多糖類で被覆された超常磁性酸化物コロイドの合成
【課題】ポリマーで覆われた超常磁性金属酸化物を含有するコロイドの合成の方法を提供すること。
【解決手段】明細書に記載され、示された発明であって、（ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して超常磁性の金属酸化物のコロイドを得る工程を含む、ポリマーで被覆された超常磁性金属酸化物を含有するコロイドを合成する方法。
【解決手段】明細書に記載され、示された発明であって、（ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して超常磁性の金属酸化物のコロイドを得る工程を含む、ポリマーで被覆された超常磁性金属酸化物を含有するコロイドを合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類で被覆された超常磁性酸化鉄コロイドの合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ａ．導入部）
しばしばＭＲ造影剤として用いられてきた磁性粒子又はコロイドの合成に広範な方法が用いられてきた。クレーブネス（Ｋｌａｖｅｎｅｓｓ）による米国特許第４，８６３，７１５号；オーエン（Ｏｗｅｎ）による米国特許第４，７９５，６９８号；ウイッダー（Ｗｉｄｄｅｒ）による米国特許第４，８４９，２１０号；ハセガワによる米国特許第４，１０１，４３５号；グロマン（Ｇｒｏｍａｎ）による米国特許第４，８２７，９４５号；グロマンによる米国特許第４，７７０，１８３号；メンズ（Ｍｅｎｚ），Ｅ．Ｔ．による、１９８９年８月３日に出願され、１９９０年２月２２日付けで公開された、特許協力条約下で公開された国際出願、国際公開番号ＷＯ９０／０１２９５；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）による、国際協力条約下で公開された国際出願、国際公開番号ＷＯ９０／０１８９９。これらの合成では、不均質であり、細網内皮系（ＲＥＳ）の食細胞により血液から迅速に除去される（又は取り除かれる）コロイドが生成される。これらの２つの特徴は幾つかの重要な点において望ましくない。
【０００３】
（Ｂ．不均質な磁性コロイドを用いる問題）
先に記載した磁性コロイド及び粒子は余りに大きすぎるか又はある場合では余りに多くの異なった大きさの粒子から成り、すなわち不均質を示し、２２０ｎｍのフィルターを通過させることによって滅菌されない。２２０ｎｍのフィルターによる濾過は、非経口医薬品の滅菌に対する最近の法的規制に合致する。非常に小割合のコロイド物質がフィルター上で遮られるのに十分に大きく、それによりさらなる濾過を妨げてしまう場合にはフィルター滅菌に対する不能が生じる。
【０００４】
不均質なコロイド又は広範な特性を有する多くの部分母集団から成るコロイドは、特徴づけることが難しい。不均質であることにより、製造時又は貯蔵することによる発現時に存在する小さい非定型性の集団の検索を不明瞭にする。均質コロイドでは、狭い範囲の特性を有する単一集団は、コロイドを含み、小さな非定型性の部分集団の検出を容易にする。ヒトへの注入用の超常磁性酸化鉄コロイドの製造において、コロイド物質の非定型性母集団は、毒性の潜在的源であると考えられている。その結果、そのような母集団の非存在を確認する能力は、生成されるコロイドの質を改良する。
【０００５】
不均質なコロイドの分画によって均質なコロイドが生成されてきた。例えば、不均質コロイドＡＭＩ−２５はセファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーによって分画され、異なるサイズの４つのコロイドを生じる［ルイス（Ｌｅｗｉｓ）らによる、特許協力条約下で公開の国際出願の国際公開ＵＳ８９／０３５１７の表Ｉ参照］。ＡＭＩ−２５は、米国特許第４，８２７，９４５号の実施例７・１０により生成される。それらの実験は、超常磁性酸化鉄コロイドが薬物動態学を制御する役目を果たすことができることを示した。約１００ｎｍ未満にコロイド粒子の大きさが落ちると、クリアランスは低減、すなわち、血漿半減期が増大した。
【０００６】
記載された（ハセガワ、米国特許第４，１０１，４３５号）ように生成されたデキストラン磁鉄鉱は、不均質のコロイドの他の例である。デキストラン磁鉄鉱は、２０乃至５２０ｎｍの直径、１６０ｎｍメジアンを有する粒子を含む。ＡＭＩ−２５のように、デキストラン磁鉄鉱はサイズ分画に付されており、より小さい画分では、より長い血中半減期を示す。全体の製剤は、３．５分の非常に短い血漿半減期を有し、最も小さい画分は、１９分の半減期を有し、最も大きい画分は、０．９分の半減期を有する［Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｍｅｄ．に提出されたイオンノン（Ｉｏｎｎｏｎｅ），Ｎ．Ａ．及びマギン（Ｍａｇｉｎ），Ｒ．Ｌ．らによる“Ｂｌｏｏｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ｄｘｔｒａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ ＥＳＲ Ｍｅｔｈｏｄ”；Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｍｅｄ．に提出されたマギン（Ｍａｇｉｎ），Ｒ．Ｌ．、バシック（Ｂａｃｉｃ）Ｇ．らによる“Ｄｅｘｔｒａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ ａｓ ａ Ｌｉｖｅｒ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ａｇｅｎｔ”］。
【０００７】
モリデイ（Ｍｏｌｉｄａｙ）（米国特許第４，４５２，７７３号）により記載された合成において、不均質なコロイドが生成され、大きな凝結体を遠心分離により取り出し捨てる（８欄、４０行）。不均質なコロイドからの均質なコロイドの生成は、望んでいないコロイド物質を捨てるので無駄である。そして、分画工程それ自体が、時間がかかりそして費用がかかる。
【０００８】
上記の磁性のコロイド及び粒子についての第二の問題は、注入後、細網内皮系（ＲＥＳ）の組織により迅速なクリアランスを示すことである。迅速なクリアランス（血漿短半減期）は、注入された物質が動物の血中に存在する時間を制限する。いくつかのＭＲ像影用途において、例えば、脳の異なる部分の毛細血管容量の描写において、造影は、血中の超常磁性酸化鉄の存在により増大される［ブラッドレイ（Ｂｒａｄｌｅｙ）らによる、Ｓｔｒｏｋｅ、２０巻（１９８９年）、１０３２乃至１０３６頁］。ＭＲ像を増大した造影が得られるときに、血漿長半減期は、必要なコロイドの用量を低減し、その時間を長くする。
【０００９】
血液からの従来技術の磁性コロイド又は粒子の迅速なクリアランスはＲＥＳの２つの主な組織である肝臓及び脾臓による取り込みから得られる。迅速にクリアーされた粒子では、典型的には、注入された物質の約９０％がこれらの２つの器官により血中から引き出される。従って、迅速な血液クリアランスは、食細胞以外の細胞及び肝臓及び脾臓以外の組織をターゲットにすることができ、それらの細胞及び組織に移送されることができるコロイドの量を制限する。
【００１０】
表面化学が注入後のコロイドの結果に影響を与えることができる、例えば、アラビノガラクタンを用いて作られた不均質のコロイドでの結果に影響を与えることができると報告された［ジョセフソン（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｉｍａｇ．８巻（１９９０年）、６３７−６４６頁及びメンズ（Ｍｅｎｚ），Ｅ．Ｔ．による１９８９年８月３日に出願され、１９９０年２月２２日に公開された特許協力条約による国際出願の国際公開ＷＯ９０／０１２９５の実施例６．１０．１）］。同様に、酸化鉄粒子に抗体を結合させることにより、鉄の特定の取り込みが組織に達成されることが報告された［レンショウ（Ｒｅｎｓｈａｗ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｉｍａｇ．、４巻（１９８６年）、３５１−３５７頁及びセルダン（Ｃｅｒｄａｎ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｍｅｄ．、１２巻（１９８９年）、１５１−１６３頁］。しかし、そのような調製物質はしばしば不均質であり、濾過滅菌ができなく、肝臓及び脾臓による非常に実質的な取り込みを示す。肝臓及び脾臓による取り込みによって他の組織をターゲットにすることができる鉄の量が制限される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明によって、以下が提供される。
【００１２】
（項目１） 明細書に記載され、示された発明。
【００１３】
（項目２） （ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して超常磁性の金属酸化物のコロイドを得る工程
を含む、ポリマーで被覆された超常磁性金属酸化物を含有するコロイドを合成する方法。
【００１４】
（項目３） ポリマーが多糖類である、項目２に記載された方法。
【００１５】
（項目４） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目３に記載の方法。
【００１６】
（項目５） 工程（ｉｉ）が、約０℃乃至約１２℃に溶液を冷却する工程を含み、
工程（ｉｖ）が、約６０℃乃至約１００℃に、約３０分以上、溶液を加熱して、超常磁性金属酸化物コロイドを得る工程を含む、項目２に記載の方法。
【００１７】
（項目６） ポリマーが多糖類である、項目５に記載の方法。
【００１８】
（項目７） 工程（ｉ）において与えられる酸性溶液には、
（ａ）第二鉄塩、
（ｂ）第一鉄塩及び
（ｃ）第一鉄塩及び第二鉄塩
から成る群から選ばれる金属塩が含まれ、
工程（ｉｖ）において超常磁性酸化鉄コロイドが得られる、項目６に記載の方法。
【００１９】
（項目８） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目７に記載の方法。
【００２０】
（項目９） コロイドが細胞受容体と相互作用をすることができ、細胞の特定の集団へのインターナリゼーションを受けることができる、項目６に記載の方法。
【００２１】
（項目１０） 多糖類がアラビノガラクタンであり、細胞が肝細胞である、項目９に記載の方法。
【００２２】
（項目１１） コロイドの血漿クリアランスがアシアログリコプロテインにより阻害される、項目９に記載の方法。
【００２３】
（項目１２） 多糖類がデキストランである、項目６に記載の方法。
【００２４】
（項目１３） コロイドの血漿半減期が約２０分より長い、項目１２に記載の方法。
【００２５】
（項目１４） 多糖類がデキストランであり、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約１０：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドには、酸化鉄の単一の結晶から実質的に成る核が含まれる、項目７に記載の方法。
【００２６】
（項目１５） 多糖類がデキストランであり、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約４：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドには、酸化鉄の１乃至４の結晶から実質的に成る核が含まれる、項目７に記載の方法。
【００２７】
（項目１６） コロイドがＭＲ造影剤である、項目５に記載の方法。
【００２８】
（項目１７） ポリマーが多糖類である、項目１６に記載の方法。
【００２９】
（項目１８） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目１７に記載の方法。
【００３０】
（項目１９） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類に、抗体、蛋白質、ペプチド、ステロイド及び結合蛋白質から成る群から選ばれる組成物を結合させる工程
をさらに含む、項目６に記載の方法。
【００３１】
（項目２０） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）ポリマーを架橋する工程
をさらに含む、項目５に記載の方法。
【００３２】
（項目２１） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類を架橋する工程
をさらに含む、項目６に記載の方法。
【００３３】
（項目２２） 多糖類がデキストランであり、デキストランを架橋する工程が、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて行われる、項目２１に記載の方法。
【００３４】
（項目２３） ポリマーが超常磁性金属酸化物を被覆するように、超常磁性金属酸化物にポリマーを結合させる工程を含む、コロイドの超常磁性金属酸化物の血漿半減期を延長させる方法。
【００３５】
（項目２４） ポリマーが多糖類である、項目２３に記載の方法。
【００３６】
（項目２５） ポリマーを架橋することをさらに含む、項目２３に記載の方法。
【００３７】
（項目２６） 多糖類を架橋することをさらに含む、項目２４に記載の方法。
【００３８】
（項目２７） 多糖類がデキストランであり、デキストランが、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて架橋される、項目２６に記載の方法。
【００３９】
（項目２８） 超常磁性金属酸化物がＭＲ造影剤である、項目２４に記載の方法。
【００４０】
（項目２９） 多糖類がデキストランである、項目２４に記載の方法。
【００４１】
（項目３０） デキストランで被覆された超常磁性金属酸化物が、約２０分より長い血漿半減期を有する、項目２９に記載の方法。
【００４２】
（項目３１） （ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して、ポリマーで被覆された超常磁性の金属酸化物を得る工程
を含む、項目２３に記載の方法。
【００４３】
（項目３２） ポリマーが多糖類である、項目３１に記載の方法。
【００４４】
（項目３３） 工程（ｉｖ）の後に、（ｖ）ポリマーを架橋する工程をさらに含む、項目３１に記載の方法。
【００４５】
（項目３４） 工程（ｉｖ）の後に、（ｖ）多糖類を架橋する工程をさらに含む、項目３２に記載の方法。
【００４６】
（項目３５） 多糖類がデキストランであり、デキストランを架橋する工程が、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて行われる、項目３４に記載の方法。
【００４７】
（項目３６） コロイド超常磁性金属酸化物かＭＲ造影剤である、項目３２に記載の方法。
【００４８】
（項目３７） 多糖類がデキストランである、項目３２に記載の方法。
【００４９】
（項目３８） デキストランで被覆された超常磁性金属酸化物が、約２０分より長い血漿半減期を有する、項目３７に記載の方法。
【００５０】
（項目３９） 有効量の、生理的に容認される担体中に分散された均質な超常磁性金属酸化物粒子を含有するコロイドを使用することによって、ヒト又は動物の被験者の器官又は組織の向上した生体内ＭＲ像を得る造影剤を製造するための改良された方法であって、ここで、ポリマーが超常磁性金属酸化物粒子を被覆し、そして前記ポリマー被覆がオプソニン化をブロックするように、超常磁性金属酸化物粒子にポリマーを結合させることにより、前記コロイドが合成される、方法。
【００５１】
（項目４０） ポリマーが多糖類である、項目３９に記載の方法。
【００５２】
（項目４１） ポリマーを架橋する工程をさらに含む、項目３９に記載の方法。
【００５３】
（項目４２） 多糖類を架橋する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
【００５４】
（項目４３） 多糖類がデキストランであり、デキストランが、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて架橋される、項目４２に記載の方法。
【００５５】
（項目４４） 多糖類がデキストランである、項目４０に記載の方法。
【００５６】
（項目４５） コロイドが約２０分より長い血漿半減期を有する、項目４４に記載の方法。
【００５７】
（項目４６） コロイドの合成が、
（ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を、塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して、均質な超常磁性の金属酸化物コロイドを得る工程
を含む、項目３９に記載の方法。
【００５８】
（項目４７） ポリマーが多糖類である、項目４６に記載の方法。
【００５９】
（項目４８） 多糖類がデキストランである、項目４７に記載の方法。
【００６０】
（項目４９） 工程（ｉ）において与えられる酸性溶液には、
（ａ）第二鉄塩、
（ｂ）第一鉄塩及び
（ｃ）第一鉄塩及び第二鉄塩
から成る群から選ばれる金属塩が含まれ、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約１０：１であり、工程（ｉｖ）において得られたコロイドは、酸化鉄の単一の結晶から実質的に成る核を含む超常磁性酸化鉄コロイドである、項目４８に記載の方法。
【００６１】
（項目５０） 工程（ｉ）において与えられる酸性溶液には、
（ａ）第二鉄塩、
（ｂ）第一鉄塩及び
（ｃ）第一鉄塩及び第二鉄塩
から成る群から選ばれる金属塩が含まれ、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約４：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドは、酸化鉄の１乃至４の結晶から実質的に成る核を含む、超常磁性の酸化鉄コロイドである、項目４８に記載の方法。
【００６２】
（項目５１） コロイドが約２０分より長い血漿半減期を有する、項目４８に記載の方法。
【００６３】
（項目５２） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）ポリマーを架橋する工程
をさらに含む、項目４６に記載の方法。
【００６４】
（項目５３） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類を架橋する工程を
さらに含む、項目４７に記載の方法。
【００６５】
（項目５４） 多糖類がデキストランであり、デキストランを架橋する工程が、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて行われる、項目５３に記載の方法。
【００６６】
（項目５５） ポリマーが超常磁性金属酸化物を被覆するように、ポリマーで結合された超常磁性金属酸化物を含む、超常磁性金属酸化物コロイド。
【００６７】
（項目５６） ポリマーが多糖類である、項目５５に記載のコロイド。
【００６８】
（項目５７） ポリマーが架橋される、項目５５に記載のコロイド。
【００６９】
（項目５８） 多糖類が架橋される、項目５６に記載のコロイド。
【００７０】
（項目５９） 多糖類がデキストランであり、デキストランが、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて架橋される、項目５８に記載のコロイド。
【００７１】
（項目６０） （ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を、塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して、超常磁性の金属酸化物コロイドを得る工程
により、コロイドが合成される、項目５５に記載のコロイド。
【００７２】
（項目６１） ポリマーが多糖類である、項目６０に記載のコロイド。
【００７３】
（項目６２） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目６１に記載のコロイド。
【００７４】
（項目６３） 工程（ｉｉ）が、約０℃乃至約１２℃に溶液を冷却する工程を含み、
工程（ｉｖ）が、約６０℃乃至約１００℃に、約３０分以上、溶液を加熱して、超常磁性金属酸化物コロイドを得る工程を含む、項目６０に記載のコロイド。
【００７５】
（項目６４） ポリマーが多糖類である、項目６３に記載のコロイド。
【００７６】
（項目６５） 工程（ｉ）において与えられた酸性溶液には、
（ａ）第二鉄塩、
（ｂ）第一鉄塩及び
（ｃ）第一鉄塩及び第二鉄塩
から成る群から選ばれる金属塩が含まれ、
工程（ｉｖ）において、超常磁性酸化鉄コロイドが得られる、項目６４に記載のコ
ロイド。
【００７７】
（項目６６） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目６５に記載のコロイド。
【００７８】
（項目６７） コロイドが細胞受容体と相互作用をすることができ、細胞の特定の集団へのインターナリゼーションを受けることができる、項目６４に記載のコロイド。
【００７９】
（項目６８） 多糖類がアラビノガラクタンであり、細胞が肝細胞である、項目６７に記載のコロイド。
【００８０】
（項目６９） コロイドの血漿クリアランスがアシアログリコプロテインにより阻害される、項目６７に記載のコロイド。
【００８１】
（項目７０） 多糖類がデキストランである、項目６４に記載のコロイド。
【００８２】
（項目７１） コロイドが、約２０分より長い血漿半減期を有する、項目７０に記載のコロイド。
【００８３】
（項目７２） 多糖類がデキストランであり、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約１０：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドには、酸化鉄の単一の結晶から実質的に成る核が含まれる、項目６５に記載のコロイド。
【００８４】
（項目７３） 多糖類がデキストランであり、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約４：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドには、酸化鉄の１乃至４の結晶から実質的に成る核が含まれる、項目６５に記載のコロイド。
【００８５】
（項目７４） コロイドがＭＲ造影剤である、項目６３に記載のコロイド。
【００８６】
（項目７５） ポリマーが多糖類である、項目７４に記載のコロイド。
【００８７】
（項目７６） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目７５に記載のコロイド。
【００８８】
（項目７７） コロイドの合成が、工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類に、抗体、蛋白質、ペプチド、ステロイド及び結合蛋白質から成る群から選ばれる組成物を結合させる工程
をさらに含む、項目６４記載のコロイド。
【００８９】
（項目７８） コロイドの合成が、工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）ポリマーを架橋する工程
をさらに含む、項目６３に記載のコロイド。
【００９０】
（項目７９） コロイドの合成が、工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類を架橋する工程
をさらに含む、項目６４に記載のコロイド。
【００９１】
（項目８０） 多糖類がデキストランであり、デキストランが、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて架橋される、項目７９に記載のコロイド。
【００９２】
本発明は、ポリマーで覆われた超常磁性金属酸化物を含有するコロイドの合成の方法を提供する。本発明の好ましい態様によれば、金属塩及びポリマーの酸性溶液を冷却し、次に塩基の冷溶液の制御された添加により中和し、次に熱を用いることにより、均質な超常磁性金属酸化物コロイドに変換する。本発明の他の好ましい態様では、ポリマーは多糖類である。本発明の１つの態様では、多糖類及び金属塩の酸性溶液を約０℃乃至約１２℃に冷却する。次に、冷却した溶液を、約０℃乃至１２℃に冷却した塩基の制御された添加により中和する。得られた溶液を次に約６０℃乃至約１００℃に約３０分以上加熱して、均質な超常磁性金属酸化物コロイドを生成させる。本発明により用いられる塩基には、水酸化アンモニウム及び炭酸ナトリウムが含まれる。本発明の他の態様では、多糖類はデキストランでありそして金属塩は第一鉄塩及び第二鉄塩であり、それらは本発明の方法により、血漿の延長された半減期を有する超常磁性酸化鉄コロイドを生成する。
【００９３】
本発明の先に述べた特徴は、図面とともに下記の詳細な記載を参照することにより容易に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９４】
（特定の態様の詳細な説明）
（Ａ．総論）
本発明は、ポリマーで覆われた超常磁性酸化鉄を含有するコロイドの合成の方法を提供する。本発明の方法によれば、金属塩及びポリマーの酸性溶液を用意し、冷却し、次に塩基の冷溶液の制御された添加により中和し、弱磁性又は非磁性のゲルを生成し、次に熱を用いることによりそれを均質な超常磁性金属酸化物コロイドに変換する。本発明の前記の方法は、冷ゲル化法とよばれる。本発明の好ましい態様では、ポリマーは多糖類である。本発明の１つの態様では、多糖類及び金属塩の酸性溶液を約０℃乃至約１２℃に冷却する。次に冷却された溶液を、約０℃乃至約１２℃に冷却された塩基の制御された添加により中和し、非磁性又は弱磁性ゲルを生成する。次に、得られたゲルを約６０℃乃至約１００℃に約３０分間以上加熱し、強磁性又は超常磁性の均質な金属酸化物コロイドを生成する。本発明の好ましい態様では、用いられる塩基には、水酸化アンモニウム及び炭酸ナトリウムが含まれる。本発明の他の態様では、多糖類はデキストランであり、金属塩は第一鉄塩及び第二鉄塩であり、それらは本発明の方法により延長された血漿半減期を有する超常磁性酸化鉄コロイドを生成する。
【００９５】
本明細書及び請求の範囲で用いられる用語「コロイド」には、約２２０ｎｍ未満のサイズを有する高分子又は粒子が含まれる。本発明のコロイドは、先に記載した物質と比較して実質的に改良された均質性を有する。本発明のコロイドがゲル除外（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー（図１乃至３）により単一の良好に画定されたピークを示す事実から本発明のコロイドの均質性は明らかである。一方、従来の方法により生成されたコロイド、ＡＭＩ−２５は、５ｎｍもの小さい粒度及び数百ナノメーターもの大きさの粒度から生じる２つのピークを形成する（図４）。
【００９６】
本発明の方法は、サイズは、いくらかサイズ測定に用いる技術にもよるが、種々のサイズのコロイドを生成する。ゲル濾過により測定されたれたサイズ（図１乃至４）は、溶液中のポリマー及び金属酸化物結晶の複合体のために得られるサイズ又は流体力学的サイズ（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｚｅ）である。流体力学的サイズは、粒子当りの鉄結晶の数及び被覆する多糖類により占められる容積に非常に依存する（粒子構造の略図のための図６を参照）。ゲル濾過により測定されるサイズは、電子が密な超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）核のみが可視化される、ほとんどの電子鏡検法技術により見られるサイズよりも大きい。
【００９７】
本発明の方法は、種々のサイズの均質なコロイド、すなわちコロイド粒子当りの酸化鉄結晶の数を変化させることにより成るコロイドを生じるように調整される。実施例１により生成されたコロイドは、存在する最も大きい不定型のコロイド粒子でさえ含む約１０乃至２０ｎｍの流体力学的粒度サイズを有する。１０乃至２０ｎｍの数字は流体力学的サイズであるのでそして、実施例１における成分超常磁性酸化鉄結晶のサイズは約６ｎｍであるので、そのコロイドは、粒子当り１つの結晶を有する粒子から大部分できている。従って、実施例１からのコロイドは非常に良好に分散、すなわち実質的に単分散された酸化鉄である。他方、実施例２により生成されたコロイドは、コロイド粒子当りのより多数の結晶を組み込むことにより、より大きなサイズを得る（デキストランＴ−１０は、実施例１及び２において被覆する多糖類として用いられ、実施例１及び２により得られる粒度における差を説明するものではない）。
【００９８】
本発明により生成される種々のサイズのコロイド粒子の略図を図６に示す。Ｔ−１０デキストランと結合した単分散された酸化鉄結晶を図６Ａに示す。これは、実施例１に記載されたような合成から生じる典型的な粒子である。デキストランＴ−１０と結合された１群の少数の酸化鉄結晶を図６Ｂに示す。これは、実施例２のような合成から得られる普通のコロイド粒子である。
【００９９】
本発明の方法は調整され、約３００ｋｄ（約５ｎｍ）以上又は最大約１０，０００ｋｄ（１００−２００ｎｍ）までの流体学的サイズを有する均質なコロイドを生成させる。特に、合成のために存在させる鉄塩の量に関連して多糖類の量を増加させることによりコロイドのサイズは低減する。低いサイズの限界では、単分散された、多糖類で覆われた超常磁性酸化鉄コロイドの純粋な調製物質が得られる。上のサイズ限界では、超常磁性酸化鉄結晶の凝結体が生成されるが、その凝結体は狭いサイズ範囲で変化する。この狭いサイズ範囲により、コロイドが濾過滅菌されるのが可能になる。
【０１００】
デキストランをその方法に用いる場合、注入後、長い血漿半減期を有するコロイドを得て、そのコロイドは、ＭＲ造影剤として用いられ得る。ＭＲ造影剤として用いられる、よりよく記載されたコロイド及び粒子のいくつかの血漿半減期及びサイズを、本発明により生成されたものと表１において比較した。ある場合では、血液半減期における直接の量的データーは与えられなかったが、一般的に短い血液半減期が肝臓及び脾臓における粒子の迅速な蓄積を示すデーターから推断される。モルデイ（Ｍｏｌｄａｙ）法により合成された粒子の場合、注入されて２時間後、注入された鉄の２０％のみが血液中に残っており、短い血漿半減期を意味している。［ポウリクエン（Ｐｏｕｌｉｑｕｅｎ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｉｍａｇ．、７巻（１９８９年）、６１９−６２７頁の図３を参照］。一方、本発明の、デキストランで覆われた超常磁性酸化鉄の血漿半減期は、１００分より長かった。
【０１０１】
本発明の冷ゲル化法にデキストランが用いられるとき、超常磁性酸化鉄の表面は、コロイドの血漿半減期を延長するようにデキストランで覆われる。デキストランの血漿半減期を延長する能力により、本発明のデキストランで覆われたコロイドはデキストランを含む前記の磁性物質から区別される（表２参照）。本発明のデキストランで覆われたコロイドを他の物質と区別するための試験としてこの観察が用いられる（下記参照）。デキストランでの被覆が、注入された酸化鉄の血漿半減期を延長させる生理学的機構は下記の通りである。
【０１０２】
注入後、オプソニンと呼ばれる血中の蛋白質が酸化鉄の表面を被覆する又は沈積するので、前記の超常磁性酸化鉄コロイド（同様に非磁性粒子も）は、迅速にクリアーされる。オプソニン被覆は、非免疫オプソニン化と呼ばれる方法においてＲＥＳの食細胞によるクリアランスのためのコロイドを指定する。非免疫オプソニン化及びそれに続く食作用は、ＲＥＳにより種々の粒子及びコロイドがクリアーされる機構である。主な血漿オプソニンはフィブロネクチンとして知られる蛋白質である［Ｅ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ及びＪ．Ａ．Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄによる“Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ，Ｂｉｏ１ｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｉ．Ａｒｉａｓ，Ｈ．Ｐｏｐｐｅｒ，Ｄ．Ｓｃｈａｔｅｒ 及びＤ．Ａ．Ｓｃｈａｆｒｉｔｚ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク）（１９８２年）５１０−５１２頁］。
【０１０３】
本発明者らにより、冷ゲル化法の一般的な特徴は、酸化鉄の多糖類被覆が注入後の薬物動態を決定することができることが見出された。デキストランの場合、被覆をすることにより血漿半減期が延長される（表２）。アラビノガラクタンが冷ゲル化法においてデキストランに代わるとき（実施例３）、多糖類被覆として、多糖類が注入後に結果として生じる薬物動態を決定するのに役立つ。アラビノガラクタンが肝細胞に見出だされるアシアログリコプロテイン受容体により認識されるので、アラビノガラクタンで被覆された超常磁性酸化鉄は血液から除去される。アラビノガラクタンで被覆されたコロイドは１０分未満の血中半減期を有し、肝細胞を有する唯一の器官、肝臓において見出だされる。一方、デキストランで被覆されたコロイドは１００分より長い血中半減期（表１）を有し、肝臓と同様に脾臓においても見出だされる。
【０１０４】
【表１】
本発明者らは、コロイドがデキストランで被覆されているか否かの試験はコロイドの熱応力（ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ）に対する応答により与えられることを見出だした。本発明の超常磁性酸化鉄コロイドは熱応力を加えた場合、コロイドの大きさは変わらないが、デキストランは酸化鉄の表面から分離する。デキストラン分離は、コロイドとともに存在する透析できる低分子量のデキストランの量が増加する（表３参照）ことにより直接見出だされる。デキストランの超常磁性酸化鉄の表面からの分離の機能的結果は、血漿半減期の低減である。表２には、デキストランで被覆されたコロイド（本発明の実施例１及び実施例２）及び先行技術である超常磁性コロイド（ＡＭＩ−２５）を５乃至５０ｍｇ／ｍｌの鉄濃度、５ｍＭのクエン酸塩及び３００ｍＭのマンニトール中で、ｐＨ８で加熱（１２１℃、３０分間）した。ＡＭＩ−２５のクリアランスは迅速で熱応力によっても変化しないことが見出だされた。ＡＭＩ−２５はデキストランで被覆されておらず、酸化鉄がオプソニンと反応し迅速な血液クリアランス結果を示すので熱応力の前にも後にもこの結果が起こる。一方、本発明の、デキストランで被覆されたコロイドのクリアランスは通常ゆっくりであり、熱応力により非常に増大する。この結果は、それらの物質のデキストラン被覆がオプソニン化を防ぎ、熱応力により表面から除去されるか又は分離されるので起こる。血漿半減期を延長することにおけるデキストランの役割の他の証拠は、加熱処理により通常生じるデキストラン分離が架橋によりブロックされるときに与えられる（表３参照）。
【０１０５】
このように、デキストラン又は他の多糖類又は他のポリマーと関連して本明細書及び請求の範囲で用いられている用語「被覆された」又は「被覆する」は、ポリマーがオプソニン化をブロックし、酸化鉄の血漿半減期を増加させるようにデキストラン又は他のポリマーが超常磁性金属酸化物の表面に結合していることを意味する（ポリマーがそれ自体、細胞受容体により認識され、受容体媒介エンドサイトーシスにより金属酸化物がインターナリゼーションにより細胞内に取り込まれる場合を除いて）。デキストランを冷ゲル化法において多糖類として用いた場合、得られるコロイドは、特有の表面を有し、すなわち、デキストランで被覆され、そして特有の機能すなわち、長血漿半減期を有する。
【０１０６】
他の態様では、本発明のコロイドは、多糖類の架橋をもたらす工程により安定化される。架橋において、２つ以上の多糖類分子と酸化鉄表面で反応する物質でコロイドを処理する。下記で説明するように、架橋は、多糖類と酸化鉄との間の、より堅固な結合をもたらす。
【０１０７】
グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ無水物）のような、１つより多い反応中心を有する多くの物質を用いることができる。生物学的分子の固定化のために多糖類粒子を活性化するために用いられる物質は、しばしば、かなりの程度まで架橋し、用いられ得る。このタイプの物質には臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンが含まれる。好ましい架橋剤はエピクロロヒドリンである。実施例１により生成された、デキストランで被覆されたコロイドは実施例４ではエピクロロヒドリンで架橋される。
【０１０８】
コロイドを熱応力に付したときに、架橋の安定化効果が示される（表３）。架橋効果を（ｉ）熱により誘導されるデキストランの酸化鉄の表面からの分離をブロックする架橋の能力及び（ｉｉ）熱により誘導される血漿半減期の低減をブロックする架橋の能力として測定された。
【０１０９】
実施例４、ｐＨ８の２５ｍＭのクエン酸ナトリウム中１１ｍｇ／ｍｌのＦｅからのコロイドに熱応力（１２１℃で３０分間）を加えた。デキストランのコロイドとの結合は、１００ｋｄのカットオフを有するミクロコンセントレーター限外濾過膜［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチュセッツ州Ｄｅｎｖｅｒｓ）を通過するデキストランとして測定される。遊離のデキストランの百分率が、限外濾過前のコロイドのデキストラン濃度（遊離の及び結合された画分が一緒にとられる）により割られた遊離のデキストランの濃度である。
【０１１０】
非架橋コロイドでは、総デキストランの５．６から２８％への遊離デキストランの増加により明らかなように、熱応力は、酸化鉄の表面からデキストランを分離させる。架橋されたコロイドでは総デキストランの５．６％からわずか８％への遊離デキストランの増加が得られた。このことは、エピクロロヒドリン処理はデキストランと酸化鉄との間の、より堅固な結合をもたらすことを示す。熱応力を加えたときに、架橋されたコロイドは血漿半減期の低下を示さない。
【０１１１】
それらの結果は、架橋は、熱で誘導されたデキストラン分離を妨げ、血漿半減期において関連する降下を妨げることを示している。架橋のデキストラン分離及び血漿半減期の降下に対する能力はさらに、デキストランは酸化鉄の表面を被覆し、非免疫オプソニン化を妨げそして血漿半減期を延長するという見解を指示するものである。
【０１１２】
本発明のコロイドはＭＲ造影剤として又は、細胞の磁性分画（又は分類）、免疫学的検定用途、遺伝子検定用途及び磁性的ターゲットによる薬物デリバリーを含むが、それらには限定されない他の用途に用いられ得る。架橋されたコロイドは、その改良された安定性のためにそして改質されたデキストランの代謝及び毒性を研究する必要がないので、特に、非経口用途（例えば細胞分類）に良好に適している。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
【表３】
（Ｂ．冷ゲル化法：一般的方法）
本発明の好ましい態様による冷ゲル化法による超常磁性酸化鉄の合成は２つの工程を含む。それらは、
（ｉ）約０℃乃至約１２℃での鉄塩を塩基により中和し、弱磁性の又は常磁性のスラリー又はゲルを形成する工程、続いて
（ｉｉ）加熱して常磁性ゲルを超常磁性コロイドに変換する工程
である。工程（ｉ）における常磁性スラリーの形成は冷ゲル化工程の独特の特徴である。形成されるスラリーを、組み込まれた多量の常磁性鉄のゆえに「常磁性」と名付けられたが、外部の手で持った磁石に対しての引き付けのような認識できる磁性特性は示さない。
【０１１５】
冷ゲル化法の好ましい態様では、第二鉄塩及び第一鉄塩の混合物及び多糖類を水に溶解させる。その混合物を約１２℃未満、一般的に２乃至４℃に冷却させる。塩基をゆっくりと添加し、それによって、イオンの鉄が酸化鉄の緑色のゲル又はスラリーになる。水酸化アンモニウム及び炭酸ナトリウムは好ましい塩基である。酸化鉄が冷却中に発現するので、他により先に用いられたものとは異なる条件下で酸化鉄は形成する。典型的には、加熱工程は、常磁性スラリーを約６０℃乃至約９０℃に少なくとも約０．５時間温度を上げることに関する。加熱中に、常磁性のスラリーは、緑色の弱磁性スラリーから黒色の強磁性コロイドに変換される。
【０１１６】
加熱工程後、その混合物はある割合で（ｉ）多糖類で被覆された超常磁性酸化鉄コロイド；（ｉｉ）多糖類；（ｉｉｉ）わずかに可溶性量のイオン鉄及びＮＨ４Ｃｌを含有する。次にその混合物を分画工程に付し、すべての高分子量のコロイド鉄（＞１００ｋｄ又はキロダルトン）を低分子量の多糖類、イオン鉄、アンモニア及び塩化物イオン（＜１００ｋｄ）から分離させる。
【０１１７】
冷ゲル化法は、異なる種類の反応器において達成される。そのうちの１つを図５に示す。ポンプ（７）を用いて塩基（５）を、管（６）を通して攪拌機（８）及び、鉄塩及び多糖類（４）の溶液を含有するジャケット付き攪拌された反応容器に添加することにより中和が達成される。入口（１）から反応器（３）のジャケットを通り出口（２）に流れる冷水により、温度を約０℃乃至約１２℃に、好ましくは２−４℃に維持する。ゲル化工程の後にジャケットの水を約８０℃乃至約１００℃に上げることによって加熱を行なう。その結果、非磁性スラリーの温度を約７０℃乃至約８０℃まで約１時間に亘り、上げる。この工程中に、高磁性又は超常磁性の均質なコロイドが生成される。管（９）により窒素をフラッシュすることにより窒素雰囲気を維持する。
【０１１８】
鉄塩及びデキストランを含有する溶液を２２０ｎｍのフィルターを通過させ、粒状物質を除去し、得られたコロイドのバイオバーデン（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を低減させる。付加的な濾過工程をその工程中に行うことができ、例えば、限外濾過が過剰の多糖類を除去する前に行うことができる。それによりさらに、バイオバーデンが制限され、エンドトキシンを有する最終的なコロイドの有り得る不純物を低減させる。低温中、中和後すぐに形成された弱磁性ゲル又はスラリーは濾過されない。
【０１１９】
適する条件の選択によって、冷ゲル化法により、異なるサイズの均質なコロイドが生成される。特に重要な条件には、３つの反応体（すなわち、第二鉄イオン、第一鉄イオン及び多糖類）の比及び全体の濃度（すなわち、添加された水の量）が含まれる。実施例１では、均質な、６００乃至９００ｋｄ（約１０乃至２０ｎｍ）の、デキストランに被覆されたコロイドが生成される（クロマトグラムについては、図１を参照）。実施例２では均質な、約１，０００乃至１，５００ｋｄ（約３０乃至５０ｎｍ）の、デキストランで被覆されたコロイドが生成される（クロマトグラムについては、図２を参照）。実施例３では、均質な、実施例２とおよそ同じサイズのアラビノガラクタンで被覆されたコロイドが生成される（図３）。比較のためにＡＭＩ−２５、従来法で生成された不均質コロイドのクロマトグラムを図４において示す。
【０１２０】
実施例１及び２により生成されたコロイドは、その血漿半減期を短縮する熱応力の能力により示されるようにデキストランで被覆されている（表２）。アラビノガラクタンは肝細胞のアシアログリコプロテイン受容体により認識されるので、実施例３により生成される、アラビノガラクタンで被覆されたコロイドは非常に短期の血漿半減期を有する。この受容体の作用により血漿から迅速にクリアーされる。
【０１２１】
再生できるコロイドの生成及び高度に磁性のコロイドの生成には、酸素の第一鉄イオンとの反応を最小にしなくてはならなく、制御されなくてはならない。酸素暴露を制御することが不十分であると第一鉄イオンを第二鉄イオンへの制御されない酸化をもたらし得て、それにより、得られるコロイドの磁性特性を低減し得る。ジャケット付きの反応器（図５）を被覆し、酸素がない気体、好ましくは窒素でパージすることにより酸素の利用性を最小にする。１つの態様では、塩化第二鉄とデキストランの溶液を１０−２４時間窒素でパージすることによって酸素含有率を最小にする。その溶液を反応器にいれ、４℃における水を反応器のジャケット中に流しながら攪拌する。これにより、ジャケットの水の温度において酸素がない溶液がもたらされる。これに、固体形の第一鉄塩を添加し、中和の直前に溶解させる。窒素パージを加熱工程中に行なうが、水酸化アンモニウムのような揮発性の塩基の添加中は除かれる。中和及び加熱工程後、酸素暴露及び次の酸化は、下記のように、コロイドについてはほとんど影響力はない。
【０１２２】
（Ｃ．代替及び置換）
一連の置換及び代替は本発明の範囲内及び教示内である。そのいくつかを以下に示す。
【０１２３】
図５に示された回分式の反応器の代わりとして、一方における冷塩基と他方における鉄塩とデキストランの冷溶液との間の混合を連続式反応器において行う。２つの溝ポンプが各溶液を引き上げて次に「Ｙ」型管の接合場所で混合させる。得られた常磁性スラリー（冷ゲル）を２つの方法の１つにおいてそれを回収することにより加熱され得る。図５に示したようにジャケット付き反応器において回収され得るか又は約９５℃における水により囲まれたコイルを通して溶液をポンプで注入することによって回収され得る。加熱コイルが用いられる場合、その加熱コイルは、生成物が加熱コイルの出口を出る前に、少なくとも約３０分間常磁性スラリーを加熱するのに十分に長くなければならない。
【０１２４】
冷ゲル化法と組み合わされて用いられる多糖類には、デキストラン、アラビノガラクタン、デキストリン、ヒドロキシエチル澱粉、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランが含まれる。冷ゲル化法の要件に合えば（最近理解されているように）、多糖類以外のポリマーが用いられ得る。ポリマーは、溶液において第二鉄イオンを保つために求められるｐＨ３より低い酸環境に対して安定でなければならなく、ポリマーは加熱工程の応力を耐えなければならなく、塩基添加における酸化鉄の形成を妨げる、第一鉄イオン又は第二鉄イオンを結合してはならない。ポリマーは又、酸化鉄表面に吸着されなければならない。
【０１２５】
鉄以外の金属を、それらを中和工程の前に塩として添加することによって、コロイドに組み込まなければならない。特に、ＣＯ２＋又はＭｎ２＋が部分的に又は完全にＦｅ２＋に置換し得る。鉄のように、それらの金属は生物的機能と鉱物的毒性を有する。一水和物塩の２６ｗ／ｗ％の溶液として調製される炭酸ナトリウムが水酸化アンモニウムの代わりに用いられ得る。
【０１２６】
遊離の多糖類を多糖類が被覆された超常磁性酸化鉄コロイドから分離するために限外濾過が用いられる。限外濾過膜のカットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）は、濾液における多糖類が除去され、多糖類で被覆された超常磁性コロイドは保有されるようにされなくてはならない。実施例で用いられる多糖類のためには、１００ｋｄ又は３００ｋｄのカットオフを有する限外濾過膜が満足される。限外濾過がこの分離工程のための好ましい技術であるが、他の実際的な方法には遠心分離及びゲル透過クロマトグラフィーが含まれる。
【０１２７】
非磁性スラリーから均質な超常磁性酸化鉄コロイドを形成させる加熱工程の後に、第一鉄塩が磁鉄鉱又はγ酸化第二鉄タイプの結晶内に存在する。鉄のそれらの酸化物は両方とも同様の磁性を有する。この工程の結果として、磁鉄鉱のγ酸化第二鉄への（Ｆｅ２＋からＦｅ３＋への）完全な酸化はコロイドの磁性特性をほとんど変えない。酸化は、２５−５０℃のような温度で１０乃至５０時間のインキュベーション時間、コロイドのＨ２Ｏ２のような酸化剤への暴露により達成される。得られたコロイドは、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）の茶色又は黒ではなくて、第一鉄イオン（Ｆｅ２−）を含むγ酸化第二鉄（γＦｅ２Ｏ３）の赤茶色である。
【０１２８】
本発明のコロイドを凍結乾燥し、それらのサイズ分布を変えずにそして粒子を形成せずに再構成する。コロイドに対する最大の安定性を得るために、デキストラン又はクエン酸ナトリウムのような補形薬を添加し得る。
【０１２９】
濾過滅菌（背景のＢで記載した）の代わりとしては、コロイドに高温（例えば、１２１℃で３０分）に付すことを含む末端滅菌（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）がある。末端滅菌は非経口製品の無菌に対する法的規制に合致する。しかし、末端滅菌は磁性コロイド及び粒子における望ましくない効果を生じることを見出だした。末端滅菌は、注入後、血圧を降下させるコロイドを生じる（米国特許出願番号０７／４８０，６７７の表１参照）。このことは、非常に望ましくない副作用であり、そのような副作用の低い発生であっても、医薬品の販売に対して求められる規定された承認が得られない。従って、本発明の方法が、増大する毒性の危険がなく滅菌を行うのに重要であると考えられる。
【０１３０】
（Ｄ．本発明の多糖類で被覆されたコロイドにおける他の化学的作用）
本発明の、架橋なく（実施例１及び２を参照）又は架橋により安定化される（実施例４）、デキストランで被覆したコロイドにおいて他の化学的作用が行われ得る。両方のタイプの、デキストランで被覆されたコロイドは長期の血漿半減期を有するので、それらが保有する鉄はいくつかの抗体、蛋白質、ペプチド、ステロイド、結合蛋白質又は他の物質のデキストランへの結合により細胞又は組織へ向けられ細胞又は組織を標的にする。長期の血漿半減期は、抗原及び受容体を保持する細胞を超常磁性鉄結晶の効率のよいターゲットにさせる。蛋白質の磁性酸化鉄コロイドのデキストランへの結合が、モルデイ（Ｍｏｌｄａｙ）による米国特許第４，４５２，７７３号に記載されている。しかし、モルデイ法によって生成された酸化鉄コロイドは短期の血中半減期（前記及び表２を参照）を有する。先に説明したように、これは注入された鉄の、肝臓及び脾臓の食細胞による迅速なクリアランスのためであり、他の部位を標的にし得る鉄の量を低減させる。このように、モルデイ型酸化鉄の表面導出は、注入後の鉄が細胞を標的にするのによく適合した接近を生じない。
【実施例】
【０１３１】
（実施例１：小さなデキストランで被覆されたコロイド）
４５０ｇのデキストラン、Ｔ−１０及び３１．５６ｇ（１１６．７６ミリモル）の塩化第二鉄６水和物の０．２μで濾過された１，００５ｍｌの水溶液を２乃至４℃に冷却した。この冷却された混合物に、水に溶解し総容量を４３ｍｌにした、１２．５５ｇ（６３．１３ミリモル）の塩化第一鉄４水和物を含有する新しく調製された（１５−３０分）、０．２μ濾過された水溶液を添加した。迅速に攪拌しながら、上記の酸性溶液を２−４℃に冷却した２８−３０％の水酸化アンモニウム溶液の４５ｍｌの滴下しての添加により中和した。次に緑がかった懸濁液を７５乃至８５℃に１時間加熱間隔に亘り加熱した。その混合物を一定に攪拌しながらこの温度範囲で７５分間保った。
【０１３２】
３００ｋｄの中空の繊維カートリッジを備えた２ｌのＣＨ−２装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、マサチュセッツ州、Ｄｅｎｖｅｒｓ）での限外濾過により、過剰のデキストラン及び水酸化アンモニウムとともに塩化アンモニウムを除去した。約６回の洗浄後、溶離剤にはすべての不純物がないことがわかった。そのコロイド生成物を限外濾過（＜４０ｍｇ／ｍｌ）により濃縮し、０．２μ濾過した。得られたコロイドは、およそ１０−２０ｎｍのサイズ及び６００乃至９００ｋｄの分子量に相当するセファロース２Ｂでのゲルクロマトグラフィーにより、およそ７５０ｋｄの単一ピークを示す。このことは、均質なコロイドが生成されたことを示す（図１）。
【０１３３】
コロイドはＦｅグラム当り２５，０００×１０−６（ｃ．ｇ．ｓ）より大きい帯磁率を有し、このことは鉄が超常磁性であることを示している［帯磁率測定の詳細については、ジョセフソン（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｉｍａｇ．、８巻（１９９０年）、６３７−６４６頁を参照。常磁性鉄は同様の単位において５，０００未満の帯磁率を有する。］。コロイドはデキストランで被覆されており、２００分より長い血漿半減期を有する（表２）。
【０１３４】
（実施例２：大きなデキストランで被覆されたコロイド）
１７０．５ｇのデキストラン、Ｔ−１０及び３１．５６ｇ（１１６．７６ミリモル）の塩化第二鉄６水和物の０．２μ濾過された水溶液３８１ｍｌを２−４℃に冷却した。その冷却混合物に、新しく調製した（１５−３０分）、４３ｍｌの総容量に溶解した１２．５５ｇ（６３．１３ミリモル）の塩化第一鉄４水和物を含有する０．２μ濾過した水溶液を添加した。迅速に攪拌しながら、上記の酸性溶液を、２−４℃に冷却した２８−３０％の水酸化アンモニウム溶液の滴下しての添加により中和した。次に緑がかった懸濁液を７５乃至８５℃に１時間加熱間隔に亘り加熱した。その混合物を一定に攪拌しながらこの温度範囲で７５分間保った。
【０１３５】
３００ｋｄの中空の繊維カートリッジを備えた２ｌのＣＨ−２装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、マサチュセッツ州、Ｄｅｎｖｅｒｓ）での限外濾過により、過剰のデキストラン及び水酸化アンモニウムとともに塩化アンモニウムを除去した。約６回の洗浄後、溶離剤にはすべての不純物がないことがわかった。そのコロイド生成物を限外濾過（＜４０ｍｇ／ｍｌ）により濃縮し、順次、８００ｎｍ、４５０ｎｍ及び２２０ｎｍと低減する多孔度のフィルターに通した。
【０１３６】
得られたコロイドは、およそ３０−５０ｎｍのサイズに相当するセファロース２Ｂでのゲルクロマトグラフィーにより、およそ１，０００乃至１，５００ｋｄの単一ピークを示し、図２に示すように均質なコロイドが生成されている。そのコロイドはＦｅグラム当り２５，０００×１０−６（ｃ．ｇ．ｓ）より大きい帯磁率を有し、このことは鉄が超常磁性であることを示している。コロイドは、１００分より長い血漿半減期を有しており、デキストランで被覆されている（表２）。
【０１３７】
（実施例３：アラビノガラクタンで被覆されたコロイド）
３２５ｇの精製されたカラマツのアラビノガラクタン及び２４．２５ｇ（８９．７２ミリモル）の塩化第二鉄６水和物の０．２μ濾過された水溶液３０００ｍｌを２−４℃に冷却した。その冷却溶液に、新しく調製した（１５−３０分）、３３．３ｍｌの総容量に水に溶解した１８．８４ｇ（８９．７２ミリモル）の塩化第一鉄４水和物を含有する０．２μ濾過した水溶液を添加した。迅速に攪拌しながら、上記の酸性溶液を、２−４℃に冷却した２８−３０％の水酸化アンモニウム溶液の４９．７ｍｌの滴下しての添加により中和した。次に得られた緑がかった懸濁液を８５乃至９０℃に１時間加熱間隔に亘り加熱した。その混合物を一定に攪拌しながらこの温度範囲で７５分間保った。
【０１３８】
３００ｋｄの中空の繊維カートリッジを備えた２ｌのＣＨ−２装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、マサチュセッツ州、Ｄｅｎｖｅｒｓ）での限外濾過により、過剰のアラビノガラクタン及び水酸化アンモニウムとともに塩化アンモニウムを除去した。約６回の洗浄後、溶離剤にはすべての不純物がないことがわかった。そのコロイド生成物を限外濾過（＜４０ｍｇ／ｍｌ）により濃縮し、順次、８００ｎｍ、４５０ｎｍ及び２２０ｎｍと低減する多孔度のフィルターに通した。
【０１３９】
得られたコロイドは、およそ３０−５０ｎｍのサイズに相当するセファロース２Ｂでのゲルクロマトグラフィーにより、およそ１，０００乃至１，５００ｋｄの単一ピークを示す。図３に示すように均質なコロイドが生成されている。そのコロイドはＦｅグラム当り２５，０００×１０−６（ｃ．ｇ．ｓ）より大きい帯磁率を有し、このことは鉄が超常磁性であることを示している。コロイドは、アシアログリコプロテイン受容体によるインターナリゼーションのために１０分より短い血漿半減期を有している（表２）。
【０１４０】
（実施例４：デキストランで被覆されたコロイドの架橋）
デキストランで被覆されたコロイドは、本質的に実施例１により調製された。ヒュームフードのなかで、２０ｍｌのコロイド（１２ミリモルのＦｅ）に１００ｍｌの５ＭのＮａＯＨ、４０ｍｌの蒸留水及び４０ｍｌのエピクロロヒドリンを添加した。いくらかのガスの放出が起こった。有機相（エピクロロヒドリン）と、デキストランで被覆されたコロイドを含有する水性相の相互作用を促進するために振盪しながらその混合物を室温で２４時間インキュベートした。コロイドを透析バッグに入れ、各２０ｌの蒸留水で２０回変えて透析することによってエピクロロヒドリンを除去した。
【０１４１】
そのコロイドのサイズ及び磁性特性は、この処理により影響されなく、実施例１で記載されたものであった。架橋されたコロイドのデキストランは、もとの、デキストランで被覆されたコロイドの表面からデキストランを分離する高温処理により分離しなかった（表３）。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、実施例１によるセファロース２Ｂゲル濾過クロマトグラムである。
【図２】図２は、実施例２によるセファロース２Ｂゲル濾過クロマトグラムである。
【図３】図３は、実施例３によるセファロース２Ｂゲル濾過クロマトグラムである。
【図４】図４は、ＡＭＩ−２５のセファロース２Ｂゲル濾過クロマトグラムである。
【図５】図５は、前記実施例の冷ゲル化法用の反応器の図である。
【図６】図６は、２つの異なるサイズのデキストランで覆われた超常磁性酸化鉄コロイドの略図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類で被覆された超常磁性酸化鉄コロイドの合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ａ．導入部）
しばしばＭＲ造影剤として用いられてきた磁性粒子又はコロイドの合成に広範な方法が用いられてきた。クレーブネス（Ｋｌａｖｅｎｅｓｓ）による米国特許第４，８６３，７１５号；オーエン（Ｏｗｅｎ）による米国特許第４，７９５，６９８号；ウイッダー（Ｗｉｄｄｅｒ）による米国特許第４，８４９，２１０号；ハセガワによる米国特許第４，１０１，４３５号；グロマン（Ｇｒｏｍａｎ）による米国特許第４，８２７，９４５号；グロマンによる米国特許第４，７７０，１８３号；メンズ（Ｍｅｎｚ），Ｅ．Ｔ．による、１９８９年８月３日に出願され、１９９０年２月２２日付けで公開された、特許協力条約下で公開された国際出願、国際公開番号ＷＯ９０／０１２９５；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）による、国際協力条約下で公開された国際出願、国際公開番号ＷＯ９０／０１８９９。これらの合成では、不均質であり、細網内皮系（ＲＥＳ）の食細胞により血液から迅速に除去される（又は取り除かれる）コロイドが生成される。これらの２つの特徴は幾つかの重要な点において望ましくない。
【０００３】
（Ｂ．不均質な磁性コロイドを用いる問題）
先に記載した磁性コロイド及び粒子は余りに大きすぎるか又はある場合では余りに多くの異なった大きさの粒子から成り、すなわち不均質を示し、２２０ｎｍのフィルターを通過させることによって滅菌されない。２２０ｎｍのフィルターによる濾過は、非経口医薬品の滅菌に対する最近の法的規制に合致する。非常に小割合のコロイド物質がフィルター上で遮られるのに十分に大きく、それによりさらなる濾過を妨げてしまう場合にはフィルター滅菌に対する不能が生じる。
【０００４】
不均質なコロイド又は広範な特性を有する多くの部分母集団から成るコロイドは、特徴づけることが難しい。不均質であることにより、製造時又は貯蔵することによる発現時に存在する小さい非定型性の集団の検索を不明瞭にする。均質コロイドでは、狭い範囲の特性を有する単一集団は、コロイドを含み、小さな非定型性の部分集団の検出を容易にする。ヒトへの注入用の超常磁性酸化鉄コロイドの製造において、コロイド物質の非定型性母集団は、毒性の潜在的源であると考えられている。その結果、そのような母集団の非存在を確認する能力は、生成されるコロイドの質を改良する。
【０００５】
不均質なコロイドの分画によって均質なコロイドが生成されてきた。例えば、不均質コロイドＡＭＩ−２５はセファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーによって分画され、異なるサイズの４つのコロイドを生じる［ルイス（Ｌｅｗｉｓ）らによる、特許協力条約下で公開の国際出願の国際公開ＵＳ８９／０３５１７の表Ｉ参照］。ＡＭＩ−２５は、米国特許第４，８２７，９４５号の実施例７・１０により生成される。それらの実験は、超常磁性酸化鉄コロイドが薬物動態学を制御する役目を果たすことができることを示した。約１００ｎｍ未満にコロイド粒子の大きさが落ちると、クリアランスは低減、すなわち、血漿半減期が増大した。
【０００６】
記載された（ハセガワ、米国特許第４，１０１，４３５号）ように生成されたデキストラン磁鉄鉱は、不均質のコロイドの他の例である。デキストラン磁鉄鉱は、２０乃至５２０ｎｍの直径、１６０ｎｍメジアンを有する粒子を含む。ＡＭＩ−２５のように、デキストラン磁鉄鉱はサイズ分画に付されており、より小さい画分では、より長い血中半減期を示す。全体の製剤は、３．５分の非常に短い血漿半減期を有し、最も小さい画分は、１９分の半減期を有し、最も大きい画分は、０．９分の半減期を有する［Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｍｅｄ．に提出されたイオンノン（Ｉｏｎｎｏｎｅ），Ｎ．Ａ．及びマギン（Ｍａｇｉｎ），Ｒ．Ｌ．らによる“Ｂｌｏｏｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ｄｘｔｒａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ ＥＳＲ Ｍｅｔｈｏｄ”；Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｍｅｄ．に提出されたマギン（Ｍａｇｉｎ），Ｒ．Ｌ．、バシック（Ｂａｃｉｃ）Ｇ．らによる“Ｄｅｘｔｒａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ ａｓ ａ Ｌｉｖｅｒ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ａｇｅｎｔ”］。
【０００７】
モリデイ（Ｍｏｌｉｄａｙ）（米国特許第４，４５２，７７３号）により記載された合成において、不均質なコロイドが生成され、大きな凝結体を遠心分離により取り出し捨てる（８欄、４０行）。不均質なコロイドからの均質なコロイドの生成は、望んでいないコロイド物質を捨てるので無駄である。そして、分画工程それ自体が、時間がかかりそして費用がかかる。
【０００８】
上記の磁性のコロイド及び粒子についての第二の問題は、注入後、細網内皮系（ＲＥＳ）の組織により迅速なクリアランスを示すことである。迅速なクリアランス（血漿短半減期）は、注入された物質が動物の血中に存在する時間を制限する。いくつかのＭＲ像影用途において、例えば、脳の異なる部分の毛細血管容量の描写において、造影は、血中の超常磁性酸化鉄の存在により増大される［ブラッドレイ（Ｂｒａｄｌｅｙ）らによる、Ｓｔｒｏｋｅ、２０巻（１９８９年）、１０３２乃至１０３６頁］。ＭＲ像を増大した造影が得られるときに、血漿長半減期は、必要なコロイドの用量を低減し、その時間を長くする。
【０００９】
血液からの従来技術の磁性コロイド又は粒子の迅速なクリアランスはＲＥＳの２つの主な組織である肝臓及び脾臓による取り込みから得られる。迅速にクリアーされた粒子では、典型的には、注入された物質の約９０％がこれらの２つの器官により血中から引き出される。従って、迅速な血液クリアランスは、食細胞以外の細胞及び肝臓及び脾臓以外の組織をターゲットにすることができ、それらの細胞及び組織に移送されることができるコロイドの量を制限する。
【００１０】
表面化学が注入後のコロイドの結果に影響を与えることができる、例えば、アラビノガラクタンを用いて作られた不均質のコロイドでの結果に影響を与えることができると報告された［ジョセフソン（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｉｍａｇ．８巻（１９９０年）、６３７−６４６頁及びメンズ（Ｍｅｎｚ），Ｅ．Ｔ．による１９８９年８月３日に出願され、１９９０年２月２２日に公開された特許協力条約による国際出願の国際公開ＷＯ９０／０１２９５の実施例６．１０．１）］。同様に、酸化鉄粒子に抗体を結合させることにより、鉄の特定の取り込みが組織に達成されることが報告された［レンショウ（Ｒｅｎｓｈａｗ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｉｍａｇ．、４巻（１９８６年）、３５１−３５７頁及びセルダン（Ｃｅｒｄａｎ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｍｅｄ．、１２巻（１９８９年）、１５１−１６３頁］。しかし、そのような調製物質はしばしば不均質であり、濾過滅菌ができなく、肝臓及び脾臓による非常に実質的な取り込みを示す。肝臓及び脾臓による取り込みによって他の組織をターゲットにすることができる鉄の量が制限される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明によって、以下が提供される。
【００１２】
（項目１） 明細書に記載され、示された発明。
【００１３】
（項目２） （ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して超常磁性の金属酸化物のコロイドを得る工程
を含む、ポリマーで被覆された超常磁性金属酸化物を含有するコロイドを合成する方法。
【００１４】
（項目３） ポリマーが多糖類である、項目２に記載された方法。
【００１５】
（項目４） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目３に記載の方法。
【００１６】
（項目５） 工程（ｉｉ）が、約０℃乃至約１２℃に溶液を冷却する工程を含み、
工程（ｉｖ）が、約６０℃乃至約１００℃に、約３０分以上、溶液を加熱して、超常磁性金属酸化物コロイドを得る工程を含む、項目２に記載の方法。
【００１７】
（項目６） ポリマーが多糖類である、項目５に記載の方法。
【００１８】
（項目７） 工程（ｉ）において与えられる酸性溶液には、
（ａ）第二鉄塩、
（ｂ）第一鉄塩及び
（ｃ）第一鉄塩及び第二鉄塩
から成る群から選ばれる金属塩が含まれ、
工程（ｉｖ）において超常磁性酸化鉄コロイドが得られる、項目６に記載の方法。
【００１９】
（項目８） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目７に記載の方法。
【００２０】
（項目９） コロイドが細胞受容体と相互作用をすることができ、細胞の特定の集団へのインターナリゼーションを受けることができる、項目６に記載の方法。
【００２１】
（項目１０） 多糖類がアラビノガラクタンであり、細胞が肝細胞である、項目９に記載の方法。
【００２２】
（項目１１） コロイドの血漿クリアランスがアシアログリコプロテインにより阻害される、項目９に記載の方法。
【００２３】
（項目１２） 多糖類がデキストランである、項目６に記載の方法。
【００２４】
（項目１３） コロイドの血漿半減期が約２０分より長い、項目１２に記載の方法。
【００２５】
（項目１４） 多糖類がデキストランであり、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約１０：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドには、酸化鉄の単一の結晶から実質的に成る核が含まれる、項目７に記載の方法。
【００２６】
（項目１５） 多糖類がデキストランであり、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約４：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドには、酸化鉄の１乃至４の結晶から実質的に成る核が含まれる、項目７に記載の方法。
【００２７】
（項目１６） コロイドがＭＲ造影剤である、項目５に記載の方法。
【００２８】
（項目１７） ポリマーが多糖類である、項目１６に記載の方法。
【００２９】
（項目１８） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目１７に記載の方法。
【００３０】
（項目１９） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類に、抗体、蛋白質、ペプチド、ステロイド及び結合蛋白質から成る群から選ばれる組成物を結合させる工程
をさらに含む、項目６に記載の方法。
【００３１】
（項目２０） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）ポリマーを架橋する工程
をさらに含む、項目５に記載の方法。
【００３２】
（項目２１） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類を架橋する工程
をさらに含む、項目６に記載の方法。
【００３３】
（項目２２） 多糖類がデキストランであり、デキストランを架橋する工程が、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて行われる、項目２１に記載の方法。
【００３４】
（項目２３） ポリマーが超常磁性金属酸化物を被覆するように、超常磁性金属酸化物にポリマーを結合させる工程を含む、コロイドの超常磁性金属酸化物の血漿半減期を延長させる方法。
【００３５】
（項目２４） ポリマーが多糖類である、項目２３に記載の方法。
【００３６】
（項目２５） ポリマーを架橋することをさらに含む、項目２３に記載の方法。
【００３７】
（項目２６） 多糖類を架橋することをさらに含む、項目２４に記載の方法。
【００３８】
（項目２７） 多糖類がデキストランであり、デキストランが、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて架橋される、項目２６に記載の方法。
【００３９】
（項目２８） 超常磁性金属酸化物がＭＲ造影剤である、項目２４に記載の方法。
【００４０】
（項目２９） 多糖類がデキストランである、項目２４に記載の方法。
【００４１】
（項目３０） デキストランで被覆された超常磁性金属酸化物が、約２０分より長い血漿半減期を有する、項目２９に記載の方法。
【００４２】
（項目３１） （ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して、ポリマーで被覆された超常磁性の金属酸化物を得る工程
を含む、項目２３に記載の方法。
【００４３】
（項目３２） ポリマーが多糖類である、項目３１に記載の方法。
【００４４】
（項目３３） 工程（ｉｖ）の後に、（ｖ）ポリマーを架橋する工程をさらに含む、項目３１に記載の方法。
【００４５】
（項目３４） 工程（ｉｖ）の後に、（ｖ）多糖類を架橋する工程をさらに含む、項目３２に記載の方法。
【００４６】
（項目３５） 多糖類がデキストランであり、デキストランを架橋する工程が、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて行われる、項目３４に記載の方法。
【００４７】
（項目３６） コロイド超常磁性金属酸化物かＭＲ造影剤である、項目３２に記載の方法。
【００４８】
（項目３７） 多糖類がデキストランである、項目３２に記載の方法。
【００４９】
（項目３８） デキストランで被覆された超常磁性金属酸化物が、約２０分より長い血漿半減期を有する、項目３７に記載の方法。
【００５０】
（項目３９） 有効量の、生理的に容認される担体中に分散された均質な超常磁性金属酸化物粒子を含有するコロイドを使用することによって、ヒト又は動物の被験者の器官又は組織の向上した生体内ＭＲ像を得る造影剤を製造するための改良された方法であって、ここで、ポリマーが超常磁性金属酸化物粒子を被覆し、そして前記ポリマー被覆がオプソニン化をブロックするように、超常磁性金属酸化物粒子にポリマーを結合させることにより、前記コロイドが合成される、方法。
【００５１】
（項目４０） ポリマーが多糖類である、項目３９に記載の方法。
【００５２】
（項目４１） ポリマーを架橋する工程をさらに含む、項目３９に記載の方法。
【００５３】
（項目４２） 多糖類を架橋する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
【００５４】
（項目４３） 多糖類がデキストランであり、デキストランが、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて架橋される、項目４２に記載の方法。
【００５５】
（項目４４） 多糖類がデキストランである、項目４０に記載の方法。
【００５６】
（項目４５） コロイドが約２０分より長い血漿半減期を有する、項目４４に記載の方法。
【００５７】
（項目４６） コロイドの合成が、
（ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を、塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して、均質な超常磁性の金属酸化物コロイドを得る工程
を含む、項目３９に記載の方法。
【００５８】
（項目４７） ポリマーが多糖類である、項目４６に記載の方法。
【００５９】
（項目４８） 多糖類がデキストランである、項目４７に記載の方法。
【００６０】
（項目４９） 工程（ｉ）において与えられる酸性溶液には、
（ａ）第二鉄塩、
（ｂ）第一鉄塩及び
（ｃ）第一鉄塩及び第二鉄塩
から成る群から選ばれる金属塩が含まれ、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約１０：１であり、工程（ｉｖ）において得られたコロイドは、酸化鉄の単一の結晶から実質的に成る核を含む超常磁性酸化鉄コロイドである、項目４８に記載の方法。
【００６１】
（項目５０） 工程（ｉ）において与えられる酸性溶液には、
（ａ）第二鉄塩、
（ｂ）第一鉄塩及び
（ｃ）第一鉄塩及び第二鉄塩
から成る群から選ばれる金属塩が含まれ、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約４：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドは、酸化鉄の１乃至４の結晶から実質的に成る核を含む、超常磁性の酸化鉄コロイドである、項目４８に記載の方法。
【００６２】
（項目５１） コロイドが約２０分より長い血漿半減期を有する、項目４８に記載の方法。
【００６３】
（項目５２） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）ポリマーを架橋する工程
をさらに含む、項目４６に記載の方法。
【００６４】
（項目５３） 工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類を架橋する工程を
さらに含む、項目４７に記載の方法。
【００６５】
（項目５４） 多糖類がデキストランであり、デキストランを架橋する工程が、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて行われる、項目５３に記載の方法。
【００６６】
（項目５５） ポリマーが超常磁性金属酸化物を被覆するように、ポリマーで結合された超常磁性金属酸化物を含む、超常磁性金属酸化物コロイド。
【００６７】
（項目５６） ポリマーが多糖類である、項目５５に記載のコロイド。
【００６８】
（項目５７） ポリマーが架橋される、項目５５に記載のコロイド。
【００６９】
（項目５８） 多糖類が架橋される、項目５６に記載のコロイド。
【００７０】
（項目５９） 多糖類がデキストランであり、デキストランが、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて架橋される、項目５８に記載のコロイド。
【００７１】
（項目６０） （ｉ）金属塩及びポリマーを含有する酸性溶液を与える工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた溶液を冷却する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた溶液を、塩基の冷溶液の制御された添加により中和する工程及び
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた溶液を加熱して、超常磁性の金属酸化物コロイドを得る工程
により、コロイドが合成される、項目５５に記載のコロイド。
【００７２】
（項目６１） ポリマーが多糖類である、項目６０に記載のコロイド。
【００７３】
（項目６２） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目６１に記載のコロイド。
【００７４】
（項目６３） 工程（ｉｉ）が、約０℃乃至約１２℃に溶液を冷却する工程を含み、
工程（ｉｖ）が、約６０℃乃至約１００℃に、約３０分以上、溶液を加熱して、超常磁性金属酸化物コロイドを得る工程を含む、項目６０に記載のコロイド。
【００７５】
（項目６４） ポリマーが多糖類である、項目６３に記載のコロイド。
【００７６】
（項目６５） 工程（ｉ）において与えられた酸性溶液には、
（ａ）第二鉄塩、
（ｂ）第一鉄塩及び
（ｃ）第一鉄塩及び第二鉄塩
から成る群から選ばれる金属塩が含まれ、
工程（ｉｖ）において、超常磁性酸化鉄コロイドが得られる、項目６４に記載のコ
ロイド。
【００７７】
（項目６６） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目６５に記載のコロイド。
【００７８】
（項目６７） コロイドが細胞受容体と相互作用をすることができ、細胞の特定の集団へのインターナリゼーションを受けることができる、項目６４に記載のコロイド。
【００７９】
（項目６８） 多糖類がアラビノガラクタンであり、細胞が肝細胞である、項目６７に記載のコロイド。
【００８０】
（項目６９） コロイドの血漿クリアランスがアシアログリコプロテインにより阻害される、項目６７に記載のコロイド。
【００８１】
（項目７０） 多糖類がデキストランである、項目６４に記載のコロイド。
【００８２】
（項目７１） コロイドが、約２０分より長い血漿半減期を有する、項目７０に記載のコロイド。
【００８３】
（項目７２） 多糖類がデキストランであり、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約１０：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドには、酸化鉄の単一の結晶から実質的に成る核が含まれる、項目６５に記載のコロイド。
【００８４】
（項目７３） 多糖類がデキストランであり、
工程（ｉ）において用いられる、デキストランの量対金属塩の量が重量で約４：１であり、
工程（ｉｖ）において得られたコロイドには、酸化鉄の１乃至４の結晶から実質的に成る核が含まれる、項目６５に記載のコロイド。
【００８５】
（項目７４） コロイドがＭＲ造影剤である、項目６３に記載のコロイド。
【００８６】
（項目７５） ポリマーが多糖類である、項目７４に記載のコロイド。
【００８７】
（項目７６） 多糖類が、アラビノガラクタン、デキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、デキストリン、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランから成る群から選ばれる、項目７５に記載のコロイド。
【００８８】
（項目７７） コロイドの合成が、工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類に、抗体、蛋白質、ペプチド、ステロイド及び結合蛋白質から成る群から選ばれる組成物を結合させる工程
をさらに含む、項目６４記載のコロイド。
【００８９】
（項目７８） コロイドの合成が、工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）ポリマーを架橋する工程
をさらに含む、項目６３に記載のコロイド。
【００９０】
（項目７９） コロイドの合成が、工程（ｉｖ）の後に、
（ｖ）多糖類を架橋する工程
をさらに含む、項目６４に記載のコロイド。
【００９１】
（項目８０） 多糖類がデキストランであり、デキストランが、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物、臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンから成る群から選ばれる架橋剤を用いて架橋される、項目７９に記載のコロイド。
【００９２】
本発明は、ポリマーで覆われた超常磁性金属酸化物を含有するコロイドの合成の方法を提供する。本発明の好ましい態様によれば、金属塩及びポリマーの酸性溶液を冷却し、次に塩基の冷溶液の制御された添加により中和し、次に熱を用いることにより、均質な超常磁性金属酸化物コロイドに変換する。本発明の他の好ましい態様では、ポリマーは多糖類である。本発明の１つの態様では、多糖類及び金属塩の酸性溶液を約０℃乃至約１２℃に冷却する。次に、冷却した溶液を、約０℃乃至１２℃に冷却した塩基の制御された添加により中和する。得られた溶液を次に約６０℃乃至約１００℃に約３０分以上加熱して、均質な超常磁性金属酸化物コロイドを生成させる。本発明により用いられる塩基には、水酸化アンモニウム及び炭酸ナトリウムが含まれる。本発明の他の態様では、多糖類はデキストランでありそして金属塩は第一鉄塩及び第二鉄塩であり、それらは本発明の方法により、血漿の延長された半減期を有する超常磁性酸化鉄コロイドを生成する。
【００９３】
本発明の先に述べた特徴は、図面とともに下記の詳細な記載を参照することにより容易に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９４】
（特定の態様の詳細な説明）
（Ａ．総論）
本発明は、ポリマーで覆われた超常磁性酸化鉄を含有するコロイドの合成の方法を提供する。本発明の方法によれば、金属塩及びポリマーの酸性溶液を用意し、冷却し、次に塩基の冷溶液の制御された添加により中和し、弱磁性又は非磁性のゲルを生成し、次に熱を用いることによりそれを均質な超常磁性金属酸化物コロイドに変換する。本発明の前記の方法は、冷ゲル化法とよばれる。本発明の好ましい態様では、ポリマーは多糖類である。本発明の１つの態様では、多糖類及び金属塩の酸性溶液を約０℃乃至約１２℃に冷却する。次に冷却された溶液を、約０℃乃至約１２℃に冷却された塩基の制御された添加により中和し、非磁性又は弱磁性ゲルを生成する。次に、得られたゲルを約６０℃乃至約１００℃に約３０分間以上加熱し、強磁性又は超常磁性の均質な金属酸化物コロイドを生成する。本発明の好ましい態様では、用いられる塩基には、水酸化アンモニウム及び炭酸ナトリウムが含まれる。本発明の他の態様では、多糖類はデキストランであり、金属塩は第一鉄塩及び第二鉄塩であり、それらは本発明の方法により延長された血漿半減期を有する超常磁性酸化鉄コロイドを生成する。
【００９５】
本明細書及び請求の範囲で用いられる用語「コロイド」には、約２２０ｎｍ未満のサイズを有する高分子又は粒子が含まれる。本発明のコロイドは、先に記載した物質と比較して実質的に改良された均質性を有する。本発明のコロイドがゲル除外（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー（図１乃至３）により単一の良好に画定されたピークを示す事実から本発明のコロイドの均質性は明らかである。一方、従来の方法により生成されたコロイド、ＡＭＩ−２５は、５ｎｍもの小さい粒度及び数百ナノメーターもの大きさの粒度から生じる２つのピークを形成する（図４）。
【００９６】
本発明の方法は、サイズは、いくらかサイズ測定に用いる技術にもよるが、種々のサイズのコロイドを生成する。ゲル濾過により測定されたれたサイズ（図１乃至４）は、溶液中のポリマー及び金属酸化物結晶の複合体のために得られるサイズ又は流体力学的サイズ（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｚｅ）である。流体力学的サイズは、粒子当りの鉄結晶の数及び被覆する多糖類により占められる容積に非常に依存する（粒子構造の略図のための図６を参照）。ゲル濾過により測定されるサイズは、電子が密な超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）核のみが可視化される、ほとんどの電子鏡検法技術により見られるサイズよりも大きい。
【００９７】
本発明の方法は、種々のサイズの均質なコロイド、すなわちコロイド粒子当りの酸化鉄結晶の数を変化させることにより成るコロイドを生じるように調整される。実施例１により生成されたコロイドは、存在する最も大きい不定型のコロイド粒子でさえ含む約１０乃至２０ｎｍの流体力学的粒度サイズを有する。１０乃至２０ｎｍの数字は流体力学的サイズであるのでそして、実施例１における成分超常磁性酸化鉄結晶のサイズは約６ｎｍであるので、そのコロイドは、粒子当り１つの結晶を有する粒子から大部分できている。従って、実施例１からのコロイドは非常に良好に分散、すなわち実質的に単分散された酸化鉄である。他方、実施例２により生成されたコロイドは、コロイド粒子当りのより多数の結晶を組み込むことにより、より大きなサイズを得る（デキストランＴ−１０は、実施例１及び２において被覆する多糖類として用いられ、実施例１及び２により得られる粒度における差を説明するものではない）。
【００９８】
本発明により生成される種々のサイズのコロイド粒子の略図を図６に示す。Ｔ−１０デキストランと結合した単分散された酸化鉄結晶を図６Ａに示す。これは、実施例１に記載されたような合成から生じる典型的な粒子である。デキストランＴ−１０と結合された１群の少数の酸化鉄結晶を図６Ｂに示す。これは、実施例２のような合成から得られる普通のコロイド粒子である。
【００９９】
本発明の方法は調整され、約３００ｋｄ（約５ｎｍ）以上又は最大約１０，０００ｋｄ（１００−２００ｎｍ）までの流体学的サイズを有する均質なコロイドを生成させる。特に、合成のために存在させる鉄塩の量に関連して多糖類の量を増加させることによりコロイドのサイズは低減する。低いサイズの限界では、単分散された、多糖類で覆われた超常磁性酸化鉄コロイドの純粋な調製物質が得られる。上のサイズ限界では、超常磁性酸化鉄結晶の凝結体が生成されるが、その凝結体は狭いサイズ範囲で変化する。この狭いサイズ範囲により、コロイドが濾過滅菌されるのが可能になる。
【０１００】
デキストランをその方法に用いる場合、注入後、長い血漿半減期を有するコロイドを得て、そのコロイドは、ＭＲ造影剤として用いられ得る。ＭＲ造影剤として用いられる、よりよく記載されたコロイド及び粒子のいくつかの血漿半減期及びサイズを、本発明により生成されたものと表１において比較した。ある場合では、血液半減期における直接の量的データーは与えられなかったが、一般的に短い血液半減期が肝臓及び脾臓における粒子の迅速な蓄積を示すデーターから推断される。モルデイ（Ｍｏｌｄａｙ）法により合成された粒子の場合、注入されて２時間後、注入された鉄の２０％のみが血液中に残っており、短い血漿半減期を意味している。［ポウリクエン（Ｐｏｕｌｉｑｕｅｎ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｉｍａｇ．、７巻（１９８９年）、６１９−６２７頁の図３を参照］。一方、本発明の、デキストランで覆われた超常磁性酸化鉄の血漿半減期は、１００分より長かった。
【０１０１】
本発明の冷ゲル化法にデキストランが用いられるとき、超常磁性酸化鉄の表面は、コロイドの血漿半減期を延長するようにデキストランで覆われる。デキストランの血漿半減期を延長する能力により、本発明のデキストランで覆われたコロイドはデキストランを含む前記の磁性物質から区別される（表２参照）。本発明のデキストランで覆われたコロイドを他の物質と区別するための試験としてこの観察が用いられる（下記参照）。デキストランでの被覆が、注入された酸化鉄の血漿半減期を延長させる生理学的機構は下記の通りである。
【０１０２】
注入後、オプソニンと呼ばれる血中の蛋白質が酸化鉄の表面を被覆する又は沈積するので、前記の超常磁性酸化鉄コロイド（同様に非磁性粒子も）は、迅速にクリアーされる。オプソニン被覆は、非免疫オプソニン化と呼ばれる方法においてＲＥＳの食細胞によるクリアランスのためのコロイドを指定する。非免疫オプソニン化及びそれに続く食作用は、ＲＥＳにより種々の粒子及びコロイドがクリアーされる機構である。主な血漿オプソニンはフィブロネクチンとして知られる蛋白質である［Ｅ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ及びＪ．Ａ．Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄによる“Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ，Ｂｉｏ１ｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｉ．Ａｒｉａｓ，Ｈ．Ｐｏｐｐｅｒ，Ｄ．Ｓｃｈａｔｅｒ 及びＤ．Ａ．Ｓｃｈａｆｒｉｔｚ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク）（１９８２年）５１０−５１２頁］。
【０１０３】
本発明者らにより、冷ゲル化法の一般的な特徴は、酸化鉄の多糖類被覆が注入後の薬物動態を決定することができることが見出された。デキストランの場合、被覆をすることにより血漿半減期が延長される（表２）。アラビノガラクタンが冷ゲル化法においてデキストランに代わるとき（実施例３）、多糖類被覆として、多糖類が注入後に結果として生じる薬物動態を決定するのに役立つ。アラビノガラクタンが肝細胞に見出だされるアシアログリコプロテイン受容体により認識されるので、アラビノガラクタンで被覆された超常磁性酸化鉄は血液から除去される。アラビノガラクタンで被覆されたコロイドは１０分未満の血中半減期を有し、肝細胞を有する唯一の器官、肝臓において見出だされる。一方、デキストランで被覆されたコロイドは１００分より長い血中半減期（表１）を有し、肝臓と同様に脾臓においても見出だされる。
【０１０４】
【表１】
本発明者らは、コロイドがデキストランで被覆されているか否かの試験はコロイドの熱応力（ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ）に対する応答により与えられることを見出だした。本発明の超常磁性酸化鉄コロイドは熱応力を加えた場合、コロイドの大きさは変わらないが、デキストランは酸化鉄の表面から分離する。デキストラン分離は、コロイドとともに存在する透析できる低分子量のデキストランの量が増加する（表３参照）ことにより直接見出だされる。デキストランの超常磁性酸化鉄の表面からの分離の機能的結果は、血漿半減期の低減である。表２には、デキストランで被覆されたコロイド（本発明の実施例１及び実施例２）及び先行技術である超常磁性コロイド（ＡＭＩ−２５）を５乃至５０ｍｇ／ｍｌの鉄濃度、５ｍＭのクエン酸塩及び３００ｍＭのマンニトール中で、ｐＨ８で加熱（１２１℃、３０分間）した。ＡＭＩ−２５のクリアランスは迅速で熱応力によっても変化しないことが見出だされた。ＡＭＩ−２５はデキストランで被覆されておらず、酸化鉄がオプソニンと反応し迅速な血液クリアランス結果を示すので熱応力の前にも後にもこの結果が起こる。一方、本発明の、デキストランで被覆されたコロイドのクリアランスは通常ゆっくりであり、熱応力により非常に増大する。この結果は、それらの物質のデキストラン被覆がオプソニン化を防ぎ、熱応力により表面から除去されるか又は分離されるので起こる。血漿半減期を延長することにおけるデキストランの役割の他の証拠は、加熱処理により通常生じるデキストラン分離が架橋によりブロックされるときに与えられる（表３参照）。
【０１０５】
このように、デキストラン又は他の多糖類又は他のポリマーと関連して本明細書及び請求の範囲で用いられている用語「被覆された」又は「被覆する」は、ポリマーがオプソニン化をブロックし、酸化鉄の血漿半減期を増加させるようにデキストラン又は他のポリマーが超常磁性金属酸化物の表面に結合していることを意味する（ポリマーがそれ自体、細胞受容体により認識され、受容体媒介エンドサイトーシスにより金属酸化物がインターナリゼーションにより細胞内に取り込まれる場合を除いて）。デキストランを冷ゲル化法において多糖類として用いた場合、得られるコロイドは、特有の表面を有し、すなわち、デキストランで被覆され、そして特有の機能すなわち、長血漿半減期を有する。
【０１０６】
他の態様では、本発明のコロイドは、多糖類の架橋をもたらす工程により安定化される。架橋において、２つ以上の多糖類分子と酸化鉄表面で反応する物質でコロイドを処理する。下記で説明するように、架橋は、多糖類と酸化鉄との間の、より堅固な結合をもたらす。
【０１０７】
グルタルアルデヒド、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ無水物）のような、１つより多い反応中心を有する多くの物質を用いることができる。生物学的分子の固定化のために多糖類粒子を活性化するために用いられる物質は、しばしば、かなりの程度まで架橋し、用いられ得る。このタイプの物質には臭化シアン、クロロ蟻酸エチル及びジビニルスルホンが含まれる。好ましい架橋剤はエピクロロヒドリンである。実施例１により生成された、デキストランで被覆されたコロイドは実施例４ではエピクロロヒドリンで架橋される。
【０１０８】
コロイドを熱応力に付したときに、架橋の安定化効果が示される（表３）。架橋効果を（ｉ）熱により誘導されるデキストランの酸化鉄の表面からの分離をブロックする架橋の能力及び（ｉｉ）熱により誘導される血漿半減期の低減をブロックする架橋の能力として測定された。
【０１０９】
実施例４、ｐＨ８の２５ｍＭのクエン酸ナトリウム中１１ｍｇ／ｍｌのＦｅからのコロイドに熱応力（１２１℃で３０分間）を加えた。デキストランのコロイドとの結合は、１００ｋｄのカットオフを有するミクロコンセントレーター限外濾過膜［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチュセッツ州Ｄｅｎｖｅｒｓ）を通過するデキストランとして測定される。遊離のデキストランの百分率が、限外濾過前のコロイドのデキストラン濃度（遊離の及び結合された画分が一緒にとられる）により割られた遊離のデキストランの濃度である。
【０１１０】
非架橋コロイドでは、総デキストランの５．６から２８％への遊離デキストランの増加により明らかなように、熱応力は、酸化鉄の表面からデキストランを分離させる。架橋されたコロイドでは総デキストランの５．６％からわずか８％への遊離デキストランの増加が得られた。このことは、エピクロロヒドリン処理はデキストランと酸化鉄との間の、より堅固な結合をもたらすことを示す。熱応力を加えたときに、架橋されたコロイドは血漿半減期の低下を示さない。
【０１１１】
それらの結果は、架橋は、熱で誘導されたデキストラン分離を妨げ、血漿半減期において関連する降下を妨げることを示している。架橋のデキストラン分離及び血漿半減期の降下に対する能力はさらに、デキストランは酸化鉄の表面を被覆し、非免疫オプソニン化を妨げそして血漿半減期を延長するという見解を指示するものである。
【０１１２】
本発明のコロイドはＭＲ造影剤として又は、細胞の磁性分画（又は分類）、免疫学的検定用途、遺伝子検定用途及び磁性的ターゲットによる薬物デリバリーを含むが、それらには限定されない他の用途に用いられ得る。架橋されたコロイドは、その改良された安定性のためにそして改質されたデキストランの代謝及び毒性を研究する必要がないので、特に、非経口用途（例えば細胞分類）に良好に適している。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
【表３】
（Ｂ．冷ゲル化法：一般的方法）
本発明の好ましい態様による冷ゲル化法による超常磁性酸化鉄の合成は２つの工程を含む。それらは、
（ｉ）約０℃乃至約１２℃での鉄塩を塩基により中和し、弱磁性の又は常磁性のスラリー又はゲルを形成する工程、続いて
（ｉｉ）加熱して常磁性ゲルを超常磁性コロイドに変換する工程
である。工程（ｉ）における常磁性スラリーの形成は冷ゲル化工程の独特の特徴である。形成されるスラリーを、組み込まれた多量の常磁性鉄のゆえに「常磁性」と名付けられたが、外部の手で持った磁石に対しての引き付けのような認識できる磁性特性は示さない。
【０１１５】
冷ゲル化法の好ましい態様では、第二鉄塩及び第一鉄塩の混合物及び多糖類を水に溶解させる。その混合物を約１２℃未満、一般的に２乃至４℃に冷却させる。塩基をゆっくりと添加し、それによって、イオンの鉄が酸化鉄の緑色のゲル又はスラリーになる。水酸化アンモニウム及び炭酸ナトリウムは好ましい塩基である。酸化鉄が冷却中に発現するので、他により先に用いられたものとは異なる条件下で酸化鉄は形成する。典型的には、加熱工程は、常磁性スラリーを約６０℃乃至約９０℃に少なくとも約０．５時間温度を上げることに関する。加熱中に、常磁性のスラリーは、緑色の弱磁性スラリーから黒色の強磁性コロイドに変換される。
【０１１６】
加熱工程後、その混合物はある割合で（ｉ）多糖類で被覆された超常磁性酸化鉄コロイド；（ｉｉ）多糖類；（ｉｉｉ）わずかに可溶性量のイオン鉄及びＮＨ４Ｃｌを含有する。次にその混合物を分画工程に付し、すべての高分子量のコロイド鉄（＞１００ｋｄ又はキロダルトン）を低分子量の多糖類、イオン鉄、アンモニア及び塩化物イオン（＜１００ｋｄ）から分離させる。
【０１１７】
冷ゲル化法は、異なる種類の反応器において達成される。そのうちの１つを図５に示す。ポンプ（７）を用いて塩基（５）を、管（６）を通して攪拌機（８）及び、鉄塩及び多糖類（４）の溶液を含有するジャケット付き攪拌された反応容器に添加することにより中和が達成される。入口（１）から反応器（３）のジャケットを通り出口（２）に流れる冷水により、温度を約０℃乃至約１２℃に、好ましくは２−４℃に維持する。ゲル化工程の後にジャケットの水を約８０℃乃至約１００℃に上げることによって加熱を行なう。その結果、非磁性スラリーの温度を約７０℃乃至約８０℃まで約１時間に亘り、上げる。この工程中に、高磁性又は超常磁性の均質なコロイドが生成される。管（９）により窒素をフラッシュすることにより窒素雰囲気を維持する。
【０１１８】
鉄塩及びデキストランを含有する溶液を２２０ｎｍのフィルターを通過させ、粒状物質を除去し、得られたコロイドのバイオバーデン（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を低減させる。付加的な濾過工程をその工程中に行うことができ、例えば、限外濾過が過剰の多糖類を除去する前に行うことができる。それによりさらに、バイオバーデンが制限され、エンドトキシンを有する最終的なコロイドの有り得る不純物を低減させる。低温中、中和後すぐに形成された弱磁性ゲル又はスラリーは濾過されない。
【０１１９】
適する条件の選択によって、冷ゲル化法により、異なるサイズの均質なコロイドが生成される。特に重要な条件には、３つの反応体（すなわち、第二鉄イオン、第一鉄イオン及び多糖類）の比及び全体の濃度（すなわち、添加された水の量）が含まれる。実施例１では、均質な、６００乃至９００ｋｄ（約１０乃至２０ｎｍ）の、デキストランに被覆されたコロイドが生成される（クロマトグラムについては、図１を参照）。実施例２では均質な、約１，０００乃至１，５００ｋｄ（約３０乃至５０ｎｍ）の、デキストランで被覆されたコロイドが生成される（クロマトグラムについては、図２を参照）。実施例３では、均質な、実施例２とおよそ同じサイズのアラビノガラクタンで被覆されたコロイドが生成される（図３）。比較のためにＡＭＩ−２５、従来法で生成された不均質コロイドのクロマトグラムを図４において示す。
【０１２０】
実施例１及び２により生成されたコロイドは、その血漿半減期を短縮する熱応力の能力により示されるようにデキストランで被覆されている（表２）。アラビノガラクタンは肝細胞のアシアログリコプロテイン受容体により認識されるので、実施例３により生成される、アラビノガラクタンで被覆されたコロイドは非常に短期の血漿半減期を有する。この受容体の作用により血漿から迅速にクリアーされる。
【０１２１】
再生できるコロイドの生成及び高度に磁性のコロイドの生成には、酸素の第一鉄イオンとの反応を最小にしなくてはならなく、制御されなくてはならない。酸素暴露を制御することが不十分であると第一鉄イオンを第二鉄イオンへの制御されない酸化をもたらし得て、それにより、得られるコロイドの磁性特性を低減し得る。ジャケット付きの反応器（図５）を被覆し、酸素がない気体、好ましくは窒素でパージすることにより酸素の利用性を最小にする。１つの態様では、塩化第二鉄とデキストランの溶液を１０−２４時間窒素でパージすることによって酸素含有率を最小にする。その溶液を反応器にいれ、４℃における水を反応器のジャケット中に流しながら攪拌する。これにより、ジャケットの水の温度において酸素がない溶液がもたらされる。これに、固体形の第一鉄塩を添加し、中和の直前に溶解させる。窒素パージを加熱工程中に行なうが、水酸化アンモニウムのような揮発性の塩基の添加中は除かれる。中和及び加熱工程後、酸素暴露及び次の酸化は、下記のように、コロイドについてはほとんど影響力はない。
【０１２２】
（Ｃ．代替及び置換）
一連の置換及び代替は本発明の範囲内及び教示内である。そのいくつかを以下に示す。
【０１２３】
図５に示された回分式の反応器の代わりとして、一方における冷塩基と他方における鉄塩とデキストランの冷溶液との間の混合を連続式反応器において行う。２つの溝ポンプが各溶液を引き上げて次に「Ｙ」型管の接合場所で混合させる。得られた常磁性スラリー（冷ゲル）を２つの方法の１つにおいてそれを回収することにより加熱され得る。図５に示したようにジャケット付き反応器において回収され得るか又は約９５℃における水により囲まれたコイルを通して溶液をポンプで注入することによって回収され得る。加熱コイルが用いられる場合、その加熱コイルは、生成物が加熱コイルの出口を出る前に、少なくとも約３０分間常磁性スラリーを加熱するのに十分に長くなければならない。
【０１２４】
冷ゲル化法と組み合わされて用いられる多糖類には、デキストラン、アラビノガラクタン、デキストリン、ヒドロキシエチル澱粉、マンナン、ガラクタン、硫酸デキストラン及びジエチルアミノデキストランが含まれる。冷ゲル化法の要件に合えば（最近理解されているように）、多糖類以外のポリマーが用いられ得る。ポリマーは、溶液において第二鉄イオンを保つために求められるｐＨ３より低い酸環境に対して安定でなければならなく、ポリマーは加熱工程の応力を耐えなければならなく、塩基添加における酸化鉄の形成を妨げる、第一鉄イオン又は第二鉄イオンを結合してはならない。ポリマーは又、酸化鉄表面に吸着されなければならない。
【０１２５】
鉄以外の金属を、それらを中和工程の前に塩として添加することによって、コロイドに組み込まなければならない。特に、ＣＯ２＋又はＭｎ２＋が部分的に又は完全にＦｅ２＋に置換し得る。鉄のように、それらの金属は生物的機能と鉱物的毒性を有する。一水和物塩の２６ｗ／ｗ％の溶液として調製される炭酸ナトリウムが水酸化アンモニウムの代わりに用いられ得る。
【０１２６】
遊離の多糖類を多糖類が被覆された超常磁性酸化鉄コロイドから分離するために限外濾過が用いられる。限外濾過膜のカットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）は、濾液における多糖類が除去され、多糖類で被覆された超常磁性コロイドは保有されるようにされなくてはならない。実施例で用いられる多糖類のためには、１００ｋｄ又は３００ｋｄのカットオフを有する限外濾過膜が満足される。限外濾過がこの分離工程のための好ましい技術であるが、他の実際的な方法には遠心分離及びゲル透過クロマトグラフィーが含まれる。
【０１２７】
非磁性スラリーから均質な超常磁性酸化鉄コロイドを形成させる加熱工程の後に、第一鉄塩が磁鉄鉱又はγ酸化第二鉄タイプの結晶内に存在する。鉄のそれらの酸化物は両方とも同様の磁性を有する。この工程の結果として、磁鉄鉱のγ酸化第二鉄への（Ｆｅ２＋からＦｅ３＋への）完全な酸化はコロイドの磁性特性をほとんど変えない。酸化は、２５−５０℃のような温度で１０乃至５０時間のインキュベーション時間、コロイドのＨ２Ｏ２のような酸化剤への暴露により達成される。得られたコロイドは、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）の茶色又は黒ではなくて、第一鉄イオン（Ｆｅ２−）を含むγ酸化第二鉄（γＦｅ２Ｏ３）の赤茶色である。
【０１２８】
本発明のコロイドを凍結乾燥し、それらのサイズ分布を変えずにそして粒子を形成せずに再構成する。コロイドに対する最大の安定性を得るために、デキストラン又はクエン酸ナトリウムのような補形薬を添加し得る。
【０１２９】
濾過滅菌（背景のＢで記載した）の代わりとしては、コロイドに高温（例えば、１２１℃で３０分）に付すことを含む末端滅菌（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）がある。末端滅菌は非経口製品の無菌に対する法的規制に合致する。しかし、末端滅菌は磁性コロイド及び粒子における望ましくない効果を生じることを見出だした。末端滅菌は、注入後、血圧を降下させるコロイドを生じる（米国特許出願番号０７／４８０，６７７の表１参照）。このことは、非常に望ましくない副作用であり、そのような副作用の低い発生であっても、医薬品の販売に対して求められる規定された承認が得られない。従って、本発明の方法が、増大する毒性の危険がなく滅菌を行うのに重要であると考えられる。
【０１３０】
（Ｄ．本発明の多糖類で被覆されたコロイドにおける他の化学的作用）
本発明の、架橋なく（実施例１及び２を参照）又は架橋により安定化される（実施例４）、デキストランで被覆したコロイドにおいて他の化学的作用が行われ得る。両方のタイプの、デキストランで被覆されたコロイドは長期の血漿半減期を有するので、それらが保有する鉄はいくつかの抗体、蛋白質、ペプチド、ステロイド、結合蛋白質又は他の物質のデキストランへの結合により細胞又は組織へ向けられ細胞又は組織を標的にする。長期の血漿半減期は、抗原及び受容体を保持する細胞を超常磁性鉄結晶の効率のよいターゲットにさせる。蛋白質の磁性酸化鉄コロイドのデキストランへの結合が、モルデイ（Ｍｏｌｄａｙ）による米国特許第４，４５２，７７３号に記載されている。しかし、モルデイ法によって生成された酸化鉄コロイドは短期の血中半減期（前記及び表２を参照）を有する。先に説明したように、これは注入された鉄の、肝臓及び脾臓の食細胞による迅速なクリアランスのためであり、他の部位を標的にし得る鉄の量を低減させる。このように、モルデイ型酸化鉄の表面導出は、注入後の鉄が細胞を標的にするのによく適合した接近を生じない。
【実施例】
【０１３１】
（実施例１：小さなデキストランで被覆されたコロイド）
４５０ｇのデキストラン、Ｔ−１０及び３１．５６ｇ（１１６．７６ミリモル）の塩化第二鉄６水和物の０．２μで濾過された１，００５ｍｌの水溶液を２乃至４℃に冷却した。この冷却された混合物に、水に溶解し総容量を４３ｍｌにした、１２．５５ｇ（６３．１３ミリモル）の塩化第一鉄４水和物を含有する新しく調製された（１５−３０分）、０．２μ濾過された水溶液を添加した。迅速に攪拌しながら、上記の酸性溶液を２−４℃に冷却した２８−３０％の水酸化アンモニウム溶液の４５ｍｌの滴下しての添加により中和した。次に緑がかった懸濁液を７５乃至８５℃に１時間加熱間隔に亘り加熱した。その混合物を一定に攪拌しながらこの温度範囲で７５分間保った。
【０１３２】
３００ｋｄの中空の繊維カートリッジを備えた２ｌのＣＨ−２装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、マサチュセッツ州、Ｄｅｎｖｅｒｓ）での限外濾過により、過剰のデキストラン及び水酸化アンモニウムとともに塩化アンモニウムを除去した。約６回の洗浄後、溶離剤にはすべての不純物がないことがわかった。そのコロイド生成物を限外濾過（＜４０ｍｇ／ｍｌ）により濃縮し、０．２μ濾過した。得られたコロイドは、およそ１０−２０ｎｍのサイズ及び６００乃至９００ｋｄの分子量に相当するセファロース２Ｂでのゲルクロマトグラフィーにより、およそ７５０ｋｄの単一ピークを示す。このことは、均質なコロイドが生成されたことを示す（図１）。
【０１３３】
コロイドはＦｅグラム当り２５，０００×１０−６（ｃ．ｇ．ｓ）より大きい帯磁率を有し、このことは鉄が超常磁性であることを示している［帯磁率測定の詳細については、ジョセフソン（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ）らによるＭａｇ．Ｒｅｓ．Ｉｍａｇ．、８巻（１９９０年）、６３７−６４６頁を参照。常磁性鉄は同様の単位において５，０００未満の帯磁率を有する。］。コロイドはデキストランで被覆されており、２００分より長い血漿半減期を有する（表２）。
【０１３４】
（実施例２：大きなデキストランで被覆されたコロイド）
１７０．５ｇのデキストラン、Ｔ−１０及び３１．５６ｇ（１１６．７６ミリモル）の塩化第二鉄６水和物の０．２μ濾過された水溶液３８１ｍｌを２−４℃に冷却した。その冷却混合物に、新しく調製した（１５−３０分）、４３ｍｌの総容量に溶解した１２．５５ｇ（６３．１３ミリモル）の塩化第一鉄４水和物を含有する０．２μ濾過した水溶液を添加した。迅速に攪拌しながら、上記の酸性溶液を、２−４℃に冷却した２８−３０％の水酸化アンモニウム溶液の滴下しての添加により中和した。次に緑がかった懸濁液を７５乃至８５℃に１時間加熱間隔に亘り加熱した。その混合物を一定に攪拌しながらこの温度範囲で７５分間保った。
【０１３５】
３００ｋｄの中空の繊維カートリッジを備えた２ｌのＣＨ−２装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、マサチュセッツ州、Ｄｅｎｖｅｒｓ）での限外濾過により、過剰のデキストラン及び水酸化アンモニウムとともに塩化アンモニウムを除去した。約６回の洗浄後、溶離剤にはすべての不純物がないことがわかった。そのコロイド生成物を限外濾過（＜４０ｍｇ／ｍｌ）により濃縮し、順次、８００ｎｍ、４５０ｎｍ及び２２０ｎｍと低減する多孔度のフィルターに通した。
【０１３６】
得られたコロイドは、およそ３０−５０ｎｍのサイズに相当するセファロース２Ｂでのゲルクロマトグラフィーにより、およそ１，０００乃至１，５００ｋｄの単一ピークを示し、図２に示すように均質なコロイドが生成されている。そのコロイドはＦｅグラム当り２５，０００×１０−６（ｃ．ｇ．ｓ）より大きい帯磁率を有し、このことは鉄が超常磁性であることを示している。コロイドは、１００分より長い血漿半減期を有しており、デキストランで被覆されている（表２）。
【０１３７】
（実施例３：アラビノガラクタンで被覆されたコロイド）
３２５ｇの精製されたカラマツのアラビノガラクタン及び２４．２５ｇ（８９．７２ミリモル）の塩化第二鉄６水和物の０．２μ濾過された水溶液３０００ｍｌを２−４℃に冷却した。その冷却溶液に、新しく調製した（１５−３０分）、３３．３ｍｌの総容量に水に溶解した１８．８４ｇ（８９．７２ミリモル）の塩化第一鉄４水和物を含有する０．２μ濾過した水溶液を添加した。迅速に攪拌しながら、上記の酸性溶液を、２−４℃に冷却した２８−３０％の水酸化アンモニウム溶液の４９．７ｍｌの滴下しての添加により中和した。次に得られた緑がかった懸濁液を８５乃至９０℃に１時間加熱間隔に亘り加熱した。その混合物を一定に攪拌しながらこの温度範囲で７５分間保った。
【０１３８】
３００ｋｄの中空の繊維カートリッジを備えた２ｌのＣＨ−２装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、マサチュセッツ州、Ｄｅｎｖｅｒｓ）での限外濾過により、過剰のアラビノガラクタン及び水酸化アンモニウムとともに塩化アンモニウムを除去した。約６回の洗浄後、溶離剤にはすべての不純物がないことがわかった。そのコロイド生成物を限外濾過（＜４０ｍｇ／ｍｌ）により濃縮し、順次、８００ｎｍ、４５０ｎｍ及び２２０ｎｍと低減する多孔度のフィルターに通した。
【０１３９】
得られたコロイドは、およそ３０−５０ｎｍのサイズに相当するセファロース２Ｂでのゲルクロマトグラフィーにより、およそ１，０００乃至１，５００ｋｄの単一ピークを示す。図３に示すように均質なコロイドが生成されている。そのコロイドはＦｅグラム当り２５，０００×１０−６（ｃ．ｇ．ｓ）より大きい帯磁率を有し、このことは鉄が超常磁性であることを示している。コロイドは、アシアログリコプロテイン受容体によるインターナリゼーションのために１０分より短い血漿半減期を有している（表２）。
【０１４０】
（実施例４：デキストランで被覆されたコロイドの架橋）
デキストランで被覆されたコロイドは、本質的に実施例１により調製された。ヒュームフードのなかで、２０ｍｌのコロイド（１２ミリモルのＦｅ）に１００ｍｌの５ＭのＮａＯＨ、４０ｍｌの蒸留水及び４０ｍｌのエピクロロヒドリンを添加した。いくらかのガスの放出が起こった。有機相（エピクロロヒドリン）と、デキストランで被覆されたコロイドを含有する水性相の相互作用を促進するために振盪しながらその混合物を室温で２４時間インキュベートした。コロイドを透析バッグに入れ、各２０ｌの蒸留水で２０回変えて透析することによってエピクロロヒドリンを除去した。
【０１４１】
そのコロイドのサイズ及び磁性特性は、この処理により影響されなく、実施例１で記載されたものであった。架橋されたコロイドのデキストランは、もとの、デキストランで被覆されたコロイドの表面からデキストランを分離する高温処理により分離しなかった（表３）。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、実施例１によるセファロース２Ｂゲル濾過クロマトグラムである。
【図２】図２は、実施例２によるセファロース２Ｂゲル濾過クロマトグラムである。
【図３】図３は、実施例３によるセファロース２Ｂゲル濾過クロマトグラムである。
【図４】図４は、ＡＭＩ−２５のセファロース２Ｂゲル濾過クロマトグラムである。
【図５】図５は、前記実施例の冷ゲル化法用の反応器の図である。
【図６】図６は、２つの異なるサイズのデキストランで覆われた超常磁性酸化鉄コロイドの略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載され、示された発明。
【請求項１】
明細書に記載され、示された発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２１３７２１（Ｐ２００６−２１３７２１Ａ）
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７７７２（Ｐ２００６−２７７７２）
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【分割の表示】特願平７−５０６９１３の分割
【原出願日】平成５年８月１２日（１９９３．８．１２）
【出願人】（５０１３９４６５３）アドバンスド・マグネティクス・インク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【分割の表示】特願平７−５０６９１３の分割
【原出願日】平成５年８月１２日（１９９３．８．１２）
【出願人】（５０１３９４６５３）アドバンスド・マグネティクス・インク (1)
【Ｆターム（参考）】
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