変異プルラナーゼ
【課題】酸化剤に対して優れた耐性を有し、至適ｐＨが変化した、漂白剤配合洗浄剤への配合など幅広い用途で有用なプルラナーゼを提供する。
【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）の特徴を持つ変異プルラナーゼ。（ａ）特定のアミノ酸配列の特定位置のアラニン残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。（ｂ）上記配列の保存IV領域と５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつプルラナーゼ活性を有するアミノ酸配列において、上記配列の特定位置のアラニン残基と相同位のアミノ酸残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。洗浄剤及び澱粉糖化用組成物として有用である。
【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）の特徴を持つ変異プルラナーゼ。（ａ）特定のアミノ酸配列の特定位置のアラニン残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。（ｂ）上記配列の保存IV領域と５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつプルラナーゼ活性を有するアミノ酸配列において、上記配列の特定位置のアラニン残基と相同位のアミノ酸残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。洗浄剤及び澱粉糖化用組成物として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は変異プルラナーゼ及びこれをコードする遺伝子に関し、さらに詳細にはプルラナーゼを構成するアミノ酸残基の一部が欠失又は他のアミノ酸に置換することにより酸化剤耐性や最適反応pHの変化を獲得した変異プルラナーゼ、その遺伝子及びこれを含有する洗浄剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プルラナーゼは、澱粉、グリコーゲン、アミロペクチン或いはプルラン分子中に存在するα−１，６グルコシド結合のみを切断し、最終的にマルトトリオースを生成する酵素であり、エンド型アミラーゼ及びエキソ型アミラーゼと併用することにより、澱粉からグルコースやマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペントオース、マルトヘキサオース等のマルトオリゴ糖を生産することができるので、澱粉製造工業において注目されている酵素である。
【０００３】
近年、Klebsiella aerogenes(Journal of Bacteriology, 169, 2301-2306(1987)、Klebsiella pneumoniae(Molecular Microbiology, 4, 73-85(1990))、Spinacia oleracea(NCBI gi:634092))、Bacillus stearothermophilus(Journal of Fermentation and Bioengineering, 69, 204-210(1990))等において、プルラナーゼがクローニングされ、そのアミノ酸配列が決定されている。それぞれの酵素において４つの保存領域（中島ら，Journal of Bacteriology, 163, 401-406(1985))が見出されており、K. aerogenesではＧＦＲＦＤＬＭＧＹ（保存II領域）及びＹＶＳＫＨＤ（保存IV領域）、K. pneumoniaeではＧＦＲＦＤＬＭＧＹ（保存II領域）及びＹＶＳＫＨＤ（保存IV領域）、S. oleraceaではＧＦＲＦＤＬＭＧＨ（保存II領域）及びＹＶＳＡＨＤ（保存IV領域）、B. stearothermophilusではＧＦＲＦＤＬＭＧＩ（保存II領域）及びＹＶＥＳＨＤ（保存IV領域）のアミノ酸配列が認められる。
一方、近年になって本発明者らは、α−アミラーゼとプルラナーゼを共に食器洗浄剤及び衣料洗浄剤に配合することによって、主に澱粉汚れに対する洗浄力が飛躍的に向上することを明らかにした（特許文献１参照）。
【０００４】
食器用洗浄剤や衣料用洗浄剤は、往々にして酸化剤、例えば漂白剤又は過酸化物を含むものであり、強いアルカリ条件で使用されており、より酸化剤耐性の酵素並びに最適反応pHの高い酵素が望まれている。非特許文献１等によりプルラナーゼのランダム変異による熱安定性向上研究が報告されているがプルラナーゼの機能改変はまだ十分とはいえない。非特許文献２には、部位特異的変異誘発を利用することで、222 位のメチオニンがズブチリシンの酸化的不活性化にとっての主要部位であることが明らかとされている。また、特許文献２〜５等には、特定のメチオニンがα−アミラーゼの酸化的不活性化に寄与することが明らかとされている。しかし、いずれもα−アミラーゼについての報告であり、機能的に異なる酵素であるプルラナーゼの部位と作用との関係については何の報告もない。
【特許文献１】特開平２−１３２１９３号公報
【特許文献２】特表平８−５００２４３号
【特許文献３】特表平８−５０６４９１１号
【特許文献４】ＷＯ９６／０５２９５
【特許文献５】ＷＯ９６／２３８７３
【非特許文献１】Journal of Biochemistry, 116巻, 1233-1240頁, 1994年
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry, 第260巻, No.11, 6518-6521頁、1985年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、プルラナーゼを変異させることにより酸化剤耐性や最適反応pHの変化した変異プルラナーゼ、これをコードする遺伝子及び該変異プルラナーゼを含有する洗浄剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、プルラナーゼのアミノ酸配列とそれらの部位特異的変異による性質の変化について種々検討してきたところ、メチオニン残基が酸化剤による不活性化に寄与しており、これを欠失させるか他のアミノ酸に置換することによりプルラナーゼ活性を保持したまま優れた酸化剤耐性を獲得することを見出した。一方、アラニン残基が、最適反応pHの変化に寄与しており、これを欠失させるか他のアミノ酸に置換することによりプルラナーゼ活性を保持したまま最適反応pHの変化した変異プルラナーゼが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の特徴を持つ変異プルラナーゼ（以下、変異プルラナーゼＢと称する）
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列の５５７位のアラニン残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。
（ｂ）配列番号１の保存IV領域と５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつプルラナーゼ活性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の５５７位のアラニン残基と相同位のアミノ酸残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。
を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、上記の変異プルラナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクタープラスミド、該ベクタープラスミドで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体細胞を提供するものである。
【０００９】
さらに、本発明は、上記の変異プルラナーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【００１０】
さらにまた、本発明は、本発明は上記の変異プルラナーゼを含有する澱粉糖化用組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、酸化剤に対して優れた耐性を有するプルラナーゼ及び最適反応pHが変化したプルラナーゼを得ることができ、漂白剤配合洗浄剤への配合など幅広い用途で有用なプルラナーゼを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「酸化剤の存在下での安定性」なる語は、プルラナーゼの貯蔵中の、及びプルラナーゼ含有洗浄剤の貯蔵中の貯蔵安定性、さらには例えば過酸化水素又はその他の漂白剤の存在下でのプルラン加水分解中のプルラナーゼの安定性を意味する。
【００１３】
本発明の変異プルラナーゼＡ及び変異プルラナーゼＡＢにおけるＣｙｓ及びＭｅｔ以外のアミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌが挙げられるが、酸化剤耐性の点からＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＶａｌがより好ましい。
【００１４】
一方、本発明の変異プルラナーゼＢ及び変異プルラナーゼＡＢにおけるＡｌａ以外のアミノ酸残基としては、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌが挙げられるが、このうちＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ及びＴｒｐがより好ましい。
【００１５】
本発明の変異プルラナーゼＡは、アミノ酸残基として少なくとも１個のメチオニン残基を有するプルラナーゼを変異させて得られるものであり、原料プルラナーゼとしてはメチオニン残基を有するものである限り、野生型プルラナーゼであっても、変異プルラナーゼであってもよい。
【００１６】
一方、本発明の変異プルラナーゼＢは、アミノ酸残基として少なくとも１個のアラニン残基を有するプルラナーゼを変異させて得られるものであり、原料プルラナーゼとしてはアラニン残基を有するものである限り、野生型プルラナーゼであっても、変異プルラナーゼであってもよい。
【００１７】
かかる原料プルラナーゼとしては、バチルス属に属する微生物由来のプルラナーゼ、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼ（アルカリアミロプルラナーゼ；バチルス ｓｐ．ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来）、又は該アミロプルラナーゼのプルラナーゼ領域が好ましい。特に好ましいアルカリアミロプルラナーゼの例としては、秦田ら，Journal Biological Chemistry, 271, 24075-24083(1996)に示されているアミノ酸配列を有するものが好ましい（配列番号２）。また、該アミロプルラナーゼのプルラナーゼ領域としては、配列番号２の１０２３番目Ｍｅｔから１８２０番目Ａｓｐまで（配列番号１）が好ましい。さらに、バチルス属由来のプルラナーゼとしてはバチルス ｓｐ．ＫＳＭ−ＡＰ１８７６株由来のプルラナーゼが好ましい。このうち、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するプルラナーゼ又は該配列と相同性の高い配列を有するプルラナーゼが特に好ましい。ここで、配列番号１記載の配列と相同性の高い配列としては、配列番号１の４４３位のメチオニン残基近傍（保存II領域）に少なくとも７７％相同性を有するプルラナーゼ、又は配列番号１の５５７位のアラニン残基近傍（保存IV領域）に少なくとも５０％の相同性を有するプルラナーゼが挙げられる。
【００１８】
また、本発明の変異プルラナーゼＡ及び変異プルラナーゼＡＢとしては、配列番号１中のメチオニン残基の１個〜１８個が変異していてもよいが、４４３位のＭｅｔ又は他のプルラナーゼの相同位のＭｅｔが欠失又は前記のＭｅｔ及びＣｙｓ以外のアミノ酸残基に置換しているのが好ましい。一方、変異プルラナーゼＢ及び変異プルラナーゼＡＢとしては、配列番号１中の５５７位のＡｌａ又は他のプルラナーゼの相同位のＡｌａが欠失又は前記のＡｌａ以外のアミノ酸残基に置換しているのが好ましい。
【００１９】
本発明の変異プルラナーゼは、例えば、プルラナーゼをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入して、変異プルラナーゼをコードする遺伝子及びこれを含有するベクタープラスミドを得、次いで該プラスミドを用いて宿主を形質転換するか、染色体相同組換えにより形質転換体を得、これを培養することにより製造される。
【００２０】
上記製造法をアルカリアミロプルラナーゼのプルラナーゼ領域（配列番号１）を原料として実施する場合を例にとり、さらに詳細に説明する。
【００２１】
まず、配列番号１のプルラナーゼをコードするＤＮＡは、例えばバチルス ｓｐ．ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株（FERM BP-3048）由来のアミロプルラナーゼをコードするＤＮＡ（配列番号２）の２９４５番目に存在する制限酵素ＰｓｔＩ及び５４６０番目に存在する制限酵素ＳｍａＩ間をプラスミドｐＵＣ１９の制限酵素ＰｓｔＩとＳｍａＩ間に結合したプラスミド（図１）を導入した大腸菌ＨＢ１０１株から常法に従って得ることができる。
【００２２】
部位特異的変異の方法としては一般的に行なわれている方法であればいずれも採用できるが、例えばClonetech の Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit、Takara社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km Kit 等を用いて行なうことができる。
【００２３】
所望の変異プルラナーゼを産生するクローンのスクリーニングは、形質転換体をレッドプルラン含有培地で培養することにより行なわれる。
【００２４】
次に、本発明方法を実施するにあたって採用する一般的な方法について説明する。
【００２５】
〔塩基配列の決定〕
塩基配列の決定は、Maxam-Gilbert の化学修飾法（Methods Enzymology., 65, 499-559 (1980)）又はジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Proceeding of National Academic Science, U. S. A., 74, 5463-5467 (1977) ；Nature, London, 321, 674-679 (1986)）などを用いて決定することができる。
【００２６】
〔部位特異的変異の導入法〕
（１）Clontech社のプロトコールに準じて、Transformer TM Site-Directd Mutagenesis Kit（2nd version ）を用いた方法。
（１−１）プラスミドＤＮＡの変性とプライマーＤＮＡの結合
１０×アニーリングバッファーが２．０μｌ、目的遺伝子の挿入したプラスミドＤＮＡ（０．０５μｇ）が２．０μｌ、リン酸化済み変異選択用プライマー（０．０５μｇ）が２．０μｌ、リン酸化済み変異導入プライマー（０．０５μｇ）が２．０μｌ、滅菌水が１２μｌ混ぜ合わさった液を１００℃で３分間放置し、その後氷上で５分間急冷する。
（１−２）変異導入ステップ
（１）で調製した液２０μｌに１０×伸長バッファーを３．０μｌ、T4 DNA polymerase（2-4単位/μl）を１μｌ、T4 DNA ligase（4-6単位/μl）を１μｌ、滅菌水５μｌ添加しよく混合後、３７℃で２時間インキュベートする。その後、７０℃で５分間熱処理をし酵素反応を停止する。
（１−３）制限酵素による１段階目の変異プラスミドの選択
酵素反応停止後の反応液からエタノール沈澱でプラスミドＤＮＡを回収し、変異の導入されていないプラスミドのみが切断される制限酵素で処理する。制限酵素処理溶液を直接大腸菌ＨＢ１０１に導入し、形質転換体を液体培養で増殖させる。
（１−４）制限酵素による２段階目の変異プラスミドの選択
（１−３）において増殖した形質転換菌体からプラスミドを精製し（１−３）で用いた制限酵素と同じ制限酵素で処理し、処理溶液でＨＢ１０１を形質転換する。抗生物質入りＬＢプレート上に出現したコロニーを変異プラスミドを有する候補コロニーと判断し、選択を行なう。
（１−５）変異の確認
（１−４）の操作で得られた形質転換体を抗生物質入りのＬＢ培地で培養し、増殖した菌体から調製したプラスミドのＤＮＡ配列解析を行ない変異の導入を確認する。
【００２７】
〔プルラナーゼ活性測定法〕
各種緩衝液中にプルラン（反応系における最終濃度は0.25％）を溶解させた基質溶液０．９mLに、酵素液０．１mLを加え、５０℃で、３０分間反応させた。反応後、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて還元糖の定量を行なった。すなわち、反応液１．０mLにＤＮＳ試薬１．０mLを加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．０mLの脱イオン水を加えて希釈し、波長５３５nmで比色定量した。酵素の力価は、１分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
【００２８】
〔変異プルラナーゼ粗酵素液の調製〕
プルラナーゼに変異を導入したプラスミドを保持する大腸菌を、適当な培地、例えば、アンピシリン５０μｇ／mLを含む２×ＹＴ培地（16g Bacto Trypton, 10g Yeast Extract, 10g NaCl/L）で、３７℃、２４時間振盪培養した。培養液３５mLを遠心分離して得られた菌体を、適当な緩衝液、例えば、７mLの１０mM Tris-HCl pH８．０に懸濁した。菌懸濁液に適当な処理、例えば、超音波処理（BIOTEC 7500ULTRASONIC PROCESSOR SEIKO INSTRUMENTS & ELECTRONICS LTD.、％DUTY CYCLE 70％, OUTPUT CONTROL3, TIMER3）を行うことにより、菌体の破砕を行った。破砕後、遠心分離によって不溶物を取り除き、得られた上清液を無細胞抽出液（粗酵素液）とした。
【００２９】
〔Ｈ2Ｏ2酸化耐性度の検定〕
（１）試験管にカタラーゼ（ベーリンガーマンハイム社、カタログ番号 106810、由来beefliver）を２．５μｌ分注し、氷中に置いておく。
（２）３０℃又は４０℃に保温した、３０％過酸化水素水（和光純薬社）をサンプル添加後最終濃度が２０、２５０、又は５００mMとなるように添加した適当な緩衝液、例えば２０mM Britton-Robinson バッファーpH８．０によって希釈しておく。
（３）サンプルのプルラナーゼを、適当な緩衝液、例えば１０mM Tris-HCl pH８．０で（２）で調製した溶液に添加後２５倍になるように希釈しておく。
（４）（２）で調製した試験管に（３）で調製したサンプルを加え、素早く混ぜ合わせた。所定の時間放置後の反応液を各々５００μｌサンプリングし、（１）で用意したカタラーゼ入りの試験管に注入し酸化反応を停止した。
（５）各々のサンプルの残存プルラナーゼ活性をＤＮＳ法で測定し、過酸化水素に対する酸化剤耐性を求めた。
【００３０】
かくして得られる本発明変異プルラナーゼは、酸化剤に対する耐性が極めて高く、酸化剤、漂白剤を含む洗浄剤、澱粉糖化用組成物等の配合成分として有用である。
【００３１】
ここで本発明の洗浄剤には、上記変異プルラナーゼ以外に、さらに、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を配合することができる。
【００３２】
また、洗浄剤に通常配合されるアニオン界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤等の界面活性剤；二価金属イオン捕捉剤（キレート剤）、アルカリ剤、無機塩、再汚染防止剤、塩素捕捉剤、還元剤、漂白剤、蛍光染料可溶化剤、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤、酵素安定化剤、相調節剤等を配合することができる。
本発明の洗浄剤組成物は、上記変異プルラナーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合せて常法に従い、製造することができる。洗浄剤の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤等として使用することができるが、特に衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗浄剤として好適に使用することができる。
【００３３】
また、本発明の澱粉糖化用組成物には、さらに、グルコアミラーゼ、マルターゼ、α−アミラーゼ、イソアミラーゼ及びネオプルラナーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素も配合し、変異プルラナーゼとともに澱粉に作用させることもできる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
バチルス ｓｐ．ＫＳＭ−１３７８株由来アミロプルラナーゼ遺伝子がプラスミドｐＢＲ３２２に連結されたプラスミドｐＢＰ１０１（１０．６kb）１μｇを、制限酵素ＰｓｔＩ及びＳｍａＩによって切断後、アガロースゲル電気泳動を行ない、ゲルからジーンクリーンキット（フナコシ社製）によって、約２．５kbのＤＮＡ断片を単離した。得られたＤＮＡ断片と、制限酵素ＰｓｔＩ及びＳｍａＩによって切断したベクターｐＵＣ１９とをＴ４リガーゼによって結合させた組換えプラスミド混合物を大腸菌ＨＢ１０１に導入し、アンピシリン５０μｇ／mLを含むＬＢ培地に塗抹した。出現してきた形質転換体から、常法〔Maniatis, T, et. al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)〕に従って組換えプラスミドを調製した。得られたプラスミドの制限酵素切断地図を作成したところ、約２．５kbのＤＮＡ断片がベクターに含まれていることが明らかとなり、これをプラスミドｐＵＰＳＰＵＬと命名した。また、プラスミドｐＵＰＳＰＵＬによって形質転換された大腸菌ＨＢ１０１株をＨＢ１０１（pUPSPUL）株と命名した。
【００３６】
実施例２
ベクターｐＵＰＳＰＵＬの配列を基にしてApplied Biosystems Division 392DNA/RNA Synthesizer（パーキンエルマー社製）を用いて合成し、ＤＮＡ Refinement System DNASTEC-1000（アステック社製）を用いて精製された２９塩基及び２５塩基からなるプライマー１及びプライマー２（図２）と、鋳型としてｐＵＰＳＰＵＬ及び、Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit（CLONTECH Laboratories, Inc. 製）を用いて、キットの操作手順に従って、プラスミドｐＵＰＳＰＵＬ上のプルラナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の４４３、４４４番目のメチオニン残基の位置にアンバー変異を導入した。変異導入処理した反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を実施例１と同様に解析し、プルラナーゼのアミノ酸配列の４４３、４４４番目のメチオニン残基の位置にアンバー変異を導入したプラスミドＰＵＰＳＡを単離した。また、変異導入の確認は、蛍光プライマー法〔Smith, L. M. et. al., Nature, 321, 674(1986)〕に従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡ Sequencer・（パーキンエルマー社製）を用いて行なった。
【００３７】
ベクターｐＵＰＳＰＵＬの配列を基にして合成された２４塩基及び３５塩基からなるプライマー３及びプライマー４（図３）と、鋳型としてＰＵＰＳＡ及びTransformer TM Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、プルラナーゼのアミノ酸配列の４４３番目の位置に種々のアミノ酸置換を導入した。変異導入処理した反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を実施例１と同様に解析し、プルラナーゼのアミノ酸配列の４４３番目の位置にアミノ酸置換を導入した種々のプラスミドを単離した。また、ＤＮＡシークエンスにより導入したアミノ酸の確認を行なった。
【００３８】
実施例３
プルラナーゼに変異を導入したプラスミドを保持する大腸菌を、アンピシリン５０μｇ／mLを含む２×ＹＴ培地（16g Bacto Trypton, 10g Yeast Extract, 10g NaCl/L）で、３７℃、２４時間振盪培養した。培養液３５mLを遠心分離して得られた菌体を、７mLの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８．０に懸濁し、超音波による破砕（BIOTEC 7500ULTRASONIC PROCESSOR SEIKO INSTRUMENTS & ELECTRONICS LTD.）を行なった。破砕後、遠心分離によって不溶物を取り除き、得られた上清液を無細胞抽出液（粗酵素液）とした。
【００３９】
実施例４
表１に示す様々なプルラナーゼ突然変異体を有する菌体の粗酵素液を、３０℃で保温した。２５０mM又は５００mM 過酸化水素（Ｈ２・Ｏ２・）を含む２０mM Britton-Robinson バッファーpH８．０に適当に希釈して添加した。１５秒後、並びに３０分後、過酸化水素処理液５００μｌにカタラーゼ（ベーリンガー マンハイム社製、カタログ番号106810、牛肝臓）２．５μｌを加えた後、プルラナーゼ活性を測定した。活性は１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８で希釈した処理液を、０．２５％プルラン、５０mM Britton-Robinson バッファーpH８．０、３０℃中で１５分間反応させ、生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸〔3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)〕試薬により定量した。その結果は下記の表１により明らかであり、種々の変異体で酸化剤の存在下での安定性の向上が認められる。プルラナーゼ突然変異体は１文字アミノ酸標記によって示している。すなわちＭ４４３Ａは、４４３位のＭｅｔがＡｌａで交換されているプルラナーゼ変異体を意味する。表１における値は、１５秒におけるプルラナーゼ活性を１００％とした相対活性の値である。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例５
突然変異プルラナーゼの粗酵素液を１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８で希釈し、各突然変異体の活性を酸化剤（Ｈ2Ｏ2）の存在下及び対照として酸化剤の非存在下で測定した。活性は実施例４に記載の通りに反応したが、反応温度を４０℃、反応液中に過酸化水素を２０mMとなるように添加した。活性の値は対照を１００％とした相対活性で示した。相対活性の値を示す表２から明らかな通り、コントロール（野生型）に比べ、全ての突然変異体に関して酸化剤存在下での活性レベルは優れていた。
【００４２】
【表２】
【００４３】
実施例６
４４３位のＭｅｔを他のアミノ酸に置換した突然変異プルラナーゼの粗酵素液を１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８で希釈し、対応pHを４と１０の間の指定のpHに調製した活性測定反応液を用いて、実施例４に記載の通り酵素活性を測定した。活性の値は最も高い活性を示した値を１００％とした相対活性で示した。各反応pHに対応する相対活性の値を示す図３から明らかな通り、コントロール（野生型）のpH８．０に比べ、突然変異体の至適pHはＭ４４３Ａ，Ｍ４４３Ｎ，Ｍ４４３Ｒ変異体のpH６．２近傍、Ｍ４４３Ｅ，Ｍ４４３Ｉ，Ｍ４４３Ｓ，Ｍ４４３Ｖ変異体のpH７．１近傍の酸性側から、Ｍ４４３Ｌ変異体のpH８．８近傍のアルカリ側まで様々な値を示すことが示された。
【００４４】
実施例７
突然変異プルラナーゼの粗酵素液を、０．２重量％のwfk モデル漂白剤配合洗剤（Institut For Applied Research Ltd.;IEC-436）中に１０倍希釈になるように添加し、３０℃でインキュベートした。様々な突然変異プルラナーゼの活性を１２０分間追跡し、実施例４に記載の通りに反応したが、反応温度を４０℃で行なった。
インキュベーション中の残存活性を表３に示す（“０”は洗剤へ添加後の最初の測定である）。表３から明らかな通り、１２０分間処理においてコントロール（野生型）の６７％に対し、Ｍ４４３Ａ，Ｍ４４３Ｅ，Ｍ４４３Ｌ，Ｍ４４３Ｓ変異体の安定性は８３〜９６％の値を示しており、コントロールに比べ、洗剤中の安定性は全ての突然変異体に関して優れていた。
【００４５】
【表３】
【００４６】
実施例８
実施例２に従って４４３位のＭｅｔをＬｅｕに変換した変異プルラナーゼＭ４４３Ｌの５５７位のアミノ酸残基を、アラニン残基以外のアミノ酸に置換した。プラスミドｐＵＰＳＰＵＬの４４３位ＭｅｔがＬｅｕに変換されたプラスミドＰＵＰＳＬを鋳型とし、プライマー５と６を用いて、Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kitにより５５７位にアンバー変異を導入した。次に得られた５５７位にアンバー変異の入った変異プラスミドＰＵＰＳＬＡを鋳型として、プライマー３と７を用いて、プルラナーゼの４４３位のＬｅｕへの変異に加えて、５５７位のアラニン残基の種々のアミノ酸残基への置換を導入した。変異導入処理した反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を実施例１と同様に解析し、プルラナーゼのアミノ酸配列の４４３番目の位置がＬｅｕに置換した変異に加えて、５５７位のアラニン残基の種々のアミノ酸残基に置換したプラスミドを単離した。また、ＤＮＡシークエンスにより導入したアミノ酸の確認を行なった。
【００４７】
実施例９
４４３位がＬｅｕ、５５７位が種々のアミノ酸残基に置換した突然変異プルラナーゼの粗酵素液を実施例３と同様に調製した。得られた粗酵素液を用いて実施例６と同様に種々のpHでのプルラナーゼ活性を測定した。各反応pHに対応する相対活性を示す図４から明らかな通り、コントロール（野生型）に比べて、突然変異体の最適反応pHは酸性側からアルカリ側まで様々な値を示すことが示された。図中の表記、例えば、Ｍ４４３Ｌ／Ａ５５７Ｃは、４４３位のＭｅｔがＬｅｕへの置換に加えて、５５７位のＡｌａがＣｙｓへの置換が導入されている二重変異プルラナーゼを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】バチルス ｓｐ．ＫＳＭ−１３７８株アルカリアミロプルラナーゼのプルラナーゼ領域を含むプラスミドｐＵＰＳＰＵＬを示す図である。図中の太線はバチルス ｓｐ．ＫＳＭ−１３７８株染色体由来ＤＮＡ領域を示し、細線はプラスミドｐＵＣ１９由来ＤＮＡを示す。図中の矢印はプルラナーゼ遺伝子の転写方向及びその領域を示す。
【図２】ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を示す図である。配列中のＸはＡＧＣＴの混合物を示す。
【図３】変異プルラナーゼの最適反応pHを示す図である。
【図４】変異プルラナーゼの最適反応pHを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は変異プルラナーゼ及びこれをコードする遺伝子に関し、さらに詳細にはプルラナーゼを構成するアミノ酸残基の一部が欠失又は他のアミノ酸に置換することにより酸化剤耐性や最適反応pHの変化を獲得した変異プルラナーゼ、その遺伝子及びこれを含有する洗浄剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プルラナーゼは、澱粉、グリコーゲン、アミロペクチン或いはプルラン分子中に存在するα−１，６グルコシド結合のみを切断し、最終的にマルトトリオースを生成する酵素であり、エンド型アミラーゼ及びエキソ型アミラーゼと併用することにより、澱粉からグルコースやマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペントオース、マルトヘキサオース等のマルトオリゴ糖を生産することができるので、澱粉製造工業において注目されている酵素である。
【０００３】
近年、Klebsiella aerogenes(Journal of Bacteriology, 169, 2301-2306(1987)、Klebsiella pneumoniae(Molecular Microbiology, 4, 73-85(1990))、Spinacia oleracea(NCBI gi:634092))、Bacillus stearothermophilus(Journal of Fermentation and Bioengineering, 69, 204-210(1990))等において、プルラナーゼがクローニングされ、そのアミノ酸配列が決定されている。それぞれの酵素において４つの保存領域（中島ら，Journal of Bacteriology, 163, 401-406(1985))が見出されており、K. aerogenesではＧＦＲＦＤＬＭＧＹ（保存II領域）及びＹＶＳＫＨＤ（保存IV領域）、K. pneumoniaeではＧＦＲＦＤＬＭＧＹ（保存II領域）及びＹＶＳＫＨＤ（保存IV領域）、S. oleraceaではＧＦＲＦＤＬＭＧＨ（保存II領域）及びＹＶＳＡＨＤ（保存IV領域）、B. stearothermophilusではＧＦＲＦＤＬＭＧＩ（保存II領域）及びＹＶＥＳＨＤ（保存IV領域）のアミノ酸配列が認められる。
一方、近年になって本発明者らは、α−アミラーゼとプルラナーゼを共に食器洗浄剤及び衣料洗浄剤に配合することによって、主に澱粉汚れに対する洗浄力が飛躍的に向上することを明らかにした（特許文献１参照）。
【０００４】
食器用洗浄剤や衣料用洗浄剤は、往々にして酸化剤、例えば漂白剤又は過酸化物を含むものであり、強いアルカリ条件で使用されており、より酸化剤耐性の酵素並びに最適反応pHの高い酵素が望まれている。非特許文献１等によりプルラナーゼのランダム変異による熱安定性向上研究が報告されているがプルラナーゼの機能改変はまだ十分とはいえない。非特許文献２には、部位特異的変異誘発を利用することで、222 位のメチオニンがズブチリシンの酸化的不活性化にとっての主要部位であることが明らかとされている。また、特許文献２〜５等には、特定のメチオニンがα−アミラーゼの酸化的不活性化に寄与することが明らかとされている。しかし、いずれもα−アミラーゼについての報告であり、機能的に異なる酵素であるプルラナーゼの部位と作用との関係については何の報告もない。
【特許文献１】特開平２−１３２１９３号公報
【特許文献２】特表平８−５００２４３号
【特許文献３】特表平８−５０６４９１１号
【特許文献４】ＷＯ９６／０５２９５
【特許文献５】ＷＯ９６／２３８７３
【非特許文献１】Journal of Biochemistry, 116巻, 1233-1240頁, 1994年
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry, 第260巻, No.11, 6518-6521頁、1985年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、プルラナーゼを変異させることにより酸化剤耐性や最適反応pHの変化した変異プルラナーゼ、これをコードする遺伝子及び該変異プルラナーゼを含有する洗浄剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、プルラナーゼのアミノ酸配列とそれらの部位特異的変異による性質の変化について種々検討してきたところ、メチオニン残基が酸化剤による不活性化に寄与しており、これを欠失させるか他のアミノ酸に置換することによりプルラナーゼ活性を保持したまま優れた酸化剤耐性を獲得することを見出した。一方、アラニン残基が、最適反応pHの変化に寄与しており、これを欠失させるか他のアミノ酸に置換することによりプルラナーゼ活性を保持したまま最適反応pHの変化した変異プルラナーゼが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の特徴を持つ変異プルラナーゼ（以下、変異プルラナーゼＢと称する）
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列の５５７位のアラニン残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。
（ｂ）配列番号１の保存IV領域と５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつプルラナーゼ活性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の５５７位のアラニン残基と相同位のアミノ酸残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。
を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、上記の変異プルラナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクタープラスミド、該ベクタープラスミドで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体細胞を提供するものである。
【０００９】
さらに、本発明は、上記の変異プルラナーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【００１０】
さらにまた、本発明は、本発明は上記の変異プルラナーゼを含有する澱粉糖化用組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、酸化剤に対して優れた耐性を有するプルラナーゼ及び最適反応pHが変化したプルラナーゼを得ることができ、漂白剤配合洗浄剤への配合など幅広い用途で有用なプルラナーゼを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「酸化剤の存在下での安定性」なる語は、プルラナーゼの貯蔵中の、及びプルラナーゼ含有洗浄剤の貯蔵中の貯蔵安定性、さらには例えば過酸化水素又はその他の漂白剤の存在下でのプルラン加水分解中のプルラナーゼの安定性を意味する。
【００１３】
本発明の変異プルラナーゼＡ及び変異プルラナーゼＡＢにおけるＣｙｓ及びＭｅｔ以外のアミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌが挙げられるが、酸化剤耐性の点からＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＶａｌがより好ましい。
【００１４】
一方、本発明の変異プルラナーゼＢ及び変異プルラナーゼＡＢにおけるＡｌａ以外のアミノ酸残基としては、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌが挙げられるが、このうちＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ及びＴｒｐがより好ましい。
【００１５】
本発明の変異プルラナーゼＡは、アミノ酸残基として少なくとも１個のメチオニン残基を有するプルラナーゼを変異させて得られるものであり、原料プルラナーゼとしてはメチオニン残基を有するものである限り、野生型プルラナーゼであっても、変異プルラナーゼであってもよい。
【００１６】
一方、本発明の変異プルラナーゼＢは、アミノ酸残基として少なくとも１個のアラニン残基を有するプルラナーゼを変異させて得られるものであり、原料プルラナーゼとしてはアラニン残基を有するものである限り、野生型プルラナーゼであっても、変異プルラナーゼであってもよい。
【００１７】
かかる原料プルラナーゼとしては、バチルス属に属する微生物由来のプルラナーゼ、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼ（アルカリアミロプルラナーゼ；バチルス ｓｐ．ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来）、又は該アミロプルラナーゼのプルラナーゼ領域が好ましい。特に好ましいアルカリアミロプルラナーゼの例としては、秦田ら，Journal Biological Chemistry, 271, 24075-24083(1996)に示されているアミノ酸配列を有するものが好ましい（配列番号２）。また、該アミロプルラナーゼのプルラナーゼ領域としては、配列番号２の１０２３番目Ｍｅｔから１８２０番目Ａｓｐまで（配列番号１）が好ましい。さらに、バチルス属由来のプルラナーゼとしてはバチルス ｓｐ．ＫＳＭ−ＡＰ１８７６株由来のプルラナーゼが好ましい。このうち、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するプルラナーゼ又は該配列と相同性の高い配列を有するプルラナーゼが特に好ましい。ここで、配列番号１記載の配列と相同性の高い配列としては、配列番号１の４４３位のメチオニン残基近傍（保存II領域）に少なくとも７７％相同性を有するプルラナーゼ、又は配列番号１の５５７位のアラニン残基近傍（保存IV領域）に少なくとも５０％の相同性を有するプルラナーゼが挙げられる。
【００１８】
また、本発明の変異プルラナーゼＡ及び変異プルラナーゼＡＢとしては、配列番号１中のメチオニン残基の１個〜１８個が変異していてもよいが、４４３位のＭｅｔ又は他のプルラナーゼの相同位のＭｅｔが欠失又は前記のＭｅｔ及びＣｙｓ以外のアミノ酸残基に置換しているのが好ましい。一方、変異プルラナーゼＢ及び変異プルラナーゼＡＢとしては、配列番号１中の５５７位のＡｌａ又は他のプルラナーゼの相同位のＡｌａが欠失又は前記のＡｌａ以外のアミノ酸残基に置換しているのが好ましい。
【００１９】
本発明の変異プルラナーゼは、例えば、プルラナーゼをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入して、変異プルラナーゼをコードする遺伝子及びこれを含有するベクタープラスミドを得、次いで該プラスミドを用いて宿主を形質転換するか、染色体相同組換えにより形質転換体を得、これを培養することにより製造される。
【００２０】
上記製造法をアルカリアミロプルラナーゼのプルラナーゼ領域（配列番号１）を原料として実施する場合を例にとり、さらに詳細に説明する。
【００２１】
まず、配列番号１のプルラナーゼをコードするＤＮＡは、例えばバチルス ｓｐ．ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株（FERM BP-3048）由来のアミロプルラナーゼをコードするＤＮＡ（配列番号２）の２９４５番目に存在する制限酵素ＰｓｔＩ及び５４６０番目に存在する制限酵素ＳｍａＩ間をプラスミドｐＵＣ１９の制限酵素ＰｓｔＩとＳｍａＩ間に結合したプラスミド（図１）を導入した大腸菌ＨＢ１０１株から常法に従って得ることができる。
【００２２】
部位特異的変異の方法としては一般的に行なわれている方法であればいずれも採用できるが、例えばClonetech の Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit、Takara社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km Kit 等を用いて行なうことができる。
【００２３】
所望の変異プルラナーゼを産生するクローンのスクリーニングは、形質転換体をレッドプルラン含有培地で培養することにより行なわれる。
【００２４】
次に、本発明方法を実施するにあたって採用する一般的な方法について説明する。
【００２５】
〔塩基配列の決定〕
塩基配列の決定は、Maxam-Gilbert の化学修飾法（Methods Enzymology., 65, 499-559 (1980)）又はジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Proceeding of National Academic Science, U. S. A., 74, 5463-5467 (1977) ；Nature, London, 321, 674-679 (1986)）などを用いて決定することができる。
【００２６】
〔部位特異的変異の導入法〕
（１）Clontech社のプロトコールに準じて、Transformer TM Site-Directd Mutagenesis Kit（2nd version ）を用いた方法。
（１−１）プラスミドＤＮＡの変性とプライマーＤＮＡの結合
１０×アニーリングバッファーが２．０μｌ、目的遺伝子の挿入したプラスミドＤＮＡ（０．０５μｇ）が２．０μｌ、リン酸化済み変異選択用プライマー（０．０５μｇ）が２．０μｌ、リン酸化済み変異導入プライマー（０．０５μｇ）が２．０μｌ、滅菌水が１２μｌ混ぜ合わさった液を１００℃で３分間放置し、その後氷上で５分間急冷する。
（１−２）変異導入ステップ
（１）で調製した液２０μｌに１０×伸長バッファーを３．０μｌ、T4 DNA polymerase（2-4単位/μl）を１μｌ、T4 DNA ligase（4-6単位/μl）を１μｌ、滅菌水５μｌ添加しよく混合後、３７℃で２時間インキュベートする。その後、７０℃で５分間熱処理をし酵素反応を停止する。
（１−３）制限酵素による１段階目の変異プラスミドの選択
酵素反応停止後の反応液からエタノール沈澱でプラスミドＤＮＡを回収し、変異の導入されていないプラスミドのみが切断される制限酵素で処理する。制限酵素処理溶液を直接大腸菌ＨＢ１０１に導入し、形質転換体を液体培養で増殖させる。
（１−４）制限酵素による２段階目の変異プラスミドの選択
（１−３）において増殖した形質転換菌体からプラスミドを精製し（１−３）で用いた制限酵素と同じ制限酵素で処理し、処理溶液でＨＢ１０１を形質転換する。抗生物質入りＬＢプレート上に出現したコロニーを変異プラスミドを有する候補コロニーと判断し、選択を行なう。
（１−５）変異の確認
（１−４）の操作で得られた形質転換体を抗生物質入りのＬＢ培地で培養し、増殖した菌体から調製したプラスミドのＤＮＡ配列解析を行ない変異の導入を確認する。
【００２７】
〔プルラナーゼ活性測定法〕
各種緩衝液中にプルラン（反応系における最終濃度は0.25％）を溶解させた基質溶液０．９mLに、酵素液０．１mLを加え、５０℃で、３０分間反応させた。反応後、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて還元糖の定量を行なった。すなわち、反応液１．０mLにＤＮＳ試薬１．０mLを加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．０mLの脱イオン水を加えて希釈し、波長５３５nmで比色定量した。酵素の力価は、１分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
【００２８】
〔変異プルラナーゼ粗酵素液の調製〕
プルラナーゼに変異を導入したプラスミドを保持する大腸菌を、適当な培地、例えば、アンピシリン５０μｇ／mLを含む２×ＹＴ培地（16g Bacto Trypton, 10g Yeast Extract, 10g NaCl/L）で、３７℃、２４時間振盪培養した。培養液３５mLを遠心分離して得られた菌体を、適当な緩衝液、例えば、７mLの１０mM Tris-HCl pH８．０に懸濁した。菌懸濁液に適当な処理、例えば、超音波処理（BIOTEC 7500ULTRASONIC PROCESSOR SEIKO INSTRUMENTS & ELECTRONICS LTD.、％DUTY CYCLE 70％, OUTPUT CONTROL3, TIMER3）を行うことにより、菌体の破砕を行った。破砕後、遠心分離によって不溶物を取り除き、得られた上清液を無細胞抽出液（粗酵素液）とした。
【００２９】
〔Ｈ2Ｏ2酸化耐性度の検定〕
（１）試験管にカタラーゼ（ベーリンガーマンハイム社、カタログ番号 106810、由来beefliver）を２．５μｌ分注し、氷中に置いておく。
（２）３０℃又は４０℃に保温した、３０％過酸化水素水（和光純薬社）をサンプル添加後最終濃度が２０、２５０、又は５００mMとなるように添加した適当な緩衝液、例えば２０mM Britton-Robinson バッファーpH８．０によって希釈しておく。
（３）サンプルのプルラナーゼを、適当な緩衝液、例えば１０mM Tris-HCl pH８．０で（２）で調製した溶液に添加後２５倍になるように希釈しておく。
（４）（２）で調製した試験管に（３）で調製したサンプルを加え、素早く混ぜ合わせた。所定の時間放置後の反応液を各々５００μｌサンプリングし、（１）で用意したカタラーゼ入りの試験管に注入し酸化反応を停止した。
（５）各々のサンプルの残存プルラナーゼ活性をＤＮＳ法で測定し、過酸化水素に対する酸化剤耐性を求めた。
【００３０】
かくして得られる本発明変異プルラナーゼは、酸化剤に対する耐性が極めて高く、酸化剤、漂白剤を含む洗浄剤、澱粉糖化用組成物等の配合成分として有用である。
【００３１】
ここで本発明の洗浄剤には、上記変異プルラナーゼ以外に、さらに、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を配合することができる。
【００３２】
また、洗浄剤に通常配合されるアニオン界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤等の界面活性剤；二価金属イオン捕捉剤（キレート剤）、アルカリ剤、無機塩、再汚染防止剤、塩素捕捉剤、還元剤、漂白剤、蛍光染料可溶化剤、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤、酵素安定化剤、相調節剤等を配合することができる。
本発明の洗浄剤組成物は、上記変異プルラナーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合せて常法に従い、製造することができる。洗浄剤の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤等として使用することができるが、特に衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗浄剤として好適に使用することができる。
【００３３】
また、本発明の澱粉糖化用組成物には、さらに、グルコアミラーゼ、マルターゼ、α−アミラーゼ、イソアミラーゼ及びネオプルラナーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素も配合し、変異プルラナーゼとともに澱粉に作用させることもできる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
バチルス ｓｐ．ＫＳＭ−１３７８株由来アミロプルラナーゼ遺伝子がプラスミドｐＢＲ３２２に連結されたプラスミドｐＢＰ１０１（１０．６kb）１μｇを、制限酵素ＰｓｔＩ及びＳｍａＩによって切断後、アガロースゲル電気泳動を行ない、ゲルからジーンクリーンキット（フナコシ社製）によって、約２．５kbのＤＮＡ断片を単離した。得られたＤＮＡ断片と、制限酵素ＰｓｔＩ及びＳｍａＩによって切断したベクターｐＵＣ１９とをＴ４リガーゼによって結合させた組換えプラスミド混合物を大腸菌ＨＢ１０１に導入し、アンピシリン５０μｇ／mLを含むＬＢ培地に塗抹した。出現してきた形質転換体から、常法〔Maniatis, T, et. al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)〕に従って組換えプラスミドを調製した。得られたプラスミドの制限酵素切断地図を作成したところ、約２．５kbのＤＮＡ断片がベクターに含まれていることが明らかとなり、これをプラスミドｐＵＰＳＰＵＬと命名した。また、プラスミドｐＵＰＳＰＵＬによって形質転換された大腸菌ＨＢ１０１株をＨＢ１０１（pUPSPUL）株と命名した。
【００３６】
実施例２
ベクターｐＵＰＳＰＵＬの配列を基にしてApplied Biosystems Division 392DNA/RNA Synthesizer（パーキンエルマー社製）を用いて合成し、ＤＮＡ Refinement System DNASTEC-1000（アステック社製）を用いて精製された２９塩基及び２５塩基からなるプライマー１及びプライマー２（図２）と、鋳型としてｐＵＰＳＰＵＬ及び、Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit（CLONTECH Laboratories, Inc. 製）を用いて、キットの操作手順に従って、プラスミドｐＵＰＳＰＵＬ上のプルラナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の４４３、４４４番目のメチオニン残基の位置にアンバー変異を導入した。変異導入処理した反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を実施例１と同様に解析し、プルラナーゼのアミノ酸配列の４４３、４４４番目のメチオニン残基の位置にアンバー変異を導入したプラスミドＰＵＰＳＡを単離した。また、変異導入の確認は、蛍光プライマー法〔Smith, L. M. et. al., Nature, 321, 674(1986)〕に従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡ Sequencer・（パーキンエルマー社製）を用いて行なった。
【００３７】
ベクターｐＵＰＳＰＵＬの配列を基にして合成された２４塩基及び３５塩基からなるプライマー３及びプライマー４（図３）と、鋳型としてＰＵＰＳＡ及びTransformer TM Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、プルラナーゼのアミノ酸配列の４４３番目の位置に種々のアミノ酸置換を導入した。変異導入処理した反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を実施例１と同様に解析し、プルラナーゼのアミノ酸配列の４４３番目の位置にアミノ酸置換を導入した種々のプラスミドを単離した。また、ＤＮＡシークエンスにより導入したアミノ酸の確認を行なった。
【００３８】
実施例３
プルラナーゼに変異を導入したプラスミドを保持する大腸菌を、アンピシリン５０μｇ／mLを含む２×ＹＴ培地（16g Bacto Trypton, 10g Yeast Extract, 10g NaCl/L）で、３７℃、２４時間振盪培養した。培養液３５mLを遠心分離して得られた菌体を、７mLの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８．０に懸濁し、超音波による破砕（BIOTEC 7500ULTRASONIC PROCESSOR SEIKO INSTRUMENTS & ELECTRONICS LTD.）を行なった。破砕後、遠心分離によって不溶物を取り除き、得られた上清液を無細胞抽出液（粗酵素液）とした。
【００３９】
実施例４
表１に示す様々なプルラナーゼ突然変異体を有する菌体の粗酵素液を、３０℃で保温した。２５０mM又は５００mM 過酸化水素（Ｈ２・Ｏ２・）を含む２０mM Britton-Robinson バッファーpH８．０に適当に希釈して添加した。１５秒後、並びに３０分後、過酸化水素処理液５００μｌにカタラーゼ（ベーリンガー マンハイム社製、カタログ番号106810、牛肝臓）２．５μｌを加えた後、プルラナーゼ活性を測定した。活性は１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８で希釈した処理液を、０．２５％プルラン、５０mM Britton-Robinson バッファーpH８．０、３０℃中で１５分間反応させ、生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸〔3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)〕試薬により定量した。その結果は下記の表１により明らかであり、種々の変異体で酸化剤の存在下での安定性の向上が認められる。プルラナーゼ突然変異体は１文字アミノ酸標記によって示している。すなわちＭ４４３Ａは、４４３位のＭｅｔがＡｌａで交換されているプルラナーゼ変異体を意味する。表１における値は、１５秒におけるプルラナーゼ活性を１００％とした相対活性の値である。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例５
突然変異プルラナーゼの粗酵素液を１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８で希釈し、各突然変異体の活性を酸化剤（Ｈ2Ｏ2）の存在下及び対照として酸化剤の非存在下で測定した。活性は実施例４に記載の通りに反応したが、反応温度を４０℃、反応液中に過酸化水素を２０mMとなるように添加した。活性の値は対照を１００％とした相対活性で示した。相対活性の値を示す表２から明らかな通り、コントロール（野生型）に比べ、全ての突然変異体に関して酸化剤存在下での活性レベルは優れていた。
【００４２】
【表２】
【００４３】
実施例６
４４３位のＭｅｔを他のアミノ酸に置換した突然変異プルラナーゼの粗酵素液を１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８で希釈し、対応pHを４と１０の間の指定のpHに調製した活性測定反応液を用いて、実施例４に記載の通り酵素活性を測定した。活性の値は最も高い活性を示した値を１００％とした相対活性で示した。各反応pHに対応する相対活性の値を示す図３から明らかな通り、コントロール（野生型）のpH８．０に比べ、突然変異体の至適pHはＭ４４３Ａ，Ｍ４４３Ｎ，Ｍ４４３Ｒ変異体のpH６．２近傍、Ｍ４４３Ｅ，Ｍ４４３Ｉ，Ｍ４４３Ｓ，Ｍ４４３Ｖ変異体のpH７．１近傍の酸性側から、Ｍ４４３Ｌ変異体のpH８．８近傍のアルカリ側まで様々な値を示すことが示された。
【００４４】
実施例７
突然変異プルラナーゼの粗酵素液を、０．２重量％のwfk モデル漂白剤配合洗剤（Institut For Applied Research Ltd.;IEC-436）中に１０倍希釈になるように添加し、３０℃でインキュベートした。様々な突然変異プルラナーゼの活性を１２０分間追跡し、実施例４に記載の通りに反応したが、反応温度を４０℃で行なった。
インキュベーション中の残存活性を表３に示す（“０”は洗剤へ添加後の最初の測定である）。表３から明らかな通り、１２０分間処理においてコントロール（野生型）の６７％に対し、Ｍ４４３Ａ，Ｍ４４３Ｅ，Ｍ４４３Ｌ，Ｍ４４３Ｓ変異体の安定性は８３〜９６％の値を示しており、コントロールに比べ、洗剤中の安定性は全ての突然変異体に関して優れていた。
【００４５】
【表３】
【００４６】
実施例８
実施例２に従って４４３位のＭｅｔをＬｅｕに変換した変異プルラナーゼＭ４４３Ｌの５５７位のアミノ酸残基を、アラニン残基以外のアミノ酸に置換した。プラスミドｐＵＰＳＰＵＬの４４３位ＭｅｔがＬｅｕに変換されたプラスミドＰＵＰＳＬを鋳型とし、プライマー５と６を用いて、Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kitにより５５７位にアンバー変異を導入した。次に得られた５５７位にアンバー変異の入った変異プラスミドＰＵＰＳＬＡを鋳型として、プライマー３と７を用いて、プルラナーゼの４４３位のＬｅｕへの変異に加えて、５５７位のアラニン残基の種々のアミノ酸残基への置換を導入した。変異導入処理した反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を実施例１と同様に解析し、プルラナーゼのアミノ酸配列の４４３番目の位置がＬｅｕに置換した変異に加えて、５５７位のアラニン残基の種々のアミノ酸残基に置換したプラスミドを単離した。また、ＤＮＡシークエンスにより導入したアミノ酸の確認を行なった。
【００４７】
実施例９
４４３位がＬｅｕ、５５７位が種々のアミノ酸残基に置換した突然変異プルラナーゼの粗酵素液を実施例３と同様に調製した。得られた粗酵素液を用いて実施例６と同様に種々のpHでのプルラナーゼ活性を測定した。各反応pHに対応する相対活性を示す図４から明らかな通り、コントロール（野生型）に比べて、突然変異体の最適反応pHは酸性側からアルカリ側まで様々な値を示すことが示された。図中の表記、例えば、Ｍ４４３Ｌ／Ａ５５７Ｃは、４４３位のＭｅｔがＬｅｕへの置換に加えて、５５７位のＡｌａがＣｙｓへの置換が導入されている二重変異プルラナーゼを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】バチルス ｓｐ．ＫＳＭ−１３７８株アルカリアミロプルラナーゼのプルラナーゼ領域を含むプラスミドｐＵＰＳＰＵＬを示す図である。図中の太線はバチルス ｓｐ．ＫＳＭ−１３７８株染色体由来ＤＮＡ領域を示し、細線はプラスミドｐＵＣ１９由来ＤＮＡを示す。図中の矢印はプルラナーゼ遺伝子の転写方向及びその領域を示す。
【図２】ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を示す図である。配列中のＸはＡＧＣＴの混合物を示す。
【図３】変異プルラナーゼの最適反応pHを示す図である。
【図４】変異プルラナーゼの最適反応pHを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の特徴を持つ変異プルラナーゼ
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列の５５７位のアラニン残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。
（ｂ）配列番号１の保存IV領域と５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつプルラナーゼ活性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の５５７位のアラニン残基と相同位のアミノ酸残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。
【請求項２】
請求項１記載の変異プルラナーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含有するベクタープラスミド。
【請求項４】
請求項３記載のベクタープラスミドで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体細胞。
【請求項５】
請求項１記載の変異プルラナーゼを含有する洗浄剤組成物。
【請求項６】
さらに、α−アミラーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を含有する請求項５記載の洗浄剤組成物。
【請求項７】
請求項１記載の変異プルラナーゼを含有する澱粉糖化用組成物。
【請求項８】
さらに、グルコアミラーゼ、マルターゼ、α−アミラーゼ、イソアミラーゼ及びネオプルラナーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を含有する請求項７記載の澱粉糖化用組成物。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の特徴を持つ変異プルラナーゼ
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列の５５７位のアラニン残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。
（ｂ）配列番号１の保存IV領域と５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつプルラナーゼ活性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の５５７位のアラニン残基と相同位のアミノ酸残基が欠失又はＣｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐに置換されている変異プルラナーゼ。
【請求項２】
請求項１記載の変異プルラナーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含有するベクタープラスミド。
【請求項４】
請求項３記載のベクタープラスミドで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体細胞。
【請求項５】
請求項１記載の変異プルラナーゼを含有する洗浄剤組成物。
【請求項６】
さらに、α−アミラーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を含有する請求項５記載の洗浄剤組成物。
【請求項７】
請求項１記載の変異プルラナーゼを含有する澱粉糖化用組成物。
【請求項８】
さらに、グルコアミラーゼ、マルターゼ、α−アミラーゼ、イソアミラーゼ及びネオプルラナーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を含有する請求項７記載の澱粉糖化用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１７４８４１（Ｐ２００６−１７４８４１Ａ）
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７２１４（Ｐ２００６−７２１４）
【出願日】平成１８年１月１６日（２００６．１．１６）
【分割の表示】特願平９−１４１５９６の分割
【原出願日】平成９年５月３０日（１９９７．５．３０）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１６日（２００６．１．１６）
【分割の表示】特願平９−１４１５９６の分割
【原出願日】平成９年５月３０日（１９９７．５．３０）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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