多糖−ペプチドグリカン複合体保有乳酸菌の取得方法
【課題】 細菌中のＰＳ−ＰＧ１の生化学的分析や細菌のＲＮＡやＤＮＡの分離操作、あるいは遺伝学的分析操作を必要とせず、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を簡便で迅速に取得、分離、判別する方法を提供すること。
【解決手段】 乳酸菌を含有する培養物を、カゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とするＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の取得方法、分離方法および判別方法。
【解決手段】 乳酸菌を含有する培養物を、カゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とするＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の取得方法、分離方法および判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖−ペプチドグリカン複合体１（ＰＳ−ＰＧ１）保有乳酸菌の取得方法に関し、更に詳細には、乳酸菌群中から、ＰＳ−ＰＧ１を保有する乳酸菌を分離し、これを取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、免疫の賦活作用や抗炎症作用を持つことが知られている。その中でも、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）は、多くの生理効果が明らかとなっている。このラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９は、胃液や胆汁等の強い消化液に耐えて生きたまま腸内に到達し、腸内に常在性のビフィドバクテリウム属細菌を増加させ、大腸菌群を減少させて腸内環境を改善させることが知られている。
【０００３】
また、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９は、腸内の有害菌が産生する有害物質の生成を抑制する。更に、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９の飲用効果としては、便性改善、病原性大腸菌Ｏ−１５７の増殖抑制効果、ベロ毒素産生抑制効果、尿路感染症予防効果等の感染防御、ＮＫ細胞活性化作用等の免疫力の上昇作用、抗アレルギー効果、大腸がんや表在性膀胱がん等のがん抑制効果等が報告されている。更にまた、近年の研究の結果、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９あるいはその菌体由来多糖画分にＩＬ−６産生抑制作用及び炎症性腸疾患に対する予防治療効果があることが見出されている（特許文献１）。
【０００４】
上記の作用を奏する菌体由来多糖画分として、多糖−ペプチドグリカン複合体（polysaccharide-peptideglycan complex、以下「ＰＳ−ＰＧ」と略称する）が明らかにされている。ＰＳ−ＰＧには分子量の異なるＰＳ−ＰＧ１、ＰＳ−ＰＧ２の２種類が知られている（非特許文献１）。このうち、ＰＳ−ＰＧ１は、分子量が１００ｋＤａ以上、ＰＳ−ＰＧ２は分子量約３０ｋＤａと推定されており、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９における含量の比率は、約１：８である（非特許文献1）。
【０００５】
上記ＰＳ−ＰＧ１の化学組成は、非特許文献１に開示されており、ラムノース、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ムラミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジンを含むことが報告されている。
【０００６】
さらに近年の研究の結果、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９の炎症性腸疾患や腸炎随伴性ガン予防効果の活性本体が、ＰＳ−ＰＧ１であることが報告されている（非特許文献２）。
【０００７】
このようにＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の生理効果については多くの報告があるものの、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の簡便な分離方法、判別方法等については検討されていない。
【０００８】
ある乳酸菌がＰＳ−ＰＧ１を持つかどうかは、ストレプトマイセス・グロビスポラス（Streptomyces globisporus）由来のＮ−アセチルムラミダーゼ処理により可溶化した後、ゲル濾過法により分離し、さらにその生化学的分析を行うことによって判別する。このように、従来の方法では、乳酸菌がＰＳ−ＰＧ１を持つかどうか判断するのに煩雑な操作と時間、費用がかかるのが実情であった。
【０００９】
さらに、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌と持たない乳酸菌が培地中に混在した場合、この２つを効率的に分離する方法は、これまでに存在しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−７３２８６
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「ラクトバチルス カゼイ シロタ株−腸内フローラおよび健康とのかかわり−」、第２６−３３頁、（ヤクルト本社中央研究所、１９９９年１月１日発行）
【非特許文献２】"Immunology",Vol.128,1 Suppl,e170-e180(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、細菌中のＰＳ−ＰＧ１の生化学的分析や細菌のＲＮＡやＤＮＡの分離操作、あるいは遺伝学的分析操作を必要とせず、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を簡便で迅速に分離、取得および判別する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討していた結果、カゼイン存在下でＰＳ−ＰＧ１を有する乳酸菌は、遠心分離で極めて沈殿しにくいという他の乳酸菌と異なる挙動を示すこと、そしてこの挙動を利用することにより、他の乳酸菌と簡単に分離できることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち本発明は、乳酸菌を含有する培養物を、カゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とする多糖−ペプチドグリカン複合体１（ＰＳ−ＰＧ１）を持つ乳酸菌の取得方法である。
【００１５】
また本発明は、乳酸菌を含有する培養物を、カゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とするＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離方法である。
【００１６】
更に本発明は、上記のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の性質を用いたＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の判別方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明方法によれば、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌と持たない乳酸菌が混在した状態から、簡便かつ迅速にＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を分離、取得することができる。
【００１８】
また、本発明方法を利用すれば、簡単にＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を分離、取得することが可能であるし、また、ある乳酸菌がＰＳ−ＰＧ１を保有しているかどうかも容易に判別可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】遠心分離条件と、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９が存在する画分の関係を示す写真である。
【図２】塩化カルシウムの存在により、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９がより非沈殿画分（上清）に多くなることを示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離、取得方法は、カゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分である上清を回収することによってＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を分離、取得するものである。
【００２１】
本発明において、カゼイン存在下での遠心分離とは、α−カゼイン、β−カゼインあるいはκ−カゼインを含む培地あるいはこれらカゼインの水溶液中において乳酸菌の遠心分離操作を行うことをいう。この場合、使用されるカゼイン濃度としては、０．０１〜２０％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０％であり、この量を含有する培地あるいは水溶液を好適に使用する事が出来る。また、本発明のカゼイン存在下での遠心分離とは、乳酸菌をカゼイン含有培地で培養後、培養液をそのまま遠心分離する場合だけでなく、乳酸菌を培養後、カゼイン含有培地あるいは水溶液に懸濁して遠心分離する場合も含む。
【００２２】
使用されるカゼイン源としては、市販の牛乳由来カゼイン、牛乳、全粉乳、脱脂粉乳等を使用する事が出来るが、その中でも脱脂粉乳が好ましい。カゼイン源として脱脂粉乳を使用する場合、その培地中の濃度は、０．１〜２０％が好ましく、さらに１０％程度が好適である。
【００２３】
乳酸菌を含有する培養物を遠心分離する際に使用される上記カゼイン含有培地の温度は、１〜４０℃の間であれば良く、好ましくは、４℃〜３７℃の間である。さらにｐＨについては、カゼインタンパク質の立体構造が大きく変化しない範囲において特に限定されないが、好ましくはｐＨ３.７〜７、さらに好適にはｐＨ５〜７である。
【００２４】
本発明における、遠心分離の遠心力（相対遠心加速度）としては、８００〜２０４００×ｇの間が好ましく、さらに２３００〜９１００×ｇが好適である。なお、この相対遠心加速度は以下の式で計算する事が出来る。
【００２５】
相対遠心加速度（×ｇ）＝１１１８×Ａ×Ｂ２×１０−８
Ａ：回転半径（ｃｍ）
Ｂ：回転数（ｒｐｍ）
【００２６】
上記、遠心分離に用いる遠心分離装置は、適当な遠心力がかかるものであれば、特に限定されないが、一般的にはスイング型あるいはローター型のものが使用できる。
【００２７】
なお、本発明のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離、取得方法は、カゼインの他、更にカルシウム塩を加えることにより、効率良く実施することができる。すなわち、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の遠心分離による沈殿をカゼイン単独より効率よく防止することができ、ＰＳ−ＰＧ１を持たない乳酸菌との分離効率を上げることが可能である。
【００２８】
使用されるカルシウム塩としては、塩化カルシウム、硝酸カルシウム等が挙げられ、遠心分離の際の使用量は、カルシウムとして、１ｍＭ〜４０ｍＭ程度が好ましい。
【００２９】
本発明のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離、取得方法は、上述のカゼイン存在下で遠心分離し、非沈殿画分である上清を回収する方法である。ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌と持たない乳酸菌が混在しており、しかもＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌が少ない場合は、遠心分離操作を複数回繰り返すことにより、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を分離、取得することが出来る。
【００３０】
更に、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の判別方法は、乳酸菌を上述のカゼイン存在下で遠心分離して沈殿画分と非沈殿画分に分け、それぞれの画分中の乳酸菌の存在を調べることにより実施することができる。そして、約２３００ないし１４２００×ｇ程度の遠心分離により、非沈殿画分中に存在する乳酸菌が沈殿画分中に存在する乳酸菌の０．１倍以上、好ましくは１．０倍以上、さらに好ましくは１０倍以上となる場合、当該乳酸菌はＰＳ−ＰＧ１を持つと判別することができる。
【００３１】
以上、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の取得方法、分離方法、判別方法について説明してきたが、ここでいうＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌としては、特に属、種に限定されるものでなく、いわゆる乳酸菌と呼ばれるものが含まれる。しかしながら、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の代表的なものとしては、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）やＹＩＴ ９０１８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５）を挙げることができる。
【００３２】
なお、本発明方法により、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌が取得でき、また、分離、判別できる理由は、不明な点もあるが、次のように考えられている。すなわち、カゼイン分子とＰＳ−ＰＧ１は結合性が高く、このＰＳ−ＰＧ１を有する乳酸菌は、カゼインを含有する培地中で、カゼインミセルに接着した状態にある。この結果、遠心分離処理によってもＰＳ−ＰＧ１を有する乳酸菌は沈殿せず、カゼインミセルと共に上清に残存し、沈殿したＰＳ−ＰＧ１を有さない乳酸菌と分離できるものと考えられる。このことは、ＰＳ−ＰＧ１を有さないラクトバチルス・カゼイは、５１００×ｇ、５分間の遠心で、ほぼすべてが沈殿することからも確認される。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００３４】
実 施 例 １
ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離試験（１）：
被験菌株として、同じ種に属するラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ０１８０Ｔ（上付Ｔは、その菌株がタイプストレインであることを示す。以下同じ。ＡＴＣＣ ３３４４）（ＰＳ−ＰＧ１を持たない）、およびラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９（ＰＳ−ＰＧ１を持つ）を利用し、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離が可能であるかどうか試験した。
【００３５】
まず、乳酸菌の培養培地として、ＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ）を用い、各被験菌株を種菌として、３７℃で、１５．５時間前培養した。得られた前培養２０μｌを、それぞれＭＲＳ培地１ｍｌに加え、３７℃で４時間本培養を行った。
【００３６】
得られた培養液１μｌを、ミルク培地（脱脂粉乳（四つ葉乳業製）１０％溶液）５０μｌに懸濁し、３７℃で３０分間保温した後、懸濁液を５１００×ｇで５分間遠心分離した。その後、遠心分離後の上清および沈殿について、それぞれの菌数をＭＲＳ寒天培地で菌数計測を行った。なお、比較として、ミルク培地に代え、ＭＲＳ培地を用いて上記と同様に懸濁させ、遠心分離したものについても、菌数計測を行った。この結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１に示すように、カゼインを含有するミルク培地で懸濁、遠心分離した場合には、ＰＳ−ＰＧ１を持つＹＩＴ９０２９は、上清に１０５ＣＦＵ存在するのに対し、ＹＩＴ ０１８０Ｔは上清にほとんど検出されなかった。これに対し、ＭＲＳ培地に懸濁、遠心分離した場合には、ＹＩＴ９０２９およびＹＩＴ ０１８０Ｔはいずれも沈殿、上清のどちらの部分にも存在していた。
【００３９】
このように、ミルク培地を用いて遠心分離し、上清中の生菌数や沈殿中の生菌数を測定することにより、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌かどうか判別することが可能であることが示された。
【００４０】
実 施 例 ２
ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離試験（２）：
被験菌株として、同じ属に属し、ＰＳ−ＰＧ１を持たないことが知られている、ラクトバチルス・アシドフィラス ＹＩＴ００７０Ｔ（ＡＴＣＣ ４３５６）、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０Ｔおよびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＹＩＴ２００８Ｔ（ＡＴＣＣ １９４３５）を用い、これらとＰＳ−ＰＧ１を持っていることが知られているラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９が分離、判別可能であるかどうかを試験した。
【００４１】
各被験菌株を、ミルク培地（脱脂粉乳（四つ葉乳業）１０％溶液）中、３７℃で４時間培養した（但し、ＹＩＴ２００８Ｔは、ミルク培地に０．２％ブドウ糖を添加したものを使用し、培養温度は３０℃とした）。
【００４２】
培養後、５０ｍｌの各培養液を２３００×ｇで５分間遠心し、上清と沈殿に分け、更に沈殿は５０ｍｌの精製水に懸濁した。上清および懸濁液それぞれを精製水で１／１０希釈したもの２．５ｍｌをＭＲＳ平板培地に置き、３７℃で２日間培養し、菌数を測定し、上清と沈殿でどちらに微生物が多いかどうか検討した。この結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
この結果、ＰＳ−ＰＧ１を持たないラクトバチルス・アシドフィラスＹＩＴ ００７０Ｔ、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０Ｔおよびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＹＩＴ２００８Ｔは、ミルク培地で培養後、遠心分離による上清での分離菌数は沈殿よりも極めて少なく、難沈殿性を示さなかった。一方、ＰＳ−ＰＧ１を持つラクトバチルス・カゼイＹＩＴ ９０２９は、遠心分離によってもあまり沈殿せず、上清で分離する事が可能であることが示された。
【００４５】
実 施 例 ３
混合乳酸菌中からのＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離試験：
被験菌株として、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０Ｔのリファンピシン耐性株であるラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０ＴＲｉｆ（１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（シグマ社製）を含むＭＲＳ寒天培地に１０８ＣＦＵ程度のＹＩＴ０１８０Ｔを塗沫し、３７℃で３日培養後出現した耐性コロニーを単コロニー分離し、ＭＲＳ培地で培養後さらに１００μｇ／ｍｌのリファンピシンに対する耐性を確認したもの。；ヤクルト本社中央研究所保存）およびラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９のストレプトマイシン耐性株であるラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９Ｓｍ（１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を含むＭＲＳ寒天培地に１０８ＣＦＵ程度のＹＩＴ９０２９を塗沫し、３７℃で３日培養後出現した耐性コロニーを単コロニー分離し、ＭＲＳ培地で培養後さらに１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンに対する耐性を確認したもの。；ヤクルト本社中央研究所保存）を下記表３の割合で混合して培養し、培養物中からラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９Ｓｍを分離できるかどうか試験した。
【００４６】
まず、各混合被験菌をＭＲＳ培地で３７℃で、１５．５時間前培養し、次いで、この前培養液２０μｌをＭＲＳ培地１ｍｌに加え、３７℃で４時間培養した。得られた、それぞれの培養液１μｌを１００μｌミルク培地（脱脂粉乳１０％溶液）に懸濁し、３７℃で３０分間保温した後、この懸濁液を５１００×ｇで５分間遠心分離した。
【００４７】
得られた上清または沈殿に含まれるそれぞれの菌数を、リファンピシン含有ＭＲＳ寒天培地及びストレプトマイシン含有ＭＲＳ培地でそれぞれの耐性菌の菌数計測を行うことにより求めた。この結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
表３から、ＹＩＴ ０１８０ＴＲｉｆ菌液とＹＩＴ ９０２９Ｓｍ菌液を１：１に混合した場合、遠心分離後の上清中のＹＩＴ９０２９Ｓｍ菌数はＹＩＴ ０１８０ＴＲｉｆ菌数の約１０００倍であり、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を特異的に取得することができた。また、混合比が１：１０−３のデータに示されるように、ＹＩＴ ９０２９Ｓｍ菌数が全体の約１／１０００であってもこの分離、取得効果が確認された。
【００５０】
実 施 例 ４
乳酸菌の分離に対する保温時間の影響：
ミルク培地における懸濁時間を５〜６０分に変化させる以外は、実施例１と同様に培養、遠心分離を行い、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９の上清の菌数を調べた。その結果、保温時間が５分〜６０分のいずれでも分離に影響が無いことが示された（表４）。
【００５１】
【表４】
【００５２】
実 施 例 ５
乳酸菌の分離に対する保温温度の影響：
ミルク培地における懸濁温度を４〜３７℃に変化させる以外は、実施例１と同様に培養、遠心分離を行い、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９の上清の菌数を調べた。その結果、懸濁温度は４〜３７℃のいずれでも分離に影響が無いことが示された（表５）。
【００５３】
【表５】
【００５４】
実 施 例 ６
乳酸菌の分離に対する遠心分離条件の影響：
実施例１と同様に、ＭＲＳ培地あるいはミルク培地を用いてラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９を３７℃で４時間培養した。次いで、各培養液５０μｌを、それぞれ２３００×ｇ、５１００×ｇ、９１００×ｇ、１４２００×ｇおよび２０４００×ｇの遠心分離条件で５分間遠心し、上清と沈殿に分けた。
【００５５】
沈殿は、５０μｌの精製水に懸濁させた後、上清はそのままで、１０ｍＭ ＥＤＴＡで１／１０希釈し、それらの２．５μｌをＭＲＳ平板培地に置き、３７℃で２日間培養した。この結果を図１に示す。
【００５６】
この結果から明らかなように、ミルク培地では、１４２００×ｇから、沈殿中にもラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９の存在が認められるものの、２３００〜２０４００×ｇで遠心分離を行っても、沈殿画分よりも上清画分に多くの菌が存在していた。これに対し、ＭＲＳ培地では、一貫して沈殿画分にほとんどの菌が存在していた。
【００５７】
実 施 例 ７
乳酸菌の分離に対する培地の影響：
被験菌株として、ＰＳ−ＰＧ１を持たないラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０Ｔと、ＰＳ−ＰＧ１を持つラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９を用い、培地の含有成分と乳酸菌の分離の関係を検討した。
【００５８】
検討に用いた培地は、α−カゼイン、β−カゼインまたはＮ，Ｎ−ジメチルカゼイン（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）を１０ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する水溶液、濃度１０ｗ／ｖ％脱脂粉乳（四つ葉乳業）水溶液、牛乳（明治乳業）および豆乳（ヤクルト本社）を用いた。
【００５９】
実験方法は、各被験菌株を実施例１と同様の方法で培養し、その培養液１μｌを、５０μｌの上記各培地に加え、３７℃で１０分保温した。次いで、５分の遠心後（５１００×ｇ）、沈殿と上清をとりわけ、上清を４５０μｌの、沈殿を５００μｌの精製水にそれぞれ加え、その１〜２μｌをＭＲＳ寒天平板培地上に塗沫して３７℃で培養し、菌数を判定した。この結果を表６に示す。
【００６０】
【表６】
【００６１】
この結果、培養した菌株を遠心する際の分散液として、α−カゼインまたはβ−カゼインを利用した培地や、脱脂粉乳または牛乳を培地とした時には、ＰＳ−ＰＧ１を持つＹＩＴ９０２９は難沈殿性を示したが、ＰＳ−ＰＧ１を持たないＹＩＴ ０１８０Ｔは沈殿することが明らかになった。一方、アミノ基がメチル化されたジメチルカゼインを利用した培地や、豆乳培地では、ＹＩＴ ９０２９には難沈殿性が認められなかった。以上より、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離は、カゼインタンパクを含む培地で実施できる事が明らかとなった。
【００６２】
実 施 例 ８
ＣａＣｌ２添加によるＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の難沈殿性の促進：
ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９をＭＲＳ培地で４時間培養後、遠心で集菌した。一方、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でαーカゼインまたはβ−カゼインを含む水溶液並びにα−カゼインおよびβ−カゼインをそれぞれ５ｍｇ／ｍｌで含む水溶液と、更にこれら各水溶液にＣａＣｌ２を１ｍＭとなるよう加えた水溶液の６つの水溶液を調製した。
【００６３】
これらの各水溶液に、前記の集菌した微生物を入れ、３７℃で３０分保温後、５１００×ｇで５分間遠心し、沈殿と上清を分離し、それぞれに精製水を加え等量とした。その後、ＭＲＳ平板培地を用い、沈殿と上清中の生菌の存在状況を調べた。この結果を図２に示す。
【００６４】
図２から明らかなように、ＣａＣｌ２添加によってカゼインのＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の難沈殿効果が促進されていた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の取得方法によれば、乳酸菌群中から、ＰＳ−ＰＧ１を保有する乳酸菌のみを簡単に分離、取得することができ、種々の生理活性作用を有する新しいタイプのヨーグルトや乳酸菌飲料の開発に有用である。
【００６６】
また、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の判別方法によれば、細菌中に存在するＰＳ−ＰＧ１の生化学的分析、細菌のＲＮＡやＤＮＡの分離操作や遺伝学的分析操作を必要とせず、乳酸菌がＰＳ−ＰＧ１を持つかどうかを簡便、迅速に判別することが可能となるので、乳酸菌の研究に大きく資するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖−ペプチドグリカン複合体１（ＰＳ−ＰＧ１）保有乳酸菌の取得方法に関し、更に詳細には、乳酸菌群中から、ＰＳ−ＰＧ１を保有する乳酸菌を分離し、これを取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、免疫の賦活作用や抗炎症作用を持つことが知られている。その中でも、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）は、多くの生理効果が明らかとなっている。このラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９は、胃液や胆汁等の強い消化液に耐えて生きたまま腸内に到達し、腸内に常在性のビフィドバクテリウム属細菌を増加させ、大腸菌群を減少させて腸内環境を改善させることが知られている。
【０００３】
また、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９は、腸内の有害菌が産生する有害物質の生成を抑制する。更に、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９の飲用効果としては、便性改善、病原性大腸菌Ｏ−１５７の増殖抑制効果、ベロ毒素産生抑制効果、尿路感染症予防効果等の感染防御、ＮＫ細胞活性化作用等の免疫力の上昇作用、抗アレルギー効果、大腸がんや表在性膀胱がん等のがん抑制効果等が報告されている。更にまた、近年の研究の結果、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９あるいはその菌体由来多糖画分にＩＬ−６産生抑制作用及び炎症性腸疾患に対する予防治療効果があることが見出されている（特許文献１）。
【０００４】
上記の作用を奏する菌体由来多糖画分として、多糖−ペプチドグリカン複合体（polysaccharide-peptideglycan complex、以下「ＰＳ−ＰＧ」と略称する）が明らかにされている。ＰＳ−ＰＧには分子量の異なるＰＳ−ＰＧ１、ＰＳ−ＰＧ２の２種類が知られている（非特許文献１）。このうち、ＰＳ−ＰＧ１は、分子量が１００ｋＤａ以上、ＰＳ−ＰＧ２は分子量約３０ｋＤａと推定されており、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９における含量の比率は、約１：８である（非特許文献1）。
【０００５】
上記ＰＳ−ＰＧ１の化学組成は、非特許文献１に開示されており、ラムノース、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ムラミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジンを含むことが報告されている。
【０００６】
さらに近年の研究の結果、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９の炎症性腸疾患や腸炎随伴性ガン予防効果の活性本体が、ＰＳ−ＰＧ１であることが報告されている（非特許文献２）。
【０００７】
このようにＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の生理効果については多くの報告があるものの、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の簡便な分離方法、判別方法等については検討されていない。
【０００８】
ある乳酸菌がＰＳ−ＰＧ１を持つかどうかは、ストレプトマイセス・グロビスポラス（Streptomyces globisporus）由来のＮ−アセチルムラミダーゼ処理により可溶化した後、ゲル濾過法により分離し、さらにその生化学的分析を行うことによって判別する。このように、従来の方法では、乳酸菌がＰＳ−ＰＧ１を持つかどうか判断するのに煩雑な操作と時間、費用がかかるのが実情であった。
【０００９】
さらに、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌と持たない乳酸菌が培地中に混在した場合、この２つを効率的に分離する方法は、これまでに存在しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−７３２８６
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「ラクトバチルス カゼイ シロタ株−腸内フローラおよび健康とのかかわり−」、第２６−３３頁、（ヤクルト本社中央研究所、１９９９年１月１日発行）
【非特許文献２】"Immunology",Vol.128,1 Suppl,e170-e180(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、細菌中のＰＳ−ＰＧ１の生化学的分析や細菌のＲＮＡやＤＮＡの分離操作、あるいは遺伝学的分析操作を必要とせず、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を簡便で迅速に分離、取得および判別する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討していた結果、カゼイン存在下でＰＳ−ＰＧ１を有する乳酸菌は、遠心分離で極めて沈殿しにくいという他の乳酸菌と異なる挙動を示すこと、そしてこの挙動を利用することにより、他の乳酸菌と簡単に分離できることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち本発明は、乳酸菌を含有する培養物を、カゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とする多糖−ペプチドグリカン複合体１（ＰＳ−ＰＧ１）を持つ乳酸菌の取得方法である。
【００１５】
また本発明は、乳酸菌を含有する培養物を、カゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とするＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離方法である。
【００１６】
更に本発明は、上記のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の性質を用いたＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の判別方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明方法によれば、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌と持たない乳酸菌が混在した状態から、簡便かつ迅速にＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を分離、取得することができる。
【００１８】
また、本発明方法を利用すれば、簡単にＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を分離、取得することが可能であるし、また、ある乳酸菌がＰＳ−ＰＧ１を保有しているかどうかも容易に判別可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】遠心分離条件と、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９が存在する画分の関係を示す写真である。
【図２】塩化カルシウムの存在により、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９がより非沈殿画分（上清）に多くなることを示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離、取得方法は、カゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分である上清を回収することによってＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を分離、取得するものである。
【００２１】
本発明において、カゼイン存在下での遠心分離とは、α−カゼイン、β−カゼインあるいはκ−カゼインを含む培地あるいはこれらカゼインの水溶液中において乳酸菌の遠心分離操作を行うことをいう。この場合、使用されるカゼイン濃度としては、０．０１〜２０％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０％であり、この量を含有する培地あるいは水溶液を好適に使用する事が出来る。また、本発明のカゼイン存在下での遠心分離とは、乳酸菌をカゼイン含有培地で培養後、培養液をそのまま遠心分離する場合だけでなく、乳酸菌を培養後、カゼイン含有培地あるいは水溶液に懸濁して遠心分離する場合も含む。
【００２２】
使用されるカゼイン源としては、市販の牛乳由来カゼイン、牛乳、全粉乳、脱脂粉乳等を使用する事が出来るが、その中でも脱脂粉乳が好ましい。カゼイン源として脱脂粉乳を使用する場合、その培地中の濃度は、０．１〜２０％が好ましく、さらに１０％程度が好適である。
【００２３】
乳酸菌を含有する培養物を遠心分離する際に使用される上記カゼイン含有培地の温度は、１〜４０℃の間であれば良く、好ましくは、４℃〜３７℃の間である。さらにｐＨについては、カゼインタンパク質の立体構造が大きく変化しない範囲において特に限定されないが、好ましくはｐＨ３.７〜７、さらに好適にはｐＨ５〜７である。
【００２４】
本発明における、遠心分離の遠心力（相対遠心加速度）としては、８００〜２０４００×ｇの間が好ましく、さらに２３００〜９１００×ｇが好適である。なお、この相対遠心加速度は以下の式で計算する事が出来る。
【００２５】
相対遠心加速度（×ｇ）＝１１１８×Ａ×Ｂ２×１０−８
Ａ：回転半径（ｃｍ）
Ｂ：回転数（ｒｐｍ）
【００２６】
上記、遠心分離に用いる遠心分離装置は、適当な遠心力がかかるものであれば、特に限定されないが、一般的にはスイング型あるいはローター型のものが使用できる。
【００２７】
なお、本発明のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離、取得方法は、カゼインの他、更にカルシウム塩を加えることにより、効率良く実施することができる。すなわち、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の遠心分離による沈殿をカゼイン単独より効率よく防止することができ、ＰＳ−ＰＧ１を持たない乳酸菌との分離効率を上げることが可能である。
【００２８】
使用されるカルシウム塩としては、塩化カルシウム、硝酸カルシウム等が挙げられ、遠心分離の際の使用量は、カルシウムとして、１ｍＭ〜４０ｍＭ程度が好ましい。
【００２９】
本発明のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離、取得方法は、上述のカゼイン存在下で遠心分離し、非沈殿画分である上清を回収する方法である。ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌と持たない乳酸菌が混在しており、しかもＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌が少ない場合は、遠心分離操作を複数回繰り返すことにより、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を分離、取得することが出来る。
【００３０】
更に、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の判別方法は、乳酸菌を上述のカゼイン存在下で遠心分離して沈殿画分と非沈殿画分に分け、それぞれの画分中の乳酸菌の存在を調べることにより実施することができる。そして、約２３００ないし１４２００×ｇ程度の遠心分離により、非沈殿画分中に存在する乳酸菌が沈殿画分中に存在する乳酸菌の０．１倍以上、好ましくは１．０倍以上、さらに好ましくは１０倍以上となる場合、当該乳酸菌はＰＳ−ＰＧ１を持つと判別することができる。
【００３１】
以上、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の取得方法、分離方法、判別方法について説明してきたが、ここでいうＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌としては、特に属、種に限定されるものでなく、いわゆる乳酸菌と呼ばれるものが含まれる。しかしながら、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の代表的なものとしては、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）やＹＩＴ ９０１８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５）を挙げることができる。
【００３２】
なお、本発明方法により、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌が取得でき、また、分離、判別できる理由は、不明な点もあるが、次のように考えられている。すなわち、カゼイン分子とＰＳ−ＰＧ１は結合性が高く、このＰＳ−ＰＧ１を有する乳酸菌は、カゼインを含有する培地中で、カゼインミセルに接着した状態にある。この結果、遠心分離処理によってもＰＳ−ＰＧ１を有する乳酸菌は沈殿せず、カゼインミセルと共に上清に残存し、沈殿したＰＳ−ＰＧ１を有さない乳酸菌と分離できるものと考えられる。このことは、ＰＳ−ＰＧ１を有さないラクトバチルス・カゼイは、５１００×ｇ、５分間の遠心で、ほぼすべてが沈殿することからも確認される。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００３４】
実 施 例 １
ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離試験（１）：
被験菌株として、同じ種に属するラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ０１８０Ｔ（上付Ｔは、その菌株がタイプストレインであることを示す。以下同じ。ＡＴＣＣ ３３４４）（ＰＳ−ＰＧ１を持たない）、およびラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９（ＰＳ−ＰＧ１を持つ）を利用し、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離が可能であるかどうか試験した。
【００３５】
まず、乳酸菌の培養培地として、ＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ）を用い、各被験菌株を種菌として、３７℃で、１５．５時間前培養した。得られた前培養２０μｌを、それぞれＭＲＳ培地１ｍｌに加え、３７℃で４時間本培養を行った。
【００３６】
得られた培養液１μｌを、ミルク培地（脱脂粉乳（四つ葉乳業製）１０％溶液）５０μｌに懸濁し、３７℃で３０分間保温した後、懸濁液を５１００×ｇで５分間遠心分離した。その後、遠心分離後の上清および沈殿について、それぞれの菌数をＭＲＳ寒天培地で菌数計測を行った。なお、比較として、ミルク培地に代え、ＭＲＳ培地を用いて上記と同様に懸濁させ、遠心分離したものについても、菌数計測を行った。この結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１に示すように、カゼインを含有するミルク培地で懸濁、遠心分離した場合には、ＰＳ−ＰＧ１を持つＹＩＴ９０２９は、上清に１０５ＣＦＵ存在するのに対し、ＹＩＴ ０１８０Ｔは上清にほとんど検出されなかった。これに対し、ＭＲＳ培地に懸濁、遠心分離した場合には、ＹＩＴ９０２９およびＹＩＴ ０１８０Ｔはいずれも沈殿、上清のどちらの部分にも存在していた。
【００３９】
このように、ミルク培地を用いて遠心分離し、上清中の生菌数や沈殿中の生菌数を測定することにより、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌かどうか判別することが可能であることが示された。
【００４０】
実 施 例 ２
ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離試験（２）：
被験菌株として、同じ属に属し、ＰＳ−ＰＧ１を持たないことが知られている、ラクトバチルス・アシドフィラス ＹＩＴ００７０Ｔ（ＡＴＣＣ ４３５６）、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０Ｔおよびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＹＩＴ２００８Ｔ（ＡＴＣＣ １９４３５）を用い、これらとＰＳ−ＰＧ１を持っていることが知られているラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９が分離、判別可能であるかどうかを試験した。
【００４１】
各被験菌株を、ミルク培地（脱脂粉乳（四つ葉乳業）１０％溶液）中、３７℃で４時間培養した（但し、ＹＩＴ２００８Ｔは、ミルク培地に０．２％ブドウ糖を添加したものを使用し、培養温度は３０℃とした）。
【００４２】
培養後、５０ｍｌの各培養液を２３００×ｇで５分間遠心し、上清と沈殿に分け、更に沈殿は５０ｍｌの精製水に懸濁した。上清および懸濁液それぞれを精製水で１／１０希釈したもの２．５ｍｌをＭＲＳ平板培地に置き、３７℃で２日間培養し、菌数を測定し、上清と沈殿でどちらに微生物が多いかどうか検討した。この結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
この結果、ＰＳ−ＰＧ１を持たないラクトバチルス・アシドフィラスＹＩＴ ００７０Ｔ、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０Ｔおよびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＹＩＴ２００８Ｔは、ミルク培地で培養後、遠心分離による上清での分離菌数は沈殿よりも極めて少なく、難沈殿性を示さなかった。一方、ＰＳ−ＰＧ１を持つラクトバチルス・カゼイＹＩＴ ９０２９は、遠心分離によってもあまり沈殿せず、上清で分離する事が可能であることが示された。
【００４５】
実 施 例 ３
混合乳酸菌中からのＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離試験：
被験菌株として、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０Ｔのリファンピシン耐性株であるラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０ＴＲｉｆ（１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（シグマ社製）を含むＭＲＳ寒天培地に１０８ＣＦＵ程度のＹＩＴ０１８０Ｔを塗沫し、３７℃で３日培養後出現した耐性コロニーを単コロニー分離し、ＭＲＳ培地で培養後さらに１００μｇ／ｍｌのリファンピシンに対する耐性を確認したもの。；ヤクルト本社中央研究所保存）およびラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９のストレプトマイシン耐性株であるラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９Ｓｍ（１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を含むＭＲＳ寒天培地に１０８ＣＦＵ程度のＹＩＴ９０２９を塗沫し、３７℃で３日培養後出現した耐性コロニーを単コロニー分離し、ＭＲＳ培地で培養後さらに１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンに対する耐性を確認したもの。；ヤクルト本社中央研究所保存）を下記表３の割合で混合して培養し、培養物中からラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９Ｓｍを分離できるかどうか試験した。
【００４６】
まず、各混合被験菌をＭＲＳ培地で３７℃で、１５．５時間前培養し、次いで、この前培養液２０μｌをＭＲＳ培地１ｍｌに加え、３７℃で４時間培養した。得られた、それぞれの培養液１μｌを１００μｌミルク培地（脱脂粉乳１０％溶液）に懸濁し、３７℃で３０分間保温した後、この懸濁液を５１００×ｇで５分間遠心分離した。
【００４７】
得られた上清または沈殿に含まれるそれぞれの菌数を、リファンピシン含有ＭＲＳ寒天培地及びストレプトマイシン含有ＭＲＳ培地でそれぞれの耐性菌の菌数計測を行うことにより求めた。この結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
表３から、ＹＩＴ ０１８０ＴＲｉｆ菌液とＹＩＴ ９０２９Ｓｍ菌液を１：１に混合した場合、遠心分離後の上清中のＹＩＴ９０２９Ｓｍ菌数はＹＩＴ ０１８０ＴＲｉｆ菌数の約１０００倍であり、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌を特異的に取得することができた。また、混合比が１：１０−３のデータに示されるように、ＹＩＴ ９０２９Ｓｍ菌数が全体の約１／１０００であってもこの分離、取得効果が確認された。
【００５０】
実 施 例 ４
乳酸菌の分離に対する保温時間の影響：
ミルク培地における懸濁時間を５〜６０分に変化させる以外は、実施例１と同様に培養、遠心分離を行い、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９の上清の菌数を調べた。その結果、保温時間が５分〜６０分のいずれでも分離に影響が無いことが示された（表４）。
【００５１】
【表４】
【００５２】
実 施 例 ５
乳酸菌の分離に対する保温温度の影響：
ミルク培地における懸濁温度を４〜３７℃に変化させる以外は、実施例１と同様に培養、遠心分離を行い、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９の上清の菌数を調べた。その結果、懸濁温度は４〜３７℃のいずれでも分離に影響が無いことが示された（表５）。
【００５３】
【表５】
【００５４】
実 施 例 ６
乳酸菌の分離に対する遠心分離条件の影響：
実施例１と同様に、ＭＲＳ培地あるいはミルク培地を用いてラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９を３７℃で４時間培養した。次いで、各培養液５０μｌを、それぞれ２３００×ｇ、５１００×ｇ、９１００×ｇ、１４２００×ｇおよび２０４００×ｇの遠心分離条件で５分間遠心し、上清と沈殿に分けた。
【００５５】
沈殿は、５０μｌの精製水に懸濁させた後、上清はそのままで、１０ｍＭ ＥＤＴＡで１／１０希釈し、それらの２．５μｌをＭＲＳ平板培地に置き、３７℃で２日間培養した。この結果を図１に示す。
【００５６】
この結果から明らかなように、ミルク培地では、１４２００×ｇから、沈殿中にもラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９の存在が認められるものの、２３００〜２０４００×ｇで遠心分離を行っても、沈殿画分よりも上清画分に多くの菌が存在していた。これに対し、ＭＲＳ培地では、一貫して沈殿画分にほとんどの菌が存在していた。
【００５７】
実 施 例 ７
乳酸菌の分離に対する培地の影響：
被験菌株として、ＰＳ−ＰＧ１を持たないラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ０１８０Ｔと、ＰＳ−ＰＧ１を持つラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９を用い、培地の含有成分と乳酸菌の分離の関係を検討した。
【００５８】
検討に用いた培地は、α−カゼイン、β−カゼインまたはＮ，Ｎ−ジメチルカゼイン（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）を１０ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する水溶液、濃度１０ｗ／ｖ％脱脂粉乳（四つ葉乳業）水溶液、牛乳（明治乳業）および豆乳（ヤクルト本社）を用いた。
【００５９】
実験方法は、各被験菌株を実施例１と同様の方法で培養し、その培養液１μｌを、５０μｌの上記各培地に加え、３７℃で１０分保温した。次いで、５分の遠心後（５１００×ｇ）、沈殿と上清をとりわけ、上清を４５０μｌの、沈殿を５００μｌの精製水にそれぞれ加え、その１〜２μｌをＭＲＳ寒天平板培地上に塗沫して３７℃で培養し、菌数を判定した。この結果を表６に示す。
【００６０】
【表６】
【００６１】
この結果、培養した菌株を遠心する際の分散液として、α−カゼインまたはβ−カゼインを利用した培地や、脱脂粉乳または牛乳を培地とした時には、ＰＳ−ＰＧ１を持つＹＩＴ９０２９は難沈殿性を示したが、ＰＳ−ＰＧ１を持たないＹＩＴ ０１８０Ｔは沈殿することが明らかになった。一方、アミノ基がメチル化されたジメチルカゼインを利用した培地や、豆乳培地では、ＹＩＴ ９０２９には難沈殿性が認められなかった。以上より、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の分離は、カゼインタンパクを含む培地で実施できる事が明らかとなった。
【００６２】
実 施 例 ８
ＣａＣｌ２添加によるＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の難沈殿性の促進：
ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９をＭＲＳ培地で４時間培養後、遠心で集菌した。一方、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でαーカゼインまたはβ−カゼインを含む水溶液並びにα−カゼインおよびβ−カゼインをそれぞれ５ｍｇ／ｍｌで含む水溶液と、更にこれら各水溶液にＣａＣｌ２を１ｍＭとなるよう加えた水溶液の６つの水溶液を調製した。
【００６３】
これらの各水溶液に、前記の集菌した微生物を入れ、３７℃で３０分保温後、５１００×ｇで５分間遠心し、沈殿と上清を分離し、それぞれに精製水を加え等量とした。その後、ＭＲＳ平板培地を用い、沈殿と上清中の生菌の存在状況を調べた。この結果を図２に示す。
【００６４】
図２から明らかなように、ＣａＣｌ２添加によってカゼインのＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の難沈殿効果が促進されていた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の取得方法によれば、乳酸菌群中から、ＰＳ−ＰＧ１を保有する乳酸菌のみを簡単に分離、取得することができ、種々の生理活性作用を有する新しいタイプのヨーグルトや乳酸菌飲料の開発に有用である。
【００６６】
また、ＰＳ−ＰＧ１を持つ乳酸菌の判別方法によれば、細菌中に存在するＰＳ−ＰＧ１の生化学的分析、細菌のＲＮＡやＤＮＡの分離操作や遺伝学的分析操作を必要とせず、乳酸菌がＰＳ−ＰＧ１を持つかどうかを簡便、迅速に判別することが可能となるので、乳酸菌の研究に大きく資するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌を含有する培養物をカゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とする多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の取得方法。
【請求項２】
更に、カルシウム塩も存在させる請求項１記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の取得方法。
【請求項３】
乳酸菌がラクトバチルス・カゼイである請求項１または２のいずれかの項記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の取得方法。
【請求項４】
乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）である請求項１ないし３のいずれかの項記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の取得方法。
【請求項５】
乳酸菌を含有する培養物をカゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とする多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の分離方法。
【請求項６】
更に、カルシウム塩も存在させる請求項５記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の分離方法。
【請求項７】
乳酸菌がラクトバチルス・カゼイである請求項５または６のいずれかの項記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の分離方法。
【請求項８】
乳酸菌を含有する培養物をカゼイン存在下で遠心分離して沈殿画分と非沈殿画分に分け、それぞれの画分中の乳酸菌の存在を調べ、非沈殿画分中に存在する乳酸菌が沈殿画分中に存在する乳酸菌の１．０倍以上である場合、当該乳酸菌が多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つと判別することを特徴とする多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の判別方法。
【請求項１】
乳酸菌を含有する培養物をカゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とする多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の取得方法。
【請求項２】
更に、カルシウム塩も存在させる請求項１記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の取得方法。
【請求項３】
乳酸菌がラクトバチルス・カゼイである請求項１または２のいずれかの項記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の取得方法。
【請求項４】
乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）である請求項１ないし３のいずれかの項記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の取得方法。
【請求項５】
乳酸菌を含有する培養物をカゼイン存在下で遠心分離し、その非沈殿画分を回収することを特徴とする多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の分離方法。
【請求項６】
更に、カルシウム塩も存在させる請求項５記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の分離方法。
【請求項７】
乳酸菌がラクトバチルス・カゼイである請求項５または６のいずれかの項記載の多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の分離方法。
【請求項８】
乳酸菌を含有する培養物をカゼイン存在下で遠心分離して沈殿画分と非沈殿画分に分け、それぞれの画分中の乳酸菌の存在を調べ、非沈殿画分中に存在する乳酸菌が沈殿画分中に存在する乳酸菌の１．０倍以上である場合、当該乳酸菌が多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つと判別することを特徴とする多糖−ペプチドグリカン複合体１を持つ乳酸菌の判別方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１９３７３０（Ｐ２０１１−１９３７３０Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６０２６３（Ｐ２０１０−６０２６３）
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
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