基質特異性拡張型β−ラクタマーゼの検出方法および同定方法
本明細書で開示された実施形態は、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子を有する微生物を検出および／または同定するための組成物に関する。具体的には、本明細書では、バクテリアのＣＴＸ−Ｍ配列を検出するためのオリゴヌクレオチド、プローブ、およびオリゴヌクレオチド、プローブを含有するキットを提供する。ＣＴＸ−Ｍ型基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子を含む基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子を有する微生物を検出および／または増幅するための方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００９年２月１９日にＬｉｐｐｅらによって出願された、「基質特異性拡張型β−ラクタマーゼの検出方法および同定方法」と題した米国仮出願第６１／１５３，９５４号明細書の優先権を主張し、その内容は参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表の参照）
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０１０年２月１８日に作成された１５．２ＫＢのサイズでＧＥＮＯＭ．０９７ＶＰＣ．ｔｘｔと題したファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本明細書で開示された実施形態は、分子診断、特に基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）、特にＣＴＸ−Ｍ遺伝子を有する微生物を検出および同定するために使用される診断に関する。
【背景技術】
【０００４】
β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系の薬剤に対する耐性を付与する。これらの酵素は、例えば、ペニシリン、セファロスポリン系、セファマイシン系およびカルバペネム系（エルタペネム）のようなβ−ラクタム系抗生物質のβ−ラクタム環を破壊する。これらの抗生物質はその分子構造内に共通の要素、すなわちβ−ラクタムとして知られる４元素環を有する。ラクタマーゼ酵素はその環を切断して開環し、抗生物質分子の抗バクテリア特性を不活性化する。
【０００５】
基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）はますます、世界中で起っている院内感染の原因となっており、憂慮すべきことに、地域での感染発生の原因にもなっている。（Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、２００８年、ＣＭＩ）。ＥＳＢＬは、オキシイミノ側鎖を備えた基質拡張型セファロスポリンを加水分解するβ−ラクタマーゼである。これらのセファロスポリン系として、セフォタキシム、セフトリアキソンおよびセフタジジムならびにオキシイミノ−モノバクタム系アズトレオナムが挙げられる。この様に、ＥＳＢＬはこれらの抗生物質および関連するオキシイミノ−β−ラクタムに対する耐性を付与する。最もよく知られているＥＳＢＬは、ＴＥＭ−１、ＴＥＭ−２またはＳＨＶ−１遺伝子由来であり、これらのβ−ラクタマーゼの活性部位周辺のアミノ酸配置を変化させる変異を含む。このことによって、これらの酵素による加水分解に対して感受性のあるβ−ラクタム系抗生物質のスペクトルを拡大させている。
【０００６】
ＴＥＭおよびＳＨＶの古くからのバリアント、例えばＴＥＭおよびＳＨＶのようなバリアントは、ヨーロッパの大部分に影響を及ぼした後、実際に急速にアメリカ合衆国中に拡大しているが、一方で新型ＥＳＢＬ、ＣＴＸ−Ｍは南アメリカ、地中海および東ヨーロッパの国々に蔓延している（Ｇｏｖｉｎｄｅｎら、２００７年、ＡＪＢ）。セフォタキシムに対する高い活性からその名前が認められた最新のものは、１９８０年代後半に日本、ヨーロッパおよびアルゼンチンで、最も具体的には１９８９年にドイツで観察された（Ｎａａｓら、２００８年、ＣＭＩ）。それは全ての群の中で最も成功した群であると考えられている（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ＆Ｈｏｉｂｙ ２００４年、ＣＪＭ）。その出現はバクテリア感染を治療するためにセフトリアキソンおよび／またはセフォタキシムの使用が増加した結果と考えられ、その起源はクライベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属の仲間に常在する染色体上の遺伝子に由来することが知られている。ワールドワイドウェブアドレスｌａｈｅｙ．ｏｒｇ／Ｓｔｕｄｉｅｓでアクセス可能であるＬａｈｅｙ Ｃｌｉｎｉｃウェブサイトによると、今日までに、５つの系統群（ＣＴＸ−Ｍ−１、２、８、９および２５）に分類される８５種類を上回るＣＴＸ−Ｍ派生種が報告されている。
【０００７】
ＣＴＸ−Ｍ耐性遺伝子は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）で発見され、プラスミドを介して種間を容易に伝播することができる。ＣＴＸ−Ｍ遺伝子を有するクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等を含む腸内細菌科の生物種は、尿路感染症の主因と考えられている。また、エンテロバクター・クロカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏｃａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、ならびにクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）の様な他の腸内細菌科の生物種も、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子を有することができる。ＣＴＸ−Ｍ耐性株を検出することは、病院において他の患者からの隔離を必要とするため、および感染に対する主な治癒法としてカルバペネム系しか残されていないため、極めて重要である。
【０００８】
最近まで、株の耐性を知る唯一の方法は、手作業で抗微生物感受性試験を実施することであった。感受性試験には、結果を得るための時間量（すなわち４８時間〜９６時間）を含む多くの欠点がある。最初に、試験者は標本からバクテリア株を単離する必要があり、これには最高で４８時間かかる可能性があり；次に生化学的同定に進むが、これに更に１８時間〜２４時間かかり、次いで手作業による抗微生物感受性試験に進むが、これも最高で２４時間がかかる可能性がある。結果を得ることが遅れることに加えて、手作業による試験方法はまた、抗生物質ディスクの保存が不適切なために再現性を欠くこと、不適切な拡散をする抗生物質ディスクもあること、およびこの工程を一般化することが欠如していること等、他の問題も有している。
【０００９】
偽陰性の結果によって、医療実施者が不適切な抗生物質の治療方式（例えば、ＥＳＢＬ感染した個人を第３世代セファロスポリンまたはアズトレオナムで治療すること）を設計してしまう可能性があるので、ＥＳＢＬ検出の特異性および正確性は重大である。このことは、被治癒者に不必要な危険性をもたらし、また医療施設（例えば病院）内における交互的なコンタミネーションの確率も増大させる。ＥＳＢＬを産生する株が提唱される限界点で第３世代または第４世代セファロスポリンを用いても、その全てに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ耐性を示さない場合には、ＥＳＢＬ産生腸内細菌科は最終的に臨床的に耐性を有するという結果となりうるので、臨床検査標準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ））は、それらをペニシリン系、セファロスポリン系およびアズトレオナムに対して耐性を持つと報告することを推奨している（ＣＬＳＩ、Ｍ１００−Ｓ１８）。ＣＴＸ−Ｍ耐性遺伝子を保有する生物にはより新規のセファロスポリン系およびアズトレオナムを加水分解する能力があるため、それらの検出を更に困難にしている。ＣＬＳＩの指針は、初期スクリーニングおよび確認試験の両方で使用した薬剤によっては、ＣＴＸ−Ｍを産生する株の存在を誤診する怖れを提起している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書で開示される実施形態は、ＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ耐性遺伝子）を有するバクテリアを検出および同定するために使用される他の方法と比較して利点を提供し、改善された特異性、より短い期間で結果を入手すること、およびＥＳＢＬを検出するために、例えば、アガロースゲル電気泳動のような追加的な工程を実施する必要性がなくなることが挙げられる（Ｌａｒｔｉｇｕｅら、２００４年、ＦＥＭＳ ＭＬ；Ｐｉｔｏｕｔら、２００４年、ＪＣＭ；Ｐｉｔｏｕｔら、２００７年、ＣＭＩ）。更に、本明細書で開示された実施形態は、本明細書で開示した方法および組成物が、例えば米国特許出願公開第２００７０２４８９５４号明細書に記載されたアッセイの開発時点では知られていなかったＣＴＸ−Ｍ遺伝子の新規に発見されたアイソフォームを検出および同定するために特に設計されているという点で、報告されたＣＴＸ−Ｍを含むＥＳＢＬをその他の検出方法よりも利点を提供する。米国特許第２００７０２４８９５４号明細書で開示された方法は、新規に発見されたＣＴＸ−Ｍアイソフォームの配列と完全には相補性を示さないプライマーを使用するが、このことは特異性を損なうか、または偽陰性の結果もたらす可能性さえある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
抗生物質耐性を付与するＣＴＸ−Ｍ遺伝子を含むＥＳＢＬの迅速で感度の高い検出のための組成物および方法を提供する。本組成物は、試料中のＣＴＸ−Ｍ核酸および／または他のＥＳＢＬ核酸の存在を検出する際に使用するオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブセットを含む。これらのプライマーおよびプローブセットは、増幅方法（例えば、ＰＣＲ、特に定量ＰＣＲ）で使用することができ、試験試料中、特に患者試料中におけるＥＳＢＬ遺伝子の存在を検出するための増幅方法で使用するキットにパッケージ化することができ、それによって該遺伝子が検出されると、その試料がＥＳＢＬを有するバクテリアを含むことを示す。
【００１２】
したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号１〜２４で記載された配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む、それらから本質的に成る、またはそれらから成るオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。本明細書で開示されるプライマーおよび／またはプローブは、標本中における基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）を有する微生物の存在を検出および／または同定する方法で使用することができる。
【００１３】
更に、試料中のＥＳＢＬ遺伝子（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）の検出に有用なキットを提供し、ここで該キットは本明細書で開示されている実施形態による組成物を含む。幾つかの実施形態では、該キットはポリメラーゼに基づく増幅反応（例えば、ＰＣＲまたはＱＰＣＲ）で提供される組成物の使用説明書を含むことができる。
【００１４】
他の実施形態は：基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）の存在を分析する標本から試料を採取して、標準的ＰＣＲ条件下で試料を増幅プライマーセットに接触させるステップであって、ここで前記増幅プライマーセットは少なくとも１対のプライマー対を含み、ここで前記プライマーセットが１つ以上のユニバーサル塩基を有するプライマーを含み、ここで前記プライマー対は基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）内の標的配列に隣接する核酸とハイブリダイズし、および、ここで前記プライマー対によって標的増幅産物が生じるステップ；標的増幅産物を生成するプライマーの伸長のための試薬および条件を提供し；および、標的増幅産物の存在および／または量を決定する、検出方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、本明細書に開示される実施形態によるプライマーおよびプローブの使用に関し、ただし、該プライマーまたは該プローブは配列番号１〜２４で定義された配列のいずれかによる配列を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】４つの群にクラスター化された全てのＣＴＸ−Ｍ遺伝子の系統樹であり、クレブシエラ・オキシトカは外集団である。
【図２】ＣＴＸ−Ｍ−１群（ｃｔｘｍ１−６１６Ｆ／配列番号１）（ｃｔｘｍ１−７４０Ｒ／配列番号２）（ｃｔｘｍ１／２−６５７Ｂ／配列番号５）を検出するための、本明細書に開示されるプライマーの位置を示したシーケンスアラインメントの図である。以前に開示された増幅プライマー（ＣＴＸＭ１−Ｆ３／配列番号４０）（ＣＴＸＭ１−Ｒ２／配列番号４１）も示されている。示されている参照配列は、全てのＣＴＸ−Ｍ−１配列のアラインメントによるコンセンサス配列である。示されているコンセンサス配列は、配列番号４８に対応する。
【図３】ＣＴＸ−Ｍ−２群（ｃｔｘｍ２−６０９Ｆ／配列番号３）（ｃｔｘｍ２−７７６Ｒ／配列番号４）（ｃｔｘｍ１／２−６５７Ｂ／配列番号５）を検出するための、本明細書に開示されるプライマーの位置を示したシーケンスアラインメントの図である。以前に開示された増幅プライマー（ＴＯＨＯ１−２Ｆ／配列番号４２）（ＴＯＨＯ１−１Ｒ／配列番号４３）も示されている。示されている参照配列は、全てのＣＴＸ−Ｍ−２配列のアラインメントからのコンセンサス配列である。示されているコンセンサス配列は、配列番号４９に対応する。
【図４】ＣＴＸ−Ｍ−８群（ｃｔｘｍ８−１１９Ｒ／配列番号７）（ｃｔｘｍ８−７Ｆ／配列番号６）（ｃｔｘｍ８／９−４２Ｂ／配列番号１０）を検出するための、本明細書に開示されるプライマーの位置を示したシーケンスアラインメントの図である。以前に開示された増幅プライマー（ＣＴＸＭ８２５Ｆ／配列番号４４）（ＣＴＸＭ８２５／配列番号４５）も示されている。示されている参照配列は、全てのＣＴＸ−Ｍ−８配列のアラインメントによるコンセンサス配列である。示されているコンセンサス配列は、配列番号５０に対応する。
【図５】ＣＴＸ−Ｍ−９群（ｃｔｘｍ９−７Ｆ／配列番号８）（ｃｔｘｍ９−１１７Ｒ／配列番号９）（ｃｔｘｍ８／９−４２Ｂ／配列番号１０）を検出するための、本明細書に開示されるプライマーの位置を示したシーケンスアラインメントの図である。以前に開示された増幅プライマー（ＣＴＸＭ９１４Ｆ／配列番号４６）（ＣＴＸＭ９１４Ｒ／配列番号４７）も示されている。示されている参照配列は、全てのＣＴＸ−Ｍ−９配列のアラインメントによるコンセンサス配列である。示されているコンセンサス配列は、配列番号５１に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で開示されている実施形態は、拡張型または基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を有する微生物の効率的で特異的な検出および／または同定のための組成物および方法に関する。
【００１８】
本明細書では、用語「拡張型または基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ」または「ＥＳＢＬ」とは、ペニシリン系、第１世代、第２世代および第３世代セファロスポリン系ならびにアズトレオナム（しかし、セファマイシン系とカルバペネム系は除く）に対して、これらの抗生物質を加水分解することによってバクテリア耐性を付与することができ、クラブラン酸等のβ−ラクタマーゼ阻害剤によって阻害されるラクタマーゼであるβ−ラクタマーゼを意味する。当業者であれば、用語「ＥＳＢＬ」は、ワールドワイドウェブアドレス、ｌａｈｅｙ．ｏｒｇ／Ｓｔｕｄｉｅｓにおいて、Ｌａｈｅｙ Ｃｌｉｎｉｃウェブサイトに列挙されている全てのＥＳＢＬを含み、しかしこれに限定されることなく、現在知られている、または将来において発見される全ての基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを包含することは認識するであろう。したがって、ＥＳＢＬという用語は、ＳＨＶ型（すなわち、スルフヒドリル変形型（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｙｐｅ））、ＴＥＭ型、ＴＯＨＯ型およびＣＴＸ−Ｍ型のＥＳＢＬを包含する。
【００１９】
幾つかの実施形態では、組成物およびアッセイは、ＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼを検出および同定するために使用される。ＣＴＸ−Ｍ酵素は、以前に詳細に概略が述べられている（Ｂｏｎｎｅｔ，Ｒ．ら（２００４年）、Ｇｒｏｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅｓ：ｔｈｅ ＣＴＸ−Ｍ ｅｎｚｙｍｅｓ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．第４８巻：１〜１４頁）。幾つかの例示的で非限定的なＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼの特性は以下の通りである：セフォタキシムのＭＩＣは耐性範囲（６４μｇ／ｍｌよりも大きい）内であり、一方、セフタジジムのＭＩＣは通常は明らかに感受性のある範囲（２〜８μｇ／ｍｌ）内である。しかし、幾つかのＣＴＸ−Ｍ型ＥＳＢＬは実際にセフタジジムを加水分解し、セファロスポリン（ＭＩＣは高く、２５６μｇ／ｍｌもある）に対する耐性を寄与することができる。アズトレオナムのＭＩＣは可変的である。ＣＴＸ−Ｍ型β−ラクタマーゼはセフェピムを加水分解するが、セフェピムのＭＩＣは他のＥＳＢＬ型を産生するバクテリアにおいて観察されるものよりも高い。タゾバクタムは、ＣＴＸ−Ｍ型β−ラクタマーゼに対してクラブラン酸よりも約１０倍高い阻害活性を示す。バクテリアの中には、ＣＴＸ−Ｍ型ＥＳＢＬおよびＳＨＶ型ＥＳＢＬの両方、またはＣＴＸ−Ｍ型ＥＳＢＬおよびＡｍｐＣ型β−ラクタマーゼの両方を有する可能性があり、このことは抗生物質耐性の表現型を変化させる可能性がある。
【００２０】
本明細書で開示した実施形態は、ＣＴＸ−Ｍ−１〜ＣＴＸ−Ｍ−８２として同定された１種以上のＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼを含み、表１に列挙されたバクテリア株で発見されたＣＴＸ−Ｍ型β−ラクタマーゼの幾つかまたは全てを含む、ＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼの迅速な検出および／または同定を可能にする。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
【表３】
【００２４】
（標本および試料）
本明細書で開示した実施形態は、標本中のＥＳＢＬを検出および／または同定するために使用することができる。本明細書で使用される様に、用語「標本（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）」とは、哺乳類のサンプル、具体的にはヒトのサンプルを含む実質的に任意の生物種の体液（血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗、腹膜液、胸膜液、滲出液、腹水、膿性分泌物、洗浄液、排泄液、ブラシ細胞診標本、生検組織、移植片医学装置、感染したカテーテル、膿、バイオフィルムおよび精液を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない１つまたは任意数の供給源からの臨床的標本または試料、および本発明での使用が見出されている環境試料（空気試料、農業試料、水試料および土壌試料を含むが、これらに限定されない）を表す。更に、試料は食品加工から採取することができ、投入試料（例えば、穀粒、ミルクまたは動物の死体）、加工の中間工程の試料、ならびに消費者に提供される最終食品を含むことができる。幾つかの実施形態では、本明細書で記載される方法およびアッセイは、標本を更に操作することなく、試料または臨床標本に直接実施することができる。幾つかの実施形態では、標本を操作する（例えば培養し、核酸を抽出するために処理し、もしくは精製し、伸長する）か、または他の操作を行う。
【００２５】
（プライマーおよびプローブ）
幾つかの実施形態では、標本または試料は、増幅プライマーセットと接触させることができる。幾つかの実施形態では、標本または試料はプローブと接触させることができる。本明細書で用いられている様に、用語「プライマー」および「プローブ」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸が含まれるが、これらに限定されない。用語「プライマー」および「プローブ」は、ヌクレオチドだけではなくヌクレオチドアナログである分子を包含する。本明細書で用いられる様に、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−もしくはＣ−グリコシドである任意の他種のポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を含有するその他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇ．からＮＥＵＧＥＮＥ（登録商標）ポリマーとして市販されている）、ならびに、配列の中に例えばＤＮＡやＲＮＡで見出されている様な塩基対および塩基スタッキングを可能にする核酸塩基を含むことを条件とした他の合成された配列特異的核酸ポリマーを含む他のポリマーの一般名である。
【００２６】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示される「プライマー」または「プローブ」は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含有することができる。「ロックド核酸（ＬＮＡ）」とは、リボースの２位の酸素が４位の炭素と結合しているメチレン架橋を含有するリボヌクレオチドである（図２７参照）。Ｂｒａａｓｃｈ Ｄ．Ａ．およびＣｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．（２００１年）、Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）；ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ．、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、第８巻、１〜７頁、は、ＬＮＡの概説を提供している。この論文は、本明細書においてその全体を参照により明示的に組み込まれる。ＬＮＡは、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡから市販されている。また、ホスホロチオエートは当業者には知られており、例えば、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから注文できる。したがって、幾つかの実施形態では、本明細書で開示される「プライマー」または「プローブ」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多いＬＮＡを含むことができる。
【００２７】
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドという用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホラミデート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、２本鎖および１本鎖ＤＮＡ、ならびに２本鎖および１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリッドを含む。また、この用語は既知の修飾型も含み、例えば当該技術分野で既知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に生じる１つ以上のヌクレオチドのアナログによる置換、ヌクレオチド間の修飾［例えば、荷電していない結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメート等）、負に荷電した結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）および正に荷電した結合を有するもの（例えば、アミノアルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等を含む）のようなペンダント部分構造を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラーレン等）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を有するもの（例えば、α−アノマー核酸等）］、ならびに非修飾型のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２８】
本明細書で用いられる様に、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」とは、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基を含有する部分構造を含むことが出来ることが理解されるであろう。そのような修飾には、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他の複素環が含まれる。また、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖の部分構造に修飾を含み、例えば、１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置換されているか、またはエーテル、アミン等として官能化されていてもよい。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する他の修飾として、それぞれの相補的ピリミジンもしくはプリンと水素結合を形成するプリンもしくはピリミジン塩基上の官能基を再配置、付加、置換、そうでなければ変化させることが挙げられる。結果としてもたらされる修飾されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、他のそのような修飾ヌクレオチド単位とは塩基対を形成することができるが、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとは形成することができない。例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）は修飾されて、イソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成することができる。そのような修飾によって、もはやシトシンとの標準的な塩基対を効率よく形成しないヌクレオシド塩基がもたらされる。しかしながら、シトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミジン）を修飾してイソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン）を形成すると、結果としてグアノシンと効率よく塩基対を形成しないが、イソグアノシンと塩基対を形成できる修飾ヌクレオチドがもたらされる。イソシトシンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から入手可能であり；イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３２巻、１０４８９〜１０４９６頁、およびその論文で引用された参考文献に記載された方法によって調製することができ；２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンはＴｏｒら（１９９３年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１５巻、４４６１〜４４６７頁、およびそこに引用された参考文献に記載された方法によって調製することができ；イソグアニンヌクレオチドは上記のＳｗｉｔｚｅｒら（１９９３年）、およびＭａｎｔｓｃｈら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４巻、５５９３〜５６０１頁、またはＣｏｌｌｉｎｓらによって米国特許第５，７８０，６１０号明細書に記載された方法を使用して調製することができる。κおよびπと表される非天然塩基対は、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ、第３４３巻、３３〜３７頁に記載された２，６−ジアミノピリミジンおよびその相補体（１−メチルピラゾロ［４，３］−ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）の合成方法によって合成してもよい。特有の塩基対を形成する他のそのような修飾ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈら（１９９２年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１４巻、３６７５〜３６８３頁、および上記のＳｗｉｔｚｅｒらに記載されているか、または当業者には明らかである。
【００２９】
好ましくは、増幅プライマーセットは、ユニバーサル塩基を含有する少なくとも１個、２個、３個または４個またはそれよりも多いプライマーおよび／またはプローブを含む。本明細書で用いられる様に、用語「ユニバーサル塩基」とは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択される１つよりも多いヌクレオチドとハイブリダイズすることができるヌクレオチドアナログを言う。幾つかの実施形態では、ユニバーサル塩基はデオキシイノシン、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、６−ニトロインドール、５−ニトロインドールから成る群から選択してもよい。好ましくは、ユニバーサル塩基はデオキシイノシンである。幾つかの実施形態では、増幅プライマーセットおよび本明細書で開示したプローブは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれよりも多いユニバーサル塩基を有する少なくとも１種のプライマーおよび／またはプローブが含まれる。
【００３０】
プライマーおよび／またはプローブの長さは、好ましくは１０〜４５ヌクレオチド長である。例えば、プライマーおよびまたはプローブの長さは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、またはそれよりも長いヌクレオチド長であってよい。プライマーおよび／またはプローブは、例えば、固相支持体に結合した形態、液体および凍結乾燥体を含む任意の適切な形態で提供することができる。幾つかの実施形態では、プライマーおよび／またはプローブは標的核酸配列に対して、オリゴヌクレオチドの全体長に渡ってハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。そのような配列は、互いに関して「完全に相補的である」ということができる。オリゴヌクレオチドが本明細書の核酸配列に関して「実質的に相補的である」という場合、その２つの配列は完全に相補的であるか、またはこれらはハイブリダイゼーションする際にミスマッチを形成してもよいが、以下に議論されるようなストリンジェント条件下もしくは標準的ＰＣＲ条件下でハイブリダイズする能力を保持している。本明細書で用いられる様に、用語「標準的ＰＣＲ条件」には、例えば、本明細書に開示される任意のＰＣＲ条件、または例えば、ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｐ．ＱｕｉｒｋｅおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、（著作権）２００１年、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂ．Ｗｈｉｔｅ編、（著作権）１９９３年、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ．に記載されるような、当該技術分野において既知のＰＣＲ条件が含まれる。
【００３１】
本明細書で用いられる様に、「実質的に相補的である」という用語は、２つの核酸間（例えば、捕捉プローブと標的配列との相補的領域）の相補性、および／または捕捉プローブのリンカー配列と競合的核酸の相補的領域との間の相補性を意味する。相補性は完全である必要はなく、２種類の核酸間に塩基対のミスマッチは任意数存在してもよい。しかしながら、変異の数が余りにも多いために、ハイブリダイゼーション条件の中で最もストリンジェントでない条件でさえもハイブリダイゼーションが起こらない場合、その配列は実質的に相補的な配列ではない。本明細書において２つの配列が「実質的に相補的である」というとき、その配列は選択された反応条件下でハイブリダイズするのに充分に互いに相補的であることを意味する。特異性を実現するために充分な核酸の相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとの関係は当該技術分野において既知であり、配列のアイデンティティー、融点、およびハイブリダイゼーション条件に関しては、以下に更に記載されている。したがって、実質的に相補的な配列は、本明細書で記載される任意の検出方法で使用することができる。ハイブリダイゼーション条件が、例えば、標的配列と非標的配列とを識別できるのに充分である限り、そのようなプローブは、例えば完全に相補的でもよく、または１個から多数のミスマッチを含有していてもよい。したがって、実質的に相補的な配列は、参照配列と比較して、アイデンティティー（％）が１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８５、８０、７５またはそれ未満、またはその間の任意の数の範囲である配列を意味することができる。
【００３２】
本明細書で定義される様に、「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェント条件」とは、この様に識別される：（１）洗浄するために、低イオン強度および高温（例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）を用い；（２）ハイブリダイゼーションの際に、例えばホルムアミド、例えば４２℃で５０％（体積／体積）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ６．５と、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとを混和したものの様な変性剤を用い、または（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを用い、５５℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、および４２℃で５０％ホルムアミド中で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣを含む高ストリンジェントな洗浄を行う。
【００３３】
「中程度のストリンジェント条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年によって記載されている様に定義することができ、前述したものより低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液で、３７℃で一晩インキュベートし、続いてフィルターを約３７〜５０℃で、１×ＳＳＣ中で洗浄することである。当業者であれば、プローブ長等の要素に適合するために、必要に応じて温度、イオン強度等をどの様に調節できるかを認識するであろう。
【００３４】
（プライマー対）
幾つかの実施形態では、増幅プライマーセットは１以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のプライマー対を含む。本明細書で用いられる様に、用語「プライマー対」とは、標的核酸（例えば、ＥＳＢＬをコードする核酸、例えば、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子またはそれらの断片等）の反対側の鎖に個々にハイブリダイズする２個のプライマーを意味することができ、それぞれのプライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で３’末端が伸長して標的増幅産物を形成することができる。プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むことができる。
【００３５】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法は、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１組の増幅プライマーを含むプライマー対を含む。例えば、本明細書で開示される組成物および方法は、表１に列挙されるバクテリア由来のＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼを検出および／または同定するために使用することができる。幾つかの実施形態では、組成物および方法は、表１に列挙された全てのバクテリア由来のＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼを集合的に検出および同定することを可能にする複数の増幅プライマーを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５から選択される少なくとも２つのＣＴＸ−Ｍ群由来のＣＴＸ−Ｍ核酸の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記ＣＴＸ−Ｍ核酸を増幅するプライマー対を含む。ＣＴＸ−Ｍ−１の検出および同定に有用なプライマーは、例えば、配列番号１、２、５、１１、１２、１３、１４、３２および３３、またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド、あるいは、配列番号１、２、５、１１、１２、１３、１４、３２および３３、またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【００３６】
ＣＴＸ−Ｍ−２の検出および同定に有用なプライマーとして、配列番号３、４、５、１５、１６、１７、１８、３２および３３またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続した核酸を有するオリゴヌクレオチド、あるいは、配列番号３、４、５、１５、１６、１７、１８、３２および３３、またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＣＴＸ−Ｍ−８の検出および同定に有用なプライマーとして、配列番号６、７、１０、１９、２０、２１、２２、２７、２８および３１、またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続した核酸を有するオリゴヌクレオチド、あるいは、配列番号３、４、５、１５、１６、１７、１８、３２および３３、またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＣＴＸ−Ｍ−９の検出および同定に有用なプライマーとして、配列番号８、９、１０、２３、２４、２５、２６、２９、３０および３１、またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続した核酸を有するオリゴヌクレオチド、あるいは、配列番号８、９、５、１０、２３、２４、２５、２６、２９、３０および３１、またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。当業者であれば、幾つかの実施形態は、本明細書で開示されたプライマー対の任意の組み合わせが含まれること、例えば、配列番号１および２、配列番号３および４、配列番号６および７、配列番号８および９、配列番号２７および２８、ならびに配列番号２９および３０のプライマー対の組み合わせが含まれることを理解するであろう。幾つかの実施形態では、組成物および方法は、配列番号１〜１０から成る、これらから本質的に成る、またはこれらを含むプライマーおよびプローブ、あるいは、配列番号１〜１０の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の連続したヌクレオチドを有するプライマーおよびプローブ、あるいは配列番号１〜１０またはそれらの相補体に実質的に相補的であり、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするプライマーおよびプローブを含む。幾つかの実施形態では、組成物および方法は、配列番号１〜５および２７〜３１から成る、これらから本質的に成る、またはこれらを含むプライマーおよびプローブ、あるいは、配列番号１〜５および２７〜３１の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の連続したヌクレオチドを有するプライマーおよびプローブ、あるいは配列番号１〜５および２７〜３１またはそれらの相補体に実質的に相補的であり、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするプライマーおよびプローブを含む。
【００３７】
幾つかの実施形態では、組成物および方法は、例えばＰＣＴ公開第０８／１２４６７０号に開示されたように、例えばカルバペネマーゼ遺伝子の検出用を含む、追加的な配列の検出および／または同定のためのプライマーおよび／またはプローブを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示した組成物および方法は、配列番号３４および３５またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを有するプライマーを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、配列番号３７および３８またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを有するプライマーを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、配列番号３４および３５の配列またはそれらの相補体の配列に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするプライマーを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、配列番号３７および３８の配列またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするプライマーを含む。
【００３８】
本明細書で開示された幾つかの実施形態では、組成物および／または方法は１つ以上のプライマーを含むことができ、ここで該プライマーは配列番号１〜２２の配列、またはそれらの相補体の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれよりも多く連続した核酸を含む。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
（プローブ）
幾つかの実施形態では、プローブは検出可能な標識を含むことができる。対象物に対する標識として、直接的に検出可能および間接的に検出可能な放射性ラベル、または蛍光色素のような非放射性標識が挙げられる。直接的に検出可能な標識とは、１種以上の追加的な化学物質と相互作用させることなく、直接的に検出可能なシグナルを提供する標識である。直接的に検出可能な標識の例として、蛍光標識が挙げられる。間接的に検出可能な標識とは、１種以上の追加的な要素と相互作用して検出可能なシグナルを提供する標識である。この後者の実施形態では、標識は共同して作用して検出可能なシグナルを提供する２つ以上の化学物質を含むシグナル生成系の要素である。間接的に検出可能な標識の例として、ビオチンまたはジゴキシゲニンが挙げられ、それらは蛍光色素またはアルカリホスファターゼのような酵素と組み合わされた適切な抗体によって検出することができる。多くの好ましい実施形態では、標識は直接的に検出可能な標識である。特定の対象物に対する直接的に検出可能な標識として、蛍光標識が挙げられる。本明細書で開示された実施形態での用途が見出される蛍光標識は、蛍光色素部分構造を含有する。対象物に対する具体的な蛍光色素として：キサンテン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２−［（エチルアミノ）−３−（エチルイミノ）−２−７−ジメチル−３Ｈ−キサンテン−９−イル］安息香酸エチルエステルモノヒドロクロリド（Ｒ６Ｇ）（約５００〜５６０ｎｍの範囲の波長で応答照射を放射する）、１，１，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドジカルボシアニンイオダイド（ＨＩＤＣ）（約６００〜６６０ｎｍの範囲の波長で応答照射を放射する）、６−カルボキシフルオレセイン（一般的に、略語ＦＡＭおよびＦとして知られている）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）およびローダミン１１０のようなフルオレセインおよびローダミン色素；シアニン色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７色素）；クマリン（例えば、ウンベリフェロン）；ベンジミド色素（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）；フェナントリジン色素（例えば、テキサスレッド）；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素（例えば、Ｃｙ３（約５４０から５８０ｎｍの範囲の波長で応答照射を放射する）、Ｃｙ５（約６４０から６８０ｎｍの範囲の波長で応答照射を放射する）等のようなシアニン色素）；ＢＯＤＩＰＹ色素およびキノリン色素、が挙げられる。対象物に対する特定の蛍光色素としては：ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、Ｒ１１０、エオジン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、ＨＩＤＣ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リサミン、ＲＯＸ、ナフトフルオレセイン、テキサスレッド、ナフトフルオレセイン、ＳＹＢＲグリーン、Ｃｙ３およびＣｙ５等が挙げられる。
【００４２】
好ましい実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、分子ビーコンプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、またはＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブを含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、１つ以上の分子ビーコンプローブを含み、ただし、該プローブは配列番号５、１０、３１、３２または３３の配列、例えば、配列番号２５、２６、２７、２８、３２および／または３３のいずれか１つで示したようなプローブを含む。
【００４３】
ｃｃａｇｃｇＴＡＴＧＧＹＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧｃｇｃｔｇｇ（配列番号５）
ｃｇａｇｇｃＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＲＡＡＡＡＧＣＡＧｇｃｃｔｃｇ（配列番号１０）
ｃｇｃｇａｔｃＡＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡｇａｔｃｇｃｇ（配列番号３６）
ｃｇｃｇａｔｃＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＣＧｇａｔｃｇｃｇ（配列番号３９）
ｃｇｇｃｇａｔＡＡＧＣＡＲＡＧＴＧＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＧａｔｃｇｃｃｇ（配列番号３１）
ｃＣａＣｃａＡｃｇａＴａｔｃｇＣｇ（配列番号３２）
ＴＧＧＹＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧＴ（配列番号３３）
【００４４】
幾つかの実施形態では、例えば配列番号２５〜２８および３２〜３３といったプローブは、ＦＡＭ蛍光色素消光分子およびＤＡＢＣＹＬ消光剤を使用して標識される。幾つかの実施形態では、プローブはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブまたはＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブである。幾つかの実施形態では、１つ以上の増幅プライマーは、例えばＳＹＢＲグリーン等のような蛍光部分構造で標識してもよい。
【００４５】
本明細書で開示されたプライマーおよびプローブ配列は、５’または３’末端に更にヌクレオチドを含めるために改変してもよい。同様にして、幾つかの実施形態では、プライマーおよびプローブ配列は、配列内に置換されたヌクレオチドを有することによって改変してもよい。プライマーおよびプローブ配列は、それぞれの標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするのに充分な相補性を含有しなければならないことが認識される。このようにして、少なくとも１、２、３、４、または約５個までのヌクレオチドが置換されてもよい。
【００４６】
配列番号３２および３３はいずれも、ＣＴＸ−Ｍ群１および２に特異的である。幾つかの実施形態では、プローブ配列番号３２は５個のロックド核酸（ＬＮＡ）を含有することができる。幾つかの実施形態では、配列番号３３はＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである。幾つかの実施形態では、配列番号３３は１つ以上のディジェネレート塩基を含有し、ＣＴＸ−Ｍ１およびＣＴＸ−Ｍ２の双方に対して（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下および／または標準的なＰＣＲ条件下で）特異的にアニールする。
【００４７】
本明細書で開示された実施形態のプライマーの作成に使用できる化学合成方法として、Ｎａｒａｎｇら（１９７９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第６８巻、９０頁に記載されたホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら（１９７９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第６８巻、１０９頁によって開示されたホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２２巻、１８５９頁によって開示されたジエチルホスホラミデート法、および米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載された固相支持体法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
また、本明細書で開示された実施形態の合成オリゴヌクレオチドプライマーを調製するための自動化オリゴヌクレオチド合成機の使用も意図される。
【００４９】
（アニーリングおよび特異的結合）
幾つかの実施形態では、標的核酸配列へのプライマーおよび／またはプローブの結合またはアニーリングは、ハイブリダイゼーションによって達成される。当業者であれば、特異的ハイブリダイゼーションは、標的または参照核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的である配列を選択することによって達成されることは理解するであろう。これは、オリゴヌクレオチド標的核酸配列がオリゴヌクレオチド配列の完全長に渡る塩基対を含む。そのような配列は、互いに関して「完全に相補的」であるということができる。オリゴヌクレオチドが本明細書の核酸配列に関して「実質的に相補的である」という場合、その２つの配列は完全に相補的であるか、またはこれらはハイブリダイゼーションの際にミスマッチを形成してもよいが、しかし以下に議論されるようにストリンジェント条件下もしくは標準的ＰＣＲ条件下でハイブリダイズする能力を保持している。
【００５０】
幾つかの実施形態では、試料または標本は、増幅プライマーセットおよびプローブと接触させる。好ましくは、増幅プライマーおよびプローブは単一の一連の条件下（すなわち、以下に議論される標準的ＰＣＲ条件を含むストリンジェント条件下）で標的核酸にハイブリダイズする。本明細書で用いられる様に、プローブの長さおよび／または核酸組成に応じて、用語「ストリンジェント条件」、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は変化してもよく（例えば、塩濃度は約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満）、ハイブリダイゼーション温度は、例えば、０℃の低さから２２℃を上回るまで、約３０℃を上回るまで、および（この場合が最も多いが）約３７℃を上回る範囲でよい。断片が長くなればなるほど、特異的なハイブリダイゼーションのために高いハイブリダイゼーション温度を必要とする可能性がある。幾つかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼすので、パラメータの組み合わせることは単一の要素の絶対的な尺度を設けることよりも重要である。したがって、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例として以下のいずれか、または両方の条件をいうことができる：ａ）約４５℃で６×ＳＳＣ、次いで６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで１回以上洗浄すること、およびｂ）４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡで、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後洗浄すること。幾つかの実施形態では、用語「ストリンジェント条件」とは、標準的ＰＣＲ条件を意味することができる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、試料または標本を増幅プライマーセットと標準的ＰＣＲ条件下で接触させる。臨床微生物学へ応用される標準的ＰＣＲ条件を含むＰＣＲ技術の概説については、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ；Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｂｏｓｔｏｎによって出版されたＳｉｎｇｌｅｔｏｎ Ｐ．著、ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）；Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第６７巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ（１９９７年）；および「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」１９９１年〜１９９５年（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照。「ＰＣＲ条件」の非限定的な例として、本明細書で引用された参考文献で開示されている条件が挙げられ、例えばアニーリング温度が７２℃で、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；またはアニーリング温度が５９℃で、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍｇ ＢＳＡ、４％トレハロース；またはアニーリング温度が５５℃で、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２等がある。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示された方法には、ＰＣＲ（例えば、ＱＰＣＲ）に基づいた、ＣＴＸ−Ｍ核酸のようなＥＳＢＬの、本明細書で記載されたプライマーおよびプローブを使用した増幅ならびに検出法が含まれる。様々な実施形態では、本明細書で開示した方法は、ＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）の存在を、生理学的範囲内で存在するバクテリア濃度（すなわち、バクテリアに感染した対象から収集した試料中のバクテリア濃度）で検出することができる。この様にして、ＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）の存在を検出するために、バクテリア集団を単離、濃縮、または拡張（例えば、培養）する必要なく、試料を直接的にスクリーニングすることができる。様々な実施形態では、本明細書で開示した方法は、バクテリア濃度が約１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、約１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、約１×１０５ＣＦＵ／ｍｌまたは約１×１０６ＣＦＵ／ｍｌである試料からＥＳＢＬの存在を検出することができる。
【００５３】
当該技術分野において、種々のＰＣＲまたはＱＰＣＲプロトコールは多数知られており、本明細書で以下に例示されており、およびそれらは試料中のＣＴＸ−Ｍを含むＥＳＢＬを検出するために本明細書に記載された組成物を用いて使用するために直接的に適用するか、または適合させることができる。
【００５４】
一般的に、ＰＣＲでは、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマー対との反応によって増幅する。プライマー（複数可）は、標的核酸の相補領域にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼはプライマー（複数可）を伸長して標的配列を増幅する。ポリメラーゼに基づいた核酸増幅産物を提供するのに充分な条件下では、あるサイズの核酸断片が反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）の優位を占める。増幅サイクルを反復して、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増加させる。該反応は、ＰＣＲ用に通常使用される任意のサーモサイクラーで実施することができる。しかしながら、リアルタイム蛍光測定能を有するサイクラ−が好ましく、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（登録商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）およびＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡである。
【００５５】
幾つかの実施形態は、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲとも言われる）を含む方法を提供する。ＱＰＣＲは、定量的な測定値を提供し、また時間およびコンタミネーションを減少させるという利点も提供する。本明細書で用いられる様に、「定量ＰＣＲ」（または「リアルタイムＰＣＲ」）とは、反応産物を繰り返してサンプリングする必要なく、増幅を起こしながらＰＣＲ増幅の進行状況を直接的にモニターすることをいう。ＱＰＣＲにおいては、反応産物が生成してバックグラウンドレベルと比較してシグナルが増加することを手掛かりに追跡されるため（ただし、反応がプラトーに達する前）、反応産物はシグナル機構（例えば、蛍光）を通じてモニターすることができる。蛍光の検出可能レベルまたは「閾値」レベルを達成する為に必要なサイクル数（本明細書では、サイクル閾値または「ＣＴ」と表される）は、ＰＣＲ工程の開始における増幅可能な標的の濃度によって直接的に変化し、シグナル強度を測定することによってリアルタイムに試料における標的核酸量の測定を提供することを可能にする。
【００５６】
幾つかの実施形態では、ＰＣＲ増幅によって生じた伸長産物を検出するために、標識プローブを使用することができる。本明細書で開示された配列を含む標識プローブを利用する任意のプローブ形式を使用してもよく、例えば、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブ、ｓｕｎｒｉｓｅプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、または当該技術分野で既知であるか、もしくは本明細書の他の場所に記載されている様な分子ビーコンプローブを使用することができる。幾つかの実施形態では、プローブは、約０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．１１μＭ、０．１２μＭ、０．１３μＭ、０．１４μＭ、０．１５μＭ、０．１６μＭ、０．１７μＭ、０．１８μＭ、０．１９μＭ、０．２μＭ、０．２１μＭ、０．２２μＭ、０．２３μＭ、０．２４μＭ、０．２５μＭ、０．２６μＭ、０．２７μＭ、０．２８μＭ、０．２９μＭ、０．３μＭ、０．３１μＭ、０．３２μＭ、０．３３μＭ、０．３４μＭ、０．３５μＭ、０．３６μＭ、０．３７μＭ、０．３８μＭ、０．３９μＭ、０．４μＭ、０．４２μＭ、０．４６μＭ、０．４８μＭ、０．５μＭまたはそれよりも高い濃度、あるいはそれらの間の任意の濃度で使用することができる。幾つかの実施形態では、反応には、約０．１μＭの配列番号３２および／または約０．３μＭの配列番号３３を含めることができる。
【００５７】
ＰＣＲ反応を設定する方法は当業者には周知である。反応混合物は最小限、適切な緩衝液、塩等と組み合わせて鋳型となる核酸（以下に記載した様に、ネガティブコントロールの場合は除く）およびオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブ、ならびに適切な濃度の核酸ポリメラーゼを含む。本明細書で用いられている様に、「核酸ポリメラーゼ」とは、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素をいう。一般的に、該酵素は、標的配列にアニールしたプライマーの３’末端での合成を開始し、合成が終結するまで鋳型に沿って５’方向へ進むことができる。適切な濃度として、本明細書で記載された方法において、この反応を触媒する濃度が含まれる。本明細書で開示された方法において有用な既知のＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００５８】
前記の構成成分に加えて、本発明の方法の反応混合物は、プライマー、プローブおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。
【００５９】
一般的に反応混合物は更に、４種の天然に生じるヌクレオシド塩基、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４種類の異なるｄＮＴＰを含んでよい。本明細書で開示された幾つかの実施形態では、各ｄＮＴＰは典型的には、約１０〜５０００μＭ、一般的に約２０〜１０００μＭ、約１００〜８００μＭ、または約３００〜６００μＭの範囲の量で存在する。
【００６０】
本明細書で開示された実施形態の方法の第１ステップで調製された反応混合物は、更に１価イオン源、２価陽イオン源、および緩衝剤を含む水溶性緩衝液を含む。例えば、塩化カリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の様な、任意の都合の良い１価イオン源を使用することができる。２価の陽イオンは、マグネシウム、マンガン、亜鉛等でよく、ただし該陽イオンは典型的にはマグネシウムである。任意の都合の良いマグネシウム陽イオン源を用いてもよく、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等が含まれる。緩衝液中に存在するマグネシウムの量は、０．５〜１０ｍＭの範囲であってもよく、約１〜約６ｍＭ、または約３〜約５ｍＭの範囲であってもよい。緩衝液中に存在してもよい代表的な緩衝剤または塩として、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等が挙げられ、緩衝剤の量は典型的に約５〜１５０ｍＭ、一般的に約１０〜１００ｍＭ、より一般的には約２０〜５０ｍＭの範囲であり、ある好ましい実施形態では、緩衝剤は約６．０〜９．５ｐＨの範囲（例えば、約６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０または９．５）を提供するのに充分な量で存在してもよい。緩衝液中に存在してもよい他の薬剤として、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のようなキレート剤が挙げられる。幾つかの実施形態では、反応混合物は、ＢＳＡ等を含んでもよい。
【００６１】
反応混合物の調製において、任意の都合の良い順序で様々な構成成分を混ぜ合わせてよい。例えば緩衝液は、プライマー、ポリメラーゼと混ぜ合わせ、次いで鋳型となる核酸と混ぜ合わせてもよく、または様々な構成成分の全てを同時に混ぜ合わせて反応混合物を生成してもよい。
【００６２】
あるいは、市販のプレミックス試薬を製造者の説明書に従って本明細書に開示された方法で利用してもよく、または反応条件を改善するために改変してもよく（例えば、必要に応じて、緩衝液濃度、陽イオン濃度、またはｄＮＴＰ濃度を改変する）、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＯＭＮＩＭＩＸ（登録商標）またはＳＭＡＲＴＭＩＸ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）、ＩＱ＆＃８４８２；Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）またはＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標） ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が含まれる。
【００６３】
反応混合物を調製後、反応混合物はプライマー伸長反応条件（「ポリメラーゼに基づいた核酸増幅産物を提供するのに充分な条件」）、すなわち、ヌクレオチドを追加することによるポリメラーゼを媒介するプライマー伸長を、鋳型鎖を鋳型として用いながらプライマー分子の末端まで可能にする条件にかけてもよい。多くの実施形態では、プライマー伸長反応条件は増幅条件であり、その条件には複数回の反応サイクルが含まれ、ここで各反応サイクルは：（１）変性ステップ、（２）アニーリングステップ、および（３）重合ステップを含む。反応サイクルの数は実施される適用例に応じて変化するが、一般的に少なくとも１５回、より一般的には少なくとも２０回、６０回くらい多いかそれより多くてもよく、異なるサイクルの数は通常約２０〜４０回の範囲でよい。約２５回、一般的には約３０回よりも多く実施される方法では、酵素によるプライマー伸長に適した条件が維持されるように、反応混合物に追加的なポリメラーゼを導入することが都合良い、または望ましい場合がある。
【００６４】
変性ステップは、反応混合物を高温まで加熱し、反応混合物中に存在する任意の２重鎖の核酸、またはハイブリダイズした核酸が解離するのに充分な時間、反応混合物を高温で維持することを含む。変性のために、反応混合物の温度は通常、約８５〜１００℃、一般的には約９０〜９８℃、より一般的には約９３〜９６℃の範囲の温度に上昇させ、約３〜１２０秒の範囲の時間、一般的に約３秒間維持する。
【００６５】
変性に続いて、反応混合物はプライマーが反応混合物中に存在する鋳型となる核酸（もし存在するならば）にアニールするのに充分な条件、および鋳型としてハイブリダイズされる核酸を用いて５’から３’の方向へプライマーが伸長するようにヌクレオチドをプライマーの末端まで重合させるのに充分な条件、すなわち、酵素によるプライマー伸長産物の生成に充分な条件にかけることができる。この実施形態では、アニーリング工程および伸長工程は同一ステップで起こる。これらの条件を達成するために反応混合物の温度を下げるが、その温度は一般的に、最適な効率および特異性を提供するように選択され、それは通常は約５０〜７５℃の範囲、一般的には約５５〜７０℃の範囲、より一般的には約６０〜６８℃の範囲、より具体的には６０℃の周辺でありうる。アニーリング条件は、約１５秒〜３０分、一般的には約２０秒〜５分、または約３０秒〜１分の範囲、または約３０秒の時間、維持してもよい。
【００６６】
このステップは所望により、各ステップの温度および時間の長さを変化させ、最適化した、各々のアニーリングステップおよび伸長ステップの１つを含んでいてもよい。２ステップアニーリングおよび伸長では、アニーリングステップは前記のように進めることが可能である。プライマーを鋳型となる核酸にアニーリングした後、反応混合物は更に、前述のようにヌクレオチドがプライマー末端まで重合することを提供するのに充分な条件にかけることができる。重合化条件を達成するために、反応混合物の温度は典型的には約６５〜７５℃、通常は約６７〜７３℃の範囲に上昇または維持してもよく、および約１５秒〜２０分、一般的には約３０秒〜５分間の範囲の時間維持してもよい。
【００６７】
幾つかの実施形態では、サイクルは、１回のみ実施される９５℃で１５分間の最初の変性を含むことができ、その後に９５℃で１秒間の変性ステップ、および６０℃で２５秒間のアニーリング／伸長ステップが続く。この２ステップサイクルは、複数回（例えば、約４５回）反復してもよい。幾つかの実施形態では、最後の伸長ステップを７２℃で１０分間追加してもよい。
【００６８】
幾つかの実施形態では、サイクルは、９５℃での１５分間の最初の変性ステップを含むことができ、９５℃で１秒間の変性、６０℃で９秒間のアニーリングおよび７２℃で９秒間の伸長のその後複数回（例えば、約４５回）が続く。最後の伸長ステップを７２℃で１０分間追加してもよい。
【００６９】
前記の変性、アニーリングおよび重合のサイクルは、一般的にはサーマルサイクラ−として知られている自動化装置を使用して実施することができる。使用できるサーマルサイクラ−は本明細書の他の場所に記載され、ならびに米国特許第５，６１２，４７３号明細書、同第５，６０２，７５６号明細書、同第５，５３８，８７１号明細書および同第５，４７５，６１０号明細書に記載されており、それらの開示は本明細書に参照によって組み込まれる。
【００７０】
また、本明細書で開示された方法は、標的核酸配列を検出するための非ＰＣＲベースの用途で使用してもよく、このような標的は固相支持体に固定することができる。核酸配列の固相支持体への固定方法は当業界では既知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９５年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）、および製造者によって提供されているプロトコール（例えばメンブレンについては、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ａｍｐ、Ｓｃｈｕｅｌｌ；磁気ビーズについては、Ｄｙｎａｌ；培養用プレートには、Ｃｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ；ビーズアレイプラットホームについては、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；本明細書で開示された実施形態で有用な他の支持体については、ＣＰＧ Ｉｎｃ．）に記載されている。
【００７１】
核酸増幅の分野における当業者であれば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベース増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および分岐ＤＮＡ法（ｂＤＮＡ）（Ｐｅｒｓｉｎｇら、（１９９３年）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ））のような、他の迅速な増幅方法を知っている。本明細書で開示された実施形態の範囲は、ＰＣＲによる増幅法を使用することに限定されず、むしろ本明細書で開示された実施形態の配列を用いて、ＥＳＢＬ抗生物質耐性遺伝子（複数可）（例えば、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子）を検出および／または定量するために有用であり得る任意の迅速な核酸増幅方法、または任意の他の手法を含む。
【００７２】
更に、様々な試薬の正確な量について変更すること、ならびに同様な増幅または検出／定量結果をもたらすＰＣＲの為の条件について、もしくは他の好適な増幅手法（例えば、緩衝液の条件、サイクル回数等）についての変更をすることは当業者には既知であり、均等（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）であると考えられる。一実施形態では、本発明のＱＰＣＲ検出は、試料中の５０コピー未満（好ましくは、２５コピー未満、より好ましくは１５コピー未満、更により好ましくは１０コピー未満）の標的核酸（すなわち、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子を含むＥＳＢＬ核酸）を検出する感度を有する。一実施形態では、非特異的な増幅によるバックグラウンドを減少させることでＰＣＲ反応を改善し、望まれる伸長産物の増幅を増加させる為に、ホットスタートＰＣＲ反応を（例えば、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して）実行する。
【００７３】
（コントロール）
幾つかの実施形態では、本明細書で開示されたＰＣＲまたはＱＰＣＲ反応は、様々なコントロールを含むことができる。そのようなコントロールは「鋳型なし」のネガティブコントロールを含めることができ、ここでは、プライマー、緩衝液、酵素（複数可）および他の必要な試薬（例えば、塩化マグネシウム、ヌクレオチド）に試験試料を添加することなくサイクルは実施される。既知の標的核酸を含むポジティブコントロールも並行して実施することができる。幾つかの実施形態では、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの双方を増幅反応に含めることができる。１回の反応には、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、もしくは試料鋳型のいずれかが含まれてもよく、または、１回の反応に試料鋳型およびポジティブコントロールの双方が含まれてもよい。
【００７４】
また、「鋳型なし」のコントロールに加えて、ネガティブコントロールは反応中に非特異的標的核酸が含まれた増幅反応も含んでよく、またはネガティブコントロールは試験試料を添加しない（核酸抽出から増幅調製までの）試料調製ステップ（例えば、各ステップでは試験試料を使用しないか、またはＣＴＸ−ＭのようなＥＳＢＬを含まないことが知られている試料を使用する）の幾つか、または全てを使用して調製された試料であってもよい。
【００７５】
ポジティブおよびネガティブコントロールは、試験試料がＥＳＢＬの有無で分類されるパラメータの設定に有用である。
【００７６】
例えば、ＱＰＣＲ反応では、ＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）がポジティブコントロール試料中で検出されるサイクル閾値は、試料を「陽性」として分類する閾値を設定するために使用することができ、対象のＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）がネガティブコントロール試料中で検出されるサイクル閾値は、試料を「陰性」として分類する閾値を設定するために使用することができる。１回の反応から得られたＣＴを各々のコントロールに使用することができ、または複製した試料の中央値または平均値を使用することもできる。更に別の実施形態では、古典的な対照値を使用してもよい。ネガティブおよびポジティブコントロールそれぞれの最小検出レベルは、典型的には複数回の反応に渡る平均ＣＴの９５％信頼区間の下端に設定される。この値は、診断アッセイの要求に応じて調節することができる。
【００７７】
好ましくは、ＰＣＲコントロールは、同一の試薬を使用して、同一の増幅反応で、試験試料と同時に実施するべきである。
【００７８】
幾つかの実施形態では、標的増幅産物の同定および／または量を決定することを提供する。プライマー伸長または増幅産物の同定は、（例えば）サザンブロットアッセイを含む標準的な分子的技術を使用して確認することができる。サザンブロットアッセイでは、増幅産物は電気泳動によって分離し、メンブレン（すなわち、ニトロセルロース、ナイロン等）にトランスファーし、オリゴヌクレオチドプローブまたは対象となる核酸配列の任意の部分と反応させる。次に、検出を可能にするためにプローブを修飾する。修飾方法は、放射性標識されたヌクレオチド、または任意数の非放射性標識（例えば、ビオチン）の組み込むものであってよい。サザンブロットアッセイで使用するオリゴヌクレオチドプローブは核酸配列に由来し、したがってＣＴＸ−Ｍ核酸に特異的であり、配列番号５、１０、３１、３２および３３に示されている配列を含むブローブであってよい。サザンブロットアッセイで使用するプローブは、日常的で標準的な方法を使用して調製することができる。例えば、プローブは、当該技術分野において既知の日常的な技術を使用して単離し、クローニングし、および制限することができ、または本明細書で既に記載した化学的合成法を使用して作成することができる。
【００７９】
あるいは、増幅産物はドットブロット分析を使用して検出することができる。ドットブロット分析には、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、以前に記載したもの）をニトロセルロース、またはビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、または非磁性ビーズ等があるが、これらに限定されない）、反応トレイの壁、ストリップ（例えば、ニトロセルロースストリップがあるが、これに限定されない）、試験管のような固相支持体（これらに限定されない）に固着させることが含まれる。標識した増幅産物を含有する試料を添加し、反応させ、結合しなかった試料を除去するために洗浄し、標識して、プローブに結合した増幅産物を当該技術分野において既知の日常的な技術を使用して可視化する。プライマー伸長産物または増幅産物を確認するためのよりストリンジェントな方法は、当該技術分野でよく知られている技術を使用した直接的な配列決定法によるものである。
【００８０】
（キット）
本明細書ではまた、本明細書で記載された方法を実施するために必要な構成要素を含有する「キット」を提供する。このようなキットは、１つ以上のチューブまたはバイアルのような容器を、内部に密接に収容するように区分された運搬容器を含むことができる。容器の１つは、本明細書で開示された少なくとも１種の非標識の、または検出可能な標識されたプライマーまたはプローブを含有してもよい。プライマーまたはプライマー類は凍結乾燥形態、または必要に応じて適切な緩衝液中に存在してもよい。１つ以上の容器は、ＰＣＲ反応で使用する１種以上の酵素または試薬を含有してもよい。これらの酵素は、凍結乾燥状態で、もしくは適切なバッファー中に、それ自体単独で、または既に混合した状態で存在してもよい。
【００８１】
結局キットは、例えば、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド三リン酸、濾紙、ゲル素材、トランスファー素材、オートラジオグラフィー用品のような、本明細書に開示された方法を実施するために必要な全ての追加的な構成要素を含むことができる。
【００８２】
好ましくは、キットは：（ａ）標識されたオリゴヌクレオチド（ここでキットは、例えばＥＭＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子）をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする２種以上の識別可能なオリゴヌクレオチドを含む）；および、（ｂ）高いフィデリティーを有する増幅（例えばＱＰＣＲのようなＰＣＲ反応）において、提供された標識されたオリゴヌクレオチド（複数可）を使用するための説明書、を少なくとも含む。一実施形態では、２種の識別可能なオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜２４から成る群から選択されてもよい。
【００８３】
幾つかの実施形態では、キットは、本明細書で開示された方法で調製された反応混合物に必要な、または含むことが都合がよい、およひ／または望ましい追加的な試薬を含み、そのような試薬には：１種以上のポリメラーゼ；水溶性緩衝液（キットの構成成分として調製されているか、または存在しているかのどちらかであり、該成分の１種以上は予め混合されているか、または全成分が別々に存在してもよい）等、が含まれる。キットの様々な試薬成分は、別々の容器に存在してもよく、または全てが鋳型の核酸と混ぜ合わせるための試薬混合物中に予め混ぜ合わせられていてもよい。
【００８４】
前記の成分に加えて、幾つかの実施形態では、キットはまた、本明細書で開示された方法を実施するための説明書を含むこともできる。これらの説明書は様々な形態でキットに存在してもよく、１種以上の説明書がキット内に存在してもよい。これらの説明書が存在できる１つの形態は、適切な媒体または基板（例えば、キットのパッケージ内、パッケージ挿入体等にある、情報が印刷されている１枚の紙または複数の紙）に印刷された情報として、である。更に別の手段は、情報が記録された、コンピューターで読み取り可能である媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ等である。存在し得る更に別の手段は、離れた場所にある情報にインターネットを通じてアクセスすることで使用できるウェブサイトアドレスである。任意の都合の良い手段がキットに存在してもよい。
【００８５】
以下のそれぞれの参照文献の開示は、本明細書においてその全体を参照によって組み込まれる。
（文献）
１．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ、およびＢｕｓｈ １９９７年、Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｈｙｄｒｏｌｉｚｉｎｇ β−Ｌａｃｔａｍａｓｅｓ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、第４１巻、２２３〜２３２頁
２．Ｗｏｏｄｆｏｒｄら、２００４年、Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ Ｎｅｗ Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ Ｃｌａｓｓ Ａ β−Ｌａｃｔａｍａｓｅ，ＫＰＣ−３，ｉｎ ａ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、第４８巻、４７９３〜４７９９頁
３．Ｙｉｇｉｔら、２００１年、Ｎｏｖｅｌ Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ β−Ｌａｃｔａｍａｓｅ，ＫＰＣ−１，ｆｒｏｍ ａ Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、第４５巻、１１５１〜１１６１頁
４．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第８版、ＰＲ Ｍｕｒｒａｙ、ＥＪ Ｂａｒｏｎ、ＪＨ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、ＭＡ Ｐｆａｌｌｅｒ、およびＲＨ Ｙｏｌｋｅｎ編、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ、２００３年
５．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２００８年、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ、第１８回Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍ１００−Ｓ１８、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗａｙｎｅ、ペンシルバニア州
６．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、およびＤｖｅｋｓｌｅｒ、２００３年、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、５２０頁
７．Ｄｅｖｏｒ，Ｅ．Ｊ．、２００５年、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＬＮＡｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
【００８６】
本明細書で記載され請求される発明は、本明細書に開示される特定の実施形態が本発明の幾つかの態様についての例示として意図したものであるため、これらの実施形態による範囲によって限定されるべきではない。任意の均等な実施は、本発明の範囲内であることを意図する。実際に、本明細書に示され記載された実施形態の改変に加え、様々な改変をすることは、当業者には上の記載から明らかであろう。付記する特許請求の範囲は、その様な改変を包含することを意図する。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００９年２月１９日にＬｉｐｐｅらによって出願された、「基質特異性拡張型β−ラクタマーゼの検出方法および同定方法」と題した米国仮出願第６１／１５３，９５４号明細書の優先権を主張し、その内容は参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表の参照）
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０１０年２月１８日に作成された１５．２ＫＢのサイズでＧＥＮＯＭ．０９７ＶＰＣ．ｔｘｔと題したファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本明細書で開示された実施形態は、分子診断、特に基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）、特にＣＴＸ−Ｍ遺伝子を有する微生物を検出および同定するために使用される診断に関する。
【背景技術】
【０００４】
β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系の薬剤に対する耐性を付与する。これらの酵素は、例えば、ペニシリン、セファロスポリン系、セファマイシン系およびカルバペネム系（エルタペネム）のようなβ−ラクタム系抗生物質のβ−ラクタム環を破壊する。これらの抗生物質はその分子構造内に共通の要素、すなわちβ−ラクタムとして知られる４元素環を有する。ラクタマーゼ酵素はその環を切断して開環し、抗生物質分子の抗バクテリア特性を不活性化する。
【０００５】
基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）はますます、世界中で起っている院内感染の原因となっており、憂慮すべきことに、地域での感染発生の原因にもなっている。（Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、２００８年、ＣＭＩ）。ＥＳＢＬは、オキシイミノ側鎖を備えた基質拡張型セファロスポリンを加水分解するβ−ラクタマーゼである。これらのセファロスポリン系として、セフォタキシム、セフトリアキソンおよびセフタジジムならびにオキシイミノ−モノバクタム系アズトレオナムが挙げられる。この様に、ＥＳＢＬはこれらの抗生物質および関連するオキシイミノ−β−ラクタムに対する耐性を付与する。最もよく知られているＥＳＢＬは、ＴＥＭ−１、ＴＥＭ−２またはＳＨＶ−１遺伝子由来であり、これらのβ−ラクタマーゼの活性部位周辺のアミノ酸配置を変化させる変異を含む。このことによって、これらの酵素による加水分解に対して感受性のあるβ−ラクタム系抗生物質のスペクトルを拡大させている。
【０００６】
ＴＥＭおよびＳＨＶの古くからのバリアント、例えばＴＥＭおよびＳＨＶのようなバリアントは、ヨーロッパの大部分に影響を及ぼした後、実際に急速にアメリカ合衆国中に拡大しているが、一方で新型ＥＳＢＬ、ＣＴＸ−Ｍは南アメリカ、地中海および東ヨーロッパの国々に蔓延している（Ｇｏｖｉｎｄｅｎら、２００７年、ＡＪＢ）。セフォタキシムに対する高い活性からその名前が認められた最新のものは、１９８０年代後半に日本、ヨーロッパおよびアルゼンチンで、最も具体的には１９８９年にドイツで観察された（Ｎａａｓら、２００８年、ＣＭＩ）。それは全ての群の中で最も成功した群であると考えられている（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ＆Ｈｏｉｂｙ ２００４年、ＣＪＭ）。その出現はバクテリア感染を治療するためにセフトリアキソンおよび／またはセフォタキシムの使用が増加した結果と考えられ、その起源はクライベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属の仲間に常在する染色体上の遺伝子に由来することが知られている。ワールドワイドウェブアドレスｌａｈｅｙ．ｏｒｇ／Ｓｔｕｄｉｅｓでアクセス可能であるＬａｈｅｙ Ｃｌｉｎｉｃウェブサイトによると、今日までに、５つの系統群（ＣＴＸ−Ｍ−１、２、８、９および２５）に分類される８５種類を上回るＣＴＸ−Ｍ派生種が報告されている。
【０００７】
ＣＴＸ−Ｍ耐性遺伝子は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）で発見され、プラスミドを介して種間を容易に伝播することができる。ＣＴＸ−Ｍ遺伝子を有するクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等を含む腸内細菌科の生物種は、尿路感染症の主因と考えられている。また、エンテロバクター・クロカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏｃａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、ならびにクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）の様な他の腸内細菌科の生物種も、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子を有することができる。ＣＴＸ−Ｍ耐性株を検出することは、病院において他の患者からの隔離を必要とするため、および感染に対する主な治癒法としてカルバペネム系しか残されていないため、極めて重要である。
【０００８】
最近まで、株の耐性を知る唯一の方法は、手作業で抗微生物感受性試験を実施することであった。感受性試験には、結果を得るための時間量（すなわち４８時間〜９６時間）を含む多くの欠点がある。最初に、試験者は標本からバクテリア株を単離する必要があり、これには最高で４８時間かかる可能性があり；次に生化学的同定に進むが、これに更に１８時間〜２４時間かかり、次いで手作業による抗微生物感受性試験に進むが、これも最高で２４時間がかかる可能性がある。結果を得ることが遅れることに加えて、手作業による試験方法はまた、抗生物質ディスクの保存が不適切なために再現性を欠くこと、不適切な拡散をする抗生物質ディスクもあること、およびこの工程を一般化することが欠如していること等、他の問題も有している。
【０００９】
偽陰性の結果によって、医療実施者が不適切な抗生物質の治療方式（例えば、ＥＳＢＬ感染した個人を第３世代セファロスポリンまたはアズトレオナムで治療すること）を設計してしまう可能性があるので、ＥＳＢＬ検出の特異性および正確性は重大である。このことは、被治癒者に不必要な危険性をもたらし、また医療施設（例えば病院）内における交互的なコンタミネーションの確率も増大させる。ＥＳＢＬを産生する株が提唱される限界点で第３世代または第４世代セファロスポリンを用いても、その全てに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ耐性を示さない場合には、ＥＳＢＬ産生腸内細菌科は最終的に臨床的に耐性を有するという結果となりうるので、臨床検査標準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ））は、それらをペニシリン系、セファロスポリン系およびアズトレオナムに対して耐性を持つと報告することを推奨している（ＣＬＳＩ、Ｍ１００−Ｓ１８）。ＣＴＸ−Ｍ耐性遺伝子を保有する生物にはより新規のセファロスポリン系およびアズトレオナムを加水分解する能力があるため、それらの検出を更に困難にしている。ＣＬＳＩの指針は、初期スクリーニングおよび確認試験の両方で使用した薬剤によっては、ＣＴＸ−Ｍを産生する株の存在を誤診する怖れを提起している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書で開示される実施形態は、ＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ耐性遺伝子）を有するバクテリアを検出および同定するために使用される他の方法と比較して利点を提供し、改善された特異性、より短い期間で結果を入手すること、およびＥＳＢＬを検出するために、例えば、アガロースゲル電気泳動のような追加的な工程を実施する必要性がなくなることが挙げられる（Ｌａｒｔｉｇｕｅら、２００４年、ＦＥＭＳ ＭＬ；Ｐｉｔｏｕｔら、２００４年、ＪＣＭ；Ｐｉｔｏｕｔら、２００７年、ＣＭＩ）。更に、本明細書で開示された実施形態は、本明細書で開示した方法および組成物が、例えば米国特許出願公開第２００７０２４８９５４号明細書に記載されたアッセイの開発時点では知られていなかったＣＴＸ−Ｍ遺伝子の新規に発見されたアイソフォームを検出および同定するために特に設計されているという点で、報告されたＣＴＸ−Ｍを含むＥＳＢＬをその他の検出方法よりも利点を提供する。米国特許第２００７０２４８９５４号明細書で開示された方法は、新規に発見されたＣＴＸ−Ｍアイソフォームの配列と完全には相補性を示さないプライマーを使用するが、このことは特異性を損なうか、または偽陰性の結果もたらす可能性さえある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
抗生物質耐性を付与するＣＴＸ−Ｍ遺伝子を含むＥＳＢＬの迅速で感度の高い検出のための組成物および方法を提供する。本組成物は、試料中のＣＴＸ−Ｍ核酸および／または他のＥＳＢＬ核酸の存在を検出する際に使用するオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブセットを含む。これらのプライマーおよびプローブセットは、増幅方法（例えば、ＰＣＲ、特に定量ＰＣＲ）で使用することができ、試験試料中、特に患者試料中におけるＥＳＢＬ遺伝子の存在を検出するための増幅方法で使用するキットにパッケージ化することができ、それによって該遺伝子が検出されると、その試料がＥＳＢＬを有するバクテリアを含むことを示す。
【００１２】
したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号１〜２４で記載された配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む、それらから本質的に成る、またはそれらから成るオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。本明細書で開示されるプライマーおよび／またはプローブは、標本中における基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）を有する微生物の存在を検出および／または同定する方法で使用することができる。
【００１３】
更に、試料中のＥＳＢＬ遺伝子（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）の検出に有用なキットを提供し、ここで該キットは本明細書で開示されている実施形態による組成物を含む。幾つかの実施形態では、該キットはポリメラーゼに基づく増幅反応（例えば、ＰＣＲまたはＱＰＣＲ）で提供される組成物の使用説明書を含むことができる。
【００１４】
他の実施形態は：基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）の存在を分析する標本から試料を採取して、標準的ＰＣＲ条件下で試料を増幅プライマーセットに接触させるステップであって、ここで前記増幅プライマーセットは少なくとも１対のプライマー対を含み、ここで前記プライマーセットが１つ以上のユニバーサル塩基を有するプライマーを含み、ここで前記プライマー対は基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）内の標的配列に隣接する核酸とハイブリダイズし、および、ここで前記プライマー対によって標的増幅産物が生じるステップ；標的増幅産物を生成するプライマーの伸長のための試薬および条件を提供し；および、標的増幅産物の存在および／または量を決定する、検出方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、本明細書に開示される実施形態によるプライマーおよびプローブの使用に関し、ただし、該プライマーまたは該プローブは配列番号１〜２４で定義された配列のいずれかによる配列を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】４つの群にクラスター化された全てのＣＴＸ−Ｍ遺伝子の系統樹であり、クレブシエラ・オキシトカは外集団である。
【図２】ＣＴＸ−Ｍ−１群（ｃｔｘｍ１−６１６Ｆ／配列番号１）（ｃｔｘｍ１−７４０Ｒ／配列番号２）（ｃｔｘｍ１／２−６５７Ｂ／配列番号５）を検出するための、本明細書に開示されるプライマーの位置を示したシーケンスアラインメントの図である。以前に開示された増幅プライマー（ＣＴＸＭ１−Ｆ３／配列番号４０）（ＣＴＸＭ１−Ｒ２／配列番号４１）も示されている。示されている参照配列は、全てのＣＴＸ−Ｍ−１配列のアラインメントによるコンセンサス配列である。示されているコンセンサス配列は、配列番号４８に対応する。
【図３】ＣＴＸ−Ｍ−２群（ｃｔｘｍ２−６０９Ｆ／配列番号３）（ｃｔｘｍ２−７７６Ｒ／配列番号４）（ｃｔｘｍ１／２−６５７Ｂ／配列番号５）を検出するための、本明細書に開示されるプライマーの位置を示したシーケンスアラインメントの図である。以前に開示された増幅プライマー（ＴＯＨＯ１−２Ｆ／配列番号４２）（ＴＯＨＯ１−１Ｒ／配列番号４３）も示されている。示されている参照配列は、全てのＣＴＸ−Ｍ−２配列のアラインメントからのコンセンサス配列である。示されているコンセンサス配列は、配列番号４９に対応する。
【図４】ＣＴＸ−Ｍ−８群（ｃｔｘｍ８−１１９Ｒ／配列番号７）（ｃｔｘｍ８−７Ｆ／配列番号６）（ｃｔｘｍ８／９−４２Ｂ／配列番号１０）を検出するための、本明細書に開示されるプライマーの位置を示したシーケンスアラインメントの図である。以前に開示された増幅プライマー（ＣＴＸＭ８２５Ｆ／配列番号４４）（ＣＴＸＭ８２５／配列番号４５）も示されている。示されている参照配列は、全てのＣＴＸ−Ｍ−８配列のアラインメントによるコンセンサス配列である。示されているコンセンサス配列は、配列番号５０に対応する。
【図５】ＣＴＸ−Ｍ−９群（ｃｔｘｍ９−７Ｆ／配列番号８）（ｃｔｘｍ９−１１７Ｒ／配列番号９）（ｃｔｘｍ８／９−４２Ｂ／配列番号１０）を検出するための、本明細書に開示されるプライマーの位置を示したシーケンスアラインメントの図である。以前に開示された増幅プライマー（ＣＴＸＭ９１４Ｆ／配列番号４６）（ＣＴＸＭ９１４Ｒ／配列番号４７）も示されている。示されている参照配列は、全てのＣＴＸ−Ｍ−９配列のアラインメントによるコンセンサス配列である。示されているコンセンサス配列は、配列番号５１に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で開示されている実施形態は、拡張型または基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を有する微生物の効率的で特異的な検出および／または同定のための組成物および方法に関する。
【００１８】
本明細書では、用語「拡張型または基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ」または「ＥＳＢＬ」とは、ペニシリン系、第１世代、第２世代および第３世代セファロスポリン系ならびにアズトレオナム（しかし、セファマイシン系とカルバペネム系は除く）に対して、これらの抗生物質を加水分解することによってバクテリア耐性を付与することができ、クラブラン酸等のβ−ラクタマーゼ阻害剤によって阻害されるラクタマーゼであるβ−ラクタマーゼを意味する。当業者であれば、用語「ＥＳＢＬ」は、ワールドワイドウェブアドレス、ｌａｈｅｙ．ｏｒｇ／Ｓｔｕｄｉｅｓにおいて、Ｌａｈｅｙ Ｃｌｉｎｉｃウェブサイトに列挙されている全てのＥＳＢＬを含み、しかしこれに限定されることなく、現在知られている、または将来において発見される全ての基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを包含することは認識するであろう。したがって、ＥＳＢＬという用語は、ＳＨＶ型（すなわち、スルフヒドリル変形型（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｙｐｅ））、ＴＥＭ型、ＴＯＨＯ型およびＣＴＸ−Ｍ型のＥＳＢＬを包含する。
【００１９】
幾つかの実施形態では、組成物およびアッセイは、ＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼを検出および同定するために使用される。ＣＴＸ−Ｍ酵素は、以前に詳細に概略が述べられている（Ｂｏｎｎｅｔ，Ｒ．ら（２００４年）、Ｇｒｏｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅｓ：ｔｈｅ ＣＴＸ−Ｍ ｅｎｚｙｍｅｓ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．第４８巻：１〜１４頁）。幾つかの例示的で非限定的なＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼの特性は以下の通りである：セフォタキシムのＭＩＣは耐性範囲（６４μｇ／ｍｌよりも大きい）内であり、一方、セフタジジムのＭＩＣは通常は明らかに感受性のある範囲（２〜８μｇ／ｍｌ）内である。しかし、幾つかのＣＴＸ−Ｍ型ＥＳＢＬは実際にセフタジジムを加水分解し、セファロスポリン（ＭＩＣは高く、２５６μｇ／ｍｌもある）に対する耐性を寄与することができる。アズトレオナムのＭＩＣは可変的である。ＣＴＸ−Ｍ型β−ラクタマーゼはセフェピムを加水分解するが、セフェピムのＭＩＣは他のＥＳＢＬ型を産生するバクテリアにおいて観察されるものよりも高い。タゾバクタムは、ＣＴＸ−Ｍ型β−ラクタマーゼに対してクラブラン酸よりも約１０倍高い阻害活性を示す。バクテリアの中には、ＣＴＸ−Ｍ型ＥＳＢＬおよびＳＨＶ型ＥＳＢＬの両方、またはＣＴＸ−Ｍ型ＥＳＢＬおよびＡｍｐＣ型β−ラクタマーゼの両方を有する可能性があり、このことは抗生物質耐性の表現型を変化させる可能性がある。
【００２０】
本明細書で開示した実施形態は、ＣＴＸ−Ｍ−１〜ＣＴＸ−Ｍ−８２として同定された１種以上のＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼを含み、表１に列挙されたバクテリア株で発見されたＣＴＸ−Ｍ型β−ラクタマーゼの幾つかまたは全てを含む、ＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼの迅速な検出および／または同定を可能にする。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
【表３】
【００２４】
（標本および試料）
本明細書で開示した実施形態は、標本中のＥＳＢＬを検出および／または同定するために使用することができる。本明細書で使用される様に、用語「標本（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）」とは、哺乳類のサンプル、具体的にはヒトのサンプルを含む実質的に任意の生物種の体液（血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗、腹膜液、胸膜液、滲出液、腹水、膿性分泌物、洗浄液、排泄液、ブラシ細胞診標本、生検組織、移植片医学装置、感染したカテーテル、膿、バイオフィルムおよび精液を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない１つまたは任意数の供給源からの臨床的標本または試料、および本発明での使用が見出されている環境試料（空気試料、農業試料、水試料および土壌試料を含むが、これらに限定されない）を表す。更に、試料は食品加工から採取することができ、投入試料（例えば、穀粒、ミルクまたは動物の死体）、加工の中間工程の試料、ならびに消費者に提供される最終食品を含むことができる。幾つかの実施形態では、本明細書で記載される方法およびアッセイは、標本を更に操作することなく、試料または臨床標本に直接実施することができる。幾つかの実施形態では、標本を操作する（例えば培養し、核酸を抽出するために処理し、もしくは精製し、伸長する）か、または他の操作を行う。
【００２５】
（プライマーおよびプローブ）
幾つかの実施形態では、標本または試料は、増幅プライマーセットと接触させることができる。幾つかの実施形態では、標本または試料はプローブと接触させることができる。本明細書で用いられている様に、用語「プライマー」および「プローブ」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸が含まれるが、これらに限定されない。用語「プライマー」および「プローブ」は、ヌクレオチドだけではなくヌクレオチドアナログである分子を包含する。本明細書で用いられる様に、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−もしくはＣ−グリコシドである任意の他種のポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を含有するその他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇ．からＮＥＵＧＥＮＥ（登録商標）ポリマーとして市販されている）、ならびに、配列の中に例えばＤＮＡやＲＮＡで見出されている様な塩基対および塩基スタッキングを可能にする核酸塩基を含むことを条件とした他の合成された配列特異的核酸ポリマーを含む他のポリマーの一般名である。
【００２６】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示される「プライマー」または「プローブ」は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含有することができる。「ロックド核酸（ＬＮＡ）」とは、リボースの２位の酸素が４位の炭素と結合しているメチレン架橋を含有するリボヌクレオチドである（図２７参照）。Ｂｒａａｓｃｈ Ｄ．Ａ．およびＣｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．（２００１年）、Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）；ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ．、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、第８巻、１〜７頁、は、ＬＮＡの概説を提供している。この論文は、本明細書においてその全体を参照により明示的に組み込まれる。ＬＮＡは、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡから市販されている。また、ホスホロチオエートは当業者には知られており、例えば、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから注文できる。したがって、幾つかの実施形態では、本明細書で開示される「プライマー」または「プローブ」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多いＬＮＡを含むことができる。
【００２７】
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドという用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホラミデート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、２本鎖および１本鎖ＤＮＡ、ならびに２本鎖および１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリッドを含む。また、この用語は既知の修飾型も含み、例えば当該技術分野で既知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に生じる１つ以上のヌクレオチドのアナログによる置換、ヌクレオチド間の修飾［例えば、荷電していない結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメート等）、負に荷電した結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）および正に荷電した結合を有するもの（例えば、アミノアルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等を含む）のようなペンダント部分構造を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラーレン等）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を有するもの（例えば、α−アノマー核酸等）］、ならびに非修飾型のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２８】
本明細書で用いられる様に、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」とは、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基を含有する部分構造を含むことが出来ることが理解されるであろう。そのような修飾には、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他の複素環が含まれる。また、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖の部分構造に修飾を含み、例えば、１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置換されているか、またはエーテル、アミン等として官能化されていてもよい。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する他の修飾として、それぞれの相補的ピリミジンもしくはプリンと水素結合を形成するプリンもしくはピリミジン塩基上の官能基を再配置、付加、置換、そうでなければ変化させることが挙げられる。結果としてもたらされる修飾されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、他のそのような修飾ヌクレオチド単位とは塩基対を形成することができるが、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとは形成することができない。例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）は修飾されて、イソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成することができる。そのような修飾によって、もはやシトシンとの標準的な塩基対を効率よく形成しないヌクレオシド塩基がもたらされる。しかしながら、シトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミジン）を修飾してイソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン）を形成すると、結果としてグアノシンと効率よく塩基対を形成しないが、イソグアノシンと塩基対を形成できる修飾ヌクレオチドがもたらされる。イソシトシンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から入手可能であり；イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３２巻、１０４８９〜１０４９６頁、およびその論文で引用された参考文献に記載された方法によって調製することができ；２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンはＴｏｒら（１９９３年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１５巻、４４６１〜４４６７頁、およびそこに引用された参考文献に記載された方法によって調製することができ；イソグアニンヌクレオチドは上記のＳｗｉｔｚｅｒら（１９９３年）、およびＭａｎｔｓｃｈら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４巻、５５９３〜５６０１頁、またはＣｏｌｌｉｎｓらによって米国特許第５，７８０，６１０号明細書に記載された方法を使用して調製することができる。κおよびπと表される非天然塩基対は、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ、第３４３巻、３３〜３７頁に記載された２，６−ジアミノピリミジンおよびその相補体（１−メチルピラゾロ［４，３］−ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）の合成方法によって合成してもよい。特有の塩基対を形成する他のそのような修飾ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈら（１９９２年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１４巻、３６７５〜３６８３頁、および上記のＳｗｉｔｚｅｒらに記載されているか、または当業者には明らかである。
【００２９】
好ましくは、増幅プライマーセットは、ユニバーサル塩基を含有する少なくとも１個、２個、３個または４個またはそれよりも多いプライマーおよび／またはプローブを含む。本明細書で用いられる様に、用語「ユニバーサル塩基」とは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択される１つよりも多いヌクレオチドとハイブリダイズすることができるヌクレオチドアナログを言う。幾つかの実施形態では、ユニバーサル塩基はデオキシイノシン、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、６−ニトロインドール、５−ニトロインドールから成る群から選択してもよい。好ましくは、ユニバーサル塩基はデオキシイノシンである。幾つかの実施形態では、増幅プライマーセットおよび本明細書で開示したプローブは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれよりも多いユニバーサル塩基を有する少なくとも１種のプライマーおよび／またはプローブが含まれる。
【００３０】
プライマーおよび／またはプローブの長さは、好ましくは１０〜４５ヌクレオチド長である。例えば、プライマーおよびまたはプローブの長さは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、またはそれよりも長いヌクレオチド長であってよい。プライマーおよび／またはプローブは、例えば、固相支持体に結合した形態、液体および凍結乾燥体を含む任意の適切な形態で提供することができる。幾つかの実施形態では、プライマーおよび／またはプローブは標的核酸配列に対して、オリゴヌクレオチドの全体長に渡ってハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。そのような配列は、互いに関して「完全に相補的である」ということができる。オリゴヌクレオチドが本明細書の核酸配列に関して「実質的に相補的である」という場合、その２つの配列は完全に相補的であるか、またはこれらはハイブリダイゼーションする際にミスマッチを形成してもよいが、以下に議論されるようなストリンジェント条件下もしくは標準的ＰＣＲ条件下でハイブリダイズする能力を保持している。本明細書で用いられる様に、用語「標準的ＰＣＲ条件」には、例えば、本明細書に開示される任意のＰＣＲ条件、または例えば、ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｐ．ＱｕｉｒｋｅおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、（著作権）２００１年、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂ．Ｗｈｉｔｅ編、（著作権）１９９３年、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ．に記載されるような、当該技術分野において既知のＰＣＲ条件が含まれる。
【００３１】
本明細書で用いられる様に、「実質的に相補的である」という用語は、２つの核酸間（例えば、捕捉プローブと標的配列との相補的領域）の相補性、および／または捕捉プローブのリンカー配列と競合的核酸の相補的領域との間の相補性を意味する。相補性は完全である必要はなく、２種類の核酸間に塩基対のミスマッチは任意数存在してもよい。しかしながら、変異の数が余りにも多いために、ハイブリダイゼーション条件の中で最もストリンジェントでない条件でさえもハイブリダイゼーションが起こらない場合、その配列は実質的に相補的な配列ではない。本明細書において２つの配列が「実質的に相補的である」というとき、その配列は選択された反応条件下でハイブリダイズするのに充分に互いに相補的であることを意味する。特異性を実現するために充分な核酸の相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとの関係は当該技術分野において既知であり、配列のアイデンティティー、融点、およびハイブリダイゼーション条件に関しては、以下に更に記載されている。したがって、実質的に相補的な配列は、本明細書で記載される任意の検出方法で使用することができる。ハイブリダイゼーション条件が、例えば、標的配列と非標的配列とを識別できるのに充分である限り、そのようなプローブは、例えば完全に相補的でもよく、または１個から多数のミスマッチを含有していてもよい。したがって、実質的に相補的な配列は、参照配列と比較して、アイデンティティー（％）が１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８５、８０、７５またはそれ未満、またはその間の任意の数の範囲である配列を意味することができる。
【００３２】
本明細書で定義される様に、「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェント条件」とは、この様に識別される：（１）洗浄するために、低イオン強度および高温（例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）を用い；（２）ハイブリダイゼーションの際に、例えばホルムアミド、例えば４２℃で５０％（体積／体積）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ６．５と、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとを混和したものの様な変性剤を用い、または（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを用い、５５℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、および４２℃で５０％ホルムアミド中で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣを含む高ストリンジェントな洗浄を行う。
【００３３】
「中程度のストリンジェント条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年によって記載されている様に定義することができ、前述したものより低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液で、３７℃で一晩インキュベートし、続いてフィルターを約３７〜５０℃で、１×ＳＳＣ中で洗浄することである。当業者であれば、プローブ長等の要素に適合するために、必要に応じて温度、イオン強度等をどの様に調節できるかを認識するであろう。
【００３４】
（プライマー対）
幾つかの実施形態では、増幅プライマーセットは１以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のプライマー対を含む。本明細書で用いられる様に、用語「プライマー対」とは、標的核酸（例えば、ＥＳＢＬをコードする核酸、例えば、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子またはそれらの断片等）の反対側の鎖に個々にハイブリダイズする２個のプライマーを意味することができ、それぞれのプライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で３’末端が伸長して標的増幅産物を形成することができる。プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むことができる。
【００３５】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法は、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１組の増幅プライマーを含むプライマー対を含む。例えば、本明細書で開示される組成物および方法は、表１に列挙されるバクテリア由来のＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼを検出および／または同定するために使用することができる。幾つかの実施形態では、組成物および方法は、表１に列挙された全てのバクテリア由来のＣＴＸ−Ｍ β−ラクタマーゼを集合的に検出および同定することを可能にする複数の増幅プライマーを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５から選択される少なくとも２つのＣＴＸ−Ｍ群由来のＣＴＸ−Ｍ核酸の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記ＣＴＸ−Ｍ核酸を増幅するプライマー対を含む。ＣＴＸ−Ｍ−１の検出および同定に有用なプライマーは、例えば、配列番号１、２、５、１１、１２、１３、１４、３２および３３、またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド、あるいは、配列番号１、２、５、１１、１２、１３、１４、３２および３３、またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【００３６】
ＣＴＸ−Ｍ−２の検出および同定に有用なプライマーとして、配列番号３、４、５、１５、１６、１７、１８、３２および３３またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続した核酸を有するオリゴヌクレオチド、あるいは、配列番号３、４、５、１５、１６、１７、１８、３２および３３、またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＣＴＸ−Ｍ−８の検出および同定に有用なプライマーとして、配列番号６、７、１０、１９、２０、２１、２２、２７、２８および３１、またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続した核酸を有するオリゴヌクレオチド、あるいは、配列番号３、４、５、１５、１６、１７、１８、３２および３３、またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＣＴＸ−Ｍ−９の検出および同定に有用なプライマーとして、配列番号８、９、１０、２３、２４、２５、２６、２９、３０および３１、またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続した核酸を有するオリゴヌクレオチド、あるいは、配列番号８、９、５、１０、２３、２４、２５、２６、２９、３０および３１、またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。当業者であれば、幾つかの実施形態は、本明細書で開示されたプライマー対の任意の組み合わせが含まれること、例えば、配列番号１および２、配列番号３および４、配列番号６および７、配列番号８および９、配列番号２７および２８、ならびに配列番号２９および３０のプライマー対の組み合わせが含まれることを理解するであろう。幾つかの実施形態では、組成物および方法は、配列番号１〜１０から成る、これらから本質的に成る、またはこれらを含むプライマーおよびプローブ、あるいは、配列番号１〜１０の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の連続したヌクレオチドを有するプライマーおよびプローブ、あるいは配列番号１〜１０またはそれらの相補体に実質的に相補的であり、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするプライマーおよびプローブを含む。幾つかの実施形態では、組成物および方法は、配列番号１〜５および２７〜３１から成る、これらから本質的に成る、またはこれらを含むプライマーおよびプローブ、あるいは、配列番号１〜５および２７〜３１の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の連続したヌクレオチドを有するプライマーおよびプローブ、あるいは配列番号１〜５および２７〜３１またはそれらの相補体に実質的に相補的であり、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするプライマーおよびプローブを含む。
【００３７】
幾つかの実施形態では、組成物および方法は、例えばＰＣＴ公開第０８／１２４６７０号に開示されたように、例えばカルバペネマーゼ遺伝子の検出用を含む、追加的な配列の検出および／または同定のためのプライマーおよび／またはプローブを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示した組成物および方法は、配列番号３４および３５またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを有するプライマーを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、配列番号３７および３８またはそれらの相補体の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを有するプライマーを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、配列番号３４および３５の配列またはそれらの相補体の配列に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするプライマーを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、配列番号３７および３８の配列またはそれらの相補体に実質的に相補的で、および／またはストリンジェント条件下でハイブリダイズするプライマーを含む。
【００３８】
本明細書で開示された幾つかの実施形態では、組成物および／または方法は１つ以上のプライマーを含むことができ、ここで該プライマーは配列番号１〜２２の配列、またはそれらの相補体の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれよりも多く連続した核酸を含む。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
（プローブ）
幾つかの実施形態では、プローブは検出可能な標識を含むことができる。対象物に対する標識として、直接的に検出可能および間接的に検出可能な放射性ラベル、または蛍光色素のような非放射性標識が挙げられる。直接的に検出可能な標識とは、１種以上の追加的な化学物質と相互作用させることなく、直接的に検出可能なシグナルを提供する標識である。直接的に検出可能な標識の例として、蛍光標識が挙げられる。間接的に検出可能な標識とは、１種以上の追加的な要素と相互作用して検出可能なシグナルを提供する標識である。この後者の実施形態では、標識は共同して作用して検出可能なシグナルを提供する２つ以上の化学物質を含むシグナル生成系の要素である。間接的に検出可能な標識の例として、ビオチンまたはジゴキシゲニンが挙げられ、それらは蛍光色素またはアルカリホスファターゼのような酵素と組み合わされた適切な抗体によって検出することができる。多くの好ましい実施形態では、標識は直接的に検出可能な標識である。特定の対象物に対する直接的に検出可能な標識として、蛍光標識が挙げられる。本明細書で開示された実施形態での用途が見出される蛍光標識は、蛍光色素部分構造を含有する。対象物に対する具体的な蛍光色素として：キサンテン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２−［（エチルアミノ）−３−（エチルイミノ）−２−７−ジメチル−３Ｈ−キサンテン−９−イル］安息香酸エチルエステルモノヒドロクロリド（Ｒ６Ｇ）（約５００〜５６０ｎｍの範囲の波長で応答照射を放射する）、１，１，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドジカルボシアニンイオダイド（ＨＩＤＣ）（約６００〜６６０ｎｍの範囲の波長で応答照射を放射する）、６−カルボキシフルオレセイン（一般的に、略語ＦＡＭおよびＦとして知られている）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）およびローダミン１１０のようなフルオレセインおよびローダミン色素；シアニン色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７色素）；クマリン（例えば、ウンベリフェロン）；ベンジミド色素（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）；フェナントリジン色素（例えば、テキサスレッド）；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素（例えば、Ｃｙ３（約５４０から５８０ｎｍの範囲の波長で応答照射を放射する）、Ｃｙ５（約６４０から６８０ｎｍの範囲の波長で応答照射を放射する）等のようなシアニン色素）；ＢＯＤＩＰＹ色素およびキノリン色素、が挙げられる。対象物に対する特定の蛍光色素としては：ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、Ｒ１１０、エオジン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、ＨＩＤＣ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リサミン、ＲＯＸ、ナフトフルオレセイン、テキサスレッド、ナフトフルオレセイン、ＳＹＢＲグリーン、Ｃｙ３およびＣｙ５等が挙げられる。
【００４２】
好ましい実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、分子ビーコンプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、またはＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブを含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物および方法は、１つ以上の分子ビーコンプローブを含み、ただし、該プローブは配列番号５、１０、３１、３２または３３の配列、例えば、配列番号２５、２６、２７、２８、３２および／または３３のいずれか１つで示したようなプローブを含む。
【００４３】
ｃｃａｇｃｇＴＡＴＧＧＹＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧｃｇｃｔｇｇ（配列番号５）
ｃｇａｇｇｃＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＲＡＡＡＡＧＣＡＧｇｃｃｔｃｇ（配列番号１０）
ｃｇｃｇａｔｃＡＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡｇａｔｃｇｃｇ（配列番号３６）
ｃｇｃｇａｔｃＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＣＧｇａｔｃｇｃｇ（配列番号３９）
ｃｇｇｃｇａｔＡＡＧＣＡＲＡＧＴＧＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＧａｔｃｇｃｃｇ（配列番号３１）
ｃＣａＣｃａＡｃｇａＴａｔｃｇＣｇ（配列番号３２）
ＴＧＧＹＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧＴ（配列番号３３）
【００４４】
幾つかの実施形態では、例えば配列番号２５〜２８および３２〜３３といったプローブは、ＦＡＭ蛍光色素消光分子およびＤＡＢＣＹＬ消光剤を使用して標識される。幾つかの実施形態では、プローブはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブまたはＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブである。幾つかの実施形態では、１つ以上の増幅プライマーは、例えばＳＹＢＲグリーン等のような蛍光部分構造で標識してもよい。
【００４５】
本明細書で開示されたプライマーおよびプローブ配列は、５’または３’末端に更にヌクレオチドを含めるために改変してもよい。同様にして、幾つかの実施形態では、プライマーおよびプローブ配列は、配列内に置換されたヌクレオチドを有することによって改変してもよい。プライマーおよびプローブ配列は、それぞれの標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするのに充分な相補性を含有しなければならないことが認識される。このようにして、少なくとも１、２、３、４、または約５個までのヌクレオチドが置換されてもよい。
【００４６】
配列番号３２および３３はいずれも、ＣＴＸ−Ｍ群１および２に特異的である。幾つかの実施形態では、プローブ配列番号３２は５個のロックド核酸（ＬＮＡ）を含有することができる。幾つかの実施形態では、配列番号３３はＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである。幾つかの実施形態では、配列番号３３は１つ以上のディジェネレート塩基を含有し、ＣＴＸ−Ｍ１およびＣＴＸ−Ｍ２の双方に対して（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下および／または標準的なＰＣＲ条件下で）特異的にアニールする。
【００４７】
本明細書で開示された実施形態のプライマーの作成に使用できる化学合成方法として、Ｎａｒａｎｇら（１９７９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第６８巻、９０頁に記載されたホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら（１９７９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第６８巻、１０９頁によって開示されたホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２２巻、１８５９頁によって開示されたジエチルホスホラミデート法、および米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載された固相支持体法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
また、本明細書で開示された実施形態の合成オリゴヌクレオチドプライマーを調製するための自動化オリゴヌクレオチド合成機の使用も意図される。
【００４９】
（アニーリングおよび特異的結合）
幾つかの実施形態では、標的核酸配列へのプライマーおよび／またはプローブの結合またはアニーリングは、ハイブリダイゼーションによって達成される。当業者であれば、特異的ハイブリダイゼーションは、標的または参照核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的である配列を選択することによって達成されることは理解するであろう。これは、オリゴヌクレオチド標的核酸配列がオリゴヌクレオチド配列の完全長に渡る塩基対を含む。そのような配列は、互いに関して「完全に相補的」であるということができる。オリゴヌクレオチドが本明細書の核酸配列に関して「実質的に相補的である」という場合、その２つの配列は完全に相補的であるか、またはこれらはハイブリダイゼーションの際にミスマッチを形成してもよいが、しかし以下に議論されるようにストリンジェント条件下もしくは標準的ＰＣＲ条件下でハイブリダイズする能力を保持している。
【００５０】
幾つかの実施形態では、試料または標本は、増幅プライマーセットおよびプローブと接触させる。好ましくは、増幅プライマーおよびプローブは単一の一連の条件下（すなわち、以下に議論される標準的ＰＣＲ条件を含むストリンジェント条件下）で標的核酸にハイブリダイズする。本明細書で用いられる様に、プローブの長さおよび／または核酸組成に応じて、用語「ストリンジェント条件」、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は変化してもよく（例えば、塩濃度は約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満）、ハイブリダイゼーション温度は、例えば、０℃の低さから２２℃を上回るまで、約３０℃を上回るまで、および（この場合が最も多いが）約３７℃を上回る範囲でよい。断片が長くなればなるほど、特異的なハイブリダイゼーションのために高いハイブリダイゼーション温度を必要とする可能性がある。幾つかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼすので、パラメータの組み合わせることは単一の要素の絶対的な尺度を設けることよりも重要である。したがって、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例として以下のいずれか、または両方の条件をいうことができる：ａ）約４５℃で６×ＳＳＣ、次いで６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで１回以上洗浄すること、およびｂ）４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡで、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後洗浄すること。幾つかの実施形態では、用語「ストリンジェント条件」とは、標準的ＰＣＲ条件を意味することができる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、試料または標本を増幅プライマーセットと標準的ＰＣＲ条件下で接触させる。臨床微生物学へ応用される標準的ＰＣＲ条件を含むＰＣＲ技術の概説については、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ；Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｂｏｓｔｏｎによって出版されたＳｉｎｇｌｅｔｏｎ Ｐ．著、ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）；Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第６７巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ（１９９７年）；および「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」１９９１年〜１９９５年（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照。「ＰＣＲ条件」の非限定的な例として、本明細書で引用された参考文献で開示されている条件が挙げられ、例えばアニーリング温度が７２℃で、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；またはアニーリング温度が５９℃で、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍｇ ＢＳＡ、４％トレハロース；またはアニーリング温度が５５℃で、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２等がある。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示された方法には、ＰＣＲ（例えば、ＱＰＣＲ）に基づいた、ＣＴＸ−Ｍ核酸のようなＥＳＢＬの、本明細書で記載されたプライマーおよびプローブを使用した増幅ならびに検出法が含まれる。様々な実施形態では、本明細書で開示した方法は、ＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）の存在を、生理学的範囲内で存在するバクテリア濃度（すなわち、バクテリアに感染した対象から収集した試料中のバクテリア濃度）で検出することができる。この様にして、ＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）の存在を検出するために、バクテリア集団を単離、濃縮、または拡張（例えば、培養）する必要なく、試料を直接的にスクリーニングすることができる。様々な実施形態では、本明細書で開示した方法は、バクテリア濃度が約１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、約１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、約１×１０５ＣＦＵ／ｍｌまたは約１×１０６ＣＦＵ／ｍｌである試料からＥＳＢＬの存在を検出することができる。
【００５３】
当該技術分野において、種々のＰＣＲまたはＱＰＣＲプロトコールは多数知られており、本明細書で以下に例示されており、およびそれらは試料中のＣＴＸ−Ｍを含むＥＳＢＬを検出するために本明細書に記載された組成物を用いて使用するために直接的に適用するか、または適合させることができる。
【００５４】
一般的に、ＰＣＲでは、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマー対との反応によって増幅する。プライマー（複数可）は、標的核酸の相補領域にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼはプライマー（複数可）を伸長して標的配列を増幅する。ポリメラーゼに基づいた核酸増幅産物を提供するのに充分な条件下では、あるサイズの核酸断片が反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）の優位を占める。増幅サイクルを反復して、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増加させる。該反応は、ＰＣＲ用に通常使用される任意のサーモサイクラーで実施することができる。しかしながら、リアルタイム蛍光測定能を有するサイクラ−が好ましく、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（登録商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）およびＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡである。
【００５５】
幾つかの実施形態は、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲとも言われる）を含む方法を提供する。ＱＰＣＲは、定量的な測定値を提供し、また時間およびコンタミネーションを減少させるという利点も提供する。本明細書で用いられる様に、「定量ＰＣＲ」（または「リアルタイムＰＣＲ」）とは、反応産物を繰り返してサンプリングする必要なく、増幅を起こしながらＰＣＲ増幅の進行状況を直接的にモニターすることをいう。ＱＰＣＲにおいては、反応産物が生成してバックグラウンドレベルと比較してシグナルが増加することを手掛かりに追跡されるため（ただし、反応がプラトーに達する前）、反応産物はシグナル機構（例えば、蛍光）を通じてモニターすることができる。蛍光の検出可能レベルまたは「閾値」レベルを達成する為に必要なサイクル数（本明細書では、サイクル閾値または「ＣＴ」と表される）は、ＰＣＲ工程の開始における増幅可能な標的の濃度によって直接的に変化し、シグナル強度を測定することによってリアルタイムに試料における標的核酸量の測定を提供することを可能にする。
【００５６】
幾つかの実施形態では、ＰＣＲ増幅によって生じた伸長産物を検出するために、標識プローブを使用することができる。本明細書で開示された配列を含む標識プローブを利用する任意のプローブ形式を使用してもよく、例えば、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブ、ｓｕｎｒｉｓｅプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、または当該技術分野で既知であるか、もしくは本明細書の他の場所に記載されている様な分子ビーコンプローブを使用することができる。幾つかの実施形態では、プローブは、約０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．１１μＭ、０．１２μＭ、０．１３μＭ、０．１４μＭ、０．１５μＭ、０．１６μＭ、０．１７μＭ、０．１８μＭ、０．１９μＭ、０．２μＭ、０．２１μＭ、０．２２μＭ、０．２３μＭ、０．２４μＭ、０．２５μＭ、０．２６μＭ、０．２７μＭ、０．２８μＭ、０．２９μＭ、０．３μＭ、０．３１μＭ、０．３２μＭ、０．３３μＭ、０．３４μＭ、０．３５μＭ、０．３６μＭ、０．３７μＭ、０．３８μＭ、０．３９μＭ、０．４μＭ、０．４２μＭ、０．４６μＭ、０．４８μＭ、０．５μＭまたはそれよりも高い濃度、あるいはそれらの間の任意の濃度で使用することができる。幾つかの実施形態では、反応には、約０．１μＭの配列番号３２および／または約０．３μＭの配列番号３３を含めることができる。
【００５７】
ＰＣＲ反応を設定する方法は当業者には周知である。反応混合物は最小限、適切な緩衝液、塩等と組み合わせて鋳型となる核酸（以下に記載した様に、ネガティブコントロールの場合は除く）およびオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブ、ならびに適切な濃度の核酸ポリメラーゼを含む。本明細書で用いられている様に、「核酸ポリメラーゼ」とは、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素をいう。一般的に、該酵素は、標的配列にアニールしたプライマーの３’末端での合成を開始し、合成が終結するまで鋳型に沿って５’方向へ進むことができる。適切な濃度として、本明細書で記載された方法において、この反応を触媒する濃度が含まれる。本明細書で開示された方法において有用な既知のＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００５８】
前記の構成成分に加えて、本発明の方法の反応混合物は、プライマー、プローブおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。
【００５９】
一般的に反応混合物は更に、４種の天然に生じるヌクレオシド塩基、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４種類の異なるｄＮＴＰを含んでよい。本明細書で開示された幾つかの実施形態では、各ｄＮＴＰは典型的には、約１０〜５０００μＭ、一般的に約２０〜１０００μＭ、約１００〜８００μＭ、または約３００〜６００μＭの範囲の量で存在する。
【００６０】
本明細書で開示された実施形態の方法の第１ステップで調製された反応混合物は、更に１価イオン源、２価陽イオン源、および緩衝剤を含む水溶性緩衝液を含む。例えば、塩化カリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の様な、任意の都合の良い１価イオン源を使用することができる。２価の陽イオンは、マグネシウム、マンガン、亜鉛等でよく、ただし該陽イオンは典型的にはマグネシウムである。任意の都合の良いマグネシウム陽イオン源を用いてもよく、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等が含まれる。緩衝液中に存在するマグネシウムの量は、０．５〜１０ｍＭの範囲であってもよく、約１〜約６ｍＭ、または約３〜約５ｍＭの範囲であってもよい。緩衝液中に存在してもよい代表的な緩衝剤または塩として、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等が挙げられ、緩衝剤の量は典型的に約５〜１５０ｍＭ、一般的に約１０〜１００ｍＭ、より一般的には約２０〜５０ｍＭの範囲であり、ある好ましい実施形態では、緩衝剤は約６．０〜９．５ｐＨの範囲（例えば、約６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０または９．５）を提供するのに充分な量で存在してもよい。緩衝液中に存在してもよい他の薬剤として、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のようなキレート剤が挙げられる。幾つかの実施形態では、反応混合物は、ＢＳＡ等を含んでもよい。
【００６１】
反応混合物の調製において、任意の都合の良い順序で様々な構成成分を混ぜ合わせてよい。例えば緩衝液は、プライマー、ポリメラーゼと混ぜ合わせ、次いで鋳型となる核酸と混ぜ合わせてもよく、または様々な構成成分の全てを同時に混ぜ合わせて反応混合物を生成してもよい。
【００６２】
あるいは、市販のプレミックス試薬を製造者の説明書に従って本明細書に開示された方法で利用してもよく、または反応条件を改善するために改変してもよく（例えば、必要に応じて、緩衝液濃度、陽イオン濃度、またはｄＮＴＰ濃度を改変する）、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＯＭＮＩＭＩＸ（登録商標）またはＳＭＡＲＴＭＩＸ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）、ＩＱ＆＃８４８２；Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）またはＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標） ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が含まれる。
【００６３】
反応混合物を調製後、反応混合物はプライマー伸長反応条件（「ポリメラーゼに基づいた核酸増幅産物を提供するのに充分な条件」）、すなわち、ヌクレオチドを追加することによるポリメラーゼを媒介するプライマー伸長を、鋳型鎖を鋳型として用いながらプライマー分子の末端まで可能にする条件にかけてもよい。多くの実施形態では、プライマー伸長反応条件は増幅条件であり、その条件には複数回の反応サイクルが含まれ、ここで各反応サイクルは：（１）変性ステップ、（２）アニーリングステップ、および（３）重合ステップを含む。反応サイクルの数は実施される適用例に応じて変化するが、一般的に少なくとも１５回、より一般的には少なくとも２０回、６０回くらい多いかそれより多くてもよく、異なるサイクルの数は通常約２０〜４０回の範囲でよい。約２５回、一般的には約３０回よりも多く実施される方法では、酵素によるプライマー伸長に適した条件が維持されるように、反応混合物に追加的なポリメラーゼを導入することが都合良い、または望ましい場合がある。
【００６４】
変性ステップは、反応混合物を高温まで加熱し、反応混合物中に存在する任意の２重鎖の核酸、またはハイブリダイズした核酸が解離するのに充分な時間、反応混合物を高温で維持することを含む。変性のために、反応混合物の温度は通常、約８５〜１００℃、一般的には約９０〜９８℃、より一般的には約９３〜９６℃の範囲の温度に上昇させ、約３〜１２０秒の範囲の時間、一般的に約３秒間維持する。
【００６５】
変性に続いて、反応混合物はプライマーが反応混合物中に存在する鋳型となる核酸（もし存在するならば）にアニールするのに充分な条件、および鋳型としてハイブリダイズされる核酸を用いて５’から３’の方向へプライマーが伸長するようにヌクレオチドをプライマーの末端まで重合させるのに充分な条件、すなわち、酵素によるプライマー伸長産物の生成に充分な条件にかけることができる。この実施形態では、アニーリング工程および伸長工程は同一ステップで起こる。これらの条件を達成するために反応混合物の温度を下げるが、その温度は一般的に、最適な効率および特異性を提供するように選択され、それは通常は約５０〜７５℃の範囲、一般的には約５５〜７０℃の範囲、より一般的には約６０〜６８℃の範囲、より具体的には６０℃の周辺でありうる。アニーリング条件は、約１５秒〜３０分、一般的には約２０秒〜５分、または約３０秒〜１分の範囲、または約３０秒の時間、維持してもよい。
【００６６】
このステップは所望により、各ステップの温度および時間の長さを変化させ、最適化した、各々のアニーリングステップおよび伸長ステップの１つを含んでいてもよい。２ステップアニーリングおよび伸長では、アニーリングステップは前記のように進めることが可能である。プライマーを鋳型となる核酸にアニーリングした後、反応混合物は更に、前述のようにヌクレオチドがプライマー末端まで重合することを提供するのに充分な条件にかけることができる。重合化条件を達成するために、反応混合物の温度は典型的には約６５〜７５℃、通常は約６７〜７３℃の範囲に上昇または維持してもよく、および約１５秒〜２０分、一般的には約３０秒〜５分間の範囲の時間維持してもよい。
【００６７】
幾つかの実施形態では、サイクルは、１回のみ実施される９５℃で１５分間の最初の変性を含むことができ、その後に９５℃で１秒間の変性ステップ、および６０℃で２５秒間のアニーリング／伸長ステップが続く。この２ステップサイクルは、複数回（例えば、約４５回）反復してもよい。幾つかの実施形態では、最後の伸長ステップを７２℃で１０分間追加してもよい。
【００６８】
幾つかの実施形態では、サイクルは、９５℃での１５分間の最初の変性ステップを含むことができ、９５℃で１秒間の変性、６０℃で９秒間のアニーリングおよび７２℃で９秒間の伸長のその後複数回（例えば、約４５回）が続く。最後の伸長ステップを７２℃で１０分間追加してもよい。
【００６９】
前記の変性、アニーリングおよび重合のサイクルは、一般的にはサーマルサイクラ−として知られている自動化装置を使用して実施することができる。使用できるサーマルサイクラ−は本明細書の他の場所に記載され、ならびに米国特許第５，６１２，４７３号明細書、同第５，６０２，７５６号明細書、同第５，５３８，８７１号明細書および同第５，４７５，６１０号明細書に記載されており、それらの開示は本明細書に参照によって組み込まれる。
【００７０】
また、本明細書で開示された方法は、標的核酸配列を検出するための非ＰＣＲベースの用途で使用してもよく、このような標的は固相支持体に固定することができる。核酸配列の固相支持体への固定方法は当業界では既知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９５年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）、および製造者によって提供されているプロトコール（例えばメンブレンについては、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ａｍｐ、Ｓｃｈｕｅｌｌ；磁気ビーズについては、Ｄｙｎａｌ；培養用プレートには、Ｃｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ；ビーズアレイプラットホームについては、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；本明細書で開示された実施形態で有用な他の支持体については、ＣＰＧ Ｉｎｃ．）に記載されている。
【００７１】
核酸増幅の分野における当業者であれば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベース増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および分岐ＤＮＡ法（ｂＤＮＡ）（Ｐｅｒｓｉｎｇら、（１９９３年）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ））のような、他の迅速な増幅方法を知っている。本明細書で開示された実施形態の範囲は、ＰＣＲによる増幅法を使用することに限定されず、むしろ本明細書で開示された実施形態の配列を用いて、ＥＳＢＬ抗生物質耐性遺伝子（複数可）（例えば、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子）を検出および／または定量するために有用であり得る任意の迅速な核酸増幅方法、または任意の他の手法を含む。
【００７２】
更に、様々な試薬の正確な量について変更すること、ならびに同様な増幅または検出／定量結果をもたらすＰＣＲの為の条件について、もしくは他の好適な増幅手法（例えば、緩衝液の条件、サイクル回数等）についての変更をすることは当業者には既知であり、均等（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）であると考えられる。一実施形態では、本発明のＱＰＣＲ検出は、試料中の５０コピー未満（好ましくは、２５コピー未満、より好ましくは１５コピー未満、更により好ましくは１０コピー未満）の標的核酸（すなわち、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子を含むＥＳＢＬ核酸）を検出する感度を有する。一実施形態では、非特異的な増幅によるバックグラウンドを減少させることでＰＣＲ反応を改善し、望まれる伸長産物の増幅を増加させる為に、ホットスタートＰＣＲ反応を（例えば、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して）実行する。
【００７３】
（コントロール）
幾つかの実施形態では、本明細書で開示されたＰＣＲまたはＱＰＣＲ反応は、様々なコントロールを含むことができる。そのようなコントロールは「鋳型なし」のネガティブコントロールを含めることができ、ここでは、プライマー、緩衝液、酵素（複数可）および他の必要な試薬（例えば、塩化マグネシウム、ヌクレオチド）に試験試料を添加することなくサイクルは実施される。既知の標的核酸を含むポジティブコントロールも並行して実施することができる。幾つかの実施形態では、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの双方を増幅反応に含めることができる。１回の反応には、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、もしくは試料鋳型のいずれかが含まれてもよく、または、１回の反応に試料鋳型およびポジティブコントロールの双方が含まれてもよい。
【００７４】
また、「鋳型なし」のコントロールに加えて、ネガティブコントロールは反応中に非特異的標的核酸が含まれた増幅反応も含んでよく、またはネガティブコントロールは試験試料を添加しない（核酸抽出から増幅調製までの）試料調製ステップ（例えば、各ステップでは試験試料を使用しないか、またはＣＴＸ−ＭのようなＥＳＢＬを含まないことが知られている試料を使用する）の幾つか、または全てを使用して調製された試料であってもよい。
【００７５】
ポジティブおよびネガティブコントロールは、試験試料がＥＳＢＬの有無で分類されるパラメータの設定に有用である。
【００７６】
例えば、ＱＰＣＲ反応では、ＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）がポジティブコントロール試料中で検出されるサイクル閾値は、試料を「陽性」として分類する閾値を設定するために使用することができ、対象のＥＳＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ）がネガティブコントロール試料中で検出されるサイクル閾値は、試料を「陰性」として分類する閾値を設定するために使用することができる。１回の反応から得られたＣＴを各々のコントロールに使用することができ、または複製した試料の中央値または平均値を使用することもできる。更に別の実施形態では、古典的な対照値を使用してもよい。ネガティブおよびポジティブコントロールそれぞれの最小検出レベルは、典型的には複数回の反応に渡る平均ＣＴの９５％信頼区間の下端に設定される。この値は、診断アッセイの要求に応じて調節することができる。
【００７７】
好ましくは、ＰＣＲコントロールは、同一の試薬を使用して、同一の増幅反応で、試験試料と同時に実施するべきである。
【００７８】
幾つかの実施形態では、標的増幅産物の同定および／または量を決定することを提供する。プライマー伸長または増幅産物の同定は、（例えば）サザンブロットアッセイを含む標準的な分子的技術を使用して確認することができる。サザンブロットアッセイでは、増幅産物は電気泳動によって分離し、メンブレン（すなわち、ニトロセルロース、ナイロン等）にトランスファーし、オリゴヌクレオチドプローブまたは対象となる核酸配列の任意の部分と反応させる。次に、検出を可能にするためにプローブを修飾する。修飾方法は、放射性標識されたヌクレオチド、または任意数の非放射性標識（例えば、ビオチン）の組み込むものであってよい。サザンブロットアッセイで使用するオリゴヌクレオチドプローブは核酸配列に由来し、したがってＣＴＸ−Ｍ核酸に特異的であり、配列番号５、１０、３１、３２および３３に示されている配列を含むブローブであってよい。サザンブロットアッセイで使用するプローブは、日常的で標準的な方法を使用して調製することができる。例えば、プローブは、当該技術分野において既知の日常的な技術を使用して単離し、クローニングし、および制限することができ、または本明細書で既に記載した化学的合成法を使用して作成することができる。
【００７９】
あるいは、増幅産物はドットブロット分析を使用して検出することができる。ドットブロット分析には、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、以前に記載したもの）をニトロセルロース、またはビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、または非磁性ビーズ等があるが、これらに限定されない）、反応トレイの壁、ストリップ（例えば、ニトロセルロースストリップがあるが、これに限定されない）、試験管のような固相支持体（これらに限定されない）に固着させることが含まれる。標識した増幅産物を含有する試料を添加し、反応させ、結合しなかった試料を除去するために洗浄し、標識して、プローブに結合した増幅産物を当該技術分野において既知の日常的な技術を使用して可視化する。プライマー伸長産物または増幅産物を確認するためのよりストリンジェントな方法は、当該技術分野でよく知られている技術を使用した直接的な配列決定法によるものである。
【００８０】
（キット）
本明細書ではまた、本明細書で記載された方法を実施するために必要な構成要素を含有する「キット」を提供する。このようなキットは、１つ以上のチューブまたはバイアルのような容器を、内部に密接に収容するように区分された運搬容器を含むことができる。容器の１つは、本明細書で開示された少なくとも１種の非標識の、または検出可能な標識されたプライマーまたはプローブを含有してもよい。プライマーまたはプライマー類は凍結乾燥形態、または必要に応じて適切な緩衝液中に存在してもよい。１つ以上の容器は、ＰＣＲ反応で使用する１種以上の酵素または試薬を含有してもよい。これらの酵素は、凍結乾燥状態で、もしくは適切なバッファー中に、それ自体単独で、または既に混合した状態で存在してもよい。
【００８１】
結局キットは、例えば、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド三リン酸、濾紙、ゲル素材、トランスファー素材、オートラジオグラフィー用品のような、本明細書に開示された方法を実施するために必要な全ての追加的な構成要素を含むことができる。
【００８２】
好ましくは、キットは：（ａ）標識されたオリゴヌクレオチド（ここでキットは、例えばＥＭＢＬ（例えば、ＣＴＸ−Ｍ遺伝子）をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする２種以上の識別可能なオリゴヌクレオチドを含む）；および、（ｂ）高いフィデリティーを有する増幅（例えばＱＰＣＲのようなＰＣＲ反応）において、提供された標識されたオリゴヌクレオチド（複数可）を使用するための説明書、を少なくとも含む。一実施形態では、２種の識別可能なオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜２４から成る群から選択されてもよい。
【００８３】
幾つかの実施形態では、キットは、本明細書で開示された方法で調製された反応混合物に必要な、または含むことが都合がよい、およひ／または望ましい追加的な試薬を含み、そのような試薬には：１種以上のポリメラーゼ；水溶性緩衝液（キットの構成成分として調製されているか、または存在しているかのどちらかであり、該成分の１種以上は予め混合されているか、または全成分が別々に存在してもよい）等、が含まれる。キットの様々な試薬成分は、別々の容器に存在してもよく、または全てが鋳型の核酸と混ぜ合わせるための試薬混合物中に予め混ぜ合わせられていてもよい。
【００８４】
前記の成分に加えて、幾つかの実施形態では、キットはまた、本明細書で開示された方法を実施するための説明書を含むこともできる。これらの説明書は様々な形態でキットに存在してもよく、１種以上の説明書がキット内に存在してもよい。これらの説明書が存在できる１つの形態は、適切な媒体または基板（例えば、キットのパッケージ内、パッケージ挿入体等にある、情報が印刷されている１枚の紙または複数の紙）に印刷された情報として、である。更に別の手段は、情報が記録された、コンピューターで読み取り可能である媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ等である。存在し得る更に別の手段は、離れた場所にある情報にインターネットを通じてアクセスすることで使用できるウェブサイトアドレスである。任意の都合の良い手段がキットに存在してもよい。
【００８５】
以下のそれぞれの参照文献の開示は、本明細書においてその全体を参照によって組み込まれる。
（文献）
１．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ、およびＢｕｓｈ １９９７年、Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｈｙｄｒｏｌｉｚｉｎｇ β−Ｌａｃｔａｍａｓｅｓ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、第４１巻、２２３〜２３２頁
２．Ｗｏｏｄｆｏｒｄら、２００４年、Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ Ｎｅｗ Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ Ｃｌａｓｓ Ａ β−Ｌａｃｔａｍａｓｅ，ＫＰＣ−３，ｉｎ ａ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、第４８巻、４７９３〜４７９９頁
３．Ｙｉｇｉｔら、２００１年、Ｎｏｖｅｌ Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ β−Ｌａｃｔａｍａｓｅ，ＫＰＣ−１，ｆｒｏｍ ａ Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、第４５巻、１１５１〜１１６１頁
４．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第８版、ＰＲ Ｍｕｒｒａｙ、ＥＪ Ｂａｒｏｎ、ＪＨ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、ＭＡ Ｐｆａｌｌｅｒ、およびＲＨ Ｙｏｌｋｅｎ編、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ、２００３年
５．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２００８年、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ、第１８回Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍ１００−Ｓ１８、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗａｙｎｅ、ペンシルバニア州
６．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、およびＤｖｅｋｓｌｅｒ、２００３年、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、５２０頁
７．Ｄｅｖｏｒ，Ｅ．Ｊ．、２００５年、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＬＮＡｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
【００８６】
本明細書で記載され請求される発明は、本明細書に開示される特定の実施形態が本発明の幾つかの態様についての例示として意図したものであるため、これらの実施形態による範囲によって限定されるべきではない。任意の均等な実施は、本発明の範囲内であることを意図する。実際に、本明細書に示され記載された実施形態の改変に加え、様々な改変をすることは、当業者には上の記載から明らかであろう。付記する特許請求の範囲は、その様な改変を包含することを意図する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本中のＣＴＸ−Ｍ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを有する微生物の存在を検出および／または同定するための方法であって、
ＣＴＸ−Ｍ遺伝子の存在を分析するための標本から試料を採取するステップと、
標準的ＰＣＲ条件下で前記試料を増幅プライマーセットに接触させるステップであり、ここで前記増幅プライマーセットは少なくとも１対のプライマー対を含み、ここで前記プライマーセットは１つ以上のユニバーサル塩基を有するプライマーを含み、ここで前記プライマー対はＣＴＸ−Ｍ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子内の標的配列に隣接する核酸にハイブリダイズし、および、ここで前記プライマー対は標的増幅産物を生成するステップと、
前記標的増幅産物を生成するプライマーの伸長のための試薬および条件を提供するステップと、
前記標的増幅産物の存在および／または量を決定するステップであり、前記標的増幅産物の存在が前記ＣＴＸ−Ｍ遺伝子の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項２】
更に前記試料を、前記標的増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブと接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対は少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸の存在下で前記標的増幅産物を生成し、前記少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子はＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５から成る群より選択される少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ群由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の増幅プライマー対が、ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５の群に由来するＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記ＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸の存在下で標的増幅産物を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対はＣＴＸ−Ｍアイソフォーム１〜８２に集合的にハイブリダイズし、ＣＴＸ−Ｍアイソフォーム１〜８２の存在下で標的増幅産物を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対は、表１に列挙されたバクテリア株由来のそれぞれのＣＴＸ−Ｍ核酸に集合的にハイブリダイズし、前記ＣＴＸ−Ｍ核酸の存在下で標的増幅産物を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが分子ビーコンプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）蛍光プローブ、およびｓｃｏｒｐｉｏｎ蛍光プローブから成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
更に、標準的ＰＣＲ条件下で、少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ群標的増幅産物に由来する前記標的増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブと前記試料を接触させるステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記試料を１種類以上のプローブと接触させるステップを更に含む方法であって、ここで前記１つ以上のプローブが標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍ群ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５由来の前記標的増幅産物に集合的にハイブリダイズする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を１種類以上のプローブと接触させるステップを更に含む方法であって、前記１または複数のプローブが、標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍ群ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５由来の前記標的増幅産物に集合的にハイブリダイズする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅プライマーセットが少なくとも２種類のプライマーを含み、各プライマーが、
ＣＹＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ （配列番号１）；
ＴＴＧＲＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧ （配列番号２）；
ＧＧＴＭＴＧＣＣＧＡＡＡＴＳＷＴＧＧ （配列番号３）；
ＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＨＡＴＣＣＣＧＡＣ （配列番号４）；
ＴＧＴＲＴＧＣＳＣＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号６）；
ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧＹＧＴＴＡＴＣＧ （配列番号７）；
ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧ （配列番号８）；
ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴ （配列番号９）
または、それらの相補体から成る群から選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
更に、前記試料を少なくとも１つのプローブと接触させることを含み、ここで前記少なくとも１つのプローブは、配列番号５、配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅プライマーセットが少なくとも２種類のプライマーを含み、ここで各プライマーは、
ＣＹＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ （配列番号１）；
ＴＴＧＲＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧ （配列番号２）；
ＧＧＴＭＴＧＣＣＧＡＡＡＴＳＷＴＧＧ （配列番号３）；
ＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＨＡＴＣＣＣＧＡＣ （配列番号４）；
ＴＧＴＲＴＧＣＳＣＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号２７）；
ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧＹＧＴＴＡＴＣＧ （配列番号２８）；
ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧ （配列番号２９）；
ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴ （配列番号３０）
または、それらの相補体から成る群から選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
更に、前記試料を少なくとも１つのプローブと接触させることを含み、ここで前記少なくとも１つのプローブは、配列番号５、配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３から成る群から選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標本中のＣＴＸ−Ｍ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを有する微生物の存在を検出および／または同定するためのキットであって、
増幅プライマーセットを含み、ここで前記増幅プライマーセットは少なくとも１対のプライマー対を含み、および、ここで前記プライマーセットはユニバーサル塩基を含む１種類以上のプライマーを含み、ここで前記少なくとも１対のプライマー対はＣＴＸ−Ｍ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子内の、またはその部分を含む標的配列に隣接した核酸にハイブリダイズするキット。
【請求項１６】
前記標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを更に含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対は、標準的ＰＣＲ条件下で、少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸の存在下で標的増幅産物を生成することができ、前記少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子はＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５から成る群から選択される少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ群由来である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記複数の増幅プライマー対が、標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５群に由来するＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記ＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸の存在下で標的増幅産物を生成することができる、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対は、標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍアイソフォーム１〜８２に集合的にハイブリダイズし、ＣＴＸ−Ｍアイソフォーム１〜８２の存在下で標的増幅産物を生成することができる、請求項１５に記載のキット。
【請求項２０】
前記プローブが分子ビーコンプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）蛍光プローブおよびｓｃｏｒｐｉｏｎ蛍光プローブから成る群より選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２１】
標準的ＰＣＲ条件下で、少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ群標的増幅産物に由来する前記標的増幅産物にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブを更に含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
１種類以上のプローブを更に含むキットであって、ここで前記１種類以上のプローブは、標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍ群ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５由来の前記標的増幅産物に集合的にハイブリダイズすることができる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
前記増幅プライマーセットが少なくとも２種類のプライマーを含み、ここで各プライマーは、
ＣＹＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ （配列番号１）；
ＴＴＧＲＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧ （配列番号２）；
ＧＧＴＭＴＧＣＣＧＡＡＡＴＳＷＴＧＧ （配列番号３）；
ＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＨＡＴＣＣＣＧＡＣ （配列番号４）；
ＴＧＴＲＴＧＣＳＣＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号６）；
ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧＹＧＴＴＡＴＣＧ （配列番号７）；
ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧ （配列番号８）；
ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴ （配列番号９）
または、それらの相補体から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項２４】
少なくとも１つのプローブを更に含むキットであって、ここで前記少なくとも１つのプローブが、配列番号５、配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記増幅プライマーセットが少なくとも２種類のプライマーを含み、ここで各プライマーは、
ＣＹＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ （配列番号１）；
ＴＴＧＲＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧ （配列番号２）；
ＧＧＴＭＴＧＣＣＧＡＡＡＴＳＷＴＧＧ （配列番号３）；
ＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＨＡＴＣＣＣＧＡＣ （配列番号４）；
ＴＧＴＲＴＧＣＳＣＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号２７）；
ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧＹＧＴＴＡＴＣＧ （配列番号２８）；
ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧ （配列番号２９）；
ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴ （配列番号３０）
または、それらの相補体から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも１つのプローブを更に含むキットであって、ここで前記少なくとも１つのプローブは、配列番号５、配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
カルバペネマーゼ遺伝子内の、またはその部分を含む標的配列に隣接した核酸にハイブリダイズする増幅プライマー対を更に含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１】
標本中のＣＴＸ−Ｍ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを有する微生物の存在を検出および／または同定するための方法であって、
ＣＴＸ−Ｍ遺伝子の存在を分析するための標本から試料を採取するステップと、
標準的ＰＣＲ条件下で前記試料を増幅プライマーセットに接触させるステップであり、ここで前記増幅プライマーセットは少なくとも１対のプライマー対を含み、ここで前記プライマーセットは１つ以上のユニバーサル塩基を有するプライマーを含み、ここで前記プライマー対はＣＴＸ−Ｍ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子内の標的配列に隣接する核酸にハイブリダイズし、および、ここで前記プライマー対は標的増幅産物を生成するステップと、
前記標的増幅産物を生成するプライマーの伸長のための試薬および条件を提供するステップと、
前記標的増幅産物の存在および／または量を決定するステップであり、前記標的増幅産物の存在が前記ＣＴＸ−Ｍ遺伝子の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項２】
更に前記試料を、前記標的増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブと接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対は少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸の存在下で前記標的増幅産物を生成し、前記少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子はＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５から成る群より選択される少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ群由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の増幅プライマー対が、ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５の群に由来するＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記ＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸の存在下で標的増幅産物を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対はＣＴＸ−Ｍアイソフォーム１〜８２に集合的にハイブリダイズし、ＣＴＸ−Ｍアイソフォーム１〜８２の存在下で標的増幅産物を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対は、表１に列挙されたバクテリア株由来のそれぞれのＣＴＸ−Ｍ核酸に集合的にハイブリダイズし、前記ＣＴＸ−Ｍ核酸の存在下で標的増幅産物を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが分子ビーコンプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）蛍光プローブ、およびｓｃｏｒｐｉｏｎ蛍光プローブから成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
更に、標準的ＰＣＲ条件下で、少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ群標的増幅産物に由来する前記標的増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブと前記試料を接触させるステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記試料を１種類以上のプローブと接触させるステップを更に含む方法であって、ここで前記１つ以上のプローブが標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍ群ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５由来の前記標的増幅産物に集合的にハイブリダイズする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を１種類以上のプローブと接触させるステップを更に含む方法であって、前記１または複数のプローブが、標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍ群ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５由来の前記標的増幅産物に集合的にハイブリダイズする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅プライマーセットが少なくとも２種類のプライマーを含み、各プライマーが、
ＣＹＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ （配列番号１）；
ＴＴＧＲＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧ （配列番号２）；
ＧＧＴＭＴＧＣＣＧＡＡＡＴＳＷＴＧＧ （配列番号３）；
ＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＨＡＴＣＣＣＧＡＣ （配列番号４）；
ＴＧＴＲＴＧＣＳＣＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号６）；
ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧＹＧＴＴＡＴＣＧ （配列番号７）；
ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧ （配列番号８）；
ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴ （配列番号９）
または、それらの相補体から成る群から選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
更に、前記試料を少なくとも１つのプローブと接触させることを含み、ここで前記少なくとも１つのプローブは、配列番号５、配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅プライマーセットが少なくとも２種類のプライマーを含み、ここで各プライマーは、
ＣＹＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ （配列番号１）；
ＴＴＧＲＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧ （配列番号２）；
ＧＧＴＭＴＧＣＣＧＡＡＡＴＳＷＴＧＧ （配列番号３）；
ＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＨＡＴＣＣＣＧＡＣ （配列番号４）；
ＴＧＴＲＴＧＣＳＣＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号２７）；
ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧＹＧＴＴＡＴＣＧ （配列番号２８）；
ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧ （配列番号２９）；
ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴ （配列番号３０）
または、それらの相補体から成る群から選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
更に、前記試料を少なくとも１つのプローブと接触させることを含み、ここで前記少なくとも１つのプローブは、配列番号５、配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３から成る群から選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標本中のＣＴＸ−Ｍ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを有する微生物の存在を検出および／または同定するためのキットであって、
増幅プライマーセットを含み、ここで前記増幅プライマーセットは少なくとも１対のプライマー対を含み、および、ここで前記プライマーセットはユニバーサル塩基を含む１種類以上のプライマーを含み、ここで前記少なくとも１対のプライマー対はＣＴＸ−Ｍ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子内の、またはその部分を含む標的配列に隣接した核酸にハイブリダイズするキット。
【請求項１６】
前記標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを更に含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対は、標準的ＰＣＲ条件下で、少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸の存在下で標的増幅産物を生成することができ、前記少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ遺伝子はＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５から成る群から選択される少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ群由来である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記複数の増幅プライマー対が、標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５群に由来するＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸に集合的にハイブリダイズし、前記ＣＴＸ−Ｍ遺伝子の核酸の存在下で標的増幅産物を生成することができる、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記増幅プライマーセットが複数の増幅プライマー対を含み、ここで前記複数の増幅プライマー対は、標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍアイソフォーム１〜８２に集合的にハイブリダイズし、ＣＴＸ−Ｍアイソフォーム１〜８２の存在下で標的増幅産物を生成することができる、請求項１５に記載のキット。
【請求項２０】
前記プローブが分子ビーコンプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）蛍光プローブおよびｓｃｏｒｐｉｏｎ蛍光プローブから成る群より選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２１】
標準的ＰＣＲ条件下で、少なくとも２種類のＣＴＸ−Ｍ群標的増幅産物に由来する前記標的増幅産物にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブを更に含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
１種類以上のプローブを更に含むキットであって、ここで前記１種類以上のプローブは、標準的ＰＣＲ条件下で、ＣＴＸ−Ｍ群ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−２、ＣＴＸ−Ｍ−８、ＣＴＸ−Ｍ−９およびＣＴＸ−Ｍ−２５由来の前記標的増幅産物に集合的にハイブリダイズすることができる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
前記増幅プライマーセットが少なくとも２種類のプライマーを含み、ここで各プライマーは、
ＣＹＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ （配列番号１）；
ＴＴＧＲＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧ （配列番号２）；
ＧＧＴＭＴＧＣＣＧＡＡＡＴＳＷＴＧＧ （配列番号３）；
ＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＨＡＴＣＣＣＧＡＣ （配列番号４）；
ＴＧＴＲＴＧＣＳＣＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号６）；
ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧＹＧＴＴＡＴＣＧ （配列番号７）；
ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧ （配列番号８）；
ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴ （配列番号９）
または、それらの相補体から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項２４】
少なくとも１つのプローブを更に含むキットであって、ここで前記少なくとも１つのプローブが、配列番号５、配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記増幅プライマーセットが少なくとも２種類のプライマーを含み、ここで各プライマーは、
ＣＹＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ （配列番号１）；
ＴＴＧＲＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧ （配列番号２）；
ＧＧＴＭＴＧＣＣＧＡＡＡＴＳＷＴＧＧ （配列番号３）；
ＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＨＡＴＣＣＣＧＡＣ （配列番号４）；
ＴＧＴＲＴＧＣＳＣＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号２７）；
ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧＹＧＴＴＡＴＣＧ （配列番号２８）；
ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧ （配列番号２９）；
ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴ （配列番号３０）
または、それらの相補体から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも１つのプローブを更に含むキットであって、ここで前記少なくとも１つのプローブは、配列番号５、配列番号１０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３から成る群より選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
カルバペネマーゼ遺伝子内の、またはその部分を含む標的配列に隣接した核酸にハイブリダイズする増幅プライマー対を更に含む、請求項１５に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５１８４１４（Ｐ２０１２−５１８４１４Ａ）
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５１２６１（Ｐ２０１１−５５１２６１）
【出願日】平成２２年２月１９日（２０１０．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４８３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９６７２３
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５１１２０２８６１）ジェネオーム サイエンシズ、 インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１９日（２０１０．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４８３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９６７２３
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５１１２０２８６１）ジェネオーム サイエンシズ、 インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
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