回腸嚢炎発症の危険性を決定するための遺伝子検査
【課題】潰瘍性大腸炎を有する患者において、内部嚢が形成される外科的手順後に、回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供する。
【解決手段】インターフェロンγレセプター遺伝子座に連結した回腸嚢炎関連対立遺伝子の、該患者における存在または非存在を決定することによって、回腸嚢炎発症の危険性を決定する方法。対立遺伝子が連結するインターフェロンγレセプター遺伝子座は、例えばインターフェロンγレセプター１遺伝子であり、有用な回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えばＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子のようなインターフェロンγレセプター１遺伝子の第６イントロン内に位置する対立遺伝子でありうる。
【解決手段】インターフェロンγレセプター遺伝子座に連結した回腸嚢炎関連対立遺伝子の、該患者における存在または非存在を決定することによって、回腸嚢炎発症の危険性を決定する方法。対立遺伝子が連結するインターフェロンγレセプター遺伝子座は、例えばインターフェロンγレセプター１遺伝子であり、有用な回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えばＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子のようなインターフェロンγレセプター１遺伝子の第６イントロン内に位置する対立遺伝子でありうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＩＤＤＫ助成金ＤＫ４６７６３の下、政府の支持によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、自己免疫および炎症性腸疾患の分野に関し、そしてより詳細には、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の発症に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景情報）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、以下の未知の病因の２つの胃腸障害を記載するために使用される、集合名である：クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）。ＩＢＤ（これは、世界中で生じ、そして２００万人もの多くの人々が罹患していると報告されている）の経過および予後は、広範に変動する。ＩＢＤの発症は、主に、幼児期にあり、下痢、腹痛および発熱という３つの最も共通の代表的症状を伴う。下痢は、穏やか〜重篤な範囲にわたり得、そして潰瘍性大腸炎において、しばしば、出血を伴う。貧血および体重の減少が、ＩＢＤのさらなる共通の症状である。ＩＢＤを有する患者の１０％〜１５％は、１０年の期間にわたって診療を必要とする。さらに、ＩＢＤを有する患者は、腸の癌の発症の危険性が増加する。心理学的問題（不安および抑うつを含む）の発症の増加の報告は、おそらく、驚くべき症状ではなく、これは、しばしば、壮年期の人々を襲う消耗性の疾患である。
【０００４】
ＩＢＤの診断、および多くの場合において、クローン病と潰瘍性大腸炎との識別において、進歩がなされてきた。しかし、クローン病および潰瘍性大腸炎の各々は、胃腸管を冒しそして類似の症状を生じる、異質の疾患の集合を表し得る。炎症性腸疾患に関連する異質性の１つの局面は、制御されない潰瘍性大腸炎の処置のための結腸切除後に見られる結果における、顕著な対照によって明らかにされる。好ましい手順は、回腸嚢肛門吻合術（ＩＰＡＡ）を用いる腹式結腸切除であり、これによって、回腸の貯蔵所すなわち「嚢」の形成を介して自制を維持しながら、疾患性の結腸粘膜が除去される。潰瘍性大腸炎患者の部分群は、手術後に好ましい結果を経験するが、手術後１０年で、ほぼ５０％が「回腸嚢炎」を発症する。これは、潰瘍性大腸炎の元々の症状を模倣し得る、嚢の炎症である。いくらかの患者において、この回腸嚢炎の再発性の症状は、手術前に存在する症状と同様に消耗性である。従って、再発性すなわち「慢性」回腸嚢炎に罹患する患者のために、潰瘍性大腸炎の外科処置は、治療的価値をほとんどまたは全く提供しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
回腸嚢炎または慢性回腸嚢炎の発症の危険性が増加した潰瘍性大腸炎患者の部分群を決定する遺伝学的方法は、手術後のこれらの患者の医療的管理において、および外科処置のための良好な候補の同定において有用である。不幸にも、回腸嚢炎または慢性回腸嚢炎の発症を予測するための遺伝学的方法は、現在、利用可能でない。従って、嚢手術後の回腸嚢炎または慢性回腸嚢炎の発症の危険性を決定する、簡便かつ非侵襲性の遺伝学的方法についての必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして同様に関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、潰瘍性大腸炎を有する患者において内部嚢を形成する外科手順後の回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供する。この方法は、患者においてインターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖する回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定することにより、実施される。ここで、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在は、回腸嚢炎の発症の危険性の増加を示す。回腸嚢炎関連対立遺伝子が連鎖するインターフェロンγレセプター遺伝子座は、例えば、インターフェロンγレセプター１遺伝子であり得る。本発明において有用な回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えば、インターフェロンγレセプター１遺伝子の６番目のイントロン内に位置する対立遺伝子（例えば、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子）である。１つの実施形態において、回腸嚢炎関連対立遺伝子は、少なくとも４のオッズ比かつ１より大きい下側の９５％信頼限界で、慢性回腸嚢炎に関連する。本発明の方法は、以下により詳細に記載するように、潰瘍性大腸炎の外科処置のための良好な候補の同定および手術後の高い危険性の患者の選択的な医療的管理において有用であり得る。
【０００７】
好ましい実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎を有する患者における、回腸嚢肛門吻合術後の慢性回腸嚢炎発症の危険性を決定する方法を提供する。この方法において、患者におけるインターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在または非存在を決定し、１７１対立遺伝子の存在は、慢性回腸嚢炎発症の危険性の増加を示す。
【０００８】
別の実施形態において、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の危険性を決定するための本発明の方法は、患者から、インターフェロンγレセプター1遺伝子のＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む核酸を含む材料を得る工程；およびこの核酸を酵素的に増幅して、ＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む増幅されたフラグメントを生成する工程によって行われ、ここで、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在は、回腸嚢炎発症の危険性の増加を示す。所望の場合、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子座が存在するかを決定するために、その増幅されたフラグメントを電気泳動する工程をさらに包含し得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 潰瘍性大腸炎を有する患者において、内部嚢が形成される外科的手順後に、回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法であって、当該方法は、インターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖する回腸嚢炎関連対立遺伝子の、当該患者における存在または非存在を決定する工程を包含し、
ここで、当該回腸嚢炎関連対立遺伝子の当該存在が、回腸嚢炎発症の増加した危険性を示す、方法。
・（項目２） 上記インターフェロンγレセプター遺伝子座が、インターフェロンγレセプター１遺伝子（ＩＦＮＧＲ１）である、項目１に記載の方法。
・（項目３） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、上記ＩＦＮＧＲ１内にある、項目２に記載の方法。
・（項目４） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、上記ＩＦＮＧＲ１の第６イントロン内に位置する、項目３に記載の方法。
・（項目５） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、ＩＦＮＧＲ１ ＦＡ１マイクロサテライトである、項目４に記載の方法。
・（項目６） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子である、項目５に記載の方法。
・（項目７） 上記外科的手順が、回腸嚢肛門吻合を含む、項目６に記載の方法。
・（項目８） 上記回腸嚢炎が慢性回腸嚢炎である、項目１に記載の方法。
・（項目９） 潰瘍性大腸炎を有する患者において、回腸嚢肛門吻合後に、慢性回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法であって、当該方法は、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の、当該患者における存在または非存在を決定する工程を包含し、
ここで、当該１７１対立遺伝子の存在が、慢性回腸嚢炎発症の増加した危険性を示す、方法。
・（項目１０） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定する工程が、上記患者由来の核酸の酵素的増幅を含む、項目１に記載の方法。
・（項目１１） 項目１に記載の方法であって、電気泳動分析、制限フラグメント長多型分析、配列決定分析、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される工程をさらに包含する、方法。
・（項目１２） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、少なくとも４のオッズ比および１より大きい下側の９５％信頼限界で慢性回腸嚢炎と関連する、項目１に記載の方法。
・（項目１３） 項目６に記載の方法であって、ここで、上記ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在または非存在が決定され、以下：
（ａ）インターフェロンγレセプター１遺伝子のＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む核酸を含む物質を、上記患者から得る工程；および
（ｂ）当該核酸を酵素的に増幅して、当該ＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む増幅されたフラグメントを生成する工程、
を包含し、ここで、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在が、回腸嚢炎発症の増加した危険性を示す、方法。
・（項目１４） 項目１３に記載の方法であって、以下：
（ｃ）上記増幅されたフラグメントを電気泳動し、これによってＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子が存在しているか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、インターフェロンγレセプター１遺伝子のマップ、および他のマーカーと相対的な第６染色体上のインターフェロンγレセプター１遺伝子の位置を示す。
【図２】図２は、隣接ヌクレオチドと共に、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライトのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ８４７２１；配列番号１）を示す。マイクロサテライトは、プライマーＡ（配列番号２）およびプライマーＢ（配列番号３）と共に印される。
【図３】図３は、プライマー配列番号２および配列番号３を使用して、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座で遺伝子型決定された個体についてのクロマトグラムを示す。上の２つのクロマトグラムは、１７１対立遺伝子についてヘテロ接合性の患者を示し；３番目のクロマトグラムは、１７１対立遺伝子についてホモ接合性の患者を示し；そして４番目のクロマトグラムは、ＣＥＰＨ参照個体１３４７−０２のヘテロ接合性の１８９／１９１対立遺伝子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
医療的管理をしない場合、潰瘍性大腸炎は、回腸切除によって治癒され得るが、これは、節制を維持するために新しく開発された手順さえも伴う、根治的処置である。好ましい外科手順は、結腸の一部または全体の除去および内部「嚢」の形成を含む。不幸にも、いくらかの術後の患者において、術前の潰瘍性大腸炎に類似する症状が、「回腸嚢炎」と呼ばれる状態において生じる。本発明の方法は、内部嚢を形成する手術後の潰瘍性大腸炎患者における回腸嚢炎発症の危険性を決定するための、簡便で非侵襲性の手段の発見に関する。
・本明細書中に開示されるように、外科手順（例えば、回腸嚢肛門吻合術）後の潰瘍性大腸炎患者における回腸嚢炎発症の増加した危険性に関連する遺伝マーカーが、同定された。特に、回腸嚢炎の発症の可能性と特定のマイクロサテライト対立遺伝子（ＦＡ１「１７１対立遺伝子」と呼ばれる）との間に、関連性が見出された。ＦＡ１マイクロサテライト（変動する数の「ＣＡ」ジヌクレオチドを含む、反復ＤＮＡ配列）は、インターフェロンγレセプター１遺伝子の６番目のイントロン中に位置する（Ａｌｔａｒｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．６２：７２３−７２６（１９９８）；図１および２もまた参照のこと）。
【００１１】
実施例Ｉに開示されるように、ＦＡ１マイクロサテライトは、嚢手術を受けている７２人の潰瘍性大腸炎患者において特徴付けられた。ＦＡ１マイクロサテライトを含むゲノムＤＮＡの小さいフラグメントを酵素的に増幅し、その後、電気泳動して、その増幅されたフラグメントのサイズを決定した。実施例Ｉに示されるように、慢性回腸嚢炎を発症した患者のうち、７３．３％の患者が１７１対立遺伝子について陽性であった；対照的に、慢性回腸嚢炎を発症しなかった患者の位置、３９．３％のみが、１７１対立遺伝子について陽性であった（表Ｉ）。統計学的分析は、１７１対立遺伝子について陽性である患者が、１７１対立遺伝子を欠失している患者と比較した場合に、術後に慢性回腸嚢炎を発症する有意により高い危険性を有することを確かめた（ｐ＝０．０２、オッズ比＝４．４）。従って、１７１対立遺伝子は、術後の慢性回腸嚢炎の発症に強く関連し、そして回腸嚢炎発症の危険性を決定するために使用され得る。
【００１２】
本発明の方法は、回腸嚢炎手術を受けた患者の術後の医療的管理において有用である。本発明の方法に従って回腸嚢炎発症の増加した危険性を有すると決定された患者は、多くの治療の任意の１つによって予防的に処置され得る。回腸嚢炎についての医療的処置としては、以下が挙げられる：抗生物質（例えば、メトロニダゾール、シプロフロキサシン、アモキシシリンまたはクラブラン酸、エリスロマイシンおよびテトラサイクリン）；抗炎症剤（例えば、メサラミン浣腸、スルファサラジンおよび経口メサラミン）；免疫抑制剤（例えば、ステロイド浣腸、経口ステロイド、アザチオプリンおよびシクロスポリン浣腸）；栄養剤（例えば、短鎖脂肪酸の浣腸または坐剤、およびグルタミン坐剤）；および酸素ラジカルのインヒビター（例えば、アロプリノール）（例えば、Ｓａｎｄｂｏｒｎ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０７：１８５６−１８６０（１９９４）；Ｈａｎａｕｅｒ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４（１３）：８４１−８４８（１９９６）を参照のこと）。
【００１３】
本発明の方法は、回腸嚢炎を発症する増加した危険性にある患者の選択的処置を可能にし、そして低い危険性の患者に不必要な治療の副作用を回避させるのを可能にするために特に有用である。例えば、抗生物質処置（回腸嚢炎のための治療の好ましい過程である）に関連する副作用は、低い危険性の患者にこれらの薬物を不必要に摂取することを望ましくないものにする。本発明の方法は、臨床的症状が検出可能となる前に、回腸嚢炎を発症する危険性が増加した患者の処置を可能にし、初期の介入を介して慢性形態の回腸嚢炎の発症を予防し得る。従って、回腸嚢炎の発症の危険性を決定するための本発明の方法は、嚢手術を受けた潰瘍性大腸炎患者のより早期かつより選択的な処置において有用であり得る。
【００１４】
従って、本発明は、外科手順後（これによって、内部嚢が、潰瘍性大腸炎を患う患者において形成される）、回腸嚢炎発症の危険性を決定する方法を提供する。この方法は、インターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖する回腸嚢炎関連対立遺伝子の患者における存在または非存在を決定することによって、実施され、ここで、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在は、回腸嚢炎発症の増大した危険性を示す。本発明の方法において、インターフェロンγレセプター遺伝子座は、例えば、インターフェロンγレセプター１遺伝子（ＩＦＮＧＲ１）であり得、そして回腸嚢炎関連対立遺伝子は、ＩＦＮＧＲ１内にあり得る（例えば、ＩＦＮＧＲ１の６番目のイントロン）。好ましい実施形態において、回腸嚢炎関連対立遺伝子は、ＩＦＮＧＲ１ ＦＡ１ マイクロサテライト対立遺伝子である（例えば、１７１対立遺伝子）。本発明の方法は、回腸嚢肛門吻合（ｉｌｅａｌ ｐｏｕｃｈ ａｎａｌ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ）後の慢性回腸嚢炎発症の危険性を決定するために特に有用であり得る。
【００１５】
潰瘍性大腸炎は、痙攣、腹痛、直腸の出血ならびに血液、膿および粘膜の弛緩性排泄を伴う慢性の下痢によって特徴付けられる大腸の疾患である。潰瘍性大腸炎の発現は、広く変化する。悪化および寛解のパターンは、多くの潰瘍性大腸炎患者（７０％）の臨床過程を分類するが、寛解がない連続した症状は、潰瘍性大腸炎を患う幾人かの患者に存在する。潰瘍性大腸炎の局所性合併症および全身性合併症としては、関節炎、眼の炎症（例えば、ブドウ膜炎）、皮膚潰瘍および肝臓疾患が挙げられる。さらに、潰瘍性大腸炎および特に、長期の広範な疾患は、結腸癌腫の増大した危険性に関連する。
【００１６】
幾つかの病理的特徴は、炎症性腸疾患と対照的に潰瘍性大腸炎を特徴付ける。潰瘍性大腸炎は、通常、直腸の最も遠位な部位から可変な距離を、近位に伸展する広汎性の疾患である。用語「左側（ｌｅｆｔ−ｓｉｄｅｄ）大腸炎」は、脾弯曲部程遠くに伸展する、結腸の遠位な部分を含む炎症を記載する。直腸の容赦（ｓｐａｒｉｎｇ）または結腸のみの右側（近位部分）の関与は、潰瘍性大腸炎において異常である。潰瘍性大腸炎の炎症プロセスは、結腸に限定され、そして例えば、小腸、胃または食道は含まない。さらに、潰瘍性大腸炎は、一般に、腸壁のより深い層に残る粘膜の表面的な炎症と区別される。陰窩膿瘍（退化した腸の陰窩は、好中球で満たされている）はまた、潰瘍性大腸炎の典型である（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（第２版）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９４））。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「潰瘍性大腸炎」は、「ＵＣ」と同義であり、そして潰瘍性大腸炎の特徴的な内視鏡的特徴または組織病理学的特徴を伴う左側結腸疾患の臨床的特徴を有する疾患を意味する。本明細書中で使用される場合、左側結腸疾患の臨床的特徴は、直腸の出血、尿意促迫およびしぶりである。直腸の出血は、粘膜の排泄を伴い得る。潰瘍性大腸炎の臨床的処置は、局所治療を用いた処置および推薦される全結腸切除もしくは全摘（ｎｅａｒ-ｔｏｔａｌ）結腸切除または実施される全結腸切除もしくは全摘結腸切除を用いた処置を含み得る。
【００１８】
潰瘍性大腸炎の特徴的な内視鏡的特徴（これは、左側結腸疾患の臨床的特徴を伴って存在する場合、潰瘍性大腸炎を示す）は、近位または持続性の炎症よりも、遠位のより重篤な炎症である。潰瘍性大腸炎において存在し得るさらなる典型的な内視鏡的特徴は、結腸からの近位に伸展する炎症または表在潰瘍形成の存在もしくは深部潰瘍形成の欠損を含む。
【００１９】
潰瘍性大腸炎の特徴的な組織病理学的特徴（これは、左側結腸疾患の臨床的特徴を伴って存在する場合、潰瘍性大腸炎を示す）は、同質の、持続性の、主に表在性の炎症であるか、または生検標本内の「病巣性（ｆｏｃａｌｉｔｙ）」の欠損である。潰瘍性大腸炎に存在し得るさらなる典型的な組織病理的特徴は、陰窩膿瘍の存在または肉芽腫の欠損を含む。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「潰瘍性大腸炎を患う患者」は、本明細書中で定義されるような潰瘍性大腸炎の特徴的な内視鏡的特徴または組織病理的特徴を伴う左側結腸癌疾患の臨床的特徴の存在によって定義されるように、潰瘍性大腸炎を有する患者を意味する。
【００２１】
潰瘍性大腸炎が、医療的治療に非応答性である場合、結腸の外科的除去および内部嚢の形成は、疾患の有痛性の症状を治療し得る選択肢である。嚢手術の不運な合併症は、回腸嚢炎の発症であり得る。回腸嚢炎は、しばしば、腹の痙攣、糞尿意促迫（ｆｅｃａｌ ｕｒｇｅｎｃｙ）および出血または発熱を含む、さらなる可変の症状を伴う下痢として現れ、そして術後の基準線より上の１日あたり少なくとも３回の便の増加によって臨床的に診断され得る（Ｓａｎｄｂｏｒｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９０：７４０−７４７（１９９５））。回腸嚢炎の特徴的な内視鏡的特徴は、粒度、可撓性または血管のパターンの消失、粘膜滲出または嚢の潰瘍化である。本明細書中で使用される場合、用語「回腸嚢炎」は、回腸嚢炎の１つ以上の特徴的な内視鏡的特徴と合わせた下痢によって臨床的に顕著である外科的に形成されたレザバーの非特異的な炎症を意味する。用語「回腸嚢炎」は、早期発症型回腸嚢炎、急性回腸嚢炎および慢性回腸嚢炎を含み、そして以下に議論される、慢性回腸嚢炎の処置応答性形態および処置耐性形態を含む。
【００２２】
回腸嚢炎は、嚢の手術後、数ヶ月または数年で発症し得る。回腸嚢炎の累積非頻度は、嚢の手術後、１５％、３６％または４６％の患者が、それぞれ、１年、５年、または１０年で回腸嚢炎を発症するように、時間と共に増大する（Ｐｅｎｎａら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０６：Ａ７５１（１９９４））。早期発症型回腸嚢炎は、外科手順後（それによって、結腸は、除去され、そして内部嚢が、形成される）の１２ヶ月内に発症する回腸嚢炎の形態をいう。
【００２３】
回腸嚢炎は、急に起こり得るか、または慢性状態として起こり得る。急性回腸嚢炎は、単一の現象として起こり得るか、または抑制的な治療が、必要とされない回腸嚢炎がない間隔の間に断続性の再発として起こり得る。対照的に、ＩＰＡＡ後の約５パーセントの原因である、慢性回腸嚢炎は、適切な医学的治療にもかかわらない回腸嚢炎の持続する症状によってか、または、医学的治療が、中断される場合、症状の急速な再発を伴う持続性の医学的に抑制的な治療の必要性によって特徴付けられる。慢性回腸嚢炎は、進行中の抑制的な治療を必要とする、処置応答性であり得るか、または処置耐性であり得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「慢性回腸嚢炎」は、持続性の医学的に抑制的な治療を必要とする持続性（ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ）再発性回腸嚢炎もしくは持続性（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）再発性回腸嚢炎または医学的処置にもかかわらず、持続性の症状によって特徴付けられる回腸嚢炎を意味する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「患者」は、回腸嚢炎を発症し得る、動物（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）を意味する。
【００２６】
本明細書中に記載される場合、用語「外科手術（それによって内部嚢が形成される）」は、「嚢手術」と同義であり、そしてしばしば、全結腸切除もしくは全摘結腸切除を含む、自制の維持のための内部レザバーの生成を生じる外科手順を意味する。形成された内部レザバーは、例えば、回腸のレザバーまたは回盲のレザバーであり得る。通常の外科手順（それによって、内部嚢は形成される）は、回腸嚢肛門吻合である。
【００２７】
本発明の方法は、回腸嚢肛門吻合のような手術を受けた潰瘍性大腸炎患者における回腸嚢炎発症の危険性を決定するために有用である。回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在によって示される回腸嚢炎発症に関して本明細書中で使用される場合、用語「増大した危険性」は、回腸嚢炎関連対立遺伝子を欠損した患者に対する回腸嚢炎発症の可能性よりも有意に高い回腸嚢炎の発症の可能性を意味する。
【００２８】
本発明の方法は、インターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖する回腸嚢炎関連対立遺伝子に依存する。本明細書中で使用される場合、用語「連鎖する（連鎖される）」は、２つの遺伝子の遺伝子座が、近接の結果として共に遺伝される傾向を有することを意味する。２つの遺伝子の遺伝子座が、連鎖され、そして多型性である場合、１つの遺伝子座における特定の対立遺伝子は、第２の遺伝子座における特定の対立遺伝子の遺伝のためのマーカーとして役立ち得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「インターフェロンγレセプター遺伝子座」は、インターフェロンγレセプターのサブユニットをコードする遺伝子座を意味する。インターフェロンγレセプター遺伝子座は、例えば、ヒトインターフェロンγレセプター１遺伝子座（ＩＦＮＧＲ１）またはインターフェロンγレセプター２遺伝子座（ＩＦＮＧＲ２）であり得る。ヒトＩＦＮＧＲ１についての配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７として入手可能であり、
インターフェロンγレセプター１の対応する転写されたｍＲＮＡについての配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０３１４３として見出され得る。ヒトインターフェロンγレセプター２の転写されたｍＲＮＡについての配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５５３４として入手可能である。
【００３０】
本発明の方法は、回腸嚢炎関連対立遺伝子に依存する。本明細書中で使用される場合、用語「回腸嚢炎関連対立遺伝子」は、安定に遺伝可能な分子バリエーションを意味し、このバリエーションは、伝統的なメンデルの遺伝学に従って予想される危険性よりも頻度が高く回腸嚢炎発症の増大した危険性と一緒に遺伝される傾向にある。回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えば、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子に連鎖する対立遺伝子であり得るか、またはＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子それ自体であり得る（実施例Ｉを参照のこと）。
【００３１】
本発明の方法において有用な回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えば、回腸嚢炎発症の増大した危険性と共に遺伝される傾向にあるマイクロサテライト（ｍｓ）、単一ヌクレオチド多型（ｓｎｐ）または、可変数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）多型であり得る。マイクロサテライトは、２つのヌクレオチド、３つのヌクレオチド、４つのヌクレオチドまたは５つのヌクレオチドの２つ以上の反復であり得；マイクロサテライトにしばしば見られるジヌクレオチド反復は、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＡＣ、ＡＧもしくはＧＣ反復またはそれらの相補鎖を含む。マイクロサテライトは、例えば、６以上のヌクレオチド反復、８以上のヌクレオチド反復、１０以上のヌクレオチド反復、１２以上のヌクレオチド反復、１４以上のヌクレオチド反復、１６以上のヌクレオチド反復、２０以上のヌクレオチド反復、２２以上のヌクレオチド反復または２４以上のヌクレオチド反復を含み得る。１つ以上のヌクレオチドのバリエーション（例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失）に加えて、当業者は、回腸嚢炎関連対立遺伝子はまた、初期ヌクレオチド配列における差異を生成しない異常なメチル化または他の改変のような分子バリエーションであり得ることを理解する。
【００３２】
回腸嚢炎関連の対立遺伝子は、イントロンもしくはエキソンまたはコード配列に対する配列５’もしくは３’に生じ得、そして遺伝子産物の発現または活性に影響し得るかあるいは影響しないかもしれない。インターフェロンγレセプター遺伝子内の回腸嚢炎関連の対立遺伝子は、例えば、活性が低いかまたは不活性なインターフェロンγレセプター遺伝子産物の生成を生じ得るか、あるいは量の減少したインターフェロンγレセプター遺伝子産物を生じ得る。インターフェロンγレセプタ遺伝子内の回腸嚢炎関連の対立遺伝子はまた、イントロン内または５’もしくは３’調節配列内に位置し得、そしてインターフェロンγレセプターコードｍＲＮＡの転写もしくは翻訳またはスプライシングの調節に影響し得る。従って、このような対立遺伝子は、インターフェロンγレセプター遺伝子発現レベルの変化またはインターフェロンγレセプター遺伝子産物改変体の発現を生じ得る。回腸嚢炎関連の対立遺伝子が、インターフェロンγレセプターコード配列内の１以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を生じるヌクレオチド改変であってインターフェロンγレセプター遺伝子産物改変体を生成する場合、この改変体は、インターフェロンγの結合後のシグナル伝達の能力を欠くポリペプチドであり得るか、またはドミナントネガティブな分子として機能する可溶性インターフェロンγレセプターポリペプチドであり得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、回腸嚢炎の発症の危険性は、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子を使用して決定される。回腸嚢炎関連の対立遺伝子（例えば、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子）は、市販の参照ＤＮＡ（例えば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から得られる）を使用して、Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）参照個体（例えば、１３４７−０２と名付けられた個体（Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：１５２−１５４（１９９６））と比較して定義される。本明細書中で使用する場合、用語「ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子」は、「１７１対立遺伝子」と同義であり、そしてインターフェロンγ ＦＡ１マイクロサテライトの対立遺伝子を意味し、これは、アッセイにおいてプライマー（配列番号２および３）で増幅された場合に１７１塩基対（ｂｐ）の大きさを有し、ここで、ＣＥＰＨ参照個体１３４７−０２のヘテロ接合性のＦＡ１対立遺伝子は、１８９塩基対および１９１塩基対の大きさを有する。このＦＡ１マイクロサテライトは、多型であり、そして異なる個体中で、異なる数の反復を有する。例えば、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライトは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７の残基６４２１３〜６４２５４で、２１個の「ＣＡ」反復を有する。ＦＡ１マイクロサテライトの別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８４７２１として利用可能であり、これは、Ｕ８４７２１の残基８９〜１３２で、２２個の「ＧＴ」反復（ＣＡ反復の相補体）を含む。
【００３４】
本明細書の実施例１で開示されるように、１７１対立遺伝子の存在は、例えば、プライマー５’−ＴＥＴ−ＴＧＡ ＡＴＴ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＣＴ−３’（配列番号２）および５’−ＣＡＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＴＧ−３’（配列番号３）での増幅によって生成される１７１塩基対のフラグメントのゲル電気泳動によって、簡便に検出され得る。当業者は、１７１対立遺伝子の単一のコピーが回腸嚢炎の発症の高い危険性を示すのに十分であること；従って、１７１対立遺伝子についてヘテロ接合体の潰瘍性大腸炎の患者が、１７１対立遺伝子のいずれのコピーも有さない潰瘍性大腸炎の患者の確率よりも有意に高い回腸嚢炎発症の確率を有することを理解する。
【００３５】
命名「１７１」が、特定のプライマー対（配列番号２および３）でのＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座の増幅によって得られるフラグメントの大きさを反映していることが理解される。ＣＥＰＨ参照個体１３４７−０２の１８９対立遺伝子および１９１対立遺伝子、ならびにＦＡ１マイクロサテライト領域内の遺伝子配列と比較した１７１対立遺伝子の大きさの観点から、当業者は、本発明の方法において有用であり得る種々の代替のプライマー対を容易に設計し得る。代替のプライマー対によって、１７１対立遺伝子は、異なる特徴的な大きさを有し、これは、同じ代替のプライマー対で増幅した場合に、ＣＥＰＨ参照個体１３４７−０２のヘテロ接合体対立遺伝子の大きさよりも１８塩基対および２０塩基対小さい。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供し、これは、患者由来の核酸の酵素的増幅を使用してインターフェロンγ遺伝子座に対する回腸嚢炎関連の対立遺伝子の連鎖の存在または非存在を決定することによる。他の実施形態において、回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在は、電気泳動分析、制限フラグメント長多型分析、配列決定分析、またはこれらの技術の組み合わせによって決定される。
【００３７】
本発明はまた、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供し、これは、患者からＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む核酸を含む材料を得、そしてこの核酸を酵素的に増幅してＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座またはその一部を含む増幅フラグメントを生成することによる。当業者は、増幅フラグメントが、列挙した遺伝子座の部分を含むことのみを必要とすることを理解する。従って、例えば、増幅フラグメントは、種々の長さのＣＡ反復を含むＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座の部分を含むことのみを必要とし、そして例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８４７２１の全体の配列を含む必要はない。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供し、これは、患者からＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む核酸を含む材料を得、この核酸を酵素的に増幅してＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む増幅フラグメントを生成し、そしてこの増幅フラグメントを電気泳動し、それによってＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子が存在するか否かを決定することによる。１７１対立遺伝子の存在は、回腸嚢炎の発症の危険性の増大を示す。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、用語「材料」は、核酸が調製され得る生物学的な任意の事物を意味する。この用語、材料は、全血、血漿、リンパ、尿、乳汁、唾液、皮膚、毛包、頸部、頬、または核酸を含む他の体液もしくは組織を含む。好ましい材料は、頬または全血であり、これらは、非侵入性の手段によって容易に得ることができ、そして酵素的増幅のためのゲノムＤＮＡの調製に使用され得る。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味し、そして一本鎖の核酸および二本鎖の核酸の両方を含む。総ゲノムＤＮＡは、本発明の方法を実行するための特に有用な核酸である。
【００４１】
回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在は、当該分野で周知の種々の分子遺伝型決定方法を使用して決定され得る。このような遺伝型決定方法としては、例えば、電気泳動ベースの方法、配列決定分析、制限フラグメント長多型分析、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ヘテロ二重鎖移動度アッセイ、一本鎖コンフォメーション多型分析、変性勾配ゲル電気泳動、切断フラグメント長多型分析およびローリングサークル増幅が挙げられる。当業者は、変性勾配ゲル電気泳動およびヘテロ二重鎖移動度アッセイを含む電気泳動ベースの方法が、マイクロサテライト対立遺伝子であるところの回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在の決定のために特に有用であることを理解する。一般には、Ｂｉｒｒｅｎら（編）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第１巻（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２章（補遺４９）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと。
【００４２】
１つの実施形態において、回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在は、電気泳動分析を使用して決定される。電気泳動（ゲルまたはキャピラリー電気泳動を含む）は、大きさの異なる対立遺伝子を含む増幅フラグメントの分離において有用であり得る。用語「電気泳動分析」または「電気泳動」は、増幅フラグメントのような１以上の核酸に関して本明細書中で使用される場合、電場の影響下で、荷電した分子を定常溶媒を通じて移動させるプロセスを意味する。電気泳動の移動度は、核酸の電荷（核酸の大きさに比例する）に基づいて主に分離し、より小さい核酸は、より迅速に移動する。用語、電気泳動分析または電気泳動は、スラブ（ｓｌａｂ）ゲル電気泳動（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動）およびキャピラリー電気泳動の両方を使用する分析を含む。数分の分離時間で高い（キロボルトレベル）分離電圧の存在下で、小直径の（５０〜１００μｍ）の石英キャピラリー内で一般に生じるキャピラリー電気泳動分析は、本発明の方法において特に有用であり得る。キャピラリー電気泳動分析を使用して、増幅フラグメントのような核酸は、ＵＶ吸収または蛍光標識によって簡便に検出され、そして一塩基の解像度が、数百塩基対までのフラグメント上で得られ得る。このような電気泳動分析の方法およびその改変は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、２０００に記載のように、当該分野で周知である。
【００４３】
制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析はまた、本発明の方法において回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在を決定するために有用であり得る（Ｊａｒｃｈｏら、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２．７．１〜２．７．５頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０））。本明細書中で使用する場合、用語「制限フラグメント長多型分析」は、「ＲＦＬＰ分析」と同義であり、そして制限酵素を使用して遺伝子多型を区別するための任意の方法を意味する。この制限酵素は、核酸の分解を触媒し、そして特定の塩基配列（一般には、パリンドロームまたは逆反復）を認識するエンドヌクレアーゼである。当業者は、ＲＦＬＰ分析の使用が、多型の部位で２つの対立遺伝子を区別し得る酵素に依存し得るか、あるいは、ＲＦＬＰ分析が、同じ部位で切断される場合のフラグメントの大きさに依存し得ることを理解する。
【００４４】
配列決定分析はまた、本発明の方法において回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在を決定するために使用され得る。用語「配列決定分析（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」は、増幅フラグメントのような１以上の核酸に関して本明細書中で使用する場合、手動または自動の任意のプロセスをいい、これによって、核酸中のヌクレオチドの順番を決定する。用語、配列決定分析は、化学的配列決定（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）およびジデオキシ酵素的配列決定（Ｓａｎｇｅｒ）ならびにこれらの改変を含むことが理解される。従って、用語、配列決定分析は、キャプラリー電気泳動およびレーザー誘導蛍光検出に依存するキャピラリーアレイＤＮＡ配列決定を含み、そして例えば、ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００またはＡＢＩ ３７００を使用して実行され得る。配列決定分析はまた、ゲル電気泳動および蛍光検出、放射性核種検出などのような検出方法を使用して実行され得る。ゲル電気泳動は、例えば、ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシーケンサーを使用して実行され得る。用語、配列決定分析によってまた含まれるものは、熱サイクル配列決定（Ｓｅａｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：６２６−６３３（１９９２））；固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：３９−４２（１９９２））およびマトリックス補助レーザー離脱／イオン化飛行時間質量分析法であるところのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：３８１−３８４（１９９８））のような質量分析法による配列決定である。用語、配列決定分析はまた、例えば、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）（これは、未知のＤＮＡに存在する配列の断片を同定するための全ての可能性のある短いオリゴヌクレオチドのアレイに依存する）を含む（Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１−６１４（１９９６）；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１６４９−１６５２（１９９３）；およびＤｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５４−５８（１９９８））。当業者は、これらのバリエーションまたはさらなるバリエーションが、本明細書中に定義される用語、配列決定分析に含まれることを理解する。一般には、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、２０００；第７章を参照のこと。
【００４５】
クレアバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）フラグメント長の多形性分析はまた、本発明の方法において有用であり得る。クレアバーゼは、ＤＮＡの一本鎖領域と二本鎖領域の間の接合部を切断する酵素である。クレアバーゼ消化後のＤＮＡサンプルのゲル濾過移動パターンは、一本鎖および二本鎖領域の数、ＤＮＡの一本鎖領域と二本鎖領域との間の平衡、および各切断フラグメントにおけるヌクレオチドの数によって、ＤＮＡサンプルの各改変体について特有であり得る。この特有のパターン、すなわち「バーコード」は、その移動パターンによって核酸サンプルサンプルを迅速に遺伝子型決定するのに用いられ得る（例えば、Ｔｏｎｄｅｌｌａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：２４０２〜２４０７（１９９９）；および米国特許第５，７１９，０２８号および同５，８４６，７１７第を参照のこと）。
【００４６】
変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）がまた、本発明の方法において、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る。ＤＧＧＥにおいて、二本鎖ＤＮＡは、漸増する濃度の変性剤を含有するゲル中で電気泳動され；ミスマッチの対立遺伝子からなる二本鎖フラグメントは、さらに迅速に融解するセグメントを有し、このようなフラグメントを、完全に相補的な配列に比較した場合、示差的に遊走させる（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｙ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ｉｎｎｉｓら．，前出、１９９０）。
【００４７】
ヘテロ二重鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）は、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る、別の周知のアッセイである。ＨＭＡは、多形性配列の存在を検出するために有用である。なぜなら、ミスマッチ（不適合）を保有するＤＮＡ二本鎖は、完全に塩基対合した二本鎖の移動度に比べてポリアクリルアミドゲルにおける移動度が減少しているからである（Ｄｅｌｗａｒｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１２５７〜１２６１（１９９３）；Ｗｈｉｔｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２：３０１〜３０６（１９９２））。
【００４８】
一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）の技術がまた、本発明の方法において、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る（Ｈａｙａｓｈｉ、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：３４〜３８（１９９１）を参照のこと）。この技術は、非変性ゲル電気泳動の際、変化した電気泳動の移動度を生じる、一本鎖ＤＮＡの二次構造における差異に基づく変異を検出するために用いられ得る。多型フラグメントは、既知の対立遺伝子を含有する、対応する標準的フラグメントに対する、試験フラグメントの電気泳動パターンの比較によって検出される。
【００４９】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションがまた、本発明の方法において、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、例えば、回腸嚢炎関連対立遺伝子のヌクレオチドに対して、完全に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく。適切な条件下で、この対立遺伝子特異的プローブは、回腸関連対立遺伝子を含む核酸にハイブリダイズするが、このプローブに比較して１つ以上のヌクレオチドミスマッチ（不適合）を有する、１つ以上の他の対立遺伝子にはハイブリダイズしない。所望の場合、別の対立遺伝子に適合する第二の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドがまた用いられ得る。同様に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド増幅の技術を用いて、例えば、回腸嚢炎関連対立遺伝子のヌクレオチド配列に完全に相補的であるが他の対立遺伝子に比較して１つ以上のミスマッチを有する、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、回腸嚢炎関連対立遺伝子を選択的に増幅し得る（Ｍｕｌｌｉｓら（編）、Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、（１９９４））。当業者は、回腸嚢炎関連対立遺伝子と１つ以上の他の対立遺伝子との間を識別する１つ以上のヌクレオチドミスマッチが、好ましくは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにおいて用いられるべき対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの中心に配置されることを理解する。対照的に、ＰＣＲ増幅において用いられるべき対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、回腸嚢炎関連対立遺伝子と他の対立遺伝子を、このプライマーの３’末端で識別する１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む。
【００５０】
ローリングサークル増幅がまた、本発明の方法において、回腸関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る（Ｂａｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：５０７３〜５０７８（１９９８）、およびＬｉｚａｒｄｉら．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５〜２３２（１９９８））。ローリングサークル増幅において、直線プローブは、プローブの５’末端および３’末端が特定のヌクレオチド配列において直ちに隣接するヌクレオチドにハイブリダイズするように、設計される。サンプルＤＮＡが、特定の配列を有する場合、５’末端および３’末端は、隣接し、そしてこのプローブは、リガーゼを用いて環状にされ得る。特定の配列のないサンプルＤＮＡは、お互いに直ちに隣接する５’末端および３’末端ハイブリダイズを生じず、従って環状化のための首尾よいテンプレートとしては作用しない。次いで、環状化されたプローブを、ローリングサークル複製において用いて、検出の前に配列を増幅し得る。
【００５１】
回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するための他の周知のアプローチとしては、自動化配列決定およびＲＮＡａｓｅミスマッチ技術が挙げられる（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７５７５〜７５７９（１９８５））。さらに、当業者は、上記の増幅方法または切断方法がまた、酵素反応の検出のためまたはテンプレートとしてＤＮＡマイクロアレイを用いて、固体状態の方法において用いられ得ることを理解する（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、２０００）。同様に、質量分析を、例えば、米国特許第６，０４３，０３１号、同第５，６０５，７９８号、および同第５，５４７，８３５号に記載のように、切断産物または増幅産物の検出のために用い得る。本発明の方法は、多型対立遺伝子を検出するためのこれらのまたは他の当該分野で認識されたアッセイを用いて実施され得る。
【００５２】
１つの実施形態において、回腸嚢炎関連対立遺伝子と回腸嚢炎発生のリスクの上昇との間の関連の強度は、少なくとも１の９５％以下の信頼区間限界で、少なくとも４のオッズ比で、特徴付けられる。オッズ比は、少なくとも１の９５％以下信頼区間限界では、例えば、少なくとも３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、または６．０であり得、例えば、オッズ比は、９５％信頼区間は１．２〜１５．４で、少なくとも４である（表１を参照のこと）。本明細書において開示されるように、１７１の対立遺伝子について陽性な潰瘍性大腸炎患者のうち３５％が、ＩＰＡＡ後に慢性回腸嚢炎を発症したが、一方、１７１の対立遺伝子について陰性の患者のうち１１％しか慢性回腸嚢炎は発症しなかった。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析は、７２例の試験した患者の群における、１７１の対立遺伝子が、１７１の対立遺伝子を欠く患者に比較して、慢性回腸嚢炎のリスクのさらに高いリスクと有意に関連していたことを示した。オッズ比は、９５％信頼区間限界が少なくとも１．２で４．４であった。オッズ比を決定する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓｃｈｌｅｓｓｅｌｍａｎら．，Ｃａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃｏｎｄｕｃｔ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと）。
【００５３】
本明細書の実施例Ｉにおいて開示されたように、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子は、０．０２のｐ値で慢性回腸嚢炎の上昇したリスクと関連していた。「ｐ値」または「確率値」は、当該分野で公知の用語である。対立遺伝子と回腸嚢炎のような状態との間の関連についての試験において、ｐ値は、この対立遺伝子および条件が、無作為な因子または偶発的因子と関連する確率を測定する。１．００のｐ値は、この確率が高いか確実であること、この対立遺伝子および条件の関連が、無作為な因子または偶発的因子に起因することを示す。このことは、この対立遺伝子が、この条件に影響しないことを示す。０．０５のｐ値は、対立遺伝子と条件との間の関連の統計学的試験における代表的閾値である。０．０５のｐ値は、「偽陽性率」、すなわち、この試験が、対立遺伝子とこの条件との間の関連が存在することを誤って示す率が、２０の試験のうち１回であることを示す。回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えば、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、もしくは０．００１以下のｐ値で、または０．０００９５、０．０００９、０．０００８５、もしくは０．０００８未満のｐ値で、回腸嚢炎発症の高いリスクと関連し得る。ある場合には、ｐ値は、例えば、サンプルサイズ（ファミリーの数）、遺伝子の異質性（結合型および非結合型）、臨床的異質性、または分析的アプローチ（パラメトリック法またはノンパラメトリック法）のような因子を考慮するために補正されることが必要かもしれない。
【００５４】
別の実施形態において、本発明は、手術手順（これによって内部パウチ（ポーチ）が作製される）後、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎発生のリスクの低下を決定する方法を提供する。この方法は、この患者における、インターフェロンγレセプター遺伝子座に結合した回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定する方法からなる。ここでこの回腸嚢炎関連対立遺伝子の非存在は、回腸嚢炎発生のリスクの低下を示す。
【００５５】
用語、リスクの低下とは、本明細書において用いる場合、回腸嚢炎関連遺伝子の非存在によって示された回腸嚢炎発生に関して言及する場合、回腸嚢炎関連対立遺伝子を有する患者についての回腸嚢炎発生の確率よりも有意に低い回腸嚢炎発症の確率をいう。
【００５６】
前の研究は、高いｐＡＮＣＡ力価（１００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌより大きい）の存在が、回腸嚢炎発生のリスクの指標として用いられ得ること、およびこのような方法が、本明細書において参考として援用されている米国特許第５，９３７，８６２号において例示されていることを実証している。さらに、本明細書において開示したように、回腸嚢炎関連の１７１の対立遺伝子の存在が、回腸嚢炎発生のリスクの上昇と関連するが、高いｐＮＡＣＡ力価の存在とは関連しないことが見出された（実施例ＩＢを参照のこと）。従って、回腸嚢炎関連対立遺伝子（例えば、ＦＡ１ミクロサテライト１７１対立遺伝子）、および高いｐＡＮＣＡ力価の存在は、回腸嚢炎発生の高いリスクの独立した指標である。これらの結果は、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子についての遺伝子試験が、高いｐＡＮＣＡ力価についての血清学的試験と組合されて、回腸嚢炎発生のリスクを決定する非常に鋭敏な方法をもたらし得ることを示す。
【００５７】
従って、本発明はまた、外科的手順後の回腸嚢炎発病の危険性を決定するための遺伝学的試験および血清学的試験をあわせる方法を提供し、それによって、内部嚢が、潰瘍性大腸炎を有する患者中に作製される。この方法は、インターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖された回腸嚢炎関連対立遺伝子の患者における存在または非存在を決定すること；および患者における高いｐＡＮＣＡ力価の存在または非存在を決定することによって実行され、ここで、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または高いｐＡＮＣＡ力価の存在のいずれかは、回腸嚢炎発病の増加した危険性を示す。
【００５８】
本明細書中に開示される結果はまた、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）（肝臓内管の関与を伴なうかまたは伴なわない肝臓外胆管の閉塞性炎症性線維症によって特徴付けられる疾患）に関する。この疾患は、一般的に、たゆまぬ様式で（予測不可能にもかかわらず）肝硬変、門脈圧亢進症、および肝不全からの死に進行する。原発性硬化性胆管炎は、単独で生じ得るか、または潰瘍性大腸炎と関連して生じ得、そしてあまり一般的ではないが、種々の他の疾患と関連して生じる。症状は、一般的に、黄疸、純正（ｐｕｒｉｔｉｓ）かつ非特異的な上腹部疼痛が挙げられる。原発性硬化性胆管炎の医学的処置は、単独または併用した、コルチコステロイド、抗体、免疫抑制剤、および胆嚢刺激物質（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｇｕｅｓ）が挙げられ得る。
【００５９】
実施例Ｉに開示されるように、１７１対立遺伝子について陽性であった原発性硬化性胆管炎を有さない患者（３７．５％；ｐ＝０．０１９）と比較して、原発性硬化性胆管炎を発病した患者の優位に高いパーセンテージが、１７１対立遺伝子について陽性であった（６９．２％）。これらの結果は、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子が、原発性硬化性胆管炎の診断指標として使用され得ることを示す。
【００６０】
従って、本発明はまた、個体におけるインターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在または非存在を決定することによって、原発性硬化性胆管炎を診断する方法を提供し、ここで、この１７１対立遺伝子の存在は、原発性硬化性胆管炎の診断である。この遺伝学的方法は、多型対立遺伝子の存在または非存在を決定するための種々の分子技術のうちのいずれかを使用して実行され得る（上記を参照のこと）。
【００６１】
潰瘍性大腸炎は、胃腸管に影響を与えそして類似の徴候を生成する多数の別個の疾患サブタイプを示す異質性の障害であると認識される。異質性の潜在する潰瘍性大腸炎は、例えば、特定の処置戦術に対する種々の応答に影響され得る。疾患サブタイプの例は、医学的に耐性の潰瘍性大腸炎を有する潰瘍性大腸炎患者のサブグループである（米国特許第５，９６８，７４１号（１９９９年１０月１９日発行）を参照のこと）。これらの患者は、ステロイド、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シクロスポリンＡなどに非応答性である。標準的な処置に対するこれらの耐性の結果として、潰瘍性大腸炎患者のサブグループは、代表的に、医療処置または結腸切除のより攻撃的な形態を必要とする。
【００６２】
臨床的なサブタイプの他の例としては、クローン病のｐＡＮＣＡ陽性臨床サブタイプ（これは、クローン病の代表的である特徴に加えた潰瘍性大腸炎の特徴によって特徴付けられる）が挙げられる。これらのｐＡＮＣＡ陽性クローン病患者は、粘膜炎症の類似した型に罹患し、そして特定の治療経過と同様に応答し、そしてさらに、潰瘍性大腸炎の医学的治療技術において効果的である治療ストラテジーと同じ治療ストラテジーのうちのいくつかから利益を受け得るが、他のクローン病患者は、非応答性である（米国特許第５，９１６，７４８号（１９９９年６月２９日発行）、および米国特許第５，８７４，２３３号（１９９９年２月２３日発行）を参照のこと）。
【００６３】
上記に鑑みて、当業者は、ＦＡ１マイクロサテライト対立遺伝子がまた、潰瘍性大腸炎またはクローン病の特定のサブタイプと関連し得ることを理解する。臨床的なサブタイプは、その疾患の特徴が同じ疾患を有する他の患者よりも互いにより類似する、特定の疾患（例えば、潰瘍性大腸炎）を有する患者のサブグループである。
【００６４】
潰瘍性大腸炎の例示的なサブタイプは、嚢手術を受け、そして引続いて腸管外合併症（例えば、クローン病において見出される炎症に類似した炎症）が続く慢性回腸嚢炎を発病する潰瘍性大腸炎を有するとして診断された患者のサブグループである。このような集団は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２１：１３４３−１３５３（１９９７）に記載される。本発明に従って、回腸嚢炎関連対立遺伝子（例えば、ＦＡ１ マイクロサテライト １７１対立遺伝子）の存在は、嚢手術後に発病するクローン病様合併症の患者のこのサブタイプを同定するために、使用され得る。
【００６５】
本発明はまた、少なくとも１５ヌクレオチドを含み、かつ、温和にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７のヌクレオチド６３２１４〜６４２１３を有する核酸分子またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７のヌクレオチド６４２５５−６５２５４を有する核酸分子と選択的にハイブリダイズする、単離されたヌクレオチドプローブを提供する（ただし、このヌクレオチドプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７でもＵ８４７２１でもない）。本発明はまた、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７のヌクレオチド６３２１４〜６４２１３を有する核酸分子またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７のヌクレオチド６４２５５〜６５２５４を有する核酸分子の、少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、単離されたヌクレオチドプローブを提供する（ただし、このヌクレオチドプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７でもＵ８４７２１でもない）。本発明の単離されたヌクレオチドプローブは、例えば、少なくとも１２、１５、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さを有し得る。本発明の単離されたヌクレオチドプローブは、例えば、最大２０、２５、３０、３５、４０、６０、８０、１００、１５０または２００ヌクレオチドの最大長を有し得る。
【００６６】
潰瘍性大腸炎を処理するための外科的手順後の回腸嚢炎発病に対する、患者の罹病性を示すためのキットがさらに、本発明によってさらに提供される。本発明のキットは、インターフェロンγレセプター１遺伝子のＦＡ１ マイクロサテライト遺伝子座を含む増幅フラグメントを形成するための増幅反応において一緒に使用され得る、２つのヌクレオチドプローブを含む（ただし、これらの２つのヌクレオチドプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７でもＵ８４７２１でもない）。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。
【００６８】
（実施例Ｉ）
本実施例は、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１ マイクロサテライト １７１対立遺伝子が、回腸嚢肛門吻合術後の慢性回腸嚢炎の発病と関連するこ
とを、実証する。
【００６９】
（Ａ．ＦＡ１ マイクロサテライト １７１対立遺伝子と、慢性回腸嚢炎の増加した危険性との関連）
血液サンプルを、回腸嚢炎を有する７２人の白色人患者から、回腸嚢肛門吻合術を施したときに収集した。回腸嚢炎発病に関する各患者の状態を、手術後の１ヶ月と８１ヶ月との間に少なくとも１回追跡調査した（中心の追跡調査：手術の２７ヶ月後）。追跡調査は、患者の遺伝子型およびｐＡＮＣＡ状態に対して目隠しされた研究者による、臨床的および内視鏡的な試験された回腸嚢炎の評価を含んだ。評価した７２人の患者のうち、３６％（ｎ＝２６）が、回腸嚢炎を発病し、そして２２％（ｎ＝１６）が、回腸嚢炎の症状再発したという基準に基づいて、慢性回腸嚢炎を発病しているとして分類した。
【００７０】
患者を、インターフェロンγレセプター１遺伝子の第６イントロン中に位置するＦＡ１マイクロサテライトマーカーについて遺伝子型決定し、そしてＦＡ１対立遺伝子と慢性回腸嚢炎との間の関係について分析した。特異的ＦＡ１対立遺伝子（１７１対立遺伝子と命名される）が、試験した７２人の患者のうちの３４人に存在した（４７％）。この１７１対立遺伝子について陽性であった患者のうち、３５％は、慢性回腸嚢炎を発病した。対照的に、この１７１対立遺伝子について陰性であった患者の内の１１％のみが、慢性回腸嚢炎を発病した。さらに、慢性回腸嚢炎を発病した患者のうち、７３．３％が、１７１対立遺伝子について陽性であり；対照的に、慢性回腸嚢炎を発病しなかった患者のうち、３９．３％のみが、この１７１対立遺伝子について陽性であった（表Ｉ）。
【００７１】
Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存分析によって、１７１対立遺伝子陽性患者が、１７１対立遺伝子陰性患者よりも、慢性回腸嚢炎を発病する有意に高い危険性を有したことが、確認された（ｐ＝０．０２、オッズ比＝４．４、９５％信頼限界＝１．２〜１５．４）。これらの結果は、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在が、回腸嚢肛門吻合術を受けた潰瘍性大腸炎患者における慢性回腸嚢炎の増加した危険性の指標であることを示す。
【００７２】
腸管外合併症、外科的適応症（原発性硬化性胆管炎（ｃｏｌａｎｇｉｔｉｓ）および回腸嚢炎）について試験された６６人の患者に対して、類似の分析を実行した。これら６６人の患者のうち、４８人をまた、ｐＡＮＣＡレベルについて試験した。慢性回腸嚢炎を用いた知見と類似して、回腸嚢炎のいずれかの形態を発病した患者は、回腸嚢炎を有さない患者よりも、１７１対立遺伝子についてより頻度が高く陽性であった（ｐ＝０．０３９、表Ｉを参照のこと）。さらに、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を発病した患者の優位に高いパーセンテージがまた、１７１対立遺伝子について陽性であったＰＳＣを有さない患者の３７．５％（ｐ＝０．０１９）に関して、１７１対立遺伝子について陽性であった（６９．２％）。考え合わせると、これらの結果は、ＦＡ１ １７１対立遺伝子が、慢性回腸嚢炎、回腸嚢炎または原発性硬化性胆管炎の発病の診断指標として試用され得ることを示す。
【００７３】
ＦＡ１ マイクロサテライト遺伝子座における遺伝子型決定を、本質的に以下のように実行した。各患者由来のゲノムＤＮＡを、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８４７２１に報告されるＦＡ１マイクロサテライトに隣接する配列に基づくプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した（図２）。プライマーＡは、配列５’−ＴＥＴ−ＴＧＡ ＡＴＴ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＣＴ−３’（配列番号２）を有し、そしてプライマーＢは、配列５’−ＣＡＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＴＧ−３’（配列番号３）を有し、これらは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）によって調製した。ＰＣＲ増幅を、製造業者ら（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の指示書に従って、Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ Ｇｏｌｄ．ＴＭ ＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実行した。簡単に言うと、ＰＣＲを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．３）；５０ｍＭ ＫＣｌ；０．００１％ ゼラチン；２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；１単位のＡｍｐｌｉ−Ｔａｑ ＧｏｌｄＴＭ ＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼ；４０〜１００ｎｇ ゲノムＤＮＡ；ならびに２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰを含む、２０μｌ容量中で実行した。サーマルサイクリングを、以下のように実行した：９５℃で１０分間を１サイクル；９５℃で３０秒間、５５℃で７５秒間、および７０℃で１５秒間を３５サイクル；ならびに７０℃で１０分間を１サイクル。
【００７４】
【表１】
増幅されたＰＣＲ産物を、以下のように分析した。ＰＣＲ産物のサンプルを、蒸留した脱イオン水で、１：５〜１：２０に希釈した。この希釈したサンプルを、４．２５％ポリアクリルアミド／６Ｍ尿素ゲル上にロードし、そして製造者によって提供される標準的なプロトコルに従って、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して２〜２．５時間電気泳動した。このバンドの位置によって、サイズ標準物およびＧｅｎＳｃａｎ（登録商標）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，１９９７）において示唆される方法に従って、サイズを割り当てた。参照個体由来のヘテロ接合性ＦＡ１マイクロサテライト（ＣＥＰＨ １３４７−０２）を、内部標準として使用した；この個体は、ＦＡ１マイクロサテライト１８９対立遺伝子および１９１対立遺伝子を有することが示された。上記の条件下で、ＣＥＰＨ １３４７−０２の１８９対立遺伝子および１９１対立遺伝子は、１８８．５ｂｐおよび１９０．４ｂｐの見掛け上のサイズを有し、そして、１７１対立遺伝子は、１７０．９の見掛け上のサイズを有する（図３）。統計学的方法を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｒｅｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して行った。患者がｐＡＮＣＡ陽性（少なくとも１ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）であるか、そして患者が高いｐＡＮＣＡレベル（少なくとも１００ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）を有するかを、Ｐ値を、患者の民族性（ユダヤ人対非ユダヤ人）を考慮して算出した。
【００７５】
（Ｂ．ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子および高ｐＡＮＣＡレベルは、独立して慢性回腸嚢炎の発生と関連する）
手術前の高レベルのｐＡＮＣＡは、ＩＰＡＡ後の慢性回腸嚢炎に関連することが示されている。ｐＡＮＣＡ状態を、１９９９年８月１７日発行の米国特許第５，９３７，８６２号において開示される方法に従って、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって、本研究における患者のうち５２人において決定した。ｐＡＮＣＡの高レベルまたは低レベルのいずれかを有するとして患者を分類し、ここで、高ｐＡＮＣＡレベルは、１００単位／ｍｌ以上のレベルとみなす。５２人の患者のうち６人（１２％）は、結腸切除およびＩＰＡＡの前に、高レベルのｐＡＮＣＡを有した。これらのうち、５人の患者（８３％）は、慢性回腸嚢炎を発症した。
【００７６】
ｐＡＮＣＡレベルとＦＡ１ １７１対立遺伝子との間の関連性を、層別化分析によって試験した。この結果は、１７１対立遺伝子陽性患者における慢性回腸嚢炎の発生率が、ｐＡＮＣＡ状態と独立であることを示した（ｐＡＮＣＡ陽性患者についてｐ＝０．０１０、および高いｐＡＮＣＡレベルを有する患者についてｐ＝０．０１１、表１を参照のこと）。これらの結果は、慢性回腸嚢炎が、ｐＡＮＣＡ依存性経路およびｐＡＮＣＡ非依存性経路の両方によって発症し得ることを実証する。これらの結果は、ｐＡＮＣＡが、ＦＡ１ １７１対立遺伝子と組み合わされて、回腸嚢炎または慢性回腸嚢炎の発症を予測する、特に感受性の方法を生成し得ることをさらに示す。
【００７７】
上記に提供される全ての学術論文、参考文献、および特許の、括弧内または他の引用は、以前に述べられているか否かにかかわらず、本明細書中で参考として援用される。
【００７８】
本発明は、上記の実施例についての参照と共に記載されてきたが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、上記の特許請求の範囲のみによって限定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＩＤＤＫ助成金ＤＫ４６７６３の下、政府の支持によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、自己免疫および炎症性腸疾患の分野に関し、そしてより詳細には、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の発症に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景情報）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、以下の未知の病因の２つの胃腸障害を記載するために使用される、集合名である：クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）。ＩＢＤ（これは、世界中で生じ、そして２００万人もの多くの人々が罹患していると報告されている）の経過および予後は、広範に変動する。ＩＢＤの発症は、主に、幼児期にあり、下痢、腹痛および発熱という３つの最も共通の代表的症状を伴う。下痢は、穏やか〜重篤な範囲にわたり得、そして潰瘍性大腸炎において、しばしば、出血を伴う。貧血および体重の減少が、ＩＢＤのさらなる共通の症状である。ＩＢＤを有する患者の１０％〜１５％は、１０年の期間にわたって診療を必要とする。さらに、ＩＢＤを有する患者は、腸の癌の発症の危険性が増加する。心理学的問題（不安および抑うつを含む）の発症の増加の報告は、おそらく、驚くべき症状ではなく、これは、しばしば、壮年期の人々を襲う消耗性の疾患である。
【０００４】
ＩＢＤの診断、および多くの場合において、クローン病と潰瘍性大腸炎との識別において、進歩がなされてきた。しかし、クローン病および潰瘍性大腸炎の各々は、胃腸管を冒しそして類似の症状を生じる、異質の疾患の集合を表し得る。炎症性腸疾患に関連する異質性の１つの局面は、制御されない潰瘍性大腸炎の処置のための結腸切除後に見られる結果における、顕著な対照によって明らかにされる。好ましい手順は、回腸嚢肛門吻合術（ＩＰＡＡ）を用いる腹式結腸切除であり、これによって、回腸の貯蔵所すなわち「嚢」の形成を介して自制を維持しながら、疾患性の結腸粘膜が除去される。潰瘍性大腸炎患者の部分群は、手術後に好ましい結果を経験するが、手術後１０年で、ほぼ５０％が「回腸嚢炎」を発症する。これは、潰瘍性大腸炎の元々の症状を模倣し得る、嚢の炎症である。いくらかの患者において、この回腸嚢炎の再発性の症状は、手術前に存在する症状と同様に消耗性である。従って、再発性すなわち「慢性」回腸嚢炎に罹患する患者のために、潰瘍性大腸炎の外科処置は、治療的価値をほとんどまたは全く提供しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
回腸嚢炎または慢性回腸嚢炎の発症の危険性が増加した潰瘍性大腸炎患者の部分群を決定する遺伝学的方法は、手術後のこれらの患者の医療的管理において、および外科処置のための良好な候補の同定において有用である。不幸にも、回腸嚢炎または慢性回腸嚢炎の発症を予測するための遺伝学的方法は、現在、利用可能でない。従って、嚢手術後の回腸嚢炎または慢性回腸嚢炎の発症の危険性を決定する、簡便かつ非侵襲性の遺伝学的方法についての必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして同様に関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、潰瘍性大腸炎を有する患者において内部嚢を形成する外科手順後の回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供する。この方法は、患者においてインターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖する回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定することにより、実施される。ここで、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在は、回腸嚢炎の発症の危険性の増加を示す。回腸嚢炎関連対立遺伝子が連鎖するインターフェロンγレセプター遺伝子座は、例えば、インターフェロンγレセプター１遺伝子であり得る。本発明において有用な回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えば、インターフェロンγレセプター１遺伝子の６番目のイントロン内に位置する対立遺伝子（例えば、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子）である。１つの実施形態において、回腸嚢炎関連対立遺伝子は、少なくとも４のオッズ比かつ１より大きい下側の９５％信頼限界で、慢性回腸嚢炎に関連する。本発明の方法は、以下により詳細に記載するように、潰瘍性大腸炎の外科処置のための良好な候補の同定および手術後の高い危険性の患者の選択的な医療的管理において有用であり得る。
【０００７】
好ましい実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎を有する患者における、回腸嚢肛門吻合術後の慢性回腸嚢炎発症の危険性を決定する方法を提供する。この方法において、患者におけるインターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在または非存在を決定し、１７１対立遺伝子の存在は、慢性回腸嚢炎発症の危険性の増加を示す。
【０００８】
別の実施形態において、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の危険性を決定するための本発明の方法は、患者から、インターフェロンγレセプター1遺伝子のＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む核酸を含む材料を得る工程；およびこの核酸を酵素的に増幅して、ＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む増幅されたフラグメントを生成する工程によって行われ、ここで、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在は、回腸嚢炎発症の危険性の増加を示す。所望の場合、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子座が存在するかを決定するために、その増幅されたフラグメントを電気泳動する工程をさらに包含し得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 潰瘍性大腸炎を有する患者において、内部嚢が形成される外科的手順後に、回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法であって、当該方法は、インターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖する回腸嚢炎関連対立遺伝子の、当該患者における存在または非存在を決定する工程を包含し、
ここで、当該回腸嚢炎関連対立遺伝子の当該存在が、回腸嚢炎発症の増加した危険性を示す、方法。
・（項目２） 上記インターフェロンγレセプター遺伝子座が、インターフェロンγレセプター１遺伝子（ＩＦＮＧＲ１）である、項目１に記載の方法。
・（項目３） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、上記ＩＦＮＧＲ１内にある、項目２に記載の方法。
・（項目４） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、上記ＩＦＮＧＲ１の第６イントロン内に位置する、項目３に記載の方法。
・（項目５） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、ＩＦＮＧＲ１ ＦＡ１マイクロサテライトである、項目４に記載の方法。
・（項目６） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子である、項目５に記載の方法。
・（項目７） 上記外科的手順が、回腸嚢肛門吻合を含む、項目６に記載の方法。
・（項目８） 上記回腸嚢炎が慢性回腸嚢炎である、項目１に記載の方法。
・（項目９） 潰瘍性大腸炎を有する患者において、回腸嚢肛門吻合後に、慢性回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法であって、当該方法は、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の、当該患者における存在または非存在を決定する工程を包含し、
ここで、当該１７１対立遺伝子の存在が、慢性回腸嚢炎発症の増加した危険性を示す、方法。
・（項目１０） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定する工程が、上記患者由来の核酸の酵素的増幅を含む、項目１に記載の方法。
・（項目１１） 項目１に記載の方法であって、電気泳動分析、制限フラグメント長多型分析、配列決定分析、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される工程をさらに包含する、方法。
・（項目１２） 上記回腸嚢炎関連対立遺伝子が、少なくとも４のオッズ比および１より大きい下側の９５％信頼限界で慢性回腸嚢炎と関連する、項目１に記載の方法。
・（項目１３） 項目６に記載の方法であって、ここで、上記ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在または非存在が決定され、以下：
（ａ）インターフェロンγレセプター１遺伝子のＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む核酸を含む物質を、上記患者から得る工程；および
（ｂ）当該核酸を酵素的に増幅して、当該ＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む増幅されたフラグメントを生成する工程、
を包含し、ここで、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在が、回腸嚢炎発症の増加した危険性を示す、方法。
・（項目１４） 項目１３に記載の方法であって、以下：
（ｃ）上記増幅されたフラグメントを電気泳動し、これによってＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子が存在しているか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、インターフェロンγレセプター１遺伝子のマップ、および他のマーカーと相対的な第６染色体上のインターフェロンγレセプター１遺伝子の位置を示す。
【図２】図２は、隣接ヌクレオチドと共に、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライトのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ８４７２１；配列番号１）を示す。マイクロサテライトは、プライマーＡ（配列番号２）およびプライマーＢ（配列番号３）と共に印される。
【図３】図３は、プライマー配列番号２および配列番号３を使用して、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座で遺伝子型決定された個体についてのクロマトグラムを示す。上の２つのクロマトグラムは、１７１対立遺伝子についてヘテロ接合性の患者を示し；３番目のクロマトグラムは、１７１対立遺伝子についてホモ接合性の患者を示し；そして４番目のクロマトグラムは、ＣＥＰＨ参照個体１３４７−０２のヘテロ接合性の１８９／１９１対立遺伝子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
医療的管理をしない場合、潰瘍性大腸炎は、回腸切除によって治癒され得るが、これは、節制を維持するために新しく開発された手順さえも伴う、根治的処置である。好ましい外科手順は、結腸の一部または全体の除去および内部「嚢」の形成を含む。不幸にも、いくらかの術後の患者において、術前の潰瘍性大腸炎に類似する症状が、「回腸嚢炎」と呼ばれる状態において生じる。本発明の方法は、内部嚢を形成する手術後の潰瘍性大腸炎患者における回腸嚢炎発症の危険性を決定するための、簡便で非侵襲性の手段の発見に関する。
・本明細書中に開示されるように、外科手順（例えば、回腸嚢肛門吻合術）後の潰瘍性大腸炎患者における回腸嚢炎発症の増加した危険性に関連する遺伝マーカーが、同定された。特に、回腸嚢炎の発症の可能性と特定のマイクロサテライト対立遺伝子（ＦＡ１「１７１対立遺伝子」と呼ばれる）との間に、関連性が見出された。ＦＡ１マイクロサテライト（変動する数の「ＣＡ」ジヌクレオチドを含む、反復ＤＮＡ配列）は、インターフェロンγレセプター１遺伝子の６番目のイントロン中に位置する（Ａｌｔａｒｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．６２：７２３−７２６（１９９８）；図１および２もまた参照のこと）。
【００１１】
実施例Ｉに開示されるように、ＦＡ１マイクロサテライトは、嚢手術を受けている７２人の潰瘍性大腸炎患者において特徴付けられた。ＦＡ１マイクロサテライトを含むゲノムＤＮＡの小さいフラグメントを酵素的に増幅し、その後、電気泳動して、その増幅されたフラグメントのサイズを決定した。実施例Ｉに示されるように、慢性回腸嚢炎を発症した患者のうち、７３．３％の患者が１７１対立遺伝子について陽性であった；対照的に、慢性回腸嚢炎を発症しなかった患者の位置、３９．３％のみが、１７１対立遺伝子について陽性であった（表Ｉ）。統計学的分析は、１７１対立遺伝子について陽性である患者が、１７１対立遺伝子を欠失している患者と比較した場合に、術後に慢性回腸嚢炎を発症する有意により高い危険性を有することを確かめた（ｐ＝０．０２、オッズ比＝４．４）。従って、１７１対立遺伝子は、術後の慢性回腸嚢炎の発症に強く関連し、そして回腸嚢炎発症の危険性を決定するために使用され得る。
【００１２】
本発明の方法は、回腸嚢炎手術を受けた患者の術後の医療的管理において有用である。本発明の方法に従って回腸嚢炎発症の増加した危険性を有すると決定された患者は、多くの治療の任意の１つによって予防的に処置され得る。回腸嚢炎についての医療的処置としては、以下が挙げられる：抗生物質（例えば、メトロニダゾール、シプロフロキサシン、アモキシシリンまたはクラブラン酸、エリスロマイシンおよびテトラサイクリン）；抗炎症剤（例えば、メサラミン浣腸、スルファサラジンおよび経口メサラミン）；免疫抑制剤（例えば、ステロイド浣腸、経口ステロイド、アザチオプリンおよびシクロスポリン浣腸）；栄養剤（例えば、短鎖脂肪酸の浣腸または坐剤、およびグルタミン坐剤）；および酸素ラジカルのインヒビター（例えば、アロプリノール）（例えば、Ｓａｎｄｂｏｒｎ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０７：１８５６−１８６０（１９９４）；Ｈａｎａｕｅｒ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４（１３）：８４１−８４８（１９９６）を参照のこと）。
【００１３】
本発明の方法は、回腸嚢炎を発症する増加した危険性にある患者の選択的処置を可能にし、そして低い危険性の患者に不必要な治療の副作用を回避させるのを可能にするために特に有用である。例えば、抗生物質処置（回腸嚢炎のための治療の好ましい過程である）に関連する副作用は、低い危険性の患者にこれらの薬物を不必要に摂取することを望ましくないものにする。本発明の方法は、臨床的症状が検出可能となる前に、回腸嚢炎を発症する危険性が増加した患者の処置を可能にし、初期の介入を介して慢性形態の回腸嚢炎の発症を予防し得る。従って、回腸嚢炎の発症の危険性を決定するための本発明の方法は、嚢手術を受けた潰瘍性大腸炎患者のより早期かつより選択的な処置において有用であり得る。
【００１４】
従って、本発明は、外科手順後（これによって、内部嚢が、潰瘍性大腸炎を患う患者において形成される）、回腸嚢炎発症の危険性を決定する方法を提供する。この方法は、インターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖する回腸嚢炎関連対立遺伝子の患者における存在または非存在を決定することによって、実施され、ここで、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在は、回腸嚢炎発症の増大した危険性を示す。本発明の方法において、インターフェロンγレセプター遺伝子座は、例えば、インターフェロンγレセプター１遺伝子（ＩＦＮＧＲ１）であり得、そして回腸嚢炎関連対立遺伝子は、ＩＦＮＧＲ１内にあり得る（例えば、ＩＦＮＧＲ１の６番目のイントロン）。好ましい実施形態において、回腸嚢炎関連対立遺伝子は、ＩＦＮＧＲ１ ＦＡ１ マイクロサテライト対立遺伝子である（例えば、１７１対立遺伝子）。本発明の方法は、回腸嚢肛門吻合（ｉｌｅａｌ ｐｏｕｃｈ ａｎａｌ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ）後の慢性回腸嚢炎発症の危険性を決定するために特に有用であり得る。
【００１５】
潰瘍性大腸炎は、痙攣、腹痛、直腸の出血ならびに血液、膿および粘膜の弛緩性排泄を伴う慢性の下痢によって特徴付けられる大腸の疾患である。潰瘍性大腸炎の発現は、広く変化する。悪化および寛解のパターンは、多くの潰瘍性大腸炎患者（７０％）の臨床過程を分類するが、寛解がない連続した症状は、潰瘍性大腸炎を患う幾人かの患者に存在する。潰瘍性大腸炎の局所性合併症および全身性合併症としては、関節炎、眼の炎症（例えば、ブドウ膜炎）、皮膚潰瘍および肝臓疾患が挙げられる。さらに、潰瘍性大腸炎および特に、長期の広範な疾患は、結腸癌腫の増大した危険性に関連する。
【００１６】
幾つかの病理的特徴は、炎症性腸疾患と対照的に潰瘍性大腸炎を特徴付ける。潰瘍性大腸炎は、通常、直腸の最も遠位な部位から可変な距離を、近位に伸展する広汎性の疾患である。用語「左側（ｌｅｆｔ−ｓｉｄｅｄ）大腸炎」は、脾弯曲部程遠くに伸展する、結腸の遠位な部分を含む炎症を記載する。直腸の容赦（ｓｐａｒｉｎｇ）または結腸のみの右側（近位部分）の関与は、潰瘍性大腸炎において異常である。潰瘍性大腸炎の炎症プロセスは、結腸に限定され、そして例えば、小腸、胃または食道は含まない。さらに、潰瘍性大腸炎は、一般に、腸壁のより深い層に残る粘膜の表面的な炎症と区別される。陰窩膿瘍（退化した腸の陰窩は、好中球で満たされている）はまた、潰瘍性大腸炎の典型である（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（第２版）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９４））。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「潰瘍性大腸炎」は、「ＵＣ」と同義であり、そして潰瘍性大腸炎の特徴的な内視鏡的特徴または組織病理学的特徴を伴う左側結腸疾患の臨床的特徴を有する疾患を意味する。本明細書中で使用される場合、左側結腸疾患の臨床的特徴は、直腸の出血、尿意促迫およびしぶりである。直腸の出血は、粘膜の排泄を伴い得る。潰瘍性大腸炎の臨床的処置は、局所治療を用いた処置および推薦される全結腸切除もしくは全摘（ｎｅａｒ-ｔｏｔａｌ）結腸切除または実施される全結腸切除もしくは全摘結腸切除を用いた処置を含み得る。
【００１８】
潰瘍性大腸炎の特徴的な内視鏡的特徴（これは、左側結腸疾患の臨床的特徴を伴って存在する場合、潰瘍性大腸炎を示す）は、近位または持続性の炎症よりも、遠位のより重篤な炎症である。潰瘍性大腸炎において存在し得るさらなる典型的な内視鏡的特徴は、結腸からの近位に伸展する炎症または表在潰瘍形成の存在もしくは深部潰瘍形成の欠損を含む。
【００１９】
潰瘍性大腸炎の特徴的な組織病理学的特徴（これは、左側結腸疾患の臨床的特徴を伴って存在する場合、潰瘍性大腸炎を示す）は、同質の、持続性の、主に表在性の炎症であるか、または生検標本内の「病巣性（ｆｏｃａｌｉｔｙ）」の欠損である。潰瘍性大腸炎に存在し得るさらなる典型的な組織病理的特徴は、陰窩膿瘍の存在または肉芽腫の欠損を含む。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「潰瘍性大腸炎を患う患者」は、本明細書中で定義されるような潰瘍性大腸炎の特徴的な内視鏡的特徴または組織病理的特徴を伴う左側結腸癌疾患の臨床的特徴の存在によって定義されるように、潰瘍性大腸炎を有する患者を意味する。
【００２１】
潰瘍性大腸炎が、医療的治療に非応答性である場合、結腸の外科的除去および内部嚢の形成は、疾患の有痛性の症状を治療し得る選択肢である。嚢手術の不運な合併症は、回腸嚢炎の発症であり得る。回腸嚢炎は、しばしば、腹の痙攣、糞尿意促迫（ｆｅｃａｌ ｕｒｇｅｎｃｙ）および出血または発熱を含む、さらなる可変の症状を伴う下痢として現れ、そして術後の基準線より上の１日あたり少なくとも３回の便の増加によって臨床的に診断され得る（Ｓａｎｄｂｏｒｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９０：７４０−７４７（１９９５））。回腸嚢炎の特徴的な内視鏡的特徴は、粒度、可撓性または血管のパターンの消失、粘膜滲出または嚢の潰瘍化である。本明細書中で使用される場合、用語「回腸嚢炎」は、回腸嚢炎の１つ以上の特徴的な内視鏡的特徴と合わせた下痢によって臨床的に顕著である外科的に形成されたレザバーの非特異的な炎症を意味する。用語「回腸嚢炎」は、早期発症型回腸嚢炎、急性回腸嚢炎および慢性回腸嚢炎を含み、そして以下に議論される、慢性回腸嚢炎の処置応答性形態および処置耐性形態を含む。
【００２２】
回腸嚢炎は、嚢の手術後、数ヶ月または数年で発症し得る。回腸嚢炎の累積非頻度は、嚢の手術後、１５％、３６％または４６％の患者が、それぞれ、１年、５年、または１０年で回腸嚢炎を発症するように、時間と共に増大する（Ｐｅｎｎａら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０６：Ａ７５１（１９９４））。早期発症型回腸嚢炎は、外科手順後（それによって、結腸は、除去され、そして内部嚢が、形成される）の１２ヶ月内に発症する回腸嚢炎の形態をいう。
【００２３】
回腸嚢炎は、急に起こり得るか、または慢性状態として起こり得る。急性回腸嚢炎は、単一の現象として起こり得るか、または抑制的な治療が、必要とされない回腸嚢炎がない間隔の間に断続性の再発として起こり得る。対照的に、ＩＰＡＡ後の約５パーセントの原因である、慢性回腸嚢炎は、適切な医学的治療にもかかわらない回腸嚢炎の持続する症状によってか、または、医学的治療が、中断される場合、症状の急速な再発を伴う持続性の医学的に抑制的な治療の必要性によって特徴付けられる。慢性回腸嚢炎は、進行中の抑制的な治療を必要とする、処置応答性であり得るか、または処置耐性であり得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「慢性回腸嚢炎」は、持続性の医学的に抑制的な治療を必要とする持続性（ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ）再発性回腸嚢炎もしくは持続性（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）再発性回腸嚢炎または医学的処置にもかかわらず、持続性の症状によって特徴付けられる回腸嚢炎を意味する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「患者」は、回腸嚢炎を発症し得る、動物（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）を意味する。
【００２６】
本明細書中に記載される場合、用語「外科手術（それによって内部嚢が形成される）」は、「嚢手術」と同義であり、そしてしばしば、全結腸切除もしくは全摘結腸切除を含む、自制の維持のための内部レザバーの生成を生じる外科手順を意味する。形成された内部レザバーは、例えば、回腸のレザバーまたは回盲のレザバーであり得る。通常の外科手順（それによって、内部嚢は形成される）は、回腸嚢肛門吻合である。
【００２７】
本発明の方法は、回腸嚢肛門吻合のような手術を受けた潰瘍性大腸炎患者における回腸嚢炎発症の危険性を決定するために有用である。回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在によって示される回腸嚢炎発症に関して本明細書中で使用される場合、用語「増大した危険性」は、回腸嚢炎関連対立遺伝子を欠損した患者に対する回腸嚢炎発症の可能性よりも有意に高い回腸嚢炎の発症の可能性を意味する。
【００２８】
本発明の方法は、インターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖する回腸嚢炎関連対立遺伝子に依存する。本明細書中で使用される場合、用語「連鎖する（連鎖される）」は、２つの遺伝子の遺伝子座が、近接の結果として共に遺伝される傾向を有することを意味する。２つの遺伝子の遺伝子座が、連鎖され、そして多型性である場合、１つの遺伝子座における特定の対立遺伝子は、第２の遺伝子座における特定の対立遺伝子の遺伝のためのマーカーとして役立ち得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「インターフェロンγレセプター遺伝子座」は、インターフェロンγレセプターのサブユニットをコードする遺伝子座を意味する。インターフェロンγレセプター遺伝子座は、例えば、ヒトインターフェロンγレセプター１遺伝子座（ＩＦＮＧＲ１）またはインターフェロンγレセプター２遺伝子座（ＩＦＮＧＲ２）であり得る。ヒトＩＦＮＧＲ１についての配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７として入手可能であり、
インターフェロンγレセプター１の対応する転写されたｍＲＮＡについての配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０３１４３として見出され得る。ヒトインターフェロンγレセプター２の転写されたｍＲＮＡについての配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５５３４として入手可能である。
【００３０】
本発明の方法は、回腸嚢炎関連対立遺伝子に依存する。本明細書中で使用される場合、用語「回腸嚢炎関連対立遺伝子」は、安定に遺伝可能な分子バリエーションを意味し、このバリエーションは、伝統的なメンデルの遺伝学に従って予想される危険性よりも頻度が高く回腸嚢炎発症の増大した危険性と一緒に遺伝される傾向にある。回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えば、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子に連鎖する対立遺伝子であり得るか、またはＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子それ自体であり得る（実施例Ｉを参照のこと）。
【００３１】
本発明の方法において有用な回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えば、回腸嚢炎発症の増大した危険性と共に遺伝される傾向にあるマイクロサテライト（ｍｓ）、単一ヌクレオチド多型（ｓｎｐ）または、可変数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）多型であり得る。マイクロサテライトは、２つのヌクレオチド、３つのヌクレオチド、４つのヌクレオチドまたは５つのヌクレオチドの２つ以上の反復であり得；マイクロサテライトにしばしば見られるジヌクレオチド反復は、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＡＣ、ＡＧもしくはＧＣ反復またはそれらの相補鎖を含む。マイクロサテライトは、例えば、６以上のヌクレオチド反復、８以上のヌクレオチド反復、１０以上のヌクレオチド反復、１２以上のヌクレオチド反復、１４以上のヌクレオチド反復、１６以上のヌクレオチド反復、２０以上のヌクレオチド反復、２２以上のヌクレオチド反復または２４以上のヌクレオチド反復を含み得る。１つ以上のヌクレオチドのバリエーション（例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失）に加えて、当業者は、回腸嚢炎関連対立遺伝子はまた、初期ヌクレオチド配列における差異を生成しない異常なメチル化または他の改変のような分子バリエーションであり得ることを理解する。
【００３２】
回腸嚢炎関連の対立遺伝子は、イントロンもしくはエキソンまたはコード配列に対する配列５’もしくは３’に生じ得、そして遺伝子産物の発現または活性に影響し得るかあるいは影響しないかもしれない。インターフェロンγレセプター遺伝子内の回腸嚢炎関連の対立遺伝子は、例えば、活性が低いかまたは不活性なインターフェロンγレセプター遺伝子産物の生成を生じ得るか、あるいは量の減少したインターフェロンγレセプター遺伝子産物を生じ得る。インターフェロンγレセプタ遺伝子内の回腸嚢炎関連の対立遺伝子はまた、イントロン内または５’もしくは３’調節配列内に位置し得、そしてインターフェロンγレセプターコードｍＲＮＡの転写もしくは翻訳またはスプライシングの調節に影響し得る。従って、このような対立遺伝子は、インターフェロンγレセプター遺伝子発現レベルの変化またはインターフェロンγレセプター遺伝子産物改変体の発現を生じ得る。回腸嚢炎関連の対立遺伝子が、インターフェロンγレセプターコード配列内の１以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を生じるヌクレオチド改変であってインターフェロンγレセプター遺伝子産物改変体を生成する場合、この改変体は、インターフェロンγの結合後のシグナル伝達の能力を欠くポリペプチドであり得るか、またはドミナントネガティブな分子として機能する可溶性インターフェロンγレセプターポリペプチドであり得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、回腸嚢炎の発症の危険性は、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子を使用して決定される。回腸嚢炎関連の対立遺伝子（例えば、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子）は、市販の参照ＤＮＡ（例えば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から得られる）を使用して、Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）参照個体（例えば、１３４７−０２と名付けられた個体（Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：１５２−１５４（１９９６））と比較して定義される。本明細書中で使用する場合、用語「ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子」は、「１７１対立遺伝子」と同義であり、そしてインターフェロンγ ＦＡ１マイクロサテライトの対立遺伝子を意味し、これは、アッセイにおいてプライマー（配列番号２および３）で増幅された場合に１７１塩基対（ｂｐ）の大きさを有し、ここで、ＣＥＰＨ参照個体１３４７−０２のヘテロ接合性のＦＡ１対立遺伝子は、１８９塩基対および１９１塩基対の大きさを有する。このＦＡ１マイクロサテライトは、多型であり、そして異なる個体中で、異なる数の反復を有する。例えば、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライトは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７の残基６４２１３〜６４２５４で、２１個の「ＣＡ」反復を有する。ＦＡ１マイクロサテライトの別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８４７２１として利用可能であり、これは、Ｕ８４７２１の残基８９〜１３２で、２２個の「ＧＴ」反復（ＣＡ反復の相補体）を含む。
【００３４】
本明細書の実施例１で開示されるように、１７１対立遺伝子の存在は、例えば、プライマー５’−ＴＥＴ−ＴＧＡ ＡＴＴ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＣＴ−３’（配列番号２）および５’−ＣＡＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＴＧ−３’（配列番号３）での増幅によって生成される１７１塩基対のフラグメントのゲル電気泳動によって、簡便に検出され得る。当業者は、１７１対立遺伝子の単一のコピーが回腸嚢炎の発症の高い危険性を示すのに十分であること；従って、１７１対立遺伝子についてヘテロ接合体の潰瘍性大腸炎の患者が、１７１対立遺伝子のいずれのコピーも有さない潰瘍性大腸炎の患者の確率よりも有意に高い回腸嚢炎発症の確率を有することを理解する。
【００３５】
命名「１７１」が、特定のプライマー対（配列番号２および３）でのＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座の増幅によって得られるフラグメントの大きさを反映していることが理解される。ＣＥＰＨ参照個体１３４７−０２の１８９対立遺伝子および１９１対立遺伝子、ならびにＦＡ１マイクロサテライト領域内の遺伝子配列と比較した１７１対立遺伝子の大きさの観点から、当業者は、本発明の方法において有用であり得る種々の代替のプライマー対を容易に設計し得る。代替のプライマー対によって、１７１対立遺伝子は、異なる特徴的な大きさを有し、これは、同じ代替のプライマー対で増幅した場合に、ＣＥＰＨ参照個体１３４７−０２のヘテロ接合体対立遺伝子の大きさよりも１８塩基対および２０塩基対小さい。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供し、これは、患者由来の核酸の酵素的増幅を使用してインターフェロンγ遺伝子座に対する回腸嚢炎関連の対立遺伝子の連鎖の存在または非存在を決定することによる。他の実施形態において、回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在は、電気泳動分析、制限フラグメント長多型分析、配列決定分析、またはこれらの技術の組み合わせによって決定される。
【００３７】
本発明はまた、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供し、これは、患者からＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む核酸を含む材料を得、そしてこの核酸を酵素的に増幅してＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座またはその一部を含む増幅フラグメントを生成することによる。当業者は、増幅フラグメントが、列挙した遺伝子座の部分を含むことのみを必要とすることを理解する。従って、例えば、増幅フラグメントは、種々の長さのＣＡ反復を含むＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座の部分を含むことのみを必要とし、そして例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８４７２１の全体の配列を含む必要はない。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎の発症の危険性を決定する方法を提供し、これは、患者からＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む核酸を含む材料を得、この核酸を酵素的に増幅してＦＡ１マイクロサテライト遺伝子座を含む増幅フラグメントを生成し、そしてこの増幅フラグメントを電気泳動し、それによってＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子が存在するか否かを決定することによる。１７１対立遺伝子の存在は、回腸嚢炎の発症の危険性の増大を示す。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、用語「材料」は、核酸が調製され得る生物学的な任意の事物を意味する。この用語、材料は、全血、血漿、リンパ、尿、乳汁、唾液、皮膚、毛包、頸部、頬、または核酸を含む他の体液もしくは組織を含む。好ましい材料は、頬または全血であり、これらは、非侵入性の手段によって容易に得ることができ、そして酵素的増幅のためのゲノムＤＮＡの調製に使用され得る。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味し、そして一本鎖の核酸および二本鎖の核酸の両方を含む。総ゲノムＤＮＡは、本発明の方法を実行するための特に有用な核酸である。
【００４１】
回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在は、当該分野で周知の種々の分子遺伝型決定方法を使用して決定され得る。このような遺伝型決定方法としては、例えば、電気泳動ベースの方法、配列決定分析、制限フラグメント長多型分析、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ヘテロ二重鎖移動度アッセイ、一本鎖コンフォメーション多型分析、変性勾配ゲル電気泳動、切断フラグメント長多型分析およびローリングサークル増幅が挙げられる。当業者は、変性勾配ゲル電気泳動およびヘテロ二重鎖移動度アッセイを含む電気泳動ベースの方法が、マイクロサテライト対立遺伝子であるところの回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在の決定のために特に有用であることを理解する。一般には、Ｂｉｒｒｅｎら（編）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第１巻（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２章（補遺４９）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと。
【００４２】
１つの実施形態において、回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在は、電気泳動分析を使用して決定される。電気泳動（ゲルまたはキャピラリー電気泳動を含む）は、大きさの異なる対立遺伝子を含む増幅フラグメントの分離において有用であり得る。用語「電気泳動分析」または「電気泳動」は、増幅フラグメントのような１以上の核酸に関して本明細書中で使用される場合、電場の影響下で、荷電した分子を定常溶媒を通じて移動させるプロセスを意味する。電気泳動の移動度は、核酸の電荷（核酸の大きさに比例する）に基づいて主に分離し、より小さい核酸は、より迅速に移動する。用語、電気泳動分析または電気泳動は、スラブ（ｓｌａｂ）ゲル電気泳動（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動）およびキャピラリー電気泳動の両方を使用する分析を含む。数分の分離時間で高い（キロボルトレベル）分離電圧の存在下で、小直径の（５０〜１００μｍ）の石英キャピラリー内で一般に生じるキャピラリー電気泳動分析は、本発明の方法において特に有用であり得る。キャピラリー電気泳動分析を使用して、増幅フラグメントのような核酸は、ＵＶ吸収または蛍光標識によって簡便に検出され、そして一塩基の解像度が、数百塩基対までのフラグメント上で得られ得る。このような電気泳動分析の方法およびその改変は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、２０００に記載のように、当該分野で周知である。
【００４３】
制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析はまた、本発明の方法において回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在を決定するために有用であり得る（Ｊａｒｃｈｏら、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２．７．１〜２．７．５頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０））。本明細書中で使用する場合、用語「制限フラグメント長多型分析」は、「ＲＦＬＰ分析」と同義であり、そして制限酵素を使用して遺伝子多型を区別するための任意の方法を意味する。この制限酵素は、核酸の分解を触媒し、そして特定の塩基配列（一般には、パリンドロームまたは逆反復）を認識するエンドヌクレアーゼである。当業者は、ＲＦＬＰ分析の使用が、多型の部位で２つの対立遺伝子を区別し得る酵素に依存し得るか、あるいは、ＲＦＬＰ分析が、同じ部位で切断される場合のフラグメントの大きさに依存し得ることを理解する。
【００４４】
配列決定分析はまた、本発明の方法において回腸嚢炎関連の対立遺伝子の存在または非存在を決定するために使用され得る。用語「配列決定分析（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」は、増幅フラグメントのような１以上の核酸に関して本明細書中で使用する場合、手動または自動の任意のプロセスをいい、これによって、核酸中のヌクレオチドの順番を決定する。用語、配列決定分析は、化学的配列決定（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）およびジデオキシ酵素的配列決定（Ｓａｎｇｅｒ）ならびにこれらの改変を含むことが理解される。従って、用語、配列決定分析は、キャプラリー電気泳動およびレーザー誘導蛍光検出に依存するキャピラリーアレイＤＮＡ配列決定を含み、そして例えば、ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００またはＡＢＩ ３７００を使用して実行され得る。配列決定分析はまた、ゲル電気泳動および蛍光検出、放射性核種検出などのような検出方法を使用して実行され得る。ゲル電気泳動は、例えば、ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシーケンサーを使用して実行され得る。用語、配列決定分析によってまた含まれるものは、熱サイクル配列決定（Ｓｅａｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：６２６−６３３（１９９２））；固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：３９−４２（１９９２））およびマトリックス補助レーザー離脱／イオン化飛行時間質量分析法であるところのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：３８１−３８４（１９９８））のような質量分析法による配列決定である。用語、配列決定分析はまた、例えば、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）（これは、未知のＤＮＡに存在する配列の断片を同定するための全ての可能性のある短いオリゴヌクレオチドのアレイに依存する）を含む（Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１−６１４（１９９６）；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１６４９−１６５２（１９９３）；およびＤｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５４−５８（１９９８））。当業者は、これらのバリエーションまたはさらなるバリエーションが、本明細書中に定義される用語、配列決定分析に含まれることを理解する。一般には、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、２０００；第７章を参照のこと。
【００４５】
クレアバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）フラグメント長の多形性分析はまた、本発明の方法において有用であり得る。クレアバーゼは、ＤＮＡの一本鎖領域と二本鎖領域の間の接合部を切断する酵素である。クレアバーゼ消化後のＤＮＡサンプルのゲル濾過移動パターンは、一本鎖および二本鎖領域の数、ＤＮＡの一本鎖領域と二本鎖領域との間の平衡、および各切断フラグメントにおけるヌクレオチドの数によって、ＤＮＡサンプルの各改変体について特有であり得る。この特有のパターン、すなわち「バーコード」は、その移動パターンによって核酸サンプルサンプルを迅速に遺伝子型決定するのに用いられ得る（例えば、Ｔｏｎｄｅｌｌａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：２４０２〜２４０７（１９９９）；および米国特許第５，７１９，０２８号および同５，８４６，７１７第を参照のこと）。
【００４６】
変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）がまた、本発明の方法において、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る。ＤＧＧＥにおいて、二本鎖ＤＮＡは、漸増する濃度の変性剤を含有するゲル中で電気泳動され；ミスマッチの対立遺伝子からなる二本鎖フラグメントは、さらに迅速に融解するセグメントを有し、このようなフラグメントを、完全に相補的な配列に比較した場合、示差的に遊走させる（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｙ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ｉｎｎｉｓら．，前出、１９９０）。
【００４７】
ヘテロ二重鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）は、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る、別の周知のアッセイである。ＨＭＡは、多形性配列の存在を検出するために有用である。なぜなら、ミスマッチ（不適合）を保有するＤＮＡ二本鎖は、完全に塩基対合した二本鎖の移動度に比べてポリアクリルアミドゲルにおける移動度が減少しているからである（Ｄｅｌｗａｒｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１２５７〜１２６１（１９９３）；Ｗｈｉｔｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２：３０１〜３０６（１９９２））。
【００４８】
一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）の技術がまた、本発明の方法において、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る（Ｈａｙａｓｈｉ、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：３４〜３８（１９９１）を参照のこと）。この技術は、非変性ゲル電気泳動の際、変化した電気泳動の移動度を生じる、一本鎖ＤＮＡの二次構造における差異に基づく変異を検出するために用いられ得る。多型フラグメントは、既知の対立遺伝子を含有する、対応する標準的フラグメントに対する、試験フラグメントの電気泳動パターンの比較によって検出される。
【００４９】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションがまた、本発明の方法において、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、例えば、回腸嚢炎関連対立遺伝子のヌクレオチドに対して、完全に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく。適切な条件下で、この対立遺伝子特異的プローブは、回腸関連対立遺伝子を含む核酸にハイブリダイズするが、このプローブに比較して１つ以上のヌクレオチドミスマッチ（不適合）を有する、１つ以上の他の対立遺伝子にはハイブリダイズしない。所望の場合、別の対立遺伝子に適合する第二の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドがまた用いられ得る。同様に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド増幅の技術を用いて、例えば、回腸嚢炎関連対立遺伝子のヌクレオチド配列に完全に相補的であるが他の対立遺伝子に比較して１つ以上のミスマッチを有する、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、回腸嚢炎関連対立遺伝子を選択的に増幅し得る（Ｍｕｌｌｉｓら（編）、Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、（１９９４））。当業者は、回腸嚢炎関連対立遺伝子と１つ以上の他の対立遺伝子との間を識別する１つ以上のヌクレオチドミスマッチが、好ましくは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにおいて用いられるべき対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの中心に配置されることを理解する。対照的に、ＰＣＲ増幅において用いられるべき対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、回腸嚢炎関連対立遺伝子と他の対立遺伝子を、このプライマーの３’末端で識別する１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む。
【００５０】
ローリングサークル増幅がまた、本発明の方法において、回腸関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するために用いられ得る（Ｂａｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：５０７３〜５０７８（１９９８）、およびＬｉｚａｒｄｉら．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５〜２３２（１９９８））。ローリングサークル増幅において、直線プローブは、プローブの５’末端および３’末端が特定のヌクレオチド配列において直ちに隣接するヌクレオチドにハイブリダイズするように、設計される。サンプルＤＮＡが、特定の配列を有する場合、５’末端および３’末端は、隣接し、そしてこのプローブは、リガーゼを用いて環状にされ得る。特定の配列のないサンプルＤＮＡは、お互いに直ちに隣接する５’末端および３’末端ハイブリダイズを生じず、従って環状化のための首尾よいテンプレートとしては作用しない。次いで、環状化されたプローブを、ローリングサークル複製において用いて、検出の前に配列を増幅し得る。
【００５１】
回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定するための他の周知のアプローチとしては、自動化配列決定およびＲＮＡａｓｅミスマッチ技術が挙げられる（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７５７５〜７５７９（１９８５））。さらに、当業者は、上記の増幅方法または切断方法がまた、酵素反応の検出のためまたはテンプレートとしてＤＮＡマイクロアレイを用いて、固体状態の方法において用いられ得ることを理解する（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、２０００）。同様に、質量分析を、例えば、米国特許第６，０４３，０３１号、同第５，６０５，７９８号、および同第５，５４７，８３５号に記載のように、切断産物または増幅産物の検出のために用い得る。本発明の方法は、多型対立遺伝子を検出するためのこれらのまたは他の当該分野で認識されたアッセイを用いて実施され得る。
【００５２】
１つの実施形態において、回腸嚢炎関連対立遺伝子と回腸嚢炎発生のリスクの上昇との間の関連の強度は、少なくとも１の９５％以下の信頼区間限界で、少なくとも４のオッズ比で、特徴付けられる。オッズ比は、少なくとも１の９５％以下信頼区間限界では、例えば、少なくとも３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、または６．０であり得、例えば、オッズ比は、９５％信頼区間は１．２〜１５．４で、少なくとも４である（表１を参照のこと）。本明細書において開示されるように、１７１の対立遺伝子について陽性な潰瘍性大腸炎患者のうち３５％が、ＩＰＡＡ後に慢性回腸嚢炎を発症したが、一方、１７１の対立遺伝子について陰性の患者のうち１１％しか慢性回腸嚢炎は発症しなかった。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析は、７２例の試験した患者の群における、１７１の対立遺伝子が、１７１の対立遺伝子を欠く患者に比較して、慢性回腸嚢炎のリスクのさらに高いリスクと有意に関連していたことを示した。オッズ比は、９５％信頼区間限界が少なくとも１．２で４．４であった。オッズ比を決定する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓｃｈｌｅｓｓｅｌｍａｎら．，Ｃａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃｏｎｄｕｃｔ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと）。
【００５３】
本明細書の実施例Ｉにおいて開示されたように、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子は、０．０２のｐ値で慢性回腸嚢炎の上昇したリスクと関連していた。「ｐ値」または「確率値」は、当該分野で公知の用語である。対立遺伝子と回腸嚢炎のような状態との間の関連についての試験において、ｐ値は、この対立遺伝子および条件が、無作為な因子または偶発的因子と関連する確率を測定する。１．００のｐ値は、この確率が高いか確実であること、この対立遺伝子および条件の関連が、無作為な因子または偶発的因子に起因することを示す。このことは、この対立遺伝子が、この条件に影響しないことを示す。０．０５のｐ値は、対立遺伝子と条件との間の関連の統計学的試験における代表的閾値である。０．０５のｐ値は、「偽陽性率」、すなわち、この試験が、対立遺伝子とこの条件との間の関連が存在することを誤って示す率が、２０の試験のうち１回であることを示す。回腸嚢炎関連対立遺伝子は、例えば、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、もしくは０．００１以下のｐ値で、または０．０００９５、０．０００９、０．０００８５、もしくは０．０００８未満のｐ値で、回腸嚢炎発症の高いリスクと関連し得る。ある場合には、ｐ値は、例えば、サンプルサイズ（ファミリーの数）、遺伝子の異質性（結合型および非結合型）、臨床的異質性、または分析的アプローチ（パラメトリック法またはノンパラメトリック法）のような因子を考慮するために補正されることが必要かもしれない。
【００５４】
別の実施形態において、本発明は、手術手順（これによって内部パウチ（ポーチ）が作製される）後、潰瘍性大腸炎を有する患者における回腸嚢炎発生のリスクの低下を決定する方法を提供する。この方法は、この患者における、インターフェロンγレセプター遺伝子座に結合した回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または非存在を決定する方法からなる。ここでこの回腸嚢炎関連対立遺伝子の非存在は、回腸嚢炎発生のリスクの低下を示す。
【００５５】
用語、リスクの低下とは、本明細書において用いる場合、回腸嚢炎関連遺伝子の非存在によって示された回腸嚢炎発生に関して言及する場合、回腸嚢炎関連対立遺伝子を有する患者についての回腸嚢炎発生の確率よりも有意に低い回腸嚢炎発症の確率をいう。
【００５６】
前の研究は、高いｐＡＮＣＡ力価（１００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌより大きい）の存在が、回腸嚢炎発生のリスクの指標として用いられ得ること、およびこのような方法が、本明細書において参考として援用されている米国特許第５，９３７，８６２号において例示されていることを実証している。さらに、本明細書において開示したように、回腸嚢炎関連の１７１の対立遺伝子の存在が、回腸嚢炎発生のリスクの上昇と関連するが、高いｐＮＡＣＡ力価の存在とは関連しないことが見出された（実施例ＩＢを参照のこと）。従って、回腸嚢炎関連対立遺伝子（例えば、ＦＡ１ミクロサテライト１７１対立遺伝子）、および高いｐＡＮＣＡ力価の存在は、回腸嚢炎発生の高いリスクの独立した指標である。これらの結果は、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子についての遺伝子試験が、高いｐＡＮＣＡ力価についての血清学的試験と組合されて、回腸嚢炎発生のリスクを決定する非常に鋭敏な方法をもたらし得ることを示す。
【００５７】
従って、本発明はまた、外科的手順後の回腸嚢炎発病の危険性を決定するための遺伝学的試験および血清学的試験をあわせる方法を提供し、それによって、内部嚢が、潰瘍性大腸炎を有する患者中に作製される。この方法は、インターフェロンγレセプター遺伝子座に連鎖された回腸嚢炎関連対立遺伝子の患者における存在または非存在を決定すること；および患者における高いｐＡＮＣＡ力価の存在または非存在を決定することによって実行され、ここで、回腸嚢炎関連対立遺伝子の存在または高いｐＡＮＣＡ力価の存在のいずれかは、回腸嚢炎発病の増加した危険性を示す。
【００５８】
本明細書中に開示される結果はまた、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）（肝臓内管の関与を伴なうかまたは伴なわない肝臓外胆管の閉塞性炎症性線維症によって特徴付けられる疾患）に関する。この疾患は、一般的に、たゆまぬ様式で（予測不可能にもかかわらず）肝硬変、門脈圧亢進症、および肝不全からの死に進行する。原発性硬化性胆管炎は、単独で生じ得るか、または潰瘍性大腸炎と関連して生じ得、そしてあまり一般的ではないが、種々の他の疾患と関連して生じる。症状は、一般的に、黄疸、純正（ｐｕｒｉｔｉｓ）かつ非特異的な上腹部疼痛が挙げられる。原発性硬化性胆管炎の医学的処置は、単独または併用した、コルチコステロイド、抗体、免疫抑制剤、および胆嚢刺激物質（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｇｕｅｓ）が挙げられ得る。
【００５９】
実施例Ｉに開示されるように、１７１対立遺伝子について陽性であった原発性硬化性胆管炎を有さない患者（３７．５％；ｐ＝０．０１９）と比較して、原発性硬化性胆管炎を発病した患者の優位に高いパーセンテージが、１７１対立遺伝子について陽性であった（６９．２％）。これらの結果は、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子が、原発性硬化性胆管炎の診断指標として使用され得ることを示す。
【００６０】
従って、本発明はまた、個体におけるインターフェロンγレセプター１ ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在または非存在を決定することによって、原発性硬化性胆管炎を診断する方法を提供し、ここで、この１７１対立遺伝子の存在は、原発性硬化性胆管炎の診断である。この遺伝学的方法は、多型対立遺伝子の存在または非存在を決定するための種々の分子技術のうちのいずれかを使用して実行され得る（上記を参照のこと）。
【００６１】
潰瘍性大腸炎は、胃腸管に影響を与えそして類似の徴候を生成する多数の別個の疾患サブタイプを示す異質性の障害であると認識される。異質性の潜在する潰瘍性大腸炎は、例えば、特定の処置戦術に対する種々の応答に影響され得る。疾患サブタイプの例は、医学的に耐性の潰瘍性大腸炎を有する潰瘍性大腸炎患者のサブグループである（米国特許第５，９６８，７４１号（１９９９年１０月１９日発行）を参照のこと）。これらの患者は、ステロイド、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シクロスポリンＡなどに非応答性である。標準的な処置に対するこれらの耐性の結果として、潰瘍性大腸炎患者のサブグループは、代表的に、医療処置または結腸切除のより攻撃的な形態を必要とする。
【００６２】
臨床的なサブタイプの他の例としては、クローン病のｐＡＮＣＡ陽性臨床サブタイプ（これは、クローン病の代表的である特徴に加えた潰瘍性大腸炎の特徴によって特徴付けられる）が挙げられる。これらのｐＡＮＣＡ陽性クローン病患者は、粘膜炎症の類似した型に罹患し、そして特定の治療経過と同様に応答し、そしてさらに、潰瘍性大腸炎の医学的治療技術において効果的である治療ストラテジーと同じ治療ストラテジーのうちのいくつかから利益を受け得るが、他のクローン病患者は、非応答性である（米国特許第５，９１６，７４８号（１９９９年６月２９日発行）、および米国特許第５，８７４，２３３号（１９９９年２月２３日発行）を参照のこと）。
【００６３】
上記に鑑みて、当業者は、ＦＡ１マイクロサテライト対立遺伝子がまた、潰瘍性大腸炎またはクローン病の特定のサブタイプと関連し得ることを理解する。臨床的なサブタイプは、その疾患の特徴が同じ疾患を有する他の患者よりも互いにより類似する、特定の疾患（例えば、潰瘍性大腸炎）を有する患者のサブグループである。
【００６４】
潰瘍性大腸炎の例示的なサブタイプは、嚢手術を受け、そして引続いて腸管外合併症（例えば、クローン病において見出される炎症に類似した炎症）が続く慢性回腸嚢炎を発病する潰瘍性大腸炎を有するとして診断された患者のサブグループである。このような集団は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２１：１３４３−１３５３（１９９７）に記載される。本発明に従って、回腸嚢炎関連対立遺伝子（例えば、ＦＡ１ マイクロサテライト １７１対立遺伝子）の存在は、嚢手術後に発病するクローン病様合併症の患者のこのサブタイプを同定するために、使用され得る。
【００６５】
本発明はまた、少なくとも１５ヌクレオチドを含み、かつ、温和にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７のヌクレオチド６３２１４〜６４２１３を有する核酸分子またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７のヌクレオチド６４２５５−６５２５４を有する核酸分子と選択的にハイブリダイズする、単離されたヌクレオチドプローブを提供する（ただし、このヌクレオチドプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７でもＵ８４７２１でもない）。本発明はまた、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７のヌクレオチド６３２１４〜６４２１３を有する核酸分子またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７のヌクレオチド６４２５５〜６５２５４を有する核酸分子の、少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、単離されたヌクレオチドプローブを提供する（ただし、このヌクレオチドプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７でもＵ８４７２１でもない）。本発明の単離されたヌクレオチドプローブは、例えば、少なくとも１２、１５、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さを有し得る。本発明の単離されたヌクレオチドプローブは、例えば、最大２０、２５、３０、３５、４０、６０、８０、１００、１５０または２００ヌクレオチドの最大長を有し得る。
【００６６】
潰瘍性大腸炎を処理するための外科的手順後の回腸嚢炎発病に対する、患者の罹病性を示すためのキットがさらに、本発明によってさらに提供される。本発明のキットは、インターフェロンγレセプター１遺伝子のＦＡ１ マイクロサテライト遺伝子座を含む増幅フラグメントを形成するための増幅反応において一緒に使用され得る、２つのヌクレオチドプローブを含む（ただし、これらの２つのヌクレオチドプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５０３３７でもＵ８４７２１でもない）。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。
【００６８】
（実施例Ｉ）
本実施例は、インターフェロンγレセプター１ ＦＡ１ マイクロサテライト １７１対立遺伝子が、回腸嚢肛門吻合術後の慢性回腸嚢炎の発病と関連するこ
とを、実証する。
【００６９】
（Ａ．ＦＡ１ マイクロサテライト １７１対立遺伝子と、慢性回腸嚢炎の増加した危険性との関連）
血液サンプルを、回腸嚢炎を有する７２人の白色人患者から、回腸嚢肛門吻合術を施したときに収集した。回腸嚢炎発病に関する各患者の状態を、手術後の１ヶ月と８１ヶ月との間に少なくとも１回追跡調査した（中心の追跡調査：手術の２７ヶ月後）。追跡調査は、患者の遺伝子型およびｐＡＮＣＡ状態に対して目隠しされた研究者による、臨床的および内視鏡的な試験された回腸嚢炎の評価を含んだ。評価した７２人の患者のうち、３６％（ｎ＝２６）が、回腸嚢炎を発病し、そして２２％（ｎ＝１６）が、回腸嚢炎の症状再発したという基準に基づいて、慢性回腸嚢炎を発病しているとして分類した。
【００７０】
患者を、インターフェロンγレセプター１遺伝子の第６イントロン中に位置するＦＡ１マイクロサテライトマーカーについて遺伝子型決定し、そしてＦＡ１対立遺伝子と慢性回腸嚢炎との間の関係について分析した。特異的ＦＡ１対立遺伝子（１７１対立遺伝子と命名される）が、試験した７２人の患者のうちの３４人に存在した（４７％）。この１７１対立遺伝子について陽性であった患者のうち、３５％は、慢性回腸嚢炎を発病した。対照的に、この１７１対立遺伝子について陰性であった患者の内の１１％のみが、慢性回腸嚢炎を発病した。さらに、慢性回腸嚢炎を発病した患者のうち、７３．３％が、１７１対立遺伝子について陽性であり；対照的に、慢性回腸嚢炎を発病しなかった患者のうち、３９．３％のみが、この１７１対立遺伝子について陽性であった（表Ｉ）。
【００７１】
Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存分析によって、１７１対立遺伝子陽性患者が、１７１対立遺伝子陰性患者よりも、慢性回腸嚢炎を発病する有意に高い危険性を有したことが、確認された（ｐ＝０．０２、オッズ比＝４．４、９５％信頼限界＝１．２〜１５．４）。これらの結果は、ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子の存在が、回腸嚢肛門吻合術を受けた潰瘍性大腸炎患者における慢性回腸嚢炎の増加した危険性の指標であることを示す。
【００７２】
腸管外合併症、外科的適応症（原発性硬化性胆管炎（ｃｏｌａｎｇｉｔｉｓ）および回腸嚢炎）について試験された６６人の患者に対して、類似の分析を実行した。これら６６人の患者のうち、４８人をまた、ｐＡＮＣＡレベルについて試験した。慢性回腸嚢炎を用いた知見と類似して、回腸嚢炎のいずれかの形態を発病した患者は、回腸嚢炎を有さない患者よりも、１７１対立遺伝子についてより頻度が高く陽性であった（ｐ＝０．０３９、表Ｉを参照のこと）。さらに、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を発病した患者の優位に高いパーセンテージがまた、１７１対立遺伝子について陽性であったＰＳＣを有さない患者の３７．５％（ｐ＝０．０１９）に関して、１７１対立遺伝子について陽性であった（６９．２％）。考え合わせると、これらの結果は、ＦＡ１ １７１対立遺伝子が、慢性回腸嚢炎、回腸嚢炎または原発性硬化性胆管炎の発病の診断指標として試用され得ることを示す。
【００７３】
ＦＡ１ マイクロサテライト遺伝子座における遺伝子型決定を、本質的に以下のように実行した。各患者由来のゲノムＤＮＡを、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８４７２１に報告されるＦＡ１マイクロサテライトに隣接する配列に基づくプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した（図２）。プライマーＡは、配列５’−ＴＥＴ−ＴＧＡ ＡＴＴ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＣＴ−３’（配列番号２）を有し、そしてプライマーＢは、配列５’−ＣＡＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＴＧ−３’（配列番号３）を有し、これらは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）によって調製した。ＰＣＲ増幅を、製造業者ら（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の指示書に従って、Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ Ｇｏｌｄ．ＴＭ ＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実行した。簡単に言うと、ＰＣＲを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．３）；５０ｍＭ ＫＣｌ；０．００１％ ゼラチン；２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；１単位のＡｍｐｌｉ−Ｔａｑ ＧｏｌｄＴＭ ＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼ；４０〜１００ｎｇ ゲノムＤＮＡ；ならびに２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰを含む、２０μｌ容量中で実行した。サーマルサイクリングを、以下のように実行した：９５℃で１０分間を１サイクル；９５℃で３０秒間、５５℃で７５秒間、および７０℃で１５秒間を３５サイクル；ならびに７０℃で１０分間を１サイクル。
【００７４】
【表１】
増幅されたＰＣＲ産物を、以下のように分析した。ＰＣＲ産物のサンプルを、蒸留した脱イオン水で、１：５〜１：２０に希釈した。この希釈したサンプルを、４．２５％ポリアクリルアミド／６Ｍ尿素ゲル上にロードし、そして製造者によって提供される標準的なプロトコルに従って、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して２〜２．５時間電気泳動した。このバンドの位置によって、サイズ標準物およびＧｅｎＳｃａｎ（登録商標）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，１９９７）において示唆される方法に従って、サイズを割り当てた。参照個体由来のヘテロ接合性ＦＡ１マイクロサテライト（ＣＥＰＨ １３４７−０２）を、内部標準として使用した；この個体は、ＦＡ１マイクロサテライト１８９対立遺伝子および１９１対立遺伝子を有することが示された。上記の条件下で、ＣＥＰＨ １３４７−０２の１８９対立遺伝子および１９１対立遺伝子は、１８８．５ｂｐおよび１９０．４ｂｐの見掛け上のサイズを有し、そして、１７１対立遺伝子は、１７０．９の見掛け上のサイズを有する（図３）。統計学的方法を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｒｅｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して行った。患者がｐＡＮＣＡ陽性（少なくとも１ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）であるか、そして患者が高いｐＡＮＣＡレベル（少なくとも１００ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）を有するかを、Ｐ値を、患者の民族性（ユダヤ人対非ユダヤ人）を考慮して算出した。
【００７５】
（Ｂ．ＦＡ１マイクロサテライト１７１対立遺伝子および高ｐＡＮＣＡレベルは、独立して慢性回腸嚢炎の発生と関連する）
手術前の高レベルのｐＡＮＣＡは、ＩＰＡＡ後の慢性回腸嚢炎に関連することが示されている。ｐＡＮＣＡ状態を、１９９９年８月１７日発行の米国特許第５，９３７，８６２号において開示される方法に従って、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって、本研究における患者のうち５２人において決定した。ｐＡＮＣＡの高レベルまたは低レベルのいずれかを有するとして患者を分類し、ここで、高ｐＡＮＣＡレベルは、１００単位／ｍｌ以上のレベルとみなす。５２人の患者のうち６人（１２％）は、結腸切除およびＩＰＡＡの前に、高レベルのｐＡＮＣＡを有した。これらのうち、５人の患者（８３％）は、慢性回腸嚢炎を発症した。
【００７６】
ｐＡＮＣＡレベルとＦＡ１ １７１対立遺伝子との間の関連性を、層別化分析によって試験した。この結果は、１７１対立遺伝子陽性患者における慢性回腸嚢炎の発生率が、ｐＡＮＣＡ状態と独立であることを示した（ｐＡＮＣＡ陽性患者についてｐ＝０．０１０、および高いｐＡＮＣＡレベルを有する患者についてｐ＝０．０１１、表１を参照のこと）。これらの結果は、慢性回腸嚢炎が、ｐＡＮＣＡ依存性経路およびｐＡＮＣＡ非依存性経路の両方によって発症し得ることを実証する。これらの結果は、ｐＡＮＣＡが、ＦＡ１ １７１対立遺伝子と組み合わされて、回腸嚢炎または慢性回腸嚢炎の発症を予測する、特に感受性の方法を生成し得ることをさらに示す。
【００７７】
上記に提供される全ての学術論文、参考文献、および特許の、括弧内または他の引用は、以前に述べられているか否かにかかわらず、本明細書中で参考として援用される。
【００７８】
本発明は、上記の実施例についての参照と共に記載されてきたが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、上記の特許請求の範囲のみによって限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１１５２７８（Ｐ２０１２−１１５２７８Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２２７９１（Ｐ２０１２−２２７９１）
【出願日】平成２４年２月６日（２０１２．２．６）
【分割の表示】特願２００１−５７６９３４（Ｐ２００１−５７６９３４）の分割
【原出願日】平成１３年４月１０日（２００１．４．１０）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２７９１（Ｐ２０１２−２２７９１）
【出願日】平成２４年２月６日（２０１２．２．６）
【分割の表示】特願２００１−５７６９３４（Ｐ２００１−５７６９３４）の分割
【原出願日】平成１３年４月１０日（２００１．４．１０）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
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