哺乳動物細胞中でシアリル化糖タンパク質を発現する方法およびその細胞
シアリル化オリゴサッカリドを有する糖タンパク質を産生するための方法および系を提供する。本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質またはそのフラグメントを発現するようにＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）遺伝子で遺伝子操作された細胞を含む。ＣＭＰ−ＳＡＴ発現の増加により、ＣＭＰ−シアル酸のゴルジ装置への輸送が増加し、内因性レベルを超えた糖タンパク質のシアリル化が可能である。特に、本発明の方法および系は、目的の哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）における複雑なシアリル化糖タンパク質の産生に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の参照］
本出願は、2004年5月4日出願の米国特許仮出願番号60/567,458号（その開示全体が本明細書中に参照することにより組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、哺乳動物細胞におけるシアリル化糖タンパク質の発現のための方法および系に関する。
【背景技術】
【０００３】
SwissProtタンパク質データベースでの最近の調査により、全真核生物タンパク質の半分以上が糖タンパク質であり、これらの９０％がＮ結合糖タンパク質を含む可能性が高いと予想された(Apweiler et al.,1999)。これらの糖タンパク質の多くは、治療に適用するために哺乳動物細胞中で組換え産物として産生される(Andersen & Krummen,2002)。グリコシル化は、その溶解性、熱安定性、および生物活性などの糖タンパク質の重要な性質に影響を与えることが公知である(Jenkins & Curling,1994)。特に、末端糖シアル酸の存在により、シアル酸終結グリカンがアシアロ糖タンパク質受容体によって認識されないので(Weiss & Ashwell,1989)、インビボでの糖タンパク質の循環半減期が増加し、そうでなければ、糖タンパク質が分解の標的にされる。したがって、組換え糖タンパク質産生の目的の１つは、これらの組換え糖タンパク質を最大且つ一貫したシアリル化を達成することである。
【０００４】
グリコシル化は、ＥＲおよびゴルジ装置における一連の酵素触媒反応として起こる(Kornfeld and Kornfeld,1985;Varki,1993に概説)。反応の補基質としての機能を果たすヌクレオチド糖はサイトゾル中で合成され、ミクロソーム膜を透過することができる。したがって、ヌクレオチド糖輸送タンパク質は、ヌクレオチド糖をサイトゾルから細胞内腔に移動させるために存在する(Hirschberg & Snider,1987)。例として、末端シアリル化工程に関与する種々のタンパク質の相互作用を、本特許出願の図７に示す。糖タンパク質の不均一性は、この複雑な過程の異なる部分の変動に起因する。グリコシル化プロフィールを修飾するために使用されたグリコシル化操作アプローチは、グリコシルトランスフェラーゼ(Bailey et al.,1998;Grabenhorst et al.,1999に概説)およびグリコシダーゼ(Warner,1999に概説)の操作を含む。より予測可能且つ一貫した糖形態(glycoform)分布を得るために宿主グリコシル化経路の遺伝子操作が行われている。グリコシル化操作の１つのこのような領域は、より有効なタンパク質を産生するためのオリゴサッカリドを付加するためのそのポリペプチド鎖の変異(Koury,2003)またはオリゴサッカリドの位置の変異(Keyt et al.,1994)による既存の糖タンパク質のグリコシル化パターンの操作を含む。宿主グリコシル化経路の特定の介入を、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の移入もしくは過剰発現(Fukuta et al.,2000;Sburlati et al.,1998)または宿主細胞中での内因性グリコシル化遺伝子のアンチセンス阻害(Ferrari et al.,1998)によって行うことができる。
【０００５】
ヌクレオチド糖基質の利用可能性ならびにＥＲおよびゴルジによるこれらのタンパク質の輸送も、タンパク質グリコシル化範囲の重要な決定要因である(Hooker et al.,1999)。様々なグループが、シアリル化を改良するためにシアリルトランスフェラーゼを過剰発現させようとしてきた。チャイニーズハムスター卵巣細胞は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを含むが、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを含まず(Lee et al.,1989)、それにより、α２，３結合シアル酸のみを含む糖タンパク質が得られる。しかし、ヒト糖タンパク質は、α２，３結合シアル酸およびα２，６結合シアル酸の両方を含む。したがって、多数のグループが、α２，６結合シアル酸の欠如を克服するためにα２，６−シアリルトランスフェラーゼを過剰発現させようとしてきた(Minch et al.,1995;Lee et al.,1989)。さらに、多数のグループが、組換えタンパク質のシアリル化を改良するために、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ(Bragonzi et al.,2000;Jassal et al.,2001)および／またはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ(Fukuta et al.,2000;Weikert et al.,1999)を過剰発現させている。これにより、本出願の表３にまとめるように、種々の結果が得られている。
【０００６】
さらに、いくつかのグループが、シアル酸前駆体（Ｎ−アセチルマンノサミン）の供給によって組換えタンパク質のシアリル化を改良しようとしていた（本出願の表３）。Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）は、細胞内シアル酸プールの増加のための特異的前駆体であることが公知である(Pels Rijcken et al.,1995)。組換えヒトインターフェロン−γを産生するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ ＩＦＮ−γ）への２０ｍＭまでのＭａｎＮＡｃ供給の段階的増加によって細胞内シアル酸濃度が増加することが報告された。これにより、その後、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のシアリル化が１５％改良された(Gu and Wang,1998)。しかし、４０ｍＭのＭａｎＮＡｃの添加によってシアリル化改良の飽和が認められた。より興味深いことに、２０ｍＭのＭａｎＮＡｃを、組換えヒト化ＩｇＧ１を産生するＮＳ０細胞(Hills et al.,2001)に供給した場合、１２倍までの細胞内シアル酸濃度の増加が認められ、ＴＩＭＰ−Ｉを産生するＣＨＯ細胞およびＮＳ０細胞の両方(Baker et al.,2001)に供給した場合、組換えタンパク質のシアリル化の明らかな増加は認められなかった。
【０００７】
シアリル化するためにはシチジン一リン酸−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）をゴルジ装置に送達させなければならず、この輸送過程はシチジン一リン酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）の存在に依存する(Deutscher et al.(1984)Cell 39:295-299)。ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）は、ヌクレオチド糖輸送体ファミリーに属する。他のヌクレオチド糖輸送体と同様に、本特許出願の図７に示すように、ＣＭＰ−ＳＡＴは、ゴルジ膜上に存在し、ＣＭＰ−ＳＡが逆輸送機構によってゴルジに輸送される内在性膜貫通タンパク質である(Berninsone & Hirschberg,2000;Hirschberg et al.,1998;Hirschberg & Snider,1987;Kawakita et al.,1998に概説)。Betenbaugh and others(公開番号WO01/42492号で公開されたＰＣＴ特許出願)は、ヒトシアル酸シンセターゼが昆虫細胞中でのシアル酸産生を増加させ、それにより、タンパク質のシアリル化が改良されることを開示していた。さらに、Betenbaugh and others(公開番号US2002/0065404 A1で公開された米国特許出願およびWO01/42492号)は、ゴルジ装置へのＣＭＰ−ＳＡの存在を増加させ、それにより、昆虫細胞中の糖タンパク質のシアリル化を増強するためのショウジョウバエＣＭＰ−ＳＡＴ発現を増強する可能性について熟考している。
【０００８】
US2002/0065404 A1およびWO01/42492号に開示されているＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子配列を、以下の２つのGenBankエントリーとの１００％適合を明らかにするためにNCBI GenBankデータベースで検索した：
１）AF397530−キイロショウジョウバエＣＭＰ−シアル酸／ＵＤＰ−ガラクトース輸送体ｍＲＮＡ（完全なｃｄｓ）；および
２）AB055493−ＵＤＰ−ガラクトース輸送体の完全なｃｄｓのキイロショウジョウバエｕｇｔ ｍＲＮＡ。
【０００９】
第１のGenBankエントリーは、Betenbaugh et al.(2002年3月20日)によって直接提出され、第２のGenBankエントリーは、Segawa et al.(2003年1月15日)によって直接提出されていた。
【００１０】
Segawa et al.(2000)は、ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子をクローン化して発現した場合、ＵＤＰ−ガラクトースが輸送されるがＣＭＰ−シアル酸は輸送されないことが実験的に証明されたと報告している。さらに、彼らは、コードされたヌクレオチド糖輸送体がＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミンも輸送することを見出した。Aumiller and Jarvis,2002は、相同性検索によってＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子配列を得て、これがBetenbaugh et al.によって得られた配列に類似することが見出されたことを開示した。彼らは、その後、ヌクレオチド糖輸送遺伝子をクローン化し、遺伝子相補性アッセイおよび生化学アッセイによって糖輸送体遺伝子によってコードされるタンパク質がＵＤＰ−ガラクトースを輸送するが、ＣＭＰ−シアル酸を輸送しないことを見出した。したがって、ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子であると考えられているUS 2002/0065404 A1号およびWO01/42492号で引用されたショウジョウバエ遺伝子がＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子であることが判明した。したがって、US 2002/0065404 A1号およびWO01/42492号は、ＣＭＰ−ＳＡＴがＣＭＰ−ＳＡを輸送するといういかなる実証やいかなる他の証拠も提供していない。それどころか、Betenbaugh and othersは、ＣＭＰ−ＳＡではなくゴルジＵＤＰ−ガラクトースに輸送するＵＤＰ−ガラクトース輸送体を示していた。
【００１１】
したがって、ゴルジに輸送されるＣＭＰ−ＳＡの量に影響を与えるようにＣＭＰ−シアル酸輸送体系を調節することができるかどうかについてのさらなる調査が当分野で必要である。有効にシアリル化される糖タンパク質の産生のための別の系も当分野で必要である。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、上記問題に取り組み、特に、上記問題を軽減するか、社会に有用な選択肢を少なくとも提供するシアリル化糖タンパク質を産生する方法および系を提供する。特に、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種の発現を増強する工程を含む、細胞または細胞株での目的のシアリル化糖タンパク質の調製方法を提供する。本発明者らは、驚いたことに、内因性レベルを超えたＣＭＰ−ＳＡＴの産生の増強によってシアリル化糖タンパク質の産生が改良されることを見出した。特に、本発明の方法は、目的の糖タンパク質のシアル酸含有量を最大にする有効な方法である。糖タンパク質中の最大シアル酸含有量は、シアル酸受容体部位の利用可能性に基づき、１モルの糖タンパク質に結合することができるシアル酸の最大モル数と定義する。特に、真核細胞のシアル酸受容体部位は、β１，４−ガラクトースで終結するグリカンである。同様に、β１，４−ガラクトース部位の利用可能性は、以前の糖タンパク質プロセシング範囲および糖タンパク質のグリカン部位の占有に依存する。本発明の方法および系は、目的の哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞が含まれるが、これに限定されない）における複雑なシアリル化糖タンパク質の産生に有用である。
【００１３】
第１の態様によれば、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントまたは変種を産生する少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。哺乳動物細胞は、本発明の目的のための任意の適切な哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたはＣＨＯ細胞）であり得る。
【００１４】
本発明はまた、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴを産生する細胞を含む、例えば細胞培養物の形態の細胞株を提供する。
【００１５】
本発明は、内因性レベルを超えたレベルでＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質を発現するようなＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）遺伝子での細胞の遺伝子操作を含む。ＣＭＰ−ＳＡＴ発現の増加により、ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）のゴルジ装置への輸送が増加して内因性レベルを超えて糖タンパク質がシアリル化される。したがって、本発明は、ＣＭＰ−ＳＡＴをコードする遺伝子またはこの遺伝子を含む構築物で形質転換された少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。特に、哺乳動物細胞を、哺乳動物ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子で形質転換する。例えば、ヒトまたはＣＨＯのＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子で形質転換する。
【００１６】
本発明の１つの態様によれば、目的の細胞中でのＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変種の発現によってシアリル化を増加させる。したがって、本発明は、内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。特に、哺乳動物細胞は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種および内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する。少なくとも１つの糖タンパク質は、異種であり得る。糖タンパク質は、哺乳動物、例えば、ヒトまたはＣＨＯの糖タンパク質であり得る。しかし、本発明の目的のために有用な任意の他の糖タンパク質を産生することができる。特に、本発明の細胞を、目的のシアリル化糖タンパク質の複合体または混合物の産生のために使用することができる。
【００１７】
より詳細には、目的の糖タンパク質は、任意のＩＦＮ−γ、フラグメント、または変種であり得る。
【００１８】
したがって、本発明の哺乳動物細胞または細胞株を、異種タンパク質をコードする遺伝子またはこの遺伝子を含む構築物で形質転換することができる。例えば、細胞を、少なくとも１つのＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種をコードする遺伝子で形質転換する。
【００１９】
特に、本発明の哺乳動物細胞または細胞株は、ＣＨＯ細胞であってよく、前記細胞が内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種を産生し、前記細胞が内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する。シアリル化糖タンパク質は、少なくともＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種であり得る。
【００２０】
本発明の哺乳動物細胞は、単離細胞株であり得る。
【００２１】
別の態様によれば、本発明は、本発明の哺乳動物細胞または細胞株を含む少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質の発現用キットを提供する。
【００２２】
別の態様によれば、シアリル化オリゴサッカリドを有する糖タンパク質を産生するための方法および系を提供する。したがって、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種の発現を増強する工程を含む、細胞または細胞株でのシアリル化糖タンパク質の調製方法を提供する。さらなる態様によれば、シアリル化糖タンパク質はまた、内因性レベルを超えて発現する。より詳細には、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現によって糖タンパク質のシアリル化が最大になる。
【００２３】
特に、哺乳動物細胞または細胞株は、ＣＨＯ細胞株またはヒト細胞株であり得る。シアリル化糖タンパク質は、異種哺乳動物糖タンパク質であり得る。例えば、シアリル化糖タンパク質は、任意のＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種である。
【００２４】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）哺乳動物細胞を、内因性レベルを超えて、ＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、もしくは変種をコードする遺伝子また前記遺伝子を含む構築物で形質転換する工程と、
（ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの目的のシアリル化糖タンパク質をコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換する工程と
を含む、哺乳動物細胞または細胞株中で少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【００２５】
さらに、上記方法では、目的のシアリル化糖タンパク質を、内因性レベルを超えて産生することができる。この方法は、さらに、目的の糖タンパク質を単離する工程を含み得る。単離糖タンパク質を、薬学的組成物または治療組成物の形態で処方することができる。
【００２６】
さらに関連する態様では、本発明は、（ａ）細胞中の炭水化物基質を決定する工程と、
（ｂ）前記細胞をタンパク質で形質転換して、必要な前駆基質を産生する工程と、
（ｃ）前記細胞中のプロセシング経路を構築してシアリル化糖タンパク質を産生する工程とを含む、目的の哺乳動物細胞中でシアリル化糖タンパク質を産生する方法を含む。
【００２７】
種々のＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質が公知である。さらに、本発明の方法で使用されるＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が公知であるか、バイオインフォマティクス検索を使用して同定される。これらの配列を、本発明で使用することができる。
【００２８】
目的の適切な細胞には、哺乳動物細胞および細胞株が含まれる。ヒト細胞および細胞株も目的の細胞に含まれ、使用することができる。特に、目的の細胞には、治療糖タンパク質の産生に有用な哺乳動物細胞が含まれる。これらの細胞は未修飾状態であるか、治療糖タンパク質を発現するように事前に修飾されていてもよい。チャイニーズハムスター卵巣細胞は、治療用糖タンパク質の産生で特に有用であることが見出されている。既存の技術と組み合わせた本発明の治療薬の使用により、内因性レベルを超えてシアリル化する糖タンパク質が得られることを調査する。
【００２９】
本発明の方法および系を、治療に有益であり得る広範な糖タンパク質に使用することができる。特に、本発明は、血流中のタンパク質の循環時間を延長するために糖タンパク質のシアリル化が望ましい場合に有用である。例として、適切な糖タンパク質には、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が含まれる。
【００３０】
本発明の方法および系は、標的細胞を修飾して「ヒト」糖タンパク質を産生するために既存の技術と共に使用することができるさらなる遺伝子操作プロセスを提供する。本発明の方法および系によって修飾された細胞によって産生された糖タンパク質は、予想されるシアリル化量が増加し、それにより、血中の循環時間が増加するので有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本明細書中に記載の文献は、便宜上、文献リストの形態で列挙し、実施例の最後に添付する。このような文献の全内容は、本明細書中に参照することにより組み込まれる。
【００３２】
本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡＴの産生および／または糖タンパク質のシアリル化の増強によって目的の細胞における糖タンパク質産生の操作が可能である。
【００３３】
「目的の細胞」は、例えば、１）内因性ＣＭＰ−ＳＡレベルが細胞中の所望のレベルのシアリル化糖タンパク質の産生に十分ではない任意の細胞、２）ゴルジへのＣＭＰ−ＳＡの移入率を改良することが望ましい場合、３）ＣＭＰ−ＳＡＴの量または活性を改良または増強することが望ましい場合、または４）シアリル化糖タンパク質の産生を改良または最大にすることが望ましい場合を意図する。目的の細胞は、任意の哺乳動物細胞であり得る。例えば、ＣＨＯ細胞、ヒト細胞および細胞株も、目的の細胞に含まれ、本発明の方法で使用することができる。例えば、これらを使用して、ヒト細胞および／または細胞株（例えば、腎臓および肝臓など）中のシアリル化糖タンパク質を操作することができる。「所望のレベル」は、本発明の方法に細胞を供した後に目的の細胞から構成される生化学物質の量が変化することを意図する。この様式では、本発明は、目的の細胞中のＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質のレベルを操作する工程を含む。本発明の好ましい実施形態では、ＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質レベルの操作は、ＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質の過剰発現（すなわち、内因性レベルを超えたＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質レベルの増加）を含む。
【００３４】
本発明の目的のために、「発現の増強」は、所望のＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質をコードする核酸の翻訳産物および／または所望の糖タンパク質をコードする核酸の翻訳産物が、核酸を発現する宿主細胞中で前記タンパク質の内因性レベルより高いことを意味することを意図する。
【００３５】
「内因性」は、本発明の方法による細胞の操作前の天然に存在する細胞または組換え細胞中に存在する生物機能または生化学組成物の型および／または量を意味することを意図する。
【００３６】
「異種」は、本発明の方法による細胞の操作前の天然に存在する細胞または組換え細胞中に存在しない生物機能または生化学組成物の型および／または量を意味することを意図する。
【００３７】
本発明の目的のために、「異種糖ポリペプチドまたは糖タンパク質」は、糖ポリペプチドまたは糖タンパク質が通常発現する（天然に発現する）細胞種と異なる目的の細胞種中で発現した（すなわち、合成された）糖ポリペプチドまたは糖タンパク質を意味する。
【００３８】
本発明に関する内因性および異種の機能および組成物の決定方法は、本明細書中に提供され、そうでなければ、当分野で公知の方法を含む。
【００３９】
先行技術の文献は、いくつかの限定要因が細胞中での糖タンパク質の有効なシアリル化に影響を与えることを示していた。本発明者らは、シアリル化に利用可能なゴルジ中のＣＭＰ−シアル酸基質量の制限は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）を介したゴルジへのＣＭＰ−シアル酸輸送の制限によって生じることを提案する。したがって、本発明者らは、この制限を軽減するためにＣＭＰ−ＳＡＴを過剰発現させる。これにより、細胞中で産生される糖タンパク質（目的の組換えタンパク質が含まれる）のシアリル化が増加する。
【００４０】
ＣＭＰ−ＳＡＴは、その構造および輸送機能が非常に類似しているヌクレオチド糖輸送体ファミリーに属する(Berninsone & Hirschberg,2000;Hirschberg et al.,1998;Hirschberg & Snider,1987;Kawakita et al.,1998に概説)。ハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送体ｃＤＮＡは、以前にＬｅｃ２(Eckhardt & Gerardy-Schahn,1997)、ＣＭＰ−シアル酸輸送体が欠失したＣＨＯグリコシル化変異細胞株(Deutscher et al.,1984)の相補性クローニングによって単離されている。ＣＭＰ−シアル酸輸送体のヒトホモログ(Ishida et al.,1998)およびマウスホモログ(Berninsone et al.,1997)は、機能活性を有することが証明されており、同様にクローン化したハムスターホモログは類似の機能性を有すると予想される。この膜貫通タンパク質の膜トポロジーも広く研究されている(Eckhardt et al.,1999)。
【００４１】
本発明は、当分野で取り組まれている問題を解決し、上記問題を軽減するシアリル化糖タンパク質を産生するための有効な方法および系を提供する。特に、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種の発現を増強する工程を含む、細胞、単離細胞、または細胞株での目的のシアリル化糖タンパク質の調製方法を提供する。本発明者らは、驚いたことに、内因性レベルを超えたＣＭＰ−ＳＡＴの産生の増強によって糖タンパク質が有効にシアリル化されることを見出した。特に、本発明の方法は、目的の糖タンパク質のシアル酸含有量を最大化する有効な方法である。本発明の方法および系は、目的の哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞が含まれるが、これに限定されない）における複雑なシアリル化糖タンパク質の産生に有用である。
【００４２】
第１の態様によれば、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種産生する少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。哺乳動物細胞は、本発明の目的のための任意の適切な哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたはＣＨＯ細胞）であり得る。本発明はまた、内因性レベルを超えて目的のＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質を産生する細胞を含む、例えば細胞培養物の形態の細胞株を提供する。目的の適切な細胞には、哺乳動物細胞および細胞株が含まれる。ヒト細胞および細胞株も目的の細胞に含まれ、使用することができる。特に、目的の細胞には、治療糖タンパク質の産生に有用な哺乳動物細胞が含まれる。これらの細胞は未修飾状態であるか、治療糖タンパク質を発現するように事前に修飾されていてもよい。チャイニーズハムスター卵巣細胞は、治療用糖タンパク質の産生で特に有用であることが見出されている。既存の技術と組み合わせた本発明の技術の使用により、内因性レベルを超えてシアリル化する糖タンパク質が得られることを調査する。
【００４３】
本発明の１つの態様によれば、目的の細胞中でのＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変種の発現によってシアリル化を増加させる。したがって、本発明は、内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。特に、哺乳動物細胞は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種および内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する。少なくとも１つの糖タンパク質は、異種であり得る。糖タンパク質は、哺乳動物、例えば、ヒトまたはＣＨＯの糖タンパク質であり得る。しかし、本発明の目的のために有用な任意の他の糖タンパク質を産生することができる。特に、本発明の細胞を、目的のシアリル化糖タンパク質の複合体または混合物の産生のために使用することができる。
【００４４】
より詳細には、本発明の実験の一部で使用したモデル系は、ＣＨＯ ＩＦＮ−γ（ヒトＩＦＮ−γを産生するチャイニーズハムスター卵巣細胞株）であった。しかし、他の哺乳動物起源のＩＦＮ−γも使用することができる。さらに、他のＩＦＮ形態（例えば、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β）も使用することができる。ＩＦＮ−γは、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調整活性を有する分泌糖タンパク質である(Farrer & Schreiber,1993)。Ａｓｎ−２５およびＡｓｎ−９７に占有率が変化し得る２つの潜在的なＮ−グリコシル化部位が存在する。占有する場合、オリゴサッカリドは、主に２つの触角を持つ(biantennary)(Gu et al.,1997;Hooker et al.,1995)。したがって、目的の糖タンパク質は、ＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種であり得る。用語「そのフラグメントまたは変種」は、ＩＦＮ−γの生物活性を発現するフラグメントおよび／または変種を意図する。
【００４５】
したがって、本発明の哺乳動物細胞または細胞株を、ＣＭＰ−ＳＡＴおよび／または異種タンパク質をコードする遺伝子またはこの遺伝子を含む構築物で形質転換することができる。例えば、細胞を、少なくとも１つのＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種をコードする遺伝子で形質転換する。したがって、本発明は、内因性レベルを超えたレベルでＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質を発現するようなＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子での細胞の遺伝子操作を含む。ＣＭＰ−ＳＡＴ発現の増加により、ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）のゴルジ装置への輸送が増加して内因性レベルを超えて糖タンパク質がシアリル化される。したがって、本発明は、ＣＭＰ−ＳＡＴをコードする遺伝子またはこの遺伝子を含む構築物で形質転換された少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。特に、哺乳動物細胞を、哺乳動物ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子で形質転換する。例えば、ヒトまたはＣＨＯのＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子で形質転換する。
【００４６】
当分野で公知の技術を使用した１つの細胞株中での複数の転写物（例えば、目的のＣＭＰ−ＳＡＴおよび／または糖タンパク質をコードする転写物）の発現クローニングは、所望のシアリル化反応を引き起こし、これらの反応を至適化する必要があり得る。あるいは、当分野で公知の技術を使用した複数のウイルスでの細胞の同時感染を使用して、複数の組換え転写物を同時に産生することもできる。さらに、プロモーターまたは初期プロモーターの調節下でいくつかを含む複数の外来遺伝子を組み込むプラスミドは、本発明の目的のために市販されているか、公的にされているか、利用可能であり、これを使用して適切な構築物を作製することができる。本発明は、これらの技術のいずれかの使用を含む。本発明はまた、目的の異種糖タンパク質の産生前に細胞中で所望のＣＭＰ−ＳＡＴが発現できるようにするための上記ベクター型の使用を含む。あるいは、目的のＣＭＰ−ＳＡＴおよび／または糖タンパク質の遺伝子を、当分野で公知のベクターを使用して宿主細胞ゲノムに直接組み込むことができる。さらに、１つまたは複数の異なる異種遺伝子を同時に構成性に発現する安定な形質転換体を産生するための連続形質転換ストラテジーを日常的に発生することができる。特に、本発明の哺乳動物細胞または細胞株は、ＣＨＯ細胞、単離細胞、または細胞株であってよく、前記細胞が内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種を産生し、前記細胞が内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する。シアリル化糖タンパク質は、少なくともＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種であり得る。本発明の哺乳動物細胞は、単離細胞株であり得る。
【００４７】
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の哺乳動物細胞または細胞株を含む少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質の発現用キットを提供する。
【００４８】
別の態様によれば、シアリル化オリゴサッカリドを有する糖タンパク質を産生するための方法および系を提供する。したがって、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種の発現を増強する工程を含む、細胞または細胞株でのシアリル化糖タンパク質の調製方法を提供する。さらなる態様によれば、シアリル化糖タンパク質はまた、内因性レベルを超えて発現する。より詳細には、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現によって糖タンパク質のシアリル化が最大になる。特に、哺乳動物細胞または細胞株は、ＣＨＯ細胞株またはヒト細胞株であり得る。シアリル化糖タンパク質は、異種哺乳動物糖タンパク質であり得る。例えば、シアリル化糖タンパク質は、任意のＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種である。
【００４９】
より詳細には、本発明では、著者は、ＣＨＯ ＩＦＮ−γ中でのハムスターＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現（すなわち、内因性レベルを超えた発現）を報告する。本発明者らは、本明細書中で、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現によって組換えＩＦＮ−γのシアリル化が改良されることを証明した。ＣＨＯ細胞におけるこのグリコシル化操作アプローチがどこかで報告されていることが知られていないので、本発明は、組換え糖タンパク質産生時のシアリル化を改良するための新規のアプローチを示す。
【００５０】
別の態様によれば、本発明は、（ａ）哺乳動物細胞を、内因性レベルを超えて、ＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、もしくは変種をコードする遺伝子また前記遺伝子を含む構築物で形質転換する工程と、
（ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの目的のシアリル化糖タンパク質をコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換する工程と
を含む、哺乳動物細胞または細胞株中で少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【００５１】
さらに、上記方法では、目的のシアリル化糖タンパク質を、内因性レベルを超えて産生することができる。この方法は、さらに、目的の糖タンパク質を単離する工程を含み得る。単離糖タンパク質を、薬学的組成物または治療組成物の形態で処方することができる。
【００５２】
さらに関連する態様では、本発明は、（ａ）細胞中の炭水化物基質を決定する工程と、
（ｂ）前記細胞をタンパク質で形質転換して、必要な前駆基質を産生する工程と、
（ｃ）前記細胞中のプロセシング経路を構築してシアリル化糖タンパク質を産生する工程とを含む、目的の哺乳動物細胞中でシアリル化糖タンパク質を産生する方法を含む。
【００５３】
細胞は、単離細胞または細胞株であり得る。
【００５４】
種々のＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質が公知である。さらに、本発明の方法で使用されるＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が公知であるか、バイオインフォマティクス検索を使用して同定される。これらの配列を、本発明で使用することができる。
【００５５】
本発明の方法および系を、治療に有益であり得る広範な糖タンパク質に使用することができる。特に、本発明は、血流中のタンパク質の循環時間を延長するために糖タンパク質のシアリル化が望ましい場合に有用である。例として、適切な糖タンパク質には、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が含まれる。
【００５６】
特に、本発明は、組換えタンパク質のシアリル化の改良のための新規のストラテジーを確立した。本発明者らは、本明細書中で、そのモデル細胞株（ＣＨＯ ＩＦＮ−γ）を使用して、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現によってＣＨＯ細胞中でシアリル化が増加することを確認した。ＣＭＰ−ＳＡＴを過剰発現するクローンによる４〜１６％のＩＦＮ−γシアリル化の増加は、既存のグリコシル化操作アプローチに匹敵した。実際、いくつかのクローンでは、ＣＭＰ−ＳＡＴのみの過剰発現がＩＦＮ−γを最大にシアリル化するのに十分であることも証明された。より有意には、所与のレベルのＩＦＮ−γ部位の占有および分岐のために、このストラテジーによって組換えタンパク質産物が最大限にシアリル化された。ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現によるゴルジでのＣＭＰ−シアル酸基質の利用可能性の増加は、いくつかの選択された単一の細胞クローンにおいて、組換えＩＮＦ−γを完全にシアリル化するのに十分であった。完全にシアリル化された糖タンパク質はインビボ循環半減期が延長するので、組換えタンパク質においてこれは理想的な例である。
【００５７】
ＣＭＰ−ＳＡＴ過剰発現ストラテジーの有効性は、グリコシル化機構における細胞型の変動および細胞のシアル酸の需要に依存する。細胞株が異なれば内因性ＣＭＰ−ＳＡＴ発現が変動するので、このストラテジーはＣＭＰ−ＳＡＴの少ない細胞株でより有効であるとわかるはずである。あるいは、外因性供給によって（例えば、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）供給によって）ＣＭＰ−シアル酸の供給を人為的に増加させる場合、過剰発現したＣＭＰ−シアル酸輸送体は、ゴルジへ増加したＣＭＰ−シアル酸基質を輸送するように作用し、この組み合わせアプローチによってシアリル化が改良される可能性がある。ＣＭＰ−ＳＡＴ過剰発現のみによってＩＦＮ−γで最大シアリル化が達成された場合、さらなるＭａｎＮＡｃ供給によってシアリル化をさらに改良することはできない。
【００５８】
細胞のシアル酸の需要は、ゴルジ細胞内腔中のβ１，４−ガラクトース受容体部位数に依存する(Baker et al.,2001)。これは、産生された組換え糖タンパク質の型およびそれによる関与するシアリル化量、ならびにその産生率または特異的産生性にも依存する。親ＣＨＯ ＩＦＮ−γが比較的高レベルでシアリル化されたＩＦＮ−γを産生することに留意すべきである（表２）。これは、ＣＨＯ ＩＦＮ−γが低収率の細胞株であることに一部寄与する可能性があり、単位時間あたりにゴルジを通過する組換えタンパク質分子少数であり、それによりシアリル化需要が低い。
【００５９】
詳細には、使用されるモデル糖タンパク質と比較して細胞株の組換えタンパク質の産生性が高いか基本的シアル酸含有量が低い場合、ＣＭＰ−ＳＡＴ過剰発現ストラテジーは、一般に、シアリル化を改良するための有用なストラテジーである。さらに、結果は、グリコシル化経路の遺伝子操作およびグリコシル化を改良するための多面的アプローチにおけるヌクレオチド糖供給のためのグリコシルトランスフェラーゼとの考慮されるＣＭＰ−ＳＡＴの可能性を証明する。例えば、ＣＭＰ−ＳＡＴと組み合わせたＮ−アセチルマンノサミン供給により、ゴルジへ増加したＣＭＰ−シアル酸基質が輸送され、シアリル化が改良される可能性が増大する。このような多面的アプローチを広範な種々の組換え糖タンパク質に適用することができ、哺乳動物細胞を使用して糖タンパク質産生で最大且つ一貫したシアリル化も達成可能である。
【００６０】
本発明は、本発明の細胞中での異種タンパク質の発現および／またはこのような発現から恩恵を受ける任意の目的のための本発明の方法を含む。このような目的には、タンパク質のインビボ循環半減期の増加；所望の量のタンパク質の産生；タンパク質の生物機能（酵素活性、結合能力、抗原性、治療特性、およびワクチンまたは診断ツールとしての能力などが含まれるが、これらに限定されない）の増加が含まれるが、これらに限定されない。このようなタンパク質は、天然に存在する化学的な合成タンパク質、または組換えタンパク質であり得る。本発明の異種発現から恩恵を受けるタンパク質の例には、トランスフェリン、プラスミノゲン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化物質、エリスロポイエエチン、インターロイキン、およびインターフェロンが含まれるが、これらに限定されない。このようなタンパク質の他の例には、国際特許出願公開番号WO98/06835号（その内容が、本明細書中に参照することにより組み込まれる）に記載のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、本発明の異種発現から恩恵を受けるタンパク質は、哺乳動物タンパク質である。この態様では、哺乳動物には、チャイニーズハムスター、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
ここに本発明を一般的に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照してより深く理解され、実施例は例示を目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【００６２】
当分野で公知であり、特に説明していない標準的な分子生物学技術は、一般に、Sambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(2001)に従う。
【００６３】
当業者は、目的の哺乳動物細胞にＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質の遺伝子を移入するのに使用可能な種々の技術に精通している。詳細には、以下は、本発明者らが内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴを発現し、それにより、内因性レベルを超えて糖タンパク質のシアリル化を達成するための目的の細胞の遺伝子操作で有効であることを見出した許容可能なアプローチを立証する。当業者に認識されるように、この遺伝子操作および発現を、以下に記載のものと詳細が異なる方法を使用して達成することができる。例として、異なるベクターおよび宿主細胞を使用することができる。
【００６４】
［実施例１］
［材料と方法］
〔哺乳動物細胞株および培地〕
ヒトＩＦＮ−γを発現するＣＨＯ細胞株(Scahill et al.,1983)を、クローニング作業のために使用した。ＣＨＯ ＩＦＮ−γと呼ばれるこの細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(HyClone,Logan,UT)および０．２５μＭメトトレキセートを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Invitrogen,Grand Island,NY)で成長させた。このＤＨＦＲ細胞株における選択圧を維持するためにメトトレキセートを添加したが、以下に記載の安定な細胞株のジェネテシン選択時にこれを除去した。細胞を、単層としてＴフラスコで成長させ、３７℃の５％ＣＯ2大気下でインキュベートした。通常の継代培養時に０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ溶液(Sigma,St.Louis,MO)の添加によって細胞をＴフラスコから引き離した。
【００６５】
〔ＣＨＯ−Ｋ１からの全長ｃＤＮＡ合成〕
製造者の説明書にしたがって、SV Total RNA Isolation System(Promega,Madison,WI)によってＣＨＯ−Ｋ１から総ＲＮＡを調製した。全ての逆転写試薬は、Promegaから入手した。５×Ｍ−ＭＬＶ反応緩衝液、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、および２５単位の組換えRNAsin（商標）リボヌクレアーゼインヒビターを含む反応混合物中でモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ）を４２℃で１時間使用して、全長ｃＤＮＡを合成した。
【００６６】
〔ＣＭＰ−ＳＡＴのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅〕
ＣＨＯ−Ｋ１の総ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを、以前にクローン化されたハムスターＣＭＰ−ＳＡＴからデザインしたプライマーに基づいて、ＣＭＰ−ＳＡＴ ｃＤＮＡのコード領域を増幅するためのテンプレートとして使用した(Eckhardt and Schahn,1997)。BamHIおよびHindIII制限部位を、その後のサブクローニングのためにコード領域の上流および下流に移入した。使用した５’−ＰＣＲプライマーは
【化１】
であり、３’−ＰＣＲプライマーは、
【化２】
（移入した制限部位に下線を引き、ＣＭＰ−ＳＡＴの組み込まれたコード領域を太字で示す）であった。全ＰＣＲ試薬は、Promegaから入手した。反応混合物は、２μｌのＤＮＡテンプレート、１×Ｐｆｕ緩衝液、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマー、およびＴａｑ−Ｐｆｕポリメラーゼミックス（約５Ｕ）を含んでいた。ＰＣＲ条件は以下であった：９４℃で６分間、その後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１分間を３５サイクル、ならびに７２℃で８分間の最終伸長。
【００６７】
〔ＣＭＰ−ＳＡＴ発現ベクターの構築〕
ＰＣＲ産物を、配列決定用のｐＣＲ（商標）−ＴＯＰＯ（商標）(Invitrogen,Grand Island,NY)に最初にサブクローン化し、以前にクローン化されたハムスターＣＭＰ−ＳＡＴ配列と任意の変異について比較した。選択された発現ベクターは、Ｎ末端にＦＬＡＧ（商標）エピトープ（DYKDDDDK）（配列番号７）を含むｐＣＭＶ−Ｔａｇベクター(Strategene,La Jolla,CA)であった。検証されたＰＣＲ産物を、ｐＣＭＶ−Ｔａｇにサブクローン化し、再度配列決定した。融合タンパク質が産生されるべきであるので、正確な発現のためにＦＬＡＧ（商標）配列がＣＭＰ−ＳＡＴのコード領域にインフレームで確実に存在することが重要であった。最終プラスミドｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＳＡＴを、Maxi Plasmid Purification Kit(Qiagen,Hilden,Germany)を使用して精製し、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションのためにその濃度を定量した。
【００６８】
〔ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのＤＮＡの一過性および安定なトランスフェクション〕
実際のトランスフェクションを行う前に、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γを死滅させるのに必要なジェネテシンの最小濃度を決定するために、０．１μｇ／ｍｌと１．０μｇ／ｍｌとの間の種々のジェネテシン濃度(Sigma,St.Louis,MO)に対してＣＨＯ ＩＦＮ−γを滴定した。Fugene 6トランスフェクション試薬(Roche,Basel,Switzerland)を使用してトランスフェクションを行った。細胞を、ウェルあたり５０万個の細胞を含む６ウェルプレート中で一晩成長させ、翌日、ウェルあたり約１μｇの環状プラスミドでトランスフェクトした。製造者の説明書にしたがって、６：１の比のFugene 6トランスフェクション試薬（μｌ）：ＤＮＡ（μｇ）中でＦｕｇｅｎｅ−ＤＮＡ複合体を調製した。
【００６９】
一過性トランスフェクションのために、細胞を４８時間成長させ、その後にこれらをＦＡＣＳ分析のために採取する。安定な細胞株の生成のために、細胞を４８時間成長させ、その後に、培地を、初期の滴定実験で決定した７００μｇ／ｍｌのジェネテシンを含む選択培地と交換した。選択培地中の非トランスフェクション細胞が１週間以内に死滅した場合、細胞を選択培地中で３週間保持した。３週間後、ジェネテシン耐性コロニーが認められ、これらのコロニーを無作為に選別し、その後、安定な細胞株に拡大した。これらの細胞株を選択培中で６世代維持し、その後、ジェネテシンを除去した。
【００７０】
〔ＦＡＣＳ分析〕
抗ＦＬＡＧ（商標）Ｍ１マウスモノクローナル抗体(Sigma,St.Louis,MO)での細胞の細胞内標識によってＦＡＣＳ分析を行った。ＣＨＯ ＩＦＮ−γを、Fugene 6トランスフェクション試薬を使用して、以下のベクターで一過性にトランスフェクトした：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）(Invitrogen,Grand Island,NY)、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−Ｌｕｃ(Strategene,La Jolla,CA)、およびｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴ。ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−Ｌｕｃは、ＦＬＡＧ（商標）−ルシフェラーゼタンパク質を発現する正のコントロールベクターである。約１５０万個の細胞を、各ＦＡＣＳ調製物で使用した。細胞をＰＢＳで洗浄し、再懸濁して単一細胞の懸濁液を得た。この懸濁液を固定し、Fix & Perm（商標）細胞透過処理キット(Caltag Laboratories,Burlingame,CA)を使用して透過処理した。次いで、これらを、抗ＦＬＡＧ（商標）Ｍ１マウスモノクローナル抗体の８７０倍希釈物で１５分間標識した。その後、細胞を、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma)を含むＰＢＳ（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄し、二次抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ(Dako,Copenhagan,Denmark)の５００倍希釈物と暗所で１５分間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳでの最終洗浄後、細胞を新鮮な１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁し、FACSCalibur（商標）システム(BD Biosciences,San Jose,CA)を使用して分析した。結果を、分析ツールに付属のソフトウェアを使用して分析した。
【００７１】
〔ＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンからの総ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成〕
約１０００万個の細胞を、安定な細胞株から採取し、以下のようにTRIzol（商標）試薬(Invitrogen,Grand Island,NY)を使用して、総ＲＮＡを抽出した。細胞を、１ｍｌのTrizol(商標)試薬に再懸濁し、２１Ｇニードルを有するシリンジで５０回剪断した。細胞を、室温で約１０分間インキュベートした。２００μｌのクロロホルムを添加し、３０秒間激しく混合した。次いで、サンプルを、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。上部の水層を新規の無ＲＮＡｓｅチューブに移し、同体積のイソプロパノールを添加した。次いで、チューブを−２０℃で２時間以上インキュベートした。その後、チューブを、氷上で解凍し、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。視覚可能なＲＮＡペレットが、チューブの底に認められた。上清を吸引し、ペレットを０．５ｍｌの７５％（ｗ／ｖ）エタノールで洗浄した。次いで、ペレットを、１４，０００ｒｐｍにて４℃で２分間遠心分離し、エタノールを除去した。ＲＮＡペレットを風乾し、３５μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。GeneQuant(商標)Pro RNA/DNA Calculator(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を使用したＲＮＡ定量のために、サンプルを採取した。２６０ｎｍと２８０ｎｍとの吸光度の比を使用してＲＮＡの質を評価し、１．９およびそれ以上の比を十分な純度のＲＮＡの指標と見なした。
【００７２】
ＲＮＡ濃度に基づいて、１０μｇのＲＮＡを使用して、第１のｃＤＮＡ鎖を合成した。製造者の説明書にしたがって４００ＵのＩｍｐｒｏｍ−ＩＩ逆転写酵素および０．５μｇのランダムプライマー(Promega,Madison,WI)を使用して、４２℃で６０分間逆転写を行った。７０℃で５分間加熱して反応を停止させ、ｃＤＮＡをその後のリアルタイムＰＣＲ分析のために使用した。
【００７３】
〔リアルタイムＰＣＲ〕
iCycler iQ(Biorad,Hercules,CA)(Professor Heng-Phon Tooからの無料提供)(Singapore-MIT Alliance,National University of Singapore)を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下であった：９５℃で３分間、その後、９５℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間を４０サイクル。アニーリング時に蛍光検出を行った。１００μｌの１×XtensaMix-SG（商標）(BioWORKs)の反応緩衝液は、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｐｍｏｌ順方向および逆方向プライマー、１．０Ｕ DyNAzyme II(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)、および５μｌの上記のように調製したＣＨＯ ＩＦＮ−γサンプル由来のｃＤＮＡを含んでいた。４０μｌアリコート中のサンプルを、各実施中に２連で実施した。総ＣＭＰ−ＳＡＴおよび組換え発現ＣＭＰ−ＳＡＴの検出のためのプライマーを、図１に示すようにデザインした（配列番号１〜４）。
【００７４】
〔ＩＦＮγのシアリル化分析〕
安定なクローンおよび非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γの培養物を、２５ｍｌの培地を含むＴ１５０培養フラスコ中に２．５Ｅ６細胞で播種した。以下に記載するように、分析した安定なクローンは、ＩＣ．１７、ＩＣ．３０、ＩＣ．３７、ＩＣ．３８、およびＩＢ．８であった。ｔ＝９２時間（培養物のピーク密度時間）の培養で上清を採取した。回収した上清を、２つのフラスコにプールし、その後のＩＦＮ−γ分析のために使用した。Gu(MIT,PhD Thesis,1997)による以前の研究に基づいたBioprocessing Technology Instituteの独自の至適化された分析手順を使用して、ＩＦＮ−γ分析を行った。まとめると、上清をＩＦＮ−γについて免疫精製した。次いで、この精製されたＩＦＮ−γを、既知濃度のＩＦＮ−γ標準を溶離し、実際のサンプルと比較する逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。チオバルビツール酸アッセイ（ＴＡＡ）(Hammond and Papermaster,1976)の修正バージョンを使用して、総シアル酸を測定した。各アッセイサンプルについて４〜５μｇの精製ＩＦＮ−γを使用し、実際のアッセイ前にシアリダーゼ（各０．００２５Ｕ）(Roche,Basel,Switzerland)処理を使用してＩＦＮ−γからシアル酸を切断する。これは、アッセイが遊離シアル酸のみを測定するからである。ＴＡＡを３回繰り返し、各サンプルを２連で行った。両側スチューデントＴ検定での比較で使用するために、全部で６〜８回測定した。さらに、ミセル電気運動キャピラリークロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）を使用して、ＩＦＮ−γの部位占有率も測定した。各サンプルにつき２回実施した。
【００７５】
［結果］
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現したＣＨＯ−ＩＦＮ−γ細胞株の確立〕
全長ＣＭＰ−ＳＡＴのＰＣＲ増幅を、前述のように、ＣＭＰ−ＳＡＴ ｃＤＮＡ周囲にデザインしたプライマーに基づいて行った。得られた配列は、アミノ酸１０３位でバリンからメチオニンに点変異していることを除き、公開されている配列とほぼ１００％類似していた。これは、サブクローニング手順時に得られた異なるクローンについての個別の配列決定時に繰り返し検出された（図２）。
【００７６】
ＣＭＰ−ＳＡＴの実際の三次元タンパク質構造は知られていないので、タンパク質の二次構造に及ぼすこの変異の影響を予想することは困難であった。したがって、この変異は、配列のサブクローニングのために使用されるタンパク質発現およびＰＣＲ産物にごくわずかしか影響を及ぼさないと予想された。
【００７７】
FLAG（商標）の存在により、内因性タンパク質から組換えＣＭＰ−ＳＡＴが分化するので、ＦＬＡＧ（商標）−ＣＭＰ−ＳＡＴ融合タンパク質を発現のために選択した。さらに、実際のタンパク質に対する抗体が利用できなかったので、ＦＬＡＧ（商標）融合タンパク質はタンパク質検出作業を容易にした。さらに、ヘマグルチニンタグ(Berninsone et al.,1997)のような他のエピトープタグと異なり、ＦＬＡＧ（商標）は、ＣＭＰ−ＳＡＴ(Eckhardt and Schahn,1997)の局在化および機能活性に影響を与えないことが示された。最終プラスミドｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴを、０．４〜０．６μｇ／ｍｌの濃度に精製した。
【００７８】
いくつかのコントロール細胞株を、過剰発現ＣＭＰ−ＳＡＴを含む実際の細胞株と共に産生した。ＣＨＯ ＩＦＮ−γを、ヌルベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ）でトランスフェクトし、１４個のコロニーを選別し、その後、拡大して細胞株を得た。１つのヌルベクター細胞株（ＩＢ．８）を、その後のシアリル化分析で使用した。非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞組をこれらの細胞株と共に成長させて継代歴を維持した。ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴを含むトランスフェクション細胞から３９個のコロニーを選別した。これらの細胞株のうちの４つ（ＩＣ．１７、ＩＣ．３０、ＩＣ．３７、およびＩＣ．３８）を、その後のシアリル化分析のために選択した。「選択の基本」を、次の節に記載する。
【００７９】
〔一過性にトランスフェクトした細胞における過剰発現ＣＭＰ−シアル酸輸送体のＦＡＣＳ分析〕
トランスフェクトした細胞中のＦＬＡＧ（商標）−ＣＭＰ−ＳＡＴ発現を検出するために、ＦＡＣＳ分析を行った。負のコントロールとして、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトした細胞を使用した。ＦＬＡＧ（商標）エピトープが依然として発現し、ＦＡＣＳによって検出されるので、ヌルベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇを使用しなかった。さらに、同一のトランスフェクション過程を経た負のコントロール細胞によって非トランスフェクション細胞よりも良好なコントロールが作製されることが見出された。ＦＡＣＳ分析の結果を図３に示す。予想通りの結果が得られた。比較の基準を確立するために、マーカー領域Ｍ１を使用して、負のコントロール中でより高い蛍光を発する細胞集団を１％と恣意に定義した。この同一のマーカー領域により、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴでトランスフェクトした細胞の細胞集団では１６．５％への増加と定義し、ＦＬＡＧ（商標）−ＣＭＰ−ＳＡＴの発現を示す。さらに、正のコントロール中の細胞集団の６．４％への増加は、ＦＬＡＧ（商標）−ルシフェラーゼの発現を示した。
【００８０】
一過性トランスフェクション実験由来の上記結果を使用して、安定な細胞株によって細胞集団がより高い蛍光を含むようにより有意にシフトすると予想された。したがって、このＦＡＣＳ手順を使用して、ＣＭＰ−ＳＡＴの相対発現のためのクローンをスクリーニングすることができる。しかし、集団のシフトを、安定なクローンのＦＡＣＳ分析で証明することができなかった。それにも関わらず、種々のクローン中の標識集団の比較により、リアルタイムＰＣＲを使用したさらなる分析およびシアリル化分析のために「高」発現、「中」発現、および「低」発現の無作為な選択が可能であった。前の節に記載するように、これにより、分析のために選択される４つの細胞株が得られた。
【００８１】
〔安定な細胞株中での過剰発現したＣＭＰ−シアル酸輸送体の検出のためのリアルタイムＰＣＲ〕
リアルタイムＰＣＲは、低レベルの転写物を検出するための高感度の方法と考えられる(Bustin,2000)。したがって、過剰発現ＣＨＯ ＩＦＮ−γクローン対非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γにおけるＣＭＰ−ＳＡＴの発現の比較に適切であると考えられた。さらに、選択された遺伝子領域の増幅におけるプライマーの特異性により、前の節に記載の２つのプライマー組ＴおよびＲ（配列番号１〜４）により、ＣＭＰ−ＳＡＴの総発現および組換え発現が比較されるであろう。リアルタイムＰＣＲの結果を、図４に示す。
【００８２】
リアルタイムＰＣＲから安定な細胞株について得た結果は、ＦＡＣＳ分析と比較してより決定的であった。この場合、ＣＭＰ−ＳＡＴの発現を安定な細胞株間で比較した場合、明らかな相違が認められた。図４の（Ａ）から、４つの各クローン（ＩＣ．１７、ＩＣ．３０、ＩＣ．３７、およびＩＣ．３８）が類似の閾値サイクルを有し、平均して、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γと比較して総ＣＭＰ−ＳＡＴの発現は１倍高かった。組換えＣＭＰ−ＳＡＴ発現を測定した場合、結果はさらにより明らかであった（Ｂ）。４つの各クローンは発現したのに対して、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γおよびＩＢ．８閾値サイクルは、テンプレートとして水を使用して行った負のコントロールと類似しており、プライマー−二量体形成に起因する蛍光によって閾値サイクルに到達した。これにより、クローンにおける組換えＣＭＰ−ＳＡＴ発現が確認され、正のクローンにおける総ＣＭＰ−ＳＡＴ発現全体が増加した。
【００８３】
〔安定な細胞株中での組換えＩＦＮ−γのシアリル化分析〕
ＣＭＰ−ＳＡＴ発現は、ＣＨＯ ＩＦＮ−γによって産生されるＩＦＮ−γのシアリル化範囲を改良すると予想された。ゴルジへのＣＭＰ−シアル酸の輸送能力の増加により、改良されたシアリル化のためのゴルジ内のＣＭＰ−シアル酸プールが増加するであろう。以下に記載するように、これは、ＣＭＰ−ＳＡＴを過剰発現する安定な細胞株の場合であることが見出された。図５は、ＩＦＮ−γの平均シアル酸含有量を測定したＴＡＡアッセイから得た結果を示し、シアル酸の量を分析したＩＦＮ−γに正規化している。認められるように、コントロール非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γ１モルあたり２．６１±０．０７ｍｏｌシアル酸）と比較した場合、選択した全ての陽性細胞株の平均ＩＦＮ−γシアル酸含有量は８．６％〜１６．１％増加した。さらに、ヌル細胞株（ＩＢ．８）の平均シアル酸含有量はＣＨＯ ＩＦＮ−γよりも低く、シアル酸増加の影響は、クローンの相違よりもしろＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現に起因することを示した。
【００８４】
ＩＦＮ−γの部位占有率を測定し、結果を図６に示す。予想通り、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現がタンパク質へのグリカンの移動（部位占有率に影響を与える）に影響を与えなかったので、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現は、ＩＦＮ−γの部位占有率に有意な影響を与えなかった。しかし、部位占有率データを使用して、利用可能なＮ結合部位数に対するＩＦＮ−γの平均シアル酸含有量を正規化して、式（１）などの部位シアリル化として公知のより正確な測定指数を得た。この正規化指数により、種々の条件で操作した場合に細胞が利用可能な部位をシアリル化する能力を直接考慮することができる。
【００８５】
【数１】
（式中、％２Ｎ、％１Ｎ、および０％Ｎは、それぞれ、２部位、１部位、および０部位グリコシル化ＩＦＮ−γの比率である）。
【００８６】
表１は、ＩＦＮ−γ部位シアリル化データを示す。ＩＣ．３７培養物から得たＩＦＮ−γについて分析したところ、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γに関するシアリル化の最大増加率は１６％であった。
【００８７】
【表１】
【００８８】
組換え糖タンパク質治療薬中のシアリル化を増加させるためにＣＭＰ−ＳＡＴを過剰発現させるためのこのアプローチを、本明細書中の他の場所で本発明者らの持てる知識を全て報告している。シアリル化を改良するための類似の遺伝子操作アプローチは、シアリルトランスフェラーゼの過剰発現を含む。シアリルトランスフェラーゼ操作によってＩＦＮ−γの２３％(Fukuta et al.,2000)およびＴＮＦＲ−ＩｇＧの３０％(Weikert et.al.,1999)のシアリル化が増加したことが報告されている。シアル酸前駆体（Ｎ−アセチルマンノサミン）の供給により、ＩＦＮ−γのシアリル化が１５％増加した(Gu & Wang,1998)。したがって、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現によって得られたシアリル化の増加は、過去のアプローチに類似している。したがって、このアプローチを、組換え糖タンパク質治療薬における新規のシアリル化改良手段と見なす。
【００８９】
［実施例２］
［材料と方法］
〔ＣＨＯ細胞株と培地〕
ＣＨＯ ＩＦＮ−γと呼ばれるヒトＩＦＮ−γを発現するＣＨＯ細胞株(Scahill et al.,1983)を、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現のために使用した。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株におけるヒトインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の遺伝子の同時トランスフェクションによってこの細胞株を作製した。接着細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(HyClone,Logan,UT)および０．２５μＭメトトレキセートを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Invitrogen,Grand Island,NY)中に維持した。安定なクローンの選択時に、７００μｇ／ｍｌのジェネテシン（商標）（Ｇ４１８）(Sigma)を添加した。非組換えＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、ＣＭＰ−シアル酸輸送体機能性実験およびＣＭＰ−シアル酸輸送体ｃＤＮＡを増幅するために使用されるｃＤＮＡテンプレートの生成のための正のコントロールとして使用した。これを、American Type Culture Collection(ATCC number CCL-61)(Manassas,VA)から入手した。ＣＨＯ−Ｋ１を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ中に保持した。ＣＨＯグリコシル化変異体（Ｌｅｃ２）を使用して、組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体の機能性を試験した。これを、American Type Culture Collection(ATCC number CRL-1736)(Manassas,VA)から入手した。Ｌｅｃ２を、小麦胚凝集素（シアル酸に結合するレクチン）に対する耐性によって単離した(Stanley & Siminovitch,1977)。Ｌｅｃ２細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(HyClone)を補足したα最小必須培地（ＭＥＭ）(Invitrogen)中に維持した。全接着細胞を、単層として固定Ｔフラスコで成長させ、３７℃の５％ＣＯ2大気下でインキュベートした。通常の継代培養時に０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ溶液(Sigma)の添加によって細胞をＴフラスコから引き離した。
【００９０】
〔チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）からの全長ｃＤＮＡ合成〕
以下のように、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬(Invitrogen)を使用して、総ＲＮＡを単離した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養物から採取し、１ｍｌのTRIzol（商標）試薬に再懸濁した。３ｍｌシリンジおよび２１ゲージのニードルを使用して、細胞をシリンジで５０回剪断した。１０分間のインキュベーション後、２００μｌの分子等級のクロロホルムを添加し、サンプルを、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。上部の水層を新規の無ＲＮＡｓｅチューブに移し、同体積のイソプロパノールを添加した。次いで、チューブを−２０℃で３時間以上インキュベートした。その後、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した後に、視覚可能なペレットが認められた。このペレットを、７５％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、風乾し、３５μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。GeneQuant(商標)Pro RNA/DNA Calculator(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を使用して、ＲＮＡを定量した。２６０ｎｍと２８０ｎｍとの吸光度の比を使用してＲＮＡの質を評価し、１．９およびそれ以上の比を十分な純度のＲＮＡの指標と見なした。製造者の説明書にしたがって、２μｌのImProm-II逆転写酵素(Promega,Madison,WI)および１μｇのオリゴｄＴ(Research Biolabs,Singapore)を含む４０μｌの反応物中で、第１のｃＤＮＡ鎖に対する１０μｇのＲＮＡの逆転写を４２℃で１時間行った。７０℃で５分間加熱して反応を停止させた。ＣＨＯ−Ｋ１ ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを、ＣＭＰ−シアル酸輸送体ｃＤＮＡの増幅のためのテンプレートとして使用した。
【００９１】
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅〕
以前にクローン化されたハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送体からデザインしたプライマーに基づいて、クローニングのために使用するＣＭＰ−シアル酸輸送体ｃＤＮＡを、ＣＨＯ−Ｋ１ ｃＤＮＡから増幅した(Eckhardt & Gerardy-Schahn,1997)。Ｎｈｅ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉ制限部位を、その後のサブクローニングのためにコード領域の上流および下流に移入した。使用した順方向プライマーは、
【化３】
であり、逆方向プライマーは、
【化４】
（移入した制限部位に下線を引き、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の組み込まれたコード領域を太字で示す）であった。プライマーストック(Research Biolabs)以外の全ＰＣＲ試薬は、Promega(Madison,WI)から購入した。５０μｌのＰＣＲ反応混合物は、４μｌのＣＨＯ Ｋ１ ｃＤＮＡテンプレート、１×Ｐｆｕ緩衝液、２５０μＭ ｄＮＴＰ、２μＭの各プライマー、および約１０ＵのＴａｑ−Ｐｆｕ ポリメラーゼミックスを含んでいた。サイクル条件は、９４℃で６分間の最初の変性、その後の９４℃で１分間、５９℃で１分間、７２℃で４分間を３０サイクル、および７２℃で８分間の最終伸長であった。
【００９２】
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現ベクターの構築〕
製造者の説明書にしたがって、ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニング（商標）のｐＣＲ（商標）２．１−ＴＯＰＯに最初にサブクローン化し、ＰＣＲ産物の配列を、以前にクローン化されたハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送体配列（GenBankアクセッション番号Y12074）との比較によって検証し、１００％類似していることが見出された。次いで、検証されたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）(Invitrogen)発現ベクターにサブクローン化した。次いで、配列を検証したプラスミドを含むクローンの拡大培養を行い、最終プラスミドｐｃＤＮＡ−ＳＡＴを、QIAfilter Plasmid Maxi(Qiagen,Valencia,CA)キットを使用して精製した。ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションの前に、プラスミド濃度を、DU(R)530 Life Science UV/Vis分光光度計(Beckman Coulter,Fullerton,CA)を使用して測定した。
【００９３】
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体を安定に過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンの生成〕
「純粋な」細胞集団から開始するためのトランスフェクションを可能にするために、親ＣＨＯ ＩＦＮ−γの単一細胞クローンを、限界希釈によって単離した。この単一細胞クローンは、元の親集団と比較した場合、類似の成長特性（単一細胞クローンおよび親ＣＨＯ ＩＦＮ−γについてそれぞれ０．０２５／時間対０．０２２／時間）およびＩＦＮ−γ産生特性（単一細胞クローンおよび親ＣＨＯ ＩＦＮ−γについてそれぞれ２．１×１０-8μｇ／細胞−時間対１．７×１０-8μｇ／細胞−時間）を有していた。次いで、Cell Line Nucleofector Kit T(Amaxa,Gaithersburg,MD)を使用したNucleofector Device(Amaxa)にてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション前に細胞を２日間継代し、密集度８０〜９０％でヌクレオフェクトした(nucleofected)。１００万個の細胞あたり約１０μｇの線状化プラスミドを使用した。トランスフェクションから４日後、培養培地を、選択のために７００μｇ／ｍｌＧ４１８(Sigma)を含む培地と置換した。Ｇ４１８選択を約２週間維持し、その後に安定にトランスフェクトされた細胞のプールが得られるのに対して、Ｇ４１８含有培地に曝露した非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γは１週間以内に死滅した。次いで、トランスフェクタントを、限界希釈によって単一細胞として単離して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体を安定に過剰発現する接着性細胞株を生成する。全部で３６個の単一細胞クローンを、下記のリアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロット分析を使用して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現についてスクリーニングした。４つのクローンを、組換えＩＦＮ−γ産物のその後のシアリル化分析のために選択した。非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γとヌルベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトした細胞との組も負のコントロールとして維持した。後者の場合、ヌルベクター細胞を単一クローンとしても単離し、これをさらなる分析のために無作為に選択した。
【００９４】
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体の機能性実験〕
ＣＭＰ−シアル酸輸送体を含む発現構築物ｐｃＤＮＡ−ＳＡＴを、前述のエレクトロポレーションによってＬｅｃ２細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後、ＦＡＣＳを使用して細胞を分析した。各単一細胞懸濁液（１５０万個の細胞）を、２０μｇ／ｍｌ ＷＧＡ−ＦＩＴＣ（Vector Laboratories,Burlingame,CA)またはＰＮＡ−ＦＩＴＣ(Vector Laboratories)と室温の暗所で１５分間インキュベートした。その後、細胞を、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma)を含むＰＢＳで洗浄し、その後、FACSCalibur(商標)System(BD Biosciences,San Jose,CA)を使用して分析した。添付のソフトウェア分析ツールを使用して、結果を計算した。
【００９５】
〔リアルタイムＰＣＲ〕
上記のように、一本鎖ｃＤＮＡを、安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株および負のコントロールから合成し、リアルタイムＰＣＲ反応でのテンプレートとして使用した。ABI PRISM(商標)7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の最初の変性、その後の９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間を４０サイクルであった。２５μｌ １×SYBR(商標)Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)の反応緩衝液は、７．５ｐｍｏｌの順方向プライマーおよび逆方向プライマーならびに１．２５μｌのｃＤＮＡテンプレートを含んでいた。ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の総発現および組換え発現の検出のためのプライマーを、図８に示すようにデザインした。ＣＨＯ β−アクチン検出のためのプライマーは、順方向プライマーとしての５’−AGCTGAGAGGGAAATTGTGCG−３’（配列番号１４）および逆方向プライマーとしての５’−GCAACGGAACCGCTCATT−３’（配列番号１５）であった。ｐｃＤＮＡ−ＳＡＴおよびＣＨＯ β−アクチンプラスミド(Dr Peter Morin,Bioprocessing Technology Instituteからの無料提供)の限界希釈を使用して、実施された各リアルタイムＰＣＲについての検量線を同時に作成した。サンプルおよび標準の両方を各実施について２連で実施した。添付のソフトウェア分析ツールを使用して、閾値サイクル（Ｃｔ）を、所与のサンプルが閾値の蛍光値と交差するサイクルと定義し、したがって、Ｃｔは出発ＤＮＡテンプレート量に比例する。Ｃｔ対プラスミド（ＤＮＡ）濃度の対数の線形プロットを内挿して、未知サンプルの濃度を見出した。それぞれの総ＣＭＰ−シアル酸輸送体濃度および組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体濃度を、その各β−アクチン濃度で正規化し、過剰発現クローン由来の各サンプルの結果を、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γサンプルから得た正規化濃度と比較した。
【００９６】
〔抗体〕
ハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送体のＣ末端領域（SwissProtアクセッション番号O08520）に対応するペプチド(CIQQEATSKERVIGV)（配列番号１６）を合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と抱合したこのペプチドに対するウサギ抗血清を生成した（Open Biosystems,Huntsville,AL)。いくつかの粗血清はまた、ＣＭＰ−シアル酸輸送体ポリクローナル抗体(Open Biosystems)を富化するために親和性精製したペプチドであり、これは、ウェスタンブロット分析の間に非特異的結合を減少させるのに役立った。抗ウサギＩｇＧ抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)を、二次検出のために使用した。正規化のためにアクチン発現を使用し、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体(Abcam)と共にアクチンに対するマウスモノクローナル抗体(Abcam,Cambridge,UK)を使用した。
【００９７】
〔ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析〕
約１０００万個の細胞を、安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株および負のコントロールから採取し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを溶解し、Eckhardt & Gerardy-Schahn(1997)に記載の条件下にて電気泳動のために還元した。同量のタンパク質溶解物を、Coomassie Plusタンパク質アッセイ(Pierce,Rockford,IL)を使用して調製した。５０μｇのタンパク質溶解物サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の１２％ポリアクリルアミドゲルにロードした。次いで、分画したタンパク質を、ＰＶＤＦ膜(Biorad,Hercules,CA)に電気ブロッティングした。膜を、５％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含むＰＢＳ−Ｔ（ブロッキング緩衝液）中で１時間ブロッキングし、その後、ブロッキング緩衝液で１０００倍希釈したポリクローナル抗ＣＭＰ−シアル酸輸送体抗体またはモノクローナル抗アクチン中にて４℃で一晩インキュベートした。翌日、膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、その後、ブロッキング緩衝液で１０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＭＰ−シアル酸輸送体の検出）または抗マウスＩｇＧ抗体（アクチンの検出）中で１時間インキュベートした。膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、その後、製造者の説明書にしたがって、膜をＥＣＬウェスタンブロット検出試薬(Amersham Biosciences)を使用した化学発光によって検出した。タンパク質バンドの強度を、Gel Doc XRシステム(Biorad)に添付のソフトウェア分析ツールを使用して定量した。特記しない限り、全てのインキュベーションを室温で行った。
【００９８】
〔ＩＦＮγのグリコシル化分析〕
ＩＦＮγのグリコシル化分析の詳細な手順は、以前に説明されている(Wong et al.,2005)。簡単に述べれば、安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株および負のコントロール由来の上清を、バッチ培養で細胞がコンフルエンシーに到達した時に採取した。上清を濾過し（０．２２μＭ）、精製マウス抗ＩＦＮγクローンＢ２７(BD Pharmigen,San Diego,CA)から作製した免疫親和性カラムによって精製した。既知のＩＦＮ−γ濃度の標準(Research Diagnostics Inc.,Flanders,NJ)で実施し、実際のサンプルと比較した逆相ＨＰＬＣを使用して、ＩＦＮ−γを定量した。Shimadzu LC-10ADvp HPLCシステム(Shimadzu Corporation,Kyoto,Japan)でVydac C18カラム（１ｍｍ×２５０ｍｍ）(Grace Vydac,Hesperia,CA)を使用した。サンプルを、３５％（ｖ／ｖ）〜６５％（ｖ／ｖ）の緩衝液Ｂの直線勾配（緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＨＰＬＣ用の水；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）のＨＰＬＣ用アセトニトリル）で、０．０６ｍｌ／分の流速にてサンプルを溶離した。次いで、シアリダーゼ処理を使用して精製ＩＦＮ−γサンプルからシアル酸を切断した後、ＩＦＮ−γの総シアル酸含有量を、チオバルビツール酸アッセイ(Hammond & Papermaster,1979)の修正バージョンを使用して測定した。ミセル電気運動キャピラリークロマトグラフィを使用して、ＩＦＮ−γの部位占有率を測定した。
【００９９】
［結果］
〔組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）の機能性試験〕
モデル細胞株ＣＨＯ ＩＦＮ−γは、内因性ＣＭＰ−シアル酸輸送体を含む。ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現構築物のトランスフェクションによって機能的組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体が得られ、輸送体活性が内因性ＣＭＰ−シアル酸輸送体のみに起因しないことを確認する必要があった。前に記載されているように、Ｌｅｃ２細胞株は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の欠失のために糖タンパク質をシアリル化することができないＣＨＯ変異細胞株である(Deutscher et al.,1984)。機能的ＣＭＰ−シアル酸輸送体のトランスフェクションによって欠失が補正され、シアリル化糖タンパク質が得られる。したがって、ＣＭＰ−シアル酸輸送体構築物を試験するためのアッセイを、この細胞株の特性に基づいてデザインすることができる。レクチンを使用して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現構築物のトランスフェクション前後のＬｅｃ２表面糖タンパク質の相違を検出した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に抱合した小麦胚凝集素（ＷＧＡ）およびピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）（それぞれシアル酸(Ishida et al.,1998)およびガラクトース(Aoki et al.,2001)に結合する）を、ＦＡＣＳ分析で使用した。レクチンがこの実験のためにシアリル化糖タンパク質と非シアリル化糖タンパク質とを区別する能力を有することを証明するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＬｅｃ２細胞によって産生された表面糖タンパク質を、ＦＡＣＳ分析でＷＧＡ−ＦＩＴＣおよびＰＮＡ−ＦＩＴＣを使用して検出した（図９Ａ、Ｂ）。予想通り、Ｌｅｃ２表面糖タンパク質は、ＣＨＯ−Ｋ１表面糖タンパク質と比較して、それぞれより低い蛍光およびより高い蛍光を有する細胞集団の相対的検出によって証明されるように、ＷＧＡ−ＦＩＴＣとの結合が弱く（図９Ａ）、ＰＮＡ−ＦＩＴＣとの結合が強かった（図９Ｂ）。Ｌｅｃ２細胞へのｐｃＤＮＡ−ＳＡＴの一過性トランスフェクションにより、ＷＧＡ−ＦＩＴＣをＦＡＣＳ分析のために使用した場合、小集団の１つが右にシフトする細胞の二峰性分布を示した（図１０Ａ）。これにより、組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体がこれらの細胞の変異体の欠失を修正することができるＬｅｃ２細胞の小集団におけるシアリル化糖タンパク質の結合が証明された。ＰＮＡ−ＦＩＴＣ（ガラクトース結合レクチン）ＦＡＣＳ分析で逆の効果が認められた場合、これらの結果が確認された（図１０Ｂ）。これにより、Ｌｅｃ２細胞の欠失を修正することができるｐｃＤＮＡ−ＳＡＴから発現されるＣＭＰ−シアル酸輸送体の機能性が証明された。得られた結果は、Ｌｅｃ２グリコシル化変異体の欠失を修正するＣＭＰ−シアル酸輸送体の能力についての以前に報告された分析と一致する(Aoki et al.,2001;Ishida et al.,1998)。したがって、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのｐｃＤＮＡ−ＳＡＴの類似のトランスフェクションにより、機能的ＣＭＰ−シアル酸輸送体が過剰発現するであろう。
【０１００】
〔安定な細胞株中で過剰発現したＣＭＰ−シアル酸輸送体の検出〕
非相同組換えによって宿主染色体に発現ベクターがほぼ単純に安定に組み込まれ、その組み込み部位は無作為に分布している(Kaufman,1990)。したがって、他の細胞操作アプローチと同様に、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現についてＣＨＯ ＩＦＮ−γサブクローンをスクリーニングする必要があった。ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現が、リアルタイムＰＣＲを使用して転写レベルで検出され、ウェスタンブロット分析を使用してタンパク質レベルで検出された。リアルタイムＰＣＲ分析は少量のｍＲＮＡの検出に有用なアッセイであることが証明されているので、ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物レベルを比較するためにリアルタイムＰＣＲ分析を選択した(Bustin,2000)。これは、７０〜８０桁と定量のダイナミックレンジが広く、技術的感度および精度が高い(Klein,2002)。さらに、選択された遺伝子領域の増幅におけるプライマーの特異性により、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の総発現と組換え発現とを比較することが可能であった（図８）（配列番号８〜１１）。
【０１０１】
ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する４つのクローンは、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γサンプルと比較して、総ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物が２〜２０倍に増加した（図１１）。組換え輸送体転写物の対応する増加が認められたので、これは、これらのクローン中の組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体発現に寄与し得る。これは、単離された４つのクローンがベクタートランスフェクションによってＣＭＰ−シアル酸輸送体発現がより高くなり、且つ、より高く内因性ＣＭＰ−シアル酸輸送体を発現する無作為なクローンの選択のみに起因しないことを示した。ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現は、ウェスタンブロット分析を使用してタンパク質レベルでも検出された（図１３）。
【０１０２】
総ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の増加倍率（図１１）により、一般に、輸送体タンパク質発現が増加し（図１３）、このことは、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の転写および翻訳過程で調節されない場合に予想される。しかし、輸送体転写レベルの増加倍率の範囲（約２〜２０倍）により、輸送体タンパク質の過剰発現の増加倍率が類似の範囲にならなかった（表２に示すように、約１．８〜２．８倍）。転写物の増加は常にタンパク質の良好な指標ではなく、それにより、両レベルでの発現プロフィールが必要であることが立証された(Cox et al.,2005)。さらに、首尾よく翻訳されたタンパク質が必ずしも機能的な形態に成熟するわけではないので、翻訳後修飾により、さらに複雑になる。最後に、位置を補正するために機能タンパク質はターゲティングもされなければならず、その後、細胞中でのその役割を果たすことができる。
【０１０３】
ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現の転写物とタンパク質レベルとの間のこの相関関係の欠如についての仮定の理由の１つは、細胞による輸送タンパク質発現の飽和である。ＣＭＰ−シアル酸輸送体は約３０ｋＤａの比較的小さなタンパク質であるが、正確に折り畳まれ、正確な膜トポロジーで挿入され、トランスゴルジ膜に局在化される必要があり、その後に機能的にＣＭＰ−シアル酸を輸送することができる膜貫通タンパク質である(Eckhardt and Gerady-Schahn,1997)。ＣＭＰ−シアル酸輸送体が１０個の膜貫通スパニング(spanning)ヘリックスを含むので(Eckhardt et al.,1999)、他の多経路膜貫通タンパク質(Lodish et al.,2000)と同様に、その正確な挿入はおそらく内部疎水性位相(topogenic)配列に依存するであろう。ＣＭＰ−シアル酸輸送体のターゲティングおよび局在化は、タンパク質配列の読み取り枠内のアミノ酸の特定の配列によって決定されるようである(Eckhardt et al.,1998)。組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体は、内因性ＣＭＰ−シアル酸輸送体を含むＣＨＯ−Ｋ１ ｃＤＮＡからクローン化されたので、正確な膜挿入およびトランスゴルジ局在化のために上記特性を有するであろう。それにもかかわらず、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の異種過剰発現が依然としてこの仮定の効率に影響を与えると主張する。例えば、ＥＲでの誤折り畳みにより、機能タンパク質として保持される代わりに分解のために組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体がターゲティングされるであろう。これにより、転写物発現の増加倍率と比較して、より狭い範囲の輸送体タンパク質の過剰発現の増加倍率が検出されるであろう。しかし、最終的に、ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現の現時点のレベルが組換えタンパク質産物（ＩＦＮ−γ）のシアリル化を改良するのに十分であるかどうかを考慮することがより重要であり、このことについては次に示す。
【０１０４】
〔ＩＦＮγグリコシル化に及ぼすＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現の影響〕
２つの量的指標を使用して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現するクローンと負のコントロール（非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γおよびヌルベクター細胞株）との間の組換えＩＦＮ−γのシアリル化範囲を比較した。ＩＦＮ−γシアル酸含有量（式２）は、タンパク質上の平均シアル酸量を測定する。ＩＦＮ−γが完全な部位占有率および２つの触角を持つ糖タンパク質のみを有すると考えられる場合、この糖タンパク質についてのＩＦＮγの分子（またはモル）あたりのシアル酸の４分子（またはモル）の理論上の最大値を計算することができる。
【０１０５】
【数２】
【０１０６】
しかし、ＩＦＮγの部位占有率は、決して１００％ではない。したがって、シアリル化範囲のより直接的な指標は、部位シアリル化である。この指標は、ＩＦＮγ上のシアル酸を利用可能なＮ結合部位に正規化する（式３）。この正規化により、細胞が所与の部位をシアリル化する能力を直接考慮することが可能である。したがって、これにより、細胞中のシアリル化過程の改良におけるＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現の有効性が直接測定されるようになる。
【０１０７】
【数３】
（式中、％２Ｎ、％１Ｎ、および０％Ｎは、それぞれ、２部位、１部位、および０部位グリコシル化ＩＦＮ−γの比率である）。ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現がシアリル化に影響を及ぼすので、ＩＦＮ−γの部位占有率は変化しないと予想され、これは、タンパク質へのオリゴサッカリドの輸送過程がシアリル化過程の上流であるからである。したがって、７８．５％２Ｎ、１８．０％１Ｎ、および３．５％０Ｎの平均部位占有率の使用により(Gu,1997)、ＩＦＮ−γの実際の最大シアル酸含有量は、ＩＦＮ−γ１モルあたり３．５モルのシアル酸と計算される。これにより、ＣＨＯ ＩＦＮ−γで達成することができる最大ＩＦＮ−γシアル酸含有量となる。
【０１０８】
ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する同一の４つの単一細胞クローンおよび負のコントロールを使用して、接着バッチ培養を行った。４つの各クローンは負のコントロールと比較した場合、ＩＦＮ−γシアル酸含有量の増加が認められた（図１４）。予想通り、ＩＦＮ−γ部位占有率は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現によって有意に影響を受けなかった（図１５）。部位シアリル化に関して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現範囲を、正規化ＩＦＮ−γシアル酸含有量と比較した（表２）。非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γと比較した場合、ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する単一細胞クローンのＩＦＮ−γ部位シアリル化が４〜１６％相対的に増加した。ＣＭＰ−シアル酸輸送体タンパク質レベルの増加倍率がより高かったクローン９および１５は、クローン２１および２６と比較して、対応するＩＦＮ−γ部位シアリル化がより改良されていることが認められた（表２）。これらの４つのクローンで認められた傾向により、この傾向が、ＩＦＮ−γ部位シアリル化を増加させるＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現であることをより決定的に推測することができる。クローン９および１５のＩＦＮ−γシアル酸含有量（表２）が先に記載したＩＦＮ−γ１モルあたりの実際の最大範囲が３．５モルのシアル酸であると考えられる場合、これらのクローンは、シアリル化が最大の組換えＩＦＮ−γを産生する。したがって、これらの結果は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現によってチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるシアリル化が増加するという仮説を確証する。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
［文献］
【表４Ａ】
【表４Ｂ】
【表４Ｃ】
【表４Ｄ】
【表４Ｅ】
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】リアルタイムＰＣＲ用のプライマーデザイン。全ＣＭＰ−ＳＡＴ発現を検出するために、ＣＭＰ−ＳＡＴ読み取り枠（ＯＲＦ）内のプライマー組Ｔをデザインした。５’プライマーは、５’−TGATAAGTGTTGGACTTTTAGC−３’（配列番号１）であり、３’プライマーは、５’−CTTCAGTTGATAGGTAACCTGG−３’（配列番号２）であった。組換え発現ＣＭＰ−ＳＡＴを検出するために、図に示すように、５’プライマーがＣＭＰ−ＳＡＴ ＯＲＦ内に存在し、且つ３’プライマーがＯＲＦおよびｐＣＭＶ−Ｔａｇプラスミド配列に隣接するようにプライマー組Ｒをデザインした。５’プライマーは、５’−CTGCAGCCATTGTTCTTTCTAC−３’（配列番号３）であり、３’プライマーは、５’−GTATCGATAAGCTTTCACACACC−３’（配列番号４）であった。
【図２】得られたＰＣＲ産物のタンパク質PSI-Blastの結果。得られたＤＮＡ配列を翻訳し、PSI-Blastを使用してblastを実施した。アミノ酸１０３にバリンからメチオニンへの点変異が認められた。
【図３】一過性にトランスフェクトされた細胞のＦＡＣＳ分析。細胞を、負のコントロールｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ａ）、実際のプラスミドｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴ（Ｂ）、および正のコントロールｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−Ｌｕｃ（Ｃ）で一過性にトランスフェクトした。マーカー領域Ｍ１を使用して、負のコントロールにおいて細胞集団の１％がより高い蛍光を発すると恣意に定義した。この同一のマーカー領域により、実際のプラスミドおよび正のコントロールでより高い蛍光を発するのはそれぞれ細胞集団の１６．５％および６．４％と定義した。したがって、各サンプル中でＦＬＡＧ−ＣＭＰ−ＳＡＴおよびＦＬＡＧ−ルシフェラーゼが発現した。
【図４】安定なＣＭＰ−ＳＡＴクローン対非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γのリアルタイムＰＣＲ分析。総ＣＭＰ−ＳＡＴ発現を比較した場合（Ａ）、陽性クローンにおける発現は、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γおよびヌル細胞株ＩＢ．８よりも高かった。組換えＣＭＰ−ＳＡＴ発現を比較した場合（Ｂ）、陽性クローンにおける発現はＣＨＯ ＩＦＮ−γおよびＩＢ．８よりも明らかに高く、後者のサンプルは負のコントロールにより近い閾値サイクル(threshold cycle)を有し、プライマー−二量体形成に起因する蛍光によって閾値サイクルに到達する。いずれの場合にも同量の出発テンプレートを使用したので、発現レベルをこの方法で比較することができる。閾値サイクルを、所与のサンプルが２０，０００の相対蛍光単位（ＲＦＵ）値と交差するサイクルと定義する。Ｗは、テンプレートとして水を使用した場合の負のコントロールを示す。
【図５】修飾チオバルビツール酸アッセイを使用したシアル酸分析(Hammond and Papermaster,1976)。１モルのＩＦＮγあたりのシアル酸のモル数で示す細胞株の平均シアル酸含有量は、以下であった：非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γ−２．６１±０．０７、ＩＣ．１７−２．８６±０．１６、ＩＣ．３０−２．８３±０．１７、ＩＣ．３７−３．０３±０．２１、ＩＣ．３８−２．８５±０．２１、ＩＢ．８−２．３０±０．２８。両側スチューデントＴ検定を使用して、安定な各細胞株の平均シアル酸含有量を、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γから得た値と比較した。得られたｐ値は０．０５未満であり、測定値は統計的に有意であると考えられる。比率は、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γを超える平均シアル酸含有量の増加率を示す。
【図６】ＭＥＫＣを使用したグリカン部位の占有率。非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γと比較した過剰発現ＣＭＰ−ＳＡＴ細胞株およびヌル細胞株の部位占有率に明らかな相違はなかった。いくつかの細胞株から得たＩＦＮγにおいてＯ部位グリコシル化ＩＦＮγを検出できなかった。各サンプルの２連の実験から標準偏差を得た。
【図７】シアリル化過程の略図。ＣＭＰ−シアル酸は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体によってサイトゾルからゴルジに輸送される。これは、ゴルジ細胞内腔へのＣＭＰ−シアル酸の侵入が細胞内腔からのＣＭＰの等モルの放出に関与する逆輸送機構によって生じる(Hirschberg et al.,1998)。次いで、シアリルトランスフェラーゼは、β１，４−ガラクトース受容体部位を有する、入ってきたポリペプチド鎖へのシアル酸の輸送のための補基質としてＣＭＰ−シアル酸を使用する。
【図８】総ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現および組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体発現を検出するために使用したリアルタイムＰＣＲプライマー。総ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現を検出するために、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の読み取り枠（ＯＲＦ）内にプライマー組Ｔをデザインした。順方向プライマーは、５’−TGATAAGTGTTGGACTTTTAGC−３’（配列番号８）であり、逆方向プライマーは、５’−CTTCAGTTGATAGGTAACCTGG−３’（配列番号９）であった。組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体を検出するために、順方向プライマーがｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター配列（５’−CTAGCGCCACCATGGCTCAGG−３’（配列番号１０））の一部であり、逆方向プライマーがＣＭＰ−シアル酸輸送体ＰＲＦ（５’−CTTCTGTGACACACACGGCTGTG−３’（配列番号１１））内に存在するようにプライマー組Ｒをデザインした。
【図９】（Ａ、Ｂ）ＷＧＡ−ＦＩＴＣ（Ａ）およびＰＮＡ−ＦＩＴＣ（Ｂ）を使用したＣＨＯ−Ｋ１およびＬｅｃ２細胞由来の表面糖タンパク質のＦＡＣＳ分析。Ｌｅｃ２細胞は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の欠失の結果としてその糖タンパク質をシアリル化することができず、表面糖タンパク質は、シアリル化されたＣＨＯ−Ｋ１由来の表面糖タンパク質よりもＷＧＡ−ＦＩＴＣに結合せず、ＰＮＡ−ＦＩＴＣに結合する。
【図１０】（Ａ、Ｂ）ＷＧＡ−ＦＩＴＣ（Ａ）およびＰＮＡ−ＦＩＴＣ（Ｂ）を使用したｐｃＤＮＡ−ＳＡＴ（Ｌｅｃ２−ＳＡＴ）で一過性にトランスフェクトしたＬｅｃ２細胞のＦＡＣＳ分析。恣意のＭ１ゲーティングを、より高い蛍光（プロットの右側）のＷＧＡ−ＦＩＴＣで染色したＬｅｃ２細胞の１％に設定した（Ａ）。Ｌｅｃ細胞集団の４０．９％が、Ｍ１ゲーティングに関するＷＧＡ−ＦＩＴＣ結合に反応した。同一のＭ１ゲーティングを、より低い蛍光（プロットの左側）のＰＮＡ−ＦＩＴＣで染色されたＬｅｃ２細胞の５％に設定した（Ｂ）。Ｌｅｃ２細胞集団の３７．３％が左にシフトし、Ｍ１ゲーティングに基づいたＰＮＡ−ＦＩＴＣとの結合がより少なかった。この実験を繰り返し、類似の結果が得られた。
【図１１】選択されたクローンおよび負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株における総ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の比較。クローン９、１５、２１、および２６についての非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γに関するＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の増加倍率は、１７．０±３．３、２０．１±０．９、５．６±０．６、および２．２±０．１であった。各サンプルについて、細胞ペレットを２回回収して、リアルタイムＰＣＲ分析用のｃＤＮＡサンプルを生成した。各リアルタイムＰＣＲの実施では、各サンプルを２連で実施する。
【図１２】選択されたクローンおよび負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株における組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の比較。より低い閾値サイクルによって示されるように、総ＣＭＰ−ＳＡＴ転写物の増加がより高いクローン９（◆）および１５（黒四角）は、対応するより高いレベルの組換えＣＭＰ−ＳＡＴ転写物を示す。クローン２１（黒三角）および２６（×）で類似の傾向が認められ、総ＣＭＰ−ＳＡＴ転写物の増加はより低かった。負のコントロールを、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ（●）およびヌルベクター細胞株（＊）によって示す。各サンプルについて、細胞ペレットを２回回収して、リアルタイムＰＣＲ分析用のｃＤＮＡサンプルを生成した。各リアルタイムＰＣＲの実施では、各サンプルを２連で実施する。この図は、反復分析の代表を示す。
【図１３】負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株と比較した場合にＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する接着安定性クローンのウェスタンブロット分析。ＣＭＰ−シアル酸輸送体を、以前の基準に基づいて約３０ｋＤａのバンドとして同定した(Berninsone et al.,1997;Eckhardt & Gerardy-Schahn,1997;Ishida et al.,1998)。
【図１４】負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株と比較した場合にＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する接着安定性クローンの組換えＩＦＮ−γシアル酸含有量（ｎ＝２）。スチューデントＴ検定によると、クローン９、１５、および２６由来のＩＦＮ−γシアル酸含有量の測定値は、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γと統計的に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＩＦＮ−γシアル酸含有量を測定するために使用されるチオバルビツール酸アッセイを２回行い、各サンプルを２回アッセイした。
【図１５】ＣＭＰ−シアル酸輸送体および負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株を過剰発現する接着安定性クローンの組換えＩＦＮ−γ部位の占有率。バーは、ＩＦＮ−γの２−Ｎ（斜線入り四角）、１−Ｎ（黒四角）、および０−Ｎ（□）グリカン部位の占有率を示す。比率は、２〜３回のミセル電気運動キャピラリークロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）から得た平均値を示す。
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の参照］
本出願は、2004年5月4日出願の米国特許仮出願番号60/567,458号（その開示全体が本明細書中に参照することにより組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、哺乳動物細胞におけるシアリル化糖タンパク質の発現のための方法および系に関する。
【背景技術】
【０００３】
SwissProtタンパク質データベースでの最近の調査により、全真核生物タンパク質の半分以上が糖タンパク質であり、これらの９０％がＮ結合糖タンパク質を含む可能性が高いと予想された(Apweiler et al.,1999)。これらの糖タンパク質の多くは、治療に適用するために哺乳動物細胞中で組換え産物として産生される(Andersen & Krummen,2002)。グリコシル化は、その溶解性、熱安定性、および生物活性などの糖タンパク質の重要な性質に影響を与えることが公知である(Jenkins & Curling,1994)。特に、末端糖シアル酸の存在により、シアル酸終結グリカンがアシアロ糖タンパク質受容体によって認識されないので(Weiss & Ashwell,1989)、インビボでの糖タンパク質の循環半減期が増加し、そうでなければ、糖タンパク質が分解の標的にされる。したがって、組換え糖タンパク質産生の目的の１つは、これらの組換え糖タンパク質を最大且つ一貫したシアリル化を達成することである。
【０００４】
グリコシル化は、ＥＲおよびゴルジ装置における一連の酵素触媒反応として起こる(Kornfeld and Kornfeld,1985;Varki,1993に概説)。反応の補基質としての機能を果たすヌクレオチド糖はサイトゾル中で合成され、ミクロソーム膜を透過することができる。したがって、ヌクレオチド糖輸送タンパク質は、ヌクレオチド糖をサイトゾルから細胞内腔に移動させるために存在する(Hirschberg & Snider,1987)。例として、末端シアリル化工程に関与する種々のタンパク質の相互作用を、本特許出願の図７に示す。糖タンパク質の不均一性は、この複雑な過程の異なる部分の変動に起因する。グリコシル化プロフィールを修飾するために使用されたグリコシル化操作アプローチは、グリコシルトランスフェラーゼ(Bailey et al.,1998;Grabenhorst et al.,1999に概説)およびグリコシダーゼ(Warner,1999に概説)の操作を含む。より予測可能且つ一貫した糖形態(glycoform)分布を得るために宿主グリコシル化経路の遺伝子操作が行われている。グリコシル化操作の１つのこのような領域は、より有効なタンパク質を産生するためのオリゴサッカリドを付加するためのそのポリペプチド鎖の変異(Koury,2003)またはオリゴサッカリドの位置の変異(Keyt et al.,1994)による既存の糖タンパク質のグリコシル化パターンの操作を含む。宿主グリコシル化経路の特定の介入を、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の移入もしくは過剰発現(Fukuta et al.,2000;Sburlati et al.,1998)または宿主細胞中での内因性グリコシル化遺伝子のアンチセンス阻害(Ferrari et al.,1998)によって行うことができる。
【０００５】
ヌクレオチド糖基質の利用可能性ならびにＥＲおよびゴルジによるこれらのタンパク質の輸送も、タンパク質グリコシル化範囲の重要な決定要因である(Hooker et al.,1999)。様々なグループが、シアリル化を改良するためにシアリルトランスフェラーゼを過剰発現させようとしてきた。チャイニーズハムスター卵巣細胞は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを含むが、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを含まず(Lee et al.,1989)、それにより、α２，３結合シアル酸のみを含む糖タンパク質が得られる。しかし、ヒト糖タンパク質は、α２，３結合シアル酸およびα２，６結合シアル酸の両方を含む。したがって、多数のグループが、α２，６結合シアル酸の欠如を克服するためにα２，６−シアリルトランスフェラーゼを過剰発現させようとしてきた(Minch et al.,1995;Lee et al.,1989)。さらに、多数のグループが、組換えタンパク質のシアリル化を改良するために、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ(Bragonzi et al.,2000;Jassal et al.,2001)および／またはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ(Fukuta et al.,2000;Weikert et al.,1999)を過剰発現させている。これにより、本出願の表３にまとめるように、種々の結果が得られている。
【０００６】
さらに、いくつかのグループが、シアル酸前駆体（Ｎ−アセチルマンノサミン）の供給によって組換えタンパク質のシアリル化を改良しようとしていた（本出願の表３）。Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）は、細胞内シアル酸プールの増加のための特異的前駆体であることが公知である(Pels Rijcken et al.,1995)。組換えヒトインターフェロン−γを産生するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ ＩＦＮ−γ）への２０ｍＭまでのＭａｎＮＡｃ供給の段階的増加によって細胞内シアル酸濃度が増加することが報告された。これにより、その後、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のシアリル化が１５％改良された(Gu and Wang,1998)。しかし、４０ｍＭのＭａｎＮＡｃの添加によってシアリル化改良の飽和が認められた。より興味深いことに、２０ｍＭのＭａｎＮＡｃを、組換えヒト化ＩｇＧ１を産生するＮＳ０細胞(Hills et al.,2001)に供給した場合、１２倍までの細胞内シアル酸濃度の増加が認められ、ＴＩＭＰ−Ｉを産生するＣＨＯ細胞およびＮＳ０細胞の両方(Baker et al.,2001)に供給した場合、組換えタンパク質のシアリル化の明らかな増加は認められなかった。
【０００７】
シアリル化するためにはシチジン一リン酸−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）をゴルジ装置に送達させなければならず、この輸送過程はシチジン一リン酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）の存在に依存する(Deutscher et al.(1984)Cell 39:295-299)。ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）は、ヌクレオチド糖輸送体ファミリーに属する。他のヌクレオチド糖輸送体と同様に、本特許出願の図７に示すように、ＣＭＰ−ＳＡＴは、ゴルジ膜上に存在し、ＣＭＰ−ＳＡが逆輸送機構によってゴルジに輸送される内在性膜貫通タンパク質である(Berninsone & Hirschberg,2000;Hirschberg et al.,1998;Hirschberg & Snider,1987;Kawakita et al.,1998に概説)。Betenbaugh and others(公開番号WO01/42492号で公開されたＰＣＴ特許出願)は、ヒトシアル酸シンセターゼが昆虫細胞中でのシアル酸産生を増加させ、それにより、タンパク質のシアリル化が改良されることを開示していた。さらに、Betenbaugh and others(公開番号US2002/0065404 A1で公開された米国特許出願およびWO01/42492号)は、ゴルジ装置へのＣＭＰ−ＳＡの存在を増加させ、それにより、昆虫細胞中の糖タンパク質のシアリル化を増強するためのショウジョウバエＣＭＰ−ＳＡＴ発現を増強する可能性について熟考している。
【０００８】
US2002/0065404 A1およびWO01/42492号に開示されているＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子配列を、以下の２つのGenBankエントリーとの１００％適合を明らかにするためにNCBI GenBankデータベースで検索した：
１）AF397530−キイロショウジョウバエＣＭＰ−シアル酸／ＵＤＰ−ガラクトース輸送体ｍＲＮＡ（完全なｃｄｓ）；および
２）AB055493−ＵＤＰ−ガラクトース輸送体の完全なｃｄｓのキイロショウジョウバエｕｇｔ ｍＲＮＡ。
【０００９】
第１のGenBankエントリーは、Betenbaugh et al.(2002年3月20日)によって直接提出され、第２のGenBankエントリーは、Segawa et al.(2003年1月15日)によって直接提出されていた。
【００１０】
Segawa et al.(2000)は、ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子をクローン化して発現した場合、ＵＤＰ−ガラクトースが輸送されるがＣＭＰ−シアル酸は輸送されないことが実験的に証明されたと報告している。さらに、彼らは、コードされたヌクレオチド糖輸送体がＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミンも輸送することを見出した。Aumiller and Jarvis,2002は、相同性検索によってＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子配列を得て、これがBetenbaugh et al.によって得られた配列に類似することが見出されたことを開示した。彼らは、その後、ヌクレオチド糖輸送遺伝子をクローン化し、遺伝子相補性アッセイおよび生化学アッセイによって糖輸送体遺伝子によってコードされるタンパク質がＵＤＰ−ガラクトースを輸送するが、ＣＭＰ−シアル酸を輸送しないことを見出した。したがって、ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子であると考えられているUS 2002/0065404 A1号およびWO01/42492号で引用されたショウジョウバエ遺伝子がＵＤＰ−ガラクトース輸送体をコードする遺伝子であることが判明した。したがって、US 2002/0065404 A1号およびWO01/42492号は、ＣＭＰ−ＳＡＴがＣＭＰ−ＳＡを輸送するといういかなる実証やいかなる他の証拠も提供していない。それどころか、Betenbaugh and othersは、ＣＭＰ−ＳＡではなくゴルジＵＤＰ−ガラクトースに輸送するＵＤＰ−ガラクトース輸送体を示していた。
【００１１】
したがって、ゴルジに輸送されるＣＭＰ−ＳＡの量に影響を与えるようにＣＭＰ−シアル酸輸送体系を調節することができるかどうかについてのさらなる調査が当分野で必要である。有効にシアリル化される糖タンパク質の産生のための別の系も当分野で必要である。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、上記問題に取り組み、特に、上記問題を軽減するか、社会に有用な選択肢を少なくとも提供するシアリル化糖タンパク質を産生する方法および系を提供する。特に、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種の発現を増強する工程を含む、細胞または細胞株での目的のシアリル化糖タンパク質の調製方法を提供する。本発明者らは、驚いたことに、内因性レベルを超えたＣＭＰ−ＳＡＴの産生の増強によってシアリル化糖タンパク質の産生が改良されることを見出した。特に、本発明の方法は、目的の糖タンパク質のシアル酸含有量を最大にする有効な方法である。糖タンパク質中の最大シアル酸含有量は、シアル酸受容体部位の利用可能性に基づき、１モルの糖タンパク質に結合することができるシアル酸の最大モル数と定義する。特に、真核細胞のシアル酸受容体部位は、β１，４−ガラクトースで終結するグリカンである。同様に、β１，４−ガラクトース部位の利用可能性は、以前の糖タンパク質プロセシング範囲および糖タンパク質のグリカン部位の占有に依存する。本発明の方法および系は、目的の哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞が含まれるが、これに限定されない）における複雑なシアリル化糖タンパク質の産生に有用である。
【００１３】
第１の態様によれば、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントまたは変種を産生する少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。哺乳動物細胞は、本発明の目的のための任意の適切な哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたはＣＨＯ細胞）であり得る。
【００１４】
本発明はまた、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴを産生する細胞を含む、例えば細胞培養物の形態の細胞株を提供する。
【００１５】
本発明は、内因性レベルを超えたレベルでＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質を発現するようなＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）遺伝子での細胞の遺伝子操作を含む。ＣＭＰ−ＳＡＴ発現の増加により、ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）のゴルジ装置への輸送が増加して内因性レベルを超えて糖タンパク質がシアリル化される。したがって、本発明は、ＣＭＰ−ＳＡＴをコードする遺伝子またはこの遺伝子を含む構築物で形質転換された少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。特に、哺乳動物細胞を、哺乳動物ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子で形質転換する。例えば、ヒトまたはＣＨＯのＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子で形質転換する。
【００１６】
本発明の１つの態様によれば、目的の細胞中でのＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変種の発現によってシアリル化を増加させる。したがって、本発明は、内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。特に、哺乳動物細胞は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種および内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する。少なくとも１つの糖タンパク質は、異種であり得る。糖タンパク質は、哺乳動物、例えば、ヒトまたはＣＨＯの糖タンパク質であり得る。しかし、本発明の目的のために有用な任意の他の糖タンパク質を産生することができる。特に、本発明の細胞を、目的のシアリル化糖タンパク質の複合体または混合物の産生のために使用することができる。
【００１７】
より詳細には、目的の糖タンパク質は、任意のＩＦＮ−γ、フラグメント、または変種であり得る。
【００１８】
したがって、本発明の哺乳動物細胞または細胞株を、異種タンパク質をコードする遺伝子またはこの遺伝子を含む構築物で形質転換することができる。例えば、細胞を、少なくとも１つのＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種をコードする遺伝子で形質転換する。
【００１９】
特に、本発明の哺乳動物細胞または細胞株は、ＣＨＯ細胞であってよく、前記細胞が内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種を産生し、前記細胞が内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する。シアリル化糖タンパク質は、少なくともＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種であり得る。
【００２０】
本発明の哺乳動物細胞は、単離細胞株であり得る。
【００２１】
別の態様によれば、本発明は、本発明の哺乳動物細胞または細胞株を含む少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質の発現用キットを提供する。
【００２２】
別の態様によれば、シアリル化オリゴサッカリドを有する糖タンパク質を産生するための方法および系を提供する。したがって、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種の発現を増強する工程を含む、細胞または細胞株でのシアリル化糖タンパク質の調製方法を提供する。さらなる態様によれば、シアリル化糖タンパク質はまた、内因性レベルを超えて発現する。より詳細には、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現によって糖タンパク質のシアリル化が最大になる。
【００２３】
特に、哺乳動物細胞または細胞株は、ＣＨＯ細胞株またはヒト細胞株であり得る。シアリル化糖タンパク質は、異種哺乳動物糖タンパク質であり得る。例えば、シアリル化糖タンパク質は、任意のＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種である。
【００２４】
別の態様によれば、本発明は、
（ａ）哺乳動物細胞を、内因性レベルを超えて、ＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、もしくは変種をコードする遺伝子また前記遺伝子を含む構築物で形質転換する工程と、
（ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの目的のシアリル化糖タンパク質をコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換する工程と
を含む、哺乳動物細胞または細胞株中で少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【００２５】
さらに、上記方法では、目的のシアリル化糖タンパク質を、内因性レベルを超えて産生することができる。この方法は、さらに、目的の糖タンパク質を単離する工程を含み得る。単離糖タンパク質を、薬学的組成物または治療組成物の形態で処方することができる。
【００２６】
さらに関連する態様では、本発明は、（ａ）細胞中の炭水化物基質を決定する工程と、
（ｂ）前記細胞をタンパク質で形質転換して、必要な前駆基質を産生する工程と、
（ｃ）前記細胞中のプロセシング経路を構築してシアリル化糖タンパク質を産生する工程とを含む、目的の哺乳動物細胞中でシアリル化糖タンパク質を産生する方法を含む。
【００２７】
種々のＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質が公知である。さらに、本発明の方法で使用されるＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が公知であるか、バイオインフォマティクス検索を使用して同定される。これらの配列を、本発明で使用することができる。
【００２８】
目的の適切な細胞には、哺乳動物細胞および細胞株が含まれる。ヒト細胞および細胞株も目的の細胞に含まれ、使用することができる。特に、目的の細胞には、治療糖タンパク質の産生に有用な哺乳動物細胞が含まれる。これらの細胞は未修飾状態であるか、治療糖タンパク質を発現するように事前に修飾されていてもよい。チャイニーズハムスター卵巣細胞は、治療用糖タンパク質の産生で特に有用であることが見出されている。既存の技術と組み合わせた本発明の治療薬の使用により、内因性レベルを超えてシアリル化する糖タンパク質が得られることを調査する。
【００２９】
本発明の方法および系を、治療に有益であり得る広範な糖タンパク質に使用することができる。特に、本発明は、血流中のタンパク質の循環時間を延長するために糖タンパク質のシアリル化が望ましい場合に有用である。例として、適切な糖タンパク質には、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が含まれる。
【００３０】
本発明の方法および系は、標的細胞を修飾して「ヒト」糖タンパク質を産生するために既存の技術と共に使用することができるさらなる遺伝子操作プロセスを提供する。本発明の方法および系によって修飾された細胞によって産生された糖タンパク質は、予想されるシアリル化量が増加し、それにより、血中の循環時間が増加するので有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本明細書中に記載の文献は、便宜上、文献リストの形態で列挙し、実施例の最後に添付する。このような文献の全内容は、本明細書中に参照することにより組み込まれる。
【００３２】
本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡＴの産生および／または糖タンパク質のシアリル化の増強によって目的の細胞における糖タンパク質産生の操作が可能である。
【００３３】
「目的の細胞」は、例えば、１）内因性ＣＭＰ−ＳＡレベルが細胞中の所望のレベルのシアリル化糖タンパク質の産生に十分ではない任意の細胞、２）ゴルジへのＣＭＰ−ＳＡの移入率を改良することが望ましい場合、３）ＣＭＰ−ＳＡＴの量または活性を改良または増強することが望ましい場合、または４）シアリル化糖タンパク質の産生を改良または最大にすることが望ましい場合を意図する。目的の細胞は、任意の哺乳動物細胞であり得る。例えば、ＣＨＯ細胞、ヒト細胞および細胞株も、目的の細胞に含まれ、本発明の方法で使用することができる。例えば、これらを使用して、ヒト細胞および／または細胞株（例えば、腎臓および肝臓など）中のシアリル化糖タンパク質を操作することができる。「所望のレベル」は、本発明の方法に細胞を供した後に目的の細胞から構成される生化学物質の量が変化することを意図する。この様式では、本発明は、目的の細胞中のＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質のレベルを操作する工程を含む。本発明の好ましい実施形態では、ＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質レベルの操作は、ＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質の過剰発現（すなわち、内因性レベルを超えたＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質レベルの増加）を含む。
【００３４】
本発明の目的のために、「発現の増強」は、所望のＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質をコードする核酸の翻訳産物および／または所望の糖タンパク質をコードする核酸の翻訳産物が、核酸を発現する宿主細胞中で前記タンパク質の内因性レベルより高いことを意味することを意図する。
【００３５】
「内因性」は、本発明の方法による細胞の操作前の天然に存在する細胞または組換え細胞中に存在する生物機能または生化学組成物の型および／または量を意味することを意図する。
【００３６】
「異種」は、本発明の方法による細胞の操作前の天然に存在する細胞または組換え細胞中に存在しない生物機能または生化学組成物の型および／または量を意味することを意図する。
【００３７】
本発明の目的のために、「異種糖ポリペプチドまたは糖タンパク質」は、糖ポリペプチドまたは糖タンパク質が通常発現する（天然に発現する）細胞種と異なる目的の細胞種中で発現した（すなわち、合成された）糖ポリペプチドまたは糖タンパク質を意味する。
【００３８】
本発明に関する内因性および異種の機能および組成物の決定方法は、本明細書中に提供され、そうでなければ、当分野で公知の方法を含む。
【００３９】
先行技術の文献は、いくつかの限定要因が細胞中での糖タンパク質の有効なシアリル化に影響を与えることを示していた。本発明者らは、シアリル化に利用可能なゴルジ中のＣＭＰ−シアル酸基質量の制限は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）を介したゴルジへのＣＭＰ−シアル酸輸送の制限によって生じることを提案する。したがって、本発明者らは、この制限を軽減するためにＣＭＰ−ＳＡＴを過剰発現させる。これにより、細胞中で産生される糖タンパク質（目的の組換えタンパク質が含まれる）のシアリル化が増加する。
【００４０】
ＣＭＰ−ＳＡＴは、その構造および輸送機能が非常に類似しているヌクレオチド糖輸送体ファミリーに属する(Berninsone & Hirschberg,2000;Hirschberg et al.,1998;Hirschberg & Snider,1987;Kawakita et al.,1998に概説)。ハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送体ｃＤＮＡは、以前にＬｅｃ２(Eckhardt & Gerardy-Schahn,1997)、ＣＭＰ−シアル酸輸送体が欠失したＣＨＯグリコシル化変異細胞株(Deutscher et al.,1984)の相補性クローニングによって単離されている。ＣＭＰ−シアル酸輸送体のヒトホモログ(Ishida et al.,1998)およびマウスホモログ(Berninsone et al.,1997)は、機能活性を有することが証明されており、同様にクローン化したハムスターホモログは類似の機能性を有すると予想される。この膜貫通タンパク質の膜トポロジーも広く研究されている(Eckhardt et al.,1999)。
【００４１】
本発明は、当分野で取り組まれている問題を解決し、上記問題を軽減するシアリル化糖タンパク質を産生するための有効な方法および系を提供する。特に、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種の発現を増強する工程を含む、細胞、単離細胞、または細胞株での目的のシアリル化糖タンパク質の調製方法を提供する。本発明者らは、驚いたことに、内因性レベルを超えたＣＭＰ−ＳＡＴの産生の増強によって糖タンパク質が有効にシアリル化されることを見出した。特に、本発明の方法は、目的の糖タンパク質のシアル酸含有量を最大化する有効な方法である。本発明の方法および系は、目的の哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞が含まれるが、これに限定されない）における複雑なシアリル化糖タンパク質の産生に有用である。
【００４２】
第１の態様によれば、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種産生する少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。哺乳動物細胞は、本発明の目的のための任意の適切な哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたはＣＨＯ細胞）であり得る。本発明はまた、内因性レベルを超えて目的のＣＭＰ−ＳＡＴおよび／またはシアリル化糖タンパク質を産生する細胞を含む、例えば細胞培養物の形態の細胞株を提供する。目的の適切な細胞には、哺乳動物細胞および細胞株が含まれる。ヒト細胞および細胞株も目的の細胞に含まれ、使用することができる。特に、目的の細胞には、治療糖タンパク質の産生に有用な哺乳動物細胞が含まれる。これらの細胞は未修飾状態であるか、治療糖タンパク質を発現するように事前に修飾されていてもよい。チャイニーズハムスター卵巣細胞は、治療用糖タンパク質の産生で特に有用であることが見出されている。既存の技術と組み合わせた本発明の技術の使用により、内因性レベルを超えてシアリル化する糖タンパク質が得られることを調査する。
【００４３】
本発明の１つの態様によれば、目的の細胞中でのＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変種の発現によってシアリル化を増加させる。したがって、本発明は、内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。特に、哺乳動物細胞は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種および内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する。少なくとも１つの糖タンパク質は、異種であり得る。糖タンパク質は、哺乳動物、例えば、ヒトまたはＣＨＯの糖タンパク質であり得る。しかし、本発明の目的のために有用な任意の他の糖タンパク質を産生することができる。特に、本発明の細胞を、目的のシアリル化糖タンパク質の複合体または混合物の産生のために使用することができる。
【００４４】
より詳細には、本発明の実験の一部で使用したモデル系は、ＣＨＯ ＩＦＮ−γ（ヒトＩＦＮ−γを産生するチャイニーズハムスター卵巣細胞株）であった。しかし、他の哺乳動物起源のＩＦＮ−γも使用することができる。さらに、他のＩＦＮ形態（例えば、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β）も使用することができる。ＩＦＮ−γは、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調整活性を有する分泌糖タンパク質である(Farrer & Schreiber,1993)。Ａｓｎ−２５およびＡｓｎ−９７に占有率が変化し得る２つの潜在的なＮ−グリコシル化部位が存在する。占有する場合、オリゴサッカリドは、主に２つの触角を持つ(biantennary)(Gu et al.,1997;Hooker et al.,1995)。したがって、目的の糖タンパク質は、ＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種であり得る。用語「そのフラグメントまたは変種」は、ＩＦＮ−γの生物活性を発現するフラグメントおよび／または変種を意図する。
【００４５】
したがって、本発明の哺乳動物細胞または細胞株を、ＣＭＰ−ＳＡＴおよび／または異種タンパク質をコードする遺伝子またはこの遺伝子を含む構築物で形質転換することができる。例えば、細胞を、少なくとも１つのＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種をコードする遺伝子で形質転換する。したがって、本発明は、内因性レベルを超えたレベルでＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質を発現するようなＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子での細胞の遺伝子操作を含む。ＣＭＰ−ＳＡＴ発現の増加により、ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）のゴルジ装置への輸送が増加して内因性レベルを超えて糖タンパク質がシアリル化される。したがって、本発明は、ＣＭＰ−ＳＡＴをコードする遺伝子またはこの遺伝子を含む構築物で形質転換された少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する。特に、哺乳動物細胞を、哺乳動物ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子で形質転換する。例えば、ヒトまたはＣＨＯのＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子で形質転換する。
【００４６】
当分野で公知の技術を使用した１つの細胞株中での複数の転写物（例えば、目的のＣＭＰ−ＳＡＴおよび／または糖タンパク質をコードする転写物）の発現クローニングは、所望のシアリル化反応を引き起こし、これらの反応を至適化する必要があり得る。あるいは、当分野で公知の技術を使用した複数のウイルスでの細胞の同時感染を使用して、複数の組換え転写物を同時に産生することもできる。さらに、プロモーターまたは初期プロモーターの調節下でいくつかを含む複数の外来遺伝子を組み込むプラスミドは、本発明の目的のために市販されているか、公的にされているか、利用可能であり、これを使用して適切な構築物を作製することができる。本発明は、これらの技術のいずれかの使用を含む。本発明はまた、目的の異種糖タンパク質の産生前に細胞中で所望のＣＭＰ−ＳＡＴが発現できるようにするための上記ベクター型の使用を含む。あるいは、目的のＣＭＰ−ＳＡＴおよび／または糖タンパク質の遺伝子を、当分野で公知のベクターを使用して宿主細胞ゲノムに直接組み込むことができる。さらに、１つまたは複数の異なる異種遺伝子を同時に構成性に発現する安定な形質転換体を産生するための連続形質転換ストラテジーを日常的に発生することができる。特に、本発明の哺乳動物細胞または細胞株は、ＣＨＯ細胞、単離細胞、または細胞株であってよく、前記細胞が内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種を産生し、前記細胞が内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する。シアリル化糖タンパク質は、少なくともＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種であり得る。本発明の哺乳動物細胞は、単離細胞株であり得る。
【００４７】
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の哺乳動物細胞または細胞株を含む少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質の発現用キットを提供する。
【００４８】
別の態様によれば、シアリル化オリゴサッカリドを有する糖タンパク質を産生するための方法および系を提供する。したがって、本発明は、内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、または変種の発現を増強する工程を含む、細胞または細胞株でのシアリル化糖タンパク質の調製方法を提供する。さらなる態様によれば、シアリル化糖タンパク質はまた、内因性レベルを超えて発現する。より詳細には、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現によって糖タンパク質のシアリル化が最大になる。特に、哺乳動物細胞または細胞株は、ＣＨＯ細胞株またはヒト細胞株であり得る。シアリル化糖タンパク質は、異種哺乳動物糖タンパク質であり得る。例えば、シアリル化糖タンパク質は、任意のＩＦＮ−γ、そのフラグメント、または変種である。
【００４９】
より詳細には、本発明では、著者は、ＣＨＯ ＩＦＮ−γ中でのハムスターＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現（すなわち、内因性レベルを超えた発現）を報告する。本発明者らは、本明細書中で、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現によって組換えＩＦＮ−γのシアリル化が改良されることを証明した。ＣＨＯ細胞におけるこのグリコシル化操作アプローチがどこかで報告されていることが知られていないので、本発明は、組換え糖タンパク質産生時のシアリル化を改良するための新規のアプローチを示す。
【００５０】
別の態様によれば、本発明は、（ａ）哺乳動物細胞を、内因性レベルを超えて、ＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメント、もしくは変種をコードする遺伝子また前記遺伝子を含む構築物で形質転換する工程と、
（ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの目的のシアリル化糖タンパク質をコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換する工程と
を含む、哺乳動物細胞または細胞株中で少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【００５１】
さらに、上記方法では、目的のシアリル化糖タンパク質を、内因性レベルを超えて産生することができる。この方法は、さらに、目的の糖タンパク質を単離する工程を含み得る。単離糖タンパク質を、薬学的組成物または治療組成物の形態で処方することができる。
【００５２】
さらに関連する態様では、本発明は、（ａ）細胞中の炭水化物基質を決定する工程と、
（ｂ）前記細胞をタンパク質で形質転換して、必要な前駆基質を産生する工程と、
（ｃ）前記細胞中のプロセシング経路を構築してシアリル化糖タンパク質を産生する工程とを含む、目的の哺乳動物細胞中でシアリル化糖タンパク質を産生する方法を含む。
【００５３】
細胞は、単離細胞または細胞株であり得る。
【００５４】
種々のＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質が公知である。さらに、本発明の方法で使用されるＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が公知であるか、バイオインフォマティクス検索を使用して同定される。これらの配列を、本発明で使用することができる。
【００５５】
本発明の方法および系を、治療に有益であり得る広範な糖タンパク質に使用することができる。特に、本発明は、血流中のタンパク質の循環時間を延長するために糖タンパク質のシアリル化が望ましい場合に有用である。例として、適切な糖タンパク質には、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が含まれる。
【００５６】
特に、本発明は、組換えタンパク質のシアリル化の改良のための新規のストラテジーを確立した。本発明者らは、本明細書中で、そのモデル細胞株（ＣＨＯ ＩＦＮ−γ）を使用して、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現によってＣＨＯ細胞中でシアリル化が増加することを確認した。ＣＭＰ−ＳＡＴを過剰発現するクローンによる４〜１６％のＩＦＮ−γシアリル化の増加は、既存のグリコシル化操作アプローチに匹敵した。実際、いくつかのクローンでは、ＣＭＰ−ＳＡＴのみの過剰発現がＩＦＮ−γを最大にシアリル化するのに十分であることも証明された。より有意には、所与のレベルのＩＦＮ−γ部位の占有および分岐のために、このストラテジーによって組換えタンパク質産物が最大限にシアリル化された。ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現によるゴルジでのＣＭＰ−シアル酸基質の利用可能性の増加は、いくつかの選択された単一の細胞クローンにおいて、組換えＩＮＦ−γを完全にシアリル化するのに十分であった。完全にシアリル化された糖タンパク質はインビボ循環半減期が延長するので、組換えタンパク質においてこれは理想的な例である。
【００５７】
ＣＭＰ−ＳＡＴ過剰発現ストラテジーの有効性は、グリコシル化機構における細胞型の変動および細胞のシアル酸の需要に依存する。細胞株が異なれば内因性ＣＭＰ−ＳＡＴ発現が変動するので、このストラテジーはＣＭＰ−ＳＡＴの少ない細胞株でより有効であるとわかるはずである。あるいは、外因性供給によって（例えば、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）供給によって）ＣＭＰ−シアル酸の供給を人為的に増加させる場合、過剰発現したＣＭＰ−シアル酸輸送体は、ゴルジへ増加したＣＭＰ−シアル酸基質を輸送するように作用し、この組み合わせアプローチによってシアリル化が改良される可能性がある。ＣＭＰ−ＳＡＴ過剰発現のみによってＩＦＮ−γで最大シアリル化が達成された場合、さらなるＭａｎＮＡｃ供給によってシアリル化をさらに改良することはできない。
【００５８】
細胞のシアル酸の需要は、ゴルジ細胞内腔中のβ１，４−ガラクトース受容体部位数に依存する(Baker et al.,2001)。これは、産生された組換え糖タンパク質の型およびそれによる関与するシアリル化量、ならびにその産生率または特異的産生性にも依存する。親ＣＨＯ ＩＦＮ−γが比較的高レベルでシアリル化されたＩＦＮ−γを産生することに留意すべきである（表２）。これは、ＣＨＯ ＩＦＮ−γが低収率の細胞株であることに一部寄与する可能性があり、単位時間あたりにゴルジを通過する組換えタンパク質分子少数であり、それによりシアリル化需要が低い。
【００５９】
詳細には、使用されるモデル糖タンパク質と比較して細胞株の組換えタンパク質の産生性が高いか基本的シアル酸含有量が低い場合、ＣＭＰ−ＳＡＴ過剰発現ストラテジーは、一般に、シアリル化を改良するための有用なストラテジーである。さらに、結果は、グリコシル化経路の遺伝子操作およびグリコシル化を改良するための多面的アプローチにおけるヌクレオチド糖供給のためのグリコシルトランスフェラーゼとの考慮されるＣＭＰ−ＳＡＴの可能性を証明する。例えば、ＣＭＰ−ＳＡＴと組み合わせたＮ−アセチルマンノサミン供給により、ゴルジへ増加したＣＭＰ−シアル酸基質が輸送され、シアリル化が改良される可能性が増大する。このような多面的アプローチを広範な種々の組換え糖タンパク質に適用することができ、哺乳動物細胞を使用して糖タンパク質産生で最大且つ一貫したシアリル化も達成可能である。
【００６０】
本発明は、本発明の細胞中での異種タンパク質の発現および／またはこのような発現から恩恵を受ける任意の目的のための本発明の方法を含む。このような目的には、タンパク質のインビボ循環半減期の増加；所望の量のタンパク質の産生；タンパク質の生物機能（酵素活性、結合能力、抗原性、治療特性、およびワクチンまたは診断ツールとしての能力などが含まれるが、これらに限定されない）の増加が含まれるが、これらに限定されない。このようなタンパク質は、天然に存在する化学的な合成タンパク質、または組換えタンパク質であり得る。本発明の異種発現から恩恵を受けるタンパク質の例には、トランスフェリン、プラスミノゲン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化物質、エリスロポイエエチン、インターロイキン、およびインターフェロンが含まれるが、これらに限定されない。このようなタンパク質の他の例には、国際特許出願公開番号WO98/06835号（その内容が、本明細書中に参照することにより組み込まれる）に記載のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、本発明の異種発現から恩恵を受けるタンパク質は、哺乳動物タンパク質である。この態様では、哺乳動物には、チャイニーズハムスター、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
ここに本発明を一般的に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照してより深く理解され、実施例は例示を目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【００６２】
当分野で公知であり、特に説明していない標準的な分子生物学技術は、一般に、Sambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(2001)に従う。
【００６３】
当業者は、目的の哺乳動物細胞にＣＭＰ−ＳＡＴタンパク質の遺伝子を移入するのに使用可能な種々の技術に精通している。詳細には、以下は、本発明者らが内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴを発現し、それにより、内因性レベルを超えて糖タンパク質のシアリル化を達成するための目的の細胞の遺伝子操作で有効であることを見出した許容可能なアプローチを立証する。当業者に認識されるように、この遺伝子操作および発現を、以下に記載のものと詳細が異なる方法を使用して達成することができる。例として、異なるベクターおよび宿主細胞を使用することができる。
【００６４】
［実施例１］
［材料と方法］
〔哺乳動物細胞株および培地〕
ヒトＩＦＮ−γを発現するＣＨＯ細胞株(Scahill et al.,1983)を、クローニング作業のために使用した。ＣＨＯ ＩＦＮ−γと呼ばれるこの細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(HyClone,Logan,UT)および０．２５μＭメトトレキセートを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Invitrogen,Grand Island,NY)で成長させた。このＤＨＦＲ細胞株における選択圧を維持するためにメトトレキセートを添加したが、以下に記載の安定な細胞株のジェネテシン選択時にこれを除去した。細胞を、単層としてＴフラスコで成長させ、３７℃の５％ＣＯ2大気下でインキュベートした。通常の継代培養時に０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ溶液(Sigma,St.Louis,MO)の添加によって細胞をＴフラスコから引き離した。
【００６５】
〔ＣＨＯ−Ｋ１からの全長ｃＤＮＡ合成〕
製造者の説明書にしたがって、SV Total RNA Isolation System(Promega,Madison,WI)によってＣＨＯ−Ｋ１から総ＲＮＡを調製した。全ての逆転写試薬は、Promegaから入手した。５×Ｍ−ＭＬＶ反応緩衝液、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、および２５単位の組換えRNAsin（商標）リボヌクレアーゼインヒビターを含む反応混合物中でモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ）を４２℃で１時間使用して、全長ｃＤＮＡを合成した。
【００６６】
〔ＣＭＰ−ＳＡＴのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅〕
ＣＨＯ−Ｋ１の総ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを、以前にクローン化されたハムスターＣＭＰ−ＳＡＴからデザインしたプライマーに基づいて、ＣＭＰ−ＳＡＴ ｃＤＮＡのコード領域を増幅するためのテンプレートとして使用した(Eckhardt and Schahn,1997)。BamHIおよびHindIII制限部位を、その後のサブクローニングのためにコード領域の上流および下流に移入した。使用した５’−ＰＣＲプライマーは
【化１】
であり、３’−ＰＣＲプライマーは、
【化２】
（移入した制限部位に下線を引き、ＣＭＰ−ＳＡＴの組み込まれたコード領域を太字で示す）であった。全ＰＣＲ試薬は、Promegaから入手した。反応混合物は、２μｌのＤＮＡテンプレート、１×Ｐｆｕ緩衝液、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマー、およびＴａｑ−Ｐｆｕポリメラーゼミックス（約５Ｕ）を含んでいた。ＰＣＲ条件は以下であった：９４℃で６分間、その後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１分間を３５サイクル、ならびに７２℃で８分間の最終伸長。
【００６７】
〔ＣＭＰ−ＳＡＴ発現ベクターの構築〕
ＰＣＲ産物を、配列決定用のｐＣＲ（商標）−ＴＯＰＯ（商標）(Invitrogen,Grand Island,NY)に最初にサブクローン化し、以前にクローン化されたハムスターＣＭＰ−ＳＡＴ配列と任意の変異について比較した。選択された発現ベクターは、Ｎ末端にＦＬＡＧ（商標）エピトープ（DYKDDDDK）（配列番号７）を含むｐＣＭＶ−Ｔａｇベクター(Strategene,La Jolla,CA)であった。検証されたＰＣＲ産物を、ｐＣＭＶ−Ｔａｇにサブクローン化し、再度配列決定した。融合タンパク質が産生されるべきであるので、正確な発現のためにＦＬＡＧ（商標）配列がＣＭＰ−ＳＡＴのコード領域にインフレームで確実に存在することが重要であった。最終プラスミドｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＳＡＴを、Maxi Plasmid Purification Kit(Qiagen,Hilden,Germany)を使用して精製し、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションのためにその濃度を定量した。
【００６８】
〔ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのＤＮＡの一過性および安定なトランスフェクション〕
実際のトランスフェクションを行う前に、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γを死滅させるのに必要なジェネテシンの最小濃度を決定するために、０．１μｇ／ｍｌと１．０μｇ／ｍｌとの間の種々のジェネテシン濃度(Sigma,St.Louis,MO)に対してＣＨＯ ＩＦＮ−γを滴定した。Fugene 6トランスフェクション試薬(Roche,Basel,Switzerland)を使用してトランスフェクションを行った。細胞を、ウェルあたり５０万個の細胞を含む６ウェルプレート中で一晩成長させ、翌日、ウェルあたり約１μｇの環状プラスミドでトランスフェクトした。製造者の説明書にしたがって、６：１の比のFugene 6トランスフェクション試薬（μｌ）：ＤＮＡ（μｇ）中でＦｕｇｅｎｅ−ＤＮＡ複合体を調製した。
【００６９】
一過性トランスフェクションのために、細胞を４８時間成長させ、その後にこれらをＦＡＣＳ分析のために採取する。安定な細胞株の生成のために、細胞を４８時間成長させ、その後に、培地を、初期の滴定実験で決定した７００μｇ／ｍｌのジェネテシンを含む選択培地と交換した。選択培地中の非トランスフェクション細胞が１週間以内に死滅した場合、細胞を選択培地中で３週間保持した。３週間後、ジェネテシン耐性コロニーが認められ、これらのコロニーを無作為に選別し、その後、安定な細胞株に拡大した。これらの細胞株を選択培中で６世代維持し、その後、ジェネテシンを除去した。
【００７０】
〔ＦＡＣＳ分析〕
抗ＦＬＡＧ（商標）Ｍ１マウスモノクローナル抗体(Sigma,St.Louis,MO)での細胞の細胞内標識によってＦＡＣＳ分析を行った。ＣＨＯ ＩＦＮ−γを、Fugene 6トランスフェクション試薬を使用して、以下のベクターで一過性にトランスフェクトした：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）(Invitrogen,Grand Island,NY)、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−Ｌｕｃ(Strategene,La Jolla,CA)、およびｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴ。ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−Ｌｕｃは、ＦＬＡＧ（商標）−ルシフェラーゼタンパク質を発現する正のコントロールベクターである。約１５０万個の細胞を、各ＦＡＣＳ調製物で使用した。細胞をＰＢＳで洗浄し、再懸濁して単一細胞の懸濁液を得た。この懸濁液を固定し、Fix & Perm（商標）細胞透過処理キット(Caltag Laboratories,Burlingame,CA)を使用して透過処理した。次いで、これらを、抗ＦＬＡＧ（商標）Ｍ１マウスモノクローナル抗体の８７０倍希釈物で１５分間標識した。その後、細胞を、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma)を含むＰＢＳ（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄し、二次抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ(Dako,Copenhagan,Denmark)の５００倍希釈物と暗所で１５分間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳでの最終洗浄後、細胞を新鮮な１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁し、FACSCalibur（商標）システム(BD Biosciences,San Jose,CA)を使用して分析した。結果を、分析ツールに付属のソフトウェアを使用して分析した。
【００７１】
〔ＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンからの総ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成〕
約１０００万個の細胞を、安定な細胞株から採取し、以下のようにTRIzol（商標）試薬(Invitrogen,Grand Island,NY)を使用して、総ＲＮＡを抽出した。細胞を、１ｍｌのTrizol(商標)試薬に再懸濁し、２１Ｇニードルを有するシリンジで５０回剪断した。細胞を、室温で約１０分間インキュベートした。２００μｌのクロロホルムを添加し、３０秒間激しく混合した。次いで、サンプルを、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。上部の水層を新規の無ＲＮＡｓｅチューブに移し、同体積のイソプロパノールを添加した。次いで、チューブを−２０℃で２時間以上インキュベートした。その後、チューブを、氷上で解凍し、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。視覚可能なＲＮＡペレットが、チューブの底に認められた。上清を吸引し、ペレットを０．５ｍｌの７５％（ｗ／ｖ）エタノールで洗浄した。次いで、ペレットを、１４，０００ｒｐｍにて４℃で２分間遠心分離し、エタノールを除去した。ＲＮＡペレットを風乾し、３５μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。GeneQuant(商標)Pro RNA/DNA Calculator(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を使用したＲＮＡ定量のために、サンプルを採取した。２６０ｎｍと２８０ｎｍとの吸光度の比を使用してＲＮＡの質を評価し、１．９およびそれ以上の比を十分な純度のＲＮＡの指標と見なした。
【００７２】
ＲＮＡ濃度に基づいて、１０μｇのＲＮＡを使用して、第１のｃＤＮＡ鎖を合成した。製造者の説明書にしたがって４００ＵのＩｍｐｒｏｍ−ＩＩ逆転写酵素および０．５μｇのランダムプライマー(Promega,Madison,WI)を使用して、４２℃で６０分間逆転写を行った。７０℃で５分間加熱して反応を停止させ、ｃＤＮＡをその後のリアルタイムＰＣＲ分析のために使用した。
【００７３】
〔リアルタイムＰＣＲ〕
iCycler iQ(Biorad,Hercules,CA)(Professor Heng-Phon Tooからの無料提供)(Singapore-MIT Alliance,National University of Singapore)を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下であった：９５℃で３分間、その後、９５℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間を４０サイクル。アニーリング時に蛍光検出を行った。１００μｌの１×XtensaMix-SG（商標）(BioWORKs)の反応緩衝液は、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｐｍｏｌ順方向および逆方向プライマー、１．０Ｕ DyNAzyme II(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)、および５μｌの上記のように調製したＣＨＯ ＩＦＮ−γサンプル由来のｃＤＮＡを含んでいた。４０μｌアリコート中のサンプルを、各実施中に２連で実施した。総ＣＭＰ−ＳＡＴおよび組換え発現ＣＭＰ−ＳＡＴの検出のためのプライマーを、図１に示すようにデザインした（配列番号１〜４）。
【００７４】
〔ＩＦＮγのシアリル化分析〕
安定なクローンおよび非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γの培養物を、２５ｍｌの培地を含むＴ１５０培養フラスコ中に２．５Ｅ６細胞で播種した。以下に記載するように、分析した安定なクローンは、ＩＣ．１７、ＩＣ．３０、ＩＣ．３７、ＩＣ．３８、およびＩＢ．８であった。ｔ＝９２時間（培養物のピーク密度時間）の培養で上清を採取した。回収した上清を、２つのフラスコにプールし、その後のＩＦＮ−γ分析のために使用した。Gu(MIT,PhD Thesis,1997)による以前の研究に基づいたBioprocessing Technology Instituteの独自の至適化された分析手順を使用して、ＩＦＮ−γ分析を行った。まとめると、上清をＩＦＮ−γについて免疫精製した。次いで、この精製されたＩＦＮ−γを、既知濃度のＩＦＮ−γ標準を溶離し、実際のサンプルと比較する逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。チオバルビツール酸アッセイ（ＴＡＡ）(Hammond and Papermaster,1976)の修正バージョンを使用して、総シアル酸を測定した。各アッセイサンプルについて４〜５μｇの精製ＩＦＮ−γを使用し、実際のアッセイ前にシアリダーゼ（各０．００２５Ｕ）(Roche,Basel,Switzerland)処理を使用してＩＦＮ−γからシアル酸を切断する。これは、アッセイが遊離シアル酸のみを測定するからである。ＴＡＡを３回繰り返し、各サンプルを２連で行った。両側スチューデントＴ検定での比較で使用するために、全部で６〜８回測定した。さらに、ミセル電気運動キャピラリークロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）を使用して、ＩＦＮ−γの部位占有率も測定した。各サンプルにつき２回実施した。
【００７５】
［結果］
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現したＣＨＯ−ＩＦＮ−γ細胞株の確立〕
全長ＣＭＰ−ＳＡＴのＰＣＲ増幅を、前述のように、ＣＭＰ−ＳＡＴ ｃＤＮＡ周囲にデザインしたプライマーに基づいて行った。得られた配列は、アミノ酸１０３位でバリンからメチオニンに点変異していることを除き、公開されている配列とほぼ１００％類似していた。これは、サブクローニング手順時に得られた異なるクローンについての個別の配列決定時に繰り返し検出された（図２）。
【００７６】
ＣＭＰ−ＳＡＴの実際の三次元タンパク質構造は知られていないので、タンパク質の二次構造に及ぼすこの変異の影響を予想することは困難であった。したがって、この変異は、配列のサブクローニングのために使用されるタンパク質発現およびＰＣＲ産物にごくわずかしか影響を及ぼさないと予想された。
【００７７】
FLAG（商標）の存在により、内因性タンパク質から組換えＣＭＰ−ＳＡＴが分化するので、ＦＬＡＧ（商標）−ＣＭＰ−ＳＡＴ融合タンパク質を発現のために選択した。さらに、実際のタンパク質に対する抗体が利用できなかったので、ＦＬＡＧ（商標）融合タンパク質はタンパク質検出作業を容易にした。さらに、ヘマグルチニンタグ(Berninsone et al.,1997)のような他のエピトープタグと異なり、ＦＬＡＧ（商標）は、ＣＭＰ−ＳＡＴ(Eckhardt and Schahn,1997)の局在化および機能活性に影響を与えないことが示された。最終プラスミドｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴを、０．４〜０．６μｇ／ｍｌの濃度に精製した。
【００７８】
いくつかのコントロール細胞株を、過剰発現ＣＭＰ−ＳＡＴを含む実際の細胞株と共に産生した。ＣＨＯ ＩＦＮ−γを、ヌルベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ）でトランスフェクトし、１４個のコロニーを選別し、その後、拡大して細胞株を得た。１つのヌルベクター細胞株（ＩＢ．８）を、その後のシアリル化分析で使用した。非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞組をこれらの細胞株と共に成長させて継代歴を維持した。ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴを含むトランスフェクション細胞から３９個のコロニーを選別した。これらの細胞株のうちの４つ（ＩＣ．１７、ＩＣ．３０、ＩＣ．３７、およびＩＣ．３８）を、その後のシアリル化分析のために選択した。「選択の基本」を、次の節に記載する。
【００７９】
〔一過性にトランスフェクトした細胞における過剰発現ＣＭＰ−シアル酸輸送体のＦＡＣＳ分析〕
トランスフェクトした細胞中のＦＬＡＧ（商標）−ＣＭＰ−ＳＡＴ発現を検出するために、ＦＡＣＳ分析を行った。負のコントロールとして、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトした細胞を使用した。ＦＬＡＧ（商標）エピトープが依然として発現し、ＦＡＣＳによって検出されるので、ヌルベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇを使用しなかった。さらに、同一のトランスフェクション過程を経た負のコントロール細胞によって非トランスフェクション細胞よりも良好なコントロールが作製されることが見出された。ＦＡＣＳ分析の結果を図３に示す。予想通りの結果が得られた。比較の基準を確立するために、マーカー領域Ｍ１を使用して、負のコントロール中でより高い蛍光を発する細胞集団を１％と恣意に定義した。この同一のマーカー領域により、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴでトランスフェクトした細胞の細胞集団では１６．５％への増加と定義し、ＦＬＡＧ（商標）−ＣＭＰ−ＳＡＴの発現を示す。さらに、正のコントロール中の細胞集団の６．４％への増加は、ＦＬＡＧ（商標）−ルシフェラーゼの発現を示した。
【００８０】
一過性トランスフェクション実験由来の上記結果を使用して、安定な細胞株によって細胞集団がより高い蛍光を含むようにより有意にシフトすると予想された。したがって、このＦＡＣＳ手順を使用して、ＣＭＰ−ＳＡＴの相対発現のためのクローンをスクリーニングすることができる。しかし、集団のシフトを、安定なクローンのＦＡＣＳ分析で証明することができなかった。それにも関わらず、種々のクローン中の標識集団の比較により、リアルタイムＰＣＲを使用したさらなる分析およびシアリル化分析のために「高」発現、「中」発現、および「低」発現の無作為な選択が可能であった。前の節に記載するように、これにより、分析のために選択される４つの細胞株が得られた。
【００８１】
〔安定な細胞株中での過剰発現したＣＭＰ−シアル酸輸送体の検出のためのリアルタイムＰＣＲ〕
リアルタイムＰＣＲは、低レベルの転写物を検出するための高感度の方法と考えられる(Bustin,2000)。したがって、過剰発現ＣＨＯ ＩＦＮ−γクローン対非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γにおけるＣＭＰ−ＳＡＴの発現の比較に適切であると考えられた。さらに、選択された遺伝子領域の増幅におけるプライマーの特異性により、前の節に記載の２つのプライマー組ＴおよびＲ（配列番号１〜４）により、ＣＭＰ−ＳＡＴの総発現および組換え発現が比較されるであろう。リアルタイムＰＣＲの結果を、図４に示す。
【００８２】
リアルタイムＰＣＲから安定な細胞株について得た結果は、ＦＡＣＳ分析と比較してより決定的であった。この場合、ＣＭＰ−ＳＡＴの発現を安定な細胞株間で比較した場合、明らかな相違が認められた。図４の（Ａ）から、４つの各クローン（ＩＣ．１７、ＩＣ．３０、ＩＣ．３７、およびＩＣ．３８）が類似の閾値サイクルを有し、平均して、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γと比較して総ＣＭＰ−ＳＡＴの発現は１倍高かった。組換えＣＭＰ−ＳＡＴ発現を測定した場合、結果はさらにより明らかであった（Ｂ）。４つの各クローンは発現したのに対して、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γおよびＩＢ．８閾値サイクルは、テンプレートとして水を使用して行った負のコントロールと類似しており、プライマー−二量体形成に起因する蛍光によって閾値サイクルに到達した。これにより、クローンにおける組換えＣＭＰ−ＳＡＴ発現が確認され、正のクローンにおける総ＣＭＰ−ＳＡＴ発現全体が増加した。
【００８３】
〔安定な細胞株中での組換えＩＦＮ−γのシアリル化分析〕
ＣＭＰ−ＳＡＴ発現は、ＣＨＯ ＩＦＮ−γによって産生されるＩＦＮ−γのシアリル化範囲を改良すると予想された。ゴルジへのＣＭＰ−シアル酸の輸送能力の増加により、改良されたシアリル化のためのゴルジ内のＣＭＰ−シアル酸プールが増加するであろう。以下に記載するように、これは、ＣＭＰ−ＳＡＴを過剰発現する安定な細胞株の場合であることが見出された。図５は、ＩＦＮ−γの平均シアル酸含有量を測定したＴＡＡアッセイから得た結果を示し、シアル酸の量を分析したＩＦＮ−γに正規化している。認められるように、コントロール非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γ１モルあたり２．６１±０．０７ｍｏｌシアル酸）と比較した場合、選択した全ての陽性細胞株の平均ＩＦＮ−γシアル酸含有量は８．６％〜１６．１％増加した。さらに、ヌル細胞株（ＩＢ．８）の平均シアル酸含有量はＣＨＯ ＩＦＮ−γよりも低く、シアル酸増加の影響は、クローンの相違よりもしろＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現に起因することを示した。
【００８４】
ＩＦＮ−γの部位占有率を測定し、結果を図６に示す。予想通り、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現がタンパク質へのグリカンの移動（部位占有率に影響を与える）に影響を与えなかったので、ＣＭＰ−ＳＡＴの過剰発現は、ＩＦＮ−γの部位占有率に有意な影響を与えなかった。しかし、部位占有率データを使用して、利用可能なＮ結合部位数に対するＩＦＮ−γの平均シアル酸含有量を正規化して、式（１）などの部位シアリル化として公知のより正確な測定指数を得た。この正規化指数により、種々の条件で操作した場合に細胞が利用可能な部位をシアリル化する能力を直接考慮することができる。
【００８５】
【数１】
（式中、％２Ｎ、％１Ｎ、および０％Ｎは、それぞれ、２部位、１部位、および０部位グリコシル化ＩＦＮ−γの比率である）。
【００８６】
表１は、ＩＦＮ−γ部位シアリル化データを示す。ＩＣ．３７培養物から得たＩＦＮ−γについて分析したところ、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γに関するシアリル化の最大増加率は１６％であった。
【００８７】
【表１】
【００８８】
組換え糖タンパク質治療薬中のシアリル化を増加させるためにＣＭＰ−ＳＡＴを過剰発現させるためのこのアプローチを、本明細書中の他の場所で本発明者らの持てる知識を全て報告している。シアリル化を改良するための類似の遺伝子操作アプローチは、シアリルトランスフェラーゼの過剰発現を含む。シアリルトランスフェラーゼ操作によってＩＦＮ−γの２３％(Fukuta et al.,2000)およびＴＮＦＲ−ＩｇＧの３０％(Weikert et.al.,1999)のシアリル化が増加したことが報告されている。シアル酸前駆体（Ｎ−アセチルマンノサミン）の供給により、ＩＦＮ−γのシアリル化が１５％増加した(Gu & Wang,1998)。したがって、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現によって得られたシアリル化の増加は、過去のアプローチに類似している。したがって、このアプローチを、組換え糖タンパク質治療薬における新規のシアリル化改良手段と見なす。
【００８９】
［実施例２］
［材料と方法］
〔ＣＨＯ細胞株と培地〕
ＣＨＯ ＩＦＮ−γと呼ばれるヒトＩＦＮ−γを発現するＣＨＯ細胞株(Scahill et al.,1983)を、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現のために使用した。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株におけるヒトインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の遺伝子の同時トランスフェクションによってこの細胞株を作製した。接着細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(HyClone,Logan,UT)および０．２５μＭメトトレキセートを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Invitrogen,Grand Island,NY)中に維持した。安定なクローンの選択時に、７００μｇ／ｍｌのジェネテシン（商標）（Ｇ４１８）(Sigma)を添加した。非組換えＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、ＣＭＰ−シアル酸輸送体機能性実験およびＣＭＰ−シアル酸輸送体ｃＤＮＡを増幅するために使用されるｃＤＮＡテンプレートの生成のための正のコントロールとして使用した。これを、American Type Culture Collection(ATCC number CCL-61)(Manassas,VA)から入手した。ＣＨＯ−Ｋ１を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ中に保持した。ＣＨＯグリコシル化変異体（Ｌｅｃ２）を使用して、組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体の機能性を試験した。これを、American Type Culture Collection(ATCC number CRL-1736)(Manassas,VA)から入手した。Ｌｅｃ２を、小麦胚凝集素（シアル酸に結合するレクチン）に対する耐性によって単離した(Stanley & Siminovitch,1977)。Ｌｅｃ２細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(HyClone)を補足したα最小必須培地（ＭＥＭ）(Invitrogen)中に維持した。全接着細胞を、単層として固定Ｔフラスコで成長させ、３７℃の５％ＣＯ2大気下でインキュベートした。通常の継代培養時に０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ溶液(Sigma)の添加によって細胞をＴフラスコから引き離した。
【００９０】
〔チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）からの全長ｃＤＮＡ合成〕
以下のように、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬(Invitrogen)を使用して、総ＲＮＡを単離した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養物から採取し、１ｍｌのTRIzol（商標）試薬に再懸濁した。３ｍｌシリンジおよび２１ゲージのニードルを使用して、細胞をシリンジで５０回剪断した。１０分間のインキュベーション後、２００μｌの分子等級のクロロホルムを添加し、サンプルを、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。上部の水層を新規の無ＲＮＡｓｅチューブに移し、同体積のイソプロパノールを添加した。次いで、チューブを−２０℃で３時間以上インキュベートした。その後、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した後に、視覚可能なペレットが認められた。このペレットを、７５％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、風乾し、３５μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。GeneQuant(商標)Pro RNA/DNA Calculator(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を使用して、ＲＮＡを定量した。２６０ｎｍと２８０ｎｍとの吸光度の比を使用してＲＮＡの質を評価し、１．９およびそれ以上の比を十分な純度のＲＮＡの指標と見なした。製造者の説明書にしたがって、２μｌのImProm-II逆転写酵素(Promega,Madison,WI)および１μｇのオリゴｄＴ(Research Biolabs,Singapore)を含む４０μｌの反応物中で、第１のｃＤＮＡ鎖に対する１０μｇのＲＮＡの逆転写を４２℃で１時間行った。７０℃で５分間加熱して反応を停止させた。ＣＨＯ−Ｋ１ ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを、ＣＭＰ−シアル酸輸送体ｃＤＮＡの増幅のためのテンプレートとして使用した。
【００９１】
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅〕
以前にクローン化されたハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送体からデザインしたプライマーに基づいて、クローニングのために使用するＣＭＰ−シアル酸輸送体ｃＤＮＡを、ＣＨＯ−Ｋ１ ｃＤＮＡから増幅した(Eckhardt & Gerardy-Schahn,1997)。Ｎｈｅ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉ制限部位を、その後のサブクローニングのためにコード領域の上流および下流に移入した。使用した順方向プライマーは、
【化３】
であり、逆方向プライマーは、
【化４】
（移入した制限部位に下線を引き、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の組み込まれたコード領域を太字で示す）であった。プライマーストック(Research Biolabs)以外の全ＰＣＲ試薬は、Promega(Madison,WI)から購入した。５０μｌのＰＣＲ反応混合物は、４μｌのＣＨＯ Ｋ１ ｃＤＮＡテンプレート、１×Ｐｆｕ緩衝液、２５０μＭ ｄＮＴＰ、２μＭの各プライマー、および約１０ＵのＴａｑ−Ｐｆｕ ポリメラーゼミックスを含んでいた。サイクル条件は、９４℃で６分間の最初の変性、その後の９４℃で１分間、５９℃で１分間、７２℃で４分間を３０サイクル、および７２℃で８分間の最終伸長であった。
【００９２】
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現ベクターの構築〕
製造者の説明書にしたがって、ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニング（商標）のｐＣＲ（商標）２．１−ＴＯＰＯに最初にサブクローン化し、ＰＣＲ産物の配列を、以前にクローン化されたハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送体配列（GenBankアクセッション番号Y12074）との比較によって検証し、１００％類似していることが見出された。次いで、検証されたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）(Invitrogen)発現ベクターにサブクローン化した。次いで、配列を検証したプラスミドを含むクローンの拡大培養を行い、最終プラスミドｐｃＤＮＡ−ＳＡＴを、QIAfilter Plasmid Maxi(Qiagen,Valencia,CA)キットを使用して精製した。ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションの前に、プラスミド濃度を、DU(R)530 Life Science UV/Vis分光光度計(Beckman Coulter,Fullerton,CA)を使用して測定した。
【００９３】
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体を安定に過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンの生成〕
「純粋な」細胞集団から開始するためのトランスフェクションを可能にするために、親ＣＨＯ ＩＦＮ−γの単一細胞クローンを、限界希釈によって単離した。この単一細胞クローンは、元の親集団と比較した場合、類似の成長特性（単一細胞クローンおよび親ＣＨＯ ＩＦＮ−γについてそれぞれ０．０２５／時間対０．０２２／時間）およびＩＦＮ−γ産生特性（単一細胞クローンおよび親ＣＨＯ ＩＦＮ−γについてそれぞれ２．１×１０-8μｇ／細胞−時間対１．７×１０-8μｇ／細胞−時間）を有していた。次いで、Cell Line Nucleofector Kit T(Amaxa,Gaithersburg,MD)を使用したNucleofector Device(Amaxa)にてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション前に細胞を２日間継代し、密集度８０〜９０％でヌクレオフェクトした(nucleofected)。１００万個の細胞あたり約１０μｇの線状化プラスミドを使用した。トランスフェクションから４日後、培養培地を、選択のために７００μｇ／ｍｌＧ４１８(Sigma)を含む培地と置換した。Ｇ４１８選択を約２週間維持し、その後に安定にトランスフェクトされた細胞のプールが得られるのに対して、Ｇ４１８含有培地に曝露した非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γは１週間以内に死滅した。次いで、トランスフェクタントを、限界希釈によって単一細胞として単離して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体を安定に過剰発現する接着性細胞株を生成する。全部で３６個の単一細胞クローンを、下記のリアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロット分析を使用して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現についてスクリーニングした。４つのクローンを、組換えＩＦＮ−γ産物のその後のシアリル化分析のために選択した。非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γとヌルベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトした細胞との組も負のコントロールとして維持した。後者の場合、ヌルベクター細胞を単一クローンとしても単離し、これをさらなる分析のために無作為に選択した。
【００９４】
〔ＣＭＰ−シアル酸輸送体の機能性実験〕
ＣＭＰ−シアル酸輸送体を含む発現構築物ｐｃＤＮＡ−ＳＡＴを、前述のエレクトロポレーションによってＬｅｃ２細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後、ＦＡＣＳを使用して細胞を分析した。各単一細胞懸濁液（１５０万個の細胞）を、２０μｇ／ｍｌ ＷＧＡ−ＦＩＴＣ（Vector Laboratories,Burlingame,CA)またはＰＮＡ−ＦＩＴＣ(Vector Laboratories)と室温の暗所で１５分間インキュベートした。その後、細胞を、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma)を含むＰＢＳで洗浄し、その後、FACSCalibur(商標)System(BD Biosciences,San Jose,CA)を使用して分析した。添付のソフトウェア分析ツールを使用して、結果を計算した。
【００９５】
〔リアルタイムＰＣＲ〕
上記のように、一本鎖ｃＤＮＡを、安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株および負のコントロールから合成し、リアルタイムＰＣＲ反応でのテンプレートとして使用した。ABI PRISM(商標)7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の最初の変性、その後の９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間を４０サイクルであった。２５μｌ １×SYBR(商標)Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)の反応緩衝液は、７．５ｐｍｏｌの順方向プライマーおよび逆方向プライマーならびに１．２５μｌのｃＤＮＡテンプレートを含んでいた。ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の総発現および組換え発現の検出のためのプライマーを、図８に示すようにデザインした。ＣＨＯ β−アクチン検出のためのプライマーは、順方向プライマーとしての５’−AGCTGAGAGGGAAATTGTGCG−３’（配列番号１４）および逆方向プライマーとしての５’−GCAACGGAACCGCTCATT−３’（配列番号１５）であった。ｐｃＤＮＡ−ＳＡＴおよびＣＨＯ β−アクチンプラスミド(Dr Peter Morin,Bioprocessing Technology Instituteからの無料提供)の限界希釈を使用して、実施された各リアルタイムＰＣＲについての検量線を同時に作成した。サンプルおよび標準の両方を各実施について２連で実施した。添付のソフトウェア分析ツールを使用して、閾値サイクル（Ｃｔ）を、所与のサンプルが閾値の蛍光値と交差するサイクルと定義し、したがって、Ｃｔは出発ＤＮＡテンプレート量に比例する。Ｃｔ対プラスミド（ＤＮＡ）濃度の対数の線形プロットを内挿して、未知サンプルの濃度を見出した。それぞれの総ＣＭＰ−シアル酸輸送体濃度および組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体濃度を、その各β−アクチン濃度で正規化し、過剰発現クローン由来の各サンプルの結果を、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γサンプルから得た正規化濃度と比較した。
【００９６】
〔抗体〕
ハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送体のＣ末端領域（SwissProtアクセッション番号O08520）に対応するペプチド(CIQQEATSKERVIGV)（配列番号１６）を合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と抱合したこのペプチドに対するウサギ抗血清を生成した（Open Biosystems,Huntsville,AL)。いくつかの粗血清はまた、ＣＭＰ−シアル酸輸送体ポリクローナル抗体(Open Biosystems)を富化するために親和性精製したペプチドであり、これは、ウェスタンブロット分析の間に非特異的結合を減少させるのに役立った。抗ウサギＩｇＧ抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)を、二次検出のために使用した。正規化のためにアクチン発現を使用し、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体(Abcam)と共にアクチンに対するマウスモノクローナル抗体(Abcam,Cambridge,UK)を使用した。
【００９７】
〔ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析〕
約１０００万個の細胞を、安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株および負のコントロールから採取し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを溶解し、Eckhardt & Gerardy-Schahn(1997)に記載の条件下にて電気泳動のために還元した。同量のタンパク質溶解物を、Coomassie Plusタンパク質アッセイ(Pierce,Rockford,IL)を使用して調製した。５０μｇのタンパク質溶解物サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の１２％ポリアクリルアミドゲルにロードした。次いで、分画したタンパク質を、ＰＶＤＦ膜(Biorad,Hercules,CA)に電気ブロッティングした。膜を、５％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含むＰＢＳ−Ｔ（ブロッキング緩衝液）中で１時間ブロッキングし、その後、ブロッキング緩衝液で１０００倍希釈したポリクローナル抗ＣＭＰ−シアル酸輸送体抗体またはモノクローナル抗アクチン中にて４℃で一晩インキュベートした。翌日、膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、その後、ブロッキング緩衝液で１０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＭＰ−シアル酸輸送体の検出）または抗マウスＩｇＧ抗体（アクチンの検出）中で１時間インキュベートした。膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、その後、製造者の説明書にしたがって、膜をＥＣＬウェスタンブロット検出試薬(Amersham Biosciences)を使用した化学発光によって検出した。タンパク質バンドの強度を、Gel Doc XRシステム(Biorad)に添付のソフトウェア分析ツールを使用して定量した。特記しない限り、全てのインキュベーションを室温で行った。
【００９８】
〔ＩＦＮγのグリコシル化分析〕
ＩＦＮγのグリコシル化分析の詳細な手順は、以前に説明されている(Wong et al.,2005)。簡単に述べれば、安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株および負のコントロール由来の上清を、バッチ培養で細胞がコンフルエンシーに到達した時に採取した。上清を濾過し（０．２２μＭ）、精製マウス抗ＩＦＮγクローンＢ２７(BD Pharmigen,San Diego,CA)から作製した免疫親和性カラムによって精製した。既知のＩＦＮ−γ濃度の標準(Research Diagnostics Inc.,Flanders,NJ)で実施し、実際のサンプルと比較した逆相ＨＰＬＣを使用して、ＩＦＮ−γを定量した。Shimadzu LC-10ADvp HPLCシステム(Shimadzu Corporation,Kyoto,Japan)でVydac C18カラム（１ｍｍ×２５０ｍｍ）(Grace Vydac,Hesperia,CA)を使用した。サンプルを、３５％（ｖ／ｖ）〜６５％（ｖ／ｖ）の緩衝液Ｂの直線勾配（緩衝液Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＨＰＬＣ用の水；緩衝液Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）のＨＰＬＣ用アセトニトリル）で、０．０６ｍｌ／分の流速にてサンプルを溶離した。次いで、シアリダーゼ処理を使用して精製ＩＦＮ−γサンプルからシアル酸を切断した後、ＩＦＮ−γの総シアル酸含有量を、チオバルビツール酸アッセイ(Hammond & Papermaster,1979)の修正バージョンを使用して測定した。ミセル電気運動キャピラリークロマトグラフィを使用して、ＩＦＮ−γの部位占有率を測定した。
【００９９】
［結果］
〔組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＭＰ−ＳＡＴ）の機能性試験〕
モデル細胞株ＣＨＯ ＩＦＮ−γは、内因性ＣＭＰ−シアル酸輸送体を含む。ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現構築物のトランスフェクションによって機能的組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体が得られ、輸送体活性が内因性ＣＭＰ−シアル酸輸送体のみに起因しないことを確認する必要があった。前に記載されているように、Ｌｅｃ２細胞株は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の欠失のために糖タンパク質をシアリル化することができないＣＨＯ変異細胞株である(Deutscher et al.,1984)。機能的ＣＭＰ−シアル酸輸送体のトランスフェクションによって欠失が補正され、シアリル化糖タンパク質が得られる。したがって、ＣＭＰ−シアル酸輸送体構築物を試験するためのアッセイを、この細胞株の特性に基づいてデザインすることができる。レクチンを使用して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現構築物のトランスフェクション前後のＬｅｃ２表面糖タンパク質の相違を検出した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に抱合した小麦胚凝集素（ＷＧＡ）およびピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）（それぞれシアル酸(Ishida et al.,1998)およびガラクトース(Aoki et al.,2001)に結合する）を、ＦＡＣＳ分析で使用した。レクチンがこの実験のためにシアリル化糖タンパク質と非シアリル化糖タンパク質とを区別する能力を有することを証明するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＬｅｃ２細胞によって産生された表面糖タンパク質を、ＦＡＣＳ分析でＷＧＡ−ＦＩＴＣおよびＰＮＡ−ＦＩＴＣを使用して検出した（図９Ａ、Ｂ）。予想通り、Ｌｅｃ２表面糖タンパク質は、ＣＨＯ−Ｋ１表面糖タンパク質と比較して、それぞれより低い蛍光およびより高い蛍光を有する細胞集団の相対的検出によって証明されるように、ＷＧＡ−ＦＩＴＣとの結合が弱く（図９Ａ）、ＰＮＡ−ＦＩＴＣとの結合が強かった（図９Ｂ）。Ｌｅｃ２細胞へのｐｃＤＮＡ−ＳＡＴの一過性トランスフェクションにより、ＷＧＡ−ＦＩＴＣをＦＡＣＳ分析のために使用した場合、小集団の１つが右にシフトする細胞の二峰性分布を示した（図１０Ａ）。これにより、組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体がこれらの細胞の変異体の欠失を修正することができるＬｅｃ２細胞の小集団におけるシアリル化糖タンパク質の結合が証明された。ＰＮＡ−ＦＩＴＣ（ガラクトース結合レクチン）ＦＡＣＳ分析で逆の効果が認められた場合、これらの結果が確認された（図１０Ｂ）。これにより、Ｌｅｃ２細胞の欠失を修正することができるｐｃＤＮＡ−ＳＡＴから発現されるＣＭＰ−シアル酸輸送体の機能性が証明された。得られた結果は、Ｌｅｃ２グリコシル化変異体の欠失を修正するＣＭＰ−シアル酸輸送体の能力についての以前に報告された分析と一致する(Aoki et al.,2001;Ishida et al.,1998)。したがって、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのｐｃＤＮＡ−ＳＡＴの類似のトランスフェクションにより、機能的ＣＭＰ−シアル酸輸送体が過剰発現するであろう。
【０１００】
〔安定な細胞株中で過剰発現したＣＭＰ−シアル酸輸送体の検出〕
非相同組換えによって宿主染色体に発現ベクターがほぼ単純に安定に組み込まれ、その組み込み部位は無作為に分布している(Kaufman,1990)。したがって、他の細胞操作アプローチと同様に、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現についてＣＨＯ ＩＦＮ−γサブクローンをスクリーニングする必要があった。ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現が、リアルタイムＰＣＲを使用して転写レベルで検出され、ウェスタンブロット分析を使用してタンパク質レベルで検出された。リアルタイムＰＣＲ分析は少量のｍＲＮＡの検出に有用なアッセイであることが証明されているので、ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物レベルを比較するためにリアルタイムＰＣＲ分析を選択した(Bustin,2000)。これは、７０〜８０桁と定量のダイナミックレンジが広く、技術的感度および精度が高い(Klein,2002)。さらに、選択された遺伝子領域の増幅におけるプライマーの特異性により、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の総発現と組換え発現とを比較することが可能であった（図８）（配列番号８〜１１）。
【０１０１】
ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する４つのクローンは、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γサンプルと比較して、総ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物が２〜２０倍に増加した（図１１）。組換え輸送体転写物の対応する増加が認められたので、これは、これらのクローン中の組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体発現に寄与し得る。これは、単離された４つのクローンがベクタートランスフェクションによってＣＭＰ−シアル酸輸送体発現がより高くなり、且つ、より高く内因性ＣＭＰ−シアル酸輸送体を発現する無作為なクローンの選択のみに起因しないことを示した。ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現は、ウェスタンブロット分析を使用してタンパク質レベルでも検出された（図１３）。
【０１０２】
総ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の増加倍率（図１１）により、一般に、輸送体タンパク質発現が増加し（図１３）、このことは、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の転写および翻訳過程で調節されない場合に予想される。しかし、輸送体転写レベルの増加倍率の範囲（約２〜２０倍）により、輸送体タンパク質の過剰発現の増加倍率が類似の範囲にならなかった（表２に示すように、約１．８〜２．８倍）。転写物の増加は常にタンパク質の良好な指標ではなく、それにより、両レベルでの発現プロフィールが必要であることが立証された(Cox et al.,2005)。さらに、首尾よく翻訳されたタンパク質が必ずしも機能的な形態に成熟するわけではないので、翻訳後修飾により、さらに複雑になる。最後に、位置を補正するために機能タンパク質はターゲティングもされなければならず、その後、細胞中でのその役割を果たすことができる。
【０１０３】
ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現の転写物とタンパク質レベルとの間のこの相関関係の欠如についての仮定の理由の１つは、細胞による輸送タンパク質発現の飽和である。ＣＭＰ−シアル酸輸送体は約３０ｋＤａの比較的小さなタンパク質であるが、正確に折り畳まれ、正確な膜トポロジーで挿入され、トランスゴルジ膜に局在化される必要があり、その後に機能的にＣＭＰ−シアル酸を輸送することができる膜貫通タンパク質である(Eckhardt and Gerady-Schahn,1997)。ＣＭＰ−シアル酸輸送体が１０個の膜貫通スパニング(spanning)ヘリックスを含むので(Eckhardt et al.,1999)、他の多経路膜貫通タンパク質(Lodish et al.,2000)と同様に、その正確な挿入はおそらく内部疎水性位相(topogenic)配列に依存するであろう。ＣＭＰ−シアル酸輸送体のターゲティングおよび局在化は、タンパク質配列の読み取り枠内のアミノ酸の特定の配列によって決定されるようである(Eckhardt et al.,1998)。組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体は、内因性ＣＭＰ−シアル酸輸送体を含むＣＨＯ−Ｋ１ ｃＤＮＡからクローン化されたので、正確な膜挿入およびトランスゴルジ局在化のために上記特性を有するであろう。それにもかかわらず、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の異種過剰発現が依然としてこの仮定の効率に影響を与えると主張する。例えば、ＥＲでの誤折り畳みにより、機能タンパク質として保持される代わりに分解のために組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体がターゲティングされるであろう。これにより、転写物発現の増加倍率と比較して、より狭い範囲の輸送体タンパク質の過剰発現の増加倍率が検出されるであろう。しかし、最終的に、ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現の現時点のレベルが組換えタンパク質産物（ＩＦＮ−γ）のシアリル化を改良するのに十分であるかどうかを考慮することがより重要であり、このことについては次に示す。
【０１０４】
〔ＩＦＮγグリコシル化に及ぼすＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現の影響〕
２つの量的指標を使用して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現するクローンと負のコントロール（非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γおよびヌルベクター細胞株）との間の組換えＩＦＮ−γのシアリル化範囲を比較した。ＩＦＮ−γシアル酸含有量（式２）は、タンパク質上の平均シアル酸量を測定する。ＩＦＮ−γが完全な部位占有率および２つの触角を持つ糖タンパク質のみを有すると考えられる場合、この糖タンパク質についてのＩＦＮγの分子（またはモル）あたりのシアル酸の４分子（またはモル）の理論上の最大値を計算することができる。
【０１０５】
【数２】
【０１０６】
しかし、ＩＦＮγの部位占有率は、決して１００％ではない。したがって、シアリル化範囲のより直接的な指標は、部位シアリル化である。この指標は、ＩＦＮγ上のシアル酸を利用可能なＮ結合部位に正規化する（式３）。この正規化により、細胞が所与の部位をシアリル化する能力を直接考慮することが可能である。したがって、これにより、細胞中のシアリル化過程の改良におけるＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現の有効性が直接測定されるようになる。
【０１０７】
【数３】
（式中、％２Ｎ、％１Ｎ、および０％Ｎは、それぞれ、２部位、１部位、および０部位グリコシル化ＩＦＮ−γの比率である）。ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現がシアリル化に影響を及ぼすので、ＩＦＮ−γの部位占有率は変化しないと予想され、これは、タンパク質へのオリゴサッカリドの輸送過程がシアリル化過程の上流であるからである。したがって、７８．５％２Ｎ、１８．０％１Ｎ、および３．５％０Ｎの平均部位占有率の使用により(Gu,1997)、ＩＦＮ−γの実際の最大シアル酸含有量は、ＩＦＮ−γ１モルあたり３．５モルのシアル酸と計算される。これにより、ＣＨＯ ＩＦＮ−γで達成することができる最大ＩＦＮ−γシアル酸含有量となる。
【０１０８】
ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する同一の４つの単一細胞クローンおよび負のコントロールを使用して、接着バッチ培養を行った。４つの各クローンは負のコントロールと比較した場合、ＩＦＮ−γシアル酸含有量の増加が認められた（図１４）。予想通り、ＩＦＮ−γ部位占有率は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現によって有意に影響を受けなかった（図１５）。部位シアリル化に関して、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現範囲を、正規化ＩＦＮ−γシアル酸含有量と比較した（表２）。非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γと比較した場合、ＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する単一細胞クローンのＩＦＮ−γ部位シアリル化が４〜１６％相対的に増加した。ＣＭＰ−シアル酸輸送体タンパク質レベルの増加倍率がより高かったクローン９および１５は、クローン２１および２６と比較して、対応するＩＦＮ−γ部位シアリル化がより改良されていることが認められた（表２）。これらの４つのクローンで認められた傾向により、この傾向が、ＩＦＮ−γ部位シアリル化を増加させるＣＭＰ−シアル酸輸送体過剰発現であることをより決定的に推測することができる。クローン９および１５のＩＦＮ−γシアル酸含有量（表２）が先に記載したＩＦＮ−γ１モルあたりの実際の最大範囲が３．５モルのシアル酸であると考えられる場合、これらのクローンは、シアリル化が最大の組換えＩＦＮ−γを産生する。したがって、これらの結果は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の過剰発現によってチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるシアリル化が増加するという仮説を確証する。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
［文献］
【表４Ａ】
【表４Ｂ】
【表４Ｃ】
【表４Ｄ】
【表４Ｅ】
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】リアルタイムＰＣＲ用のプライマーデザイン。全ＣＭＰ−ＳＡＴ発現を検出するために、ＣＭＰ−ＳＡＴ読み取り枠（ＯＲＦ）内のプライマー組Ｔをデザインした。５’プライマーは、５’−TGATAAGTGTTGGACTTTTAGC−３’（配列番号１）であり、３’プライマーは、５’−CTTCAGTTGATAGGTAACCTGG−３’（配列番号２）であった。組換え発現ＣＭＰ−ＳＡＴを検出するために、図に示すように、５’プライマーがＣＭＰ−ＳＡＴ ＯＲＦ内に存在し、且つ３’プライマーがＯＲＦおよびｐＣＭＶ−Ｔａｇプラスミド配列に隣接するようにプライマー組Ｒをデザインした。５’プライマーは、５’−CTGCAGCCATTGTTCTTTCTAC−３’（配列番号３）であり、３’プライマーは、５’−GTATCGATAAGCTTTCACACACC−３’（配列番号４）であった。
【図２】得られたＰＣＲ産物のタンパク質PSI-Blastの結果。得られたＤＮＡ配列を翻訳し、PSI-Blastを使用してblastを実施した。アミノ酸１０３にバリンからメチオニンへの点変異が認められた。
【図３】一過性にトランスフェクトされた細胞のＦＡＣＳ分析。細胞を、負のコントロールｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ａ）、実際のプラスミドｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−ＳＡＴ（Ｂ）、および正のコントロールｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ（商標）−Ｌｕｃ（Ｃ）で一過性にトランスフェクトした。マーカー領域Ｍ１を使用して、負のコントロールにおいて細胞集団の１％がより高い蛍光を発すると恣意に定義した。この同一のマーカー領域により、実際のプラスミドおよび正のコントロールでより高い蛍光を発するのはそれぞれ細胞集団の１６．５％および６．４％と定義した。したがって、各サンプル中でＦＬＡＧ−ＣＭＰ−ＳＡＴおよびＦＬＡＧ−ルシフェラーゼが発現した。
【図４】安定なＣＭＰ−ＳＡＴクローン対非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γのリアルタイムＰＣＲ分析。総ＣＭＰ−ＳＡＴ発現を比較した場合（Ａ）、陽性クローンにおける発現は、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γおよびヌル細胞株ＩＢ．８よりも高かった。組換えＣＭＰ−ＳＡＴ発現を比較した場合（Ｂ）、陽性クローンにおける発現はＣＨＯ ＩＦＮ−γおよびＩＢ．８よりも明らかに高く、後者のサンプルは負のコントロールにより近い閾値サイクル(threshold cycle)を有し、プライマー−二量体形成に起因する蛍光によって閾値サイクルに到達する。いずれの場合にも同量の出発テンプレートを使用したので、発現レベルをこの方法で比較することができる。閾値サイクルを、所与のサンプルが２０，０００の相対蛍光単位（ＲＦＵ）値と交差するサイクルと定義する。Ｗは、テンプレートとして水を使用した場合の負のコントロールを示す。
【図５】修飾チオバルビツール酸アッセイを使用したシアル酸分析(Hammond and Papermaster,1976)。１モルのＩＦＮγあたりのシアル酸のモル数で示す細胞株の平均シアル酸含有量は、以下であった：非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γ−２．６１±０．０７、ＩＣ．１７−２．８６±０．１６、ＩＣ．３０−２．８３±０．１７、ＩＣ．３７−３．０３±０．２１、ＩＣ．３８−２．８５±０．２１、ＩＢ．８−２．３０±０．２８。両側スチューデントＴ検定を使用して、安定な各細胞株の平均シアル酸含有量を、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γから得た値と比較した。得られたｐ値は０．０５未満であり、測定値は統計的に有意であると考えられる。比率は、非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γを超える平均シアル酸含有量の増加率を示す。
【図６】ＭＥＫＣを使用したグリカン部位の占有率。非トランスフェクションＣＨＯ ＩＦＮ−γと比較した過剰発現ＣＭＰ−ＳＡＴ細胞株およびヌル細胞株の部位占有率に明らかな相違はなかった。いくつかの細胞株から得たＩＦＮγにおいてＯ部位グリコシル化ＩＦＮγを検出できなかった。各サンプルの２連の実験から標準偏差を得た。
【図７】シアリル化過程の略図。ＣＭＰ−シアル酸は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体によってサイトゾルからゴルジに輸送される。これは、ゴルジ細胞内腔へのＣＭＰ−シアル酸の侵入が細胞内腔からのＣＭＰの等モルの放出に関与する逆輸送機構によって生じる(Hirschberg et al.,1998)。次いで、シアリルトランスフェラーゼは、β１，４−ガラクトース受容体部位を有する、入ってきたポリペプチド鎖へのシアル酸の輸送のための補基質としてＣＭＰ−シアル酸を使用する。
【図８】総ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現および組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体発現を検出するために使用したリアルタイムＰＣＲプライマー。総ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現を検出するために、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の読み取り枠（ＯＲＦ）内にプライマー組Ｔをデザインした。順方向プライマーは、５’−TGATAAGTGTTGGACTTTTAGC−３’（配列番号８）であり、逆方向プライマーは、５’−CTTCAGTTGATAGGTAACCTGG−３’（配列番号９）であった。組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体を検出するために、順方向プライマーがｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター配列（５’−CTAGCGCCACCATGGCTCAGG−３’（配列番号１０））の一部であり、逆方向プライマーがＣＭＰ−シアル酸輸送体ＰＲＦ（５’−CTTCTGTGACACACACGGCTGTG−３’（配列番号１１））内に存在するようにプライマー組Ｒをデザインした。
【図９】（Ａ、Ｂ）ＷＧＡ−ＦＩＴＣ（Ａ）およびＰＮＡ−ＦＩＴＣ（Ｂ）を使用したＣＨＯ−Ｋ１およびＬｅｃ２細胞由来の表面糖タンパク質のＦＡＣＳ分析。Ｌｅｃ２細胞は、ＣＭＰ−シアル酸輸送体の欠失の結果としてその糖タンパク質をシアリル化することができず、表面糖タンパク質は、シアリル化されたＣＨＯ−Ｋ１由来の表面糖タンパク質よりもＷＧＡ−ＦＩＴＣに結合せず、ＰＮＡ−ＦＩＴＣに結合する。
【図１０】（Ａ、Ｂ）ＷＧＡ−ＦＩＴＣ（Ａ）およびＰＮＡ−ＦＩＴＣ（Ｂ）を使用したｐｃＤＮＡ−ＳＡＴ（Ｌｅｃ２−ＳＡＴ）で一過性にトランスフェクトしたＬｅｃ２細胞のＦＡＣＳ分析。恣意のＭ１ゲーティングを、より高い蛍光（プロットの右側）のＷＧＡ−ＦＩＴＣで染色したＬｅｃ２細胞の１％に設定した（Ａ）。Ｌｅｃ細胞集団の４０．９％が、Ｍ１ゲーティングに関するＷＧＡ−ＦＩＴＣ結合に反応した。同一のＭ１ゲーティングを、より低い蛍光（プロットの左側）のＰＮＡ−ＦＩＴＣで染色されたＬｅｃ２細胞の５％に設定した（Ｂ）。Ｌｅｃ２細胞集団の３７．３％が左にシフトし、Ｍ１ゲーティングに基づいたＰＮＡ−ＦＩＴＣとの結合がより少なかった。この実験を繰り返し、類似の結果が得られた。
【図１１】選択されたクローンおよび負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株における総ＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の比較。クローン９、１５、２１、および２６についての非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γに関するＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の増加倍率は、１７．０±３．３、２０．１±０．９、５．６±０．６、および２．２±０．１であった。各サンプルについて、細胞ペレットを２回回収して、リアルタイムＰＣＲ分析用のｃＤＮＡサンプルを生成した。各リアルタイムＰＣＲの実施では、各サンプルを２連で実施する。
【図１２】選択されたクローンおよび負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株における組換えＣＭＰ−シアル酸輸送体転写物の比較。より低い閾値サイクルによって示されるように、総ＣＭＰ−ＳＡＴ転写物の増加がより高いクローン９（◆）および１５（黒四角）は、対応するより高いレベルの組換えＣＭＰ−ＳＡＴ転写物を示す。クローン２１（黒三角）および２６（×）で類似の傾向が認められ、総ＣＭＰ−ＳＡＴ転写物の増加はより低かった。負のコントロールを、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ（●）およびヌルベクター細胞株（＊）によって示す。各サンプルについて、細胞ペレットを２回回収して、リアルタイムＰＣＲ分析用のｃＤＮＡサンプルを生成した。各リアルタイムＰＣＲの実施では、各サンプルを２連で実施する。この図は、反復分析の代表を示す。
【図１３】負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株と比較した場合にＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する接着安定性クローンのウェスタンブロット分析。ＣＭＰ−シアル酸輸送体を、以前の基準に基づいて約３０ｋＤａのバンドとして同定した(Berninsone et al.,1997;Eckhardt & Gerardy-Schahn,1997;Ishida et al.,1998)。
【図１４】負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株と比較した場合にＣＭＰ−シアル酸輸送体を過剰発現する接着安定性クローンの組換えＩＦＮ−γシアル酸含有量（ｎ＝２）。スチューデントＴ検定によると、クローン９、１５、および２６由来のＩＦＮ−γシアル酸含有量の測定値は、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γと統計的に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＩＦＮ−γシアル酸含有量を測定するために使用されるチオバルビツール酸アッセイを２回行い、各サンプルを２回アッセイした。
【図１５】ＣＭＰ−シアル酸輸送体および負のコントロール、非トランスフェクション親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ、およびヌルベクター細胞株を過剰発現する接着安定性クローンの組換えＩＦＮ−γ部位の占有率。バーは、ＩＦＮ−γの２−Ｎ（斜線入り四角）、１−Ｎ（黒四角）、および０−Ｎ（□）グリカン部位の占有率を示す。比率は、２〜３回のミセル電気運動キャピラリークロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）から得た平均値を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントまたはその変種を産生する哺乳動物細胞。
【請求項２】
前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項４】
前記細胞が、ＣＭＰ−ＳＡＴをコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換されている、請求項１〜３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項５】
前記ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子が哺乳動物遺伝子である、請求項１〜４に記載の哺乳動物細胞。
【請求項６】
前記ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子が、ＣＨＯ遺伝子またはヒト遺伝子である、請求項１〜５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
前記細胞が、内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する、請求項１〜６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項８】
前記糖タンパク質が異種である、請求項７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
前記糖タンパク質が哺乳動物である、請求項７〜８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記糖タンパク質がヒトである、請求項７〜９に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
前記糖タンパク質が、任意のＩＦＮ−γ、そのフラグメントまたはその変種である、請求項７〜１０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、異種タンパク質をコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換されている、請求項１〜１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、少なくとも１つのＩＦＮ−γ、そのフラグメントまたはその変種をコードする遺伝子で形質転換されている、請求項１〜１２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１４】
前記細胞がＣＨＯ細胞であり、前記細胞が内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントまたはその変種を産生し、前記細胞が内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する、請求項１〜１３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１５】
単離細胞株形態である、請求項１〜１４に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞が、少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質の発現用キット中に含まれる、請求項１〜１５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１７】
内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントまたはその変種の発現を増強するステップを含む、細胞または細胞株でシアリル化糖タンパク質を調製する方法。
【請求項１８】
前記シアリル化糖タンパク質が内因性レベルを超えて発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞または細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）またはヒトである、請求項１７〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記シアリル化糖タンパク質が、異種哺乳動物糖タンパク質である、請求項１７〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記シアリル化糖タンパク質が、任意のＩＦＮ−γ、そのフラグメントまたはその変種である、請求項１７〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞または細胞株中で少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する方法であって、
（ａ）哺乳動物細胞を、内因性レベルを超えて、ＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントもしくはその変種をコードする遺伝子また前記遺伝子を含む構築物で形質転換するステップと、
（ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの目的のシアリル化糖タンパク質をコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
前記目的のシアリル化糖タンパク質が、内因性レベルを超えて産生される、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントまたはその変種を産生する哺乳動物細胞。
【請求項２】
前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項４】
前記細胞が、ＣＭＰ−ＳＡＴをコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換されている、請求項１〜３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項５】
前記ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子が哺乳動物遺伝子である、請求項１〜４に記載の哺乳動物細胞。
【請求項６】
前記ＣＭＰ−ＳＡＴ遺伝子が、ＣＨＯ遺伝子またはヒト遺伝子である、請求項１〜５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
前記細胞が、内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する、請求項１〜６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項８】
前記糖タンパク質が異種である、請求項７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
前記糖タンパク質が哺乳動物である、請求項７〜８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記糖タンパク質がヒトである、請求項７〜９に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
前記糖タンパク質が、任意のＩＦＮ−γ、そのフラグメントまたはその変種である、請求項７〜１０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、異種タンパク質をコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換されている、請求項１〜１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、少なくとも１つのＩＦＮ−γ、そのフラグメントまたはその変種をコードする遺伝子で形質転換されている、請求項１〜１２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１４】
前記細胞がＣＨＯ細胞であり、前記細胞が内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントまたはその変種を産生し、前記細胞が内因性レベルを超えて少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する、請求項１〜１３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１５】
単離細胞株形態である、請求項１〜１４に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞が、少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質の発現用キット中に含まれる、請求項１〜１５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１７】
内因性レベルを超えてＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントまたはその変種の発現を増強するステップを含む、細胞または細胞株でシアリル化糖タンパク質を調製する方法。
【請求項１８】
前記シアリル化糖タンパク質が内因性レベルを超えて発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞または細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）またはヒトである、請求項１７〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記シアリル化糖タンパク質が、異種哺乳動物糖タンパク質である、請求項１７〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記シアリル化糖タンパク質が、任意のＩＦＮ−γ、そのフラグメントまたはその変種である、請求項１７〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞または細胞株中で少なくとも１つのシアリル化糖タンパク質を産生する方法であって、
（ａ）哺乳動物細胞を、内因性レベルを超えて、ＣＭＰ−ＳＡＴ、そのフラグメントもしくはその変種をコードする遺伝子また前記遺伝子を含む構築物で形質転換するステップと、
（ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの目的のシアリル化糖タンパク質をコードする遺伝子または前記遺伝子を含む構築物で形質転換するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
前記目的のシアリル化糖タンパク質が、内因性レベルを超えて産生される、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００７−５３５９２５（Ｐ２００７−５３５９２５Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１３２３（Ｐ２００７−５１１３２３）
【出願日】平成１７年５月４日（２００５．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００１３９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５１５６
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（３０４０３８７４７）ナショナル ユニバーシティー オブ シンガポール (10)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ
【住所又は居所原語表記】１０ Ｋｅｎｔ Ｒｉｄｇｅ Ｃｒｅｓｃｅｎｔ， Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ １１９２６０
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月４日（２００５．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００１３９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５１５６
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（３０４０３８７４７）ナショナル ユニバーシティー オブ シンガポール (10)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ
【住所又は居所原語表記】１０ Ｋｅｎｔ Ｒｉｄｇｅ Ｃｒｅｓｃｅｎｔ， Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ １１９２６０
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]