変異させた集団のハイスループットスクリーニング
変異させた集団のメンバーにおける遺伝子中の変異のハイスループット同定のために、効率的な方法が開示される。本方法は、ＤＮＡ単離、プール、増幅、ライブラリーの作成、好ましくは合成によるシークエンシング技術によるライブラリーのハイスループットシークエンシング、変異の同定、並びに変異を保有する集団のメンバーの同定及びその変異の同定を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び遺伝学の分野において、ハイスループットシークエンシング技術の使用に基づいた、集団中の変異の同定のために改良されたストラテジーに関する。本発明は、更に、本方法に適用できるキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
重要な形質に影響する遺伝子を逆遺伝学（reverse genetics：リバースジェネティクス）アプローチによって同定、識別するために、誘発された変異又は天然に存在する変異のいずれかを保有する個体の集団は、最新のゲノミクス研究において使用される。この研究は、農学的に重要な植物及び作物に対して特に適用可能であるが、これら個体の集団は、酵母、細菌等の他の生物にも有用である。動物、トリ、哺乳類等の他の生物も使用することができるが、典型的には、これらの集団の採取又は制御は、より煩わしい。それにもかかわらず、本明細書において記述される本発明が非常に一般的な性質のものであり、そのような生物にも適用することができることが観察される。
【０００３】
変異させた集団（mutagenized populations）は、機能欠損変異に対する既知遺伝子のスクリーニング（assessing：選別）又は変異遺伝子を有する生物における表現型変化の評価のために一般に使用されるように、突然変異した集団は遺伝子の発見のための相補的なツールである。律速段階は、それぞれ、対象となる遺伝子中に変異を保有する生物の同定に関連したスクリーニング研究である。以下で、そのような集団の本質及びスクリーニング方法はより詳細に記述され、遺伝子の発見のためのこれらのツールの価値を増加させる、より効率的なスクリーニング方法が示される。
【０００４】
変異させた集団を使用する技術は、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）による処理によって、又は電離放射線（高速中性子照射）（Li et al.The Plant Journal, 2001, 27, 235-42）によって、ゲノムへの多数変異（ほとんどヌクレオチド置換）を無作為に導入することによるＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化誘発局所的損傷（Targeted Induced Local Lesions In Genomes））（McCallum et al., Nat. Biotechnol 2000, 18, 455-457, McCallum et al., Plant Physiology, 2000, 123, 439-442; Till et al.Genome Research 2003, 13, 524-530）として既知である。この集団中のすべての植物は、数百の（又は数千の）変異体を保有し、そのうちのいくつかは、正常な発生、形態に影響するか、そうでなければ、１つ又は複数の遺伝子若しくはその遺伝子の調節配列の機能欠損（ノックアウト、ノックダウン）による表現型を与える。ＴＩＬＬＩＮＧ集団は、一般に、複数の独立した変異体（１つの遺伝子当たり５〜２０個）ですべての遺伝子をカバーするために、十分な数の植物を含んでいる。したがって、ＴＩＬＬＩＮＧにおいて使用される変異させた植物集団は、通常、３０００〜１００００の植物から成り、以下に示す２つの方法において使用することができる。
【０００５】
逆遺伝学
「逆遺伝学」は、ＴＩＬＬＩＮＧ集団を使用する最も一般的な方法である。対象となる遺伝子は、例えば、転写プロファイリング又は候補遺伝子アプローチによって同定され、応答すべき問題は、この遺伝子が対象となる或る特定の表現型形質に影響するかどうかである。したがって課題は、この遺伝子の機能欠損変異を有する１つの（又はいくつかの）植物を同定することである。これは、典型的には、下記工程を含む多重工程のスクリーニング過程において一般に実行される：
１．ＴＩＬＬＩＮＧ集団の多数の（プールした）Ｍ２植物（例えば３０７２個）のゲノムＤＮＡを単離する。
２．１つのプール当たり８〜３２の植物からの等しい量のＤＮＡのプールは、ＣＥＬ Ｉスクリーニング系の感受性に依存するプールレベルで集められる（以下を参照）。これは３０７２の植物の場合には、合計９６〜３８４のプールしたＤＮＡサンプルをもたらす。
３．すべてのプールされたＤＮＡからの遺伝子の部分を増幅するために、標識されたＰＣＲプライマーを使用する。オーバーラップしたＰＣＲ断片を、遺伝子全体をカバーするために使用する（例えば、６００ｂｐである複数のＰＣＲ断片が１５００ｂｐである１個の遺伝子から３回増幅される）。
４．プールされたＤＮＡサンプルから採取されたＰＣＲ産物のヘテロ二本鎖を調製し、単一のヌクレオチド配列のミスマッチを認識し切断するＣＥＬ Ｉ又は他の酵素（例えば、マングビーンヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ及びサーベイヤー（Surveyor）等）と共にインキュベートし、処理されたサンプルを変性（シークエンシング）ゲル上で又はキャピラリー電気泳動法によって分離する。
５．遺伝子中の変異を保有する植物を含むプールは、ＣＥＬ Ｉ処理に起因する消化産物のバンドを観察することにより同定される。
【０００６】
変異を保有する植物を同定するために、陽性プールにおける植物の個別のＤＮＡに対してＰＣＲが反復して行われ、双方向サンガー法のシークエンシングが続いて行われる。
【０００７】
変異と観察された表現型変化との間の因果関係を立証するために、変異を有する植物を成長させ、野生型に対して外部交配する。
【０００８】
ＣＥＬ Ｉスクリーニング（上記の工程の３〜５）の利点は、プールされたサンプルをあらかじめスクリーニングすることによって、サンガー法のシークエンシングで個別にすべての植物をシークエンシングすることに要する費用を低減できることである。
【０００９】
しかしながら、ＣＥＬ Ｉスクリーニングの限界は、すべての同定された変異が遺伝子機能に影響するとは限らない（例えば、サイレント置換）ということであり、陽性のプールにおける個別の植物のＰＣＲ産物がシークエンスされるまではこのことはわからない。それにもかかわらず、ＣＥＬ Ｉを介したスクリーニング方法は、すべての植物のＰＣＲ産物の個別のシークエンシングと比較して、コストが削減される。
【００１０】
別の限界は、ＣＥＬ Ｉスクリーニングがゲルの泳動及びスコアリング（ゲルパターンが常に明瞭だとは限らないので、第２鎖からの変異の確認を必要とする比較的煩わしい過程）を含んでいるということである。
【００１１】
第３の短所は、ＣＥＬ Ｉスクリーニングでは、ＰＣＲ産物の末端での変異の検出に対して比較的感度が悪く、結果的に、これらの変異は検出されにくいと云うことである。ＣＥＬ Ｉのさらなる短所は、この酵素が塩濃度のような反応条件に対して非常に影響を受けやすいことが発見されたということである。このことは、酵素を限られた数のバッファーにおいてのみにしか使用することができず、その結果としてＣＥＬ Ｉの広範囲の使用を妨げる。ＣＥＬ Ｉの適用に関連した別の実際的な短所は、ミスマッチしたすべてのヘテロ二本鎖を切断した場合、酵素は確実ではないということである。
【００１２】
最終的に、ＣＥＬ Ｉスクリーニングは、ミスセンス変異（それらは最も優勢なものである）とナンセンス変異とを区別することができず、対象となる変異を得ることなく、陽性プールに対して多くのスクリーニング研究が行なわれる原因となる。
【００１３】
順遺伝学（Forward Genetics：フォワードジェネティクス）
変異させた集団の植物を成長させ、対象となる形質について表現型の分析を行なった。次に、対象となる表現型に連鎖していない変異を外部交配するために、対象となる表現型を有する植物を野生型の植物と交配する。最終的に、対象となる表現型に関連する原因変異遺伝子は、従来の遺伝学的マッピング集団（Ｆ２、ＲＩＬ（組換え近交系統）等））におけるマッピングＱＴＬ（量的形質遺伝子座）と類似したポジショナルクローニング（遺伝的マーカーを使用して）によって同定される。理論上可能ではあるが、変異させた集団は、一般にはこのように使用されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、変異させた集団のスクリーニングに対する既存のストラテジーを部分的に改良する。本発明は、変異の存在に対して多くの集団をスクリーニングする効率的な方法を提供し、遺伝子機能への影響に対する変異の効率的な評価を改良し、すなわち遺伝子機能の変更をもたらさない変異のスクリーニングに費やされる負担の量を減少させることを目的とする。本方法は、ＣＥＬ Ｉ酵素又はその同等物の使用を回避するように設計された。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、ハイスループットシークエンシングストラテジーを使用して上述の目標が達成されることを見出した。また、ＴＩＬＬＩＮＧ集団のような変異させた集団、変異が（合成）変異原性オリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド損傷ＤＮＡを使用して、又はすなわち標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）若しくは領域標的化変異誘発（ＲＴＭ）によって導入されたことを特徴とする集団、又は一塩基多型（ＳＮＰ）、小さな挿入及び欠失、並びにマイクロサテライト反復数における変化のような天然に存在する変異を含む集団については、対象となる変異の存在が効率的にスクリーニングすることができることも見出した。
【００１６】
定義
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む、明細書及び特許請求の範囲についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特別に本明細書において定義されないならば、使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照によりそれら全体は本明細書において援用される。
【００１７】
「ＴＩＬＬＩＮＧ」即ち「ゲノム中の標的化誘発局所的損傷」は、対象となる領域中の点変異を同定するための一般的な逆遺伝学的ストラテジーであり、ここでは、ＰＣＲに基づいたスクリーニングと組み合わせた、無作為の化学的変異誘発又は物理的変異誘発によって誘発された（点）変異の対立遺伝子のシリーズを提供する。ＴＩＬＬＩＮＧスクリーニングにおいて、対象となる領域はＰＣＲによって増幅される。野生型の断片と誘発変異を有する断片との間のヘテロ二本鎖は、ＰＣＲ産物の変性及びアニーリングによって形成される。これらのヘテロ二本鎖はＣＥＬ Ｉによって切断され、切断された産物は分離される。スループットはプールすることによって増加することができる。プール中の配列差異を有するＰＣＲ産物の発見に続いて、プール中に含まれるＰＣＲ産物は個別のＰＣＲ産物のサンガー法のシークエンシングによって共通して再びスクリーニングされ、それによって変異体植物及び変異遺伝子中の厳密な配列差異を同定する。
【００１８】
「変異させた集団」は、変異体のライブラリーを産出するために変異誘発（化学的又は物理的な）された生物の集団（通常は植物であるが、ショウジョウバエ及びマウスのような動物を含む他の生物を、変異させた集団を生成するために使用してもよい；Schimenti et al., 1998, Genome Research 8:698-710）を指す。ＴＩＬＬＩＮＧ集団は、サイズにおいて広く変化してもよく、或る特定の目的のためには、もとの集団の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％又は２０％のみを含む部分的なＴＩＬＬＩＮＧ集団を使用することができる。変異させた集団に対する代替物として、集団を変異させないが、一塩基多型（ＳＮＰ）、小さな挿入及び欠失のような天然に存在する変異、並びにマイクロサテライト反復数における変化を含む亜集団から成ることを特徴とする集団を使用することができる。変異させた集団が容易に入手可能でない場合（ヒト）、又は前に大きい生殖質が既に入手可能な場合には、これらの集団は特に有利である。例えばComai et al., The Plant Journal, 2004, 37, 778-786を参照。そのような集団は「参照ＤＮＡ」と組み合わせて使用することができる。
【００１９】
「標的化ヌクレオチド交換」即ち「ＴＮＥ」。標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）は、特異的な部位で、染色体遺伝子又はエピゾーム遺伝子中の部位に部分的に相補的な合成オリゴヌクレオチドが、単一のヌクレオチドの反転を導く過程である。ＴＮＥは様々なオリゴヌクレオチド及び標的を使用して記述されてきた。報告されたオリゴヌクレオチドのうちのいくつかは、ヌクレアーゼ抵抗性を与えるための末端修飾を含むＲＮＡ／ＤＮＡキメラである。
【００２０】
「領域標的化変異誘発」即ち「ＲＴＭ」。領域標的化変異誘発は、ゲノムＤＮＡのあらかじめ定められた標的部位での二本鎖切断が人工的に生成される過程であり、大半は切断の部位での変異に結びつくような、様々な利用可能な細胞の修復機構のうちの１つによる切断の修復をもたらす。二本鎖切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（例えば、Lloyd et al., 2005を参照）、Ｉ−Ｓｃｅ１のようなメガヌクレアーゼ（Epinat et al., 2003）、又は変異原性化学基に結合された三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（Havre et al., 1993）の細胞核の中への導入によって生成されてもよい。
【００２１】
「核酸」：核酸は、本明細書において使用されるように、ピリミジン塩基及びプリン塩基を有するヌクレオチド、好ましくはそれぞれシトシン、チミン（又はウラシル）、アデニン及びグアニンの任意のポリマー又はオリゴマーを含んでもよい（Lehninger、生化学の原理（Principles of Biochemistry）、７９３〜８００ページ（ウォース出版（Worth Pub.）1982）を参照、すべての目的のために参照によりそれら全体は本明細書において援用される）。任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸の構成要素、及びこれらの塩基のメチル化型、ヒドロキシメチル化型又は糖鎖が付加した型を有するもの等のような、それらの任意の化学的な変形が含まれる。ポリマー又はオリゴマーは、組成において不均質又は均質であってもよく、天然に存在するソースから単離されるか又は人工若しくは合成で産生されてもよい。核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はその混合物であってもよく、一本鎖形式又は、ホモ二重鎖状態、ヘテロ二重鎖状態、及びハイブリッド状態を含む二本鎖形式で永続的に又は一時的に存在してもよい。
【００２２】
「タグ付け」（Ｔａｇｇｉｎｇ）は、核酸と第２の核酸又はさらなる核酸の区別を可能にするための、その核酸へのタグ又は標識の付加を指す。タグ付けは、例えばタグを付けたプライマーを使用して、増幅時の配列識別子の付加することにより、又は当該技術分野において既知の他の手段により実行することができる。そのような配列識別子は、特異的な核酸サンプルの同定のために独自に使用される、変化するが定義された長さのユニーク塩基配列になり得る。代表的な例はＺＩＰ配列である。そのようなタグを使用して、サンプルの起源を次の処理の際に決定することができる。異なる核酸サンプルから生じる処理された生成物の組み合わせの場合には、異なる核酸サンプルは異なるタグを使用して一般に同定される。
【００２３】
「タグを付けたライブラリー」は、タグを付けた核酸のライブラリーを指す。
【００２４】
「シークエンシング」は、核酸サンプル、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡにおいてヌクレオチド（塩基配列）の順序を決定することを指す。
【００２５】
「アライメントさせること及びアライメント」は、同じヌクレオチド又は類似するヌクレオチドの短いストレッチ又は長いストレッチの存在に基づいた、２つ以上のヌクレオチド配列の比較を意味する。さらに以下で説明されるように、ヌクレオチド配列のアライメントのためのいくつかの方法は当該技術分野において既知である。時には、用語「アセンブリー」又は「クラスタリング」は、同義語として使用される。
【００２６】
「ハイスループットスクリーニング」（ＨＴＳ）は、特に生物学及び化学の分野に関連する科学的な実験の方法である。最新のロボット工学と他の特殊化した研究室ハードウェアとの組み合わせによって、ＨＴＳは、研究者が効果的に同時に（又は実質的に同時に）多数のサンプルをスクリーニングすることを可能にする。
【００２７】
「プライマー」は、一般には、ＤＮＡの合成をプライミングするＤＮＡ鎖を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーなしにはデノボでＤＮＡを合成することができない。プライマーは、組み立てられるヌクレオチドの順序を指示するために、鋳型として相補鎖が使用される反応において、既存のＤＮＡ鎖のみを延長することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される合成オリゴヌクレオチド分子は、本明細書においてプライマーと呼ばれる。
【００２８】
「増加した親和性を有するプライマー」は、ＰＮＡ又はＬＮＡのような修飾されたヌクレオチドを有するプライマーであり、それらの熱安定性を増加させ、単一のヌクレオチド配列の差異に基づいた対立遺伝子特異的な増幅を可能にする。これを達成するために、１つ又は複数の修飾されたヌクレオチドが好ましくはプライマーの３’末端に、しばしば含まれる。
【００２９】
「ＤＮＡ増幅」は、典型的には、ＰＣＲを使用する二本鎖ＤＮＡ分子の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における合成を表わすために使用される。なお、他の増幅方法が存在し、それらは本発明において使用されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
１つの態様において、本発明は、
（ａ）変異させた集団の各メンバーのゲノムＤＮＡを単離して、集団の各メンバーのＤＮＡサンプルについて提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で採取されたＤＮＡをプールする工程と、
（ｃ）１組の（任意的に標識された）プライマーによりＤＮＡプールから標的配列を増幅する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物をプールして、増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
（ｅ）ライブラリー中の増幅産物を任意的に断片化する工程と、
（ｆ）ハイスループットシークエンシングを使用して、産物及び／又は断片のヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｇ）断片の配列をクラスタリングすること（アライメントさせること）によって変異を同定する工程と、
（ｈ）標的配列の修飾された機能について同定された変異をスクリーニングする工程と、
（ｉ）同定された変異へハイブリダイズするように向けられたプライマーを設計する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）のプライマー、及び工程（ｃ）のプライマーのうちの１つにより工程（ｄ）のライブラリーを増幅する工程と、
（ｋ）変異を保有するメンバー（複数可）を同定する工程と、
（ｌ）任意で、工程（ｃ）のプライマーを使用して工程（ｋ）のメンバー（複数可）からの標的配列を増幅することによって変異を確認する工程及び増幅された産物の配列を決定する工程と
を含む、変異させた集団のメンバーの標的配列中の変異の検出のための方法へ向けられる。
【００３１】
ＤＮＡの単離は、一般には、集団のメンバーからの組織の回収、ＤＮＡ抽出（例えば、Ｑ−バイオジーン高速ＤＮＡキット（Q-Biogene fast DNA kit）を使用して）、１つのサンプル当たり等しい量のＤＮＡを採取するための定量化及び正規化のような当該技術分野における一般の方法を使用して達成される。実施例として、本発明は、３０７２の植物のＴＩＬＬＩＮＧ集団及び１５００ｂｐの遺伝子に基づいて図示される。
【００３２】
単離されたＤＮＡのプーリングは、例えば三次元プーリングスキームを使用して達成できる（Vandenbussche et al., 2003, The Plant Cell, 15: 2680-93）。プーリングは、好ましくは等しい量のＤＮＡを使用して達成される。３Ｄプーリングスキームは、１５×１５×１４を含んでもよく、１つのプール当たり３０７２／１４＝２１９又は３０７２／１５＝２０５の異なるＤＮＡサンプルを含む４４プール（１５＋１５＋１４）をもたらす。
【００３３】
プールする工程は、典型的には、ＰＣＲスクリーニングの１回後に観察された変異を含む植物を同定する役目をする。ＤＮＡのプーリングはさらに、ＰＣＲ増幅の前に、シークエンシングのためのライブラリーにおいてより等しい表示を提供するために、ＤＮＡを正規化する役目をする。ＤＮＡのプーリングのさらなる利点は、特にタグを付けたライブラリーが使用される場合には、すべての配列を別々に決定しなければならないのではなく、このプールは対象となる配列の迅速な同定を可能にすることである。これは、大きな集団又は複雑な集団のスクリーニングを特に容易にする。
【００３４】
プールからの１組の任意に標識されたプライマーによる標的配列の増幅は、対象となる遺伝子を増幅するために設計した１セットのプライマーの使用によって、達成することができる。上で述べたように、プライマーは対象となる遺伝子の増幅産物を可視化するために標識されてもよい。
【００３５】
増幅産物は、好ましくは、それによって増幅産物のライブラリーを作成するために、等しい量又は正規化された量でプールされる。例示的には、ライブラリーの複雑度は３０７２植物数×１５００ｂｐ遺伝子配列＝４．６Ｍｂ配列になるだろう。
【００３６】
ＰＣＲ産物の長さがシークエンストレースの平均長を上回った場合には、ライブラリー中の増幅産物は、断片のシークエンシングの前に無作為に断片化されてもよい。断片化は物理的な技術（すなわち、剪断、超音波処理又は他の無作為な断片化方法）により達成することができる。工程（ｆ）において、ライブラリー中に含まれている少なくとも一部分、好ましくは、すべての断片の少なくとも一部分、更に好ましくは、ヌクレオチド配列の全体が決定される。或る特定の実施形態において、断片化の工程は任意である。例えば、シークエンシング技術で読み取られた長さとＰＣＲ断片の長さが、ほぼ同じである場合、断片化の必要はない。またＰＣＲ産物の一部のみがシークエンスされること、例えば１５００ｂｐのＰＣＲ産物であり、４００ｂｐの読み取り長さ（各サイドから）の場合には、７００ｂｐはシークエンスされないままであることが許容できるならば、より大きいＰＣＲ産物の場合においても、断片化は必要ではないかもしれない。
【００３７】
シークエンシングは、ジデオキシチェーンターミネーション法（サンガー法のシークエンシング）のような、当該技術分野において既知の、原則として任意の手段によって行われてもよいが、決定すべき配列が多数であることを考えるとあまり好まれない。しかしながらシークエンシングが、国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（すべては454 Life Sciencesの名称のもとに）、Seo et al.(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:5488-93による、及びHelios、Solexa、US Genomics等に開示された方法のような、ハイスループットシークエンシング方法を使用して実行されるときには、ジデオキシチェーンターミネーション法が好ましく有利であり、これらは、参照により本明細書に援用される。シークエンシングが、国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（すべては454 Life Sciencesの名称のもとに）中に開示された装置及び／又は方法を使用して実行されることは最も好ましく、これらは、参照により本明細書に援用される。記述された技術は、単一の実行において４０００万塩基のシークエンシングを可能にし、競合技術よりも１００倍高速で安価である。シークエンシング技術はおよそ、１）ＤＮＡの断片化、及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライブラリーを作成するための特異的なアダプターのライゲーションと、２）ビーズへのｓｓＤＮＡのアニーリング、油中水滴型マイクロリアクター中のビーズの乳化、及びビーズに対して個別のｓｓＤＮＡ分子を増幅するためのエマルジョンＰＣＲの実行と、３）ビーズの表面上に増幅されたｓｓＤＮＡ分子を含むビーズに対する濃縮の選別と、４）ピコタイタープレート（PicoTiterPlate）（登録商標）中のビーズを保有するＤＮＡの沈着と、５）ピロリン酸光シグナルの生成による少なくとも１０００００のウェル中の同時シークエン
シングとの５工程から成る。方法はより詳細に以下で説明されるだろう。
【００３８】
好ましい実施形態において、シークエンシングは、
（ａ）単一のアダプター化された断片が各々のビーズへアニールされている状態で、アダプター化された断片をビーズへアニールする工程と、
（ｂ）各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクター中でビーズを乳化する工程と、
（ｃ）各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェル中にビーズを入れる工程と、
ピロリン酸シグナルを生成する工程とを含む。
【００３９】
工程（ａ）において、シークエンシングアダプターは、ライブラリー中の断片へライゲーションされる。シークエンシングアダプターは、少なくともビーズへアニールするための「鍵となる」領域、シークエンシングプライマー領域及びＰＣＲプライマー領域を含んでいる。このように、アダプター化された断片は得られる。
【００４０】
第２の工程において、各々のビーズが単一のアダプター化された断片とアニーリングされる状態で、アダプター化された断片は、ビーズへアニールされる。大多数のビーズに対して１つのビーズ当たり１つの単一のアダプター化された断片のアニーリングを保証するように（ポアソン分布）、アダプター化された断片のプールへ、ビーズを過剰に追加する。
【００４１】
次の工程において、各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクター中でビーズは、乳化される。ＰＣＲ反応がマイクロリアクター内で行なわれることを可能にする油中水滴型マイクロリアクター中に、ＰＣＲ試薬は存在する。続いて、マイクロリアクターは破壊され、ＤＮＡを含むビーズ（ＤＮＡ陽性のビーズ）が濃縮される。
【００４２】
以下の工程において、各々のウェルが単一のビーズを含むように、ウェル中にビーズが入れられる。ウェルは、好ましくは大量の断片の同時シークエンシングを可能にするピコタイター（商標）プレートの一部である。
【００４３】
酵素を保有するビーズの追加後に、断片の配列は、ピロシークエンシングを使用して決定される。引き続く工程において、ピコタイター（商標）プレート及びビーズは、その中の酵素ビーズとともに、従来のシークエンシング試薬の存在下で異なるデオキシリボヌクレオチドにさらされ、デオキシリボヌクレオチドのとり込みに際して、記録される光シグナルが生成される。正確なヌクレオチドのとり込みは、検出可能なピロシークエンシングシグナルを生成するだろう。
【００４４】
ピロシークエンシング自体は、当該技術分野において既知であり、www.biotagebio.com、www.pyrosequencing.comのｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの項で特に詳しく記述されている。この技術は、例えば国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（すべて454 Life Sciencesの名称のもとに）においてさらに適用されており、それらは参照により本明細書に援用される。
【００４５】
変異は増幅されたライブラリー中のシークエンスされた断片のクラスタリングによって同定される。変異の同定は、ライブラリーの断片の決定された配列をアライメントさせることによって達成される。大多数の配列は野生型である（変異していない）が、誘発変異及び偶発的なシークエンシングエラーも観察される。増幅ライブラリーが複数倍の冗長度（典型的には約４〜５倍の冗長）でシークエンスされるので、同じ配列変化の複数の観察は、シークエンシングエラーというよりもむしろ変異を示す。図１を参照。
【００４６】
クラスタリングは、増幅されたライブラリー中の断片のアライメントを提供する。ライブラリー中の各々のＰＣＲ産物についてはこの方法で、クラスターはシークエンスされた断片から生成される、すなわち、断片のコンティグは工程（ｅ）における断片化から得られた様々な断片の配列のアライメントから構築される。
【００４７】
比較目的のための配列のアライメントの方法は、当該技術分野において既知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムは、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444、Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244、Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al.(1988) Nucl. Acids Res. 16:10881-90、Huang et al.(1992) Computer Appl. in the Biosci. 8:155-65、及びPearson et al (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31に記述されており、それらは、参照により本明細書に援用される。Altschul et al.(1994) Nature Genet. 6:119-29(参照により本明細書に援用される)は、配列アライメント方法及び相同性の計算の詳細な考察を提示する。
【００４８】
ＮＣＢＩの基本的局所アライメント検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool）（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., 1990）は、配列解析プログラムのｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連する使用について、国立生体情報センター（National Center for Biological Information）（ＮＣＢＩ、メリーランド州、ベテスダ）及びインターネット上を含むいくつかのソースから利用可能である。それは<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>でアクセスすることができる。このプログラムを使用して、配列同一性を決定する方法の説明は<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html>で利用可能である。
【００４９】
変異させた集団の分析において、変異が同定された後、同定された変異は、関連する遺伝子の修飾された機能（例えば終止コドンの導入）で評価される。この評価は、例えば６フレームでの翻訳によって配列自体に対して実行される。一旦対象となる変異が同定されたならば、集団の関連するメンバーを同定するために、変異は、さらに調べられる。
【００５０】
対象となる変異として分類された各々の変異について、対象となる変異を標的とする対立遺伝子特異的なプライマーが設計される。したがって、次に対立遺伝子特異的なプライマーは、プールされたＤＮＡサンプルの増幅において使用されるプライマーのうちの１つと組み合わせて使用される（リバースプライマー又はフォワードプライマーのいずれか）。１つのプライマー又は両方のプライマーが標識されてもよい。プライマーのセットは、ＤＮＡのプールを増幅するために使用される。陽性のプールは同定され、変異体植物が同定される。上述の３Ｄプーリングスキームにおいて、３ＤプールされたＤＮＡサンプルプレートをスクリーニングするためのプライマーのセットによる対立遺伝子特異的なＰＣＲは、３つの陽性プール（各々の次元において１つ）の同定をもたらし、変異体植物のライブラリーアドレスを規定する。
【００５１】
或る特定の実施形態において、対立遺伝子特異的プライマーは、それらの特異性を増加するためにロックされた核酸（Locked Nucleic Acids）（ＬＮＡ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）のような代わりのヌクレオチドを含む。そのような核酸は、当該技術分野において広く既知であり、供給業者の選択から市販で入手可能である。
【００５２】
変異の確認は、同定された変異体植物からの標的配列の増幅によって達成される。この増幅は、工程（ｃ）からのプライマーにより実行される。増幅された産物のヌクレオチド配列は、決定され、コンセンサス配列による比較によって変異は同定される。シークエンシングは、好ましくは、サンガー法シークエンシングで実行される。
【００５３】
１つの態様において、本発明は、
（ａ）集団における各々のメンバーのＤＮＡサンプルを提供するために、変異させた集団の各々のメンバーのゲノムＤＮＡを単離する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡをプールする工程と、
（ｃ）好ましくはプライマーのうちの少なくとも１つが、遺伝子特異的セクション、タグ及びシークエンスプライマー結合部位を含む、１組のタグを付けた（任意で標識した）プライマーにより、ＤＮＡプールから標的配列の一部又はセグメントを増幅する工程と、
（ｄ）増幅産物のライブラリーを作成するために工程（ｃ）の増幅産物をプールする工程と、
（ｅ）ハイスループットシークエンシングを使用して、増幅産物のヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｆ）断片の配列をクラスタリングすること（アライメントさせること）によって変異を同定する工程と、
（ｇ）タグを使用して、変異があるメンバー（複数可）を同定する工程と、
（ｈ）任意で、工程（ｃ）のプライマーを使用して工程（ｇ）のメンバー（複数可）からの標的配列の増幅により変異を確認する工程、及び増幅された産物の配列を決定する工程と
を含む、変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法に関する。
【００５４】
上で記述されるように、変異させた集団のメンバーのゲノムＤＮＡの単離及び単離されたＤＮＡのプーリングは、実質的に上記した手法で実行することができる。
【００５５】
標的配列の一部又はセグメントは、標識されてもよい１組のタグを付けたプライマーを使用して増幅される。好ましくは、各々の次元の各々のプールのために異なるプライマーが使用される。このことは、上記した例の場合、４４のフォワードプライマー及び４４のリバースプライマーが好ましいことを意味する。好ましくは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの各々は、
（ｉ）次のシークエンシング工程で使用することができるシークエンスプライマー結合部位と、
（ｉｉ）プライマー（及び結果として生じる増幅産物）を集団のもとのメンバーに連結する役目をするタグと、
（ｉｉｉ）対象となる標的配列（すなわち遺伝子）にアニールすることができる遺伝子特異的配列とを含む。
【００５６】
典型的な実施形態において、プライマーは、以下の順序を有する：
５’−シークエンスプライマー結合部位−タグ−遺伝子特異的ＰＣＲプライマー配列−３’
シークエンスプライマー結合部位及び遺伝子特異的なＰＣＲプライマー配列の長さは、一般のＰＣＲ使用において通常の長さであり、すなわち、独立して約１０ｂｐ〜約３０ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜２５ｂｐである。好ましくは、増幅される配列の部分又はセグメントは、下記に述べられるハイスループットシークエンシング技術を使用して、１回の実行でシークエンスすることができる長さに相当する。或る特定の実施形態において、部分又はセグメントは、約５０ｂｐ〜約５００ｂｐの間、好ましくは約７５ｂｐ〜約３００ｂｐ、及びより好ましくは約９０ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さを有する。上で述べられたように、この長さは、今なお開発されている技術を含む使用されたシークエンシング技術に応じて変化してもよい。
【００５７】
すべてのプール次元に相当するプライマーの各々に特有のタグ配列を含むプライマー（フォワード及び／又はリバース）を使用することによって、各々のタグ配列の特異的な植物起源は、タグの上流側にアニールされているシークエンスプライマーとして既知であり、このタグ配列は、各々の増幅産物中に存在する。或る特定の実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方は、タグを付けられる。他の実施形態において、フォワードプライマー又はリバースプライマー上でのみタグが付けられる。１つ又は２つのタグの間の選択は、状況に依存し、ハイスループットシークエンシング反応の読み取られた長さ及び／又は独立した妥当性検証の必要性に依存する。例えば、一方向にシークエンスされる１００ｂｐのＰＣＲ産物の場合には、１つのタグのみが必要とされる。２００ｂｐのＰＣＲ産物及び１００ｂｐの読み取り長さの場合には、効率を２倍に改良するので、二重のタグ付けが双方向シークエンシングと組み合わせて有用である。それは、さらに同じ工程で独立した妥当性検証の可能性を提供する。１００ｂｐのＰＣＲ産物が、２つのタグを付けたプライマーにより二方向にシークエンスされるとき、すべてのトレースは、配向にかかわらず、変異についての情報を提供するだろう。したがって、両方のプライマーは、どの植物がどの変異を含んでいるかについての「アドレス情報」を提供する。
【００５８】
タグは任意の数のヌクレオチドになり得るが、好ましくは２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド又は５ヌクレオチドを含む。４ヌクレオチドの並べ替えでは、２５６のタグが可能であるが、３ヌクレオチドの並べ替えは６４の異なるタグを提供する。使用される実例において、タグは好ましくは、＞１塩基で異なり、したがって、好ましいタグは４ｂｐの長さである。これらのプライマーを使用する増幅は、タグを付けた増幅産物のライブラリーをもたらす。
【００５９】
或る特定の実施形態において、増幅過程が、
（１）（ａ）５’−コンスタントセクションに連結された（ｂ）縮重タグセクション（ＮＮＮＮ）に連結された（ｃ）遺伝子特異的セクション−３’を含む、ロングＰＣＲプライマー、及び
（２）（ａ）５’−コンタクトセクションに連結された（ｂ）非縮重タグセクション−３’（すなわち、ＮＮＮＮの中の選別）から成り、次に増幅されるショートＰＣＲプライマーを含むことを特徴とするタグのシステムを使用することができる。非縮重タグセクションは、各々のサンプルに特有であり、例えば、サンプル１ではＡＣＴＧ、サンプル２ではＡＡＴＣ等である。ショートプライマーは、ロングプライマーのサブセットにアニールする。プライマーのコンスタントセクションは、シークエンスプライマーとして使用することができる。図３を参照。
【００６０】
ライブラリーは、好ましくは、すべての増幅されたプールからの等しい量のＰＣＲ産物を含む。例示的な実施例において、ライブラリーは、決定される３０７２植物数×１００ｂｐ＝３０７ｋｂの配列を含む。
【００６１】
ライブラリー中のＰＣＲ産物は、上で開示されるようなシークエンシング過程にかけられる。特に、ＰＣＲ産物は、ビーズに連結された配列に対応するシークエンスプライマー結合部位を使用して、ビーズに付けられている。したがって、本実施形態は、断片化及びアダプターライゲーションを必要としない。むしろ、この実施形態において、アダプターは、ＰＣＲプライマー設計を介してより早期に導入されてきた。このことは、本方法の信頼性を改良する。ビーズへのアニーリングに続いて、上で記述されるように、シークエンシングは、実行される、すなわち（１）油中水滴型マイクロリアクターにおけるビーズの乳化、（２）ビーズ上の個別のｓｓＤＮＡ分子を増幅するエマルジョンＰＣＲ、（３）それらの表面上の増幅されたｓｓＤＮＡ分子を含むビーズに対する濃縮の選別、（４）ピコタイタープレート（登録商標）にビーズを保有するＤＮＡの移入及び（５）ピロリン酸光シグナルを生成する方法による１０００００のウェルにおける同時シークエンシングである。典型的なアウトプットは、ライブラリーにおけるすべてのＰＣＲ産物の６６倍のカバー範囲を表わす約２００．０００×１００〜２００ｂｐ配列である。
【００６２】
上で記述されるように、クラスタリング及びアライメントは、実質的に上記した手法で実行される。変異を含む個別の植物は、タグを使用して同定することができる。実施例において、３つのタグの組み合わせは、陽性のプール、したがってプールにおける個別の植物の座標位置（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を意味する。
【００６３】
同定された変異体サンプルのＰＣＲ産物の再シークエンシングによる変異の確認は、上で記述された通りである。
【００６４】
様々なプーリングストラテジーは、本発明と共に使用することができ、それらの例は、多次元のプーリング（３Ｄプーリングを含む）又は行プーリング、列プーリング若しくはプレートプーリングである。
【００６５】
ここで使用することができるハイスループットシークエンシング方法は、例えばShendure et al., Science 309:1728-32中に記述されている。例は、微量電気泳動シークエンシング、ハイブリダイゼーションシークエンシング／ハイブリダイゼーションによるシークエンシング（ＳＢＨ）、増幅された分子に対するサイクリックアレイシークエンシング、単一の分子に対するサイクリックアレイシークエンシング、ポリメラーゼシークエンシングのようなノンサイクリック方法、単一分子方法、リアルタイム方法、エキソヌクレアーゼシークエンシング、又はナノポアシークエンシングを含む。
【００６６】
最適な結果を得るためには、断片又は増幅された産物は、十分な冗長度でシークエンスされるべきである。冗長度は、シークエンシングエラーと真の可能な変異との間の区別を可能にする。或る特定の実施形態において、シークエンシングの冗長度は、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５であるが、本発明のために必須でないが、実施例から理解できるように、１０より多くの、好ましくは２５より多くの、又はさらに５０より多くの冗長度は有利であると考えられる。
【００６７】
本発明の方法の利点は、とりわけ遺伝子機能へのそれらの影響についてコンピューター内で変異を評価することができるという事実にあり、選別が活性のある変異についてなされることを意味する。サイレント置換のみを与える変異に対して選択することができ、それによって全過程をより経済的及びより効率的にする。このことは、既知のＣＥＬ Ｉに基づいたＴＩＬＬＩＮＧ技術に対して、大きな利点である。即ち、ＣＥＬ Ｉに基づいたＴＩＬＬＩＮＧ技術では、大多数のＣＥＬ Ｉ変異がＣ／ＧからＴ／Ａへの転位であり、一般にそのうちの５％のみが終止コドンを生成するからである（Colbert et al.2001）。大部分は、関心の低いミスセンス変異である。集団における終止コドン変異を有するメンバーの効率的な認識は、過程を節約し、陽性のプールの個別のメンバーの補足スクリーニングのための必要性を回避する。
【００６８】
特に全標的配列がスクリーニングされる場合、すべての変異は、ＰＣＲ産物におけるそれらのポジションに関係なく等しい確率で見出すことができる。
【００６９】
本方法は、ＣＥＬ Ｉ消化（digestion）、ヘテロ二重鎖形成、及び、煩わしいゲルスコアリングの使用を避けることができる。したがって本発明は、ＣＥＬ Ｉ技術に関連したプーリングの限界に対して影響を受けない。
【００７０】
本発明は、さらに、特定の遺伝子又は形質に対する１つ又は複数の（標識された）プライマー、変異特異的なプライマー又は対立遺伝子特異的プライマーから成る群から選択された、１つ又は複数の化合物を含んでもよいキットに関する。本キットはさらに、ビーズ、シークエンシングプライマー、ソフトウェア、プーリングストラテジーのための説明及びキット自体について既知の他の構成要素を含んでもよい。或る特定の実施形態において、特異的変異（例えば、疾患に関連した変異）を発見する専用のキットが提供される。
【００７１】
ここで本発明は本明細書において以下で図示される。
【実施例】
【００７２】
ＴＩＬＬＩＮＧ集団のスクリーニングは、454 Life Sciencesのシークエンシング方法（Margulies et al., 2005）又はポロニーシークエンシング（Shendure et al., 2005）のような新規ハイスループットシークエンシング方法を使用することによって進めることができる。最新最先端技術である454 Life Sciences技術は、１回のシークエンシング実行においておよそ２０Ｍｂの配列をもたらす。読み取りの長さは、１回の読み取り当たりおよそ１００ｂｐである。１５００ｂｐ遺伝子中の変異に対して３０７２の植物から成る集団のスクリーニングを想定して（上記の引用された参照の２章中に記述されているように）、２つのアプローチが意図され、より詳細に以下で記述される、すなわち
（１）１５００ｂｐ遺伝子全体がＥＭＳ誘発変異の存在について調べられる場合のアプローチ及び
（１）１つ又は複数の１００ｂｐストレッチがＥＭＳ誘発変異の存在について調べられる場合のアプローチである。
実施例Ｉ
【００７３】
１５００ｂｐ領域全体のスクリーニング：
ＴＩＬＬＩＮＧ集団の３０７２の植物のゲノムＤＮＡを単離する。１植物当たり等量のＤＮＡの３Ｄプーリングスキームを構築し（例えば、１５×１５×１４）、３０７２／１４＝２１９又は３０７２／１５＝２０５の異なるＤＮＡサンプルを含む４４プール（１５＋１５＋１４＝４４）がもたらされる。（Vandenbussche et al.、上記）。
【００７４】
このプーリング工程は、ＰＣＲスクリーニング（工程８）の１ラウンド後に、観察される変異を含む植物の同定を可能にする役目をする。ゲノムＤＮＡのプーリングは、すべてのＤＮＡが配列ライブラリー中で等しく表わされる可能性を増加させるために、ＰＣＲ増幅に先立ってＤＮＡを正規化する役目をさらにする。
【００７５】
１５００ｂｐ遺伝子は、１組の標識されていないＰＣＲプライマーを使用して、プールされたＤＮＡサンプルから増幅される。
【００７６】
すべてのプールウェルからの等量のＰＣＲ産物は、プールされたＰＣＲ産物ライブラリーを作成するためにプールされる（複雑度３０７２植物×１５００ｂｐ＝４．６Ｍｂ配列）。
【００７７】
ＰＣＲ産物が、無作為に断片化され、個別のビーズ上で増幅され、ビーズ上でシークエンスされる、プールされたＰＣＲ産物ライブラリーは、従来技術（454 Life Sciencesにより提供される技術のような）を使用するショットガンシークエンシングにかけられる。アウトプットは、ライブラリー中のすべてのＰＣＲ産物の４倍〜５倍のカバー範囲を表わすおよそ２０００００の１００ｂｐ配列である。
【００７８】
すべての配列がクラスタリングされる。大多数の配列は野生型であるが、ＥＭＳ誘発変異（及びシークエンスエラー）も観察される。ＰＣＲ産物が４倍〜５倍の冗長度でシークエンスされるので、同じ配列変化の複数回の観察は、シークエンシングエラーというよりもむしろ変異を示す（図１）。
【００７９】
変異は、終止コドンの導入のような遺伝子機能へのそれらの影響に対して評価される。
【００８０】
対象となる変異を標的とする対立遺伝子特異的なプライマー（３’でロックされた核酸、ＬＮＡ、又はペプチド核酸、ＰＮＡをともなう）は、３ＤプールされたＤＮＡサンプルプレートをスクリーニングするために、工程３において使用されるフォワードプライマー又はリバースプライマーのいずれかと組み合わせて使用されるように設計される。対立遺伝子特異的なＰＣＲは３つの陽性のプール（各々の次元のうちの１つ）をもたらし、それは変異体植物のライブラリーアドレスを規定する。
【００８１】
工程３のプライマーを使用して１５００ｂｐ遺伝子を増幅し、後続するサンガー法のシークエンシング（双方向）によって変異を確認した。
実施例ＩＩ
【００８２】
１００ｂｐストレッチのスクリーニング
（１００ｂｐは１回の４５４シークエンス実行の読み取りの長さである）
ＴＩＬＬＩＮＧ集団の３０７２の植物のゲノムＤＮＡを単離する。１植物当たり等量のＤＮＡの３Ｄプーリングスキームを構築し（例えば、１５×１５×１４）、３０７２／１４＝２１９又は３０７２／１５＝２０５の異なるＤＮＡサンプルを含む４４プール（１５＋１５＋１４＝４４）がもたらされる。（Vandenbussche et al.、上記）。
【００８３】
このプーリング工程は、シークエンスデータから観察された変異を直接含む、植物の同定を可能にする役目をする。ゲノムＤＮＡのプーリングは、すべてのＤＮＡが配列ライブラリー中で等しく表わされる可能性を増加させるために、ＰＣＲ増幅に先立ってＤＮＡを正規化する役目をさらにする。
【００８４】
遺伝子の１００ｂｐ（又は２００ｂｐ）領域を、タグを付けた標識されていないＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲによってプールから増幅する。この増幅は、以下の配置を備えた４４のフォワードプライマー及び４４のリバースプライマー（各々の次元の各々のプールについて１つ）を必要とする：
５’−シークエンスプライマー結合部位−４ｂｐタグ−遺伝子特異的プライマーシークエンス−３’。
【００８５】
すべてのプール次元を表わす４４のプライマーの各々に対して異なる４ｂｐ配列タグを含む、テーリングフォワードプライマー及びテーリングリバースプライマーの使用によって、各々の配列の特異的な植物起源は、タグの上流にアニールされたシークエンスプライマーとして既知である。したがって、タグ配列は、各々のシークエンストレース中に存在する。４ｂｐタグは４４＝２５６の異なるタグを与える。３ｂｐタグは、４４タグを区別するのに十分な６４の異なるタグ配列を可能にするが、１つより多い塩基で異なるタグ配列が好ましい。
【００８６】
すべてのプールウェルからの等しい量のＰＣＲ産物は、プールされたＰＣＲ産物ライブラリーを作成するためにプールされる。（複雑度３０７２植物×１００ｂｐ＝３０７ｋｂ配列）。
【００８７】
プールされたＰＣＲ産物ライブラリーは、シークエンシングのために４５４へ提供される、すなわち、ＰＣＲ産物はビーズ上で増幅及びシークエンスされる。アウトプットは、ライブラリーにおけるすべてのＰＣＲ産物の６６倍のカバー範囲を表わすおよそ２０００００の１００ｂｐ配列である。
【００８８】
すべての配列（いずれかの方向からの）がクラスタリングされ、大多数の配列は野生型配列であるが、ＥＭＳ誘発変異（及びシークエンスエラー）が同様に観察される。ＰＣＲ産物は、６６倍の冗長度でシークエンスされるので、同じ配列変化の複数回の観察は、シークエンシングエラーというよりもむしろ変異を示す（図１）。
【００８９】
変異を含む個別の植物の座標位置は、変異を有するシークエンストレースの生じる３つのタグ配列に特有の組み合わせに基づいて、直ちに識別されるだろう（図２）。
【００９０】
この変異は、工程３にプライマーを使用して１５００のｂｐ遺伝子を増幅し、後続するサンガー法のシークエンシング（双方向）によって変異を確認した。
実施例ＩＩＩ．トマトの変異体ライブラリー中の特異的突然変異の同定
【００９１】
トマトの変異体ライブラリー
この実施例は、特異的な遺伝子座（標的遺伝子）中の点変異を同定するために、大量の並列のシークエンシングによるトマトの変異体ライブラリーのスクリーニングを記述する。使用される変異体ライブラリーは、ＥＭＳ変異誘発処理に由来する、５０７５のＭ２ファミリーから成る近交系有限花序トマト栽培品種Ｍ８２の同質遺伝子ライブラリーである。５０７５のＭ２ファミリーの各々の種子を１０％の相対湿度及び７℃で保存した。ライブラリーの起源及び特性は、Menda et al.（Plant J. 38: 861-872, 2004）及びhttp://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/index.html上のデータベース中に記述されている。
【００９２】
ＤＮＡ単離
葉の材料は、ライブラリーから無作為に選択され、３０７２のＭ２ファミリーの５つの個別の温室で栽培された植物から採取された。ライブラリー中で生じる任意の変異はＭ２子孫においてメンデルの法則の様式で分離するので、５つの個別のＭ２植物の葉材料のプーリングは、分離結果として、０．１％未満の任意の変異を見落とす可能性を減少させた。ゲノムＤＮＡを、Stuart and Via （Biotechniques, 14: 748-750, 1993）によって記述された改変ＣＴＡＢ手順を使用して、プールされた葉の材料から単離した。ＤＮＡサンプルを、ＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に１００ｎｇ／μｌの濃度で希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート中で−２０℃で保存した。
【００９３】
ＤＮＡサンプルの３Ｄプーリング
単離されたＤＮＡサンプルを、２０ｎｇ／μｌの濃度に正規化し、続いて４重にプールし、その結果８枚の９６ウェルマイクロタイタープレート中に含まれる７６８のサンプルがもたらされた。続いてこれらの８枚のマイクロタイタープレートは、３Ｄプーリングストラテジーにかけられ、ＤＮＡの２８プールがもたらされた。３Ｄプーリングストラテジーは３つの異なる様式ですべてのＤＮＡを一緒にプールすることから成り、したがって、各々の単独の４重プールがＸ座標プールで一度のみ、Ｙ座標プールで一度のみ、及びＺ座標プールで一度のみ生じることを保証する。Ｘプールは、８枚のマイクロタイタープレートすべてから、８つのウェルの１つの段当たりのすべてのＤＮＡサンプル（例えば、Ａ１〜Ｈ１）を一緒にプールすることによって組み立てられ、１２のＸプールをもたらした。したがって各々のＸプールは、８（段中のウェル）×８（プレート）＝４重プールの６４サンプル保有し、２５６のＭ２ファミリーを表わす。Ｙプールは、８枚のマイクロタイタープレートすべてから、１２のウェルの１つの列当たりのすべてのＤＮＡサンプル（例えば、Ａ１〜Ａ１２）を一緒にプールすることによって組み立てられ、８つのＹプールをもたらした。したがって各々のＹプールは、１２（列中のウェル）×８（プレート）＝４重プールの９６サンプルを保有し、３８４のＭ２ファミリーを表わす。Ｚプールは、マイクロタイタープレート全体から、すべてのＤＮＡサンプルを一緒にプールすることによって組み立てられ、８つのＺプールをもたらした。したがって各々のＺプールは、１２×８＝４重のプールの９６サンプルを保有し、３８４のＭ２ファミリーを表わす。
【００９４】
標的遺伝子座
この実施例における標的遺伝子座は、真核生物開始因子４Ｅに対するトマト遺伝子の一部であった（ｅＩＦ４Ｅ）。この遺伝子は、シロイヌナズナ（Duprat et al., Plant J. 32: 927-934, 2002）、レタス（Nicaise et al.Plant Physiol. 132: 1272-1282, 2003）及びナス科（Ruffel et al, Plant J. 32: 1067-1075, 2002; Mol Gen. Genomics 274: 346-353, 2005）中のポチウイルスの感染に対する感受性に関与することが示され、この遺伝子における特異的変異は劣性のポチウイルス抵抗性に関連する。この実施例で記述される変異スクリーニングは、トマトｅＩＦ４Ｅ遺伝子における付加的変異を、新しいポチウイルス抵抗性の可能性のあるソースとして同定することを目的とした。トマトｅＩＦ４Ｅについては、ｃＤＮＡ配列のみが既知である（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ７２３７３３及びＡＹ７２３７３４）。ｃＤＮＡ配列に基づいて設計されたプライマーを使用するＰＣＲアプローチを使用して、トマト栽培品種マネーバーグ（Moneyberg）のｅＩＦ４Ｅ遺伝子座のゲノム配列の断片を増幅及びシークエンスした。この結果、トマトｅＩＦ４Ｅの大部分のゲノム遺伝子座の配列が得られた。この遺伝子座は、４つのエクソン及び３つのイントロンから成る。変異スクリーニングのために、上記遺伝子のエクソン１が標的配列として選ばれた（配列番号５７）。
【００９５】
配列番号５７：トマトのマネーバーグｅＩＦ４Ｅのエクソン１の配列：
ATGGCAGCAGCTGAAATGGAGAGAACGATGTCGTTTGATGCAGCTGAGAAGTTGAAGGCCGCCG ATGGAGGAGGAGGAGAGGTAGACGATGAACTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAATCAAATGA TACGGCATCGTATTTAGGGAAAGAAATCACAGTGAAGCATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTT TGGTTTGATAACCCTACCACTAAATCTCGACAAACTGCTTGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCT ACACTTTCTCCACTGTTGAAAATTTTTGGGG
【００９６】
標的遺伝子座増幅のためのプライマー設計
プライマーは、トマトｅＩＦ４Ｅのエクソン１のＰＣＲ増幅のために設計された。フォワードプライマーは、ＡＴＧの５’で４塩基のタグ配列をともない、エクソン１のオープンリーディングフレームのＡＴＧ開始コドンに対応するように設計され、２８のプールの各々のために特有の識別子を提供した。フォワードＰＣＲプライマーの離れた５’末端で、５’−Ｃが追加された。すべてのプライマーは、続いて行なわれるアダプターのライゲーションを容易にするために、それらの５’末端でリン酸化された。２８のフォワードプライマーの配列及び名称は、表１中にリストされる。タグ配列には、下線が引かれる。
【００９７】
【表１】
【００９８】
リバースプライマーは、非コード鎖中のエクソン１の塩基対ポジション２６７〜２８７に対応するように設計された。再び、５’プライミング部分の４塩基のタグ配列の同様のシリーズが含まれており、２８プールの各々のために識別子を提供する。リバースＰＣＲプライマーの離れた５’末端で、５’−Ｃは追加された。すべてのプライマーは、続いて行なわれるアダプターのライゲーションを容易にするために、それらの５’末端でリン酸化された。２８のリバースプライマーの配列及び名称は表２中にリストされる。タグ配列には、下線が引かれる。
【００９９】
【表２】
【０１００】
標的遺伝子座増幅
標的遺伝子座のエクソン１を、上で記述されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、３ＤプールされたＤＮＡから増幅した。各々のＰＣＲ反応のために、フォワードプライマーとリバースプライマーとを同じタグと共に使用した。２８の３Ｄプールの各々からのエクソン１の増幅のために、フォワードプライマー及びリバースプライマーの異なるセットを使用した。各々のサンプルのためのＰＣＲ増幅反応条件は、以下のとおりであった：２５μｌ ＤＮＡ（＝５０ｎｇ）、５μｌ ＲＮａｓｅ混合物、１０μｌ ５×Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＰＣＲバッファー、０．６μｌの４種類のｄＮＴＰｓ（２０ｍＭ）、１．２５μｌフォワードプライマー（５０ｎｇ／μｌ）、１．２５μｌリバースプライマー（５０ｎｇ／μｌ）、０．５μｌ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼ、２８．９μｌミリＱ精製水。ＲＮａｓｅ混合物は、１５７．５μｌミリＱ精製水＋１７．５μｌ ＲＮａｓｅから成った。
【０１０１】
ＰＣＲ増幅は、以下の条件を使用して、金ブロック又は銀ブロックを備えたＰＥ９６００サーモサイクラーで実行した：９４℃２分のホットスタートに後続して、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分の３５サイクル、及び４℃の最終定常温度。ＰＣＲ増幅効率を、１％アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の１０μｌの分析によってチェックした。図４は、同様なゲル上でラムダＤＮＡの濃度範囲に対する比較における、２８の３Ｄプールの各々からのエクソン１のＰＣＲ産物の効率的な増幅を示す。
【０１０２】
増幅に続いて、等しい量のＰＣＲ産物は、混合され、キアクイック（QIAquick）（登録商標）スピンのハンドブック（１８ページ）に従って、キアクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社（QIAGEN））を使用して精製された。各々のカラムに最大１００μｌの産物を入れた。産物を１０ｍＭトリス−ＥＤＴＡで溶出した。
【０１０３】
配列ライブラリー調製及びハイスループットシークエンシング
３Ｄプールからの混合増幅産物は、Margulies et al.（Nature 437: 376-380, 2005、及びオンライン追補）によって記述されるような、454 Life Sciencesシークエンシング技術を使用するＧＳ２０シークエンサー上で、ハイスループットシークエンシングにかけられた。具体的には、Margulies et al.によって記述されるようなエマルジョンＰＣＲ増幅、及び続いて行なわれる断片シークエンシングを容易にするために、ＰＣＲ産物をアダプターへライゲーションした。４５４アダプター配列、エマルジョンＰＣＲプライマー、シークエンスプライマー及びシークエンスの実行条件は、すべてMargulies et al.によって記述される。４５４シークエンシング過程においてセファロースビーズ上で増幅されたエマルジョンＰＣＲ断片中の機能的要素の直線状順序は、以下のとおりだった：４５４ ＰＣＲアダプター−４５４シークエンスアダプター−Ｃヌクレオチド−４ｂｐタグ−標的増幅プライマー配列１−標的断片内部配列−標的増幅プライマー配列２−４ｂｐタグ−Ｇヌクレオチド−４５４シークエンスアダプター−４５４ＰＣＲアダプター−セファロースビーズ。
【０１０４】
４５４シークエンス実行のデータ処理
マイクロタイタープレートの各々の領域に対して、４５４のソフトウェアによるベースコーリング（塩基呼び出し）後に、ＦＡＳＴＡによりフォーマットされたシークエンスを備えたファイルが生成された。これらは１つのファイルへ連結された。このファイル内で、検索は、５ヌクレオチド（Ｃプラス４ｂｐタグシークエンス）が挿入されたフォワードプライマーの１００％マッチに対する正規表現により行なわれた。同様なことが、５ヌクレオチド（Ｃプラスタグシークエンス）により延長されたリバースプライマーで行なわれた。次にすべての配列を、個別のファイルにおいてそれらのタグ配列（プール識別子）によってグループ化した。各々のファイルはｓｓａｈａＳＮＰツールにより分析され、既知のエクソン１ヌクレオチド配列を参照とした。ｓｓａｈａＳＮＰツールは、すべての単一ヌクレオチド配列差異、及び４５４シークエンス対参照ゲノムの「インデル」（変異誘発又は誤ったベースコーリングのいずれかの結果としての単一の塩基挿入又は単一の塩基欠失）について報告した。これらの単一のヌクレオチド配列差異及びインデル統計はデータベース中に保存され、エラー率分析及び点変異同定のために使用された。
【０１０５】
４５４シークエンシングのエラー率
組み合わせた２８のプールすべてに対するデータ処理から得られた正確な配列の総数は、２４７０５２であった。配列は、フォワードプライマー及びエクソン１のＰＣＲ産物（１２８５９４＝５２％）のコード鎖（５’末端）でアライメントさせた群、並びにリバースプライマー及びＰＣＲ産物（１１８４５８＝４８％）の相補鎖でアライメントさせた群の、２つの群に分割された。異なるプール及びアライメント群の各々から得られた配列の数は、６９〜７２６９にわたった。平均では、３０７２のＭ２ファミリーの各々は、配列の全回収において８０回及び各々の対立遺伝子で４０回で表わされたものとする。
【０１０６】
フォワードプライマーに対応するアライメント群の内では、１２８５９４配列のうちの１３３８（１．２％）は、アライメントさせた標的配列の６３塩基のストレッチに沿ったｅＩＦ４Ｅ参照配列に関して、１つ又は複数の単一のヌクレオチド配列差異を示した。リバースプライマー群については、１１８４５８配列のうちの７４３（０．６％）は、アライメントさせた標的配列の１０２塩基のストレッチに沿ったｅＩＦ４Ｅ参照配列に関して、１つ又は複数の単一のヌクレオチド配列差異を示した。したがって、両方を組み合わせた配列群に対する単一の塩基置換エラー率は、１６５塩基ストレッチに対して０．８４％又は塩基位置当たり０．００５１％（１００００の塩基当たり０．５のエラー）に等しい。このエラー率は、テスト配列における個別の読み取られた置換エラーについては、Margulies et al.によって報告されたエラー率の０．００４％に類似しているが、全ゲノム再シークエンシング（０．６８％）に対するよりもはるかに低い。
【０１０７】
両方のアライメント群中のインデルの出現率の同様の分析は、合計２４７０５２の配列（１６５ｂｐストレッチ中に３．１％である）中の３８８３（フォワードプライマー群）及び３８２９（リバースプライマー群）のインデル出現率を示した。したがって、インデル出現率は、塩基位置当たり０．０１８９１％（１００００塩基当たり１．８９のインデル）と等しい。インデル率は、塩基置換エラー率よりも高い。組み合わせた両方のタイプのシークエンシングエラーは、平均で１００００塩基当たり２．３９の頻度で、又は塩基位置当たり０．０２４で生じる。このエラー率は、Margulies et al.によって報告されたよりもはるかに低く、ｅＩＦ４ｅエクソン１配列中に長いホモポリマーストレッチが存在しないことによって説明されるだろう。
【０１０８】
標的遺伝子座中の変異の検出
このスクリーニングの目的が（ＥＭＳ）誘導点変異（優先的にＣ→Ｔ変異及びＧ→Ａ変異）の同定であるので、参照配列に対する比較においてインデルを表わす配列はすべて、この実施例における分析のために廃棄された。大部分の単一の塩基置換は、任意の与えられた３Ｄプールにおいて一度のみ生じ、いくつかは２回若しくは３回、又は稀により頻繁に生じる。これらの単一の塩基置換は、アライメントさせた配列のすべての位置で一様に、且つ、均一の頻度で塩基当たり０．００５％で生じるので、それらは、シークエンシングエラーを表わし、変異体ライブラリー中に存在する特異的変異ではないと憶測された。しかしながら、スキャンされた配列中の少数の特異的塩基位置では、特異的な単一の塩基配列差異がはるかに高い発生で生じる。以下の基準が満たされる場合、そのような単一の塩基配列差異はライブラリー中の変異を示す：
１．単一の塩基配列差異はＣ→Ｔ又はＧ→Ａの変異を表わす。
２．出現率は、３Ｄプール当たり１００００配列読み取り当たり、２０以上である。
３．単一の塩基配列差異が、正確に１つ及び多くて１つの、Ｘプール、Ｙプール及びＺプールに生じる。
この実施例において、そのような変異の１つは、リバースプライマーに対応するアライメント群中にｅＩＦ４Ｅエクソン１配列の塩基位置２２１で発見された。Ｇ→Ａ変異（相補的な鎖におけるＣ→Ｔに対応する）であるこの変異が、１００００の配列当たり７０の頻度でプールＸ１２中に、１００００配列当たり３３の頻度でプールＹ３中に及び１００００配列当たり６２の頻度でプールＺ６中に生じた。同様な位置でのこの同様な変異は、バックグラウンドエラーレイトにおいても生じず、他のプールのうちのいずれかにも生じなかった。
【０１０９】
３つのプールのみの中のこのＧ２２１Ａ変異の特有の出現は、ＤＮＡのもとの４重プールの同定を可能にし、４つのＭ２ファミリーを表した。これらの４つのＭ２ファミリーの各々のＤＮＡは、表１及び表２のフォワードプライマー及びリバースプライマーと同一のプライマー０６Ｆ５９８及び０６Ｆ５９９（しかし５’の５塩基配列タグなしの）により個別に増幅された。増幅されたＰＣＲ産物を通常のサンガー法のシークエンシングにかけた。４つのファミリーのうちの１つのｅＩＦ４Ｅ遺伝子の配列（「２４」とコードされた）は、オーバーラップするＧ及びＡに対応する位置２２１での２つのピークを示した。これは、対立遺伝子の半分は野生型で、他方の半分がＧ２２１Ａ点変異を保有するＭ２ファミリープールを示す（図２）。塩基位置２２１付近の他のＭ２ファミリーの配列は、参照（野生型）に従うものだった。
【０１１０】
この変異は、アルギニンに対してグルタミン置換をもたらす。この特定のＭ２ファミリーの種子は、ホモ接合変異体個体について選択するために温室で植えられ、それは、表現型を示すために使用されるだろう。
【０１１１】
同様の様式で、２つの他の点変異が４５４配列読み取りにおいて同定された。したがって、Ｍ８２トマト変異体ライブラリーの変異密度の推定は、１６５ｂｐにスキャンされた配列当たり３つの変異又は３０７２のＭ２ファミリー中の１０００塩基当たり１８の変異と等しい。これは、シロイヌナズナ（Greene et al., Genetics 164: 731-740, 2003）に対して報告された変異密度に相当する。
参考
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Duprat et al., 2002. The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses. Plant J. 32: 927-934.
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McCallum et al., 2000. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology 18: 455-457.
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Lloyd et al., 2005. Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 102: 2232-2237.
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Ruffel et al., 2002. A natural recessive resistance gene against potato virus Y in pepper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E). Plant J. 32: 1067-1075.
Ruffel et al., 2005. The recessive potyvirus resistance gene pot-1 is the tomato orthologue of the pepper pvr2-eIF4E gene. Mol. Gen. Genomics 274: 346-353.
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Stuart and Via, 1993. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications. Biotechniques, 14: 748-750.
Vandenbussche et al., 2003. Toward the analysis of the petunia MADS box gene family by reverse and forward transposon insertion mutagenesis approaches: B, C, and D floral organ identity functions require SEP ALLAT A-like MADS box genes in petunia. The Plant Cell 15: 2680-2693.
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ＥＭＳ誘発変異を同定するための遺伝子のショットガンシークエンシングからもたらされるクラスタリングされた配列の図式的な表示を示す図である。変異はより明るい色、シークエンスエラーはより暗い色で塗られた。シークエンスエラーは無作為に及び大抵の場合ただ一度のみ観察されることが予想される。
【図２】３Ｄプールされたライブラリーからの４ｂｐタグを付けたＰＣＲプライマーにより増幅された１００ｂｐの遺伝子領域からもたらされるクラスタリングされたタグを付けたシークエンシングの図式的な表示を示す図である。変異はより明るい色、シークエンスエラーはより暗い色で塗られた。植物識別情報は、３つのタグ（１、２、３）及び（４、５、６）により同定された変異で識別されるが、２つ未満のタグ（７、８）により同定された変異で識別されない。シークエンスエラーは無作為に及び大抵の場合ただ一度のみ観察されることが予想される。
【図３】配列のタグ付けにおいて使用する長いＰＣＲプライマー及び短いＰＣＲプライマーのシステムの図解を示す図である。
【図４】２８の３Ｄプールの各々に対するｅＩＦ４Ｅエクソン１増幅のＰＣＲ増幅収率のアガロースゲル推定を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び遺伝学の分野において、ハイスループットシークエンシング技術の使用に基づいた、集団中の変異の同定のために改良されたストラテジーに関する。本発明は、更に、本方法に適用できるキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
重要な形質に影響する遺伝子を逆遺伝学（reverse genetics：リバースジェネティクス）アプローチによって同定、識別するために、誘発された変異又は天然に存在する変異のいずれかを保有する個体の集団は、最新のゲノミクス研究において使用される。この研究は、農学的に重要な植物及び作物に対して特に適用可能であるが、これら個体の集団は、酵母、細菌等の他の生物にも有用である。動物、トリ、哺乳類等の他の生物も使用することができるが、典型的には、これらの集団の採取又は制御は、より煩わしい。それにもかかわらず、本明細書において記述される本発明が非常に一般的な性質のものであり、そのような生物にも適用することができることが観察される。
【０００３】
変異させた集団（mutagenized populations）は、機能欠損変異に対する既知遺伝子のスクリーニング（assessing：選別）又は変異遺伝子を有する生物における表現型変化の評価のために一般に使用されるように、突然変異した集団は遺伝子の発見のための相補的なツールである。律速段階は、それぞれ、対象となる遺伝子中に変異を保有する生物の同定に関連したスクリーニング研究である。以下で、そのような集団の本質及びスクリーニング方法はより詳細に記述され、遺伝子の発見のためのこれらのツールの価値を増加させる、より効率的なスクリーニング方法が示される。
【０００４】
変異させた集団を使用する技術は、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）による処理によって、又は電離放射線（高速中性子照射）（Li et al.The Plant Journal, 2001, 27, 235-42）によって、ゲノムへの多数変異（ほとんどヌクレオチド置換）を無作為に導入することによるＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化誘発局所的損傷（Targeted Induced Local Lesions In Genomes））（McCallum et al., Nat. Biotechnol 2000, 18, 455-457, McCallum et al., Plant Physiology, 2000, 123, 439-442; Till et al.Genome Research 2003, 13, 524-530）として既知である。この集団中のすべての植物は、数百の（又は数千の）変異体を保有し、そのうちのいくつかは、正常な発生、形態に影響するか、そうでなければ、１つ又は複数の遺伝子若しくはその遺伝子の調節配列の機能欠損（ノックアウト、ノックダウン）による表現型を与える。ＴＩＬＬＩＮＧ集団は、一般に、複数の独立した変異体（１つの遺伝子当たり５〜２０個）ですべての遺伝子をカバーするために、十分な数の植物を含んでいる。したがって、ＴＩＬＬＩＮＧにおいて使用される変異させた植物集団は、通常、３０００〜１００００の植物から成り、以下に示す２つの方法において使用することができる。
【０００５】
逆遺伝学
「逆遺伝学」は、ＴＩＬＬＩＮＧ集団を使用する最も一般的な方法である。対象となる遺伝子は、例えば、転写プロファイリング又は候補遺伝子アプローチによって同定され、応答すべき問題は、この遺伝子が対象となる或る特定の表現型形質に影響するかどうかである。したがって課題は、この遺伝子の機能欠損変異を有する１つの（又はいくつかの）植物を同定することである。これは、典型的には、下記工程を含む多重工程のスクリーニング過程において一般に実行される：
１．ＴＩＬＬＩＮＧ集団の多数の（プールした）Ｍ２植物（例えば３０７２個）のゲノムＤＮＡを単離する。
２．１つのプール当たり８〜３２の植物からの等しい量のＤＮＡのプールは、ＣＥＬ Ｉスクリーニング系の感受性に依存するプールレベルで集められる（以下を参照）。これは３０７２の植物の場合には、合計９６〜３８４のプールしたＤＮＡサンプルをもたらす。
３．すべてのプールされたＤＮＡからの遺伝子の部分を増幅するために、標識されたＰＣＲプライマーを使用する。オーバーラップしたＰＣＲ断片を、遺伝子全体をカバーするために使用する（例えば、６００ｂｐである複数のＰＣＲ断片が１５００ｂｐである１個の遺伝子から３回増幅される）。
４．プールされたＤＮＡサンプルから採取されたＰＣＲ産物のヘテロ二本鎖を調製し、単一のヌクレオチド配列のミスマッチを認識し切断するＣＥＬ Ｉ又は他の酵素（例えば、マングビーンヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ及びサーベイヤー（Surveyor）等）と共にインキュベートし、処理されたサンプルを変性（シークエンシング）ゲル上で又はキャピラリー電気泳動法によって分離する。
５．遺伝子中の変異を保有する植物を含むプールは、ＣＥＬ Ｉ処理に起因する消化産物のバンドを観察することにより同定される。
【０００６】
変異を保有する植物を同定するために、陽性プールにおける植物の個別のＤＮＡに対してＰＣＲが反復して行われ、双方向サンガー法のシークエンシングが続いて行われる。
【０００７】
変異と観察された表現型変化との間の因果関係を立証するために、変異を有する植物を成長させ、野生型に対して外部交配する。
【０００８】
ＣＥＬ Ｉスクリーニング（上記の工程の３〜５）の利点は、プールされたサンプルをあらかじめスクリーニングすることによって、サンガー法のシークエンシングで個別にすべての植物をシークエンシングすることに要する費用を低減できることである。
【０００９】
しかしながら、ＣＥＬ Ｉスクリーニングの限界は、すべての同定された変異が遺伝子機能に影響するとは限らない（例えば、サイレント置換）ということであり、陽性のプールにおける個別の植物のＰＣＲ産物がシークエンスされるまではこのことはわからない。それにもかかわらず、ＣＥＬ Ｉを介したスクリーニング方法は、すべての植物のＰＣＲ産物の個別のシークエンシングと比較して、コストが削減される。
【００１０】
別の限界は、ＣＥＬ Ｉスクリーニングがゲルの泳動及びスコアリング（ゲルパターンが常に明瞭だとは限らないので、第２鎖からの変異の確認を必要とする比較的煩わしい過程）を含んでいるということである。
【００１１】
第３の短所は、ＣＥＬ Ｉスクリーニングでは、ＰＣＲ産物の末端での変異の検出に対して比較的感度が悪く、結果的に、これらの変異は検出されにくいと云うことである。ＣＥＬ Ｉのさらなる短所は、この酵素が塩濃度のような反応条件に対して非常に影響を受けやすいことが発見されたということである。このことは、酵素を限られた数のバッファーにおいてのみにしか使用することができず、その結果としてＣＥＬ Ｉの広範囲の使用を妨げる。ＣＥＬ Ｉの適用に関連した別の実際的な短所は、ミスマッチしたすべてのヘテロ二本鎖を切断した場合、酵素は確実ではないということである。
【００１２】
最終的に、ＣＥＬ Ｉスクリーニングは、ミスセンス変異（それらは最も優勢なものである）とナンセンス変異とを区別することができず、対象となる変異を得ることなく、陽性プールに対して多くのスクリーニング研究が行なわれる原因となる。
【００１３】
順遺伝学（Forward Genetics：フォワードジェネティクス）
変異させた集団の植物を成長させ、対象となる形質について表現型の分析を行なった。次に、対象となる表現型に連鎖していない変異を外部交配するために、対象となる表現型を有する植物を野生型の植物と交配する。最終的に、対象となる表現型に関連する原因変異遺伝子は、従来の遺伝学的マッピング集団（Ｆ２、ＲＩＬ（組換え近交系統）等））におけるマッピングＱＴＬ（量的形質遺伝子座）と類似したポジショナルクローニング（遺伝的マーカーを使用して）によって同定される。理論上可能ではあるが、変異させた集団は、一般にはこのように使用されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、変異させた集団のスクリーニングに対する既存のストラテジーを部分的に改良する。本発明は、変異の存在に対して多くの集団をスクリーニングする効率的な方法を提供し、遺伝子機能への影響に対する変異の効率的な評価を改良し、すなわち遺伝子機能の変更をもたらさない変異のスクリーニングに費やされる負担の量を減少させることを目的とする。本方法は、ＣＥＬ Ｉ酵素又はその同等物の使用を回避するように設計された。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、ハイスループットシークエンシングストラテジーを使用して上述の目標が達成されることを見出した。また、ＴＩＬＬＩＮＧ集団のような変異させた集団、変異が（合成）変異原性オリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド損傷ＤＮＡを使用して、又はすなわち標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）若しくは領域標的化変異誘発（ＲＴＭ）によって導入されたことを特徴とする集団、又は一塩基多型（ＳＮＰ）、小さな挿入及び欠失、並びにマイクロサテライト反復数における変化のような天然に存在する変異を含む集団については、対象となる変異の存在が効率的にスクリーニングすることができることも見出した。
【００１６】
定義
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む、明細書及び特許請求の範囲についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特別に本明細書において定義されないならば、使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照によりそれら全体は本明細書において援用される。
【００１７】
「ＴＩＬＬＩＮＧ」即ち「ゲノム中の標的化誘発局所的損傷」は、対象となる領域中の点変異を同定するための一般的な逆遺伝学的ストラテジーであり、ここでは、ＰＣＲに基づいたスクリーニングと組み合わせた、無作為の化学的変異誘発又は物理的変異誘発によって誘発された（点）変異の対立遺伝子のシリーズを提供する。ＴＩＬＬＩＮＧスクリーニングにおいて、対象となる領域はＰＣＲによって増幅される。野生型の断片と誘発変異を有する断片との間のヘテロ二本鎖は、ＰＣＲ産物の変性及びアニーリングによって形成される。これらのヘテロ二本鎖はＣＥＬ Ｉによって切断され、切断された産物は分離される。スループットはプールすることによって増加することができる。プール中の配列差異を有するＰＣＲ産物の発見に続いて、プール中に含まれるＰＣＲ産物は個別のＰＣＲ産物のサンガー法のシークエンシングによって共通して再びスクリーニングされ、それによって変異体植物及び変異遺伝子中の厳密な配列差異を同定する。
【００１８】
「変異させた集団」は、変異体のライブラリーを産出するために変異誘発（化学的又は物理的な）された生物の集団（通常は植物であるが、ショウジョウバエ及びマウスのような動物を含む他の生物を、変異させた集団を生成するために使用してもよい；Schimenti et al., 1998, Genome Research 8:698-710）を指す。ＴＩＬＬＩＮＧ集団は、サイズにおいて広く変化してもよく、或る特定の目的のためには、もとの集団の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％又は２０％のみを含む部分的なＴＩＬＬＩＮＧ集団を使用することができる。変異させた集団に対する代替物として、集団を変異させないが、一塩基多型（ＳＮＰ）、小さな挿入及び欠失のような天然に存在する変異、並びにマイクロサテライト反復数における変化を含む亜集団から成ることを特徴とする集団を使用することができる。変異させた集団が容易に入手可能でない場合（ヒト）、又は前に大きい生殖質が既に入手可能な場合には、これらの集団は特に有利である。例えばComai et al., The Plant Journal, 2004, 37, 778-786を参照。そのような集団は「参照ＤＮＡ」と組み合わせて使用することができる。
【００１９】
「標的化ヌクレオチド交換」即ち「ＴＮＥ」。標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）は、特異的な部位で、染色体遺伝子又はエピゾーム遺伝子中の部位に部分的に相補的な合成オリゴヌクレオチドが、単一のヌクレオチドの反転を導く過程である。ＴＮＥは様々なオリゴヌクレオチド及び標的を使用して記述されてきた。報告されたオリゴヌクレオチドのうちのいくつかは、ヌクレアーゼ抵抗性を与えるための末端修飾を含むＲＮＡ／ＤＮＡキメラである。
【００２０】
「領域標的化変異誘発」即ち「ＲＴＭ」。領域標的化変異誘発は、ゲノムＤＮＡのあらかじめ定められた標的部位での二本鎖切断が人工的に生成される過程であり、大半は切断の部位での変異に結びつくような、様々な利用可能な細胞の修復機構のうちの１つによる切断の修復をもたらす。二本鎖切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（例えば、Lloyd et al., 2005を参照）、Ｉ−Ｓｃｅ１のようなメガヌクレアーゼ（Epinat et al., 2003）、又は変異原性化学基に結合された三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（Havre et al., 1993）の細胞核の中への導入によって生成されてもよい。
【００２１】
「核酸」：核酸は、本明細書において使用されるように、ピリミジン塩基及びプリン塩基を有するヌクレオチド、好ましくはそれぞれシトシン、チミン（又はウラシル）、アデニン及びグアニンの任意のポリマー又はオリゴマーを含んでもよい（Lehninger、生化学の原理（Principles of Biochemistry）、７９３〜８００ページ（ウォース出版（Worth Pub.）1982）を参照、すべての目的のために参照によりそれら全体は本明細書において援用される）。任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸の構成要素、及びこれらの塩基のメチル化型、ヒドロキシメチル化型又は糖鎖が付加した型を有するもの等のような、それらの任意の化学的な変形が含まれる。ポリマー又はオリゴマーは、組成において不均質又は均質であってもよく、天然に存在するソースから単離されるか又は人工若しくは合成で産生されてもよい。核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はその混合物であってもよく、一本鎖形式又は、ホモ二重鎖状態、ヘテロ二重鎖状態、及びハイブリッド状態を含む二本鎖形式で永続的に又は一時的に存在してもよい。
【００２２】
「タグ付け」（Ｔａｇｇｉｎｇ）は、核酸と第２の核酸又はさらなる核酸の区別を可能にするための、その核酸へのタグ又は標識の付加を指す。タグ付けは、例えばタグを付けたプライマーを使用して、増幅時の配列識別子の付加することにより、又は当該技術分野において既知の他の手段により実行することができる。そのような配列識別子は、特異的な核酸サンプルの同定のために独自に使用される、変化するが定義された長さのユニーク塩基配列になり得る。代表的な例はＺＩＰ配列である。そのようなタグを使用して、サンプルの起源を次の処理の際に決定することができる。異なる核酸サンプルから生じる処理された生成物の組み合わせの場合には、異なる核酸サンプルは異なるタグを使用して一般に同定される。
【００２３】
「タグを付けたライブラリー」は、タグを付けた核酸のライブラリーを指す。
【００２４】
「シークエンシング」は、核酸サンプル、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡにおいてヌクレオチド（塩基配列）の順序を決定することを指す。
【００２５】
「アライメントさせること及びアライメント」は、同じヌクレオチド又は類似するヌクレオチドの短いストレッチ又は長いストレッチの存在に基づいた、２つ以上のヌクレオチド配列の比較を意味する。さらに以下で説明されるように、ヌクレオチド配列のアライメントのためのいくつかの方法は当該技術分野において既知である。時には、用語「アセンブリー」又は「クラスタリング」は、同義語として使用される。
【００２６】
「ハイスループットスクリーニング」（ＨＴＳ）は、特に生物学及び化学の分野に関連する科学的な実験の方法である。最新のロボット工学と他の特殊化した研究室ハードウェアとの組み合わせによって、ＨＴＳは、研究者が効果的に同時に（又は実質的に同時に）多数のサンプルをスクリーニングすることを可能にする。
【００２７】
「プライマー」は、一般には、ＤＮＡの合成をプライミングするＤＮＡ鎖を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーなしにはデノボでＤＮＡを合成することができない。プライマーは、組み立てられるヌクレオチドの順序を指示するために、鋳型として相補鎖が使用される反応において、既存のＤＮＡ鎖のみを延長することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される合成オリゴヌクレオチド分子は、本明細書においてプライマーと呼ばれる。
【００２８】
「増加した親和性を有するプライマー」は、ＰＮＡ又はＬＮＡのような修飾されたヌクレオチドを有するプライマーであり、それらの熱安定性を増加させ、単一のヌクレオチド配列の差異に基づいた対立遺伝子特異的な増幅を可能にする。これを達成するために、１つ又は複数の修飾されたヌクレオチドが好ましくはプライマーの３’末端に、しばしば含まれる。
【００２９】
「ＤＮＡ増幅」は、典型的には、ＰＣＲを使用する二本鎖ＤＮＡ分子の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における合成を表わすために使用される。なお、他の増幅方法が存在し、それらは本発明において使用されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
１つの態様において、本発明は、
（ａ）変異させた集団の各メンバーのゲノムＤＮＡを単離して、集団の各メンバーのＤＮＡサンプルについて提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で採取されたＤＮＡをプールする工程と、
（ｃ）１組の（任意的に標識された）プライマーによりＤＮＡプールから標的配列を増幅する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の増幅産物をプールして、増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
（ｅ）ライブラリー中の増幅産物を任意的に断片化する工程と、
（ｆ）ハイスループットシークエンシングを使用して、産物及び／又は断片のヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｇ）断片の配列をクラスタリングすること（アライメントさせること）によって変異を同定する工程と、
（ｈ）標的配列の修飾された機能について同定された変異をスクリーニングする工程と、
（ｉ）同定された変異へハイブリダイズするように向けられたプライマーを設計する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）のプライマー、及び工程（ｃ）のプライマーのうちの１つにより工程（ｄ）のライブラリーを増幅する工程と、
（ｋ）変異を保有するメンバー（複数可）を同定する工程と、
（ｌ）任意で、工程（ｃ）のプライマーを使用して工程（ｋ）のメンバー（複数可）からの標的配列を増幅することによって変異を確認する工程及び増幅された産物の配列を決定する工程と
を含む、変異させた集団のメンバーの標的配列中の変異の検出のための方法へ向けられる。
【００３１】
ＤＮＡの単離は、一般には、集団のメンバーからの組織の回収、ＤＮＡ抽出（例えば、Ｑ−バイオジーン高速ＤＮＡキット（Q-Biogene fast DNA kit）を使用して）、１つのサンプル当たり等しい量のＤＮＡを採取するための定量化及び正規化のような当該技術分野における一般の方法を使用して達成される。実施例として、本発明は、３０７２の植物のＴＩＬＬＩＮＧ集団及び１５００ｂｐの遺伝子に基づいて図示される。
【００３２】
単離されたＤＮＡのプーリングは、例えば三次元プーリングスキームを使用して達成できる（Vandenbussche et al., 2003, The Plant Cell, 15: 2680-93）。プーリングは、好ましくは等しい量のＤＮＡを使用して達成される。３Ｄプーリングスキームは、１５×１５×１４を含んでもよく、１つのプール当たり３０７２／１４＝２１９又は３０７２／１５＝２０５の異なるＤＮＡサンプルを含む４４プール（１５＋１５＋１４）をもたらす。
【００３３】
プールする工程は、典型的には、ＰＣＲスクリーニングの１回後に観察された変異を含む植物を同定する役目をする。ＤＮＡのプーリングはさらに、ＰＣＲ増幅の前に、シークエンシングのためのライブラリーにおいてより等しい表示を提供するために、ＤＮＡを正規化する役目をする。ＤＮＡのプーリングのさらなる利点は、特にタグを付けたライブラリーが使用される場合には、すべての配列を別々に決定しなければならないのではなく、このプールは対象となる配列の迅速な同定を可能にすることである。これは、大きな集団又は複雑な集団のスクリーニングを特に容易にする。
【００３４】
プールからの１組の任意に標識されたプライマーによる標的配列の増幅は、対象となる遺伝子を増幅するために設計した１セットのプライマーの使用によって、達成することができる。上で述べたように、プライマーは対象となる遺伝子の増幅産物を可視化するために標識されてもよい。
【００３５】
増幅産物は、好ましくは、それによって増幅産物のライブラリーを作成するために、等しい量又は正規化された量でプールされる。例示的には、ライブラリーの複雑度は３０７２植物数×１５００ｂｐ遺伝子配列＝４．６Ｍｂ配列になるだろう。
【００３６】
ＰＣＲ産物の長さがシークエンストレースの平均長を上回った場合には、ライブラリー中の増幅産物は、断片のシークエンシングの前に無作為に断片化されてもよい。断片化は物理的な技術（すなわち、剪断、超音波処理又は他の無作為な断片化方法）により達成することができる。工程（ｆ）において、ライブラリー中に含まれている少なくとも一部分、好ましくは、すべての断片の少なくとも一部分、更に好ましくは、ヌクレオチド配列の全体が決定される。或る特定の実施形態において、断片化の工程は任意である。例えば、シークエンシング技術で読み取られた長さとＰＣＲ断片の長さが、ほぼ同じである場合、断片化の必要はない。またＰＣＲ産物の一部のみがシークエンスされること、例えば１５００ｂｐのＰＣＲ産物であり、４００ｂｐの読み取り長さ（各サイドから）の場合には、７００ｂｐはシークエンスされないままであることが許容できるならば、より大きいＰＣＲ産物の場合においても、断片化は必要ではないかもしれない。
【００３７】
シークエンシングは、ジデオキシチェーンターミネーション法（サンガー法のシークエンシング）のような、当該技術分野において既知の、原則として任意の手段によって行われてもよいが、決定すべき配列が多数であることを考えるとあまり好まれない。しかしながらシークエンシングが、国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（すべては454 Life Sciencesの名称のもとに）、Seo et al.(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:5488-93による、及びHelios、Solexa、US Genomics等に開示された方法のような、ハイスループットシークエンシング方法を使用して実行されるときには、ジデオキシチェーンターミネーション法が好ましく有利であり、これらは、参照により本明細書に援用される。シークエンシングが、国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（すべては454 Life Sciencesの名称のもとに）中に開示された装置及び／又は方法を使用して実行されることは最も好ましく、これらは、参照により本明細書に援用される。記述された技術は、単一の実行において４０００万塩基のシークエンシングを可能にし、競合技術よりも１００倍高速で安価である。シークエンシング技術はおよそ、１）ＤＮＡの断片化、及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライブラリーを作成するための特異的なアダプターのライゲーションと、２）ビーズへのｓｓＤＮＡのアニーリング、油中水滴型マイクロリアクター中のビーズの乳化、及びビーズに対して個別のｓｓＤＮＡ分子を増幅するためのエマルジョンＰＣＲの実行と、３）ビーズの表面上に増幅されたｓｓＤＮＡ分子を含むビーズに対する濃縮の選別と、４）ピコタイタープレート（PicoTiterPlate）（登録商標）中のビーズを保有するＤＮＡの沈着と、５）ピロリン酸光シグナルの生成による少なくとも１０００００のウェル中の同時シークエン
シングとの５工程から成る。方法はより詳細に以下で説明されるだろう。
【００３８】
好ましい実施形態において、シークエンシングは、
（ａ）単一のアダプター化された断片が各々のビーズへアニールされている状態で、アダプター化された断片をビーズへアニールする工程と、
（ｂ）各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクター中でビーズを乳化する工程と、
（ｃ）各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェル中にビーズを入れる工程と、
ピロリン酸シグナルを生成する工程とを含む。
【００３９】
工程（ａ）において、シークエンシングアダプターは、ライブラリー中の断片へライゲーションされる。シークエンシングアダプターは、少なくともビーズへアニールするための「鍵となる」領域、シークエンシングプライマー領域及びＰＣＲプライマー領域を含んでいる。このように、アダプター化された断片は得られる。
【００４０】
第２の工程において、各々のビーズが単一のアダプター化された断片とアニーリングされる状態で、アダプター化された断片は、ビーズへアニールされる。大多数のビーズに対して１つのビーズ当たり１つの単一のアダプター化された断片のアニーリングを保証するように（ポアソン分布）、アダプター化された断片のプールへ、ビーズを過剰に追加する。
【００４１】
次の工程において、各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクター中でビーズは、乳化される。ＰＣＲ反応がマイクロリアクター内で行なわれることを可能にする油中水滴型マイクロリアクター中に、ＰＣＲ試薬は存在する。続いて、マイクロリアクターは破壊され、ＤＮＡを含むビーズ（ＤＮＡ陽性のビーズ）が濃縮される。
【００４２】
以下の工程において、各々のウェルが単一のビーズを含むように、ウェル中にビーズが入れられる。ウェルは、好ましくは大量の断片の同時シークエンシングを可能にするピコタイター（商標）プレートの一部である。
【００４３】
酵素を保有するビーズの追加後に、断片の配列は、ピロシークエンシングを使用して決定される。引き続く工程において、ピコタイター（商標）プレート及びビーズは、その中の酵素ビーズとともに、従来のシークエンシング試薬の存在下で異なるデオキシリボヌクレオチドにさらされ、デオキシリボヌクレオチドのとり込みに際して、記録される光シグナルが生成される。正確なヌクレオチドのとり込みは、検出可能なピロシークエンシングシグナルを生成するだろう。
【００４４】
ピロシークエンシング自体は、当該技術分野において既知であり、www.biotagebio.com、www.pyrosequencing.comのｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの項で特に詳しく記述されている。この技術は、例えば国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（すべて454 Life Sciencesの名称のもとに）においてさらに適用されており、それらは参照により本明細書に援用される。
【００４５】
変異は増幅されたライブラリー中のシークエンスされた断片のクラスタリングによって同定される。変異の同定は、ライブラリーの断片の決定された配列をアライメントさせることによって達成される。大多数の配列は野生型である（変異していない）が、誘発変異及び偶発的なシークエンシングエラーも観察される。増幅ライブラリーが複数倍の冗長度（典型的には約４〜５倍の冗長）でシークエンスされるので、同じ配列変化の複数の観察は、シークエンシングエラーというよりもむしろ変異を示す。図１を参照。
【００４６】
クラスタリングは、増幅されたライブラリー中の断片のアライメントを提供する。ライブラリー中の各々のＰＣＲ産物についてはこの方法で、クラスターはシークエンスされた断片から生成される、すなわち、断片のコンティグは工程（ｅ）における断片化から得られた様々な断片の配列のアライメントから構築される。
【００４７】
比較目的のための配列のアライメントの方法は、当該技術分野において既知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムは、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444、Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244、Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al.(1988) Nucl. Acids Res. 16:10881-90、Huang et al.(1992) Computer Appl. in the Biosci. 8:155-65、及びPearson et al (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31に記述されており、それらは、参照により本明細書に援用される。Altschul et al.(1994) Nature Genet. 6:119-29(参照により本明細書に援用される)は、配列アライメント方法及び相同性の計算の詳細な考察を提示する。
【００４８】
ＮＣＢＩの基本的局所アライメント検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool）（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., 1990）は、配列解析プログラムのｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連する使用について、国立生体情報センター（National Center for Biological Information）（ＮＣＢＩ、メリーランド州、ベテスダ）及びインターネット上を含むいくつかのソースから利用可能である。それは<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>でアクセスすることができる。このプログラムを使用して、配列同一性を決定する方法の説明は<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html>で利用可能である。
【００４９】
変異させた集団の分析において、変異が同定された後、同定された変異は、関連する遺伝子の修飾された機能（例えば終止コドンの導入）で評価される。この評価は、例えば６フレームでの翻訳によって配列自体に対して実行される。一旦対象となる変異が同定されたならば、集団の関連するメンバーを同定するために、変異は、さらに調べられる。
【００５０】
対象となる変異として分類された各々の変異について、対象となる変異を標的とする対立遺伝子特異的なプライマーが設計される。したがって、次に対立遺伝子特異的なプライマーは、プールされたＤＮＡサンプルの増幅において使用されるプライマーのうちの１つと組み合わせて使用される（リバースプライマー又はフォワードプライマーのいずれか）。１つのプライマー又は両方のプライマーが標識されてもよい。プライマーのセットは、ＤＮＡのプールを増幅するために使用される。陽性のプールは同定され、変異体植物が同定される。上述の３Ｄプーリングスキームにおいて、３ＤプールされたＤＮＡサンプルプレートをスクリーニングするためのプライマーのセットによる対立遺伝子特異的なＰＣＲは、３つの陽性プール（各々の次元において１つ）の同定をもたらし、変異体植物のライブラリーアドレスを規定する。
【００５１】
或る特定の実施形態において、対立遺伝子特異的プライマーは、それらの特異性を増加するためにロックされた核酸（Locked Nucleic Acids）（ＬＮＡ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）のような代わりのヌクレオチドを含む。そのような核酸は、当該技術分野において広く既知であり、供給業者の選択から市販で入手可能である。
【００５２】
変異の確認は、同定された変異体植物からの標的配列の増幅によって達成される。この増幅は、工程（ｃ）からのプライマーにより実行される。増幅された産物のヌクレオチド配列は、決定され、コンセンサス配列による比較によって変異は同定される。シークエンシングは、好ましくは、サンガー法シークエンシングで実行される。
【００５３】
１つの態様において、本発明は、
（ａ）集団における各々のメンバーのＤＮＡサンプルを提供するために、変異させた集団の各々のメンバーのゲノムＤＮＡを単離する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡをプールする工程と、
（ｃ）好ましくはプライマーのうちの少なくとも１つが、遺伝子特異的セクション、タグ及びシークエンスプライマー結合部位を含む、１組のタグを付けた（任意で標識した）プライマーにより、ＤＮＡプールから標的配列の一部又はセグメントを増幅する工程と、
（ｄ）増幅産物のライブラリーを作成するために工程（ｃ）の増幅産物をプールする工程と、
（ｅ）ハイスループットシークエンシングを使用して、増幅産物のヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｆ）断片の配列をクラスタリングすること（アライメントさせること）によって変異を同定する工程と、
（ｇ）タグを使用して、変異があるメンバー（複数可）を同定する工程と、
（ｈ）任意で、工程（ｃ）のプライマーを使用して工程（ｇ）のメンバー（複数可）からの標的配列の増幅により変異を確認する工程、及び増幅された産物の配列を決定する工程と
を含む、変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法に関する。
【００５４】
上で記述されるように、変異させた集団のメンバーのゲノムＤＮＡの単離及び単離されたＤＮＡのプーリングは、実質的に上記した手法で実行することができる。
【００５５】
標的配列の一部又はセグメントは、標識されてもよい１組のタグを付けたプライマーを使用して増幅される。好ましくは、各々の次元の各々のプールのために異なるプライマーが使用される。このことは、上記した例の場合、４４のフォワードプライマー及び４４のリバースプライマーが好ましいことを意味する。好ましくは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの各々は、
（ｉ）次のシークエンシング工程で使用することができるシークエンスプライマー結合部位と、
（ｉｉ）プライマー（及び結果として生じる増幅産物）を集団のもとのメンバーに連結する役目をするタグと、
（ｉｉｉ）対象となる標的配列（すなわち遺伝子）にアニールすることができる遺伝子特異的配列とを含む。
【００５６】
典型的な実施形態において、プライマーは、以下の順序を有する：
５’−シークエンスプライマー結合部位−タグ−遺伝子特異的ＰＣＲプライマー配列−３’
シークエンスプライマー結合部位及び遺伝子特異的なＰＣＲプライマー配列の長さは、一般のＰＣＲ使用において通常の長さであり、すなわち、独立して約１０ｂｐ〜約３０ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜２５ｂｐである。好ましくは、増幅される配列の部分又はセグメントは、下記に述べられるハイスループットシークエンシング技術を使用して、１回の実行でシークエンスすることができる長さに相当する。或る特定の実施形態において、部分又はセグメントは、約５０ｂｐ〜約５００ｂｐの間、好ましくは約７５ｂｐ〜約３００ｂｐ、及びより好ましくは約９０ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さを有する。上で述べられたように、この長さは、今なお開発されている技術を含む使用されたシークエンシング技術に応じて変化してもよい。
【００５７】
すべてのプール次元に相当するプライマーの各々に特有のタグ配列を含むプライマー（フォワード及び／又はリバース）を使用することによって、各々のタグ配列の特異的な植物起源は、タグの上流側にアニールされているシークエンスプライマーとして既知であり、このタグ配列は、各々の増幅産物中に存在する。或る特定の実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方は、タグを付けられる。他の実施形態において、フォワードプライマー又はリバースプライマー上でのみタグが付けられる。１つ又は２つのタグの間の選択は、状況に依存し、ハイスループットシークエンシング反応の読み取られた長さ及び／又は独立した妥当性検証の必要性に依存する。例えば、一方向にシークエンスされる１００ｂｐのＰＣＲ産物の場合には、１つのタグのみが必要とされる。２００ｂｐのＰＣＲ産物及び１００ｂｐの読み取り長さの場合には、効率を２倍に改良するので、二重のタグ付けが双方向シークエンシングと組み合わせて有用である。それは、さらに同じ工程で独立した妥当性検証の可能性を提供する。１００ｂｐのＰＣＲ産物が、２つのタグを付けたプライマーにより二方向にシークエンスされるとき、すべてのトレースは、配向にかかわらず、変異についての情報を提供するだろう。したがって、両方のプライマーは、どの植物がどの変異を含んでいるかについての「アドレス情報」を提供する。
【００５８】
タグは任意の数のヌクレオチドになり得るが、好ましくは２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド又は５ヌクレオチドを含む。４ヌクレオチドの並べ替えでは、２５６のタグが可能であるが、３ヌクレオチドの並べ替えは６４の異なるタグを提供する。使用される実例において、タグは好ましくは、＞１塩基で異なり、したがって、好ましいタグは４ｂｐの長さである。これらのプライマーを使用する増幅は、タグを付けた増幅産物のライブラリーをもたらす。
【００５９】
或る特定の実施形態において、増幅過程が、
（１）（ａ）５’−コンスタントセクションに連結された（ｂ）縮重タグセクション（ＮＮＮＮ）に連結された（ｃ）遺伝子特異的セクション−３’を含む、ロングＰＣＲプライマー、及び
（２）（ａ）５’−コンタクトセクションに連結された（ｂ）非縮重タグセクション−３’（すなわち、ＮＮＮＮの中の選別）から成り、次に増幅されるショートＰＣＲプライマーを含むことを特徴とするタグのシステムを使用することができる。非縮重タグセクションは、各々のサンプルに特有であり、例えば、サンプル１ではＡＣＴＧ、サンプル２ではＡＡＴＣ等である。ショートプライマーは、ロングプライマーのサブセットにアニールする。プライマーのコンスタントセクションは、シークエンスプライマーとして使用することができる。図３を参照。
【００６０】
ライブラリーは、好ましくは、すべての増幅されたプールからの等しい量のＰＣＲ産物を含む。例示的な実施例において、ライブラリーは、決定される３０７２植物数×１００ｂｐ＝３０７ｋｂの配列を含む。
【００６１】
ライブラリー中のＰＣＲ産物は、上で開示されるようなシークエンシング過程にかけられる。特に、ＰＣＲ産物は、ビーズに連結された配列に対応するシークエンスプライマー結合部位を使用して、ビーズに付けられている。したがって、本実施形態は、断片化及びアダプターライゲーションを必要としない。むしろ、この実施形態において、アダプターは、ＰＣＲプライマー設計を介してより早期に導入されてきた。このことは、本方法の信頼性を改良する。ビーズへのアニーリングに続いて、上で記述されるように、シークエンシングは、実行される、すなわち（１）油中水滴型マイクロリアクターにおけるビーズの乳化、（２）ビーズ上の個別のｓｓＤＮＡ分子を増幅するエマルジョンＰＣＲ、（３）それらの表面上の増幅されたｓｓＤＮＡ分子を含むビーズに対する濃縮の選別、（４）ピコタイタープレート（登録商標）にビーズを保有するＤＮＡの移入及び（５）ピロリン酸光シグナルを生成する方法による１０００００のウェルにおける同時シークエンシングである。典型的なアウトプットは、ライブラリーにおけるすべてのＰＣＲ産物の６６倍のカバー範囲を表わす約２００．０００×１００〜２００ｂｐ配列である。
【００６２】
上で記述されるように、クラスタリング及びアライメントは、実質的に上記した手法で実行される。変異を含む個別の植物は、タグを使用して同定することができる。実施例において、３つのタグの組み合わせは、陽性のプール、したがってプールにおける個別の植物の座標位置（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を意味する。
【００６３】
同定された変異体サンプルのＰＣＲ産物の再シークエンシングによる変異の確認は、上で記述された通りである。
【００６４】
様々なプーリングストラテジーは、本発明と共に使用することができ、それらの例は、多次元のプーリング（３Ｄプーリングを含む）又は行プーリング、列プーリング若しくはプレートプーリングである。
【００６５】
ここで使用することができるハイスループットシークエンシング方法は、例えばShendure et al., Science 309:1728-32中に記述されている。例は、微量電気泳動シークエンシング、ハイブリダイゼーションシークエンシング／ハイブリダイゼーションによるシークエンシング（ＳＢＨ）、増幅された分子に対するサイクリックアレイシークエンシング、単一の分子に対するサイクリックアレイシークエンシング、ポリメラーゼシークエンシングのようなノンサイクリック方法、単一分子方法、リアルタイム方法、エキソヌクレアーゼシークエンシング、又はナノポアシークエンシングを含む。
【００６６】
最適な結果を得るためには、断片又は増幅された産物は、十分な冗長度でシークエンスされるべきである。冗長度は、シークエンシングエラーと真の可能な変異との間の区別を可能にする。或る特定の実施形態において、シークエンシングの冗長度は、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５であるが、本発明のために必須でないが、実施例から理解できるように、１０より多くの、好ましくは２５より多くの、又はさらに５０より多くの冗長度は有利であると考えられる。
【００６７】
本発明の方法の利点は、とりわけ遺伝子機能へのそれらの影響についてコンピューター内で変異を評価することができるという事実にあり、選別が活性のある変異についてなされることを意味する。サイレント置換のみを与える変異に対して選択することができ、それによって全過程をより経済的及びより効率的にする。このことは、既知のＣＥＬ Ｉに基づいたＴＩＬＬＩＮＧ技術に対して、大きな利点である。即ち、ＣＥＬ Ｉに基づいたＴＩＬＬＩＮＧ技術では、大多数のＣＥＬ Ｉ変異がＣ／ＧからＴ／Ａへの転位であり、一般にそのうちの５％のみが終止コドンを生成するからである（Colbert et al.2001）。大部分は、関心の低いミスセンス変異である。集団における終止コドン変異を有するメンバーの効率的な認識は、過程を節約し、陽性のプールの個別のメンバーの補足スクリーニングのための必要性を回避する。
【００６８】
特に全標的配列がスクリーニングされる場合、すべての変異は、ＰＣＲ産物におけるそれらのポジションに関係なく等しい確率で見出すことができる。
【００６９】
本方法は、ＣＥＬ Ｉ消化（digestion）、ヘテロ二重鎖形成、及び、煩わしいゲルスコアリングの使用を避けることができる。したがって本発明は、ＣＥＬ Ｉ技術に関連したプーリングの限界に対して影響を受けない。
【００７０】
本発明は、さらに、特定の遺伝子又は形質に対する１つ又は複数の（標識された）プライマー、変異特異的なプライマー又は対立遺伝子特異的プライマーから成る群から選択された、１つ又は複数の化合物を含んでもよいキットに関する。本キットはさらに、ビーズ、シークエンシングプライマー、ソフトウェア、プーリングストラテジーのための説明及びキット自体について既知の他の構成要素を含んでもよい。或る特定の実施形態において、特異的変異（例えば、疾患に関連した変異）を発見する専用のキットが提供される。
【００７１】
ここで本発明は本明細書において以下で図示される。
【実施例】
【００７２】
ＴＩＬＬＩＮＧ集団のスクリーニングは、454 Life Sciencesのシークエンシング方法（Margulies et al., 2005）又はポロニーシークエンシング（Shendure et al., 2005）のような新規ハイスループットシークエンシング方法を使用することによって進めることができる。最新最先端技術である454 Life Sciences技術は、１回のシークエンシング実行においておよそ２０Ｍｂの配列をもたらす。読み取りの長さは、１回の読み取り当たりおよそ１００ｂｐである。１５００ｂｐ遺伝子中の変異に対して３０７２の植物から成る集団のスクリーニングを想定して（上記の引用された参照の２章中に記述されているように）、２つのアプローチが意図され、より詳細に以下で記述される、すなわち
（１）１５００ｂｐ遺伝子全体がＥＭＳ誘発変異の存在について調べられる場合のアプローチ及び
（１）１つ又は複数の１００ｂｐストレッチがＥＭＳ誘発変異の存在について調べられる場合のアプローチである。
実施例Ｉ
【００７３】
１５００ｂｐ領域全体のスクリーニング：
ＴＩＬＬＩＮＧ集団の３０７２の植物のゲノムＤＮＡを単離する。１植物当たり等量のＤＮＡの３Ｄプーリングスキームを構築し（例えば、１５×１５×１４）、３０７２／１４＝２１９又は３０７２／１５＝２０５の異なるＤＮＡサンプルを含む４４プール（１５＋１５＋１４＝４４）がもたらされる。（Vandenbussche et al.、上記）。
【００７４】
このプーリング工程は、ＰＣＲスクリーニング（工程８）の１ラウンド後に、観察される変異を含む植物の同定を可能にする役目をする。ゲノムＤＮＡのプーリングは、すべてのＤＮＡが配列ライブラリー中で等しく表わされる可能性を増加させるために、ＰＣＲ増幅に先立ってＤＮＡを正規化する役目をさらにする。
【００７５】
１５００ｂｐ遺伝子は、１組の標識されていないＰＣＲプライマーを使用して、プールされたＤＮＡサンプルから増幅される。
【００７６】
すべてのプールウェルからの等量のＰＣＲ産物は、プールされたＰＣＲ産物ライブラリーを作成するためにプールされる（複雑度３０７２植物×１５００ｂｐ＝４．６Ｍｂ配列）。
【００７７】
ＰＣＲ産物が、無作為に断片化され、個別のビーズ上で増幅され、ビーズ上でシークエンスされる、プールされたＰＣＲ産物ライブラリーは、従来技術（454 Life Sciencesにより提供される技術のような）を使用するショットガンシークエンシングにかけられる。アウトプットは、ライブラリー中のすべてのＰＣＲ産物の４倍〜５倍のカバー範囲を表わすおよそ２０００００の１００ｂｐ配列である。
【００７８】
すべての配列がクラスタリングされる。大多数の配列は野生型であるが、ＥＭＳ誘発変異（及びシークエンスエラー）も観察される。ＰＣＲ産物が４倍〜５倍の冗長度でシークエンスされるので、同じ配列変化の複数回の観察は、シークエンシングエラーというよりもむしろ変異を示す（図１）。
【００７９】
変異は、終止コドンの導入のような遺伝子機能へのそれらの影響に対して評価される。
【００８０】
対象となる変異を標的とする対立遺伝子特異的なプライマー（３’でロックされた核酸、ＬＮＡ、又はペプチド核酸、ＰＮＡをともなう）は、３ＤプールされたＤＮＡサンプルプレートをスクリーニングするために、工程３において使用されるフォワードプライマー又はリバースプライマーのいずれかと組み合わせて使用されるように設計される。対立遺伝子特異的なＰＣＲは３つの陽性のプール（各々の次元のうちの１つ）をもたらし、それは変異体植物のライブラリーアドレスを規定する。
【００８１】
工程３のプライマーを使用して１５００ｂｐ遺伝子を増幅し、後続するサンガー法のシークエンシング（双方向）によって変異を確認した。
実施例ＩＩ
【００８２】
１００ｂｐストレッチのスクリーニング
（１００ｂｐは１回の４５４シークエンス実行の読み取りの長さである）
ＴＩＬＬＩＮＧ集団の３０７２の植物のゲノムＤＮＡを単離する。１植物当たり等量のＤＮＡの３Ｄプーリングスキームを構築し（例えば、１５×１５×１４）、３０７２／１４＝２１９又は３０７２／１５＝２０５の異なるＤＮＡサンプルを含む４４プール（１５＋１５＋１４＝４４）がもたらされる。（Vandenbussche et al.、上記）。
【００８３】
このプーリング工程は、シークエンスデータから観察された変異を直接含む、植物の同定を可能にする役目をする。ゲノムＤＮＡのプーリングは、すべてのＤＮＡが配列ライブラリー中で等しく表わされる可能性を増加させるために、ＰＣＲ増幅に先立ってＤＮＡを正規化する役目をさらにする。
【００８４】
遺伝子の１００ｂｐ（又は２００ｂｐ）領域を、タグを付けた標識されていないＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲによってプールから増幅する。この増幅は、以下の配置を備えた４４のフォワードプライマー及び４４のリバースプライマー（各々の次元の各々のプールについて１つ）を必要とする：
５’−シークエンスプライマー結合部位−４ｂｐタグ−遺伝子特異的プライマーシークエンス−３’。
【００８５】
すべてのプール次元を表わす４４のプライマーの各々に対して異なる４ｂｐ配列タグを含む、テーリングフォワードプライマー及びテーリングリバースプライマーの使用によって、各々の配列の特異的な植物起源は、タグの上流にアニールされたシークエンスプライマーとして既知である。したがって、タグ配列は、各々のシークエンストレース中に存在する。４ｂｐタグは４４＝２５６の異なるタグを与える。３ｂｐタグは、４４タグを区別するのに十分な６４の異なるタグ配列を可能にするが、１つより多い塩基で異なるタグ配列が好ましい。
【００８６】
すべてのプールウェルからの等しい量のＰＣＲ産物は、プールされたＰＣＲ産物ライブラリーを作成するためにプールされる。（複雑度３０７２植物×１００ｂｐ＝３０７ｋｂ配列）。
【００８７】
プールされたＰＣＲ産物ライブラリーは、シークエンシングのために４５４へ提供される、すなわち、ＰＣＲ産物はビーズ上で増幅及びシークエンスされる。アウトプットは、ライブラリーにおけるすべてのＰＣＲ産物の６６倍のカバー範囲を表わすおよそ２０００００の１００ｂｐ配列である。
【００８８】
すべての配列（いずれかの方向からの）がクラスタリングされ、大多数の配列は野生型配列であるが、ＥＭＳ誘発変異（及びシークエンスエラー）が同様に観察される。ＰＣＲ産物は、６６倍の冗長度でシークエンスされるので、同じ配列変化の複数回の観察は、シークエンシングエラーというよりもむしろ変異を示す（図１）。
【００８９】
変異を含む個別の植物の座標位置は、変異を有するシークエンストレースの生じる３つのタグ配列に特有の組み合わせに基づいて、直ちに識別されるだろう（図２）。
【００９０】
この変異は、工程３にプライマーを使用して１５００のｂｐ遺伝子を増幅し、後続するサンガー法のシークエンシング（双方向）によって変異を確認した。
実施例ＩＩＩ．トマトの変異体ライブラリー中の特異的突然変異の同定
【００９１】
トマトの変異体ライブラリー
この実施例は、特異的な遺伝子座（標的遺伝子）中の点変異を同定するために、大量の並列のシークエンシングによるトマトの変異体ライブラリーのスクリーニングを記述する。使用される変異体ライブラリーは、ＥＭＳ変異誘発処理に由来する、５０７５のＭ２ファミリーから成る近交系有限花序トマト栽培品種Ｍ８２の同質遺伝子ライブラリーである。５０７５のＭ２ファミリーの各々の種子を１０％の相対湿度及び７℃で保存した。ライブラリーの起源及び特性は、Menda et al.（Plant J. 38: 861-872, 2004）及びhttp://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/index.html上のデータベース中に記述されている。
【００９２】
ＤＮＡ単離
葉の材料は、ライブラリーから無作為に選択され、３０７２のＭ２ファミリーの５つの個別の温室で栽培された植物から採取された。ライブラリー中で生じる任意の変異はＭ２子孫においてメンデルの法則の様式で分離するので、５つの個別のＭ２植物の葉材料のプーリングは、分離結果として、０．１％未満の任意の変異を見落とす可能性を減少させた。ゲノムＤＮＡを、Stuart and Via （Biotechniques, 14: 748-750, 1993）によって記述された改変ＣＴＡＢ手順を使用して、プールされた葉の材料から単離した。ＤＮＡサンプルを、ＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に１００ｎｇ／μｌの濃度で希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート中で−２０℃で保存した。
【００９３】
ＤＮＡサンプルの３Ｄプーリング
単離されたＤＮＡサンプルを、２０ｎｇ／μｌの濃度に正規化し、続いて４重にプールし、その結果８枚の９６ウェルマイクロタイタープレート中に含まれる７６８のサンプルがもたらされた。続いてこれらの８枚のマイクロタイタープレートは、３Ｄプーリングストラテジーにかけられ、ＤＮＡの２８プールがもたらされた。３Ｄプーリングストラテジーは３つの異なる様式ですべてのＤＮＡを一緒にプールすることから成り、したがって、各々の単独の４重プールがＸ座標プールで一度のみ、Ｙ座標プールで一度のみ、及びＺ座標プールで一度のみ生じることを保証する。Ｘプールは、８枚のマイクロタイタープレートすべてから、８つのウェルの１つの段当たりのすべてのＤＮＡサンプル（例えば、Ａ１〜Ｈ１）を一緒にプールすることによって組み立てられ、１２のＸプールをもたらした。したがって各々のＸプールは、８（段中のウェル）×８（プレート）＝４重プールの６４サンプル保有し、２５６のＭ２ファミリーを表わす。Ｙプールは、８枚のマイクロタイタープレートすべてから、１２のウェルの１つの列当たりのすべてのＤＮＡサンプル（例えば、Ａ１〜Ａ１２）を一緒にプールすることによって組み立てられ、８つのＹプールをもたらした。したがって各々のＹプールは、１２（列中のウェル）×８（プレート）＝４重プールの９６サンプルを保有し、３８４のＭ２ファミリーを表わす。Ｚプールは、マイクロタイタープレート全体から、すべてのＤＮＡサンプルを一緒にプールすることによって組み立てられ、８つのＺプールをもたらした。したがって各々のＺプールは、１２×８＝４重のプールの９６サンプルを保有し、３８４のＭ２ファミリーを表わす。
【００９４】
標的遺伝子座
この実施例における標的遺伝子座は、真核生物開始因子４Ｅに対するトマト遺伝子の一部であった（ｅＩＦ４Ｅ）。この遺伝子は、シロイヌナズナ（Duprat et al., Plant J. 32: 927-934, 2002）、レタス（Nicaise et al.Plant Physiol. 132: 1272-1282, 2003）及びナス科（Ruffel et al, Plant J. 32: 1067-1075, 2002; Mol Gen. Genomics 274: 346-353, 2005）中のポチウイルスの感染に対する感受性に関与することが示され、この遺伝子における特異的変異は劣性のポチウイルス抵抗性に関連する。この実施例で記述される変異スクリーニングは、トマトｅＩＦ４Ｅ遺伝子における付加的変異を、新しいポチウイルス抵抗性の可能性のあるソースとして同定することを目的とした。トマトｅＩＦ４Ｅについては、ｃＤＮＡ配列のみが既知である（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ７２３７３３及びＡＹ７２３７３４）。ｃＤＮＡ配列に基づいて設計されたプライマーを使用するＰＣＲアプローチを使用して、トマト栽培品種マネーバーグ（Moneyberg）のｅＩＦ４Ｅ遺伝子座のゲノム配列の断片を増幅及びシークエンスした。この結果、トマトｅＩＦ４Ｅの大部分のゲノム遺伝子座の配列が得られた。この遺伝子座は、４つのエクソン及び３つのイントロンから成る。変異スクリーニングのために、上記遺伝子のエクソン１が標的配列として選ばれた（配列番号５７）。
【００９５】
配列番号５７：トマトのマネーバーグｅＩＦ４Ｅのエクソン１の配列：
ATGGCAGCAGCTGAAATGGAGAGAACGATGTCGTTTGATGCAGCTGAGAAGTTGAAGGCCGCCG ATGGAGGAGGAGGAGAGGTAGACGATGAACTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAATCAAATGA TACGGCATCGTATTTAGGGAAAGAAATCACAGTGAAGCATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTT TGGTTTGATAACCCTACCACTAAATCTCGACAAACTGCTTGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCT ACACTTTCTCCACTGTTGAAAATTTTTGGGG
【００９６】
標的遺伝子座増幅のためのプライマー設計
プライマーは、トマトｅＩＦ４Ｅのエクソン１のＰＣＲ増幅のために設計された。フォワードプライマーは、ＡＴＧの５’で４塩基のタグ配列をともない、エクソン１のオープンリーディングフレームのＡＴＧ開始コドンに対応するように設計され、２８のプールの各々のために特有の識別子を提供した。フォワードＰＣＲプライマーの離れた５’末端で、５’−Ｃが追加された。すべてのプライマーは、続いて行なわれるアダプターのライゲーションを容易にするために、それらの５’末端でリン酸化された。２８のフォワードプライマーの配列及び名称は、表１中にリストされる。タグ配列には、下線が引かれる。
【００９７】
【表１】
【００９８】
リバースプライマーは、非コード鎖中のエクソン１の塩基対ポジション２６７〜２８７に対応するように設計された。再び、５’プライミング部分の４塩基のタグ配列の同様のシリーズが含まれており、２８プールの各々のために識別子を提供する。リバースＰＣＲプライマーの離れた５’末端で、５’−Ｃは追加された。すべてのプライマーは、続いて行なわれるアダプターのライゲーションを容易にするために、それらの５’末端でリン酸化された。２８のリバースプライマーの配列及び名称は表２中にリストされる。タグ配列には、下線が引かれる。
【００９９】
【表２】
【０１００】
標的遺伝子座増幅
標的遺伝子座のエクソン１を、上で記述されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、３ＤプールされたＤＮＡから増幅した。各々のＰＣＲ反応のために、フォワードプライマーとリバースプライマーとを同じタグと共に使用した。２８の３Ｄプールの各々からのエクソン１の増幅のために、フォワードプライマー及びリバースプライマーの異なるセットを使用した。各々のサンプルのためのＰＣＲ増幅反応条件は、以下のとおりであった：２５μｌ ＤＮＡ（＝５０ｎｇ）、５μｌ ＲＮａｓｅ混合物、１０μｌ ５×Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＰＣＲバッファー、０．６μｌの４種類のｄＮＴＰｓ（２０ｍＭ）、１．２５μｌフォワードプライマー（５０ｎｇ／μｌ）、１．２５μｌリバースプライマー（５０ｎｇ／μｌ）、０．５μｌ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼ、２８．９μｌミリＱ精製水。ＲＮａｓｅ混合物は、１５７．５μｌミリＱ精製水＋１７．５μｌ ＲＮａｓｅから成った。
【０１０１】
ＰＣＲ増幅は、以下の条件を使用して、金ブロック又は銀ブロックを備えたＰＥ９６００サーモサイクラーで実行した：９４℃２分のホットスタートに後続して、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分の３５サイクル、及び４℃の最終定常温度。ＰＣＲ増幅効率を、１％アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の１０μｌの分析によってチェックした。図４は、同様なゲル上でラムダＤＮＡの濃度範囲に対する比較における、２８の３Ｄプールの各々からのエクソン１のＰＣＲ産物の効率的な増幅を示す。
【０１０２】
増幅に続いて、等しい量のＰＣＲ産物は、混合され、キアクイック（QIAquick）（登録商標）スピンのハンドブック（１８ページ）に従って、キアクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社（QIAGEN））を使用して精製された。各々のカラムに最大１００μｌの産物を入れた。産物を１０ｍＭトリス−ＥＤＴＡで溶出した。
【０１０３】
配列ライブラリー調製及びハイスループットシークエンシング
３Ｄプールからの混合増幅産物は、Margulies et al.（Nature 437: 376-380, 2005、及びオンライン追補）によって記述されるような、454 Life Sciencesシークエンシング技術を使用するＧＳ２０シークエンサー上で、ハイスループットシークエンシングにかけられた。具体的には、Margulies et al.によって記述されるようなエマルジョンＰＣＲ増幅、及び続いて行なわれる断片シークエンシングを容易にするために、ＰＣＲ産物をアダプターへライゲーションした。４５４アダプター配列、エマルジョンＰＣＲプライマー、シークエンスプライマー及びシークエンスの実行条件は、すべてMargulies et al.によって記述される。４５４シークエンシング過程においてセファロースビーズ上で増幅されたエマルジョンＰＣＲ断片中の機能的要素の直線状順序は、以下のとおりだった：４５４ ＰＣＲアダプター−４５４シークエンスアダプター−Ｃヌクレオチド−４ｂｐタグ−標的増幅プライマー配列１−標的断片内部配列−標的増幅プライマー配列２−４ｂｐタグ−Ｇヌクレオチド−４５４シークエンスアダプター−４５４ＰＣＲアダプター−セファロースビーズ。
【０１０４】
４５４シークエンス実行のデータ処理
マイクロタイタープレートの各々の領域に対して、４５４のソフトウェアによるベースコーリング（塩基呼び出し）後に、ＦＡＳＴＡによりフォーマットされたシークエンスを備えたファイルが生成された。これらは１つのファイルへ連結された。このファイル内で、検索は、５ヌクレオチド（Ｃプラス４ｂｐタグシークエンス）が挿入されたフォワードプライマーの１００％マッチに対する正規表現により行なわれた。同様なことが、５ヌクレオチド（Ｃプラスタグシークエンス）により延長されたリバースプライマーで行なわれた。次にすべての配列を、個別のファイルにおいてそれらのタグ配列（プール識別子）によってグループ化した。各々のファイルはｓｓａｈａＳＮＰツールにより分析され、既知のエクソン１ヌクレオチド配列を参照とした。ｓｓａｈａＳＮＰツールは、すべての単一ヌクレオチド配列差異、及び４５４シークエンス対参照ゲノムの「インデル」（変異誘発又は誤ったベースコーリングのいずれかの結果としての単一の塩基挿入又は単一の塩基欠失）について報告した。これらの単一のヌクレオチド配列差異及びインデル統計はデータベース中に保存され、エラー率分析及び点変異同定のために使用された。
【０１０５】
４５４シークエンシングのエラー率
組み合わせた２８のプールすべてに対するデータ処理から得られた正確な配列の総数は、２４７０５２であった。配列は、フォワードプライマー及びエクソン１のＰＣＲ産物（１２８５９４＝５２％）のコード鎖（５’末端）でアライメントさせた群、並びにリバースプライマー及びＰＣＲ産物（１１８４５８＝４８％）の相補鎖でアライメントさせた群の、２つの群に分割された。異なるプール及びアライメント群の各々から得られた配列の数は、６９〜７２６９にわたった。平均では、３０７２のＭ２ファミリーの各々は、配列の全回収において８０回及び各々の対立遺伝子で４０回で表わされたものとする。
【０１０６】
フォワードプライマーに対応するアライメント群の内では、１２８５９４配列のうちの１３３８（１．２％）は、アライメントさせた標的配列の６３塩基のストレッチに沿ったｅＩＦ４Ｅ参照配列に関して、１つ又は複数の単一のヌクレオチド配列差異を示した。リバースプライマー群については、１１８４５８配列のうちの７４３（０．６％）は、アライメントさせた標的配列の１０２塩基のストレッチに沿ったｅＩＦ４Ｅ参照配列に関して、１つ又は複数の単一のヌクレオチド配列差異を示した。したがって、両方を組み合わせた配列群に対する単一の塩基置換エラー率は、１６５塩基ストレッチに対して０．８４％又は塩基位置当たり０．００５１％（１００００の塩基当たり０．５のエラー）に等しい。このエラー率は、テスト配列における個別の読み取られた置換エラーについては、Margulies et al.によって報告されたエラー率の０．００４％に類似しているが、全ゲノム再シークエンシング（０．６８％）に対するよりもはるかに低い。
【０１０７】
両方のアライメント群中のインデルの出現率の同様の分析は、合計２４７０５２の配列（１６５ｂｐストレッチ中に３．１％である）中の３８８３（フォワードプライマー群）及び３８２９（リバースプライマー群）のインデル出現率を示した。したがって、インデル出現率は、塩基位置当たり０．０１８９１％（１００００塩基当たり１．８９のインデル）と等しい。インデル率は、塩基置換エラー率よりも高い。組み合わせた両方のタイプのシークエンシングエラーは、平均で１００００塩基当たり２．３９の頻度で、又は塩基位置当たり０．０２４で生じる。このエラー率は、Margulies et al.によって報告されたよりもはるかに低く、ｅＩＦ４ｅエクソン１配列中に長いホモポリマーストレッチが存在しないことによって説明されるだろう。
【０１０８】
標的遺伝子座中の変異の検出
このスクリーニングの目的が（ＥＭＳ）誘導点変異（優先的にＣ→Ｔ変異及びＧ→Ａ変異）の同定であるので、参照配列に対する比較においてインデルを表わす配列はすべて、この実施例における分析のために廃棄された。大部分の単一の塩基置換は、任意の与えられた３Ｄプールにおいて一度のみ生じ、いくつかは２回若しくは３回、又は稀により頻繁に生じる。これらの単一の塩基置換は、アライメントさせた配列のすべての位置で一様に、且つ、均一の頻度で塩基当たり０．００５％で生じるので、それらは、シークエンシングエラーを表わし、変異体ライブラリー中に存在する特異的変異ではないと憶測された。しかしながら、スキャンされた配列中の少数の特異的塩基位置では、特異的な単一の塩基配列差異がはるかに高い発生で生じる。以下の基準が満たされる場合、そのような単一の塩基配列差異はライブラリー中の変異を示す：
１．単一の塩基配列差異はＣ→Ｔ又はＧ→Ａの変異を表わす。
２．出現率は、３Ｄプール当たり１００００配列読み取り当たり、２０以上である。
３．単一の塩基配列差異が、正確に１つ及び多くて１つの、Ｘプール、Ｙプール及びＺプールに生じる。
この実施例において、そのような変異の１つは、リバースプライマーに対応するアライメント群中にｅＩＦ４Ｅエクソン１配列の塩基位置２２１で発見された。Ｇ→Ａ変異（相補的な鎖におけるＣ→Ｔに対応する）であるこの変異が、１００００の配列当たり７０の頻度でプールＸ１２中に、１００００配列当たり３３の頻度でプールＹ３中に及び１００００配列当たり６２の頻度でプールＺ６中に生じた。同様な位置でのこの同様な変異は、バックグラウンドエラーレイトにおいても生じず、他のプールのうちのいずれかにも生じなかった。
【０１０９】
３つのプールのみの中のこのＧ２２１Ａ変異の特有の出現は、ＤＮＡのもとの４重プールの同定を可能にし、４つのＭ２ファミリーを表した。これらの４つのＭ２ファミリーの各々のＤＮＡは、表１及び表２のフォワードプライマー及びリバースプライマーと同一のプライマー０６Ｆ５９８及び０６Ｆ５９９（しかし５’の５塩基配列タグなしの）により個別に増幅された。増幅されたＰＣＲ産物を通常のサンガー法のシークエンシングにかけた。４つのファミリーのうちの１つのｅＩＦ４Ｅ遺伝子の配列（「２４」とコードされた）は、オーバーラップするＧ及びＡに対応する位置２２１での２つのピークを示した。これは、対立遺伝子の半分は野生型で、他方の半分がＧ２２１Ａ点変異を保有するＭ２ファミリープールを示す（図２）。塩基位置２２１付近の他のＭ２ファミリーの配列は、参照（野生型）に従うものだった。
【０１１０】
この変異は、アルギニンに対してグルタミン置換をもたらす。この特定のＭ２ファミリーの種子は、ホモ接合変異体個体について選択するために温室で植えられ、それは、表現型を示すために使用されるだろう。
【０１１１】
同様の様式で、２つの他の点変異が４５４配列読み取りにおいて同定された。したがって、Ｍ８２トマト変異体ライブラリーの変異密度の推定は、１６５ｂｐにスキャンされた配列当たり３つの変異又は３０７２のＭ２ファミリー中の１０００塩基当たり１８の変異と等しい。これは、シロイヌナズナ（Greene et al., Genetics 164: 731-740, 2003）に対して報告された変異密度に相当する。
参考
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【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ＥＭＳ誘発変異を同定するための遺伝子のショットガンシークエンシングからもたらされるクラスタリングされた配列の図式的な表示を示す図である。変異はより明るい色、シークエンスエラーはより暗い色で塗られた。シークエンスエラーは無作為に及び大抵の場合ただ一度のみ観察されることが予想される。
【図２】３Ｄプールされたライブラリーからの４ｂｐタグを付けたＰＣＲプライマーにより増幅された１００ｂｐの遺伝子領域からもたらされるクラスタリングされたタグを付けたシークエンシングの図式的な表示を示す図である。変異はより明るい色、シークエンスエラーはより暗い色で塗られた。植物識別情報は、３つのタグ（１、２、３）及び（４、５、６）により同定された変異で識別されるが、２つ未満のタグ（７、８）により同定された変異で識別されない。シークエンスエラーは無作為に及び大抵の場合ただ一度のみ観察されることが予想される。
【図３】配列のタグ付けにおいて使用する長いＰＣＲプライマー及び短いＰＣＲプライマーのシステムの図解を示す図である。
【図４】２８の３Ｄプールの各々に対するｅＩＦ４Ｅエクソン１増幅のＰＣＲ増幅収率のアガロースゲル推定を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法であって、
（ａ）前記変異させた集団の各々のメンバーのゲノムＤＮＡを単離して、各々の集団メンバーのＤＮＡサンプルを提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた前記ＤＮＡをプールする工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡプールからの１組の（任意に標識された）プライマーにより前記標的配列を増幅する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の前記増幅産物をプールして増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
（ｅ）前記ライブラリー中の前記増幅産物を任意に断片化する工程と、
（ｆ）ハイスループットシークエンシングを使用して、前記増幅産物又は断片の前記ヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｇ）前記断片の前記配列をクラスタリング／アライメントすることによって変異を同定する工程と、
（ｈ）前記標的配列の修飾された機能について前記同定された変異をスクリーニングする工程と、
（ｉ）前記同定された変異に対してハイブリダイズするようなプライマーを設計する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）の前記プライマー、及び工程（ｃ）の前記プライマーのうちの１つにより工程（ｄ）の前記ライブラリーを増幅する工程と、
（ｋ）前記変異を保有する前記集団メンバーを同定する工程と、
（ｌ）工程（ｃ）の前記プライマーを使用して工程（ｋ）のメンバーからの前記標的配列を任意に増幅することによって、前記変異を確認する工程、及び前記増幅された産物の前記配列を決定する工程と
を含む変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法。
【請求項２】
変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法であって、
（ａ）前記変異させた集団の各々のメンバーのゲノムＤＮＡを単離して、各々の集団メンバーのＤＮＡサンプルを提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた前記ＤＮＡをプールする工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡプールからの１組のタグ付けされた（任意に標識された）プライマーにより標的配列部分を増幅すると共に、該プライマーのうち少なくとも１つが、好ましくは遺伝子特異的な部位、タグ及びシークエンスプライマー結合部位が含まれるようにする工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の前記増幅産物をプールして、増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
（ｅ）ハイスループットシークエンシングを使用して、前記増幅産物の前記ヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｆ）前記断片の前記配列をクラスタリング／アライメントさせることによって変異を同定する工程と、
（ｇ）前記タグを使用して前記変異を保有する前記メンバーを同定する工程と、
（ｈ）工程（ｃ）の前記プライマーを使用して工程（ｇ）の前記メンバー（複数可）からの前記標的配列を増幅することによって、前記変異を任意的に確認する工程、及び前記増幅された産物の前記配列を決定する工程と
を含む変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法。
【請求項３】
前記変異させた集団が、変異を誘導する化学物質、電離放射線、標的化ヌクレオチド交換又は領域標的化変異誘発から成る群から選択された１つ又は複数による前記ゲノムの処理によって得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記集団が、変異していないが、天然に存在する変異を含む亜集団を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記プールする工程が、３Ｄプーリングストラテジーによるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイスループットシークエンシングが、合成、好ましくはピロシークエンシングによって実行される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
シークエンシングは、ビーズのような固体支持体上で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記シークエンシングが、ハイスループットシークエンシング、好ましくは合成によるシークエンシング(Sequencing-by-Synthesis)に基づく、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シークエンシングが、合成によるシークエンシング、好ましくはピロシークエンシングによって実行される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
シークエンシングが、
（ｉ）シークエンシングアダプターを、前記断片にライゲーションさせる工程と、
（ｉｉ）前記アダプターライゲーションされた断片をビーズへアニーリングさせる工程（各ビーズは、単一の断片とアニーリングする）と、
（ｉｉｉ）各マイクロリアクターは、単一のビーズを含むように油中水型マイクロリアクター中で前記ビーズを乳化させる工程と、
（ｉｖ）エマルジョンＰＣＲを実行して、前記ビーズの表面上でアダプターライゲーションされた断片を増幅させる工程と、
（ｖ）前記増幅されたアダプターライゲーションされた断片が付着しているビーズを選別／濃縮する工程と、
（ｖｉ）各ウェルが単一のビーズを含むようにウェル中に前記ビーズを配置する工程と、
（ｖｉｉ）ピロリン酸シグナルを生成する工程と
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）及び／又は工程（ｉ）中の前記プライマーが、改良された結合親和性を有するヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）において増幅される前記標的配列の部分が、約８０ｂｐ〜約４００ｂｐである、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）において増幅される前記標的配列の部分が、約９０ｂｐ〜約３００ｂｐである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）において増幅される前記標的配列の部分が、１００ｂｐ〜約２００ｂｐである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
特定の遺伝子又は形質のための１つ又は複数の（標識された）プライマーを含むキット。
【請求項１６】
変異特異的なプライマー又は対立遺伝子特異的プライマーをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ビーズ及び／又はシークエンシングプライマーをさらに含む、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１】
変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法であって、
（ａ）前記変異させた集団の各々のメンバーのゲノムＤＮＡを単離して、各々の集団メンバーのＤＮＡサンプルを提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた前記ＤＮＡをプールする工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡプールからの１組の（任意に標識された）プライマーにより前記標的配列を増幅する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の前記増幅産物をプールして増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
（ｅ）前記ライブラリー中の前記増幅産物を任意に断片化する工程と、
（ｆ）ハイスループットシークエンシングを使用して、前記増幅産物又は断片の前記ヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｇ）前記断片の前記配列をクラスタリング／アライメントすることによって変異を同定する工程と、
（ｈ）前記標的配列の修飾された機能について前記同定された変異をスクリーニングする工程と、
（ｉ）前記同定された変異に対してハイブリダイズするようなプライマーを設計する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）の前記プライマー、及び工程（ｃ）の前記プライマーのうちの１つにより工程（ｄ）の前記ライブラリーを増幅する工程と、
（ｋ）前記変異を保有する前記集団メンバーを同定する工程と、
（ｌ）工程（ｃ）の前記プライマーを使用して工程（ｋ）のメンバーからの前記標的配列を任意に増幅することによって、前記変異を確認する工程、及び前記増幅された産物の前記配列を決定する工程と
を含む変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法。
【請求項２】
変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法であって、
（ａ）前記変異させた集団の各々のメンバーのゲノムＤＮＡを単離して、各々の集団メンバーのＤＮＡサンプルを提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた前記ＤＮＡをプールする工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡプールからの１組のタグ付けされた（任意に標識された）プライマーにより標的配列部分を増幅すると共に、該プライマーのうち少なくとも１つが、好ましくは遺伝子特異的な部位、タグ及びシークエンスプライマー結合部位が含まれるようにする工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の前記増幅産物をプールして、増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
（ｅ）ハイスループットシークエンシングを使用して、前記増幅産物の前記ヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｆ）前記断片の前記配列をクラスタリング／アライメントさせることによって変異を同定する工程と、
（ｇ）前記タグを使用して前記変異を保有する前記メンバーを同定する工程と、
（ｈ）工程（ｃ）の前記プライマーを使用して工程（ｇ）の前記メンバー（複数可）からの前記標的配列を増幅することによって、前記変異を任意的に確認する工程、及び前記増幅された産物の前記配列を決定する工程と
を含む変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法。
【請求項３】
前記変異させた集団が、変異を誘導する化学物質、電離放射線、標的化ヌクレオチド交換又は領域標的化変異誘発から成る群から選択された１つ又は複数による前記ゲノムの処理によって得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記集団が、変異していないが、天然に存在する変異を含む亜集団を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記プールする工程が、３Ｄプーリングストラテジーによるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイスループットシークエンシングが、合成、好ましくはピロシークエンシングによって実行される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
シークエンシングは、ビーズのような固体支持体上で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記シークエンシングが、ハイスループットシークエンシング、好ましくは合成によるシークエンシング(Sequencing-by-Synthesis)に基づく、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シークエンシングが、合成によるシークエンシング、好ましくはピロシークエンシングによって実行される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
シークエンシングが、
（ｉ）シークエンシングアダプターを、前記断片にライゲーションさせる工程と、
（ｉｉ）前記アダプターライゲーションされた断片をビーズへアニーリングさせる工程（各ビーズは、単一の断片とアニーリングする）と、
（ｉｉｉ）各マイクロリアクターは、単一のビーズを含むように油中水型マイクロリアクター中で前記ビーズを乳化させる工程と、
（ｉｖ）エマルジョンＰＣＲを実行して、前記ビーズの表面上でアダプターライゲーションされた断片を増幅させる工程と、
（ｖ）前記増幅されたアダプターライゲーションされた断片が付着しているビーズを選別／濃縮する工程と、
（ｖｉ）各ウェルが単一のビーズを含むようにウェル中に前記ビーズを配置する工程と、
（ｖｉｉ）ピロリン酸シグナルを生成する工程と
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）及び／又は工程（ｉ）中の前記プライマーが、改良された結合親和性を有するヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）において増幅される前記標的配列の部分が、約８０ｂｐ〜約４００ｂｐである、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）において増幅される前記標的配列の部分が、約９０ｂｐ〜約３００ｂｐである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）において増幅される前記標的配列の部分が、１００ｂｐ〜約２００ｂｐである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
特定の遺伝子又は形質のための１つ又は複数の（標識された）プライマーを含むキット。
【請求項１６】
変異特異的なプライマー又は対立遺伝子特異的プライマーをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ビーズ及び／又はシークエンシングプライマーをさらに含む、請求項１５又は１６に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５０９５２７（Ｐ２００９−５０９５２７Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３３２６７（Ｐ２００８−５３３２６７）
【出願日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０００４６７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３７６７８
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０５４６４８８８）キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０００４６７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３７６７８
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０５４６４８８８）キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ (11)
【Ｆターム（参考）】
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