本発明は哺乳動物宿主細胞（例えば霊長類宿主細胞や齧歯類宿主細胞）で蛋白質に非天然アミノ酸を組込むことが可能なｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの直交対に関する。本発明は限定されないが、例えば宿主細胞（例えば霊長類又は齧歯類細胞）と、真正細菌シンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、直交ｔＲＮＡと、非天然アミノ酸を含む翻訳系を提供する。本発明は更に、哺乳動物宿主細胞系で少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ該当蛋白質を生産するための方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｉ）ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
ｉｉ）ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
ｉｉｉ）ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
ｉｖ）ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
ｖ）ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；
ｖｉ）ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；
ｖｉｉ）α−アミノカプリル酸；
ｖｉｉｉ）ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
ｉｘ）１，５−ダンシルアラニン；及び
ｘ）ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）
から構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（ｃ）真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導され、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、齧歯類細胞と霊長類細胞から選択される宿主細胞を含む翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記第１の非天然アミノ酸と、配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
前記第１のＯ−ＲＳが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号５７〜１０１に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体の群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
前記宿主細胞が該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
前記宿主細胞が第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸と、第２のＯ−ＲＳと、第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸によりコードされるセレクターコドンを認識する請求項６に記載の翻訳系。
【請求項８】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号８〜５６に記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項８に記載の翻訳系。
【請求項１０】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１１】
前記齧歯類宿主細胞がラット宿主細胞とマウス宿主細胞から選択される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１２】
前記霊長類宿主細胞がヒト宿主細胞、チンパンジー宿主細胞、ボノボ宿主細胞、ゴリラ宿主細胞、オランウータン宿主細胞、テナガザル宿主細胞、マカクザル宿主細胞、タマリン宿主細胞及びマーモセット宿主細胞から構成される群から選択される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
前記齧歯類宿主細胞がＣＨＯ宿主細胞である請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１４】
前記霊長類宿主細胞が２９３Ｔ宿主細胞である請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１５】
選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質の生産方法であって、
（ａ）（ｉ）Ａ）ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
Ｂ）ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
Ｃ）ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
Ｄ）ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
Ｅ）ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；
Ｆ）ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；
Ｇ）α−アミノカプリル酸；
Ｈ）ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
Ｉ）１，５−ダンシルアラニン；及び
Ｊ）ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）
から構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（ｉｉｉ）前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸（但し、前記核酸におけるセレクターコドンの位置は前記蛋白質における選択位置に対応する）と；
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含み、齧歯類細胞と霊長類細胞から選択される宿主細胞を準備する段階と；
（ｂ）前記非天然アミノ酸、Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの存在下で前記セレクターコドンに応答して前記蛋白質の翻訳中に前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１６】
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記第１の非天然アミノ酸と、配列番号５７〜１０１のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
第１のＯ−ＲＳを準備する段階が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のＯ−ＲＳが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号５７〜１０１に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体の群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
第１のＯ−ＲＳを準備する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号８〜５６に記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第１のＯ−ＲＳを準備する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、その結果として得られるＯ−ＲＳとして、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記第１のＯ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第１のＯ−ｔＲＮＡを準備する前記段階が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記蛋白質が前記第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸を含み、前記方法が前記第２の非天然アミノ酸と第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを準備する段階を更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の非天然アミノ酸がフォトケージドアミノ酸を含み、前記方法が宿主細胞に紫外線を照射する段階を更に含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞に紫外線を照射する段階が宿主細胞における蛋白質活性の空間制御を提供する請求項２９に記載の方法。

【図１−１】

【図１−２】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６−１】

【図１６−２】

【図１６−３】

【図１６−４】

【図１６−５】

【図１６−６】

【図１６−７】

【図１６−８】

【図１６−９】

【図１６−１０】

【図１６−１１】

【図１６−１２】

【図１６−１３】

【図１６−１４】

【図１６−１５】

【図１６−１６】

【図１６−１７】

【図１６−１８】

【図１６−１９】

【図１６−２０】

【図１６−２１】

【図１６−２２】

【図１６−２３】

【図１６−２４】

【図１６−２５】

【図１６−２６】

【図１６−２７】

【図１６−２８】

【図１６−２９】

【図１６−３０】

【図１６−３１】

【図１６−３２】

【図１６−３３】

【図１６−３４】

【図１６−３５】

【図１６−３６】

【図１６−３７】

【公表番号】特表２０１０−５０６５９１（Ｐ２０１０−５０６５９１Ａ）
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３３３７２（Ｐ２００９−５３３３７２）
【出願日】平成１９年１０月１７日（２００７．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２２３２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７３１８４
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ　スクリップス　リサーチ　インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】