変異の検出方法およびそれに用いるキット
【課題】 Ｔｍ解析を利用した検出感度に優れる変異の検出方法を提供する。
【解決手段】 検出部位が変異している検出対象ＤＮＡと前記検出部位が未変異である非検出対象ＤＮＡとを含有する試料に、変異している前記検出部位を含む検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブ、および、未変異である前記検出部位を含む非検出対象配列に相補的な阻害用ポリヌクレオチドを添加し、前記ＤＮＡに前記検出用プローブをハイブリダイズさせる。そして、前記ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリッド形成体を加熱して温度上昇に伴うシグナルの変動を測定し、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定することによって、変異の有無を決定する。
【解決手段】 検出部位が変異している検出対象ＤＮＡと前記検出部位が未変異である非検出対象ＤＮＡとを含有する試料に、変異している前記検出部位を含む検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブ、および、未変異である前記検出部位を含む非検出対象配列に相補的な阻害用ポリヌクレオチドを添加し、前記ＤＮＡに前記検出用プローブをハイブリダイズさせる。そして、前記ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリッド形成体を加熱して温度上昇に伴うシグナルの変動を測定し、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定することによって、変異の有無を決定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異の検出方法およびそれに用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。
【０００３】
点突然変異の一般的な検出方法としては、例えば、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域を増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を解析するＤｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（２）Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（３）検出対象配列に相当する領域を増幅させ、得られた増幅産物について温度勾配カラム中でＨＰＬＣを行い、溶出される時間によって変異の有無を検出するＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＨＰＬＣ法、（４）目的の変異を含む領域に蛍光プローブが結合すると蛍光を発することを利用し、前記蛍光の検出により変異を検出するＩｎｖａｄａｒ法、（５）３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。
【０００４】
しかしながら、前記（１）、（２）および（４）の方法は、それぞれ約２０％、約５％、約５％程度と感度が低く、操作に多大な手間と時間がかかる。前記（３）の方法は、感度が約１０％と低く、また、変異の有無が確認できるのみで、どの部位にどのような変異が生じているのかを解析できず、特異性に欠けるという問題がある。また、前記（５）の方法は、感度は高いものの特異性が低く、偽陽性が生じ易いという問題がある。なお、感度は数値（％）が小さい程高感度である。
【０００５】
このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、Ｔｍ解析を利用した検出が行われている。この方法は、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、試料中の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処理を施して、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナル測定により検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって点突然変異の有無を判断する。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定すれば、以下のような判断が可能である。前記測定値が前記評価基準値と同じであれば、マッチ、すなわち、標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断できる。他方、前記測定値が前記評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち、標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。
【０００６】
しかしながら、このようなＴｍ解析を用いた検出方法は、感度が低いという問題がある。具体例として、白血病患者の血液細胞由来ＤＮＡについて点突然変異を検出する際に問題となっている（特許文献１）。白血病は、骨髄中の造血幹細胞がガン化することによって起こる疾患である。中でも慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）は、９番目の染色体と２２番目の染色体との転座により形成されるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子が発症原因として知られており、その治療には、ＡＢＬキナーゼ阻害剤であるイマチニブ等が広く使用されている。しかしながら、このａｂｌ遺伝子（前記融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子を含む）に点突然変異が存在すると、イマチニブに対して耐性を発現するという問題がある。その場合、治療において、例えば、イマチニブ投与量の増加、他の治療薬への変更、骨髄移植等への切り替え等が必要になる。したがって、白血病、特にＣＭＬの治療においては、ａｂｌ遺伝子における点突然変異の有無を検出することが非常に重要となっている。しかしながら、一人のＣＭＬ患者の血液であっても、その血液細胞にはａｂｌ遺伝子に点突然変異が発生しているもの（検出対象配列）と発生していないもの（非検出対象配列）とが含まれており、両者の違いは、点突然変異すなわち一塩基の配列にすぎない。そうすると、点突然変異を検出するためのプローブは、点突然変異を含む検出対象配列にハイブリダイズ（マッチ）し、さらに、点突然変異を含まない非検出対象配列にもハイブリダイズ（ミスマッチ）するという現象が起こってしまう。このような場合に、Ｔｍ解析によってシグナルの強度と温度との関係を示す融解曲線を作成すると、マッチしている検出対象配列に対する高温側のピークが、ミスマッチである非検出対象配列に対する低温側のピークの存在によって検出し難くなり、さらに検出感度の低下が生じてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３７９９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、Ｔｍ解析を利用した検出感度に優れる変異の検出方法ならびにそれに用いる検出用プローブキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の遺伝子増幅方法は、プライマーを用いて検出部位を含む検出対象配列を増幅する遺伝子増幅方法であって、
検出部位が変異している検出対象の核酸と、前記検出部位が未変異である非検出対象の核酸とを含有する試料を、前記検出部位を含む検出対象配列を増幅できる前記プライマーと、前記検出部位が未変異である非検出対象の核酸に相補的なポリヌクレオチド（以下、「阻害用ポリヌクレオチド」という）との存在下で、遺伝子増幅処理することを特徴とする。
前記目的を達成するために、本発明の変異の検出方法は、前記試料が、検出部位が変異している検出対象ＤＮＡと、前記検出部位が未変異である非検出対象ＤＮＡとを含有する試料であり、
下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ） 前記ＤＮＡを含む試料に、検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブ、および、非検出対象配列に相補的なポリヌクレオチド（以下、「阻害用ポリヌクレオチド」という）を添加する工程であって、
前記検出対象配列が、前記検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、変異している前記検出部位を含み、
前記非検出対象配列が、前記非検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、未変異である前記検出部位を含む、前記工程
（Ｂ） 前記ＤＮＡに前記検出用プローブをハイブリダイズさせる工程
（Ｃ） 前記ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（Ｄ） 前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（Ｅ） 前記Ｔｍ値から前記検出対象部位における変異の有無を決定する工程
【００１０】
本発明の検出用プローブキットは、本発明の変異の検出方法に使用する検出用プローブキットであって、
検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブと、非検出対象配列に相補的な阻害用ポリヌクレオチドとを含み、
前記検出対象配列が、検出部位が変異している検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、変異している前記検出部位を含み、
前記非検出対象配列が、前記検出部位が未変異である前記非検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、未変異である前記検出部位を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の変異の検出方法は、試料に、検出部位が変異している前記検出対象配列に対する検出用プローブだけでなく、さらに、検出部位が未変異である前記非検出対象配列に対する阻害用ポリヌクレオチドを添加している。このため、非検出対象配列への前記検出用プローブのハイブリダイズを抑制でき、この結果、従来よりも優れた感度（約３％）で、前記検出部位における変異を検出できる。このように、検出用プローブの非検出対象配列へのハイブリダイズを抑制できるのは、前記検出用プローブと比較して、前記阻害用ポリヌクレオチドの前記非検出対象配列に対する相同性が高いことによる。したがって、本発明の検出方法は、例えば、試料中に検出対象ＤＮＡと非検出対象ＤＮＡの両方が含まれる試料に対して有用である。特に、白血病患者の試料に対して有用であり、中でも、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者について、ａｂｌ遺伝子の変異（ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子の変異を含む）を検出する際に有用である。前述のように、変異を高感度で検出できるため、例えば、患者ごとの白血病治療薬の適正を、遺伝子レベルで解析することが可能となり、医療分野において極めて有用な方法といえる。また、本発明の検出用プローブキットを用いれば、本発明の変異の検出方法を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、阻害用ポリヌクレオチドを添加したＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、比較例１における、阻害用ポリヌクレオチド無添加でのＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の前記実施例１における、検出用プローブの添加割合を変化させたＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の前記実施例１における、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合を変化させたＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２における、阻害用ポリヌクレオチドを添加したＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例３における、阻害用ポリヌクレオチドを添加したＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例４における、阻害用ポリヌクレオチドを添加したＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の変異の検出方法は、前述のとおり、試料中のＤＮＡの変異を検出する方法であって、前記試料が、検出部位が変異している検出対象ＤＮＡと、前記検出部位が未変異である非検出対象ＤＮＡとを含有する試料であり、下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ） 前記ＤＮＡを含む試料に、検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブ、および、非検出対象配列に相補的な阻害用ポリヌクレオチドを添加する工程
（Ｂ） 前記ＤＮＡに前記検出用プローブをハイブリダイズさせる工程
（Ｃ） 前記ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（Ｄ） 前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（Ｅ） 前記Ｔｍ値から前記検出対象部位における変異の有無を決定する工程
【００１４】
前記（Ａ）工程において、前記検出対象配列とは、前記検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、変異している前記検出対象部位を含む配列である。また、前記非検出対象配列とは、前記非検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、未変異である前記検出対象部位を含む配列である。
【００１５】
本発明において、検出部位に変異が存在する前記検出対象配列を「変異配列」、前記検出対象配列を含む検出対象ＤＮＡを「変異ＤＮＡ」ともいい、検出部位に変異が存在しない前記非検出対象配列を「正常配列」、前記非検出対象配列を含むＤＮＡを「正常ＤＮＡ」ともいう。また、検出部位における変異を「検出目的の変異」ともいう。変異の有無を検出する標的となる試料中ＤＮＡを「標的ＤＮＡ」ともいう。本発明において検出する変異としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等があげられる。
【００１６】
本発明において、前記試料中のＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし二本鎖ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、例えば、前記（Ｂ）ハイブリダイズ工程に先立って、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することによって、次の（Ｂ）ハイブリダイズ工程において、検出用プローブや阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを効率よく行うことができる。
【００１７】
本発明において、前記試料中のＤＮＡは、例えば、遺伝子であってもよいし、遺伝子の部分配列であってもよい。また、前記試料中のＤＮＡは、例えば、生体試料等の試料に元来含まれるＤＮＡでもよいが、例えば、検出精度を向上できることから、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物であることが好ましい。具体的には、例えば、前記試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物や、前記試料に元来含まれているＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）から逆転写反応（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ））により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物があげられる。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００ｍｅｒであり、好ましくは８０〜２００ｍｅｒである。
【００１８】
本発明の検出方法を適用する試料は、特に制限されない。本発明は、例えば、前述のように、標的ＤＮＡとして、目的の変異を有するＤＮＡ（検出対象ＤＮＡ）と目的の変異を有さないＤＮＡ（非検出対象ＤＮＡ）との両方を含む試料に対して、非常に有用である。前記ＤＮＡやＲＮＡの由来は、制限されず、例えば、各種がん細胞等の細胞、ウィルス、ミトコンドリア等があげられる。特に、前述のように、白血病患者の生体試料（例えば、血液試料）について変異の検出を行う場合、ガン化した血液細胞には、変異が発生したＤＮＡを有する細胞と、変異が発生していないＤＮＡを有する細胞とが含まれるため、前述のような問題が起こり易い。したがって、本発明の検出方法は、特に、変異が発生したＤＮＡと変異が発生していないＤＮＡを有する試料への適用が好ましく、例えば、白血病の生体試料、具体例としては、血液試料や白血球細胞等に適用することが好ましい。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡの調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００１９】
本発明における検出目的の変異は、制限されない。前述のように、白血病に関連する変異を検出する際、非検出対象配列に対して検出用プローブがハイブリダイズすることが知られている。このことから、具体例として、白血病に関連する遺伝子の変異を検出する際、本発明の方法は有用である。前記白血病に関連する遺伝子の変異としては、例えば、ａｂｌ遺伝子の変異（ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子の変異を含む）があげられる。例えば、配列番号１に示すａｂｌ遺伝子のｃＤＮＡ配列（ｍＲＮＡ配列）において、７５６番目の塩基Ｇ、７５８番目の塩基Ａ、７６３番目の塩基Ｇの変異があげられる。これらの塩基については、例えば、以下のような塩基への変異が報告されている。なお、ａｂｌ遺伝子の配列は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００５１５７に登録されている。
変異Ｇ７５６Ｃ ７５６番目の塩基ＧがＣに変異
変異Ａ７５８Ｔ ７５８番目の塩基ＡがＴに変異
変異Ｇ７６３Ａ ７６３番目の塩基ＧがＡに変異
【００２０】
本発明において、前記検出用プローブは、検出部位が変異している前記検出対象配列に相補的な配列であればよく、前記阻害用ポリヌクレオチドは、検出部位が未変異である前記非検出対象配列に相補的な配列であればよい。前記プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドの長さは、特に制限されないが、同じ長さであることが好ましい。前記検出用プローブの配列と前記阻害用ポリヌクレオチドの配列とは、例えば、ハイブリッド形成の際に前記検出部位（目的の変異が発生する部位）と対をなす部位（塩基）を除いて、９０％〜１００％同じ配列であることが好ましく、特に好ましくは１００％である。また、前記検出用プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドは、例えば、同じ鎖であれば、ＤＮＡの順鎖および逆鎖のいずれにハイブリダイズするように設計してもよい。
【００２１】
以下に、ａｂｌ遺伝子の前記３種類の変異（Ｇ７５６Ｃ、Ａ７５８Ｔ、Ｇ７６３Ａ）の検出に使用する検出用プローブと阻害用ポリヌクレオチドとの組み合わせを例示する。なお、各配列において、大文字で示した塩基が、ａｂｌ遺伝子の７５６番目、７５８番目、７６３番目にそれぞれ対応する。本発明は、これらには制限されない。
【００２２】
変異Ｇ７５６Ｃ（順鎖の検出用）
検出用プローブ 配列番号２
５’−ｃｃｇｔａＧｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号３
５’−ｃｃｇｔａＣｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’
【００２３】
変異Ａ７５８Ｔ（順鎖の検出用）
検出用プローブ 配列番号４
５’−ｃｃｇＡａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号５
５’−ｃｃｔｃｃｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号６
５’−ｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’
【００２４】
変異Ｇ７６３Ａ（逆鎖の検出用）
検出用プローブ 配列番号７
５’−ｃｃａｇｔａｃｇｇｇＡａｇｇｔｇｔ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号８
５’−ｃｃａｇｔａｃｇｇｇＧａｇｇｔｇｔ−３’
【００２５】
本発明において、前記阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記検出用プローブの長さ、検出対象配列のＧＣ含量等、検出系の条件に応じて適宜決定できる。前記検出用プローブに対する添加割合は、特に制限されないが、下限は、例えば、モル比で０．１倍以上であり、好ましくは１倍以上、より好ましくは２倍以上である。また、上限は、例えば、モル比で１００倍以下である。前記阻害用ポリヌクレオチドの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０ｍｅｒであり、好ましくは１０〜３０ｍｅｒであり、前記検出用プローブと同じ長さに設定することが好ましい。
【００２６】
本発明において、前記検出対象配列に相補的な検出用プローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、検出シグナルを十分に確保することができることから、前記試料中のＤＮＡに対してモル比で１倍以下が好ましい。前記阻害用ポリヌクレオチドの添加に加えて、さらに、前記検出用プローブの添加割合を制御することによって、例えば、検出感度のより一層の向上を図ることができる。また、前記検出用プローブの添加割合を設定するのみで足りることから、操作が極めて簡便である。前記検出用プローブの添加割合は、より好ましくは、前記ＤＮＡに対してモル比で０．１倍以下である。この際、試料中のＤＮＡとは、例えば、検出対象ＤＮＡと非検出対象ＤＮＡとの合計でもよいし、検出対象配列を含む増幅産物と非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中のＤＮＡにおける検出対象ＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記検出用プローブの添加割合は、例えば、検出対象ＤＮＡ（または、検出対象配列を含む増幅産物）に対してモル比で１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに好ましくは３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、前記検出対象ＤＮＡ等に対して、モル比で、０．００１倍以上が好ましく、より好ましくは０．０１倍以上であり、さらに好ましくは０．１倍以上である。
【００２７】
なお、前記ＤＮＡに対する検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよいし、一本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよい。また、前記検出用プローブの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０ｍｅｒであり、好ましくは１０〜３０ｍｅｒである。
【００２８】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００２９】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度上昇に伴うシグナル変動の測定は、例えば、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うことができる。より好ましくは、前記検出用プローブとして、標識化物質で標識化されたプローブを使用して、シグナル変動の測定を行う。前記検出用プローブにおいて標識化部位は、特に制限されない。また、標識化物質は、特に制限されないが、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
【００３０】
前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、例えば、この標識化物質によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【００３１】
前記標識化物質としては、制限されないが、例えば、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、検出用プローブとしては、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、Ｃであることが好ましい。この場合、検出用プローブがハイブリダイズする検出対象ＤＮＡにおいて、前記検出用プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がＧとなるように、前記検出用プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが検出対象ＤＮＡにハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のＣが、前記検出対象ＤＮＡにおけるＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。
【００３２】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＲＭＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。具体例として、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、例えば、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、例えば、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、例えば、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。他方、前記阻害用ポリヌクレオチドは、標識化されていないことが好ましい。
【００３３】
次に、ａｂｌ遺伝子（配列番号１）における７５８番目の塩基Ａの点突然変異（Ａ→Ｔ）を例にあげて、本発明の検出方法について説明する。なお、本発明は、阻害用ポリヌクレオチドを添加した点が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。また、検出用プローブがハイブリダイズする検出対象配列は、例えば、配列番号１の塩基配列において７５８番目の塩基ＡがＴに変異した全長配列でもよいが、検出部位である７５８番目の塩基（Ａ→Ｔ）を含んでいれば部分配列であることが好ましい。
【００３４】
まず、全血からゲノムＤＮＡを単離する。全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができ、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００３５】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、検出用プローブおよび阻害用ポリヌクレオチドを添加する。前記検出用プローブと阻害用ポリヌクレオチドの添加時は、後述するように、何ら制限されないが、本実施形態においては、一例として、検出用プローブを添加した後に、阻害用ポリヌクレオチドを添加する方法をあげる。
【００３６】
すなわち、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、まず、検出用プローブを添加する。前記検出用プローブとしては、例えば、前述のものがあげられるが、中でも、ＱＰｒｏｂｅが好ましい。このＱＰｒｏｂｅは、前述のように、一般に、末端塩基がシトシンであり、前記末端を蛍光色素で標識化したプローブである。そして、これが検出対象配列にハイブリッドすることで、前記蛍光色素と検出対象配列のグアニンとが相互作用し、その結果、蛍光が減少（または消光）するものである。
【００３７】
前記検出用プローブの配列は、前述のように、点突然変異を含む検出対象配列に相補的であればよく、前記検出対象配列に応じて適宜設計できる。ａｂｌ遺伝子（配列番号１）における７５８番目塩基Ａの点突然変異（Ａ→Ｔ）を検出する場合は、例えば、前述の配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド等があげられる。
変異Ａ７５８Ｔの検出用プローブ 配列番号４
５’−ｃｃｇａＡｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’ （ＧＣ含量８１．３％）
【００３８】
前記試料中のＤＮＡやＲＮＡを鋳型として遺伝子増幅法を行う場合も、前記検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されない。前記検出用プローブは、例えば、後述する遺伝子増幅処理の後、得られた増幅産物に対して添加してもよいが、遺伝子増幅処理の前に添加することが好ましい。このように遺伝子増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合、例えば、プローブ自体の伸長を予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよいし、前述のような蛍光色素で３’末端を標識化してもよい。
【００３９】
前記検出用プローブは、例えば、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００４０】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、遺伝子増幅法により、目的配列の増幅を行う。具体的には、検出目的の点突然変異を生じる塩基部位を含む配列、すなわち、検出対象配列および非検出対象配列を増幅させる。
【００４１】
遺伝子増幅法は、制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法が好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。なお、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４２】
ＰＣＲのプライマーの配列は、例えば、目的の検出対象配列を増幅できるものであれば特に制限されず、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。増幅させる領域は、例えば、目的の検出対象配列のみでもよいし、前記検出対象配列を含む領域であってもよい。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定でき、例えば、１０〜３０ｍｅｒである。前述のように、ａｂｌ遺伝子（配列番号１）における７５８番目塩基Ａの点突然変異（Ａ→Ｔ）を検出する場合、具体例として、以下に示すポリヌクレオチドからなるプライマーが使用できる。これらのプライマーの組み合わせは特に制限されない。なお、配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを組み合わせた場合、得られる増幅産物の長さは１０３ｍｅｒ程度である。
（プライマーセット１）
センスプライマー 配列番号９
５’−ｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃａｃｇｇａｃ−３’ （ＧＣ含量６３．２％）
アンチセンスプライマー 配列番号１０
５’−ｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇｃｔｇ−３’ （ＧＣ含量７５％）
（プライマーセット２）
センスプライマー 配列番号１１
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１２
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
【００４３】
次に、後述するハイブリダイズ工程に先立って、前記増幅産物を含む試料に前記阻害用ポリヌクレオチドを添加する。前記阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前述の通りである。前述のように、添加のタイミングは、これに制限されず、例えば、前記検出用プローブ添加の前後もしくは同時に行うことができる。また、前記阻害用ポリヌクレオチドの添加は、例えば、前述の遺伝子増幅処理の前後いずれでもよいが、例えば、処理が簡便であることから、遺伝子増幅処理前に添加しておくことが好ましい。このように遺伝子増幅処理前に前記阻害用ポリヌクレオチドを添加する場合、例えば、阻害用ポリヌクレオチド自体が伸長することを予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。
【００４４】
前述のように、ａｂｌ遺伝子（配列番号１）における７５８番目塩基Ａの点突然変異（Ａ→Ｔ）を検出する場合、阻害用ポリヌクレオチドとしては、例えば、点突然変異を含まない、配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド等があげられる。この阻害用ポリヌクレオチドは、例えば、前述の配列番号４の塩基配列からなる検出用プローブと組み合わせて使用することが好ましい。
変異Ａ７５８Ｔの阻害用ポリヌクレオチド 配列番号５
５’−ｃｃｔｃｃｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇ−３’ （ＧＣ含量８０％）
【００４５】
次に、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記検出用プローブならびに阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを行う。
【００４６】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されず、例えば、８５℃以上であり、好ましくは、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されず、例えば、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００４７】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリダイズ、および、前記一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃以下である。
【００４８】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μＭであり、好ましくは０．１〜０．５μＭ、前記検出用プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μＭであり、好ましくは０．００１〜１μＭ、前記阻害用ポリヌクレオチドの濃度は、例えば、０．１ｎＭ〜１ｍＭであり、好ましくは０．１ｎＭ〜１００μＭである。
【００４９】
本発明においては、前述のように阻害用ポリヌクレオチドの添加が重要であって、例えば、検出対象ＤＮＡ、検出用プローブ、阻害用ポリヌクレオチドの反応液における濃度等は、特に制限されない。具体例としては、後述するシグナルの検出において、例えば、使用する装置の検出感度が相対的に高い程、反応液における検出対象ＤＮＡの濃度を低減でき、使用する装置の検出感度が相対的に低い程、反応液における検出対象ＤＮＡの濃度を増加させることが好ましい。具体例として、後述するシグナル検出で市販装置（商品名Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ；Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を使用する場合、例えば、反応液において、検出対象ＤＮＡ濃度５〜１０００ｎＭ、前記検出用プローブ濃度５０〜１０００ｎＭ、前記阻害用ポリヌクレオチド濃度５ｎＭ〜１００μＭとすることが好ましく、より好ましくは、検出対象ＤＮＡ濃度１０〜５００ｎＭ、前記検出用プローブ濃度１００〜５００ｎＭ、前記阻害用ポリヌクレオチド濃度１０ｎＭ〜５０μＭである。
【００５０】
そして、形成された、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブまたは阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成体を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。例えば、Ｑ-Ｐｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５１】
シグナル変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されない。開始温度は、例えば、室温（例えば、１０℃）〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００５２】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における値（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、検出用プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００５３】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することもできる。
【００５４】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００５５】
具体例を以下に示す。検出用プローブとして、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、Ｑ-Ｐｒｏｂｅ）を使用した場合、前記検出用プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、検出用プローブとして、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５６】
つぎに、本発明の検出用プローブキットは、前述のように、本発明の変異の検出方法に使用するキットであって、検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブと、非検出対象配列に相補的な阻害用ポリヌクレオチドとを含むことを特徴とする。本発明において、前記検出対象配列は、前述のように、検出部位が変異している検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、変異している前記検出部位を含む配列である。また、前記非検出対象配列は、前述のように、前記検出部位が未変異である前記非検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、未変異である前記検出部位を含む配列である。本発明の検出用プローブキットは、前記プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は制限されない。
【００５７】
前記プローブおよび前記阻害用ポリヌクレオチドとしては、制限されず、前述と同様のものが利用でき、好ましい組み合わせも前述の通りである。
【００５８】
本発明の検出用プローブキットにおいて、前記プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドは、一つの試薬として混合されてもよいし、別個の試薬として独立していてもよい。前者の場合、前記プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドは、前述のような割合で混合されていることが好ましい。後者の場合には、例えば、反応液中の割合が、前述のような範囲となるように使用すればよい。また、本発明の検出用プローブキットは、前記プローブと相補的な配列を含む領域を増幅するためのプライマーをさらに有しても良い。
【００５９】
また、本発明のデータ解析方法は、ＤＮＡの変異の有無を決定するためのデータの解析方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）工程を有することを特徴とする。
（ａ） 本発明の変異検出方法における（Ｃ）工程で得られたシグナル変動を解析してＴｍ値を演算する工程
（ｂ） 前記演算工程において演算した前記Ｔｍ値からＤＮＡの変異の有無を決定する工程
【００６０】
本発明のシステムは、試料中のＤＮＡの変異の有無を検出するためのシステムであって、本発明の変異の検出方法における（Ｃ）工程で得られたシグナル変動を入力する入力手段、前記入力手段により入力した前記シグナル変動からＴｍ値を演算する演算手段、および、前記演算手段により演算したＴｍ値に基づいて、ＤＮＡの変異の有無を決定する決定手段を有することを特徴とする。本発明のシステムは、例えば、コンピュータシステムによって構築された検出装置があげられる。前記システムのハードウェア構造は、制限されず、例えば、制御部であるＣＰＵに、記憶装置、キーボードやマウス等の入力装置が接続されており、さらに、例えば、結果の出力装置、入力データや結果を表示する表示装置（ディスプレイ）等が接続されてもよい。また、各手段は、例えば、コンピュータのＣＰＵが所定のプログラムを実行することによって実現される機能的ブロックであればよい。このため、例えば、各構成手段が、ハードウェアとして実装されていなくともよく、ネットワークシステムであってもよい。
【００６１】
また、本発明のシステムは、例えば、本発明の変異の検出方法における（Ｂ）工程や（Ｃ）工程を実行するための手段を有していてもよい。前記工程を実行するための手段としては、例えば、温度制御手段、シグナルの検出手段があげられる。前記温度制御手段の実行により、例えば、ハイブリダイズによる二本鎖ＤＮＡ（ハイブリッド形成体）の形成や、ハイブリッド形成体の解離を行うことができる。また、前記シグナル検出手段の実行により、例えば、温度変化に伴いハイブリッド形成体が形成されることによるシグナル変動量や、ハイブリッド形成体が解離することによるシグナル変動量を検出できる。この場合、例えば、前記入力手段にかえて、前記シグナル検出手段により検出されたシグナル変動を記録する記録手段を有してもよい。さらに、本発明のシステムは、前記決定手段により決定されたＤＮＡの変異の有無を出力する出力する手段を備えてもよい。
【００６２】
本発明のプログラムは、本発明のデータ解析方法をコンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラムである。
【００６３】
また、本発明の電子媒体は、本発明のコンピュータプログラムを格納したコンピュータ読取可能な電子媒体（「記録媒体」ともいう）である。
【実施例】
【００６４】
次に、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例および比較例により制限されない。
【００６５】
［実施例１］
ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）
（１）阻害用ポリヌクレオチドを添加して、ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００６６】
ａｂｌ遺伝子７５８番目の塩基に変異を有さない白血球細胞株のゲノムＤＮＡ（配列番号１）と、ａｂｌ遺伝子７５８番目の塩基に変異を有する白血球細胞株のゲノムＤＮＡ（配列番号１において７５８番目塩基がＴ：ａｂｌチロシンキナーゼＡ７５８Ｔ（＝Ｙ２５３Ｆ））とを調製した。以下、変異を有さない前者を「ｗｔＤＮＡ」、変異を有する後者を「ｍｔＤＮＡ」という。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝１００：０、５０：５０、１０：９０、５：９５、３：９７、０：１００）に調製して、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液５０μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液における阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は２００ｎＭ、検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１０秒および６０℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。なお、検出用プローブの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．１倍であり、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．４倍および前記プローブに対してモル比で４倍である。なお、検出用プローブの検出対象ＤＮＡ（検出対象配列の増幅産物）に対する添加割合は、以下の通りである。これらの結果を実施例１−１とする。また、比較例１−１として、阻害用ポリヌクレオチド２μＬに代えて蒸留水２μＬを下記ＰＣＲ反応液に添加した以外は、同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】
センスプライマー 配列番号９
５’−ｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃａｃｇｇａｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１０
５’−ｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇｃｔｇ−３’
検出用プローブ 配列番号４
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｇＡａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号５
５’−ｃｃｔｃｃｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇ−３’
【００７０】
これらの結果を図１および図２に示す。両図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、縦軸の微分値とは「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示す（以下、同様）。図１は実施例１−１、図２は比較例１−１の結果である。図１において、（Ａ）は、全ゲノムの１００％が点突然変異を有する試料、（Ｂ）は、全ゲノムのうち５％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）は、全ゲノムのうち３％が点突然変異を有する試料、（Ｄ）は、全ゲノムが点突然変異を有さない試料についての結果である。図２において、（Ａ）は、全ゲノム１００％が点突然変異を有する試料、（Ｂ）は、全ゲノムのうち５０％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）は、全ゲノムのうち５％が点突然変異を有する試料、（Ｄ）は、全ゲノムのうち３％が点突然変異を有する試料、（Ｅ）は、全ゲノムが点突然変異を有さない試料についての結果である。
【００７１】
図１（Ａ）および図２（Ａ）に示すように、ｍｔＤＮＡは６９．５℃、図１（Ｄ）および図２（Ｅ）に示すように、ｗｔＤＮＡは６１．５℃でシグナルのピークが検出された。これを標準として各試料を評価した。その結果、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例１−１では、ｍｔＤＮＡが５０％の場合、図２（Ｂ）に示すようにｍｔＤＮＡのシグナルを検出できたが、ｍｔＤＮＡが少量（５％、３％）の場合には、図２（Ｃ）および（Ｄ）に示すようにｍｔＤＮＡのシグナルを全く検出することができなかった。これに対して、阻害用ポリヌクレオチドを添加した実施例１−１では、ｍｔＤＮＡが少量（５％、３％）であっても、図１（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、ｍｔＤＮＡのシグナルを検出することができた。つまり、阻害用ポリヌクレオチドの添加によって、点突然変異を有さないｗｔＤＮＡへの検出用プローブのハイブリダイズが阻害されたため、結果として、ｍｔＤＮＡに結合する検出用プローブの量が増加し、それによって検出感度が向上したといえる。
【００７２】
（２）さらに、検出用プローブの添加割合を変化させ、ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７３】
前記実施例１におけるＰＣＲ反応液の検出用プローブ添加量０．５μＬを０．１μＬ、蒸留水添加量３４．３７５μＬを３４.７７５μＬとし、前記検出用プローブの終濃度を１／５の１０ｎＭに設定した以外は、前記実施例１と同様にしてＴｍ解析を行った。この結果を実施例１−２として、図３に示す。同図において、（Ａ）は、全ゲノム１００％が点突然変異を有する試料、（Ｂ）は、全ゲノムのうち１０％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）は、全ゲノムのうち５％が点突然変異を有する試料、（Ｄ）は、全ゲノムのうち３％が点突然変異を有する試料についての結果である。
【００７４】
この結果、同図に示すように、ｍｔＤＮＡのピークが顕著に検出できた。例えば、プローブ添加量以外は同条件で解析を行った実施例１−１の結果と比較すると、図３（Ｃ）と前述の図１（Ｂ）、図３（Ｄ）と図１（Ｃ）に示すように、プローブの添加量を実施例１−１よりも軽減（ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．０２倍）することによって、さらにｗｔＤＮＡのピークが減少し、ｍｔＤＮＡの相対的ピークが大きくなった。このことから、プローブ添加量を調節することによって、さらに、検出感度が向上することがわかった。
【００７５】
（３）阻害用ポリヌクレオチドの添加量を増加して、ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７６】
前記実施例１におけるＰＣＲ反応液の阻害用ポリヌクレオチド添加量２μＬを３μＬ、蒸留水添加量３４．３７５μＬを３３.７７５μＬとした以外は、前記（２）の実施例１−２と同様にしてＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲ反応液における阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は３００ｎＭであり、検出用プローブの終濃度は１０ｎＭである。これらの結果を実施例１−３として図４に示す。同図において、（Ａ）は、全ゲノム１００％が点突然変異を有する試料、（Ｂ）は、全ゲノムのうち１０％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）は、全ゲノムのうち５％が点突然変異を有する試料、（Ｄ）は、全ゲノムのうち３％が点突然変異を有する試料についての結果である。
【００７７】
この結果、同図に示すように、ｍｔＤＮＡのピークが極めて顕著に検出できた。特に、阻害用ポリヌクレオチドの添加量以外は同条件で解析を行った実施例１−２の結果と比較すると、図４（Ｂ）と前述の図３（Ｂ）、図４（Ｃ）と図３（Ｃ）、図４（Ｄ）と図３（Ｄ）に示すように、阻害用ポリヌクレオチドの添加量を実施例１−２よりも増加（前記プローブに対してモル比で３０倍）することによって、さらにｗｔＤＮＡのピークが減少し、ｍｔＤＮＡの相対的ピークが大きくなっている。このことから、阻害用ポリヌクレオチド添加量を調節することによって、より一層、検出感度が向上することがわかった。
【００７８】
［実施例２］
ａｂｌ遺伝子の７５６番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ｃ）
阻害用ポリヌクレオチドを添加して、ａｂｌ遺伝子における７５６番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ｃ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７９】
配列番号１に示す７５６番目の塩基Ｇに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミドと、前記７５６番目の塩基ＧがＣに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＧ７５６Ｃ（＝Ｑ２５０Ｅ））を挿入したプラスミドとを調製した。以下、変異を有さない前者を「ｗｔＤＮＡ」、変異を有する後者を「ｍｔＤＮＡ」という。そして、前記実施例１の表１と同様に、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝０：１００、３：９７、１００：０）に調製して、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液において、阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は３００ｎＭ、検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５８℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。検出用プローブの添加割合は、ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．０５倍であり、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．３倍および前記プローブに対してモル比で６倍である。また、比較例２として、下記ＰＣＲ反応液に阻害用ポリヌクレオチド３μＬに代えて蒸留水３μＬを添加した以外は、同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００８０】
【表３】
【００８１】
センスプライマー 配列番号１３
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１４
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
検出用プローブ 配列番号２
５’−（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）−ｃｃｇｔａＧｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号３
５’−ｃｃｇｔａＣｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
【００８２】
これらの結果を図５に示す。同図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図５において、（Ａ）は、全プラスミドが点突然変異を有さない試料、（Ｂ）は、全プラスミドの１００％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）および（Ｄ）は、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料である。そして、前記（Ｃ）は、比較例２の結果、前記（Ｄ）は、実施例２の結果である。
【００８３】
同図（Ａ）に示すように、ｗｔＤＮＡは６１．０℃、同図（Ｂ）に示すように、ｍｔＤＮＡは６７．０℃で、それぞれシグナルのピークが検出された。これを標準として、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料を評価した。その結果、同図（Ｃ）に示すように、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例２では、ｍｔＤＮＡのシグナルを全く検出することができなかった。これに対して、阻害用ポリヌクレオチドを添加した実施例２では、同図（Ｄ）に示すように、ｍｔＤＮＡが少量であっても、ｗｔＤＮＡとｍｔＤＮＡの両方のシグナルを検出することができた。
【００８４】
［実施例３］
ａｂｌ遺伝子の７６３番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ａ）
阻害用ポリヌクレオチドを添加して、ａｂｌ遺伝子における７６３番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ａ）についてのＴｍ解析を行った。
【００８５】
配列番号１に示す７６３番目の塩基Ｇに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミドと、前記７６３番目の塩基ＧがＡに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＧ７６３Ａ（＝Ｅ２５５Ｋ））を挿入したプラスミドとを調製した。以下、変異を有さない前者を「ｗｔＤＮＡ」、変異を有する後者を「ｍｔＤＮＡ」という。そして、前記実施例１の表１と同様に、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝０：１００、３：９７、１００：０）に調製して、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液において、阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は５００ｎＭ、検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、前記実施例２と同様に行い、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。検出用プローブの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．０５倍であり、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．５倍および前記プローブに対してモル比で１０倍である。また、比較例３として、下記ＰＣＲ反応液に阻害用ポリヌクレオチド５μＬに代えて蒸留水５μＬを添加した以外は、同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００８６】
【表４】
【００８７】
センスプライマー 配列番号１５
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１６
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
検出用プローブ 配列番号７
５’−（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）−ｃｃａｇｔａｃｇｇｇＡａｇｇｔｇｔ−Ｐ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号８
５’−ｃｃａｇｔａｃｇｇｇＧａｇｇｔｇｔ−Ｐ−３’
【００８８】
これらの結果を図６に示す。同図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図６において、（Ａ）は、全プラスミドが点突然変化を有さない試料、（Ｂ）は、全プラスミドの１００％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）および（Ｄ）は、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料である。そして、前記（Ｃ）は、比較例３の結果、前記（Ｄ）は、実施例３の結果である。
【００８９】
同図（Ａ）に示すように、ｗｔＤＮＡは５０.０℃、同図（Ｂ）に示すように、ｍｔＤＮＡは５９．０℃で、それぞれシグナルのピークが検出された。これを標準として、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料を評価した。その結果、同図（Ｃ）に示すように、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例３では、ｍｔＤＮＡのシグナルを全く検出することができなかった。これに対して、阻害用ポリヌクレオチドを添加した実施例３では、同図（Ｄ）に示すように、ｍｔＤＮＡが少量であっても、ｗｔＤＮＡとｍｔＤＮＡの両方のシグナルを検出することができた。
【００９０】
［実施例４］
ａｂｌ遺伝子の７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）
阻害用ポリヌクレオチドを添加して、ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００９１】
配列番号１に示す７５８番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミドと、前記７５８番目の塩基ＡがＴに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ７５８Ｔ（＝Ｙ２５３Ｆ））を挿入したプラスミドとを調製した。以下、変異を有さない前者を、「ｗｔＤＮＡ」、変異を有する後者を、「ｍｔＤＮＡ」という。そして、前記実施例１の表１と同様に、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝０：１００、３：９７、１００：０）に調製して、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液において、阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は５００ｎＭ、検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、前記実施例２と同様に行い、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。検出用プローブの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．０５倍であり、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．５倍および前記プローブに対してモル比で１０倍である。また、比較例４として、下記ＰＣＲ反応液に阻害用ポリヌクレオチド５μＬに代えて蒸留水５μＬを添加した以外は、同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００９２】
【表５】
【００９３】
センスプライマー 配列番号１１
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１２
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
検出用プローブ 配列番号４
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｇＡａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号６
５’−ｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
【００９４】
これらの結果を図７に示す。同図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図７において、（Ａ）は、全プラスミドが点突然変化を有さない試料、（Ｂ）は、全プラスミドの１００％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）および（Ｄ）は、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料である。そして、前記（Ｃ）は、比較例４の結果、前記（Ｄ）は、実施例４の結果である。
【００９５】
同図（Ａ）に示すように、ｗｔＤＮＡは６０.０℃、同図（Ｂ）に示すように、ｍｔＤＮＡは６７．０℃で、それぞれシグナルのピークが検出された。これを標準として、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料を評価した結果、同図（Ｃ）に示すように、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例４では、ｍｔＤＮＡのシグナルを全く検出することができなかった。これに対して、阻害用ポリヌクレオチドを添加した実施例４では、同図（Ｄ）に示すように、ｍｔＤＮＡが少量であっても、ｗｔＤＮＡとｍｔＤＮＡの両方のシグナルを検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
以上のように、本発明の変異の検出方法によれば、前述のような阻害用ポリヌクレオチドを添加することで、例えば、白血病患者の白血球試料のように、点突然変異を有する検出対象ＤＮＡと前記点突然変異を有さない非検出対象ＤＮＡとが混在する試料であっても、優れた感度で前記点突然変異を検出できる。また、変異の種類が特定できることから、特異性にも優れる検出方法である。したがって、この方法は、特に白血病患者の点突然変異検出に有用であり、例えば、白血病治療薬が個人間において適しているか否かを遺伝子レベルで解析することも可能となることから、医療の分野において極めて有用な方法といえる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異の検出方法およびそれに用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。
【０００３】
点突然変異の一般的な検出方法としては、例えば、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域を増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を解析するＤｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（２）Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（３）検出対象配列に相当する領域を増幅させ、得られた増幅産物について温度勾配カラム中でＨＰＬＣを行い、溶出される時間によって変異の有無を検出するＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＨＰＬＣ法、（４）目的の変異を含む領域に蛍光プローブが結合すると蛍光を発することを利用し、前記蛍光の検出により変異を検出するＩｎｖａｄａｒ法、（５）３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。
【０００４】
しかしながら、前記（１）、（２）および（４）の方法は、それぞれ約２０％、約５％、約５％程度と感度が低く、操作に多大な手間と時間がかかる。前記（３）の方法は、感度が約１０％と低く、また、変異の有無が確認できるのみで、どの部位にどのような変異が生じているのかを解析できず、特異性に欠けるという問題がある。また、前記（５）の方法は、感度は高いものの特異性が低く、偽陽性が生じ易いという問題がある。なお、感度は数値（％）が小さい程高感度である。
【０００５】
このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、Ｔｍ解析を利用した検出が行われている。この方法は、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、試料中の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処理を施して、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナル測定により検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって点突然変異の有無を判断する。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定すれば、以下のような判断が可能である。前記測定値が前記評価基準値と同じであれば、マッチ、すなわち、標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断できる。他方、前記測定値が前記評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち、標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。
【０００６】
しかしながら、このようなＴｍ解析を用いた検出方法は、感度が低いという問題がある。具体例として、白血病患者の血液細胞由来ＤＮＡについて点突然変異を検出する際に問題となっている（特許文献１）。白血病は、骨髄中の造血幹細胞がガン化することによって起こる疾患である。中でも慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）は、９番目の染色体と２２番目の染色体との転座により形成されるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子が発症原因として知られており、その治療には、ＡＢＬキナーゼ阻害剤であるイマチニブ等が広く使用されている。しかしながら、このａｂｌ遺伝子（前記融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子を含む）に点突然変異が存在すると、イマチニブに対して耐性を発現するという問題がある。その場合、治療において、例えば、イマチニブ投与量の増加、他の治療薬への変更、骨髄移植等への切り替え等が必要になる。したがって、白血病、特にＣＭＬの治療においては、ａｂｌ遺伝子における点突然変異の有無を検出することが非常に重要となっている。しかしながら、一人のＣＭＬ患者の血液であっても、その血液細胞にはａｂｌ遺伝子に点突然変異が発生しているもの（検出対象配列）と発生していないもの（非検出対象配列）とが含まれており、両者の違いは、点突然変異すなわち一塩基の配列にすぎない。そうすると、点突然変異を検出するためのプローブは、点突然変異を含む検出対象配列にハイブリダイズ（マッチ）し、さらに、点突然変異を含まない非検出対象配列にもハイブリダイズ（ミスマッチ）するという現象が起こってしまう。このような場合に、Ｔｍ解析によってシグナルの強度と温度との関係を示す融解曲線を作成すると、マッチしている検出対象配列に対する高温側のピークが、ミスマッチである非検出対象配列に対する低温側のピークの存在によって検出し難くなり、さらに検出感度の低下が生じてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３７９９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、Ｔｍ解析を利用した検出感度に優れる変異の検出方法ならびにそれに用いる検出用プローブキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の遺伝子増幅方法は、プライマーを用いて検出部位を含む検出対象配列を増幅する遺伝子増幅方法であって、
検出部位が変異している検出対象の核酸と、前記検出部位が未変異である非検出対象の核酸とを含有する試料を、前記検出部位を含む検出対象配列を増幅できる前記プライマーと、前記検出部位が未変異である非検出対象の核酸に相補的なポリヌクレオチド（以下、「阻害用ポリヌクレオチド」という）との存在下で、遺伝子増幅処理することを特徴とする。
前記目的を達成するために、本発明の変異の検出方法は、前記試料が、検出部位が変異している検出対象ＤＮＡと、前記検出部位が未変異である非検出対象ＤＮＡとを含有する試料であり、
下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ） 前記ＤＮＡを含む試料に、検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブ、および、非検出対象配列に相補的なポリヌクレオチド（以下、「阻害用ポリヌクレオチド」という）を添加する工程であって、
前記検出対象配列が、前記検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、変異している前記検出部位を含み、
前記非検出対象配列が、前記非検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、未変異である前記検出部位を含む、前記工程
（Ｂ） 前記ＤＮＡに前記検出用プローブをハイブリダイズさせる工程
（Ｃ） 前記ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（Ｄ） 前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（Ｅ） 前記Ｔｍ値から前記検出対象部位における変異の有無を決定する工程
【００１０】
本発明の検出用プローブキットは、本発明の変異の検出方法に使用する検出用プローブキットであって、
検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブと、非検出対象配列に相補的な阻害用ポリヌクレオチドとを含み、
前記検出対象配列が、検出部位が変異している検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、変異している前記検出部位を含み、
前記非検出対象配列が、前記検出部位が未変異である前記非検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、未変異である前記検出部位を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の変異の検出方法は、試料に、検出部位が変異している前記検出対象配列に対する検出用プローブだけでなく、さらに、検出部位が未変異である前記非検出対象配列に対する阻害用ポリヌクレオチドを添加している。このため、非検出対象配列への前記検出用プローブのハイブリダイズを抑制でき、この結果、従来よりも優れた感度（約３％）で、前記検出部位における変異を検出できる。このように、検出用プローブの非検出対象配列へのハイブリダイズを抑制できるのは、前記検出用プローブと比較して、前記阻害用ポリヌクレオチドの前記非検出対象配列に対する相同性が高いことによる。したがって、本発明の検出方法は、例えば、試料中に検出対象ＤＮＡと非検出対象ＤＮＡの両方が含まれる試料に対して有用である。特に、白血病患者の試料に対して有用であり、中でも、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者について、ａｂｌ遺伝子の変異（ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子の変異を含む）を検出する際に有用である。前述のように、変異を高感度で検出できるため、例えば、患者ごとの白血病治療薬の適正を、遺伝子レベルで解析することが可能となり、医療分野において極めて有用な方法といえる。また、本発明の検出用プローブキットを用いれば、本発明の変異の検出方法を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、阻害用ポリヌクレオチドを添加したＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、比較例１における、阻害用ポリヌクレオチド無添加でのＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の前記実施例１における、検出用プローブの添加割合を変化させたＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の前記実施例１における、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合を変化させたＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２における、阻害用ポリヌクレオチドを添加したＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例３における、阻害用ポリヌクレオチドを添加したＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例４における、阻害用ポリヌクレオチドを添加したＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の変異の検出方法は、前述のとおり、試料中のＤＮＡの変異を検出する方法であって、前記試料が、検出部位が変異している検出対象ＤＮＡと、前記検出部位が未変異である非検出対象ＤＮＡとを含有する試料であり、下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ） 前記ＤＮＡを含む試料に、検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブ、および、非検出対象配列に相補的な阻害用ポリヌクレオチドを添加する工程
（Ｂ） 前記ＤＮＡに前記検出用プローブをハイブリダイズさせる工程
（Ｃ） 前記ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（Ｄ） 前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（Ｅ） 前記Ｔｍ値から前記検出対象部位における変異の有無を決定する工程
【００１４】
前記（Ａ）工程において、前記検出対象配列とは、前記検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、変異している前記検出対象部位を含む配列である。また、前記非検出対象配列とは、前記非検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、未変異である前記検出対象部位を含む配列である。
【００１５】
本発明において、検出部位に変異が存在する前記検出対象配列を「変異配列」、前記検出対象配列を含む検出対象ＤＮＡを「変異ＤＮＡ」ともいい、検出部位に変異が存在しない前記非検出対象配列を「正常配列」、前記非検出対象配列を含むＤＮＡを「正常ＤＮＡ」ともいう。また、検出部位における変異を「検出目的の変異」ともいう。変異の有無を検出する標的となる試料中ＤＮＡを「標的ＤＮＡ」ともいう。本発明において検出する変異としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等があげられる。
【００１６】
本発明において、前記試料中のＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし二本鎖ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、例えば、前記（Ｂ）ハイブリダイズ工程に先立って、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することによって、次の（Ｂ）ハイブリダイズ工程において、検出用プローブや阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを効率よく行うことができる。
【００１７】
本発明において、前記試料中のＤＮＡは、例えば、遺伝子であってもよいし、遺伝子の部分配列であってもよい。また、前記試料中のＤＮＡは、例えば、生体試料等の試料に元来含まれるＤＮＡでもよいが、例えば、検出精度を向上できることから、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物であることが好ましい。具体的には、例えば、前記試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物や、前記試料に元来含まれているＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）から逆転写反応（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ））により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物があげられる。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００ｍｅｒであり、好ましくは８０〜２００ｍｅｒである。
【００１８】
本発明の検出方法を適用する試料は、特に制限されない。本発明は、例えば、前述のように、標的ＤＮＡとして、目的の変異を有するＤＮＡ（検出対象ＤＮＡ）と目的の変異を有さないＤＮＡ（非検出対象ＤＮＡ）との両方を含む試料に対して、非常に有用である。前記ＤＮＡやＲＮＡの由来は、制限されず、例えば、各種がん細胞等の細胞、ウィルス、ミトコンドリア等があげられる。特に、前述のように、白血病患者の生体試料（例えば、血液試料）について変異の検出を行う場合、ガン化した血液細胞には、変異が発生したＤＮＡを有する細胞と、変異が発生していないＤＮＡを有する細胞とが含まれるため、前述のような問題が起こり易い。したがって、本発明の検出方法は、特に、変異が発生したＤＮＡと変異が発生していないＤＮＡを有する試料への適用が好ましく、例えば、白血病の生体試料、具体例としては、血液試料や白血球細胞等に適用することが好ましい。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡの調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００１９】
本発明における検出目的の変異は、制限されない。前述のように、白血病に関連する変異を検出する際、非検出対象配列に対して検出用プローブがハイブリダイズすることが知られている。このことから、具体例として、白血病に関連する遺伝子の変異を検出する際、本発明の方法は有用である。前記白血病に関連する遺伝子の変異としては、例えば、ａｂｌ遺伝子の変異（ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子の変異を含む）があげられる。例えば、配列番号１に示すａｂｌ遺伝子のｃＤＮＡ配列（ｍＲＮＡ配列）において、７５６番目の塩基Ｇ、７５８番目の塩基Ａ、７６３番目の塩基Ｇの変異があげられる。これらの塩基については、例えば、以下のような塩基への変異が報告されている。なお、ａｂｌ遺伝子の配列は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００５１５７に登録されている。
変異Ｇ７５６Ｃ ７５６番目の塩基ＧがＣに変異
変異Ａ７５８Ｔ ７５８番目の塩基ＡがＴに変異
変異Ｇ７６３Ａ ７６３番目の塩基ＧがＡに変異
【００２０】
本発明において、前記検出用プローブは、検出部位が変異している前記検出対象配列に相補的な配列であればよく、前記阻害用ポリヌクレオチドは、検出部位が未変異である前記非検出対象配列に相補的な配列であればよい。前記プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドの長さは、特に制限されないが、同じ長さであることが好ましい。前記検出用プローブの配列と前記阻害用ポリヌクレオチドの配列とは、例えば、ハイブリッド形成の際に前記検出部位（目的の変異が発生する部位）と対をなす部位（塩基）を除いて、９０％〜１００％同じ配列であることが好ましく、特に好ましくは１００％である。また、前記検出用プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドは、例えば、同じ鎖であれば、ＤＮＡの順鎖および逆鎖のいずれにハイブリダイズするように設計してもよい。
【００２１】
以下に、ａｂｌ遺伝子の前記３種類の変異（Ｇ７５６Ｃ、Ａ７５８Ｔ、Ｇ７６３Ａ）の検出に使用する検出用プローブと阻害用ポリヌクレオチドとの組み合わせを例示する。なお、各配列において、大文字で示した塩基が、ａｂｌ遺伝子の７５６番目、７５８番目、７６３番目にそれぞれ対応する。本発明は、これらには制限されない。
【００２２】
変異Ｇ７５６Ｃ（順鎖の検出用）
検出用プローブ 配列番号２
５’−ｃｃｇｔａＧｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号３
５’−ｃｃｇｔａＣｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’
【００２３】
変異Ａ７５８Ｔ（順鎖の検出用）
検出用プローブ 配列番号４
５’−ｃｃｇＡａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号５
５’−ｃｃｔｃｃｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号６
５’−ｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’
【００２４】
変異Ｇ７６３Ａ（逆鎖の検出用）
検出用プローブ 配列番号７
５’−ｃｃａｇｔａｃｇｇｇＡａｇｇｔｇｔ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号８
５’−ｃｃａｇｔａｃｇｇｇＧａｇｇｔｇｔ−３’
【００２５】
本発明において、前記阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記検出用プローブの長さ、検出対象配列のＧＣ含量等、検出系の条件に応じて適宜決定できる。前記検出用プローブに対する添加割合は、特に制限されないが、下限は、例えば、モル比で０．１倍以上であり、好ましくは１倍以上、より好ましくは２倍以上である。また、上限は、例えば、モル比で１００倍以下である。前記阻害用ポリヌクレオチドの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０ｍｅｒであり、好ましくは１０〜３０ｍｅｒであり、前記検出用プローブと同じ長さに設定することが好ましい。
【００２６】
本発明において、前記検出対象配列に相補的な検出用プローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、検出シグナルを十分に確保することができることから、前記試料中のＤＮＡに対してモル比で１倍以下が好ましい。前記阻害用ポリヌクレオチドの添加に加えて、さらに、前記検出用プローブの添加割合を制御することによって、例えば、検出感度のより一層の向上を図ることができる。また、前記検出用プローブの添加割合を設定するのみで足りることから、操作が極めて簡便である。前記検出用プローブの添加割合は、より好ましくは、前記ＤＮＡに対してモル比で０．１倍以下である。この際、試料中のＤＮＡとは、例えば、検出対象ＤＮＡと非検出対象ＤＮＡとの合計でもよいし、検出対象配列を含む増幅産物と非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中のＤＮＡにおける検出対象ＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記検出用プローブの添加割合は、例えば、検出対象ＤＮＡ（または、検出対象配列を含む増幅産物）に対してモル比で１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに好ましくは３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、前記検出対象ＤＮＡ等に対して、モル比で、０．００１倍以上が好ましく、より好ましくは０．０１倍以上であり、さらに好ましくは０．１倍以上である。
【００２７】
なお、前記ＤＮＡに対する検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよいし、一本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよい。また、前記検出用プローブの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０ｍｅｒであり、好ましくは１０〜３０ｍｅｒである。
【００２８】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００２９】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度上昇に伴うシグナル変動の測定は、例えば、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うことができる。より好ましくは、前記検出用プローブとして、標識化物質で標識化されたプローブを使用して、シグナル変動の測定を行う。前記検出用プローブにおいて標識化部位は、特に制限されない。また、標識化物質は、特に制限されないが、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
【００３０】
前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、例えば、この標識化物質によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【００３１】
前記標識化物質としては、制限されないが、例えば、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、検出用プローブとしては、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、Ｃであることが好ましい。この場合、検出用プローブがハイブリダイズする検出対象ＤＮＡにおいて、前記検出用プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がＧとなるように、前記検出用プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが検出対象ＤＮＡにハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のＣが、前記検出対象ＤＮＡにおけるＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。
【００３２】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＲＭＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。具体例として、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、例えば、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、例えば、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、例えば、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。他方、前記阻害用ポリヌクレオチドは、標識化されていないことが好ましい。
【００３３】
次に、ａｂｌ遺伝子（配列番号１）における７５８番目の塩基Ａの点突然変異（Ａ→Ｔ）を例にあげて、本発明の検出方法について説明する。なお、本発明は、阻害用ポリヌクレオチドを添加した点が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。また、検出用プローブがハイブリダイズする検出対象配列は、例えば、配列番号１の塩基配列において７５８番目の塩基ＡがＴに変異した全長配列でもよいが、検出部位である７５８番目の塩基（Ａ→Ｔ）を含んでいれば部分配列であることが好ましい。
【００３４】
まず、全血からゲノムＤＮＡを単離する。全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができ、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００３５】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、検出用プローブおよび阻害用ポリヌクレオチドを添加する。前記検出用プローブと阻害用ポリヌクレオチドの添加時は、後述するように、何ら制限されないが、本実施形態においては、一例として、検出用プローブを添加した後に、阻害用ポリヌクレオチドを添加する方法をあげる。
【００３６】
すなわち、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、まず、検出用プローブを添加する。前記検出用プローブとしては、例えば、前述のものがあげられるが、中でも、ＱＰｒｏｂｅが好ましい。このＱＰｒｏｂｅは、前述のように、一般に、末端塩基がシトシンであり、前記末端を蛍光色素で標識化したプローブである。そして、これが検出対象配列にハイブリッドすることで、前記蛍光色素と検出対象配列のグアニンとが相互作用し、その結果、蛍光が減少（または消光）するものである。
【００３７】
前記検出用プローブの配列は、前述のように、点突然変異を含む検出対象配列に相補的であればよく、前記検出対象配列に応じて適宜設計できる。ａｂｌ遺伝子（配列番号１）における７５８番目塩基Ａの点突然変異（Ａ→Ｔ）を検出する場合は、例えば、前述の配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド等があげられる。
変異Ａ７５８Ｔの検出用プローブ 配列番号４
５’−ｃｃｇａＡｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−３’ （ＧＣ含量８１．３％）
【００３８】
前記試料中のＤＮＡやＲＮＡを鋳型として遺伝子増幅法を行う場合も、前記検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されない。前記検出用プローブは、例えば、後述する遺伝子増幅処理の後、得られた増幅産物に対して添加してもよいが、遺伝子増幅処理の前に添加することが好ましい。このように遺伝子増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合、例えば、プローブ自体の伸長を予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよいし、前述のような蛍光色素で３’末端を標識化してもよい。
【００３９】
前記検出用プローブは、例えば、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００４０】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、遺伝子増幅法により、目的配列の増幅を行う。具体的には、検出目的の点突然変異を生じる塩基部位を含む配列、すなわち、検出対象配列および非検出対象配列を増幅させる。
【００４１】
遺伝子増幅法は、制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法が好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。なお、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４２】
ＰＣＲのプライマーの配列は、例えば、目的の検出対象配列を増幅できるものであれば特に制限されず、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。増幅させる領域は、例えば、目的の検出対象配列のみでもよいし、前記検出対象配列を含む領域であってもよい。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定でき、例えば、１０〜３０ｍｅｒである。前述のように、ａｂｌ遺伝子（配列番号１）における７５８番目塩基Ａの点突然変異（Ａ→Ｔ）を検出する場合、具体例として、以下に示すポリヌクレオチドからなるプライマーが使用できる。これらのプライマーの組み合わせは特に制限されない。なお、配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを組み合わせた場合、得られる増幅産物の長さは１０３ｍｅｒ程度である。
（プライマーセット１）
センスプライマー 配列番号９
５’−ｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃａｃｇｇａｃ−３’ （ＧＣ含量６３．２％）
アンチセンスプライマー 配列番号１０
５’−ｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇｃｔｇ−３’ （ＧＣ含量７５％）
（プライマーセット２）
センスプライマー 配列番号１１
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１２
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
【００４３】
次に、後述するハイブリダイズ工程に先立って、前記増幅産物を含む試料に前記阻害用ポリヌクレオチドを添加する。前記阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前述の通りである。前述のように、添加のタイミングは、これに制限されず、例えば、前記検出用プローブ添加の前後もしくは同時に行うことができる。また、前記阻害用ポリヌクレオチドの添加は、例えば、前述の遺伝子増幅処理の前後いずれでもよいが、例えば、処理が簡便であることから、遺伝子増幅処理前に添加しておくことが好ましい。このように遺伝子増幅処理前に前記阻害用ポリヌクレオチドを添加する場合、例えば、阻害用ポリヌクレオチド自体が伸長することを予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。
【００４４】
前述のように、ａｂｌ遺伝子（配列番号１）における７５８番目塩基Ａの点突然変異（Ａ→Ｔ）を検出する場合、阻害用ポリヌクレオチドとしては、例えば、点突然変異を含まない、配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド等があげられる。この阻害用ポリヌクレオチドは、例えば、前述の配列番号４の塩基配列からなる検出用プローブと組み合わせて使用することが好ましい。
変異Ａ７５８Ｔの阻害用ポリヌクレオチド 配列番号５
５’−ｃｃｔｃｃｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇ−３’ （ＧＣ含量８０％）
【００４５】
次に、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記検出用プローブならびに阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを行う。
【００４６】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されず、例えば、８５℃以上であり、好ましくは、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されず、例えば、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００４７】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリダイズ、および、前記一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃以下である。
【００４８】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μＭであり、好ましくは０．１〜０．５μＭ、前記検出用プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μＭであり、好ましくは０．００１〜１μＭ、前記阻害用ポリヌクレオチドの濃度は、例えば、０．１ｎＭ〜１ｍＭであり、好ましくは０．１ｎＭ〜１００μＭである。
【００４９】
本発明においては、前述のように阻害用ポリヌクレオチドの添加が重要であって、例えば、検出対象ＤＮＡ、検出用プローブ、阻害用ポリヌクレオチドの反応液における濃度等は、特に制限されない。具体例としては、後述するシグナルの検出において、例えば、使用する装置の検出感度が相対的に高い程、反応液における検出対象ＤＮＡの濃度を低減でき、使用する装置の検出感度が相対的に低い程、反応液における検出対象ＤＮＡの濃度を増加させることが好ましい。具体例として、後述するシグナル検出で市販装置（商品名Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ；Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を使用する場合、例えば、反応液において、検出対象ＤＮＡ濃度５〜１０００ｎＭ、前記検出用プローブ濃度５０〜１０００ｎＭ、前記阻害用ポリヌクレオチド濃度５ｎＭ〜１００μＭとすることが好ましく、より好ましくは、検出対象ＤＮＡ濃度１０〜５００ｎＭ、前記検出用プローブ濃度１００〜５００ｎＭ、前記阻害用ポリヌクレオチド濃度１０ｎＭ〜５０μＭである。
【００５０】
そして、形成された、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブまたは阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成体を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。例えば、Ｑ-Ｐｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５１】
シグナル変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されない。開始温度は、例えば、室温（例えば、１０℃）〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００５２】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における値（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、検出用プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００５３】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することもできる。
【００５４】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００５５】
具体例を以下に示す。検出用プローブとして、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、Ｑ-Ｐｒｏｂｅ）を使用した場合、前記検出用プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、検出用プローブとして、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５６】
つぎに、本発明の検出用プローブキットは、前述のように、本発明の変異の検出方法に使用するキットであって、検出対象配列に相補的なポリヌクレオチドからなる検出用プローブと、非検出対象配列に相補的な阻害用ポリヌクレオチドとを含むことを特徴とする。本発明において、前記検出対象配列は、前述のように、検出部位が変異している検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、変異している前記検出部位を含む配列である。また、前記非検出対象配列は、前述のように、前記検出部位が未変異である前記非検出対象ＤＮＡまたはその部分配列であって、未変異である前記検出部位を含む配列である。本発明の検出用プローブキットは、前記プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は制限されない。
【００５７】
前記プローブおよび前記阻害用ポリヌクレオチドとしては、制限されず、前述と同様のものが利用でき、好ましい組み合わせも前述の通りである。
【００５８】
本発明の検出用プローブキットにおいて、前記プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドは、一つの試薬として混合されてもよいし、別個の試薬として独立していてもよい。前者の場合、前記プローブと前記阻害用ポリヌクレオチドは、前述のような割合で混合されていることが好ましい。後者の場合には、例えば、反応液中の割合が、前述のような範囲となるように使用すればよい。また、本発明の検出用プローブキットは、前記プローブと相補的な配列を含む領域を増幅するためのプライマーをさらに有しても良い。
【００５９】
また、本発明のデータ解析方法は、ＤＮＡの変異の有無を決定するためのデータの解析方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）工程を有することを特徴とする。
（ａ） 本発明の変異検出方法における（Ｃ）工程で得られたシグナル変動を解析してＴｍ値を演算する工程
（ｂ） 前記演算工程において演算した前記Ｔｍ値からＤＮＡの変異の有無を決定する工程
【００６０】
本発明のシステムは、試料中のＤＮＡの変異の有無を検出するためのシステムであって、本発明の変異の検出方法における（Ｃ）工程で得られたシグナル変動を入力する入力手段、前記入力手段により入力した前記シグナル変動からＴｍ値を演算する演算手段、および、前記演算手段により演算したＴｍ値に基づいて、ＤＮＡの変異の有無を決定する決定手段を有することを特徴とする。本発明のシステムは、例えば、コンピュータシステムによって構築された検出装置があげられる。前記システムのハードウェア構造は、制限されず、例えば、制御部であるＣＰＵに、記憶装置、キーボードやマウス等の入力装置が接続されており、さらに、例えば、結果の出力装置、入力データや結果を表示する表示装置（ディスプレイ）等が接続されてもよい。また、各手段は、例えば、コンピュータのＣＰＵが所定のプログラムを実行することによって実現される機能的ブロックであればよい。このため、例えば、各構成手段が、ハードウェアとして実装されていなくともよく、ネットワークシステムであってもよい。
【００６１】
また、本発明のシステムは、例えば、本発明の変異の検出方法における（Ｂ）工程や（Ｃ）工程を実行するための手段を有していてもよい。前記工程を実行するための手段としては、例えば、温度制御手段、シグナルの検出手段があげられる。前記温度制御手段の実行により、例えば、ハイブリダイズによる二本鎖ＤＮＡ（ハイブリッド形成体）の形成や、ハイブリッド形成体の解離を行うことができる。また、前記シグナル検出手段の実行により、例えば、温度変化に伴いハイブリッド形成体が形成されることによるシグナル変動量や、ハイブリッド形成体が解離することによるシグナル変動量を検出できる。この場合、例えば、前記入力手段にかえて、前記シグナル検出手段により検出されたシグナル変動を記録する記録手段を有してもよい。さらに、本発明のシステムは、前記決定手段により決定されたＤＮＡの変異の有無を出力する出力する手段を備えてもよい。
【００６２】
本発明のプログラムは、本発明のデータ解析方法をコンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラムである。
【００６３】
また、本発明の電子媒体は、本発明のコンピュータプログラムを格納したコンピュータ読取可能な電子媒体（「記録媒体」ともいう）である。
【実施例】
【００６４】
次に、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例および比較例により制限されない。
【００６５】
［実施例１］
ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）
（１）阻害用ポリヌクレオチドを添加して、ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００６６】
ａｂｌ遺伝子７５８番目の塩基に変異を有さない白血球細胞株のゲノムＤＮＡ（配列番号１）と、ａｂｌ遺伝子７５８番目の塩基に変異を有する白血球細胞株のゲノムＤＮＡ（配列番号１において７５８番目塩基がＴ：ａｂｌチロシンキナーゼＡ７５８Ｔ（＝Ｙ２５３Ｆ））とを調製した。以下、変異を有さない前者を「ｗｔＤＮＡ」、変異を有する後者を「ｍｔＤＮＡ」という。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝１００：０、５０：５０、１０：９０、５：９５、３：９７、０：１００）に調製して、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液５０μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液における阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は２００ｎＭ、検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１０秒および６０℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。なお、検出用プローブの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．１倍であり、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．４倍および前記プローブに対してモル比で４倍である。なお、検出用プローブの検出対象ＤＮＡ（検出対象配列の増幅産物）に対する添加割合は、以下の通りである。これらの結果を実施例１−１とする。また、比較例１−１として、阻害用ポリヌクレオチド２μＬに代えて蒸留水２μＬを下記ＰＣＲ反応液に添加した以外は、同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】
センスプライマー 配列番号９
５’−ｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃａｃｇｇａｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１０
５’−ｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇｃｔｇ−３’
検出用プローブ 配列番号４
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｇＡａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号５
５’−ｃｃｔｃｃｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇ−３’
【００７０】
これらの結果を図１および図２に示す。両図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、縦軸の微分値とは「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示す（以下、同様）。図１は実施例１−１、図２は比較例１−１の結果である。図１において、（Ａ）は、全ゲノムの１００％が点突然変異を有する試料、（Ｂ）は、全ゲノムのうち５％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）は、全ゲノムのうち３％が点突然変異を有する試料、（Ｄ）は、全ゲノムが点突然変異を有さない試料についての結果である。図２において、（Ａ）は、全ゲノム１００％が点突然変異を有する試料、（Ｂ）は、全ゲノムのうち５０％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）は、全ゲノムのうち５％が点突然変異を有する試料、（Ｄ）は、全ゲノムのうち３％が点突然変異を有する試料、（Ｅ）は、全ゲノムが点突然変異を有さない試料についての結果である。
【００７１】
図１（Ａ）および図２（Ａ）に示すように、ｍｔＤＮＡは６９．５℃、図１（Ｄ）および図２（Ｅ）に示すように、ｗｔＤＮＡは６１．５℃でシグナルのピークが検出された。これを標準として各試料を評価した。その結果、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例１−１では、ｍｔＤＮＡが５０％の場合、図２（Ｂ）に示すようにｍｔＤＮＡのシグナルを検出できたが、ｍｔＤＮＡが少量（５％、３％）の場合には、図２（Ｃ）および（Ｄ）に示すようにｍｔＤＮＡのシグナルを全く検出することができなかった。これに対して、阻害用ポリヌクレオチドを添加した実施例１−１では、ｍｔＤＮＡが少量（５％、３％）であっても、図１（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、ｍｔＤＮＡのシグナルを検出することができた。つまり、阻害用ポリヌクレオチドの添加によって、点突然変異を有さないｗｔＤＮＡへの検出用プローブのハイブリダイズが阻害されたため、結果として、ｍｔＤＮＡに結合する検出用プローブの量が増加し、それによって検出感度が向上したといえる。
【００７２】
（２）さらに、検出用プローブの添加割合を変化させ、ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７３】
前記実施例１におけるＰＣＲ反応液の検出用プローブ添加量０．５μＬを０．１μＬ、蒸留水添加量３４．３７５μＬを３４.７７５μＬとし、前記検出用プローブの終濃度を１／５の１０ｎＭに設定した以外は、前記実施例１と同様にしてＴｍ解析を行った。この結果を実施例１−２として、図３に示す。同図において、（Ａ）は、全ゲノム１００％が点突然変異を有する試料、（Ｂ）は、全ゲノムのうち１０％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）は、全ゲノムのうち５％が点突然変異を有する試料、（Ｄ）は、全ゲノムのうち３％が点突然変異を有する試料についての結果である。
【００７４】
この結果、同図に示すように、ｍｔＤＮＡのピークが顕著に検出できた。例えば、プローブ添加量以外は同条件で解析を行った実施例１−１の結果と比較すると、図３（Ｃ）と前述の図１（Ｂ）、図３（Ｄ）と図１（Ｃ）に示すように、プローブの添加量を実施例１−１よりも軽減（ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．０２倍）することによって、さらにｗｔＤＮＡのピークが減少し、ｍｔＤＮＡの相対的ピークが大きくなった。このことから、プローブ添加量を調節することによって、さらに、検出感度が向上することがわかった。
【００７５】
（３）阻害用ポリヌクレオチドの添加量を増加して、ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７６】
前記実施例１におけるＰＣＲ反応液の阻害用ポリヌクレオチド添加量２μＬを３μＬ、蒸留水添加量３４．３７５μＬを３３.７７５μＬとした以外は、前記（２）の実施例１−２と同様にしてＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲ反応液における阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は３００ｎＭであり、検出用プローブの終濃度は１０ｎＭである。これらの結果を実施例１−３として図４に示す。同図において、（Ａ）は、全ゲノム１００％が点突然変異を有する試料、（Ｂ）は、全ゲノムのうち１０％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）は、全ゲノムのうち５％が点突然変異を有する試料、（Ｄ）は、全ゲノムのうち３％が点突然変異を有する試料についての結果である。
【００７７】
この結果、同図に示すように、ｍｔＤＮＡのピークが極めて顕著に検出できた。特に、阻害用ポリヌクレオチドの添加量以外は同条件で解析を行った実施例１−２の結果と比較すると、図４（Ｂ）と前述の図３（Ｂ）、図４（Ｃ）と図３（Ｃ）、図４（Ｄ）と図３（Ｄ）に示すように、阻害用ポリヌクレオチドの添加量を実施例１−２よりも増加（前記プローブに対してモル比で３０倍）することによって、さらにｗｔＤＮＡのピークが減少し、ｍｔＤＮＡの相対的ピークが大きくなっている。このことから、阻害用ポリヌクレオチド添加量を調節することによって、より一層、検出感度が向上することがわかった。
【００７８】
［実施例２］
ａｂｌ遺伝子の７５６番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ｃ）
阻害用ポリヌクレオチドを添加して、ａｂｌ遺伝子における７５６番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ｃ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７９】
配列番号１に示す７５６番目の塩基Ｇに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミドと、前記７５６番目の塩基ＧがＣに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＧ７５６Ｃ（＝Ｑ２５０Ｅ））を挿入したプラスミドとを調製した。以下、変異を有さない前者を「ｗｔＤＮＡ」、変異を有する後者を「ｍｔＤＮＡ」という。そして、前記実施例１の表１と同様に、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝０：１００、３：９７、１００：０）に調製して、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液において、阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は３００ｎＭ、検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５８℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。検出用プローブの添加割合は、ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．０５倍であり、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．３倍および前記プローブに対してモル比で６倍である。また、比較例２として、下記ＰＣＲ反応液に阻害用ポリヌクレオチド３μＬに代えて蒸留水３μＬを添加した以外は、同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００８０】
【表３】
【００８１】
センスプライマー 配列番号１３
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１４
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
検出用プローブ 配列番号２
５’−（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）−ｃｃｇｔａＧｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号３
５’−ｃｃｇｔａＣｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
【００８２】
これらの結果を図５に示す。同図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図５において、（Ａ）は、全プラスミドが点突然変異を有さない試料、（Ｂ）は、全プラスミドの１００％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）および（Ｄ）は、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料である。そして、前記（Ｃ）は、比較例２の結果、前記（Ｄ）は、実施例２の結果である。
【００８３】
同図（Ａ）に示すように、ｗｔＤＮＡは６１．０℃、同図（Ｂ）に示すように、ｍｔＤＮＡは６７．０℃で、それぞれシグナルのピークが検出された。これを標準として、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料を評価した。その結果、同図（Ｃ）に示すように、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例２では、ｍｔＤＮＡのシグナルを全く検出することができなかった。これに対して、阻害用ポリヌクレオチドを添加した実施例２では、同図（Ｄ）に示すように、ｍｔＤＮＡが少量であっても、ｗｔＤＮＡとｍｔＤＮＡの両方のシグナルを検出することができた。
【００８４】
［実施例３］
ａｂｌ遺伝子の７６３番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ａ）
阻害用ポリヌクレオチドを添加して、ａｂｌ遺伝子における７６３番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ａ）についてのＴｍ解析を行った。
【００８５】
配列番号１に示す７６３番目の塩基Ｇに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミドと、前記７６３番目の塩基ＧがＡに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＧ７６３Ａ（＝Ｅ２５５Ｋ））を挿入したプラスミドとを調製した。以下、変異を有さない前者を「ｗｔＤＮＡ」、変異を有する後者を「ｍｔＤＮＡ」という。そして、前記実施例１の表１と同様に、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝０：１００、３：９７、１００：０）に調製して、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液において、阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は５００ｎＭ、検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、前記実施例２と同様に行い、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。検出用プローブの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．０５倍であり、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．５倍および前記プローブに対してモル比で１０倍である。また、比較例３として、下記ＰＣＲ反応液に阻害用ポリヌクレオチド５μＬに代えて蒸留水５μＬを添加した以外は、同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００８６】
【表４】
【００８７】
センスプライマー 配列番号１５
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１６
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
検出用プローブ 配列番号７
５’−（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）−ｃｃａｇｔａｃｇｇｇＡａｇｇｔｇｔ−Ｐ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号８
５’−ｃｃａｇｔａｃｇｇｇＧａｇｇｔｇｔ−Ｐ−３’
【００８８】
これらの結果を図６に示す。同図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図６において、（Ａ）は、全プラスミドが点突然変化を有さない試料、（Ｂ）は、全プラスミドの１００％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）および（Ｄ）は、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料である。そして、前記（Ｃ）は、比較例３の結果、前記（Ｄ）は、実施例３の結果である。
【００８９】
同図（Ａ）に示すように、ｗｔＤＮＡは５０.０℃、同図（Ｂ）に示すように、ｍｔＤＮＡは５９．０℃で、それぞれシグナルのピークが検出された。これを標準として、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料を評価した。その結果、同図（Ｃ）に示すように、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例３では、ｍｔＤＮＡのシグナルを全く検出することができなかった。これに対して、阻害用ポリヌクレオチドを添加した実施例３では、同図（Ｄ）に示すように、ｍｔＤＮＡが少量であっても、ｗｔＤＮＡとｍｔＤＮＡの両方のシグナルを検出することができた。
【００９０】
［実施例４］
ａｂｌ遺伝子の７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）
阻害用ポリヌクレオチドを添加して、ａｂｌ遺伝子における７５８番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００９１】
配列番号１に示す７５８番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミドと、前記７５８番目の塩基ＡがＴに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ７５８Ｔ（＝Ｙ２５３Ｆ））を挿入したプラスミドとを調製した。以下、変異を有さない前者を、「ｗｔＤＮＡ」、変異を有する後者を、「ｍｔＤＮＡ」という。そして、前記実施例１の表１と同様に、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝０：１００、３：９７、１００：０）に調製して、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液において、阻害用ポリヌクレオチドの終濃度は５００ｎＭ、検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、前記実施例２と同様に行い、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。検出用プローブの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．０５倍であり、阻害用ポリヌクレオチドの添加割合は、前記ＰＣＲ増幅産物に対してモル比で０．５倍および前記プローブに対してモル比で１０倍である。また、比較例４として、下記ＰＣＲ反応液に阻害用ポリヌクレオチド５μＬに代えて蒸留水５μＬを添加した以外は、同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００９２】
【表５】
【００９３】
センスプライマー 配列番号１１
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１２
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
検出用プローブ 配列番号４
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｇＡａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
阻害用ポリヌクレオチド 配列番号６
５’−ｃｃｇＴａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｃ−Ｐ−３’
【００９４】
これらの結果を図７に示す。同図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図７において、（Ａ）は、全プラスミドが点突然変化を有さない試料、（Ｂ）は、全プラスミドの１００％が点突然変異を有する試料、（Ｃ）および（Ｄ）は、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料である。そして、前記（Ｃ）は、比較例４の結果、前記（Ｄ）は、実施例４の結果である。
【００９５】
同図（Ａ）に示すように、ｗｔＤＮＡは６０.０℃、同図（Ｂ）に示すように、ｍｔＤＮＡは６７．０℃で、それぞれシグナルのピークが検出された。これを標準として、全プラスミドのうち３％が点突然変異を有する試料を評価した結果、同図（Ｃ）に示すように、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例４では、ｍｔＤＮＡのシグナルを全く検出することができなかった。これに対して、阻害用ポリヌクレオチドを添加した実施例４では、同図（Ｄ）に示すように、ｍｔＤＮＡが少量であっても、ｗｔＤＮＡとｍｔＤＮＡの両方のシグナルを検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
以上のように、本発明の変異の検出方法によれば、前述のような阻害用ポリヌクレオチドを添加することで、例えば、白血病患者の白血球試料のように、点突然変異を有する検出対象ＤＮＡと前記点突然変異を有さない非検出対象ＤＮＡとが混在する試料であっても、優れた感度で前記点突然変異を検出できる。また、変異の種類が特定できることから、特異性にも優れる検出方法である。したがって、この方法は、特に白血病患者の点突然変異検出に有用であり、例えば、白血病治療薬が個人間において適しているか否かを遺伝子レベルで解析することも可能となることから、医療の分野において極めて有用な方法といえる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーを用いて検出部位を含む検出対象配列を増幅する遺伝子増幅方法であって、
検出部位が変異している検出対象の核酸と、前記検出部位が未変異である非検出対象の核酸とを含有する試料を、前記検出部位を含む検出対象配列を増幅できる前記プライマーと、前記検出部位が未変異である非検出対象の核酸に相補的なポリヌクレオチドとの存在下で、遺伝子増幅処理することを特徴とする遺伝子増幅方法。
【請求項２】
前記核酸が、ＤＮＡである、請求項１記載の遺伝子増幅方法。
【請求項３】
前記遺伝子増幅処理の反応液において、前記ポリヌクレオチドの添加濃度が、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１または２記載の増幅方法。
【請求項４】
前記遺伝子増幅処理の反応液において、前記ポリヌクレオチドの添加濃度が、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌである、請求項１から３のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの３’末端の伸長が阻害されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸化されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドはＤＮＡである、請求項１から６のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡが、白血球由来のＤＮＡである、請求項２から７のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項９】
前記変異が、ａｂｌ遺伝子の変異である、請求項１から８のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項１０】
前記変異が、配列番号１における１塩基の変異である、請求項１から９のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項１１】
前記変異が、配列番号１の塩基配列における７５６番目の塩基ＧのＣへの変異、７５８番目の塩基ＡのＴへの変異、又は７６３番目の塩基ＧのＡへの変異である、請求項１０記載の増幅方法。
【請求項１】
プライマーを用いて検出部位を含む検出対象配列を増幅する遺伝子増幅方法であって、
検出部位が変異している検出対象の核酸と、前記検出部位が未変異である非検出対象の核酸とを含有する試料を、前記検出部位を含む検出対象配列を増幅できる前記プライマーと、前記検出部位が未変異である非検出対象の核酸に相補的なポリヌクレオチドとの存在下で、遺伝子増幅処理することを特徴とする遺伝子増幅方法。
【請求項２】
前記核酸が、ＤＮＡである、請求項１記載の遺伝子増幅方法。
【請求項３】
前記遺伝子増幅処理の反応液において、前記ポリヌクレオチドの添加濃度が、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１または２記載の増幅方法。
【請求項４】
前記遺伝子増幅処理の反応液において、前記ポリヌクレオチドの添加濃度が、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌである、請求項１から３のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの３’末端の伸長が阻害されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸化されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドはＤＮＡである、請求項１から６のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡが、白血球由来のＤＮＡである、請求項２から７のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項９】
前記変異が、ａｂｌ遺伝子の変異である、請求項１から８のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項１０】
前記変異が、配列番号１における１塩基の変異である、請求項１から９のいずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項１１】
前記変異が、配列番号１の塩基配列における７５６番目の塩基ＧのＣへの変異、７５８番目の塩基ＡのＴへの変異、又は７６３番目の塩基ＧのＡへの変異である、請求項１０記載の増幅方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−４００２９（Ｐ２０１２−４００２９Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６１２９８（Ｐ２０１１−２６１２９８）
【出願日】平成２３年１１月３０日（２０１１．１１．３０）
【分割の表示】特願２００７−５４９７５３（Ｐ２００７−５４９７５３）の分割
【原出願日】平成１９年７月２７日（２００７．７．２７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月３０日（２０１１．１１．３０）
【分割の表示】特願２００７−５４９７５３（Ｐ２００７−５４９７５３）の分割
【原出願日】平成１９年７月２７日（２００７．７．２７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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