウムブロミドで染色することにより可視化した。
【０１７６】
ＦＣＭ分析を、FAC-ScanIIフルオレセンス活性化セルソーター（Becton Dickenson）を用いて、抗ＤＲモノクローナル抗体４０Ｄ（Pierres等、1980,Eur.J.Immunol.10:950-957）、抗Ｈ−２^dアロ抗血清又は抗ブタＣＤ８モノクローナル抗体７６−２−１１（Pescovitz等、1984,J.Exp.Med.160:1495-1505）で染色し、その後、フルオレセインイソチオシアネート標識したヤギ抗マウス抗体（Boehringer Manheim）で処理した細胞について行なった。
【０１７７】
同種クラスIIｃＤＮＡの組換えレトロウイルスで形質導入したブタ骨髄細胞中での発現
ＭＨＣ遺伝子（ＤＲＢ）を、組換えレトロウイルスベクター（ＧＳ４．５）及びイン・ビボ適用するためにデザインされた形質導入プロトコールを用いて、ブタからのクローン原性前駆細胞中にトランスファーした。選択可能な薬物耐性遺伝子及びこのベクターによりトランスファーされた同種クラスIIｃＤＮＡの両者を、これらの形質導入された前駆細胞の子孫中で発現させた。Ｎｅｏ遺伝子の発現を、Ｇ４１８選択下でのコロニー形成により機能的にモニターし、他方、クラスII転写物の存在をＰＣＲ分析により検出した。この後者の方法を用いて、内在性及びウイルス由来のＤＲＢ遺伝子の両者の、形質導入して選択したコロニーにおける転写発現を示した。
【０１７８】
第一次のブタ繊維芽細胞を、高力価のウイルス上清と共に培養し、次いで、ＤＲＢ及びＮｅｏに特異的なプローブを用いてノーザンブロットにより分析した。ＤＲＢプローブとユニークにハイブリダイズし且つＴＫプロモーターから始まりＬＴＲ３’ＲＮＡプロセッシング部位にて終了するＤＲＢｃＤＮＡ転写単位について予想される位置（１７００塩基）に移動する特異的転写物が認められた。
【０１７９】
ＧＳ４．５含有ビリオンがブタ骨髄造血前駆細胞を形質導入することが出来るか否かを測定するために、ブタＣＦＵ−ＧＭに適合させたコロニーアッセイを使用した。形質導入を、ＳＬＡＣハプロタイプのドナーからの骨髄を高力価ウイルス上清中でインキュベートすることにより行なった。全部で５つの独立した実験について、Ｇ４１８の存在及び不在において形成されたコロニー数の比較は、ＣＦＵ−ＧＭの５〜１４％が形質導入されたことを示した。
【０１８０】
形質導入したＣＦＵ−ＧＭから生ずる細胞のコロニーを、ＤＲＢ特異的転写物の存在について、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、次いでＰＣＲ増幅を行なうことによって試験した。内在性ＤＲＢ^c遺伝子に存在しない多型のＳａｕ３ＡＩ制限部位を利用して、ＤＲＢ^d特異的転写物の存在を明確に示した。ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動は、ベクター由来のＤＲＢ^d転写物を示す１８３／１７７ダブレットが、形質導入して選択したＣＦＵ−ＧＭの子孫のプールからだけでなく、試験した６つの別個のコロニーの少なくとも４つからの試料においても増幅されたことを示した。内在性ＤＲＢ^c転写物を示す３６０ｂｐのＰＣＲ断片も又、ＳＬＡＣドナーから単離されたＰＢＬからだけでなく、プールしたコロニー試料及び幾つかの個々のコロニー試料の両者からも予想されるので増幅した。
【０１８１】
レトロウイルスＧＳ４．５の構築及び高力価のウイルス上清の作成は、以下に記載したようにした。ＣＦＵ由来のコロニー中のＤＲＢ特異的転写物のｃＤＮＡのＰＣＲによる検出は、上記及び下記のようにした。ＳＬＡ^cドナーからの骨髄をＧＳ４．５含有ビリオンにさらし、Ｇ４１８選択したコロニーを、ＤＲＢ^c（内在性）及びＤＲＢ^d（ウイルス由来）特異的転写物の存在について、ｃＤＮＡのＰＣＲとそれに続くＳａｕ３ＡＩでの消化及びアガロースゲル電気泳動により試験した。対照は次の通りであった：逆転写酵素の存在又は不在において合成されたテンプレート；ＧＳ４．５含有ビリオンを産生する細胞、ＳＬＡ^c又はＳＬＡ^dドナーから単離されたＰＢＬ、及びキャリアーＲＮＡとして用いられる形質導入してないプロデューサー細胞に由来するテンプレート。
【０１８２】
骨髄の形質導入を下記のように行なった。ブタ骨髄を、以前に記載されたようにして採取し（Pennington等、1988,Transplantation 45:21-26）、形質導入を、骨髄細胞を高力価ウイルス上清中で、３〜３のm.o.i.にて、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で、３７℃で５時間インキュベートするにより行なった。ミエロイド前駆細胞を、ＰＨＡ刺激したブタリンパ球調整培地を成長因子源として用いて、メチルセルロース培養におけるコロニー形成によりアッセイした。選択培地は、１．２ｍｇ／ｍｌの活性Ｇ４１８を含有した。
【０１８３】
形質導入した骨髄を、致死照射したミニブタに投与した。５週目に、末梢血液リンパ球を、サザーン、ノーザン及び細胞表面ＦＡＣＳ分析により分析した。これらのすべての試験により、これらの細胞中の形質導入された同種クラスII遺伝子の存在及びこの遺伝子の生成物の発現の証拠があった。特に、ノーザン分析は、転写されたｃＤＮＡに特徴的なバンドを示し、アロ抗血清及びＤＲに対するモノクローナル抗体の組合せを用いるＦＡＣＳ分析は、末梢リンパ球表面におけるＤＲβの形質導入された対立遺伝子の存在を示した。
【０１８４】
同種寛容
Ｂ１０．ＭＢＲ−Ｂ１０．ＡＫＭ株組合せの開発
ＭＨＣについて真にコンジェニックである株を維持することを意図して、各コンジェニック系統の共通バックグラウンドパートナー株への戻し交配が、１５年以上前に始められた。戻し交配動物を交雑させ、適当な子孫を、各コンジェニック系統を再樹立するために血清学的分類により選択した。こうして、Ｃ５７ＢＬ／１０は、一標準バックグラウンド株として用いられ、Ｂ１０バックグラウンド上のすべての他のコンジェニック系統を、６〜１０世代で各々一回このＣ５７ＢＬ／１０系統に戻し交配した。
【０１８５】
各コンジェニック系統のその血統の明らかな標準系統への戻し交配において、勿論、内部ＭＨＣ組換え事象が起きる機会はある。交雑（Ｆ２）世代の分類は血清学的にかかる組換え事象を示し、組換えが遺伝研究に潜在的に興味のある新たなハプロタイプを与える場合は、それを外部交配させ、次いで、交雑させてホモ接合の組換えＨ−２ハプロタイプを生成する。このコロニーで始まるかかる組換え体の最も大切なものの一つは、Ｂ１０．ＭＢＲ系統であり（Sachs等、1979,J.Immunol.123:1965-1969）、それは、Ｂ１０．ＡＫＭのＣ５７ＢＬ／１０への戻し交配中の組換え事象から得られた。この株はＩ^kからＩ^bを分離した最初のものであったので、Ｒ−２免疫遺伝学の研究において広く用いられた。更に、親のＢ１０．ＡＫＭ株と組合せて、ＭＢＲ株は、単離されたＫ遺伝子をこれらの２株間で異なる唯一のＭＨＣとして試験する可能性を提供する。それ故、図５に示したように、Ｋ_b遺伝子のＢ１０．ＡＫＭ骨髄幹細胞中への導入は、理論的に、Ｂ１０．ＭＢＲのすべての細胞表面ＭＨＣ抗原の発現へと導く。骨髄由来細胞集団における発現は、形質導入した遺伝子の生成物に対する移植寛容を生じ、この寛容は、Ｂ１０．ＭＢＲ株からの組織移植片により試験することが出来る。
【０１８６】
形質導入した骨髄を用いる骨髄除去マウスの再構築
８０匹の予期されるドナーＢ１０．ＡＫＭマウスを−７日目に１５０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵで処理した。これらのマウスから−５日目に骨髄を採取し、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）プラス補体で処理して成熟Ｔ細胞を除去し、ｐｓｉＣｒｉｐパッケージング細胞系統からのＮ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂウイルス含有上清（Ｈ２）と共に５日間培養した。対照として、骨髄の１／２をＮ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂを含まない対照パッケージング細胞からの上清（Ａ２）と共にインキュベートした。０日目に、４５匹のＢ１０．ＡＫＭレシピエントに１０Ｇｙの全身照射（ＴＢＩ）を行ない、続いて、種々の濃度の培養骨髄細胞（Ａ２又はＨ２）を投与した。
【０１８７】
Ｋ^b発現
１３日目に最小投与量の培養骨髄を受けた数匹の動物を殺して個々の脾臓コロニーを採取し、Ｎ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂＤＮＡの存在についてＰＣＲにより分析した。更に、脾臓細胞懸濁液を調製し、Ｋ^bの細胞表面発現について、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）上のフローミクロフルオロメトリーにより分析した。ＦＡＣＳ分析は、Ｈ２処理した骨髄を受けたすべての動物が対照を上回る幾らかのレベルのＫ^b発現を示す（非反応性抗体で染色）ことを示した。これらの結果を図６に示す（これは、形質導入骨髄のレシピエントからの脾臓細胞のＦＡＣＳプロフィルである。Ａ＝抗Ｋ^b抗体；Ｂ＝対照抗体）。形質導入してない骨髄のレシピエントからの脾臓細胞も又、陰性であった。更に、ＰＣＲ分析は、試験した各コロニーが形質導入されたＤＮＡを含むことを示した。動物を、その後、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）についてＦＡＣＳ及びＰＣＲ分析した。２８日目及び４０日目に、ＰＣＲ分析は陽性であった。しかしながら、細胞表面発現についてのＦＡＣＳ分析は変化し易く、殆どのＨ２動物からのＰＢＬは、抗Ｋ^b抗体で染色したＡ２動物からのＰＢＬと比較して又は非反応性ＨＯＰＣ抗体で染色したＨ２動物からのＰＢＬと比較して、抗Ｋ^bでの染色に対して全ピークの僅かなシフト示した。
【０１８８】
同種移植片
４０日目に、Ｂ１０．ＭＢＲ（Ｋ^b特異的）及びＢ１０．ＢＲ（対照。異種の第三者のクラス Ｉ）ドナーからの皮膚をすべての動物に移植した。移植片の生存を毎日、拒絶が完了するまで、blinded観察者によって記録した（即ち、どの移植片がどのドナー株からのものであるかを知らないで読みを行なった）。生存時間を図７に示し、Ｂ１０．ＭＢＲ皮膚移植片の生存の顕著で特異的な延長をＫ^b形質導入したＢＭＣのレシピエント（図７Ｂ）について示すが、対照骨髄のレシピエント（図７Ａ）については示さない。長期の完全なＢ１０．ＭＢＲ皮膚移植片を有する動物の１匹を１１４日目に殺して、そのリンパ組織の細胞懸濁液をＦＡＣＳによって試験し、Ｂ１０．ＭＢＲ皮膚移植片が拒絶された動物からの同じ細胞懸濁液と比較した。抗Ｋ^bｍＡＢを用いた胸腺細胞の染色において著しい違いが見られた。細胞懸濁液を調製して、抗Ｋ^bｍＡＢ２８−８−６又は対照抗体ＨＯＰＣ１の何れかで染色した。寛容な動物からの胸腺細胞の亜集団は、ＨＯＰＣ１に比べて増大した２８−８−６での染色への顕著なシフトを示したが、他方、移植片を失った動物からの胸腺細胞の染色パターンには本質的に何の変化もなかった。図８は、皮膚移植片拒絶者（図８Ａ、Ｂ）及び皮膚移植受入者（図８Ｃ、Ｄ）からの胸腺細胞についてのＦＡＣＳ分析を示している。対照ＨＯＰＣ１抗体（図８Ａ、Ｃ）及び特異的抗Ｋ^b抗体（図８Ｂ、Ｄ）を用いた染色。骨髄細胞についての染色パターンの類似の比較は、寛容マウスの骨髄中の細胞集団における低レベルのＫ^b発現の存在を示したが、皮膚移植片を拒絶したマウスでは示さなかった。これらの結果は、多能性幹細胞若しくは初期前駆細胞集団は寛容マウスにおいてはＫ^bを発現するが、拒絶者マウスにおいては発現しないこと並びに、このＢＭＣ幹細胞は、胸腺において、Ｋ^b反応性ＴＣＲを伴う胸腺細胞の発生の不活性化に重要な細胞上にＫ^b抗原の連続的源を提供するということを示している。Ｋ^b発現が寛容マウスの脾臓細胞において検出されなかったこと及び一般に脾臓細胞発現は皮膚移植片の寛容と相関しなかったということに注目するのは興味深い。脾臓は胸腺で成熟するＴ細胞を含んでいるので、これらの結果は、胸腺細胞が成熟するにつれてＫ^bの発現を失うのか或は、Ｋ^bを有するこの動物の胸腺細胞がマクロファージ等の非リンパ様細胞系統の細胞であることに何れかを示唆している。
【０１８９】
長期間の発現
上述のように、Ｂ１０．ＡＫＭ及びＢ１０．ＭＢＲコンジェニックマウス系統は、ＭＨＣクラスＩ領域を除いて同一である。Ｂ１０．ＭＢＲ系統からのクラスＩ遺伝子を含む組換えレトロウイルス（Ｈ−２Ｋ^b）は、Ｂ１９パーボウイルスプロモーター（Ｂ１９−Ｈ２Ｋ^b）に結合し、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ^r）遺伝子を、Ｂ１０．ＡＫＭ（Ｈ−２Ｋ^b）骨髄細胞に導入した。対照として、ｎｅｏ^r遺伝子のみを含む組換えレトロウイルスをＢ１０．ＡＫＭ骨髄細胞に導入した。形質導入した骨髄を、抗ＣＤ８モノクローナル抗体で前処理した致死的に照射したＡＫＭレシピエントに注入した。ＢＭＴの１２週後に、量的ＰＣＲを用いて、すべてのレシピエント動物において末梢血液細胞の５〜３０％にＢ１９−Ｈ−２Ｋ^bプロウイルス配列が存在するということを示した。逆転写酵素ＰＣＲを用いて、レシピエント動物のサブセットの骨髄及び脾臓から単離したＲＮＡ中にＢ１９−Ｈ−２Ｋ^bｍＲＮＡを示した。
【０１９０】
Ｋ^bレトロウイルスベクターの構築
レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクターＮ２（Armentano等、J.Virol.61:1647-1650）を用いた。このウイルス内のコード領域をその構築の間に削除して選択可能マーカー遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）（ウイルス性ＬＴＲプロモーターから転写されてＧ４１８に対する薬剤耐性を与える）で置き換えた。この伝統的Ｎ２ウイルスを、次いで、パーボウイルス由来のプロモーターＢ１９（Liu等、1991,J. Virol.（印刷中））のＮｅｏの下流への挿入（クラスＩ抗原Ｈ−２Ｋ^bをコードして新たな組換えウイルスＮ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂを形成する１．６ｋｂのｃＤＮＡが続く）により更に改変した。図９は、Ｎ２−Ｂ１９−Ｈ２６レトロウイルスベクター（Ｐ＝ＰｓｔＩ；Ｘ＝ＸｈｏＩ；Ｈ＝ＨｉｎＤＩＩＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；Ｂ＝ＢａｍＨＩ）を描写している。この後者のｃＤＮＡは、別の目的のためのＨ−２^bｃＤＮＡライブラリーの構築中に、Waneck等により導かれた（Waneck等、1987,J.Exp.Med.165:1358-1370）。
【０１９１】
両栄養性（ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ）（Danos等、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:6460-6464）及び環境栄養性（ｐｓｉ−２）（Sambrook等、1989,Molecularcloniong:A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,viral production）のパッケージング細胞系統を用いて、ウイルス性生産者細胞系統が生成された。これらの細胞系統は、特に、組換え不全ウイルスを生成するためのウイルス性構造蛋白質を生成するためにデザインされた。ウイルス生成は、ｐｓｉ−ＣｒｉｐをＮ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂでトランスフェクトすることにより達成した。両栄養性及び環境栄養性の両生産者細胞系統を、次いで、同時培養して多重集積事象及び高発現を与えた［即ち、「ピンポン」技術。Bestwick等、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5404-5408を参照されたい］。この技術において、同時培養は、両栄養性及び環境栄養性ウイルスは異なるレセプターを認識するので、内因性分泌蛋白質によるウイルス抗原レセプター妨害を克服する。次いで、３Ｔ３細胞において１０⁷ｃｆｕ／ｍｌを超えるＧ４１８耐性の力価を生成する環境栄養性ｐｓｉ−２ウイルス性生産者クローンを選択した。
【０１９２】
組換えウイルス由来のＫ^bが発現されることを確実にするために、形質導入した３Ｔ３細胞を、この抗原に特異的なモノクローナル抗体で染色してフローミクロフルオロメトリーにより分析した。これらの実験は、ウイルス由来のＫ^bの高レベルの発現を明確に示した。
【０１９３】
動物及び管理は、次の通りであった：Ｂ１０．ＢＭＲ系統［Sachs等、1979,J.Immunol.123:1965-1969］は、約６年前に、メイン州Bar HarborのJackson研究所に与えられ、現在、その源から、特定の病原体を有しないこの動物のストックを入手することが出来る。生きている間は、動物を、オートクレーブした食餌及びオートクレーブした酸性化した飲料水を含むオートクレーブしたミクロアイソレーターケージに移すべきである。解釈可能な生存研究を実施し得るようにする動物を病原体を有しない状態に維持するのに有効な無菌動物取扱手順を用いるべきである。
【０１９４】
骨髄移植を次のようにして実施した。マウスにおける骨髄移植のための技術は、当業者には公知である（例えば、Sykes等、1988,J.Immunol.140:2903-2911を参照されたい）。簡単に言えば、１２〜１６週齢のレシピエントＢ１０．ＡＫＭマウスを致死的に照射（１０２５Ｒ、１３７Ｃｓ源、１１０Ｒ／分）して、８時間以内に、６〜１４週齢の同性のドナーの脛骨及び大腿骨から得た２．５×１０⁶の骨髄細胞で再構成した。動物は、滅菌したミクロアイソレーターケージ内に収容され、オートクレーブした食餌及びオートクレーブした酸性化した飲料水を受ける。同系の骨髄は同種の遺伝子で形質導入されるので及び骨髄は５ＦＵ処理したマウス（正常マウスより低い全細胞カウントを有するが一層高い幹細胞含量を有する）に由来するので、これらの研究のために、この一般的技術の幾らかの改変が必要である。従って、このプロトコールは、次のとおりである：
１．多能性幹細胞に循環を誘導するために、ドナーを１５０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシルで−７日目に処理する（静脈注射）。
２．骨髄をドナーから−５日目に採集して、ｍＡＢ及び補体によりＴ細胞涸渇させる。
３．骨髄を、Ｋ^b遺伝子を含む高力価の非感染性レトロウイルス粒子を生成する環境栄養性パッケージング細胞系統（Ｂ１７Ｈ２Ｋｂ−１８）からの上清中で５日間培養する（下記参照）。ＩＬ−３及びＩＬ−６をこれらの培養に加える。
４．０日目に、レシピエントＢ１０．ＡＫＭマウスを致死的照射して（１０．２５Ｇｙ）、Ｋ^b遺伝子を形質導入した２．５×１０⁶のＢＭＣで再構成する。対照動物を同様に処理する（但し、それらは、Ｋ^b含有ベクターにさらしてない同じ環境栄養性パッケージング系統からの上清にさらした骨髄を受ける）。レシピエントを抗ＣＤ８モノクローナル抗体で前処理することも出来る。
【０１９５】
細胞及び血清学的アッセイを次のようにして実施する。
【０１９６】
抗クラスＩ細胞媒介のリンパ球溶解（ＣＭＬ）のアッセイ：脾臓をＢＭＴレシピエント及び正常マウスから取り出し、赤血球をＡＣＫ緩衝液を用いて溶解させて単一細胞懸濁液を調製する。細胞を、１００メッシュナイロンを通して濾過し、洗浄して、１０％ウシ胎児血清、０．０２５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．０９ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０からなる完全培地中に４×１０⁶／ｍｌで再懸濁させる。９０μｌの応答細胞を、照射（３０Ｇｙ）した刺激用脾臓細胞と共にCostar ９６ウェル丸底プレートに加える。培養を、３つの複製それぞれの２列においてセットアップし、６％ＣＯ₂中で３７℃にて５日間のインキュベーションの後に、５つの異なる応答者：標的比の全部にて細胞溶解能力を試験し得るように２倍の連続稀釈物を３連の第２列から調製した。⁵¹Ｃｒ標識した２日間コンカナバリンＡ誘導したリンパ芽球を、次いで、ウェル当り１０⁴の芽細胞で加えて３７℃、６％ＣＯ₂で４時間インキュベートする。プレートをTitertek上清採集システム（バージニア州、Sterling在、Skatron,Inc.）を用いて採集し、⁵¹Ｃｒ放出を自動ガンマーカウンターを用いて測定する。細胞溶解能力は、測定がプレートされた応答者の数に基づいてされるように、５日間のインキュベーション期間の終りに存在する生細胞の数ではなくて最初にプレートした細胞培養において直接測定する。この方法論は、この研究所で開発されて、数年間にわたって、個々の動物からの脾臓細胞応答の分析のために首尾よく用いられてきた［Sykes,M.等、1988 J.Immunol. 140:2903-2911］。特異的溶解パーセントは、下記の式を用いて計算する：

【０１９７】
限界稀釈分析：応答者及び刺激者（６×１０⁵、３０Ｇｙ照射）細胞を、９６ウェルプレート中で１３％ＴＣＧＦ（ＢＡＬＢ／ｃ ｃｏｎＡ活性化脾臓細胞から得たレクチン不活性化ｃｏｎＡ上清）を含む完全培地中で、７日間同時培養する。１０⁵（２４ウェル）、３×１０⁴（２４ウェル）、１０⁴（３０ウェル）、３０００（３０ウェル）、１０００（３０ウェル）、３００（３０ウェル）及び１００（３０ウェル）の応答者細胞を調製する。３０００の⁵¹Ｃｒ標識したｃｏｎＡ芽細胞を各ウェルに７日目に加えて、４時間⁵¹Ｃｒ放出を測定する。⁵¹Ｃｒ放出が、同数の標的細胞を加えただけの刺激細胞を含む２４ウェル中の平均⁵¹Ｃｒ放出を３標準偏差超えている場合に、ウェルを陽性と考える。ポアッソン分布を用いて各標的を認識する前駆体ＣＴＬの頻度を測定し、統計的分析をTaswellのカイ二乗法によって実施する（Taswell,1981,J.Immunol.126:1614）。
【０１９８】
フローミクロフルオロメトリー：１色及び２色のフローサイトメトリーを実施して、特定の表現型を発現している細胞のパーセンテージを、前にSykes,1990,J.Immunol.145:3209-3215に詳細に記載されたようにして２色データから測定する。Lysis IIソフトウェアプログラム（Becton Dickinson）を用いて、前方角及び９０°光散乱に基づくゲート制御により顆粒球をリンパ球から区別する。細胞ソーティングをCoulter Epics Eliteセルソーターにて行なう。
【０１９９】
フローサイトメトリー用の細胞懸濁液：ＰＢＬ、ＢＭＣ、胸腺細胞、脾臓細胞及びリンパ節懸濁液を、前に記載されたようにして調製する（Sykes,M.等、1988,J.Immunol.140:2903-2911;Sykes,M.1990,J.Immunol.145:3209-3215;Sharabi,Y.等、1990,J.Exp.Med.172:195-202）。全末梢白血球細胞懸濁液（顆粒球を含む）を、ヘパリン処理した血液を、エッペンドルフ遠心分離機で１４，０００ＲＰＭで２分間遠心してからバフィーコート層を吸引して調製した。これらの細胞を１５ｍｌの円錐チューブに移して洗う。残ったペレットを汚染している赤血球（ＲＢＣ）を、４．５ｍｌの蒸留Ｈ₂Ｏに５秒間さらすことにより溶解させてから０．５ｍｌの１０×ＰＢＳでレスキューする。
【０２００】
細胞染色：１色及び２色染色を、前に記載されたようにして実施する（Sykes,M.,1990,J.Immunol.145:3209-3215;Sykes等、1988,J.Immunol.141:2282-2288）。直接染色のみを用いるときはいつでも、ラット抗マウスＲｃτＲ ｍＡＢ ２．４Ｇ２（Unkeless,J.C.,1979,J.Exp.Med.150:580-596）の培養上清を用いて、ＦｃτＲ結合による非特異的染色をブロックする。次のｍＡＢを用いる：ビオチン化マウスＫ^b特異的ＩｇＧ_2a ｍＡＢ２８−８−６（Ozato等、1981,J.Immunol.126:317-321）及び対照用マウスＩｇＧ_2a ｍＡＢ ＨＯＰＣ１（マウス抗原に対する公知の特異的結合を有しない）を、プロテインＡセファロースカラムにおける精製によって調製し、我々の研究室において用いられる標準的手順によりビオチン化する；ラット抗ＭＡＣ１ ｍＡＢ Ｍ１／７０（Springer等、Eur.J.Immunol.9:301）を培養上清として用い、マウス抗ラットＩｇＧ特異的ｍＡＢ ＭＡＲ１８．５により染色する；ＦＩＴＣ標識したラット抗マウス顆粒球抗体Ｇｒ１をPharmingenから購入する；ＦＩＴＣ標識したラット抗マウスＩｇＭ ｍＡｂをZymedから購入する；ＦＩＴＣ標識したラット抗マウスＴｈｙ１．２ ｍＡＢをBecton-Dickinsonから購入する；ＦＩＴＣ標識したマウス抗ヒトＣＤ３ ｍＡＢ Ｌｅｕ４（Becton Dickenson）をＦＩＴＣ標識したネガティブ対照として直接使用する。
【０２０１】
胸腺組織の免疫蛍光検査：組織をＬ１５培地中で２４時間インキュベートしてバックグラウンド染色を減少させ、次いで、切断してイソペンタン中での凍結のためにＯ．Ｃ．Ｔ．化合物中に包埋する。凍結切片（厚さ４μｍ）を低温保持装置にて調製し、乾燥してアセトン中で固定し、ＰＢＳ中で洗う。第１の抗体インキュベーション（２８−８−６との）を、Ｆｃレセプターを飽和するために、２％正常マウス血清の存在下で実施する。４５分後に、スライドを４回洗い、ＦＩＴＣ結合した第２の試薬（モノクローナルラット抗マウスＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ、Pandexより購入）を加える。第２の試薬と共に４５分間のインキュベーションの後に、４回の洗浄を行なって組織を載せる。切片を、蛍光顕微鏡下で、その組織が得られた動物の群を知らない観察者によって検査する。
【０２０２】
骨髄操作及びアッセイを次のようにして実施した：
マウス骨髄幹細胞の形質導入：骨髄細胞の形質導入に用いる方法論は、以前に記載されている（Karlsson等、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:6062-6066）。骨髄を、２日前に１５０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで処理した６〜１２週齢の雌Ｂ１０．ＡＫＭドナーから採集する。Ｔ細胞涸渇（上記参照）に続いて、骨髄を分割して、１０ｃｍプレート当り１０⁷細胞を、８μｇ／ｍｌのポリブレン、１０％ＦＣＳ、０．６％ ＩＬ−３含有上清、０．６％ ＩＬ−６含有上清及びＢ１９Ｈ２Ｋ^b若しくはＮ２細胞由来の新鮮な上清の存在下で５日間培養する。ＩＬ−３及びＩＬ−６含有上清は、マウスｒＩＬ−３遺伝子含有プラスミッドｐＣＤ−ＩＬ−３又はｒＩＬ−６遺伝子含有プラスミッドｐＣＤ−ＩＬ−６で、それぞれ、トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞の４８時間上清である（両プラスミッドは DNAX Corp.のFrank Lee博士により提供された）。ＩＬ−３含有上清を、ＩＬ−３依存性細胞系統３２Ｄの増殖を、これらの上清の稀釈物の存在下において試験することにより力価測定し、ＩＬ−６を、ＩＬ−６依存性系統Ｔ１１６５を指示細胞系統として用いて同じ方法で力価測定する。我々は又、最近記載されたように（Zsebo等、1990,Cell 63:125-201）、骨髄形質導入におけるマウスＳＣＦの効果を試験する。
【０２０３】
これらのウイルス含有上清を、毎日、各プレートの非付着層を採集し、細胞をペレット化して新たに採集して濾過したウイルス含有Ｂ１９Ｈ２Ｋ^b若しくはＮ２上清（添加剤を含む）に再懸濁することによって新鮮にする。５日後、非付着及び付着ＢＭＣを採集して洗浄し、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びヘパリン１０Ｕ／Ｍｌを加えたゲンタマイシンを含むMedium 199に２．５×１０⁶／ｍｌで再懸濁する。この懸濁液の１ｍｌを照射したマウスに静脈注射する。
【０２０４】
マウスＣＦＵ−ＧＭアッセイ：ＣＦＵ−ＧＭ（コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ）として公知の骨髄前駆細胞を試験するために、骨髄細胞を、３０％限定ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ユタ州、Logan在、HyClone）、１０^-4Ｍ β−メルカプトエタノール、抗生物質、５％（ｖ／ｖ）マウスＩＬ−３培養補足（マサチューセッツ州、Bedford在、Collaborative ResearchInc.）及び０．８％メチルセルロース（Vancouver在 Terry Fox Laboratoryから購入した市販の調製溶液の３６％ｖ／ｖの添加による）を含むＩＭＤＭ培地からなるプレート用培地に懸濁する。この懸濁液の１．１ｍｌを、次いで、３５ｍｍ組織培養プレートに分配して（２連で）、３７℃のインキュベーター中に置く。その結果のＣＦＵ−ＧＭ由来のコロニーを、５〜７日後に、顕微鏡的に数える。形質導入したＣＦＵ−ＧＭを、培養培地に０．９μｇ／ｍｌの活性Ｇ４１８を含ませることにより選択する。形質導入頻度を、次いで、薬剤の存在下及び不在下のコロニーに由来するＣＦＵ−ＧＭの比により測定する。
【０２０５】
分子的方法を次のようにして行なった：
Ｎ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂベクター：このベクターを、元のレトロウイルスベクターＮ２（Eglitis等、1985,Science 230:1395-1398）から出発して構築した（更なるＢａｍＨＩ部位をＸｈｏＩ部位の直ぐ３’側に誘導するようにShimadaにより改変された）。それは、Waneck（Waneck等、1987,J.Exp.Med.165:1358-1370）に記載されたように前にベクターｐＢＧ３６７にクローン化されたＫ^bｃＤＮＡを含む。この遺伝子を、Ｎ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂ構築物を生成するために、高い効率のパーボウイルス由来のプロモーターであるＢ１９プロモーター［Liu等、1991,J.Virol.印刷中］の制御下に置いた。
【０２０６】
サザーンブロット分析を、ＰＢＬ、胸腺細胞、ＢＭＣ、脾臓細胞又はリンパ節細胞懸濁液から抽出したＤＮＡについて、標準的方法（Ausubel等、1989,Current protocols in molecular biology.John Wiley & Sons,ニューヨーク）を用いて行なうことが出来、ｐＢＧ３６７からＥｃｏＲＩによって遊離されたＫ^bｃＤＮＡの断片を用いてプローブ検出を行なう。ゲノムＤＮＡを、形質導入したＫ^bを他のＢ１０．ＡＫＭ系統のクラスＩ遺伝子と区別することの出来る酵素で切断する。公知の配列から、ＥｃｏＲＩは、１．６ｋｂのバンドを形質導入したＫ^bｃＤＮＡから遊離させるはずなので、この目的に十分なものであることがわかる（それは予想される内在性のＢ１０．ＡＫＭのＫ^k及びＤ^qクラスＩバンドと異なる）（Arnold等、1984,Nucl.Acids Res. 12:9473-9485;Lee等、J.Exp.Med.168:1719-1739）。しかしながら、他のクラスＩ及びクラスＩ様遺伝子から遊離したバンドとの混同がないことを確実にするために、我々は、幾つかの酵素を先ず、Ｂ１０．ＡＫＭ由来のＤＮＡについて試験して適当な制限酵素の組合せを選択する。
【０２０７】
ＤＮＡのＰＣＲ分析を、前に我々の予備研究において有効であることを示したプライマーを用いて実施することが出来る（図４参照）。
5'プライマー: 5'-GGCCCACACTCGCTGAGGTATTTCGTC-3'（α１エキソンの５’末端をカバー）（配列番号３）
3'プライマー: 5'-GCCAGAGATCACCTGAATAGTGTGA-3'（α２エキソンの５’末端をカバー）（配列番号４）
【０２０８】
これらの特異的オリゴヌクレオチド及びCetus GeneAmp キット（コネチカット、Norwalk,Perkin Elmer Cetus ）を製造者の指示に従って用いて、ＤＮＡを２５サイクルのＰＣＲ増幅にかける。更に、生成物を電気泳動の後にオートラジオグラフィーによって可視化するために^[32]ＰｄＣＴＰをＰＣＲ反応に含ませる。
【０２０９】
ＲＮＡを、５×１０⁶ 〜５×１０⁷ 細胞から、グアニジンイソチオシアネート及びＣｓＣｌ法（Chirgwin等、 1979, Biochem.18:5294-5308）を用いて単離することが出来、ノーザン分析、ＲＮアーゼ保護分析及び逆転写酵素により形成された生成物のＰＣＲ分析に用いる。５×１０⁶ 未満の細胞しか利用できない状況（例えば下記の個々のマウスの尾からの採血）のために、我々は、QuickPrep mRNA Purification Kit（Amgen）を、小型化したＲＮＡ調製手順として利用する。
【０２１０】
ノーザン分析を、標準的方法（Ausubel 等、 1989, Current protocols in molecular biology John & Sons ニューヨーク）及び同じＫ^b ｃＤＮＡ由来のプローブを用いて行なうことが出来る。ベクター由来のＫ^b ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡの３’末端とウイルス性３’ＬＴＲ内のポリアデニル化部位との間にベクター配列を含むために、内在性のクラスＩ転写物より大きい（２．５ｋｂ対１．６ｋｂ）。それ故、ベクター由来のＫ^b ｍＲＮＡをＫ^b ｃＤＮＡプローブとクロスハイブリダイズし得る内在性転写物から区別することは容易である。我々は又、転写物のユニークな非Ｋ^b 配列から導いたプローブをも利用する（例えば、Ｂ１９又はＮ２由来のベクター配列からのもの）。
【０２１１】
ＲＮアーゼ保護分析は、標準的なノーザンブロットより高感度であり、しかも定量的である。公開された方法（Sambrook等、 1989, Molecular cloning:A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）に基く手順を用いてリボプローブを導く。簡単に言えば、Ｋ^b ｃＤＮＡを、Ｔ３及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（Stratageneからのブルースクリプト又はブルースクリプトプラスミッド）を含むプラスミッドベクター中にクローン化する。適当なポリメラーゼ及び³²Ｐ−ヌクレオチドを用いて、挿入物の転写を開始して放射性Ｋ^b ＲＮＡを精製する。このプローブを、次いで、種々のＲＮＡ調製物とインキュベートし、その後、リボヌクレアーゼで処理する。ＲＮＡの存在を、配列決定用ゲル上で電気泳動により評価する。
【０２１２】
ＲＮＡの逆転写酵素処理の後に、ＰＣＲを、Ｋ^b 転写物を検出するための高感度の手順として用いる。適当なプライマーを、レトロウイルス由来の転写物を特異的に増幅するためにデザインする（１つのプライマーが、構築物の５’ＵＴ領域及びｃＤＮＡ配列から導かれた配列をカバーする）。簡単に言えば、ＲＮＡを、ＧｕＳＣＮ／ＣｓＣｌ法により調製し、第１鎖ｃＤＮＡを５μｇの全ＲＮＡからスーパースクリプト予備増幅システム（メリーランド、 Gaithersburg在、 BRL/Life Technologies, Inc. ）を用いて調製する。ＰＣＲ増幅を、Cetus GeneAmp キット（コネチカット、 Norwalk 在、 Perkin Elmer Cetus）を用いて、５０サイクル行なう（Hansen等、 J.Immunol. 118:1403-1408）。反応生成物を、３％ NuSieve アガロースゲル（メイン、 Rockland 在、 FMC BioProducts ）上での電気泳動の後に可視化する。
【０２１３】
同種ＭＨＣ遺伝子トランスファープラスシクロスポリン
第１に血管新生した同種移植片の運命の決定においてクラスIIＭＨＣ遺伝子座における違いが決定的に重要であることは、以前に、部分的に同系交配したミニブタにおいて示された。移植後の早い時期に与えたシクロスポリンは、一律に、クラスIIマッチしたクラスＩミスマッチの腎臓同種移植片の寛容へ導く。しかしながら、シクロスポリン単独では、完全ＭＨＣバリヤーを横切る寛容を生成しない。クラスIIの重要性と一致して、クラスIIバリヤーを横切る同種骨髄移植は、骨髄ドナーのクラスIIにマッチするがレシピエントとは完全に異なる腎臓移植片に対する寛容を誘導する。下記の実験において、ＳＬＡ不同の腎臓移植を達成するための特異的移植寛容を、レシピエントの骨髄を一般に移植前に同種ＳＬＡクラスII遺伝子を有するレトロウイルス発現ベクターでの形質導入により改変する自己の骨髄移植によって誘導した。レトロウイルス発現ベクターは、ＳＬＡ−ＤＲＢ^a 又はＤＲＢ^c の何れかについてのｃＤＮＡ及び薬物選択マーカー（Ｎｅｏ）を含み、高力価のウイルス上清を両栄養性パッケージング細胞系統を用いて調製した。この研究に含まれた５匹の動物からの骨髄を２日目に採取し、次いで、同種（ｎ＝４）又は同系（ｎ＝１）ＭＨＣ遺伝子の何れかについて、約４８時間にわたって、ウイルス含有上清と共に培養した。−１日又は０日目の致死照射（２４時間間隔を置いた２フラクションにて１０Ｇｙ）の後で、動物に、０日目に、０．４〜１．３×１０⁸ 細胞／ｋｇを移植した。遺伝子トランスファーの効力を、ネオマイシン耐性について選択するためのＧ４１８の存在下で、顆粒球／マクロファージ前駆細胞についてのコロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵ−ＧＭ）を用いて試験した。Ｇ４１８耐性ＣＦＵ−ＧＭの頻度は、移植直後に動物間で有意に変動し（６．５〜２５．９％）、時間と共にゆっくり減少した。すべての動物は、骨髄移植の３か月後までに、同種刺激に対する応答性を回復した（ＭＬＲにより試験）。クラスIIＭＨＣのＤＱ及びＤＲ分子に特異的なＭＡｂを、ＤＱ及びＤＲの認識の効果を分離するために、「ブロッキング」ＭＬＲ研究のために用いた。同種ＤＲＢ遺伝子で形質導入した骨髄移植のレシピエントからの細胞を用いるアッセイにおいて、遺伝子ドナー型細胞に対する応答のＤＲ部分は、強く減少され、形質導入した遺伝子のＤＲ特異的無応答性の誘導における効力を示した。この効果は、ｇｇ方向に対するＤＲＢ^a よりｃｃ組合せに対するＤＲＢ^d において一層著しいにもかかわらずすべての実験動物において認められた。同系遺伝子で形質導入した対照動物からの細胞を用いるＭＲＬにおいて、ＭＬＲ中のＤＲ又はＤＱのブロッキングは、同じハプロタイプの天然の動物において認められたものと同一の反応性パターンを示した。ＢＭＴの５か月後に、動物を、遺伝子ドナー型のクラスIIにマッチ且つ元のレシピエントのハプロタイプとは完全にミスマッチである腎臓移植片により攻撃誘発（challenged）した。クラスＩＭＨＣ及びマイナー抗原不同に対して寛容化するために、１２日間にわたって１０〜１５ｍｇ／ｋｇ／日でシクロスポリンを静脈投与した。３匹の動物が、それらの腎臓移植片を８、２２及び４０日目に拒絶した。８日目の早められた拒絶の様式は、同種遺伝子生成物の発現の望ましくない効果としての増感を示唆するものであった。これらの何れのレシピエントにおいても、抗ドナー型抗体の存在は、フローサイトメトリーによって検出されなかった。一匹の動物が寛容になり、移植後１０１日目で正常のクレアチニンレベルを示した。同系遺伝子で形質導入した骨髄を受けた動物は、高クレアチニンレベルで病理学的血管変化を伴う重大な拒絶を受けた。最長生存腎臓移植片のレシピエントも又、Ｇ４１８ｒＣＦＵ−ＧＭの初期頻度に基づいて判断して、最も効率的に形質導入された自己骨髄を受けた。この一例において、組換えサイトカイン［Pixy321 （Pixyは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ３融合蛋白質である）１００単位／ｍｌ；マウス幹細胞成長因子２０単位／ｍｌ；これらのサイトカインを使用したが、トランスフォームされた細胞と同じ種からのサイトカインも又使用出来る］を、同種ＤＲＢレトロウイルス発現ベクターでの形質導入中、培養培地に含ませた。これらのサイトカインは、最終的にＤＲＢ特異的な低応答性を誘導した樹状細胞の前駆細胞を含む多系列多能性造血幹細胞の形質導入へと導いた。これらの実験は、骨髄細胞中への体細胞クラスIIＭＨＣＤＲＢ遺伝子トランスファーが、レシピエントの免疫応答に際して著しい機能的意義を有することを示す。イン・ビトロ及び一層重要なことにはイン・ビボにおいて、完全にミスマッチの腎臓移植片の生存のドナー特異的な延長の誘導に伴って免疫機能が有意に調節された。同種骨髄幹細胞のＭＨＣ遺伝子での形質導入は、リンパ造血キメリズムに匹敵する機構によりＭＨＣバリヤーを横切る寛容を誘導する方法を提供する。ここに記載した実験で用いた致死的照射は、一層臨床的に許容される様式で骨髄植付けを可能にする骨髄除去しない条件の養生法で置き換えることが出来る。
【０２１４】
III．骨髄移植を伴う寛容の誘導
クラスＩ及び他のマイナーな不同に対する寛容を誘導するための、骨髄細胞の移植と組合せた高投与量シクロスポリンの短期コース（サイトカイン放出を刺激する治療例えばプレドニゾンでの治療の不在にて施与する）は、クラスII不同に対する寛容を誘導する。
異種移植片：
下記の手順を、移植された器官（異種移植片）が拒絶前に異種移植宿主において生存する時間を延長するためにデザインした。この器官は任意の器官例えば肝臓、腎臓、心臓であってよい。主要な戦略は、器官灌流による天然抗体の排除、寛容誘導性骨髄の移植、適宜に、ドナーの間質組織の移植、及び適宜に、上記のように移植片の導入の頃に補助減縮剤の短期コースを施与することである。レシピエントの移植に対する準備は、これらのステップの何れか又はすべてを含む。好ましくは、それらを下記の順序で行なう。
【０２１５】
第一に、ウマ抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の調製物を、レシピエントに静脈注射する。この抗体調製物は、成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を排除する。もし排除されないと、成熟Ｔ細胞は、骨髄移植片及び異種移植片自身（感作後）の両者の拒絶を促進するであろう。同様に重要なことであるが、ＡＴＧ調製物は又、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をも排除する。ＮＫ細胞は、恐らく、移植された器官に影響を有しないが、新たに導入された骨髄を直接作用して拒絶するであろう。任意の哺乳動物宿主から得た抗ヒトＡＴＧ、例えばウマ由来のＡＴＧより低い力価であったが、ブタで生成されたＡＴＧも用いることが出来る。ＡＴＧは、ＡＴＧにおけるポリクローナル混合物はすべての宿主ＮＫ細胞を溶解させることが出来るが、抗ＮＫモノクローナル抗体は一般にすべての宿主ＮＫ細胞を溶解させることはないので、抗ＮＫモノクローナル抗体より優れている。しかしながら、抗ＮＫモノクローナル抗体を用いることは出来る。
【０２１６】
宿主Ｔ細胞が移植後再生する時期における、宿主胸腺中のドナー抗原の存在は、宿主Ｔ細胞を寛容化するために決定的に重要である。もしドナーの造血幹細胞を、宿主Ｔ細胞が再生される前に宿主胸腺内で樹立して寛容を誘導することが出来なかったならば、この非骨髄除去養生法の間中、抗レシピエントＴ細胞抗体の反復投与が必要であろう。宿主Ｔ細胞の連続的涸渇は、数週間にわたって必要であろう。或は、例えば、もしこのアプローチが成功せず、寛容がこれらの動物において誘導されない［ドナー皮膚移植片受容、特異的細胞性低応答性（イン・ビトロ）及び体液性寛容により測定］ならば、このアプローチを改変して宿主の胸腺摘出を含むことが出来る。胸腺摘出されたレシピエントにおいて、宿主Ｔ細胞は、宿主胸腺内で分化する機会を持たず、従って、ドナーの胸腺内で分化しなければならない。もしこれが可能でないならば、その動物は、免疫適格について、ドナー胸腺内でのドナーＴ細胞の発達に依存しなければならない。免疫適格は、非ドナー型異種ドナー皮膚移植片を拒絶する能力及び病原体を含む環境で生存する能力により測定することが出来る。
【０２１７】
貧血を回避するために、レシピエントを脾臓摘出することも必要又は望ましいであろう。
【０２１８】
第２に、レシピエントに、新たに注入された骨髄細胞のための場所を作るために低線量照射を施与する。１００〜４００ラドの準致死線量（全身照射）プラス７００ラドの局所的胸腺照射が、この目的に効果的であることが見出された。
【０２１９】
第３に、天然の抗体を、ドナー種の肝臓の血液灌流によりレシピエントの血液から吸収する。前もって形成されていた天然抗体（ｎＡＢ）が、移植片拒絶の第一次因子である。天然抗体は異種内皮細胞に結合し、それらは第１にＩｇＭクラスである。これらの抗体は、異種ドナーの抗原に対する如何なる公知の以前の曝露にも依存しない。これらの天然抗体をを生成するＢ細胞は、Ｔ細胞非依存性の傾向があり、通常、発生中に自己抗原に曝露されることによりこれらの抗原に対して寛容となる。新たに発生中のＢ細胞が寛容化される機構は未知である。肝臓は、腎臓より一層効果的な天然抗体の吸収体である。
【０２２０】
骨髄除去をしない手順における第４のステップは、ドナー間質組織好ましくは胎児の肝臓、胸腺及び／又は胎児の脾臓から得たものをレシピエント中に好ましくは腎臓被膜内に移植することである。異種バリヤーを横切る幹細胞植付け及び造血は、ドナー種からの造血間質環境を提供することにより増大される。間質マトリックスは、造血細胞及びそれらの間質環境間の相互作用に必要な種特異的因子例えば造血成長因子、接着分子及びそれらのリガンドを供給する。
【０２２１】
肝臓は、胎児における造血の主要部位であるので、胎児肝も又造血幹細胞源として骨髄の代替物として働き得る。胸腺は、Ｔ細胞成熟の主要部位である。各器官は、宿主中に移植されたそれぞれの未分化幹細胞の分化を支持することの出来る器官特異的な間質マトリックスを含む。成体胸腺を使用することも出来るが、妊娠の十分初期に得られた胎児組織は、ＧＶＨＤを引き起こし得る成熟Ｔリンパ球を含まないので好ましい。ＧＶＨＤに対する更なる用心として、胸腺間質組織を、移植前に、例えば１０００ラドで照射することが出来る。移植の別法又は補助として胎児肝細胞を懸濁液にて投与することが出来る。
【０２２２】
第５に、ドナーの骨髄細胞（ＢＭＣ）又は他の造血幹細胞の源例えば胎児肝懸濁液を、レシピエントに注入する。ドナーのＢＭＣは、レシピエントの適当な部位に帰り、残りの宿主細胞と隣接して成長して増殖し、キメラ状リンパ造血集団を形成する。このプロセスにより、新たに形成中のＢ細胞（及びそれらが産生する抗体）は、ドナー抗原にさらされるので、この移植片は自己として認識されるようになる。ドナーに対する寛容は又、造血幹細胞例えばＢＭＣの植付けが達成された動物中のＴ細胞レベルにおいても認められる。骨髄キメリズムが誘導されてから数か月後に器官移植片をかかるレシピエント中に位置させた場合には、ドナーに対する天然抗体は消失し、移植片は免疫系の体液性及び細胞性防御の両者に受容されるはずである。このアプローチは、造血細胞移植、例えばＢＭＴ例えば胎児肝懸濁液の移植の後、器官移植の時点で正常な健康及び免疫適格が回復している程十分長期間経っても器官移植を可能にするという更なる利点を有する。異種ドナーの利用は、同じ動物又は遺伝的にマッチする動物からの骨髄細胞及び器官を使用する可能性を与える。
【０２２３】
最後に、補助減縮剤の短期コース例えば高投与量
ＣｓＡの短期コースをレシピエントに施与することが出来る。上記のように、このコースを移植の頃又はその少し前に初め且つ、成熟Ｔ細胞が刺激され、拒絶を開始するのに要する時間とほぼ等しい時間にわたって継続する。これらの手順の何れもが移植された器官の生存を助成し得るが、最良の結果は、すべてのステップを組合せて用いたときに達成される。この発明の方法を用いて、同種移植片（例えば、移植片のドナー及びレシピエントの両者がヒト）及び異種移植片（例えば、移植片のドナーが非ヒト動物、例えばブタ例えばミニブタであり、移植片レシピエントが霊長類、例えばヒト）に対する寛容を与えることが出来る。
【０２２４】
これらの手順の何れもが移植された期間の生存を助成するが、最良の結果は、すべてのステップを組合せて用いたときに達成される。この発明の方法を用いて、同種移植片（例えば、移植片のドナー及びレシピエントの両者がヒト）及び異種移植片（例えば、移植片のドナーが非ヒト動物、例えばブタ例えばミニブタであり、移植片レシピエントが霊長類、例えばヒト）に対する寛容を与えることが出来る。
【０２２５】
異種移植片の場合に、移植片のドナー及び寛容誘導性造血細胞又は灌流用の肝臓を供給する個体は、同一個体であるか又は出来るだけ密接に関連しているべきである。例えば、高度に同系交配したドナー集団から移植用組織を得ることは好ましい。
【０２２６】
詳細なプロトコール
ミニブタドナーからの腎臓のレシピエントとしてカニクイザルを準備する下記のプロトコールにおいて、レシピエントの動脈及び静脈カニューレを灌流用肝臓に接続した時点をゼロ時間と定義する。
【０２２７】
−１日目において、市販のウマ抗ヒト抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の調製物をレシピエントに注射する。ＡＴＧは、排除しなければ、寛容を誘導するために用いる骨髄細胞の拒絶を引き起こすであろう成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を排除する。レシピエントを麻酔し、IVカテーテルをレシピエントに挿入し、そして６ｍｌのヘパリン化全血液を感染前に取り出す。次いで、ＡＴＧ調製物を静脈注射する（５０ｍｇ／ｋｇ）。６ｍｌのヘパリン化全血液を、３０分、２４時間及び４８時間の時点において試験するために吸い出す。血液試料を、ナチュラルキラー細胞活性に対する抗体処理の効果について分析し（Ｋ５６２標的について試験）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１６を含むリンパ球サブポピュレーションについてＦＡＣＳ分析により分析する。両アッセイからの予備データは、細胞の両グループがＡＴＧの投与により排除されることを示す。もし成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞が排除されないならば、器官移植の前及び後のこの手順のもっと遅い時期に再投与することが出来る。
【０２２８】
準致死的照射を、−１〜−８日目に、レシピエントに施与することが出来る。照射は、十分なレシピエントの内在性ＢＭＣを排除して新たに導入された外来のＢＭＣの造血を刺激するのに必要である。準致死的全身照射は、レシピエントに対する最小毒性効果にて植付けを許すのに十分である。全身照射（１５０ラド）を、両側からの（ＴＲＢＣ）コバルト遠隔放射線療法で、１０ラド／分にて、カニクイザルレシピエントに施与する。植付けを促進するために、胸腺の局所的照射（７００ラド）も用いることが出来る。
【０２２９】
天然抗体は、器官拒絶の第１の原因である。移植前にレシピエントの循環系から天然抗体を除去するために、０日目に、天然抗体（ｎＡＢ）の手術的吸収を、下記のようにミニブタの肝臓を用いて行なう。−９０分において、ブタドナーを麻酔し、標準的手術手順により肝臓を取り出す準備をする。−６０分において、レシピエントのサルを麻酔する。末梢IVカテーテルを挿入し、６ｍｌの全血液試料を吸い出す。正中線切開により、腹大動脈及び大静脈を取り出す。血液採取用のサイドポートを有するシラスティックカニューレをこれらの血管に挿入する。
【０２３０】
−３０分において、肝臓をインシトゥーで薄色になるまで灌流し、次いで、ブタドナーから取り出して冷リンゲルラクテート中に置く。この肝臓を、サルにおける再灌流の直前まで冷やしておく。肝臓のバイオプシーを行なう。−１０分において、肝臓を温アルブミン溶液で、肝臓が暖まる（３７℃）まで灌流する。
【０２３１】
０時間において、レシピエントの動脈及び静脈カニューレをドナーの肝臓の門脈及び大静脈に接続して灌流を開始する。肝臓バイオプシーを、３０分及び６０分にそれぞれ行なう。レシピエント血液試料を血清用にも、３０分及び６０分にてそれぞれ吸い出す。６０分に、肝臓をカニューレから分離し、レシピエントの大血管を修復する。レシピエントのサルから有害な天然抗体を吸収する機能を果たした肝臓を捨てる。血清用の更なる血液試料をレシピエントから、２、２４及び４８時間にて吸い出す。この手順を２つのブタ肝臓の順次的灌流にて行なった場合、第２の肝臓は、灌流中軽い虚血性変化の証拠を示さなかった。３０分の灌流の終りに、第２の肝臓は、隣接する２つのカニューレにおいて動脈の流入血液と比べて黒ずんだ静脈の流出血液により証明されるように大いに正常且つ機能的であるようであった。これらの肝臓からの組織切片は正常であったが、免疫蛍光染色は内皮細胞にＩｇＭを示した。血清試料は、天然抗体の減少を示した。
【０２３２】
Ｔ細胞及びＢ細胞媒介の寛容による移植された器官の長期生存を促進するために、ドナー骨髄細胞をレシピエントに投与してキメラ状骨髄を形成する。骨髄中のドナー抗原の存在は、新たにＢ細胞を発生させ且つ新たにＴ細胞を感作してドナーの抗原を自己として認識させ、それにより、ドナー由来の移植された器官に対する寛容を誘導することを可能にする。ドナーのＢＭＣを安定化するために、ドナーの間質組織（胎児肝の組織スライスの形態）、胸腺及び／又は胎児脾臓を、レシピエントの腎臓被膜の下に移植する。間質組織は、好ましくは、造血幹細胞例えばＢＭＣ又は胎児肝細胞懸濁液の投与と同時に又は投与前に移植する。
【０２３３】
キメリズムの後に、２色フローサイトメトリーを用いることが出来る。このアッセイは、モノクローナル抗体を用いて、ドナークラスＩ主要組織適合抗原及び白血球共通抗原をレシピエントクラスＩ主要組織適合抗原に対して識別する。次に、ＢＭＣを、器官移植と同時に又は移植前に注射することが出来る。以前に記載のように、骨髄を採取し、静脈注射（７．５×１０⁸ ／ｋｇ）する（Pennington等、1988,Transplantation 45:21-26）。寛容が誘導される前に天然抗体の再発が見られ、これらの抗体が移植片に障害を引き起こすならば、プロトコールを改変してＢＭＴ後に十分時間をおいて器官移植前に体液性寛容が樹立されるようにすることが出来る。
【０２３４】
上記のアプローチは、共同して移植拒絶の問題を防ぐようにデザインされている。腎臓をカニクイザルに、肝臓の天然抗体吸収後に、寛容を誘導するための骨髄移植を用いずに移植した場合には、腎臓機能は、腎臓の拒絶の前に１〜２日間持続した。４つの手順（肝臓灌流による天然抗体の吸収、ＡＴＧの投与、準致死的照射及び骨髄注入、その後にブタ腎臓を霊長類レシピエントに移植する）を行なった場合には、腎臓は、拒絶前に７日間機能した。移植された器官の拒絶にもかかわらず、レシピエントは健康を維持した。
【０２３５】
ブタ胎児肝及び胸腺間質組織を２匹の準致死的照射したＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に移植した場合、移植の２週間後において、末梢血液白血球の２５〜５０％は、ドナー系列であった。胎児肝を胸腺を伴わずに受けた第３の動物においては、有意の程度のキメリズムは検出されなかった。
【０２３６】
この発明の方法を、説明したように、組合せて、又は一部分で用いることが出来る。
【０２３７】
この骨髄細胞を導入する方法を変えることが出来、特に、（１）造血幹細胞の注射と移植との時間間隔を増すこと；（２）注射する造血幹細胞の量を増し又は減じること；（３）造血幹細胞注射の回数を変えること；（４）造血幹細胞の送達方法を変えること；（５）造血幹細胞の組織源を変えること、例えば胎児肝細胞懸濁液を用いることが出来る；又は（６）造血幹細胞のドナー源を変えることによって変えることが出来る。移植片ドナーから導いた造血幹細胞が好適であるが、造血幹細胞を他の個体若しくは種から、又は遺伝子操作した同系交配ドナー株から、又はイン・ビトロ細胞培養から得ることも出来る。
【０２３８】
造血幹細胞の移植のためにレシピエントを準備する方法を変えることが出来る。例えば、レシピエントは、脾臓摘出又は胸腺摘出を受けることが出来る。後者は、好ましくは、骨髄を除去しない養生法の前例えば−１４日に施与する。
【０２３９】
天然抗体の血液灌流は、（１）他の血管器官例えば肝臓、腎臓、腸を利用する；（２）複数の逐次的器官を利用する；（３）各器官を灌流する時間の長さを変える；（４）灌流される器官のドナーを変えることが出来る。レシピエントの照射は、（１）準致死的範囲より低い全身照射の吸収線量を変える；（２）種々の身体部分（例えば、胸腺、脾臓）を標的とする；（３）照射率を変える（例えば、１０ラド／分、１５ラド／分）；又は（４）照射と造血幹細胞移植との時間間隔を変える（１〜１４日の任意の時間間隔を用いることが出来、ある種の利益は４〜７日の時間間隔の利用から生じ得る）ことを利用することが出来る。造血細胞移植前に導入する抗体を、（１）Ｔ細胞サブセット又はＮＫ細胞に対するモノクローナル抗体を利用すること（例えば、Hercend 等の米国特許第４，７７２，５５２号に記載された抗ＮＫＨ１_A 、参考として本明細書中に援用する）；（２）抗ヒトＡＴＧを他の哺乳動物宿主にて調製すること（例えば、サル、ブタ、ウサギ、イヌ）；又は（３）上記の宿主の何れかにおいて調製した抗サルＡＴＧを用いることにより変えることが出来る。
【０２４０】
この発明の方法を他の哺乳動物レシピエント（例えば、アカゲザル）に用いることが出来、又、他の哺乳動物ドナー（例えば、霊長類、ヒツジ又はイヌ）を用いることが出来る。血液灌流の別法又は補助として、宿主抗体を、過剰の造血細胞の投与により涸渇させることが出来る。
【０２４１】
造血細胞移植例えばＢＭＴ前に導入する間質組織を、（１）胎児肝及び胸腺組織を細胞懸濁液として投与すること；（２）胎児肝又は胸腺間質組織の何れか一方のみを投与すること；（３）間質移植組織を他の被膜を有する十分血管化された部位に置くこと、又は（４）成体胸腺又は胎児脾臓を間質組織源として用いることにより変えることが出来る。
【０２４２】
キメラブタにおける完全にＭＨＣミスマッチの腎臓同種移植片に対する寛容
ミニブタにおける腎臓移植片（ＫＴｘ）の寛容の達成に対する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスIIマッチングの圧倒的重要性が以前に示された。クラスII抗原がマッチする場合、ＭＨＣクラスＩ及びマイナー抗原（ＭＡ）バリヤーを越える長期の特異的寛容を、シクロスポリンの短期コースによって一様に誘導することが出来る。しかしながら、シクロスポリンは、全ＭＨＣバリヤーを越えるこの効果を生じない。単一ハプロタイプクラスIIＭＨＣ＋ＭＡバリヤーを越える骨髄移植（ＢＭＴ）は、ＦＣＭにより確認されたように、完全キメラ動物を創出した。これらのキメラは、ＢＭＴの２〜３か月後に正常な細胞性免疫機能を回復する（ＭＬＲ及びＣＭＬにより試験）。４匹のかかるキメラ動物（表１の１〜４番参照）は、ＭＢＴドナーとクラスIIマッチするがレシピエントとは完全にミスマッチのドナーからの腎臓移植片を受けた。シクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）の１２日コースが、腎臓移植後の唯一の免疫抑制であった。４匹のすべてのブタは、３００日より長期間正常クレアチニン（Ｃｒ）値（＜２ｍｇ％）を維持し、一レシピエントは、良好な腎臓機能を有して３年より長く生存し、移植片組織学は最小境界線拒絶を示した。これらの結果は、ＢＭＴによるクラスII抗原に対する寛容の誘導が、完全に異種の腎臓移植片に対する特異的寛容を誘導することを可能にすることを示す（皮膚移植片により試験）。続いて、我々は、この現象の特異性を、単一ハプロタイプクラスII＋ＭＡミスマッチＢＭＴが、レシピエント及びＢＭＴドナーの両者と完全にミスマッチの腎臓移植片のシクロスポリン誘導した長期受容を促進するかを測定することによって試験した（表１の５〜１０番）。シクロスポリンの１２日コースは、キメラレシピエントにおけるかかる腎臓移植片の長期生存を与えた。５番の動物は未だ生存し、正常Ｃｒレベルを有して臨床的に良好であった；しかしながら、組織学は、境界線拒絶を示している。６番の動物を腎臓移植の１８か月後に殺したが、腎臓機能の低下を有した（Ｃｒ＞１１ｍｇ％）。７番の動物を、感染症の故に、腎臓移植の６か月後に殺したが、腎臓移植片は、血管傷害の徴候を有しない中程度の腸管（tubulointestinal）浸潤物を示した。両長期生存動物（３番及び５番のブタ）を、最近、抗ドナー反応性について試験した。ＣＭＬ及びＭＬＲは、腎臓移植片ドナー型細胞に対する特異的非応答性を示した。８〜１０番のブタは、異系交配したヨークシャードナーからの腎臓移植片を受けた。これらの動物は、シクロスポリン治療の停止後少しして始まる不可逆的腎不全を発生した。
【０２４３】
【表１】

【０２４４】
従って、ＭＨＣクラスIIミスマッチのＢＭＴレシピエントにおけるシクロスポリンの手術後短期コースは、ＢＭＴドナーとクラスIIマッチする腎臓移植片に対する寛容を誘導することを可能にする。ある場合には、明らかに複数の遺伝子座の不同の程度に依存（同系交配及び異系交配ドナー間の差異と比較）して、レシピエント及びＢＭＴドナーの両者と完全にミスマッチの腎臓移植片に対する長期非応答性を達成することが出来る。
【０２４５】
霊長類同種腎臓移植におけるＴ細胞機能を抑制するためのシクロスポリンの短期コース
下記の実験は、植付けを達成するための骨髄を除去しないプロトコールにおいて得られた混合キメリズムが、多系列リンパ造血キメリズム及び完全にＭＨＣミスマッチのカニクイザル間の腎臓移植片に対する長期の寛容を生じ得ることを示す。骨髄移植を寛容誘導養生法として用いる場合には、宿主のリンパ造血要素の完全除去は、必要でないし望ましくもない。それよりも、混合キメリズムの状態を達成することが有利であり、該状態において、ある種のドナー由来の要素の存在が特異的寛容を誘導し、他方、宿主型抗原提示細胞は正常免疫適格を維持する。
【０２４６】
混合キメリズムを達成するためには、成熟宿主Ｔ細胞の除去が重要であることがマウスにおける研究において示されている。完全にＭＨＣミスマッチのカニクイザルを用いる初期の研究において、種々のモノクローナル抗体を、成熟Ｔ細胞サブセット（抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８）並びにＴ細胞涸渇剤としての抗胸腺グロブリン（ＡＴＧ）の幾つかの源に対して試験した。これらの抗体処理は末梢血液中のＴ細胞の著しい涸渇を生じたが、リンパ節のバイオプシーは、残余のＴ細胞が残っており、しばしば抗体で覆われていることを示した。Ｔ細胞機能を更に抑制するために、筋肉内投与用の油中シクロスポリン（ＣｙＡ）調製物を用いる治療の１か月コースを、調製養生法に加えた。この治療は、薬物投与中にシクロスポリンの治療レベルを生じ、薬物を停止した後３週間の期間にわたって漸減するレベルを生じた。非致死的な調製養生法の基本的プロトコールは、次の通りである：体重６〜１０ｋｇのカニクイザル（マサチューセッツ、Wilmington 在、 Charles River Primates）を、３００ラドのＷＢＩ、−６日目における単一照射（＃Ｍ３９３）又は−６日目と−５日目の各１５０ラドの２フラクション（＃Ｍ３０９３及び＃Ｍ３２９３）で処理した。７００ラドの胸腺照射を−１日目に施与した。ウマ抗ヒト胸腺グロブリン（ＡＴＧ）（Upjohn）を、−２、−１及び０日目に５０ｍｇ／ｋｇにて筋肉内投与した。０日目に、正中線切開により、ドナーの腎動脈及び腎静脈を、レシピエントの大動脈及び大静脈中に、それぞれ、末端から側面へ（end to side）吻合し且つ排尿のために尿管尿管吻合することにより、正常位の腎臓移植を行った。骨髄を２匹のドナーウサギから採取し、単離細胞浮遊液として調製して、腎臓移植の最後にレシピエント中に静脈から注入した。シクロスポリン（Sandimmun,１５ｍｇ／ｋｇ／日、オリーブ油中に懸濁）での治療（筋肉内投与）を、０日目に始めて２７日間継続した。
【０２４７】
サル＃３９３は、８日目に汎血球減少となり、血液型の適合した輸血を３回必要とし、次の２週間にわたって全血液を照射した。しかしながら、末梢血液成分はその後徐々に回復し、３０日目までに正常となった。腎臓機能は２５０日より長期にわたって正常であり、２１５日目のバイオプシーは正常腎臓を示した。
【０２４８】
この動物について、ドナーを宿主から区別することを予め測定したモノクローナル抗クラスＩ抗体を用いて、逐次的フローサイトメトリー（ＦＭＣ）分析を行ない、リンパ様細胞、単核細胞及び好中球ポピュレーションを散乱プロフィル測定により分析した。３つのすべてのサブポピュレーションにおけるキメリズムの明白な証拠が、最初、１０日目に検出され、２７日目にシクロスポリン治療を停止するまで同様に高レベルを持続した。それ故に、各サブポピュレーションにおいて検出されたキメリズムのレベルは減少したが、キメリズムは、ＦＣＭによって、リンパ球（１．５％）及び単核細胞（２９％）中で、２０３日目に依然として検出可能であった（最後の日に試験した）。更に、２０３日目の骨髄吸引は、ＦＣＭにより、１１．２％のドナー細胞を示した。
【０２４９】
混合リンパ球反応は、予備移植を行ない、移植後１５９日目に、抗ドナー反応性の特異的喪失を示した（表２）。
【表２】

【０２５０】
この結果は、２７日目以後、何らの更なる外因性の免疫抑制を伴わずに正常な腎臓機能及び正常な腎臓組織学と合わせて、我々に、特異的な移植寛容がこの動物中に混合キメリズムの樹立により誘導されたということを結論させる。更なる２匹の動物を、同じプロトコールで処理したが、３週間にわたる徐々に漸減するレベルではなく、停止後に血液中のシクロスポリンレベルの急激な下降を生じるシクロスポリン調製物の静脈内投与を用いた。これらの動物の内の１匹は、感染症のため、形成不全期間中に１２日目に死亡し、他方は、シクロスポリンの停止後にキメリズムの証拠を喪失し、１００日目に未だ生存したが、臨床及び病理学的基準の両者により慢性的拒絶と一致する経過を示した。
【０２５１】
調製養生法の毒性を減少させるために、我々は、続いて、照射プロトコールを改変した。一匹の動物（＃３８９３）において、ＷＢＩを１．５Ｇｙに減らした。この動物は、混合キメリズムを発生し得ず、腎臓移植片を拒絶した（４７日目にて、クレアチニン＝１２．１）。更なる２匹の動物（＃３０９３及び＃３２９２）において、ＷＢＩを３．０Ｇｙに維持したが、単一照射ではなく、連続する２日（−６及び−５日目）の１．５Ｇｙに分けた。これらの動物の両者とも混合多系統キメリズムを生じ、それぞれ、１１及び２０日目に最初に検出可能であった。それらは、分割しない照射を受けた動物よりずっと低い調製養生法の毒性を示し、両者は、この文章を書いているこの時点において、正常の腎臓機能を持つキメラを維持している（それぞれ、４０日目及び２５日目）。
【０２５２】
混合キメリズムアプローチによるブタからサルへの腎臓異種移植
下記の実験は、以前に調和性ゲッ歯動物系において効果が示された異種リンパ造血キメリズムアプローチによる、サルにおけるブタの器官に対する寛容の誘導を示す。今までに、１６匹のカニクイザルが、ブタ腎臓移植片を同じドナーからの異種骨髄と共に受けた。これらの異種移植片についての調製養生法は、１）骨髄を除去しない全身照射（ＷＢＩ）及び胸腺照射による調整；２）サルの血液をブタの肝臓を灌流させることによる前に形成されたｍＡｂの除去；３）脾臓摘出術；４）ＡＴＧ及び／又はｍＡｂを用いるＴ細胞涸渇；及び５）シクロスポリン（及びある種の動物では抗ＩｇＭｍＡｂ）を用いる手術後免疫抑制を含む。１０匹の動物が４日より長く生存し、最長で１３日間生存し、１１日目まで正常な腎臓機能を有した。この動物において、ブタの細胞は、移植後１０日目においてのみ末梢血液中に検出され、これは、一時的な異種キメリズムを示唆した。２匹のサルは、腎臓異種移植前に脾臓摘出とブタ肝臓灌流のみを受けた。これらの動物の一方において、移植後更なる免疫抑制は施与しなかったが、腎臓は、３日間機能し、その後急速に機能を喪失して、５日目までに完全に拒絶された。このサルの血清のフローサイトメトリーによる分析は、拒絶と相関する高力価のＩｇＭの再発を示した。第２の動物において、シクロスポリン１５ｍｇ／ｋｇ／日及び１５デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）６ｍｇ／ｋｇ／日を、移植後に静脈投与した。腎臓は、７日目まで機能し、その後衰弱して、８日目に除去された。病理学的検査は、パッチ状の間質の出血に加えて焦点の炎症性浸潤物を示した。この浸潤物は、約２０％のＴ細胞を含んだ（ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８に対するｍＡｂを用いる染色により測定）。ＩｇＭ天然抗体は、この動物における肝臓灌流中に効果的に除去され、著しいことには、それらはその後血清中に現れず、ＩｇＧレベルは、７日目に上昇し始め、腎臓機能不全の開始と相関した。これらの結果は、１）天然抗体（ＩｇＭ）応答が、ブタ肝臓による吸収及びＤＳＧによる手術後抑制を含む調製養生法の構成要素により効果的に排除されたこと；及び２）この調製養生法のＴ細胞抑制用の構成要素（即ち、照射、シクロスポリン及びＡＴＧ）は、これらの実験において、細胞性及び第二次（ＩｇＧ）応答を防ぐことを要求されることを示す。
【０２５３】
他の具体例
造血細胞移植例えばＢＭＴ前に導入した間質組織を、（１）胎児肝及び胸腺組織を細胞懸濁液として投与すること；（２）胎児肝又は胸腺間質組織の何れか一方のみを投与すること；（３）間質移植組織を他の被膜を有する十分血管化した部位内に置くこと；又は（４）成体胸腺又は胎児脾臓を間質組織源として使用することによって変えることが出来る。
【０２５４】
同種抗原又は同種移植片に対する寛容を誘導し又は受容を促進するためのここに記載した方法は、ドナーとレシピエント間で移植片拒絶に影響するＭＨＣ遺伝子座又は他の遺伝子座に如何なる程度のミスマッチがある場合にも使用することが出来る。好ましくは、少なくとも１つのＭＨＣ遺伝子座又は認識及び拒絶を媒介する少なくとも１つの他の遺伝子座例えばマイナー抗原遺伝子座にミスマッチがある。クラスＩ及びクラスIIＭＨＣ遺伝子座に関して、ドナー及びレシピエントは、クラスＩでマッチし且つクラスIIでミスマッチする；クラスＩでミスマッチし且つクラスIIでマッチする；クラスＩでミスマッチし且つクラスIIでミスマッチする；クラスＩでマッチし且つクラスIIでマッチすることがあり得る。これらの組合せの何れにおいても、認識及び拒絶を制御する他の遺伝子座例えばマイナー抗原遺伝子座は、マッチし又はミスマッチし得る。上述のように、少なくとも一遺伝子座においてミスマッチであることが好ましい。ＭＨＣクラスＩにおいてミスマッチとは、１つ以上のＭＨＣクラスＩ遺伝子座についてミスマッチであることを意味し、例えばヒトの場合には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ若しくはＨＬＡ−Ｃの１つ以上におけるミスマッチ、又はブタの場合には、１つ以上のＳＬＡクラスＩ遺伝子座例えばブタＡ若しくはＢ遺伝子座におけるミスマッチを意味する。ＭＨＣクラスIIにおいてミスマッチとは、１つ以上のＭＨＣクラスII遺伝子座においてミスマッチであることを意味し、例えばヒトの場合には、ＤＰα、ＤＰβ、ＤＱα、ＤＱβ、ＤＲα若しくはＤＲβの１つ以上においてミスマッチ、又はブタの場合には、１つ又はＳＬＡクラスII遺伝子座におけるミスマッチ例えばＤＱα若しくはβ又はＤＲα若しくはβにおけるミスマッチを意味する。
【０２５５】
同種抗原又は同種移植片に対する寛容を誘導するためのここに記載の方法は、ドナーとレシピエントの間に、混合リンパ球アッセイにおける如何なる程度の反応性がある場合（例えば、ドナーとレシピエントの間の混合リンパ球反応性がない場合、低い場合、中程度の場合又は高い場合）にも使用することが出来る。好適具体例において、混合リンパ球反応性を用いてクラスIIについてのミスマッチを規定し、この発明は、混合リンパ球アッセイにより規定した如何なる程度のミスマッチを有する個体間の同種移植をも実施する方法を含む。血清学的試験を用いてクラスＩ又はII遺伝子座におけるミスマッチを規定することが出来、この発明は、血清学的方法で測定してクラスＩ又はIIにおいて如何なる程度のミスマッチを有する個体間の同種移植をも実施する方法を含む。好適具体例において、この発明は、血清学的及び又は混合リンパ球反応性アッセイにより測定してクラスＩ及びクラスIIの両者においてミスマッチである個体間の同種移植を実施する方法を特徴とする。
【０２５６】
この発明の方法は、新生物疾患、特に通常の様式の治療例えば化学療法又は放射線療法に耐性の疾患で苦しめられている組織又は器官を置き換えるのに特に有用である。この発明の方法を用いて、移植片例えば同種移植片例えば１つ以上のクラスＩ遺伝子座、１つ以上のクラスII遺伝子座、又は１つ以上のクラスＩ及びクラスIIの各遺伝子座でミスマッチのドナーからの同種移植片に対する寛容を誘導することが出来る。好適具体例において、移植片は、消化管由来の組織例えば胃由来の組織又は腸組織（例えば小腸、大腸若しくは結腸）を含み；移植片は、レシピエントの消化系の一部、例えば消化管例えば胃、腸（例えば、小腸、大腸、結腸）の全部又は部分を置き換える。
【０２５７】
寛容とは、ここで用いる場合、抗原に対する完全な免疫学的寛容だけでなく、部分的な免疫学的寛容即ちこの発明の方法を用いなかったならば見られたであろうものより大きい程度の抗原に対するの寛容のことをもいう。
【０２５８】
ここで論ずる場合、混合キメリズムの発生を促進するために、移植片レシピエントを照射にさらすことは、しばしば、望ましい。本発明者は、照射線量を分割することにより、即ち照射を２回以上の曝露又は期間にて加えることにより、照射毒性を一層減じて混合キメリズムを誘導することが可能であることを発見した。従って、異種移植片又は同種移植片のレシピエント、例えば霊長類レシピエント例えばヒトレシピエントの照射を要するこの発明の任意の方法において、照射を、単一曝露において加えることが出来、又は、一層好ましくは、２回以上の曝露若しくは期間に分割することが出来る。分割した線量の合計は、好ましくは、単一曝露で与えた場合に混合キメリズムを生じ得る照射線量（例えば、ラド又はＧｙ）に等しい。これらの分割は、好ましくは、ほぼ等しい線量である。例えば、７００ラドの単一照射線量を、例えば３５０ラドの２フラクション又は１００ラドの７フラクションで置き換えることが出来る。照射線量の分割過多もこの発明の方法において用いることが出来る。これらの分割を同じ日に加え、又は１、２、３、４、５日若しくはそれより多い日数の間隔をおいて分割することが出来る。全身照射、胸腺照射、又はこれらの両方を分割することが出来る。
【０２５９】
本発明者は又、調製養生法の多く又はすべてを、寛容化幹細胞及び／又は移植片の移植の数日以内に、好ましくは７２、４８若しくは２４時間以内にレシピエント例えば同種移植片若しくは異種移植片レシピエントに加え又は施与することが出来ることをも発見した。これは、特に、死体からの移植片を受けるヒトの場合に有用である。従って、幹細胞及び／又は移植片の移植前の処理、例えば、宿主抗体を不活性化し若しくは涸渇させる処理、宿主Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞を不活性化する処理、又は照射を要するこの発明の任意の方法において、これらの処理を、幹細胞及び／又は移植片の移植の数日以内に、好ましくは７２、４８若しくは２４時間以内に施与することが出来る。特に、同種移植片の霊長類例えばヒトレシピエントに、宿主抗体を不活性化し又は涸渇させる処理、宿主Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞を不活性化する処理、又は照射の何れか若しくはすべてを、幹細胞及び／又は移植片の移植の数日以内、好ましくは７２、４８若しくは２４時間以内に与えることが出来る。例えば、レシピエントのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を涸渇させる処理、例えばＡＴＧの投与を−２、−１及び０日目に与えることが出来、ＷＢＩ、胸腺照射及び幹細胞（例えば、骨髄幹細胞）を０日目に施与することが出来る。（移植片例えば腎臓同種移植片を０日目に移植する）。
【０２６０】
この発明の方法は、レシピエントの脾臓摘出を含むことが出来る。
【０２６１】
ここで論ずるように、血液灌流例えばドナー器官を用いる血液灌流を用いて、宿主の天然抗体を涸渇させることが出来る。天然抗体を涸渇させるかさもなければ不活性化する他の方法は、ここに記載の任意の方法と共に用いることが出来る。例えば、天然抗体を涸渇させ又は不活性化する薬物例えばデオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）（Bristol ）又は抗ＩｇＭ抗体を同種移植片又は異種移植片のレシピエントに投与することが出来る。ＤＳＧ（又は類似の薬物）、抗ＩｇＭ抗体、及び血液灌流の１つ以上を用いて、この発明の方法において、レシピエントの天然抗体を涸渇させさもなければ不活性化することが出来る。濃度６ｍｇ／ｋｇ／日のＤＳＧの静脈投与は、ブタからカニクイザルへの腎臓移植において天然抗体を抑制するのに有用であることが見出された。
【０２６２】
ここに記載した方法の幾つかは、致死的照射を用いて造血空間を創り、それにより、同種、異種、同系、又は遺伝子操作した自己の幹細胞の投与に対するレシピエントの準備をする。ここに記載の方法、特に霊長類用又は臨床用の方法の何れにおいても、かかる細胞の投与のための造血空間を、非致死的方法、例えば準致死的照射線量、骨髄涸渇用薬物又は抗体を施与することによって創るのが好ましい。準致死的レベルの骨髄涸渇の利用は、レシピエントにおいて混合キメリズムの生成を与える。混合キメリズムは、一般に、レシピエント骨髄の全除去又は致死的除去及び、その後の投与された幹細胞でのレシピエントの完全再構成に好適である。
【０２６３】
胸腺Ｔ細胞の不活性化のための別法も又、この発明の具体例に含まれる。ここに記載の方法の幾つかは、宿主胸腺Ｔ細胞を不活性化するか、さもなければ、宿主の胸腺Ｔ細胞媒介のドナー抗原に対する応答を減らす胸腺照射の施与を含む。この発明の同種又は異種移植方法において必要とされる胸腺照射を、宿主の胸腺Ｔ細胞媒介の応答を（例えば、胸腺Ｔ細胞を涸渇させ及び／又はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ＣＤ４コレセプター若しくはＣＤ８コレセプターの１つ以上を下方調節することにより）減じる他の治療で補い、又は置き換えることが出来ることが見出されている。例えば、胸腺照射を、宿主の胸腺Ｔ細胞媒介の応答を減少させるのに十分な回数、十分な投与量で、十分な期間投与される抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗ＣＤ４及び／又は抗ＣＤ８モノクローナル抗体）で補い、又は置き換えることが出来る。
【０２６４】
最良の結果を得るためには、抗Ｔ細胞抗体を、反復投与すべきである。例えば、抗Ｔ細胞抗体を、ドナー骨髄移植前に１、２、３回又はそれより多数回投与することが出来る。典型的には、抗体の骨髄移植前投与を、骨髄移植の約５日前に患者に与える。更に、骨髄移植の６、７又は８日前の投与を与えることも出来る。最初に治療を施し、次いで、患者が血清中の過剰の抗体及び末梢Ｔ細胞の約９９％涸渇を示すまで予備骨髄投与を１〜５日毎に反復し、次いで、骨髄移植を行うのが望ましい。抗Ｔ細胞抗体を、ドナー骨髄移植後にも、１、２、３回又はそれより多数回投与することが出来る。典型的には、骨髄移植後治療を、骨髄移植後約２〜１４日に与える。骨髄後施与を、必要な回数だけ反復することが出来る。２回以上の施与を与える場合は、これらの施与を約１週間間隔にすることが出来る。もし患者が早期の又は望ましくないＴ細胞回復を受けるようならば、更なる投与を与えることが出来る。好ましくは、抗Ｔ細胞抗体を、ドナー骨髄移植前に、少なくとも１回（好ましくは、２、３回又はそれより多数回）投与し、ドナー骨髄移植後に、少なくとも１回（好ましくは、２、３回又はそれより多数回）投与する。
【０２６５】
下記の実験は、更なるＴ細胞涸渇用抗体が、骨髄を除去しない条件の養生法において胸腺照射に置き換って、同種骨髄の植付け及びドナー特異的な寛容の誘導を与え得ることを示す。
【０２６６】
マウスにおいて、同種骨髄植付け及びドナー特異的寛容の誘導を与える、低毒性の、骨髄除去しない条件の養生法が、以前に記載されている。涸渇投与量の抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体による−５日目の予備治療、０日目の３Ｇｙの全身照射及び７Ｇｙの胸腺照射の施与及びその後の完全にＭＨＣミスマッチのドナー骨髄細胞の投与を含む養生法は、永久的混合キメリズム及び皮膚移植片寛容の誘導を与える。このプロトコールにおける胸腺照射ステップは、更なる抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体治療で置き換えることが出来る。多系統キメリズムを、０日目に同種（Ｂ１０．Ａ、Ｈ−２^a ）骨髄移植を受けその後３Ｇｙの全身照射を胸腺照射を伴って又は伴わないで受け、及び骨髄移植前及び後の様々なスケジュールでモノクローナル抗体による治療を受けたＢ１０（Ｈ−２^b ）マウスにおいて比較した。胸腺照射を受けるか又は骨髄移植前のモノクローナル抗体治療を少なくとも２回受けた殆どの動物（５２匹中の５０匹）は、長期多系統末梢血液混合同種キメリズムを示した（フローサイトメトリー分析による）。対照的に、骨髄移植前のモノクローナル抗体治療を胸腺照射を伴わずに１回だけ受けた８匹の動物の内１匹だけが、継続する（２０週より長期）混合キメリズムを発生した。すべてのキメラ動物は、１００日より長期間にわたってドナー皮膚移植片を受容し、第三者のＢＡＬＢ／ｃ移植片を１４日以内に拒絶した。それ故、混合キメリズム及びドナー特異的皮膚移植片受容は、骨髄移植前モノクローナル抗体治療を少なくとも２回行なうならば、胸腺照射を用いることなく誘導することが出来る。（モノクローナル抗体治療は、約５日間隔で、最終治療は、骨髄移植の１日前であった。）しかしながら、ドナーＴ細胞再構成のレベルは、骨髄移植後に胸腺照射を受けるか又は更なる抗Ｔ細胞モノクローナル抗体治療を受けた動物において最高であった。２回の骨髄移植前モノクローナル抗体治療（モノクローナル抗体治療は、約５日間隔とし、最終治療は骨髄移植の１日前であった）を受け且つ胸腺照射を受けてない２０匹のマウスの内１１匹は、６週目において、比較的低レベルのドナーＴ細胞再構成（２０％未満のドナーで、８０％を超える宿主）を示し、これらの内の９匹は、２０週目までに、全系統中のドナー細胞の顕著な消失を示した。対照的に、１又は２回の骨髄移植後モノクローナル抗体治療（モノクローナル抗体治療は、約７日間隔とし、最初の治療は骨髄移植後７日目であった）を受けた同様に治療した１２匹のマウスの内１２匹は、６週目に、高レベルのドナーＴ細胞再構成（平均８６±１２％のドナー）を示し及び、２０週目に、全系統中で存続する高レベルのドナー再構成を示した。従って、骨髄移植前Ｔ細胞涸渇用モノクローナル抗体の第２投与は、胸腺照射に置き換わり且つ我々の養生法における寛容誘導を与えることが出来るが、骨髄移植の１〜２週後に投与する更なるモノクローナル抗体は、永続的な混合キメリズム及び寛容を確実に誘導する能力を増大させることが出来る。反復抗Ｔ細胞モノクローナル抗体治療がこの養生法における胸腺照射に置き換わる能力が、最初のモノクローナル抗体治療による涸渇を逃れた宿主胸腺細胞を涸渇させるそれらの能力を反映することは最もありそうである。これらのモノクローナル抗体は、殆どの宿主Ｔ細胞を涸渇させ、少数の残存細胞上のＴＣＲ並びにＣＤ４及びＣＤ８コレセプターの両者の下方調節を誘導する。これらの動物において、ドナー骨髄由来細胞の宿主胸腺への早期移動は、ドナー抗原を認識するＴＣＲを有する成熟宿主型胸腺細胞の完全なクローン涸渇と関連している。かかるＴＣＲを有する宿主Ｔ細胞の小集団がキメラ脾臓中に存続しても、これらの細胞は、それらのＴＣＲによる刺激に対してアネルギーである。これらの細胞は、モノクローナル抗体治療後にＣＤ４又はＣＤ８を下方調節することにより涸渇を逃れることが出来たのであろう。従って、この比較的非毒性の養生法は、存在するＴ細胞レパトアの殆どを除去し、胸腺内ドナー抗原の存在下で新たなＴ細胞を発生させ、及び末梢における少数の残存宿主Ｔ細胞間でアネルギーを誘導することによって多能性造血幹細胞植付け及び特異的寛容を達成する。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】ＧＳ４．５レトロウイルス構築物の図解である。
【図２】ＧＳ４．５プロウイルスゲノム及び予想される転写物の図解である。
【図３】３ａ及び３ｂは、形質導入細胞のフローサイトメトリープロフィルの表示である。
【図４】形質導入アッセイの図解である。
【図５】Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｂ１０．ＡＫＭ及びＢ１０．ＭＢＲ株の遺伝地図の図解である。
【図６】形質導入した骨髄のレシピエントからの脾臓細胞のＦＡＣＳプロフィルの図解である。
【図７】７ａ及び７ｂは、皮膚移植実験における生存対時間のグラフである。
【図８】８ａ〜ｄは、移植片拒絶者及び対照からの胸腺細胞のＦＡＣＳ分析の図解である。
【図９】Ｎ２−Ｂ１９−Ｈ２ｂベクターの図解である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシピエント霊長類に、ドナー霊長類からの同種移植片に対する寛容を誘発させる方法にして、
前記レシピエントに前記同種移植片を移植し、そして
該レシピエントに補助減縮治療の短期コースを施して前記同種移植片に対する寛容を誘発させることを含む方法。
【請求項２】
補助減縮治療の短期コースは、同種移植片がレシピエントに導入されるほぼ同じ時に概ね施される、請求項１の方法。
【請求項３】
レシピエントが、移植片拒絶に影響する第１の遺伝子座でミスマッチし、且つ移植片拒絶に影響する第２の遺伝子座でマッチし或はミスマッチに寛容である、請求項１の方法。
【請求項４】
補助減縮治療の短期コースの持続は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞が最初に抗原で刺激された後該抗原の拒絶を開始するのに必要とされる期間にほぼ等しいかそれより短い、請求項１の方法。
【請求項５】
補助減縮治療の短期コースは、レシピエントの成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出を刺激する処置を行わずに施される、請求項１の方法。
【請求項６】
補助減縮治療の短期コースがプレドニゾンの不存在で施される、請求項１の方法。
【請求項７】
補助減縮剤がシクロスポリンＡよりなる、請求項１の方法。
【請求項８】
第１の種のレシピエント哺乳動物に、第２の種の哺乳動物からの移植片に対する寛容を誘発させる方法にして、
前記第２の種のＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを前記レシピエント哺乳動物の造血幹細胞に挿入し、
前記ＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを前記レシピエントに発現させ、
前記移植片を該レシピエントに移植し、そして
該レシピエントに補助減縮治療の短期コースを施して前記移植片に対する寛容を誘発させることを含む方法。
【請求項９】
レシピエント霊長類に、同じ種のドナーから得られる移植片に対する寛容を誘発させる方法にして、
前記ドナーのＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを前記レシピエントの造血幹細胞に挿入し、
前記ＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを前記レシピエントに発現させ、
前記移植片を該レシピエントに移植し、そして
該レシピエントに補助減縮治療の短期コースを施して前記移植片に対する寛容を誘発させることを含む方法。
【請求項１０】
第１の種のレシピエント哺乳動物に、第２の種の哺乳動物から得られる移植片に対する寛容を誘発させる方法にして、
前記レシピエント哺乳動物に第２の種の造血幹細胞を導入し、
前記移植片を前記レシピエントに移植し、そして
該レシピエントに補助減縮治療の短期コースを施して前記移植片に対する寛容を誘発させることを含む方法。
【請求項１１】
レシピエント哺乳動物に、同じ種のドナー哺乳動物から得られる移植片に対する寛容を誘発させる方法にして、
前記レシピエント哺乳動物に前記ドナーの造血幹細胞を導入し、
前記移植片を前記レシピエントに移植し、そして
該レシピエントに補助減縮治療の短期コースを施して前記移植片に対する寛容を誘発させることを含む方法。
【請求項１２】
ドナー哺乳動物から移植片を受けるレシピエント哺乳動物の胸腺ないしリンパ節Ｔ細胞の活性を減少または抑制する方法にして、
前記移植片に対する寛容を誘発させ、
前記レシピエントに、胸腺ないしリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な短期コースの免疫抑制剤を施し、そして
前記移植片を前記レシピエンスに移植することを含む方法。
【請求項１３】
短期コースの免疫抑制剤の持続がほぼ３０日に等しい、請求項１２の方法。
【請求項１４】
短期コースは、寛容を誘発させる治療が始まる前か或はほぼ同じ時に開始される、請求項１２の方法。
【請求項１５】
第１の種のレシピエント哺乳動物で、第２の種のドナー哺乳動物からの移植片の受容を促進させる方法にして、
前記第２の種のＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを前記レシピエント哺乳動物の造血幹細胞に挿入し、
前記ＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを前記レシピエントに発現させ、
前記移植片を前記レシピエントに移植し、そして
該レシピエントに、その胸腺ないしリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な免疫抑制剤の短期コースを施すことを含む方法。
【請求項１６】
レシピエント哺乳動物で、同じ種のドナーから得られる移植片の受容を促進させる方法にして、
前記ドナーのＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを前記レシピエントの造血幹細胞に挿入し、
前記ＭＨＣ抗原をコードするＤＮＡを前記レシピエントに発現させ、そして
該レシピエントに、その胸腺ないしリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な免疫抑制剤の短期コースを施すことを含む方法。
【請求項１７】
第１の種のレシピエント哺乳動物で、第２の種の哺乳動物から得られる移植片の受容を促進させる方法にして、
前記レシピエンス哺乳動物に第２の種の造血幹細胞を導入し、そして
該レシピエントに、その胸腺ないしリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な免疫抑制剤の短期コースを施すことを含む方法。
【請求項１８】
レシピエント哺乳動物で、同じ種のドナーから得られる移植片の受容を促進させる方法にして、
前記レシピエントに前記ドナーの造血幹細胞を導入し、そして
該レシピエントに、その胸腺ないしリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分な免疫抑制剤の短期コースを施すことを含む方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【公開番号】特開２００６−３１２６４７（Ｐ２００６−３１２６４７Ａ）
【公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２１２５０８（Ｐ２００６−２１２５０８）
【出願日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【分割の表示】特願平６−５２５７９４の分割
【原出願日】平成６年５月１６日（１９９４．５．１６）
【出願人】（３０００５２４５３）ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション (24)
【Ｆターム（参考）】