哺乳動物由来のグルコーストランスポーターの発現のための、サッカロミセス・セレビジエＥｒｇ４突然変異体の使用
本発明は、ヒトＧＬＵＴ４トランスポーターまたはヒトＧＬＵＴ１トランスポーターが機能的に発現される酵母株に関し、特に、酵母株で特に容易に機能的に発現させることができるＧＬＵＴ４輸送タンパク質に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＧｌｕｔ４およびＧｌｕｔ１トランスポーターを機能的に発現させることができる酵母株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの異所性細胞は、特別なトランスポータータンパク質を介してグルコースを細胞内部へ輸送する。様々な生物が、グルコース輸送に介在する様々なメカニズムを構築しており、例えば、特にプロトン共輸送系、Ｎａ+グルコーストランスポーター、結合タンパク質依存性系、ホスホトランスフェラーゼ系、および、促進拡散のための系がある。真核生物において、哺乳動物でＧＬＵＴ遺伝子（ＧＬＵＴ＝グルコーストランスポーター）によってコードされたグルコーストランスポーターのファミリーと、サッカロミセス・セレビジエでＨＸＴ遺伝子（ＨＸＴ＝ヘキソーストランスポーター）によってコードされたグルコーストランスポーターのファミリーは、促進拡散によってグルコース摂取に介在する。前記トランスポーターは、糖トランスポーターのより大きいファミリーに属する。これらは、１２回膜貫通へリックスの存在と、複数の保存されたアミノ酸基を特徴とする。グルコース輸送は、例えば糖尿病またはファンコーニ−ビッケル症候群のような不完全なグルコースホメオスタシスに関連する疾患において重要な役割を果たす。それゆえに、哺乳動物におけるグルコース輸送が多数の研究における目的とされてきた。これまで、１３種のグルコーストランスポーター様タンパク質が同定されている（ＧＬＵＴ１〜ＧＬＵＴ１２，ＨＭＩＴ−Ｈ−ｍｙｏ−イノシトールトランスポーター）。前記トランスポーターは、様々な組織へのグルコース摂取、グルコースの肝臓での貯蔵、筋肉細胞と脂肪細胞へのグルコースのインスリン依存性の摂取、および、膵臓のβ細胞によるグルコース測定など主要な役割を果たす。ＧＬＵＴ１は、赤血球へのグルコース輸送や、血液脳関門を通過するグルコース輸送に介在するが、その他多くの組織でも発現されており、一方、ＧＬＵＴ４は、インスリン依存性の組織（主として筋肉および脂肪組織）に限定される。前記インスリン依存性の組織において、細胞内区画または細胞質膜区画を通過するＧＬＵＴ４トランスポーターの標的化を制御することは、グルコース摂取調節に重要なメカニズムの代表である。インスリンの存在下で、細胞内のＧＬＵＴ４は、グルコース摂取を促進するために細胞質膜を通過して再分配される。同様に、前記インスリン依存性の組織でＧＬＵＴ１が発現され、同様に、その細胞における分配は、強くはないが、インスリンによって影響を受ける。加えて、ＧＬＵＴ１またはＧＬＵＴ４が糖輸送を触媒する相対的な有効性は、各トランスポーターの細胞表面への標的化の程度によってだけでなく、それらの動力学的特性によっても決定される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
異なるグルコーストランスポーターアイソフォームが共発現されることと、グルコース代謝が迅速なことにより、これらインスリン依存性の組織における各グルコーストランスポーターアイソフォームの役割および正確な特性に関する研究は複雑であった。これらの問題を解決するために、アフリカツメガエルの卵母細胞、組織培養細胞、昆虫細胞および酵母細胞のような異種発現系が用いられてきた。しかしながら、多数の困難がこれらの系に関連している可能性が明らかになり、すなわち、異種発現されるトランスポーターの活性が弱すぎること、前記系における内因性のグルコーストランスポーター、トランスポーターが相当な比率で細胞内に保持されること、または、不活性なトランスポーターの生産である。
【０００４】
天然に存在する哺乳動物のＧＬＵＴ４タンパク質、特にヒトのＧＬＵＴ４タンパク質は、サッカロミセス・セレビジエ株において、特定の条件下で機能的に発現可能である。
【０００５】
酵母細胞は、単細胞の真核生物である。それゆえに、これらは、特に医薬活性を有する物質を同定するためにスクリーニング分析を実行することに関して、数種のタンパク質に関して細菌系より発現に適している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、精製および単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０００７】
前記タンパク質は、ヒトＧＬＵＴ４タンパク質のアミノ酸鎖８５位に、バリンからメチオニンへのアミノ酸置換を含む。この改変されたＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質は、機能的なＧＬＵＴ４タンパク質を発現するための別手段を提供する。グルコーストランスポーターが全体として不活性であるサッカロミセス・セレビジエ株（＝ｈｘｔ（−））で、前記ＧＬＵＴ４タンパク質の発現の後、グルコース摂取が観察され得る場合、ＧＬＵＴ４タンパク質は、サッカロミセス・セレビジエに関して機能的とみなされる。グルコース摂取は、放射標識したグルコースによる輸送の測定、または、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地での成長のいずれかによって決定することができる。
【０００８】
好ましい実施形態において、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを生じるＤＮＡ配列を含む精製および単離されたポリヌクレオチドは、以下の群の配列を含むか、またはそれらからなるものが可能である：
ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズし、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍをコードするヌクレオチド配列。
【０００９】
好ましくは、前記精製および単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードする。
【００１０】
上述したようにタンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含む精製および単離されたポリヌクレオチドは、使用可能にプロモーターに連結されていてよい。適切なプロモーターは、特に、原核性または真核性のプロモーターであり、例えば、Ｌａｃ−、ｔｒｐ−、ＡＤＨ−またはＨＸＴ７プロモーターである。細菌または真核生物が、ベクターの補助で前記プロモーターによりタンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍに翻訳され得るｍＲＮＡを生産する場合、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍをコードするポリヌクレオチドの一部は正確に使用可能にプロモーターに連結している。このようなベクターの例は、ベクターｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ（配列番号３）である。タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍは、酵母細胞で前記ベクターによって発現可能である。
【００１１】
好ましい実施形態において、上述のタンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、酵母細胞で前記ポリヌクレオチドを複製すること、または、酵母細胞でタンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍをコードするポリヌクレオチドの一部を発現し、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを生産することに適している。サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞が特に適切である。酵母細胞における複製および発現に関して、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを生じるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、酵母ベクターの形態で存在する。ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチド領域は、使用可能に酵母細胞特異的プロモーターに連結していてよく、このようなプロモーターとしては、例えば、ＡＤＨプロモーター（アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター）、または、ＨＸＴ７プロモーター（ヘキソース−トランスポータープロモーター）が挙げられる。酵母の分野は、酵母でのＤＮＡクローニングのために開発されたベクター群である。
【００１２】
その上、本発明は、全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており（＝ｈｘｔ（−））、機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まないサッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞に関する。このような酵母細胞は、好ましくは、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，マシェローダーヴェグ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ）１６，３８１２４，ブラウンシュヴィック，ドイツ）にサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８７として寄託された酵母細胞である。
【００１３】
本発明はまた、全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており、機能的なＦｇｙ１と機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まない酵母細胞に関する。Ｅｒｇ４タンパク質またはＦｇｙ１タンパク質の欠損は、特に、対応するコーディングゲノム部分の断絶、または、前記コーディングゲノム部分の部分的または完全な除去によるものがあり得る。
【００１４】
好ましくは、機能的なグルコーストランスポーター、機能的なＦｇｙ１タンパク質および機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まない酵母細胞として、ＤＳＭＺにサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８４として寄託された酵母細胞を用いることである。
【００１５】
上述の酵母細胞は、好ましくは、哺乳動物のＧＬＵＴ１タンパク質または哺乳動物のＧＬＵＴ４タンパク質、特に、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ウシまたは霊長類由来のタンパク質を発現するために用いられる。好ましい実施形態では、ヒトＧＬＵＴ４またはＧＬＵＴ１タンパク質を発現するための酵母細胞が用いられる。
【００１６】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっているサッカロミセス・セレビジエ酵母細胞は、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含む本発明のポリヌクレオチドを含んでもよい。前記酵母細胞はまた、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現し、従って前記タンパク質を含む。
【００１７】
ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含むこの種の酵母株は、好ましくは、ＤＭＳＺに寄託されたサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８５酵母株である。
【００１８】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっており、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを生じるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を、例えば、以下のように製造してもよい：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
ｂ）ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
ｃ）ａ）からの酵母細胞をｂ）からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択すること、
ｅ）必要に応じて、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現すること。
【００１９】
ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドは、好ましくは、酵母細胞で複製することができ、前記ＤＮＡ配列がクローニングされたベクターである。このようなベクターの例は、ｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ（配列番号３）である。
【００２０】
本発明はまた、グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、Ｆｇｙ１およびＥｒｇ４に関するタンパク質が機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞に関する。前記酵母細胞はまた、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現し、従って、前記タンパク質を含む。この種の酵母株は、好ましくは、ＤＳＭＺに寄託されたサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８６である。
【００２１】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにタンパク質Ｆｇｙ１およびＥｒｇ４も機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を、例えば、以下のように製造してもよい：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにタンパク質Ｆｇｙ１およびＥｒｇ４も機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
ｂ）ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
ｃ）ａ）からの酵母細胞をｂ）からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択すること、
ｅ）必要に応じて、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現すること。
【００２２】
ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製された上述のポリヌクレオチドは、好ましくは、酵母細胞で複製することができ、前記ＤＮＡ配列がクローニングされているベクターである。このようなベクターの例は、ｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ（配列番号３）である。
【００２３】
本発明はまた、グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を生じるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞に関する。
【００２４】
前記酵母細胞はまた、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現し、従って前記タンパク質を含む。好ましいこの種の酵母株は、ＤＳＭＺに寄託されたサッカロミセス・セレビジエ１５１８８酵母株である。
【００２５】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を、例えば、以下のように製造してもよい：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
ｂ）ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
ｃ）ａ）からの酵母細胞をｂ）からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択すること、
ｅ）必要に応じて、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現すること。
【００２６】
ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドは、好ましくは、酵母細胞で複製することができ、前記ＤＮＡ配列がクローニングされているベクターである。このようなベクターの例は、ｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ（配列番号３）である。
【００２７】
本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。前記タンパク質は、アミノ酸鎖８５位でバリンがメチオニンに置換されたヒトＧＬＵＴ４タンパク質である。
【００２８】
本発明はまた、ＧＬＵＴ４タンパク質の活性を刺激する化合物を同定する方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっており、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触させたａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物が前記ＧＬＵＴ４タンパク質の活性を刺激することとを関連付ける工程。ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質の活性を刺激する化合物は、ＧＬＵＴ４活性も刺激すると考えられる。
【００２９】
本発明はまた、上述の方法によって同定された化合物、並びにさらに、医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬に関する。その上、本発明は、Ｉおよび／またはII型糖尿病の治療のための医薬を製造するための上述の方法によって同定された化合物の使用に関する。
【００３０】
本発明はまた、上述の方法によって同定された化合物、並びに、医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬に関する。その上、本発明は、糖尿病を治療するための医薬を製造するための、上述の方法によって同定された化合物の使用に関する。
【００３１】
その上、本発明は、糖尿病を治療するための医薬を製造するための、上述の方法によって同定された化合物の使用に関する。
【００３２】
本発明はまた、Ｅｒｇ４遺伝子によってコードされるタンパク質を阻害する化合物を同定する方法も含み、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、酵母細胞で複製することができるポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Ｅｒｇ４の活性を刺激することとを関連付ける工程。
【００３３】
その上、本発明は、Ｆｇｙ１遺伝子に対応するタンパク質を阻害する化合物を同定する方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４タンパク質を含む酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Ｆｇｙ１の活性を刺激することとを関連付ける工程。
【００３４】
本発明はまた、上述の方法によって同定された化合物、並びに、医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬に関する。
【００３５】
以下で、本発明を技術的な詳細に関してより詳細に説明する。
【００３６】
ハイブリダイゼーションは、相補的な塩基配列を有する２つの一本鎖核酸が二本鎖にアセンブルすることを意味する。ハイブリダイゼーションは、２つのＤＮＡ鎖間、１つのＤＮＡと１つのＲＮＡ鎖間、および、２つのＲＮＡ鎖間で起こり得る。原則的に、関連する核酸は最初は二本鎮型であってよく、これを二次構造を持たない一本鎖分子に分解するまで加熱することによって、例えば水槽中で１０分間ボイルすることによってハイブリッド分子を製造することが可能である。続いて、それらをゆっくり冷却することができる。冷却段階の際に、相補鎖が対を形成し、二本鎖ハイブリッド分子が得られる。実験条件下で、ハイブリダイゼーションは通常、ハイブリダイゼーションフィルターを用いて実行され、そのフィルターに一本鎖または変性可能なポリヌクレオチド分子がブロッティングまたは電気泳動によってアプライされる。適切な相補ポリヌクレオチド分子を用いて、ハイブリダイズしようとする前記ポリヌクレオチド分子に放射活性の蛍光標識を与えることによって、ハイブリダイゼーションを可視化することが可能である。ストリンジェンシーは、特定の条件のマッチングまたはアライメントの程度を説明するものである。高ストリンジェンシーは、マッチングに対して低ストリンジェンシーよりも高い要求を有する。用途と目的に応じて、異なるストリンジェンシーを有する特定の条件は、核酸のハイブリダイゼーションに関して設定される。高ストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーションの反応条件は、極めてよくマッチする相補的な分子だけが他方とハイブリダイズできるように設定される。低ストリンジェンシーでは、分子は、対を形成しない塩基または誤って対を形成する塩基の比較的大きい断片と部分的にハイブリダイズすることもできる。
【００３７】
ハイブリダイゼーション条件は、特に、ハイブリダイゼーションが、２×ＳＳＣを含む水溶液中で、６８℃で少なくとも２時間行われ、続いて初めに２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで室温で５分間、次に１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで６８℃で１時間、次に０.２％ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで６８℃でさらに１時間洗浄される場合、ストリンジェントであると理解することができる。
【００３８】
２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣまたは０.２×ＳＳＣ溶液は、２０×ＳＳＣ溶液を適切に希釈することによって製造される。２０×ＳＳＣ溶液は、３モル／ｌのＮａＣｌ、および、０.３モル／ｌのクエン酸Ｎａを含む。ｐＨは７.０である。当業者であれば、ストリンジェントな条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション方法に精通している。適切な指示は、専門書に見出すことができ、例えば、特にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）；編集者：Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒｏｇｅｒ Ｂｒａｎｔ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ；ＩＳＢＮ：０−４７１−５０３３８−Ｘ）である。
【００３９】
酵母ベクターは、様々なサブグループに分類することができる。Ｙｌｐベクター（酵母の組込み型プラスミド）は、実質的に細菌でクローニングに用いられるベクターに相当す
るが、選択可能な酵母遺伝子（例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２）を含む。前記ベクター導入後に外来ＤＮＡが酵母染色体に組込まれた場合のみ、これら配列は染色体と共に複製され、クローンの形成を伴って、安定して全ての娘細胞にトランスファーされる。
【００４０】
この方法に基づき、真核性のＯＲＩ（複製開始点）によって自律的に複製できるプラスミドが得られている。このような酵母ベクターは、ＹＲｐベクター（酵母複製プラスミド）、または、ＡＲＳベクター（自律複製配列）という。その上、ＹＥｐベクター（酵母エピゾーム性プラスミド）もあり、これは、酵母２μｍプラスミドから得られ、選択的マーカー遺伝子を含む。ＹＡＣベクター（酵母人工染色体）のクラスは、独立した染色体のように行動する。
【００４１】
発現しようとする遺伝子を含む酵母ベクターは、前記遺伝子が発現できるように形質転換によって酵母に導入される。この目的に適した方法の例は、エレクトロポレーション、または、コンピテント細胞をベクターＤＮＡとインキュベートすることである。適切な酵母発現プロモーターは、当業者既知であり、例えば、ＳＯＤ１プロモーター（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＤＨプロモーター（アルコールデヒドロゲナーゼ）、酸性ホスファターゼに関する遺伝子のプロモーター、ＨＸＴ２プロモーター（グルコーストランスポーター２）、ＨＸＴ７プロモーター（グルコーストランスポーター７）、ＧＡＬ２プロモーター（ガラクトーストランスポーター）などである。酵母発現プロモーターと、発現しようとする遺伝子（例えばＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ）を含む構築物は、発現する目的のためには、酵母ベクターの一部である。発現を実行するために、前記酵母ベクターは、自己複製する小片であってもよく、これは、酵母ゲノムから独立しているか、または、安定して酵母ゲノムに組込まれていてもよい。適切な酵母ベクターは、原則的に、酵母で増殖可能なあらゆるポリヌクレオチド配列である。用いることができる酵母ベクターは、特に、酵母プラスミド、または、酵母人工染色体である。酵母ベクターは通常、複製起点（２μ，ａｒｓ）すなわち複製プロセスの開始点、および、通常、栄養要求性マーカーまたは抗生物質耐性遺伝子からなる選択マーカーを含む。当業者既知の酵母ベクターの例としては、ｐＢＭ２７２、ｐＣＳ１９、ｐＥＭＢＣＹｅ２３、ｐＦＬ２６、ｐＧ６、ｐＮＮ４１４、ｐＴＶ３、ｐ４２６ＭＥＴ２５、ｐ４Ｈ７などが挙げられる。
【００４２】
本発明に従って、細胞の選択とは、例えば、抗生物質に対する耐性、または、特定の最小培地で成長する能力のような選択マーカーによる細胞の特異的濃縮、さらに、それらの単離およびそれに続く寒天プレートでの培養または液中培養を意味する。
【００４３】
培養、形質転換および形質転換された酵母細胞の選択、さらに酵母細胞でのタンパク質発現は、当業者が一般的に用いる方法の範囲内である。前記方法に関する説明は、標準的な教本で見出すことができ、例えば、Ｗａｌｋｅｒ Ｇｒａｅｍｅ Ｍ．：Ｙｅａｓｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ワイリー＆サンズ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ），ＩＳＢＮ：０−４７１−９４４６−８、または、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，Ａｌｉｓｔａｉｒ Ｊ．Ｐ．Ｂｒｏｗｎ，Ｍｉｃｋ Ｆ．ＦｒｕｉｔｅおよびＪｏｈｎ Ｅ．Ｇ．Ｍｃ Ｃａｒｔｌｙ編；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ；ＩＳＢＮ：３−５４０−５６５２１−３、または、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７：Ａ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ；Ａｄａｍｓ Ａｌｉｓｏｎ（編）；コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＩＳＢＮ：０−８７９６９−５０８−０」で見出すことができる。
【００４４】
酵母サッカロミセス・セレビジエは、１７種の既知のヘキソーストランスポーターと、さらに３種の既知のマルトーストランスポーターを有しており、これらは、その発現が十
分に高い場合にヘキソースを前記酵母内に輸送することができる。１種の既知の株で、ヘキソース摂取に適した全てのトランスポーターを欠失によって除去した。前記株には、マルトース輸送タンパク質に相同な２つの遺伝子ＭＰＨ２およびＭＰＨ３だけが含まれる。２つの遺伝子ＭＰＨ２およびＭＰＨ３は、培地中にグルコースが存在する場合に抑制される。Ｗｉｅｃｚｏｒｋｅ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４６４，１２３〜１２８（１９９９年）では、この酵母株の製造と特徴付けが説明されている。前記株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質上では増殖できない。前記株から、対応するベクター（ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株）に起因する、ＧＬＵＴ１を機能的に発現する突然変異体を選択することが可能である。酵母株ｈｘｔ ｆｇｙ１−１が、酵母プロモーターの制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有するプラスミドベクターで形質転換される場合、ほんのわずかなグルコースしか輸送されない。機能的なＧＬＵＴ４発現は、ＧＬＵＴ４による顕著なグルコース輸送を可能にするために、この酵母株に対してさらなる調節を必要とする。このような、単一のグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４によって細胞がグルコースを摂取する酵母株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質で単離することができる。この目的のために、酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有する酵母ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株は、形質転換される。これらの、この方法で形質転換された酵母細胞を、唯一の炭素源としてグルコースを含む栄養培地に塗布し、そこでインキュベートする。例えば３０℃で２〜３日インキュベートした後、個々のコロニーの成長を観察する。これらコロニーの１つを単離する。前記コロニーから酵母プラスミドを除去すると、唯一の炭素源としてグルコースを含む栄養培地での増殖が妨害される。この、ベクタープラスミドをすでに含まない株が、再び酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有する酵母ベクターで形質転換されると、前記株は、再び唯一の炭素源としてグルコースを含む培地で増殖が可能になる。
【００４５】
上述の酵母株は、２００２年２月１４日のＤＥ１０１０６７１８.６の優先権を主張する、２００２年２月９日付で出願された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０１３７３の主題である。
【００４６】
ヘキソースのための固有のトランスポーター（グルコーストランスポーター）が全体として機能的ではなくなっている酵母株は、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０１３７３との関連において、これより先の日付に、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）に、ＤＳＭ１４０３５、ＤＳＭ１４０３６、または、ＤＳＭ１４０３７という番号ですでに寄託されている。
【００４７】
ＧＬＵＴ４のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、遺伝子バンクにおいて、例えば以下の登録で利用可能である：Ｍ２０７４７（ｃＤＮＡ；ヒト）、ＥＭＢＬ：Ｄ２８５６１（ｃＤＮＡ；ラット）、ＥＭＢＬ：Ｍ２３３８２（ｃＤＮＡ；マウス）、スイスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）：Ｐ１４６７２（タンパク質；ヒト）、スイスプロット：Ｐ１９３５７（タンパク質；ラット）、および、スイスプロット：Ｐ１４１４２（タンパク質；マウス）。
【００４８】
ＧＬＵＴ１のポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下に示されたデータベースのコード番号で開示されている：ＥＭＢＬ：Ｍ２０６５３（ｃＤＮＡ；ヒト）、ＥＭＢＬ：Ｍ１３９７９（ｃＤＮＡ；ラット）、ＥＭＢＬ：Ｍ２３３８４（ｃＤＮＡ；マウス）、スイスプロット：Ｐ１１１６６（タンパク質；ヒト）、スイスプロット：Ｐ１１１６７（タンパク質；ラット）、および、スイスプロット：Ｐ１７８０９（タンパク質；マウス）。
【００４９】
医薬は、ヒトや動物における病気または身体の機能不全の療法のための薬理学的な活性
物質の投薬形態である。経口療法のための投薬形態の例としては、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、液状抽出物、チンキ、および、シロップが挙げられる。外用塗布に用いられるものの例としては、エアロゾル、スプレー、ゲル、軟膏、または、粉末が挙げられる。注射用または不溶解性の溶液は、バイアル、ボトルまたは予め充填された注射器を用いて非経口投与を可能にする。これら、およびその他の医薬は、製薬技術分野の当業者に既知である。
【００５０】
医薬を製剤化するための賦形剤により、特定の用途に対して活性成分の作用の適用、分布および発達を最適化する目的を有する活性物質の製造が可能である。このような賦形剤の例としては、充填剤、結合剤、崩壊剤または滑剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、スターチ、リン酸二カルシウム、ポリグリコール、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、タルクまたは二酸化ケイ素が挙げられる。
【００５１】
糖尿病は、インスリン欠乏または減少したインスリン作用による慢性的な代謝条件が原因で、血中グルコース濃度の異常な増加（高血糖症）を伴い尿と共にグルコースが排出されるという兆候を示す。インスリン作用の欠損またはインスリン作用の減少により、血中に摂取されたグルコースの不十分な吸収と、細胞による転換が起こる。脂肪組織において、インスリン拮抗ホルモンは、遊離脂肪酸の血中濃度の増加を伴う脂肪分解の増加作用を有する。
【００５２】
脂肪症（肥満症）は、健康上のリスクを構成するカロリーの過剰摂取によるエネルギーの不均衡が原因の異常な体重増加である。
【００５３】
まさに上述したような提供された酵母株によって摂取されるヘキソースの量は、放射標識したグルコースを用いた摂取の研究によって決定することができる。この目的のために、特定の酵母細胞濃度を、例えば緩衝液１００μｌに、例えば１ｍｌあたり６０ｍｇ（湿重量）の濃度で懸濁し、唯一の炭素源として決められた量の14Ｃまたは3Ｈで標識したグルコースと混合する。この細胞をインキュベートし、それらの決められた量を特定の時間で取り出す。摂取されたグルコース量は、ＬＳＣ（液体シンチレーション計数）を用いて決定される。しかしながら、提供された酵母株によって、まさに上述したように摂取されたヘキソース量は、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地での成長を分析することによって決定してもよい。この目的のために、化合物添加の後に、株の成長速度は、例えば、規則的な間隔で６００ｎｍで培養の光学密度を測定し、この値をコントロール株（例えば酵母の野生株）の成長速度と比較することによって決定される。
【００５４】
化合物は、特に化学合成または生物からの化学物質の単離によって提供される。自動的な手法で化学合成を行うことも可能である。合成または単離によって得られた化合物は、適切な溶媒に溶解させることができる。適切な溶媒は、特に、例えばＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような有機溶媒を特定の比率で含む水溶液である。
【００５５】
上述した発明に従って化合物を同定するために、酵母株を化合物で処理することは、特に、そのために提供された自動化実験システムでなされる。このようなシステムは、特別に製造された凹部を有するチャンバー、またはマイクロタイタープレート、エッペンドルフチューブまたは実験用ガラス容器を含んでもよい。自動化された実験システムは通常、ハイスループット速度用に設計される。それゆえに、自動化された実験システムを用いて実行される上述したような方法はまた、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）ともいう。
【００５６】
配列番号１は、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質のコード領域を含むポリヌクレオチド配
列を開示している。配列番号２は、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質のアミノ酸配列を開示している。配列番号３は、ｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍベクターのポリヌクレオチド配列を開示している。
【実施例】
【００５７】
酵母株の使用
本発明に記載された全ての酵母株は、ＣＥＮ−ＰＫ２−１Ｃ株（ＭＡＴａ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｈｉｓ３−Δ１ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２）から得た。ヘキソーストランスポーター遺伝子（ＨＸＴ）が欠失した酵母株の製造は、Ｗｉｅｃｚｏｒｋｅ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４６４，１２３〜１２８（１９９９年）で説明されている：ＥＢＹ−１８ｇａ（ＭＡＴａ Δｈｘｔ１−１７ Δｇａｌ２ Δａｇｔ１ Δｓｔｌ１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｈｉｓ３−Δ１ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２）、ＥＢＹ．ＶＷ４０００（ＭＡＴａ Δｈｘｔ１−１７ Δｇａｌ２ Δａｇｔ１ Δｍｐｈ２ Δｍｐｈ３ Δｓｔｌ１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｈｉｓ３−Δ１ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２）。培地は、１％酵母抽出物、および、２％ペプトン（ＹＰ）に基づくが、最小培地は、０．６７％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）アミノ酸非含有酵母窒素ベース（ＹＮＢ）で構成されており、栄養要求性に必要な添加剤と様々な炭素源を含む。酵母細胞を、回転式振盪機または寒天プレートで、好気性条件下で３０℃で成長させた。細胞成長は、６００ｎｍで光学密度を測定することによって（ＯＤ600）、または、酵母コロニーの直径を測定することによってモニターした。
【００５８】
グルコース摂取の決定
グルコース輸送をＤ−［Ｕ−14Ｃ］−グルコース（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の摂取として測定し、動力学的パラメーターをイーディー−ホフステープロットから決定した。遠心分離で細胞を分離し、リン酸緩衝液で洗浄し、リン酸緩衝液に１ｍｌあたり６０ｍｇ（湿重量）の濃度に再懸濁した。グルコース摂取は、グルコース濃度で０.２〜１００ｍＭと決定され、基質の特異的活性は、０.１〜５５.５ｋＢｑ／μmol-1と決定された。細胞とグルコース溶液を３０℃で５分間プレインキュベートした。放射活性グルコースを細胞に添加することによってグルコース摂取を開始させた。５秒間インキュベートした後、氷冷したストップ緩衝液１０ｍｌ（０.１ＭのＫｉＰＯ4，ｐＨ６.５，５００ｍＭグルコース）を添加し、ガラス繊維フィルター（直径２４ｍｍ，ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ））でろ過によって細胞を即座に分離した。フィルターを即座に氷冷した緩衝液で３回洗浄し、取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。サイトカラシンＢによる添加（最終濃度２０μＭ，エタノールに溶解させる）を、阻害剤の存在下で、または、溶媒のみで１５分間細胞をインキュベートした後の、５０ｍＭまたは１００ｍＭの放射活性グルコースを用いた１５秒での摂取の分析で測定した。
【００５９】
哺乳動物細胞由来のグルコーストランスポーターの新規の異種発現系が開発されている。この系は、コード遺伝子を破壊することで全ての内因性のグルコーストランスポーターが除去されたサッカロミセス・セレビジエ株に基づく。前記株は、すでに細胞質膜を通過してグルコースを摂取できなくなっており、グルコースを唯一の炭素源としては成長できない。ヒトまたはその他の哺乳動物の異種性のグルコーストランスポーター、活性型のＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４を酵母の細胞質膜に統合するために、酵母株にさらなる突然変異を導入しなければならなかった。ＧＬＵＴ１は、ｆｇｙ１−１突然変異株においてのみ活性であり、ＧＬＵＴ４は、ｆｇｙ１−１ ｆｇｙ４−Ｘ二重突然変異体においてのみ活性である。
【００６０】
ＦＧＹ１遺伝子は、クローニングされている。それは、サッカロミセス・セレビジエＯＲＦ ＹＭＲ２１２ｃである。機能に関しては、Ｆｇｙ１またはＦｇｙ１によって生じた
産物のいずれかが、ヒトグルコーストランスポーターの活性を阻害すること、または、ＧＬＵＴ輸送小胞の細胞質膜への融合に関与することが結果で示されている。
【００６１】
ＧＬＵＴ１とは異なり、哺乳動物細胞と同様に、酵母中のＧＬＵＴ４タンパク質の大部分は細胞内構造に存在する。合計９種の劣性突然変異体が単離されており（ｆｇｙ４−１〜ｆｇｙ４−９）、それらにおいてＧＬＵＴ４は、さらに細胞質膜に向けられ、ｆｇｙ１−１突然変異が同時に起こる場合、活性になる。
【００６２】
相補性分析には、Ｂｒｕｎｓ等（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９４年；８：１０８７〜１０５）によって説明された挿入遺伝子バンクが用いられた。ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株を、まずＧＬＵＴ４プラスミドで形質転換し、次に、用いられた挿入遺伝子バンクで形質転換した。これに続き、グルコース培地で成長可能な形質転換体をスクリーニングした。研究された突然変異体の１つにおいて、ＥＲＧ４遺伝子が破壊されていたことがわかった。ＥＲＧ４は、エルゴステロール生合成酵素（オキシドレダクターゼ）をコードする。この酵素、ステロールＣ−２４（２８）−レダクターゼは、エルゴステロール生合成の最後の工程を触媒し、エルゴスタ−５，７，２２，２４，（２８）−テトラエノールを、最終産物のエルゴステロールに変換する。この時点でＥｒｇ４タンパク質は、８回膜貫通ドメインを含み、小胞体に存在する。エルゴステロール前駆体の酵母の膜への取り込みが、エルゴステロールの欠損を補填するため、ｅｒｇ４突然変異体は生存可能である。
【００６３】
ＧＬＵＴ４機能へのＥｒｇ４の阻害的影響は、ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株におけるｅｒｇ４の特異的な欠失によって確認された。得られた株（ｈｘｔ ｆｇｙ１−１Δｅｒｇ４）は、ＳＤＹ０２２とした。
【００６４】
スプリット−ユビキチンシステムを用いたタンパク質の相互作用の分析により、ヒトＧＬＵＴ４は、酵母Ｅｒｇ４と直接相互作用することが示された。それゆえに、小胞体における酵母Ｅｒｇ４タンパク質は、ＧＬＵＴ４のさらなる移動を直接防ぐか、または、移動および／または機能に関して重要な種々の方法でＧＬＵＴ４を改変すると仮定することができる。
【００６５】
同様に、ｈｘｔのみが無効となっている株、すなわちＦＧＹ１が機能的である株におけるＥＲＧ４の欠失により、ＧＬＵＴ１は活性化するが、ＧＬＵＴ４は活性化しないことが示された。成長の分析の結果を表１に要約する。
【００６６】
エルゴステロールそれ自体がＧＬＵＴ４に対する負の影響を加えることを除外するために、成長の分析を、好気性条件下で、エルゴステロールを含む寒天プレートで行った。ＧＬＵＴ４で形質転換されたあらゆる酵母株は、これら条件下で成長できなかった（表２）。ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株におけるＧＬＵＴ１形質転換体は、好気性での成長とは対照的に、嫌気性条件下ではグルコースの成長を示さなかった。ＧＬＵＴ１形質転換体は、ＥＲＧ４を欠失させた後のみ成長可能であった。
【００６７】
インビトロでの変異誘発によるＶａｌ８５のＭｅｔでの置換により、ＧＬＵＴ４をｆｇｙ１−１突然変異から独立させ、ｈｘｔ ｅｒｇ４株においてでもＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍが機能的になった。この観察は、Ｆｇｙ１は、このＧＬＵＴトランスポーターの２回膜貫通へリックス内に存在する位置に直接的または間接的に作用することを示す。
【００６８】
表３は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）（マシェローダーヴェグ１ｂ ３８１２４，ブラウンシュヴィック，ドイツ）に寄託された、本特許出願に関連する酵母株の説明を示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
【表３】
【００７２】
【表４】
【００７３】
【表５】
【００７４】
【表６】
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
【表９】
【００７８】
【表１０】
【００７９】
【表１１】
【００８０】
【表１２】
【００８１】
【表１３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＧｌｕｔ４およびＧｌｕｔ１トランスポーターを機能的に発現させることができる酵母株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの異所性細胞は、特別なトランスポータータンパク質を介してグルコースを細胞内部へ輸送する。様々な生物が、グルコース輸送に介在する様々なメカニズムを構築しており、例えば、特にプロトン共輸送系、Ｎａ+グルコーストランスポーター、結合タンパク質依存性系、ホスホトランスフェラーゼ系、および、促進拡散のための系がある。真核生物において、哺乳動物でＧＬＵＴ遺伝子（ＧＬＵＴ＝グルコーストランスポーター）によってコードされたグルコーストランスポーターのファミリーと、サッカロミセス・セレビジエでＨＸＴ遺伝子（ＨＸＴ＝ヘキソーストランスポーター）によってコードされたグルコーストランスポーターのファミリーは、促進拡散によってグルコース摂取に介在する。前記トランスポーターは、糖トランスポーターのより大きいファミリーに属する。これらは、１２回膜貫通へリックスの存在と、複数の保存されたアミノ酸基を特徴とする。グルコース輸送は、例えば糖尿病またはファンコーニ−ビッケル症候群のような不完全なグルコースホメオスタシスに関連する疾患において重要な役割を果たす。それゆえに、哺乳動物におけるグルコース輸送が多数の研究における目的とされてきた。これまで、１３種のグルコーストランスポーター様タンパク質が同定されている（ＧＬＵＴ１〜ＧＬＵＴ１２，ＨＭＩＴ−Ｈ−ｍｙｏ−イノシトールトランスポーター）。前記トランスポーターは、様々な組織へのグルコース摂取、グルコースの肝臓での貯蔵、筋肉細胞と脂肪細胞へのグルコースのインスリン依存性の摂取、および、膵臓のβ細胞によるグルコース測定など主要な役割を果たす。ＧＬＵＴ１は、赤血球へのグルコース輸送や、血液脳関門を通過するグルコース輸送に介在するが、その他多くの組織でも発現されており、一方、ＧＬＵＴ４は、インスリン依存性の組織（主として筋肉および脂肪組織）に限定される。前記インスリン依存性の組織において、細胞内区画または細胞質膜区画を通過するＧＬＵＴ４トランスポーターの標的化を制御することは、グルコース摂取調節に重要なメカニズムの代表である。インスリンの存在下で、細胞内のＧＬＵＴ４は、グルコース摂取を促進するために細胞質膜を通過して再分配される。同様に、前記インスリン依存性の組織でＧＬＵＴ１が発現され、同様に、その細胞における分配は、強くはないが、インスリンによって影響を受ける。加えて、ＧＬＵＴ１またはＧＬＵＴ４が糖輸送を触媒する相対的な有効性は、各トランスポーターの細胞表面への標的化の程度によってだけでなく、それらの動力学的特性によっても決定される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
異なるグルコーストランスポーターアイソフォームが共発現されることと、グルコース代謝が迅速なことにより、これらインスリン依存性の組織における各グルコーストランスポーターアイソフォームの役割および正確な特性に関する研究は複雑であった。これらの問題を解決するために、アフリカツメガエルの卵母細胞、組織培養細胞、昆虫細胞および酵母細胞のような異種発現系が用いられてきた。しかしながら、多数の困難がこれらの系に関連している可能性が明らかになり、すなわち、異種発現されるトランスポーターの活性が弱すぎること、前記系における内因性のグルコーストランスポーター、トランスポーターが相当な比率で細胞内に保持されること、または、不活性なトランスポーターの生産である。
【０００４】
天然に存在する哺乳動物のＧＬＵＴ４タンパク質、特にヒトのＧＬＵＴ４タンパク質は、サッカロミセス・セレビジエ株において、特定の条件下で機能的に発現可能である。
【０００５】
酵母細胞は、単細胞の真核生物である。それゆえに、これらは、特に医薬活性を有する物質を同定するためにスクリーニング分析を実行することに関して、数種のタンパク質に関して細菌系より発現に適している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、精製および単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０００７】
前記タンパク質は、ヒトＧＬＵＴ４タンパク質のアミノ酸鎖８５位に、バリンからメチオニンへのアミノ酸置換を含む。この改変されたＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質は、機能的なＧＬＵＴ４タンパク質を発現するための別手段を提供する。グルコーストランスポーターが全体として不活性であるサッカロミセス・セレビジエ株（＝ｈｘｔ（−））で、前記ＧＬＵＴ４タンパク質の発現の後、グルコース摂取が観察され得る場合、ＧＬＵＴ４タンパク質は、サッカロミセス・セレビジエに関して機能的とみなされる。グルコース摂取は、放射標識したグルコースによる輸送の測定、または、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地での成長のいずれかによって決定することができる。
【０００８】
好ましい実施形態において、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを生じるＤＮＡ配列を含む精製および単離されたポリヌクレオチドは、以下の群の配列を含むか、またはそれらからなるものが可能である：
ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズし、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍをコードするヌクレオチド配列。
【０００９】
好ましくは、前記精製および単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードする。
【００１０】
上述したようにタンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含む精製および単離されたポリヌクレオチドは、使用可能にプロモーターに連結されていてよい。適切なプロモーターは、特に、原核性または真核性のプロモーターであり、例えば、Ｌａｃ−、ｔｒｐ−、ＡＤＨ−またはＨＸＴ７プロモーターである。細菌または真核生物が、ベクターの補助で前記プロモーターによりタンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍに翻訳され得るｍＲＮＡを生産する場合、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍをコードするポリヌクレオチドの一部は正確に使用可能にプロモーターに連結している。このようなベクターの例は、ベクターｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ（配列番号３）である。タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍは、酵母細胞で前記ベクターによって発現可能である。
【００１１】
好ましい実施形態において、上述のタンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、酵母細胞で前記ポリヌクレオチドを複製すること、または、酵母細胞でタンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍをコードするポリヌクレオチドの一部を発現し、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを生産することに適している。サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞が特に適切である。酵母細胞における複製および発現に関して、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを生じるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、酵母ベクターの形態で存在する。ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチド領域は、使用可能に酵母細胞特異的プロモーターに連結していてよく、このようなプロモーターとしては、例えば、ＡＤＨプロモーター（アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター）、または、ＨＸＴ７プロモーター（ヘキソース−トランスポータープロモーター）が挙げられる。酵母の分野は、酵母でのＤＮＡクローニングのために開発されたベクター群である。
【００１２】
その上、本発明は、全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており（＝ｈｘｔ（−））、機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まないサッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞に関する。このような酵母細胞は、好ましくは、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，マシェローダーヴェグ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ）１６，３８１２４，ブラウンシュヴィック，ドイツ）にサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８７として寄託された酵母細胞である。
【００１３】
本発明はまた、全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており、機能的なＦｇｙ１と機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まない酵母細胞に関する。Ｅｒｇ４タンパク質またはＦｇｙ１タンパク質の欠損は、特に、対応するコーディングゲノム部分の断絶、または、前記コーディングゲノム部分の部分的または完全な除去によるものがあり得る。
【００１４】
好ましくは、機能的なグルコーストランスポーター、機能的なＦｇｙ１タンパク質および機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まない酵母細胞として、ＤＳＭＺにサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８４として寄託された酵母細胞を用いることである。
【００１５】
上述の酵母細胞は、好ましくは、哺乳動物のＧＬＵＴ１タンパク質または哺乳動物のＧＬＵＴ４タンパク質、特に、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ウシまたは霊長類由来のタンパク質を発現するために用いられる。好ましい実施形態では、ヒトＧＬＵＴ４またはＧＬＵＴ１タンパク質を発現するための酵母細胞が用いられる。
【００１６】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっているサッカロミセス・セレビジエ酵母細胞は、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含む本発明のポリヌクレオチドを含んでもよい。前記酵母細胞はまた、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現し、従って前記タンパク質を含む。
【００１７】
ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含むこの種の酵母株は、好ましくは、ＤＭＳＺに寄託されたサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８５酵母株である。
【００１８】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっており、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを生じるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を、例えば、以下のように製造してもよい：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
ｂ）ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
ｃ）ａ）からの酵母細胞をｂ）からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択すること、
ｅ）必要に応じて、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現すること。
【００１９】
ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドは、好ましくは、酵母細胞で複製することができ、前記ＤＮＡ配列がクローニングされたベクターである。このようなベクターの例は、ｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ（配列番号３）である。
【００２０】
本発明はまた、グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、Ｆｇｙ１およびＥｒｇ４に関するタンパク質が機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞に関する。前記酵母細胞はまた、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現し、従って、前記タンパク質を含む。この種の酵母株は、好ましくは、ＤＳＭＺに寄託されたサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８６である。
【００２１】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにタンパク質Ｆｇｙ１およびＥｒｇ４も機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を、例えば、以下のように製造してもよい：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにタンパク質Ｆｇｙ１およびＥｒｇ４も機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
ｂ）ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
ｃ）ａ）からの酵母細胞をｂ）からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択すること、
ｅ）必要に応じて、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現すること。
【００２２】
ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製された上述のポリヌクレオチドは、好ましくは、酵母細胞で複製することができ、前記ＤＮＡ配列がクローニングされているベクターである。このようなベクターの例は、ｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ（配列番号３）である。
【００２３】
本発明はまた、グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を生じるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞に関する。
【００２４】
前記酵母細胞はまた、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現し、従って前記タンパク質を含む。好ましいこの種の酵母株は、ＤＳＭＺに寄託されたサッカロミセス・セレビジエ１５１８８酵母株である。
【００２５】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を、例えば、以下のように製造してもよい：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
ｂ）ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
ｃ）ａ）からの酵母細胞をｂ）からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択すること、
ｅ）必要に応じて、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質を発現すること。
【００２６】
ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドは、好ましくは、酵母細胞で複製することができ、前記ＤＮＡ配列がクローニングされているベクターである。このようなベクターの例は、ｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ（配列番号３）である。
【００２７】
本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。前記タンパク質は、アミノ酸鎖８５位でバリンがメチオニンに置換されたヒトＧＬＵＴ４タンパク質である。
【００２８】
本発明はまた、ＧＬＵＴ４タンパク質の活性を刺激する化合物を同定する方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっており、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触させたａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物が前記ＧＬＵＴ４タンパク質の活性を刺激することとを関連付ける工程。ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質の活性を刺激する化合物は、ＧＬＵＴ４活性も刺激すると考えられる。
【００２９】
本発明はまた、上述の方法によって同定された化合物、並びにさらに、医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬に関する。その上、本発明は、Ｉおよび／またはII型糖尿病の治療のための医薬を製造するための上述の方法によって同定された化合物の使用に関する。
【００３０】
本発明はまた、上述の方法によって同定された化合物、並びに、医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬に関する。その上、本発明は、糖尿病を治療するための医薬を製造するための、上述の方法によって同定された化合物の使用に関する。
【００３１】
その上、本発明は、糖尿病を治療するための医薬を製造するための、上述の方法によって同定された化合物の使用に関する。
【００３２】
本発明はまた、Ｅｒｇ４遺伝子によってコードされるタンパク質を阻害する化合物を同定する方法も含み、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、酵母細胞で複製することができるポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Ｅｒｇ４の活性を刺激することとを関連付ける工程。
【００３３】
その上、本発明は、Ｆｇｙ１遺伝子に対応するタンパク質を阻害する化合物を同定する方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにＥｒｇ４タンパク質も機能的ではなくなっており、ＧＬＵＴ４タンパク質を含む酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Ｆｇｙ１の活性を刺激することとを関連付ける工程。
【００３４】
本発明はまた、上述の方法によって同定された化合物、並びに、医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬に関する。
【００３５】
以下で、本発明を技術的な詳細に関してより詳細に説明する。
【００３６】
ハイブリダイゼーションは、相補的な塩基配列を有する２つの一本鎖核酸が二本鎖にアセンブルすることを意味する。ハイブリダイゼーションは、２つのＤＮＡ鎖間、１つのＤＮＡと１つのＲＮＡ鎖間、および、２つのＲＮＡ鎖間で起こり得る。原則的に、関連する核酸は最初は二本鎮型であってよく、これを二次構造を持たない一本鎖分子に分解するまで加熱することによって、例えば水槽中で１０分間ボイルすることによってハイブリッド分子を製造することが可能である。続いて、それらをゆっくり冷却することができる。冷却段階の際に、相補鎖が対を形成し、二本鎖ハイブリッド分子が得られる。実験条件下で、ハイブリダイゼーションは通常、ハイブリダイゼーションフィルターを用いて実行され、そのフィルターに一本鎖または変性可能なポリヌクレオチド分子がブロッティングまたは電気泳動によってアプライされる。適切な相補ポリヌクレオチド分子を用いて、ハイブリダイズしようとする前記ポリヌクレオチド分子に放射活性の蛍光標識を与えることによって、ハイブリダイゼーションを可視化することが可能である。ストリンジェンシーは、特定の条件のマッチングまたはアライメントの程度を説明するものである。高ストリンジェンシーは、マッチングに対して低ストリンジェンシーよりも高い要求を有する。用途と目的に応じて、異なるストリンジェンシーを有する特定の条件は、核酸のハイブリダイゼーションに関して設定される。高ストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーションの反応条件は、極めてよくマッチする相補的な分子だけが他方とハイブリダイズできるように設定される。低ストリンジェンシーでは、分子は、対を形成しない塩基または誤って対を形成する塩基の比較的大きい断片と部分的にハイブリダイズすることもできる。
【００３７】
ハイブリダイゼーション条件は、特に、ハイブリダイゼーションが、２×ＳＳＣを含む水溶液中で、６８℃で少なくとも２時間行われ、続いて初めに２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで室温で５分間、次に１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで６８℃で１時間、次に０.２％ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで６８℃でさらに１時間洗浄される場合、ストリンジェントであると理解することができる。
【００３８】
２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣまたは０.２×ＳＳＣ溶液は、２０×ＳＳＣ溶液を適切に希釈することによって製造される。２０×ＳＳＣ溶液は、３モル／ｌのＮａＣｌ、および、０.３モル／ｌのクエン酸Ｎａを含む。ｐＨは７.０である。当業者であれば、ストリンジェントな条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション方法に精通している。適切な指示は、専門書に見出すことができ、例えば、特にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）；編集者：Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒｏｇｅｒ Ｂｒａｎｔ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ；ＩＳＢＮ：０−４７１−５０３３８−Ｘ）である。
【００３９】
酵母ベクターは、様々なサブグループに分類することができる。Ｙｌｐベクター（酵母の組込み型プラスミド）は、実質的に細菌でクローニングに用いられるベクターに相当す
るが、選択可能な酵母遺伝子（例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２）を含む。前記ベクター導入後に外来ＤＮＡが酵母染色体に組込まれた場合のみ、これら配列は染色体と共に複製され、クローンの形成を伴って、安定して全ての娘細胞にトランスファーされる。
【００４０】
この方法に基づき、真核性のＯＲＩ（複製開始点）によって自律的に複製できるプラスミドが得られている。このような酵母ベクターは、ＹＲｐベクター（酵母複製プラスミド）、または、ＡＲＳベクター（自律複製配列）という。その上、ＹＥｐベクター（酵母エピゾーム性プラスミド）もあり、これは、酵母２μｍプラスミドから得られ、選択的マーカー遺伝子を含む。ＹＡＣベクター（酵母人工染色体）のクラスは、独立した染色体のように行動する。
【００４１】
発現しようとする遺伝子を含む酵母ベクターは、前記遺伝子が発現できるように形質転換によって酵母に導入される。この目的に適した方法の例は、エレクトロポレーション、または、コンピテント細胞をベクターＤＮＡとインキュベートすることである。適切な酵母発現プロモーターは、当業者既知であり、例えば、ＳＯＤ１プロモーター（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＤＨプロモーター（アルコールデヒドロゲナーゼ）、酸性ホスファターゼに関する遺伝子のプロモーター、ＨＸＴ２プロモーター（グルコーストランスポーター２）、ＨＸＴ７プロモーター（グルコーストランスポーター７）、ＧＡＬ２プロモーター（ガラクトーストランスポーター）などである。酵母発現プロモーターと、発現しようとする遺伝子（例えばＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍ）を含む構築物は、発現する目的のためには、酵母ベクターの一部である。発現を実行するために、前記酵母ベクターは、自己複製する小片であってもよく、これは、酵母ゲノムから独立しているか、または、安定して酵母ゲノムに組込まれていてもよい。適切な酵母ベクターは、原則的に、酵母で増殖可能なあらゆるポリヌクレオチド配列である。用いることができる酵母ベクターは、特に、酵母プラスミド、または、酵母人工染色体である。酵母ベクターは通常、複製起点（２μ，ａｒｓ）すなわち複製プロセスの開始点、および、通常、栄養要求性マーカーまたは抗生物質耐性遺伝子からなる選択マーカーを含む。当業者既知の酵母ベクターの例としては、ｐＢＭ２７２、ｐＣＳ１９、ｐＥＭＢＣＹｅ２３、ｐＦＬ２６、ｐＧ６、ｐＮＮ４１４、ｐＴＶ３、ｐ４２６ＭＥＴ２５、ｐ４Ｈ７などが挙げられる。
【００４２】
本発明に従って、細胞の選択とは、例えば、抗生物質に対する耐性、または、特定の最小培地で成長する能力のような選択マーカーによる細胞の特異的濃縮、さらに、それらの単離およびそれに続く寒天プレートでの培養または液中培養を意味する。
【００４３】
培養、形質転換および形質転換された酵母細胞の選択、さらに酵母細胞でのタンパク質発現は、当業者が一般的に用いる方法の範囲内である。前記方法に関する説明は、標準的な教本で見出すことができ、例えば、Ｗａｌｋｅｒ Ｇｒａｅｍｅ Ｍ．：Ｙｅａｓｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ワイリー＆サンズ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ），ＩＳＢＮ：０−４７１−９４４６−８、または、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，Ａｌｉｓｔａｉｒ Ｊ．Ｐ．Ｂｒｏｗｎ，Ｍｉｃｋ Ｆ．ＦｒｕｉｔｅおよびＪｏｈｎ Ｅ．Ｇ．Ｍｃ Ｃａｒｔｌｙ編；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ；ＩＳＢＮ：３−５４０−５６５２１−３、または、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７：Ａ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ；Ａｄａｍｓ Ａｌｉｓｏｎ（編）；コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＩＳＢＮ：０−８７９６９−５０８−０」で見出すことができる。
【００４４】
酵母サッカロミセス・セレビジエは、１７種の既知のヘキソーストランスポーターと、さらに３種の既知のマルトーストランスポーターを有しており、これらは、その発現が十
分に高い場合にヘキソースを前記酵母内に輸送することができる。１種の既知の株で、ヘキソース摂取に適した全てのトランスポーターを欠失によって除去した。前記株には、マルトース輸送タンパク質に相同な２つの遺伝子ＭＰＨ２およびＭＰＨ３だけが含まれる。２つの遺伝子ＭＰＨ２およびＭＰＨ３は、培地中にグルコースが存在する場合に抑制される。Ｗｉｅｃｚｏｒｋｅ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４６４，１２３〜１２８（１９９９年）では、この酵母株の製造と特徴付けが説明されている。前記株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質上では増殖できない。前記株から、対応するベクター（ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株）に起因する、ＧＬＵＴ１を機能的に発現する突然変異体を選択することが可能である。酵母株ｈｘｔ ｆｇｙ１−１が、酵母プロモーターの制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有するプラスミドベクターで形質転換される場合、ほんのわずかなグルコースしか輸送されない。機能的なＧＬＵＴ４発現は、ＧＬＵＴ４による顕著なグルコース輸送を可能にするために、この酵母株に対してさらなる調節を必要とする。このような、単一のグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４によって細胞がグルコースを摂取する酵母株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質で単離することができる。この目的のために、酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有する酵母ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株は、形質転換される。これらの、この方法で形質転換された酵母細胞を、唯一の炭素源としてグルコースを含む栄養培地に塗布し、そこでインキュベートする。例えば３０℃で２〜３日インキュベートした後、個々のコロニーの成長を観察する。これらコロニーの１つを単離する。前記コロニーから酵母プラスミドを除去すると、唯一の炭素源としてグルコースを含む栄養培地での増殖が妨害される。この、ベクタープラスミドをすでに含まない株が、再び酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有する酵母ベクターで形質転換されると、前記株は、再び唯一の炭素源としてグルコースを含む培地で増殖が可能になる。
【００４５】
上述の酵母株は、２００２年２月１４日のＤＥ１０１０６７１８.６の優先権を主張する、２００２年２月９日付で出願された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０１３７３の主題である。
【００４６】
ヘキソースのための固有のトランスポーター（グルコーストランスポーター）が全体として機能的ではなくなっている酵母株は、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０１３７３との関連において、これより先の日付に、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）に、ＤＳＭ１４０３５、ＤＳＭ１４０３６、または、ＤＳＭ１４０３７という番号ですでに寄託されている。
【００４７】
ＧＬＵＴ４のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、遺伝子バンクにおいて、例えば以下の登録で利用可能である：Ｍ２０７４７（ｃＤＮＡ；ヒト）、ＥＭＢＬ：Ｄ２８５６１（ｃＤＮＡ；ラット）、ＥＭＢＬ：Ｍ２３３８２（ｃＤＮＡ；マウス）、スイスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）：Ｐ１４６７２（タンパク質；ヒト）、スイスプロット：Ｐ１９３５７（タンパク質；ラット）、および、スイスプロット：Ｐ１４１４２（タンパク質；マウス）。
【００４８】
ＧＬＵＴ１のポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下に示されたデータベースのコード番号で開示されている：ＥＭＢＬ：Ｍ２０６５３（ｃＤＮＡ；ヒト）、ＥＭＢＬ：Ｍ１３９７９（ｃＤＮＡ；ラット）、ＥＭＢＬ：Ｍ２３３８４（ｃＤＮＡ；マウス）、スイスプロット：Ｐ１１１６６（タンパク質；ヒト）、スイスプロット：Ｐ１１１６７（タンパク質；ラット）、および、スイスプロット：Ｐ１７８０９（タンパク質；マウス）。
【００４９】
医薬は、ヒトや動物における病気または身体の機能不全の療法のための薬理学的な活性
物質の投薬形態である。経口療法のための投薬形態の例としては、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、液状抽出物、チンキ、および、シロップが挙げられる。外用塗布に用いられるものの例としては、エアロゾル、スプレー、ゲル、軟膏、または、粉末が挙げられる。注射用または不溶解性の溶液は、バイアル、ボトルまたは予め充填された注射器を用いて非経口投与を可能にする。これら、およびその他の医薬は、製薬技術分野の当業者に既知である。
【００５０】
医薬を製剤化するための賦形剤により、特定の用途に対して活性成分の作用の適用、分布および発達を最適化する目的を有する活性物質の製造が可能である。このような賦形剤の例としては、充填剤、結合剤、崩壊剤または滑剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、スターチ、リン酸二カルシウム、ポリグリコール、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、タルクまたは二酸化ケイ素が挙げられる。
【００５１】
糖尿病は、インスリン欠乏または減少したインスリン作用による慢性的な代謝条件が原因で、血中グルコース濃度の異常な増加（高血糖症）を伴い尿と共にグルコースが排出されるという兆候を示す。インスリン作用の欠損またはインスリン作用の減少により、血中に摂取されたグルコースの不十分な吸収と、細胞による転換が起こる。脂肪組織において、インスリン拮抗ホルモンは、遊離脂肪酸の血中濃度の増加を伴う脂肪分解の増加作用を有する。
【００５２】
脂肪症（肥満症）は、健康上のリスクを構成するカロリーの過剰摂取によるエネルギーの不均衡が原因の異常な体重増加である。
【００５３】
まさに上述したような提供された酵母株によって摂取されるヘキソースの量は、放射標識したグルコースを用いた摂取の研究によって決定することができる。この目的のために、特定の酵母細胞濃度を、例えば緩衝液１００μｌに、例えば１ｍｌあたり６０ｍｇ（湿重量）の濃度で懸濁し、唯一の炭素源として決められた量の14Ｃまたは3Ｈで標識したグルコースと混合する。この細胞をインキュベートし、それらの決められた量を特定の時間で取り出す。摂取されたグルコース量は、ＬＳＣ（液体シンチレーション計数）を用いて決定される。しかしながら、提供された酵母株によって、まさに上述したように摂取されたヘキソース量は、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地での成長を分析することによって決定してもよい。この目的のために、化合物添加の後に、株の成長速度は、例えば、規則的な間隔で６００ｎｍで培養の光学密度を測定し、この値をコントロール株（例えば酵母の野生株）の成長速度と比較することによって決定される。
【００５４】
化合物は、特に化学合成または生物からの化学物質の単離によって提供される。自動的な手法で化学合成を行うことも可能である。合成または単離によって得られた化合物は、適切な溶媒に溶解させることができる。適切な溶媒は、特に、例えばＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような有機溶媒を特定の比率で含む水溶液である。
【００５５】
上述した発明に従って化合物を同定するために、酵母株を化合物で処理することは、特に、そのために提供された自動化実験システムでなされる。このようなシステムは、特別に製造された凹部を有するチャンバー、またはマイクロタイタープレート、エッペンドルフチューブまたは実験用ガラス容器を含んでもよい。自動化された実験システムは通常、ハイスループット速度用に設計される。それゆえに、自動化された実験システムを用いて実行される上述したような方法はまた、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）ともいう。
【００５６】
配列番号１は、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質のコード領域を含むポリヌクレオチド配
列を開示している。配列番号２は、ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍタンパク質のアミノ酸配列を開示している。配列番号３は、ｐ４Ｈ７ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍベクターのポリヌクレオチド配列を開示している。
【実施例】
【００５７】
酵母株の使用
本発明に記載された全ての酵母株は、ＣＥＮ−ＰＫ２−１Ｃ株（ＭＡＴａ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｈｉｓ３−Δ１ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２）から得た。ヘキソーストランスポーター遺伝子（ＨＸＴ）が欠失した酵母株の製造は、Ｗｉｅｃｚｏｒｋｅ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４６４，１２３〜１２８（１９９９年）で説明されている：ＥＢＹ−１８ｇａ（ＭＡＴａ Δｈｘｔ１−１７ Δｇａｌ２ Δａｇｔ１ Δｓｔｌ１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｈｉｓ３−Δ１ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２）、ＥＢＹ．ＶＷ４０００（ＭＡＴａ Δｈｘｔ１−１７ Δｇａｌ２ Δａｇｔ１ Δｍｐｈ２ Δｍｐｈ３ Δｓｔｌ１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｈｉｓ３−Δ１ＭＡＬ２−８c ＳＵＣ２）。培地は、１％酵母抽出物、および、２％ペプトン（ＹＰ）に基づくが、最小培地は、０．６７％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）アミノ酸非含有酵母窒素ベース（ＹＮＢ）で構成されており、栄養要求性に必要な添加剤と様々な炭素源を含む。酵母細胞を、回転式振盪機または寒天プレートで、好気性条件下で３０℃で成長させた。細胞成長は、６００ｎｍで光学密度を測定することによって（ＯＤ600）、または、酵母コロニーの直径を測定することによってモニターした。
【００５８】
グルコース摂取の決定
グルコース輸送をＤ−［Ｕ−14Ｃ］−グルコース（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の摂取として測定し、動力学的パラメーターをイーディー−ホフステープロットから決定した。遠心分離で細胞を分離し、リン酸緩衝液で洗浄し、リン酸緩衝液に１ｍｌあたり６０ｍｇ（湿重量）の濃度に再懸濁した。グルコース摂取は、グルコース濃度で０.２〜１００ｍＭと決定され、基質の特異的活性は、０.１〜５５.５ｋＢｑ／μmol-1と決定された。細胞とグルコース溶液を３０℃で５分間プレインキュベートした。放射活性グルコースを細胞に添加することによってグルコース摂取を開始させた。５秒間インキュベートした後、氷冷したストップ緩衝液１０ｍｌ（０.１ＭのＫｉＰＯ4，ｐＨ６.５，５００ｍＭグルコース）を添加し、ガラス繊維フィルター（直径２４ｍｍ，ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ））でろ過によって細胞を即座に分離した。フィルターを即座に氷冷した緩衝液で３回洗浄し、取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。サイトカラシンＢによる添加（最終濃度２０μＭ，エタノールに溶解させる）を、阻害剤の存在下で、または、溶媒のみで１５分間細胞をインキュベートした後の、５０ｍＭまたは１００ｍＭの放射活性グルコースを用いた１５秒での摂取の分析で測定した。
【００５９】
哺乳動物細胞由来のグルコーストランスポーターの新規の異種発現系が開発されている。この系は、コード遺伝子を破壊することで全ての内因性のグルコーストランスポーターが除去されたサッカロミセス・セレビジエ株に基づく。前記株は、すでに細胞質膜を通過してグルコースを摂取できなくなっており、グルコースを唯一の炭素源としては成長できない。ヒトまたはその他の哺乳動物の異種性のグルコーストランスポーター、活性型のＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４を酵母の細胞質膜に統合するために、酵母株にさらなる突然変異を導入しなければならなかった。ＧＬＵＴ１は、ｆｇｙ１−１突然変異株においてのみ活性であり、ＧＬＵＴ４は、ｆｇｙ１−１ ｆｇｙ４−Ｘ二重突然変異体においてのみ活性である。
【００６０】
ＦＧＹ１遺伝子は、クローニングされている。それは、サッカロミセス・セレビジエＯＲＦ ＹＭＲ２１２ｃである。機能に関しては、Ｆｇｙ１またはＦｇｙ１によって生じた
産物のいずれかが、ヒトグルコーストランスポーターの活性を阻害すること、または、ＧＬＵＴ輸送小胞の細胞質膜への融合に関与することが結果で示されている。
【００６１】
ＧＬＵＴ１とは異なり、哺乳動物細胞と同様に、酵母中のＧＬＵＴ４タンパク質の大部分は細胞内構造に存在する。合計９種の劣性突然変異体が単離されており（ｆｇｙ４−１〜ｆｇｙ４−９）、それらにおいてＧＬＵＴ４は、さらに細胞質膜に向けられ、ｆｇｙ１−１突然変異が同時に起こる場合、活性になる。
【００６２】
相補性分析には、Ｂｒｕｎｓ等（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９４年；８：１０８７〜１０５）によって説明された挿入遺伝子バンクが用いられた。ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株を、まずＧＬＵＴ４プラスミドで形質転換し、次に、用いられた挿入遺伝子バンクで形質転換した。これに続き、グルコース培地で成長可能な形質転換体をスクリーニングした。研究された突然変異体の１つにおいて、ＥＲＧ４遺伝子が破壊されていたことがわかった。ＥＲＧ４は、エルゴステロール生合成酵素（オキシドレダクターゼ）をコードする。この酵素、ステロールＣ−２４（２８）−レダクターゼは、エルゴステロール生合成の最後の工程を触媒し、エルゴスタ−５，７，２２，２４，（２８）−テトラエノールを、最終産物のエルゴステロールに変換する。この時点でＥｒｇ４タンパク質は、８回膜貫通ドメインを含み、小胞体に存在する。エルゴステロール前駆体の酵母の膜への取り込みが、エルゴステロールの欠損を補填するため、ｅｒｇ４突然変異体は生存可能である。
【００６３】
ＧＬＵＴ４機能へのＥｒｇ４の阻害的影響は、ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株におけるｅｒｇ４の特異的な欠失によって確認された。得られた株（ｈｘｔ ｆｇｙ１−１Δｅｒｇ４）は、ＳＤＹ０２２とした。
【００６４】
スプリット−ユビキチンシステムを用いたタンパク質の相互作用の分析により、ヒトＧＬＵＴ４は、酵母Ｅｒｇ４と直接相互作用することが示された。それゆえに、小胞体における酵母Ｅｒｇ４タンパク質は、ＧＬＵＴ４のさらなる移動を直接防ぐか、または、移動および／または機能に関して重要な種々の方法でＧＬＵＴ４を改変すると仮定することができる。
【００６５】
同様に、ｈｘｔのみが無効となっている株、すなわちＦＧＹ１が機能的である株におけるＥＲＧ４の欠失により、ＧＬＵＴ１は活性化するが、ＧＬＵＴ４は活性化しないことが示された。成長の分析の結果を表１に要約する。
【００６６】
エルゴステロールそれ自体がＧＬＵＴ４に対する負の影響を加えることを除外するために、成長の分析を、好気性条件下で、エルゴステロールを含む寒天プレートで行った。ＧＬＵＴ４で形質転換されたあらゆる酵母株は、これら条件下で成長できなかった（表２）。ｈｘｔ ｆｇｙ１−１株におけるＧＬＵＴ１形質転換体は、好気性での成長とは対照的に、嫌気性条件下ではグルコースの成長を示さなかった。ＧＬＵＴ１形質転換体は、ＥＲＧ４を欠失させた後のみ成長可能であった。
【００６７】
インビトロでの変異誘発によるＶａｌ８５のＭｅｔでの置換により、ＧＬＵＴ４をｆｇｙ１−１突然変異から独立させ、ｈｘｔ ｅｒｇ４株においてでもＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍが機能的になった。この観察は、Ｆｇｙ１は、このＧＬＵＴトランスポーターの２回膜貫通へリックス内に存在する位置に直接的または間接的に作用することを示す。
【００６８】
表３は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）（マシェローダーヴェグ１ｂ ３８１２４，ブラウンシュヴィック，ドイツ）に寄託された、本特許出願に関連する酵母株の説明を示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
【表３】
【００７２】
【表４】
【００７３】
【表５】
【００７４】
【表６】
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
【表９】
【００７８】
【表１０】
【００７９】
【表１１】
【００８０】
【表１２】
【００８１】
【表１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含む、精製および単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記の群：
ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズし、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍをコードするヌクレオチド配列
のいずれかからの配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍのコード領域は、使用可能にプロモーターに連結している、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
酵母細胞で複製することができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
酵母細胞でタンパク質を発現するのに用いることができる、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており、機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まない、サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞。
【請求項８】
全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており、機能的なＦｇｙ１タンパク質および機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まない、サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞。
【請求項９】
ＥＲＧ４遺伝子は、完全に、または部分的に欠失している、請求項７または８に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８７として寄託された、請求項７に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８４として寄託された、請求項８または９に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
哺乳動物のＧＬＵＴ１タンパク質またはＧＬＵＴ４タンパク質を発現するための、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の酵母細胞の使用。
【請求項１３】
ヒトＧＬＵＴ４タンパク質またはヒトＧＬＵＴ１タンパク質を発現するための、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを含む、請求項１４に記載の酵母細胞。
【請求項１６】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８５として寄託された、請求項１４または１
５に記載の酵母細胞。
【請求項１７】
下記の工程：
ａ）請求項７に記載の酵母細胞を提供する工程、
ｂ）請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母細胞をｂ）に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択する工程、
ｅ）必要に応じて、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを発現させる工程、
を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項８または９に記載の酵母細胞。
【請求項１９】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを含む、請求項１８に記載の酵母細胞。
【請求項２０】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８６として寄託された、請求項１８または１９に記載の酵母細胞。
【請求項２１】
下記の工程：
ａ）請求項８または９に記載の酵母細胞を提供する工程、
ｂ）請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母細胞をｂ）に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択する工程、
ｅ）必要に応じて、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを発現させる工程、
を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。
【請求項２２】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、請求項１〜６のいずれか一項にに記載のポリヌクレオチドを含む、酵母細胞。
【請求項２３】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを含む、請求項２２に記載の酵母細胞。
【請求項２４】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８８として寄託された、請求項２２または２３に記載の酵母細胞。
【請求項２５】
下記の工程：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっている酵母細胞を製造する工程、
ｂ）請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母細胞をｂ）に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択する工程、
ｅ）必要に応じて、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８４Ｍを発現させる工程、
を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。
【請求項２６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる、グルコーストランスポーターの機能的な活性を有するタンパク質。
【請求項２７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項２８】
下記の工程：
ａ）請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母と、ｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がＧＬＵＴ４タンパク質の活性を刺激することとを関連付ける工程、
を含む、ＧＬＵＴ４タンパク質活性を刺激する化合物を同定する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
【請求項３０】
Ｉおよび／またはII型糖尿病の治療のための医薬を製造するための、請求項２８に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項３１】
下記の工程：
ａ）請求項７〜１０のいずれか一項に記載のＧＬＵＴ４タンパク質を含む酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Ｆｇｙ１の活性を刺激することとを関連付ける工程、
を含む、Ｆｇｙ１遺伝子に対応するタンパク質を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
【請求項３３】
糖尿病を治療するための医薬を製造するための、請求項３１に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項３４】
下記の工程：
ａ）請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Ｅｒｇ４の活性を阻害することとを関連付ける工程、
を含む、ＥＲＧ４遺伝子によってコードされるタンパク質を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
【請求項３６】
糖尿病を治療するための医薬を製造するための、請求項３４に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項１】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５ＭをコードするＤＮＡ配列を含む、精製および単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記の群：
ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズし、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍをコードするヌクレオチド配列
のいずれかからの配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍのコード領域は、使用可能にプロモーターに連結している、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
酵母細胞で複製することができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
酵母細胞でタンパク質を発現するのに用いることができる、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており、機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まない、サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞。
【請求項８】
全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており、機能的なＦｇｙ１タンパク質および機能的なＥｒｇ４タンパク質を含まない、サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞。
【請求項９】
ＥＲＧ４遺伝子は、完全に、または部分的に欠失している、請求項７または８に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８７として寄託された、請求項７に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８４として寄託された、請求項８または９に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
哺乳動物のＧＬＵＴ１タンパク質またはＧＬＵＴ４タンパク質を発現するための、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の酵母細胞の使用。
【請求項１３】
ヒトＧＬＵＴ４タンパク質またはヒトＧＬＵＴ１タンパク質を発現するための、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを含む、請求項１４に記載の酵母細胞。
【請求項１６】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８５として寄託された、請求項１４または１
５に記載の酵母細胞。
【請求項１７】
下記の工程：
ａ）請求項７に記載の酵母細胞を提供する工程、
ｂ）請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母細胞をｂ）に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択する工程、
ｅ）必要に応じて、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを発現させる工程、
を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項８または９に記載の酵母細胞。
【請求項１９】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを含む、請求項１８に記載の酵母細胞。
【請求項２０】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８６として寄託された、請求項１８または１９に記載の酵母細胞。
【請求項２１】
下記の工程：
ａ）請求項８または９に記載の酵母細胞を提供する工程、
ｂ）請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母細胞をｂ）に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択する工程、
ｅ）必要に応じて、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを発現させる工程、
を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。
【請求項２２】
グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、請求項１〜６のいずれか一項にに記載のポリヌクレオチドを含む、酵母細胞。
【請求項２３】
タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８５Ｍを含む、請求項２２に記載の酵母細胞。
【請求項２４】
サッカロミセス・セレビジエＤＳＭ１５１８８として寄託された、請求項２２または２３に記載の酵母細胞。
【請求項２５】
下記の工程：
ａ）グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっている酵母細胞を製造する工程、
ｂ）請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母細胞をｂ）に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
ｄ）形質転換した酵母細胞を選択する工程、
ｅ）必要に応じて、タンパク質ＧＬＵＴ４Ｖ８４Ｍを発現させる工程、
を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。
【請求項２６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる、グルコーストランスポーターの機能的な活性を有するタンパク質。
【請求項２７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項２８】
下記の工程：
ａ）請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母と、ｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がＧＬＵＴ４タンパク質の活性を刺激することとを関連付ける工程、
を含む、ＧＬＵＴ４タンパク質活性を刺激する化合物を同定する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
【請求項３０】
Ｉおよび／またはII型糖尿病の治療のための医薬を製造するための、請求項２８に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項３１】
下記の工程：
ａ）請求項７〜１０のいずれか一項に記載のＧＬＵＴ４タンパク質を含む酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Ｆｇｙ１の活性を刺激することとを関連付ける工程、
を含む、Ｆｇｙ１遺伝子に対応するタンパク質を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
【請求項３３】
糖尿病を治療するための医薬を製造するための、請求項３１に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項３４】
下記の工程：
ａ）請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程、
ｂ）化学物質を提供する工程、
ｃ）ａ）に記載の酵母とｂ）に記載の化学物質とを接触させる工程、
ｄ）ｃ）に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
ｅ）ｂ）に記載の化学物質と接触していないａ）に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するｄ）で検出されたグルコース摂取値と、ｄ）に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Ｅｒｇ４の活性を阻害することとを関連付ける工程、
を含む、ＥＲＧ４遺伝子によってコードされるタンパク質を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
【請求項３６】
糖尿病を治療するための医薬を製造するための、請求項３４に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【公表番号】特表２００６−５１７０８８（Ｐ２００６−５１７０８８Ａ）
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３６９７９（Ｐ２００４−５３６９７９）
【出願日】平成１５年９月４日（２００３．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９８１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２６９０７
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月４日（２００３．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９８１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２６９０７
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
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