哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法
【課題】化学物質の発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法等を提供すること。
【解決手段】哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）検体における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法等。
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
【解決手段】哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）検体における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法等。
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌が遺伝子の関わる異常を原因とする疾病であることが次第に明らかになりつつあるが、癌に対する羅漢率、死亡率は未だ高い。このような状況において、様々な化学物質の発癌性の有無を事前に確認しておくための安全性試験は極めて重要である。従来、化学物質の発癌性を検定する代表的な方法としては、種々の哺乳動物（例えばラット）を用いた安全性試験において、種々の診断基準に代表される病変の組織学的特徴を指標とした病理組織標本の診断により、発癌性の有無を評価する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Williams, G.M., Safety assessment of pharmaceuticals: examples of inadequate assessments and a mechanistic approach to assuring adequate assessment. Toxicological Pathology, 1997, vol.25(1), page 32-38.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、哺乳動物を用いた安全性試験において、例えば、化学物質の発癌標的となる割合の最も高い器官 若しくは組織の一つである肝臓の場合には、腫瘍性病変になる前段階である前腫瘍性病変にあって、肝細胞腺腫になる直前の病変（以下、境界病変と記すこともある）は良性肝細胞腺腫の組織学的特徴に類似した組織変化を呈してくるため、境界病変の診断は従来法のみでは場合によっては必ずしも十分に満足のゆくものではなかった。
そこで、化学物質の発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意検討した結果、哺乳動物における肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞において、特定の遺伝子の発現レベルが隣接する正常組織での肝細胞における当該遺伝子の発現レベルに比べ２倍以上に増加していることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）検体における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）
＜登録番号群１＞
AA892298（例えば、配列番号１参照）、A892680（例えば、配列番号２参照）、NM_175707（例えば、配列番号３参照）、BC087645（例えば、配列番号４参照）、AF315802（例えば、配列番号５参照）
２．検体が、肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．第二工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であることを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する工程であることを特徴とする前項１，２、３又は４記載の方法；
６．物質の肝発癌活性の検定方法であって、
（１）肝細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた前記肝細胞における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明肝発癌活性検定方法と記すこともある。）
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
７．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量の測定によりなされることを特徴とする前項６記載の方法；
８．遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする前項６又は７記載の方法；
９．第三工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であることを指標とし、前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価することを特徴とする前項８記載の方法；
１０．前項６〜９のいずれかに記載される方法により評価された肝発癌活性の有無又はその量に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする肝発癌物質の探索方法
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によって、遺伝子の発現レベルの異常を指標とした哺乳動物の肝臓腫瘍性病変の検定方法等が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において検体とは、例えば、肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料をあげることができ、具体的には、例えば、被験動物から採取された肝臓組織等の組織或いはこれら組織から分離された細胞又はその培養細胞等をあげることができる。これらの試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された試料を検体として用いてもよい。
本発明において発現レベルが測定される遺伝子は、上記の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログ（以下、一括して本遺伝子と記すこともある。）から選ばれる１以上の遺伝子である。Genbankに登録されている塩基配列に関する情報は、例えば、National Center for Biotechnology Information のWEBページ（URL；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から、Genbankによって各遺伝子に付与されている上記の登録番号 (Accession No.)をもとに検索を行うことによって入手することができる。因みに、GenBnak、DDBL及びEMBLの各データバンクが公開しているデータ全てを誰でも制限なしで利用でき、INSDに登録されたデータは科学資料として永久に保存され公開されることは、上記３データバンクで構成される国際塩基配列データベース（international Nucleotide Sequence Databases, INSD）の諮問機関である国際諮問委員会により作成された「DDBL/EMBL/GenBnakの登録データの取り扱い」（2002年5月23-24日）で明文化されており、如何なる当業者であっても登録番号 (Accession No.)に基づきデータの照合、検索、入手等は可能である。
本発明において利用される本遺伝子には、上記の公知の塩基配列と全く同一の塩基配列を有する遺伝子のほか、前記の遺伝子の塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
因みに、本発明において利用される本遺伝子のうち、NM_175707（配列番号３）でGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 99(26), 16899-16903 (2002)等に記載されており、当該遺伝子の塩基配列に基づき翻訳されたアミノ酸配列（一文字表記として）は、MSVTLHTDVGDIKIEVFCERTPKTCENFLALCASNYYNGCVFHRNIKGFMVQTGDPTGTGRGGSSIWGKKFEDEYSEYLKHNVRGVVSMANNGPNTNGSQFFITYGKQPHLDMKYTVFGKVIDGLETLDELEKLPVNEKTYRPLNDVHIKDITIHANPFAQ [peptidylprolyl isomerase (cyclophilin)-like 3]であることが知られている。
【０００８】
本遺伝子の発現レベルの測定は、例えば、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができる。
本遺伝子の転写物量を測定するには、例えば、当該遺伝子の転写物であるmRNA量を測定する。特定の遺伝子のmRNA量の測定は、具体的には、例えば、定量的リアルタイム−ポリメラーゼチェイン反応（以下、定量的RT-PCRと記す。）、ノーザンハイブリダイゼーション法［J.Sambrook, E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年］、DNAアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等により実施することができる。
また、本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、例えば、本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質の量を測定する。特定の蛋白質の量の測定は、具体的には、例えば、当該蛋白質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、免疫組織化学的検査等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー等により実施することができる。本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質を免疫抗原として調製することができる。
【０００９】
本遺伝子の転写物量の測定方法についてさらに説明する。
本遺伝子の転写物であるmRNA量は、例えば、本遺伝子の塩基配列に基づいて設計、調製されたプローブ又はプライマーを使用して、通常の遺伝子工学的方法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、定量的RT-PCR、DNAアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等を用いることによって測定することができる。具体的には、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著；モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載された方法に準じて行うことができる。この際、組織における発現レベルが恒常的に一定であることが知られている遺伝子（以下、対照遺伝子と記す。）、例えば、β-actin遺伝子（Nucl.Acids.Res., vol.12,No.3, p.1687,1984）や36B4（Acidic Ribosomal Phosphoprotein）（Nucl.Acids.Res., vol.19,No.14, p.3998,1991）遺伝子等のmRNA量を同時に測定しても良い。そして、対照遺伝子のmRNA量若しくはその指標値あたりの本遺伝子のmRNA量又はその指標値を算出することにより、本遺伝子の発現レベルを求めてもよい。
【００１０】
（１．ノーザンハイブリダイゼーション法）
まず、mRNA量を測定しようとする遺伝子のDNAを調製し、次いで、その全部又は一部からなるDNAを標識してプローブを調製する。
上記遺伝子は、市販のcDNA（例えば宝酒造から入手）又は以下に示した方法により調製したcDNAを鋳型にしてPCR等によって調製することができる。例えば、まず当該遺伝子を発現する組織から、塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の通常の方法によって全RNAを抽出する。例えばISOGEN（ニッポンジーン製）等の市販のキットを利用して全RNAを抽出してもよい。
抽出された全RNAから、例えば、以下のようにしてmRNAを調製する。まず、オリゴdTをリガンドとして有するポリAカラムを5倍カラム容量以上のLoading buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］を用いて、平衡化し、続いて前述の方法で調製された全RNAをカラムにかけ、10倍カラム容量のloading bufferで洗浄する。さらに5倍カラム容量のWashing buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］で洗浄する。続いて、3倍カラム容量のelution buffer［10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、1mM EDTA、0.05％(w/v)SDS）でmRNAを溶出させることによってmRNAを得る。
次いで、オリゴdTプライマーを前記全RNA或いはmRNAのポリＡ鎖にアニールさせ、例えばcDNA合成キット（宝酒造）のプロトコールに従って、一本鎖cDNAを合成する。この時、鋳型とするRNAは、全RNA或いはmRNAのどちらでも良いが、mRNAを用いる方がより好ましい。
前記一本鎖cDNAを鋳型にして、TaKaRa taq（宝酒造）等のDNA polymeraseを用いてPCRすることにより、DNAを増幅する。PCRの条件は、測定対象とする動物の種類、使用するプライマーの配列等により異なるが、例えば、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、2.5mM NTP存在下で、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件等を挙げることができる。
【００１１】
このようにして増幅された本遺伝子のDNAはpUC118等のベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。当該DNAの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M&W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.,74,560,1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F.&A.R.Coulson,J.Mol.Biol.,94,441,1975 、Sanger,F,& Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.,74,5463,1977等に記載される）等により確認することができる。
【００１２】
このようにして調製された本遺伝子のDNAの全部又はその一部を、次のようにして放射性同位元素や蛍光色素等で標識することによりプローブを調製することができる。例えば、上記のようにして調製されたDNAを鋳型とし、当該DNAの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、[α-32P]dCTP或いは[α-32P]dATPを含むdNTPを反応液に添加してPCRを行うことにより32Pで標識されたプローブが得られる。また、上記のようにして調製されたDNAを、例えば、Random prime labeling Kit（ベーリンガーマンハイム社）、MEGALABEL（宝酒造）等の市販の標識キットを用いて標識してもよい。
【００１３】
次に、上記プローブを使用して、ノーザンハイブリダイゼーション分析を行う。具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から全RNA又はmRNAを調製する。調製された全RNA 20μg或いはｍRNA 2μgをアガロースゲルで分離し、10×SSC（1.5Ｍ NaCl、0.35Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄した後、ナイロンメンブラン［例えば、Hybond-N（アマシャム製）等］に移す。ポリエチレン袋にメンブランを入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC（0.9Ｍ NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコール400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％BSA］、0.1％(w/v)SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを捨て、新たに2ml〜6mlのハイブリダイゼーションバッファーを加える。更に上記方法で得られたプローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベーリンガーマンハイム社)等を用いることができる。メンブランを取り出して、50〜100mlの2×SSC、0.1％ SDS中で室温、15分間インキュベートし、さらに同じ操作を１回繰り返し行い、最後に50〜100mlの0.1×SSC、0.1％ SDS中で68℃、30分間インキュベートする。メンブラン上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写産物であるmRNAの量を測定することができる。
【００１４】
（２．定量的RT-PCR）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに例えばMMLV（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、10mM DTT］中、0.5mM dNTP及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜1時間反応させ、対応するcDNAを調製する。cDNA合成キット（宝酒造）を用いて対応するcDNAを調製しても良い。調製されたcDNAを鋳型にして、本遺伝子の塩基配列の一部分を有するDNAをプライマーとしてPCRを行う。プライマーとしては、例えば、本遺伝子の部分塩基配列を有するプライマーをあげることができる。PCRの条件としては、例えば、例えば、TAKARA taq（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、2.5mM dNTP及び［α32P］-dCTP存在下で、例えば、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件をあげることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたDNAの放射活性量を測定することにより、本遺伝子のmRNAの量を測定することができる。或いはまた、例えば、TAKARA taq（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、SYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃，2分間次いで95℃，10分間の保温の後、95℃，15秒間次いで60℃，１分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの蛍光を測定することにより、本遺伝子のmRNAの量を測定することができる。
【００１５】
（３．DNAアレイ解析）
本発明の転写物量の測定には、ナイロンメンブラン等のメンブランフィルター等に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されるマクロアレイ、スライドガラス等に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されるマイクロアレイ、スライドガラス上に本遺伝子の塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチド（通常18〜25merの鎖長）を光化学反応を利用して固定して作製されるプローブアレイ等、公知の技術に基づいたDNAアレイを利用することができる。これらのアレイの作製は、例えばゲノム機能研究プロトコール 実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて行うことができる。またAffymetrix社等から市販されているGenechip等を利用することもできる。
【００１６】
以下、DNAアレイを用いて本遺伝子の転写物量を測定する方法の一例を示す。
（３−１．マクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えばMMLV（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、及び10mM DTTを含む液］中、0.5mMdNTP、［α32P］-dCTP、及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜１時間反応させて、標識DNAを調製し、これをプローブとする。このとき、cDNA合成キット（宝酒造）等を用いても良い。メンブランフィルターに本遺伝子のcDNAをスポットして作製されたマクロアレイをポリエチレン袋に入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC（0.9Ｍ NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコール400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％ BSA］、0.1％(w/v) SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新たに2ml〜6mlのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。更に上記プローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベーリンガーマンハイム社)等を用いることもできる。マクロアレイを取り出して、50ml〜100mlの2×SSC、0.1％ SDSに浸し室温にて15分間程度インキュベートした後、さらに同じ操作を1回繰り返し行い、最後に50ml〜100mlの0.1×SSC、0.1％ SDS中で68℃、30分間インキュベートする。マクロアレイ上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１７】
（３−２．マイクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えばMMLV（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、及び10mM DTTを含む液］中、0.5mM dNTP、Cy3-dUTP、（又はCy5-dUTP）及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜１時間反応させる。アルカリバッファー（例えば、１N NaOH、20mM EDTAを含む液）を加え、65℃10分間保温した後、MicroconYM-30等を用いて遊離のCy3又はCy5を除くことにより蛍光標識DNAを調製し、これをプローブとする。得られたプローブを用いてマイクロアレイに対して（３−１ DNAマクロアレイによる定量）に記載された方法と同様にしてハイブリダイゼーションを行う。アレイ上のシグナル量をスキャナーにより測定することによって、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１８】
（３−３．プローブアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えば、cDNA合成キット（GENSET社）等を用いてcDNAを調製する。調製されたcDNAを、例えば、ビオチンラベル化cRNA合成キット（In Vitro Transcription社）（Enzo社）等によりビオチン標識し、cRNA cleanup and quantitation キット（In Vitro Transcription社）により精製する。生成されたビオチン標識DNAをFragmentation バッファー（200mMトリス酢酸（pH8.1）、500mM KOAc、150mM MgOAc）により断片化する。これに内部標準物質Contol Oligo B2 （Amersham社製）、100×Control cRNA Cocktail、Herring sperm DNA （Promega社製）、Acetylated BSA（Gibco-BRL社製）、2×MES Hybridization Buffer〔200mM MES、2M [Na+], 40mM EDTA、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7〕及びDEPC処理滅菌蒸留水を加え、ハイブリカクテルを作製する。
1×MESハイブリダイゼーションバッファーで満たしたプローブアレイ［例えば、Genechip（Affymetrix社製）等］を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpm、10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーションバッファーを除去する。その後、該プローブアレイに上記のハイブリカクテル200μlを添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60rpm、16時間回転させる（ハイブリダイゼーション）。続いてハイブリカクテルを除去し、Non-Stringent Wash Buffer〔6×SSPE［20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈］、0.01％ Tween20、及び0.005％ Antifoam0-30(Sigma社)を含む〕で満たした後、GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置に上記プローブアレイを装着し、プロトコールに従って洗浄する。次いで、MicroArray Suite(Affymetrix社)の染色プロトコールEuKGE-WS2に従って該プローブアレイを染色する。HP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)により570nmの蛍光輝度を測定することにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１９】
（４．インサイチューハイブリダイゼーション法）
基本的には１）組織の固定、包埋、及び切片の作製、２）プローブの調製、３）ハイブリダイゼーションによる検出からなり、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡ又はＤＮＡをプローブとすること以外は、例えば、Heiles,H.et al., Biotechniques,6,978,1988、遺伝子工学ハンドブック 羊土社 278 1991、細胞工学ハンドブック,羊土社,214,1992、細胞工学ハンドブック,羊土社,222,1992等に記載される方法に準じて行うことができる。
RNAプローブを調製する場合には、まず、例えば前記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載した方法と同様にして本遺伝子のDNAを取得し、当該DNAをSP6、T7、T3RNAポリメラーゼプロモーターをもったベクター（例えばStratagene社のBluescript、Promega社のpGEM等）に組み込んで大腸菌に導入し、プラスミドDNAを調製する。次いで、センス（ネガティブコントロール用）、アンチセンス（ハイブリダイゼーション用）RNAができるようにプラスミドDNAを制限酵素で切断する。これらDNAを鋳型とし、放射性標識の場合はα-35S-UTP等、非放射性標識の場合はディゴキシゲニンUTP或いはフルオレセイン修飾UTP等を基質として、SP6、T7、T3RNAポリメラーゼを用いてRNAを合成しながら標識し、アルカリ加水分解によりハイブリダイゼーションに適したサイズに切断することによって、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたRNAを調製する。なお、これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはRNAラベリングキット（アマシャム社）が、非放射性標識用にはDIG RNAラベリングキット（ベーリンガー・マンハイム社）やRNAカラーキット（アマシャム社）が市販されている。
また、DNAプローブを調製する場合には、例えば、32Ｐ等で標識した放射性ヌクレオチド又はビオチン、ディゴキシゲニン若しくはフルオレセインで標識したヌクレオチドを、ニックトランスレーション法(J.Mol.Biol.,113,237,Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,10,6-10,12,Cold Spring Harbor Lab.)又はランダムプライム法(Anal.Biochem., 132,6,Anal.Biochem.,137,266)によって取り込ませることによって、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたDNAを調製する。これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはニックトランスレーションキット（アマシャム社）やRandom Prime Labeling Kit（ベーリンガーマンハイム社）が、非放射性標識用にはDIG DNA標識キット（ベーリンガーマンハイム社）、DNAカラーキット（アマシャム社）等が市販されている。
具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞をパラホルムアルデヒド等で固定し、パラフィン等に包埋した後、薄切切片を作製しスライドグラスに張り付ける。又は、上記の組織又は細胞をOCTコンパウンドに包埋後、液体窒素又は液体窒素で冷却したイソペンタン中にて凍結させ、その薄切切片を作製し、スライドグラスに張り付ける。このようにしてスライド標本を得る。
次に、上記の組織又は細胞中にあって使用されるプローブと非特異的に反応する物質を除去するために、上記のようにして作製されたスライドグラス切片をプロテイナーゼＫ処理し、アセチル化する。次いで、該スライドグラス切片と上記のようにして調製されたプローブとのハイブリダイゼーションを行う。例えば、上記のプローブを90℃で3分間加熱した後ハイブリダイゼーション溶液で希釈し、該溶液を前処理の終了したスライドグラス切片上に滴下してフィルムでおおい、モイスチャーチャンバー中で45℃、16時間保温することにより、ハイブリッドを形成させる。ハイブリダイゼーションの後、非特異的吸着或いは未反応プローブを洗浄等（RNAプローブを用いた場合はRNase処理も加える）により除去する。転写物量は、例えば、スライドグラス切片上の標識量を測定すること等により、本遺伝子の転写物であるmRNAの量又はそれに相当する値を測定することができる。
【００２０】
本発明検出方法においては、本遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の検体における発現レベルを、上述のようにして測定する。発現レベルを測定する遺伝子を複数選ぶ場合には、登録番号群１に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログを複数選んでもよい。
【００２１】
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量又は翻訳産物量を測定する方法を好ましくあげることができる。
【００２２】
上記のようにして得られた前記検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を、当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する。
【００２３】
本遺伝子の発現レベルの対照値としては、例えば、正常組織での細胞における当該遺伝子の発現レベルの値をあげることができる。ここで、正常組織とは、例えば、病理組織学的検査において異常の認められない組織を意味し、特に、発現レベルについて転写物量の測定をする方法としてインサイチューハイブリダイゼーション法や、翻訳産物量の測定をする方法として免疫組織化学的検査方法等を用いる場合には、被験物質と接触した肝臓組織であっても転写物量又は翻訳産物量のシグナルが肝臓腫瘍性病変組織の２倍以上を示す。
かかる対照値は、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルを、検体における当該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。
例えば、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルの値を対照値として、検体における、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であれば、検体中に肝臓腫瘍性病変を有すると評価することができる。
【００２４】
本発明肝発癌活性検定方法においては、まず、肝細胞と被験物質とを接触させる。用いられる肝細胞としては、哺乳動物から採取された肝臓組織内に存在している状態にある肝細胞、或いは、当該組織から分離された細胞又はその培養細胞等があげられる。
【００２５】
本発明肝発癌活性検定方法において、肝細胞と被験物質との接触は、例えば、哺乳動物に被験物質を投与することにより行ってもよい。哺乳動物は、天然の動物のほか、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物等であってもよい。哺乳動物への被験物質の投与方法としては、例えば、経口（強制又は飲料水や餌に混じ）、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、経気道等により行うことができる。投与量、投与回数及び投与期間は、例えば、全身状態、全身諸器官組織等に重篤な影響を及ぼさない範囲内（例えば投与量は、最大耐量）とすればよい。
【００２６】
次に、上記のようにして被験物質と接触させた肝細胞における、本遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを、上述のようにして測定する。発現レベルを測定する遺伝子を複数選ぶ場合には、同一の登録番号群に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログを複数選んでもよい。
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量を測定する方法を好ましくあげることができる。
【００２７】
上記のようにして被験物質と接触させた又は肝細胞から得られた本遺伝子の発現レベルの測定値を、当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する。
本遺伝子の発現レベルの対照値としては、例えば、前記被験物質と接触させていない肝細胞における発現レベルの値をあげることができる。肝細胞は、正常組織での肝細胞における当該遺伝子の発現レベルの値を好ましくあげることができる。ここで正常組織とは、例えば、被験物質と接触していない肝臓組織で病理組織学的検査において異常の認められない組織を意味し、特に、発現レベルを転写物量で測定する方法としてインサイチューハイブリダイゼーション法、又は翻訳産物量で測定する方法として免疫組織化学的検査方法を用いる場合には、被験物質と接触した肝臓組織であっても転写物量又は翻訳産物量のシグナルが肝臓腫瘍性病変組織の２倍以上を示す。
かかる対照値は、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルを、被験物質と接触させた肝臓組織での細胞における当該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。例えば、被験物質と接触させる前の肝臓組織の一部を採取して本遺伝子の発現レベルを測定し、得られた値を対照値とすることもできる。
例えば、被験物質と接触させた肝細胞における本遺伝子の発現レベルの測定値が、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルの値の２倍以上であれば、前記被験物質との接触による肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞の発生を意味し、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価することができる。
【００２８】
さらに、上記のような本発明肝発癌活性検定方法は、肝発癌活性を有する物質の探索等に利用することができる。具体的には、本発明肝発癌活性検定方法により評価された肝発癌活性の有無に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜することによって、肝発癌活性物質を探索することができる。選抜された肝発癌活性物質は、例えば、肝癌モデル哺乳動物の作製等に利用することもできる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施例１ （本遺伝子の発現レベルの測定）
（１）total RNAの調製
ラット肝臓腫瘍性病変組織及び正常組織それぞれ湿重1gに対して10mlのTRIZOL Reagent(Gibco-BRL社製)を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズし、５分間室温で放置する。次いで、4℃、9,000rpm、10分間遠心分離した後、水層を50ml遠心チューブ（IWAKI社製）に回収する。TRIZOL Reagentの1/5容量のクロロホルム（関東化学社製）を添加し、15秒間上下に激しく撹拌した後、5分間室温で放置する。次いで、4℃、9,000rpm、10分間遠心分離した後、水層を新しい50ml遠心チューブに回収する。更に、TRIZOL Reagentの1/2容量の2-プロパノール（関東化学社製）を添加して、転倒混和した後、室温で10分間静置する。4℃、9,000rpm、10分間遠心分離した後、上清を除去しペレットを得る。得られたペレットを、TRIZOL Reagentの1/10容量のDEPC処理滅菌蒸留水（和光純薬工業社製）で溶解する。得られるRNA溶液0.1mlにRNeasy Mini Kit(QIAGEN社製)添付のRLT buffer (10μL β-メルカプトエタノール/mL RLT buffer)350μlを添加し、混和する。更に、250μl エタノール(関東化学社製)を添加し、混和する。当該混和液をRNeasy Mini Kit添付のRNeasy Spin Columnにアプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を再度同じRNeasy Spin Columnにアプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで4倍希釈したRNeasy Mini Kit添付のRPE bufferを500μlプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで希釈したRPE bufferを500μlアプライし、室温、14,000rpm、2分間遠心分離する。その後、カラムを新しいエッペンドルフチューブに移してRNeasy Mini Kit添付の蒸留水を50μl添加し、1分間室温で静置する。静置後、室温、10,000rpm、1分間遠心分離によって溶出し、total RNAを得る。正常組織についても、上記と同様の操作を行い、total RNAを調製する。
【００３１】
（２）cDNAの調製
上記（１）で肝臓腫瘍性病変組織から調製したtotal RNA及び正常組織から調製したtotal RNA それぞれ10μg、T7-(dT)24プライマー(Amersham社製) 100pmolを含む11μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却する。冷却後、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 2μl、及び当該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μlを添加し、42℃、2分間加熱する。更に、当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μl(400U)を添加し、42℃、1時間加熱した後、氷上で冷却する。冷却後、DEPC処理滅菌蒸留水91μl、当該キットに含まれる5×Second Strand Reaction Buffer 30μl、10mM dNTP Mix 3μl、当該キットに含まれるE. coli DNA Ligase 1μl(10U)、当該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μl(40U)、及び当該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μl(2U)を添加し、16℃、2時間反応させる。次いで、当該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μl(10U)を加え、16℃、5分間反応させた後、0.5M EDTA 10μlを添加する。次いで、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μlを添加し、混合する。当該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、室温、14,000rpm、2分間遠心分離した後、145μlの水層をエッペンドルフチューブに移す。これに、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μl、エタノール362.5μlを加え混合した後、4℃、14,000rpm、20分間遠心分離する。遠心分離後、上清を捨て、DNAペレットを得る。その後、DNAペレットに80%エタノール0.5mlを添加し、4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨てる。DNAペレットに再度80%エタノール0.5mlを添加し、4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、次いで当該ペレットを乾燥させ、これをDEPC処理滅菌蒸留水12μlに溶解することにより、cDNA溶液を得る。一方、正常組織から調製した total RNAについても、上記と同様の操作を行うことによりcDNA溶液を調製する。
【００３２】
（３）ラベル化cRNAの調製
肝臓腫瘍性病変組織由来のcDNA及び正常組織由来のcDNAそれぞれを用いて、それぞれラベル化cRNAを調製する。即ち、上記（２）で得られたcDNA溶液5μl、DEPC処理滅菌蒸留水17μl、BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit(ENZO社製)に含まれる10×HY Reaction Buffer 4μl、当該キットに含まれる10×Biotin Labeled Ribonucleotides 4μl、当該キットに含まれる10×DTT 4μl、当該キットに含まれる10×RNase Inhibitor Mix 4μl及び当該キットに含まれる20×T7 RNA Polymerase 2μlを混合し、37℃、5時間反応させる。当該反応液にDEPC処理滅菌蒸留水60μlを加えたのち、上記（１）に記載された RNeasy Mini Kitを用いてラベル化cRNAの精製を行う。
【００３３】
（４）ラベル化cRNAのフラグメント化
精製されたラベル化cRNA 20μg、5×Fragmentation Buffer（200mMトリス−酢酸 pH8.1(Sigma社製)、 500mM酢酸カリウム(Sigma社製)及び150mM酢酸マグネシウム(Sigma社製)）8μlを含む反応液40μlを、94℃、35分間加熱した後、氷冷し、フラグメント化cRNA溶液を得る。
【００３４】
（５）フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ
肝臓腫瘍性病変組織由来のフラグメント化cRNA及び正常組織由来のフラグメント化cRNAそれぞれを、以下のようにしてそれぞれプローブアレイとハイブリダイズさせる。即ち、上記（４）で得られたフラグメント化cRNA溶液 40μl、5nM Contol Oligo B2 （Amersham社製）4μl、100×Control cRNA Cocktail 4μl、Herring sperm DNA （Promega社製）40μg、Acetylated BSA（Gibco-BRL社製）200μg、2×MES Hybridization Buffer(200mM MES、2M [Na+], 40mM EDTA、0.02％ Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7) 200μl及びDEPC処理滅菌蒸留水144μlを混合し、400μlのハイブリカクテルを得る。得られたハイブリカクテルを99℃、5分間加熱し、更に45℃、5分間加熱する。加熱後、室温、14,000rpm、5分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得る。
1×MESハイブリダイゼーションバッファーで満たしたラットゲノムU34プローブアレイ（Affymetrix社製）を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpm、10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーションバッファーを除去する。その後、当該プローブアレイに該ハイブリカクテル上清200μlを添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60rpm、16時間回転させ、ハイブリダイズ済みプローブアレイを得る。
【００３５】
（６）プローブアレイの染色
上記（５）で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイからハイブリカクテルを除去し、Non-Stringent Wash Buffer［6×SSPE(20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈)、0.01％ Tween20を含む］で満たす。GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置に前記プローブアレイを装着し、プロトコールに従って前記プローブアレイを洗浄した後、MicroArray Suite(Affymetrix社)の染色プロトコールEuKGE-WS2に従って以下の方法により前記プローブアレイを染色する。まず１次染色液［10μg/ml Streptavidin Phycoerythrin (SAPE)(Molecular Probe社製)、2mg/ml Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl(Ambion社製)、0.05％Tween20を含む］に45分間浸漬する。次いで、2次染色液［100μg/ml Goat IgG (Sigma社製)、3μg/ml Biotinylated Anti-Streptavidinantibody (Vector Laboratories社製)、2mg/ml Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl、0.05％ Tween20、及び0.005％ Antifoam0-30を含む］に10分間浸漬し、最後に１次染色液に45分間浸漬する。
【００３６】
（７）プローブアレイのスキャン、解析
上記（６）で染色した肝臓腫瘍性病変組織由来のプローブアレイ及び正常組織由来のプローブアレイそれぞれを、HP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、シグナルを570nmの蛍光輝度を測定することによって読み取る。得られた結果をGeneChip Microarray Suite(Affymetrix社製)によって比較解析し、正常組織と肝臓腫瘍性病変組織間で発現レベルが異なる遺伝子を抽出した。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子は、上記の肝臓腫瘍性病変組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルが、正常組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルの２倍以上であった。
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
【００３７】
実施例２ （プローブアレイを用いた肝臓腫瘍性病変組織の検定）
無処置ラットの病理組織学的に正常な肝臓試料を含む、異なる２つ以上の肝臓試料から実施例１（１）と同様の操作によってtotal RNAを調製した後、実施例１（２）〜（４）と同様の操作によって無処置ラットの正常肝臓試料由来のフラグメント化cRNA及び被験肝臓試料由来のフラグメント化cRNAを調製する。次に、実施例１（５）と同様の操作によって無処置ラットの正常肝臓試料由来のフラグメント化cRNA及び被験肝臓試料由来のフラグメント化cRNAを、本遺伝子の塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが固定されたプローブアレイにハイブリダイズした後、染色する。得られた染色済みのプローブアレイをHP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、シグナルを570nmの蛍光輝度を測定することによって読み取り、得られた結果をGeneChip Microarray Suite (Affymetrix社製)によって比較解析する。登録番号群１に示された登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルを無処置ラットの正常肝臓試料と比較し、その差異に基づいて被験肝臓試料における肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞を検出する。即ち、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの被験肝臓試料における発現レベルの測定値が、無処置ラット正常肝臓試料における当該遺伝子の発現レベルの２倍以上であれば、前記被験生検試料中に肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞が存在すると評価する。
【００３８】
実施例３ （定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた肝臓腫瘍性病変の検定）
無処置ラットの病理組織学的に正常な肝臓試料を含む、異なる２つ以上の肝臓試料から実施例１（１）と同様の操作によってtotal RNAを調製した後、実施例１（２）と同様の操作によって無処置ラット正常肝臓試料由来のcDNA及び被験肝臓試料由来のcDNAを調製する。次に、調製されたcDNAを鋳型として、以下のようにしてPCRを行い、増幅されたDNAを定量する。即ち、当該cDNA 1μl、配列番号１〜５のいずれかの塩基配列の一部分を有するDNAをプライマー１ 20pmol、当該プライマー１にPCRのための対となりうる塩基配列を有するDNAをプライマー２ 20pmol、及びSYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃ 2分間次いで95℃ 10分間保温した後、95℃ 15秒次いで60℃ 1分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの量から、被験肝臓試料での本遺伝子の発現量レベルと無処置ラット正常肝臓試料での本遺伝子の発現レベルを求める。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの被験肝臓試料における発現レベルの測定値が、無処置ラット正常肝臓試料における当該遺伝子の発現レベルの２倍以上であれば、前記被験肝臓試料中に肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞が存在すると評価する。
【００３９】
実施例４ （プローブアレイを用いた肝発癌活性検定方法）
（１）哺乳動物への被験物質の投与
例えば、以下に記載される二段階発癌モデルを用いることができる。
具体的には、被験物質が変異原性物質の場合には、雄F344系ラット（投与開始時６週齢）に、被験物質として、例えば、Ｎ-ジエチルニトロサミン（以下、DENと記す）100mg/kg・体重を1回/週の割合で2週間腹腔内投与し、対照として被験物質の溶媒、例えば、生理食塩水を投与した群をさらに設けた。被験物質が非変異原性の場合には、同じ雄F344系ラットにDEN 100mg/kg・体重を1回/週の割合で2週間腹腔内投与した後、翌週から被験物質として、例えば、クロフィブレート3000ppmやＷＹ-14,643 1000ppmを混餌投与した群をそれぞれ設け、対照として基礎飼料のみを混餌投与した群をさらに設けた。試験開始後、非被験物質投与群には肝臓腫瘍性病変の発生しない時期、例えば、被験物質が変異原性物質の場合には26週目又は36週目に、被験物質が非変異原性物質の場合には26週目に各群動物の肝臓を採取した。
【００４０】
（２）遺伝子の発現解析
被験物質投与群由来動物の肝臓組織及び非被験物質投与群動物由来の肝臓組織それぞれから、動物個体毎に実施例１（１）と同様の操作によってtotal RNAを調製した後、実施例１（２）〜（４）と同様の操作によって被験物質投与群及び非被験物質投与群の各動物毎のそれぞれの肝臓組織由来のフラグメント化cRNAを調製する。次に、実施例１（５）と同様の操作によって被験物質投与群及び非被験物質投与群の各動物毎のそれぞれの肝臓組織由来のフラグメント化cRNAを、本遺伝子の塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが固定されたプローブアレイにハイブリダイズした後、染色する。得られた被験物質投与群及び非被験物質投与群の各動物毎のそれぞれのプローブアレイをHP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、シグナルを570nmの蛍光輝度を測定することによって読み取り、得られた結果をGeneChip Microarray Suite (Affymetrix社製)によって比較解析する。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの、被験物質投与群動物の肝組織における発現レベルが、非被験物質投与群動物の肝組織の発現レベルの２倍以上であれば、その肝組織由来の動物は肝臓腫瘍性病変を有していると判定でき、被験物質投与群における肝臓腫瘍性病変を有している動物数が非被験物質投与群に比較して適当な統計学的解析を実施することで有意に多ければ、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【００４１】
実施例５ （定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた肝発癌活性検定方法）
（１）哺乳動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて動物個体毎に肝臓組織を採取する。
【００４２】
（２）遺伝子の発現解析
被験物質投与群動物由来の肝臓組織及び非被験物質投与群動物由来の肝臓組織それぞれから、実施例１（１）と同様の操作によってtotal RNAを調製した後、実施例１（２）と同様の操作によって被験物質投与群及び非基礎飼料投与群動物それぞれの肝臓組織由来のcDNAを調製する。次に、調製されたcDNAを鋳型として、以下のようにしてPCRを行って増幅されたDNAを定量する。即ち、当該cDNA 1μl、配列番号１〜５のいずれかの塩基配列の一部を有するDNAをプライマー１ 20pmol、当該プライマー１にPCRのための対となりうる塩基配列を有するDNAをプライマー２ 20pmol及びSYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃ 2分間次いで95℃ 10分間保温した後、95℃ 15秒次いで60℃ 1分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの量から、被験物質投与群動物由来の肝臓組織における本遺伝子の発現レベル及び非被験物質投与群動物由来の肝臓組織における本遺伝子の発現レベルそれぞれを求める。被験物質投与群動物由来の肝臓組織における発現レベルが、非被験物質投与群動物由来の肝臓の発現レベルの２倍以上であれば、その肝臓組織由来の動物は肝臓腫瘍性病変を有していると判定でき、被験物質投与群における肝臓腫瘍性病変を有している動物数が非被験物質投与群に比較して適当な統計学的解析を実施することで有意に多ければ、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【００４３】
実施例６ （インサイチューハイブリダイゼーションを用いた肝発癌活性検定方法）
（１）哺乳動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて肝臓組織を採取する。但し、肝臓はそのまま
又は、例えば、4％パラホルムアルデヒド（pH7.2〜7.4）で固定（灌流してもよい）後に採取する。
【００４４】
（２）肝臓組織の固定、包埋及び薄切切片の作製
採取した肝臓を固定する場合には、例えば、4％パラホルムアルデヒド（pH7.2〜
7.4）で4℃、一晩固定する。固定後、被験物質投与群動物由来の肝臓組織及び非被験物質投与群動物由来の肝臓組織それぞれをアルコール脱水し、パラフィンに包埋した後、ミクロスライサーを用いて2〜10μmの厚さで薄切し、これをスライドグラスに載せる。
【００４５】
（３）cDNAの調製
登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子を発現している組織（肝臓組織）から実施例１（１）と同様の操作にてtotal RNAを1μg/μlになるように調製する。次に目的遺伝子（例えば、NM_175707）の約1kbpを選定し、当該塩基配列を有するＤＮＡをPCRで増やすためのプライマーの合成を行う。プライマーは、そのsense primerの5'末端にT3プロモーター配列（aat taa ccc tca cta aag gga ac）を、antisense primerの5'末端にT7プロモーター配列（gta ata cga ctc act ata ggg ag）を付加したものとし、合成は遺伝子工学的手法にて用いられる通常の方法により合成する。RT-PCRには、ThermoScript RT-PCR System (Gibco社)及びPLATIUM taq DNA Polymerase High fidelity (Gibco社)の各キットを用いる。まず、Antisenseのプライマー20pmol、total RNA 1μl、当該キット内のH20を混じ、65℃、5分間保温し、その後、氷上で冷却する。次いで、5×DNA Synthesis Buffer 4μl、0.1M DTT 1μl、RNase OUT 1μl、滅菌水1μl、10mM dNTP Mix 2μl、ThermoScript RT 1μlを加え、65℃で1時間保温した後、85℃で5分間加温し、ThermoScript RTを失活させる。これを氷上で冷却した後、1μlのRNase H (Gibco社)を加え、37℃で20分間反応させることでcDNAを作製する。作製したcDNA 5μlに、sense primer 20pmol、×10 High Fidelity PCR Buffer 5μl、50mM MgSO 2μl、10mM dNTPmix 1μl、PLATINUM taq DNA Polymerase Hight Fidelity 0.2μl、滅菌水34.8μlを加え、94℃で2分間加温した後、94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分間を１サイクルとして40サイクル実施し、最後に68℃で5分間反応を行う。このPCR反応液を1％アガロースゲル電気泳動に供し、目的PCR産物をゲルから切り出した後、等量のイソプロパノールと混じ、当該キット内のカラムに供して、2分間遠心分離する。遠心後、カラムに新しいチューブを繋ぎ、当該キット内のEB buffer 50μlをカラムに供して遠心分離し、目的DNA産物を得る。
【００４６】
（４）ラベル化cRNAの調製
実施例６（３）で合成されたcDNAを鋳型とし、T3 polymerase又はT7 polymeraseを用いてcRNAプローブ（FITC標識）を合成する。具体的には、cDNA 0.2〜1μlに×10 transcription buffer(DTT+)（宝酒造）2μl、×10 FITC-laveling mix (ベーリンガマンハイム) 2μl、RNase inhibitor（ニッポンジーン）1μlを加え、さらにH2Oを加えて総量を18μlにする。そこにsense probeを合成する場合には2μlのT3 polymerase(宝酒造) 、anti-sense probeを合成する場合には2μlのT7 polymerase(宝酒造)をそれぞれ加え、37℃で3〜5時間保温する。次いで、1μlのRNase freeのDNase I（ベーリンガマンハイム社）を加え、さらに20分間保温する。合成されたcRNAはエタノール沈澱させ、得られたペレットを60℃に加温した100μLの 40mM NaHCO3, 60mM Na2CO3 (pH10.2)に溶解する。その後、アルカリ分解により約150bの断片になるように、次の計算式から得られた時間、60℃で保温する。加温時間(分) = (cDNA長(kb)-加水分解後の平均断片長(kb))/(0.11×cDNA長(kb)×加水分解後の平均断片長(kb))。反応後、氷上で冷却し、１μlの酢酸を加える。更に、10分の1量の4M LiClを添加し、15000rpmで10分間遠心分離し、上清を棄てる。500μlのエタノールを加えてペレットを洗浄した後、TE buffer 20μl、0.1M DTT 2μl、RNase inhibitor 1μlを加え溶解する。
【００４７】
（５）ハイブリダイゼーション
実施例６（２）で作製したスライド標本を室温で脱パラフィンし、再水和する。次に、前処理として1×Target Retrieve Solution (DAKO)を加え、オートクレーブにより121℃で20分間加温する。60℃まで温度が下がった後にこれを取り出し、室温に20分間放置することで更に冷却する。冷却後、室温でDEPC処理滅菌水に2分×2回、3％過酸化水素水/DEPC処理滅菌水に30分間、DEPC処理滅菌水に2分×3回、90％エタノール/DEPC処理滅菌水に3分間、100％エタノールに3分間浸漬した後、風乾する。実施例６（４）で調製したcRNAプローブをhybridization buffer（組成：40％ホルムアミド(ニッポンジーン), 4×SCC (pH5.0)(Gibco), 1 mM EDTA, 1×Denhardet's(Nippon gene)，250μg/ml yeast tRNA (Gibco),125μg/ml サケ精子DNA (Gibco), 10％dextran sulfateで0.1〜0.3μg/ml/kbとなるように希釈し、切片上で滴下し、EasiSeal（HYBAID社）を用いて封入する。封入したスライドグラスを湿潤箱に並べ、60℃で5時間以上保温する。その後、スライドグラスを65℃に保温した5×SSC (pH5.0)中に浸し、65℃に加温した洗浄液Ａ（組成：2×SSC［pH5.0］, 1％SDS）に30分間×2回浸漬し、室温の洗浄液Ｂ（組成：10 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5M NaCl, 0.1％ Tween 20）に5分間×3回浸漬した後、37℃に加温した洗浄液Ｂに20μg/ml RNase A (SIGMA)を加えたものに20分間浸漬する。その後、65℃に加温した洗浄液Ｃ（組成：2×SSC［pH5.0］, 50％ ホルムアミド［和光］）で30分間×2回、室温のTBS buffer（組成：50 mM Tris-HCl ［pH7.5］, 150mM NaCl）で3分間×3回洗浄を行う。洗浄後、切片周囲の過剰な溶液を拭き取り、組織周囲をPAP PEN（大道産業株式会社）で囲んだ後、FITC標識プローブ検出キット（DAKO）に含まれるアルカリフォスファターゼ標識抗FITC抗体を1％Bovine serum albumin/TBSで希釈したものを、切片上に滴下し、湿潤箱中に37℃で60分間放置する。反応後、室温のTBST（組成：TBS + 0.1% Tween 20）に5分間×3回、室温のTBSに2〜3分浸漬する。切片周囲の過剰な溶液を拭き取り、AP基質溶液（DAKO、BCIP/NBT発色基質溶液）を滴下し、湿潤箱中に37℃で60分〜2日間放置する。その後、流水中で発色液を洗い流し、透徹、封入する。
【００４８】
（６）遺伝子の発現を指標とした肝発癌活性解析
本遺伝子の転写物量を指標とする肝臓腫瘍性病変の有無は、肝臓薄切切片上で蛍光活性が周囲の肝臓正常組織に比較して２倍以上の細胞巣の有無により評価される。従って、被験物質投与群動物由来の肝臓薄切切片及び非被験物質投与群動物由来の肝臓薄切切片上において上記記載の蛍光活性の低い領域が認められた場合、その肝臓組織薄切切片由来の動物は肝臓腫瘍性病変を有していると判定でき、被験物質投与群において肝臓腫瘍性病変を有している動物数が非被験物質投与群に比較して適当な統計学的解析を実施することで有意に多ければ、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【００４９】
実施例７ （免疫組織化学的検査を用いた肝発癌活性検定方法）
（１）哺乳動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて肝臓組織を採取する。
【００５０】
（２）組織の固定、包埋、及び切片の作製
採取した肝臓から組織を適度な大きさに切り出した後、OCTコンパウンドにこれを包埋し、液体窒素にて冷却したイソペンタン中で凍結させる。これを-20℃に冷却したクリオスタット中で約5μmの厚さに薄切し、スライドグラスに載せ、乾燥させる。
【００５１】
（３）薄切切片の免疫組織化学的染色
上記（２）で作製した薄切切片を70％エタノールで1分間固定した後、PBS buffer（組成：10 mM リン酸ナトリウム ［pH7.4］, 100mM NaCl）で洗浄してOCTコンパウンドを落とし、0.3％過酸化水素水で5分間処理する。PBS bufferで5分間×3回洗浄し、正常血清で室温20分間処理する。次いで、PBS bufferで適度に希釈した登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子の翻訳産物に対する抗体（以下、一次抗体）で室温60分間処理する。反応後、PBS bufferで5分間×3回洗浄し、PBS bufferで適度に希釈した一次抗体と同じ免疫動物のVECTASTAIN/ABC試薬（フナコシ）で室温30分間処理する。更に、PBS bufferで5分間×3回洗浄した後、3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩（ナカライ）を用いて発色させる。その後、蒸留水で洗浄し、脱水、透徹、封入を行う。
【００５２】
（４）遺伝子翻訳産物の発現を指標とした肝発癌活性解析
本遺伝子の転写翻訳産物量を指標とする肝臓腫瘍性病変の有無は、肝臓薄切切片上での染色強度が周囲の肝臓正常組織に比較して２倍以上の細胞巣の有無により評価され、染色強度は、例えば、画像解析装置IPAP（住化テクノサービス（株））を用いて測定することができる。従って、被験物質投与群動物由来の肝臓薄切切片及び非被験物質投与群動物由来の肝臓薄切切片上において上記記載の染色強度の低い領域が認められた場合、その肝臓組織薄切切片由来の動物は肝臓腫瘍性病変を有していると判定でき、被験物質投与群における肝臓腫瘍性病変を有している動物数が非被験物質投与群に比較して適当な統計学的解析を実施することで有意に多ければ、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によって、遺伝子の発現レベルの異常を指標とした哺乳動物の肝臓腫瘍性病変の検定方法等が提供可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌が遺伝子の関わる異常を原因とする疾病であることが次第に明らかになりつつあるが、癌に対する羅漢率、死亡率は未だ高い。このような状況において、様々な化学物質の発癌性の有無を事前に確認しておくための安全性試験は極めて重要である。従来、化学物質の発癌性を検定する代表的な方法としては、種々の哺乳動物（例えばラット）を用いた安全性試験において、種々の診断基準に代表される病変の組織学的特徴を指標とした病理組織標本の診断により、発癌性の有無を評価する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Williams, G.M., Safety assessment of pharmaceuticals: examples of inadequate assessments and a mechanistic approach to assuring adequate assessment. Toxicological Pathology, 1997, vol.25(1), page 32-38.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、哺乳動物を用いた安全性試験において、例えば、化学物質の発癌標的となる割合の最も高い器官 若しくは組織の一つである肝臓の場合には、腫瘍性病変になる前段階である前腫瘍性病変にあって、肝細胞腺腫になる直前の病変（以下、境界病変と記すこともある）は良性肝細胞腺腫の組織学的特徴に類似した組織変化を呈してくるため、境界病変の診断は従来法のみでは場合によっては必ずしも十分に満足のゆくものではなかった。
そこで、化学物質の発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意検討した結果、哺乳動物における肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞において、特定の遺伝子の発現レベルが隣接する正常組織での肝細胞における当該遺伝子の発現レベルに比べ２倍以上に増加していることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）検体における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）
＜登録番号群１＞
AA892298（例えば、配列番号１参照）、A892680（例えば、配列番号２参照）、NM_175707（例えば、配列番号３参照）、BC087645（例えば、配列番号４参照）、AF315802（例えば、配列番号５参照）
２．検体が、肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．第二工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であることを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する工程であることを特徴とする前項１，２、３又は４記載の方法；
６．物質の肝発癌活性の検定方法であって、
（１）肝細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた前記肝細胞における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明肝発癌活性検定方法と記すこともある。）
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
７．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量の測定によりなされることを特徴とする前項６記載の方法；
８．遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする前項６又は７記載の方法；
９．第三工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であることを指標とし、前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価することを特徴とする前項８記載の方法；
１０．前項６〜９のいずれかに記載される方法により評価された肝発癌活性の有無又はその量に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする肝発癌物質の探索方法
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によって、遺伝子の発現レベルの異常を指標とした哺乳動物の肝臓腫瘍性病変の検定方法等が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において検体とは、例えば、肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料をあげることができ、具体的には、例えば、被験動物から採取された肝臓組織等の組織或いはこれら組織から分離された細胞又はその培養細胞等をあげることができる。これらの試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された試料を検体として用いてもよい。
本発明において発現レベルが測定される遺伝子は、上記の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログ（以下、一括して本遺伝子と記すこともある。）から選ばれる１以上の遺伝子である。Genbankに登録されている塩基配列に関する情報は、例えば、National Center for Biotechnology Information のWEBページ（URL；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から、Genbankによって各遺伝子に付与されている上記の登録番号 (Accession No.)をもとに検索を行うことによって入手することができる。因みに、GenBnak、DDBL及びEMBLの各データバンクが公開しているデータ全てを誰でも制限なしで利用でき、INSDに登録されたデータは科学資料として永久に保存され公開されることは、上記３データバンクで構成される国際塩基配列データベース（international Nucleotide Sequence Databases, INSD）の諮問機関である国際諮問委員会により作成された「DDBL/EMBL/GenBnakの登録データの取り扱い」（2002年5月23-24日）で明文化されており、如何なる当業者であっても登録番号 (Accession No.)に基づきデータの照合、検索、入手等は可能である。
本発明において利用される本遺伝子には、上記の公知の塩基配列と全く同一の塩基配列を有する遺伝子のほか、前記の遺伝子の塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
因みに、本発明において利用される本遺伝子のうち、NM_175707（配列番号３）でGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 99(26), 16899-16903 (2002)等に記載されており、当該遺伝子の塩基配列に基づき翻訳されたアミノ酸配列（一文字表記として）は、MSVTLHTDVGDIKIEVFCERTPKTCENFLALCASNYYNGCVFHRNIKGFMVQTGDPTGTGRGGSSIWGKKFEDEYSEYLKHNVRGVVSMANNGPNTNGSQFFITYGKQPHLDMKYTVFGKVIDGLETLDELEKLPVNEKTYRPLNDVHIKDITIHANPFAQ [peptidylprolyl isomerase (cyclophilin)-like 3]であることが知られている。
【０００８】
本遺伝子の発現レベルの測定は、例えば、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができる。
本遺伝子の転写物量を測定するには、例えば、当該遺伝子の転写物であるmRNA量を測定する。特定の遺伝子のmRNA量の測定は、具体的には、例えば、定量的リアルタイム−ポリメラーゼチェイン反応（以下、定量的RT-PCRと記す。）、ノーザンハイブリダイゼーション法［J.Sambrook, E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年］、DNAアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等により実施することができる。
また、本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、例えば、本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質の量を測定する。特定の蛋白質の量の測定は、具体的には、例えば、当該蛋白質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、免疫組織化学的検査等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー等により実施することができる。本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質を免疫抗原として調製することができる。
【０００９】
本遺伝子の転写物量の測定方法についてさらに説明する。
本遺伝子の転写物であるmRNA量は、例えば、本遺伝子の塩基配列に基づいて設計、調製されたプローブ又はプライマーを使用して、通常の遺伝子工学的方法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、定量的RT-PCR、DNAアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等を用いることによって測定することができる。具体的には、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著；モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載された方法に準じて行うことができる。この際、組織における発現レベルが恒常的に一定であることが知られている遺伝子（以下、対照遺伝子と記す。）、例えば、β-actin遺伝子（Nucl.Acids.Res., vol.12,No.3, p.1687,1984）や36B4（Acidic Ribosomal Phosphoprotein）（Nucl.Acids.Res., vol.19,No.14, p.3998,1991）遺伝子等のmRNA量を同時に測定しても良い。そして、対照遺伝子のmRNA量若しくはその指標値あたりの本遺伝子のmRNA量又はその指標値を算出することにより、本遺伝子の発現レベルを求めてもよい。
【００１０】
（１．ノーザンハイブリダイゼーション法）
まず、mRNA量を測定しようとする遺伝子のDNAを調製し、次いで、その全部又は一部からなるDNAを標識してプローブを調製する。
上記遺伝子は、市販のcDNA（例えば宝酒造から入手）又は以下に示した方法により調製したcDNAを鋳型にしてPCR等によって調製することができる。例えば、まず当該遺伝子を発現する組織から、塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の通常の方法によって全RNAを抽出する。例えばISOGEN（ニッポンジーン製）等の市販のキットを利用して全RNAを抽出してもよい。
抽出された全RNAから、例えば、以下のようにしてmRNAを調製する。まず、オリゴdTをリガンドとして有するポリAカラムを5倍カラム容量以上のLoading buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］を用いて、平衡化し、続いて前述の方法で調製された全RNAをカラムにかけ、10倍カラム容量のloading bufferで洗浄する。さらに5倍カラム容量のWashing buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］で洗浄する。続いて、3倍カラム容量のelution buffer［10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、1mM EDTA、0.05％(w/v)SDS）でmRNAを溶出させることによってmRNAを得る。
次いで、オリゴdTプライマーを前記全RNA或いはmRNAのポリＡ鎖にアニールさせ、例えばcDNA合成キット（宝酒造）のプロトコールに従って、一本鎖cDNAを合成する。この時、鋳型とするRNAは、全RNA或いはmRNAのどちらでも良いが、mRNAを用いる方がより好ましい。
前記一本鎖cDNAを鋳型にして、TaKaRa taq（宝酒造）等のDNA polymeraseを用いてPCRすることにより、DNAを増幅する。PCRの条件は、測定対象とする動物の種類、使用するプライマーの配列等により異なるが、例えば、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、2.5mM NTP存在下で、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件等を挙げることができる。
【００１１】
このようにして増幅された本遺伝子のDNAはpUC118等のベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。当該DNAの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M&W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.,74,560,1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F.&A.R.Coulson,J.Mol.Biol.,94,441,1975 、Sanger,F,& Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.,74,5463,1977等に記載される）等により確認することができる。
【００１２】
このようにして調製された本遺伝子のDNAの全部又はその一部を、次のようにして放射性同位元素や蛍光色素等で標識することによりプローブを調製することができる。例えば、上記のようにして調製されたDNAを鋳型とし、当該DNAの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、[α-32P]dCTP或いは[α-32P]dATPを含むdNTPを反応液に添加してPCRを行うことにより32Pで標識されたプローブが得られる。また、上記のようにして調製されたDNAを、例えば、Random prime labeling Kit（ベーリンガーマンハイム社）、MEGALABEL（宝酒造）等の市販の標識キットを用いて標識してもよい。
【００１３】
次に、上記プローブを使用して、ノーザンハイブリダイゼーション分析を行う。具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から全RNA又はmRNAを調製する。調製された全RNA 20μg或いはｍRNA 2μgをアガロースゲルで分離し、10×SSC（1.5Ｍ NaCl、0.35Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄した後、ナイロンメンブラン［例えば、Hybond-N（アマシャム製）等］に移す。ポリエチレン袋にメンブランを入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC（0.9Ｍ NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコール400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％BSA］、0.1％(w/v)SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを捨て、新たに2ml〜6mlのハイブリダイゼーションバッファーを加える。更に上記方法で得られたプローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベーリンガーマンハイム社)等を用いることができる。メンブランを取り出して、50〜100mlの2×SSC、0.1％ SDS中で室温、15分間インキュベートし、さらに同じ操作を１回繰り返し行い、最後に50〜100mlの0.1×SSC、0.1％ SDS中で68℃、30分間インキュベートする。メンブラン上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写産物であるmRNAの量を測定することができる。
【００１４】
（２．定量的RT-PCR）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに例えばMMLV（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、10mM DTT］中、0.5mM dNTP及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜1時間反応させ、対応するcDNAを調製する。cDNA合成キット（宝酒造）を用いて対応するcDNAを調製しても良い。調製されたcDNAを鋳型にして、本遺伝子の塩基配列の一部分を有するDNAをプライマーとしてPCRを行う。プライマーとしては、例えば、本遺伝子の部分塩基配列を有するプライマーをあげることができる。PCRの条件としては、例えば、例えば、TAKARA taq（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、2.5mM dNTP及び［α32P］-dCTP存在下で、例えば、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件をあげることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたDNAの放射活性量を測定することにより、本遺伝子のmRNAの量を測定することができる。或いはまた、例えば、TAKARA taq（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、SYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃，2分間次いで95℃，10分間の保温の後、95℃，15秒間次いで60℃，１分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの蛍光を測定することにより、本遺伝子のmRNAの量を測定することができる。
【００１５】
（３．DNAアレイ解析）
本発明の転写物量の測定には、ナイロンメンブラン等のメンブランフィルター等に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されるマクロアレイ、スライドガラス等に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されるマイクロアレイ、スライドガラス上に本遺伝子の塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチド（通常18〜25merの鎖長）を光化学反応を利用して固定して作製されるプローブアレイ等、公知の技術に基づいたDNAアレイを利用することができる。これらのアレイの作製は、例えばゲノム機能研究プロトコール 実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて行うことができる。またAffymetrix社等から市販されているGenechip等を利用することもできる。
【００１６】
以下、DNAアレイを用いて本遺伝子の転写物量を測定する方法の一例を示す。
（３−１．マクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えばMMLV（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、及び10mM DTTを含む液］中、0.5mMdNTP、［α32P］-dCTP、及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜１時間反応させて、標識DNAを調製し、これをプローブとする。このとき、cDNA合成キット（宝酒造）等を用いても良い。メンブランフィルターに本遺伝子のcDNAをスポットして作製されたマクロアレイをポリエチレン袋に入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC（0.9Ｍ NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコール400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％ BSA］、0.1％(w/v) SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新たに2ml〜6mlのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。更に上記プローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベーリンガーマンハイム社)等を用いることもできる。マクロアレイを取り出して、50ml〜100mlの2×SSC、0.1％ SDSに浸し室温にて15分間程度インキュベートした後、さらに同じ操作を1回繰り返し行い、最後に50ml〜100mlの0.1×SSC、0.1％ SDS中で68℃、30分間インキュベートする。マクロアレイ上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１７】
（３−２．マイクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えばMMLV（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、及び10mM DTTを含む液］中、0.5mM dNTP、Cy3-dUTP、（又はCy5-dUTP）及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜１時間反応させる。アルカリバッファー（例えば、１N NaOH、20mM EDTAを含む液）を加え、65℃10分間保温した後、MicroconYM-30等を用いて遊離のCy3又はCy5を除くことにより蛍光標識DNAを調製し、これをプローブとする。得られたプローブを用いてマイクロアレイに対して（３−１ DNAマクロアレイによる定量）に記載された方法と同様にしてハイブリダイゼーションを行う。アレイ上のシグナル量をスキャナーにより測定することによって、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１８】
（３−３．プローブアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えば、cDNA合成キット（GENSET社）等を用いてcDNAを調製する。調製されたcDNAを、例えば、ビオチンラベル化cRNA合成キット（In Vitro Transcription社）（Enzo社）等によりビオチン標識し、cRNA cleanup and quantitation キット（In Vitro Transcription社）により精製する。生成されたビオチン標識DNAをFragmentation バッファー（200mMトリス酢酸（pH8.1）、500mM KOAc、150mM MgOAc）により断片化する。これに内部標準物質Contol Oligo B2 （Amersham社製）、100×Control cRNA Cocktail、Herring sperm DNA （Promega社製）、Acetylated BSA（Gibco-BRL社製）、2×MES Hybridization Buffer〔200mM MES、2M [Na+], 40mM EDTA、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7〕及びDEPC処理滅菌蒸留水を加え、ハイブリカクテルを作製する。
1×MESハイブリダイゼーションバッファーで満たしたプローブアレイ［例えば、Genechip（Affymetrix社製）等］を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpm、10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーションバッファーを除去する。その後、該プローブアレイに上記のハイブリカクテル200μlを添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60rpm、16時間回転させる（ハイブリダイゼーション）。続いてハイブリカクテルを除去し、Non-Stringent Wash Buffer〔6×SSPE［20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈］、0.01％ Tween20、及び0.005％ Antifoam0-30(Sigma社)を含む〕で満たした後、GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置に上記プローブアレイを装着し、プロトコールに従って洗浄する。次いで、MicroArray Suite(Affymetrix社)の染色プロトコールEuKGE-WS2に従って該プローブアレイを染色する。HP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)により570nmの蛍光輝度を測定することにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１９】
（４．インサイチューハイブリダイゼーション法）
基本的には１）組織の固定、包埋、及び切片の作製、２）プローブの調製、３）ハイブリダイゼーションによる検出からなり、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡ又はＤＮＡをプローブとすること以外は、例えば、Heiles,H.et al., Biotechniques,6,978,1988、遺伝子工学ハンドブック 羊土社 278 1991、細胞工学ハンドブック,羊土社,214,1992、細胞工学ハンドブック,羊土社,222,1992等に記載される方法に準じて行うことができる。
RNAプローブを調製する場合には、まず、例えば前記（１ ノーザンハイブリダイゼーション法）に記載した方法と同様にして本遺伝子のDNAを取得し、当該DNAをSP6、T7、T3RNAポリメラーゼプロモーターをもったベクター（例えばStratagene社のBluescript、Promega社のpGEM等）に組み込んで大腸菌に導入し、プラスミドDNAを調製する。次いで、センス（ネガティブコントロール用）、アンチセンス（ハイブリダイゼーション用）RNAができるようにプラスミドDNAを制限酵素で切断する。これらDNAを鋳型とし、放射性標識の場合はα-35S-UTP等、非放射性標識の場合はディゴキシゲニンUTP或いはフルオレセイン修飾UTP等を基質として、SP6、T7、T3RNAポリメラーゼを用いてRNAを合成しながら標識し、アルカリ加水分解によりハイブリダイゼーションに適したサイズに切断することによって、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたRNAを調製する。なお、これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはRNAラベリングキット（アマシャム社）が、非放射性標識用にはDIG RNAラベリングキット（ベーリンガー・マンハイム社）やRNAカラーキット（アマシャム社）が市販されている。
また、DNAプローブを調製する場合には、例えば、32Ｐ等で標識した放射性ヌクレオチド又はビオチン、ディゴキシゲニン若しくはフルオレセインで標識したヌクレオチドを、ニックトランスレーション法(J.Mol.Biol.,113,237,Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,10,6-10,12,Cold Spring Harbor Lab.)又はランダムプライム法(Anal.Biochem., 132,6,Anal.Biochem.,137,266)によって取り込ませることによって、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたDNAを調製する。これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはニックトランスレーションキット（アマシャム社）やRandom Prime Labeling Kit（ベーリンガーマンハイム社）が、非放射性標識用にはDIG DNA標識キット（ベーリンガーマンハイム社）、DNAカラーキット（アマシャム社）等が市販されている。
具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞をパラホルムアルデヒド等で固定し、パラフィン等に包埋した後、薄切切片を作製しスライドグラスに張り付ける。又は、上記の組織又は細胞をOCTコンパウンドに包埋後、液体窒素又は液体窒素で冷却したイソペンタン中にて凍結させ、その薄切切片を作製し、スライドグラスに張り付ける。このようにしてスライド標本を得る。
次に、上記の組織又は細胞中にあって使用されるプローブと非特異的に反応する物質を除去するために、上記のようにして作製されたスライドグラス切片をプロテイナーゼＫ処理し、アセチル化する。次いで、該スライドグラス切片と上記のようにして調製されたプローブとのハイブリダイゼーションを行う。例えば、上記のプローブを90℃で3分間加熱した後ハイブリダイゼーション溶液で希釈し、該溶液を前処理の終了したスライドグラス切片上に滴下してフィルムでおおい、モイスチャーチャンバー中で45℃、16時間保温することにより、ハイブリッドを形成させる。ハイブリダイゼーションの後、非特異的吸着或いは未反応プローブを洗浄等（RNAプローブを用いた場合はRNase処理も加える）により除去する。転写物量は、例えば、スライドグラス切片上の標識量を測定すること等により、本遺伝子の転写物であるmRNAの量又はそれに相当する値を測定することができる。
【００２０】
本発明検出方法においては、本遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の検体における発現レベルを、上述のようにして測定する。発現レベルを測定する遺伝子を複数選ぶ場合には、登録番号群１に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログを複数選んでもよい。
【００２１】
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量又は翻訳産物量を測定する方法を好ましくあげることができる。
【００２２】
上記のようにして得られた前記検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を、当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する。
【００２３】
本遺伝子の発現レベルの対照値としては、例えば、正常組織での細胞における当該遺伝子の発現レベルの値をあげることができる。ここで、正常組織とは、例えば、病理組織学的検査において異常の認められない組織を意味し、特に、発現レベルについて転写物量の測定をする方法としてインサイチューハイブリダイゼーション法や、翻訳産物量の測定をする方法として免疫組織化学的検査方法等を用いる場合には、被験物質と接触した肝臓組織であっても転写物量又は翻訳産物量のシグナルが肝臓腫瘍性病変組織の２倍以上を示す。
かかる対照値は、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルを、検体における当該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。
例えば、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルの値を対照値として、検体における、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であれば、検体中に肝臓腫瘍性病変を有すると評価することができる。
【００２４】
本発明肝発癌活性検定方法においては、まず、肝細胞と被験物質とを接触させる。用いられる肝細胞としては、哺乳動物から採取された肝臓組織内に存在している状態にある肝細胞、或いは、当該組織から分離された細胞又はその培養細胞等があげられる。
【００２５】
本発明肝発癌活性検定方法において、肝細胞と被験物質との接触は、例えば、哺乳動物に被験物質を投与することにより行ってもよい。哺乳動物は、天然の動物のほか、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物等であってもよい。哺乳動物への被験物質の投与方法としては、例えば、経口（強制又は飲料水や餌に混じ）、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、経気道等により行うことができる。投与量、投与回数及び投与期間は、例えば、全身状態、全身諸器官組織等に重篤な影響を及ぼさない範囲内（例えば投与量は、最大耐量）とすればよい。
【００２６】
次に、上記のようにして被験物質と接触させた肝細胞における、本遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを、上述のようにして測定する。発現レベルを測定する遺伝子を複数選ぶ場合には、同一の登録番号群に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログを複数選んでもよい。
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量を測定する方法を好ましくあげることができる。
【００２７】
上記のようにして被験物質と接触させた又は肝細胞から得られた本遺伝子の発現レベルの測定値を、当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する。
本遺伝子の発現レベルの対照値としては、例えば、前記被験物質と接触させていない肝細胞における発現レベルの値をあげることができる。肝細胞は、正常組織での肝細胞における当該遺伝子の発現レベルの値を好ましくあげることができる。ここで正常組織とは、例えば、被験物質と接触していない肝臓組織で病理組織学的検査において異常の認められない組織を意味し、特に、発現レベルを転写物量で測定する方法としてインサイチューハイブリダイゼーション法、又は翻訳産物量で測定する方法として免疫組織化学的検査方法を用いる場合には、被験物質と接触した肝臓組織であっても転写物量又は翻訳産物量のシグナルが肝臓腫瘍性病変組織の２倍以上を示す。
かかる対照値は、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルを、被験物質と接触させた肝臓組織での細胞における当該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。例えば、被験物質と接触させる前の肝臓組織の一部を採取して本遺伝子の発現レベルを測定し、得られた値を対照値とすることもできる。
例えば、被験物質と接触させた肝細胞における本遺伝子の発現レベルの測定値が、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルの値の２倍以上であれば、前記被験物質との接触による肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞の発生を意味し、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価することができる。
【００２８】
さらに、上記のような本発明肝発癌活性検定方法は、肝発癌活性を有する物質の探索等に利用することができる。具体的には、本発明肝発癌活性検定方法により評価された肝発癌活性の有無に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜することによって、肝発癌活性物質を探索することができる。選抜された肝発癌活性物質は、例えば、肝癌モデル哺乳動物の作製等に利用することもできる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施例１ （本遺伝子の発現レベルの測定）
（１）total RNAの調製
ラット肝臓腫瘍性病変組織及び正常組織それぞれ湿重1gに対して10mlのTRIZOL Reagent(Gibco-BRL社製)を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズし、５分間室温で放置する。次いで、4℃、9,000rpm、10分間遠心分離した後、水層を50ml遠心チューブ（IWAKI社製）に回収する。TRIZOL Reagentの1/5容量のクロロホルム（関東化学社製）を添加し、15秒間上下に激しく撹拌した後、5分間室温で放置する。次いで、4℃、9,000rpm、10分間遠心分離した後、水層を新しい50ml遠心チューブに回収する。更に、TRIZOL Reagentの1/2容量の2-プロパノール（関東化学社製）を添加して、転倒混和した後、室温で10分間静置する。4℃、9,000rpm、10分間遠心分離した後、上清を除去しペレットを得る。得られたペレットを、TRIZOL Reagentの1/10容量のDEPC処理滅菌蒸留水（和光純薬工業社製）で溶解する。得られるRNA溶液0.1mlにRNeasy Mini Kit(QIAGEN社製)添付のRLT buffer (10μL β-メルカプトエタノール/mL RLT buffer)350μlを添加し、混和する。更に、250μl エタノール(関東化学社製)を添加し、混和する。当該混和液をRNeasy Mini Kit添付のRNeasy Spin Columnにアプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を再度同じRNeasy Spin Columnにアプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで4倍希釈したRNeasy Mini Kit添付のRPE bufferを500μlプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで希釈したRPE bufferを500μlアプライし、室温、14,000rpm、2分間遠心分離する。その後、カラムを新しいエッペンドルフチューブに移してRNeasy Mini Kit添付の蒸留水を50μl添加し、1分間室温で静置する。静置後、室温、10,000rpm、1分間遠心分離によって溶出し、total RNAを得る。正常組織についても、上記と同様の操作を行い、total RNAを調製する。
【００３１】
（２）cDNAの調製
上記（１）で肝臓腫瘍性病変組織から調製したtotal RNA及び正常組織から調製したtotal RNA それぞれ10μg、T7-(dT)24プライマー(Amersham社製) 100pmolを含む11μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却する。冷却後、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 2μl、及び当該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μlを添加し、42℃、2分間加熱する。更に、当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μl(400U)を添加し、42℃、1時間加熱した後、氷上で冷却する。冷却後、DEPC処理滅菌蒸留水91μl、当該キットに含まれる5×Second Strand Reaction Buffer 30μl、10mM dNTP Mix 3μl、当該キットに含まれるE. coli DNA Ligase 1μl(10U)、当該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μl(40U)、及び当該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μl(2U)を添加し、16℃、2時間反応させる。次いで、当該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μl(10U)を加え、16℃、5分間反応させた後、0.5M EDTA 10μlを添加する。次いで、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μlを添加し、混合する。当該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、室温、14,000rpm、2分間遠心分離した後、145μlの水層をエッペンドルフチューブに移す。これに、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μl、エタノール362.5μlを加え混合した後、4℃、14,000rpm、20分間遠心分離する。遠心分離後、上清を捨て、DNAペレットを得る。その後、DNAペレットに80%エタノール0.5mlを添加し、4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨てる。DNAペレットに再度80%エタノール0.5mlを添加し、4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、次いで当該ペレットを乾燥させ、これをDEPC処理滅菌蒸留水12μlに溶解することにより、cDNA溶液を得る。一方、正常組織から調製した total RNAについても、上記と同様の操作を行うことによりcDNA溶液を調製する。
【００３２】
（３）ラベル化cRNAの調製
肝臓腫瘍性病変組織由来のcDNA及び正常組織由来のcDNAそれぞれを用いて、それぞれラベル化cRNAを調製する。即ち、上記（２）で得られたcDNA溶液5μl、DEPC処理滅菌蒸留水17μl、BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit(ENZO社製)に含まれる10×HY Reaction Buffer 4μl、当該キットに含まれる10×Biotin Labeled Ribonucleotides 4μl、当該キットに含まれる10×DTT 4μl、当該キットに含まれる10×RNase Inhibitor Mix 4μl及び当該キットに含まれる20×T7 RNA Polymerase 2μlを混合し、37℃、5時間反応させる。当該反応液にDEPC処理滅菌蒸留水60μlを加えたのち、上記（１）に記載された RNeasy Mini Kitを用いてラベル化cRNAの精製を行う。
【００３３】
（４）ラベル化cRNAのフラグメント化
精製されたラベル化cRNA 20μg、5×Fragmentation Buffer（200mMトリス−酢酸 pH8.1(Sigma社製)、 500mM酢酸カリウム(Sigma社製)及び150mM酢酸マグネシウム(Sigma社製)）8μlを含む反応液40μlを、94℃、35分間加熱した後、氷冷し、フラグメント化cRNA溶液を得る。
【００３４】
（５）フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ
肝臓腫瘍性病変組織由来のフラグメント化cRNA及び正常組織由来のフラグメント化cRNAそれぞれを、以下のようにしてそれぞれプローブアレイとハイブリダイズさせる。即ち、上記（４）で得られたフラグメント化cRNA溶液 40μl、5nM Contol Oligo B2 （Amersham社製）4μl、100×Control cRNA Cocktail 4μl、Herring sperm DNA （Promega社製）40μg、Acetylated BSA（Gibco-BRL社製）200μg、2×MES Hybridization Buffer(200mM MES、2M [Na+], 40mM EDTA、0.02％ Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7) 200μl及びDEPC処理滅菌蒸留水144μlを混合し、400μlのハイブリカクテルを得る。得られたハイブリカクテルを99℃、5分間加熱し、更に45℃、5分間加熱する。加熱後、室温、14,000rpm、5分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得る。
1×MESハイブリダイゼーションバッファーで満たしたラットゲノムU34プローブアレイ（Affymetrix社製）を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpm、10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーションバッファーを除去する。その後、当該プローブアレイに該ハイブリカクテル上清200μlを添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60rpm、16時間回転させ、ハイブリダイズ済みプローブアレイを得る。
【００３５】
（６）プローブアレイの染色
上記（５）で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイからハイブリカクテルを除去し、Non-Stringent Wash Buffer［6×SSPE(20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈)、0.01％ Tween20を含む］で満たす。GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置に前記プローブアレイを装着し、プロトコールに従って前記プローブアレイを洗浄した後、MicroArray Suite(Affymetrix社)の染色プロトコールEuKGE-WS2に従って以下の方法により前記プローブアレイを染色する。まず１次染色液［10μg/ml Streptavidin Phycoerythrin (SAPE)(Molecular Probe社製)、2mg/ml Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl(Ambion社製)、0.05％Tween20を含む］に45分間浸漬する。次いで、2次染色液［100μg/ml Goat IgG (Sigma社製)、3μg/ml Biotinylated Anti-Streptavidinantibody (Vector Laboratories社製)、2mg/ml Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl、0.05％ Tween20、及び0.005％ Antifoam0-30を含む］に10分間浸漬し、最後に１次染色液に45分間浸漬する。
【００３６】
（７）プローブアレイのスキャン、解析
上記（６）で染色した肝臓腫瘍性病変組織由来のプローブアレイ及び正常組織由来のプローブアレイそれぞれを、HP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、シグナルを570nmの蛍光輝度を測定することによって読み取る。得られた結果をGeneChip Microarray Suite(Affymetrix社製)によって比較解析し、正常組織と肝臓腫瘍性病変組織間で発現レベルが異なる遺伝子を抽出した。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子は、上記の肝臓腫瘍性病変組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルが、正常組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルの２倍以上であった。
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
【００３７】
実施例２ （プローブアレイを用いた肝臓腫瘍性病変組織の検定）
無処置ラットの病理組織学的に正常な肝臓試料を含む、異なる２つ以上の肝臓試料から実施例１（１）と同様の操作によってtotal RNAを調製した後、実施例１（２）〜（４）と同様の操作によって無処置ラットの正常肝臓試料由来のフラグメント化cRNA及び被験肝臓試料由来のフラグメント化cRNAを調製する。次に、実施例１（５）と同様の操作によって無処置ラットの正常肝臓試料由来のフラグメント化cRNA及び被験肝臓試料由来のフラグメント化cRNAを、本遺伝子の塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが固定されたプローブアレイにハイブリダイズした後、染色する。得られた染色済みのプローブアレイをHP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、シグナルを570nmの蛍光輝度を測定することによって読み取り、得られた結果をGeneChip Microarray Suite (Affymetrix社製)によって比較解析する。登録番号群１に示された登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルを無処置ラットの正常肝臓試料と比較し、その差異に基づいて被験肝臓試料における肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞を検出する。即ち、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの被験肝臓試料における発現レベルの測定値が、無処置ラット正常肝臓試料における当該遺伝子の発現レベルの２倍以上であれば、前記被験生検試料中に肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞が存在すると評価する。
【００３８】
実施例３ （定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた肝臓腫瘍性病変の検定）
無処置ラットの病理組織学的に正常な肝臓試料を含む、異なる２つ以上の肝臓試料から実施例１（１）と同様の操作によってtotal RNAを調製した後、実施例１（２）と同様の操作によって無処置ラット正常肝臓試料由来のcDNA及び被験肝臓試料由来のcDNAを調製する。次に、調製されたcDNAを鋳型として、以下のようにしてPCRを行い、増幅されたDNAを定量する。即ち、当該cDNA 1μl、配列番号１〜５のいずれかの塩基配列の一部分を有するDNAをプライマー１ 20pmol、当該プライマー１にPCRのための対となりうる塩基配列を有するDNAをプライマー２ 20pmol、及びSYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃ 2分間次いで95℃ 10分間保温した後、95℃ 15秒次いで60℃ 1分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの量から、被験肝臓試料での本遺伝子の発現量レベルと無処置ラット正常肝臓試料での本遺伝子の発現レベルを求める。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの被験肝臓試料における発現レベルの測定値が、無処置ラット正常肝臓試料における当該遺伝子の発現レベルの２倍以上であれば、前記被験肝臓試料中に肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞が存在すると評価する。
【００３９】
実施例４ （プローブアレイを用いた肝発癌活性検定方法）
（１）哺乳動物への被験物質の投与
例えば、以下に記載される二段階発癌モデルを用いることができる。
具体的には、被験物質が変異原性物質の場合には、雄F344系ラット（投与開始時６週齢）に、被験物質として、例えば、Ｎ-ジエチルニトロサミン（以下、DENと記す）100mg/kg・体重を1回/週の割合で2週間腹腔内投与し、対照として被験物質の溶媒、例えば、生理食塩水を投与した群をさらに設けた。被験物質が非変異原性の場合には、同じ雄F344系ラットにDEN 100mg/kg・体重を1回/週の割合で2週間腹腔内投与した後、翌週から被験物質として、例えば、クロフィブレート3000ppmやＷＹ-14,643 1000ppmを混餌投与した群をそれぞれ設け、対照として基礎飼料のみを混餌投与した群をさらに設けた。試験開始後、非被験物質投与群には肝臓腫瘍性病変の発生しない時期、例えば、被験物質が変異原性物質の場合には26週目又は36週目に、被験物質が非変異原性物質の場合には26週目に各群動物の肝臓を採取した。
【００４０】
（２）遺伝子の発現解析
被験物質投与群由来動物の肝臓組織及び非被験物質投与群動物由来の肝臓組織それぞれから、動物個体毎に実施例１（１）と同様の操作によってtotal RNAを調製した後、実施例１（２）〜（４）と同様の操作によって被験物質投与群及び非被験物質投与群の各動物毎のそれぞれの肝臓組織由来のフラグメント化cRNAを調製する。次に、実施例１（５）と同様の操作によって被験物質投与群及び非被験物質投与群の各動物毎のそれぞれの肝臓組織由来のフラグメント化cRNAを、本遺伝子の塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが固定されたプローブアレイにハイブリダイズした後、染色する。得られた被験物質投与群及び非被験物質投与群の各動物毎のそれぞれのプローブアレイをHP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、シグナルを570nmの蛍光輝度を測定することによって読み取り、得られた結果をGeneChip Microarray Suite (Affymetrix社製)によって比較解析する。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの、被験物質投与群動物の肝組織における発現レベルが、非被験物質投与群動物の肝組織の発現レベルの２倍以上であれば、その肝組織由来の動物は肝臓腫瘍性病変を有していると判定でき、被験物質投与群における肝臓腫瘍性病変を有している動物数が非被験物質投与群に比較して適当な統計学的解析を実施することで有意に多ければ、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【００４１】
実施例５ （定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた肝発癌活性検定方法）
（１）哺乳動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて動物個体毎に肝臓組織を採取する。
【００４２】
（２）遺伝子の発現解析
被験物質投与群動物由来の肝臓組織及び非被験物質投与群動物由来の肝臓組織それぞれから、実施例１（１）と同様の操作によってtotal RNAを調製した後、実施例１（２）と同様の操作によって被験物質投与群及び非基礎飼料投与群動物それぞれの肝臓組織由来のcDNAを調製する。次に、調製されたcDNAを鋳型として、以下のようにしてPCRを行って増幅されたDNAを定量する。即ち、当該cDNA 1μl、配列番号１〜５のいずれかの塩基配列の一部を有するDNAをプライマー１ 20pmol、当該プライマー１にPCRのための対となりうる塩基配列を有するDNAをプライマー２ 20pmol及びSYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃ 2分間次いで95℃ 10分間保温した後、95℃ 15秒次いで60℃ 1分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの量から、被験物質投与群動物由来の肝臓組織における本遺伝子の発現レベル及び非被験物質投与群動物由来の肝臓組織における本遺伝子の発現レベルそれぞれを求める。被験物質投与群動物由来の肝臓組織における発現レベルが、非被験物質投与群動物由来の肝臓の発現レベルの２倍以上であれば、その肝臓組織由来の動物は肝臓腫瘍性病変を有していると判定でき、被験物質投与群における肝臓腫瘍性病変を有している動物数が非被験物質投与群に比較して適当な統計学的解析を実施することで有意に多ければ、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【００４３】
実施例６ （インサイチューハイブリダイゼーションを用いた肝発癌活性検定方法）
（１）哺乳動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて肝臓組織を採取する。但し、肝臓はそのまま
又は、例えば、4％パラホルムアルデヒド（pH7.2〜7.4）で固定（灌流してもよい）後に採取する。
【００４４】
（２）肝臓組織の固定、包埋及び薄切切片の作製
採取した肝臓を固定する場合には、例えば、4％パラホルムアルデヒド（pH7.2〜
7.4）で4℃、一晩固定する。固定後、被験物質投与群動物由来の肝臓組織及び非被験物質投与群動物由来の肝臓組織それぞれをアルコール脱水し、パラフィンに包埋した後、ミクロスライサーを用いて2〜10μmの厚さで薄切し、これをスライドグラスに載せる。
【００４５】
（３）cDNAの調製
登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子を発現している組織（肝臓組織）から実施例１（１）と同様の操作にてtotal RNAを1μg/μlになるように調製する。次に目的遺伝子（例えば、NM_175707）の約1kbpを選定し、当該塩基配列を有するＤＮＡをPCRで増やすためのプライマーの合成を行う。プライマーは、そのsense primerの5'末端にT3プロモーター配列（aat taa ccc tca cta aag gga ac）を、antisense primerの5'末端にT7プロモーター配列（gta ata cga ctc act ata ggg ag）を付加したものとし、合成は遺伝子工学的手法にて用いられる通常の方法により合成する。RT-PCRには、ThermoScript RT-PCR System (Gibco社)及びPLATIUM taq DNA Polymerase High fidelity (Gibco社)の各キットを用いる。まず、Antisenseのプライマー20pmol、total RNA 1μl、当該キット内のH20を混じ、65℃、5分間保温し、その後、氷上で冷却する。次いで、5×DNA Synthesis Buffer 4μl、0.1M DTT 1μl、RNase OUT 1μl、滅菌水1μl、10mM dNTP Mix 2μl、ThermoScript RT 1μlを加え、65℃で1時間保温した後、85℃で5分間加温し、ThermoScript RTを失活させる。これを氷上で冷却した後、1μlのRNase H (Gibco社)を加え、37℃で20分間反応させることでcDNAを作製する。作製したcDNA 5μlに、sense primer 20pmol、×10 High Fidelity PCR Buffer 5μl、50mM MgSO 2μl、10mM dNTPmix 1μl、PLATINUM taq DNA Polymerase Hight Fidelity 0.2μl、滅菌水34.8μlを加え、94℃で2分間加温した後、94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分間を１サイクルとして40サイクル実施し、最後に68℃で5分間反応を行う。このPCR反応液を1％アガロースゲル電気泳動に供し、目的PCR産物をゲルから切り出した後、等量のイソプロパノールと混じ、当該キット内のカラムに供して、2分間遠心分離する。遠心後、カラムに新しいチューブを繋ぎ、当該キット内のEB buffer 50μlをカラムに供して遠心分離し、目的DNA産物を得る。
【００４６】
（４）ラベル化cRNAの調製
実施例６（３）で合成されたcDNAを鋳型とし、T3 polymerase又はT7 polymeraseを用いてcRNAプローブ（FITC標識）を合成する。具体的には、cDNA 0.2〜1μlに×10 transcription buffer(DTT+)（宝酒造）2μl、×10 FITC-laveling mix (ベーリンガマンハイム) 2μl、RNase inhibitor（ニッポンジーン）1μlを加え、さらにH2Oを加えて総量を18μlにする。そこにsense probeを合成する場合には2μlのT3 polymerase(宝酒造) 、anti-sense probeを合成する場合には2μlのT7 polymerase(宝酒造)をそれぞれ加え、37℃で3〜5時間保温する。次いで、1μlのRNase freeのDNase I（ベーリンガマンハイム社）を加え、さらに20分間保温する。合成されたcRNAはエタノール沈澱させ、得られたペレットを60℃に加温した100μLの 40mM NaHCO3, 60mM Na2CO3 (pH10.2)に溶解する。その後、アルカリ分解により約150bの断片になるように、次の計算式から得られた時間、60℃で保温する。加温時間(分) = (cDNA長(kb)-加水分解後の平均断片長(kb))/(0.11×cDNA長(kb)×加水分解後の平均断片長(kb))。反応後、氷上で冷却し、１μlの酢酸を加える。更に、10分の1量の4M LiClを添加し、15000rpmで10分間遠心分離し、上清を棄てる。500μlのエタノールを加えてペレットを洗浄した後、TE buffer 20μl、0.1M DTT 2μl、RNase inhibitor 1μlを加え溶解する。
【００４７】
（５）ハイブリダイゼーション
実施例６（２）で作製したスライド標本を室温で脱パラフィンし、再水和する。次に、前処理として1×Target Retrieve Solution (DAKO)を加え、オートクレーブにより121℃で20分間加温する。60℃まで温度が下がった後にこれを取り出し、室温に20分間放置することで更に冷却する。冷却後、室温でDEPC処理滅菌水に2分×2回、3％過酸化水素水/DEPC処理滅菌水に30分間、DEPC処理滅菌水に2分×3回、90％エタノール/DEPC処理滅菌水に3分間、100％エタノールに3分間浸漬した後、風乾する。実施例６（４）で調製したcRNAプローブをhybridization buffer（組成：40％ホルムアミド(ニッポンジーン), 4×SCC (pH5.0)(Gibco), 1 mM EDTA, 1×Denhardet's(Nippon gene)，250μg/ml yeast tRNA (Gibco),125μg/ml サケ精子DNA (Gibco), 10％dextran sulfateで0.1〜0.3μg/ml/kbとなるように希釈し、切片上で滴下し、EasiSeal（HYBAID社）を用いて封入する。封入したスライドグラスを湿潤箱に並べ、60℃で5時間以上保温する。その後、スライドグラスを65℃に保温した5×SSC (pH5.0)中に浸し、65℃に加温した洗浄液Ａ（組成：2×SSC［pH5.0］, 1％SDS）に30分間×2回浸漬し、室温の洗浄液Ｂ（組成：10 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5M NaCl, 0.1％ Tween 20）に5分間×3回浸漬した後、37℃に加温した洗浄液Ｂに20μg/ml RNase A (SIGMA)を加えたものに20分間浸漬する。その後、65℃に加温した洗浄液Ｃ（組成：2×SSC［pH5.0］, 50％ ホルムアミド［和光］）で30分間×2回、室温のTBS buffer（組成：50 mM Tris-HCl ［pH7.5］, 150mM NaCl）で3分間×3回洗浄を行う。洗浄後、切片周囲の過剰な溶液を拭き取り、組織周囲をPAP PEN（大道産業株式会社）で囲んだ後、FITC標識プローブ検出キット（DAKO）に含まれるアルカリフォスファターゼ標識抗FITC抗体を1％Bovine serum albumin/TBSで希釈したものを、切片上に滴下し、湿潤箱中に37℃で60分間放置する。反応後、室温のTBST（組成：TBS + 0.1% Tween 20）に5分間×3回、室温のTBSに2〜3分浸漬する。切片周囲の過剰な溶液を拭き取り、AP基質溶液（DAKO、BCIP/NBT発色基質溶液）を滴下し、湿潤箱中に37℃で60分〜2日間放置する。その後、流水中で発色液を洗い流し、透徹、封入する。
【００４８】
（６）遺伝子の発現を指標とした肝発癌活性解析
本遺伝子の転写物量を指標とする肝臓腫瘍性病変の有無は、肝臓薄切切片上で蛍光活性が周囲の肝臓正常組織に比較して２倍以上の細胞巣の有無により評価される。従って、被験物質投与群動物由来の肝臓薄切切片及び非被験物質投与群動物由来の肝臓薄切切片上において上記記載の蛍光活性の低い領域が認められた場合、その肝臓組織薄切切片由来の動物は肝臓腫瘍性病変を有していると判定でき、被験物質投与群において肝臓腫瘍性病変を有している動物数が非被験物質投与群に比較して適当な統計学的解析を実施することで有意に多ければ、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【００４９】
実施例７ （免疫組織化学的検査を用いた肝発癌活性検定方法）
（１）哺乳動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて肝臓組織を採取する。
【００５０】
（２）組織の固定、包埋、及び切片の作製
採取した肝臓から組織を適度な大きさに切り出した後、OCTコンパウンドにこれを包埋し、液体窒素にて冷却したイソペンタン中で凍結させる。これを-20℃に冷却したクリオスタット中で約5μmの厚さに薄切し、スライドグラスに載せ、乾燥させる。
【００５１】
（３）薄切切片の免疫組織化学的染色
上記（２）で作製した薄切切片を70％エタノールで1分間固定した後、PBS buffer（組成：10 mM リン酸ナトリウム ［pH7.4］, 100mM NaCl）で洗浄してOCTコンパウンドを落とし、0.3％過酸化水素水で5分間処理する。PBS bufferで5分間×3回洗浄し、正常血清で室温20分間処理する。次いで、PBS bufferで適度に希釈した登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子の翻訳産物に対する抗体（以下、一次抗体）で室温60分間処理する。反応後、PBS bufferで5分間×3回洗浄し、PBS bufferで適度に希釈した一次抗体と同じ免疫動物のVECTASTAIN/ABC試薬（フナコシ）で室温30分間処理する。更に、PBS bufferで5分間×3回洗浄した後、3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩（ナカライ）を用いて発色させる。その後、蒸留水で洗浄し、脱水、透徹、封入を行う。
【００５２】
（４）遺伝子翻訳産物の発現を指標とした肝発癌活性解析
本遺伝子の転写翻訳産物量を指標とする肝臓腫瘍性病変の有無は、肝臓薄切切片上での染色強度が周囲の肝臓正常組織に比較して２倍以上の細胞巣の有無により評価され、染色強度は、例えば、画像解析装置IPAP（住化テクノサービス（株））を用いて測定することができる。従って、被験物質投与群動物由来の肝臓薄切切片及び非被験物質投与群動物由来の肝臓薄切切片上において上記記載の染色強度の低い領域が認められた場合、その肝臓組織薄切切片由来の動物は肝臓腫瘍性病変を有していると判定でき、被験物質投与群における肝臓腫瘍性病変を有している動物数が非被験物質投与群に比較して適当な統計学的解析を実施することで有意に多ければ、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によって、遺伝子の発現レベルの異常を指標とした哺乳動物の肝臓腫瘍性病変の検定方法等が提供可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）検体における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法。
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
【請求項２】
検体が、肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
第二工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であることを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する工程であることを特徴とする請求項１，２、３又は４記載の方法。
【請求項６】
物質の肝発癌活性の検定方法であって、
（１）肝細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた前記肝細胞における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法。
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
【請求項７】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量の測定によりなされることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
第三工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であることを指標とし、前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価することを特徴とする請求項６、７又は８記載の方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載される方法により評価された肝発癌活性の有無又はその量に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする肝発癌物質の探索方法。
【請求項１】
哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）検体における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法。
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
【請求項２】
検体が、肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
第二工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であることを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する工程であることを特徴とする請求項１，２、３又は４記載の方法。
【請求項６】
物質の肝発癌活性の検定方法であって、
（１）肝細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた前記肝細胞における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法。
＜登録番号群１＞
AA892298、A892680、NM_175707、BC087645、AF315802
【請求項７】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量の測定によりなされることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
第三工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値の２倍以上であることを指標とし、前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価することを特徴とする請求項６、７又は８記載の方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載される方法により評価された肝発癌活性の有無又はその量に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする肝発癌物質の探索方法。
【公開番号】特開２００８−２２０１７８（Ｐ２００８−２２０１７８Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５８３０８（Ｐ２００７−５８３０８）
【出願日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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