堅牢な統計的方法を使用する質量スペクトルの自己較正
【課題】新しい改善された較正方法、関連システム、およびメディアを提供する。
【解決手段】方法は、たとえば質量および相補ペアにおける差を使用し、較正パラメータを評価することを伴う。方法１００においては、シーケンスまたは方法が１１０において開始される。ピークの集合を含む入力質量スペクトルが、１２０において獲得される。標本に適したあらかじめ決定済みの分子が１３０において選択される。１４０において、ピークの集合の部分集合を包含するデータ集合が入力質量スペクトルから作成される。このデータ集合に対して堅牢な統計的方法が１５０において適用され、１ないしは複数の変換パラメータが計算される。１６０においては、この１ないしは複数の計算された変換パラメータを使用して質量スペクトルが変換され、再較正済み質量スペクトルが提供される。このシーケンスは、オペレータによる終了時に１７０において停止するか、反復される。
【解決手段】方法は、たとえば質量および相補ペアにおける差を使用し、較正パラメータを評価することを伴う。方法１００においては、シーケンスまたは方法が１１０において開始される。ピークの集合を含む入力質量スペクトルが、１２０において獲得される。標本に適したあらかじめ決定済みの分子が１３０において選択される。１４０において、ピークの集合の部分集合を包含するデータ集合が入力質量スペクトルから作成される。このデータ集合に対して堅牢な統計的方法が１５０において適用され、１ないしは複数の変換パラメータが計算される。１６０においては、この１ないしは複数の計算された変換パラメータを使用して質量スペクトルが変換され、再較正済み質量スペクトルが提供される。このシーケンスは、オペレータによる終了時に１７０において停止するか、反復される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
例として示すこの実施態様は、測定済み質量が真の質量により近く変換されるように行う測定済み質量スペクトルの再較正における堅牢な統計的方法の使用に関する。質量スペクトロメトリのための較正テクニックに関連する特定の応用が見出されており、特にそれに言及して説明を行う。
【背景技術】
【０００２】
測定の不確かさは、スペクトル計の精度ならびにバイアスの正確な評価によって最小化される。使用する計測器のタイプには内在的な精度の上限がある。たとえば、ＦＴＭＳは１〜２ｐｐｍの精度（代表的な１０００Ｄａのｍ／ｚにおいて０．００１Ｄａ）を有し、ＱＴＯＦは１０ｐｐｍの公称精度（０．０１Ｄａ）を有する。しかしながら、精度は計測器のセットアップに応じても変化する。バイアスのための補正を行うパラメータもまた、セットアップごとに、さらにはスペクトルごとに異なるものとなり得る。図１および２に一例が提供されているが、これらは、異なる時間に同一のＴＯＦ計測器上おいて同一標本から得られた２つの質量スペクトルを示している。これら２つのグラフは、偏差（観察された質量から理論的質量を引いた値）対ピークの測定済み質量のプロットである。それぞれの場合において、偏差は、ピークの質量とともに直線的に変化する。直線当てはめが示されており、精度（直線に対するポイントの近さ）が類似している場合であってもバイアス（直線の傾き）が極めて異なる（２つのグラフのｙ軸の間の差に注意）ことは明らかである。
【０００３】
【非特許文献１】ルソー（Ｒｏｕｓｓｅｅｕｗ）ＰＪ、およびレロイ（Ｌｅｒｏｙ）ＡＭ著『堅牢退行及びアウトライア検出（Ｒｏｂｕｓｔ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｕｔｌｉｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）』、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）出版（１９８７年）
【非特許文献２】フィシュラー（Ｆｉｓｃｈｌｅｒ）ＭＡほか著『コミュニケーション・オフ・ザＡＣＭ（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＣＭ）』、２４（６）、ｐ３８１-３９５（１９８１年）
【非特許文献３】サットン-スミス（Ｓｕｔｔｏｎ?Ｓｍｉｔｈ）Ｍほか著『テトラヘドン：アシンメトリ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）』、１１（２）、ｐ３６３?３６９（２０００年）
【非特許文献４】デル（Ｄｅｌｌ）Ａほか著『セル・バイオロジー（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）：ア・ラボラトリ・ハンドブック（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）』第４巻、Ｊ．Ｅ．セリス（Ｃｅｌｉｓ）編集、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）サンディエゴ、インプレス
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この例示の実施態様は、上記ならびにそのほかの問題を克服する新しい改善された較正方法、関連システム、およびメディアを企図している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この例示の実施態様の第１の側面においては、複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するための方法が提供される。この方法は、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を包含する。質量スペクトルは、複数のピークを含み、そのそれぞれが質量対電荷比に対応する。またこの方法は、標本に適した複数のあらかじめ決定済み分子の選択も包含する。
【０００６】
さらにこの方法は、複数のピークの部分集合を包含するデータ集合の作成を包含し、それにおいて複数のピークの部分集合内の各ピークは、複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられる。またこの方法は、堅牢な統計的方法をデータ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算することも包含する。それに加えて、この方法は、その変換パラメータのうちの少なくとも１つを使用することによる質量スペクトルの変換を包含し、それによって再較正済み質量スペクトルを提供する。
【０００７】
別の態様において、この例示の実施態様は、複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するための方法を提供する。この方法は、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を含む。質量スペクトルは、複数のピークを含み、そのそれぞれが質量対電荷比に対応する。またこの方法は、標本に適した複数のあらかじめ決定済み分子の選択も含む。さらにこの方法は、複数のピークからの複数のピークのペアを包含するデータ集合の作成を含み、それにおいてピークのペアのそれぞれは、複数のあらかじめ決定済みの分子の１つに対して割り当てられる。またこの方法は、堅牢な統計的方法をデータ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算することも含む。それに加えて、この方法は、その少なくとも１つの変換パラメータを使用することによる質量スペクトルの変換を含み、それによって再較正済み質量スペクトルを提供する。
【０００８】
別の態様においてこの例示の実施態様は、複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するためのシステムを提供する。このシステムは、質量スペクトルを維持するべく機能する第１のストレージ・デバイスを含む。質量スペクトルは複数のピークを含み、複数のピークのそれぞれは、質量対電荷比に対応する。またこのシステムは、（ｉ）標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、（ｉｉ）複数のピークの部分集合を含むデータ集合を作成し、それにおいて複数のピークの部分集合の各ピークは、複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられ、（ｉｉｉ）そのデータ集合に堅牢な統計的方法を適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、かつ（ｉｖ）その少なくとも１つの変換パラメータを使用して質量スペクトルを変換し、それによって再較正済み質量スペクトルを提供するコンピュータ・プログラムを含むコンピュータ実行可能インストラクションを維持するべく機能する第２のストレージ・デバイスを含む。さらにこのシステムは、第１および第２のストレージ・デバイスと通信し、かつそのコンピュータ・プログラムを実行して再較正済み質量スペクトルを提供するべく機能するプロセッサを含む。
【０００９】
さらに別の側面において、この例示の実施態様は、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を含む方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを有するコンピュータ可読メディアを提供する。質量スペクトルは、複数のピークを含み、そのそれぞれが質量対電荷比に対応する。またこの方法は、標本に適した複数のあらかじめ決定済み分子の選択も含む。さらにこの方法は、複数のピークの部分集合を包含するデータ集合の作成を含み、それにおいて複数のピークの部分集合の各ピークは、複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられる。またこの方法は、堅牢な統計的方法をデータ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算することも含む。それに加えて、この方法は、その少なくとも１つの変換パラメータを使用することによる質量スペクトルの変換を含み、それによって再較正済み質量スペクトルを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
未知の巨大分子または断片の質量スペクトルを、スペクトル自体のピークを使用して再較正し、それによって分子識別を実行する能力を向上させるための新しい方法が提供されている。ここで使用されている表現『再較正』は、測定済みｍ／ｚの読みがそのｍ／ｚの読みの『真の』値に近くなるように、スペクトルのピークおよび／またはピーク間の差に対して特定の分子の仮の割り当てを行うことを基礎とした測定済みｍ／ｚの読みの補正を言う。この方法は、３つの異なる試験所から得られたＴＯＦ、ＱＴＯＦ、およびイオン−トラップ計測器からのグリカンならびにペプチド・スペクトルに対してテストされたが、飛行時間型質量スペクトル計からのスペクトルに特に適している。再較正の後は、１００〜４０００Ｄａの全質量範囲にわたってＴＯＦスペクトルの精度が、通常、約０．０３Ｄａとなる。ＱＴＯＦスペクトルの精度は、１００〜２０００Ｄａの質量範囲にわたって、通常、約０．００５ダルトンである。この精度は、一般に自己較正前に観察される５０〜１００ｐｐｍ（すなわち、１０００Ｄａにおいて０．１Ｄａ）より有意に良好であり、１０ｐｐｍとする計測器製造業者の公称精度さえも上回る。この改良は、識別のためのエラー・レートの大きな縮小となる。
【００１１】
なお、図１、図２に示すこれら２つのグラフは、偏差（観察された質量から理論的質量を引いた値）対ピークの測定済み質量のプロットであり、計測器のバイアスがスペクトル間でどのように変化するかを示している。
【００１２】
主要なストラテジは、測定済み質量スペクトルの再較正に対する堅牢な統計的方法の適用である。この『堅牢』という表現は、任意量による単一データ・ポイントの変更が、式または計算の結果を任意量により変化させない統計的方法を言う。質量スペクトルの再較正において堅牢な統計的方法を使用する利点は、その種の方法が非常に多くの数の不正確なデータポイントを許容しており、それにもかかわらず正しい結果を見つけ出せることである。
【００１３】
概して言えば、この方法は、標本またはその標本内の分子の質量スペクトルの獲得することを伴う。またこの方法は、標本、その標本内に含まれると考えられている分子に関する情報、あるいはその標本内の分子を決定するために使用できる情報の獲得も伴う。その種の情報の特定の例として、限定する意図ではないが、アイソトープ・エンベロープに関する情報；標本内の分子、断片、イオン、またはそれらの組成物に関する情報；およびそのほかの分子、断片、イオン、またはそれらの組成物に関する情報が挙げられる。特定のストラテジにおいては、これらの情報がアイソトープの質量の分布に関係することがある。例示の実施態様の特定の変形においては、ここに述べた情報を少なくとも部分的に使用し、質量スペクトルに対して候補識別が割り当てられるか作られる。これらの初期識別からデータ集合が準備される。１ないしは複数の比較を行ってデータ集合を生成することができる。このデータに対して堅牢な統計的方法が実行されて１ないしは複数の変換パラメータが生成され、続いてそれが質量スペクトルの変換に使用されて、再較正済み質量スペクトルが提供される。
【００１４】
特に質量スペクトルについて、この例示の実施態様のストラテジは、既知の真の質量
【数１】
を有する観察された質量ｍiのいくつかのピークを見つけ出し、
【数２】
をｍiに対してプロットすることである。ＱＴＯＦ質量スペクトル計の場合には、この曲線が直線に非常に近くなる。妥当な評価がピークのいくつかの真の質量からなされるとき、適正な評価が滑らかな曲線上に位置することになり、堅牢な統計における周知のテクニックを使用してその曲線を見つけ出し、不正確な評価（または『アウトライア』）の中から正しい評価（または『線上の』）見分けることが可能になる。この種の統計的テクニックの１つが、最小二乗平均法（『ＬＭＳ』）である。非特許文献１を参照されたい。ＬＭＳの実際的な具体化は、『ランダムサンプリング一致（Ｒａｎｄｏｍ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）』またはＲＡＮＳＡＣを使用する。ＲＡＮＳＡＣについてのさらに詳しい情報は、非特許文献２から得ることができる。質量スペクトルの場合は、ｙ＝Ａｘ＋Ｂの形式のアフィン（affine）変換が求められ、それにおいてｘは測定済み質量、ｙは真の質量である。
【００１５】
ＬＭＳ計算の一例を示すと次のようになる。平面内のｎ個のポイントからなるデータ集合Ｐが識別され、そのいくつかが直線上にあるが、多くは外れている。目的は、この直線の式を明らかにすることである。ｋ個のポイントからなる複数の部分集合ＳｊがＰからランダムに選択され、それにおいて、ｋはｎに比べて小さい数であり、ｊは部分集合の数であり、一般に大きな数になる。概して言えば、ｋおよびｊは、充分に大きな数ｊにわたって部分集合Ｓｊがアウトライアに汚染させることなく、良好な回帰線を提供するように選択される。その後、以下の方法によって各部分集合Ｓｊにスコアが与えられる。最初に、周知の最小二乗法を使用してｋ個のポイントに直線が当てはめられる。続いて、Ｐ内の各ポイントについて、そのポイントから当てはめ直線までの垂直距離が決定される；この距離は、残余として知られている。Ｐ内の各ポイントについての残余が平方される。平方後の残余のメディアンが決定され、その部分集合Ｓｊのためのスコアとしてそれが使用される。もっとも低いスコアを伴う部分集合Ｓｊによって決定される直線が、『真の』直線を表すとして採用される。『真の』直線の評価は、その後さらに、Ｐ内の各ポイントを『直線上』または『アウトライア』として分類した後、『直線上』として分類済みのポイントだけを用いて直線の式の再評価を行うことによって改良される。
【００１６】
ペプチドの場合には、通常、質量スペクトル上のピークがアミノ酸の特異シーケンスに属するとしてのラベル付けが困難である。単一アミノ酸を表すピークが生じることはほとんどない。アミノ酸の組み合わせが類似の質量を有することも可能である。たとえば、ＰＴ（１９８．１０１Ｄａ）およびＶＶ（１９８．１３６Ｄａ）等のアミノ酸ペアが計測器の精度内の質量を持つとき、ｂ２またはｙ２イオンを指定することは困難となり得る。したがって、この例示の実施態様は、測定済み質量自体ではなく測定済み質量の間における差を使用する。続いてこれらの差と既知の『真の』質量を比較する。たとえば、スペクトルが、４００．２００、５１５．２２３および６６２．２８９に強度のピークを含むとき、最初の差（５１５．２２３−４００．２００＝１１５．０２３）がアミノ酸Ｄ（１１５．０２７ Ｄａ）に、２番目の差（６６２．２８９−５１５．２２３＝１４７．０６６）がアミノ酸Ｆ（１４７．０６８ Ｄａ）に対応するとの結論は、仮に４００．２００におけるピークに属する特異シーケンスが決定できなかったとしても妥当性がある。その後これらの差を使用し、ポイント（０，０）、（１１５．０２３，１１５．０２７）、および（２６２．０８９，２６２．０９５）に対する最小二乗を使用して直線を当てはめることによって勾配Ａを評価することができる。
【００１７】
切片Ｂは、二重荷電イオンを使用することによって評価可能である。たとえば、スペクトルが７７５．４０２Ｄａにピークを含み、二重荷電イオンについてのピークを３８８．２００に含むとき、式Ａ×７７５．４０２＋Ｂ＝（Ａ×３８８．２００＋Ｂ）−１．００７３と記述することが可能であり、それにおいて１．００７３は、プロトンの質量である。Ｂの評価を、Ａの評価と組み合わせて獲得することができる。その後、アフィン変換ｙ＝Ａｘ＋Ｂをすべての質量測定値に対して適用する。
【００１８】
堅牢な統計的方法、特にＬＭＳが適用されて、標本グリカンの質量スペクトルの再較正が行われる。良好なアイソトープ・エンベロープならびに、予測された質量と観察された質量の間に小さい誤差を伴うピークが識別される。続いてＬＭＳが使用され、標本質量スペクトルと、既知のあるいは理論的なグリカンの質量スペクトルが比較されてバイアスを表す勾配Ａが評価され、その後、再較正が行われて全プロセス（ピークの識別および再較正を含む）が反復される。この反復は、完全に較正未済の飛行時間型スペクトルからのピークの識別が困難であることから重要である。困難は、誤差が質量とともに直線的に成長し、高い質量ピークについて非常に大きくなることであり、そのため最初の反復がしばしば、１０００Ｄａといった小さい質量を伴うピークだけを識別することになる。少ない数のラウンドの後に反復が終了し、スペクトルのすべての測定済み質量に対してアフィン変換ｙ＝Ａｘ＋Ｂが適用される。
【００１９】
堅牢な統計的方法、特にＬＭＳが適用されて、標本ペプチドの質量スペクトルの再較正が行われる。標本ペプチドの質量スペクトルを、既知のペプチドのデータベースと比較し、ベストマッチ（最良調和）を決定する比較の前にＬＭＳを使用してそれらの質量スペクトルを再較正することができる。それに代えて、新しいペプチド・シーケンスの場合には、ＬＭＳを使用して標本ペプチドの質量スペクトルと理論的なペプチドの質量スペクトルを比較し、勾配Ａを評価することができる。
【００２０】
このほかの、反復最小二乗等の堅牢な統計的方法を使用し、標本巨大分子の質量スペクトルの再較正を行う。反復最小二乗法においては、Ｐ内のすべてのポイントについて最小二乗法を使用し、ＡおよびＢが解決される。もっとも多くの誤差（たとえば最悪の２０％）を伴うポイントが削除され、最小二乗法が再び繰り返される。
【００２１】
広い配列の巨大分子の、特に質量スペクトルの分析を再較正し、あるいは取り扱うことができる。たとえば、巨大分子をペプチド、グリカン、あるいは脂質とすることができる。ここで使用される場合、表現『ペプチド』は、化学的に互いにリンクした２もしくはそれを超える数のアミノ酸を言う。アミノ酸の数が比較的大きい場合に、しばしばそのストリングがポリペプチドと呼ばれる。より詳細に述べれば、巨大分子は、質量に対する何らかの制限、たとえばペプチドがアミノ酸の小さい集合からなるとの制限を含む任意クラスの分子からなるとすることができる。別の例としては、多糖類を、糖の小さい集合からなると制限することができる。また巨大分子を、アミノ酸、イオン化ペプチド、イオン化ポリペプチド、イオン化アミノ酸、あるいはそれらの混合とすることも可能である。さらには巨大分子を、糖、でんぷん、セルロース、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、イオン化グリカン、イオン化糖類、イオン化でんぷん、イオン化セルロース、イオン化単糖類、イオン化二糖類、イオン化オリゴ糖類、あるいはそれらの混合とすることも可能である。この例示の実施態様は、非生物学的分子の分析に対しても適応することができる。
【００２２】
ここで特に図３を参照すると方法１００が提供されており、この方法１００においては、シーケンスまたは方法が１１０において開始される。ピークの集合を含む入力質量スペクトルが、１２０において獲得される。標本に適したあらかじめ決定済みの分子が１３０において選択される。１４０において、ピークの集合の部分集合を包含するデータ集合が入力質量スペクトルから作成される。このデータ集合に対して堅牢な統計的方法が１５０において適用され、１ないしは複数の変換パラメータが計算される。１６０においては、この１ないしは複数の計算された変換パラメータを使用して質量スペクトルが変換され、再較正済み質量スペクトルが提供される。このシーケンスは、オペレータによる終了時に１７０において停止するか、反復される。
【００２３】
いくつかの代替実施態様においては、ピークの集合の部分集合を包含するデータ集合を作成する１４０における操作が次のように行われる。図４を参照すると、図３のプロセス１３０から１４２Ａに進み、あらかじめ決定済みの分子のｍ／ｚ比の集合が決定される。それに加えて１４３Ａにおいては、質量スペクトルから入力質量スペクトルのｍ／ｚ比の集合が決定される。これらのｍ／ｚ比は、１４４Ａにおいて比較され、その結果が１４６Ａにおいて使用されてデータ集合が組み立てられる。
【００２４】
図５においては、１４０におけるデータ集合を作成する操作を、次のように実行することができる。あらかじめ決定済みのｍ／ｚ比の集合が１４１Ｂにおいて決定される。１４２Ｂにおいては、入力質量スペクトルのｍ／ｚ比の集合が決定される。続いてあらかじめ決定済みのｍ／ｚ比と入力質量スペクトルのｍ／ｚ比が１４３Ｂにおいて比較される。あらかじめ決定済みの分子のうちの少なくとも１つについて、分子質量のアイソトープ・エンベロープが１４４Ｂにおいて決定される。その後、あらかじめ決定済みのｍ／ｚ比に関連付けされたエンベロープと、入力質量のｍ／ｚ比に関連付けされたエンベロープを１４６Ｂにおいて比較する。そのポイントにおいて比較１４６Ｂの結果を使用し、１４８Ｂにおいてデータ集合を作成する。
【００２５】
再較正のための代替方法２００は、図６に示されるとおりに提供される。このシーケンスは、２１０において開始される。ピークの集合を含む入力質量スペクトルが、２２０に入力される。標本に適したあらかじめ決定済みの分子が２３０において選択される。このピークの集合からピークのペアの集合を含むデータ集合が作成される。このデータ集合に対し、２５０において堅牢な統計的方法が適用されて１ないしは複数の変換パラメータが計算される。２６０においては、この１ないしは複数の変換パラメータを使用して質量スペクトルが変換され、再較正済み質量スペクトルが提供される。このシーケンスは、オペレータによる終了時に２７０において停止するか、反復される。
【００２６】
図７に示されているとおり、データ集合を作成する２４０における操作は、いくつかの応用において次のように行うことができる。２４２においては、あらかじめ決定済みの分子のｍ／ｚ比の集合が決定される。ピークのペアの集合の１つのピーク間の差の１つと、あらかじめ決定済みの分子のｍ／ｚ比の集合の１つが２４４において比較される。２４６において、ピークのペアの集合の１つが、データ集合に含めるために選択される。
【００２７】
このシステムは、概して質量スペクトル・データならびに関連情報、およびコンピュータによる分析ならびにここで説明している方法を実行するコンピュータ・プログラムをストアする、コンピュータ可読メディア等の情報ならびにデータを保持するための１ないしは複数のストレージ・デバイスを包含する。さらにこのシステムは、プロセッサ、入力デバイス、およびオプションの出力デバイスを包含する。ここで用いている表現『コンピュータ可読メディア』は、任意タイプのコンピュータ・メモリまたはストレージ・デバイスを含み、限定するものではないが、フレキシブルディスク、ハードディスク、ＣＤ‐ＲＯＭ、フラッシュＲＯＭ、不揮発性ＲＯＭ、およびＲＡＭ等である。
【００２８】
ここで特に図８を参照すると、第１のストレージ・デバイス４１０、第２のストレージ・デバイス４２０、プロセッサ・デバイス４３０、入力デバイス４４０、および出力デバイス４５０を含むシステム４００が例示されている。各デバイスは、有線またはワイヤレス通信パス、たとえばネットワーク、シリアルもしくはパラレル・ポート、またはそのほかの任意の適切な通信手段等を介してプロセッサ・デバイス４３０と通信する。このシステム４００は、標本の再較正済み質量スペクトルを提供し、その標本は、１ないしは複数の巨大分子を含むことができる。システム４００は、第１のストレージ・デバイス４１０を含み、第１のストレージ・デバイス４１０が質量スペクトル４６０、質量スペクトルに対応する関連情報４７０、および再較正済み質量スペクトル４８０を維持するべく機能する。またシステム４００は、第２のストレージ・デバイス４２０も含み、第２のストレージ・デバイス４２０が種々の異なる構成でプログラム可能なコンピュータ・プログラム４９０を含むコンピュータ実行可能インストラクションを維持する。コンピュータ・プログラム４９０は、ピークまたはその種のピークを示す情報の集合を含む質量スペクトルの入力および／または保持を行うべくプログラムすることができる。またコンピュータ・プログラム４９０は、あらかじめ決定済みの、標本に適した分子を選択するべくプログラムすることができる。さらにコンピュータ・プログラム４９０は、追加として、ピークの集合の部分集合を構成するデータ集合を作成するべくプログラムすることができる。別の構成においては、コンピュータ・プログラム４９０を、ピークまたはその種のピークを示す情報の集合を含む質量スペクトルの入力および／または保持を行うべくプログラムすることができる。またコンピュータ・プログラム４９０は、あらかじめ決定済みの、標本に適した分子を選択するべくプログラムすることができる。さらにコンピュータ・プログラム４９０は、ピークの集合からピークのペアの集合を構成するデータ集合を作成するべくプログラムすることができる。いずれの構成においても、コンピュータ・プログラム４９０がデータ集合に対して堅牢な統計的方法を適用し、それによって少なくとも１つの変換パラメータを提供する。またコンピュータ・プログラム４９０は、その少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって質量スペクトル４６０を変換し、それによって再較正済み質量スペクトル４８０を提供する。出力デバイス４５０は、概して再較正済み質量スペクトルの視覚的な例示、またはグラフィック表現を提供する。理解されるとおり、出力デバイス４５０は、プリンタ・デバイスおよび／またはディスプレイ・デバイスとすることができる。また出力デバイス４５０が通信ポートを含むこともあり、それを介して再較正済み質量スペクトル４８０のようなデータをほかのデバイスへ伝えることができる。
【００２９】
第１および第２のストレージ・デバイス４１０，４２０は、別体のデバイスとして示されている。しかしながら別の実施態様においては、第１および第２のストレージ・デバイス４１０，４２０の内容を共通のストレージ・デバイス内にストア（格納）することができる。それとは異なり、図８に示されている２つに代えて、３もしくはそれを超える数のストレージ・デバイスを使用してもよい。さらに別の実施態様においては、第１および第２のストレージ・デバイス４１０，４２０のうちの１ないしは複数の内容の一部が、プロセッサ・デバイス４３０に関連付けされたメモリ内に埋め込まれる。
【００３０】
入力デバイス４４０は、キーボード、キーパッド、ポインティング・デバイス、あるいはそのほかのタイプのプロセッサ・デバイス４３０を操作するためのコントロールを含むことができる。また入力デバイス４４０は、測定デバイスおよび／または、質量スペクトル４６０および関連情報４７０のようなデータを受信することのできる通信ポートを含むこともある。
【００３１】
プロセッサ・デバイス４３０は、プロセッサ・デバイス４３０が質量スペクトル４６０および関連情報４７０からデータを読み取り、データを処理し、再較正済み質量スペクトル４８０に関連付けされたデータをストアするためのコンピュータ実行可能インストラクションを含むコンピュータ・プログラム４９０を走らせるか、あるいは実行することができる。このコンピュータ・プログラムはまた、プロセッサ・デバイス４３０が質量スペクトル４６０、関連情報４７０、および／または再較正済み質量スペクトル４８０から、出力デバイス４５０に関連付けされたディスプレイ・デバイスおよび／またはプリンタ・デバイスへデータを提供するためのコンピュータ実行可能インストラクションも含むことができる。コンピュータ・プログラムは、プロセッサ・デバイス４３０が、入力デバイス４４０に関連付けされた測定デバイスから、あるいは入力デバイス４４０に関連付けされた通信ポート経由で別のデバイスから質量スペクトル４６０および／または関連情報４７０に関連付けされたデータを要求するためのコンピュータ実行可能インストラクションを含むこともある。またこのコンピュータ・プログラムは、プロセッサ・デバイス４３０が、別のデバイスに対して出力デバイス４５０に関連付けされた通信ポート経由で質量スペクトル４６０、関連情報４７０、および／または再較正済み質量スペクトル４８０に関連付けされたデータを送信するためのコンピュータ実行可能インストラクションを含むこともある。
【００３２】
この方法は、概して、質量対電荷比の比較、または測定済みスペクトルと仮説的スペクトルのピークもしくはピーク間の差の比較から獲得されるデータ集合に対して堅牢な統計的方法を適用することを伴う。堅牢な統計的方法を適用し、それによって少なくとも１つの変換パラメータを提供する。またこの方法は、その少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって質量スペクトルを変換し、再較正済み質量スペクトルを提供することも伴う。
【００３３】
方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを有するコンピュータ可読メディアは、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を含む。質量スペクトルは、それぞれが質量対電荷比に対応する複数のピークを包含する。この方法はまた、標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子の選択も包含する。それに加えてこの方法は、複数のピークの部分集合を包含するデータ集合の作成も包含し、それにおいて複数のピークの部分集合のそれぞれは、複数のあらかじめ決定済みの分子のうちの１ないしは複数に割り当てられる。またこの方法は、データ集合に対して堅牢な統計的方法を適用し、少なくとも１つの変換パラメータを計算することを包含する。さらに加えて、この方法は、少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって質量スペクトルを変換し、それによって再較正済み質量スペクトルを提供することを包含する。
【００３４】
コンピュータ可読メディアは、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を包含する方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを含む。質量スペクトルは、それぞれが質量対電荷比に対応する複数のピークを包含する。この方法はまた、標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子の選択も包含する。この方法は、それに加えて複数のピークからの複数のピークのペアの集合を包含するデータ集合の作成も包含し、それにおいてピークのペアのそれぞれは、複数のあらかじめ決定済みの分子のうちの１つに割り当てられる。またこの方法は、データ集合に対して堅牢な統計的方法を適用し、少なくとも１つの変換パラメータを計算することを包含する。さらに加えて、この方法は、少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって質量スペクトルを変換し、それによって再較正済み質量スペクトルを提供することを包含する。
【実施例１】
【００３５】
グリカン質量スペクトルの再較正
マウスの腎臓からＮ−グリカンの１００を超える質量スペクトルが獲得された。Ｎ−グリカンは、ペプチド：Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）処理により腎臓ペプチド抽出からリリースされ、それに続いて、ここに参照により援用されている非特許文献３に述べられているストラテジのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメトリを使用し、質量スペクトロメトリによる分析に先行してパーメチル化を行った。パーメチル化は、非特許文献４に記述されているとおりの水酸化ナトリウム手法を使用して行われた。ＭＡＬＤＩデータは、ＡＢＩパースペクティブ・バイオシステムズ（ＡＢＩ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のボイジャーＤＥ（登録商標）ｓＳＴＲ質量スペクトル計を、遅延抽出を伴うリフレクトロン・モードで使用して獲得された。パーメチル化後の標本は１０μｌのメタノールに溶解され、溶解標本の１μｌが、１μｌのマトリックス（２，５−ジヒドロ安息香酸）と予混合された後、１００ウェルのステンレス製の標本プレートにロードされた。
【００３６】
質量スペクトルは、最初の約１５の高信頼度のピーク割り当てを見つけることによって再較正された。これらの高信頼度ピークは、比較的高い強度のピーク（通常、もっとも高い２００ピークの間）であり、それに割り当てられた潜在的にマッチするグリカンの理論的な値と緊密にマッチ（調和）するアイソトープ・エンベロープを有しており、かつそれに割り当てられた潜在的にマッチするグリカンの理論的な質量に非常に近い（１００ｐｐｍ内）測定済み質量を有していた。各測定済みのピークｍiについて、測定済み質量と理論的質量の間の偏差ｄi＝｛ｍi−（理論的質量）｝が計算された。ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムが連続的に適用されて、ペア（ｍi，ｄi）が直線ｙ＝Ａｘ＋Ｂに当てはめられ、いずれのピークが高信頼度ピークであるか決定された。測定済み質量ｍのピークについての補正偏差ｄ’は、直線を基礎とする理論的質量と測定済み質量の差ｄ’＝（Ａｍ＋Ｂ）−ｍである。
【００３７】
ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムを使用して作成された質量スペクトルのピークに対するグリカンの割り当てと、現在行われているように人間の専門家によって作成された割り当ての比較が行われた。すべての場合において、このアルゴリズムは、質量スペクトル内の観察されたピークに対するグリカンの有望な組成ならびに構造の意味のある割り当てを提供した。一例が、人間の専門家による手書き注記された図９の質量スペクトルと、ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムを使用して自動注記された図１０の質量スペクトルの比較によって与えられる。１５の手書き注記のピークが、ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムによっても識別された。１５のピークのうちの１２について注記はまったく同一であった；残り３つについて、ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは、２つの有望な構造を提供し、その１つは、手書き注記の１つ（専門家による２つの代替注記を伴う２８１０．３におけるピーク；ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは両方を見つけ出した）と一致した。残りの差は、注記のために選択されたピークの集合における変動に起因する。ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは、もっとも強いピークから開始し、系統的に次の強度に続くという形でピークを選択したが、人間の注記はこの手続きからわずかに逸れていた。
【００３８】
ペプチド質量スペクトルの再較正
ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムを３つの異なるペプチド質量スペクトルの集合に対して適用した。第１の集合は、マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）Ｑ‐ＴＯＦ ＩＩスペクトル計上において測定されたウシの血清アルブミン等の共通基準プロテインからの長さ７〜１５の、トリプシンによって生じたペプチドの７４のＱＴＯＦスペクトルから構成した。第２の集合は、マウスの透明帯プロテインからの長さ６〜２３の、トリプシンによって生じたペプチドの１０６のＱ−ＴＯＦスペクトルから構成した。これらのスペクトルは、分裂の特異性に関係なく、すべてのマウス・プロテインの大きな『デコイ（ｄｅｃｏｙ）』データベースに対してデータベース・サーチを行うことによって識別された。第３の集合は、サーモフィネガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｅｇａｎ）ＬＣＱ−デカ（ＬＣＱ‐Ｄｅｃａ）スペクトル計で測定され、ＮＣＢＩ非冗長プロテイン・データベースに対するデータベース・サーチ（ＳＥＱＵＥＳＴ）によって識別された、共通基準プロテインからの長さ５〜１４のペプチド（トリプシンによって生じたものである必要はない）の１０１のイオン−トラップ・スペクトルから構成した。
【００３９】
ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは、前述の説明から修正された。特に、アルゴリズムは、『真の』直線を表していると決定された部分集合Ｓiのスコアの２．５倍、もしくはマシンの理論的質量精度の評価に対応するユーザ指定の数のいずれかより大きい残余を有するポイントを破棄するべく修正された。この修正は、アルゴリズムがアウトライアの除去に積極的になりすぎることを防ぐ。強いピークが小さいピークより正確になるという観察に基づいて、基本的なアルゴリズムについても最小二乗法ではなく重み付け最小二乗法を使用して『直線上』として分類されたポイントの集合からの直線を改良し、再評価するべく修正を行った。データ・ポイントｐの重みは１／（３＋Ｒａｎｋ（ｐ））であり、それにおいてＲａｎｋ（ｐ）は較正ピークのリスト内のｐのランクに等しい（もっとも強いピークについて１、２番目に強いピークについて２というようにそれ以下も続く）。ＴＯＦ誤差のプロットがわずかなＳ字形状を有するという観察に基づいて、Ｐ内のポイント数が有意に大きい場合には（１４もしくはそれを超えるデータ・ポイント）直線に代えて３次曲線を当てはめるべく基本的なアルゴリズムが修正された。
【００４０】
ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは、次の態様で適用された。すべてのラダーｉについて、評価済み勾配Ａiが、ラダーの最初と最後のピークの間の推定された真の差をそれらの測定済みの差で除することによって計算された。評価Ａiの重みを、長さ２のラダーについて
【数３】
に、長さ３のラダーについて
【数４】
にそれぞれセットし、それにおいてＭＤｉｆｆは、そのラダー内の最初と最後のピークの間の測定済み質量の差を示し、分母内の和は、ラダー内のピークｐにわたって行われるものとした。最終的な勾配Ａの評価は、個別の評価Ａiの重み付けおよび成形後の平均として決定され、それにおいては、評価の上側２０％および下側２０％が切り捨てられ、残りの評価から重み付け平均が求められた。
【００４１】
演繹的（アプリオリ、a priori）な再較正に関する結果が、ピークを識別する帰納的（ポステリオリ、posteriori）な分析によって決定され、それらを次の表１にリストする。
【表１】
【００４２】
これにおいて、ｅｒｒは平均質量誤差（真の質量から測定済み質量を減ずる）を示し、σはスペクトル内のｂ−およびｙ−イオンのピークに関する質量誤差の標準偏差を示す。下付き文字は、較正未済（つまりＵｎｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）および較正済み（つまりＣａｌｉｂｒａｔｅｄ）を表し、Ｍｅｄおよびｍａｘは、スペクトルに関するメディアンおよび最大を表す。たとえば、Ｍｅｄ ｅｒｒＵは、較正未済の質量誤差の平均（ピークに関する）のメディアン（スペクトルに関する）である。比較のため、３次の帰納的（ポステリオリ）な再較正は、ＱＴＯＦについてＭｅｄ σＣ＝０．００３４、ＴＯＦについてＭｅｄ σＣ＝０．０２５１を与える。すべての単位は、Ｄａである。
【００４３】
アルゴリズムのパフォーマンスの最も重要なメトリック（metric）は、再較正後の質量誤差の標準偏差Ｍｅｄ σであり、これは質量測定における一定のオフセット（メディアン誤差を増加することになるが、標準偏差は増加なし）が勾配Ａのみによって補正できないことによる。結果は、再較正前に『代表的な』ＱＴＯＦスペクトルが０．０４０２のオフセット（真の質量から測定済み質量を減ずる；すなわち、測定済み質量は低くなる傾向にある）を有しており、代表的なピークが両方向に０．０２２０の追加の誤差を有していたと考えることによって解釈できる。再較正の後、スペクトルは両方向に０．００８９Ｄａのオフセットを有し、代表的なピークは両方向に０．００７２の追加の誤差を有していた。再較正の後、代表的なＴＯＦスペクトルは０．０２７７のオフセットを有し、代表的なピークは０．０２８６の追加の誤差を有していた。質量誤差の標準偏差は、Ｍｅｄ σＵならびにＭｅｄ σＣにおける差によって反映されるとおり、有意に低下した。このアルゴリズムが質量誤差の標準偏差を増加することはなかったが、ＱＴＯＦスペクトルのうちの３つ、およびＴＯＦスペクトルのうちの２１について、標準偏差に２０％未満の減少があった。
【００４４】
前述したとおり、二重荷電ピークを使用して切片Ｂの評価可能が行われた。しかしながら、ＱＴＯＦおよびＴＯＦのいずれも約半分のスペクトルしか識別可能な二重荷電ピークを有してなく、その種のピークを伴うスペクトルであっても、勾配のみを使用して達成されるものより有意に高い精度まで再較正が可能でなかった。たとえば、ＱＴＯＦについてのＭｅｄ σＣは、０．００７２から０．００５８に向上したが、ＴＯＦについてのＭｅｄ σＣは、０．０２８６から０．０２８４に変化したに過ぎない。新しい（de novo）シーケンスについては、Ｂが相対的なピークの場所、たとえば連続するｙ−イオンの間の差に影響せず、それらの絶対的な場所にのみ影響することから、Ｂは、Ａより重要性が低い。
【００４５】
親イオンの質量もまた再較正が行われた。親の質量の正確な決定は、データベース・ルックアップ方法が使用されるときに候補の消去を補助し、また新しいシーケンスの共通スケール上におけるｂ−およびｙ−イオンの配置を補助する。親イオンの質量は、すでにタンデムＭＳの最初のラウンドで測定されているが、再較正を使用して精度を向上することができる。適格ピークｐおよびｑの各ペア、すなわちそれらのｍ／ｚ測定値の和が、親の質量のユーザ指定許容値（ＱＴＯＦについて０．２Ｄａ、ＴＯＦについて０．３Ｄａ）にプロトンを加えた範囲内となる各ペアは、合計質量の評価を提供する。親イオンの質量は、相補ペアの重み付け平均として再較正され、それにおいて各ペアの平均には、１／（Ｒａｎｋ（ｐ）＋Ｒａｎｋ（ｑ））として重み付けが行われた。相補ペアが存在しないというまれなケースでは、親イオンの質量が変更されなかった。成形後の平均は、通常、質量スペクトル内にわずかな相補ペアしか含まれないために使用されなかった。ＱＴＯＦについては、メディアン誤差が０．０９８２から０．００４５に向上した；最悪誤差は、０．１９６８から０．０９１８に向上した。７４のスペクトルのうち１つだけに関しては、再較正によって誤差が悪化し、０．０６１９から０．０８８０に変化した。ＴＯＦについては、メディアン誤差が０．１９０２から０．０６１４に向上した；最悪誤差は、０．４５９４から０．３２７２に向上した。１０６のスペクトルのうち６つに関しては誤差が悪化し、最悪で０．１１８５から０．１６４０に変化した。
【００４６】
概して言えば、演繹的（アプリオリ）な再較正は非常に成功であり、特にＴＯＦスペクトルについては、達成されたパフォーマンスが帰納的（ポステリオリ）な再較正よりわずかに悪いだけだった。ＱＴＯＦとＴＯＦの誤差の間の相違は、測定誤差における差からの結果であった。ＴＯＦの場合は、測定誤差が切片Ｂと概略で等しく、したがってＢを評価するためのデータの欠如は、主要な問題ではない。それに対してＱＴＯＦの測定誤差はＢより小さく、約４分の１であり、したがってＢを伴う回帰モデルは、部分的な成功が達成されているだけである。
【００４７】
帰納的（ポステリオリ）な再較正については、ペプチドのアミノ酸シーケンスが既知であると仮定した。これは、データベースを使用して未知のスペクトルの質量スペクトルに比較するための候補シーケンスを調べるときに生じ得る；各候補シーケンスもまた、正しいシーケンスと見なされる。この正しいシーケンスは、質量スペクトルを良好に再較正し、その結果、多数のピークが予測されたイオンに対応する。これに対して、正しくないシーケンスは、スペクトルをあまり良好に再較正せず、より少ないピークがイオンに対応する。これが正しいことは、各候補シーケンスに対して割り当てられるスコアに反映される。
【００４８】
帰納的（ポステリオリ）な再較正の場合、適格ピークが、演繹的（アプリオリ）な再較正とは異なる方法によって選択された。前処理ステップが、より低い強度のピークの通過を可能にし（アミノ酸の数の１５倍までのランクを伴う）、またｂ−およびｙ−イオンに加えて、ａ−イオンおよびに水分損失にマッチするピークも考慮された。当初、ユーザ指定の相対許容範囲（ＱＴＯＦについて１５０ｐｐｍ、ＴＯＦについて２５０ｐｐｍ）内の観察されたピークにマッチする予測されたピークのそれぞれについてデータ・ポイントが定義された。ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムが使用されて、それらのポイントに対する回帰直線の当てはめが行われた。その後、再較正の第２ラウンドが実行され、今度はピーク識別のためにユーザ指定の絶対許容範囲（ＱＴＯＦについて０．０２５Ｄａ、ＴＯＦについて０．１０Ｄａ）が用いられた。ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムが使用され、ユーザによって選択されたポイントの新しい集合に対する直線もしくは３次曲線のいずれかの当てはめが行われた。アルゴリズムは、ポイント数が１４より少なければ『３次』が選択されていた場合であっても直線当てはめだけを行う。
【００４９】
帰納的（ポステリオリ）な再較正に関する結果を次の表２にリストする。
【表２】
これにおいて、ｅｒｒは平均質量誤差（真の質量から測定済み質量を減ずる）を示し、σはスペクトル内のａ−、ｂ−およびｙ−イオンのピーク、およびそれらの水分損失に関する質量誤差の標準偏差を示す。『直線』当てはめは、常に回帰直線を使用し；『３次』当てはめは、ポイントの数が少なくとも１４であれば３次曲線を使用し、それ以外の場合には直線を使用する。ほとんどのスペクトル、すなわち７４のＱＴＯＦスペクトルのうちの４９、１０６のＴＯＦスペクトルのうちの９１が３次曲線に適格であった。すべて単位はＤａである。
【００５０】
ここに示されているとおり、３次曲線は直線回帰よりパフォーマンスがわずかに良好であるに過ぎない。比較すると、通常の重み付けのない最小二乗直線当てはめは、有意に、より悪い結果をもたらす。７４のＱＴＯＦスペクトルについて、予測されたピークの１５０ｐｐｍ内のすべてのピークに対して直線が当てはめられた最小二乗の１ラウンドでは、Ｍｅｄ σＣ＝０．０１０６およびＭａｘ σＣ＝０．０３６６がもたらされているが、それに比べて、２ラウンドのＲＡＮＳＡＣアルゴリズムの使用を伴う場合には、それぞれ０．００３４および０．００５８となる。通常の、１５０ｐｐｍおよび０．０２５Ｄａをスレッショルド（閾値）として使用する２ラウンドの最小二乗は、１ラウンドより有意に良好であり、Ｍｅｄ σＣ＝０．００３９およびＭａｘ σＣ＝０．００７６を達成する。
【００５１】
再較正におけるより悪い結果は、新しいシーケンスにおけるより悪い結果となった。７４のＱＴＯＦスペクトルが、変換文字、およびＱについてＫ、ＭＦについてＤＹといった近い質量の代用を伴うシーケンス等のもっともらしいデコイ（それぞれ２００〜１０００デコイ）に対してスコアが与えられた。このスコア付けは、識別されたピークの重み付けを、予測された質量に対する近さによって、またその種のピークの観察の何らかの演繹的（アプリオリ）な確率によって行う（その結果、中心のｙ−イオンが高い重みを有する）。再較正はいずれも、２２．５の正解、すなわちもっとも高いスコアのシーケンスが実際に真のシーケンスであったという意味での正解をまったくもたらさなかった。最初に互いのシーケンスと結びつけられた真のシーケンスが関係する５つのスペクトルは、それぞれ１／２の正解としてカウントされた。通常の最小二乗は３９の正解をもたらし；２ラウンドの最小二乗は５４の正解をもたらし；２ラウンドのＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは６２正解をもたらした。最良結果−６５の正解−は、３次曲線のオプションを伴わなかった２ラウンドのＲＡＮＳＡＣアルゴリズムによって得られた。スコア付けのパフォーマンスは、敏感に再較正に依存すると見られる；２ラウンドの最小二乗と直線ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムの間のＭｅｄ σＣにおける微差（０．００３９対０．００３４）は、スコア付けにおける有意の差（２０の誤差対９の誤差）となった。
【００５２】
図１１は、帰納的（ポステリオリ）な再較正の後の全７４のＱＴＯＦスペクトルのピークの質量誤差を示したヒストグラムである。これには、強いピーク（１から２０までのランクを伴うもの）が、弱いピーク（ランク＞２０）より正確に測定されたことが示されている。なお、図１１では、強いピークが弱いピークより正確に測定されることを示している。
【００５３】
帰納的（ポステリオリ）な再較正は、イオン−トラップ・データに対しても行われた。イオン‐トラップが構造的誤差を有していないことから、ピーク識別の第１および第２ラウンドの両方において絶対許容範囲（それぞれ０．４０Ｄａおよび０．３５Ｄａ）が使用された。その結果は、表２に含まれている。較正未済のイオン−トラップ・スペクトルは、小さな一定のオフセットを有していたが、これは補正可能であり、Ｍｅｄ ｅｒｒＵ＝０．０６６３がＭｅｄ｜ｅｒｒＣ｜＝０．０１６７に改善されたという事実に反映されている。しかしながら、誤差の標準偏差の有意な改善はなく、Ｍｅｄ σＵ＝０．１０１０はＭｅｄ σＣ＝０．０９９６よりそれほど有意に大きくないという事実に反映されている。最悪イオン−トラップ・スペクトルは、それらの誤差においてわずかに線形の傾向を有し、それは、Ｍａｘ σＵ＝０．１９２０がＭｅｄ σＣ＝０．１６６２に改善されたという事実に反映される。
【００５４】
［好ましい態様］
（１）前記データ集合を作成するステップは、さらに、
複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比を決定し、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比のそれぞれが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つから決定され、
前記複数のピークの１つと、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比の１つを比較し、
前記比較のステップに応答して、前記データ集合に含めるために前記複数のピークの前記１つを選択することを含む請求項１に記載の方法。
【００５５】
（２）前記データ集合を作成するステップは、さらに、
複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比を決定し、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比のそれぞれが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つから決定され、
前記複数のピークの１つと、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比の１つを比較し、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比の前記１つが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つと関連付けされ、
前記複数のあらかじめ決定済みの分子の前記１つについて、分子質量アイソトープ・エンベロープを決定し、
前記複数のピークの前記１つに関連付けされたピークのアイソトープ・エンベロープと、前記分子質量アイソトープ・エンベロープを比較し、
前記複数のピークの１つを比較するステップおよびピークのアイソトープ・エンベロープを比較するステップに応答して、前記データ集合に含めるために前記複数のピークの前記１つを選択することを含む請求項１に記載の方法。
【００５６】
（３）複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するためのシステムであって、
質量対電荷比に対応する複数のピークを含む質量スペクトルを維持するべく機能する第１のストレージ・デバイスと、
（ｉ）前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、（ｉｉ）前記複数のピークからピークのペアを包含するデータ集合を作成し、前記ピークのペアのそれぞれは、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つに割り当てられ、（ｉｉｉ）堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、かつ（ｉｖ）前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、再較正済み質量スペクトルを提供するコンピュータ・プログラムを含むコンピュータ実行可能インストラクションを維持するべく機能する第２のストレージ・デバイスと、
前記第１ストレージ・デバイスおよび第２のストレージ・デバイスと通信し、かつ前記コンピュータ・プログラムを実行し、前記再較正済み質量スペクトルを提供するべく機能するプロセッサと、
を含むシステム。
【００５７】
（４）複数の巨大分子の質量スペクトルを獲得し、前記質量スペクトルが複数のピークを含み、前記複数のピークのそれぞれを質量対電荷比に対応させ、
前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、
前記複数のピークからの複数のピークのペアを含むデータ集合を作成し、前記複数のピークのペアのそれぞれが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つに対して割り当てられ、
堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、
前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、前記再較正済み質量スペクトルを提供すること
を包含する方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを有するコンピュータ可読メディア。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】異なる時間に同一のＴＯＦ計測器上おいて同一標本から得られた２つの質量スペクトルを示したグラフである。
【図２】異なる時間に同一のＴＯＦ計測器上おいて同一標本から得られた２つの質量スペクトルを示したグラフである。これら２つのグラフは、偏差（観察された質量から理論的質量を引いた値）対ピークの測定済み質量のプロットであり、計測器のバイアスがスペクトル間でどのように変化するかを示している。
【図３】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図４】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図５】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図６】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図７】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図８】例示の実施態様のシステムの概略図である。
【図９】各ピークにグリカンを割り当てる人間の専門家によるマウスの腎臓スペクトルのマニュアル注釈を示した説明図である。
【図１０】各ピークにグリカンを割り当てるＲＡＮＳＡＣアルゴリズムによるマウスの腎臓スペクトルの自動注釈を示した説明図である。
【図１１】ポステリオリな再較正の後の全７４のＱＴＯＦスペクトル内のピークの質量誤差を示すヒストグラムである。
【符号の説明】
【００５９】
４００ システム、４１０ 第１のストレージ・デバイス、４２０ 第２のストレージ・デバイス、４３０ プロセッサ・デバイス、４４０ 入力デバイス、４５０ 出力デバイス、４６０ 質量スペクトル、４７０ 関連情報、４８０ 再較正済み質量スペクトル、４９０ コンピュータ・プログラム。
【技術分野】
【０００１】
例として示すこの実施態様は、測定済み質量が真の質量により近く変換されるように行う測定済み質量スペクトルの再較正における堅牢な統計的方法の使用に関する。質量スペクトロメトリのための較正テクニックに関連する特定の応用が見出されており、特にそれに言及して説明を行う。
【背景技術】
【０００２】
測定の不確かさは、スペクトル計の精度ならびにバイアスの正確な評価によって最小化される。使用する計測器のタイプには内在的な精度の上限がある。たとえば、ＦＴＭＳは１〜２ｐｐｍの精度（代表的な１０００Ｄａのｍ／ｚにおいて０．００１Ｄａ）を有し、ＱＴＯＦは１０ｐｐｍの公称精度（０．０１Ｄａ）を有する。しかしながら、精度は計測器のセットアップに応じても変化する。バイアスのための補正を行うパラメータもまた、セットアップごとに、さらにはスペクトルごとに異なるものとなり得る。図１および２に一例が提供されているが、これらは、異なる時間に同一のＴＯＦ計測器上おいて同一標本から得られた２つの質量スペクトルを示している。これら２つのグラフは、偏差（観察された質量から理論的質量を引いた値）対ピークの測定済み質量のプロットである。それぞれの場合において、偏差は、ピークの質量とともに直線的に変化する。直線当てはめが示されており、精度（直線に対するポイントの近さ）が類似している場合であってもバイアス（直線の傾き）が極めて異なる（２つのグラフのｙ軸の間の差に注意）ことは明らかである。
【０００３】
【非特許文献１】ルソー（Ｒｏｕｓｓｅｅｕｗ）ＰＪ、およびレロイ（Ｌｅｒｏｙ）ＡＭ著『堅牢退行及びアウトライア検出（Ｒｏｂｕｓｔ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｕｔｌｉｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）』、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）出版（１９８７年）
【非特許文献２】フィシュラー（Ｆｉｓｃｈｌｅｒ）ＭＡほか著『コミュニケーション・オフ・ザＡＣＭ（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＣＭ）』、２４（６）、ｐ３８１-３９５（１９８１年）
【非特許文献３】サットン-スミス（Ｓｕｔｔｏｎ?Ｓｍｉｔｈ）Ｍほか著『テトラヘドン：アシンメトリ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）』、１１（２）、ｐ３６３?３６９（２０００年）
【非特許文献４】デル（Ｄｅｌｌ）Ａほか著『セル・バイオロジー（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）：ア・ラボラトリ・ハンドブック（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）』第４巻、Ｊ．Ｅ．セリス（Ｃｅｌｉｓ）編集、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）サンディエゴ、インプレス
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この例示の実施態様は、上記ならびにそのほかの問題を克服する新しい改善された較正方法、関連システム、およびメディアを企図している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この例示の実施態様の第１の側面においては、複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するための方法が提供される。この方法は、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を包含する。質量スペクトルは、複数のピークを含み、そのそれぞれが質量対電荷比に対応する。またこの方法は、標本に適した複数のあらかじめ決定済み分子の選択も包含する。
【０００６】
さらにこの方法は、複数のピークの部分集合を包含するデータ集合の作成を包含し、それにおいて複数のピークの部分集合内の各ピークは、複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられる。またこの方法は、堅牢な統計的方法をデータ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算することも包含する。それに加えて、この方法は、その変換パラメータのうちの少なくとも１つを使用することによる質量スペクトルの変換を包含し、それによって再較正済み質量スペクトルを提供する。
【０００７】
別の態様において、この例示の実施態様は、複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するための方法を提供する。この方法は、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を含む。質量スペクトルは、複数のピークを含み、そのそれぞれが質量対電荷比に対応する。またこの方法は、標本に適した複数のあらかじめ決定済み分子の選択も含む。さらにこの方法は、複数のピークからの複数のピークのペアを包含するデータ集合の作成を含み、それにおいてピークのペアのそれぞれは、複数のあらかじめ決定済みの分子の１つに対して割り当てられる。またこの方法は、堅牢な統計的方法をデータ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算することも含む。それに加えて、この方法は、その少なくとも１つの変換パラメータを使用することによる質量スペクトルの変換を含み、それによって再較正済み質量スペクトルを提供する。
【０００８】
別の態様においてこの例示の実施態様は、複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するためのシステムを提供する。このシステムは、質量スペクトルを維持するべく機能する第１のストレージ・デバイスを含む。質量スペクトルは複数のピークを含み、複数のピークのそれぞれは、質量対電荷比に対応する。またこのシステムは、（ｉ）標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、（ｉｉ）複数のピークの部分集合を含むデータ集合を作成し、それにおいて複数のピークの部分集合の各ピークは、複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられ、（ｉｉｉ）そのデータ集合に堅牢な統計的方法を適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、かつ（ｉｖ）その少なくとも１つの変換パラメータを使用して質量スペクトルを変換し、それによって再較正済み質量スペクトルを提供するコンピュータ・プログラムを含むコンピュータ実行可能インストラクションを維持するべく機能する第２のストレージ・デバイスを含む。さらにこのシステムは、第１および第２のストレージ・デバイスと通信し、かつそのコンピュータ・プログラムを実行して再較正済み質量スペクトルを提供するべく機能するプロセッサを含む。
【０００９】
さらに別の側面において、この例示の実施態様は、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を含む方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを有するコンピュータ可読メディアを提供する。質量スペクトルは、複数のピークを含み、そのそれぞれが質量対電荷比に対応する。またこの方法は、標本に適した複数のあらかじめ決定済み分子の選択も含む。さらにこの方法は、複数のピークの部分集合を包含するデータ集合の作成を含み、それにおいて複数のピークの部分集合の各ピークは、複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられる。またこの方法は、堅牢な統計的方法をデータ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算することも含む。それに加えて、この方法は、その少なくとも１つの変換パラメータを使用することによる質量スペクトルの変換を含み、それによって再較正済み質量スペクトルを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
未知の巨大分子または断片の質量スペクトルを、スペクトル自体のピークを使用して再較正し、それによって分子識別を実行する能力を向上させるための新しい方法が提供されている。ここで使用されている表現『再較正』は、測定済みｍ／ｚの読みがそのｍ／ｚの読みの『真の』値に近くなるように、スペクトルのピークおよび／またはピーク間の差に対して特定の分子の仮の割り当てを行うことを基礎とした測定済みｍ／ｚの読みの補正を言う。この方法は、３つの異なる試験所から得られたＴＯＦ、ＱＴＯＦ、およびイオン−トラップ計測器からのグリカンならびにペプチド・スペクトルに対してテストされたが、飛行時間型質量スペクトル計からのスペクトルに特に適している。再較正の後は、１００〜４０００Ｄａの全質量範囲にわたってＴＯＦスペクトルの精度が、通常、約０．０３Ｄａとなる。ＱＴＯＦスペクトルの精度は、１００〜２０００Ｄａの質量範囲にわたって、通常、約０．００５ダルトンである。この精度は、一般に自己較正前に観察される５０〜１００ｐｐｍ（すなわち、１０００Ｄａにおいて０．１Ｄａ）より有意に良好であり、１０ｐｐｍとする計測器製造業者の公称精度さえも上回る。この改良は、識別のためのエラー・レートの大きな縮小となる。
【００１１】
なお、図１、図２に示すこれら２つのグラフは、偏差（観察された質量から理論的質量を引いた値）対ピークの測定済み質量のプロットであり、計測器のバイアスがスペクトル間でどのように変化するかを示している。
【００１２】
主要なストラテジは、測定済み質量スペクトルの再較正に対する堅牢な統計的方法の適用である。この『堅牢』という表現は、任意量による単一データ・ポイントの変更が、式または計算の結果を任意量により変化させない統計的方法を言う。質量スペクトルの再較正において堅牢な統計的方法を使用する利点は、その種の方法が非常に多くの数の不正確なデータポイントを許容しており、それにもかかわらず正しい結果を見つけ出せることである。
【００１３】
概して言えば、この方法は、標本またはその標本内の分子の質量スペクトルの獲得することを伴う。またこの方法は、標本、その標本内に含まれると考えられている分子に関する情報、あるいはその標本内の分子を決定するために使用できる情報の獲得も伴う。その種の情報の特定の例として、限定する意図ではないが、アイソトープ・エンベロープに関する情報；標本内の分子、断片、イオン、またはそれらの組成物に関する情報；およびそのほかの分子、断片、イオン、またはそれらの組成物に関する情報が挙げられる。特定のストラテジにおいては、これらの情報がアイソトープの質量の分布に関係することがある。例示の実施態様の特定の変形においては、ここに述べた情報を少なくとも部分的に使用し、質量スペクトルに対して候補識別が割り当てられるか作られる。これらの初期識別からデータ集合が準備される。１ないしは複数の比較を行ってデータ集合を生成することができる。このデータに対して堅牢な統計的方法が実行されて１ないしは複数の変換パラメータが生成され、続いてそれが質量スペクトルの変換に使用されて、再較正済み質量スペクトルが提供される。
【００１４】
特に質量スペクトルについて、この例示の実施態様のストラテジは、既知の真の質量
【数１】
を有する観察された質量ｍiのいくつかのピークを見つけ出し、
【数２】
をｍiに対してプロットすることである。ＱＴＯＦ質量スペクトル計の場合には、この曲線が直線に非常に近くなる。妥当な評価がピークのいくつかの真の質量からなされるとき、適正な評価が滑らかな曲線上に位置することになり、堅牢な統計における周知のテクニックを使用してその曲線を見つけ出し、不正確な評価（または『アウトライア』）の中から正しい評価（または『線上の』）見分けることが可能になる。この種の統計的テクニックの１つが、最小二乗平均法（『ＬＭＳ』）である。非特許文献１を参照されたい。ＬＭＳの実際的な具体化は、『ランダムサンプリング一致（Ｒａｎｄｏｍ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）』またはＲＡＮＳＡＣを使用する。ＲＡＮＳＡＣについてのさらに詳しい情報は、非特許文献２から得ることができる。質量スペクトルの場合は、ｙ＝Ａｘ＋Ｂの形式のアフィン（affine）変換が求められ、それにおいてｘは測定済み質量、ｙは真の質量である。
【００１５】
ＬＭＳ計算の一例を示すと次のようになる。平面内のｎ個のポイントからなるデータ集合Ｐが識別され、そのいくつかが直線上にあるが、多くは外れている。目的は、この直線の式を明らかにすることである。ｋ個のポイントからなる複数の部分集合ＳｊがＰからランダムに選択され、それにおいて、ｋはｎに比べて小さい数であり、ｊは部分集合の数であり、一般に大きな数になる。概して言えば、ｋおよびｊは、充分に大きな数ｊにわたって部分集合Ｓｊがアウトライアに汚染させることなく、良好な回帰線を提供するように選択される。その後、以下の方法によって各部分集合Ｓｊにスコアが与えられる。最初に、周知の最小二乗法を使用してｋ個のポイントに直線が当てはめられる。続いて、Ｐ内の各ポイントについて、そのポイントから当てはめ直線までの垂直距離が決定される；この距離は、残余として知られている。Ｐ内の各ポイントについての残余が平方される。平方後の残余のメディアンが決定され、その部分集合Ｓｊのためのスコアとしてそれが使用される。もっとも低いスコアを伴う部分集合Ｓｊによって決定される直線が、『真の』直線を表すとして採用される。『真の』直線の評価は、その後さらに、Ｐ内の各ポイントを『直線上』または『アウトライア』として分類した後、『直線上』として分類済みのポイントだけを用いて直線の式の再評価を行うことによって改良される。
【００１６】
ペプチドの場合には、通常、質量スペクトル上のピークがアミノ酸の特異シーケンスに属するとしてのラベル付けが困難である。単一アミノ酸を表すピークが生じることはほとんどない。アミノ酸の組み合わせが類似の質量を有することも可能である。たとえば、ＰＴ（１９８．１０１Ｄａ）およびＶＶ（１９８．１３６Ｄａ）等のアミノ酸ペアが計測器の精度内の質量を持つとき、ｂ２またはｙ２イオンを指定することは困難となり得る。したがって、この例示の実施態様は、測定済み質量自体ではなく測定済み質量の間における差を使用する。続いてこれらの差と既知の『真の』質量を比較する。たとえば、スペクトルが、４００．２００、５１５．２２３および６６２．２８９に強度のピークを含むとき、最初の差（５１５．２２３−４００．２００＝１１５．０２３）がアミノ酸Ｄ（１１５．０２７ Ｄａ）に、２番目の差（６６２．２８９−５１５．２２３＝１４７．０６６）がアミノ酸Ｆ（１４７．０６８ Ｄａ）に対応するとの結論は、仮に４００．２００におけるピークに属する特異シーケンスが決定できなかったとしても妥当性がある。その後これらの差を使用し、ポイント（０，０）、（１１５．０２３，１１５．０２７）、および（２６２．０８９，２６２．０９５）に対する最小二乗を使用して直線を当てはめることによって勾配Ａを評価することができる。
【００１７】
切片Ｂは、二重荷電イオンを使用することによって評価可能である。たとえば、スペクトルが７７５．４０２Ｄａにピークを含み、二重荷電イオンについてのピークを３８８．２００に含むとき、式Ａ×７７５．４０２＋Ｂ＝（Ａ×３８８．２００＋Ｂ）−１．００７３と記述することが可能であり、それにおいて１．００７３は、プロトンの質量である。Ｂの評価を、Ａの評価と組み合わせて獲得することができる。その後、アフィン変換ｙ＝Ａｘ＋Ｂをすべての質量測定値に対して適用する。
【００１８】
堅牢な統計的方法、特にＬＭＳが適用されて、標本グリカンの質量スペクトルの再較正が行われる。良好なアイソトープ・エンベロープならびに、予測された質量と観察された質量の間に小さい誤差を伴うピークが識別される。続いてＬＭＳが使用され、標本質量スペクトルと、既知のあるいは理論的なグリカンの質量スペクトルが比較されてバイアスを表す勾配Ａが評価され、その後、再較正が行われて全プロセス（ピークの識別および再較正を含む）が反復される。この反復は、完全に較正未済の飛行時間型スペクトルからのピークの識別が困難であることから重要である。困難は、誤差が質量とともに直線的に成長し、高い質量ピークについて非常に大きくなることであり、そのため最初の反復がしばしば、１０００Ｄａといった小さい質量を伴うピークだけを識別することになる。少ない数のラウンドの後に反復が終了し、スペクトルのすべての測定済み質量に対してアフィン変換ｙ＝Ａｘ＋Ｂが適用される。
【００１９】
堅牢な統計的方法、特にＬＭＳが適用されて、標本ペプチドの質量スペクトルの再較正が行われる。標本ペプチドの質量スペクトルを、既知のペプチドのデータベースと比較し、ベストマッチ（最良調和）を決定する比較の前にＬＭＳを使用してそれらの質量スペクトルを再較正することができる。それに代えて、新しいペプチド・シーケンスの場合には、ＬＭＳを使用して標本ペプチドの質量スペクトルと理論的なペプチドの質量スペクトルを比較し、勾配Ａを評価することができる。
【００２０】
このほかの、反復最小二乗等の堅牢な統計的方法を使用し、標本巨大分子の質量スペクトルの再較正を行う。反復最小二乗法においては、Ｐ内のすべてのポイントについて最小二乗法を使用し、ＡおよびＢが解決される。もっとも多くの誤差（たとえば最悪の２０％）を伴うポイントが削除され、最小二乗法が再び繰り返される。
【００２１】
広い配列の巨大分子の、特に質量スペクトルの分析を再較正し、あるいは取り扱うことができる。たとえば、巨大分子をペプチド、グリカン、あるいは脂質とすることができる。ここで使用される場合、表現『ペプチド』は、化学的に互いにリンクした２もしくはそれを超える数のアミノ酸を言う。アミノ酸の数が比較的大きい場合に、しばしばそのストリングがポリペプチドと呼ばれる。より詳細に述べれば、巨大分子は、質量に対する何らかの制限、たとえばペプチドがアミノ酸の小さい集合からなるとの制限を含む任意クラスの分子からなるとすることができる。別の例としては、多糖類を、糖の小さい集合からなると制限することができる。また巨大分子を、アミノ酸、イオン化ペプチド、イオン化ポリペプチド、イオン化アミノ酸、あるいはそれらの混合とすることも可能である。さらには巨大分子を、糖、でんぷん、セルロース、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、イオン化グリカン、イオン化糖類、イオン化でんぷん、イオン化セルロース、イオン化単糖類、イオン化二糖類、イオン化オリゴ糖類、あるいはそれらの混合とすることも可能である。この例示の実施態様は、非生物学的分子の分析に対しても適応することができる。
【００２２】
ここで特に図３を参照すると方法１００が提供されており、この方法１００においては、シーケンスまたは方法が１１０において開始される。ピークの集合を含む入力質量スペクトルが、１２０において獲得される。標本に適したあらかじめ決定済みの分子が１３０において選択される。１４０において、ピークの集合の部分集合を包含するデータ集合が入力質量スペクトルから作成される。このデータ集合に対して堅牢な統計的方法が１５０において適用され、１ないしは複数の変換パラメータが計算される。１６０においては、この１ないしは複数の計算された変換パラメータを使用して質量スペクトルが変換され、再較正済み質量スペクトルが提供される。このシーケンスは、オペレータによる終了時に１７０において停止するか、反復される。
【００２３】
いくつかの代替実施態様においては、ピークの集合の部分集合を包含するデータ集合を作成する１４０における操作が次のように行われる。図４を参照すると、図３のプロセス１３０から１４２Ａに進み、あらかじめ決定済みの分子のｍ／ｚ比の集合が決定される。それに加えて１４３Ａにおいては、質量スペクトルから入力質量スペクトルのｍ／ｚ比の集合が決定される。これらのｍ／ｚ比は、１４４Ａにおいて比較され、その結果が１４６Ａにおいて使用されてデータ集合が組み立てられる。
【００２４】
図５においては、１４０におけるデータ集合を作成する操作を、次のように実行することができる。あらかじめ決定済みのｍ／ｚ比の集合が１４１Ｂにおいて決定される。１４２Ｂにおいては、入力質量スペクトルのｍ／ｚ比の集合が決定される。続いてあらかじめ決定済みのｍ／ｚ比と入力質量スペクトルのｍ／ｚ比が１４３Ｂにおいて比較される。あらかじめ決定済みの分子のうちの少なくとも１つについて、分子質量のアイソトープ・エンベロープが１４４Ｂにおいて決定される。その後、あらかじめ決定済みのｍ／ｚ比に関連付けされたエンベロープと、入力質量のｍ／ｚ比に関連付けされたエンベロープを１４６Ｂにおいて比較する。そのポイントにおいて比較１４６Ｂの結果を使用し、１４８Ｂにおいてデータ集合を作成する。
【００２５】
再較正のための代替方法２００は、図６に示されるとおりに提供される。このシーケンスは、２１０において開始される。ピークの集合を含む入力質量スペクトルが、２２０に入力される。標本に適したあらかじめ決定済みの分子が２３０において選択される。このピークの集合からピークのペアの集合を含むデータ集合が作成される。このデータ集合に対し、２５０において堅牢な統計的方法が適用されて１ないしは複数の変換パラメータが計算される。２６０においては、この１ないしは複数の変換パラメータを使用して質量スペクトルが変換され、再較正済み質量スペクトルが提供される。このシーケンスは、オペレータによる終了時に２７０において停止するか、反復される。
【００２６】
図７に示されているとおり、データ集合を作成する２４０における操作は、いくつかの応用において次のように行うことができる。２４２においては、あらかじめ決定済みの分子のｍ／ｚ比の集合が決定される。ピークのペアの集合の１つのピーク間の差の１つと、あらかじめ決定済みの分子のｍ／ｚ比の集合の１つが２４４において比較される。２４６において、ピークのペアの集合の１つが、データ集合に含めるために選択される。
【００２７】
このシステムは、概して質量スペクトル・データならびに関連情報、およびコンピュータによる分析ならびにここで説明している方法を実行するコンピュータ・プログラムをストアする、コンピュータ可読メディア等の情報ならびにデータを保持するための１ないしは複数のストレージ・デバイスを包含する。さらにこのシステムは、プロセッサ、入力デバイス、およびオプションの出力デバイスを包含する。ここで用いている表現『コンピュータ可読メディア』は、任意タイプのコンピュータ・メモリまたはストレージ・デバイスを含み、限定するものではないが、フレキシブルディスク、ハードディスク、ＣＤ‐ＲＯＭ、フラッシュＲＯＭ、不揮発性ＲＯＭ、およびＲＡＭ等である。
【００２８】
ここで特に図８を参照すると、第１のストレージ・デバイス４１０、第２のストレージ・デバイス４２０、プロセッサ・デバイス４３０、入力デバイス４４０、および出力デバイス４５０を含むシステム４００が例示されている。各デバイスは、有線またはワイヤレス通信パス、たとえばネットワーク、シリアルもしくはパラレル・ポート、またはそのほかの任意の適切な通信手段等を介してプロセッサ・デバイス４３０と通信する。このシステム４００は、標本の再較正済み質量スペクトルを提供し、その標本は、１ないしは複数の巨大分子を含むことができる。システム４００は、第１のストレージ・デバイス４１０を含み、第１のストレージ・デバイス４１０が質量スペクトル４６０、質量スペクトルに対応する関連情報４７０、および再較正済み質量スペクトル４８０を維持するべく機能する。またシステム４００は、第２のストレージ・デバイス４２０も含み、第２のストレージ・デバイス４２０が種々の異なる構成でプログラム可能なコンピュータ・プログラム４９０を含むコンピュータ実行可能インストラクションを維持する。コンピュータ・プログラム４９０は、ピークまたはその種のピークを示す情報の集合を含む質量スペクトルの入力および／または保持を行うべくプログラムすることができる。またコンピュータ・プログラム４９０は、あらかじめ決定済みの、標本に適した分子を選択するべくプログラムすることができる。さらにコンピュータ・プログラム４９０は、追加として、ピークの集合の部分集合を構成するデータ集合を作成するべくプログラムすることができる。別の構成においては、コンピュータ・プログラム４９０を、ピークまたはその種のピークを示す情報の集合を含む質量スペクトルの入力および／または保持を行うべくプログラムすることができる。またコンピュータ・プログラム４９０は、あらかじめ決定済みの、標本に適した分子を選択するべくプログラムすることができる。さらにコンピュータ・プログラム４９０は、ピークの集合からピークのペアの集合を構成するデータ集合を作成するべくプログラムすることができる。いずれの構成においても、コンピュータ・プログラム４９０がデータ集合に対して堅牢な統計的方法を適用し、それによって少なくとも１つの変換パラメータを提供する。またコンピュータ・プログラム４９０は、その少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって質量スペクトル４６０を変換し、それによって再較正済み質量スペクトル４８０を提供する。出力デバイス４５０は、概して再較正済み質量スペクトルの視覚的な例示、またはグラフィック表現を提供する。理解されるとおり、出力デバイス４５０は、プリンタ・デバイスおよび／またはディスプレイ・デバイスとすることができる。また出力デバイス４５０が通信ポートを含むこともあり、それを介して再較正済み質量スペクトル４８０のようなデータをほかのデバイスへ伝えることができる。
【００２９】
第１および第２のストレージ・デバイス４１０，４２０は、別体のデバイスとして示されている。しかしながら別の実施態様においては、第１および第２のストレージ・デバイス４１０，４２０の内容を共通のストレージ・デバイス内にストア（格納）することができる。それとは異なり、図８に示されている２つに代えて、３もしくはそれを超える数のストレージ・デバイスを使用してもよい。さらに別の実施態様においては、第１および第２のストレージ・デバイス４１０，４２０のうちの１ないしは複数の内容の一部が、プロセッサ・デバイス４３０に関連付けされたメモリ内に埋め込まれる。
【００３０】
入力デバイス４４０は、キーボード、キーパッド、ポインティング・デバイス、あるいはそのほかのタイプのプロセッサ・デバイス４３０を操作するためのコントロールを含むことができる。また入力デバイス４４０は、測定デバイスおよび／または、質量スペクトル４６０および関連情報４７０のようなデータを受信することのできる通信ポートを含むこともある。
【００３１】
プロセッサ・デバイス４３０は、プロセッサ・デバイス４３０が質量スペクトル４６０および関連情報４７０からデータを読み取り、データを処理し、再較正済み質量スペクトル４８０に関連付けされたデータをストアするためのコンピュータ実行可能インストラクションを含むコンピュータ・プログラム４９０を走らせるか、あるいは実行することができる。このコンピュータ・プログラムはまた、プロセッサ・デバイス４３０が質量スペクトル４６０、関連情報４７０、および／または再較正済み質量スペクトル４８０から、出力デバイス４５０に関連付けされたディスプレイ・デバイスおよび／またはプリンタ・デバイスへデータを提供するためのコンピュータ実行可能インストラクションも含むことができる。コンピュータ・プログラムは、プロセッサ・デバイス４３０が、入力デバイス４４０に関連付けされた測定デバイスから、あるいは入力デバイス４４０に関連付けされた通信ポート経由で別のデバイスから質量スペクトル４６０および／または関連情報４７０に関連付けされたデータを要求するためのコンピュータ実行可能インストラクションを含むこともある。またこのコンピュータ・プログラムは、プロセッサ・デバイス４３０が、別のデバイスに対して出力デバイス４５０に関連付けされた通信ポート経由で質量スペクトル４６０、関連情報４７０、および／または再較正済み質量スペクトル４８０に関連付けされたデータを送信するためのコンピュータ実行可能インストラクションを含むこともある。
【００３２】
この方法は、概して、質量対電荷比の比較、または測定済みスペクトルと仮説的スペクトルのピークもしくはピーク間の差の比較から獲得されるデータ集合に対して堅牢な統計的方法を適用することを伴う。堅牢な統計的方法を適用し、それによって少なくとも１つの変換パラメータを提供する。またこの方法は、その少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって質量スペクトルを変換し、再較正済み質量スペクトルを提供することも伴う。
【００３３】
方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを有するコンピュータ可読メディアは、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を含む。質量スペクトルは、それぞれが質量対電荷比に対応する複数のピークを包含する。この方法はまた、標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子の選択も包含する。それに加えてこの方法は、複数のピークの部分集合を包含するデータ集合の作成も包含し、それにおいて複数のピークの部分集合のそれぞれは、複数のあらかじめ決定済みの分子のうちの１ないしは複数に割り当てられる。またこの方法は、データ集合に対して堅牢な統計的方法を適用し、少なくとも１つの変換パラメータを計算することを包含する。さらに加えて、この方法は、少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって質量スペクトルを変換し、それによって再較正済み質量スペクトルを提供することを包含する。
【００３４】
コンピュータ可読メディアは、複数の巨大分子の質量スペクトルの獲得を包含する方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを含む。質量スペクトルは、それぞれが質量対電荷比に対応する複数のピークを包含する。この方法はまた、標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子の選択も包含する。この方法は、それに加えて複数のピークからの複数のピークのペアの集合を包含するデータ集合の作成も包含し、それにおいてピークのペアのそれぞれは、複数のあらかじめ決定済みの分子のうちの１つに割り当てられる。またこの方法は、データ集合に対して堅牢な統計的方法を適用し、少なくとも１つの変換パラメータを計算することを包含する。さらに加えて、この方法は、少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって質量スペクトルを変換し、それによって再較正済み質量スペクトルを提供することを包含する。
【実施例１】
【００３５】
グリカン質量スペクトルの再較正
マウスの腎臓からＮ−グリカンの１００を超える質量スペクトルが獲得された。Ｎ−グリカンは、ペプチド：Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）処理により腎臓ペプチド抽出からリリースされ、それに続いて、ここに参照により援用されている非特許文献３に述べられているストラテジのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメトリを使用し、質量スペクトロメトリによる分析に先行してパーメチル化を行った。パーメチル化は、非特許文献４に記述されているとおりの水酸化ナトリウム手法を使用して行われた。ＭＡＬＤＩデータは、ＡＢＩパースペクティブ・バイオシステムズ（ＡＢＩ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のボイジャーＤＥ（登録商標）ｓＳＴＲ質量スペクトル計を、遅延抽出を伴うリフレクトロン・モードで使用して獲得された。パーメチル化後の標本は１０μｌのメタノールに溶解され、溶解標本の１μｌが、１μｌのマトリックス（２，５−ジヒドロ安息香酸）と予混合された後、１００ウェルのステンレス製の標本プレートにロードされた。
【００３６】
質量スペクトルは、最初の約１５の高信頼度のピーク割り当てを見つけることによって再較正された。これらの高信頼度ピークは、比較的高い強度のピーク（通常、もっとも高い２００ピークの間）であり、それに割り当てられた潜在的にマッチするグリカンの理論的な値と緊密にマッチ（調和）するアイソトープ・エンベロープを有しており、かつそれに割り当てられた潜在的にマッチするグリカンの理論的な質量に非常に近い（１００ｐｐｍ内）測定済み質量を有していた。各測定済みのピークｍiについて、測定済み質量と理論的質量の間の偏差ｄi＝｛ｍi−（理論的質量）｝が計算された。ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムが連続的に適用されて、ペア（ｍi，ｄi）が直線ｙ＝Ａｘ＋Ｂに当てはめられ、いずれのピークが高信頼度ピークであるか決定された。測定済み質量ｍのピークについての補正偏差ｄ’は、直線を基礎とする理論的質量と測定済み質量の差ｄ’＝（Ａｍ＋Ｂ）−ｍである。
【００３７】
ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムを使用して作成された質量スペクトルのピークに対するグリカンの割り当てと、現在行われているように人間の専門家によって作成された割り当ての比較が行われた。すべての場合において、このアルゴリズムは、質量スペクトル内の観察されたピークに対するグリカンの有望な組成ならびに構造の意味のある割り当てを提供した。一例が、人間の専門家による手書き注記された図９の質量スペクトルと、ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムを使用して自動注記された図１０の質量スペクトルの比較によって与えられる。１５の手書き注記のピークが、ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムによっても識別された。１５のピークのうちの１２について注記はまったく同一であった；残り３つについて、ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは、２つの有望な構造を提供し、その１つは、手書き注記の１つ（専門家による２つの代替注記を伴う２８１０．３におけるピーク；ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは両方を見つけ出した）と一致した。残りの差は、注記のために選択されたピークの集合における変動に起因する。ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは、もっとも強いピークから開始し、系統的に次の強度に続くという形でピークを選択したが、人間の注記はこの手続きからわずかに逸れていた。
【００３８】
ペプチド質量スペクトルの再較正
ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムを３つの異なるペプチド質量スペクトルの集合に対して適用した。第１の集合は、マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）Ｑ‐ＴＯＦ ＩＩスペクトル計上において測定されたウシの血清アルブミン等の共通基準プロテインからの長さ７〜１５の、トリプシンによって生じたペプチドの７４のＱＴＯＦスペクトルから構成した。第２の集合は、マウスの透明帯プロテインからの長さ６〜２３の、トリプシンによって生じたペプチドの１０６のＱ−ＴＯＦスペクトルから構成した。これらのスペクトルは、分裂の特異性に関係なく、すべてのマウス・プロテインの大きな『デコイ（ｄｅｃｏｙ）』データベースに対してデータベース・サーチを行うことによって識別された。第３の集合は、サーモフィネガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｅｇａｎ）ＬＣＱ−デカ（ＬＣＱ‐Ｄｅｃａ）スペクトル計で測定され、ＮＣＢＩ非冗長プロテイン・データベースに対するデータベース・サーチ（ＳＥＱＵＥＳＴ）によって識別された、共通基準プロテインからの長さ５〜１４のペプチド（トリプシンによって生じたものである必要はない）の１０１のイオン−トラップ・スペクトルから構成した。
【００３９】
ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは、前述の説明から修正された。特に、アルゴリズムは、『真の』直線を表していると決定された部分集合Ｓiのスコアの２．５倍、もしくはマシンの理論的質量精度の評価に対応するユーザ指定の数のいずれかより大きい残余を有するポイントを破棄するべく修正された。この修正は、アルゴリズムがアウトライアの除去に積極的になりすぎることを防ぐ。強いピークが小さいピークより正確になるという観察に基づいて、基本的なアルゴリズムについても最小二乗法ではなく重み付け最小二乗法を使用して『直線上』として分類されたポイントの集合からの直線を改良し、再評価するべく修正を行った。データ・ポイントｐの重みは１／（３＋Ｒａｎｋ（ｐ））であり、それにおいてＲａｎｋ（ｐ）は較正ピークのリスト内のｐのランクに等しい（もっとも強いピークについて１、２番目に強いピークについて２というようにそれ以下も続く）。ＴＯＦ誤差のプロットがわずかなＳ字形状を有するという観察に基づいて、Ｐ内のポイント数が有意に大きい場合には（１４もしくはそれを超えるデータ・ポイント）直線に代えて３次曲線を当てはめるべく基本的なアルゴリズムが修正された。
【００４０】
ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは、次の態様で適用された。すべてのラダーｉについて、評価済み勾配Ａiが、ラダーの最初と最後のピークの間の推定された真の差をそれらの測定済みの差で除することによって計算された。評価Ａiの重みを、長さ２のラダーについて
【数３】
に、長さ３のラダーについて
【数４】
にそれぞれセットし、それにおいてＭＤｉｆｆは、そのラダー内の最初と最後のピークの間の測定済み質量の差を示し、分母内の和は、ラダー内のピークｐにわたって行われるものとした。最終的な勾配Ａの評価は、個別の評価Ａiの重み付けおよび成形後の平均として決定され、それにおいては、評価の上側２０％および下側２０％が切り捨てられ、残りの評価から重み付け平均が求められた。
【００４１】
演繹的（アプリオリ、a priori）な再較正に関する結果が、ピークを識別する帰納的（ポステリオリ、posteriori）な分析によって決定され、それらを次の表１にリストする。
【表１】
【００４２】
これにおいて、ｅｒｒは平均質量誤差（真の質量から測定済み質量を減ずる）を示し、σはスペクトル内のｂ−およびｙ−イオンのピークに関する質量誤差の標準偏差を示す。下付き文字は、較正未済（つまりＵｎｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）および較正済み（つまりＣａｌｉｂｒａｔｅｄ）を表し、Ｍｅｄおよびｍａｘは、スペクトルに関するメディアンおよび最大を表す。たとえば、Ｍｅｄ ｅｒｒＵは、較正未済の質量誤差の平均（ピークに関する）のメディアン（スペクトルに関する）である。比較のため、３次の帰納的（ポステリオリ）な再較正は、ＱＴＯＦについてＭｅｄ σＣ＝０．００３４、ＴＯＦについてＭｅｄ σＣ＝０．０２５１を与える。すべての単位は、Ｄａである。
【００４３】
アルゴリズムのパフォーマンスの最も重要なメトリック（metric）は、再較正後の質量誤差の標準偏差Ｍｅｄ σであり、これは質量測定における一定のオフセット（メディアン誤差を増加することになるが、標準偏差は増加なし）が勾配Ａのみによって補正できないことによる。結果は、再較正前に『代表的な』ＱＴＯＦスペクトルが０．０４０２のオフセット（真の質量から測定済み質量を減ずる；すなわち、測定済み質量は低くなる傾向にある）を有しており、代表的なピークが両方向に０．０２２０の追加の誤差を有していたと考えることによって解釈できる。再較正の後、スペクトルは両方向に０．００８９Ｄａのオフセットを有し、代表的なピークは両方向に０．００７２の追加の誤差を有していた。再較正の後、代表的なＴＯＦスペクトルは０．０２７７のオフセットを有し、代表的なピークは０．０２８６の追加の誤差を有していた。質量誤差の標準偏差は、Ｍｅｄ σＵならびにＭｅｄ σＣにおける差によって反映されるとおり、有意に低下した。このアルゴリズムが質量誤差の標準偏差を増加することはなかったが、ＱＴＯＦスペクトルのうちの３つ、およびＴＯＦスペクトルのうちの２１について、標準偏差に２０％未満の減少があった。
【００４４】
前述したとおり、二重荷電ピークを使用して切片Ｂの評価可能が行われた。しかしながら、ＱＴＯＦおよびＴＯＦのいずれも約半分のスペクトルしか識別可能な二重荷電ピークを有してなく、その種のピークを伴うスペクトルであっても、勾配のみを使用して達成されるものより有意に高い精度まで再較正が可能でなかった。たとえば、ＱＴＯＦについてのＭｅｄ σＣは、０．００７２から０．００５８に向上したが、ＴＯＦについてのＭｅｄ σＣは、０．０２８６から０．０２８４に変化したに過ぎない。新しい（de novo）シーケンスについては、Ｂが相対的なピークの場所、たとえば連続するｙ−イオンの間の差に影響せず、それらの絶対的な場所にのみ影響することから、Ｂは、Ａより重要性が低い。
【００４５】
親イオンの質量もまた再較正が行われた。親の質量の正確な決定は、データベース・ルックアップ方法が使用されるときに候補の消去を補助し、また新しいシーケンスの共通スケール上におけるｂ−およびｙ−イオンの配置を補助する。親イオンの質量は、すでにタンデムＭＳの最初のラウンドで測定されているが、再較正を使用して精度を向上することができる。適格ピークｐおよびｑの各ペア、すなわちそれらのｍ／ｚ測定値の和が、親の質量のユーザ指定許容値（ＱＴＯＦについて０．２Ｄａ、ＴＯＦについて０．３Ｄａ）にプロトンを加えた範囲内となる各ペアは、合計質量の評価を提供する。親イオンの質量は、相補ペアの重み付け平均として再較正され、それにおいて各ペアの平均には、１／（Ｒａｎｋ（ｐ）＋Ｒａｎｋ（ｑ））として重み付けが行われた。相補ペアが存在しないというまれなケースでは、親イオンの質量が変更されなかった。成形後の平均は、通常、質量スペクトル内にわずかな相補ペアしか含まれないために使用されなかった。ＱＴＯＦについては、メディアン誤差が０．０９８２から０．００４５に向上した；最悪誤差は、０．１９６８から０．０９１８に向上した。７４のスペクトルのうち１つだけに関しては、再較正によって誤差が悪化し、０．０６１９から０．０８８０に変化した。ＴＯＦについては、メディアン誤差が０．１９０２から０．０６１４に向上した；最悪誤差は、０．４５９４から０．３２７２に向上した。１０６のスペクトルのうち６つに関しては誤差が悪化し、最悪で０．１１８５から０．１６４０に変化した。
【００４６】
概して言えば、演繹的（アプリオリ）な再較正は非常に成功であり、特にＴＯＦスペクトルについては、達成されたパフォーマンスが帰納的（ポステリオリ）な再較正よりわずかに悪いだけだった。ＱＴＯＦとＴＯＦの誤差の間の相違は、測定誤差における差からの結果であった。ＴＯＦの場合は、測定誤差が切片Ｂと概略で等しく、したがってＢを評価するためのデータの欠如は、主要な問題ではない。それに対してＱＴＯＦの測定誤差はＢより小さく、約４分の１であり、したがってＢを伴う回帰モデルは、部分的な成功が達成されているだけである。
【００４７】
帰納的（ポステリオリ）な再較正については、ペプチドのアミノ酸シーケンスが既知であると仮定した。これは、データベースを使用して未知のスペクトルの質量スペクトルに比較するための候補シーケンスを調べるときに生じ得る；各候補シーケンスもまた、正しいシーケンスと見なされる。この正しいシーケンスは、質量スペクトルを良好に再較正し、その結果、多数のピークが予測されたイオンに対応する。これに対して、正しくないシーケンスは、スペクトルをあまり良好に再較正せず、より少ないピークがイオンに対応する。これが正しいことは、各候補シーケンスに対して割り当てられるスコアに反映される。
【００４８】
帰納的（ポステリオリ）な再較正の場合、適格ピークが、演繹的（アプリオリ）な再較正とは異なる方法によって選択された。前処理ステップが、より低い強度のピークの通過を可能にし（アミノ酸の数の１５倍までのランクを伴う）、またｂ−およびｙ−イオンに加えて、ａ−イオンおよびに水分損失にマッチするピークも考慮された。当初、ユーザ指定の相対許容範囲（ＱＴＯＦについて１５０ｐｐｍ、ＴＯＦについて２５０ｐｐｍ）内の観察されたピークにマッチする予測されたピークのそれぞれについてデータ・ポイントが定義された。ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムが使用されて、それらのポイントに対する回帰直線の当てはめが行われた。その後、再較正の第２ラウンドが実行され、今度はピーク識別のためにユーザ指定の絶対許容範囲（ＱＴＯＦについて０．０２５Ｄａ、ＴＯＦについて０．１０Ｄａ）が用いられた。ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムが使用され、ユーザによって選択されたポイントの新しい集合に対する直線もしくは３次曲線のいずれかの当てはめが行われた。アルゴリズムは、ポイント数が１４より少なければ『３次』が選択されていた場合であっても直線当てはめだけを行う。
【００４９】
帰納的（ポステリオリ）な再較正に関する結果を次の表２にリストする。
【表２】
これにおいて、ｅｒｒは平均質量誤差（真の質量から測定済み質量を減ずる）を示し、σはスペクトル内のａ−、ｂ−およびｙ−イオンのピーク、およびそれらの水分損失に関する質量誤差の標準偏差を示す。『直線』当てはめは、常に回帰直線を使用し；『３次』当てはめは、ポイントの数が少なくとも１４であれば３次曲線を使用し、それ以外の場合には直線を使用する。ほとんどのスペクトル、すなわち７４のＱＴＯＦスペクトルのうちの４９、１０６のＴＯＦスペクトルのうちの９１が３次曲線に適格であった。すべて単位はＤａである。
【００５０】
ここに示されているとおり、３次曲線は直線回帰よりパフォーマンスがわずかに良好であるに過ぎない。比較すると、通常の重み付けのない最小二乗直線当てはめは、有意に、より悪い結果をもたらす。７４のＱＴＯＦスペクトルについて、予測されたピークの１５０ｐｐｍ内のすべてのピークに対して直線が当てはめられた最小二乗の１ラウンドでは、Ｍｅｄ σＣ＝０．０１０６およびＭａｘ σＣ＝０．０３６６がもたらされているが、それに比べて、２ラウンドのＲＡＮＳＡＣアルゴリズムの使用を伴う場合には、それぞれ０．００３４および０．００５８となる。通常の、１５０ｐｐｍおよび０．０２５Ｄａをスレッショルド（閾値）として使用する２ラウンドの最小二乗は、１ラウンドより有意に良好であり、Ｍｅｄ σＣ＝０．００３９およびＭａｘ σＣ＝０．００７６を達成する。
【００５１】
再較正におけるより悪い結果は、新しいシーケンスにおけるより悪い結果となった。７４のＱＴＯＦスペクトルが、変換文字、およびＱについてＫ、ＭＦについてＤＹといった近い質量の代用を伴うシーケンス等のもっともらしいデコイ（それぞれ２００〜１０００デコイ）に対してスコアが与えられた。このスコア付けは、識別されたピークの重み付けを、予測された質量に対する近さによって、またその種のピークの観察の何らかの演繹的（アプリオリ）な確率によって行う（その結果、中心のｙ−イオンが高い重みを有する）。再較正はいずれも、２２．５の正解、すなわちもっとも高いスコアのシーケンスが実際に真のシーケンスであったという意味での正解をまったくもたらさなかった。最初に互いのシーケンスと結びつけられた真のシーケンスが関係する５つのスペクトルは、それぞれ１／２の正解としてカウントされた。通常の最小二乗は３９の正解をもたらし；２ラウンドの最小二乗は５４の正解をもたらし；２ラウンドのＲＡＮＳＡＣアルゴリズムは６２正解をもたらした。最良結果−６５の正解−は、３次曲線のオプションを伴わなかった２ラウンドのＲＡＮＳＡＣアルゴリズムによって得られた。スコア付けのパフォーマンスは、敏感に再較正に依存すると見られる；２ラウンドの最小二乗と直線ＲＡＮＳＡＣアルゴリズムの間のＭｅｄ σＣにおける微差（０．００３９対０．００３４）は、スコア付けにおける有意の差（２０の誤差対９の誤差）となった。
【００５２】
図１１は、帰納的（ポステリオリ）な再較正の後の全７４のＱＴＯＦスペクトルのピークの質量誤差を示したヒストグラムである。これには、強いピーク（１から２０までのランクを伴うもの）が、弱いピーク（ランク＞２０）より正確に測定されたことが示されている。なお、図１１では、強いピークが弱いピークより正確に測定されることを示している。
【００５３】
帰納的（ポステリオリ）な再較正は、イオン−トラップ・データに対しても行われた。イオン‐トラップが構造的誤差を有していないことから、ピーク識別の第１および第２ラウンドの両方において絶対許容範囲（それぞれ０．４０Ｄａおよび０．３５Ｄａ）が使用された。その結果は、表２に含まれている。較正未済のイオン−トラップ・スペクトルは、小さな一定のオフセットを有していたが、これは補正可能であり、Ｍｅｄ ｅｒｒＵ＝０．０６６３がＭｅｄ｜ｅｒｒＣ｜＝０．０１６７に改善されたという事実に反映されている。しかしながら、誤差の標準偏差の有意な改善はなく、Ｍｅｄ σＵ＝０．１０１０はＭｅｄ σＣ＝０．０９９６よりそれほど有意に大きくないという事実に反映されている。最悪イオン−トラップ・スペクトルは、それらの誤差においてわずかに線形の傾向を有し、それは、Ｍａｘ σＵ＝０．１９２０がＭｅｄ σＣ＝０．１６６２に改善されたという事実に反映される。
【００５４】
［好ましい態様］
（１）前記データ集合を作成するステップは、さらに、
複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比を決定し、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比のそれぞれが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つから決定され、
前記複数のピークの１つと、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比の１つを比較し、
前記比較のステップに応答して、前記データ集合に含めるために前記複数のピークの前記１つを選択することを含む請求項１に記載の方法。
【００５５】
（２）前記データ集合を作成するステップは、さらに、
複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比を決定し、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比のそれぞれが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つから決定され、
前記複数のピークの１つと、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比の１つを比較し、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の質量対電荷比の前記１つが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つと関連付けされ、
前記複数のあらかじめ決定済みの分子の前記１つについて、分子質量アイソトープ・エンベロープを決定し、
前記複数のピークの前記１つに関連付けされたピークのアイソトープ・エンベロープと、前記分子質量アイソトープ・エンベロープを比較し、
前記複数のピークの１つを比較するステップおよびピークのアイソトープ・エンベロープを比較するステップに応答して、前記データ集合に含めるために前記複数のピークの前記１つを選択することを含む請求項１に記載の方法。
【００５６】
（３）複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するためのシステムであって、
質量対電荷比に対応する複数のピークを含む質量スペクトルを維持するべく機能する第１のストレージ・デバイスと、
（ｉ）前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、（ｉｉ）前記複数のピークからピークのペアを包含するデータ集合を作成し、前記ピークのペアのそれぞれは、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つに割り当てられ、（ｉｉｉ）堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、かつ（ｉｖ）前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、再較正済み質量スペクトルを提供するコンピュータ・プログラムを含むコンピュータ実行可能インストラクションを維持するべく機能する第２のストレージ・デバイスと、
前記第１ストレージ・デバイスおよび第２のストレージ・デバイスと通信し、かつ前記コンピュータ・プログラムを実行し、前記再較正済み質量スペクトルを提供するべく機能するプロセッサと、
を含むシステム。
【００５７】
（４）複数の巨大分子の質量スペクトルを獲得し、前記質量スペクトルが複数のピークを含み、前記複数のピークのそれぞれを質量対電荷比に対応させ、
前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、
前記複数のピークからの複数のピークのペアを含むデータ集合を作成し、前記複数のピークのペアのそれぞれが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つに対して割り当てられ、
堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、
前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、前記再較正済み質量スペクトルを提供すること
を包含する方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを有するコンピュータ可読メディア。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】異なる時間に同一のＴＯＦ計測器上おいて同一標本から得られた２つの質量スペクトルを示したグラフである。
【図２】異なる時間に同一のＴＯＦ計測器上おいて同一標本から得られた２つの質量スペクトルを示したグラフである。これら２つのグラフは、偏差（観察された質量から理論的質量を引いた値）対ピークの測定済み質量のプロットであり、計測器のバイアスがスペクトル間でどのように変化するかを示している。
【図３】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図４】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図５】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図６】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図７】種々の例示の実施態様における再較正方法の概略のフローチャートである。
【図８】例示の実施態様のシステムの概略図である。
【図９】各ピークにグリカンを割り当てる人間の専門家によるマウスの腎臓スペクトルのマニュアル注釈を示した説明図である。
【図１０】各ピークにグリカンを割り当てるＲＡＮＳＡＣアルゴリズムによるマウスの腎臓スペクトルの自動注釈を示した説明図である。
【図１１】ポステリオリな再較正の後の全７４のＱＴＯＦスペクトル内のピークの質量誤差を示すヒストグラムである。
【符号の説明】
【００５９】
４００ システム、４１０ 第１のストレージ・デバイス、４２０ 第２のストレージ・デバイス、４３０ プロセッサ・デバイス、４４０ 入力デバイス、４５０ 出力デバイス、４６０ 質量スペクトル、４７０ 関連情報、４８０ 再較正済み質量スペクトル、４９０ コンピュータ・プログラム。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するための方法であって、
前記複数の巨大分子の質量スペクトルを取り込み、前記質量スペクトルが複数のピークを含み、前記複数のピークのそれぞれを質量対電荷比に対応させ、
前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、
前記複数のピークの部分集合を含むデータ集合を作成し、前記複数のピークの前記部分集合の各ピークが、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられ、
堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、
前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、前記再較正済み質量スペクトルを提供することを含む方法。
【請求項２】
複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するための方法であって、
前記複数の巨大分子の質量スペクトルを取り込み、前記質量スペクトルが複数のピークを含み、前記複数のピークのそれぞれを質量対電荷比に対応させ、
前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、
前記複数のピークからの複数のピークのペアを含むデータ集合を作成し、前記ピークのペアのそれぞれが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つに対して割り当てられ、
堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、
前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、前記再較正済み質量スペクトルを提供することを含む方法。
【請求項３】
複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するためのシステムであって、
それぞれの複数のピークが質量対電荷比に対応する複数のピークを含む質量スペクトルを維持するべく機能する第１のストレージ・デバイスと、
（ｉ）前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、（ｉｉ）前記複数のピークの部分集合を含むデータ集合を作成し、前記複数のピークの前記部分集合の各ピークは、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられ、（ｉｉｉ）堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、かつ（ｉｖ）前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、それにより再較正済み質量スペクトルを提供するコンピュータ・プログラムを含むコンピュータ実行可能インストラクションを維持するべく機能する第２のストレージ・デバイスと、
前記第１ストレージ・デバイスおよび第２のストレージ・デバイスと通信し、かつ前記コンピュータ・プログラムを実行し、前記再較正済み質量スペクトルを提供するべく機能するプロセッサと
を含むシステム。
【請求項４】
複数の巨大分子の質量スペクトルを獲得し、前記質量スペクトルが複数のピークを含み、前記複数のピークのそれぞれを質量対電荷比に対応させ、
前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、
前記複数のピークの部分集合を含むデータ集合を作成し、前記複数のピークの前記部分集合の各ピークが、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられ、
堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、
前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、前記再較正済み質量スペクトルを提供すること
を包含する方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを有するコンピュータ可読メディア。
【請求項１】
複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するための方法であって、
前記複数の巨大分子の質量スペクトルを取り込み、前記質量スペクトルが複数のピークを含み、前記複数のピークのそれぞれを質量対電荷比に対応させ、
前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、
前記複数のピークの部分集合を含むデータ集合を作成し、前記複数のピークの前記部分集合の各ピークが、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられ、
堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、
前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、前記再較正済み質量スペクトルを提供することを含む方法。
【請求項２】
複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するための方法であって、
前記複数の巨大分子の質量スペクトルを取り込み、前記質量スペクトルが複数のピークを含み、前記複数のピークのそれぞれを質量対電荷比に対応させ、
前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、
前記複数のピークからの複数のピークのペアを含むデータ集合を作成し、前記ピークのペアのそれぞれが前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１つに対して割り当てられ、
堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、
前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、前記再較正済み質量スペクトルを提供することを含む方法。
【請求項３】
複数の巨大分子を含む標本の再較正済み質量スペクトルを提供するためのシステムであって、
それぞれの複数のピークが質量対電荷比に対応する複数のピークを含む質量スペクトルを維持するべく機能する第１のストレージ・デバイスと、
（ｉ）前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、（ｉｉ）前記複数のピークの部分集合を含むデータ集合を作成し、前記複数のピークの前記部分集合の各ピークは、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられ、（ｉｉｉ）堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、かつ（ｉｖ）前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、それにより再較正済み質量スペクトルを提供するコンピュータ・プログラムを含むコンピュータ実行可能インストラクションを維持するべく機能する第２のストレージ・デバイスと、
前記第１ストレージ・デバイスおよび第２のストレージ・デバイスと通信し、かつ前記コンピュータ・プログラムを実行し、前記再較正済み質量スペクトルを提供するべく機能するプロセッサと
を含むシステム。
【請求項４】
複数の巨大分子の質量スペクトルを獲得し、前記質量スペクトルが複数のピークを含み、前記複数のピークのそれぞれを質量対電荷比に対応させ、
前記標本に適した複数のあらかじめ決定済みの分子を選択し、
前記複数のピークの部分集合を含むデータ集合を作成し、前記複数のピークの前記部分集合の各ピークが、前記複数のあらかじめ決定済みの分子の１ないしは複数に対して割り当てられ、
堅牢な統計的方法を前記データ集合に適用して少なくとも１つの変換パラメータを計算し、
前記少なくとも１つの変換パラメータを使用することによって前記質量スペクトルを変換し、前記再較正済み質量スペクトルを提供すること
を包含する方法を実行するためのコンピュータ実行可能インストラクションを有するコンピュータ可読メディア。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００６−１７７９５３（Ｐ２００６−１７７９５３Ａ）
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６２９５７（Ｐ２００５−３６２９５７）
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【出願人】（５０２０９６５４３）パロ・アルト・リサーチ・センター・インコーポレーテッド (393)
【氏名又は名称原語表記】Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【出願人】（５０２０９６５４３）パロ・アルト・リサーチ・センター・インコーポレーテッド (393)
【氏名又は名称原語表記】Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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