塩基検出細孔
本発明は、確率的感知により１つまたはそれ以上のヌクレオチドを検出するために有用である、変異型α−ヘモリシン（α−ＨＬ）細孔に関する。細孔はＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定にとって特に有用である。ヌクレオチドの検出を可能とする分子アダプターは、細孔と共有結合する。細孔は特異的に修飾されてアダプターの配置を促進し、且つ共有結合を促進しうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、確率的感知により１つまたはそれ以上のヌクレオチドを検出するために有用である、変異型α−ヘモリシン（α−ＨＬ）細孔に関する。細孔は、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定にとって特に有用である。ヌクレオチドの検出を可能とする分子アダプターは、細孔と共有結合する。細孔は特異的に修飾されてアダプターの配置を促進し、且つ共有結合を促進することもある。
【背景技術】
【０００２】
確率的検出は、ヌクレオチド分子とレセプターの間の個別の結合イベントの観察に依拠する感知の手法である。確率的センサーは、ナノメーターサイズの単一細孔を絶縁膜に配置し、ヌクレオチド分子の存在下での細孔を経た電圧駆動イオン輸送を測定することによって創成することができる。電流の変動が発生する頻度によって、細孔内で結合するヌクレオチドの濃度が判明する。ヌクレオチドの本性は、その特徴的な電流シグネチャ、特に電流遮断の持続時間および程度によって判明する（Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｓｏｎｇ．Ｌ．，Ｇｏｕａｕｘ．Ｊ．Ｅ．およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４，４９７−５０５；およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，およびＣｒｅｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３，２２＆２３０）。
【０００３】
毒素α−ヘモリシン（α−ＨＬ）を形成する改変細菌細孔変種は、多種類の分子の確率的感知に用いられている（Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．，およびＣｒｅｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３，２２２−２３０；Ｓｈｉｎ，Ｓ．−Ｈ．，Ｌｕｃｈｉａｎ，Ｔ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１，３７０７−３７０９；およびＧｕａｎ，Ｘ．，Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（２００５）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ６，１８７５−１８８１）。これらの研究の過程で、α−ＨＬを操作して小さな有機ヌクレオチドと直接結合させる試みは困難となりうることが立証され、成功例はまれであることが確認された（Ｇｕａｎ，Ｘ．，Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（２００５）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ６，１８７５−１８８１）。幸いなことに、非共有結合的に結合する分子アダプター、特にシクロデキストリン（Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｃｏｎｌａｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８，６８６−６９０）、またさらに環状ペプチド（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｑｕｅｓａｄａ，Ｌ，Ｇｈａｄｉｒｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．，およびＢｒａｈａ，Ｏ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，１１７５８−１１７６６）およびキューカビチュリル（Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｗｅｂｂ，Ｊ．，Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ．，Ｋｉｍ，Ｋ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（２００５）ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ ６，８８９−８９２）を利用した異なる戦略が発見された。シクロデキストリンは一時的にα−ＨＬ細孔内に滞留し、相当大きいが不完全なチャネル遮断を引き起こす。シクロデキストリンの疎水性の内部で結合する有機ヌクレオチドは、この遮断を増強してヌクレオチドの検出を可能とする（Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｃｏｎｌａｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８，６８６−６９０）。
【０００４】
現在、広い用途範囲にまたがって、迅速且つ安価なＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定技術に対するニーズがある。既存の技術は、主として大量の核酸を生成する増幅技術に依拠し且つシグナルの検出に高品質の特殊な蛍光薬品を必要とすることから、緩速且つ高価である。確率的感知は、必要なヌクレオチドおよび試薬の量を減らすことにより迅速且つ安価なＤＮＡ配列決定をもたらす可能性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明者らは、驚くべきことに、１３９残基またはその近傍に配置されるようにその樽状構造またはチャネルの下部と共有結合する分子アダプターを有する変異型α−ＨＬ細孔が、ヌクレオチドを検出および識別することができることを証明している。特に発明者らは、１３９残基またはその近傍に配置されるように共有結合する分子アダプターを有する変異型α−ＨＬ細孔が、異なるヌクレオチドを識別することができることを示している。この細孔は感度が高く、且つそれゆえＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の配列決定に用いることができる。
【０００６】
また発明者らは、驚くべきことに、１３９残基またはその近傍に配置されるよう共有結合した分子アダプターを有する変異型α−ＨＬ細孔が、幅広い異なる条件の下で異なるヌクレオチドを識別することができることも証明している。特に、細孔はその機能が核酸の配列決定にとって必要である酵素にとって好ましい条件下でヌクレオチドを識別することができるであろう。
【０００７】
また発明者らは、驚くべきことに、１３９残基におけるおよび／またはその近傍における変異型α−ＨＬ細孔の修飾がアダプターの配置および異なるヌクレオチドの検出および識別にとって不可欠であることも示している。
【０００８】
本発明の細孔は確率的感知、特にヌクレオチドの検出またはＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の配列決定にとって有用な手段である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって本発明は、サンプル中の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの検出に用いることを目的とした変異型α−ＨＬ細孔であって：
（ａ）それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を含む７つのサブユニット、および
（ｂ）細孔とヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを含み、
７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍において修飾されてアダプターの配置を促進し、且つ
分子アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置されるよう１つまたはそれ以上のサブユニットと共有結合する変異型α−ＨＬ細孔を提供する。
【００１０】
また本発明は、
−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列であって、サブユニットがＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１１９，１２１または１３５位にシステインを有するヌクレオチド配列；
−それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードする７つのポリヌクレオチドであって、サブユニットの少なくとも１つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１１９、１２１または１３５位にシステインを有するポリヌクレオチドを含む変位型α−ＨＬ細孔を生成するためのキット；
−本発明の細孔を生成するための方法であって：
（ａ）上に定義された細孔を提供すること；および
（ｂ）細孔と１つまたはそれ以上のヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを細孔と共有結合させることを含む方法；
−個別のヌクレオチドを同定する方法であって、
（ａ）ヌクレオチドが本発明の細孔と相互作用するようヌクレオチドを細孔と接触させること；および
（ｂ）相互作用時に細孔を通過する電流を測定し、且つそれによりヌクレオチドの本性を決定することを含む方法；
−標的核酸の配列を決定する方法であって：
（ａ）エキソヌクレアーゼを用いて個別のヌクレオチドを標的配列の一方の末端より消化すること；
（ｂ）ヌクレオチドがアダプターと相互作用するようヌクレオチドを本発明の細孔と接触させること；
（ｃ）相互作用時に細孔を通過する電流を測定し、且つそれによりヌクレオチドの本性を決定すること；および
（ｄ）核酸配列の同一末端において手順（ａ）から（ｃ）を反復し、且つそれにより核酸の配列を決定することを含む方法；および
−核酸の配列を決定するキットであって：
（ａ）本発明の細孔または上記のキットに包含される７つのポリヌクレオチド；および
（ｂ）エキソヌクレアーゼを含むキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例で用いられるアダプターの構造を示す。この図は、未反応アダプターであるヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、および二官能性架橋剤である３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）と一旦反応してａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤを形成した場合のアダプターの構造を示す。図は、アダプターに対するアミン基の影響を検討するために実施例で用いられた対照アダプターの構造も示す（ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）。
【図２】野生型バックグラウンドにおけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７（上）およびＲＬ２バックグラウンドにおけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７（下）の単一チャネル記録を示す。ａｍ７−βＣＤ結合およびｄＮＭＰが認められる。
【図３】図１からの対応するｄＮＭＰイベントのヒストグラムを示す。Ｌｅｄｔは野生型であり右はＲＬ２である（１２００ｍＭ ＫＣＩ、１５０ｍＶ，ｐＨ７．５）。
【図４】野生型と比較したＲＬ２の重要な変異を示す図を示す。
【図５】ｄＮＭＰがＨＬ−（Ｍ１１１３Ｒ）７ＲＬ２バックグラウンドおよびＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）７ｗｔバックグラウンドと結合した場合の残留電流のヒストグラムを示す。この図は、ＲＬ２バックグラウンドにおけるＮ１３９Ｑ変異の重要性を示す（図３と比較せよ）（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図６】提唱されたα−ＨＬの残基１３９におけるシクロデキストリンの位置を示す。
【図７】α−ＨＬのβ−樽状構造における重要な変異の位置を示す図を示す。
【図８】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｔ１１５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録を示す。ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤとの反応によって変動し雑音の多いベースラインとなることが認められる（バイアスはなし）。
【図９】変動し雑音の多いベースラインを示すＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｔ１１７Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録を示す（バイアスはなし）。
【図１０】ヌクレオチドを添加する前後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録を示す。また、ヌクレオチドを添加した後のベースラインの拡大も示す。
【図１１】ヌクレオチドの添加後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録を示す。
【図１２】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｇ１１９Ｇ−Ｄ８）１（左）およびＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８）１変異体（右）のヒストグラムを示す。８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５において限定された塩基識別が認められる。
【図１３】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２３Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（１秒間提示）。
【図１４】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２３−Ｄ８）１（左）およびＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１３７Ｃ−Ｄ８）１変異体（右）のヒストグラムを示す。限定された塩基識別が認められる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図１５】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（１秒間提示）。
【図１６】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。良好な塩基識別が認められる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図１７】印加された電位の範囲（１１０〜１７０ｍＶ）におけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体についてのｄＮＭＰ結合の残留電流ヒストグラムを示す。４つのヌクレオチドの相対的位置の変化が認められる。鋭い黒いピークはシクロデキストリンレベルに対応する。
【図１８】単一のヌクレオチドが細孔に結合した場合の印加電位によるピーク位置の変動（残留細孔電流）のプロットを示す。
【図１９】印加電位１３０、１５０および１７０ｍＶにおける試験についての残留電流ヒストグラム、各塩基のガウスフィッティングおよび隣接する塩基間の重なり面積の算出値のプロットを示す。
【図２０】残留細孔電圧の平均に対する滞留時間を示す。ｄＴＭＰの長い平均滞留時間を認めることができるように、全４種類の塩基（下から順にＧ、Ｔ、Ａ、Ｃ）のピークを認めることができる。
【図２１】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。低塩濃度で良好な塩基識別を認めることができる（４００ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２２】ｄＮＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（３５０ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２３】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。低塩濃度で良好な塩基識別が見られる（３５０ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２４】３００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ中でｐＨ７．５より開始した単一チャネルについての溶液温度に対するヘモリシンコンダクタンスのプロットを示す。１．６５ｐＡ／℃の上昇を見ることができる。
【図２５】低塩濃度且つ高温（３００ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．２，４０℃）で良好な塩基検出を示すＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体についてのヒストグラム（左）、および短い滞留時間を示す同じデータの振幅に対する滞留時間のプロット（右）を示す。
【図２６】ｄＣＭＰおよびメチル−ｄＣＭＰの化学構造を示す（比較のためにｄＴＭＰも含める）。
【図２７】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。ｄＧＭＰおよびメチル−ｄＣＭＰ塩基検出を認めることができる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２８】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。全４種類の標準的ヌクレオチド一リン酸（左）およびメチル−ｄＣＭＰを加えた全４種類の標準的ヌクレオチド一リン酸（右）の検出を認めることができる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１７０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２９】残留細孔電圧の平均に対する滞留時間を示す。全４種類の塩基およびメチル−ｄＣＭＰのピーク（左）および５種類の塩基についての残留電流ヒストグラムのガウスフィッティング（右）を示す。
【図３０】印加電位の範囲（１３０〜１７０ｍＶ）におけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体についてのｄＮＭＰ結合の残留電流ヒストグラムを示す。メチル−ｄＣＭＰを加えた４つのヌクレオチドの相対的位置の変化を認めることができる。
【図３１】ＤＮＡおよび対応するＲＮＡ塩基の一般的に認められる塩基の化学構造を示す。
【図３２】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。ＮＭＰ塩基の検出が認められる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）＝。
【図３３】１２１位においてａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したホモ７量体ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ）７の単一チャネル記録を示す。
【図３４】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰ ｎｄ ｄＣＭＰを添加した後にＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング、０．５秒間提示）。
【図３５】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング、０．５秒間提示）。
【図３６】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（ｗｔ）６（Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング、０．５秒間提示）および対応する残留電流ヒストグラムを示す。
【図３７】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング、０．５秒間提示）および対応する残留電流ヒストグラムを示す。
【図３８】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｎ１３９Ｑ）６（Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング０．５秒間提示）および対応する残留電流ヒストグラムを示す。
【００１２】
（配列リストの説明）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は野生型α−ヘモリシン（α−ＨＬ）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は野生型α−ＨＬの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ−ＲＬ２の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ−ＲＬ２の１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は野生型バックグラウンドを有するα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒの１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は野生型バックグラウンドを有するα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑの１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１１９−Ｄ８の１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２および１４はいずれもアミノ末端にメチオニンを欠く成熟型である。
【００２７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５はＥ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩＩＩをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はＥ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩＩＩのアミノ酸配列を示す。
【００２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７はＥ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８はＥ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩのアミノ酸配列を示す。
【００３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９はバクテリオファージλエキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０はバクテリオファージλエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。配列は集合して３量体となる３つの同一のサブユニットの１つである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
開示された生成物および方法の異なる適用を、当技術分野における特定のニーズに対して個別に調節してもよいことを理解すべきである。本明細書で用いる用語は本発明の具体的な実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解すべきである。
【００３４】
さらに、本明細書および付属の請求項で用いるところの単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その」（ｔｈｅ）は、内容が明確にそうでないと指示していない限り複数の指示物を含む。したがって、たとえば「１つのヌクレオチド」に対する言及は「複数のヌクレオチド」を含み、「１つの細孔」に対する言及は２つまたはそれ以上のこうした細孔を含み、「１つの分子アダプター」に対する言及は２つまたはそれ以上のこうしたアダプターを含む、などである。
【００３５】
本明細書に引用された全ての出版物、特許および特許明細書は、上記のものも下記のものも、その全文を参照文献として本明細書に組み入れる。
【００３６】
（変異型α−ＨＬ細孔）
本明細書は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを検出するのに用いることを目的とした変異型α−ＨＬ細孔を提供する。細孔は異なるヌクレオチドを鑑別または識別するために用いてもよい。細孔はヌクレオチドの相互作用を促進する分子アダプターを含む。アダプターは特定の位置で細孔と共有結合する。アダプターは、ヌクレオチドと細孔が相互作用する時に、ヌクレオチドがそのヌクレオチドに特有の様式で細孔内を流れる電流に影響するよう配置される。したがってアダプターは、確率的感知によるヌクレオチドの検出またはヌクレオチドの識別に細孔を用いることを可能とする位置で、細孔と共有結合する。
【００３７】
本発明の細孔は、確率的感知にとって有用な手段である。本発明の細孔は、ヌクレオチド間の識別に特に有用である。したがって細孔は核酸の配列決定にとって理想的である。
【００３８】
本発明の細孔は、異なるヌクレオチドを高い感度で識別することができる。細孔は、ＤＮＡおよびＲＮＡにおける４種類のヌクレオチドを容易に識別することができる。本発明の細孔は、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを識別することまでできる。残基１３５にアダプターが共有結合した変位型α−ＨＬ細孔の塩基分解能は、驚くほど高い。細孔は４種類のＤＮＡヌクレオチドのほぼ完全な分離を示し、これを核酸配列決定のための優れた候補としている。細孔は、そのより長い細孔内滞留時間に基づき、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）を他の３種類のＤＮＡヌクレオチドと明確に識別することを可能とする。さらに細孔は、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）とメチル−ｄＣＭＰを、細孔内滞留時間および細孔内を流れる電流に基づいて識別する。
【００３９】
本発明の細孔は、幅広い条件下で異なるヌクレオチド間を高い感度で識別することもできる。具体的には、細孔は核酸の配列決定にとって好ましい条件下でヌクレオチドを識別するであろう。細孔をＤＮＡおよびＲＮＡ分子の配列決定に用いることができる方法は数多い。１つの方法は、エキソヌクレアーゼ酵素の使用を包含する。この手法では、エキソヌクレアーゼ酵素を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖よりヌクレオチドを連続的に脱離させる。このような酵素は、通常は高塩濃度下で機能しない。本発明の細孔は、低塩濃度であってもヌクレオチド同士を識別することができる。細孔は、たとえば室温で３００ｍＭと低いＫＣｌ濃度において、良好なヌクレオチド識別で機能することができる。細孔は、温度が上昇した場合または非対称的塩濃度が用いられた場合、より低い塩濃度において良好なヌクレオチド識別で機能するであろう。これについては、以下でより詳しく議論する。
【００４０】
本発明の細孔が異なるヌクレオチドを識別できる度合いは、印加電位を変化させることによって調節することができる。それにより、特に配列決定の際に細孔の機能を精密に調節することができる。
【００４１】
分子アダプターが固定されているという性質は、細孔から得られたシグナルが細孔の樽状構造またはチャネル内のヌクレオチドの存在に完全に依存し、且つアダプターの細孔からの解離によって影響されないことも意味している。換言すれば、アダプターが固定されているという性質は、ヌクレオチドが細孔と相互作用する時には、常に特徴的な電流が細孔内を流れることを意味している。配列内の各ヌクレオチドを検出および同定する必要があるので、これは核酸配列決定にとって特に重要である。
【００４２】
本発明の細孔は、それらが遮断されないように設計することができる。電気生理学においては、細孔は大きな多価イオンによって遮断されることがある。イオンは細孔の樽状構造またはチャネルに捕捉され、さらにイオン電流の流れを妨害する。通常、遮断は超高純度塩溶液内で実験を実施することによって回避することができる。アルギニンなどの正に荷電した残基を、α−ＨＬの樽状構造またはチャネルの狭窄部近傍に導入することにより、遮断されやすい細孔が生じる。以下の考察より明らかにされるように、本発明の変異型α−ＨＬ細孔が、１つまたはそれ以上の正荷電残基を、その樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に有することは必須ではない。このような残基を欠く本発明の細孔は、大きな多価イオンの存在下で遮断を受けることなく用いることができる。
【００４３】
最後に、分子アダプターが固定されているという性質は、細孔およびアダプターを共に保存することができるので、即時使用可能なバイオセンサーの製造が可能となることを意味している。
【００４４】
本発明の細孔は分離するか、相当分離するか、精製するか、または相当精製してもよい。脂質または他の細孔などの他の成分を全く含まない場合、本発明の細孔は分離または精製される。その意図する用途を妨害しない担体または希釈剤と混合される場合、細孔は相当分離される。たとえば、脂質または他の細孔などの他の成分を１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満含む形態で存在する場合、細孔は相当分離または相当精製される。代替的に、本発明の細孔は脂質二重層で存在することもある。
【００４５】
本発明の細孔は、個別または単独の細孔として存在してもよい。本発明の細孔は、代替的に２つまたはそれ以上の細孔の相同または非相同群で存在してもよい。
【００４６】
野生型α−ＨＬ細孔は７つの同一の単量体またはサブユニットより構成される（すなわち７量体）。α−ヘモリシンの１つの野生型単量体またはサブユニットの配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。変位型α−ＨＬ細孔は、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有し、且つ細孔活性を維持する７量体細孔である。細孔は、以下に論じるようなアダプターの配置を促進する修飾を含む。細孔は、好ましくはアダプターの共有結合を促進する修飾も含む。
【００４７】
細孔におけるサブユニットのうち１、２、３、４、５、６つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有してもよい。好ましい実施形態においては、細孔のサブユニットは全てＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有する。細孔における７つのサブユニットが全て同一であってもよいが、特に、以下に論じるように異なるサブユニットが異なる様式で修飾されてアダプターの配置を促進し、且つ任意にアダプターの共有結合を促進するので、典型的には異なる。
【００４８】
本発明の変異型α−ＨＬ細孔は、それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を含む７つのサブユニットより形成される。変種とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有し、且つ細孔を形成する能力を保持するサブユニットである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６、８、１０、１２および１４に示す配列は、全てＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種である。以下に論ずるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対する特異的な修飾は、いずれもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種をもたらす。
【００４９】
変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有する構造体を含み、且つ米国特許出願第６１／０７８，６９５号からの優先権を主張し且つ本出願と同時に出願された国際同時継続出願［Ｊ Ａ Ｋｅｍｐ ＆ Ｃｏ Ｒｅｆ：Ｎ．１０４４０４Ａ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｌａｂｓ Ｒｅｆ：ＯＮＬ ＩＰ ００５］に記載されている。このような構造は、エキソヌクレアーゼなどの核酸代謝酵素も含む。その出願の教示するものは、全て本発明にも同等に適用することができる。
【００５０】
細孔は、修飾されて１つまたはそれ以上のヌクレオチドを削除できるよう、アダプターを配置することを促進する。疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力などの非共有結合的相互作用によりアダプターを正しい位置に保持するために、１つまたはアミノ酸を細孔に導入する。
【００５１】
７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９においておよび／またはその近傍において修飾される。たとえば、７つのサブユニットのうち２つ、３つ、４つ、６つまたは全てがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９においておよび／またはその近傍において修飾される。７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９においておよび／またはその近傍において２つ、３つ、４つまたは５つなど少なくとも１つの修飾を含む。
【００５２】
７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９においておよび／または残基１３９近傍において修飾される。７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が残基１３９の近傍で修飾される場合、修飾は残基１３９に十分に近いのでアダプターの配置を促進することができる。修飾は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９より、典型的には２０オングストローム未満の位置、たとえば１５未満、１０未満または５オングストローム未満などの位置において行われる。好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列の残基１３９より２または３アミノ酸の残基が修飾される。より好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列の残基１３９および／または残基１３９に隣接する残基の１つまたは両者が修飾される。好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１または１４２における修飾またはそのあらゆる組合せを含む。最も好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９のみにおける修飾を含む。
【００５３】
７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、一旦配列が折りたたまれて三次元サブユニットを形成すると残基１３９の近傍となるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基における修飾を含んでもよい。好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１７、１１９、１２１、１２３、１３５、１３７、１４１または１４３の修飾またはそのあらゆる組合せを含む。
【００５４】
好ましくは、サブユニットは極性、非荷電アミノ酸の導入により残基１３９および／またはその近傍において修飾される。そのようなアミノ酸は、水素結合によるアダプターの配置に影響しうる。その電荷の欠如は、静電的相互作用がアダプターの機能を妨害することも防止する。下記の表１は極性非荷電アミノ酸を列挙する。グルタミンは好ましい極性非荷電アミノ酸である。極性非荷電アミノ酸は、残基１３９および／またはその近傍に挿入することができる。残基１３９におけるおよび／またはその近傍のアミノ酸は、代替的に極性非荷電アミノ酸と置換することができる。
【００５５】
好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が修飾されて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍に極性非荷電アミノ酸であるグルタミンを含む。グルタミンを残基１３９および／またはその近傍に挿入することができるか、または残基１３９におけるおよび／またはその近傍のアミノ酸をグルタミンと置換することができる。好ましくは、残基１３９のアミノ酸はグルタミンと置換される（Ｎ１３９Ｑ）。たとえば、７つのサブユニットのうち２つ、３つ、４つ、５つまたは６つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９にグルタミンを有する。好ましい実施形態においては、７つのサブユニットの全てがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９にグルタミンを有する。残基１３９における非荷電グルタミンは、アダプター中の水酸基などの化学基と水素結合により相互作用し、且つそれにより変位型α−ＨＬ細孔の樽状構造またはチャネル内におけるアダプターの配置を促進することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９がグルタミンと置換された好ましいサブユニット（Ｎ１３９Ｑ）をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１０、１２および１４に示す。適切なサブユニットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１０、１２および１４に示すオクタアスパラギン酸テールを含んでも欠いてもよい。
【００５６】
細孔は、樽構造またはチャネルの狭窄部の近傍に他の非荷電アミノ酸、または芳香族アミノ酸までもが配置されて、アダプターの配置がさらに促進されることがある。下記の表１は非荷電芳香族アミノ酸を列挙する。たとえば、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍にアスパラギンのような非荷電アミノ酸を１つまたはそれ以上、またはフェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸を１つまたはそれ以上配置されてもよい。細孔は、好ましくは４、５、６または好ましくは７つの非荷電または芳香族アミノ酸の環が、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に配置される。環の中の各アミノ酸は、典型的には各サブユニットより提供される。樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に配置されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基は１１１、１１３および１４７を含むが、これに限定されない。適切なサブユニットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１１、１１３または１４７に非荷電または芳香族アミノ酸を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１１、１１３または１４７に、非荷電または芳香族アミノ酸を挿入することができる。代替的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１１、１１３または１４７のアミノ酸を非荷電または芳香族アミノ酸と置換することができる。
【００５７】
細孔は、好ましくは修飾されてアダプターの共有結合を促進する。システインなどの共有結合を形成することのできる１つまたはそれ以上のアミノ酸を、１つまたはそれ以上のサブユニットに導入することができる。アミノ酸は、天然に産するものでも非天然的に産するものでもよい。アミノ酸は付加によって導入してもよい。アミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置される限り、あらゆる位置にアミノ酸を導入することができる。アミノ酸が残基１３９より遠隔の残基に導入される場合、適切な長さの二官能性架橋剤を用いて、アダプターが残基１３９またはその近傍に配置されることを確実にしてもよい。
【００５８】
好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５が修飾されてアダプターの共有結合を促進する。より好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つのみにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５が修飾されてアダプターの共有結合を促進する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５に導入されるアミノ酸は、好ましくはシステインである。残基１１９、１２１または１３５のアミノ酸は、好ましくはシステインと置換される（Ｇ１１９Ｃ、Ｎ１２１ＣまたはＬ１３５Ｃ）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１１９位がシステインと置換された好ましいサブユニット（Ｇ１１９Ｃ）を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１２１がシステインと置換された好ましいサブユニット（Ｎ１２１Ｃ）を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３５がシステインと置換された好ましいサブユニット（Ｌ１３５Ｃ）を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す。
【００５９】
細孔は、好ましくは樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に、正に荷電したアミノ酸が配置されてアダプターの共有結合を促進する。たとえば、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上に対し、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に、アルギニン、リジンまたはヒスチジンのような正に荷電したアミノ酸が配置してもよい。正に荷電したアミノ酸は、アダプター内のアミンなどの正に荷電した基との静電的相互作用により、アダプターの共有結合を促進する。より具体的には、正に荷電したアミノ酸がアダプター内の正に荷電した基と反発し、アダプターを細孔の樽状構造またはチャネルに押し下げ、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置する。それにより、アダプターと細孔の共有結合反応が促進される。しかし、上に論じたように、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に配置された正に荷電したアミノ酸を有する細孔は、遮断されやすいことがある。
【００６０】
細孔は、好ましくはアルギニン、リジンまたはヒスチジンなどの正に荷電した４つ、５つ、６つまたは好ましくは７つのアミノ酸の環が、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に配置される。環の中の各アミノ酸は、典型的には各サブユニットより提供される。好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３に、アルギニン、リジンまたはヒスチジンのような正に荷電したアミノ酸を１つ有する。より好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３にアルギニン残基を有する。より好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのすべてがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３にアルギニン残基を有する。アルギニンを残基１１３に導入することができるか、または残基１１３をアルギニンと置換することができる（Ｍ１１３Ｒ）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３がアルギニンと置換された好ましいサブユニット（Ｍ１１３Ｒ）を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６、８、１０、１２および１４に示す。
【００６１】
サブユニットは、たとえばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌などの生物が発現した天然に産する変種でもよい。変種は、組換え技術によって生成された非天然産生変種も含む。変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の全長に対し、好ましくは少なくとも５０％がアミノ酸同一性に基づきその配列と相同となるであろう。サブユニットポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のアミノ酸同一性に基づき、より好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％が、配列の全長に対して相同となる。２００またはそれ以上、たとえば２３０、２５０、２７０または２８０またはそれ以上の長さの近接アミノ酸に対し、アミノ酸の同一性は少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、９０％または９５％ある（「硬い相同性」）。
【００６２】
アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対し、上に論じたものに加えて、たとえば１、２、３、４、５、１０，２０または３０置換までなどのアミノ酸置換を行ってもよい。たとえば下記の表１によれば、保存的置換を行ってもよい。
【００６３】
【表１】
【００６４】
上に論じたポリペプチドより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列の１つまたはそれ以上の残基をさらに削除することができる。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基まで、またはそれ以上を削除することができる。
【００６５】
変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントよりなるサブユニットを含んでもよい。このようなフラグメントは、細孔形成活性を保持する。フラグメントは少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸の長さであってもよい。このようなフラグメントを用いて、キメラ細孔を生成してもよい。フラグメントは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の細孔形成ドメインを含む。フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および１１９、１２１または１３５を含まなければならない。
【００６６】
変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントまたは一部を含むキメラタンパク質を含む。キメラタンパク質細孔は、それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントまたはその一部を含む、１つまたはそれ以上のサブユニットより形成してもよい。キメラタンパク質細孔の細孔またはチャネル部分は、典型的にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントまたはその一部より形成される。
【００６７】
１つまたはそれ以上のアミノ酸を、代替的または追加的に上記のポリペプチドに付加してもよい。延長部を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはそのポリペプチド変種またはフラグメントのアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシル末端に提供してもよい。延長部は、たとえば長さ１から１０アミノ酸のように非常に短くしてもよい。代替的に、たとえば５０または１００アミノ酸までのように、延長部をより長くしてもよい。担体タンパク質を本発明によるアミノ酸配列と融合させてもよい。
【００６８】
上述のように、変種とはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有し、且つその細孔形成能力を保持するサブユニットである。典型的には、変種は細孔形成を担当するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の領域を含む。β−樽状構造を含むα−ＨＬの細孔形成能力は、各サブユニットのβ−シートによって提供される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種は、典型的にはβ−シートを形成するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸２２から３０、３５から４４、５２から６２、６７から７１、７６から９１、９８から１０３、１１２から１２３、１３７から１４８、１５４から１５９、１６５から１７２、２２９から２３５、２４３から２６１、２６６から２７１、２８５から２８６および２９１から２９３がβ−シートを形成する。生成する変種がその細孔形成能力を維持する限り、β−シートを形成するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の領域に１つまたはそれ以上の修飾を施すことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のβ−シート領域に施すことのできる具体的な修飾を以下に論じる。
【００６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種は、そのα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に、置換、付加または削除などの修飾を好ましくは１つまたはそれ以上含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸２から６、７３から７５、２０７から２０９、２１４から２１６および２１９から２２２がα−ヘリックスを形成する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４および２８７から２９０がループを形成する。アミノ酸１および２９４は末端アミノ酸である。
【００７０】
当技術分野における標準的方法を用いて相同性を判定することができる。たとえばＵＷＧＣＧパッケージは、たとえばそのデフォルト環境に使用される、相同性を算出するために用いることのできるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｔ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ．３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ．ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０に記載されているように、相同性を算出または配列を決定することができる（たとえば（典型的にはそのデフォルト環境に対して）同等の残基または対応する配列を同定するなど）。
【００７１】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターより公開されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、始めに、データベース配列において同じ長さのあるワードでアラインメントした場合、いくつかのプラス閾値スコアＴに合致または適合する問い合わせ配列において、長さＷの短いワードを同定することによって高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを包含する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（上記Ａｌｔｓｅｈｕｌ ｅｔ ａｌ）。これらの初回の隣接ワードヒントは、検索を開始してＨＳＰがこれらを含むことを確認するためのシードの機能を果たす。ワードヒントは、累積配列スコアを増加できる限り、各配列の両方向に拡張される。各方向へのワードヒントの拡張は：累積配列スコアがその最大達成値より量Ｘ減少した時；１つまたはそれ以上のマイナススコア残基配列が累積したことにより累積スコアが０またはそれ以下となる時；または各配列の末端に到達した時に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９を参照）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５，Ｎ＝４および両鎖の比較を用いた。
【００７２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する；たとえばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の指標の１つは、それによって２つのアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の指標を提供する最小確率和（Ｐ（Ｎ））である。たとえば、第１の配列の第２の配列に対する比較における最小確率和が約１を下回り、好ましくは約０．１を下回り、より好ましくは約０．０１を下回り、また最も好ましくは約０．００１を下回る場合、一方の配列はもう一方の配列と類似している。
【００７３】
たとえばその同定または生成を支援するためのヒスチジンまたはアスパラギン酸などの付加によって、または天然ではポリペプチドがシグナル配列を含まない細胞からのその分泌を促進するためのそのような配列の付加によって、１つまたはそれ以上のサブユニットを修飾してもよい。
【００７４】
細孔は判別ラベルでラベリングしてもよい。判別ラベルは、細孔が検出されることを可能とするあらゆる適切なラベルとしてよい。適切なラベルは蛍光分子、たとえば１２５Ｉ、３５Ｓなどの放射性同位元素、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドを含むが、これに限定されない。
【００７５】
細孔は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどの細孔生成生物より得ても、または合成的にまたは組換え手段によって生成してもよい。たとえば、細孔はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写によって合成してもよい。細孔のアミノ酸配列は、非天然産生アミノ酸を含めるか、または化合物の安定性を高めるために修飾してもよい。合成的手段によって細孔が生成される場合、このようなアミノ酸を精製時に導入してもよい。細孔は、以下の合成または組換えのいずれかの生成法にしたがって変化させてもよい。
【００７６】
細孔はＤ−アミノ酸を用いて生成してもよい。たとえば、細孔はＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含んでもよい。このことは、このようなタンパク質またはペプチドを生成することを目的とした当技術分野において一般的である。
【００７７】
細孔は、アダプターの配置を促進し、且つ任意に共有結合を促進するための特異的な修飾を１つまたはそれ以上含む。細孔は、アダプターの結合および配置を妨害しない限り、その他の非特異的修飾を含む。多数の非特異的な側鎖の修飾は当技術分野において既知であり、細孔の側鎖に行ってもよい。このような修飾は、たとえばアミノ酸に対するアルデヒドとの反応の後ＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化、メチルアセトイミデートによるアミジン化または無水酢酸によるアシル化などを含む。
【００７８】
細孔は、当技術分野において既知である標準的な方法を用いて生成することができる。細孔または細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的な方法を用いて誘導および複製することができる。このような配列については以下でより詳しく議論する。細孔または細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的な技術を用いて、細菌宿主細胞に発現させることができる。細孔または細孔サブユニットは、組換え発現ベクターに由来するポリペプチドのｉｎ ｓｉｔｕ発現によって、細胞内で生成することができる。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するための誘導プロモーターを担持することもある。
【００７９】
細孔サブユニットは、あらゆるタンパク質液体クロマトグラフィ系によって細孔生成生物より精製した後に、または以下に記載するような組換え発現後に、大スケールで生成してもよい。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィ系はＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムを含む。次に、本発明に従った使用を目的として、天然産生または組換え生成細孔または細孔サブユニットを、天然産生または人工膜に挿入してもよい。細孔を膜に挿入する方法を以下に記載する。
【００８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６、８、１０、１２および１４に示された７つのサブユニット（すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種）のあらゆる組合せを用いて本発明の細孔を形成してもよい。好ましい細孔は：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６つおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８サブユニット１つ；または
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６つおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８サブユニット１つを含み；
【００８１】
細孔（ａ）および（ｂ）においては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１２、１８、２２、２６、３０および３４に示すサブユニットは、オクタ−アスパラギン酸テールを欠いてもよい。
【００８２】
本発明の最も好ましい細孔は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６つおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１３５Ｃ−Ｄ８サブユニット１つを含む。このような細孔においては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すサブユニットは、オクタ−アスパラギン酸テールを欠いてもよい。
【００８３】
（分子アダプター）
本発明の細孔は、細孔とヌクレオチドまたは標的核酸配列との相互作用を促進する分子アダプターを含む。アダプターの存在により、細孔とヌクレオチドのホスト−ゲスト化学が向上する。ホスト−ゲスト化学の原則は、当技術分野において周知である。アダプターは、そのヌクレオチドとの相互作用を向上させる細孔の物理的または化学的性質に対する効果を有する。アダプターは、典型的には細孔の樽状構造またはチャネルの電荷を変化させるか、またはヌクレオチドと特異的に相互作用または結合し、それによりその細孔との相互作用を促進する。
【００８４】
アダプターは各個別のヌクレオチド同士の相互作用を媒介するか、または各ヌクレオチドが標的核酸配列および細孔である。ヌクレオチドは、好ましくはアダプターを介して、またはこれと共に、可逆的に細孔と結合する。ヌクレオチドは、最も好ましくは、それらが膜を横断して細孔を通過するにつれて、アダプターを介して、またはこれと共に、可逆的に細孔と結合する。またヌクレオチドは、それらが膜を横断して細孔を通過するにつれて、アダプターを介して、またはこれと共に、細孔の樽状構造またはチャネルと可逆的に結合することもできる。アダプターは、好ましくはヌクレオチドと相互作用できるように樽状構造またはチャネルを収縮させる。
【００８５】
アダプターは、典型的には環状である。アダプターは、好ましくは細孔と同じ対称性を有する。α−ＨＬは、中心軸の周囲に、膜貫通β−樽状構造に鎖１４本を付与する７つのサブユニットを有するので、アダプターは好ましくは７倍の対称性を有する。
【００８６】
アダプターは、典型的にはホスト−ゲスト化学によりヌクレオチドと相互作用する。アダプターは、典型的にはヌクレオチドと相互作用することができる。アダプターは、ヌクレオチドと相互作用することのできる化学基を１つまたはそれ以上含む。１つまたはそれ以上の化学基は、好ましくは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力などの非共有結合的相互作用によって、ヌクレオチドと相互作用する。ヌクレオチドと相互作用することのできる１つまたはそれ以上の化学基は、好ましくは正に荷電する。ヌクレオチドと相互作用することのできる１つまたはそれ以上の化学基は、より好ましくはアミノ基を含む。アミノ基は一級、二級または三級炭素原子と結合することができる。アダプターは、より好ましくは６、７または８個のアミノ基の環などのアミノ基の環を１つ含む。アダプターは、最も好ましくは７個のアミノ基の環を１つ含む。プロトン化されたアミノ基の環は、ヌクレオチドの負に荷電したリン酸基と相互作用しうる。
【００８７】
以下により詳しく論じるように、細孔の樽状構造またはチャネル内でのアダプターの正しい配置は、アダプターと細孔との間のホスト−ゲスト化学によって促進することができる。アダプターは、好ましくは細孔内で１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することのできる化学基を１つまたはそれ以上含む。アダプターは、より好ましくは疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力などの非共有結合的相互作用により、細孔内の１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することのできる化学基を１つまたはそれ以上含む。細孔内の１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することのできる化学基は、典型的には水酸基またはアミン基である。水酸基は、一級、二級または三級炭素原子と結合することができる。水酸基は、細孔内の非荷電アミノ酸、具体的にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍に導入されたものと水素結合を形成しうる。アダプター内の１つまたはそれ以上の化学基と細孔内の１つまたはそれ以上のアミノ酸の間のこの相互作用を用いて、アダプターをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍における正しい配置に保持することができる。
【００８８】
細孔内の１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することのできるアミン基は、ヌクレオチドと相互作用することのできるアミン基と同一でも、または異なっていてもよい。上に論じたように、細孔の樽状構造またはチャネル内に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３におけるアルギニン（Ｍ１１３Ｒ）のような正に荷電したアミノ酸が存在すれば、アダプター内の正に荷電したアミン基は、これと静電的に相互作用してもよい。この相互作用によって、アダプターは細孔の樽状構造またはチャネルに押し下げられ、且つそれにより共有結合が促進される。
【００８９】
細孔とヌクレオチドの相互作用を促進するあらゆるアダプターを用いることができる。適切なアダプターはシクロデキストリン、環状ペプチドおよびキューカビチュリルを含むが、これに限定されない。アダプターは、好ましくはシクロデキストリンまたはその誘導体である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Ｅｌｉｓｅｅｖ，Ａ．Ｖ．，およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ−Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．１１６，６０８１−６０８８に開示されたもののうちいずれであってもよい。アダプターは、より好ましくはヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。ｇｕ７−βＣＤ内のグアニジノ基のｐＫａはａｍ７−βＣＤの一級アミンよりもはるかに高いので、より正に荷電する。このｇｕ７−βＣＤアダプターを用いて、ヌクレオチドの細孔内滞留時間を延長、測定する残留電流値の精度を向上、さらには高温または低いデータ取得率において塩基検出率を向上してもよい。
【００９０】
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）架橋剤を、以下により詳細に論じる方法により用いる場合、アダプターは、好ましくはヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）である。
【００９１】
（共有結合）
アダプターは細孔と共有結合する。アダプターは、当技術分野において既知であるあらゆる方法を用いて細孔と共有結合させることができる。アダプターは細孔と直接結合させてもよい。アダプターは、好ましくは二官能性架橋剤を用いて細孔と共有結合させる。適切な架橋剤は、当技術分野において周知である。好ましい架橋剤は３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル、４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルおよび８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルを含む。最も好ましい架橋剤は３−（２−ピリジルジチオ）プロパン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）である。アダプターは、典型的にはアダプター／架橋剤複合体が細孔と共有結合する前に、二官能性架橋剤と結合するが、二官能性架橋剤／細孔複合体がアダプターと結合する前に、二官能性架橋剤が細孔と共有結合することも可能である。本発明の細孔の生成は、以下により詳細に論じる。
【００９２】
共有結合部位は、アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置されるよう選択される。それにより、ヌクレオチドと細孔の相互作用が促進され、且つそれによりヌクレオチドの検出が可能となる。またそれによって、ヌクレオチドがそのヌクレオチドに特異的な様式で細孔内を流れる電流を変化させることが確実となる。
【００９３】
アダプターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９と同じ水平面において細孔の樽状構造またはチャネルに配置される場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９に配置される。アダプターは、細孔の樽状構造またはチャネル内で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９と同じ垂直位置に配置される場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９に配置される。アダプターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍にある残基と同じ水平面において細孔の樽状構造またはチャネルに配置される場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍に配置される。アダプターは、細孔の樽状構造またはチャネル内で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍にある残基と同じ垂直位置に配置される場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍に配置される。アダプターは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の水平面より５オングストローム未満、たとえば３未満、または２オングストローム未満などにある水平面に配置される。アダプターは、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１または１４２と同じ水平面に配置される。
【００９４】
アダプターは、典型的には細孔の樽状構造またはチャネルと共有結合する。アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置され、ヌクレオチドとの細孔の相互作用を促進し、且つそれによりヌクレオチドの検出を可能とする限り、アダプターは樽状構造またはチャネル内のあらゆる部位で共有結合することができる。アダプターは、典型的にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍にある樽状構造またはチャネル内のアミノ酸と共有結合する。アダプターは、好ましくは各サブユニットのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９によって形成される残基の環の近傍にある、細孔内のアミノ酸と共有結合する。各サブユニットのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９によって形成される残基の環より遠隔にある樽状構造またはチャネル内のアミノ酸に、アダプターが共有結合する場合、アダプターが残基１３９またはその近傍に配置されるように適切な長さの二官能性架橋剤を用いてもよい。
【００９５】
アダプターは、好ましくは７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９または１２１と結合する。アダプターは、より好ましくは７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３５と結合する。アダプターを残基１１９、１２１または１３５と結合させることで、アダプターは各サブユニットのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９によって形成される残基の環の近傍に配置される。
【００９６】
細孔は、好ましくは１つまたはそれ以上のアミノ酸の導入によって修飾されて、分子アダプターの二官能性架橋剤との共有結合が促進される。より好ましくは、細孔の樽状構造またはチャネルが修飾されて、分子アダプターの二官能性架橋剤との共有結合が促進される。細孔は、当技術分野において既知であるあらゆる方法を用いて修飾することができる。１つまたはそれ以上のアミノ酸を、細孔の同一または異なるサブユニットに導入してもよい。システインなどのような、共有結合を形成することのできるあらゆるアミノ酸を導入することができる。アミノ酸は、天然に産するものでも非天然的に産するものでもよい。１つまたはそれ以上のアミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。
【００９７】
好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５が修飾されて共有結合を促進する。より好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５が修飾される。上に論じたサブユニットのいずれも、分子アダプターまたは二官能性架橋剤の共有結合を促進するために用いることができる。
【００９８】
（アダプターの配置）
アダプターは、細孔を用いてヌクレオチドを検出することを可能とする位置において、細孔と共有結合する。アダプターは配置され、そのようなヌクレオチドがそのヌクレオチドに特異的な様式で細孔内を流れる電流を変化させる。アダプターはそのように配置され、これは細孔とヌクレオチドのホスト−ゲスト化学を向上する。アダプターは、細孔の物理的または化学的性質を変化させ、且つそのヌクレオチドとの相互作用を向上させるよう配置される。アダプターは、典型的には細孔を通るイオンの流れに対して立体的な遮断を形成するよう配置される。アダプターがヌクレオチドと特異的に相互作用または結合することができる場合、アダプターはヌクレオチドと特異的に相互作用または結合するよう配置される。ヌクレオチドと相互作用するアダプター内の１つまたはそれ以上の化学基は、好ましくはヌクレオチドがそこを通じて進入する細孔の末端より離れて配向される。そのような配向によって、細孔の樽状構造またはチャネルを経たヌクレオチドの取り込みが促進される。好ましくは、基はアミノ基である。そこを経てヌクレオチドが進入する細孔の末端は、ｃｉｓ末端であってもｔｒａｎｓ末端であってもよい。末端は、好ましくはｃｉｓ末端である。
【００９９】
共有結合は、アダプターが正しく配置されるよう設計してもよい。たとえば、アダプターが正しく配置されるよう、アダプターが細孔と共有結合する部位（例：アミノ酸）を設計してもよく、且つ／またはアダプターが正しく配置されるよう二官能性架橋剤を用いてもよい。
【０１００】
本発明の細孔は、アダプターの配置を促進するよう修飾される。上に論じるように、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍においてグルタミンを有する。残基１３９および／またはその近傍におけるグルタミンは、アダプター上の水酸基などの化学基と水素結合により相互作用することができ、かつそれにより細孔の樽状構造またはチャネル内におけるアダプターの配置を促進する。細孔は、アダプターの配置を促進することを目的とした、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３などの他の配置における修飾も含む（上を参照）。
【０１０１】
最も好ましくは、細孔は修飾されて共有結合を促進し、且つアダプターの配置を促進する。このような実施形態においては、共有結合部位と、アダプターの配置を促進するために細孔が修飾される部位の間の空間的関係は、アダプターが正しい位置に保持されることを確実にするよう設計される。たとえばアダプターは、好ましくは１つのサブユニットにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３５と結合し、各サブユニットのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９によって形成される１つまたはそれ以上のグルタミンの環の近傍にそれを配置する。１つまたはそれ以上のグルタミンは、水素結合によりアダプターの配置を促進する。
【０１０２】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列であって、サブユニットが残基１１９、１２１または１３５にシステインを有するポリヌクレオチド配列も提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種は、上に論じたもののうちのいかなるものであってもよい。ポリヌクレオチド配列は、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３に示す配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３の配列の全配列に対し、ヌクレオチド同一性に基づき、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％相同である配列を含む。６００またはそれ以上、たとえば７００、７５０、８５０または９００またはそれ以上の長さの近接ヌクレオチドに対し、少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、９０％または９５％のヌクレオチドの同一性があってもよい（「硬い相同性」）。相同性は上述の方法によって算出してもよい。ポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重度に基づき、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３と異なる配列を含んでもよい。
【０１０３】
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的な方法を用いて誘導または複製することができる。染色体ＤＮＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどの細孔生成生物より抽出してもよい。細孔サブユニットをコードする遺伝子は、特異的なプライマーを包含するＰＣＲを用いて増幅することができる。次に、増幅された配列は、クローニングベクターなどの複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。ベクターを用いて、適合性のある宿主細胞内でポリヌクレオチドを複製してもよい。したがって、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、ベクターを適合性のある宿主細胞に導入し、さらにベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を発育させることにより生成してもよい。ベクターは、宿主細胞より回収してもよい。細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチドのクローニングに適した宿主細胞は、当技術分野において既知であり、且つ以下により詳細に記載される。
【０１０４】
細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、適切な発現ベクターにクローニングしてもよい。発現ベクターにおいては、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、典型的には宿主細胞によるコード配列の発現を提供できる対照配列と動作的に結合する。このような発現ベクターは、細孔サブユニットを発現させるために用いることができる。
【０１０５】
用語「動作的に結合」は、記載された成分がその意図した様式で機能することを許す関係にある近接を指す。コード配列に「動作的に結合した」対照配列は、対照配列に適合した条件下でコード配列の発現が達成されるよう結合する。同一または異なった細孔サブユニット配列の複数のコピーを、ベクターに導入してもよい。
【０１０６】
発現ベクターは、その後で適切な宿主細胞に導入することができる。したがって、細孔サブユニットは、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適合性のある細菌宿主細胞に導入し、さらに細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列の発現を引き起こす条件下で宿主細胞を発育させることにより生成してもよい。組換えにより発現した細孔サブユニットは、自己集合させて宿主細胞膜内の細孔としてもよい。代替的に、この様式で生成された組換え細孔を宿主細胞より取出し、さらに他の膜に挿入してもよい。少なくとも２つの異なるサブユニットを含む７量体細孔をプロディウスする場合、異なるサブユニットは上述の方法で異なる宿主細胞に別個に発現させ、宿主細胞より取出し、さらにウサギ細胞膜などの別の膜において集合させて細孔としてもよい。
【０１０７】
ベクターは、たとえば複製元、任意に前記ポリヌクレオチド配列の発現を目的としたプロモーターおよび任意にプロモーターのレギュレーターを具備したプラスミド、ウイルスまたはファージベクターとしてもよい。ベクターは１つまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、たとえばテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでもよい。プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、そのために発現ベクターが設計される宿主細胞と適合するように選択してもよい。典型的には、Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターが用いられる。
【０１０８】
宿主細胞は、典型的には細孔サブユニットを高レベルで発現する。細胞を形質転換するために用いられる発現ベクターと適合可能とするために、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞が選択されるであろう。宿主細胞は、典型的には細菌であり、且つ好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。λＤＥ３溶原を有するあらゆる細胞、たとえばＣ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３），Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現することができる。
【０１０９】
（本発明の細孔を生成する方法）
本発明は、本発明の細孔を生成する方法も提供する。方法は、細孔とヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを細孔と共有結合させることを含む。アダプターは、当技術分野において既知であるあらゆる方法を用いて、細孔と共有結合させることができる。
【０１１０】
上に論じられた細孔、アダプターおよび二官能性架橋剤のいずれも本方法において用いることができる。共有結合部位は、上に論じられた方法で選択される。
【０１１１】
アダプターは、典型的には、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤなどの二官能性架橋剤を含むアダプターを、システインなどの反応性アミノ酸を少なくとも１つ含む変異型α−ＨＬ細孔に添加することにより細孔と結合する。しかし、この方法には２つの欠点がある。第１は、時間の経過とともに酸化または溶液中の他の化学種との反応によって劣化する、システインなどのアミノ酸の反応性である。第２は、架橋剤と細孔の間で反応が起こるまでにかかる時間である。特に単一の細孔を用いる場合、これらの欠点によって困難がもたらされることがある。たとえば、単一のシステイン変位を含む単一のα−ＨＬ細孔を液状膜に挿入し、架橋剤を含むアダプターを電気生理学的チャンバーに添加する場合、１つがシステインと反応するまでアダプター分子は細孔に出入りする。システインが不活化すると、その後はどれだけ多くのアダプター分子が細孔に進入しても反応は認められないであろう。細孔中の反応性アミノ酸の不活化は、たとえば酸素の除去、還元剤（例：ジチオスレイトール、ＤＴＴ）などの安定化剤の添加、システインを化学的保護したのち使用前に活性化すること、または保存前のアダプターとの化学的結合などによる保存条件の改善によって、減少させることができる。
【０１１２】
好ましい実施形態においては、そこにアダプターが結合する細孔は保護的脱離基を含み、且つ本方法は細孔から脱離基を置換することを含む。保護的脱離基は、細孔中の１つまたはそれ以上の反応的アミノ酸を保護するために用いられる。保護的脱離基は、好ましくは細孔中の１つまたはそれ以上のシステイン残基を保護するために用いられる。保護的脱離基は、架橋剤を含みうる、アダプター上の反応性の基との反応によって置換される。
【０１１３】
より好ましい実施形態においては、細孔は、上述の変種におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１１９、１２１または１３５のような、１つまたはそれ以上の反応性システイン上の保護的脱離基を含み、且つ反応性−ＳＨ基を有する架橋剤を含むアダプターと反応する。架橋剤上の−ＳＨ基は、細孔と結合した保護的脱離基と置換し、且つそれと共有結合するアダプターを有する細孔が生成される。
【０１１４】
保護的脱離基を細孔中の１つまたはそれ以上の反応性アミノ酸と結合させること、およびアダプター上に反応性の基を有することによって、本発明の方法は、特に単一の細孔を用いる場合に大いに改善される。たとえば、反応性アダプター分子を、保護基を有する単一の細孔と結合させる場合、アダプター分子数は単一細孔数をはるかに上回る。その結果、反応性分子の一部が不活化されたとしても、少なくとも１つは反応性を維持し、細孔より保護的脱離基を置換する可能性がある。
【０１１５】
電気生理学的実験は極めて困難なことがあるので、実験の準備時間を制限し、且つそれによりデータ取得までの時間を最適化することが好ましい。したがって、二層挿入の前にアダプターを細孔に結合することが好ましい。これは電気生理学的実験の容易さを高めるばかりでなく、細孔の使用期限を向上させる。
【０１１６】
適切な保護的脱離基は当技術分野において既知である。例は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）および２，２’−ジチオジピリジンを含むが、これに限定されない。
【０１１７】
アダプターは、オリゴマー化して細孔を形成する前に、１つまたはそれ以上のサブユニットと結合させてもよい。大きなアダプター分子は、オリゴマー化の効率を低下させるか、または細孔の形成を完全に妨害することがある。しかし、この手法の利点は、電荷または質量の比較的大きな変化によって、単量体−アダプター化学種が未修飾単量体から容易に分離されることである。さらに、オリゴマー化の前に２つの化学種を分離することができるので、最終的なナノ細孔が共有結合したアダプターを含有する確率は高い。
【０１１８】
アダプターは、それらがオリゴマー化する際に、細孔の１つまたはそれ以上のサブユニットと結合させてもよい。これは、アダプターを装填された脂質小胞を用いて行う。この手法は、アダプターをサブユニットと離れた場所に配置することにより利益を受ける。さらに、オリゴマー化が起こる場合、細孔は小胞二重層によってアダプターより保護される。次に、装填された小胞は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル操作を実行して膜より小胞を抽出し、未反応のアダプターは全て除去する。
【０１１９】
アダプターは、オリゴマー化された細孔と結合させてもよい。細孔は、上に論じた標準的技術を用いて生成される。アダプターは、７量体が形成された後に付加される。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いるなどの最終的な生成の前、または直後に行うことができる。この実施形態は、標準的な細孔生成プロトコルに必要な変更が最も少なく、且つ生成する本発明の細孔の割合は高い。しかし、この実施形態を用いて生成される細孔の収率は予想よりはるかに低いことが試験により示されている。おそらくこれは、タンパク質サンプル中の界面活性剤を阻害するのに十分な量のアダプターが存在して、タンパク質の凝集を引き起こしたか、または疎水性架橋剤が存在する場合、おそらくは架橋剤が細孔のβ−樽状構造と会合し、且つ効率的な細孔の挿入を妨害したためと思われる。
【０１２０】
本方法は、細孔を用いたヌクレオチドの検出を可能とする位置において、アダプターが細孔と結合するか否か判定することも含む。これは、細孔を用いてヌクレオチドの有無を判定することができるか否かを判定することも包含する。これは、以下により詳しく記載する方法で行うことができる。ヌクレオチドの有無を判定できる場合、アダプターは正しい位置にあり、且つ本発明の細孔が生成されている。ヌクレオチドの有無を判定できない場合、アダプターは正しくない位置にある可能性があり、且つ本発明の細孔は生成されていない。
【０１２１】
（個別のヌクレオチドを同定する方法）
本発明は、個別のヌクレオチドを同定する方法も提供する。本方法は、ヌクレオチドが本発明の細孔と相互作用するよう、ヌクレオチドを細孔と接触させること、および相互作用時に細孔を通過する電流を測定すること、およびそれによりヌクレオチドの本性を判定することを含む。したがって、本発明は個別のヌクレオチドの確率的感知を包含する。本発明の細孔のいずれも用いることができる。
【０１２２】
ヌクレオチドに固有の様式で細孔内を電流が流れる場合（すなわち、ヌクレオチドと関連する特徴的な電流が細孔を流れるのが検出される場合）、ヌクレオチドが存在する。電流がヌクレオチドに特異的な様式で細孔内を流れない場合、ヌクレオチドは存在しない。
【０１２３】
本発明は、それらが細孔を流れる電流に与える異なる作用に基づき、類似した構造のヌクレオチドを識別するために用いることができる。個別のヌクレオチドは、細孔と相互作用する際に、電流の振幅より単一分子レベルで同定することができる。本発明は、特定のヌクレオチドがサンプル中に存在するか否か判定するために用いることもできる。本発明は、サンプル中の特定のヌクレオチドの濃度を測定するために用いることもできる。
【０１２４】
本方法は、本発明の細孔を膜に挿入することができる、あらゆる適切な膜／細孔系を用いて実施することができる。本方法は、典型的には（ｉ）本発明の細孔を含む人工膜、（ｉｉ）本発明の細孔を含む分離された天然産生膜、または（ｉｉｉ）本発明にしたがって修飾されている細孔を発現する細胞を用いて実施することができる。本方法は、好ましくは人工膜を用いて実施される。膜は、本発明の細孔に加えて、他の膜貫通および／または膜内タンパク質さらには他の分子を含んでもよい。
【０１２５】
膜は、イオン、ヌクレオチドおよび核酸の流れに対する障壁を形成する。好ましくは、膜は脂質二重層である。本発明にしたがって用いるのに適した脂質二重層は、本技術分野において既知の方法を用いて生成することができる。たとえば、脂質二重膜はＭｏｎｔａｌおよびＭｕｅｌｌｅｒ（１９７２）の方法を用いて形成することができる。脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３に記載の方法を用いて形成することもできる。
【０１２６】
本発明の方法は、リン脂質、糖脂質、コレステロールおよびその混合物を含むが、これに限定されない、あらゆる膜脂質より形成される脂質二重層を用いて実施してもよい。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３に記載のあらゆる脂質を用いてよい。
【０１２７】
細孔を脂質二重層などの膜に挿入することについては、方法は本技術分野において既知である。たとえば、脂質二重層に拡散し、さらに脂質二重層と結合し且つ機能的な状態に集合することにより挿入されるよう、精製された形態で脂質二重層を含む溶液に細孔を懸濁してもよい。代替的に、Ｍ．Ａ．Ｈｏｌｄｅｎ，Ｈ．Ｂａｙｌｅｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，６５０２−６５０３および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピック・ザ・プレイス」法を用いて、細孔を直接膜に挿入してもよい。
【０１２８】
本発明の方法は、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１２９】
（個別のヌクレオチド）
個別のヌクレオチドは、単一のヌクレオチドである。個別のヌクレオチドは、他のヌクレオチドまたは核酸と、ヌクレオチド結合により結合していないものである。ヌクレオチド結合は、他のヌクレオチドの糖基と結合しているヌクレオチドのリン酸基の１つを包含する。個別のヌクレオチドは、典型的には少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、または少なくとも５０００個のヌクレオチドの他の核酸配列とヌクレオチド結合によって結合していないものである。たとえば、個々のヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖などの標的ポリヌクレオチド配列より消化されている。
【０１３０】
本発明の方法を用いて、あらゆるヌクレオチドを判定することができる。ヌクレオチドは、天然産生または人工とすることができる。ヌクレオチドは、典型的には核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含む。核酸塩基は、典型的には複素環状である。適切な核酸塩基はプリン類およびピリミジン類を含み、またより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。典型的には、糖はペントース糖である。適切な糖はリボースおよびデオキシリボースを含むが、これに限定されない。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含む。
【０１３１】
適切な核酸は、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸、（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含むが、これに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰである。
【０１３２】
ヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸などの核酸配列の消化によって得ることができる。核酸配列は、当技術分野において既知であるあらゆる方法を用いて消化することができる。適切な方法は酵素または触媒を用いるものを含むが、これに限定されない。核酸の触媒的消化は、Ｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００２；４１：６６９−６７７に開示される。
【０１３３】
単独の核酸配列に由来する個別のヌクレオチドは、核酸の全体または一部の配列を決定するために、連続的な様式で細孔と接触させてもよい。本発明の第２の実施形態にしたがった核酸配列の決定は、以下により詳細に論じる。
【０１３４】
典型的には、ヌクレオチドが核酸配列の消化に由来する場合のように、ヌクレオチドは未修飾である。ヌクレオチドは、代替的に修飾されていても損傷されていてもよい。ヌクレオチドは、典型的にはメチル化または酸化される。ヌクレオチドは、判別ラベルでラベリングしてもよい。判別ラベルは、ヌクレオチドが検出されることを可能とするあらゆる適切なラベルとしてよい。適切なラベルは蛍光分子、たとえば１２５Ｉ、３５Ｓなどの放射性同位元素およびビオチンなどのリンカーを含む。
【０１３５】
ヌクレオチドは、典型的にはあらゆる適切な生物学的サンプル中に存在する。適切な生物学的サンプルは、上に論じられる。
【０１３６】
（細孔とヌクレオチドの相互作用）
ヌクレオチドは、膜のいずれかの側で細孔と接触させてもよい。ヌクレオチドは、膜のいずれの側で細孔に導入してもよい。ヌクレオチドは、ヌクレオチドが細孔を経て膜の反対側に通過することを可能とする膜の面と接触させてもよい。たとえば、ヌクレオチドが細孔を通過しうるよう、その生来の環境によって、イオンまたはヌクレオチドなどの小分子が細孔の樽状構造またはチャネルに進入することを可能とする、細孔の一方の末端にヌクレオチドを接触させる。このような場合、ヌクレオチドは、細孔の樽状構造またはチャネルを経て膜を横断するにつれて、細孔および／またはアダプターと相互作用する。代替的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがアダプターを経て、またはこれとともに細孔と相互作用し、細孔と解離し、且つ膜の同じ側に留まることを可能とする膜の面と接触させてもよい。本発明は、そこにおいてアダプターの位置が固定される細孔を提供する。結果として、ヌクレオチドは、好ましくはアダプターがヌクレオチドと相互作用することを可能とする細孔の末端と接触する。
【０１３７】
ヌクレオチドは、あらゆる方式且つあらゆる部位で細孔と相互作用しうる。上に論じたように、ヌクレオチドは、好ましくはアダプターを介して、またはこれと共に、可逆的に細孔と結合する。ヌクレオチドは、最も好ましくは、細孔を経て膜を横断するにつれて、アダプターを介して、またはこれと共に可逆的に細孔と結合する。またヌクレオチドは、細孔をへて膜を横断するにつれて、アダプターを介して、またはこれと共に、細孔の樽状構造またはチャネルとも可逆的に結合することができる。
【０１３８】
ヌクレオチドは、ヌクレオチドと細孔の相互作用の際、そのヌクレオチドに特異的な様式で細孔内を流れる電流に影響する。たとえば、特定のヌクレオチドは、特定の平均時間の間且つ特定の程度、細孔を流れる電流を減少させるであろう。換言すれば、細孔を流れる電流は特定のヌクレオチドに特徴的である。対照実験を実施して、特定のヌクレオチドが細孔内を流れる電流に有する影響を判定してもよい。その後、サンプル中の特定のヌクレオチドを同定、または特定のヌクレオチドがサンプル中に存在するか判定するために、試験サンプルに対して本発明の方法を実施した結果を、このような対象試験より導かれたものと比較することができる。細孔を流れる電流が特定のヌクレオチドを指示する様式で影響される頻度は、サンプル中のそのヌクレオチドの濃度を判定するために用いることができる。サンプル中の異なるヌクレオチドの比率も、算出することができる。たとえば、ｄＣＭＰとメチル−ｄＣＭＰの比率を産出することができる。
【０１３９】
（機器）
本方法は、本発明の細孔が膜に挿入される膜／細孔系を検討するのに適したあらゆる機器を用いて、実施することができる。本方法は、確率的感知に適したあらゆる装置を用いて実施することができる。たとえば、装置は水溶液およびチャンバーを２つの区画に分ける障壁を含むチャンバーを含む。障壁は、細孔を含む膜が形成される開口を有する。ヌクレオチドは、ヌクレオチドをチャンバーに導入することにより、細孔と接触させることができる。ヌクレオチドは、チャンバーの２区画のうちいずれかに導入することができる。
【０１４０】
本方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２に記載の機器を用いて実施することもできる。
【０１４１】
本発明の方法は、ヌクレオチドとの相互作用時に細孔を流れる電流を測定することを包含する。したがって、機器は電位を印加し、且つ膜および細孔を横切る電気的シグナルを測定することのできる電気回路も含む。本方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いて実施することができる。方法は、好ましくは電圧クランプの使用を包含する。
【０１４２】
（サンプル）
ヌクレオチドはあらゆる適切なサンプル中に存在する。本発明は、典型的にはヌクレオチドを含有することが既知である、または含有することが疑われるサンプルに対して実施される。本発明は、その本性が不明である１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含有するサンプルに対して実施してもよい。代替的に、本発明は、サンプル中のその存在が既知であるかまたは予測される１つまたはそれ以上のヌクレオチドの本性を確認するために、サンプルに対して実施してもよい。
【０１４３】
サンプルは、生物学的サンプルであってもよい。本発明は、あらゆる生物または微生物より得られるか、または抽出されるサンプルに対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよい。生物または微生物は、典型的には原核性または真核性であり、且つ典型的には５つの界：植物、動物、真菌、細菌、原生生物のうち１つに属する。本発明は、あらゆるウイルスより得られるか、または抽出されるサンプルに対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよい。サンプルは、好ましくは液状サンプルである。サンプルは、典型的には患者の体液を含む。サンプルは尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってもよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。サンプルは、典型的にはヒト由来であるが、代替的にウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの他の哺乳類由来であってもよく、または代替的にネコまたはイヌなどのペットであってもよい。
【０１４４】
サンプルは、非生物学的サンプルであってもよい。非生物学的サンプルは、好ましくは液状サンプルである。非生物学的サンプルの例は、外科用液状物、飲用水などの水、海水または河川水、および臨床検査用の試薬を含む。
【０１４５】
サンプルは、典型的にはたとえば遠心分離または望ましくない分子または赤血球などの細胞を濾取する膜の通過によって、分析される前に処理される。サンプルは、採取時に速やかに測定してもよい。またサンプルは、典型的には分析前に、好ましくは−７０℃未満で保存してもよい。
【０１４６】
（条件）
本発明の方法は、ヌクレオチドとの相互作用時に細孔を流れる電流を測定することを包含する。膜貫通タンパク質細孔を通過するイオン電流を測定するための適切な条件は、当技術分野において既知であり、且つ実施例において開示される。方法は、膜および細孔を横断して印加される電圧によって実施される。用いられる電圧は、典型的には−４００ｍＶから４００ｍＶである。使用する電圧は、好ましくは−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限、および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限を有する範囲内にある。使用する電圧は、より好ましくは１２０ｍＶから１７０ｍＶの範囲にある。上昇した印加電位を用いることにより、本発明の細孔による異なるヌクレオチドの間の識別を高めることが可能である。
【０１４７】
本方法は、典型的にはあらゆる塩化アルカリ金属塩の存在下で実施される。上に論じた典型的な機器においては、塩はチャンバー内の水溶液に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が典型的に用いられる。ＫＣｌが好ましい。塩濃度は、典型的には０．１から２．５Ｍ、０．３から１．９Ｍ、０．５から１．８Ｍ、０．７から１．７Ｍ、０．９から１．６Ｍまたは１Ｍから１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは１５０から５００ｍＭである。高い塩濃度は、高い信号雑音比を提供し、正常な電流変動のバックグラウンドに対して、同定すべきヌクレオチドの存在を指示する電流が見込まれる。核酸配列を決定する場合などのように、酵素の存在下でヌクレオチド検出が実施される場合、より低い塩濃度を用いなければならない。これについては以下でより詳しく議論する。
【０１４８】
本方法は、典型的には緩衝剤の存在下で実施される。上に論じた典型的な機器においては、緩衝剤はチャンバー内の水溶液に存在する。本発明の方法においては、あらゆる緩衝剤を使用することができる。適切な緩衝剤１つは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤である。本方法は、典型的には４．０から１０．０、４．５から９．５、５．０から９．０、５．５から８．８、６．０から８．７または７．０から８．８または７．５から８．５のｐＨで実施される。使用されるｐＨは、好ましくは約７．５である。
【０１４９】
本方法は、典型的には０℃から１００℃、１５℃から９５℃、１６℃から９０℃、１７℃から８５℃、１８℃から８０℃、１９℃から７０℃、または２０℃から６０℃で実施される。本方法は室温で実施してもよい。本方法は、好ましくは約３７℃などの酵素機能を支持する温度で実施する。温度が上昇している場合、低い塩濃度で良好なヌクレオチド識別を達成することができる。
【０１５０】
（核酸配列を決定する方法）
本発明は、標的ヌクレオチド配列を決定する方法も提供する。１つの実施形態においては、本方法は（ａ）エキソヌクレアーゼを用いて標的配列の一方の末端より個別のヌクレオチドを消化すること；（ｂ）ヌクレオチドが細孔と相互作用するようヌクレオチドを本発明の細孔と接触させること；（ｃ）相互作用時に細孔を通過する電流を測定し、またそれによりヌクレオチドの本性を判定すること；および（ｄ）標的配列の同じ末端で手順（ａ）から（ｃ）を繰り返し、またそれにより標的配列を配列決定することを含む。したがって本方法は、核酸の配列を決定するための連続的な様式による、核酸配列の各単一ヌクレオチドの確率的感知を包含する。本方法の手順（ｂ）および（ｃ）は、全般的に、上に論じたヌクレオチドを同定する方法において実施される手順と同一である。
【０１５１】
本発明の細孔は、これらの方法に特に適している。核酸の配列を効率的に決定するためには、核酸中の各ヌクレオチドが連続的な様式で同定されることを確実にすることが重要である。本発明の細孔内でアダプターが固定されているという性質は、連続した各ヌクレオチドが細孔と相互作用すれば、常に特徴的な電流が細孔内を流れることを意味している。
【０１５２】
この方法を用いて、標的ヌクレオチドの配列全体または一部のみを決定してもよい。核酸配列は、あらゆる長さとすることができる。たとえば、核酸配列は少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも４００個または少なくとも５００個のヌクレオチドの長さとすることができる。核酸は天然産生または人工とすることができる。たとえば、本方法は、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を確認するために用いてもよい。本方法は、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１５３】
ヌクレオチドを検出することに関する、および具体的には使用してもよい細孔、膜、機器および条件に関する上記のすべての議論は、同等にこれらの方法に適用することができる。典型的には、核酸は上に論じるところのあらゆる生物学的サンプル中に存在する。
【０１５４】
（エキソヌクレアーゼ）
１つの実施形態においては、標的核酸配列を配列決定する方法は、標的配列をデオキシリボヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼと接触させ、核酸の一方の末端より個別のヌクレオチドを遊離させることを包含する。エキソヌクレアーゼは、典型的には核酸の一方の末端に掛合し、且つ配列のその末端より一度に１つのヌクレオチドを消化する。エキソヌクレアーゼは核酸を５’から３’方向、または３’から５’方向に消化することができる。そこにエキソヌクレアーゼが結合する核酸の末端は、典型的には使用する酵素の選択および／または当技術分野において既知である使用する方法によって決定される。核酸配列のいずれかの末端における水酸基またはキャップ構造は、典型的にはエキソヌクレアーゼが核酸配列の特定の末端に結合することを妨害または促進するために用いうる。
【０１５５】
本方法においては、あらゆるエキソヌクレアーゼ酵素を使用することができる。本方法において用いるための好ましい酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）およびその変種を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の３つの同一のサブユニットが相互作用し、３量体エキソヌクレアーゼを形成する。変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１８または２０のそれと異なるアミノ酸配列を有し、且つエキソヌクレアーゼ活性を保持するポリペプチドである。変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種について上に論じたのと同じ様式かつ同じ程度で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１８または２０と異なりうる。変種は、好ましくは核酸との結合および核酸の消化を担当するドメイン（酵素的ドメイン）を含む。変種は、好ましくは必要に応じて酵素活性速度が増加または減少しており、且つ／または野生型酵素と比較してより高い塩耐性を有する。エキソヌクレアーゼは、細孔の生成について上に論じた方法のいずれかを用いて生成してもよい。
【０１５６】
本方法は、上に論じたように、個別のヌクレオチドがそれぞれ同定できるような速度でヌクレオチドが核酸の末端より消化されるよう、核酸配列をエキソヌクレアーゼと接触させることを包含する。これを行う方法は当技術分野において周知である。たとえば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて同定できるように、ポリペプチドの末端より単一アミノ酸を連続的に消化するために、エドマン分解が用いられる。本発明においては、相同的な方法を用いてもよい。
【０１５７】
エキソヌクレアーゼは、好ましくは細孔と共有結合する。エキソヌクレアーゼを細孔と共有結合させるための方法は、当技術分野において周知である。本方法は、好ましくは米国特許出願第６１／０７８，６９５号からの優先権を主張し且つ本出願と同時に出願された国際同時継続出願［Ｊ Ａ Ｋｅｍｐ ＆ Ｃｏ Ｒｅｆ：Ｎ．１０４４０４Ａ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｌａｂｓ Ｒｅｆ：ＯＮＬ ＩＰ ００５］に記載されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種およびエキソヌクレアーゼを含む１つまたはそれ以上の構造体を含む細孔の使用を包含する。本方法が同時継続出願に開示された構造体を含む細孔の使用を包含する場合、標的核酸配列は、典型的には酵素が細孔と結合する膜の面と接触する。
【０１５８】
エキソヌクレアーゼが機能する速度は、典型的には野生型エキソヌクレアーゼの最適速度よりも低い。配列決定方法におけるエキソヌクレアーゼ活性の適切な速度は、０．５から１０００ヌクレオチド／秒、０．６から５００ヌクレオチド／秒、０．７から２００ヌクレオチド／秒、０．８から１００ヌクレオチド／秒、０．９から５０ヌクレオチド／秒または１から２０または１０ヌクレオチド／秒の消化を包含する。好ましくは、速度は１、１０、１００、５００または１０００ヌクレオチド／秒である。好ましいエキソヌクレアーゼ活性の速度は、多様な方法で達成することができる。たとえば、本発明にしたがって、最適活性速度が低下した変種エキソヌクレアーゼを用いてもよい。
【０１５９】
エキソヌクレアーゼの活性は、典型的にはｐＨが減少するにしたがってその活性が低下するようなｐＨ依存性である。したがって、第２の実施形態の方法は、典型的には７．５から８．０または７．７から８．０のｐＨで実施される。使用するｐＨは、好ましくは約７．５である。
【０１６０】
エキソヌクレアーゼの活性は、典型的にはマグネシウムのような特定の金属イオンの存在に依存する。したがって、エキソヌクレアーゼ酵素の活性の適切な速度は、マグネシウムイオンの濃度を低下させるか、またはマグネシウムイオンをマンガンイオンなどの異なる金属イオンと置換することによって達成される。
【０１６１】
エキソヌクレアーゼ活性の速度は、典型的には塩濃度が上昇するにつれて低下する。エキソヌクレアーゼは、高い塩コンサーントレーションにおいては作用しないであろう。本発明の細孔は、低い塩コンサーントレーションでヌクレオチドを識別することができる。配列決定法は、典型的には０．１５から０．８Ｍ（１５０ｍＭから８００ｍＭ）の塩濃度を用いて実施される。これらの低塩濃度における良好なヌクレオチド識別は、３０℃から４０℃などの室温を上回る温度、且つ好ましくは約３７℃において本方法を実施することにより達成される。
【０１６２】
酵素活性に適した条件を維持する一方で溶液のコンダクタンスを高めるために、溶液の濃度を高めることに加えて、用いることのできる他の戦略は数多くある。そのような戦略の１つは、酵素側の塩の低塩濃度および反対側のより高い濃度の異なる２つの濃度の塩溶液を分割するために、脂質二重層を用いることである。この手法の１例は、膜のｃｉｓ側に２００ｍＭ ＫＣｌを、ｔｒａｎｓチャンバーに５００ｍＭ ＫＣｌを用いることである。これらの条件においては、通常の条件下での細孔を経たコンダクタンスは４００ｍＭ ＫＣｌとほぼ同等と予想され、且つｃｉｓ側に配置した場合、酵素は２００ｍＭのみを経験する。非対称的塩条件を用いることのもう１つの可能な利点は、細孔にまたがって誘導される浸透圧勾配である。この水の正味の流動を用いて、ヌクレオチドを細孔内に引き入れて検出することが可能であろう。ショ糖、グリセロールまたはＰＥＧなどの中性オスモライトを用いて、同様の効果を達成することができる。もう１つの可能性は、ＫＣｌレベルが比較的低い溶液を用い、且つ酵素活性に対する妨害性の低いもう１つの電荷坦持化学種に依拠することである。
【０１６３】
（キット）
本発明は、本発明の細孔を生成するためのキットも提供する。キットは、それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬ細孔のサブユニットをコードする、７つのポリヌクレオチドを含む。７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９にグルタミンを有する。サブユニットのうち少なくとも１つ、好ましくは１つのみが残基１１９、１２１または１３５にシステインを有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９にグルタミンを有するサブユニットをコードする好ましいポリヌクレオチドを、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、９、１１および１３に示す。残基１１９，１２１または１３５にシステインを有するサブユニットをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１および１３に示すもののうちいずれかであってもよい。
【０１６４】
キットは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列を含む６つのポリヌクレオチド、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３に示す配列を含む１つのポリヌクレオチドを含む。キットは、最も好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列を含む６つのポリヌクレオチドおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示す配列を含む１つのポリヌクレオチドを含む。
【０１６５】
本発明は、標的ヌクレオチド配列を決定する方法を実施するために用いうるキットも提供する。したがって、キットはヌクレオチド配列の決定に適している。キットは、本発明の細孔およびエキソヌクレアーゼを含む。
【０１６６】
本発明のキットは、さらに上述の実施形態のいずれかを実施可能とする他の試薬または器具を１つまたはそれ以上含んでもよい。このような試薬または器具は、以下に挙げるもののうち１つまたはそれ以上を含む：適切な緩衝剤（水溶液）、対象よりサンプルを採取する手段（容器または針を含む器具など）、ポリヌクレオチド配列を増幅および／または発現するための手段、上に定義するような膜または電圧またはパッチクランプ機器。試薬は、液状サンプルで試薬を再懸濁するよう、乾燥した状態でキットに存在してもよい。キットは、任意に、本発明の方法でキットを用いることができるようにする指示書、またはどの患者に本方法を用いうるかについての詳細も含んでよい。キットは、任意にヌクレオチドを含んでもよい。
【０１６７】
以下の実施例は本発明を例示する：
【実施例】
【０１６８】
（１．材料と方法）
（１．１ 薬品類）
入手した試薬は以下のとおりである：１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）；ペンタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ヘキサデカン（９９＋％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−β−シクロデキストリン．７ＨＣｌ（ａｍ７−βＣＤ、＞９９％、ＣＹＣＬＯＬＡＢ，ハンガリー、ブダペスト）；２’−デオキシグアノシン５’−一リン酸ナトリウム塩（９９％、Ａｃｒｏｓ）；２’−デオキシシトシン５’−一リン酸二ナトリウム塩（＞９５％、Ｆｌｕｋａ）；２’−デオキシチミジン５’−一リン酸二ナトリウム塩（＞９７％， Ｆｌｕｋａ）；２’−デオキシアデノシン５’−一リン酸二ナトリウム塩（＞９５％、Ｆｌｕｋａ）；ウリジン５’−一リン酸二ナトリウム塩（９９％、Ｆｌｕｋａ）；シトシン５’−一リン酸（遊離酸＞９８％、Ｆｌｕｋａ）；アデノシン５’−一リン酸（遊離酸９９％、Ａｃｒｏｓ）；グアノシン５’−一リン酸二ナトリウム塩（９７％、Ａｃｒｏｓ）；５−メチルシトシン（ＵＳＢ Ｅｕｒｏｐｅ），Ｔｒｉｚｍａ塩基（９９．９％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；濃塩酸（分析試薬等級、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；および塩化カリウム（９９％、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０１６９】
（１．２ 反応性シクロデキストリンの合成）
この作業に用いられるヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤおよびａｍＰＤＰ１−βＣＤの構造を図１に示す。ａｍ６−ａｍＰＤＰ１−βＣＤは以下のように合成した：ヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−β−シクロデキストリン．７ＨＣｌ（ａｍ７βＣＤ、６０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を脱イオン水（２．５ｍＬ）に溶解した。次に、これをエタノール（２．５ｍＬ）に溶解した３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＰＤＰ、３．１３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）に加えた。生成した溶液を室温で２４時間攪拌した。次に、溶媒を除去して生成物の混合物；未修飾シクロデキストリン（ａｍ７βＣＤ）、所望の一置換誘導体（ａｍ６−ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）および少量の多置換シクロデキストリン（例：ａｍ５−ａｍＰＤＰ２−βＣＤ）を得た。生成物混合物を直接、または逆相分取ＨＰＬＣにより精製した一置換生成物を電気生理学的実験に使用することができる。
【０１７０】
（１．３ 共有結合のためのアダプターの設計）
この作業において用いる親和性の高いアダプターａｍ７−βＣＤは、一次ヒドロキシル面上で、各糖環に１つずつ７つの１級アミンを含む。これらの荷電基の存在は、塩基検出において決定的であることが知られている（以下を参照）。塩基検出のための所望の化合物は、細孔と結合するための単一の反応部位を有し、且つ塩基検出にとって必要な一級アミンも含有しなければならない。
【０１７１】
この作業においては、二官能性架橋剤３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸サクシンイミジル（ＳＰＤＰ）を用いて、遺伝子操作によってα−ＨＬタンパク質細孔に導入したシステイン残基とａｍ７−βＣＤを結合させた。この架橋剤を、７つの１級アミンを含むシクロデキストリン分子（ａｍ７−βＣＤ）と反応させた。１つの架橋剤分子のみが単一のアミノシクロデキストリンと結合して、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤアダプターを合成する最終化学種の形成を促進するよう、各化学種の濃度を選択した。
【０１７２】
（１．４ α−ＨＬ変異体の構造）
ＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）およびＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）構造体は、ｐＴ７−ＳＣ１発現ベクターにおいて集合し（Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｍａｌｇｈａｎｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｈｏｂａｕｇｈ，Ｍ．，Ｇｏｕａｕｘ，Ｊ．Ｅ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，（１９９７），１０（１２），１４３３−１４４３）、且つα−ＨＬインサート全体のＤＮＡ配列決定によって確認された。変異体をコードする遺伝子は、他の文献に記載されているように、ＰＣＲ変異誘発およびライゲーションフリーｉｎ ｖｉｖｏ組み換えによって生成した（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｈ．（１９９５）ＰＣＲ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｉｎ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． Ｉｎ： Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃ．Ｗ．Ｄ．ａ．Ｇ．Ｓ．（ｅｄ）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＨｏｗｏｒｋａ，Ｓ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９８），２５（５），７６４−７６６，７６８，７７０の諸所）。
【０１７３】
（１．５ 共役ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳（ＩＶＴＴ））
タンパク質は、環状ＤＮＡのためのＥ．ｃｏｌｉ Ｔ７−Ｓ３０抽出系を用いることによる共役ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳（ＩＶＴＴ）によって生成した（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｎｏ．Ｌ１１３０）。キットに提供された、システインを除いた完全アミノ酸混合物（１ｍＭ）とメチオニンを除いた完全アミノ酸混合物（１ｍＭ）を等体積で混合し、高濃度のタンパク質を得るために必要とされる作業用アミノ酸溶液を得た。アミノ酸（５．０μＬ）をプレミックス溶液（２０μＬ）、［３５Ｓ］Ｌ−メチオニン（１μＬ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ｎｏ．５１００１Ｈ，１１７５Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＣｉ／ｍＬ），リファンピシン（１μＬ，０．８ｍｇ／ｍＬ），プラスミドＤＮＡ（８μＬ，４００ｎｇ／μＬ）およびＴ７ Ｓ３０抽出物（１５μＬ）（Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｍａｌｇｈａｎｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｈｏｂａｕｇｈ，Ｍ．，Ｇｏｕａｕｘ，Ｊ．Ｅ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，（１９９７），１０（１２），１４３３−１４４３）と混合した。３７℃で１．５時間合成を実施し、放射能標識ＩＶＴＴタンパク質５０μＬを生成した。
【０１７４】
（１．６ 電気生理学的分析のためのヘテロオリゴマーの生成）
上述のように、ＩＶＴＴによりタンパク質ＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ（１００μＬ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８（２５μＬ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を生成した。ＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の「Ｄ８テール」の負の荷電は、集合した細孔の電気泳動移動度を変化させてヘテロ７量体の分離を可能とすることが予測された。
【０１７５】
タンパク質サンプルを２５，０００ｇで１０分間遠心分離してＩＶＴＴ反応物の不溶性デブリを分離した。２つの上清をウサギ赤血球細胞膜（１０μＬ、２．５ｍｇタンパク質／ｍＬ）と混合し、ＤＴＴを添加して最終濃度を２ｍＭとし、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を２５，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＭＢＳＡ（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン含有）２００μＬに膜ペレットを再懸濁し、再度２５，０００ｇで１０分間遠心分離することにより洗浄した。上清を廃棄した後、膜ペレットを１×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液７５μＬに溶解した。
【０１７６】
サンプル全体を５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの単一ウェルに装填し、５０Ｖで約１８時間電気泳動した。次に、ゲルをＷｈａｔｍａｎ３ｍｍろ紙上で５０℃において約３時間真空乾燥し、さらにＸ線フィルムに２時間露光した。ＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８タンパク質の“Ｄ８テール”（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の負の荷電は、集合した細孔の電気泳動移動度を変化させてヘテロ７量体の分離を可能とする（Ｈｏｗｏｒｋａ，Ｓ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９８），２５（５），７６４−７６６，７６８，７７０の各所）。オートラジオグラムをテンプレートとして用い、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌｌ３５Ｃ−Ｄ８）１を含むオリゴマーバンドをゲルより切り取った。次に、２ｍＭ ＤＴＴを含有するＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３００μＬでゲルスライスを再水和した。Ｗｈａｔｍａｎ濾紙スライスを除去した後、滅菌乳棒でゲル片を粉砕した。オリゴマータンパク質を、０．２μｍ酢酸セルローススピンフィルター（カタログ番号７０１６−０２４、マイクロ遠心管、Ｒａｉｎｉｎ）を経て２５，０００ｇで３０分間遠心分離することにより、ゲルデブリより分離した。濾液を分取して−８０℃で保存した。
【０１７７】
（１．７ 単一チャネル記録）
学術文献ですでに公開されている標準的な方法を用いて、単一チャネル記録を得た。簡単に言うと、平面二重層チャンバーをｃｉｓおよびｔｒａｎｓの２つのコンパートメントに分割するテフロンフィルム（厚さ２５μｍ、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、ペンシルベニア州Ｍａｌｖｅｍ）における直径６０〜１５０μｍの開口部上に、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の二重層を形成した。両コンパートメントとも緩衝液１ｍＬを収容した。特に言及しない限り、ヘモリシン変異体およびｄＮＭＰ（またはｒＮＭＰ）の両者を、アースに接続したｃｉｓコンパートメントに添加した。ａｍ７−βＣＤまたはａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤを、増幅器のヘッドステージに接続したｔｒａｎｓコンパートメントに添加した。特に言及しない限り、ｄＮＭＰを用いた実験は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ８００ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．５において２２℃で実施した。ヌクレオチド保存液は、毎日用時分取した。
【０１７８】
（１．８ データの分析および取得）
単一チャネル記録は、パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ；Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）によって取得され、ビルトイン４極ベッセルフィルターにより１０ｋＨｚで低フィルタリングされ、さらに、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ Ａ／Ｄコンバーター（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を搭載しＣｌａｍｐＥｘ１０ソフトウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を実行するＰＣにより、２０ｋＨｚでサンプリングされた。
【０１７９】
以下の手順を用いてイベントヒストグラムを構築した：
１）生データに２つの隣接ＷＴポイントウィンドウを通過させた（サンプリングレート２０ｋＨｚ、１０ｋＨｚベッセルフィルタリング）。
２）ウィンドウ間のＴ−統計（２つの母集団の統計的な差の測定）を各時点で算出した。
３）所与の閾値ＴＴを上回るＴ−統計におけるＰＴ幅のピークを検出することによりステップを特定した。
４）ステップ間のデータを平均して平均電流およびイベント持続時間を算出した。
５）平均イベント電流のヒストグラムをプロットした。前のイベントの平均値が設定値ＬＣＤとＵＣＤの間にあり、且つ持続時間がＮデータポイントよりも大きい場合、１つのイベントは「限度内にある」と定義した。
【０１８０】
４−ヌクレオシド一リン酸ヒストグラムを生成するイベント検出のための典型的な数値は、ＷＴ＝８、ＰＴ＝３、Ｆｔ＝２０、ＴＴ＝８であり、ＬＣＤおよびＵＣＤがシクロデキストリンレベルの限度に対応していた。
【０１８１】
適切な初期パラメータで開始する反復平均、標準偏差および適切なピーク数についての振幅フィッティングにより、イベントヒストグラム上でマルチプルガウスフィッティングを実施した。
【０１８２】
ガウス分布の重なりは、２つの隣接するフィッティングピークの積をピーク面積の合計に対して正規化することにより算出した。重なりの範囲は０（重なりなし）から０．５（同一の分布）とした。始めに各ガウス分布をその面積で割ることにより、正規化した重なりを算出した。
【０１８３】
（２．結果）
（２．１ Ｎ１３９Ｑ位の重要性）
２つの異なる変異体を比較した。第１は、ＲＬ２バックグラウンドにおけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７変異体である。換言すれば、第１の変異体はＲＬ２構造体より出発して生成された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す７つのサブユニットを含有した。
【０１８４】
ＲＬ２は、膜貫通β−樽状構造をコードする配列のカセット変異導入を可能とするよう設計された、半合成遺伝子の生成物である（Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｌｕ，Ｘ．，Ｃｏｎｌａｎ，Ｓ．およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．８，１２５７−１２６７）。コード化されたポリペプチド配列に、６つのサイレント制限部位および５つの変換アミノ酸を含む（Ｋ８Ａ、Ｖ１２４Ｌ、Ｇ１３０Ｓ、Ｎ１３９ＱおよびＩ１４２Ｌ）。Ｄ８ＲＬ２は、オクタアスパラギン酸テールを有するＲＬ２である。Ｋ８Ａを例外として、すべての変化はタンパク質の挙動に対して有する影響を最小限とするためになされ、その例は；バリンからロイシンおよびアスパラギンからグルタミンへの変異（付加メチレン基の導入）、およびイソロイシンからロイシンへの変異（メチレン基の部位の変動）である。
【０１８５】
第２は、野生型ＨＬに基づくＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７変異体である。換言すれば、第２の変異体は野生型α−ＨＬ構造体より生成し、かつＲＬ２の５つの変異アミノ酸を含有しない。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す７つのサブユニットを含有した。
【０１８６】
２つの変異体より非常に異なる結果が得られた。両変異体で、ａｍ７−βＣＤを用いたアダプター結合イベントが認められ、またｄＮＭＰイベントが規則的に認められたが、ｄＮＭＰの結合は極めて異なっていた（図２および３）。
【０１８７】
２つの変異体の間の明らかな違いの１つは電流遮断の振幅であり；ＲＬ２による変異を用いると、ｄＮＭＰ結合が生成した場合の残留電流は２３〜３３ｐＡであり、また塩基の分布は４つのすべての塩基を識別するのに十分である。しかし、野生型変異体においては、残留電流の振幅は４５〜５０ｐＡであり、またヒストグラムに特性が認められるにもかかわらず、ｄＮＭＰ識別は不良であった。
【０１８８】
野生型ベースのＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７変異体とＲＬ２ベースのＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７の間のバックグラウンドの差は、ＲＬ２バックグラウンドに存在する追加的な変異によると考えられた。これらの変異のうち、Ｎ１３９Ｑは２つの変異体の間の差を引き起こす可能性が最も高いと思われた。Ｋ８Ａ残基はタンパク質のｃａｐ領域に位置し、ｄＮＭＰ認識に干渉する可能性は低いが、Ｖ１２７Ｌ、Ｉ１４２ＬおよびＧ１３０Ｓ変異はβ−樽状構造の外面にあり、ほとんど影響がないと考えられる（図４）。
【０１８９】
塩基結合に対するＮ１３９Ｑ変異の影響を検討するため、野生型バックグラウンドに、ｄＮＭＰ検出に必要なアルギニンと共に当該変異を組み入れ、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）７タンパク質を得た。このタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示された７つのサブユニットを含有した。同様の条件の下で、上に論じたＲＬ２ベースの構造体と比較した（図５）。
【０１９０】
このデータより、Ｎ１３９Ｑ変異は、これまで認識されていなかった効果である塩基検出にとって必要であることが明確である。
【０１９１】
（２．２ 提唱されたａｍ７−βＣＤの配置）
我々は、シクロデキストリンが１３９位近傍のβ−樽状構造内の低い位置にあり、グルタミン基によって安定化されていると仮定した（図６）。Ｎ１３９Ｑ変異の重要性を認識することは、塩基識別の機構を理解し、且つ向上され且つ連続的な塩基検出を目的として改善された構造体を設計するための鍵である。
【０１９２】
この仮説を検証するために、一連の変異体を設計および生成し、β−樽状構造内の広い位置範囲で反応性ａｍ７−βＣＤと結合させた。一方が反応性システインを有しもう一方がシステイン基を欠く、異なる２種類の単量体ユニットを生成することにより、ヘテロ７量体が形成された。単量体を混合し、オリゴマー化して７量体タンパク質細孔とした。次に、これらを化学量論により分離して、あらゆる７量体タンパク質細孔にただ１つのシステイン修飾単量体ユニットが存在することを確実にし、結合部位の正確な制御が可能となるようにした。
【０１９３】
２セットの変異体を設計した；一方は結合したアダプターがβ−樽状構造の上部付近に配置されるよう設定する一方で、第２のセットはＮ１３９Ｑ位の近傍にアダプターが配置されるよう設計された（以下の表２および図７）。
【０１９４】
【表２】
【０１９５】
一部の変異体はＭ１１３ＲまたはＮ１３９Ｑ変異を有する６つの単量体のみを含むが、挙動の差は最小であると予想されることに留意すべきである。
【０１９６】
（２．３ ａｍ７−βＣＤの共有結合）
反応性ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤは、幅広い実験条件の下で多数の変異体と良好に結合した。反応は、印加電位の極性または強度を変化させても除去することのできない、残留細孔電流の恒久的な低下によって特徴付けられる（図８）。この反応の更なる検証は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の付加を経てアダプターをタンパク質細孔と結合させるジスルフィド結合を低下させることである。
【０１９７】
反応の前に多数の異なるシクロデキストリン状態が認められることは共通しているが、一旦反応したならば、電流レベルは比較的一定した値に留まることに留意しなければならない。さらに、共有結合したシクロデキストリンのレベルは、未反応シクロデキストリンレベルに対してしばしば異なる強度を示す。
【０１９８】
（２．４ 高い位置での結合−残基１１５から１２１）
シクロデキストリンの位置がβ−樽状構造の上部付近となるのを促進するために、シクロデキストリンについては高い位置での結合を選択した。選択したすべての位置はアミノ末端により近く、側鎖はβ−樽状構造の内部を指向する（奇数番の残基）。修飾シクロデキストリン上の架橋剤の設計は、シクロデキストリン上部が、結合部位からほぼ４アミノ酸離れた位置となることを意味している。したがって、１１７位結合は１１３位にあるシクロデキストリンの上部に対応する。
【０１９９】
（１１５位）
このガイドを用いた場合、特にシクロデキストリンの一級アミンと反発するであろうと予測されるアルギニン基がＭ１１３Ｒ変異体に存在する場合、反応したシクロデキストリンが１１３位近傍で安定に位置するには、１１５位はβ−樽状構造の上部の高い位置にありすぎると予想された。しかし、このタンパク質はａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応した。
【０２００】
α−ＨＬの１１５位で反応が達成されたものの、ヌクレオチド塩基を添加する前であっても、ベースラインはノイズが多く且つ大きな電流の変動を示した。これは、β−樽状構造内のシクロデキストリンの動き、または溶液中に存在する他の化学種の結合による可能性があったが、しかしながら、ヌクレオチドの添加はこの構造体からのシグナルに影響しなかった。
【０２０１】
（１１７位）
シクロデキストリンを１１７位に結合することにより、シクロデキストリンは１１３位近傍に配置されるはずである。この構造体のチャートの例を以下に認めることが（図９）。ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｔ１１７Ｃ−Ｄ８）１変異体はａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したが、ベースラインはＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｔ１１５Ｃ−Ｄ８）１変異体と非常に類似していた。ヌクレオチドの添加は、細孔シグナルに認識できる変化をまったく引き起こさなかった。１１７位での結合により引き起こされる良好でない挙動は、荷電したアダプターと反発する、正に荷電したアルギニンと相互作用するシクロデキストリンの結果と思われる。塩基感知のために必要なアルギニンはシクロデキストリンに近すぎると思われ、且つシクロデキストリンが安定した位置を獲得することを妨げる可能性もあった。
【０２０２】
（１１９位）
システインの位置をβ−樽状構造のさらに下部に移行して１１９位とした場合、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤとの反応は１１５または１１７位のいずれよりも明確なベースラインを示した。しかし、電流にはいまだに多少の変動があり、ベースラインのスパイクとして現れた（図１０）。
【０２０３】
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ構造体にヌクレオチドを添加したところ、ナノ細孔電流は、連続的なヌクレオチド結合イベントを明確に示しながら変調された（図１０）。ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８）１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すサブユニット１個を含有していた。
【０２０４】
追加的なイベントはなおベースラインに存在し、且つシグナルを複雑化したが（図１０）、ヌクレオチドイベントは、残留細孔電流の変動を引き起こすヌクレオチドの検出によって容易に識別することが可能であった。これらのイベントは、後でヒストグラムとしてプロットし、塩基識別を示すことができる（図１２）。
【０２０５】
（１２１位）
この変異体群からの最も有望なシステイン部位は、残基１２１位であった。特に、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰｌ−βＣＤ構造体である。この構造体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すサブユニット１個を含有していた。反応した細孔のベースラインは、過去に試験した変異体よりも小さな変動を示し、且つ明らかな塩基結合を示した（図１１）。
【０２０６】
１２１位にシステインを有する構造体は、１１９位にシステインを有する対応する変異体よりも、優れた分解能を有する塩基識別を示した。これは、各変異体についての残留細孔電流のヒストグラムに容易に認められる（図１２）。
【０２０７】
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８）１変異体は、修飾シクロデキストリンと反応して、連続的な塩基検出および若干の塩基間識別を示すことができるものの、残留電流間の重なりはこの手法による配列決定を困難にするであろう。
【０２０８】
（２．５ 低い位置での結合−残基）
塩基分解能は、システインの位置がβ−樽状構造の下方に移動するにつれて上昇するので、塩基識別をさらに改善することが可能か確認するために、より低いシステイン位置を検討した。
【０２０９】
システインの位置を１２３、１２５、１３３、１３５および１３７残基に移動した；これらの変異体を選択して、アダプターをＮ１３９Ｑ変異体にできるだけ近く配置した。シクロデキストリン架橋剤の長さの検討により、シクロデキストリンの上端（二級ヒドロキシル面）とチオール基の距離は９．２Åであることが示される。β−樽状構造内で多様な位置にあるアミノ酸架橋剤と１３９位にあるグルタミン環の距離を表３に示す。
【０２１０】
【表３】
【０２１１】
これらの測定値より、修飾シクロデキストリンの結合に最も適したシステインの位置は、Ｎ１３９Ｑ位からの距離が９．１ÅであるＬ１３５Ｃ残基であることが明らかである。この数値は、細孔とアダプターとの水素結合を最大化し、かつそれにより構造体を安定化させる必要のある、シクロデキストリンの水素結合とチオール結合部位の距離（９．２Å）とよく適合する。
【０２１２】
この仮説を検証するために生成された変異体を表４に示す。
【０２１３】
【表４】
【０２１４】
（１２５位および１３３位）
β−樽状構造底部の１２５位および１３３位にシステインを有する変異体については、修飾シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）との反応を観察することは不可能であった。これは、反応を可能とするためには不適切な方向を指向するシステイン基によると思われ、代替的には、シクロデキストリンは反応しうるものの、シクロデキストリンはβ−樽状構造内に入らず、且つそれゆえ細孔を経たコンダクタンスの測定によって観察されなかった。
【０２１５】
（１３５位および１３７位）
１２３位および１３７位を、シクロデキストリントンの結合およびｄＮＭＰの検出について検討した。これらの位置はＮ１３９Ｑ変異に近く、且つ１２１位における結合と同様の挙動を示すと予想された。いずれの位置も、ａｍ６ａｍＰＤＰｌ−βＣＤと良好に反応して安定したベースラインをもたらし、且つｄＮＭＰを添加すると塩基結合を示した。塩基検出は良好であったが、これらのシステイン位置のどちらについても、幅広い条件下での全４塩基間の識別は不可能であった。ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２３Ｃ−Ｄ８）１変異体のチャートの例を下に（図１３）、ｄＮＭＰが結合した際の残留電流のヒストグラム（図１４）と共に確認することができる。
【０２１６】
（１３５位）
分子モデリングを用いて算出した距離は、塩基識別にとって最良の結合位置はＬ１３５Ｃでなければならないことを示した。先の変異体と同じ条件を用いて、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌｌ３５Ｃ−Ｄ８）１変異体においてこの位置を検討した。この変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すサブユニット６個、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すサブユニット１個を含有していた。
【０２１７】
システインは修飾シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）と良好に反応して、安定したベースラインをもたらした。ヌクレオチド（ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ）の添加時、追加的な結合イベントが認められた。これらのピークの振幅は、残留細孔電流のヒストグラムをプロットした場合（図１６）に明瞭となる異なる母集団を示した（図１５）。
【０２１８】
修飾シクロデキストリンがＬ１３５Ｃ位に結合した場合の塩基分解能は、β−樽状構造における他のいずれの位置よりも明らかに優れており、且つ４つのヌクレオチドすべてのほぼ完全な分離を示し、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定のための優れた候補となった。
【０２１９】
したがって、この構造体は更なる研究のためのベースライン変異体として選択された。次の数節では、塩基識別に対する物理的パラメータの影響、塩および温度の制約、構造体が異なる化学種を同定する能力およびベースライン構造体の機械論的評価を扱う。
【０２２０】
（２．６ Ｌ１３５Ｃ位における塩基結合）
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌｌ３５Ｃ−Ｄ８）１変異体をベースラインと定義し、４つのピークのそれぞれを同定する実験を実施した。これは、溶液中の単一のヌクレオシド一リン酸化学種、またはヌクレオシド一リン酸対のいずれかを用いて実験を実行することによって遂行された（データは示さず）。これらの試験によりピークを同定した。それらは、最大の遮断（またそれゆえ最小の残留電流）を示すヌクレオチドがｄＧＭＰであり、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰがこれに続き、ｄＣＭＰは最小の電流遮断（またそれゆえ最大の残留電流）を引き起こすことも示した。８００ ｍＭ ＫＣｌ中の１６０ ｍＶにおいては、ｄＮＭＰが結合した場合の残留電流はおおよそ：３０ｐＡ（ｄＧＭＰ）、３３ｐＡ（ｄＴＭＰ）、３６ｐＡ（ｄＡＭＰ）および４４ｐＡ（ｄＣＭＰ）であった。
【０２２１】
観察された電流の振幅は、印加された電位についてほぼ線形で比例するものの、４つの塩基の互いに対する位置は比例しない。これは、印加された電位範囲における残留電流ヒストグラムを検討することにより認められる（図１７）。
【０２２２】
このデータより、より低い電位（１００ｍＶ）においては、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰが良好な分離を示したものの、ｄＡＭＰとｄＣＭＰのピークは重なり、一方より高い電位（１７０ｍＶ）においては、今度はｄＧＭＰとｄＴＭＰのピークが重なる一方で、ｄＡＭＰとｄＣＭＰピークは優れた分離を示すことが示される。したがって印加された電位は、分離を促進するために利用することのできる優れたピークの重なりの制御を提供する。このデータは、図１８にも要約する。
【０２２３】
残留電流分布の重なりを算出するために、残留電流ヒストグラムに認められる各個別のｄＮＭＰピークを、単一のガウス分布にフィッティングした。次に、単一塩基を検出する確率が等しくなるようガウス分布を正規化し、さらに正規化したガウス分布の重なりの面積より、隣接する各塩基環の重なりの割合を算出した（図１９）。
【０２２４】
異なる電位におけるピークの重なりの間には変動があるものの、変動は小さく、それゆえ、この構造体は幅広い操作条件において塩基識別のために用いることが可能であった。
【０２２５】
このプロットの１つの特徴は、ｄＴＭＰピークの鋭さである。ｄＴＭＰ結合は、構造体中でより長い結合時間（滞留時間）を有する点で、他の４つの塩基と異なっている。これは、あるイベントの持続時間を、修飾した細孔を通る残留電流の平均に対してプロットすることによって、容易に認めることができる（図２０）。
【０２２６】
平均すると、ｄＴＭＰの滞留時間が長いほど、各結合イベントについて収集されるデータポイントの数が多くなる。データポイントの平均より残留細孔電流の精度を算出するので、あるイベントのデータポイントが多ければ平均値はより正確となり、且つそれゆえ残留電流ヒストグラムにおけるイベントの分布はより小さくなる。ｄＮＭＰの読み違いの確率が低下するので、配列決定用途のためには長い結合時間が望ましい。
【０２２７】
（２．７ 低塩濃度操作条件）
上に提示した全てのデータは比較的高い塩濃度で取得しており、溶液コンダクタンスが高ければ信号雑音比が高まり、細孔変動のバックグラウンドに対するシグナルを容易に特定することができるので、これは望ましい。しかし、配列決定の用途のためには、ｄＮＭＰがＤＮＡより遊離するよう、酵素機能にとって好ましい条件下で塩基検出を操作しなければならない。
【０２２８】
一連の塩条件を検討し、酵素操作条件に有利となるようなヌクレオチド検出および識別の下限を確認した。最初の検討は５００ｍＭに焦点を合わせたが、このＫＣｌ濃度においては、８００ｍＭ ＫＣｌでの測定と比較して塩基分離にはほとんど差が見られなかった（データは示さず）。さらに、４００ｍＭ ＫＣｌで実施した試験により、４つのｄＮＭＰ塩基は電流状態の重なりがほとんど増加することなく、容易に分解することが可能であったものの、塩の減少は４つのピークの相対的位置に影響し、また最良のピーク分離を得るためにわずかに高い印加電位を必要とした（図２１）。
【０２２９】
低塩濃度における実験のための良好なベースラインを達成し、塩濃度をさらに３００および３５０ｍＭに低下させた。３５０ｍＭでの試験では比較的良好な塩基識別が示され、且つ４つのピークを識別することが可能であったものの、信号雑音比は低く、またシクロデキストリンレベル付近（ｄＣＭＰ結合）でピークがヌクレオチドイベントを選択することは困難であった（図２２）。
【０２３０】
残留電流ヒストグラムにおいて４つのピークが容易に分離可能であることから、各ピークをガウス分布および算出した重なりとフィッティングした（図２３）。ピークの重なりは４００ｍＭ ＫＣｌよりもわずかに高く、ｄＴＭＰとｄＡＭＰの間に面積の２０％の重なりを示したものの、他のヌクレオチドの分離は良好であった。
【０２３１】
塩濃度をさらに３００ｍＭ ＫＣｌに低下させ、同じ濃度で測定した。塩基検出は達成されたものの、ｄＮＭＰ間の識別は不良であった。
【０２３２】
異なったパラメータを用いてデータを分析したが、塩基分離を改善することは不可能であった。塩の減少によって伝導率が低下し、且つそれゆえ塩の検出が困難になったものの、ピークの位置および３００ｍＭと３５０ｍＭの間のスペクトラムの大きな違いより、塩の変化が塩基結合のメカニズムに影響した可能性が示唆される。
【０２３３】
コンダクタンスを高める方法の１つは、溶液の温度を高めることである。これにより、温度が生理学的条件に近い場合に酵素活性が高まるという利点が付け加えられている。温度による溶液のコンダクタンスの変化の量について、３００ｍＭ溶液の温度上昇にしたがって、単一のＨＬ−（Ｍｌ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体を通る電流を測定した（図２４）。
【０２３４】
溶液の温度を２５から４０℃に上昇させると、細孔コンダクタンスが６２．５ｐＡから９１．５ｐＡに変化した（細孔コンダクタンスが４６％上昇）。３００ｍＭ ＫＣｌにおける塩基検出実験を繰り返し、塩基識別に対する温度の影響を検討した（図２５）。
【０２３５】
４０℃と室温の間の残留電流ヒストグラムの明確な差は、分布幅の広さである。この効果は、高温におけるヌクレオチドの滞留時間の低下に帰すことができる（４０℃では平均滞留時間が２ｍ秒であるのに対し、室温では９．４ｍ秒）。単一結合イベントの平均電流レベルの算出精度はデータポイント数と関連するので、電流レベルの分布は滞留時間が短くなると共に大きくなる。さらに、滞留時間が低下するにしたがい、短すぎて観察できないヌクレオチド結合イベントの数が増加し、同じ数のイベントを捕捉するためにより迅速なデータ取得速度が必要とされる。
【０２３６】
要約すると、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ構造体は幅広い操作条件を示し、その一部はエキソヌクレアーゼのようなＤＮＡ処理酵素に適している。塩濃度は、室温において良好な塩識別を示しながら３５０ｍＭまで低下させることができ、且つ温度を高めた場合、または非対称的塩条件を用いた場合、より低い塩濃度を用いることができる。
【０２３７】
（２．８ メチル−ｄＣＭＰの検出）
上に論じた４つのヌクレオチドに付け加えて、塩基対形成性に影響しないＤＮＡ構造の化学変化体である５−メチルシトシン（メチルｄ−ＣＭＰ）に対して、科学界の関心が増大している（図２６）。
【０２３８】
メチル−ｄＣＭＰの存在は、非メチル化シトシンの自然発生的脱アミン化によってウラシルが生成され、これはＤＮＡ修復酵素によって認識および除去されるが、ｄＣＭＰがメチル化されると脱アミノ化によってチミンが生成するので、エピジェネティクスにとって重要である。ＣからＴへのこの変換によって対突然変異が生じることがあるため、遺伝病を理解するためには非常に重要である。
【０２３９】
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ構造体を用いて、この技術によってメチル−ｄＣＭＰを検出することが可能か確認した。始めに、メチル−ｄＣＭＰを内部較正物質としてｄＧＭＰを含有する溶液に添加した（図２７）。一方が既知のｄＧＭＰ分布に対応し、もう一方がメチル−ｄＣＭＰの結合に由来する異なる２つの母集団が認められる。
【０２４０】
我々のベースライン構造体がメチル−ｄＣＭＰを検出することができることが証明され、且つこの化学種のピーク位置が確認されているので、５つのヌクレオシド一リン酸（ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰおよびメチル−ｄＣＭＰ）を全て含む溶液を試験し、物理的な条件を最適化した。８００ｍＭ ＫＣｌにおいて、最も低い塩基の重なりを達成するのに最適な電位は１７０ｍＶであることが確認された。次に、これを４つの標準的ヌクレオチドを含有する測定（メチル−ｄＣＭＰが存在しない）と比較した（図２８）。
【０２４１】
各イベントの持続時間を残留細孔電流に対してプロットし、標準的な４つの塩基と比較したメチル−ｄＣＭＰの結合親和性を示した（図２９）。それによりメチル−ｄＣＭＰの滞留時間がより長く、ｄＣＭＰよりもｄＴＭＰに近いことが示された。このことは、ｄＴＭＰおよびメチル−ｄＣＭＰの両者に存在するメチル基（図２６）が、シクロデキストリンとの長時間の結合に重要であることを示唆している。
【０２４２】
５つのヌクレオシド一リン酸ピークを全てガウス分布にフィッティングし、重なり面積の割合を算出した（図３３）。全４個の塩基の検出についてのガウス分布の重なりは良好であったが、メチル−ｄＣＭＰとｄＡＭＰの間には比較的大きな重なりが認められた。ここでも、各塩基の相対位置は、印加電位の強度を変化させることによって制御することが可能であった（図３０）。
【０２４３】
メチル−ｄＣＭＰを検出する能力は幅広い用途にとって重要であるが、従来の技術で達成することは非常に困難である。この理由の１つは、現行の戦略の多くがＰＣＲまたは他の一般的技術によってＤＮＡ濃度を増幅することに依拠していることである。ＤＮＡを増幅する際、メチル−ｄＣＭＰは全てｄＣＭＰに変換され、且つそれゆえ情報が失われる。他の多くの技術と異なり、ナノ細孔感知は単分子システムであり、且つそれゆえＤＮＡを増幅することなく用いられる可能性があることから、エピジェネティクス情報を抽出するための完璧な候補となる。
【０２４４】
（２．９ ＲＮＡ塩基検出）
ベースライン構造体について示されたデータは、現在のところＤＮＡの構成単位であるｄＮＭＰ塩基に焦点を置いているものの、このシステムは他のヌクレオチド、具体的にはＲＮＡに認められるリボース塩基を検討する能力を有する。これらの塩基は２つの点で対応するｄＮＭＰと異なる；糖単位はさらなる水酸基を有し且つチミン塩基がウラシルに置換されている（ウラシルはチミンの非メチル化体）（図３１）。
【０２４５】
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ構造体を用いて、４つの主要なＲＮＡ塩基であるアデンソシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）およびシチジン一リン酸（ＣＭＰ）を試験し、これらの化学種が互いに識別されるか検討した。始めに選択した条件は、ｄＮＭＰ塩基にとって最適の条件（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）であった。これらの結果を残留電流ヒストグラムにプロットした（図３２）。
【０２４６】
ＲＮＡ塩基検出についての予備的な結果は良好であり；これらの塩基について特に最適化しなくとも、変動のないヒストグラムは３つの明確な分布を示す。これらのピークの本性はまだ確認されていないものの、順序はこれらの条件下におけるｄＮＭＰ塩基と類似しており、ＧＭＰが最も大きな細孔遮断を示し（３０ｐＡ残留電流）、ＡＭＰ（３４ｐＡ残留電流）がこれに続き、最小の遮断はＣＭＰ（３８ｐＡ残留電流）より生じた可能性が高いとみられる。ウリジン一リン酸の化学構造はシチジン一リン酸のそれと酷似しており、且つ同様のレベルの細孔遮断を引き起こすことが可能であったと思われる。
【０２４７】
（２．１０ ヘテロ７量体対ホモ７量体）
これらの実験を実施する上での制限因子の１つは、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤが反応に要する時間の長さであり、タンパク質細孔の一部はシクロデキストリンとまったく反応しない。これについての説明の１つは、タンパク質へテロ７量体上の単一システイン残基が不純物と反応したか、または酸化したというものである。一旦これが起こると、この官能基の活性を回復することは難しい。
【０２４８】
これに対する解決策の１つは、細孔中のシステイン残基数を増加させることである。これは、７量体中の修飾単量体の数を最大全７個までに変更することによって実施される。７量体中の７個の単量体全てが同一である場合、タンパク質はホモ７量体と呼ばれる（表５）。
【０２４９】
【表５】
【０２５０】
ホモ７量体をａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応させ、対応するヘテロ７量体と比較した（図３３）。全般的に、ホモ７量体細孔は対応するヘテロ７量体よりも大きな変動性を示した。これらの構造体の大半が修飾シクロデキストリンと反応したものの、ホモ７量体はベースライン変動の増加を被り、ベースラインの「ノイズ」に対して良好な塩基識別を得ることは困難であった。
【０２５１】
これについて可能な説明の１つは、他の６つの無反応システインの化学的状態である。これらの基のそれぞれは、数多くの異なる酸化状態にある可能性がある。システイン基は酸化されると以下の形態をとることができる：スルフェン酸（Ｒ−ＳＯＨ）、スルフィン酸（Ｒ−ＳＯ２−）、またはスルフォン酸（Ｒ−ＳＯ３２−）。より高い酸化状態はまれであるものの、このような化学種の形成は、修飾シクロデキストリンの一級アミンなどの隣接する正に荷電した基によって触媒することができる。酸化されると、システインはシクロデキストリンの正に荷電した基と相互作用して、観察される細孔電流に影響する可能性がある。
【０２５２】
（２．１１ バイオセンサーの機械論的評価）
ベースライン構造体をよりよく理解するために、一連の変異体を生成し、アダプターがＬ１３５残基に結合した場合の個別のタンパク質構成単位をそれぞれ試験した（表６）。一連のタンパク質は１１３残基にアルギニンを欠く変異体、１３９残基にグルタミンを欠く変異体を含有した。さらに、細孔と反応することができるがａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ化合物の一級アミンを欠く化学修飾アダプターを用いて、ベースライン変異体を試験した。
【０２５３】
【表６】
【０２５４】
初めに検討した修飾はシクロデキストリンの一級アミン基であって、その６つのアミンがｐＨ７．５で部分的にプロトン化され、且つｄＮＭＦの負のリン酸基と総合作用しうるアミン基であった。アミノシクロデキストリンは他の利点も有し、正電位における滞留時間を通常の（ヒドロキシル）β−シクロデキストリンと比較して１０００倍に増大することができる。この滞留時間の増加は、アダプターの共有結合にとっては有用であるが、必要ではない。
【０２５５】
ベースライン変異型細孔を最適条件下で（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ）試験し、一方の測定ではＰＤＰ１−βＣＤを用い（図３４）、もう一方の測定では標準的なａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤシクロデキストリン（図３５）を用いた。
【０２５６】
ｄＮＭＰの高分解能検出のためには、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤアダプターの一級アミン基が必要であることは明らかである。アミノシクロデキストリン（６８ｐＡ）とヒドロキシルシクロデキストリン（３０ｐＡ）の間の大きなコンダクタンスの変化より、反応したシクロデキストリン化合物の安定化に一級アミンが１つの役割を果たすことが証明される。荷電したアミン基が、結合時に塩基と直接相互作用することができる可能性もあるとみられる。
【０２５７】
次に試験した構造体は、１１３残基のアルギニンと１３９残基のグルタミンを共に欠いていたが、なおＬ１３５Ｃ位のシクロデキストリン結合部位を維持していた。この変異体は、本質的に単一のシステインを有する野生型タンパク質であった。アミノシクロデキストリンを用いたところ良好に反応したものの、ヌクレオチドを添加する前でも反応レベルはベースライン構造体よりも大きな変動を示した。標準的な４つのヌクレオシド一リン酸を全て添加したところ、若干の結合イベントが認められたものの、これらは頻度が低く且つ塩基間の識別は不可能であった（図３６）。
【０２５８】
それにより、正確な塩基識別のためにはアルギニン、グルタミン、または両変異が必要であることが示される。これを判定するために、Ｎ１３９Ｑ変異を欠くベースライン変異体の変種を試験した。この変異体は野生型細孔と類似しているが、β−樽状構造体にアルギニン環、およびＬ１３５Ｃ位にシクロデキストリンの結合のための単一システインを有していた。正に荷電したアルギニンは負に荷電したｄＮＭＰと相互作用すると予測されるが、アミノシクロデキストリン上の電荷にも影響し、さらにベースラインシグナルに影響しうる。
【０２５９】
反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体は、アミノシクロデキストリンとの反応後にＨＬ−（ｗｔ）６（Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体よりも明瞭なベースラインを示した。ヌクレオチドの添加により観察すべき結合イベントが発生し、且つベースラインにおける追加的なスパイクも認められた。結合は野生型類似体よりも頻繁であり、アルギニンがヌクレオチドと反応しうることが示唆された。ヌクレオチド結合イベントの残留電流は変動し、且つ残留電流ヒストグラムにプロットした場合の塩基間の識別は不良であった（図３７）。
【０２６０】
この理由の１つは、結合したシクロデキストリンの安定性であり、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体は、シクロデキストリンの二次ヒドロキシル面と水素結合し、かつ構造体を安定化することができる１３９位のグルタミンを欠く。このデータは、ヌクレオチド間の高分解能分離を達成するためにシクロデキストリンが安定化されなければならないことを示し、このことはグルタミンまたはアスパラギンなどの水素結合残基によって達成することができる。
【０２６１】
次に試験すべきタンパク質は、ベースライン構造体と類似しているが狭窄点にアルギニンを欠くＨＬ−（Ｎ１３９Ｑ）６（Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体であった。この変異体は、水素結合相互作用により結合したアミノシクロデキストリンを安定化させることができるはずであるが、荷電したアルギニンがないため塩基を捕捉できないと思われた。
【０２６２】
ＨＬ−（Ｎ１３９Ｑ）６（Ｎ１３９Ｑ／Ｌｌ３５Ｃ−Ｄ８）１変異体はシクロデキストリンと反応し、且つ非常に変化の少ないベースラインをもたらした。塩基を添加する際に、生チャート上で異なる振幅を伴う結合イベントを視覚的に確認することが可能であった。残留細孔電流のヒストグラムは、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１ベースライン変異体とほぼ同一である、４つの異なるピークを示した（図３８）。
【０２６３】
このことは、アルギニンはベースライン構造体で認められた４つの塩基の識別をもたらすために必要でないことを証明する。しかし、それらはやはり細孔の性能に影響しうる。構造体の成功には数多くの追加的な因子が関与しており；これらはヌクレオチドの検出率およびナノ細孔と結合したアダプターの収率を含む。
【０２６４】
アルギニン基はｄＮＭＰ塩基の結合部位への誘因を促進することもあり、且つヌクレオチドの捕捉率を高める可能性があり、これは配列決定用途にとって望ましい。しかし、アルギニン側鎖はタンパク質中に認められるアミノ酸の中でより嵩高いものの１つであり、立体的相互作用によって捕捉率を制限する可能性がある（検討中）。
【０２６５】
アルギニン基がシクロデキストリンの良好な反応の促進に関与している可能性もある。非共有結合アダプターデータに認められるように、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）７変異体は、塩基検出のためにシクロデキストリンをＮ１３９Ｑ残基近傍に配置し、アルギニンが除去された場合には見られない効果である（データは示さず）。Ｌ１３５Ｃ残基にある反応部位はＮ１３９Ｑに近いので、アルギニンはシクロデキストリンの反応を補助すると思われる。シクロデキストリンは、頻度は高くないものの、Ｌ１３５Ｃ位で反応するが、ｄＮＭＰを検出することのできない雑音の多いベースラインを示すことがある。このことを、変異によって影響されることのある、細孔におけるシクロデキストリンの配向と関連付けることも可能である。
【０２６６】
【表７】
【０２６７】
【表８】
【０２６８】
【表９】
【０２６９】
【表１０】
【０２７０】
【表１１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、確率的感知により１つまたはそれ以上のヌクレオチドを検出するために有用である、変異型α−ヘモリシン（α−ＨＬ）細孔に関する。細孔は、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定にとって特に有用である。ヌクレオチドの検出を可能とする分子アダプターは、細孔と共有結合する。細孔は特異的に修飾されてアダプターの配置を促進し、且つ共有結合を促進することもある。
【背景技術】
【０００２】
確率的検出は、ヌクレオチド分子とレセプターの間の個別の結合イベントの観察に依拠する感知の手法である。確率的センサーは、ナノメーターサイズの単一細孔を絶縁膜に配置し、ヌクレオチド分子の存在下での細孔を経た電圧駆動イオン輸送を測定することによって創成することができる。電流の変動が発生する頻度によって、細孔内で結合するヌクレオチドの濃度が判明する。ヌクレオチドの本性は、その特徴的な電流シグネチャ、特に電流遮断の持続時間および程度によって判明する（Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｓｏｎｇ．Ｌ．，Ｇｏｕａｕｘ．Ｊ．Ｅ．およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４，４９７−５０５；およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，およびＣｒｅｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３，２２＆２３０）。
【０００３】
毒素α−ヘモリシン（α−ＨＬ）を形成する改変細菌細孔変種は、多種類の分子の確率的感知に用いられている（Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．，およびＣｒｅｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３，２２２−２３０；Ｓｈｉｎ，Ｓ．−Ｈ．，Ｌｕｃｈｉａｎ，Ｔ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１，３７０７−３７０９；およびＧｕａｎ，Ｘ．，Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（２００５）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ６，１８７５−１８８１）。これらの研究の過程で、α−ＨＬを操作して小さな有機ヌクレオチドと直接結合させる試みは困難となりうることが立証され、成功例はまれであることが確認された（Ｇｕａｎ，Ｘ．，Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（２００５）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ６，１８７５−１８８１）。幸いなことに、非共有結合的に結合する分子アダプター、特にシクロデキストリン（Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｃｏｎｌａｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８，６８６−６９０）、またさらに環状ペプチド（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｑｕｅｓａｄａ，Ｌ，Ｇｈａｄｉｒｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．，およびＢｒａｈａ，Ｏ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，１１７５８−１１７６６）およびキューカビチュリル（Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｗｅｂｂ，Ｊ．，Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ．，Ｋｉｍ，Ｋ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（２００５）ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ ６，８８９−８９２）を利用した異なる戦略が発見された。シクロデキストリンは一時的にα−ＨＬ細孔内に滞留し、相当大きいが不完全なチャネル遮断を引き起こす。シクロデキストリンの疎水性の内部で結合する有機ヌクレオチドは、この遮断を増強してヌクレオチドの検出を可能とする（Ｇｕ，Ｌ．−Ｑ，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｃｏｎｌａｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８，６８６−６９０）。
【０００４】
現在、広い用途範囲にまたがって、迅速且つ安価なＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定技術に対するニーズがある。既存の技術は、主として大量の核酸を生成する増幅技術に依拠し且つシグナルの検出に高品質の特殊な蛍光薬品を必要とすることから、緩速且つ高価である。確率的感知は、必要なヌクレオチドおよび試薬の量を減らすことにより迅速且つ安価なＤＮＡ配列決定をもたらす可能性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明者らは、驚くべきことに、１３９残基またはその近傍に配置されるようにその樽状構造またはチャネルの下部と共有結合する分子アダプターを有する変異型α−ＨＬ細孔が、ヌクレオチドを検出および識別することができることを証明している。特に発明者らは、１３９残基またはその近傍に配置されるように共有結合する分子アダプターを有する変異型α−ＨＬ細孔が、異なるヌクレオチドを識別することができることを示している。この細孔は感度が高く、且つそれゆえＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の配列決定に用いることができる。
【０００６】
また発明者らは、驚くべきことに、１３９残基またはその近傍に配置されるよう共有結合した分子アダプターを有する変異型α−ＨＬ細孔が、幅広い異なる条件の下で異なるヌクレオチドを識別することができることも証明している。特に、細孔はその機能が核酸の配列決定にとって必要である酵素にとって好ましい条件下でヌクレオチドを識別することができるであろう。
【０００７】
また発明者らは、驚くべきことに、１３９残基におけるおよび／またはその近傍における変異型α−ＨＬ細孔の修飾がアダプターの配置および異なるヌクレオチドの検出および識別にとって不可欠であることも示している。
【０００８】
本発明の細孔は確率的感知、特にヌクレオチドの検出またはＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の配列決定にとって有用な手段である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって本発明は、サンプル中の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの検出に用いることを目的とした変異型α−ＨＬ細孔であって：
（ａ）それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を含む７つのサブユニット、および
（ｂ）細孔とヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを含み、
７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍において修飾されてアダプターの配置を促進し、且つ
分子アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置されるよう１つまたはそれ以上のサブユニットと共有結合する変異型α−ＨＬ細孔を提供する。
【００１０】
また本発明は、
−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列であって、サブユニットがＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１１９，１２１または１３５位にシステインを有するヌクレオチド配列；
−それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードする７つのポリヌクレオチドであって、サブユニットの少なくとも１つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１１９、１２１または１３５位にシステインを有するポリヌクレオチドを含む変位型α−ＨＬ細孔を生成するためのキット；
−本発明の細孔を生成するための方法であって：
（ａ）上に定義された細孔を提供すること；および
（ｂ）細孔と１つまたはそれ以上のヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを細孔と共有結合させることを含む方法；
−個別のヌクレオチドを同定する方法であって、
（ａ）ヌクレオチドが本発明の細孔と相互作用するようヌクレオチドを細孔と接触させること；および
（ｂ）相互作用時に細孔を通過する電流を測定し、且つそれによりヌクレオチドの本性を決定することを含む方法；
−標的核酸の配列を決定する方法であって：
（ａ）エキソヌクレアーゼを用いて個別のヌクレオチドを標的配列の一方の末端より消化すること；
（ｂ）ヌクレオチドがアダプターと相互作用するようヌクレオチドを本発明の細孔と接触させること；
（ｃ）相互作用時に細孔を通過する電流を測定し、且つそれによりヌクレオチドの本性を決定すること；および
（ｄ）核酸配列の同一末端において手順（ａ）から（ｃ）を反復し、且つそれにより核酸の配列を決定することを含む方法；および
−核酸の配列を決定するキットであって：
（ａ）本発明の細孔または上記のキットに包含される７つのポリヌクレオチド；および
（ｂ）エキソヌクレアーゼを含むキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例で用いられるアダプターの構造を示す。この図は、未反応アダプターであるヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、および二官能性架橋剤である３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）と一旦反応してａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤを形成した場合のアダプターの構造を示す。図は、アダプターに対するアミン基の影響を検討するために実施例で用いられた対照アダプターの構造も示す（ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）。
【図２】野生型バックグラウンドにおけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７（上）およびＲＬ２バックグラウンドにおけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７（下）の単一チャネル記録を示す。ａｍ７−βＣＤ結合およびｄＮＭＰが認められる。
【図３】図１からの対応するｄＮＭＰイベントのヒストグラムを示す。Ｌｅｄｔは野生型であり右はＲＬ２である（１２００ｍＭ ＫＣＩ、１５０ｍＶ，ｐＨ７．５）。
【図４】野生型と比較したＲＬ２の重要な変異を示す図を示す。
【図５】ｄＮＭＰがＨＬ−（Ｍ１１１３Ｒ）７ＲＬ２バックグラウンドおよびＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）７ｗｔバックグラウンドと結合した場合の残留電流のヒストグラムを示す。この図は、ＲＬ２バックグラウンドにおけるＮ１３９Ｑ変異の重要性を示す（図３と比較せよ）（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図６】提唱されたα−ＨＬの残基１３９におけるシクロデキストリンの位置を示す。
【図７】α−ＨＬのβ−樽状構造における重要な変異の位置を示す図を示す。
【図８】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｔ１１５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録を示す。ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤとの反応によって変動し雑音の多いベースラインとなることが認められる（バイアスはなし）。
【図９】変動し雑音の多いベースラインを示すＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｔ１１７Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録を示す（バイアスはなし）。
【図１０】ヌクレオチドを添加する前後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録を示す。また、ヌクレオチドを添加した後のベースラインの拡大も示す。
【図１１】ヌクレオチドの添加後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録を示す。
【図１２】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｇ１１９Ｇ−Ｄ８）１（左）およびＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８）１変異体（右）のヒストグラムを示す。８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５において限定された塩基識別が認められる。
【図１３】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２３Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（１秒間提示）。
【図１４】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２３−Ｄ８）１（左）およびＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１３７Ｃ−Ｄ８）１変異体（右）のヒストグラムを示す。限定された塩基識別が認められる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図１５】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（１秒間提示）。
【図１６】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。良好な塩基識別が認められる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図１７】印加された電位の範囲（１１０〜１７０ｍＶ）におけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体についてのｄＮＭＰ結合の残留電流ヒストグラムを示す。４つのヌクレオチドの相対的位置の変化が認められる。鋭い黒いピークはシクロデキストリンレベルに対応する。
【図１８】単一のヌクレオチドが細孔に結合した場合の印加電位によるピーク位置の変動（残留細孔電流）のプロットを示す。
【図１９】印加電位１３０、１５０および１７０ｍＶにおける試験についての残留電流ヒストグラム、各塩基のガウスフィッティングおよび隣接する塩基間の重なり面積の算出値のプロットを示す。
【図２０】残留細孔電圧の平均に対する滞留時間を示す。ｄＴＭＰの長い平均滞留時間を認めることができるように、全４種類の塩基（下から順にＧ、Ｔ、Ａ、Ｃ）のピークを認めることができる。
【図２１】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。低塩濃度で良好な塩基識別を認めることができる（４００ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２２】ｄＮＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（３５０ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２３】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。低塩濃度で良好な塩基識別が見られる（３５０ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２４】３００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ中でｐＨ７．５より開始した単一チャネルについての溶液温度に対するヘモリシンコンダクタンスのプロットを示す。１．６５ｐＡ／℃の上昇を見ることができる。
【図２５】低塩濃度且つ高温（３００ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．２，４０℃）で良好な塩基検出を示すＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体についてのヒストグラム（左）、および短い滞留時間を示す同じデータの振幅に対する滞留時間のプロット（右）を示す。
【図２６】ｄＣＭＰおよびメチル−ｄＣＭＰの化学構造を示す（比較のためにｄＴＭＰも含める）。
【図２７】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。ｄＧＭＰおよびメチル−ｄＣＭＰ塩基検出を認めることができる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１８０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２８】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。全４種類の標準的ヌクレオチド一リン酸（左）およびメチル−ｄＣＭＰを加えた全４種類の標準的ヌクレオチド一リン酸（右）の検出を認めることができる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１７０ｍＶ、ｐＨ７．５）。
【図２９】残留細孔電圧の平均に対する滞留時間を示す。全４種類の塩基およびメチル−ｄＣＭＰのピーク（左）および５種類の塩基についての残留電流ヒストグラムのガウスフィッティング（右）を示す。
【図３０】印加電位の範囲（１３０〜１７０ｍＶ）におけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体についてのｄＮＭＰ結合の残留電流ヒストグラムを示す。メチル−ｄＣＭＰを加えた４つのヌクレオチドの相対的位置の変化を認めることができる。
【図３１】ＤＮＡおよび対応するＲＮＡ塩基の一般的に認められる塩基の化学構造を示す。
【図３２】ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体のヒストグラムを示す。ＮＭＰ塩基の検出が認められる（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）＝。
【図３３】１２１位においてａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したホモ７量体ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ）７の単一チャネル記録を示す。
【図３４】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰ ｎｄ ｄＣＭＰを添加した後にＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング、０．５秒間提示）。
【図３５】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）を示す（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング、０．５秒間提示）。
【図３６】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（ｗｔ）６（Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング、０．５秒間提示）および対応する残留電流ヒストグラムを示す。
【図３７】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング、０．５秒間提示）および対応する残留電流ヒストグラムを示す。
【図３８】ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＣＭＰを添加した後にａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したＨＬ−（Ｎ１３９Ｑ）６（Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体の単一チャネル記録（５ｋＨソフトウェアでフィルタリング）（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ、５ｋＨフィルタリング０．５秒間提示）および対応する残留電流ヒストグラムを示す。
【００１２】
（配列リストの説明）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は野生型α−ヘモリシン（α−ＨＬ）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は野生型α−ＨＬの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ−ＲＬ２の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ−ＲＬ２の１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は野生型バックグラウンドを有するα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒの１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は野生型バックグラウンドを有するα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑの１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１１９−Ｄ８の１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８の１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２および１４はいずれもアミノ末端にメチオニンを欠く成熟型である。
【００２７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５はＥ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩＩＩをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はＥ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩＩＩのアミノ酸配列を示す。
【００２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７はＥ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８はＥ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩのアミノ酸配列を示す。
【００３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９はバクテリオファージλエキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０はバクテリオファージλエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。配列は集合して３量体となる３つの同一のサブユニットの１つである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
開示された生成物および方法の異なる適用を、当技術分野における特定のニーズに対して個別に調節してもよいことを理解すべきである。本明細書で用いる用語は本発明の具体的な実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解すべきである。
【００３４】
さらに、本明細書および付属の請求項で用いるところの単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その」（ｔｈｅ）は、内容が明確にそうでないと指示していない限り複数の指示物を含む。したがって、たとえば「１つのヌクレオチド」に対する言及は「複数のヌクレオチド」を含み、「１つの細孔」に対する言及は２つまたはそれ以上のこうした細孔を含み、「１つの分子アダプター」に対する言及は２つまたはそれ以上のこうしたアダプターを含む、などである。
【００３５】
本明細書に引用された全ての出版物、特許および特許明細書は、上記のものも下記のものも、その全文を参照文献として本明細書に組み入れる。
【００３６】
（変異型α−ＨＬ細孔）
本明細書は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを検出するのに用いることを目的とした変異型α−ＨＬ細孔を提供する。細孔は異なるヌクレオチドを鑑別または識別するために用いてもよい。細孔はヌクレオチドの相互作用を促進する分子アダプターを含む。アダプターは特定の位置で細孔と共有結合する。アダプターは、ヌクレオチドと細孔が相互作用する時に、ヌクレオチドがそのヌクレオチドに特有の様式で細孔内を流れる電流に影響するよう配置される。したがってアダプターは、確率的感知によるヌクレオチドの検出またはヌクレオチドの識別に細孔を用いることを可能とする位置で、細孔と共有結合する。
【００３７】
本発明の細孔は、確率的感知にとって有用な手段である。本発明の細孔は、ヌクレオチド間の識別に特に有用である。したがって細孔は核酸の配列決定にとって理想的である。
【００３８】
本発明の細孔は、異なるヌクレオチドを高い感度で識別することができる。細孔は、ＤＮＡおよびＲＮＡにおける４種類のヌクレオチドを容易に識別することができる。本発明の細孔は、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを識別することまでできる。残基１３５にアダプターが共有結合した変位型α−ＨＬ細孔の塩基分解能は、驚くほど高い。細孔は４種類のＤＮＡヌクレオチドのほぼ完全な分離を示し、これを核酸配列決定のための優れた候補としている。細孔は、そのより長い細孔内滞留時間に基づき、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）を他の３種類のＤＮＡヌクレオチドと明確に識別することを可能とする。さらに細孔は、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）とメチル−ｄＣＭＰを、細孔内滞留時間および細孔内を流れる電流に基づいて識別する。
【００３９】
本発明の細孔は、幅広い条件下で異なるヌクレオチド間を高い感度で識別することもできる。具体的には、細孔は核酸の配列決定にとって好ましい条件下でヌクレオチドを識別するであろう。細孔をＤＮＡおよびＲＮＡ分子の配列決定に用いることができる方法は数多い。１つの方法は、エキソヌクレアーゼ酵素の使用を包含する。この手法では、エキソヌクレアーゼ酵素を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖よりヌクレオチドを連続的に脱離させる。このような酵素は、通常は高塩濃度下で機能しない。本発明の細孔は、低塩濃度であってもヌクレオチド同士を識別することができる。細孔は、たとえば室温で３００ｍＭと低いＫＣｌ濃度において、良好なヌクレオチド識別で機能することができる。細孔は、温度が上昇した場合または非対称的塩濃度が用いられた場合、より低い塩濃度において良好なヌクレオチド識別で機能するであろう。これについては、以下でより詳しく議論する。
【００４０】
本発明の細孔が異なるヌクレオチドを識別できる度合いは、印加電位を変化させることによって調節することができる。それにより、特に配列決定の際に細孔の機能を精密に調節することができる。
【００４１】
分子アダプターが固定されているという性質は、細孔から得られたシグナルが細孔の樽状構造またはチャネル内のヌクレオチドの存在に完全に依存し、且つアダプターの細孔からの解離によって影響されないことも意味している。換言すれば、アダプターが固定されているという性質は、ヌクレオチドが細孔と相互作用する時には、常に特徴的な電流が細孔内を流れることを意味している。配列内の各ヌクレオチドを検出および同定する必要があるので、これは核酸配列決定にとって特に重要である。
【００４２】
本発明の細孔は、それらが遮断されないように設計することができる。電気生理学においては、細孔は大きな多価イオンによって遮断されることがある。イオンは細孔の樽状構造またはチャネルに捕捉され、さらにイオン電流の流れを妨害する。通常、遮断は超高純度塩溶液内で実験を実施することによって回避することができる。アルギニンなどの正に荷電した残基を、α−ＨＬの樽状構造またはチャネルの狭窄部近傍に導入することにより、遮断されやすい細孔が生じる。以下の考察より明らかにされるように、本発明の変異型α−ＨＬ細孔が、１つまたはそれ以上の正荷電残基を、その樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に有することは必須ではない。このような残基を欠く本発明の細孔は、大きな多価イオンの存在下で遮断を受けることなく用いることができる。
【００４３】
最後に、分子アダプターが固定されているという性質は、細孔およびアダプターを共に保存することができるので、即時使用可能なバイオセンサーの製造が可能となることを意味している。
【００４４】
本発明の細孔は分離するか、相当分離するか、精製するか、または相当精製してもよい。脂質または他の細孔などの他の成分を全く含まない場合、本発明の細孔は分離または精製される。その意図する用途を妨害しない担体または希釈剤と混合される場合、細孔は相当分離される。たとえば、脂質または他の細孔などの他の成分を１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満含む形態で存在する場合、細孔は相当分離または相当精製される。代替的に、本発明の細孔は脂質二重層で存在することもある。
【００４５】
本発明の細孔は、個別または単独の細孔として存在してもよい。本発明の細孔は、代替的に２つまたはそれ以上の細孔の相同または非相同群で存在してもよい。
【００４６】
野生型α−ＨＬ細孔は７つの同一の単量体またはサブユニットより構成される（すなわち７量体）。α−ヘモリシンの１つの野生型単量体またはサブユニットの配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。変位型α−ＨＬ細孔は、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有し、且つ細孔活性を維持する７量体細孔である。細孔は、以下に論じるようなアダプターの配置を促進する修飾を含む。細孔は、好ましくはアダプターの共有結合を促進する修飾も含む。
【００４７】
細孔におけるサブユニットのうち１、２、３、４、５、６つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有してもよい。好ましい実施形態においては、細孔のサブユニットは全てＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有する。細孔における７つのサブユニットが全て同一であってもよいが、特に、以下に論じるように異なるサブユニットが異なる様式で修飾されてアダプターの配置を促進し、且つ任意にアダプターの共有結合を促進するので、典型的には異なる。
【００４８】
本発明の変異型α−ＨＬ細孔は、それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を含む７つのサブユニットより形成される。変種とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有し、且つ細孔を形成する能力を保持するサブユニットである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６、８、１０、１２および１４に示す配列は、全てＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種である。以下に論ずるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対する特異的な修飾は、いずれもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種をもたらす。
【００４９】
変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有する構造体を含み、且つ米国特許出願第６１／０７８，６９５号からの優先権を主張し且つ本出願と同時に出願された国際同時継続出願［Ｊ Ａ Ｋｅｍｐ ＆ Ｃｏ Ｒｅｆ：Ｎ．１０４４０４Ａ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｌａｂｓ Ｒｅｆ：ＯＮＬ ＩＰ ００５］に記載されている。このような構造は、エキソヌクレアーゼなどの核酸代謝酵素も含む。その出願の教示するものは、全て本発明にも同等に適用することができる。
【００５０】
細孔は、修飾されて１つまたはそれ以上のヌクレオチドを削除できるよう、アダプターを配置することを促進する。疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力などの非共有結合的相互作用によりアダプターを正しい位置に保持するために、１つまたはアミノ酸を細孔に導入する。
【００５１】
７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９においておよび／またはその近傍において修飾される。たとえば、７つのサブユニットのうち２つ、３つ、４つ、６つまたは全てがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９においておよび／またはその近傍において修飾される。７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９においておよび／またはその近傍において２つ、３つ、４つまたは５つなど少なくとも１つの修飾を含む。
【００５２】
７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９においておよび／または残基１３９近傍において修飾される。７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が残基１３９の近傍で修飾される場合、修飾は残基１３９に十分に近いのでアダプターの配置を促進することができる。修飾は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９より、典型的には２０オングストローム未満の位置、たとえば１５未満、１０未満または５オングストローム未満などの位置において行われる。好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列の残基１３９より２または３アミノ酸の残基が修飾される。より好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列の残基１３９および／または残基１３９に隣接する残基の１つまたは両者が修飾される。好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１または１４２における修飾またはそのあらゆる組合せを含む。最も好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９のみにおける修飾を含む。
【００５３】
７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、一旦配列が折りたたまれて三次元サブユニットを形成すると残基１３９の近傍となるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基における修飾を含んでもよい。好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１７、１１９、１２１、１２３、１３５、１３７、１４１または１４３の修飾またはそのあらゆる組合せを含む。
【００５４】
好ましくは、サブユニットは極性、非荷電アミノ酸の導入により残基１３９および／またはその近傍において修飾される。そのようなアミノ酸は、水素結合によるアダプターの配置に影響しうる。その電荷の欠如は、静電的相互作用がアダプターの機能を妨害することも防止する。下記の表１は極性非荷電アミノ酸を列挙する。グルタミンは好ましい極性非荷電アミノ酸である。極性非荷電アミノ酸は、残基１３９および／またはその近傍に挿入することができる。残基１３９におけるおよび／またはその近傍のアミノ酸は、代替的に極性非荷電アミノ酸と置換することができる。
【００５５】
好ましくは、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が修飾されて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍に極性非荷電アミノ酸であるグルタミンを含む。グルタミンを残基１３９および／またはその近傍に挿入することができるか、または残基１３９におけるおよび／またはその近傍のアミノ酸をグルタミンと置換することができる。好ましくは、残基１３９のアミノ酸はグルタミンと置換される（Ｎ１３９Ｑ）。たとえば、７つのサブユニットのうち２つ、３つ、４つ、５つまたは６つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９にグルタミンを有する。好ましい実施形態においては、７つのサブユニットの全てがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９にグルタミンを有する。残基１３９における非荷電グルタミンは、アダプター中の水酸基などの化学基と水素結合により相互作用し、且つそれにより変位型α−ＨＬ細孔の樽状構造またはチャネル内におけるアダプターの配置を促進することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９がグルタミンと置換された好ましいサブユニット（Ｎ１３９Ｑ）をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１０、１２および１４に示す。適切なサブユニットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１０、１２および１４に示すオクタアスパラギン酸テールを含んでも欠いてもよい。
【００５６】
細孔は、樽構造またはチャネルの狭窄部の近傍に他の非荷電アミノ酸、または芳香族アミノ酸までもが配置されて、アダプターの配置がさらに促進されることがある。下記の表１は非荷電芳香族アミノ酸を列挙する。たとえば、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍にアスパラギンのような非荷電アミノ酸を１つまたはそれ以上、またはフェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸を１つまたはそれ以上配置されてもよい。細孔は、好ましくは４、５、６または好ましくは７つの非荷電または芳香族アミノ酸の環が、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に配置される。環の中の各アミノ酸は、典型的には各サブユニットより提供される。樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に配置されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基は１１１、１１３および１４７を含むが、これに限定されない。適切なサブユニットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１１、１１３または１４７に非荷電または芳香族アミノ酸を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１１、１１３または１４７に、非荷電または芳香族アミノ酸を挿入することができる。代替的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１１、１１３または１４７のアミノ酸を非荷電または芳香族アミノ酸と置換することができる。
【００５７】
細孔は、好ましくは修飾されてアダプターの共有結合を促進する。システインなどの共有結合を形成することのできる１つまたはそれ以上のアミノ酸を、１つまたはそれ以上のサブユニットに導入することができる。アミノ酸は、天然に産するものでも非天然的に産するものでもよい。アミノ酸は付加によって導入してもよい。アミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置される限り、あらゆる位置にアミノ酸を導入することができる。アミノ酸が残基１３９より遠隔の残基に導入される場合、適切な長さの二官能性架橋剤を用いて、アダプターが残基１３９またはその近傍に配置されることを確実にしてもよい。
【００５８】
好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５が修飾されてアダプターの共有結合を促進する。より好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つのみにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５が修飾されてアダプターの共有結合を促進する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５に導入されるアミノ酸は、好ましくはシステインである。残基１１９、１２１または１３５のアミノ酸は、好ましくはシステインと置換される（Ｇ１１９Ｃ、Ｎ１２１ＣまたはＬ１３５Ｃ）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１１９位がシステインと置換された好ましいサブユニット（Ｇ１１９Ｃ）を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１２１がシステインと置換された好ましいサブユニット（Ｎ１２１Ｃ）を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３５がシステインと置換された好ましいサブユニット（Ｌ１３５Ｃ）を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す。
【００５９】
細孔は、好ましくは樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に、正に荷電したアミノ酸が配置されてアダプターの共有結合を促進する。たとえば、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上に対し、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に、アルギニン、リジンまたはヒスチジンのような正に荷電したアミノ酸が配置してもよい。正に荷電したアミノ酸は、アダプター内のアミンなどの正に荷電した基との静電的相互作用により、アダプターの共有結合を促進する。より具体的には、正に荷電したアミノ酸がアダプター内の正に荷電した基と反発し、アダプターを細孔の樽状構造またはチャネルに押し下げ、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置する。それにより、アダプターと細孔の共有結合反応が促進される。しかし、上に論じたように、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に配置された正に荷電したアミノ酸を有する細孔は、遮断されやすいことがある。
【００６０】
細孔は、好ましくはアルギニン、リジンまたはヒスチジンなどの正に荷電した４つ、５つ、６つまたは好ましくは７つのアミノ酸の環が、樽状構造またはチャネルの狭窄部の近傍に配置される。環の中の各アミノ酸は、典型的には各サブユニットより提供される。好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３に、アルギニン、リジンまたはヒスチジンのような正に荷電したアミノ酸を１つ有する。より好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３にアルギニン残基を有する。より好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのすべてがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３にアルギニン残基を有する。アルギニンを残基１１３に導入することができるか、または残基１１３をアルギニンと置換することができる（Ｍ１１３Ｒ）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３がアルギニンと置換された好ましいサブユニット（Ｍ１１３Ｒ）を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６、８、１０、１２および１４に示す。
【００６１】
サブユニットは、たとえばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌などの生物が発現した天然に産する変種でもよい。変種は、組換え技術によって生成された非天然産生変種も含む。変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の全長に対し、好ましくは少なくとも５０％がアミノ酸同一性に基づきその配列と相同となるであろう。サブユニットポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のアミノ酸同一性に基づき、より好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％が、配列の全長に対して相同となる。２００またはそれ以上、たとえば２３０、２５０、２７０または２８０またはそれ以上の長さの近接アミノ酸に対し、アミノ酸の同一性は少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、９０％または９５％ある（「硬い相同性」）。
【００６２】
アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対し、上に論じたものに加えて、たとえば１、２、３、４、５、１０，２０または３０置換までなどのアミノ酸置換を行ってもよい。たとえば下記の表１によれば、保存的置換を行ってもよい。
【００６３】
【表１】
【００６４】
上に論じたポリペプチドより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列の１つまたはそれ以上の残基をさらに削除することができる。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基まで、またはそれ以上を削除することができる。
【００６５】
変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントよりなるサブユニットを含んでもよい。このようなフラグメントは、細孔形成活性を保持する。フラグメントは少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸の長さであってもよい。このようなフラグメントを用いて、キメラ細孔を生成してもよい。フラグメントは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の細孔形成ドメインを含む。フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および１１９、１２１または１３５を含まなければならない。
【００６６】
変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントまたは一部を含むキメラタンパク質を含む。キメラタンパク質細孔は、それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントまたはその一部を含む、１つまたはそれ以上のサブユニットより形成してもよい。キメラタンパク質細孔の細孔またはチャネル部分は、典型的にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメントまたはその一部より形成される。
【００６７】
１つまたはそれ以上のアミノ酸を、代替的または追加的に上記のポリペプチドに付加してもよい。延長部を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはそのポリペプチド変種またはフラグメントのアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシル末端に提供してもよい。延長部は、たとえば長さ１から１０アミノ酸のように非常に短くしてもよい。代替的に、たとえば５０または１００アミノ酸までのように、延長部をより長くしてもよい。担体タンパク質を本発明によるアミノ酸配列と融合させてもよい。
【００６８】
上述のように、変種とはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のそれと異なるアミノ酸配列を有し、且つその細孔形成能力を保持するサブユニットである。典型的には、変種は細孔形成を担当するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の領域を含む。β−樽状構造を含むα−ＨＬの細孔形成能力は、各サブユニットのβ−シートによって提供される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種は、典型的にはβ−シートを形成するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸２２から３０、３５から４４、５２から６２、６７から７１、７６から９１、９８から１０３、１１２から１２３、１３７から１４８、１５４から１５９、１６５から１７２、２２９から２３５、２４３から２６１、２６６から２７１、２８５から２８６および２９１から２９３がβ−シートを形成する。生成する変種がその細孔形成能力を維持する限り、β−シートを形成するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の領域に１つまたはそれ以上の修飾を施すことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のβ−シート領域に施すことのできる具体的な修飾を以下に論じる。
【００６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種は、そのα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に、置換、付加または削除などの修飾を好ましくは１つまたはそれ以上含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸２から６、７３から７５、２０７から２０９、２１４から２１６および２１９から２２２がα−ヘリックスを形成する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４および２８７から２９０がループを形成する。アミノ酸１および２９４は末端アミノ酸である。
【００７０】
当技術分野における標準的方法を用いて相同性を判定することができる。たとえばＵＷＧＣＧパッケージは、たとえばそのデフォルト環境に使用される、相同性を算出するために用いることのできるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｔ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ．３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ．ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０に記載されているように、相同性を算出または配列を決定することができる（たとえば（典型的にはそのデフォルト環境に対して）同等の残基または対応する配列を同定するなど）。
【００７１】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターより公開されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、始めに、データベース配列において同じ長さのあるワードでアラインメントした場合、いくつかのプラス閾値スコアＴに合致または適合する問い合わせ配列において、長さＷの短いワードを同定することによって高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを包含する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（上記Ａｌｔｓｅｈｕｌ ｅｔ ａｌ）。これらの初回の隣接ワードヒントは、検索を開始してＨＳＰがこれらを含むことを確認するためのシードの機能を果たす。ワードヒントは、累積配列スコアを増加できる限り、各配列の両方向に拡張される。各方向へのワードヒントの拡張は：累積配列スコアがその最大達成値より量Ｘ減少した時；１つまたはそれ以上のマイナススコア残基配列が累積したことにより累積スコアが０またはそれ以下となる時；または各配列の末端に到達した時に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９を参照）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５，Ｎ＝４および両鎖の比較を用いた。
【００７２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する；たとえばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の指標の１つは、それによって２つのアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の指標を提供する最小確率和（Ｐ（Ｎ））である。たとえば、第１の配列の第２の配列に対する比較における最小確率和が約１を下回り、好ましくは約０．１を下回り、より好ましくは約０．０１を下回り、また最も好ましくは約０．００１を下回る場合、一方の配列はもう一方の配列と類似している。
【００７３】
たとえばその同定または生成を支援するためのヒスチジンまたはアスパラギン酸などの付加によって、または天然ではポリペプチドがシグナル配列を含まない細胞からのその分泌を促進するためのそのような配列の付加によって、１つまたはそれ以上のサブユニットを修飾してもよい。
【００７４】
細孔は判別ラベルでラベリングしてもよい。判別ラベルは、細孔が検出されることを可能とするあらゆる適切なラベルとしてよい。適切なラベルは蛍光分子、たとえば１２５Ｉ、３５Ｓなどの放射性同位元素、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドを含むが、これに限定されない。
【００７５】
細孔は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどの細孔生成生物より得ても、または合成的にまたは組換え手段によって生成してもよい。たとえば、細孔はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写によって合成してもよい。細孔のアミノ酸配列は、非天然産生アミノ酸を含めるか、または化合物の安定性を高めるために修飾してもよい。合成的手段によって細孔が生成される場合、このようなアミノ酸を精製時に導入してもよい。細孔は、以下の合成または組換えのいずれかの生成法にしたがって変化させてもよい。
【００７６】
細孔はＤ−アミノ酸を用いて生成してもよい。たとえば、細孔はＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含んでもよい。このことは、このようなタンパク質またはペプチドを生成することを目的とした当技術分野において一般的である。
【００７７】
細孔は、アダプターの配置を促進し、且つ任意に共有結合を促進するための特異的な修飾を１つまたはそれ以上含む。細孔は、アダプターの結合および配置を妨害しない限り、その他の非特異的修飾を含む。多数の非特異的な側鎖の修飾は当技術分野において既知であり、細孔の側鎖に行ってもよい。このような修飾は、たとえばアミノ酸に対するアルデヒドとの反応の後ＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化、メチルアセトイミデートによるアミジン化または無水酢酸によるアシル化などを含む。
【００７８】
細孔は、当技術分野において既知である標準的な方法を用いて生成することができる。細孔または細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的な方法を用いて誘導および複製することができる。このような配列については以下でより詳しく議論する。細孔または細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的な技術を用いて、細菌宿主細胞に発現させることができる。細孔または細孔サブユニットは、組換え発現ベクターに由来するポリペプチドのｉｎ ｓｉｔｕ発現によって、細胞内で生成することができる。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するための誘導プロモーターを担持することもある。
【００７９】
細孔サブユニットは、あらゆるタンパク質液体クロマトグラフィ系によって細孔生成生物より精製した後に、または以下に記載するような組換え発現後に、大スケールで生成してもよい。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィ系はＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムを含む。次に、本発明に従った使用を目的として、天然産生または組換え生成細孔または細孔サブユニットを、天然産生または人工膜に挿入してもよい。細孔を膜に挿入する方法を以下に記載する。
【００８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６、８、１０、１２および１４に示された７つのサブユニット（すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種）のあらゆる組合せを用いて本発明の細孔を形成してもよい。好ましい細孔は：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６つおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８サブユニット１つ；または
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６つおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８サブユニット１つを含み；
【００８１】
細孔（ａ）および（ｂ）においては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１２、１８、２２、２６、３０および３４に示すサブユニットは、オクタ−アスパラギン酸テールを欠いてもよい。
【００８２】
本発明の最も好ましい細孔は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６つおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１３５Ｃ−Ｄ８サブユニット１つを含む。このような細孔においては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すサブユニットは、オクタ−アスパラギン酸テールを欠いてもよい。
【００８３】
（分子アダプター）
本発明の細孔は、細孔とヌクレオチドまたは標的核酸配列との相互作用を促進する分子アダプターを含む。アダプターの存在により、細孔とヌクレオチドのホスト−ゲスト化学が向上する。ホスト−ゲスト化学の原則は、当技術分野において周知である。アダプターは、そのヌクレオチドとの相互作用を向上させる細孔の物理的または化学的性質に対する効果を有する。アダプターは、典型的には細孔の樽状構造またはチャネルの電荷を変化させるか、またはヌクレオチドと特異的に相互作用または結合し、それによりその細孔との相互作用を促進する。
【００８４】
アダプターは各個別のヌクレオチド同士の相互作用を媒介するか、または各ヌクレオチドが標的核酸配列および細孔である。ヌクレオチドは、好ましくはアダプターを介して、またはこれと共に、可逆的に細孔と結合する。ヌクレオチドは、最も好ましくは、それらが膜を横断して細孔を通過するにつれて、アダプターを介して、またはこれと共に、可逆的に細孔と結合する。またヌクレオチドは、それらが膜を横断して細孔を通過するにつれて、アダプターを介して、またはこれと共に、細孔の樽状構造またはチャネルと可逆的に結合することもできる。アダプターは、好ましくはヌクレオチドと相互作用できるように樽状構造またはチャネルを収縮させる。
【００８５】
アダプターは、典型的には環状である。アダプターは、好ましくは細孔と同じ対称性を有する。α−ＨＬは、中心軸の周囲に、膜貫通β−樽状構造に鎖１４本を付与する７つのサブユニットを有するので、アダプターは好ましくは７倍の対称性を有する。
【００８６】
アダプターは、典型的にはホスト−ゲスト化学によりヌクレオチドと相互作用する。アダプターは、典型的にはヌクレオチドと相互作用することができる。アダプターは、ヌクレオチドと相互作用することのできる化学基を１つまたはそれ以上含む。１つまたはそれ以上の化学基は、好ましくは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力などの非共有結合的相互作用によって、ヌクレオチドと相互作用する。ヌクレオチドと相互作用することのできる１つまたはそれ以上の化学基は、好ましくは正に荷電する。ヌクレオチドと相互作用することのできる１つまたはそれ以上の化学基は、より好ましくはアミノ基を含む。アミノ基は一級、二級または三級炭素原子と結合することができる。アダプターは、より好ましくは６、７または８個のアミノ基の環などのアミノ基の環を１つ含む。アダプターは、最も好ましくは７個のアミノ基の環を１つ含む。プロトン化されたアミノ基の環は、ヌクレオチドの負に荷電したリン酸基と相互作用しうる。
【００８７】
以下により詳しく論じるように、細孔の樽状構造またはチャネル内でのアダプターの正しい配置は、アダプターと細孔との間のホスト−ゲスト化学によって促進することができる。アダプターは、好ましくは細孔内で１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することのできる化学基を１つまたはそれ以上含む。アダプターは、より好ましくは疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力などの非共有結合的相互作用により、細孔内の１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することのできる化学基を１つまたはそれ以上含む。細孔内の１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することのできる化学基は、典型的には水酸基またはアミン基である。水酸基は、一級、二級または三級炭素原子と結合することができる。水酸基は、細孔内の非荷電アミノ酸、具体的にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍に導入されたものと水素結合を形成しうる。アダプター内の１つまたはそれ以上の化学基と細孔内の１つまたはそれ以上のアミノ酸の間のこの相互作用を用いて、アダプターをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍における正しい配置に保持することができる。
【００８８】
細孔内の１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用することのできるアミン基は、ヌクレオチドと相互作用することのできるアミン基と同一でも、または異なっていてもよい。上に論じたように、細孔の樽状構造またはチャネル内に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３におけるアルギニン（Ｍ１１３Ｒ）のような正に荷電したアミノ酸が存在すれば、アダプター内の正に荷電したアミン基は、これと静電的に相互作用してもよい。この相互作用によって、アダプターは細孔の樽状構造またはチャネルに押し下げられ、且つそれにより共有結合が促進される。
【００８９】
細孔とヌクレオチドの相互作用を促進するあらゆるアダプターを用いることができる。適切なアダプターはシクロデキストリン、環状ペプチドおよびキューカビチュリルを含むが、これに限定されない。アダプターは、好ましくはシクロデキストリンまたはその誘導体である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Ｅｌｉｓｅｅｖ，Ａ．Ｖ．，およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ−Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．１１６，６０８１−６０８８に開示されたもののうちいずれであってもよい。アダプターは、より好ましくはヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。ｇｕ７−βＣＤ内のグアニジノ基のｐＫａはａｍ７−βＣＤの一級アミンよりもはるかに高いので、より正に荷電する。このｇｕ７−βＣＤアダプターを用いて、ヌクレオチドの細孔内滞留時間を延長、測定する残留電流値の精度を向上、さらには高温または低いデータ取得率において塩基検出率を向上してもよい。
【００９０】
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）架橋剤を、以下により詳細に論じる方法により用いる場合、アダプターは、好ましくはヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）である。
【００９１】
（共有結合）
アダプターは細孔と共有結合する。アダプターは、当技術分野において既知であるあらゆる方法を用いて細孔と共有結合させることができる。アダプターは細孔と直接結合させてもよい。アダプターは、好ましくは二官能性架橋剤を用いて細孔と共有結合させる。適切な架橋剤は、当技術分野において周知である。好ましい架橋剤は３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル、４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルおよび８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルを含む。最も好ましい架橋剤は３−（２−ピリジルジチオ）プロパン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）である。アダプターは、典型的にはアダプター／架橋剤複合体が細孔と共有結合する前に、二官能性架橋剤と結合するが、二官能性架橋剤／細孔複合体がアダプターと結合する前に、二官能性架橋剤が細孔と共有結合することも可能である。本発明の細孔の生成は、以下により詳細に論じる。
【００９２】
共有結合部位は、アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置されるよう選択される。それにより、ヌクレオチドと細孔の相互作用が促進され、且つそれによりヌクレオチドの検出が可能となる。またそれによって、ヌクレオチドがそのヌクレオチドに特異的な様式で細孔内を流れる電流を変化させることが確実となる。
【００９３】
アダプターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９と同じ水平面において細孔の樽状構造またはチャネルに配置される場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９に配置される。アダプターは、細孔の樽状構造またはチャネル内で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９と同じ垂直位置に配置される場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９に配置される。アダプターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍にある残基と同じ水平面において細孔の樽状構造またはチャネルに配置される場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍に配置される。アダプターは、細孔の樽状構造またはチャネル内で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍にある残基と同じ垂直位置に配置される場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍に配置される。アダプターは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の水平面より５オングストローム未満、たとえば３未満、または２オングストローム未満などにある水平面に配置される。アダプターは、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１または１４２と同じ水平面に配置される。
【００９４】
アダプターは、典型的には細孔の樽状構造またはチャネルと共有結合する。アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置され、ヌクレオチドとの細孔の相互作用を促進し、且つそれによりヌクレオチドの検出を可能とする限り、アダプターは樽状構造またはチャネル内のあらゆる部位で共有結合することができる。アダプターは、典型的にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９の近傍にある樽状構造またはチャネル内のアミノ酸と共有結合する。アダプターは、好ましくは各サブユニットのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９によって形成される残基の環の近傍にある、細孔内のアミノ酸と共有結合する。各サブユニットのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９によって形成される残基の環より遠隔にある樽状構造またはチャネル内のアミノ酸に、アダプターが共有結合する場合、アダプターが残基１３９またはその近傍に配置されるように適切な長さの二官能性架橋剤を用いてもよい。
【００９５】
アダプターは、好ましくは７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９または１２１と結合する。アダプターは、より好ましくは７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３５と結合する。アダプターを残基１１９、１２１または１３５と結合させることで、アダプターは各サブユニットのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９によって形成される残基の環の近傍に配置される。
【００９６】
細孔は、好ましくは１つまたはそれ以上のアミノ酸の導入によって修飾されて、分子アダプターの二官能性架橋剤との共有結合が促進される。より好ましくは、細孔の樽状構造またはチャネルが修飾されて、分子アダプターの二官能性架橋剤との共有結合が促進される。細孔は、当技術分野において既知であるあらゆる方法を用いて修飾することができる。１つまたはそれ以上のアミノ酸を、細孔の同一または異なるサブユニットに導入してもよい。システインなどのような、共有結合を形成することのできるあらゆるアミノ酸を導入することができる。アミノ酸は、天然に産するものでも非天然的に産するものでもよい。１つまたはそれ以上のアミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。
【００９７】
好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５が修飾されて共有結合を促進する。より好ましい実施形態においては、７つのサブユニットのうち１つにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５が修飾される。上に論じたサブユニットのいずれも、分子アダプターまたは二官能性架橋剤の共有結合を促進するために用いることができる。
【００９８】
（アダプターの配置）
アダプターは、細孔を用いてヌクレオチドを検出することを可能とする位置において、細孔と共有結合する。アダプターは配置され、そのようなヌクレオチドがそのヌクレオチドに特異的な様式で細孔内を流れる電流を変化させる。アダプターはそのように配置され、これは細孔とヌクレオチドのホスト−ゲスト化学を向上する。アダプターは、細孔の物理的または化学的性質を変化させ、且つそのヌクレオチドとの相互作用を向上させるよう配置される。アダプターは、典型的には細孔を通るイオンの流れに対して立体的な遮断を形成するよう配置される。アダプターがヌクレオチドと特異的に相互作用または結合することができる場合、アダプターはヌクレオチドと特異的に相互作用または結合するよう配置される。ヌクレオチドと相互作用するアダプター内の１つまたはそれ以上の化学基は、好ましくはヌクレオチドがそこを通じて進入する細孔の末端より離れて配向される。そのような配向によって、細孔の樽状構造またはチャネルを経たヌクレオチドの取り込みが促進される。好ましくは、基はアミノ基である。そこを経てヌクレオチドが進入する細孔の末端は、ｃｉｓ末端であってもｔｒａｎｓ末端であってもよい。末端は、好ましくはｃｉｓ末端である。
【００９９】
共有結合は、アダプターが正しく配置されるよう設計してもよい。たとえば、アダプターが正しく配置されるよう、アダプターが細孔と共有結合する部位（例：アミノ酸）を設計してもよく、且つ／またはアダプターが正しく配置されるよう二官能性架橋剤を用いてもよい。
【０１００】
本発明の細孔は、アダプターの配置を促進するよう修飾される。上に論じるように、７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍においてグルタミンを有する。残基１３９および／またはその近傍におけるグルタミンは、アダプター上の水酸基などの化学基と水素結合により相互作用することができ、かつそれにより細孔の樽状構造またはチャネル内におけるアダプターの配置を促進する。細孔は、アダプターの配置を促進することを目的とした、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３などの他の配置における修飾も含む（上を参照）。
【０１０１】
最も好ましくは、細孔は修飾されて共有結合を促進し、且つアダプターの配置を促進する。このような実施形態においては、共有結合部位と、アダプターの配置を促進するために細孔が修飾される部位の間の空間的関係は、アダプターが正しい位置に保持されることを確実にするよう設計される。たとえばアダプターは、好ましくは１つのサブユニットにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３５と結合し、各サブユニットのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９によって形成される１つまたはそれ以上のグルタミンの環の近傍にそれを配置する。１つまたはそれ以上のグルタミンは、水素結合によりアダプターの配置を促進する。
【０１０２】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列であって、サブユニットが残基１１９、１２１または１３５にシステインを有するポリヌクレオチド配列も提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種は、上に論じたもののうちのいかなるものであってもよい。ポリヌクレオチド配列は、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３に示す配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３の配列の全配列に対し、ヌクレオチド同一性に基づき、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％相同である配列を含む。６００またはそれ以上、たとえば７００、７５０、８５０または９００またはそれ以上の長さの近接ヌクレオチドに対し、少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、９０％または９５％のヌクレオチドの同一性があってもよい（「硬い相同性」）。相同性は上述の方法によって算出してもよい。ポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重度に基づき、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３と異なる配列を含んでもよい。
【０１０３】
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的な方法を用いて誘導または複製することができる。染色体ＤＮＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどの細孔生成生物より抽出してもよい。細孔サブユニットをコードする遺伝子は、特異的なプライマーを包含するＰＣＲを用いて増幅することができる。次に、増幅された配列は、クローニングベクターなどの複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。ベクターを用いて、適合性のある宿主細胞内でポリヌクレオチドを複製してもよい。したがって、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、ベクターを適合性のある宿主細胞に導入し、さらにベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を発育させることにより生成してもよい。ベクターは、宿主細胞より回収してもよい。細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチドのクローニングに適した宿主細胞は、当技術分野において既知であり、且つ以下により詳細に記載される。
【０１０４】
細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、適切な発現ベクターにクローニングしてもよい。発現ベクターにおいては、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、典型的には宿主細胞によるコード配列の発現を提供できる対照配列と動作的に結合する。このような発現ベクターは、細孔サブユニットを発現させるために用いることができる。
【０１０５】
用語「動作的に結合」は、記載された成分がその意図した様式で機能することを許す関係にある近接を指す。コード配列に「動作的に結合した」対照配列は、対照配列に適合した条件下でコード配列の発現が達成されるよう結合する。同一または異なった細孔サブユニット配列の複数のコピーを、ベクターに導入してもよい。
【０１０６】
発現ベクターは、その後で適切な宿主細胞に導入することができる。したがって、細孔サブユニットは、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適合性のある細菌宿主細胞に導入し、さらに細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列の発現を引き起こす条件下で宿主細胞を発育させることにより生成してもよい。組換えにより発現した細孔サブユニットは、自己集合させて宿主細胞膜内の細孔としてもよい。代替的に、この様式で生成された組換え細孔を宿主細胞より取出し、さらに他の膜に挿入してもよい。少なくとも２つの異なるサブユニットを含む７量体細孔をプロディウスする場合、異なるサブユニットは上述の方法で異なる宿主細胞に別個に発現させ、宿主細胞より取出し、さらにウサギ細胞膜などの別の膜において集合させて細孔としてもよい。
【０１０７】
ベクターは、たとえば複製元、任意に前記ポリヌクレオチド配列の発現を目的としたプロモーターおよび任意にプロモーターのレギュレーターを具備したプラスミド、ウイルスまたはファージベクターとしてもよい。ベクターは１つまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、たとえばテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでもよい。プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、そのために発現ベクターが設計される宿主細胞と適合するように選択してもよい。典型的には、Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターが用いられる。
【０１０８】
宿主細胞は、典型的には細孔サブユニットを高レベルで発現する。細胞を形質転換するために用いられる発現ベクターと適合可能とするために、細孔サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞が選択されるであろう。宿主細胞は、典型的には細菌であり、且つ好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。λＤＥ３溶原を有するあらゆる細胞、たとえばＣ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３），Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現することができる。
【０１０９】
（本発明の細孔を生成する方法）
本発明は、本発明の細孔を生成する方法も提供する。方法は、細孔とヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを細孔と共有結合させることを含む。アダプターは、当技術分野において既知であるあらゆる方法を用いて、細孔と共有結合させることができる。
【０１１０】
上に論じられた細孔、アダプターおよび二官能性架橋剤のいずれも本方法において用いることができる。共有結合部位は、上に論じられた方法で選択される。
【０１１１】
アダプターは、典型的には、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤなどの二官能性架橋剤を含むアダプターを、システインなどの反応性アミノ酸を少なくとも１つ含む変異型α−ＨＬ細孔に添加することにより細孔と結合する。しかし、この方法には２つの欠点がある。第１は、時間の経過とともに酸化または溶液中の他の化学種との反応によって劣化する、システインなどのアミノ酸の反応性である。第２は、架橋剤と細孔の間で反応が起こるまでにかかる時間である。特に単一の細孔を用いる場合、これらの欠点によって困難がもたらされることがある。たとえば、単一のシステイン変位を含む単一のα−ＨＬ細孔を液状膜に挿入し、架橋剤を含むアダプターを電気生理学的チャンバーに添加する場合、１つがシステインと反応するまでアダプター分子は細孔に出入りする。システインが不活化すると、その後はどれだけ多くのアダプター分子が細孔に進入しても反応は認められないであろう。細孔中の反応性アミノ酸の不活化は、たとえば酸素の除去、還元剤（例：ジチオスレイトール、ＤＴＴ）などの安定化剤の添加、システインを化学的保護したのち使用前に活性化すること、または保存前のアダプターとの化学的結合などによる保存条件の改善によって、減少させることができる。
【０１１２】
好ましい実施形態においては、そこにアダプターが結合する細孔は保護的脱離基を含み、且つ本方法は細孔から脱離基を置換することを含む。保護的脱離基は、細孔中の１つまたはそれ以上の反応的アミノ酸を保護するために用いられる。保護的脱離基は、好ましくは細孔中の１つまたはそれ以上のシステイン残基を保護するために用いられる。保護的脱離基は、架橋剤を含みうる、アダプター上の反応性の基との反応によって置換される。
【０１１３】
より好ましい実施形態においては、細孔は、上述の変種におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１１９、１２１または１３５のような、１つまたはそれ以上の反応性システイン上の保護的脱離基を含み、且つ反応性−ＳＨ基を有する架橋剤を含むアダプターと反応する。架橋剤上の−ＳＨ基は、細孔と結合した保護的脱離基と置換し、且つそれと共有結合するアダプターを有する細孔が生成される。
【０１１４】
保護的脱離基を細孔中の１つまたはそれ以上の反応性アミノ酸と結合させること、およびアダプター上に反応性の基を有することによって、本発明の方法は、特に単一の細孔を用いる場合に大いに改善される。たとえば、反応性アダプター分子を、保護基を有する単一の細孔と結合させる場合、アダプター分子数は単一細孔数をはるかに上回る。その結果、反応性分子の一部が不活化されたとしても、少なくとも１つは反応性を維持し、細孔より保護的脱離基を置換する可能性がある。
【０１１５】
電気生理学的実験は極めて困難なことがあるので、実験の準備時間を制限し、且つそれによりデータ取得までの時間を最適化することが好ましい。したがって、二層挿入の前にアダプターを細孔に結合することが好ましい。これは電気生理学的実験の容易さを高めるばかりでなく、細孔の使用期限を向上させる。
【０１１６】
適切な保護的脱離基は当技術分野において既知である。例は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）および２，２’−ジチオジピリジンを含むが、これに限定されない。
【０１１７】
アダプターは、オリゴマー化して細孔を形成する前に、１つまたはそれ以上のサブユニットと結合させてもよい。大きなアダプター分子は、オリゴマー化の効率を低下させるか、または細孔の形成を完全に妨害することがある。しかし、この手法の利点は、電荷または質量の比較的大きな変化によって、単量体−アダプター化学種が未修飾単量体から容易に分離されることである。さらに、オリゴマー化の前に２つの化学種を分離することができるので、最終的なナノ細孔が共有結合したアダプターを含有する確率は高い。
【０１１８】
アダプターは、それらがオリゴマー化する際に、細孔の１つまたはそれ以上のサブユニットと結合させてもよい。これは、アダプターを装填された脂質小胞を用いて行う。この手法は、アダプターをサブユニットと離れた場所に配置することにより利益を受ける。さらに、オリゴマー化が起こる場合、細孔は小胞二重層によってアダプターより保護される。次に、装填された小胞は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル操作を実行して膜より小胞を抽出し、未反応のアダプターは全て除去する。
【０１１９】
アダプターは、オリゴマー化された細孔と結合させてもよい。細孔は、上に論じた標準的技術を用いて生成される。アダプターは、７量体が形成された後に付加される。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いるなどの最終的な生成の前、または直後に行うことができる。この実施形態は、標準的な細孔生成プロトコルに必要な変更が最も少なく、且つ生成する本発明の細孔の割合は高い。しかし、この実施形態を用いて生成される細孔の収率は予想よりはるかに低いことが試験により示されている。おそらくこれは、タンパク質サンプル中の界面活性剤を阻害するのに十分な量のアダプターが存在して、タンパク質の凝集を引き起こしたか、または疎水性架橋剤が存在する場合、おそらくは架橋剤が細孔のβ−樽状構造と会合し、且つ効率的な細孔の挿入を妨害したためと思われる。
【０１２０】
本方法は、細孔を用いたヌクレオチドの検出を可能とする位置において、アダプターが細孔と結合するか否か判定することも含む。これは、細孔を用いてヌクレオチドの有無を判定することができるか否かを判定することも包含する。これは、以下により詳しく記載する方法で行うことができる。ヌクレオチドの有無を判定できる場合、アダプターは正しい位置にあり、且つ本発明の細孔が生成されている。ヌクレオチドの有無を判定できない場合、アダプターは正しくない位置にある可能性があり、且つ本発明の細孔は生成されていない。
【０１２１】
（個別のヌクレオチドを同定する方法）
本発明は、個別のヌクレオチドを同定する方法も提供する。本方法は、ヌクレオチドが本発明の細孔と相互作用するよう、ヌクレオチドを細孔と接触させること、および相互作用時に細孔を通過する電流を測定すること、およびそれによりヌクレオチドの本性を判定することを含む。したがって、本発明は個別のヌクレオチドの確率的感知を包含する。本発明の細孔のいずれも用いることができる。
【０１２２】
ヌクレオチドに固有の様式で細孔内を電流が流れる場合（すなわち、ヌクレオチドと関連する特徴的な電流が細孔を流れるのが検出される場合）、ヌクレオチドが存在する。電流がヌクレオチドに特異的な様式で細孔内を流れない場合、ヌクレオチドは存在しない。
【０１２３】
本発明は、それらが細孔を流れる電流に与える異なる作用に基づき、類似した構造のヌクレオチドを識別するために用いることができる。個別のヌクレオチドは、細孔と相互作用する際に、電流の振幅より単一分子レベルで同定することができる。本発明は、特定のヌクレオチドがサンプル中に存在するか否か判定するために用いることもできる。本発明は、サンプル中の特定のヌクレオチドの濃度を測定するために用いることもできる。
【０１２４】
本方法は、本発明の細孔を膜に挿入することができる、あらゆる適切な膜／細孔系を用いて実施することができる。本方法は、典型的には（ｉ）本発明の細孔を含む人工膜、（ｉｉ）本発明の細孔を含む分離された天然産生膜、または（ｉｉｉ）本発明にしたがって修飾されている細孔を発現する細胞を用いて実施することができる。本方法は、好ましくは人工膜を用いて実施される。膜は、本発明の細孔に加えて、他の膜貫通および／または膜内タンパク質さらには他の分子を含んでもよい。
【０１２５】
膜は、イオン、ヌクレオチドおよび核酸の流れに対する障壁を形成する。好ましくは、膜は脂質二重層である。本発明にしたがって用いるのに適した脂質二重層は、本技術分野において既知の方法を用いて生成することができる。たとえば、脂質二重膜はＭｏｎｔａｌおよびＭｕｅｌｌｅｒ（１９７２）の方法を用いて形成することができる。脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３に記載の方法を用いて形成することもできる。
【０１２６】
本発明の方法は、リン脂質、糖脂質、コレステロールおよびその混合物を含むが、これに限定されない、あらゆる膜脂質より形成される脂質二重層を用いて実施してもよい。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３に記載のあらゆる脂質を用いてよい。
【０１２７】
細孔を脂質二重層などの膜に挿入することについては、方法は本技術分野において既知である。たとえば、脂質二重層に拡散し、さらに脂質二重層と結合し且つ機能的な状態に集合することにより挿入されるよう、精製された形態で脂質二重層を含む溶液に細孔を懸濁してもよい。代替的に、Ｍ．Ａ．Ｈｏｌｄｅｎ，Ｈ．Ｂａｙｌｅｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，６５０２−６５０３および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピック・ザ・プレイス」法を用いて、細孔を直接膜に挿入してもよい。
【０１２８】
本発明の方法は、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１２９】
（個別のヌクレオチド）
個別のヌクレオチドは、単一のヌクレオチドである。個別のヌクレオチドは、他のヌクレオチドまたは核酸と、ヌクレオチド結合により結合していないものである。ヌクレオチド結合は、他のヌクレオチドの糖基と結合しているヌクレオチドのリン酸基の１つを包含する。個別のヌクレオチドは、典型的には少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、または少なくとも５０００個のヌクレオチドの他の核酸配列とヌクレオチド結合によって結合していないものである。たとえば、個々のヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖などの標的ポリヌクレオチド配列より消化されている。
【０１３０】
本発明の方法を用いて、あらゆるヌクレオチドを判定することができる。ヌクレオチドは、天然産生または人工とすることができる。ヌクレオチドは、典型的には核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含む。核酸塩基は、典型的には複素環状である。適切な核酸塩基はプリン類およびピリミジン類を含み、またより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。典型的には、糖はペントース糖である。適切な糖はリボースおよびデオキシリボースを含むが、これに限定されない。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含む。
【０１３１】
適切な核酸は、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸、（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含むが、これに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰである。
【０１３２】
ヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸などの核酸配列の消化によって得ることができる。核酸配列は、当技術分野において既知であるあらゆる方法を用いて消化することができる。適切な方法は酵素または触媒を用いるものを含むが、これに限定されない。核酸の触媒的消化は、Ｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００２；４１：６６９−６７７に開示される。
【０１３３】
単独の核酸配列に由来する個別のヌクレオチドは、核酸の全体または一部の配列を決定するために、連続的な様式で細孔と接触させてもよい。本発明の第２の実施形態にしたがった核酸配列の決定は、以下により詳細に論じる。
【０１３４】
典型的には、ヌクレオチドが核酸配列の消化に由来する場合のように、ヌクレオチドは未修飾である。ヌクレオチドは、代替的に修飾されていても損傷されていてもよい。ヌクレオチドは、典型的にはメチル化または酸化される。ヌクレオチドは、判別ラベルでラベリングしてもよい。判別ラベルは、ヌクレオチドが検出されることを可能とするあらゆる適切なラベルとしてよい。適切なラベルは蛍光分子、たとえば１２５Ｉ、３５Ｓなどの放射性同位元素およびビオチンなどのリンカーを含む。
【０１３５】
ヌクレオチドは、典型的にはあらゆる適切な生物学的サンプル中に存在する。適切な生物学的サンプルは、上に論じられる。
【０１３６】
（細孔とヌクレオチドの相互作用）
ヌクレオチドは、膜のいずれかの側で細孔と接触させてもよい。ヌクレオチドは、膜のいずれの側で細孔に導入してもよい。ヌクレオチドは、ヌクレオチドが細孔を経て膜の反対側に通過することを可能とする膜の面と接触させてもよい。たとえば、ヌクレオチドが細孔を通過しうるよう、その生来の環境によって、イオンまたはヌクレオチドなどの小分子が細孔の樽状構造またはチャネルに進入することを可能とする、細孔の一方の末端にヌクレオチドを接触させる。このような場合、ヌクレオチドは、細孔の樽状構造またはチャネルを経て膜を横断するにつれて、細孔および／またはアダプターと相互作用する。代替的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがアダプターを経て、またはこれとともに細孔と相互作用し、細孔と解離し、且つ膜の同じ側に留まることを可能とする膜の面と接触させてもよい。本発明は、そこにおいてアダプターの位置が固定される細孔を提供する。結果として、ヌクレオチドは、好ましくはアダプターがヌクレオチドと相互作用することを可能とする細孔の末端と接触する。
【０１３７】
ヌクレオチドは、あらゆる方式且つあらゆる部位で細孔と相互作用しうる。上に論じたように、ヌクレオチドは、好ましくはアダプターを介して、またはこれと共に、可逆的に細孔と結合する。ヌクレオチドは、最も好ましくは、細孔を経て膜を横断するにつれて、アダプターを介して、またはこれと共に可逆的に細孔と結合する。またヌクレオチドは、細孔をへて膜を横断するにつれて、アダプターを介して、またはこれと共に、細孔の樽状構造またはチャネルとも可逆的に結合することができる。
【０１３８】
ヌクレオチドは、ヌクレオチドと細孔の相互作用の際、そのヌクレオチドに特異的な様式で細孔内を流れる電流に影響する。たとえば、特定のヌクレオチドは、特定の平均時間の間且つ特定の程度、細孔を流れる電流を減少させるであろう。換言すれば、細孔を流れる電流は特定のヌクレオチドに特徴的である。対照実験を実施して、特定のヌクレオチドが細孔内を流れる電流に有する影響を判定してもよい。その後、サンプル中の特定のヌクレオチドを同定、または特定のヌクレオチドがサンプル中に存在するか判定するために、試験サンプルに対して本発明の方法を実施した結果を、このような対象試験より導かれたものと比較することができる。細孔を流れる電流が特定のヌクレオチドを指示する様式で影響される頻度は、サンプル中のそのヌクレオチドの濃度を判定するために用いることができる。サンプル中の異なるヌクレオチドの比率も、算出することができる。たとえば、ｄＣＭＰとメチル−ｄＣＭＰの比率を産出することができる。
【０１３９】
（機器）
本方法は、本発明の細孔が膜に挿入される膜／細孔系を検討するのに適したあらゆる機器を用いて、実施することができる。本方法は、確率的感知に適したあらゆる装置を用いて実施することができる。たとえば、装置は水溶液およびチャンバーを２つの区画に分ける障壁を含むチャンバーを含む。障壁は、細孔を含む膜が形成される開口を有する。ヌクレオチドは、ヌクレオチドをチャンバーに導入することにより、細孔と接触させることができる。ヌクレオチドは、チャンバーの２区画のうちいずれかに導入することができる。
【０１４０】
本方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２に記載の機器を用いて実施することもできる。
【０１４１】
本発明の方法は、ヌクレオチドとの相互作用時に細孔を流れる電流を測定することを包含する。したがって、機器は電位を印加し、且つ膜および細孔を横切る電気的シグナルを測定することのできる電気回路も含む。本方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いて実施することができる。方法は、好ましくは電圧クランプの使用を包含する。
【０１４２】
（サンプル）
ヌクレオチドはあらゆる適切なサンプル中に存在する。本発明は、典型的にはヌクレオチドを含有することが既知である、または含有することが疑われるサンプルに対して実施される。本発明は、その本性が不明である１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含有するサンプルに対して実施してもよい。代替的に、本発明は、サンプル中のその存在が既知であるかまたは予測される１つまたはそれ以上のヌクレオチドの本性を確認するために、サンプルに対して実施してもよい。
【０１４３】
サンプルは、生物学的サンプルであってもよい。本発明は、あらゆる生物または微生物より得られるか、または抽出されるサンプルに対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよい。生物または微生物は、典型的には原核性または真核性であり、且つ典型的には５つの界：植物、動物、真菌、細菌、原生生物のうち１つに属する。本発明は、あらゆるウイルスより得られるか、または抽出されるサンプルに対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよい。サンプルは、好ましくは液状サンプルである。サンプルは、典型的には患者の体液を含む。サンプルは尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってもよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。サンプルは、典型的にはヒト由来であるが、代替的にウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの他の哺乳類由来であってもよく、または代替的にネコまたはイヌなどのペットであってもよい。
【０１４４】
サンプルは、非生物学的サンプルであってもよい。非生物学的サンプルは、好ましくは液状サンプルである。非生物学的サンプルの例は、外科用液状物、飲用水などの水、海水または河川水、および臨床検査用の試薬を含む。
【０１４５】
サンプルは、典型的にはたとえば遠心分離または望ましくない分子または赤血球などの細胞を濾取する膜の通過によって、分析される前に処理される。サンプルは、採取時に速やかに測定してもよい。またサンプルは、典型的には分析前に、好ましくは−７０℃未満で保存してもよい。
【０１４６】
（条件）
本発明の方法は、ヌクレオチドとの相互作用時に細孔を流れる電流を測定することを包含する。膜貫通タンパク質細孔を通過するイオン電流を測定するための適切な条件は、当技術分野において既知であり、且つ実施例において開示される。方法は、膜および細孔を横断して印加される電圧によって実施される。用いられる電圧は、典型的には−４００ｍＶから４００ｍＶである。使用する電圧は、好ましくは−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限、および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限を有する範囲内にある。使用する電圧は、より好ましくは１２０ｍＶから１７０ｍＶの範囲にある。上昇した印加電位を用いることにより、本発明の細孔による異なるヌクレオチドの間の識別を高めることが可能である。
【０１４７】
本方法は、典型的にはあらゆる塩化アルカリ金属塩の存在下で実施される。上に論じた典型的な機器においては、塩はチャンバー内の水溶液に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が典型的に用いられる。ＫＣｌが好ましい。塩濃度は、典型的には０．１から２．５Ｍ、０．３から１．９Ｍ、０．５から１．８Ｍ、０．７から１．７Ｍ、０．９から１．６Ｍまたは１Ｍから１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは１５０から５００ｍＭである。高い塩濃度は、高い信号雑音比を提供し、正常な電流変動のバックグラウンドに対して、同定すべきヌクレオチドの存在を指示する電流が見込まれる。核酸配列を決定する場合などのように、酵素の存在下でヌクレオチド検出が実施される場合、より低い塩濃度を用いなければならない。これについては以下でより詳しく議論する。
【０１４８】
本方法は、典型的には緩衝剤の存在下で実施される。上に論じた典型的な機器においては、緩衝剤はチャンバー内の水溶液に存在する。本発明の方法においては、あらゆる緩衝剤を使用することができる。適切な緩衝剤１つは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤である。本方法は、典型的には４．０から１０．０、４．５から９．５、５．０から９．０、５．５から８．８、６．０から８．７または７．０から８．８または７．５から８．５のｐＨで実施される。使用されるｐＨは、好ましくは約７．５である。
【０１４９】
本方法は、典型的には０℃から１００℃、１５℃から９５℃、１６℃から９０℃、１７℃から８５℃、１８℃から８０℃、１９℃から７０℃、または２０℃から６０℃で実施される。本方法は室温で実施してもよい。本方法は、好ましくは約３７℃などの酵素機能を支持する温度で実施する。温度が上昇している場合、低い塩濃度で良好なヌクレオチド識別を達成することができる。
【０１５０】
（核酸配列を決定する方法）
本発明は、標的ヌクレオチド配列を決定する方法も提供する。１つの実施形態においては、本方法は（ａ）エキソヌクレアーゼを用いて標的配列の一方の末端より個別のヌクレオチドを消化すること；（ｂ）ヌクレオチドが細孔と相互作用するようヌクレオチドを本発明の細孔と接触させること；（ｃ）相互作用時に細孔を通過する電流を測定し、またそれによりヌクレオチドの本性を判定すること；および（ｄ）標的配列の同じ末端で手順（ａ）から（ｃ）を繰り返し、またそれにより標的配列を配列決定することを含む。したがって本方法は、核酸の配列を決定するための連続的な様式による、核酸配列の各単一ヌクレオチドの確率的感知を包含する。本方法の手順（ｂ）および（ｃ）は、全般的に、上に論じたヌクレオチドを同定する方法において実施される手順と同一である。
【０１５１】
本発明の細孔は、これらの方法に特に適している。核酸の配列を効率的に決定するためには、核酸中の各ヌクレオチドが連続的な様式で同定されることを確実にすることが重要である。本発明の細孔内でアダプターが固定されているという性質は、連続した各ヌクレオチドが細孔と相互作用すれば、常に特徴的な電流が細孔内を流れることを意味している。
【０１５２】
この方法を用いて、標的ヌクレオチドの配列全体または一部のみを決定してもよい。核酸配列は、あらゆる長さとすることができる。たとえば、核酸配列は少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも４００個または少なくとも５００個のヌクレオチドの長さとすることができる。核酸は天然産生または人工とすることができる。たとえば、本方法は、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を確認するために用いてもよい。本方法は、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１５３】
ヌクレオチドを検出することに関する、および具体的には使用してもよい細孔、膜、機器および条件に関する上記のすべての議論は、同等にこれらの方法に適用することができる。典型的には、核酸は上に論じるところのあらゆる生物学的サンプル中に存在する。
【０１５４】
（エキソヌクレアーゼ）
１つの実施形態においては、標的核酸配列を配列決定する方法は、標的配列をデオキシリボヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼと接触させ、核酸の一方の末端より個別のヌクレオチドを遊離させることを包含する。エキソヌクレアーゼは、典型的には核酸の一方の末端に掛合し、且つ配列のその末端より一度に１つのヌクレオチドを消化する。エキソヌクレアーゼは核酸を５’から３’方向、または３’から５’方向に消化することができる。そこにエキソヌクレアーゼが結合する核酸の末端は、典型的には使用する酵素の選択および／または当技術分野において既知である使用する方法によって決定される。核酸配列のいずれかの末端における水酸基またはキャップ構造は、典型的にはエキソヌクレアーゼが核酸配列の特定の末端に結合することを妨害または促進するために用いうる。
【０１５５】
本方法においては、あらゆるエキソヌクレアーゼ酵素を使用することができる。本方法において用いるための好ましい酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するエキソヌクレアーゼＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）およびその変種を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の３つの同一のサブユニットが相互作用し、３量体エキソヌクレアーゼを形成する。変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１８または２０のそれと異なるアミノ酸配列を有し、且つエキソヌクレアーゼ活性を保持するポリペプチドである。変種は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変種について上に論じたのと同じ様式かつ同じ程度で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１８または２０と異なりうる。変種は、好ましくは核酸との結合および核酸の消化を担当するドメイン（酵素的ドメイン）を含む。変種は、好ましくは必要に応じて酵素活性速度が増加または減少しており、且つ／または野生型酵素と比較してより高い塩耐性を有する。エキソヌクレアーゼは、細孔の生成について上に論じた方法のいずれかを用いて生成してもよい。
【０１５６】
本方法は、上に論じたように、個別のヌクレオチドがそれぞれ同定できるような速度でヌクレオチドが核酸の末端より消化されるよう、核酸配列をエキソヌクレアーゼと接触させることを包含する。これを行う方法は当技術分野において周知である。たとえば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて同定できるように、ポリペプチドの末端より単一アミノ酸を連続的に消化するために、エドマン分解が用いられる。本発明においては、相同的な方法を用いてもよい。
【０１５７】
エキソヌクレアーゼは、好ましくは細孔と共有結合する。エキソヌクレアーゼを細孔と共有結合させるための方法は、当技術分野において周知である。本方法は、好ましくは米国特許出願第６１／０７８，６９５号からの優先権を主張し且つ本出願と同時に出願された国際同時継続出願［Ｊ Ａ Ｋｅｍｐ ＆ Ｃｏ Ｒｅｆ：Ｎ．１０４４０４Ａ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｌａｂｓ Ｒｅｆ：ＯＮＬ ＩＰ ００５］に記載されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種およびエキソヌクレアーゼを含む１つまたはそれ以上の構造体を含む細孔の使用を包含する。本方法が同時継続出願に開示された構造体を含む細孔の使用を包含する場合、標的核酸配列は、典型的には酵素が細孔と結合する膜の面と接触する。
【０１５８】
エキソヌクレアーゼが機能する速度は、典型的には野生型エキソヌクレアーゼの最適速度よりも低い。配列決定方法におけるエキソヌクレアーゼ活性の適切な速度は、０．５から１０００ヌクレオチド／秒、０．６から５００ヌクレオチド／秒、０．７から２００ヌクレオチド／秒、０．８から１００ヌクレオチド／秒、０．９から５０ヌクレオチド／秒または１から２０または１０ヌクレオチド／秒の消化を包含する。好ましくは、速度は１、１０、１００、５００または１０００ヌクレオチド／秒である。好ましいエキソヌクレアーゼ活性の速度は、多様な方法で達成することができる。たとえば、本発明にしたがって、最適活性速度が低下した変種エキソヌクレアーゼを用いてもよい。
【０１５９】
エキソヌクレアーゼの活性は、典型的にはｐＨが減少するにしたがってその活性が低下するようなｐＨ依存性である。したがって、第２の実施形態の方法は、典型的には７．５から８．０または７．７から８．０のｐＨで実施される。使用するｐＨは、好ましくは約７．５である。
【０１６０】
エキソヌクレアーゼの活性は、典型的にはマグネシウムのような特定の金属イオンの存在に依存する。したがって、エキソヌクレアーゼ酵素の活性の適切な速度は、マグネシウムイオンの濃度を低下させるか、またはマグネシウムイオンをマンガンイオンなどの異なる金属イオンと置換することによって達成される。
【０１６１】
エキソヌクレアーゼ活性の速度は、典型的には塩濃度が上昇するにつれて低下する。エキソヌクレアーゼは、高い塩コンサーントレーションにおいては作用しないであろう。本発明の細孔は、低い塩コンサーントレーションでヌクレオチドを識別することができる。配列決定法は、典型的には０．１５から０．８Ｍ（１５０ｍＭから８００ｍＭ）の塩濃度を用いて実施される。これらの低塩濃度における良好なヌクレオチド識別は、３０℃から４０℃などの室温を上回る温度、且つ好ましくは約３７℃において本方法を実施することにより達成される。
【０１６２】
酵素活性に適した条件を維持する一方で溶液のコンダクタンスを高めるために、溶液の濃度を高めることに加えて、用いることのできる他の戦略は数多くある。そのような戦略の１つは、酵素側の塩の低塩濃度および反対側のより高い濃度の異なる２つの濃度の塩溶液を分割するために、脂質二重層を用いることである。この手法の１例は、膜のｃｉｓ側に２００ｍＭ ＫＣｌを、ｔｒａｎｓチャンバーに５００ｍＭ ＫＣｌを用いることである。これらの条件においては、通常の条件下での細孔を経たコンダクタンスは４００ｍＭ ＫＣｌとほぼ同等と予想され、且つｃｉｓ側に配置した場合、酵素は２００ｍＭのみを経験する。非対称的塩条件を用いることのもう１つの可能な利点は、細孔にまたがって誘導される浸透圧勾配である。この水の正味の流動を用いて、ヌクレオチドを細孔内に引き入れて検出することが可能であろう。ショ糖、グリセロールまたはＰＥＧなどの中性オスモライトを用いて、同様の効果を達成することができる。もう１つの可能性は、ＫＣｌレベルが比較的低い溶液を用い、且つ酵素活性に対する妨害性の低いもう１つの電荷坦持化学種に依拠することである。
【０１６３】
（キット）
本発明は、本発明の細孔を生成するためのキットも提供する。キットは、それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬ細孔のサブユニットをコードする、７つのポリヌクレオチドを含む。７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９にグルタミンを有する。サブユニットのうち少なくとも１つ、好ましくは１つのみが残基１１９、１２１または１３５にシステインを有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９にグルタミンを有するサブユニットをコードする好ましいポリヌクレオチドを、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、９、１１および１３に示す。残基１１９，１２１または１３５にシステインを有するサブユニットをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１および１３に示すもののうちいずれかであってもよい。
【０１６４】
キットは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列を含む６つのポリヌクレオチド、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３に示す配列を含む１つのポリヌクレオチドを含む。キットは、最も好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列を含む６つのポリヌクレオチドおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示す配列を含む１つのポリヌクレオチドを含む。
【０１６５】
本発明は、標的ヌクレオチド配列を決定する方法を実施するために用いうるキットも提供する。したがって、キットはヌクレオチド配列の決定に適している。キットは、本発明の細孔およびエキソヌクレアーゼを含む。
【０１６６】
本発明のキットは、さらに上述の実施形態のいずれかを実施可能とする他の試薬または器具を１つまたはそれ以上含んでもよい。このような試薬または器具は、以下に挙げるもののうち１つまたはそれ以上を含む：適切な緩衝剤（水溶液）、対象よりサンプルを採取する手段（容器または針を含む器具など）、ポリヌクレオチド配列を増幅および／または発現するための手段、上に定義するような膜または電圧またはパッチクランプ機器。試薬は、液状サンプルで試薬を再懸濁するよう、乾燥した状態でキットに存在してもよい。キットは、任意に、本発明の方法でキットを用いることができるようにする指示書、またはどの患者に本方法を用いうるかについての詳細も含んでよい。キットは、任意にヌクレオチドを含んでもよい。
【０１６７】
以下の実施例は本発明を例示する：
【実施例】
【０１６８】
（１．材料と方法）
（１．１ 薬品類）
入手した試薬は以下のとおりである：１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）；ペンタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ヘキサデカン（９９＋％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−β−シクロデキストリン．７ＨＣｌ（ａｍ７−βＣＤ、＞９９％、ＣＹＣＬＯＬＡＢ，ハンガリー、ブダペスト）；２’−デオキシグアノシン５’−一リン酸ナトリウム塩（９９％、Ａｃｒｏｓ）；２’−デオキシシトシン５’−一リン酸二ナトリウム塩（＞９５％、Ｆｌｕｋａ）；２’−デオキシチミジン５’−一リン酸二ナトリウム塩（＞９７％， Ｆｌｕｋａ）；２’−デオキシアデノシン５’−一リン酸二ナトリウム塩（＞９５％、Ｆｌｕｋａ）；ウリジン５’−一リン酸二ナトリウム塩（９９％、Ｆｌｕｋａ）；シトシン５’−一リン酸（遊離酸＞９８％、Ｆｌｕｋａ）；アデノシン５’−一リン酸（遊離酸９９％、Ａｃｒｏｓ）；グアノシン５’−一リン酸二ナトリウム塩（９７％、Ａｃｒｏｓ）；５−メチルシトシン（ＵＳＢ Ｅｕｒｏｐｅ），Ｔｒｉｚｍａ塩基（９９．９％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；濃塩酸（分析試薬等級、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；および塩化カリウム（９９％、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０１６９】
（１．２ 反応性シクロデキストリンの合成）
この作業に用いられるヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤおよびａｍＰＤＰ１−βＣＤの構造を図１に示す。ａｍ６−ａｍＰＤＰ１−βＣＤは以下のように合成した：ヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−β−シクロデキストリン．７ＨＣｌ（ａｍ７βＣＤ、６０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を脱イオン水（２．５ｍＬ）に溶解した。次に、これをエタノール（２．５ｍＬ）に溶解した３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＰＤＰ、３．１３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）に加えた。生成した溶液を室温で２４時間攪拌した。次に、溶媒を除去して生成物の混合物；未修飾シクロデキストリン（ａｍ７βＣＤ）、所望の一置換誘導体（ａｍ６−ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）および少量の多置換シクロデキストリン（例：ａｍ５−ａｍＰＤＰ２−βＣＤ）を得た。生成物混合物を直接、または逆相分取ＨＰＬＣにより精製した一置換生成物を電気生理学的実験に使用することができる。
【０１７０】
（１．３ 共有結合のためのアダプターの設計）
この作業において用いる親和性の高いアダプターａｍ７−βＣＤは、一次ヒドロキシル面上で、各糖環に１つずつ７つの１級アミンを含む。これらの荷電基の存在は、塩基検出において決定的であることが知られている（以下を参照）。塩基検出のための所望の化合物は、細孔と結合するための単一の反応部位を有し、且つ塩基検出にとって必要な一級アミンも含有しなければならない。
【０１７１】
この作業においては、二官能性架橋剤３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸サクシンイミジル（ＳＰＤＰ）を用いて、遺伝子操作によってα−ＨＬタンパク質細孔に導入したシステイン残基とａｍ７−βＣＤを結合させた。この架橋剤を、７つの１級アミンを含むシクロデキストリン分子（ａｍ７−βＣＤ）と反応させた。１つの架橋剤分子のみが単一のアミノシクロデキストリンと結合して、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤアダプターを合成する最終化学種の形成を促進するよう、各化学種の濃度を選択した。
【０１７２】
（１．４ α−ＨＬ変異体の構造）
ＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）およびＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）構造体は、ｐＴ７−ＳＣ１発現ベクターにおいて集合し（Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｍａｌｇｈａｎｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｈｏｂａｕｇｈ，Ｍ．，Ｇｏｕａｕｘ，Ｊ．Ｅ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，（１９９７），１０（１２），１４３３−１４４３）、且つα−ＨＬインサート全体のＤＮＡ配列決定によって確認された。変異体をコードする遺伝子は、他の文献に記載されているように、ＰＣＲ変異誘発およびライゲーションフリーｉｎ ｖｉｖｏ組み換えによって生成した（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｈ．（１９９５）ＰＣＲ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｉｎ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． Ｉｎ： Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃ．Ｗ．Ｄ．ａ．Ｇ．Ｓ．（ｅｄ）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＨｏｗｏｒｋａ，Ｓ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９８），２５（５），７６４−７６６，７６８，７７０の諸所）。
【０１７３】
（１．５ 共役ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳（ＩＶＴＴ））
タンパク質は、環状ＤＮＡのためのＥ．ｃｏｌｉ Ｔ７−Ｓ３０抽出系を用いることによる共役ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳（ＩＶＴＴ）によって生成した（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｎｏ．Ｌ１１３０）。キットに提供された、システインを除いた完全アミノ酸混合物（１ｍＭ）とメチオニンを除いた完全アミノ酸混合物（１ｍＭ）を等体積で混合し、高濃度のタンパク質を得るために必要とされる作業用アミノ酸溶液を得た。アミノ酸（５．０μＬ）をプレミックス溶液（２０μＬ）、［３５Ｓ］Ｌ−メチオニン（１μＬ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ｎｏ．５１００１Ｈ，１１７５Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＣｉ／ｍＬ），リファンピシン（１μＬ，０．８ｍｇ／ｍＬ），プラスミドＤＮＡ（８μＬ，４００ｎｇ／μＬ）およびＴ７ Ｓ３０抽出物（１５μＬ）（Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｍａｌｇｈａｎｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｈｏｂａｕｇｈ，Ｍ．，Ｇｏｕａｕｘ，Ｊ．Ｅ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，（１９９７），１０（１２），１４３３−１４４３）と混合した。３７℃で１．５時間合成を実施し、放射能標識ＩＶＴＴタンパク質５０μＬを生成した。
【０１７４】
（１．６ 電気生理学的分析のためのヘテロオリゴマーの生成）
上述のように、ＩＶＴＴによりタンパク質ＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ（１００μＬ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８（２５μＬ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を生成した。ＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の「Ｄ８テール」の負の荷電は、集合した細孔の電気泳動移動度を変化させてヘテロ７量体の分離を可能とすることが予測された。
【０１７５】
タンパク質サンプルを２５，０００ｇで１０分間遠心分離してＩＶＴＴ反応物の不溶性デブリを分離した。２つの上清をウサギ赤血球細胞膜（１０μＬ、２．５ｍｇタンパク質／ｍＬ）と混合し、ＤＴＴを添加して最終濃度を２ｍＭとし、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を２５，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＭＢＳＡ（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン含有）２００μＬに膜ペレットを再懸濁し、再度２５，０００ｇで１０分間遠心分離することにより洗浄した。上清を廃棄した後、膜ペレットを１×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液７５μＬに溶解した。
【０１７６】
サンプル全体を５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの単一ウェルに装填し、５０Ｖで約１８時間電気泳動した。次に、ゲルをＷｈａｔｍａｎ３ｍｍろ紙上で５０℃において約３時間真空乾燥し、さらにＸ線フィルムに２時間露光した。ＨＬ−Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８タンパク質の“Ｄ８テール”（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の負の荷電は、集合した細孔の電気泳動移動度を変化させてヘテロ７量体の分離を可能とする（Ｈｏｗｏｒｋａ，Ｓ．，およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９８），２５（５），７６４−７６６，７６８，７７０の各所）。オートラジオグラムをテンプレートとして用い、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌｌ３５Ｃ−Ｄ８）１を含むオリゴマーバンドをゲルより切り取った。次に、２ｍＭ ＤＴＴを含有するＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３００μＬでゲルスライスを再水和した。Ｗｈａｔｍａｎ濾紙スライスを除去した後、滅菌乳棒でゲル片を粉砕した。オリゴマータンパク質を、０．２μｍ酢酸セルローススピンフィルター（カタログ番号７０１６−０２４、マイクロ遠心管、Ｒａｉｎｉｎ）を経て２５，０００ｇで３０分間遠心分離することにより、ゲルデブリより分離した。濾液を分取して−８０℃で保存した。
【０１７７】
（１．７ 単一チャネル記録）
学術文献ですでに公開されている標準的な方法を用いて、単一チャネル記録を得た。簡単に言うと、平面二重層チャンバーをｃｉｓおよびｔｒａｎｓの２つのコンパートメントに分割するテフロンフィルム（厚さ２５μｍ、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、ペンシルベニア州Ｍａｌｖｅｍ）における直径６０〜１５０μｍの開口部上に、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の二重層を形成した。両コンパートメントとも緩衝液１ｍＬを収容した。特に言及しない限り、ヘモリシン変異体およびｄＮＭＰ（またはｒＮＭＰ）の両者を、アースに接続したｃｉｓコンパートメントに添加した。ａｍ７−βＣＤまたはａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤを、増幅器のヘッドステージに接続したｔｒａｎｓコンパートメントに添加した。特に言及しない限り、ｄＮＭＰを用いた実験は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ８００ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．５において２２℃で実施した。ヌクレオチド保存液は、毎日用時分取した。
【０１７８】
（１．８ データの分析および取得）
単一チャネル記録は、パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ；Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）によって取得され、ビルトイン４極ベッセルフィルターにより１０ｋＨｚで低フィルタリングされ、さらに、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ Ａ／Ｄコンバーター（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を搭載しＣｌａｍｐＥｘ１０ソフトウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を実行するＰＣにより、２０ｋＨｚでサンプリングされた。
【０１７９】
以下の手順を用いてイベントヒストグラムを構築した：
１）生データに２つの隣接ＷＴポイントウィンドウを通過させた（サンプリングレート２０ｋＨｚ、１０ｋＨｚベッセルフィルタリング）。
２）ウィンドウ間のＴ−統計（２つの母集団の統計的な差の測定）を各時点で算出した。
３）所与の閾値ＴＴを上回るＴ−統計におけるＰＴ幅のピークを検出することによりステップを特定した。
４）ステップ間のデータを平均して平均電流およびイベント持続時間を算出した。
５）平均イベント電流のヒストグラムをプロットした。前のイベントの平均値が設定値ＬＣＤとＵＣＤの間にあり、且つ持続時間がＮデータポイントよりも大きい場合、１つのイベントは「限度内にある」と定義した。
【０１８０】
４−ヌクレオシド一リン酸ヒストグラムを生成するイベント検出のための典型的な数値は、ＷＴ＝８、ＰＴ＝３、Ｆｔ＝２０、ＴＴ＝８であり、ＬＣＤおよびＵＣＤがシクロデキストリンレベルの限度に対応していた。
【０１８１】
適切な初期パラメータで開始する反復平均、標準偏差および適切なピーク数についての振幅フィッティングにより、イベントヒストグラム上でマルチプルガウスフィッティングを実施した。
【０１８２】
ガウス分布の重なりは、２つの隣接するフィッティングピークの積をピーク面積の合計に対して正規化することにより算出した。重なりの範囲は０（重なりなし）から０．５（同一の分布）とした。始めに各ガウス分布をその面積で割ることにより、正規化した重なりを算出した。
【０１８３】
（２．結果）
（２．１ Ｎ１３９Ｑ位の重要性）
２つの異なる変異体を比較した。第１は、ＲＬ２バックグラウンドにおけるＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７変異体である。換言すれば、第１の変異体はＲＬ２構造体より出発して生成された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す７つのサブユニットを含有した。
【０１８４】
ＲＬ２は、膜貫通β−樽状構造をコードする配列のカセット変異導入を可能とするよう設計された、半合成遺伝子の生成物である（Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｌｕ，Ｘ．，Ｃｏｎｌａｎ，Ｓ．およびＢａｙｌｅｙ，Ｈ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．８，１２５７−１２６７）。コード化されたポリペプチド配列に、６つのサイレント制限部位および５つの変換アミノ酸を含む（Ｋ８Ａ、Ｖ１２４Ｌ、Ｇ１３０Ｓ、Ｎ１３９ＱおよびＩ１４２Ｌ）。Ｄ８ＲＬ２は、オクタアスパラギン酸テールを有するＲＬ２である。Ｋ８Ａを例外として、すべての変化はタンパク質の挙動に対して有する影響を最小限とするためになされ、その例は；バリンからロイシンおよびアスパラギンからグルタミンへの変異（付加メチレン基の導入）、およびイソロイシンからロイシンへの変異（メチレン基の部位の変動）である。
【０１８５】
第２は、野生型ＨＬに基づくＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７変異体である。換言すれば、第２の変異体は野生型α−ＨＬ構造体より生成し、かつＲＬ２の５つの変異アミノ酸を含有しない。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す７つのサブユニットを含有した。
【０１８６】
２つの変異体より非常に異なる結果が得られた。両変異体で、ａｍ７−βＣＤを用いたアダプター結合イベントが認められ、またｄＮＭＰイベントが規則的に認められたが、ｄＮＭＰの結合は極めて異なっていた（図２および３）。
【０１８７】
２つの変異体の間の明らかな違いの１つは電流遮断の振幅であり；ＲＬ２による変異を用いると、ｄＮＭＰ結合が生成した場合の残留電流は２３〜３３ｐＡであり、また塩基の分布は４つのすべての塩基を識別するのに十分である。しかし、野生型変異体においては、残留電流の振幅は４５〜５０ｐＡであり、またヒストグラムに特性が認められるにもかかわらず、ｄＮＭＰ識別は不良であった。
【０１８８】
野生型ベースのＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７変異体とＲＬ２ベースのＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）７の間のバックグラウンドの差は、ＲＬ２バックグラウンドに存在する追加的な変異によると考えられた。これらの変異のうち、Ｎ１３９Ｑは２つの変異体の間の差を引き起こす可能性が最も高いと思われた。Ｋ８Ａ残基はタンパク質のｃａｐ領域に位置し、ｄＮＭＰ認識に干渉する可能性は低いが、Ｖ１２７Ｌ、Ｉ１４２ＬおよびＧ１３０Ｓ変異はβ−樽状構造の外面にあり、ほとんど影響がないと考えられる（図４）。
【０１８９】
塩基結合に対するＮ１３９Ｑ変異の影響を検討するため、野生型バックグラウンドに、ｄＮＭＰ検出に必要なアルギニンと共に当該変異を組み入れ、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）７タンパク質を得た。このタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示された７つのサブユニットを含有した。同様の条件の下で、上に論じたＲＬ２ベースの構造体と比較した（図５）。
【０１９０】
このデータより、Ｎ１３９Ｑ変異は、これまで認識されていなかった効果である塩基検出にとって必要であることが明確である。
【０１９１】
（２．２ 提唱されたａｍ７−βＣＤの配置）
我々は、シクロデキストリンが１３９位近傍のβ−樽状構造内の低い位置にあり、グルタミン基によって安定化されていると仮定した（図６）。Ｎ１３９Ｑ変異の重要性を認識することは、塩基識別の機構を理解し、且つ向上され且つ連続的な塩基検出を目的として改善された構造体を設計するための鍵である。
【０１９２】
この仮説を検証するために、一連の変異体を設計および生成し、β−樽状構造内の広い位置範囲で反応性ａｍ７−βＣＤと結合させた。一方が反応性システインを有しもう一方がシステイン基を欠く、異なる２種類の単量体ユニットを生成することにより、ヘテロ７量体が形成された。単量体を混合し、オリゴマー化して７量体タンパク質細孔とした。次に、これらを化学量論により分離して、あらゆる７量体タンパク質細孔にただ１つのシステイン修飾単量体ユニットが存在することを確実にし、結合部位の正確な制御が可能となるようにした。
【０１９３】
２セットの変異体を設計した；一方は結合したアダプターがβ−樽状構造の上部付近に配置されるよう設定する一方で、第２のセットはＮ１３９Ｑ位の近傍にアダプターが配置されるよう設計された（以下の表２および図７）。
【０１９４】
【表２】
【０１９５】
一部の変異体はＭ１１３ＲまたはＮ１３９Ｑ変異を有する６つの単量体のみを含むが、挙動の差は最小であると予想されることに留意すべきである。
【０１９６】
（２．３ ａｍ７−βＣＤの共有結合）
反応性ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤは、幅広い実験条件の下で多数の変異体と良好に結合した。反応は、印加電位の極性または強度を変化させても除去することのできない、残留細孔電流の恒久的な低下によって特徴付けられる（図８）。この反応の更なる検証は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の付加を経てアダプターをタンパク質細孔と結合させるジスルフィド結合を低下させることである。
【０１９７】
反応の前に多数の異なるシクロデキストリン状態が認められることは共通しているが、一旦反応したならば、電流レベルは比較的一定した値に留まることに留意しなければならない。さらに、共有結合したシクロデキストリンのレベルは、未反応シクロデキストリンレベルに対してしばしば異なる強度を示す。
【０１９８】
（２．４ 高い位置での結合−残基１１５から１２１）
シクロデキストリンの位置がβ−樽状構造の上部付近となるのを促進するために、シクロデキストリンについては高い位置での結合を選択した。選択したすべての位置はアミノ末端により近く、側鎖はβ−樽状構造の内部を指向する（奇数番の残基）。修飾シクロデキストリン上の架橋剤の設計は、シクロデキストリン上部が、結合部位からほぼ４アミノ酸離れた位置となることを意味している。したがって、１１７位結合は１１３位にあるシクロデキストリンの上部に対応する。
【０１９９】
（１１５位）
このガイドを用いた場合、特にシクロデキストリンの一級アミンと反発するであろうと予測されるアルギニン基がＭ１１３Ｒ変異体に存在する場合、反応したシクロデキストリンが１１３位近傍で安定に位置するには、１１５位はβ−樽状構造の上部の高い位置にありすぎると予想された。しかし、このタンパク質はａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応した。
【０２００】
α−ＨＬの１１５位で反応が達成されたものの、ヌクレオチド塩基を添加する前であっても、ベースラインはノイズが多く且つ大きな電流の変動を示した。これは、β−樽状構造内のシクロデキストリンの動き、または溶液中に存在する他の化学種の結合による可能性があったが、しかしながら、ヌクレオチドの添加はこの構造体からのシグナルに影響しなかった。
【０２０１】
（１１７位）
シクロデキストリンを１１７位に結合することにより、シクロデキストリンは１１３位近傍に配置されるはずである。この構造体のチャートの例を以下に認めることが（図９）。ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｔ１１７Ｃ−Ｄ８）１変異体はａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応したが、ベースラインはＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｔ１１５Ｃ−Ｄ８）１変異体と非常に類似していた。ヌクレオチドの添加は、細孔シグナルに認識できる変化をまったく引き起こさなかった。１１７位での結合により引き起こされる良好でない挙動は、荷電したアダプターと反発する、正に荷電したアルギニンと相互作用するシクロデキストリンの結果と思われる。塩基感知のために必要なアルギニンはシクロデキストリンに近すぎると思われ、且つシクロデキストリンが安定した位置を獲得することを妨げる可能性もあった。
【０２０２】
（１１９位）
システインの位置をβ−樽状構造のさらに下部に移行して１１９位とした場合、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤとの反応は１１５または１１７位のいずれよりも明確なベースラインを示した。しかし、電流にはいまだに多少の変動があり、ベースラインのスパイクとして現れた（図１０）。
【０２０３】
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ構造体にヌクレオチドを添加したところ、ナノ細孔電流は、連続的なヌクレオチド結合イベントを明確に示しながら変調された（図１０）。ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８）１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すサブユニット１個を含有していた。
【０２０４】
追加的なイベントはなおベースラインに存在し、且つシグナルを複雑化したが（図１０）、ヌクレオチドイベントは、残留細孔電流の変動を引き起こすヌクレオチドの検出によって容易に識別することが可能であった。これらのイベントは、後でヒストグラムとしてプロットし、塩基識別を示すことができる（図１２）。
【０２０５】
（１２１位）
この変異体群からの最も有望なシステイン部位は、残基１２１位であった。特に、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰｌ−βＣＤ構造体である。この構造体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すサブユニット１個を含有していた。反応した細孔のベースラインは、過去に試験した変異体よりも小さな変動を示し、且つ明らかな塩基結合を示した（図１１）。
【０２０６】
１２１位にシステインを有する構造体は、１１９位にシステインを有する対応する変異体よりも、優れた分解能を有する塩基識別を示した。これは、各変異体についての残留細孔電流のヒストグラムに容易に認められる（図１２）。
【０２０７】
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８）１変異体は、修飾シクロデキストリンと反応して、連続的な塩基検出および若干の塩基間識別を示すことができるものの、残留電流間の重なりはこの手法による配列決定を困難にするであろう。
【０２０８】
（２．５ 低い位置での結合−残基）
塩基分解能は、システインの位置がβ−樽状構造の下方に移動するにつれて上昇するので、塩基識別をさらに改善することが可能か確認するために、より低いシステイン位置を検討した。
【０２０９】
システインの位置を１２３、１２５、１３３、１３５および１３７残基に移動した；これらの変異体を選択して、アダプターをＮ１３９Ｑ変異体にできるだけ近く配置した。シクロデキストリン架橋剤の長さの検討により、シクロデキストリンの上端（二級ヒドロキシル面）とチオール基の距離は９．２Åであることが示される。β−樽状構造内で多様な位置にあるアミノ酸架橋剤と１３９位にあるグルタミン環の距離を表３に示す。
【０２１０】
【表３】
【０２１１】
これらの測定値より、修飾シクロデキストリンの結合に最も適したシステインの位置は、Ｎ１３９Ｑ位からの距離が９．１ÅであるＬ１３５Ｃ残基であることが明らかである。この数値は、細孔とアダプターとの水素結合を最大化し、かつそれにより構造体を安定化させる必要のある、シクロデキストリンの水素結合とチオール結合部位の距離（９．２Å）とよく適合する。
【０２１２】
この仮説を検証するために生成された変異体を表４に示す。
【０２１３】
【表４】
【０２１４】
（１２５位および１３３位）
β−樽状構造底部の１２５位および１３３位にシステインを有する変異体については、修飾シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）との反応を観察することは不可能であった。これは、反応を可能とするためには不適切な方向を指向するシステイン基によると思われ、代替的には、シクロデキストリンは反応しうるものの、シクロデキストリンはβ−樽状構造内に入らず、且つそれゆえ細孔を経たコンダクタンスの測定によって観察されなかった。
【０２１５】
（１３５位および１３７位）
１２３位および１３７位を、シクロデキストリントンの結合およびｄＮＭＰの検出について検討した。これらの位置はＮ１３９Ｑ変異に近く、且つ１２１位における結合と同様の挙動を示すと予想された。いずれの位置も、ａｍ６ａｍＰＤＰｌ−βＣＤと良好に反応して安定したベースラインをもたらし、且つｄＮＭＰを添加すると塩基結合を示した。塩基検出は良好であったが、これらのシステイン位置のどちらについても、幅広い条件下での全４塩基間の識別は不可能であった。ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２３Ｃ−Ｄ８）１変異体のチャートの例を下に（図１３）、ｄＮＭＰが結合した際の残留電流のヒストグラム（図１４）と共に確認することができる。
【０２１６】
（１３５位）
分子モデリングを用いて算出した距離は、塩基識別にとって最良の結合位置はＬ１３５Ｃでなければならないことを示した。先の変異体と同じ条件を用いて、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌｌ３５Ｃ−Ｄ８）１変異体においてこの位置を検討した。この変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すサブユニット６個、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すサブユニット１個を含有していた。
【０２１７】
システインは修飾シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）と良好に反応して、安定したベースラインをもたらした。ヌクレオチド（ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ）の添加時、追加的な結合イベントが認められた。これらのピークの振幅は、残留細孔電流のヒストグラムをプロットした場合（図１６）に明瞭となる異なる母集団を示した（図１５）。
【０２１８】
修飾シクロデキストリンがＬ１３５Ｃ位に結合した場合の塩基分解能は、β−樽状構造における他のいずれの位置よりも明らかに優れており、且つ４つのヌクレオチドすべてのほぼ完全な分離を示し、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定のための優れた候補となった。
【０２１９】
したがって、この構造体は更なる研究のためのベースライン変異体として選択された。次の数節では、塩基識別に対する物理的パラメータの影響、塩および温度の制約、構造体が異なる化学種を同定する能力およびベースライン構造体の機械論的評価を扱う。
【０２２０】
（２．６ Ｌ１３５Ｃ位における塩基結合）
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌｌ３５Ｃ−Ｄ８）１変異体をベースラインと定義し、４つのピークのそれぞれを同定する実験を実施した。これは、溶液中の単一のヌクレオシド一リン酸化学種、またはヌクレオシド一リン酸対のいずれかを用いて実験を実行することによって遂行された（データは示さず）。これらの試験によりピークを同定した。それらは、最大の遮断（またそれゆえ最小の残留電流）を示すヌクレオチドがｄＧＭＰであり、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰがこれに続き、ｄＣＭＰは最小の電流遮断（またそれゆえ最大の残留電流）を引き起こすことも示した。８００ ｍＭ ＫＣｌ中の１６０ ｍＶにおいては、ｄＮＭＰが結合した場合の残留電流はおおよそ：３０ｐＡ（ｄＧＭＰ）、３３ｐＡ（ｄＴＭＰ）、３６ｐＡ（ｄＡＭＰ）および４４ｐＡ（ｄＣＭＰ）であった。
【０２２１】
観察された電流の振幅は、印加された電位についてほぼ線形で比例するものの、４つの塩基の互いに対する位置は比例しない。これは、印加された電位範囲における残留電流ヒストグラムを検討することにより認められる（図１７）。
【０２２２】
このデータより、より低い電位（１００ｍＶ）においては、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰが良好な分離を示したものの、ｄＡＭＰとｄＣＭＰのピークは重なり、一方より高い電位（１７０ｍＶ）においては、今度はｄＧＭＰとｄＴＭＰのピークが重なる一方で、ｄＡＭＰとｄＣＭＰピークは優れた分離を示すことが示される。したがって印加された電位は、分離を促進するために利用することのできる優れたピークの重なりの制御を提供する。このデータは、図１８にも要約する。
【０２２３】
残留電流分布の重なりを算出するために、残留電流ヒストグラムに認められる各個別のｄＮＭＰピークを、単一のガウス分布にフィッティングした。次に、単一塩基を検出する確率が等しくなるようガウス分布を正規化し、さらに正規化したガウス分布の重なりの面積より、隣接する各塩基環の重なりの割合を算出した（図１９）。
【０２２４】
異なる電位におけるピークの重なりの間には変動があるものの、変動は小さく、それゆえ、この構造体は幅広い操作条件において塩基識別のために用いることが可能であった。
【０２２５】
このプロットの１つの特徴は、ｄＴＭＰピークの鋭さである。ｄＴＭＰ結合は、構造体中でより長い結合時間（滞留時間）を有する点で、他の４つの塩基と異なっている。これは、あるイベントの持続時間を、修飾した細孔を通る残留電流の平均に対してプロットすることによって、容易に認めることができる（図２０）。
【０２２６】
平均すると、ｄＴＭＰの滞留時間が長いほど、各結合イベントについて収集されるデータポイントの数が多くなる。データポイントの平均より残留細孔電流の精度を算出するので、あるイベントのデータポイントが多ければ平均値はより正確となり、且つそれゆえ残留電流ヒストグラムにおけるイベントの分布はより小さくなる。ｄＮＭＰの読み違いの確率が低下するので、配列決定用途のためには長い結合時間が望ましい。
【０２２７】
（２．７ 低塩濃度操作条件）
上に提示した全てのデータは比較的高い塩濃度で取得しており、溶液コンダクタンスが高ければ信号雑音比が高まり、細孔変動のバックグラウンドに対するシグナルを容易に特定することができるので、これは望ましい。しかし、配列決定の用途のためには、ｄＮＭＰがＤＮＡより遊離するよう、酵素機能にとって好ましい条件下で塩基検出を操作しなければならない。
【０２２８】
一連の塩条件を検討し、酵素操作条件に有利となるようなヌクレオチド検出および識別の下限を確認した。最初の検討は５００ｍＭに焦点を合わせたが、このＫＣｌ濃度においては、８００ｍＭ ＫＣｌでの測定と比較して塩基分離にはほとんど差が見られなかった（データは示さず）。さらに、４００ｍＭ ＫＣｌで実施した試験により、４つのｄＮＭＰ塩基は電流状態の重なりがほとんど増加することなく、容易に分解することが可能であったものの、塩の減少は４つのピークの相対的位置に影響し、また最良のピーク分離を得るためにわずかに高い印加電位を必要とした（図２１）。
【０２２９】
低塩濃度における実験のための良好なベースラインを達成し、塩濃度をさらに３００および３５０ｍＭに低下させた。３５０ｍＭでの試験では比較的良好な塩基識別が示され、且つ４つのピークを識別することが可能であったものの、信号雑音比は低く、またシクロデキストリンレベル付近（ｄＣＭＰ結合）でピークがヌクレオチドイベントを選択することは困難であった（図２２）。
【０２３０】
残留電流ヒストグラムにおいて４つのピークが容易に分離可能であることから、各ピークをガウス分布および算出した重なりとフィッティングした（図２３）。ピークの重なりは４００ｍＭ ＫＣｌよりもわずかに高く、ｄＴＭＰとｄＡＭＰの間に面積の２０％の重なりを示したものの、他のヌクレオチドの分離は良好であった。
【０２３１】
塩濃度をさらに３００ｍＭ ＫＣｌに低下させ、同じ濃度で測定した。塩基検出は達成されたものの、ｄＮＭＰ間の識別は不良であった。
【０２３２】
異なったパラメータを用いてデータを分析したが、塩基分離を改善することは不可能であった。塩の減少によって伝導率が低下し、且つそれゆえ塩の検出が困難になったものの、ピークの位置および３００ｍＭと３５０ｍＭの間のスペクトラムの大きな違いより、塩の変化が塩基結合のメカニズムに影響した可能性が示唆される。
【０２３３】
コンダクタンスを高める方法の１つは、溶液の温度を高めることである。これにより、温度が生理学的条件に近い場合に酵素活性が高まるという利点が付け加えられている。温度による溶液のコンダクタンスの変化の量について、３００ｍＭ溶液の温度上昇にしたがって、単一のＨＬ−（Ｍｌ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体を通る電流を測定した（図２４）。
【０２３４】
溶液の温度を２５から４０℃に上昇させると、細孔コンダクタンスが６２．５ｐＡから９１．５ｐＡに変化した（細孔コンダクタンスが４６％上昇）。３００ｍＭ ＫＣｌにおける塩基検出実験を繰り返し、塩基識別に対する温度の影響を検討した（図２５）。
【０２３５】
４０℃と室温の間の残留電流ヒストグラムの明確な差は、分布幅の広さである。この効果は、高温におけるヌクレオチドの滞留時間の低下に帰すことができる（４０℃では平均滞留時間が２ｍ秒であるのに対し、室温では９．４ｍ秒）。単一結合イベントの平均電流レベルの算出精度はデータポイント数と関連するので、電流レベルの分布は滞留時間が短くなると共に大きくなる。さらに、滞留時間が低下するにしたがい、短すぎて観察できないヌクレオチド結合イベントの数が増加し、同じ数のイベントを捕捉するためにより迅速なデータ取得速度が必要とされる。
【０２３６】
要約すると、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ構造体は幅広い操作条件を示し、その一部はエキソヌクレアーゼのようなＤＮＡ処理酵素に適している。塩濃度は、室温において良好な塩識別を示しながら３５０ｍＭまで低下させることができ、且つ温度を高めた場合、または非対称的塩条件を用いた場合、より低い塩濃度を用いることができる。
【０２３７】
（２．８ メチル−ｄＣＭＰの検出）
上に論じた４つのヌクレオチドに付け加えて、塩基対形成性に影響しないＤＮＡ構造の化学変化体である５−メチルシトシン（メチルｄ−ＣＭＰ）に対して、科学界の関心が増大している（図２６）。
【０２３８】
メチル−ｄＣＭＰの存在は、非メチル化シトシンの自然発生的脱アミン化によってウラシルが生成され、これはＤＮＡ修復酵素によって認識および除去されるが、ｄＣＭＰがメチル化されると脱アミノ化によってチミンが生成するので、エピジェネティクスにとって重要である。ＣからＴへのこの変換によって対突然変異が生じることがあるため、遺伝病を理解するためには非常に重要である。
【０２３９】
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ構造体を用いて、この技術によってメチル−ｄＣＭＰを検出することが可能か確認した。始めに、メチル−ｄＣＭＰを内部較正物質としてｄＧＭＰを含有する溶液に添加した（図２７）。一方が既知のｄＧＭＰ分布に対応し、もう一方がメチル−ｄＣＭＰの結合に由来する異なる２つの母集団が認められる。
【０２４０】
我々のベースライン構造体がメチル−ｄＣＭＰを検出することができることが証明され、且つこの化学種のピーク位置が確認されているので、５つのヌクレオシド一リン酸（ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰおよびメチル−ｄＣＭＰ）を全て含む溶液を試験し、物理的な条件を最適化した。８００ｍＭ ＫＣｌにおいて、最も低い塩基の重なりを達成するのに最適な電位は１７０ｍＶであることが確認された。次に、これを４つの標準的ヌクレオチドを含有する測定（メチル−ｄＣＭＰが存在しない）と比較した（図２８）。
【０２４１】
各イベントの持続時間を残留細孔電流に対してプロットし、標準的な４つの塩基と比較したメチル−ｄＣＭＰの結合親和性を示した（図２９）。それによりメチル−ｄＣＭＰの滞留時間がより長く、ｄＣＭＰよりもｄＴＭＰに近いことが示された。このことは、ｄＴＭＰおよびメチル−ｄＣＭＰの両者に存在するメチル基（図２６）が、シクロデキストリンとの長時間の結合に重要であることを示唆している。
【０２４２】
５つのヌクレオシド一リン酸ピークを全てガウス分布にフィッティングし、重なり面積の割合を算出した（図３３）。全４個の塩基の検出についてのガウス分布の重なりは良好であったが、メチル−ｄＣＭＰとｄＡＭＰの間には比較的大きな重なりが認められた。ここでも、各塩基の相対位置は、印加電位の強度を変化させることによって制御することが可能であった（図３０）。
【０２４３】
メチル−ｄＣＭＰを検出する能力は幅広い用途にとって重要であるが、従来の技術で達成することは非常に困難である。この理由の１つは、現行の戦略の多くがＰＣＲまたは他の一般的技術によってＤＮＡ濃度を増幅することに依拠していることである。ＤＮＡを増幅する際、メチル−ｄＣＭＰは全てｄＣＭＰに変換され、且つそれゆえ情報が失われる。他の多くの技術と異なり、ナノ細孔感知は単分子システムであり、且つそれゆえＤＮＡを増幅することなく用いられる可能性があることから、エピジェネティクス情報を抽出するための完璧な候補となる。
【０２４４】
（２．９ ＲＮＡ塩基検出）
ベースライン構造体について示されたデータは、現在のところＤＮＡの構成単位であるｄＮＭＰ塩基に焦点を置いているものの、このシステムは他のヌクレオチド、具体的にはＲＮＡに認められるリボース塩基を検討する能力を有する。これらの塩基は２つの点で対応するｄＮＭＰと異なる；糖単位はさらなる水酸基を有し且つチミン塩基がウラシルに置換されている（ウラシルはチミンの非メチル化体）（図３１）。
【０２４５】
ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１．ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ構造体を用いて、４つの主要なＲＮＡ塩基であるアデンソシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）およびシチジン一リン酸（ＣＭＰ）を試験し、これらの化学種が互いに識別されるか検討した。始めに選択した条件は、ｄＮＭＰ塩基にとって最適の条件（８００ｍＭ ＫＣｌ、１６０ｍＶ、ｐＨ７．５）であった。これらの結果を残留電流ヒストグラムにプロットした（図３２）。
【０２４６】
ＲＮＡ塩基検出についての予備的な結果は良好であり；これらの塩基について特に最適化しなくとも、変動のないヒストグラムは３つの明確な分布を示す。これらのピークの本性はまだ確認されていないものの、順序はこれらの条件下におけるｄＮＭＰ塩基と類似しており、ＧＭＰが最も大きな細孔遮断を示し（３０ｐＡ残留電流）、ＡＭＰ（３４ｐＡ残留電流）がこれに続き、最小の遮断はＣＭＰ（３８ｐＡ残留電流）より生じた可能性が高いとみられる。ウリジン一リン酸の化学構造はシチジン一リン酸のそれと酷似しており、且つ同様のレベルの細孔遮断を引き起こすことが可能であったと思われる。
【０２４７】
（２．１０ ヘテロ７量体対ホモ７量体）
これらの実験を実施する上での制限因子の１つは、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤが反応に要する時間の長さであり、タンパク質細孔の一部はシクロデキストリンとまったく反応しない。これについての説明の１つは、タンパク質へテロ７量体上の単一システイン残基が不純物と反応したか、または酸化したというものである。一旦これが起こると、この官能基の活性を回復することは難しい。
【０２４８】
これに対する解決策の１つは、細孔中のシステイン残基数を増加させることである。これは、７量体中の修飾単量体の数を最大全７個までに変更することによって実施される。７量体中の７個の単量体全てが同一である場合、タンパク質はホモ７量体と呼ばれる（表５）。
【０２４９】
【表５】
【０２５０】
ホモ７量体をａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤと反応させ、対応するヘテロ７量体と比較した（図３３）。全般的に、ホモ７量体細孔は対応するヘテロ７量体よりも大きな変動性を示した。これらの構造体の大半が修飾シクロデキストリンと反応したものの、ホモ７量体はベースライン変動の増加を被り、ベースラインの「ノイズ」に対して良好な塩基識別を得ることは困難であった。
【０２５１】
これについて可能な説明の１つは、他の６つの無反応システインの化学的状態である。これらの基のそれぞれは、数多くの異なる酸化状態にある可能性がある。システイン基は酸化されると以下の形態をとることができる：スルフェン酸（Ｒ−ＳＯＨ）、スルフィン酸（Ｒ−ＳＯ２−）、またはスルフォン酸（Ｒ−ＳＯ３２−）。より高い酸化状態はまれであるものの、このような化学種の形成は、修飾シクロデキストリンの一級アミンなどの隣接する正に荷電した基によって触媒することができる。酸化されると、システインはシクロデキストリンの正に荷電した基と相互作用して、観察される細孔電流に影響する可能性がある。
【０２５２】
（２．１１ バイオセンサーの機械論的評価）
ベースライン構造体をよりよく理解するために、一連の変異体を生成し、アダプターがＬ１３５残基に結合した場合の個別のタンパク質構成単位をそれぞれ試験した（表６）。一連のタンパク質は１１３残基にアルギニンを欠く変異体、１３９残基にグルタミンを欠く変異体を含有した。さらに、細孔と反応することができるがａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ化合物の一級アミンを欠く化学修飾アダプターを用いて、ベースライン変異体を試験した。
【０２５３】
【表６】
【０２５４】
初めに検討した修飾はシクロデキストリンの一級アミン基であって、その６つのアミンがｐＨ７．５で部分的にプロトン化され、且つｄＮＭＦの負のリン酸基と総合作用しうるアミン基であった。アミノシクロデキストリンは他の利点も有し、正電位における滞留時間を通常の（ヒドロキシル）β−シクロデキストリンと比較して１０００倍に増大することができる。この滞留時間の増加は、アダプターの共有結合にとっては有用であるが、必要ではない。
【０２５５】
ベースライン変異型細孔を最適条件下で（８００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＶ）試験し、一方の測定ではＰＤＰ１−βＣＤを用い（図３４）、もう一方の測定では標準的なａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤシクロデキストリン（図３５）を用いた。
【０２５６】
ｄＮＭＰの高分解能検出のためには、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤアダプターの一級アミン基が必要であることは明らかである。アミノシクロデキストリン（６８ｐＡ）とヒドロキシルシクロデキストリン（３０ｐＡ）の間の大きなコンダクタンスの変化より、反応したシクロデキストリン化合物の安定化に一級アミンが１つの役割を果たすことが証明される。荷電したアミン基が、結合時に塩基と直接相互作用することができる可能性もあるとみられる。
【０２５７】
次に試験した構造体は、１１３残基のアルギニンと１３９残基のグルタミンを共に欠いていたが、なおＬ１３５Ｃ位のシクロデキストリン結合部位を維持していた。この変異体は、本質的に単一のシステインを有する野生型タンパク質であった。アミノシクロデキストリンを用いたところ良好に反応したものの、ヌクレオチドを添加する前でも反応レベルはベースライン構造体よりも大きな変動を示した。標準的な４つのヌクレオシド一リン酸を全て添加したところ、若干の結合イベントが認められたものの、これらは頻度が低く且つ塩基間の識別は不可能であった（図３６）。
【０２５８】
それにより、正確な塩基識別のためにはアルギニン、グルタミン、または両変異が必要であることが示される。これを判定するために、Ｎ１３９Ｑ変異を欠くベースライン変異体の変種を試験した。この変異体は野生型細孔と類似しているが、β−樽状構造体にアルギニン環、およびＬ１３５Ｃ位にシクロデキストリンの結合のための単一システインを有していた。正に荷電したアルギニンは負に荷電したｄＮＭＰと相互作用すると予測されるが、アミノシクロデキストリン上の電荷にも影響し、さらにベースラインシグナルに影響しうる。
【０２５９】
反応したＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体は、アミノシクロデキストリンとの反応後にＨＬ−（ｗｔ）６（Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体よりも明瞭なベースラインを示した。ヌクレオチドの添加により観察すべき結合イベントが発生し、且つベースラインにおける追加的なスパイクも認められた。結合は野生型類似体よりも頻繁であり、アルギニンがヌクレオチドと反応しうることが示唆された。ヌクレオチド結合イベントの残留電流は変動し、且つ残留電流ヒストグラムにプロットした場合の塩基間の識別は不良であった（図３７）。
【０２６０】
この理由の１つは、結合したシクロデキストリンの安定性であり、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体は、シクロデキストリンの二次ヒドロキシル面と水素結合し、かつ構造体を安定化することができる１３９位のグルタミンを欠く。このデータは、ヌクレオチド間の高分解能分離を達成するためにシクロデキストリンが安定化されなければならないことを示し、このことはグルタミンまたはアスパラギンなどの水素結合残基によって達成することができる。
【０２６１】
次に試験すべきタンパク質は、ベースライン構造体と類似しているが狭窄点にアルギニンを欠くＨＬ−（Ｎ１３９Ｑ）６（Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１変異体であった。この変異体は、水素結合相互作用により結合したアミノシクロデキストリンを安定化させることができるはずであるが、荷電したアルギニンがないため塩基を捕捉できないと思われた。
【０２６２】
ＨＬ−（Ｎ１３９Ｑ）６（Ｎ１３９Ｑ／Ｌｌ３５Ｃ−Ｄ８）１変異体はシクロデキストリンと反応し、且つ非常に変化の少ないベースラインをもたらした。塩基を添加する際に、生チャート上で異なる振幅を伴う結合イベントを視覚的に確認することが可能であった。残留細孔電流のヒストグラムは、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）６（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８）１ベースライン変異体とほぼ同一である、４つの異なるピークを示した（図３８）。
【０２６３】
このことは、アルギニンはベースライン構造体で認められた４つの塩基の識別をもたらすために必要でないことを証明する。しかし、それらはやはり細孔の性能に影響しうる。構造体の成功には数多くの追加的な因子が関与しており；これらはヌクレオチドの検出率およびナノ細孔と結合したアダプターの収率を含む。
【０２６４】
アルギニン基はｄＮＭＰ塩基の結合部位への誘因を促進することもあり、且つヌクレオチドの捕捉率を高める可能性があり、これは配列決定用途にとって望ましい。しかし、アルギニン側鎖はタンパク質中に認められるアミノ酸の中でより嵩高いものの１つであり、立体的相互作用によって捕捉率を制限する可能性がある（検討中）。
【０２６５】
アルギニン基がシクロデキストリンの良好な反応の促進に関与している可能性もある。非共有結合アダプターデータに認められるように、ＨＬ−（Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ）７変異体は、塩基検出のためにシクロデキストリンをＮ１３９Ｑ残基近傍に配置し、アルギニンが除去された場合には見られない効果である（データは示さず）。Ｌ１３５Ｃ残基にある反応部位はＮ１３９Ｑに近いので、アルギニンはシクロデキストリンの反応を補助すると思われる。シクロデキストリンは、頻度は高くないものの、Ｌ１３５Ｃ位で反応するが、ｄＮＭＰを検出することのできない雑音の多いベースラインを示すことがある。このことを、変異によって影響されることのある、細孔におけるシクロデキストリンの配向と関連付けることも可能である。
【０２６６】
【表７】
【０２６７】
【表８】
【０２６８】
【表９】
【０２６９】
【表１０】
【０２７０】
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの検出に用いることを目的とした変異型α−ヘモリシン（α−ＨＬ）細孔であって：
（ａ）それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を含む７つのサブユニット、および
（ｂ）前記細孔と前記ヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを含み、
前記の７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍において修飾されて前記アダプターの配置を促進し、且つ
前記分子アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置されるよう１つまたはそれ以上の前記サブユニットと共有結合する前記変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項２】
前記の７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍にグルタミンを含む、請求項１に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項３】
７つのサブユニットの全てがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍にグルタミンを含む、請求項２に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項４】
前記の７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１および１４２のうち１つまたはそれ以上にグルタミンを含む、請求項２または３に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項５】
前記アダプターが前記サブユニットのうち１つまたはそれ以上においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５と共有結合する、前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の前記サブユニットにおいて残基１１９、１２１または１３５が修飾されて前記アダプターの前記共有結合を促進する、請求項５に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項７】
残基１１９、１２１または１３５がシステインの導入によって修飾される、請求項６に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項８】
前記の７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がさらに修飾されて前記アダプターの共有結合を促進する、前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項９】
前記の１つまたはそれ以上のサブユニットがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３にアルギニンを導入することにより修飾される、請求項８に記載のα−ＨＬ細孔。
【請求項１０】
前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔であって、前記細孔が：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８サブユニット１個；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８サブユニット１個；または
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８サブユニット１個を含む前記変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項１１】
前記分子アダプターがシクロデキストリンである、前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項１２】
前記シクロデキストリンがヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７β−ＣＤ）である、請求項１１に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項１３】
前記アダプターが二官能性架橋剤を介して前記細孔と共有結合する、前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記サブユニットがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９，１２１または１３５位にシステインを有する前記ポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３に示す配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
変異型α−ＨＬ細孔を生成するためのキットであって、それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードする７つのポリヌクレオチドを含み、前記サブユニットの少なくとも１つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５にシステインを有する前記キット。
【請求項１７】
請求項１６に記載のキットであって、前記キットが：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列を含むポリヌクレオチド６つ、および
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３に示す配列を含むポリヌクレオチド１つを含む前記キット。
【請求項１８】
請求項１から１３のうちいずれか１つに記載の細孔を生成するための方法であって、
（ａ）請求項１から１３のうちいずれか１つに定義するところの細孔を提供すること；および
（ｂ）前記細孔と１つまたはそれ以上のヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを前記細孔に共有結合させることを含む前記方法。
【請求項１９】
（ａ）における前記の提供することが請求項１４または１５に定義された前記の７つのポリヌクレオチドを宿主細胞に発現させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
手順（ａ）において提供される前記細孔が保護的脱離基を含み且つ手順（ｂ）が前記脱離基を前記細孔より置換することを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８から２０のいずれか１つに記載の方法であって、前記アダプターが：
（ａ）オリゴマー化する前に前記細孔の１つまたはそれ以上のサブユニットと；
（ｂ）オリゴマー化する際に前記細孔の１つまたはそれ以上のサブユニットと；または
（ｃ）オリゴマー化した細孔と結合する前記方法。
【請求項２２】
個別のヌクレオチドを同定するための方法であって：
（ａ）前記ヌクレオチドが請求項１から１３のいずれか１つに記載の細孔と相互作用するよう前記ヌクレオチドを前記細孔と接触させること；および
（ｂ）前記相互作用中に前記細孔を通る電流を測定し且つそれにより前記ヌクレオチドの本性を決定することを含む前記方法。
【請求項２３】
標的核酸配列を配列決定する方法であって：
（ａ）エキソヌクレアーゼを用いて前記標的配列の一方の末端より個別のヌクレオチドを消化すること；
（ｂ）前記ヌクレオチドが前記アダプターと相互作用するよう前記ヌクレオチドを請求項１から１４のいずれか１つに記載の細孔と接触させること；
（ｃ）前記相互作用中に前記細孔を通る電流を測定し且つそれにより前記ヌクレオチドの本性を決定すること；および
（ｄ）前記標的配列の同一末端において手順（ａ）から（ｃ）を反復し且つそれにより前記標的配列の前記配列を決定することを含む前記方法。
【請求項２４】
核酸の配列を決定するためのキットであって：
（ａ）請求項１から１３のいずれか１つに記載の細孔または請求項１４および１５に定義される前記の７つのポリヌクレオチド；および
（ｂ）エキソヌクレアーゼを含む前記キット。
【請求項１】
サンプル中の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの検出に用いることを目的とした変異型α−ヘモリシン（α−ＨＬ）細孔であって：
（ａ）それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を含む７つのサブユニット、および
（ｂ）前記細孔と前記ヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを含み、
前記の７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍において修飾されて前記アダプターの配置を促進し、且つ
前記分子アダプターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９またはその近傍に配置されるよう１つまたはそれ以上の前記サブユニットと共有結合する前記変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項２】
前記の７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍にグルタミンを含む、請求項１に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項３】
７つのサブユニットの全てがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３９および／またはその近傍にグルタミンを含む、請求項２に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項４】
前記の７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１および１４２のうち１つまたはそれ以上にグルタミンを含む、請求項２または３に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項５】
前記アダプターが前記サブユニットのうち１つまたはそれ以上においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５と共有結合する、前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の前記サブユニットにおいて残基１１９、１２１または１３５が修飾されて前記アダプターの前記共有結合を促進する、請求項５に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項７】
残基１１９、１２１または１３５がシステインの導入によって修飾される、請求項６に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項８】
前記の７つのサブユニットのうち１つまたはそれ以上がさらに修飾されて前記アダプターの共有結合を促進する、前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項９】
前記の１つまたはそれ以上のサブユニットがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１３にアルギニンを導入することにより修飾される、請求項８に記載のα−ＨＬ細孔。
【請求項１０】
前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔であって、前記細孔が：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｌ１３５Ｃ−Ｄ８サブユニット１個；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｇ１１９Ｃ−Ｄ８サブユニット１個；または
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑサブユニット６個およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すα−ＨＬ Ｍ１１３Ｒ／Ｎ１３９Ｑ／Ｎ１２１Ｃ−Ｄ８サブユニット１個を含む前記変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項１１】
前記分子アダプターがシクロデキストリンである、前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項１２】
前記シクロデキストリンがヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７β−ＣＤ）である、請求項１１に記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項１３】
前記アダプターが二官能性架橋剤を介して前記細孔と共有結合する、前記の請求項のうちいずれか１つに記載の変異型α−ＨＬ細孔。
【請求項１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記サブユニットがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９，１２１または１３５位にシステインを有する前記ポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３に示す配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
変異型α−ＨＬ細孔を生成するためのキットであって、それぞれがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列またはその変種を有するα−ＨＬのサブユニットをコードする７つのポリヌクレオチドを含み、前記サブユニットの少なくとも１つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１１９、１２１または１３５にシステインを有する前記キット。
【請求項１７】
請求項１６に記載のキットであって、前記キットが：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列を含むポリヌクレオチド６つ、および
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１または１３に示す配列を含むポリヌクレオチド１つを含む前記キット。
【請求項１８】
請求項１から１３のうちいずれか１つに記載の細孔を生成するための方法であって、
（ａ）請求項１から１３のうちいずれか１つに定義するところの細孔を提供すること；および
（ｂ）前記細孔と１つまたはそれ以上のヌクレオチドの間の相互作用を促進する分子アダプターを前記細孔に共有結合させることを含む前記方法。
【請求項１９】
（ａ）における前記の提供することが請求項１４または１５に定義された前記の７つのポリヌクレオチドを宿主細胞に発現させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
手順（ａ）において提供される前記細孔が保護的脱離基を含み且つ手順（ｂ）が前記脱離基を前記細孔より置換することを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８から２０のいずれか１つに記載の方法であって、前記アダプターが：
（ａ）オリゴマー化する前に前記細孔の１つまたはそれ以上のサブユニットと；
（ｂ）オリゴマー化する際に前記細孔の１つまたはそれ以上のサブユニットと；または
（ｃ）オリゴマー化した細孔と結合する前記方法。
【請求項２２】
個別のヌクレオチドを同定するための方法であって：
（ａ）前記ヌクレオチドが請求項１から１３のいずれか１つに記載の細孔と相互作用するよう前記ヌクレオチドを前記細孔と接触させること；および
（ｂ）前記相互作用中に前記細孔を通る電流を測定し且つそれにより前記ヌクレオチドの本性を決定することを含む前記方法。
【請求項２３】
標的核酸配列を配列決定する方法であって：
（ａ）エキソヌクレアーゼを用いて前記標的配列の一方の末端より個別のヌクレオチドを消化すること；
（ｂ）前記ヌクレオチドが前記アダプターと相互作用するよう前記ヌクレオチドを請求項１から１４のいずれか１つに記載の細孔と接触させること；
（ｃ）前記相互作用中に前記細孔を通る電流を測定し且つそれにより前記ヌクレオチドの本性を決定すること；および
（ｄ）前記標的配列の同一末端において手順（ａ）から（ｃ）を反復し且つそれにより前記標的配列の前記配列を決定することを含む前記方法。
【請求項２４】
核酸の配列を決定するためのキットであって：
（ａ）請求項１から１３のいずれか１つに記載の細孔または請求項１４および１５に定義される前記の７つのポリヌクレオチド；および
（ｂ）エキソヌクレアーゼを含む前記キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図４】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図４】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５２７１９１（Ｐ２０１１−５２７１９１Ａ）
【公表日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７２２８（Ｐ２０１１−５１７２２８）
【出願日】平成２１年７月６日（２００９．７．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１６９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００４２７３
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５１１００５４０２）オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月６日（２００９．７．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１６９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００４２７３
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５１１００５４０２）オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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