多能細胞集団を産生する方法およびその使用
請求の範囲に記載されている発明は、生体内の様々な細胞への分化を促進し、更なる分化を可能にする多能、多能性、自己再生可能な細胞の生成に直接関係している。請求の範囲に記載されている発明は、望まれる移植可能の分化細胞集団、遺伝子組み換えされた細胞、これらの方法により改善されるであろう病気によって苦しんでいる患者の治療法に、直接関係する。本発明は、免疫不全ウィルス感染に関連した病気の予防や治療方法をも与える（ＨＩＶ−１，、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶなど）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本国内段階での出願（35 U.S.C. § 371）は、国際出願PCT/US2008/065007（35
USC §120）（2008年5月29日出願）の継続であり、35 U.S.C. §119での米国仮出願60/932,020号（35 U.S.C. §119）（2007年5月29日出願）、米国仮出願60/933,133号（2007年6月5日出願）、米国仮出願60/933,670号（2007年6月8日出願）、米国仮出願61/006,449号（2008年1月14日出願）、米国仮出願61/064,761号（2008年3月25日出願）における利益を請求するものであり、各出願における内容全体は参考として本明細書に記載する。
【背景技術】
【０００２】
21世紀の医療における優れた挑戦は、損傷し擦り切れまたは遺伝子学的に損なわれた細胞を、再生するまでになっている。DNAへ明確に結ばれる転写調節因子は、遺伝子発現の調節において重要な役割をなしている。それは各細胞において転写調節因子の補完物であり、どの細胞プログラムが活性化され、どれが消去されているかを決定するものである。この機能で転写調節因子は、細胞の同一性を決定・維持し、同様に細胞の脆弱性を決定する役割がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（発明の要約）
まだ多能化されず自己再生できない細胞から、増殖し自己再生し、多能で多能化できる細胞集団を得る能力は、細胞療法を利用する全ての分野において明らかに有益なものであろう。骨髄移植、輸血、遺伝子療法を含むこれらの分野により、患者独自の幹細胞や、その他望まれる種類の細胞の生成が可能になる。同様に、神経、筋肉、その他の様々な細胞集団への分化を始める能力は、医療や動物を含む商業面の過程にとって大きな価値を生むであろう。それに応じて本発明は、遺伝子生成、多能な細胞集団の利用、多能性の細胞集団の利用、神経細胞集団の利用、筋細胞集団の利用、またHIV耐性細胞のような他の望まれる細胞集団の利用の方法を提供する。
【０００４】
本発明の請求は、単独もしくは（Notch、NumbNumblikeなど）他の細胞運命デターミナントとの組み合わせによって、一時的（多能、多能性、自己再生可能）で（分化されたまたは肉体）細胞の遺伝子表現型の調整を可能にする相互転換する、特定の転写調節因子の有効的な介入または過剰発現についてである。
【０００５】
信頼できる遺伝子表現型の確実な転換や細胞の再プログラムの能力により、個々の患者に適応した幹細胞、代替細胞、組織、器官の生成が可能になる。
【０００６】
遺伝子治療技術や細胞培養技術に合わせて、細胞タイプの相互交換は、移植に適応できる、疾患に耐性があり、遺伝子学的に修復された細胞を生成することもできる。
【０００７】
本発明の目的は、増殖でき、自己再生可能で、多能および／あるいは多能性の細胞集団だけでなく、他の望まれる細胞集団を生成する方法を、癌遺伝子を使わずに分化した細胞または分化していない細胞から提供することである。分化した細胞集団は、特定に分類された細胞タイプと関連する全てのマーカーではないが、いくつかのマーカーを発現する細胞から成る。ここで述べられているように、適切な麻痺した、他の導入遺伝子（特に転写調整因子）との組み合わせによって発現するアイソフォームは、分化した、多能化した細胞集団または分化している細胞集団の生成を可能にする。さらに本発明における遺伝子ベクターは、遺伝子組み換えや(例：患者で遺伝子産物の不足が発現)、一時的もしくは永久的に増殖でき、自己再生でき、幹細胞や前駆細胞を生成するために使われ、それらの細胞は、生体内において内在性の細胞で作用し、普通ではこのような作用は見せない組織の中で発見されたものである。最後に、本発明における他の遺伝子ベクターは、（癌細胞など）異常な作用を見せる細胞で、遺伝子組み換えを行いおよび／あるいは増殖し、自己再生でき、または幹細胞／前駆細胞を防ぐのに用いられる。病気の過程を和らげるのを予想する、オリゴヌクレオチド鎖の発現を可能にする、治療上のベクターや細胞を生成することも本発明の目的である。例えば本発明では、有害なHIV遺伝子の発現を減少させ、他の免疫不全ウィルス感染、発現また拡大を防ぐ合成オリゴヌクレオチドの利用方法を明らかにする。
【０００８】
本発明は脊椎動物の細胞ならびに魚類、哺乳類、鳥類、両性類、爬虫類の細胞など、いかなる適した細胞にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】は、例13のベクター連鎖を図式化したベクターマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
全ての特許、特許出願、ならびに本出願書で引用された出版物は、そのまま参照し本論に引用されている。ここで論じられているように、「DNA」はデオキシリボ核酸を表わし、「RNA」はリボ核酸を表わす。ここで書かれている、「ｃDNA」は補足DNAを意味し、「ｍRNA」はメッセンジャーRNAを表わす。
【００１１】
「siRNA」は小妨害RNAを表わし、「shRNA」は小U字型RNAを表わす。「miRNA」は、単一ストランドRNA分子や、特に約20から30の原子核を持ち遺伝子の発現を規制する可能性があるマイクロRNAを表わす。（「decoy」「decoyRNA」ならびに「RNAdecoy」は、リガンドの自然に束ねられた形に良く似たRNA分子を表わす）
ここで記されたように「ameliorating（改善する）」は影響を減らし、損傷を少なくすることを意味する。それは例えば、疾患による有害な影響や状態を減らすことのように、動き、活動または機能などの衝撃を最小にすることを意味する。
【００１２】
ここで記されたように、「retarding（遅らせる」は影響または動きの進行を緩め減少させることを意味する。それは例えば、病気の進行を緩めたり、感染率を低下させたり、疾患または症状の経過あるいは進行を低下させるように作用することである。
【００１３】
ここで記されているように、「誘発剤」は動きを促進するための唯一の効果的な作用である。例えば、活動を誘引し増進させることによりプロモータに作用し、またプロモータの統制のもと遺伝子発現に影響する外生の作用物質は誘発剤と称されるだろう。例えば、テトラサイクリンは誘発剤として使われ、ドキシサイクリンも誘発剤として使われるであろう。
【００１４】
核酸鎖（ポリペプチドを符号化する核酸鎖など）は、第1の核酸鎖が第2の核酸鎖と機能的な関係のもとに配置された時に、他の核酸鎖（プロモータなど）に対して「実効的に関連する」と言われている。例えば、もし符号化された連鎖の転写または発現に、プロモータが影響を与えたら、プロモータは符号化された連鎖に実効的に関連するということである。ここで記されているように「操作される」という言葉は、遺伝子や符号化された連鎖がプロモータ連鎖に実効的に関連し、プロモータ連鎖が符号化された連鎖の転写または発現に影響を与えることを意味する。
【００１５】
ここで記されているように、「マーカー」は、探知できまたは探知できる分子の符号またはマーカーの存在を探知できる分子のことである。「マーカー・たんぱく質」あるいは「マーカー・ポリペプチド」は、研究室やクリニックにおいて探知でき、実施例において可視できる、たんぱく質あるいはポリペプチドのことである。「マーカー遺伝子」は、マーカー・たんぱく質またはマーカー・ポリペプチドを符号化するものである。
【００１６】
ここで記されているように、「HIV」はヒト免疫不全ウィルスのことを表わし、
例えば変異のHlV-I、HIV-2を含む。他の免疫不全ウィルスとしては、SIV（サル免疫不全ウィルス）やFIV（ネコ免疫不全ウィルス）などがある。HIVに関連する酵素は「HIV酵素」と呼ばれることもでき、例えばインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TAT（転写促進調節たんぱく質）などを含む。HIVによる感染は、「HIV受容体」と呼ばれる受容体が関わっていると考えられている。「HIV共受容体」として名づけられている複数の受容体があるであろう。ここで記されているように、「HIV共受容体」にはCXCR4やCCR5などがある。
【００１７】
本発明における理論上の論拠はここに記されているが、この議論は本発明を否定し制限するものではない。ここで記されている技術は、本発明の理論上の支持をするか否かを問わず、多くに利用されているものである。
【００１８】
実施の形態としては、細胞は、a)増殖しで多能でまた多能性の細胞集団を繁殖させ、b)神経細胞の集団、c)筋細胞、d)および／あるいは他の望まれる細胞集団を生成する目的で、アプローチしやすく分裂しているまたは分裂していない細胞集団から選択される。更に、生体外、生体内、および／あるいは生体内で組織に適切な、または部位で適切な一層の分化ができる。
【００１９】
本発明に用いられた選択された細胞の根源：選択された細胞は、本発明において利用可能であるすべての細胞を含んでいてもよい。本発明に使われた細胞（ここでは「選択された細胞」という）は、患者の内生的な細胞に由来し、他の器官システムから分化した細胞、または外生の根源から分化したもの（細胞株からの分化、低温保存された根源、貯蔵された根源、移植源を含む）である。細胞は、合成あるいは天然の核酸鎖と遺伝子組み換えされたものから選択されることもあるる。ここで使用されている「選択された細胞」とは、ヒト胎幹細胞は含まない。
【００２０】
本発明においては健康な組織を侵襲的に害することなく行う目的で、選択された細胞は容易に採取することができ(例：末梢血白血球、循環造血幹細胞、上皮細胞)、(例：口頬細胞(例：Michalczyk et al, 2004))、脂肪組織(例：Gimbleet al., 2007; Ma et al., 2007)、臍帯血液細胞(例：Zhao, et al., 2006; Tian et al., 2007)、など)を利用した。しかしながら骨髄幹細胞、精原細胞(例：Guanel al., 2006; Takahashi et al., 2007)、始原生殖細胞(PGC)、羊膜から分離した幹細胞(例：Ilancheran etal., 2007)、羊水 (例：De Coppi et al., 2007)、同様に皮膚から分離した細胞(例：Tumbar, 2006; Dunnwaldet al., 2001 ; Szudal'tseva et al., 2007)などは、本発明においても利用された。このような細胞は、この研究手法にてよく知られている組織から分離することができる。
【００２１】
精原細胞の酵素消化パーコール分離後のステップ2を使用して分離することができる。細胞を最小必須培地（MEM）のに再懸濁することができる106/mLの最終濃度にウシ血清アルブミンを補充。具体的には：尿細管の断片手術でアクセスされ、離れて前に治療に1ミリグラム/mlのトリプシン、ヒアルロニダーゼ、およびコラゲナーゼとからかわれるし、1ミリグラム/ mlのヒアルロニダーゼとコラゲナーゼは、MEMでの0.10％炭酸水素ナトリウム、4mM L -グルタミンを含む非必須アミノ酸、40マイクログラム/ mlのゲンタマイシン、100 KJ 100マイクログラム/ mlのペニシリンストレプトマイシン、および15mMのHEPES。精原細胞をさらに尿細管の断片から30倍の重力で遠心分離によって区切られている。 77ナイロンフィルタ - および/または55 - ミクロンの孔径を介してろ過した後、細胞を収集され、不連続パーコール密度勾配上にロードされる。純度の高い40％以上前駆/幹細胞/精原細胞を洗浄して、細胞と同等の濃度に10前駆細胞を再懸濁/幹細胞/ ml当たり精原細胞と分数。その後、細胞を培養すると/または任意の凍結保存技術は、芸術に知られて格納される。
【００２２】
精原細胞は二段階の酵素吸収に続くパーコール分化方法により分離できる。そして、これら細胞は106/mL の終末濃度までウシの血清アルブミンを補足した最小必須培養液（MEM）によって再懸濁される。具体的には：
選択された細胞は遺伝子組み換え細胞で、特に治療法または商業的に有利なデオキシリボ酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）鎖を符号化するためこの研究手法にてよく知られている技術で遺伝子組み換えされた。
【００２３】
本発明の一つの側面によれば、選択された細胞から望まれる細胞集団を生成する方法がある(例：多能性、 神経、筋肉、など)。
【００２４】
多能で多能性および／あるいは自己再生可能な細胞集団の生成
増殖し自己再生できる多能性の細胞集団を、得るために、選択された細胞および／あるいはその結果である集団は、哺乳類の麻痺した遺伝子の「長」 (PRR insert +) アイソフォームを符号化するものを含むヌクレオチド配列によって核酸を入れられる。それとほぼ同時に選択された細胞は、短く麻痺したまたは麻痺したようなアイソフォームとを標的にした合成オリゴヌクレオチドによって核酸移入され、それから最適の成長速度で選択された細胞を成長させる環境下で培養される。選択された細胞はこのような環境下において、望まれる細胞数に達するまで保管される。細胞はLIF、鉄因子および／あるいは 11-6、hyper 1L-6、 IL-7、-オンコスタティンM および／あるいはカーディオトロフィン-1と等しい効力の濃度によって培養され得られた（最適な）成長速度、もしくは他のサイトカインを減少させる転写遺伝子の存在(例：多能性細胞を培養する条件、例： Guan et al., 2006)によって得られた成長速度によって培養された。成長速度は、培地によって2倍にされた細胞数によって決定される。同様に、米国特許6432711 と 5453357にある培養環境は、長(PRR+) Numbアイソフォームによって核酸が入れられた細胞の繁殖や拡大に最適な成長速度を与えられる。他の望まれるプロコトルやサイトカイン濃度は、（Koshimizuet al., 1996; Keller et al., 1996; Piquet-Pellorce, 1994; Rose et al., 1994;Park and Han, 2000; Guan et al., 2006; Dykstra et al., 2006; Zhang et al.,2007)に従った。しかしながら、本発明の実験は、これら技術の詳細に制限されない。
【００２５】
一つの好適な実施例において、選択された細胞は標準的な培地において培養された(例：補完が有るまたは無い最少必須培養(例：グルタミン、ベータ・ メルカプトエタノール)。培地は、基本的な繊維芽細胞成長因子bFGF、鉄因子、白血病抑制因子LIFおよび／あるいはLIF活性がある因子(例：LIF、LIF受容体(LIFR)、 繊毛状神経栄養因子(CNTF)、 オンコスタティン M (OSM)、 OSM 受容体(OSMR)、 カーディオトロフィン、 IL-6、hyper IL-6、GP 130インターロイキン、その他(IL))、ウマの血清を含む。LIFのみではなくLIF活性がある因子は、細胞の自発的な分化を防止する。このような環境下で、PRR+Numb アイソフォームとその結果である集団によって核酸を入れられた選択された細胞は、多能、多能性および／あるいは自己再生能力を得ることが期待されている。
【００２６】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である集団は、「長」 (PRR insert +) Numb アイソフォームを符号化するヌクレオチド鎖のみならず、他の導入遺伝子を符号化する鎖によって核酸に入れられる。これら導入遺伝子の多くは、NCBI連鎖データベースに、それぞれの識別番号に基づいて挙げられる。
【００２７】
別の好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、他の導入遺伝子を符号化する連鎖と同様に、「長」(PRR insert +) Numb アイソフォームを符号化するヌクレオチド鎖によって核酸を入れられる。これらの導入遺伝子の多くは、それぞれの識別（取得）番号（コード）に基づいてNCBI連鎖データベースに分類される。一つの好適な実施例において、選択された細胞やその結果である細胞は、LIFなどの他の導入遺伝子を符号化する連鎖と同様に、連鎖を符号化する長(PRR+)Numbアイソフォームによって核酸に入れられる。
【００２８】
一つの好適な実施例において、LIF活性を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸を入れられる。一つの好適な実施例において、LIFRを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+)Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００２９】
一つの好適な実施例において、オンコンスタティンM（OSM）を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３０】
一つの好適な実施例において、オンコンスタティンM受容体（OSMR）を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。一つの好適な実施例において、カーディオトロフィン-１を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３１】
一つの好適な実施例において、CNTFを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３２】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸を入れられる。
【００３３】
一つの好適な実施例において、NANOGやOCT3/4、SOX2を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３４】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2、LIF活性を伴う導入遺伝子を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはやその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３５】
一つの好適な実施例において、Notchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる（例：Gaianoet al., 2000）。
【００３６】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2、Notchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる(例：notch1 および／あるいはnotch 2)。
【００３７】
一つの好適な実施例において、OCT3/4、SOX2、NanogまたNotchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３８】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、OCT3/4、SOX2、NANOG、またLIF活性の遺伝子などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームを符号化して核酸が入れられる。一つの好適な実施例において、選択された細胞その結果である細胞は、OCT3/4、SOX2、NANOG、LIF活性がある多重導入遺伝子などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長(PRR+)Numbアイソフォームを符号化して核酸が入れられる。
【００３９】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、他のOCT3/4、 Notch,、 HOXB4 、またSOX2などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームを符号化して核酸が入れられる。
【００４０】
さらに、他のここで記されたものから分化した遺伝子の組み合わせは、多能で、多能性で、自己再生できるか分化を始める細胞を引き起こす可能性があるかもしれない。しかしながら、本特許出願はいかなる核酸細胞またはたんぱく質の電気穿孔法 ( Gagne et al., 1991 ; Saito et al., 2001 ; Yuan, 2008; Huang etal., 2007; Xia and Zhang, 2007; Cemazar and Sersa 2007; lsaka and Imai, 2007;Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007; etc.参照)、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトを適応する「遺伝子再プログラミング」(Goldberg et al., 2007; Li et al., 2007参照)および／あるいはウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチに使用でき、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。それは安全性と効率の向上を意味する。さらに当然として、ランダムな遺伝子交替の分類には、、ゲノムの特定の場所においてDNAを導入または取り除くために設計された遺伝子ターゲティングならびに部位特異的方法がある。
【００４１】
同様にして、本特許出願は核酸またはたんぱく質の電気穿孔法を利用するいかなる核酸細胞の遺伝子再プログラムにも適応でき、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、その他、および／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチに使用でき、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。それは安全性や効率の向上を意味する。このようなアプローチや手法は、本特許出願において実用的な技術として知られている。
【００４２】
一つの好適な実施例において、単一の遺伝子やその一部に(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの;または多能で多能性で、自己再生可能であるもの)対応する核酸またはたんぱく質が唯一の過剰発現した、および／あるいは選択された細胞から多能、多能性または自己再生細胞を生成するよう導入された、および／あるいは、唯一の核酸またはたんぱく質である。一つの好適な実施例において、単一の遺伝子やその一部に(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの;または多能で多能性で、自己再生可能であるもの)対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４３】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、単一の遺伝子やその一部(特にここで挙げられたもので, ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの; もしくは多能で多能分化し、自己再生可能であるもの)に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞の中から、多分能、多能性および／あるいは自己再生細胞が生成されている限り使用できる。
【００４４】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は単一の遺伝子やその一部(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの、もしくは多分可能で万能分化し、自己再生可能であるもの)に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成ている限り使用される。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４５】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４６】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はNanogに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成される限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／あるいは、ウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４７】
別の好適な実施例において、Oct4 とSox2に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムランダムな変質である。
【００４８】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4/Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４９】
別の好適な実施例において、長(PRR+) Numbアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５０】
別の好適な実施例において、選択された細胞から、長(PRR+) Numbアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成される限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５１】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するために過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５２】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５３】
別の好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは、導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５４】
一つの好適な実施例において、LIF活性を利用して遺伝子に対応する核酸またたんぱく質が、多能で多能化で自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現および／あるいは導入された唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５５】
一つの好適な実施例において、LIF活性のある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５６】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、LIF活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
【００５７】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、LIF活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５８】
一つの好適な実施例において、Oct4に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５９】
一つの好適な実施例において、Oct4に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００６０】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
【００６１】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／1エンチ・ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００６２】
一つの好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００６３】
一つの好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６４】
別の好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００６５】
別の好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞の中から、多能、多能性および／あるいは自己再生の再蔵を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６６】
一つの好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００６７】
一つの好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう1つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６８】
別の好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはそ細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６９】
一つの好適な実施例において、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。、実施の形態としては、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。別個の実施の形態としては、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７０】
別の好適な実施例において、c-mycに対応する核酸または、たんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。実施の形態としては、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７１】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、選使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７２】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７３】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７４】
別の好適な実施例において、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７５】
別の好適な実施例において、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７６】
別の好適な実施例において、長（PRRX+） Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７７】
別の好適な実施例において、長（PRRX+） Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７８】
別の好適な実施例において、Oct4、 Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７９】
別の好適な実施例において、Oct4、 Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８０】
別の好適な実施例において、Oct4, Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００８１】
別の好適な実施例において、Oct4, Sox2とNanonに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８２】
別の好適な実施例において、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、
別の好適な実施例において、長(PRR+) Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生の細胞を生成するよう、過剰発現および／あるいは導入され、使用されている手法は電気穿孔法、リボソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう1つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。。
【００８３】
別の好適な実施例において、長 (PRR+)Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００８４】
別の好適な実施例において、長 (PRR+)Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８５】
ここに示される核酸またはたんぱく質の連鎖のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団または習性が得られる限り、Numbおよび／あるいはNumblikeに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで操作できる。
【００８６】
同様にここで示される分化を開始する方法は、誘発されたまたは誘発されなかった、多能、多能性、自己再生する幹細胞、他の前駆細胞、または他の選択された細胞、あるいはここにある手法で得られた細胞だけでなく適応できる。ここに示される核酸またたんぱく質の連鎖のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団または習性が得られる限り、Numbおよび／あるいはNumblikeに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで操作できる。
【００８７】
別の好適な実施例において、ここに示される核酸またたんぱく質の様々な組み合わせは、Numblikeおよび／あるいはNumb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで使用できる。
【００８８】
好ましい実施態様では、選択されたセルおよび/またはその子孫が遺伝的に、事前に変更されているセルです。
【００８９】
好ましい実施態様では、トランスフェクションの手順をここに一時的なトランスフェクションを表す説明する。さらに好ましい実施態様ではこのような一時的なトランスフェクションを使用して達成されるは、ホストゲノムへのウイルスベクターを統合しないでください。
【００９０】
別の好適な実施例において、かかる一時的なトランスフェクションは、標準のトランスフェクション技術（電気穿孔法、化学的に調節されたトランスフェクション、融合誘導または非融合誘導リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなど）を用いて達成される。時間の経過に従い、ここに示されるものとは異なる他の遺伝子組み合わせで、多能、多能性、自己再生可能または分化できる細胞が示され、あるいは発見されるであろう。しかしながら本特許出願は、またあらゆる核で生成される細胞で、核酸またはたんぱく質の電気穿孔法（例：手法についてはGagne et al., 1991 ; Saito et al., 2001; Yuan, 2008; Huang et al.,2007; Xia and Zhang, 2007; Cemazar and Sersa 2007; Isaka and Imai, 2007;Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007;その他を参照）、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質などは安全性と効率を上げる。
【００９１】
別の好ましい実施態様では長い（ペンシルバニア鉄道で、トランスフェクション+）麻痺アイソフォームのエンコーディング配列（および/または合成オリゴヌクレオチド）numblikeと短い感覚のアイソフォームターゲットに伴ってのものでも、これらのエンコーディングヒトLIFから選択など、他のシーケンスを一時的または永続的なトランスフェクションに置き換えられます（例：杜の市、1996年）オンコスタチン-Mのcardiotrophin - 1のIL -私リットルのIL - 6、IL6R、ハイパーのIL - 6、LIFR、gpl30、OCT3（OCT4）、nanogの、Sox2の、および/またはFGF- 4。これらの異なる遺伝子配列の任意のサブセットとの同時トランスフェクション任意の単一遺伝子ベクターを使用するなど、芸術に知られることを意味し、複数の遺伝的ベクトル、シリアルトランスフェクションと選択の明確なマーカータンパク質および/または抗生物質耐性に基づいて行うことができます。
【００９２】
別の好ましい実施態様では、細胞間で（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（s）は、細胞培養で培養されるよう、上記のよう最適成長率を促進するトランスフェクトし、EGFの、bFGF、オンコスタチン、LIFの含まれています（ドゥとの始皇帝例えば、1996）、鉄鋼因子のIL - 11、cardiotrophin - 1、IL - 6の、ハイパーのIL - 6、CNTF、および/または水溶性gpl30。.
可能性と分化の評価
多能性と多能は次の分野に有用であるといえる。1) 移植、2) 類胚芽腫体の形成を促進状態する培養、3) 動物の胚盤胞期胚芽への細胞導入とその後の成長、4) 分化、多能、多複性など（Guanet al., 2006を参照）に関連した遺伝子発現のRNA発現検査（例：RI-PCR法ならびにマイクロアレイ法に基づいた分析）、5)コロニー形成のみならずES細胞類似形態。ここで説明する、選択された細胞および／あるいはその結果の多能性を知るための1つの方法としては、蛍光タンパク遺伝子に結び付けられたNanogプロモータを使ってトランスフェクションを評価するというものがある。これによりNanog発現細胞は、蛍光活性細胞分別（FACS）などを使って特定し集積することができる。
【００９３】
実施の形態としては、内因細胞（例：火傷または怪我をした部分の周りの細胞）が長（PRR+）Numb アイソフォームを符号化した遺伝子ベクターのみと、あるいはここで名前を挙げた他の導入遺伝子と共に生体内でトランスフェクションし、一時的に細胞の再生を促進したり、増殖の効率を高める。この手法は再生不良組織、幹／前駆細胞が異常に激減したりする疾患、また他のこの手法が有効であろうと考えられる疾患に対して臨床的に用いることができる。
【００９４】
分化する細胞集団を得る
生体内で環境的に制限された状態で b) 神経、c) 筋肉、d) その他の部位の細胞集団がさらに分化するには、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞が、長（PPR+）Numbアイソフォーム配列および／あるいは合成されたオリゴヌクレオチド配列のトランスフェクション任意的に受け、（上記の如く）試験管内で十分な時間をもって望まれる量の前駆細胞を得て増補される。この任意の手順を踏むことで、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞からサイトカインと拡大／最高の成長媒体の因子を取り除き、、任意にNumblike遺伝子および／あるいは「短」（PRR-）Numbアイソフォームおよび／あるいは（PRR+）アイソフォームを対象とする合成オリゴヌクレオチドを符号化したヌクレオチド配列など (例： Zaehres etal., 2005)とトランスフェクションした。そして選択された細胞を望まれる細胞タイプに分化させるのを促進させる状況下で培養した。
【００９５】
殆どの例において、細胞は5から10％の胎児ウシ血清と、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞を分化させるのを促進させる因子が存在するという条件下で培養された。胎児ウシ血清と媒体が存在することにより、最大成長（または拡大）率よりも低い割合で成長あるいは増殖し、望まれる細胞集団に分化させることができた。媒体と培養した環境の細かい内容は、望まれる細胞集団により選ばれ下のように表わされる。
【００９６】
神経細胞集団を得る
望まれる細胞集団が神経細胞集団の時は、トランスフェクションが成功した細胞が、細胞を神経細胞に分化させるのを促進する因子が存在し、最も望ましい割合よりも低い割合で成長を促進する条件下で培養された。ニューロンへの分化を促進する条件については、次のような数多くの文献で説明されている（Benninger et al., 2003; Chung et al. 2005; Harkany et al., 2004;Ikeda et al., 2004; Ikeda et al., 2005; Wernig et al., 2002; and Wernig et al.,2004）。さらには加えたサイトカインとレチノイン酸露出を組み合わせることで、特定の神経細胞タイプが試験管内で分化する（例：Soundararajan etal., 2006; Soundararajan et al., 2007; U.S. Patent 6432711）。
【００９７】
実施の形態としては、試験管内でニューロンまた神経細胞を分化するには50ng/mlの神経成長因子（NGF）が必要であった。
【００９８】
一つの好適な実施例において、神経細胞集団が望まれる細胞集団である時、短アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Nurrl、REN、ネウロジェニン1、ネウロジェニン2、ネウロジェニック、Mash1、Phox2b、Phox2a、dlland、Gata3、Shh、FGF8、Lmxlb、Nkx2.2、Petl、Lbxlおよび／あるいはRnxを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【００９９】
別の好適な実施例において、ドーパミン作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mash1、Ngn2、Nurrl、Lmxlbおよび／あるいはPtx-3を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１００】
別の好適な実施例において、セロトニン作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時に、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mashl、Phox2b、Lmxlb、Nkx2.2、 Gata2、 Gata3、 および／あるいはPetlを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０１】
別の好適な実施例において、コリン作用性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、MASII1、Phox2aおよび／あるいはRKST4を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０２】
別の好適な実施例において、GABA作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、MASIIl、Phox2aおよび／あるいはREST4を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列で、任意的にLIF、Neurotrophi 3(NT3)および／あるいは神経成長因子（NGF）が補足された媒体の培養により、と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０３】
別の好適な実施例において、ノルアドレナリン・ニューロンが望まれる神経細胞集団の時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mashl、 dlland、Phox2a、 Phox2b、Gata2 および／あるいは Gata3対象とすを符号化したものから選ばれたを配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０４】
別の好適な実施例において、GABA作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）とトランスフェクションした細胞が、P1TX2、Dlx2、Dlx5、アンチセンスHeslRNAおよび／あるいはその他のHES1を対象にした合成オリゴヌクレオチドを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的又は永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０５】
上で説明したような分化を中程度に促進させる環境で培養された。その際、次の因子を1つまたはそれ以上加えた：レチノイン酸、NT3、NGF、GDNF、IFN-γ
筋細胞集団を得る
ときは、目的のセルの人口筋肉の人口は、正常にトランスフェクトした細胞を、エージェントの存在下でのレートでより最適な速度よりも筋細胞や成長に変えて細胞の分化を促進する培養です。条件を筋細胞への分化を促進また、以前に（中村ら説明されている、2003;パルとカンナ、2005;パイプら、2005; Albilezヌら、2006;パルとカンナ、2007; Behfarヌら、2007;米国特許64327 '1 1）。さらに、選択したセルを暴露/またはヘキサメチレンビス - アクリルアミドまたはジメチルスルホキシドに自分たちの子孫の関連性サイトカインの存在下でのinvitroで筋肉型分化の開始を支持する。
【０１０６】
一つの好適な実施例において、心筋細胞が望まれる細胞集団である時、短(PRR-) Numb アイソフォーム(および／あるいはNumblike)と共に核酸が入れられた細胞は、心筋細胞(He et al.,2003; Guan et al., 2007;その他)への分化を促進するか、心筋細胞の分化を促進する濃度の仲介物(例：0.75%- 1 % dimethylsulfoxideジメチル・スルホキシド (DMSO)が含まれるか、20%の標準ウシ血清(NBS)、10(-7) mM レチノイン酸(RA) 、20% 心筋細胞状況の培養地(Hua et al., 2006)などにて培養される。
【０１０７】
別の好適な実施例において、心筋細胞集団が望まれる細胞集団の時、それら細胞はGata 4、Gata 5、 and Gata 6と符号化された選択された細胞を含むヌクレオチド鎖と共に核酸が入れれる。
【０１０８】
一つの好適な実施例において、筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム (および／あるいはNumblike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定 bHLH-符号化連鎖、MyoD、ミオゲニン、Myf5、Myf6、 Mef2、ミオカーディン、Ifrdl や他の筋肉転写因子を符号化するこれらから、選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１０９】
一つの好適な実施例において、平滑筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム (および／あるいはNumblike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定ミオカーディンヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１０】
一つの好適な実施例において、骨格筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム(および／あるいはNumlike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定MyoDとミオゲニンヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１１】
一つの好適な実施例において、oligodensrocyte細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム(および／あるいはNumlike)を符号化する連鎖による核酸の移入は希突起膠細胞の特有の-OLlGl、 OLIG2、またZfp488 ヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１２】
これらの異なる遺伝子配列を上記の任意のサブセットとの同時トランスフェクションは、複数の遺伝子のベクトルを使用し、シリアルトランスフェクションだけでなく、選択の異なるマーカータンパク質および/または抗生物質耐性に基づいなどの芸術に既知の手段によって達成することができます。ときに、目的の細胞集団造血細胞集団が、分化中濃度の造血前駆細胞への分化を促進では、特定のエージェントが含まれます（表示等（例えば、Ohmizono、1997トロンボポイエチン血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、例えば、Wangらは、2005; Srivastavaさんら、2007; Gupta氏ら、2007）、または分化造血細胞の型（メソッドは、芸術に未分化または多能性幹細胞から分化造血細胞を提供するための既知のによれば）。
【０１１３】
望まれる細胞集団が遺伝子細胞集団である時、分化培養地は遺伝子細胞への分化を促進させる濃度において特定の仲介物を含む（例Nayerniaら2006a、2006b）。望まれた細胞集団が、すい臓内胚葉島細胞集団の時、分化培養地は、すい臓内胚葉島細胞集団への分化を促進させる濃度において特定の仲介物を含む（例：徐ら、2006;デネールら、2007;シムら、2007;江ら、2007）。
【０１１４】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および/あるいはその結果として集団の分化は、分化培養地において、Numblike、短麻痺idsoフォームや他の導入遺伝子の核酸の移入なしに起こる。また培養地は変えられない。
【０１１５】
実施例では、単一のベクトルは、塩基配列の発現をコントロール（秒）でエンコードを利用される""（ペンシルバニア鉄道+）（s）は哺乳動物の感覚の遺伝子（および/または合成オリゴヌクレオチドまたは次の短い感覚のアイソフォームnumblikeターゲットアイソフォーム）長下に1つの調節性のプロモーター（tetracycラインなどのプロモーター規制）、一方Numblikeと短い麻痺アイソフォーム（および/または合成オリゴヌクレオチドは長い（ペンシルバニア鉄道ターゲット+）アイソフォーム）を別の、別個の制御下で発現しているだけでなく、調節性プロモーター。したがって、長い（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（秒）で表現することができます（および/または短絡）は、選択したセルの拡大と誘発剤（例えばテトラサイクリン）が必要です成長培地に追加され抑圧されたアイソフォーム;以降とnumblike短期アイソフォーム（および/またはlong型（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（秒）抑圧された）が差別化が望まれる表現することができます。
実施の形態としては、単一ベクターは、
また、タンパク質やペプチド麻痺アイソフォーム、ノッチ、OCT3 / 4、Sox2のには、対応すると他のDNAここに類似の方法で選択したセルを適用することが記載さシーケンス/またはエレクトロポレーション法（例えば、を介してその子孫浩賢ら、1994;リッチーとギルロイ、1998）、ナノ粒子、カチオン性脂質、融合リポソームを使用して（例えば、吉川ら、2005;2007）、等の代わりに、または組み合わせで遺伝子トランスフェクションした。一般的に、エレクトロポレーション高いトランスフェクション効率のための遺伝子のゲノム統合せずに、目的の細胞（および効率的な生産）とできるため、より高い安全性に関連付けられている。DNA やRNAのエンコーディングタンパク質（s）またはポリペプチド（秒）の増殖、multipotentiality、pluripotentiality または選択された細胞の分化を促進するに従って、標準的な遺伝子工学的手法（たとえば、分離されるかもしれませんが、のcDNAライブラリーからこのようなDNAを分離することによって特定のセルライン）とそれを配置し、それを選択したセルにトランスフェクトされ、適切な発現ベクターに。別の好ましい実施態様では、内胚葉と膵島細胞（および/または）numblike希望の人口、およびシーケンスの短い感覚のアイソフォームのエンコーディングでトランスフェクション伴っているものでも、これらのエンコーディングFoxa2、Soxl7から選択など、他のシーケンスを一時的または永続的なトランスフェクションに置き換え、HLXB9および/またはPdxl。
【０１１６】
一つの好適な実施例において、肝細胞が望まれる集団であり短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、肝胞核因子（hnf hnf用の）私は、IINF - 3 、IINF - 4、hnf hnf用の- 6ならびに転写調節因子結合たんぱく質を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１７】
別の好適な実施例において、造血性細胞が望まれる細胞集団である時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、Runxl / AMLlと11月（CCN3）および/あるいは望まれる細胞集団のコロニー刺激因子がある細胞培養を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。Runxl/ AMLlアイソフォームは、移植が望まれる時に、Bのアイソフォームは分化が望まれる時に（Creemersらされる導入され導入、2006）。
【０１１８】
別の好適な実施例において、軟骨細胞が望まれる集団であった時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、Sox9、転写調節因子結合たんぱく質、Gatao、および/あるいはRunx2を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な確執の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１９】
別の好適な実施例において、骨胞（特に造骨細胞）が望まれる細胞集団である時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入が併発され置き換えられる。
【０１２０】
別の好適な実施例において、κ麻痺アイソフォームを符号化する遺伝子ベクターは、過渡的に標準的なプロモータの操作によって、一時的に細胞の増殖を起こす目的で生体内の内在細胞にされる導入。
【０１２１】
別の好適な実施例において、内生細胞（例：中枢神経系の上衣ゾーン細胞）は生体内において、遺伝子ベクターによって核酸が移入される。そのベクターは、短麻痺アイソフォームまたは独立したNumblikeたんぱく質のみまたはここで名づけられているような他の導入遺伝子を、一過性あるいは永久的に細胞の分化や増殖を促進させるために符号化する。この再生または増殖は、分化に関連したマーカーの遺伝子発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、この目的のために適した方法を用いて導入されることにより完成する。実施の形態としては、内生細胞（例：中枢神経系の上衣ゾーン細胞）は、生体内において、幹細胞集団の再生または増殖を促進する目的で、κ麻痺アイソフォームおよび/あるいはここで名づけられた他の導入遺伝子を符号化する遺伝子ベクターである。この再生または増殖は、その結果である集団の分化に関連し、マーカーの遺伝子発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、それに適した方法を用いて導入して達成される。
【０１２２】
同様に、この方法は、他の組織（皮膚など）における他の幹細胞集団からの再度のまたは増加する分化、を起こすためにも適している。この方法は、例えば中枢神経障害、通常の分化または移動が不十分で、形成異常疾患、その他の疾患においてアプローチが容易な場合にされる適応。
【０１２３】
好ましい実施態様では、核酸（s）またはタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特に記載の名前を発見した方法を、ここに記載によると、対応する発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の差別化の目的の方法で開始する）能力がある唯一の核酸（s）またはタンパク質（秒）が過剰発現および/または選択された細胞の分化を開始するために導入。
実施の形態としてうは、単一遺伝子やその一部（特に記載の名前、メソッド、ここに記載によると、発見発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の分化の目的の方法を開始することができると）に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞において分化を誘導するように発現され導入された唯一の核酸またはたんぱく質である。
【０１２４】
好ましい実施態様では、核酸（s）またはタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特に記載の名前を発見した方法を、ここに記載によると、対応する発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の差別化の目的の方法で開始する）能力がある唯一の核酸（s）またはタンパク質（秒）が過剰発現および/または選択したセル内のメソッドを利用し分化を開始するために導入、エレクトロポレーション、リポソームは、ナノカプセル、nanovaults、および/または、別のアプローチをレトロウイルスを避ける/レンチ統合したり、細胞のゲノムの他のランダムな変化。別の好ましい実施態様においては、他の核酸（s）または秒）コンサートでは、核酸（掲載に利用することができる蛋白質（）やタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特にここに、名前に対応するメソッドを、ここに記載によると、発見された他の公開方法によると、発見された、及び/または既知の分化のが望ましい方法を開始することができると）ので、長い分化細胞の集団としては、選択したセルから生成されます。
【０１２５】
別の好ましい実施態様においては、他の核酸（s）または秒）コンサートでは、核酸（掲載に利用することができる蛋白質（）やタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特にここに、名前に対応するメソッドを、ここに記載によると、発見された他の公開方法によると、発見された、及び/または既知の分化のが望ましい方法を開始することができると）ので、長い分化細胞の集団として、選択したセルからメソッドを利用し生産され、エレクトロポレーションです。リポソーム、ナノカプセル、nanovaults、および/または別のアプローチをレトロウイルスを避ける/レンチ統合したり、細胞のゲノムの他のランダムな変化。
【０１２６】
は、核酸や蛋白質の任意の組み合わせのシーケンス記載の目的の細胞集団または動作を実現しています麻痺および/またはNumblikeに限り、これらに対応するものを除くによって変更することができます説明を理解するためだ。
ここで記されているどの核酸ならびに鎖の組み合わせも、麻痺および/あいはNumblikeに対応する組み合わせを除き、望まれる細胞集団または習性が達成される限り、操作できるたんぱく質。
【０１２７】
同様にして、ここに記されている分化を促すための方法は、いかなる誘導されたもしくは誘導されていない多能、多能化または自己再生できる幹細胞、または他のここで記されている方法で得られた細胞だけでない選択された細胞にすることができる利用。
【０１２８】
選択された細胞の根源
選択された細胞の集団は、様々な幹細胞、前駆細胞また体細胞から得られるであろう。しかしながら細胞核が欠損している体細胞（例：成長したヒトの赤血球細胞）は、とりわけ排除された。選択された幹細胞は、存在する細胞株または貯蔵、バンク化、または低温保存されていたものから得られるであろう。典型的な幹細胞の根源は、骨髄、末梢血、胎盤血、羊水（例：投稿者コッピら、2007）、靭帯血（例：趙ら、2006;田ら、2007）、脂肪組織（例：Gimbleら、2007;馬ら、2007）、ヒト以外の胎芽などである。循環白血球や他の幹細胞ではない細胞は、同様に、上記に記されたような培養地で培養され、結果として多能、多能化および/あるいは自己再生能力を得ることになる。本発明において利用できる他の体細胞の例には、リンパ球、上皮細胞（例：頬）が含まれる。本発明のためにされた細胞は、技術として知られている選択いかなる方法にも使われるだろう。
【０１２９】
動物に関する実施例では、前立腺、精巣、胎児脳、腸から独立した幹細胞は、選択された細胞の好まれる根源であると明らかにれているさ。
【０１３０】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および/あるいはその結果である子細胞は3次元の型で培養されている。
【０１３１】
本発明の更なる目的は、患者に互換性があり、かかる器官または組織が必要をされる患者の特定の組織や臓器の移植に利用できる細胞を生成することである。ここにある方法によって与えられた多能、多能化および/あるいは分化する細胞は、そのような器官および/あるいは組織の生成のための技術に共用できることが明らかにている（例：ボーランドらなっも、2006。徐ら、2006;キャンベルとワイス、2007）。そのような利用方法は、本発明により明確にされているカバー。例えば、ここで記された方法により生成され扱われた多能、多能化および/あるいは分化する細胞は、正常な組織構造および/あるいは臓器構造の再生のためにされた足場において成長していることなどが挙げられる（例：Yarlagadaら3次元もしくは2次元の設計。、2005; Kimら、1998; WO/2003/070084; EP1482871; WO03070084;米国特許2395698、7297540、6995013、6800753;アイゼンバーグら、2006）。
【０１３２】
同様に、多能的で、多能性のある、および/あるいは分化する細胞によって占領される足場は、死体臓器あるいは組織（骨、心臓、腎臓、肝臓、肺など）が、宿主免疫細胞が対象の組織に常駐し、その他の不要あるいは付随する宿主細胞が除去される（乖離放射線、殺菌（ムロツら、2006など）などにより）ように、および/あるいは各種脱細胞方法（米国特許6734018 ; 6962814、6479064、6376244、米パット。番5032508、4902508、4956178、5281422、5554389、6099567、および6206931、4361552および6576618、6753181、米国出願Ser。第11 / 162、715; WO/2001/048153; WO/2002/024244; WO003002165; WO/2001/049210;WO/2007/025233;欧州特許EP1482871、EP1246903、EP1244396、EP0987998、EP1244396;プレミアリーグ333870;Riederらら、2004;オットら、2008; Taylorら、1998）において治療できうる後に死体臓器あるいは組織から派生されうる。
【０１３３】
同様にして、多能、多能化および/あるいは分化する細胞にされた足場は、死体の器官または組織における免疫細胞や他の望まれないまたは付属する細胞が除去さえるように処置されたあと占領の、死体の器官または組織から得られるだろう。
【０１３４】
同様にして、本発明における多能、多能化および/あるいは分化する細胞が、ヒト組織工学におけるインクジェット式印刷に（例：。ボーランドら応用されるだろうも、2006。徐ら。 、2006;キャンベルら、2007）。それゆえに、ここで記された方法によりそのような目的のために生成され扱われた細胞も、ここで触れられている。
【０１３５】
別の好適な実施例において、選択された細胞やその結果の集団は、懸滴のなかで培養される。
【０１３６】
本発明の別の側面によれば、選択された細胞を望まれる細胞集団に分化させることを促進すると、選択された細胞は、前もって遺伝子的に組み換えられることができる。本発明の別の側面によれば、選択された細胞はのDNAまたはRNAのを符号化した、細胞を望まれる細胞集団に分化させることを促進するたんぱく質またはポリペプチドにより組み換えられてることができる。
【０１３７】
細胞集団の検査
一つの実施例では、本発明による方法は、細胞株、ドナー源、臍帯血から細胞をスクリーニングし、自己あるいはドナーの骨髄、血液、精原細胞、構成する始原生殖細胞、口腔細胞、あるいは本発明に置いて効果的なその他の細胞源からの細胞のスクリーニングが含まれる。選択した細胞は、先行技術（関ら、2006;米国特許6,432,71 1）において公知の方法により、有益な配列による分化の開始の他、トランスフェクションや治療用ベクターの成功を確認するためにスクリーニングできる。いくつかの実施例では、標準的なPCR法および核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは急速な入力方法を用いて、これらの細胞はスクリーニングされる。好適な実施例では、レポーター遺伝子の発現に応じて細胞がスクリーニングされる。いくつかの実施例では、抗生物質抵抗性遺伝子や蛍光たんぱく質（GFPのなど）遺伝子などのトランス遺伝子発現ベクターにより符号化されたマーカー遺伝子の発現によって細胞はスクリーニングされる。
【０１３８】
本発明の一実施例によれば、選択された細胞は、有効な連鎖や治療ベクターとの核酸の移入を成功させるため検査される（関ら、2006;米国特許6,432,71 1）。 いくつかの実施の形態としては、
治療ベクターと有効な連鎖細胞の検査は、特定連鎖の探知として知られている技術を用いて、有効な連鎖と治療ベクターの存在を確認される。それぞれ細胞サンプルは、同時に様々な連鎖について調べられる。あるいは、多数のサンプルは、同時に検査される。
【０１３９】
細胞の分化は、（私は）形而学的評価、（ＩＩ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を利用した（アングル - のPCR法）、ノーザンブロット（遺伝子発現における変化を監視するためのマイクロアレイ技術）、（ＩＩＩ） βチューブリン3世など（神経細胞など）（小澤ら、1985）などいくつかの手段によって監視できる。いくつかの実施例では、細胞の分化を正常にのために細胞型特異的な開始マーカーや遺伝子マーカー発現にてFACSソートを使用細胞の種類に固有のプロモーターの制御下筋ミオシンのプロモーターなどの抗生物質耐性や蛍光たんぱく質の発現など上映される細胞、人間の心臓のα-心筋の基づいアクチンのプロモーター、インスリン産生細胞のインスリンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）ののニューロンの分化や、神経伝達物質の関連するプロモーターのプロモーターのドーパミン作動性ニューロンのチロシン水酸化酵素プロモーター等）いくつかの実施例では、細胞の標準的なPCR法と核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を使用してスクリーニングされる。特に実施態様では、細胞の急速な入力方法使用してスクリーニングされる好ましい。
【０１４０】
HLAタイプの検査
特定の実施の形態としては、選択された細胞はHLAタイピングに適合するように選択される。HLAの遺伝子型は、当業者にとって既知の手段により決定される。
【０１４１】
検査に利用される細胞は、ドナーから直接採取された細胞配列、またはドナー細胞から作られた細胞株、または実用できる細胞源の中に存在する。細胞は実用的な連鎖および/あるいは治療ベクター、またHLAタイプを瞬時にそれぞれ検査される。これらの細胞は、実用的な連鎖と共にが移入されはHLA遺伝子型を見せ、核酸患者への移植を可能にする。
【０１４２】
特定の実施の形態としては、核酸が移入された細胞ははHLAタイピングすることなく移植される。他の実施の形態としては、細胞は適応するようにHLAタイピングされる。
【０１４３】
細胞の表現型を促進させる仲介物の検査
本発明はまた、表現型の変化あるいは選択された細胞および/あるいはその子孫の必要な細胞集団への分化を誘発する能力のためのたんぱく質およびエージェントをスクリーニングする方法を提供する。簡単に言えば、適切なcDNAをライブラリから相補のDNA（cDNA）のを符号化するベクターは選択した細胞および/あるいはその子孫にトランスフェクトされる。分化あるいはその他の表現型の変化を誘発する固有のcDNAのが特定されると、このようなcDNAのは孤立化され、適切な細胞（のCOS細胞など）でたんぱく質を生成するための適切な表現ベクターに複製される。
【０１４４】
その後、上清を含むたんぱく質は、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞の培養に適用できる。あるいは、候補者エージェントは、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞の培養に適用できる（米国特許6432711参照）。本発明はまた、多能性、多能化および/あるい自己再生できるようあるい選択された細胞および/あるいその子孫の分化を開始できるよう核酸をスクリーニングを行うための方法を提供する。
【０１４５】
これらの方法では、曳気穿孔法、ナノカプセル、ナノボールト、リポソーム、レトロウイルス、レンチウイルス、および/あるいはその他の適用可能なトランスフェクション手段を用いて、選択されたcDNAの（あるいは適切なcDNAのライブラリからのcDNAのあるいはその他の配列）を符号化するベクターは、選択された細胞および/あるいはその子孫にトランスフェクトされる。表現型の変化、多能性、多能化および/あるい自己再生を誘発する固有のcDNAのが特定されると、このようなcDNAのは孤立化され、適切な表現ベクターにしたアッセイ。このようなへかを決定するアッセイには、本明細書の他の項で説明される複製が含まれる。同様に、上清をふくむたんぱく質が選択された細胞の培養に可能であり、必要な変化を誘発しうるかを決定するのに適用、体外の適切な細胞（のCOS細胞など）で特定されたcDNAのに対応するたんぱく質が生成される。
【０１４６】
最後にたんぱく質は、曳気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールト、リポソーム、レトロウィルス、レンチウィルスおよび/あるいはトランスフェクションのその他の実用的な方法、多能、多能性、自己再生または分化の開始としてここに記される。
【０１４７】
患者への細胞移植
検査后、選択された細胞および/あるいはその結果である集団は、低温保存され、培養する細胞株として維持されるか、患者に与えられる。選択された細胞は、将来の移植術のために保存されよく知られている手法により、低温保存され維持することができる。
できれば、検査される細胞は、容易に採取できるものがよい。
【０１４８】
抗HIV陽性細胞の生成に関して：本発明における標的となる体細胞および幹細胞はエイズに感染しうる細胞に分化できる種類では、HIVの転写および/あるいは複写を維持でき、HIVの免疫反応を変更でき、エイズへの信仰を送らせうる種類の細胞でありうる。このような幹細胞には、精原細胞由来多能性細胞、始原生殖細胞、造血干細胞、末梢血液細胞、胎盤の血液細胞、羊水細胞、靭帯血細胞、口腔細胞、脂肪組織の細胞（これらの組織から派生した幹細胞を含む）、書き換え細胞、多能性細胞誘導、誘発多能化細胞、人間のもの以外の胚細胞、血液や免疫細胞は、HIV標的細胞およびその他の細胞を形成できるその他の細胞型が含まれる（これに限定されない）。
【０１４９】
治療ベクターは、核酸を移入した細胞または感染細胞のHIVの再生能力や転写の能力を減少させる"にな配列"を表現する。その遺伝子ベクターは、そのようなベクターから得られるいかなるウィルスと同様有用、"有用な配列"を表現し、ここでは"治療ベクター"と名づけられている。
【０１５０】
検査后、望まれる治療ベクターに（HLA遺伝型と同様にもしくはそれ無し）は、細胞を分裂させ安定的な細胞株を保たせるための標準を移入し、有用な配列を表現している細胞核酸的な培養方法（米国特許643271 1 5453357参照として引用）によって生体外で拡張される。その代わりに、これらの細胞は、患者やその生体内にすることができる投与。
【０１５１】
選択された細胞は、この技術として良く知られた方法で低温保存され、将来の移植術のためにされる保存。
【０１５２】
患者への特定細胞集団の移植
特定の実施の形態としては、細胞集団は移植に先立って幹細胞のためにさせられる増殖。幹細胞を選択する様々な方法は、この手法では良く知られている。例えば、細胞サンプルを、分化していない血液性の幹細胞（例：、CD34陽性、CD59、Thyl、CD38低く、c - kitと低く、林マイナス）を判別し、蛍光活性のある細胞種類（FACS）を分類するため、細胞表面のマーカー蛍光性のラベルをされた単クローンの抗体によって増強する。その他の実施の形態としては、選択された細胞のサンプルは、増殖させられることなく移植することである。
【０１５３】
いくつかの実施の形態としては、骨髄の内生幹細胞は、治療幹細胞の移植に先立って排除されるか減少される。治療幹細胞は、有用な配列または治療ベクターを含む幹細胞として定められる。いくつかの実施の形態としては、移植過程は、以下の段階を含む。
（1）前処置、（2）肝細胞注入、（3）好中球減少性段階、（4）生着段階、そして（5）生着完了段階。
【０１５４】
いくつかの実施の形態としては、一般的に望まれる細胞（例：。骨髄干細胞）を生成する内在性の幹細胞は、に移植先立って排除または減少される。化学療法、放射線などおよび/あるいは米国特許6217867にあるものに類似した、方法は、移植に最適な生着のために骨髄の状態と整える手法として利用されるだろう。最終的には治療幹細胞は、この技術に関してよく知られている方法を用いて患者にされるだろう移植。
【０１５５】
麻痺/Numblikeとその他の導入遺伝子を符号化したベクターの設計は、
ある実施の形態としては、Numblike /麻痺アイソフォームを符号化した核酸鎖の核酸の移入は、ウィルスの核酸の移入を介して完成される。"麻痺/Numblike符号化ベクター"単語は、核酸鎖というを符号化したNumblike/麻痺アイソフォームおよび/あるいは合成オリゴヌクレオチドがNumblikeまたは麻痺アイソフォームだけでなく、あらゆる付加的な導入遺伝子鎖、合成オリゴヌクレオチドなど、およびそれらベクター鎖と合体する関連ウィルス浮遊物を標的とするベクターである。
【０１５６】
麻痺/Numblike符号化ベクターは、遺伝子発現ベクターから成りうる。
最適な遺伝子発現ベクターはは、DNAまたはRNAのを真核細胞への核酸の移入のために。そのようなベクターは、これらに限られるわけではないが、例えばバクテリアベクター、真核されるものだろう使用ベクターなどの原核細胞ベクター、例えばイーストベクター、真菌性ベクター、またアデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、レトロウィルスベクターなどのウィルスベクターがある。動因されるレトロウィルスベクターの例としては、これらに限られるわけではないが、モロニーマウス白血病ウィルス、モロニーマウス肉腫ウィルスや、ラウス肉腫ウィルス、FIVは、HIV、SIVの、混成ベクターなどを含む。
【０１５７】
麻痺/Numblike符号化ベクターが生体内および/あるいは生体外の細胞への核酸の移入にも用いられることが明らかにている。核酸の移入は、この技術では良く知られた方法により行われ、なっ特にウィルス包括細胞から生成されたウィルスを用いて行われる。このようなウィルスは、様々なウィルスタイプにできるよう感染にキャプシド形成させられる。言うまでも無く、選択された細胞タイプおよび/あるいはその結果である集団の感染を認めるキャプシド形成技術は、本発明における状況において実用的である。
【０１５８】
ヒト免疫不全ウィルス対（HIV）の遺伝子治療用ベクターの設計
"治療用ベクター"は発現ベクターを含んでいてもよい。適切な発現ベクターはのDNAあるいはRNAのを真核細胞にするのにトランスフェクト採用できるベクターである。このようなベクターには、例えば、アデノ
有効な連鎖は、HIVウィルスが細胞に感染する、ウィルスDNAを転写する、または感染した細胞内で複製する能力を減少させるまたはHIV感染ウィルスを中和する能力を高めるものだろう。
【０１５９】
特定の実施例においては、、有効な連鎖とはHIVウィルスの侵入を妨げる合成オリゴヌクレオチドで、siRNΛ、shRNA、アンチセンスRNA またはmiRNAが、いかなるHIV受容体（CXCR4、CCR5、CCR2b、 CCR3、 およびCCRlなどに限らず）に対抗することができる。
【０１６０】
一つの実施例では、治療用ベクターとは、CXCR4、CCR5、CCRl、CCR2、CCR3、CXCR6および／あるいは BOBなどのHIV共受容体の1つまたはそれ以上を標的にする、合成オリゴヌクレオチドを含む。
【０１６１】
別の実施例では、治療用ベクターは主要なHIVウィルス共受容体であるCXCR4 とCCR5を標的にする、合成オリゴヌクレオチドなどがある。
【０１６２】
更なる実施例では、合成オリゴヌクレオチドを含む治療用ベクターは、1つまたはそれ以上のHIV逆転写酵素、インテグラーゼ、タンパク分解酵素などのHIV酵素を標的にするとある。
【０１６３】
合成オリゴヌクレオチドとして適切な連鎖は、１）コンピュータのアルゴリズムにより、標的連鎖の減少に効果的であると予想でき、２）標準の定量的RNA分析検査および、酵素活性検査で70パーセント以上、または劣っていても治療的である度合いで標的酵素を減少させる能力のあるものである。
【０１６４】
「標的配列」という言葉は、特定の配列が、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と少なくとも70%一致するヌクレオチド塩基を有しているあるいは対応するRNA配列であることを示す。本発明の特定の実施例においては、この言葉は、配列が、オリゴヌクレオチドが指向される特定のウイルスのウイルスゲノム配列あるいはその相補配列と少なくとも70%一致することを示す。合成オリゴヌクレオチドの様々な種類のいずれも、治療用ベクターのトランスフェクションを介して発現されてもよい。また、本発明はこのようなオリゴヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせに関する。
【０１６５】
一つの好適な実勢例において、合成オリゴヌクレオチドの配列を標的細胞は、特定のプロモーターにより駆動される。別の好ましい実施態様では、合成オリゴヌクレオチド配列U6プロモーターにより駆動される。
【０１６６】
合成オリゴヌクレオチドは、デコイRNAと同じ治療用ベクターに含まれる。
【０１６７】
デコイRNAは、特定のたんぱく質を結びつけ、機能を抑制するのに効果を示すRNAの連鎖である。
【０１６８】
一つの実施例では、治療用ベクターは、集合デコイRNA連鎖から成る。
【０１６９】
更なる実施例では、デコイRNA連鎖は、デコイ連鎖の安定性を与えるために提供された連鎖によって配置される。
【０１７０】
その他の実施例では、デコイRNA連鎖はRREおよび/あるいは TARデコイ連鎖である。
【０１７１】
一つの実施例では、RREと TARデコイ連鎖は、HIV-2から操作されるTARと RRE連鎖である。他の実施の形態としては、デコイ連鎖は、Psi要素デコイをも含むという。
【０１７２】
一つの実施例では、デコイ連鎖はそれぞれU6プロモータによって操作される。
【０１７３】
別個の実施の形態としては、デコイ連鎖は標的細胞の特定プロモータによって操作されている。実施の形態としては、治療用ベクターは、HIV生命サイクルの一次的な段階を標的とし、HIV-2 TAR および／あるいは RREデコイ連鎖を組み合わせて合成ヌクレオチド鎖を符号化している。
【０１７４】
別個の実施の形態としては、ベクターはmiRNAオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７５】
別個の実施の形態としては、ベクターはshRNΛオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７６】
別個の実施の形態としては、ベクターはsi RNAオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７７】
別個の実施の形態としては、ベクターはRNAiオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７８】
別個の実施の形態としては、ベクターはリボザイム鎖を含む。
【０１７９】
別個の実施の形態としては、ベクターは合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む。更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド鎖は、CCR5、 CXCR4などのHIV共受容体を標的にする。
【０１８０】
更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド鎖はインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TATなどのHIV酵素を標的にする。
【０１８１】
更なる実施例としては、リボザイム鎖は、CCR5、CXCR4などのHIV共受容体や、インテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TATなどのHIV酵素を標的にする。
【０１８２】
一つの実施例では、ウィルスは療用のベクターを用いて生成され、シュードダイピングされる。
【０１８３】
一つの実施例では、ウィルスは治療用ベクターを用いて生成され、ウィルスはシュードタイプされずに、HIVトロピズムを見せる。
【０１８４】
一つの実施例では、治療用ベクターは、ウィルスベクターである。実施の形態としては、治療用ベクターは、レンチウィルスベクターである。
【０１８５】
一つの実施例では、治療用ベクターは第三世代のレンチウィルスベクターである。一つの実施例では、治療用ベクターは、合成ヌクレオチド鎖を含む。
【０１８６】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子配列は、EF-I alphaプロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。
【０１８７】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子発現は、1)6プロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。
【０１８８】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子発現は、EF-I alpha と U6の組み合わせや、他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。実施の形態としては、HF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、miRNAの遺伝子発現を操作する。
【０１８９】
一つの実施例では、HF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、siRNA鎖の遺伝子発現を操作している。
【０１９０】
一つの実施例では、EF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、shRNA鎖の遺伝子発現を操作している。
【０１９１】
好ましい実施態様では、治療上のベクター、複数のmiRNAの配列は、CCR5、I1IV - 2 RREデコイ配列とは、HIV - 2のTARデコイ配列、およびベクターに対する監督のウイルスベクターは、複数のmiRNAの配列CXCR4に対する監督が含まれます。好ましい実施態様では、治療の治療vcctor（掲載を含む）薬理学的治療を含む抗レトロウイルス療法の他のモードと結合される。治療用ベクターとの組み合わせに適した抗レトロウイルス療法は、治療用ベクターとの組み合わせにおける添加および相乗効果のある治療である。
【０１９２】
HIVの遺伝子治療のための細胞には、末梢血Tリンパ球、単球、組織マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および/あるいは臍帯血、末梢血、および占領骨髄スペースなどの多能性造血幹細胞が含まれる、これらに限定されない。
【０１９３】
本発明は、CD4+ T細胞、マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、CDの34+幹細胞/前駆細胞および/またはその他の静止細胞分裂する細胞で、対外あるいは体内でHIV感染の標的細胞に分化可能な幹細胞や前駆細胞、CD4 + T細胞、マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および/またはCD34 +幹細胞/前駆細胞のトランスフェクションに関する。そのため、トランスフェクトされた細胞は、元の位置にある外因性の細胞あるいは、他の身体部位、あるいはその他の個々のドナーから取り出した外因性の細胞となりうる。この目的のために選択された細胞を本明細書では「選択された細胞」と呼ぶ。
【０１９４】
同様に、自己再生可能で、多能性があり、多能化可能な幹細胞の多能性（書き換され、誘発された多能性細胞を含む）は、HIVの遺伝子治療のための別の論理的なターゲットを表し、その使用は、特に本発明の対象となっている。本プロセスの一実施例では、選択された細胞（造血幹細胞、皮膚幹細胞、臍帯細胞、始原生殖細胞（PGC）、精原細胞、アクセス可能な任意の体細胞など）は、1）培養中に1つあるいは複数のサイトカイン（造血幹細胞因子、白血病抑制因子（LIF）、カーディオトロピック1、IL-11、IL-6R、GP-130、CNTF、IGF-I、bFGF、および/あるいはオンコンスタチン-M）を用いて培養され、2）当該技術分野（本明細書で参考として追加されたUSPatent 5677139方法など）で既知の方法を用いた、あるいはその他の標的細胞に関して、US Patent 5677139に類似した方法による分化の前に治療用ベクターまたは有益な配列でトランスフェクトされる。
【０１９５】
別の実施例では、核酸移入の前段階としてさまざまな段階を経るかもしれない。別個の実施の形態としては、多能性の幹細胞を生成する目的で、培養の段階だけが行われることが望ましい。
【０１９６】
その他の細胞培養条件の他、幹細胞および前駆細胞のL1Fおよび造血幹細胞因子の適切な濃度についてはすでに説明している（本明細書において参考用に引用されているUS Patent6432711および5453357）。その他の適切な基準および参考となるサイトカイン濃度については、Koshimizu et al.、1996; Kelleret al.、1996; Piquet-Pellorce、1994; Rose et al.、1994; Park and Han、2000; Guan etal.、2006; Dykstra et al., 2006において説明されている。
【０１９７】
標的細胞の集団は、体細胞、幹細胞、前駆細胞を含むであろう。幹細胞はおそらく、既存する細胞集団や採取される培養、貯蔵、低温保存された材料から分離されたものである。幹細胞の望まれる材料は、骨髄、末梢血管、胎盤血、羊水液、臍帯血、脂肪性組織、ヒト以外の胎芽などである。
【０１９８】
体細胞、特に白血球やその他のnon-progenitor/stem細胞の循環も同様の幹細胞については、上記/前駆細胞は、幹細胞を取得する/結果として、前駆細胞のプロパティの効果的な説明は、同じ培養条件にさらされることがある。
【０１９９】
本発明は、1I1V感染および／あるいはHIV複製へ相対的に抵抗するために作られた幹細胞／前駆細胞から標的細胞を生成することも明らかにする（USPatent Application 20030099621など)。
【０２００】
一つの実施例では、治療用ウィルスベクターは、ネイティブHIV株から1つないしそれ以上の包膜たんぱく質を伴い、ネイティブHIV株が感染しえるあらゆる細胞に対し感染する能力を持つ治療用ウィルスを与える。
【０２０１】
本発明のために選択された細胞は、一般的にアクセスしやすいとされる細胞である(（帯血幹細胞、骨髄幹細胞、精巣の精原細胞、原始細菌細胞、羊水液から独立された幹細胞、皮膚から独立された幹細胞など）。これら細胞はこの研究方法にてよく知られている方法により、組織から取り除くことができる。
【０２０２】
他の選択された細胞は、再プログラムされた細胞、誘導された多能細胞、多能化細胞から成るであろう。
【０２０３】
本発明の一つの側面によれば、選択した細胞から、目的の細胞株、細胞型、あるいは細胞分類を生成する方法が提供される。一般的に、この方法は、最適な成長速度で選択した細胞の成長を促進する条件下での選択した細胞および/あるいはその子孫の培養を含む。次に、生成された細胞集団は通常最適な速度未満の速度で、および細胞の必要な細胞株、細胞型、細胞分類（CD4 + T細胞など）への分化を促進する促進剤の存在下で細胞の成長を促進する条件下で培養される。本発明はこの他に、治療用ベクターによるトランスフェクション前あるいは後に当該技術分野（US Patent Application 20060099177など）で既知の手段によって、選択した細胞および/または培養中の子孫の増殖を開示する。このような方法はまた、LIF、造血幹細胞因子、11-6、IL-7、オンコンスタチン-Mおよび/あるいはカーディオトロピックI、およびその他の成長促進サイトカインなどによる培養を含む。本発明はさらに、適切なサイトカインおよびM-CSF(CSF-I )、GM-CSF、L-7、CD4+ T 細胞分化を促進する任意のサイトカインなどコロニーを刺激する因子などの成長因子を含む媒介での更なる培養により治療用ベクターで必要な細胞型にトランスフェクトされた細胞の定方向分化も開示する。
【０２０４】
選択した細胞および標的細胞のトランスフェクション遺伝子組み換えは、外因性の細胞あるいは内因性の細胞であるかに関係なく、当該技術分野（U.S. Pat. Nos. 6,432,711, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S.5,928,944, U.S. 05,910,488, U.S. 05,824,547など）において既知であり、公開済みあるいは未公開の方法、あるいはその他の一般的に通用する手段によって実施可能である。宿主細胞を変換するための適切な方法は、Sambrooket al （Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring HarborLaboratory press （1989））およびその他の研究室の教科書に記載されている。
【０２０５】
正常にトランスフェクトした細胞を選択プロトコルRNAの発現アッセイと形態素解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含むことによって識別できる。適切なレベルで外因性のDNAを発現する正常にトランスフェクトした細胞から生成されたクローンは、凍結保存（当該技術分野で既知の適切な冷凍保存方法を用いて）によって細胞株として保存できる。
【０２０６】
選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は、G418、ハイグロマイシン、アンピシリンとブラストサイジンなどの薬に耐性を与えるマーカーを含んでいてもよい。対象となる遺伝子を含む細胞は、選択可能なマーカー遺伝子が生き残り、それ以外のマーカーは死滅する薬品選択によって特定できる。
【０２０７】
本発明の実施の形態における理論上の根拠は、ここで記されている通りである。しかしながら、ここでの議論は本発明を制限し否定するものではない。ここでの手法の技術は、本発明の理論上の根拠を記すために用いられたモデルに関わらず実用的に使用されるものである。
【０２０８】
本発明は、以下の例に従い尊敬の念をこめて書かれた。しかしながら、本発明における視野は、これらに限定して示されたわけではない。
【実施例】
【０２０９】
例１．本発明に最適な導入遺伝子ベクターの構築
つの遺伝子私日成Vの- EGFPの- HSAを例に適していますEGFPの、麻痺しHGFP - Numblikc、およびEGFPの- Xのレンチウイルスベクター（ここでXは任意の遺伝子本発明で説明）の適切なウイルス性ベクターにクローニングによって生成されることができますベクター（ライザーら、2000））。アダプタのプライマーNumblikeと麻痺アイソフォームcDNAおよびクローンのPCR増幅のために遺伝的ベクターに選択することができます。クローン作成の準備では、遺伝子ベクターの酵素で消化される。その後、各遺伝子のcDNAネフ地域は、以前私はISAのcDNAを占領コーディングに挿入される。EGFPの（強化緑色蛍光たんぱく質）と細胞集団に適切なプロモーター（CMVすなわちまたはEFlアルファなど）は、以前は、ウイルスのコード領域に挿入されたこと。遺伝子ベクターのバックボーンを含むことがあり、これはプロモーターoperably異種核酸配列にリンクを調節する転写を構築します。
【０２１０】
が採用される可能性がありますレトロウイルスベクターの例を含むがこれに限定されない場合は、それらMoloneyマウス白血病ウイルス、Moloneyマウス肉腫ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、FIVとHIV感染から派生した。適切な発現ベクター、これらは、真核生物の細胞にDNAまたはRNAのトランスフェクションに雇用されることがあります。このようなベクターを含むがこれに限定されないが、例えば、細菌のベクター;真核生物のベクターなどのような原核生物のベクターは、例えば、酵母のベクターと真菌のベクターおよびウイルスベクターなどが、これに限定されない、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターに関連し、レトロウイルスベクター。レプリケーション無能pcDNA 6.2/EmGFP-Bsd/V5-DESTベクターの適切な発現ベクター（Invitrogen社）の一例であり、合成オリゴヌクレオチドの式（の miRNAなどができます）は、pcDNA 6.2重量から転送/のmiRベクターは、切断する能力を持ってターゲット配列。これらのベクターからループ配列miRNAの内因性の長いpol IIの転写産物から（事前のmiRNA）は、人工miRNAの切除を直接に隣接しています。
【０２１１】
特定の内生RNA種に対抗する複合的なmiRNA連鎖の結合は、標的細胞配列の遺伝子発現を減少させる過程の成功を促進させる可能性がある。miRNA連鎖は、手術可能な組織の特定プロモータに関連しているかもしれない。
【０２１２】
遺伝子発現のためにレンチウィルスベクターを使用することによって、Numb / Numblike符号化ベクターおよび／あるいは本発明における他の導入遺伝子ベクターは、分化細胞と非分化細胞のいずれにも安定的な形質導入能力を生む。
【０２１３】
実施の形態としては、結果として生じるNumb / Numblike符号化ベクターおよび／あるいは本発明に用いられる他の導入遺伝子ベクターは、特定のNumbアイソフォームおよび／あるいはNumblikeを減少させるために、1つまたはそれ以上のプロモータによて操作された複合的な合成ヌクレオチド鎖を含む。例２：他の適したベクターの例は、レトロウィルスベクターである。レトロウィルスは、RNAゲノムを含むRNAウィルスである。Gag、pol、 env遺伝子は、LTR配列によって配置される。5' と3' LTR配列は、mRNAの転写とポリアデルニ化を促進する。
【０２１４】
レトロウィルスベクターは、標準的なトランス活性エレメント、IRHS、選択マーカー、標準プロモータによって操作された標的異種性遺伝子を与えることができる。
【０２１５】
また、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で表現されることがあります。最後に、レトロウイルスベクターシスを含む可能性があります配列を逆転写と統合のために必要な演技。感染時には、RNAの逆のDNAには、効率的にホストゲノムに統合され転写される。本発明の組換えレトロウイルスの遺伝子組み換えなどの方法では、一部のネイティブなウイルスのレトロウイルス、感染症の遺伝子が削除されている特定のインスタンスではなく、ターゲットと細胞の遺伝子改変のための核酸配列に置き換え変更される。配列外因性の可能性がありますDNAまたはRNAは、その自然のまたは変更されたフォームです。例3：麻痺の発生の例方法/Numblike符号化ベクター（s）、および/または他の遺伝子組み換えベクター本発明（s）の
麻痺結果/Numblike符号化ベクター（sの生成のための方法）、および/または他の遺伝子ベクター、本発明のこれらのInvitrogen社のウイルスパワーレンチウイルス発現システムマニュアル、2007年に教えています。簡潔に、EmGFP- bsdのカセットPmIlとしてクローン化されてBIpIフラグメントpLenti6/R4R2/V5-DESTベクターに一方、工場長（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォームかのmiR-短い感覚アイソフォーム/ numblikeカセットを同時に血圧によって転送されるpDONR221に反応。その後、調節性のプロモーター（s）とのmiR -アイソフォームカセットマルチサイトのlrされている変更に渡ったpLenti6/EmGFP-bsd/R4R2-DESTvector。複数のベクターは、この方法で合成オリゴヌクレオチドと遺伝子カセットのさまざまな組み合わせで構成で生成することができます。
【０２１６】
pLenti6/R4R2/V5-DESTベクター配列：
【０２１７】
【化１】
【０２１８】
【化２】
【０２１９】
例４：治療用ベクターの生成の追加的方法
「包括細胞ライン」は、ウィルス gag、 pol、 env構造遺伝子によって、通常細胞が核酸移入されたまたは感染されたことに由来するヒトおよび／あるいは動物の繊維芽細胞から得られる。
その一方で、包括細胞株は、psi配列のRNA欠陥を生む。従って、包括細胞から生成されたウィルス粒子は、gag、pol、env遺伝子を含まない。一度、psi配列を含むベクターのDNAが包括細胞に導入されると、核酸移入ならびに感染のために、包括細胞は治療用のRNAを最終標的細胞(例：.a CD4+細胞)へ移送する様々な能力を生成する。
【０２２０】
治療ベクターの「感染しやすい範囲」は、包括細胞株によって決められる。
包括細胞株の数が、ヒトの細胞タイプに感染しやすい範囲のウィルス生成に役立てられる。これらの包括細胞株は、それでも普段自然に存在し他の動物種に感染しやすいウィルスから得られるウィルスベクターのキャプシド形成ができる。例えば、SIV またはMMLVから分割したベクターは、GP 120キャプシド形成細胞株により包括される。治療用ベクターの補完物を生成する例のプルコトルは以下の方法で得られる。
【０２２１】
１．20マイクログラムのレトロウィルスベクターが、一般的なプラスチック・チューブのIIepes緩衝生理食塩水0.8‐1ミリののタッピングによって選別できるマーカー遺伝子を含まれた2‐3マイクログラムのウィルスDNAと混ぜ合わせられる。
２．70マイクロリットルの2MCaClが、一般的なタッピングを繰り返しながら混合液に入れられる。
３．チューブの中に、青い沈殿が初めて起こったら、生成物は包括細胞の30%の密集した層に生成される(いかなる数の商業用ベンダーから)。DNA混合液は、包括細胞から最初に媒体を除いた後に得られる。
４．包括細胞は、室温25度の部屋で20−30分培養してから、36‐38度の孵化機に3.5時間入れられる。
５．3.5-4ミリの15%グリセロールを含むヘペス緩衝液に3分間加えて、細胞をDulbecco's 修正Eagle's 媒体(DMEM)+! 0% FBS x2で洗浄する。
６．DMKM+10% FBSにもどし、37度で20時間培養する。
７．取り除き、治療用のウィルスを含む培養液をフィルターする。
【０２２２】
過剰なウィルスの上澄みは、瞬時に貯蓄され摂氏80度の培養に集められる。上澄みは、5から8マイクログラムのポリブレンとともに保存され、標的細胞感染の効果を増加させる。別の方法で、ポリブレンは感染させる前に取り除かれるであろう。
【０２２３】
安定的な生産者ラインは、
8。安定的な生産ライン20に分割パッケージング細胞ライン1、または1から40と、その後に、これらの細胞の培養に10日間（）によって媒体選択薬を含む（特定の抗生物質をトランスフェクトした抵抗性遺伝子に対応する例の中3日ごとに変化を確立することができます）。
【０２２４】
10日培養されたのちに取り出され、一定分量に分けられ保存のために冷凍される。
【０２２５】
アッセイレトロウイルス感染性の/滴融合"テストの層にウイルス上清の定義されたボリュームのアプリケーションで実現しています"細胞のようなNIII 3T3細胞20％の合流点にメッキ。NIHのための後、2〜3の細胞分裂回（24-36時間3T3細胞）"テスト"のコロニーの細胞系抗生物質には37度を含む培地で培養カウントされる。清の力価、これらの植民地から推定されている次の算式によりカウント：
コロニー形成単位/mlの=植民地Xの0.5（分割要因）を同定/ウイルスの量（）mlの
この推定値の精度は、大量のテストによって増加は、"テスト"細胞の多くはプレート上清。
この見積りの正確性は、「試験」細胞より多くのより多くの上澄みをテストすることで増加する。
【０２２６】
治療用ウィルスの上澄みのアプリケーションは、治療での状況に適した様々な方法により成される。
【０２２７】
例５：選択された細胞のための成長培養環境
選択されたセルを拡大することができます/ダルベッコの修正最小必須培地（DMEM培地）で栽培さグルタミンで補足し、β-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。LIF および、多能性、未分化または多能性の状態では、このような細胞をダルベッコの修正最小必須培地で維持することができます選択したセルを維持するために不可欠である細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上を維持し、選択したセルの必要性を置き換える（DMEMに）グルタミンと、補完β-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。 LIFおよび未分化状態を米国特許6432711（一部屋あたり）細胞の維持に不可欠な細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上のセルを維持するため必要が置き換えられます。
【０２２８】
ためには、細胞をトリプシンている神経細胞には、選択した細胞の分化を開始するとLIF無料で洗浄し、DMEMに置か10％牛胎児血清（FBS）を補充。 DMEM培地に再懸濁と10％のFBSをした後、IXlO5細胞を5mlのDMEMに、10％FBSを、0.5ミクロンのレチノイン酸では、細胞の小さな集合体を形成すると予想されている60ミリメートルフィッシャー細菌学生のペトリ皿で、メッキされる。適切な細胞の分化の集約に役立ちます。適切な神経細胞の転写因子を持つ高効率トランスフェクションの前またはDMEM培地、FBSを、レチノイン酸のめっき後に発生することができます。（追加の詳細については）米国特許643271 1 5453357してください。
【０２２９】
例６：HLAマッチング 標的細胞(例：例：臍帯血、その他の適する根源および／あるいはその結果からの臍帯血または細胞.)は検査され、遺伝子組み換えされ（オプション）、増殖させられ、望まれる細胞タイプ（オプション）への分化のために誘導される。それら細胞は、標準的な幹細胞移植プロコトルに従って移植される。確かな例として、細胞はHLAマッチングなしに移植される。例７：ごくまれな例では、生体内における細胞分化を刺激し促進させる目的で、導入遺伝子を符号化するベクターを患者に導入することは適切であるとされている。
【０２３０】
例８：選択された細胞の遺伝子組み換え
体外では外因性の細胞や、患者の内因性の細胞の遺伝子改変のいずれかまたは未発表の方法は、アート（米国パットなどに知られて公開さに応じて実行することができます。番6,432,71 1、米国05593875、米国05783566、米国5928944、米国05910488、米国05824547など）や、他の一般に受け入れられたことを意味し。宿主細胞に変換するために適した方法をSambrookらで発見することができます。 （分子クローニング：実験室マニュアル第2版、コールドスプリングハーバー研究所を押します（1989））、および他の研究室の教科書。正常にトランスフェクトした細胞を選択プロトコルRNAの発現アッセイと形態素解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む識別される。正常にトランスフェクトした細胞からクローンは、適切なレベルでは、適切な外因性のDNAを表現する凍結保存によってセルの行（）として凍結保存の芸術に知られている任意の適切な方法を活用し維持することができま
選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、これらG418、ハイグロマイシンとメトトレキサートなどの薬に耐性を授与などがあります。細胞の関心のある薬剤選択によって識別されることができる遺伝子を含む場所のセルには、選択可能なマーカー遺伝子の生き残る設立しており、他の人死ぬ。
【０２３１】
現在の発明"とは、発明の選択されたセル"とは、遺伝子組み換え細胞の選択を開示する。長期的遺伝子改変細胞の遺伝子の改変に選択したセルを、天然または合成の核酸を導入することを指します/またはその子孫、または不死化細胞株および/または任意の芸術に既知の手段によってその子孫。また培養条件は、遺伝子発現パターンの永続的な変化を誘発する本遺伝子改変を表すために考えられている。幹細胞の改造かどうかは、ホストの脳から派生する、内因性ドナー源、外因性のドナー源、またはセルの行を、特に人間の神経システムの特定の人間の病気の治療に実行可能なアプローチを表しています。
【０２３２】
遺伝的変更は、この情報開示の対象が、これらに限定されていません：遺伝的改良in vivoでの実行;変更は、アクティビティや代謝酵素の内因性または外因性の選択したセルを発現量を変更する/またはその子孫;変更は、活動の量を変更する細胞たんぱく質の、または抗原;は、アクティビティや蛋白質のシグナル伝達経路に関与する量を変更する変更、修正は、HLAのタイプを変更する;は、細胞の分化を変更変更;は、腫瘍の可能性を変更する修正;は、細胞の分化を変更変更;変更は、変更する量や構造たんぱく質の活性;は、量や膜関連たんぱく質の活性を変更する変更（構造や酵素）;変更は、アクティビティやたんぱく質、DNA修復および染色体の維持に関与する量を変える;変更は、アクティビティやたんぱく質の量を変更する細胞輸送に関与する;変更は、アクティビティや酵素の量を変える;変更は、アクティビティや蛋白質のシナプスの形成と維持に関与する量を変える;変更は、アクティビティやたんぱく質の神経突起伸長や軸索伸長や形成に関与する量を変える;変更は、セル内の量や抗酸化物質を生成酵素の活性を変える;は、変更後の細胞内たんぱく質の翻訳後修飾につながる変更;は、アクティビティやたんぱく質の細胞修復の他の側面に関与する量、これは寿命の増加変更変更変更細胞テロメラーゼの生産（など）。これら上記のようにこのような蛋白質、DNAやRNAによるヒトゲノムや他の動物、植物、ウイルス、または細菌ゲノムから派生したエンコードされることがあります。また、配列ノボド設計をカバーこの発明は。
【０２３３】
加えて、本発明に関連して、選択したセルとのin - situ、遺伝子組み換え技術で/またはその子孫細胞は病気の治療のために。内因性の細胞に直接注入やDNAまたはRNAベクター、ウイルス、レトロウイルスなどのアプリケーションでその場で変更することが幹細胞は、組織の物質にリポソーム等、または脳室系の適切な部分に。1992年以来、我々は、この方法で、幹細胞の数千/前駆細胞や何千もの子孫細胞を更新している。私たちのデータを表示、変更、セルの種類の非常に様々な神経システム全体の前駆細胞の結果を変更する副作用のような結果はないが、この方法、および。例9：遺伝子ベクターの導入は、ホストに。
【０２３４】
好ましい実施態様では、内因性細胞のベクターと、これらのような本in vivoでのホストの血液、組織、中枢神経系への治療のベクター（s）の導入によって、骨髄などの最大の利点は変更することによって達成される可能性があります説明トランスフェクトされる内因性の標的細胞の数が多い。これは、適切に、デバイスのように、または静脈や動脈循環には、治療のベクターを注入する針、筋肉組織、または中枢神経系になどの特定の組織にカテーテルのサイズを使用することによって達成されることがあります。好ましい実施態様では、ウイルスVSVの偽型は- gをエンベロープ糖たんぱく質とネイティブのHIV -私envたんぱく質。
【０２３５】
例10：注射神経系の移植を選択したセルに成長や分化のメディア（のいずれか）は胎児の神経系や内因性の胎児の細胞の遺伝的ベクターを利用した遺伝子組み換え技術により、次の方法で達成される可能性があります：無菌状態の下では、子宮や胎児を超音波やによって視覚化され放射性物質の指導、他。で胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の識別を容易にする別の方法としては、子宮手術で公開されることがあります。選択されたセルを注射によって（使用して適切にカテーテルや針の大きさ）は、心室のシステムは、胚ゾーン（掲載に）導入することができますまたは中枢神経系の物質に。注射特定のインスタンスでは、母親の腹壁を介して実行されるかもしれませんが、胎児に子宮壁と胎児の膜。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体に基づく方法、またはその他の手段によって監視されて指導を芸術に知られ放射線。
【０２３６】
腹部の壁は、胎児に子宮壁と胎児の膜。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体ベースの方法、または指導art.Under適切な無菌状態のことが知られ放射線、胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の身分証明書を視覚的にも達成されるのは他の手段によって監視されて物理的な検査や触診で結合によって定位と指導放射線。細胞培養後、選択、または分化細胞の適切な量を注射または他の手段によって心室のシステムは、胚のゾーン、または中枢神経系の物質に導入することができます。注射の精度を直接観察、超音波、またはによって監視されることが放射性物質の指導、他の。
【０２３７】
ハンチントン病やパーキンソン病、脳の特定部分の細胞のような大人の特定の、神経の病気では中枢神経系、選択的に影響を受けます。パーキンソン病の場合には、黒質のドーパミン作動性細胞です。無菌状態の下で細胞分化の地域特有の疾患の細胞の、ローカライズされた移植大人に影響を与えるX線写真により実現されるように誘導された移植します。放射線技術指導、CTおよび/またはMRIの使用を含めることが注入された材料を監視する利点は、コントラストや同位体比を用いた手法を取ることがあります。
【０２３８】
特定の神経系の病気では、いくつかの代謝貯蔵障害などの細胞は神経系の多様な地域間、そして最大の利点は影響を受けている遺伝子組み換えによって達成される可能性があります成長文化（いずれかから、内因性の細胞または本発明の選択されたセルの導入を変更するびまん性の方法で、大量に組織にメディアや差別化中）。中枢神経系では、これらの疾患の最高の心室内注射によって（適切に、デバイス、または針）の開発の初期段階（特に）では、びまん性内因性のセルを変更または選択したセルの拡散engraflment分離できるようになるカテーテルのサイズを使用して接近する可能性がありますの成長および/または分化のメディアから。それにもかかわらず、同じ目的のために循環系への細胞の注入も覆われている。しかし、すべての障害、複数の臓器や体のびまん性（）リソソーム貯蔵障害、hemoglobinpathies、筋ジストロフィーなどに影響を与える点で、細胞の成長および/または分化メディアからの分離にも優先的に直接循環および/または臓器に導入される可能性があります肝臓、腎臓、腸、脾臓、副腎、膵臓、肺などの臓器は、胸腺を使用して指導し、任意の適切な、デバイスのように、全身の細胞のびまん性移植できるだけでなく、特定のカテーテルのサイズの内視鏡導入と細胞の浸潤、選択された臓器に。
【０２３９】
例11：血液循環の流れと器官への注入による細胞輸送
1つの器官系の病気別々の器官系から遺伝子組み換え細胞を治療できる可能性があります。また、いくつかのインスタンスで、その選択したセルを統合することがありますが独自に生体内、十分な数字で区別する場合は、血流は動脈、静脈または肝、に成長との培養後に注入され、/または明らかになる可能性があります分化メディア。このアプローチは、本発明で覆われている。びまん性筋の治療（）、（遺伝性球状赤血球例えば、鎌状赤血球貧血、他のhemoglobinopathies等）は、例えば、細胞の成長をメディアや差別から分離されたの注入を伴うことがあります器官、組織、または血液疾患筋ジストロフィーなど患者にメディア、特に、患者の循環。このアプローチは、また、心筋梗塞、脳卒中などの虚血性傷害を改善するだけでなく、脳や他の組織への外傷と考えられています。針やカテーテルによる血流中にそのような細胞は、現在の発明により生産の射出、直接ように、細胞の"ホーム"は、骨髄、筋肉を有効にして、腎臓、肺、および/またはその他の他の器官系、骨髄空間にだけでなく、注射液を直接、本発明の練習用に適しています。とや、超音波、放射線や透視また、本発明の練習用に適していますせずに、損傷部位に細胞を同様に注射を直接。
【０２４０】
本発明において有効な選択された細胞を独立させる方法は、Zhao et al., 2006によって書かれているものを含む。
【０２４１】
実施の形態としては、Numblike および／あるいはNumbアイソフォームを符号化する遺伝子ベクターは、Numb またはNumblike導入遺伝子の術法によりアプローチ可能なプロモータにより成る。
【０２４２】
別個の実施の形態としては、核酸移入のモードは、Numblike とNumbアイソフォームの永久的な遺伝子発現よりも、一過性の遺伝子発現を誘導する核酸移入から選択されることができる。
【０２４３】
例12：遺伝子組み換えの例
これは、病気の数百の臨床条件ができると考えられて扱われることをおよび/または含む本発明の方法によって、改善さないようにカナバン病（ASP）に限る。テイサックス病（HEXAの）;レッシュナイハン症候群（HRPT）;ハンチントン病（HTTの）;スライ症候群;タイプAとBのニーマンピック病型;サンドホフ（HEXB）病、ファブリー病（総賃貸）; C型ニーマンピック病（NPCl）;ゴーシェ病（ GBアドバンス）;パーキンソン病（PARK2等）フォンヒッペルリンダウ病、鎌状赤血球貧血（HBB）およびその他のサラセミアなどと同じような病気。これらの導入遺伝子のコーディング領域、または通常の遺伝子のコーディング領域の一部を表すことがあります。は、特定の実施態様および例は、上記に限定されることが理解されるためには、しかし、その発明の範囲ではありません。発明以外の練習になるかもしれません、特に説明しても、添付の特許請求の範囲内である。
【０２４４】
例13：多能化細胞を提供し、長Numbアイソフォーム、Oct-4、Sox-2、 EmGFP核酸鎖を発現するベクターの配列の例は、
【０２４５】
【化３】
【０２４６】
【化４】
【０２４７】
【化５】
【０２４８】
【化６】
【０２４９】
【化７】
【０２５０】
【化８】
【０２５１】
上のベクター配列に対応する図式化マップは、図１に示されている。
【０２５２】
ベクターを完全にdenovoの遺伝子合成、または一部を麻痺、ソックスとOCT3のクローン技術で構築される可能性があります/位置LacZのでインビトロジェンpcDNA4tolacZベクターの中で占領に4cDNA配列。同様に、tetR遺伝子インビトロジェンpcDNA6/TRベクターの中で発見される。遺伝子を参照の配列を符号化もpcDNA41acZベクターにクローニングに適しています。
【０２５３】
代わりにtetR遺伝子は標的細胞に、pcDNA6/TRベクターを、tetR遺伝子とそのPCMVプロモータを除いた配列により構成されるベクターとの組み合わせにより核酸移入されるだろう。
【０２５４】
同様に、複数のベクターに限り、要素要素に似て採用される可能性があります上記の配列に含まれて存在している。このプロモーターの競争の可能性を減らすことができます。は、他の条件のプロモーター要素は、テトラサイクリン感受性のプロモーター要素の代わりに使用されることが理解されるためだ。
同様に、複合的なベクターは
例14 ここに記された方法（または公表された方法）により生成された、静脈内および投薬内の多能性の幹細胞は、移植細胞が老年期の患者において寿命または健康を増進させるであろう投薬に1回かそれ以上与えられることを期待されている。
【０２５５】
例15 遺伝子細胞の生成
本発明は、ここで記されている方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能、多能性、自己再生できる幹細胞から遺伝子細胞を誘導することについて触れている。このような遺伝子細胞の生成は、不妊の治療ならびに生体外での胎芽の生成に適すると考えられている。(例：. Hubner et al., 2003; Kehler et al., 2005;Nayernia et al., 2006a; Nayernia et al., 2006b; Drusenheimer et al., 2007;Moore et al., 2007; etc.)
例16：形質転換動物の形成
本発明は、形質転換動物の形成についても触れている。ここで記されている方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能性細胞は、本発明に関して知られている方法により形質転換動物を形成することに有効利用されるだろう。
【０２５６】
例17：治療用ベクターの構築
が採用される可能性がありますレトロウイルスベクターの例を含むがこれに限定されない場合は、それらMoloneyマウス白血病ウイルス、Moloneyマウス肉腫ウイルスから派生した、
とラウス肉腫ウイルス、FIVや、HIV。適切な発現ベクターは、真核生物の細胞にDNAまたはRNAのトランスフェクションに雇用されることがあります。このようなベクターが含まれますが原核生物のベクターには、例えば、細菌のベクター;真核生物のベクターなどのような制限はありませんが、例えば、酵母のベクターと真菌のベクターおよびウイルスベクターなどが、これに限定されない、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターに関連し、レトロウイルスベクター。
【０２５７】
レトロウィルスの例は、ここに挙げるものに限られないが、モロニーマウス白血病ウィルス、モロニーマウス肉腫ウィルスや、ラウス肉腫ウィルス、FIV、 HIVから得られたものがある。適した遺伝子発現ベクターは、DNAまたはRNAを真核生物細胞に核酸移入するために動因される。そのようなベクターには、ここに挙げるものに限られないが、含まれる。
【０２５８】
レプリケーション無能pcDNA 6.2重量/ミールとpcDNA 6.2/EmGFP-Bsd/V5- destにベクターを適切な発現ベクター（インビトロジェン社）の例ですと、合成オリゴヌクレオチドの式（miRNAの例を許可）は、ターゲット配列を切断する能力があります。これらのベクターからループ配列miRNAの内因性の長いpolIIの転写産物から（事前のmiRNA）は、人工miRNAの切除を直接に隣接しています。
【０２５９】
代わりに、HIVpsi配列の包含は、治療用ベクターにネイティブのHIV遺伝子と戦い、ウィルス粒子だけでなく抑制性のHIV輸送物質に包括することを許可する。
【０２６０】
単一の標的に対抗する複合的miRNA鎖の結合は、標的連鎖発現を減少させる成功率を上昇させる。miRNA連鎖は、EF-I alphaプロモータ、いかなる Tcell 特定プロモータのような特定組織のプロモータまたは望まれる細胞での発現を誘導するマクロファージの特定プロモータに手術によりリンクする。
【０２６１】
遺伝子発現のためのDESTベクターを利用すると、結果として生まれた治療用ベクターは、分割した細胞と分割していない細胞の両方の安定的な形質導入を可能にする。
【０２６２】
実施の形態としては、治療用ベクターは、CXCR4、CCR5および／あるは標的細胞におけるHIV感染の共受容体に作用すると知られている他の細胞たんぱく質の発現を減少させるための、1つないしそれ以上のプロモータにより操作される複合的な合成オリゴヌクレオチド連鎖を含む。
【０２６３】
ある治療用ベクターでは(2006年に構築)、CXCR4 とCCR5の共受容体を標的にする4つのmiRNA連鎖が、HIV -2 TAR とRRE を標的にするRNA連鎖に従って、pcDNA6.2 GW/miRベクターにクローンされる。
【０２６４】
遺伝子の構築は、ベクターの背景、異種核酸連鎖の手術によりアクセスできるプロモータを生成するトランス活性化因子を含む。
【０２６５】
他の適したベクターの例としては、レトロウィルスベクターがある。レトロウィルスは、RNA遺伝子を含むRNAウィルスである。gag、 pol、 env 遺伝子は、LTR連鎖によって配置される。5' と 3'LTR連鎖は、転写とRNAのプロアデニル化を促進させる。
【０２６６】
レトロウイルスベクターは、ターゲットの異種遺伝子調節性プロモーターによって運営さ調節できるtransactivating要素は、内部リボソームリエントリー部位（IRES）、選択マーカーを提供することがあります。
【０２６７】
また、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で表現されることがあります。最後に、レトロウイルスベクターシスを含む可能性があります配列を逆転写と統合のために必要な演技。感染時には、RNAの逆のDNAには、効率的にホストゲノムに統合され転写される。本発明の組換えレトロウイルスの遺伝子組み換えなどの方法では、一部のネイティブなウイルスのレトロウイルス、感染症の遺伝子を削除し、変更された実施の形態ではなく、ターゲットと細胞の遺伝子改変のための核酸配列に置き換えています。配列外因性の可能性がありますDNAまたはRNAは、その自然のまたは変更されたフォームです。
【０２６８】
例18：治療用ベクターを生成する方法の例
治療用ベクターを生成する方法は、Invitrogen's Viral Power Lentiviral Expression Systems Manualに記されている通りのものを含む。簡潔に言えば、EmGFP-bsdカセットは、miR-dccoyカセットが同時にBP反応によってpDONR221に輸送される際に、PmII-BIpI断片として複写されpLenti6/R4R2/V5-DESTベクターとなる。それから、EFIaプロモータとmiR-decoyは、修正されたpLenti6/KmGFP-bsd/R4R2-DESTベクターに交配する多部位LRである。
pLenti6/R4R2/V5-DESTベクター配列：
【０２６９】
【化９】
【０２７０】
【化１０】
【０２７１】
【化１１】
【０２７２】
【化１２】
【０２７３】
例19：生体内で増殖/増殖性の幹細胞/前駆細胞のための方法
順）HIV感染症とは、比較的1に耐性のある標的細胞の大量取得する/または2）HIVの複製および/または3）HIVの転写、前駆細胞/細胞をダルベッコの修正最小必須培地（DMEM培地）で補完成長することができます幹グルタミンとβ-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。 LIFおよび前駆細胞の維持に不可欠である前駆細胞を維持するための必要性/細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上の幹細胞を置き換える/未分化状態の幹細胞。
【０２７４】
例20：幹細胞は個人から集められ、細胞は治療用ベクターによって核酸移入され、HLAタイピングやマッチングを伴うか否かで一般的な方法により移植の準備をする。
【０２７５】
例21：臍帯血サンプルは臍帯血バンクから得られる。細胞は、有用な配列の治療用ベクターに核酸移入され、HLAタイピングやマッチングを伴うか否かで一般的な方法により移植の準備をする。例22：治療用ベクターの細胞含有物に適する合成オリゴヌクレオチド配列の例
70%以上のたんぱく質発現を減少させるいかなる合成オリゴヌクレオチド鎖も本発明により言及されている。
【０２７６】
任意の合成オリゴヌクレオチド配列が正常に標的細胞の能力を"70％以上をHIVに感染複製を維持するために削減が低い"の70％が治療の学位またはHIVウイルスの活動やしかし、治療の程度低いまた、この発明によりカバーされています。
【０２７７】
Examplesof miRNA sequences include miRNA sequences derived by IVGN
【０２７８】
【化１３】
【０２７９】
Similarly,miRNΛ sequences targeting the CCR5 gene include top strand: 5'-
【０２８０】
【化１４】
【０２８１】
例23：治療用ベクターにおける細胞含有物に適したデコイRNAの例
すべての桜が正常に標的細胞の能力を"70％またはITIV複製を維持するために削減する配列が低い"の70％が治療の学位またはHIVウイルスの活動やしかし、治療の程度低い本発明でカバーされています。
【０２８２】
例TARをデコイ配列です。
【０２８３】
【化１５】
【０２８４】
Anexample RRE decoy sequence is 例RREデコイ配列です。
【０２８５】
【化１６】
【０２８６】
例24：RNAデコイの安定性を提供する側面連鎖
RNAデコイに適した側面連鎖の例は以下に挙げられる。
【０２８７】
【化１７】
【０２８８】
以前は、それはとりのいずれかの側にヘアピン、19ヌクレオチドの5'側のU6のRNAの（したNTDS）も3'幹、直ちにPOEIII用ポリターミネータの前に並ぶ配列、実証されたより高い安定性を示した。この配置は3'-5'エキソヌクレアーゼの攻撃から保護するものと期待されている3'トレーラーを挿入するRNAの折り畳みに干渉する可能性を低減する。は、最初の3年/4 tRNAの配列は、挿入の5'末端に存在して保護されるべきであるし、核からの輸出を阻止する必要があります（グッドら、1997）。
【０２８９】
例25：治療用のベクターの受け入れ先への導入
実施の形態としては、血液幹／前駆細胞、標的細胞は、生体内において治療用ベクターの受け入れ先血液や組織、骨髄への導入により治療用ベクターによって核酸移入される。最大の有効点は、より多くの標的幹細胞／子細胞を組み換えることによって得られる。これは、適したサイズのカテーテルのような装置を用いて、また治療用ベクターを静脈や循環動脈に注入するための針などを利用して行われる。
【０２９０】
例26：受け入れ先への遺伝子組み換えされた細胞の導入
成長した末梢血管Tリンパ球、単球、マクロファージ、T細胞子細胞、マクロファージ単球子細胞、および／あるいは多能性の造血幹細胞などの血液細胞は、他の幹細胞/前駆細胞と同様に、生体外において治療用ベクターを用いて核酸移入される。治療用ベクターの適切な濃度は、Browninget al., 1999と一致したものである。その後、治療用ベクターによって核酸移入された細胞は、骨髄や他の組織で"本拠地化"できる。
【０２９１】
ここで書かれている例や実施の形態は、説明的な目的であり、様々な組み換えまたは変化が起こると考えられる。全ての引用された出版物、特許、特許出願は、すべての目的において、ここで編入されたことを理解されなくてはならない。
【０２９２】
例27：本発明を利用し発現、標的にされた導入遺伝子の例
本発明を実行するのに有効な導入遺伝子配列は、本発明への利用に有効である。適したヌクレオチド連鎖は、望まれる細胞の活性が得られる限り、どの種からも採取される。このような連鎖の呼称方法は、ここで記された小さなものから重要なものまで、特別な種類は表わさない。NCBIデータベースに保存される連鎖は、上記の本アプリケーションにあるような例を表わす。これらは、本発明に有効な連鎖を符号化する特定導入遺伝子の例でもある。
【０２９３】
【化１８】
【０２９４】
【化１９】
【０２９５】
【化２０】
【０２９６】
【化２１】
【０２９７】
【化２２】
【０２９８】
【化２３】
【０２９９】
【化２４】
【０３００】
【化２５】
【０３０１】
【化２６】
【０３０２】
【化２７】
【０３０３】
【化２８】
【０３０４】
【化２９】
【０３０５】
【化３０】
【０３０６】
【化３１】
【０３０７】
【化３２】
【０３０８】
【化３３】
【０３０９】
【化３４】
【０３１０】
【化３５】
【０３１１】
【化３６】
【０３１２】
【化３７】
【０３１３】
【化３８】
【０３１４】
【化３９】
【０３１５】
【化４０】
【０３１６】
【化４１】
【０３１７】
【化４２】
【０３１８】
【化４３】
【０３１９】
【化４４】
【０３２０】
【化４５】
【０３２１】
【化４６】
【０３２２】
【化４７】
【０３２３】
【化４８】
【０３２４】
【化４９】
【０３２５】
【化５０】
【０３２６】
【化５１】
【０３２７】
挿話として引用されている全刊行物の内容および次のアメリカ合衆国における特許は、そのま記載および追加されている。5453357, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S. 5,928,944, U.S.05,910,488, U.S. 05,824,547
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本国内段階での出願（35 U.S.C. § 371）は、国際出願PCT/US2008/065007（35
USC §120）（2008年5月29日出願）の継続であり、35 U.S.C. §119での米国仮出願60/932,020号（35 U.S.C. §119）（2007年5月29日出願）、米国仮出願60/933,133号（2007年6月5日出願）、米国仮出願60/933,670号（2007年6月8日出願）、米国仮出願61/006,449号（2008年1月14日出願）、米国仮出願61/064,761号（2008年3月25日出願）における利益を請求するものであり、各出願における内容全体は参考として本明細書に記載する。
【背景技術】
【０００２】
21世紀の医療における優れた挑戦は、損傷し擦り切れまたは遺伝子学的に損なわれた細胞を、再生するまでになっている。DNAへ明確に結ばれる転写調節因子は、遺伝子発現の調節において重要な役割をなしている。それは各細胞において転写調節因子の補完物であり、どの細胞プログラムが活性化され、どれが消去されているかを決定するものである。この機能で転写調節因子は、細胞の同一性を決定・維持し、同様に細胞の脆弱性を決定する役割がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（発明の要約）
まだ多能化されず自己再生できない細胞から、増殖し自己再生し、多能で多能化できる細胞集団を得る能力は、細胞療法を利用する全ての分野において明らかに有益なものであろう。骨髄移植、輸血、遺伝子療法を含むこれらの分野により、患者独自の幹細胞や、その他望まれる種類の細胞の生成が可能になる。同様に、神経、筋肉、その他の様々な細胞集団への分化を始める能力は、医療や動物を含む商業面の過程にとって大きな価値を生むであろう。それに応じて本発明は、遺伝子生成、多能な細胞集団の利用、多能性の細胞集団の利用、神経細胞集団の利用、筋細胞集団の利用、またHIV耐性細胞のような他の望まれる細胞集団の利用の方法を提供する。
【０００４】
本発明の請求は、単独もしくは（Notch、NumbNumblikeなど）他の細胞運命デターミナントとの組み合わせによって、一時的（多能、多能性、自己再生可能）で（分化されたまたは肉体）細胞の遺伝子表現型の調整を可能にする相互転換する、特定の転写調節因子の有効的な介入または過剰発現についてである。
【０００５】
信頼できる遺伝子表現型の確実な転換や細胞の再プログラムの能力により、個々の患者に適応した幹細胞、代替細胞、組織、器官の生成が可能になる。
【０００６】
遺伝子治療技術や細胞培養技術に合わせて、細胞タイプの相互交換は、移植に適応できる、疾患に耐性があり、遺伝子学的に修復された細胞を生成することもできる。
【０００７】
本発明の目的は、増殖でき、自己再生可能で、多能および／あるいは多能性の細胞集団だけでなく、他の望まれる細胞集団を生成する方法を、癌遺伝子を使わずに分化した細胞または分化していない細胞から提供することである。分化した細胞集団は、特定に分類された細胞タイプと関連する全てのマーカーではないが、いくつかのマーカーを発現する細胞から成る。ここで述べられているように、適切な麻痺した、他の導入遺伝子（特に転写調整因子）との組み合わせによって発現するアイソフォームは、分化した、多能化した細胞集団または分化している細胞集団の生成を可能にする。さらに本発明における遺伝子ベクターは、遺伝子組み換えや(例：患者で遺伝子産物の不足が発現)、一時的もしくは永久的に増殖でき、自己再生でき、幹細胞や前駆細胞を生成するために使われ、それらの細胞は、生体内において内在性の細胞で作用し、普通ではこのような作用は見せない組織の中で発見されたものである。最後に、本発明における他の遺伝子ベクターは、（癌細胞など）異常な作用を見せる細胞で、遺伝子組み換えを行いおよび／あるいは増殖し、自己再生でき、または幹細胞／前駆細胞を防ぐのに用いられる。病気の過程を和らげるのを予想する、オリゴヌクレオチド鎖の発現を可能にする、治療上のベクターや細胞を生成することも本発明の目的である。例えば本発明では、有害なHIV遺伝子の発現を減少させ、他の免疫不全ウィルス感染、発現また拡大を防ぐ合成オリゴヌクレオチドの利用方法を明らかにする。
【０００８】
本発明は脊椎動物の細胞ならびに魚類、哺乳類、鳥類、両性類、爬虫類の細胞など、いかなる適した細胞にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】は、例13のベクター連鎖を図式化したベクターマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
全ての特許、特許出願、ならびに本出願書で引用された出版物は、そのまま参照し本論に引用されている。ここで論じられているように、「DNA」はデオキシリボ核酸を表わし、「RNA」はリボ核酸を表わす。ここで書かれている、「ｃDNA」は補足DNAを意味し、「ｍRNA」はメッセンジャーRNAを表わす。
【００１１】
「siRNA」は小妨害RNAを表わし、「shRNA」は小U字型RNAを表わす。「miRNA」は、単一ストランドRNA分子や、特に約20から30の原子核を持ち遺伝子の発現を規制する可能性があるマイクロRNAを表わす。（「decoy」「decoyRNA」ならびに「RNAdecoy」は、リガンドの自然に束ねられた形に良く似たRNA分子を表わす）
ここで記されたように「ameliorating（改善する）」は影響を減らし、損傷を少なくすることを意味する。それは例えば、疾患による有害な影響や状態を減らすことのように、動き、活動または機能などの衝撃を最小にすることを意味する。
【００１２】
ここで記されたように、「retarding（遅らせる」は影響または動きの進行を緩め減少させることを意味する。それは例えば、病気の進行を緩めたり、感染率を低下させたり、疾患または症状の経過あるいは進行を低下させるように作用することである。
【００１３】
ここで記されているように、「誘発剤」は動きを促進するための唯一の効果的な作用である。例えば、活動を誘引し増進させることによりプロモータに作用し、またプロモータの統制のもと遺伝子発現に影響する外生の作用物質は誘発剤と称されるだろう。例えば、テトラサイクリンは誘発剤として使われ、ドキシサイクリンも誘発剤として使われるであろう。
【００１４】
核酸鎖（ポリペプチドを符号化する核酸鎖など）は、第1の核酸鎖が第2の核酸鎖と機能的な関係のもとに配置された時に、他の核酸鎖（プロモータなど）に対して「実効的に関連する」と言われている。例えば、もし符号化された連鎖の転写または発現に、プロモータが影響を与えたら、プロモータは符号化された連鎖に実効的に関連するということである。ここで記されているように「操作される」という言葉は、遺伝子や符号化された連鎖がプロモータ連鎖に実効的に関連し、プロモータ連鎖が符号化された連鎖の転写または発現に影響を与えることを意味する。
【００１５】
ここで記されているように、「マーカー」は、探知できまたは探知できる分子の符号またはマーカーの存在を探知できる分子のことである。「マーカー・たんぱく質」あるいは「マーカー・ポリペプチド」は、研究室やクリニックにおいて探知でき、実施例において可視できる、たんぱく質あるいはポリペプチドのことである。「マーカー遺伝子」は、マーカー・たんぱく質またはマーカー・ポリペプチドを符号化するものである。
【００１６】
ここで記されているように、「HIV」はヒト免疫不全ウィルスのことを表わし、
例えば変異のHlV-I、HIV-2を含む。他の免疫不全ウィルスとしては、SIV（サル免疫不全ウィルス）やFIV（ネコ免疫不全ウィルス）などがある。HIVに関連する酵素は「HIV酵素」と呼ばれることもでき、例えばインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TAT（転写促進調節たんぱく質）などを含む。HIVによる感染は、「HIV受容体」と呼ばれる受容体が関わっていると考えられている。「HIV共受容体」として名づけられている複数の受容体があるであろう。ここで記されているように、「HIV共受容体」にはCXCR4やCCR5などがある。
【００１７】
本発明における理論上の論拠はここに記されているが、この議論は本発明を否定し制限するものではない。ここで記されている技術は、本発明の理論上の支持をするか否かを問わず、多くに利用されているものである。
【００１８】
実施の形態としては、細胞は、a)増殖しで多能でまた多能性の細胞集団を繁殖させ、b)神経細胞の集団、c)筋細胞、d)および／あるいは他の望まれる細胞集団を生成する目的で、アプローチしやすく分裂しているまたは分裂していない細胞集団から選択される。更に、生体外、生体内、および／あるいは生体内で組織に適切な、または部位で適切な一層の分化ができる。
【００１９】
本発明に用いられた選択された細胞の根源：選択された細胞は、本発明において利用可能であるすべての細胞を含んでいてもよい。本発明に使われた細胞（ここでは「選択された細胞」という）は、患者の内生的な細胞に由来し、他の器官システムから分化した細胞、または外生の根源から分化したもの（細胞株からの分化、低温保存された根源、貯蔵された根源、移植源を含む）である。細胞は、合成あるいは天然の核酸鎖と遺伝子組み換えされたものから選択されることもあるる。ここで使用されている「選択された細胞」とは、ヒト胎幹細胞は含まない。
【００２０】
本発明においては健康な組織を侵襲的に害することなく行う目的で、選択された細胞は容易に採取することができ(例：末梢血白血球、循環造血幹細胞、上皮細胞)、(例：口頬細胞(例：Michalczyk et al, 2004))、脂肪組織(例：Gimbleet al., 2007; Ma et al., 2007)、臍帯血液細胞(例：Zhao, et al., 2006; Tian et al., 2007)、など)を利用した。しかしながら骨髄幹細胞、精原細胞(例：Guanel al., 2006; Takahashi et al., 2007)、始原生殖細胞(PGC)、羊膜から分離した幹細胞(例：Ilancheran etal., 2007)、羊水 (例：De Coppi et al., 2007)、同様に皮膚から分離した細胞(例：Tumbar, 2006; Dunnwaldet al., 2001 ; Szudal'tseva et al., 2007)などは、本発明においても利用された。このような細胞は、この研究手法にてよく知られている組織から分離することができる。
【００２１】
精原細胞の酵素消化パーコール分離後のステップ2を使用して分離することができる。細胞を最小必須培地（MEM）のに再懸濁することができる106/mLの最終濃度にウシ血清アルブミンを補充。具体的には：尿細管の断片手術でアクセスされ、離れて前に治療に1ミリグラム/mlのトリプシン、ヒアルロニダーゼ、およびコラゲナーゼとからかわれるし、1ミリグラム/ mlのヒアルロニダーゼとコラゲナーゼは、MEMでの0.10％炭酸水素ナトリウム、4mM L -グルタミンを含む非必須アミノ酸、40マイクログラム/ mlのゲンタマイシン、100 KJ 100マイクログラム/ mlのペニシリンストレプトマイシン、および15mMのHEPES。精原細胞をさらに尿細管の断片から30倍の重力で遠心分離によって区切られている。 77ナイロンフィルタ - および/または55 - ミクロンの孔径を介してろ過した後、細胞を収集され、不連続パーコール密度勾配上にロードされる。純度の高い40％以上前駆/幹細胞/精原細胞を洗浄して、細胞と同等の濃度に10前駆細胞を再懸濁/幹細胞/ ml当たり精原細胞と分数。その後、細胞を培養すると/または任意の凍結保存技術は、芸術に知られて格納される。
【００２２】
精原細胞は二段階の酵素吸収に続くパーコール分化方法により分離できる。そして、これら細胞は106/mL の終末濃度までウシの血清アルブミンを補足した最小必須培養液（MEM）によって再懸濁される。具体的には：
選択された細胞は遺伝子組み換え細胞で、特に治療法または商業的に有利なデオキシリボ酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）鎖を符号化するためこの研究手法にてよく知られている技術で遺伝子組み換えされた。
【００２３】
本発明の一つの側面によれば、選択された細胞から望まれる細胞集団を生成する方法がある(例：多能性、 神経、筋肉、など)。
【００２４】
多能で多能性および／あるいは自己再生可能な細胞集団の生成
増殖し自己再生できる多能性の細胞集団を、得るために、選択された細胞および／あるいはその結果である集団は、哺乳類の麻痺した遺伝子の「長」 (PRR insert +) アイソフォームを符号化するものを含むヌクレオチド配列によって核酸を入れられる。それとほぼ同時に選択された細胞は、短く麻痺したまたは麻痺したようなアイソフォームとを標的にした合成オリゴヌクレオチドによって核酸移入され、それから最適の成長速度で選択された細胞を成長させる環境下で培養される。選択された細胞はこのような環境下において、望まれる細胞数に達するまで保管される。細胞はLIF、鉄因子および／あるいは 11-6、hyper 1L-6、 IL-7、-オンコスタティンM および／あるいはカーディオトロフィン-1と等しい効力の濃度によって培養され得られた（最適な）成長速度、もしくは他のサイトカインを減少させる転写遺伝子の存在(例：多能性細胞を培養する条件、例： Guan et al., 2006)によって得られた成長速度によって培養された。成長速度は、培地によって2倍にされた細胞数によって決定される。同様に、米国特許6432711 と 5453357にある培養環境は、長(PRR+) Numbアイソフォームによって核酸が入れられた細胞の繁殖や拡大に最適な成長速度を与えられる。他の望まれるプロコトルやサイトカイン濃度は、（Koshimizuet al., 1996; Keller et al., 1996; Piquet-Pellorce, 1994; Rose et al., 1994;Park and Han, 2000; Guan et al., 2006; Dykstra et al., 2006; Zhang et al.,2007)に従った。しかしながら、本発明の実験は、これら技術の詳細に制限されない。
【００２５】
一つの好適な実施例において、選択された細胞は標準的な培地において培養された(例：補完が有るまたは無い最少必須培養(例：グルタミン、ベータ・ メルカプトエタノール)。培地は、基本的な繊維芽細胞成長因子bFGF、鉄因子、白血病抑制因子LIFおよび／あるいはLIF活性がある因子(例：LIF、LIF受容体(LIFR)、 繊毛状神経栄養因子(CNTF)、 オンコスタティン M (OSM)、 OSM 受容体(OSMR)、 カーディオトロフィン、 IL-6、hyper IL-6、GP 130インターロイキン、その他(IL))、ウマの血清を含む。LIFのみではなくLIF活性がある因子は、細胞の自発的な分化を防止する。このような環境下で、PRR+Numb アイソフォームとその結果である集団によって核酸を入れられた選択された細胞は、多能、多能性および／あるいは自己再生能力を得ることが期待されている。
【００２６】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である集団は、「長」 (PRR insert +) Numb アイソフォームを符号化するヌクレオチド鎖のみならず、他の導入遺伝子を符号化する鎖によって核酸に入れられる。これら導入遺伝子の多くは、NCBI連鎖データベースに、それぞれの識別番号に基づいて挙げられる。
【００２７】
別の好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、他の導入遺伝子を符号化する連鎖と同様に、「長」(PRR insert +) Numb アイソフォームを符号化するヌクレオチド鎖によって核酸を入れられる。これらの導入遺伝子の多くは、それぞれの識別（取得）番号（コード）に基づいてNCBI連鎖データベースに分類される。一つの好適な実施例において、選択された細胞やその結果である細胞は、LIFなどの他の導入遺伝子を符号化する連鎖と同様に、連鎖を符号化する長(PRR+)Numbアイソフォームによって核酸に入れられる。
【００２８】
一つの好適な実施例において、LIF活性を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸を入れられる。一つの好適な実施例において、LIFRを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+)Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００２９】
一つの好適な実施例において、オンコンスタティンM（OSM）を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３０】
一つの好適な実施例において、オンコンスタティンM受容体（OSMR）を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。一つの好適な実施例において、カーディオトロフィン-１を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３１】
一つの好適な実施例において、CNTFを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３２】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸を入れられる。
【００３３】
一つの好適な実施例において、NANOGやOCT3/4、SOX2を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３４】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2、LIF活性を伴う導入遺伝子を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはやその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３５】
一つの好適な実施例において、Notchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる（例：Gaianoet al., 2000）。
【００３６】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2、Notchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる(例：notch1 および／あるいはnotch 2)。
【００３７】
一つの好適な実施例において、OCT3/4、SOX2、NanogまたNotchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３８】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、OCT3/4、SOX2、NANOG、またLIF活性の遺伝子などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームを符号化して核酸が入れられる。一つの好適な実施例において、選択された細胞その結果である細胞は、OCT3/4、SOX2、NANOG、LIF活性がある多重導入遺伝子などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長(PRR+)Numbアイソフォームを符号化して核酸が入れられる。
【００３９】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、他のOCT3/4、 Notch,、 HOXB4 、またSOX2などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームを符号化して核酸が入れられる。
【００４０】
さらに、他のここで記されたものから分化した遺伝子の組み合わせは、多能で、多能性で、自己再生できるか分化を始める細胞を引き起こす可能性があるかもしれない。しかしながら、本特許出願はいかなる核酸細胞またはたんぱく質の電気穿孔法 ( Gagne et al., 1991 ; Saito et al., 2001 ; Yuan, 2008; Huang etal., 2007; Xia and Zhang, 2007; Cemazar and Sersa 2007; lsaka and Imai, 2007;Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007; etc.参照)、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトを適応する「遺伝子再プログラミング」(Goldberg et al., 2007; Li et al., 2007参照)および／あるいはウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチに使用でき、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。それは安全性と効率の向上を意味する。さらに当然として、ランダムな遺伝子交替の分類には、、ゲノムの特定の場所においてDNAを導入または取り除くために設計された遺伝子ターゲティングならびに部位特異的方法がある。
【００４１】
同様にして、本特許出願は核酸またはたんぱく質の電気穿孔法を利用するいかなる核酸細胞の遺伝子再プログラムにも適応でき、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、その他、および／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチに使用でき、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。それは安全性や効率の向上を意味する。このようなアプローチや手法は、本特許出願において実用的な技術として知られている。
【００４２】
一つの好適な実施例において、単一の遺伝子やその一部に(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの;または多能で多能性で、自己再生可能であるもの)対応する核酸またはたんぱく質が唯一の過剰発現した、および／あるいは選択された細胞から多能、多能性または自己再生細胞を生成するよう導入された、および／あるいは、唯一の核酸またはたんぱく質である。一つの好適な実施例において、単一の遺伝子やその一部に(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの;または多能で多能性で、自己再生可能であるもの)対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４３】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、単一の遺伝子やその一部(特にここで挙げられたもので, ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの; もしくは多能で多能分化し、自己再生可能であるもの)に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞の中から、多分能、多能性および／あるいは自己再生細胞が生成されている限り使用できる。
【００４４】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は単一の遺伝子やその一部(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの、もしくは多分可能で万能分化し、自己再生可能であるもの)に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成ている限り使用される。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４５】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４６】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はNanogに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成される限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／あるいは、ウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４７】
別の好適な実施例において、Oct4 とSox2に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムランダムな変質である。
【００４８】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4/Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４９】
別の好適な実施例において、長(PRR+) Numbアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５０】
別の好適な実施例において、選択された細胞から、長(PRR+) Numbアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成される限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５１】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するために過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５２】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５３】
別の好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは、導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５４】
一つの好適な実施例において、LIF活性を利用して遺伝子に対応する核酸またたんぱく質が、多能で多能化で自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現および／あるいは導入された唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５５】
一つの好適な実施例において、LIF活性のある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５６】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、LIF活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
【００５７】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、LIF活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５８】
一つの好適な実施例において、Oct4に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５９】
一つの好適な実施例において、Oct4に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００６０】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
【００６１】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／1エンチ・ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００６２】
一つの好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００６３】
一つの好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６４】
別の好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００６５】
別の好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞の中から、多能、多能性および／あるいは自己再生の再蔵を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６６】
一つの好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００６７】
一つの好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう1つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６８】
別の好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはそ細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６９】
一つの好適な実施例において、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。、実施の形態としては、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。別個の実施の形態としては、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７０】
別の好適な実施例において、c-mycに対応する核酸または、たんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。実施の形態としては、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７１】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、選使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７２】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７３】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７４】
別の好適な実施例において、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７５】
別の好適な実施例において、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７６】
別の好適な実施例において、長（PRRX+） Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７７】
別の好適な実施例において、長（PRRX+） Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７８】
別の好適な実施例において、Oct4、 Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７９】
別の好適な実施例において、Oct4、 Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８０】
別の好適な実施例において、Oct4, Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００８１】
別の好適な実施例において、Oct4, Sox2とNanonに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８２】
別の好適な実施例において、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、
別の好適な実施例において、長(PRR+) Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生の細胞を生成するよう、過剰発現および／あるいは導入され、使用されている手法は電気穿孔法、リボソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう1つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。。
【００８３】
別の好適な実施例において、長 (PRR+)Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００８４】
別の好適な実施例において、長 (PRR+)Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８５】
ここに示される核酸またはたんぱく質の連鎖のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団または習性が得られる限り、Numbおよび／あるいはNumblikeに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで操作できる。
【００８６】
同様にここで示される分化を開始する方法は、誘発されたまたは誘発されなかった、多能、多能性、自己再生する幹細胞、他の前駆細胞、または他の選択された細胞、あるいはここにある手法で得られた細胞だけでなく適応できる。ここに示される核酸またたんぱく質の連鎖のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団または習性が得られる限り、Numbおよび／あるいはNumblikeに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで操作できる。
【００８７】
別の好適な実施例において、ここに示される核酸またたんぱく質の様々な組み合わせは、Numblikeおよび／あるいはNumb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで使用できる。
【００８８】
好ましい実施態様では、選択されたセルおよび/またはその子孫が遺伝的に、事前に変更されているセルです。
【００８９】
好ましい実施態様では、トランスフェクションの手順をここに一時的なトランスフェクションを表す説明する。さらに好ましい実施態様ではこのような一時的なトランスフェクションを使用して達成されるは、ホストゲノムへのウイルスベクターを統合しないでください。
【００９０】
別の好適な実施例において、かかる一時的なトランスフェクションは、標準のトランスフェクション技術（電気穿孔法、化学的に調節されたトランスフェクション、融合誘導または非融合誘導リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなど）を用いて達成される。時間の経過に従い、ここに示されるものとは異なる他の遺伝子組み合わせで、多能、多能性、自己再生可能または分化できる細胞が示され、あるいは発見されるであろう。しかしながら本特許出願は、またあらゆる核で生成される細胞で、核酸またはたんぱく質の電気穿孔法（例：手法についてはGagne et al., 1991 ; Saito et al., 2001; Yuan, 2008; Huang et al.,2007; Xia and Zhang, 2007; Cemazar and Sersa 2007; Isaka and Imai, 2007;Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007;その他を参照）、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質などは安全性と効率を上げる。
【００９１】
別の好ましい実施態様では長い（ペンシルバニア鉄道で、トランスフェクション+）麻痺アイソフォームのエンコーディング配列（および/または合成オリゴヌクレオチド）numblikeと短い感覚のアイソフォームターゲットに伴ってのものでも、これらのエンコーディングヒトLIFから選択など、他のシーケンスを一時的または永続的なトランスフェクションに置き換えられます（例：杜の市、1996年）オンコスタチン-Mのcardiotrophin - 1のIL -私リットルのIL - 6、IL6R、ハイパーのIL - 6、LIFR、gpl30、OCT3（OCT4）、nanogの、Sox2の、および/またはFGF- 4。これらの異なる遺伝子配列の任意のサブセットとの同時トランスフェクション任意の単一遺伝子ベクターを使用するなど、芸術に知られることを意味し、複数の遺伝的ベクトル、シリアルトランスフェクションと選択の明確なマーカータンパク質および/または抗生物質耐性に基づいて行うことができます。
【００９２】
別の好ましい実施態様では、細胞間で（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（s）は、細胞培養で培養されるよう、上記のよう最適成長率を促進するトランスフェクトし、EGFの、bFGF、オンコスタチン、LIFの含まれています（ドゥとの始皇帝例えば、1996）、鉄鋼因子のIL - 11、cardiotrophin - 1、IL - 6の、ハイパーのIL - 6、CNTF、および/または水溶性gpl30。.
可能性と分化の評価
多能性と多能は次の分野に有用であるといえる。1) 移植、2) 類胚芽腫体の形成を促進状態する培養、3) 動物の胚盤胞期胚芽への細胞導入とその後の成長、4) 分化、多能、多複性など（Guanet al., 2006を参照）に関連した遺伝子発現のRNA発現検査（例：RI-PCR法ならびにマイクロアレイ法に基づいた分析）、5)コロニー形成のみならずES細胞類似形態。ここで説明する、選択された細胞および／あるいはその結果の多能性を知るための1つの方法としては、蛍光タンパク遺伝子に結び付けられたNanogプロモータを使ってトランスフェクションを評価するというものがある。これによりNanog発現細胞は、蛍光活性細胞分別（FACS）などを使って特定し集積することができる。
【００９３】
実施の形態としては、内因細胞（例：火傷または怪我をした部分の周りの細胞）が長（PRR+）Numb アイソフォームを符号化した遺伝子ベクターのみと、あるいはここで名前を挙げた他の導入遺伝子と共に生体内でトランスフェクションし、一時的に細胞の再生を促進したり、増殖の効率を高める。この手法は再生不良組織、幹／前駆細胞が異常に激減したりする疾患、また他のこの手法が有効であろうと考えられる疾患に対して臨床的に用いることができる。
【００９４】
分化する細胞集団を得る
生体内で環境的に制限された状態で b) 神経、c) 筋肉、d) その他の部位の細胞集団がさらに分化するには、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞が、長（PPR+）Numbアイソフォーム配列および／あるいは合成されたオリゴヌクレオチド配列のトランスフェクション任意的に受け、（上記の如く）試験管内で十分な時間をもって望まれる量の前駆細胞を得て増補される。この任意の手順を踏むことで、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞からサイトカインと拡大／最高の成長媒体の因子を取り除き、、任意にNumblike遺伝子および／あるいは「短」（PRR-）Numbアイソフォームおよび／あるいは（PRR+）アイソフォームを対象とする合成オリゴヌクレオチドを符号化したヌクレオチド配列など (例： Zaehres etal., 2005)とトランスフェクションした。そして選択された細胞を望まれる細胞タイプに分化させるのを促進させる状況下で培養した。
【００９５】
殆どの例において、細胞は5から10％の胎児ウシ血清と、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞を分化させるのを促進させる因子が存在するという条件下で培養された。胎児ウシ血清と媒体が存在することにより、最大成長（または拡大）率よりも低い割合で成長あるいは増殖し、望まれる細胞集団に分化させることができた。媒体と培養した環境の細かい内容は、望まれる細胞集団により選ばれ下のように表わされる。
【００９６】
神経細胞集団を得る
望まれる細胞集団が神経細胞集団の時は、トランスフェクションが成功した細胞が、細胞を神経細胞に分化させるのを促進する因子が存在し、最も望ましい割合よりも低い割合で成長を促進する条件下で培養された。ニューロンへの分化を促進する条件については、次のような数多くの文献で説明されている（Benninger et al., 2003; Chung et al. 2005; Harkany et al., 2004;Ikeda et al., 2004; Ikeda et al., 2005; Wernig et al., 2002; and Wernig et al.,2004）。さらには加えたサイトカインとレチノイン酸露出を組み合わせることで、特定の神経細胞タイプが試験管内で分化する（例：Soundararajan etal., 2006; Soundararajan et al., 2007; U.S. Patent 6432711）。
【００９７】
実施の形態としては、試験管内でニューロンまた神経細胞を分化するには50ng/mlの神経成長因子（NGF）が必要であった。
【００９８】
一つの好適な実施例において、神経細胞集団が望まれる細胞集団である時、短アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Nurrl、REN、ネウロジェニン1、ネウロジェニン2、ネウロジェニック、Mash1、Phox2b、Phox2a、dlland、Gata3、Shh、FGF8、Lmxlb、Nkx2.2、Petl、Lbxlおよび／あるいはRnxを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【００９９】
別の好適な実施例において、ドーパミン作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mash1、Ngn2、Nurrl、Lmxlbおよび／あるいはPtx-3を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１００】
別の好適な実施例において、セロトニン作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時に、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mashl、Phox2b、Lmxlb、Nkx2.2、 Gata2、 Gata3、 および／あるいはPetlを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０１】
別の好適な実施例において、コリン作用性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、MASII1、Phox2aおよび／あるいはRKST4を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０２】
別の好適な実施例において、GABA作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、MASIIl、Phox2aおよび／あるいはREST4を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列で、任意的にLIF、Neurotrophi 3(NT3)および／あるいは神経成長因子（NGF）が補足された媒体の培養により、と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０３】
別の好適な実施例において、ノルアドレナリン・ニューロンが望まれる神経細胞集団の時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mashl、 dlland、Phox2a、 Phox2b、Gata2 および／あるいは Gata3対象とすを符号化したものから選ばれたを配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０４】
別の好適な実施例において、GABA作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）とトランスフェクションした細胞が、P1TX2、Dlx2、Dlx5、アンチセンスHeslRNAおよび／あるいはその他のHES1を対象にした合成オリゴヌクレオチドを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的又は永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０５】
上で説明したような分化を中程度に促進させる環境で培養された。その際、次の因子を1つまたはそれ以上加えた：レチノイン酸、NT3、NGF、GDNF、IFN-γ
筋細胞集団を得る
ときは、目的のセルの人口筋肉の人口は、正常にトランスフェクトした細胞を、エージェントの存在下でのレートでより最適な速度よりも筋細胞や成長に変えて細胞の分化を促進する培養です。条件を筋細胞への分化を促進また、以前に（中村ら説明されている、2003;パルとカンナ、2005;パイプら、2005; Albilezヌら、2006;パルとカンナ、2007; Behfarヌら、2007;米国特許64327 '1 1）。さらに、選択したセルを暴露/またはヘキサメチレンビス - アクリルアミドまたはジメチルスルホキシドに自分たちの子孫の関連性サイトカインの存在下でのinvitroで筋肉型分化の開始を支持する。
【０１０６】
一つの好適な実施例において、心筋細胞が望まれる細胞集団である時、短(PRR-) Numb アイソフォーム(および／あるいはNumblike)と共に核酸が入れられた細胞は、心筋細胞(He et al.,2003; Guan et al., 2007;その他)への分化を促進するか、心筋細胞の分化を促進する濃度の仲介物(例：0.75%- 1 % dimethylsulfoxideジメチル・スルホキシド (DMSO)が含まれるか、20%の標準ウシ血清(NBS)、10(-7) mM レチノイン酸(RA) 、20% 心筋細胞状況の培養地(Hua et al., 2006)などにて培養される。
【０１０７】
別の好適な実施例において、心筋細胞集団が望まれる細胞集団の時、それら細胞はGata 4、Gata 5、 and Gata 6と符号化された選択された細胞を含むヌクレオチド鎖と共に核酸が入れれる。
【０１０８】
一つの好適な実施例において、筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム (および／あるいはNumblike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定 bHLH-符号化連鎖、MyoD、ミオゲニン、Myf5、Myf6、 Mef2、ミオカーディン、Ifrdl や他の筋肉転写因子を符号化するこれらから、選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１０９】
一つの好適な実施例において、平滑筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム (および／あるいはNumblike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定ミオカーディンヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１０】
一つの好適な実施例において、骨格筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム(および／あるいはNumlike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定MyoDとミオゲニンヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１１】
一つの好適な実施例において、oligodensrocyte細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム(および／あるいはNumlike)を符号化する連鎖による核酸の移入は希突起膠細胞の特有の-OLlGl、 OLIG2、またZfp488 ヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１２】
これらの異なる遺伝子配列を上記の任意のサブセットとの同時トランスフェクションは、複数の遺伝子のベクトルを使用し、シリアルトランスフェクションだけでなく、選択の異なるマーカータンパク質および/または抗生物質耐性に基づいなどの芸術に既知の手段によって達成することができます。ときに、目的の細胞集団造血細胞集団が、分化中濃度の造血前駆細胞への分化を促進では、特定のエージェントが含まれます（表示等（例えば、Ohmizono、1997トロンボポイエチン血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、例えば、Wangらは、2005; Srivastavaさんら、2007; Gupta氏ら、2007）、または分化造血細胞の型（メソッドは、芸術に未分化または多能性幹細胞から分化造血細胞を提供するための既知のによれば）。
【０１１３】
望まれる細胞集団が遺伝子細胞集団である時、分化培養地は遺伝子細胞への分化を促進させる濃度において特定の仲介物を含む（例Nayerniaら2006a、2006b）。望まれた細胞集団が、すい臓内胚葉島細胞集団の時、分化培養地は、すい臓内胚葉島細胞集団への分化を促進させる濃度において特定の仲介物を含む（例：徐ら、2006;デネールら、2007;シムら、2007;江ら、2007）。
【０１１４】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および/あるいはその結果として集団の分化は、分化培養地において、Numblike、短麻痺idsoフォームや他の導入遺伝子の核酸の移入なしに起こる。また培養地は変えられない。
【０１１５】
実施例では、単一のベクトルは、塩基配列の発現をコントロール（秒）でエンコードを利用される""（ペンシルバニア鉄道+）（s）は哺乳動物の感覚の遺伝子（および/または合成オリゴヌクレオチドまたは次の短い感覚のアイソフォームnumblikeターゲットアイソフォーム）長下に1つの調節性のプロモーター（tetracycラインなどのプロモーター規制）、一方Numblikeと短い麻痺アイソフォーム（および/または合成オリゴヌクレオチドは長い（ペンシルバニア鉄道ターゲット+）アイソフォーム）を別の、別個の制御下で発現しているだけでなく、調節性プロモーター。したがって、長い（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（秒）で表現することができます（および/または短絡）は、選択したセルの拡大と誘発剤（例えばテトラサイクリン）が必要です成長培地に追加され抑圧されたアイソフォーム;以降とnumblike短期アイソフォーム（および/またはlong型（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（秒）抑圧された）が差別化が望まれる表現することができます。
実施の形態としては、単一ベクターは、
また、タンパク質やペプチド麻痺アイソフォーム、ノッチ、OCT3 / 4、Sox2のには、対応すると他のDNAここに類似の方法で選択したセルを適用することが記載さシーケンス/またはエレクトロポレーション法（例えば、を介してその子孫浩賢ら、1994;リッチーとギルロイ、1998）、ナノ粒子、カチオン性脂質、融合リポソームを使用して（例えば、吉川ら、2005;2007）、等の代わりに、または組み合わせで遺伝子トランスフェクションした。一般的に、エレクトロポレーション高いトランスフェクション効率のための遺伝子のゲノム統合せずに、目的の細胞（および効率的な生産）とできるため、より高い安全性に関連付けられている。DNA やRNAのエンコーディングタンパク質（s）またはポリペプチド（秒）の増殖、multipotentiality、pluripotentiality または選択された細胞の分化を促進するに従って、標準的な遺伝子工学的手法（たとえば、分離されるかもしれませんが、のcDNAライブラリーからこのようなDNAを分離することによって特定のセルライン）とそれを配置し、それを選択したセルにトランスフェクトされ、適切な発現ベクターに。別の好ましい実施態様では、内胚葉と膵島細胞（および/または）numblike希望の人口、およびシーケンスの短い感覚のアイソフォームのエンコーディングでトランスフェクション伴っているものでも、これらのエンコーディングFoxa2、Soxl7から選択など、他のシーケンスを一時的または永続的なトランスフェクションに置き換え、HLXB9および/またはPdxl。
【０１１６】
一つの好適な実施例において、肝細胞が望まれる集団であり短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、肝胞核因子（hnf hnf用の）私は、IINF - 3 、IINF - 4、hnf hnf用の- 6ならびに転写調節因子結合たんぱく質を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１７】
別の好適な実施例において、造血性細胞が望まれる細胞集団である時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、Runxl / AMLlと11月（CCN3）および/あるいは望まれる細胞集団のコロニー刺激因子がある細胞培養を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。Runxl/ AMLlアイソフォームは、移植が望まれる時に、Bのアイソフォームは分化が望まれる時に（Creemersらされる導入され導入、2006）。
【０１１８】
別の好適な実施例において、軟骨細胞が望まれる集団であった時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、Sox9、転写調節因子結合たんぱく質、Gatao、および/あるいはRunx2を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な確執の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１９】
別の好適な実施例において、骨胞（特に造骨細胞）が望まれる細胞集団である時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入が併発され置き換えられる。
【０１２０】
別の好適な実施例において、κ麻痺アイソフォームを符号化する遺伝子ベクターは、過渡的に標準的なプロモータの操作によって、一時的に細胞の増殖を起こす目的で生体内の内在細胞にされる導入。
【０１２１】
別の好適な実施例において、内生細胞（例：中枢神経系の上衣ゾーン細胞）は生体内において、遺伝子ベクターによって核酸が移入される。そのベクターは、短麻痺アイソフォームまたは独立したNumblikeたんぱく質のみまたはここで名づけられているような他の導入遺伝子を、一過性あるいは永久的に細胞の分化や増殖を促進させるために符号化する。この再生または増殖は、分化に関連したマーカーの遺伝子発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、この目的のために適した方法を用いて導入されることにより完成する。実施の形態としては、内生細胞（例：中枢神経系の上衣ゾーン細胞）は、生体内において、幹細胞集団の再生または増殖を促進する目的で、κ麻痺アイソフォームおよび/あるいはここで名づけられた他の導入遺伝子を符号化する遺伝子ベクターである。この再生または増殖は、その結果である集団の分化に関連し、マーカーの遺伝子発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、それに適した方法を用いて導入して達成される。
【０１２２】
同様に、この方法は、他の組織（皮膚など）における他の幹細胞集団からの再度のまたは増加する分化、を起こすためにも適している。この方法は、例えば中枢神経障害、通常の分化または移動が不十分で、形成異常疾患、その他の疾患においてアプローチが容易な場合にされる適応。
【０１２３】
好ましい実施態様では、核酸（s）またはタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特に記載の名前を発見した方法を、ここに記載によると、対応する発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の差別化の目的の方法で開始する）能力がある唯一の核酸（s）またはタンパク質（秒）が過剰発現および/または選択された細胞の分化を開始するために導入。
実施の形態としてうは、単一遺伝子やその一部（特に記載の名前、メソッド、ここに記載によると、発見発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の分化の目的の方法を開始することができると）に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞において分化を誘導するように発現され導入された唯一の核酸またはたんぱく質である。
【０１２４】
好ましい実施態様では、核酸（s）またはタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特に記載の名前を発見した方法を、ここに記載によると、対応する発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の差別化の目的の方法で開始する）能力がある唯一の核酸（s）またはタンパク質（秒）が過剰発現および/または選択したセル内のメソッドを利用し分化を開始するために導入、エレクトロポレーション、リポソームは、ナノカプセル、nanovaults、および/または、別のアプローチをレトロウイルスを避ける/レンチ統合したり、細胞のゲノムの他のランダムな変化。別の好ましい実施態様においては、他の核酸（s）または秒）コンサートでは、核酸（掲載に利用することができる蛋白質（）やタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特にここに、名前に対応するメソッドを、ここに記載によると、発見された他の公開方法によると、発見された、及び/または既知の分化のが望ましい方法を開始することができると）ので、長い分化細胞の集団としては、選択したセルから生成されます。
【０１２５】
別の好ましい実施態様においては、他の核酸（s）または秒）コンサートでは、核酸（掲載に利用することができる蛋白質（）やタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特にここに、名前に対応するメソッドを、ここに記載によると、発見された他の公開方法によると、発見された、及び/または既知の分化のが望ましい方法を開始することができると）ので、長い分化細胞の集団として、選択したセルからメソッドを利用し生産され、エレクトロポレーションです。リポソーム、ナノカプセル、nanovaults、および/または別のアプローチをレトロウイルスを避ける/レンチ統合したり、細胞のゲノムの他のランダムな変化。
【０１２６】
は、核酸や蛋白質の任意の組み合わせのシーケンス記載の目的の細胞集団または動作を実現しています麻痺および/またはNumblikeに限り、これらに対応するものを除くによって変更することができます説明を理解するためだ。
ここで記されているどの核酸ならびに鎖の組み合わせも、麻痺および/あいはNumblikeに対応する組み合わせを除き、望まれる細胞集団または習性が達成される限り、操作できるたんぱく質。
【０１２７】
同様にして、ここに記されている分化を促すための方法は、いかなる誘導されたもしくは誘導されていない多能、多能化または自己再生できる幹細胞、または他のここで記されている方法で得られた細胞だけでない選択された細胞にすることができる利用。
【０１２８】
選択された細胞の根源
選択された細胞の集団は、様々な幹細胞、前駆細胞また体細胞から得られるであろう。しかしながら細胞核が欠損している体細胞（例：成長したヒトの赤血球細胞）は、とりわけ排除された。選択された幹細胞は、存在する細胞株または貯蔵、バンク化、または低温保存されていたものから得られるであろう。典型的な幹細胞の根源は、骨髄、末梢血、胎盤血、羊水（例：投稿者コッピら、2007）、靭帯血（例：趙ら、2006;田ら、2007）、脂肪組織（例：Gimbleら、2007;馬ら、2007）、ヒト以外の胎芽などである。循環白血球や他の幹細胞ではない細胞は、同様に、上記に記されたような培養地で培養され、結果として多能、多能化および/あるいは自己再生能力を得ることになる。本発明において利用できる他の体細胞の例には、リンパ球、上皮細胞（例：頬）が含まれる。本発明のためにされた細胞は、技術として知られている選択いかなる方法にも使われるだろう。
【０１２９】
動物に関する実施例では、前立腺、精巣、胎児脳、腸から独立した幹細胞は、選択された細胞の好まれる根源であると明らかにれているさ。
【０１３０】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および/あるいはその結果である子細胞は3次元の型で培養されている。
【０１３１】
本発明の更なる目的は、患者に互換性があり、かかる器官または組織が必要をされる患者の特定の組織や臓器の移植に利用できる細胞を生成することである。ここにある方法によって与えられた多能、多能化および/あるいは分化する細胞は、そのような器官および/あるいは組織の生成のための技術に共用できることが明らかにている（例：ボーランドらなっも、2006。徐ら、2006;キャンベルとワイス、2007）。そのような利用方法は、本発明により明確にされているカバー。例えば、ここで記された方法により生成され扱われた多能、多能化および/あるいは分化する細胞は、正常な組織構造および/あるいは臓器構造の再生のためにされた足場において成長していることなどが挙げられる（例：Yarlagadaら3次元もしくは2次元の設計。、2005; Kimら、1998; WO/2003/070084; EP1482871; WO03070084;米国特許2395698、7297540、6995013、6800753;アイゼンバーグら、2006）。
【０１３２】
同様に、多能的で、多能性のある、および/あるいは分化する細胞によって占領される足場は、死体臓器あるいは組織（骨、心臓、腎臓、肝臓、肺など）が、宿主免疫細胞が対象の組織に常駐し、その他の不要あるいは付随する宿主細胞が除去される（乖離放射線、殺菌（ムロツら、2006など）などにより）ように、および/あるいは各種脱細胞方法（米国特許6734018 ; 6962814、6479064、6376244、米パット。番5032508、4902508、4956178、5281422、5554389、6099567、および6206931、4361552および6576618、6753181、米国出願Ser。第11 / 162、715; WO/2001/048153; WO/2002/024244; WO003002165; WO/2001/049210;WO/2007/025233;欧州特許EP1482871、EP1246903、EP1244396、EP0987998、EP1244396;プレミアリーグ333870;Riederらら、2004;オットら、2008; Taylorら、1998）において治療できうる後に死体臓器あるいは組織から派生されうる。
【０１３３】
同様にして、多能、多能化および/あるいは分化する細胞にされた足場は、死体の器官または組織における免疫細胞や他の望まれないまたは付属する細胞が除去さえるように処置されたあと占領の、死体の器官または組織から得られるだろう。
【０１３４】
同様にして、本発明における多能、多能化および/あるいは分化する細胞が、ヒト組織工学におけるインクジェット式印刷に（例：。ボーランドら応用されるだろうも、2006。徐ら。 、2006;キャンベルら、2007）。それゆえに、ここで記された方法によりそのような目的のために生成され扱われた細胞も、ここで触れられている。
【０１３５】
別の好適な実施例において、選択された細胞やその結果の集団は、懸滴のなかで培養される。
【０１３６】
本発明の別の側面によれば、選択された細胞を望まれる細胞集団に分化させることを促進すると、選択された細胞は、前もって遺伝子的に組み換えられることができる。本発明の別の側面によれば、選択された細胞はのDNAまたはRNAのを符号化した、細胞を望まれる細胞集団に分化させることを促進するたんぱく質またはポリペプチドにより組み換えられてることができる。
【０１３７】
細胞集団の検査
一つの実施例では、本発明による方法は、細胞株、ドナー源、臍帯血から細胞をスクリーニングし、自己あるいはドナーの骨髄、血液、精原細胞、構成する始原生殖細胞、口腔細胞、あるいは本発明に置いて効果的なその他の細胞源からの細胞のスクリーニングが含まれる。選択した細胞は、先行技術（関ら、2006;米国特許6,432,71 1）において公知の方法により、有益な配列による分化の開始の他、トランスフェクションや治療用ベクターの成功を確認するためにスクリーニングできる。いくつかの実施例では、標準的なPCR法および核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは急速な入力方法を用いて、これらの細胞はスクリーニングされる。好適な実施例では、レポーター遺伝子の発現に応じて細胞がスクリーニングされる。いくつかの実施例では、抗生物質抵抗性遺伝子や蛍光たんぱく質（GFPのなど）遺伝子などのトランス遺伝子発現ベクターにより符号化されたマーカー遺伝子の発現によって細胞はスクリーニングされる。
【０１３８】
本発明の一実施例によれば、選択された細胞は、有効な連鎖や治療ベクターとの核酸の移入を成功させるため検査される（関ら、2006;米国特許6,432,71 1）。 いくつかの実施の形態としては、
治療ベクターと有効な連鎖細胞の検査は、特定連鎖の探知として知られている技術を用いて、有効な連鎖と治療ベクターの存在を確認される。それぞれ細胞サンプルは、同時に様々な連鎖について調べられる。あるいは、多数のサンプルは、同時に検査される。
【０１３９】
細胞の分化は、（私は）形而学的評価、（ＩＩ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を利用した（アングル - のPCR法）、ノーザンブロット（遺伝子発現における変化を監視するためのマイクロアレイ技術）、（ＩＩＩ） βチューブリン3世など（神経細胞など）（小澤ら、1985）などいくつかの手段によって監視できる。いくつかの実施例では、細胞の分化を正常にのために細胞型特異的な開始マーカーや遺伝子マーカー発現にてFACSソートを使用細胞の種類に固有のプロモーターの制御下筋ミオシンのプロモーターなどの抗生物質耐性や蛍光たんぱく質の発現など上映される細胞、人間の心臓のα-心筋の基づいアクチンのプロモーター、インスリン産生細胞のインスリンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）ののニューロンの分化や、神経伝達物質の関連するプロモーターのプロモーターのドーパミン作動性ニューロンのチロシン水酸化酵素プロモーター等）いくつかの実施例では、細胞の標準的なPCR法と核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を使用してスクリーニングされる。特に実施態様では、細胞の急速な入力方法使用してスクリーニングされる好ましい。
【０１４０】
HLAタイプの検査
特定の実施の形態としては、選択された細胞はHLAタイピングに適合するように選択される。HLAの遺伝子型は、当業者にとって既知の手段により決定される。
【０１４１】
検査に利用される細胞は、ドナーから直接採取された細胞配列、またはドナー細胞から作られた細胞株、または実用できる細胞源の中に存在する。細胞は実用的な連鎖および/あるいは治療ベクター、またHLAタイプを瞬時にそれぞれ検査される。これらの細胞は、実用的な連鎖と共にが移入されはHLA遺伝子型を見せ、核酸患者への移植を可能にする。
【０１４２】
特定の実施の形態としては、核酸が移入された細胞ははHLAタイピングすることなく移植される。他の実施の形態としては、細胞は適応するようにHLAタイピングされる。
【０１４３】
細胞の表現型を促進させる仲介物の検査
本発明はまた、表現型の変化あるいは選択された細胞および/あるいはその子孫の必要な細胞集団への分化を誘発する能力のためのたんぱく質およびエージェントをスクリーニングする方法を提供する。簡単に言えば、適切なcDNAをライブラリから相補のDNA（cDNA）のを符号化するベクターは選択した細胞および/あるいはその子孫にトランスフェクトされる。分化あるいはその他の表現型の変化を誘発する固有のcDNAのが特定されると、このようなcDNAのは孤立化され、適切な細胞（のCOS細胞など）でたんぱく質を生成するための適切な表現ベクターに複製される。
【０１４４】
その後、上清を含むたんぱく質は、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞の培養に適用できる。あるいは、候補者エージェントは、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞の培養に適用できる（米国特許6432711参照）。本発明はまた、多能性、多能化および/あるい自己再生できるようあるい選択された細胞および/あるいその子孫の分化を開始できるよう核酸をスクリーニングを行うための方法を提供する。
【０１４５】
これらの方法では、曳気穿孔法、ナノカプセル、ナノボールト、リポソーム、レトロウイルス、レンチウイルス、および/あるいはその他の適用可能なトランスフェクション手段を用いて、選択されたcDNAの（あるいは適切なcDNAのライブラリからのcDNAのあるいはその他の配列）を符号化するベクターは、選択された細胞および/あるいはその子孫にトランスフェクトされる。表現型の変化、多能性、多能化および/あるい自己再生を誘発する固有のcDNAのが特定されると、このようなcDNAのは孤立化され、適切な表現ベクターにしたアッセイ。このようなへかを決定するアッセイには、本明細書の他の項で説明される複製が含まれる。同様に、上清をふくむたんぱく質が選択された細胞の培養に可能であり、必要な変化を誘発しうるかを決定するのに適用、体外の適切な細胞（のCOS細胞など）で特定されたcDNAのに対応するたんぱく質が生成される。
【０１４６】
最後にたんぱく質は、曳気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールト、リポソーム、レトロウィルス、レンチウィルスおよび/あるいはトランスフェクションのその他の実用的な方法、多能、多能性、自己再生または分化の開始としてここに記される。
【０１４７】
患者への細胞移植
検査后、選択された細胞および/あるいはその結果である集団は、低温保存され、培養する細胞株として維持されるか、患者に与えられる。選択された細胞は、将来の移植術のために保存されよく知られている手法により、低温保存され維持することができる。
できれば、検査される細胞は、容易に採取できるものがよい。
【０１４８】
抗HIV陽性細胞の生成に関して：本発明における標的となる体細胞および幹細胞はエイズに感染しうる細胞に分化できる種類では、HIVの転写および/あるいは複写を維持でき、HIVの免疫反応を変更でき、エイズへの信仰を送らせうる種類の細胞でありうる。このような幹細胞には、精原細胞由来多能性細胞、始原生殖細胞、造血干細胞、末梢血液細胞、胎盤の血液細胞、羊水細胞、靭帯血細胞、口腔細胞、脂肪組織の細胞（これらの組織から派生した幹細胞を含む）、書き換え細胞、多能性細胞誘導、誘発多能化細胞、人間のもの以外の胚細胞、血液や免疫細胞は、HIV標的細胞およびその他の細胞を形成できるその他の細胞型が含まれる（これに限定されない）。
【０１４９】
治療ベクターは、核酸を移入した細胞または感染細胞のHIVの再生能力や転写の能力を減少させる"にな配列"を表現する。その遺伝子ベクターは、そのようなベクターから得られるいかなるウィルスと同様有用、"有用な配列"を表現し、ここでは"治療ベクター"と名づけられている。
【０１５０】
検査后、望まれる治療ベクターに（HLA遺伝型と同様にもしくはそれ無し）は、細胞を分裂させ安定的な細胞株を保たせるための標準を移入し、有用な配列を表現している細胞核酸的な培養方法（米国特許643271 1 5453357参照として引用）によって生体外で拡張される。その代わりに、これらの細胞は、患者やその生体内にすることができる投与。
【０１５１】
選択された細胞は、この技術として良く知られた方法で低温保存され、将来の移植術のためにされる保存。
【０１５２】
患者への特定細胞集団の移植
特定の実施の形態としては、細胞集団は移植に先立って幹細胞のためにさせられる増殖。幹細胞を選択する様々な方法は、この手法では良く知られている。例えば、細胞サンプルを、分化していない血液性の幹細胞（例：、CD34陽性、CD59、Thyl、CD38低く、c - kitと低く、林マイナス）を判別し、蛍光活性のある細胞種類（FACS）を分類するため、細胞表面のマーカー蛍光性のラベルをされた単クローンの抗体によって増強する。その他の実施の形態としては、選択された細胞のサンプルは、増殖させられることなく移植することである。
【０１５３】
いくつかの実施の形態としては、骨髄の内生幹細胞は、治療幹細胞の移植に先立って排除されるか減少される。治療幹細胞は、有用な配列または治療ベクターを含む幹細胞として定められる。いくつかの実施の形態としては、移植過程は、以下の段階を含む。
（1）前処置、（2）肝細胞注入、（3）好中球減少性段階、（4）生着段階、そして（5）生着完了段階。
【０１５４】
いくつかの実施の形態としては、一般的に望まれる細胞（例：。骨髄干細胞）を生成する内在性の幹細胞は、に移植先立って排除または減少される。化学療法、放射線などおよび/あるいは米国特許6217867にあるものに類似した、方法は、移植に最適な生着のために骨髄の状態と整える手法として利用されるだろう。最終的には治療幹細胞は、この技術に関してよく知られている方法を用いて患者にされるだろう移植。
【０１５５】
麻痺/Numblikeとその他の導入遺伝子を符号化したベクターの設計は、
ある実施の形態としては、Numblike /麻痺アイソフォームを符号化した核酸鎖の核酸の移入は、ウィルスの核酸の移入を介して完成される。"麻痺/Numblike符号化ベクター"単語は、核酸鎖というを符号化したNumblike/麻痺アイソフォームおよび/あるいは合成オリゴヌクレオチドがNumblikeまたは麻痺アイソフォームだけでなく、あらゆる付加的な導入遺伝子鎖、合成オリゴヌクレオチドなど、およびそれらベクター鎖と合体する関連ウィルス浮遊物を標的とするベクターである。
【０１５６】
麻痺/Numblike符号化ベクターは、遺伝子発現ベクターから成りうる。
最適な遺伝子発現ベクターはは、DNAまたはRNAのを真核細胞への核酸の移入のために。そのようなベクターは、これらに限られるわけではないが、例えばバクテリアベクター、真核されるものだろう使用ベクターなどの原核細胞ベクター、例えばイーストベクター、真菌性ベクター、またアデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、レトロウィルスベクターなどのウィルスベクターがある。動因されるレトロウィルスベクターの例としては、これらに限られるわけではないが、モロニーマウス白血病ウィルス、モロニーマウス肉腫ウィルスや、ラウス肉腫ウィルス、FIVは、HIV、SIVの、混成ベクターなどを含む。
【０１５７】
麻痺/Numblike符号化ベクターが生体内および/あるいは生体外の細胞への核酸の移入にも用いられることが明らかにている。核酸の移入は、この技術では良く知られた方法により行われ、なっ特にウィルス包括細胞から生成されたウィルスを用いて行われる。このようなウィルスは、様々なウィルスタイプにできるよう感染にキャプシド形成させられる。言うまでも無く、選択された細胞タイプおよび/あるいはその結果である集団の感染を認めるキャプシド形成技術は、本発明における状況において実用的である。
【０１５８】
ヒト免疫不全ウィルス対（HIV）の遺伝子治療用ベクターの設計
"治療用ベクター"は発現ベクターを含んでいてもよい。適切な発現ベクターはのDNAあるいはRNAのを真核細胞にするのにトランスフェクト採用できるベクターである。このようなベクターには、例えば、アデノ
有効な連鎖は、HIVウィルスが細胞に感染する、ウィルスDNAを転写する、または感染した細胞内で複製する能力を減少させるまたはHIV感染ウィルスを中和する能力を高めるものだろう。
【０１５９】
特定の実施例においては、、有効な連鎖とはHIVウィルスの侵入を妨げる合成オリゴヌクレオチドで、siRNΛ、shRNA、アンチセンスRNA またはmiRNAが、いかなるHIV受容体（CXCR4、CCR5、CCR2b、 CCR3、 およびCCRlなどに限らず）に対抗することができる。
【０１６０】
一つの実施例では、治療用ベクターとは、CXCR4、CCR5、CCRl、CCR2、CCR3、CXCR6および／あるいは BOBなどのHIV共受容体の1つまたはそれ以上を標的にする、合成オリゴヌクレオチドを含む。
【０１６１】
別の実施例では、治療用ベクターは主要なHIVウィルス共受容体であるCXCR4 とCCR5を標的にする、合成オリゴヌクレオチドなどがある。
【０１６２】
更なる実施例では、合成オリゴヌクレオチドを含む治療用ベクターは、1つまたはそれ以上のHIV逆転写酵素、インテグラーゼ、タンパク分解酵素などのHIV酵素を標的にするとある。
【０１６３】
合成オリゴヌクレオチドとして適切な連鎖は、１）コンピュータのアルゴリズムにより、標的連鎖の減少に効果的であると予想でき、２）標準の定量的RNA分析検査および、酵素活性検査で70パーセント以上、または劣っていても治療的である度合いで標的酵素を減少させる能力のあるものである。
【０１６４】
「標的配列」という言葉は、特定の配列が、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と少なくとも70%一致するヌクレオチド塩基を有しているあるいは対応するRNA配列であることを示す。本発明の特定の実施例においては、この言葉は、配列が、オリゴヌクレオチドが指向される特定のウイルスのウイルスゲノム配列あるいはその相補配列と少なくとも70%一致することを示す。合成オリゴヌクレオチドの様々な種類のいずれも、治療用ベクターのトランスフェクションを介して発現されてもよい。また、本発明はこのようなオリゴヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせに関する。
【０１６５】
一つの好適な実勢例において、合成オリゴヌクレオチドの配列を標的細胞は、特定のプロモーターにより駆動される。別の好ましい実施態様では、合成オリゴヌクレオチド配列U6プロモーターにより駆動される。
【０１６６】
合成オリゴヌクレオチドは、デコイRNAと同じ治療用ベクターに含まれる。
【０１６７】
デコイRNAは、特定のたんぱく質を結びつけ、機能を抑制するのに効果を示すRNAの連鎖である。
【０１６８】
一つの実施例では、治療用ベクターは、集合デコイRNA連鎖から成る。
【０１６９】
更なる実施例では、デコイRNA連鎖は、デコイ連鎖の安定性を与えるために提供された連鎖によって配置される。
【０１７０】
その他の実施例では、デコイRNA連鎖はRREおよび/あるいは TARデコイ連鎖である。
【０１７１】
一つの実施例では、RREと TARデコイ連鎖は、HIV-2から操作されるTARと RRE連鎖である。他の実施の形態としては、デコイ連鎖は、Psi要素デコイをも含むという。
【０１７２】
一つの実施例では、デコイ連鎖はそれぞれU6プロモータによって操作される。
【０１７３】
別個の実施の形態としては、デコイ連鎖は標的細胞の特定プロモータによって操作されている。実施の形態としては、治療用ベクターは、HIV生命サイクルの一次的な段階を標的とし、HIV-2 TAR および／あるいは RREデコイ連鎖を組み合わせて合成ヌクレオチド鎖を符号化している。
【０１７４】
別個の実施の形態としては、ベクターはmiRNAオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７５】
別個の実施の形態としては、ベクターはshRNΛオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７６】
別個の実施の形態としては、ベクターはsi RNAオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７７】
別個の実施の形態としては、ベクターはRNAiオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７８】
別個の実施の形態としては、ベクターはリボザイム鎖を含む。
【０１７９】
別個の実施の形態としては、ベクターは合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む。更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド鎖は、CCR5、 CXCR4などのHIV共受容体を標的にする。
【０１８０】
更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド鎖はインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TATなどのHIV酵素を標的にする。
【０１８１】
更なる実施例としては、リボザイム鎖は、CCR5、CXCR4などのHIV共受容体や、インテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TATなどのHIV酵素を標的にする。
【０１８２】
一つの実施例では、ウィルスは療用のベクターを用いて生成され、シュードダイピングされる。
【０１８３】
一つの実施例では、ウィルスは治療用ベクターを用いて生成され、ウィルスはシュードタイプされずに、HIVトロピズムを見せる。
【０１８４】
一つの実施例では、治療用ベクターは、ウィルスベクターである。実施の形態としては、治療用ベクターは、レンチウィルスベクターである。
【０１８５】
一つの実施例では、治療用ベクターは第三世代のレンチウィルスベクターである。一つの実施例では、治療用ベクターは、合成ヌクレオチド鎖を含む。
【０１８６】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子配列は、EF-I alphaプロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。
【０１８７】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子発現は、1)6プロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。
【０１８８】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子発現は、EF-I alpha と U6の組み合わせや、他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。実施の形態としては、HF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、miRNAの遺伝子発現を操作する。
【０１８９】
一つの実施例では、HF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、siRNA鎖の遺伝子発現を操作している。
【０１９０】
一つの実施例では、EF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、shRNA鎖の遺伝子発現を操作している。
【０１９１】
好ましい実施態様では、治療上のベクター、複数のmiRNAの配列は、CCR5、I1IV - 2 RREデコイ配列とは、HIV - 2のTARデコイ配列、およびベクターに対する監督のウイルスベクターは、複数のmiRNAの配列CXCR4に対する監督が含まれます。好ましい実施態様では、治療の治療vcctor（掲載を含む）薬理学的治療を含む抗レトロウイルス療法の他のモードと結合される。治療用ベクターとの組み合わせに適した抗レトロウイルス療法は、治療用ベクターとの組み合わせにおける添加および相乗効果のある治療である。
【０１９２】
HIVの遺伝子治療のための細胞には、末梢血Tリンパ球、単球、組織マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および/あるいは臍帯血、末梢血、および占領骨髄スペースなどの多能性造血幹細胞が含まれる、これらに限定されない。
【０１９３】
本発明は、CD4+ T細胞、マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、CDの34+幹細胞/前駆細胞および/またはその他の静止細胞分裂する細胞で、対外あるいは体内でHIV感染の標的細胞に分化可能な幹細胞や前駆細胞、CD4 + T細胞、マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および/またはCD34 +幹細胞/前駆細胞のトランスフェクションに関する。そのため、トランスフェクトされた細胞は、元の位置にある外因性の細胞あるいは、他の身体部位、あるいはその他の個々のドナーから取り出した外因性の細胞となりうる。この目的のために選択された細胞を本明細書では「選択された細胞」と呼ぶ。
【０１９４】
同様に、自己再生可能で、多能性があり、多能化可能な幹細胞の多能性（書き換され、誘発された多能性細胞を含む）は、HIVの遺伝子治療のための別の論理的なターゲットを表し、その使用は、特に本発明の対象となっている。本プロセスの一実施例では、選択された細胞（造血幹細胞、皮膚幹細胞、臍帯細胞、始原生殖細胞（PGC）、精原細胞、アクセス可能な任意の体細胞など）は、1）培養中に1つあるいは複数のサイトカイン（造血幹細胞因子、白血病抑制因子（LIF）、カーディオトロピック1、IL-11、IL-6R、GP-130、CNTF、IGF-I、bFGF、および/あるいはオンコンスタチン-M）を用いて培養され、2）当該技術分野（本明細書で参考として追加されたUSPatent 5677139方法など）で既知の方法を用いた、あるいはその他の標的細胞に関して、US Patent 5677139に類似した方法による分化の前に治療用ベクターまたは有益な配列でトランスフェクトされる。
【０１９５】
別の実施例では、核酸移入の前段階としてさまざまな段階を経るかもしれない。別個の実施の形態としては、多能性の幹細胞を生成する目的で、培養の段階だけが行われることが望ましい。
【０１９６】
その他の細胞培養条件の他、幹細胞および前駆細胞のL1Fおよび造血幹細胞因子の適切な濃度についてはすでに説明している（本明細書において参考用に引用されているUS Patent6432711および5453357）。その他の適切な基準および参考となるサイトカイン濃度については、Koshimizu et al.、1996; Kelleret al.、1996; Piquet-Pellorce、1994; Rose et al.、1994; Park and Han、2000; Guan etal.、2006; Dykstra et al., 2006において説明されている。
【０１９７】
標的細胞の集団は、体細胞、幹細胞、前駆細胞を含むであろう。幹細胞はおそらく、既存する細胞集団や採取される培養、貯蔵、低温保存された材料から分離されたものである。幹細胞の望まれる材料は、骨髄、末梢血管、胎盤血、羊水液、臍帯血、脂肪性組織、ヒト以外の胎芽などである。
【０１９８】
体細胞、特に白血球やその他のnon-progenitor/stem細胞の循環も同様の幹細胞については、上記/前駆細胞は、幹細胞を取得する/結果として、前駆細胞のプロパティの効果的な説明は、同じ培養条件にさらされることがある。
【０１９９】
本発明は、1I1V感染および／あるいはHIV複製へ相対的に抵抗するために作られた幹細胞／前駆細胞から標的細胞を生成することも明らかにする（USPatent Application 20030099621など)。
【０２００】
一つの実施例では、治療用ウィルスベクターは、ネイティブHIV株から1つないしそれ以上の包膜たんぱく質を伴い、ネイティブHIV株が感染しえるあらゆる細胞に対し感染する能力を持つ治療用ウィルスを与える。
【０２０１】
本発明のために選択された細胞は、一般的にアクセスしやすいとされる細胞である(（帯血幹細胞、骨髄幹細胞、精巣の精原細胞、原始細菌細胞、羊水液から独立された幹細胞、皮膚から独立された幹細胞など）。これら細胞はこの研究方法にてよく知られている方法により、組織から取り除くことができる。
【０２０２】
他の選択された細胞は、再プログラムされた細胞、誘導された多能細胞、多能化細胞から成るであろう。
【０２０３】
本発明の一つの側面によれば、選択した細胞から、目的の細胞株、細胞型、あるいは細胞分類を生成する方法が提供される。一般的に、この方法は、最適な成長速度で選択した細胞の成長を促進する条件下での選択した細胞および/あるいはその子孫の培養を含む。次に、生成された細胞集団は通常最適な速度未満の速度で、および細胞の必要な細胞株、細胞型、細胞分類（CD4 + T細胞など）への分化を促進する促進剤の存在下で細胞の成長を促進する条件下で培養される。本発明はこの他に、治療用ベクターによるトランスフェクション前あるいは後に当該技術分野（US Patent Application 20060099177など）で既知の手段によって、選択した細胞および/または培養中の子孫の増殖を開示する。このような方法はまた、LIF、造血幹細胞因子、11-6、IL-7、オンコンスタチン-Mおよび/あるいはカーディオトロピックI、およびその他の成長促進サイトカインなどによる培養を含む。本発明はさらに、適切なサイトカインおよびM-CSF(CSF-I )、GM-CSF、L-7、CD4+ T 細胞分化を促進する任意のサイトカインなどコロニーを刺激する因子などの成長因子を含む媒介での更なる培養により治療用ベクターで必要な細胞型にトランスフェクトされた細胞の定方向分化も開示する。
【０２０４】
選択した細胞および標的細胞のトランスフェクション遺伝子組み換えは、外因性の細胞あるいは内因性の細胞であるかに関係なく、当該技術分野（U.S. Pat. Nos. 6,432,711, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S.5,928,944, U.S. 05,910,488, U.S. 05,824,547など）において既知であり、公開済みあるいは未公開の方法、あるいはその他の一般的に通用する手段によって実施可能である。宿主細胞を変換するための適切な方法は、Sambrooket al （Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring HarborLaboratory press （1989））およびその他の研究室の教科書に記載されている。
【０２０５】
正常にトランスフェクトした細胞を選択プロトコルRNAの発現アッセイと形態素解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含むことによって識別できる。適切なレベルで外因性のDNAを発現する正常にトランスフェクトした細胞から生成されたクローンは、凍結保存（当該技術分野で既知の適切な冷凍保存方法を用いて）によって細胞株として保存できる。
【０２０６】
選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は、G418、ハイグロマイシン、アンピシリンとブラストサイジンなどの薬に耐性を与えるマーカーを含んでいてもよい。対象となる遺伝子を含む細胞は、選択可能なマーカー遺伝子が生き残り、それ以外のマーカーは死滅する薬品選択によって特定できる。
【０２０７】
本発明の実施の形態における理論上の根拠は、ここで記されている通りである。しかしながら、ここでの議論は本発明を制限し否定するものではない。ここでの手法の技術は、本発明の理論上の根拠を記すために用いられたモデルに関わらず実用的に使用されるものである。
【０２０８】
本発明は、以下の例に従い尊敬の念をこめて書かれた。しかしながら、本発明における視野は、これらに限定して示されたわけではない。
【実施例】
【０２０９】
例１．本発明に最適な導入遺伝子ベクターの構築
つの遺伝子私日成Vの- EGFPの- HSAを例に適していますEGFPの、麻痺しHGFP - Numblikc、およびEGFPの- Xのレンチウイルスベクター（ここでXは任意の遺伝子本発明で説明）の適切なウイルス性ベクターにクローニングによって生成されることができますベクター（ライザーら、2000））。アダプタのプライマーNumblikeと麻痺アイソフォームcDNAおよびクローンのPCR増幅のために遺伝的ベクターに選択することができます。クローン作成の準備では、遺伝子ベクターの酵素で消化される。その後、各遺伝子のcDNAネフ地域は、以前私はISAのcDNAを占領コーディングに挿入される。EGFPの（強化緑色蛍光たんぱく質）と細胞集団に適切なプロモーター（CMVすなわちまたはEFlアルファなど）は、以前は、ウイルスのコード領域に挿入されたこと。遺伝子ベクターのバックボーンを含むことがあり、これはプロモーターoperably異種核酸配列にリンクを調節する転写を構築します。
【０２１０】
が採用される可能性がありますレトロウイルスベクターの例を含むがこれに限定されない場合は、それらMoloneyマウス白血病ウイルス、Moloneyマウス肉腫ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、FIVとHIV感染から派生した。適切な発現ベクター、これらは、真核生物の細胞にDNAまたはRNAのトランスフェクションに雇用されることがあります。このようなベクターを含むがこれに限定されないが、例えば、細菌のベクター;真核生物のベクターなどのような原核生物のベクターは、例えば、酵母のベクターと真菌のベクターおよびウイルスベクターなどが、これに限定されない、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターに関連し、レトロウイルスベクター。レプリケーション無能pcDNA 6.2/EmGFP-Bsd/V5-DESTベクターの適切な発現ベクター（Invitrogen社）の一例であり、合成オリゴヌクレオチドの式（の miRNAなどができます）は、pcDNA 6.2重量から転送/のmiRベクターは、切断する能力を持ってターゲット配列。これらのベクターからループ配列miRNAの内因性の長いpol IIの転写産物から（事前のmiRNA）は、人工miRNAの切除を直接に隣接しています。
【０２１１】
特定の内生RNA種に対抗する複合的なmiRNA連鎖の結合は、標的細胞配列の遺伝子発現を減少させる過程の成功を促進させる可能性がある。miRNA連鎖は、手術可能な組織の特定プロモータに関連しているかもしれない。
【０２１２】
遺伝子発現のためにレンチウィルスベクターを使用することによって、Numb / Numblike符号化ベクターおよび／あるいは本発明における他の導入遺伝子ベクターは、分化細胞と非分化細胞のいずれにも安定的な形質導入能力を生む。
【０２１３】
実施の形態としては、結果として生じるNumb / Numblike符号化ベクターおよび／あるいは本発明に用いられる他の導入遺伝子ベクターは、特定のNumbアイソフォームおよび／あるいはNumblikeを減少させるために、1つまたはそれ以上のプロモータによて操作された複合的な合成ヌクレオチド鎖を含む。例２：他の適したベクターの例は、レトロウィルスベクターである。レトロウィルスは、RNAゲノムを含むRNAウィルスである。Gag、pol、 env遺伝子は、LTR配列によって配置される。5' と3' LTR配列は、mRNAの転写とポリアデルニ化を促進する。
【０２１４】
レトロウィルスベクターは、標準的なトランス活性エレメント、IRHS、選択マーカー、標準プロモータによって操作された標的異種性遺伝子を与えることができる。
【０２１５】
また、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で表現されることがあります。最後に、レトロウイルスベクターシスを含む可能性があります配列を逆転写と統合のために必要な演技。感染時には、RNAの逆のDNAには、効率的にホストゲノムに統合され転写される。本発明の組換えレトロウイルスの遺伝子組み換えなどの方法では、一部のネイティブなウイルスのレトロウイルス、感染症の遺伝子が削除されている特定のインスタンスではなく、ターゲットと細胞の遺伝子改変のための核酸配列に置き換え変更される。配列外因性の可能性がありますDNAまたはRNAは、その自然のまたは変更されたフォームです。例3：麻痺の発生の例方法/Numblike符号化ベクター（s）、および/または他の遺伝子組み換えベクター本発明（s）の
麻痺結果/Numblike符号化ベクター（sの生成のための方法）、および/または他の遺伝子ベクター、本発明のこれらのInvitrogen社のウイルスパワーレンチウイルス発現システムマニュアル、2007年に教えています。簡潔に、EmGFP- bsdのカセットPmIlとしてクローン化されてBIpIフラグメントpLenti6/R4R2/V5-DESTベクターに一方、工場長（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォームかのmiR-短い感覚アイソフォーム/ numblikeカセットを同時に血圧によって転送されるpDONR221に反応。その後、調節性のプロモーター（s）とのmiR -アイソフォームカセットマルチサイトのlrされている変更に渡ったpLenti6/EmGFP-bsd/R4R2-DESTvector。複数のベクターは、この方法で合成オリゴヌクレオチドと遺伝子カセットのさまざまな組み合わせで構成で生成することができます。
【０２１６】
pLenti6/R4R2/V5-DESTベクター配列：
【０２１７】
【化１】
【０２１８】
【化２】
【０２１９】
例４：治療用ベクターの生成の追加的方法
「包括細胞ライン」は、ウィルス gag、 pol、 env構造遺伝子によって、通常細胞が核酸移入されたまたは感染されたことに由来するヒトおよび／あるいは動物の繊維芽細胞から得られる。
その一方で、包括細胞株は、psi配列のRNA欠陥を生む。従って、包括細胞から生成されたウィルス粒子は、gag、pol、env遺伝子を含まない。一度、psi配列を含むベクターのDNAが包括細胞に導入されると、核酸移入ならびに感染のために、包括細胞は治療用のRNAを最終標的細胞(例：.a CD4+細胞)へ移送する様々な能力を生成する。
【０２２０】
治療ベクターの「感染しやすい範囲」は、包括細胞株によって決められる。
包括細胞株の数が、ヒトの細胞タイプに感染しやすい範囲のウィルス生成に役立てられる。これらの包括細胞株は、それでも普段自然に存在し他の動物種に感染しやすいウィルスから得られるウィルスベクターのキャプシド形成ができる。例えば、SIV またはMMLVから分割したベクターは、GP 120キャプシド形成細胞株により包括される。治療用ベクターの補完物を生成する例のプルコトルは以下の方法で得られる。
【０２２１】
１．20マイクログラムのレトロウィルスベクターが、一般的なプラスチック・チューブのIIepes緩衝生理食塩水0.8‐1ミリののタッピングによって選別できるマーカー遺伝子を含まれた2‐3マイクログラムのウィルスDNAと混ぜ合わせられる。
２．70マイクロリットルの2MCaClが、一般的なタッピングを繰り返しながら混合液に入れられる。
３．チューブの中に、青い沈殿が初めて起こったら、生成物は包括細胞の30%の密集した層に生成される(いかなる数の商業用ベンダーから)。DNA混合液は、包括細胞から最初に媒体を除いた後に得られる。
４．包括細胞は、室温25度の部屋で20−30分培養してから、36‐38度の孵化機に3.5時間入れられる。
５．3.5-4ミリの15%グリセロールを含むヘペス緩衝液に3分間加えて、細胞をDulbecco's 修正Eagle's 媒体(DMEM)+! 0% FBS x2で洗浄する。
６．DMKM+10% FBSにもどし、37度で20時間培養する。
７．取り除き、治療用のウィルスを含む培養液をフィルターする。
【０２２２】
過剰なウィルスの上澄みは、瞬時に貯蓄され摂氏80度の培養に集められる。上澄みは、5から8マイクログラムのポリブレンとともに保存され、標的細胞感染の効果を増加させる。別の方法で、ポリブレンは感染させる前に取り除かれるであろう。
【０２２３】
安定的な生産者ラインは、
8。安定的な生産ライン20に分割パッケージング細胞ライン1、または1から40と、その後に、これらの細胞の培養に10日間（）によって媒体選択薬を含む（特定の抗生物質をトランスフェクトした抵抗性遺伝子に対応する例の中3日ごとに変化を確立することができます）。
【０２２４】
10日培養されたのちに取り出され、一定分量に分けられ保存のために冷凍される。
【０２２５】
アッセイレトロウイルス感染性の/滴融合"テストの層にウイルス上清の定義されたボリュームのアプリケーションで実現しています"細胞のようなNIII 3T3細胞20％の合流点にメッキ。NIHのための後、2〜3の細胞分裂回（24-36時間3T3細胞）"テスト"のコロニーの細胞系抗生物質には37度を含む培地で培養カウントされる。清の力価、これらの植民地から推定されている次の算式によりカウント：
コロニー形成単位/mlの=植民地Xの0.5（分割要因）を同定/ウイルスの量（）mlの
この推定値の精度は、大量のテストによって増加は、"テスト"細胞の多くはプレート上清。
この見積りの正確性は、「試験」細胞より多くのより多くの上澄みをテストすることで増加する。
【０２２６】
治療用ウィルスの上澄みのアプリケーションは、治療での状況に適した様々な方法により成される。
【０２２７】
例５：選択された細胞のための成長培養環境
選択されたセルを拡大することができます/ダルベッコの修正最小必須培地（DMEM培地）で栽培さグルタミンで補足し、β-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。LIF および、多能性、未分化または多能性の状態では、このような細胞をダルベッコの修正最小必須培地で維持することができます選択したセルを維持するために不可欠である細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上を維持し、選択したセルの必要性を置き換える（DMEMに）グルタミンと、補完β-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。 LIFおよび未分化状態を米国特許6432711（一部屋あたり）細胞の維持に不可欠な細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上のセルを維持するため必要が置き換えられます。
【０２２８】
ためには、細胞をトリプシンている神経細胞には、選択した細胞の分化を開始するとLIF無料で洗浄し、DMEMに置か10％牛胎児血清（FBS）を補充。 DMEM培地に再懸濁と10％のFBSをした後、IXlO5細胞を5mlのDMEMに、10％FBSを、0.5ミクロンのレチノイン酸では、細胞の小さな集合体を形成すると予想されている60ミリメートルフィッシャー細菌学生のペトリ皿で、メッキされる。適切な細胞の分化の集約に役立ちます。適切な神経細胞の転写因子を持つ高効率トランスフェクションの前またはDMEM培地、FBSを、レチノイン酸のめっき後に発生することができます。（追加の詳細については）米国特許643271 1 5453357してください。
【０２２９】
例６：HLAマッチング 標的細胞(例：例：臍帯血、その他の適する根源および／あるいはその結果からの臍帯血または細胞.)は検査され、遺伝子組み換えされ（オプション）、増殖させられ、望まれる細胞タイプ（オプション）への分化のために誘導される。それら細胞は、標準的な幹細胞移植プロコトルに従って移植される。確かな例として、細胞はHLAマッチングなしに移植される。例７：ごくまれな例では、生体内における細胞分化を刺激し促進させる目的で、導入遺伝子を符号化するベクターを患者に導入することは適切であるとされている。
【０２３０】
例８：選択された細胞の遺伝子組み換え
体外では外因性の細胞や、患者の内因性の細胞の遺伝子改変のいずれかまたは未発表の方法は、アート（米国パットなどに知られて公開さに応じて実行することができます。番6,432,71 1、米国05593875、米国05783566、米国5928944、米国05910488、米国05824547など）や、他の一般に受け入れられたことを意味し。宿主細胞に変換するために適した方法をSambrookらで発見することができます。 （分子クローニング：実験室マニュアル第2版、コールドスプリングハーバー研究所を押します（1989））、および他の研究室の教科書。正常にトランスフェクトした細胞を選択プロトコルRNAの発現アッセイと形態素解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む識別される。正常にトランスフェクトした細胞からクローンは、適切なレベルでは、適切な外因性のDNAを表現する凍結保存によってセルの行（）として凍結保存の芸術に知られている任意の適切な方法を活用し維持することができま
選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、これらG418、ハイグロマイシンとメトトレキサートなどの薬に耐性を授与などがあります。細胞の関心のある薬剤選択によって識別されることができる遺伝子を含む場所のセルには、選択可能なマーカー遺伝子の生き残る設立しており、他の人死ぬ。
【０２３１】
現在の発明"とは、発明の選択されたセル"とは、遺伝子組み換え細胞の選択を開示する。長期的遺伝子改変細胞の遺伝子の改変に選択したセルを、天然または合成の核酸を導入することを指します/またはその子孫、または不死化細胞株および/または任意の芸術に既知の手段によってその子孫。また培養条件は、遺伝子発現パターンの永続的な変化を誘発する本遺伝子改変を表すために考えられている。幹細胞の改造かどうかは、ホストの脳から派生する、内因性ドナー源、外因性のドナー源、またはセルの行を、特に人間の神経システムの特定の人間の病気の治療に実行可能なアプローチを表しています。
【０２３２】
遺伝的変更は、この情報開示の対象が、これらに限定されていません：遺伝的改良in vivoでの実行;変更は、アクティビティや代謝酵素の内因性または外因性の選択したセルを発現量を変更する/またはその子孫;変更は、活動の量を変更する細胞たんぱく質の、または抗原;は、アクティビティや蛋白質のシグナル伝達経路に関与する量を変更する変更、修正は、HLAのタイプを変更する;は、細胞の分化を変更変更;は、腫瘍の可能性を変更する修正;は、細胞の分化を変更変更;変更は、変更する量や構造たんぱく質の活性;は、量や膜関連たんぱく質の活性を変更する変更（構造や酵素）;変更は、アクティビティやたんぱく質、DNA修復および染色体の維持に関与する量を変える;変更は、アクティビティやたんぱく質の量を変更する細胞輸送に関与する;変更は、アクティビティや酵素の量を変える;変更は、アクティビティや蛋白質のシナプスの形成と維持に関与する量を変える;変更は、アクティビティやたんぱく質の神経突起伸長や軸索伸長や形成に関与する量を変える;変更は、セル内の量や抗酸化物質を生成酵素の活性を変える;は、変更後の細胞内たんぱく質の翻訳後修飾につながる変更;は、アクティビティやたんぱく質の細胞修復の他の側面に関与する量、これは寿命の増加変更変更変更細胞テロメラーゼの生産（など）。これら上記のようにこのような蛋白質、DNAやRNAによるヒトゲノムや他の動物、植物、ウイルス、または細菌ゲノムから派生したエンコードされることがあります。また、配列ノボド設計をカバーこの発明は。
【０２３３】
加えて、本発明に関連して、選択したセルとのin - situ、遺伝子組み換え技術で/またはその子孫細胞は病気の治療のために。内因性の細胞に直接注入やDNAまたはRNAベクター、ウイルス、レトロウイルスなどのアプリケーションでその場で変更することが幹細胞は、組織の物質にリポソーム等、または脳室系の適切な部分に。1992年以来、我々は、この方法で、幹細胞の数千/前駆細胞や何千もの子孫細胞を更新している。私たちのデータを表示、変更、セルの種類の非常に様々な神経システム全体の前駆細胞の結果を変更する副作用のような結果はないが、この方法、および。例9：遺伝子ベクターの導入は、ホストに。
【０２３４】
好ましい実施態様では、内因性細胞のベクターと、これらのような本in vivoでのホストの血液、組織、中枢神経系への治療のベクター（s）の導入によって、骨髄などの最大の利点は変更することによって達成される可能性があります説明トランスフェクトされる内因性の標的細胞の数が多い。これは、適切に、デバイスのように、または静脈や動脈循環には、治療のベクターを注入する針、筋肉組織、または中枢神経系になどの特定の組織にカテーテルのサイズを使用することによって達成されることがあります。好ましい実施態様では、ウイルスVSVの偽型は- gをエンベロープ糖たんぱく質とネイティブのHIV -私envたんぱく質。
【０２３５】
例10：注射神経系の移植を選択したセルに成長や分化のメディア（のいずれか）は胎児の神経系や内因性の胎児の細胞の遺伝的ベクターを利用した遺伝子組み換え技術により、次の方法で達成される可能性があります：無菌状態の下では、子宮や胎児を超音波やによって視覚化され放射性物質の指導、他。で胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の識別を容易にする別の方法としては、子宮手術で公開されることがあります。選択されたセルを注射によって（使用して適切にカテーテルや針の大きさ）は、心室のシステムは、胚ゾーン（掲載に）導入することができますまたは中枢神経系の物質に。注射特定のインスタンスでは、母親の腹壁を介して実行されるかもしれませんが、胎児に子宮壁と胎児の膜。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体に基づく方法、またはその他の手段によって監視されて指導を芸術に知られ放射線。
【０２３６】
腹部の壁は、胎児に子宮壁と胎児の膜。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体ベースの方法、または指導art.Under適切な無菌状態のことが知られ放射線、胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の身分証明書を視覚的にも達成されるのは他の手段によって監視されて物理的な検査や触診で結合によって定位と指導放射線。細胞培養後、選択、または分化細胞の適切な量を注射または他の手段によって心室のシステムは、胚のゾーン、または中枢神経系の物質に導入することができます。注射の精度を直接観察、超音波、またはによって監視されることが放射性物質の指導、他の。
【０２３７】
ハンチントン病やパーキンソン病、脳の特定部分の細胞のような大人の特定の、神経の病気では中枢神経系、選択的に影響を受けます。パーキンソン病の場合には、黒質のドーパミン作動性細胞です。無菌状態の下で細胞分化の地域特有の疾患の細胞の、ローカライズされた移植大人に影響を与えるX線写真により実現されるように誘導された移植します。放射線技術指導、CTおよび/またはMRIの使用を含めることが注入された材料を監視する利点は、コントラストや同位体比を用いた手法を取ることがあります。
【０２３８】
特定の神経系の病気では、いくつかの代謝貯蔵障害などの細胞は神経系の多様な地域間、そして最大の利点は影響を受けている遺伝子組み換えによって達成される可能性があります成長文化（いずれかから、内因性の細胞または本発明の選択されたセルの導入を変更するびまん性の方法で、大量に組織にメディアや差別化中）。中枢神経系では、これらの疾患の最高の心室内注射によって（適切に、デバイス、または針）の開発の初期段階（特に）では、びまん性内因性のセルを変更または選択したセルの拡散engraflment分離できるようになるカテーテルのサイズを使用して接近する可能性がありますの成長および/または分化のメディアから。それにもかかわらず、同じ目的のために循環系への細胞の注入も覆われている。しかし、すべての障害、複数の臓器や体のびまん性（）リソソーム貯蔵障害、hemoglobinpathies、筋ジストロフィーなどに影響を与える点で、細胞の成長および/または分化メディアからの分離にも優先的に直接循環および/または臓器に導入される可能性があります肝臓、腎臓、腸、脾臓、副腎、膵臓、肺などの臓器は、胸腺を使用して指導し、任意の適切な、デバイスのように、全身の細胞のびまん性移植できるだけでなく、特定のカテーテルのサイズの内視鏡導入と細胞の浸潤、選択された臓器に。
【０２３９】
例11：血液循環の流れと器官への注入による細胞輸送
1つの器官系の病気別々の器官系から遺伝子組み換え細胞を治療できる可能性があります。また、いくつかのインスタンスで、その選択したセルを統合することがありますが独自に生体内、十分な数字で区別する場合は、血流は動脈、静脈または肝、に成長との培養後に注入され、/または明らかになる可能性があります分化メディア。このアプローチは、本発明で覆われている。びまん性筋の治療（）、（遺伝性球状赤血球例えば、鎌状赤血球貧血、他のhemoglobinopathies等）は、例えば、細胞の成長をメディアや差別から分離されたの注入を伴うことがあります器官、組織、または血液疾患筋ジストロフィーなど患者にメディア、特に、患者の循環。このアプローチは、また、心筋梗塞、脳卒中などの虚血性傷害を改善するだけでなく、脳や他の組織への外傷と考えられています。針やカテーテルによる血流中にそのような細胞は、現在の発明により生産の射出、直接ように、細胞の"ホーム"は、骨髄、筋肉を有効にして、腎臓、肺、および/またはその他の他の器官系、骨髄空間にだけでなく、注射液を直接、本発明の練習用に適しています。とや、超音波、放射線や透視また、本発明の練習用に適していますせずに、損傷部位に細胞を同様に注射を直接。
【０２４０】
本発明において有効な選択された細胞を独立させる方法は、Zhao et al., 2006によって書かれているものを含む。
【０２４１】
実施の形態としては、Numblike および／あるいはNumbアイソフォームを符号化する遺伝子ベクターは、Numb またはNumblike導入遺伝子の術法によりアプローチ可能なプロモータにより成る。
【０２４２】
別個の実施の形態としては、核酸移入のモードは、Numblike とNumbアイソフォームの永久的な遺伝子発現よりも、一過性の遺伝子発現を誘導する核酸移入から選択されることができる。
【０２４３】
例12：遺伝子組み換えの例
これは、病気の数百の臨床条件ができると考えられて扱われることをおよび/または含む本発明の方法によって、改善さないようにカナバン病（ASP）に限る。テイサックス病（HEXAの）;レッシュナイハン症候群（HRPT）;ハンチントン病（HTTの）;スライ症候群;タイプAとBのニーマンピック病型;サンドホフ（HEXB）病、ファブリー病（総賃貸）; C型ニーマンピック病（NPCl）;ゴーシェ病（ GBアドバンス）;パーキンソン病（PARK2等）フォンヒッペルリンダウ病、鎌状赤血球貧血（HBB）およびその他のサラセミアなどと同じような病気。これらの導入遺伝子のコーディング領域、または通常の遺伝子のコーディング領域の一部を表すことがあります。は、特定の実施態様および例は、上記に限定されることが理解されるためには、しかし、その発明の範囲ではありません。発明以外の練習になるかもしれません、特に説明しても、添付の特許請求の範囲内である。
【０２４４】
例13：多能化細胞を提供し、長Numbアイソフォーム、Oct-4、Sox-2、 EmGFP核酸鎖を発現するベクターの配列の例は、
【０２４５】
【化３】
【０２４６】
【化４】
【０２４７】
【化５】
【０２４８】
【化６】
【０２４９】
【化７】
【０２５０】
【化８】
【０２５１】
上のベクター配列に対応する図式化マップは、図１に示されている。
【０２５２】
ベクターを完全にdenovoの遺伝子合成、または一部を麻痺、ソックスとOCT3のクローン技術で構築される可能性があります/位置LacZのでインビトロジェンpcDNA4tolacZベクターの中で占領に4cDNA配列。同様に、tetR遺伝子インビトロジェンpcDNA6/TRベクターの中で発見される。遺伝子を参照の配列を符号化もpcDNA41acZベクターにクローニングに適しています。
【０２５３】
代わりにtetR遺伝子は標的細胞に、pcDNA6/TRベクターを、tetR遺伝子とそのPCMVプロモータを除いた配列により構成されるベクターとの組み合わせにより核酸移入されるだろう。
【０２５４】
同様に、複数のベクターに限り、要素要素に似て採用される可能性があります上記の配列に含まれて存在している。このプロモーターの競争の可能性を減らすことができます。は、他の条件のプロモーター要素は、テトラサイクリン感受性のプロモーター要素の代わりに使用されることが理解されるためだ。
同様に、複合的なベクターは
例14 ここに記された方法（または公表された方法）により生成された、静脈内および投薬内の多能性の幹細胞は、移植細胞が老年期の患者において寿命または健康を増進させるであろう投薬に1回かそれ以上与えられることを期待されている。
【０２５５】
例15 遺伝子細胞の生成
本発明は、ここで記されている方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能、多能性、自己再生できる幹細胞から遺伝子細胞を誘導することについて触れている。このような遺伝子細胞の生成は、不妊の治療ならびに生体外での胎芽の生成に適すると考えられている。(例：. Hubner et al., 2003; Kehler et al., 2005;Nayernia et al., 2006a; Nayernia et al., 2006b; Drusenheimer et al., 2007;Moore et al., 2007; etc.)
例16：形質転換動物の形成
本発明は、形質転換動物の形成についても触れている。ここで記されている方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能性細胞は、本発明に関して知られている方法により形質転換動物を形成することに有効利用されるだろう。
【０２５６】
例17：治療用ベクターの構築
が採用される可能性がありますレトロウイルスベクターの例を含むがこれに限定されない場合は、それらMoloneyマウス白血病ウイルス、Moloneyマウス肉腫ウイルスから派生した、
とラウス肉腫ウイルス、FIVや、HIV。適切な発現ベクターは、真核生物の細胞にDNAまたはRNAのトランスフェクションに雇用されることがあります。このようなベクターが含まれますが原核生物のベクターには、例えば、細菌のベクター;真核生物のベクターなどのような制限はありませんが、例えば、酵母のベクターと真菌のベクターおよびウイルスベクターなどが、これに限定されない、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターに関連し、レトロウイルスベクター。
【０２５７】
レトロウィルスの例は、ここに挙げるものに限られないが、モロニーマウス白血病ウィルス、モロニーマウス肉腫ウィルスや、ラウス肉腫ウィルス、FIV、 HIVから得られたものがある。適した遺伝子発現ベクターは、DNAまたはRNAを真核生物細胞に核酸移入するために動因される。そのようなベクターには、ここに挙げるものに限られないが、含まれる。
【０２５８】
レプリケーション無能pcDNA 6.2重量/ミールとpcDNA 6.2/EmGFP-Bsd/V5- destにベクターを適切な発現ベクター（インビトロジェン社）の例ですと、合成オリゴヌクレオチドの式（miRNAの例を許可）は、ターゲット配列を切断する能力があります。これらのベクターからループ配列miRNAの内因性の長いpolIIの転写産物から（事前のmiRNA）は、人工miRNAの切除を直接に隣接しています。
【０２５９】
代わりに、HIVpsi配列の包含は、治療用ベクターにネイティブのHIV遺伝子と戦い、ウィルス粒子だけでなく抑制性のHIV輸送物質に包括することを許可する。
【０２６０】
単一の標的に対抗する複合的miRNA鎖の結合は、標的連鎖発現を減少させる成功率を上昇させる。miRNA連鎖は、EF-I alphaプロモータ、いかなる Tcell 特定プロモータのような特定組織のプロモータまたは望まれる細胞での発現を誘導するマクロファージの特定プロモータに手術によりリンクする。
【０２６１】
遺伝子発現のためのDESTベクターを利用すると、結果として生まれた治療用ベクターは、分割した細胞と分割していない細胞の両方の安定的な形質導入を可能にする。
【０２６２】
実施の形態としては、治療用ベクターは、CXCR4、CCR5および／あるは標的細胞におけるHIV感染の共受容体に作用すると知られている他の細胞たんぱく質の発現を減少させるための、1つないしそれ以上のプロモータにより操作される複合的な合成オリゴヌクレオチド連鎖を含む。
【０２６３】
ある治療用ベクターでは(2006年に構築)、CXCR4 とCCR5の共受容体を標的にする4つのmiRNA連鎖が、HIV -2 TAR とRRE を標的にするRNA連鎖に従って、pcDNA6.2 GW/miRベクターにクローンされる。
【０２６４】
遺伝子の構築は、ベクターの背景、異種核酸連鎖の手術によりアクセスできるプロモータを生成するトランス活性化因子を含む。
【０２６５】
他の適したベクターの例としては、レトロウィルスベクターがある。レトロウィルスは、RNA遺伝子を含むRNAウィルスである。gag、 pol、 env 遺伝子は、LTR連鎖によって配置される。5' と 3'LTR連鎖は、転写とRNAのプロアデニル化を促進させる。
【０２６６】
レトロウイルスベクターは、ターゲットの異種遺伝子調節性プロモーターによって運営さ調節できるtransactivating要素は、内部リボソームリエントリー部位（IRES）、選択マーカーを提供することがあります。
【０２６７】
また、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で表現されることがあります。最後に、レトロウイルスベクターシスを含む可能性があります配列を逆転写と統合のために必要な演技。感染時には、RNAの逆のDNAには、効率的にホストゲノムに統合され転写される。本発明の組換えレトロウイルスの遺伝子組み換えなどの方法では、一部のネイティブなウイルスのレトロウイルス、感染症の遺伝子を削除し、変更された実施の形態ではなく、ターゲットと細胞の遺伝子改変のための核酸配列に置き換えています。配列外因性の可能性がありますDNAまたはRNAは、その自然のまたは変更されたフォームです。
【０２６８】
例18：治療用ベクターを生成する方法の例
治療用ベクターを生成する方法は、Invitrogen's Viral Power Lentiviral Expression Systems Manualに記されている通りのものを含む。簡潔に言えば、EmGFP-bsdカセットは、miR-dccoyカセットが同時にBP反応によってpDONR221に輸送される際に、PmII-BIpI断片として複写されpLenti6/R4R2/V5-DESTベクターとなる。それから、EFIaプロモータとmiR-decoyは、修正されたpLenti6/KmGFP-bsd/R4R2-DESTベクターに交配する多部位LRである。
pLenti6/R4R2/V5-DESTベクター配列：
【０２６９】
【化９】
【０２７０】
【化１０】
【０２７１】
【化１１】
【０２７２】
【化１２】
【０２７３】
例19：生体内で増殖/増殖性の幹細胞/前駆細胞のための方法
順）HIV感染症とは、比較的1に耐性のある標的細胞の大量取得する/または2）HIVの複製および/または3）HIVの転写、前駆細胞/細胞をダルベッコの修正最小必須培地（DMEM培地）で補完成長することができます幹グルタミンとβ-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。 LIFおよび前駆細胞の維持に不可欠である前駆細胞を維持するための必要性/細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上の幹細胞を置き換える/未分化状態の幹細胞。
【０２７４】
例20：幹細胞は個人から集められ、細胞は治療用ベクターによって核酸移入され、HLAタイピングやマッチングを伴うか否かで一般的な方法により移植の準備をする。
【０２７５】
例21：臍帯血サンプルは臍帯血バンクから得られる。細胞は、有用な配列の治療用ベクターに核酸移入され、HLAタイピングやマッチングを伴うか否かで一般的な方法により移植の準備をする。例22：治療用ベクターの細胞含有物に適する合成オリゴヌクレオチド配列の例
70%以上のたんぱく質発現を減少させるいかなる合成オリゴヌクレオチド鎖も本発明により言及されている。
【０２７６】
任意の合成オリゴヌクレオチド配列が正常に標的細胞の能力を"70％以上をHIVに感染複製を維持するために削減が低い"の70％が治療の学位またはHIVウイルスの活動やしかし、治療の程度低いまた、この発明によりカバーされています。
【０２７７】
Examplesof miRNA sequences include miRNA sequences derived by IVGN
【０２７８】
【化１３】
【０２７９】
Similarly,miRNΛ sequences targeting the CCR5 gene include top strand: 5'-
【０２８０】
【化１４】
【０２８１】
例23：治療用ベクターにおける細胞含有物に適したデコイRNAの例
すべての桜が正常に標的細胞の能力を"70％またはITIV複製を維持するために削減する配列が低い"の70％が治療の学位またはHIVウイルスの活動やしかし、治療の程度低い本発明でカバーされています。
【０２８２】
例TARをデコイ配列です。
【０２８３】
【化１５】
【０２８４】
Anexample RRE decoy sequence is 例RREデコイ配列です。
【０２８５】
【化１６】
【０２８６】
例24：RNAデコイの安定性を提供する側面連鎖
RNAデコイに適した側面連鎖の例は以下に挙げられる。
【０２８７】
【化１７】
【０２８８】
以前は、それはとりのいずれかの側にヘアピン、19ヌクレオチドの5'側のU6のRNAの（したNTDS）も3'幹、直ちにPOEIII用ポリターミネータの前に並ぶ配列、実証されたより高い安定性を示した。この配置は3'-5'エキソヌクレアーゼの攻撃から保護するものと期待されている3'トレーラーを挿入するRNAの折り畳みに干渉する可能性を低減する。は、最初の3年/4 tRNAの配列は、挿入の5'末端に存在して保護されるべきであるし、核からの輸出を阻止する必要があります（グッドら、1997）。
【０２８９】
例25：治療用のベクターの受け入れ先への導入
実施の形態としては、血液幹／前駆細胞、標的細胞は、生体内において治療用ベクターの受け入れ先血液や組織、骨髄への導入により治療用ベクターによって核酸移入される。最大の有効点は、より多くの標的幹細胞／子細胞を組み換えることによって得られる。これは、適したサイズのカテーテルのような装置を用いて、また治療用ベクターを静脈や循環動脈に注入するための針などを利用して行われる。
【０２９０】
例26：受け入れ先への遺伝子組み換えされた細胞の導入
成長した末梢血管Tリンパ球、単球、マクロファージ、T細胞子細胞、マクロファージ単球子細胞、および／あるいは多能性の造血幹細胞などの血液細胞は、他の幹細胞/前駆細胞と同様に、生体外において治療用ベクターを用いて核酸移入される。治療用ベクターの適切な濃度は、Browninget al., 1999と一致したものである。その後、治療用ベクターによって核酸移入された細胞は、骨髄や他の組織で"本拠地化"できる。
【０２９１】
ここで書かれている例や実施の形態は、説明的な目的であり、様々な組み換えまたは変化が起こると考えられる。全ての引用された出版物、特許、特許出願は、すべての目的において、ここで編入されたことを理解されなくてはならない。
【０２９２】
例27：本発明を利用し発現、標的にされた導入遺伝子の例
本発明を実行するのに有効な導入遺伝子配列は、本発明への利用に有効である。適したヌクレオチド連鎖は、望まれる細胞の活性が得られる限り、どの種からも採取される。このような連鎖の呼称方法は、ここで記された小さなものから重要なものまで、特別な種類は表わさない。NCBIデータベースに保存される連鎖は、上記の本アプリケーションにあるような例を表わす。これらは、本発明に有効な連鎖を符号化する特定導入遺伝子の例でもある。
【０２９３】
【化１８】
【０２９４】
【化１９】
【０２９５】
【化２０】
【０２９６】
【化２１】
【０２９７】
【化２２】
【０２９８】
【化２３】
【０２９９】
【化２４】
【０３００】
【化２５】
【０３０１】
【化２６】
【０３０２】
【化２７】
【０３０３】
【化２８】
【０３０４】
【化２９】
【０３０５】
【化３０】
【０３０６】
【化３１】
【０３０７】
【化３２】
【０３０８】
【化３３】
【０３０９】
【化３４】
【０３１０】
【化３５】
【０３１１】
【化３６】
【０３１２】
【化３７】
【０３１３】
【化３８】
【０３１４】
【化３９】
【０３１５】
【化４０】
【０３１６】
【化４１】
【０３１７】
【化４２】
【０３１８】
【化４３】
【０３１９】
【化４４】
【０３２０】
【化４５】
【０３２１】
【化４６】
【０３２２】
【化４７】
【０３２３】
【化４８】
【０３２４】
【化４９】
【０３２５】
【化５０】
【０３２６】
【化５１】
【０３２７】
挿話として引用されている全刊行物の内容および次のアメリカ合衆国における特許は、そのま記載および追加されている。5453357, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S. 5,928,944, U.S.05,910,488, U.S. 05,824,547
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デコイ、合成オリゴヌクレオチド連鎖、合成オリゴヌクレオチドを含む、ＨＩＶ共受容体に直接対抗するｌｌｌＶ−ｌおよび／あるいはＩＩＩＶ−２の感染を減少させるベクター。
【請求項２】
合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ連鎖グループから選択される合成オリゴヌクレオチド連鎖を含む請求項１のベクター。
【請求項３】
合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを含む請求項１のベクターは分類される。
【請求項４】
ウィルスベクターである請求項１のベクター。
【請求項５】
ＨＩＶ酵素を標的にする合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項６】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作される合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項７】
ＥＦ−１ ａｌｐｈａプロモータによって操作される合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項８】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するマーカー遺伝子を含む、請求項１のベクター。
【請求項９】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させる、デコイ合成オリゴヌクレオチド鎖と合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ共受容体に対抗するＨＩＶ ＲＲＥおよび／あるいはＴＡＲデコイ鎖を含むベクター。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ連鎖を含む合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１１】
合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを含む請求項９のベクター。
【請求項１２】
ウィルスベクターである請求項９のベクター。
【請求項１３】
ＨＩＶ酵素も標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１４】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１５】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項９のベクター。
【請求項１６】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項９のベクター。
【請求項１７】
ＩＩＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨ１Ｖ−２感染を減少させ、デコイ鎖がＨＩＶ−Ｉ とＨＩＶ−２デコイ連鎖の組み合わせを表わすベクター。
【請求項１８】
合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡ連鎖を含む請求項１７のベクター。
【請求項１９】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項１７のベクター。
【請求項２０】
ベクターがウィルスベクターである請求項１７のベクター。
【請求項２１】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項１７のベクター。
【請求項２２】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項１７のベクター。
【請求項２３】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項１７のベクター。
【請求項２４】
抗生たんぱく質また蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項１７のベクター。
【請求項２５】
ＩＩＩＶ−Ｉ および／あるいはＨ１Ｖ−２感染を減少させ、デコイ鎖がＨＩＶ−２ ＲＲＥ ａｎｄ ＨＩＶ−２ ＴＡＲ連鎖の組み合わせを表わすベクター。
【請求項２６】
合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ あるいはｓｈＲＮＡ連鎖を含む請求項２５のベクター。
【請求項２７】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項２５のベクター。
【請求項２８】
ベクターがウィルスベクターである請求項２５のベクター。
【請求項２９】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項２５のベクター。
【請求項３０】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項２５のベクター。
【請求項３１】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項２５のベクター。．
【請求項３２】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項２５のベクター。
【請求項３３】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させることのできる、ＨＩＶ共受容体、ＨＩＶ ＲＲＥ、ＨＩＶ ＴＡＲデコイ連鎖に直接対抗する合成オリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３４】
請求項３３のベクターは、合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ連鎖を含む。
【請求項３５】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項３４のベクター。
【請求項３６】
ウィルスベクターである請求項３４のベクター。
【請求項３７】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項３４のベクター。
【請求項３８】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項３４のベクター。
【請求項３９】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項３４のベクター。
【請求項４０】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項３４のベクター。
【請求項４１】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させることのできる、ＨＩＶ共受容体や単一ＨＩＶ共受容体に直接対抗する合成オリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮＡ配列を含む請求項４１のベクター。
【請求項４３】
前記ベクターは合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項４１のベクター。
【請求項４４】
前ベクターがウイルスベクターである請求項４１のベクター。
【請求項４５】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶの酵素のターゲットである請求項４１のベクター。
【請求項４６】
合成オリゴヌクレオチドのプロモーターの標的細胞に積極的で駆動される請求項４１のベクター。
【請求項４７】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉアルファプロモータによって駆動される請求項４１のベクター。
【請求項４８】
前記ベクターが抗生物質抵抗たんぱく質あるいは蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカ遺伝子を含む請求項４１の方法。
【請求項４９】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含む請求項４９のＨＩＶコレセプタを標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクター。
【請求項５０】
前記合成ヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮＡ配列を含む請求項４９のベクター。
【請求項５１】
前記ベクターは合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項４９のベクター。
【請求項５２】
前記ベクターはウイルスベクターである請求項４９のベクター。
【請求項５３】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする請求項４９のベクター。
【請求項５４】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項４９のベクター。
【請求項５５】
前記合成オリゴヌクレオチドはＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項４９のベクター。
【請求項５６】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項４９のベクター。
【請求項５７】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含む請求項４９のＨＩＶコレセプタを標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクターであって、ＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列であるベクター。
【請求項５８】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項５７のベクター。
【請求項５９】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項５７のベクター。
【請求項６０】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項５７のベクター。
【請求項６１】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項５７のベクター。
【請求項６２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項５７のベクター。
【請求項６３】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項５７のベクター。
【請求項６４】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項５７のベクター。
【請求項６５】
デコイ合成ヌクレオチド配列およびＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクターであって、ＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列であるベクター。
【請求項６６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項６５のベクター。
【請求項６７】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項６５のベクター。
【請求項６８】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項６５のベクター。
【請求項６９】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項６５のベクター。
【請求項７０】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項６５のベクター。
【請求項７１】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項６５のベクター。
【請求項７２】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項６５のベクター。
【請求項７３】
ＣＸＣＲ４に対して指向される複数のｍｉＲＮＡ配列と、ＣＣＲ５に対して指向される複数のｍｉＲＮＡ配列と、Ｉ１ＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列と、ＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターがウイルスベクターであるベクター。
【請求項７４】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項７３のベクター。
【請求項７５】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項７３のベクター。
【請求項７６】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項７３のベクター。
【請求項７７】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項７３のベクター。
【請求項７８】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項７３のベクター。
【請求項７９】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項７３のベクター。
【請求項８０】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項７３のベクター。
【請求項８１】
ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＴＡＲ配列を含む免疫不全による感染を遅らせることができるベクター。
【請求項８２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項８１のベクター。
【請求項８３】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項８１のベクター。
【請求項８４】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項８１のベクター。
【請求項８５】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項８１のベクター。
【請求項８６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項８１のベクター。
【請求項８７】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項８１のベクター。
【請求項８８】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項８１のベクター。
【請求項８９】
患者の感染を改善するための方法であって、
１）免疫不全ウイルス感染を遅らせることができるベクターを生成するステップと、
２）臍帯血細胞、造血細胞、末梢血、骨髄、精原細胞、始原生殖細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、ＣＤの３４＋幹細胞あるいは前駆細胞および／または体外あるいは体内でＨＩＶ標的細胞に分化できる任意の細胞から選択される幹細胞あるいは前駆細胞をトランスフェクトするステップと、
３）トランスフェクトした細胞を患者の血液や骨髄に導入するステップとを含む方法。
【請求項９０】
前記幹／前駆細胞は、成長促進媒体で培養され、患者への循環に導入する前に前記細胞を拡張する請求項８９の方法。
【請求項９１】
マーカーたんぱく質の発現により、正常なトランスフェクションが監視される請求項８９の方法。
【請求項９２】
クレーム８９の方法は、選択された幹細胞／前駆細胞ドナーの臍帯血前駆細胞である、請求項８９の方法。
【請求項９３】
クレーム８９の方法は、選択された幹細胞／前駆細胞が自家末梢血の幹／前駆細胞である、請求項８９の方法。
【請求項９４】
前記選択された幹／前駆細胞が同系細胞から由来した、誘発した、あるいは再プログラミングされた多能性あるいは多能化幹細胞である請求項８９の方法。
【請求項９５】
患者のＨＩＶ感染を遅らせることができる方法であって、前記ウイルスベクターとを生成するステップと、前記ベクターから生成されたウイルスを患者の循環器に導入するステップとを含む方法。
【請求項９６】
デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶコレセプタに対して指向された合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を遅らせることができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２配列に対して指向されたリボザイム配列を含むベクター。
【請求項９７】
デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶコレセプタに対して指向された合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を遅らせることができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記デコイ配列は、Ｕ６プロモーターにより駆動されるベクター。
【請求項９８】
Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＮＯＧたんぱく質、ＩＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦたんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質を符号化する配列から選択された配列を含む追加のヌクレオチド配列の他、哺乳類ｎｕｍｂたんぱく質の「長い」（ＲＲＲ挿入＋）アイソフォームを符号化するヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項９９】
前記ベクターは短いＮｕｍｂアイソフォームおよびＮｕｍｂｌｉｋｅを標的とする合成オリゴヌクレオチドを含む請求項９８のベクター。
【請求項１００】
哺乳類の長（ＰＲＲｉｎｓｅｒｔ＋）アイソフォームを符号化したヌクレオチド配列が、ナノ粒子の Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ− ４、ＬＩＦ、 ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタティン（ＯＳＭ）、オンコスタティン 受容体（ＯＳＭＲ）カーディオトロフィン−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、 ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、 ＩＬ−１ １、 ｇｐｌ３０、そして白血病抑制因子の活動を伴う他のたんぱく質や細胞表面の細胞表面のシグナル受容体遺伝子ファミリー（ノッチ）の活動のアークにより選り抜かれたヌクレオチド配列を含み付加されたヌクレオチド配列と同じくらいたんぱく質を鈍くするとする請求項９８のベクター。
【請求項１０１】
多能、多能性、及び／または選択した細胞から自己再生できる細胞を製造する方法は、以下のものを含む：骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間の胚細胞、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、白血球の循環、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水中の幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換えの皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え精巣の始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血の幹細胞、遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間の胚細胞、その他の遺伝子組み換え幹細胞／前駆細胞と体細胞からなる体細胞の種類と幹細胞／前駆細胞のグループから細胞を選択する；ノッチ活性を有する蛋白質とＬＩＦ活性を有する蛋白質、ＦＧＦ４蛋白質、Ｈ０ＸＢ４蛋白質、ＮＡＮＯＧ蛋白質、Ｏｃｔ４蛋白質、Ｓｏｘ２蛋白質をエンコーディングするヌクレオチド配列から選択した追加のヌクレオチド配列と哺乳類の蛋白質のアイソフォーム”ｌｏｎｇ” （ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ ＋）をエンコーディングするヌクレオチド配列を有する選択した細胞をトランスフェクションする；ＦｉＧＦ， ｂＦＧＦ， ＬＩＦ， 鋼因子、１１−６， ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６， ＩＬ−７， オンコスタチン−Ｍ， ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１、その他の成長率を高めるサイトカインから選択したサイトカインを構成する成長培地に選択した細胞を決まった率で拡大し成長させる；前記率は前記成長培地に選択した細胞の時間の２倍から決定される；そして目的の細胞数になるまで、前記培養条件下で細胞を維持する。
【請求項１０２】
成熟したメディアが遺伝子を超えた発現を誘導するために誘引剤をさらに構成するとする、請求項１０１の方法。
【請求項１０３】
体内でさらなる分化が可能な必要な分化細胞集団を提供する方法であって、前記必要な細胞は、分化造血細胞、神経細胞、ドーパミン系の細胞、セロトニン系の細胞、コリン作用性の細胞、ノルアドレナリン作用性の細胞、ＧＡＢＡ作動性の細胞、筋細胞、心筋細胞、内胚葉と膵臓ランゲルハンス島の細胞、細菌細胞、骨髄あるいはその他の必要な細胞を含む方法であって、骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間胚細胞、造血細胞精原細胞、精巣、上皮細胞の始原生殖細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換え脂肪細胞、遺伝子組み換え胎盤細胞、遺伝子組み換え造血細胞、遺伝子組み換え皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血幹細胞、変更遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間胚細胞、その他の遺伝子組み換え幹／前駆細胞および体細胞の集団から細胞を選択し、選択された細胞を提供するステップと、
Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＧＯＮたんぱく質、ＨＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦ４たんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質を符号化する配列から選択された配列を含む付加されたヌクレオチド配列の他、哺乳類のｎｕｍｂたんぱく質の「長い」（ＰＲＲ 挿入＋）アイソフォーム を符号化するヌクレオチド配列で前記細胞をトランスフェクトするステップと、
前記選択された細胞を第１の成長速度で成長させるための成長媒体で前記選択された細胞を成長させるステップであって、前記第１の成長速度は前記成長培養媒体内で前記選択された細胞の２倍の時間から決定されるステップと、
目的の細胞数を達成するまで、成長培養媒体で前記細胞を維持するステップと、
前記選択された細胞を分化媒体の中で第２の成長時間で成長させるよう、前記分化媒体で前記選択された細胞を培養するステップであって、前記第２の成長速度は、前記成長培養媒体内で前記選択された細胞の２倍の時間から決定される、前記第２の成長速度は前記第１の成長速度の１０％から９０％の間で決定されるステップとを含み、
前記分化媒体は、分化あるいは前記選択された細胞を前記必要な分化細胞への変更を促進する上で効果的な少なくとも１つの分化促進剤を含み、
前記分化促進剤はレチノイン酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、前記必要な細胞型に適切なその他の分化促進剤からなる集団から選択される方法。
【請求項１０４】
請求項１０３の方法であって、
ｉ）ヌクレオチド配列と共に行われる核酸移入、特に転写調節因子はある細胞を望まれる細胞への分化を促すステップと、
ｉｉ）細胞をヌクレオチド配列と共に最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）へ核酸移入することはアイソフォームを和らげるステップと、
ｉｉｉ）ＰＲＲ＋Ｎｕｍｂアイソフォームを標的にした合成オリゴヌクレオチド鎖により細胞を核酸移入するステップとを含む方法。
【請求項１０５】
望まれる細胞が心筋細胞であり、その細胞がＤＭＳＯやＮＢＳ、レチノ酸、またはオルカディオミオサイドを含む分化媒介物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０６】
望まれる細胞が神経細胞であり、その細胞が神経成長因子やレチノイン酸から選択された分化作用物質を含む分化培養物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０７】
望まれる細胞が筋細胞であり、その筋細胞がエキサメタジムアクリルアミド、またはジメチルスルホキシドから選択された分化作用物質を含む分化培養物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０８】
体内でさらなる分化が可能な必要な細胞集団を提供する方法であって、
骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間胚細胞、造血細胞精原細胞、精巣、上皮細胞の始原生殖細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換え脂肪細胞、遺伝子組み換え胎盤細胞、遺伝子組み換え造血細胞、遺伝子組み換え皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血幹細胞、変更遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間胚細胞、遺伝子組み換えその他の幹／前駆細胞および体細胞から由来する細胞などの幹／前駆細胞および体細胞型の集団から細胞を選択し、選択した細胞を提供するステップと、
目的の細胞数を達成するまで、成長培養媒体で前記細胞を維持するステップと、
前記細胞をヌクレオチド配列、特に転写因子でトランスフェクトするステップと、前記細胞の必要な細胞への分化開始を促進するステップと、
細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） ＮｕｍｂアイソフォームあるいはＮｕｍｂｌｉｋｅを符号化するヌクレオチド配列と共にトランスフェクトするステップと、
分化培養物の中で、少なくとも１つの効果的な分化作用物質が選択された細胞を望まれる分化をした細胞に、分化や改造培養されるよう促進するとされる培養するステップを含み、
分化作用物質はレチノインや神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、または望まれる細胞タイプと同じくらい適した他の分化作用物質である方法。
【請求項１０９】
細胞が、最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） Ｎｕｍｂアイソフォームが符号化したヌクレオチド配列と共に培養されないとする請求項１０８の方法。
【請求項１１０】
望まれる細胞が筋細胞であり、その細胞が骨格筋細胞、平滑筋、心筋であるか否かに依存するＭｙｏＤ，ミオゲニン、ミオカルディン、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、Ｍｅｆ２Ａ、Ｇａｔａ５、Ｇａｔａ６を含む転写調整因子と共に培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１１】
ドーパミン作動性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈ１ｙａＮｇｎ２、Ｌｍｘｌｂ、またはＰｔｘ３を含む転写調整因子と共に核酸移入するとする請求項１０８の方法。
【請求項１１２】
セロトニン作用性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために転写調整因子と共に核酸移入されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１３】
Ｍａｓｈｌ、 Ｐｈｏｘ２ｂ、 Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、 Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３ 、Ｐｅｔｌ を含む転写調節因子請求項１１２の方法。
【請求項１１４】
コリン作用性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、ＭＡＳＨｌ、 Ｐｈｏｘ２ａ またＲＥＳＴ４を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１５】
ＧＡＢＡ神経が望む細胞であり、その細胞がＬｌＦ、ＮＴ３、ＮＧＦを引き起こす分化培養物の中で培養されるために、ＭＡＳＨｌ、Ｐｈｏｘ２ａ、ＲＥＳＴ４を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１６】
ノルアドレナリン神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈｌ、ｄｌＩ（ＨＡＮＤ２）、Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｇａｔａ２ またＧａｔａ３を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１７】
ＧＡＢＡ神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、ＰＩＴＸ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、Ｈｅｓ１をターゲットとするＲＮＡ を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１８】
ノルアドレナリン神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈｌ、ｄｌＩ（ＨＡＮＤ２）、 Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ。Ｇａｔａ２またＧａｔａ３を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１９】
膵臓ランゲルハンス島細胞、または内胚葉細胞が望む細胞であり、選択された細胞はＦｏｘａ２、Ｓｏｘｌ７、ＨＬＸＢ９またＰｄｘｌを含む転写調節因子と共に核酸移入する。そして付加された分化作用因子はソディウム酪酸、アクチビンＡ、レチノイン酸、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ノギン、インスリン様成長因子ＩＩ、ニコチンアミドから選ばれるとする請求項１０８の方法。
【請求項１２０】
必要な細胞は造血細胞であり、前記細胞はＲｕｎｘｌ／ＡＭＬｌを符号化するヌクレオチド配列とにトランスフェクトされ、分化分化作用因子は、必要な細胞型に適したＶＥＧＦ、血小板産生因子、コロニー刺激因子から選択される請求項１０８の方法。
【請求項１２１】
腹部機関や筋組織、心臓、中枢神経、血液、他の組織の不調を患っていて、治療が必要な患者に処置する方法であって、
祖先／種族の細胞と骨髄や末梢神経、胎盤の血液、羊水、臍帯血、肌、脂肪細胞、ヒト以外の胎芽、造血細胞、精原細胞、精巣の原始細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、他の体細胞、そして遺伝子的に改造された骨髄や末梢神経、胎盤の血液、羊水、臍帯血、肌、脂肪細胞、ヒト以外の胎芽、造血細胞、精原細胞、精巣の原始細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージから抽出された体細胞細胞を選択するステップと、
細胞が哺乳類の長（ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ −＋）アイソフォームと共に起こる核酸移入は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタティンを含む付加されたヌクレオチド配列と同じくらいたんぱく質を和らげるステップと、
選択されだ細胞が最初の成長率で育ち、分化培養物の中で培養するステップと、
核酸移入は効果的な分化培養物の中で育つ選択された細胞は、その倍の成長率で成長させるステップと、成長媒介物と呼ばれる効果的な分化は、選択された細胞の２倍の時間と決められている成長率を伸ばす、というような効果的な成長過程で細胞を発達させるステップと、
そして望む個体数を獲得するまでこの環境で細胞を保存するステップと、
選択された細胞は異なる媒介物の中で第２の成長率で成長し、成長率は選択された細胞の２倍の時間がかかるとされており、第２の成長率は１０％から９０％の間の成長率であり、
このような効果的な発達過程で細胞を発達させるステップと、
分化作用物質は、レチノイン酸や神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、他の望む細胞タイプに適した誘導体からなるステップを含む方法。。
【請求項１２２】
請求項１２１に記載の方法であって、
望まれる細胞へと分化させるよう促すヌクレオチド配列、特に転写調節因子と共に細胞を核酸移入させるステップと。
そして細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） ＮｕｍｂまたはＰＲＲ＋ ｎｕｍｂアイソフォームを符号化したヌクレオチド配列と共に核酸移入させるステップとを更に含む方法。
【請求項１２３】
選択された細胞は望まれる細胞の個体数を獲得した後に成長媒体から分離され、患者の循環組織、神経組織、他の細胞に注入されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１２４】
（Ｐｒｒ＋） ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ノッチ導入遺伝子、Ｈｏｘｂ４，ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦを含む核酸、オンコスタティン、オンコスタティン受動体、心臓毒、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、Ｌ−１１、ｇｐｌ３０を含むたんぱく質が、選択された細胞へと導入され、自己再生、多能、多能性細胞の集団を獲得する方法。
【請求項１２５】
請求項１２４に記載の方法であって、前記トランスフェクション方法がは、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避ける別の方法、あるいは、または細胞遺伝子の恣意的な変質である方法。
【請求項１２６】
自己再生、多能、多能性細胞の集団を獲得する方法であって、単一の遺伝子あるいはその一部に対応する核酸あるいはたんぱく質が過剰発言あるいは誘発され、選択された細胞となる方法であって、これらの核酸あるいはたんぱく質が長（Ｐｒｒ＋） Ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ活動を有するトランス遺伝子、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、 ＬＩＦ、 ＬＩＦＲ、 ＣＮＴＦ、ＯＳＭ、 ＯＳＭＲ、カーディオトロフィン−１ 、 ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、 ＩＬ−１ １、 ｇｐｌ３０を符号化する核酸あるいはたんぱく質から選択された１つに対応する方法。
【請求項１２７】
核酸移入の方法の利用は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞遺伝子のランダムな変質である請求項１２１の方法。
【請求項１２８】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に発生させた自己再生、多能、多能化および／あるいは分化細胞を３次元または２次元で構成される請求項１２１の方法。
【請求項１２９】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能化細胞、または分化した細胞は、細胞膜形成器官か細胞膜形成組織が培養されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３０】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能性、またくは分化した細胞はインクジェット印刷の技術と合わせ利用するとする請求項１２１の方法。
【請求項１３１】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能化細胞、または分化した細胞は懸滴で分化されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３２】
神経細胞は遺伝子的に引き起こされる自己再生、多能、多能化細胞を供給するとする請求項１２１の方法。
【請求項１３３】
核酸は自己再生、多能、多能性細胞を低下させ、その配列は電気穿孔法、ナノカプセルまたナノヴォールトを利用して選択された細胞を促進させるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３４】
自己再生、多能、多能性細胞を低下させる能力のために核酸をスクリーニングし、その配列が電気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールトを利用して選択されだ細胞を促進させる分化を始めるとする請求項１０８の方法。
【請求項１３１】
分化細胞が所望され、所望な分化細胞中に通常存在する一つまたは一つより多い転写因子に対応する核酸またはタンパク質の過剰発現または導入による、遺伝子賛成、自己再生、多能、および／または多能性細胞から産生される、請求項１２１の方法。
【請求項１】
デコイ、合成オリゴヌクレオチド連鎖、合成オリゴヌクレオチドを含む、ＨＩＶ共受容体に直接対抗するｌｌｌＶ−ｌおよび／あるいはＩＩＩＶ−２の感染を減少させるベクター。
【請求項２】
合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ連鎖グループから選択される合成オリゴヌクレオチド連鎖を含む請求項１のベクター。
【請求項３】
合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを含む請求項１のベクターは分類される。
【請求項４】
ウィルスベクターである請求項１のベクター。
【請求項５】
ＨＩＶ酵素を標的にする合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項６】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作される合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項７】
ＥＦ−１ ａｌｐｈａプロモータによって操作される合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項８】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するマーカー遺伝子を含む、請求項１のベクター。
【請求項９】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させる、デコイ合成オリゴヌクレオチド鎖と合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ共受容体に対抗するＨＩＶ ＲＲＥおよび／あるいはＴＡＲデコイ鎖を含むベクター。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ連鎖を含む合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１１】
合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを含む請求項９のベクター。
【請求項１２】
ウィルスベクターである請求項９のベクター。
【請求項１３】
ＨＩＶ酵素も標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１４】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１５】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項９のベクター。
【請求項１６】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項９のベクター。
【請求項１７】
ＩＩＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨ１Ｖ−２感染を減少させ、デコイ鎖がＨＩＶ−Ｉ とＨＩＶ−２デコイ連鎖の組み合わせを表わすベクター。
【請求項１８】
合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡ連鎖を含む請求項１７のベクター。
【請求項１９】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項１７のベクター。
【請求項２０】
ベクターがウィルスベクターである請求項１７のベクター。
【請求項２１】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項１７のベクター。
【請求項２２】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項１７のベクター。
【請求項２３】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項１７のベクター。
【請求項２４】
抗生たんぱく質また蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項１７のベクター。
【請求項２５】
ＩＩＩＶ−Ｉ および／あるいはＨ１Ｖ−２感染を減少させ、デコイ鎖がＨＩＶ−２ ＲＲＥ ａｎｄ ＨＩＶ−２ ＴＡＲ連鎖の組み合わせを表わすベクター。
【請求項２６】
合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ あるいはｓｈＲＮＡ連鎖を含む請求項２５のベクター。
【請求項２７】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項２５のベクター。
【請求項２８】
ベクターがウィルスベクターである請求項２５のベクター。
【請求項２９】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項２５のベクター。
【請求項３０】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項２５のベクター。
【請求項３１】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項２５のベクター。．
【請求項３２】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項２５のベクター。
【請求項３３】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させることのできる、ＨＩＶ共受容体、ＨＩＶ ＲＲＥ、ＨＩＶ ＴＡＲデコイ連鎖に直接対抗する合成オリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３４】
請求項３３のベクターは、合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ連鎖を含む。
【請求項３５】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項３４のベクター。
【請求項３６】
ウィルスベクターである請求項３４のベクター。
【請求項３７】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項３４のベクター。
【請求項３８】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項３４のベクター。
【請求項３９】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項３４のベクター。
【請求項４０】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項３４のベクター。
【請求項４１】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させることのできる、ＨＩＶ共受容体や単一ＨＩＶ共受容体に直接対抗する合成オリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮＡ配列を含む請求項４１のベクター。
【請求項４３】
前記ベクターは合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項４１のベクター。
【請求項４４】
前ベクターがウイルスベクターである請求項４１のベクター。
【請求項４５】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶの酵素のターゲットである請求項４１のベクター。
【請求項４６】
合成オリゴヌクレオチドのプロモーターの標的細胞に積極的で駆動される請求項４１のベクター。
【請求項４７】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉアルファプロモータによって駆動される請求項４１のベクター。
【請求項４８】
前記ベクターが抗生物質抵抗たんぱく質あるいは蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカ遺伝子を含む請求項４１の方法。
【請求項４９】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含む請求項４９のＨＩＶコレセプタを標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクター。
【請求項５０】
前記合成ヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮＡ配列を含む請求項４９のベクター。
【請求項５１】
前記ベクターは合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項４９のベクター。
【請求項５２】
前記ベクターはウイルスベクターである請求項４９のベクター。
【請求項５３】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする請求項４９のベクター。
【請求項５４】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項４９のベクター。
【請求項５５】
前記合成オリゴヌクレオチドはＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項４９のベクター。
【請求項５６】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項４９のベクター。
【請求項５７】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含む請求項４９のＨＩＶコレセプタを標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクターであって、ＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列であるベクター。
【請求項５８】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項５７のベクター。
【請求項５９】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項５７のベクター。
【請求項６０】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項５７のベクター。
【請求項６１】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項５７のベクター。
【請求項６２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項５７のベクター。
【請求項６３】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項５７のベクター。
【請求項６４】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項５７のベクター。
【請求項６５】
デコイ合成ヌクレオチド配列およびＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクターであって、ＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列であるベクター。
【請求項６６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項６５のベクター。
【請求項６７】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項６５のベクター。
【請求項６８】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項６５のベクター。
【請求項６９】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項６５のベクター。
【請求項７０】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項６５のベクター。
【請求項７１】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項６５のベクター。
【請求項７２】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項６５のベクター。
【請求項７３】
ＣＸＣＲ４に対して指向される複数のｍｉＲＮＡ配列と、ＣＣＲ５に対して指向される複数のｍｉＲＮＡ配列と、Ｉ１ＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列と、ＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターがウイルスベクターであるベクター。
【請求項７４】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項７３のベクター。
【請求項７５】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項７３のベクター。
【請求項７６】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項７３のベクター。
【請求項７７】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項７３のベクター。
【請求項７８】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項７３のベクター。
【請求項７９】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項７３のベクター。
【請求項８０】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項７３のベクター。
【請求項８１】
ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＴＡＲ配列を含む免疫不全による感染を遅らせることができるベクター。
【請求項８２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項８１のベクター。
【請求項８３】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項８１のベクター。
【請求項８４】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項８１のベクター。
【請求項８５】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項８１のベクター。
【請求項８６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項８１のベクター。
【請求項８７】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項８１のベクター。
【請求項８８】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項８１のベクター。
【請求項８９】
患者の感染を改善するための方法であって、
１）免疫不全ウイルス感染を遅らせることができるベクターを生成するステップと、
２）臍帯血細胞、造血細胞、末梢血、骨髄、精原細胞、始原生殖細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、ＣＤの３４＋幹細胞あるいは前駆細胞および／または体外あるいは体内でＨＩＶ標的細胞に分化できる任意の細胞から選択される幹細胞あるいは前駆細胞をトランスフェクトするステップと、
３）トランスフェクトした細胞を患者の血液や骨髄に導入するステップとを含む方法。
【請求項９０】
前記幹／前駆細胞は、成長促進媒体で培養され、患者への循環に導入する前に前記細胞を拡張する請求項８９の方法。
【請求項９１】
マーカーたんぱく質の発現により、正常なトランスフェクションが監視される請求項８９の方法。
【請求項９２】
クレーム８９の方法は、選択された幹細胞／前駆細胞ドナーの臍帯血前駆細胞である、請求項８９の方法。
【請求項９３】
クレーム８９の方法は、選択された幹細胞／前駆細胞が自家末梢血の幹／前駆細胞である、請求項８９の方法。
【請求項９４】
前記選択された幹／前駆細胞が同系細胞から由来した、誘発した、あるいは再プログラミングされた多能性あるいは多能化幹細胞である請求項８９の方法。
【請求項９５】
患者のＨＩＶ感染を遅らせることができる方法であって、前記ウイルスベクターとを生成するステップと、前記ベクターから生成されたウイルスを患者の循環器に導入するステップとを含む方法。
【請求項９６】
デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶコレセプタに対して指向された合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を遅らせることができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２配列に対して指向されたリボザイム配列を含むベクター。
【請求項９７】
デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶコレセプタに対して指向された合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を遅らせることができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記デコイ配列は、Ｕ６プロモーターにより駆動されるベクター。
【請求項９８】
Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＮＯＧたんぱく質、ＩＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦたんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質を符号化する配列から選択された配列を含む追加のヌクレオチド配列の他、哺乳類ｎｕｍｂたんぱく質の「長い」（ＲＲＲ挿入＋）アイソフォームを符号化するヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項９９】
前記ベクターは短いＮｕｍｂアイソフォームおよびＮｕｍｂｌｉｋｅを標的とする合成オリゴヌクレオチドを含む請求項９８のベクター。
【請求項１００】
哺乳類の長（ＰＲＲｉｎｓｅｒｔ＋）アイソフォームを符号化したヌクレオチド配列が、ナノ粒子の Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ− ４、ＬＩＦ、 ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタティン（ＯＳＭ）、オンコスタティン 受容体（ＯＳＭＲ）カーディオトロフィン−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、 ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、 ＩＬ−１ １、 ｇｐｌ３０、そして白血病抑制因子の活動を伴う他のたんぱく質や細胞表面の細胞表面のシグナル受容体遺伝子ファミリー（ノッチ）の活動のアークにより選り抜かれたヌクレオチド配列を含み付加されたヌクレオチド配列と同じくらいたんぱく質を鈍くするとする請求項９８のベクター。
【請求項１０１】
多能、多能性、及び／または選択した細胞から自己再生できる細胞を製造する方法は、以下のものを含む：骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間の胚細胞、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、白血球の循環、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水中の幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換えの皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え精巣の始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血の幹細胞、遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間の胚細胞、その他の遺伝子組み換え幹細胞／前駆細胞と体細胞からなる体細胞の種類と幹細胞／前駆細胞のグループから細胞を選択する；ノッチ活性を有する蛋白質とＬＩＦ活性を有する蛋白質、ＦＧＦ４蛋白質、Ｈ０ＸＢ４蛋白質、ＮＡＮＯＧ蛋白質、Ｏｃｔ４蛋白質、Ｓｏｘ２蛋白質をエンコーディングするヌクレオチド配列から選択した追加のヌクレオチド配列と哺乳類の蛋白質のアイソフォーム”ｌｏｎｇ” （ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ ＋）をエンコーディングするヌクレオチド配列を有する選択した細胞をトランスフェクションする；ＦｉＧＦ， ｂＦＧＦ， ＬＩＦ， 鋼因子、１１−６， ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６， ＩＬ−７， オンコスタチン−Ｍ， ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１、その他の成長率を高めるサイトカインから選択したサイトカインを構成する成長培地に選択した細胞を決まった率で拡大し成長させる；前記率は前記成長培地に選択した細胞の時間の２倍から決定される；そして目的の細胞数になるまで、前記培養条件下で細胞を維持する。
【請求項１０２】
成熟したメディアが遺伝子を超えた発現を誘導するために誘引剤をさらに構成するとする、請求項１０１の方法。
【請求項１０３】
体内でさらなる分化が可能な必要な分化細胞集団を提供する方法であって、前記必要な細胞は、分化造血細胞、神経細胞、ドーパミン系の細胞、セロトニン系の細胞、コリン作用性の細胞、ノルアドレナリン作用性の細胞、ＧＡＢＡ作動性の細胞、筋細胞、心筋細胞、内胚葉と膵臓ランゲルハンス島の細胞、細菌細胞、骨髄あるいはその他の必要な細胞を含む方法であって、骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間胚細胞、造血細胞精原細胞、精巣、上皮細胞の始原生殖細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換え脂肪細胞、遺伝子組み換え胎盤細胞、遺伝子組み換え造血細胞、遺伝子組み換え皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血幹細胞、変更遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間胚細胞、その他の遺伝子組み換え幹／前駆細胞および体細胞の集団から細胞を選択し、選択された細胞を提供するステップと、
Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＧＯＮたんぱく質、ＨＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦ４たんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質を符号化する配列から選択された配列を含む付加されたヌクレオチド配列の他、哺乳類のｎｕｍｂたんぱく質の「長い」（ＰＲＲ 挿入＋）アイソフォーム を符号化するヌクレオチド配列で前記細胞をトランスフェクトするステップと、
前記選択された細胞を第１の成長速度で成長させるための成長媒体で前記選択された細胞を成長させるステップであって、前記第１の成長速度は前記成長培養媒体内で前記選択された細胞の２倍の時間から決定されるステップと、
目的の細胞数を達成するまで、成長培養媒体で前記細胞を維持するステップと、
前記選択された細胞を分化媒体の中で第２の成長時間で成長させるよう、前記分化媒体で前記選択された細胞を培養するステップであって、前記第２の成長速度は、前記成長培養媒体内で前記選択された細胞の２倍の時間から決定される、前記第２の成長速度は前記第１の成長速度の１０％から９０％の間で決定されるステップとを含み、
前記分化媒体は、分化あるいは前記選択された細胞を前記必要な分化細胞への変更を促進する上で効果的な少なくとも１つの分化促進剤を含み、
前記分化促進剤はレチノイン酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、前記必要な細胞型に適切なその他の分化促進剤からなる集団から選択される方法。
【請求項１０４】
請求項１０３の方法であって、
ｉ）ヌクレオチド配列と共に行われる核酸移入、特に転写調節因子はある細胞を望まれる細胞への分化を促すステップと、
ｉｉ）細胞をヌクレオチド配列と共に最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）へ核酸移入することはアイソフォームを和らげるステップと、
ｉｉｉ）ＰＲＲ＋Ｎｕｍｂアイソフォームを標的にした合成オリゴヌクレオチド鎖により細胞を核酸移入するステップとを含む方法。
【請求項１０５】
望まれる細胞が心筋細胞であり、その細胞がＤＭＳＯやＮＢＳ、レチノ酸、またはオルカディオミオサイドを含む分化媒介物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０６】
望まれる細胞が神経細胞であり、その細胞が神経成長因子やレチノイン酸から選択された分化作用物質を含む分化培養物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０７】
望まれる細胞が筋細胞であり、その筋細胞がエキサメタジムアクリルアミド、またはジメチルスルホキシドから選択された分化作用物質を含む分化培養物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０８】
体内でさらなる分化が可能な必要な細胞集団を提供する方法であって、
骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間胚細胞、造血細胞精原細胞、精巣、上皮細胞の始原生殖細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換え脂肪細胞、遺伝子組み換え胎盤細胞、遺伝子組み換え造血細胞、遺伝子組み換え皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血幹細胞、変更遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間胚細胞、遺伝子組み換えその他の幹／前駆細胞および体細胞から由来する細胞などの幹／前駆細胞および体細胞型の集団から細胞を選択し、選択した細胞を提供するステップと、
目的の細胞数を達成するまで、成長培養媒体で前記細胞を維持するステップと、
前記細胞をヌクレオチド配列、特に転写因子でトランスフェクトするステップと、前記細胞の必要な細胞への分化開始を促進するステップと、
細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） ＮｕｍｂアイソフォームあるいはＮｕｍｂｌｉｋｅを符号化するヌクレオチド配列と共にトランスフェクトするステップと、
分化培養物の中で、少なくとも１つの効果的な分化作用物質が選択された細胞を望まれる分化をした細胞に、分化や改造培養されるよう促進するとされる培養するステップを含み、
分化作用物質はレチノインや神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、または望まれる細胞タイプと同じくらい適した他の分化作用物質である方法。
【請求項１０９】
細胞が、最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） Ｎｕｍｂアイソフォームが符号化したヌクレオチド配列と共に培養されないとする請求項１０８の方法。
【請求項１１０】
望まれる細胞が筋細胞であり、その細胞が骨格筋細胞、平滑筋、心筋であるか否かに依存するＭｙｏＤ，ミオゲニン、ミオカルディン、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、Ｍｅｆ２Ａ、Ｇａｔａ５、Ｇａｔａ６を含む転写調整因子と共に培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１１】
ドーパミン作動性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈ１ｙａＮｇｎ２、Ｌｍｘｌｂ、またはＰｔｘ３を含む転写調整因子と共に核酸移入するとする請求項１０８の方法。
【請求項１１２】
セロトニン作用性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために転写調整因子と共に核酸移入されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１３】
Ｍａｓｈｌ、 Ｐｈｏｘ２ｂ、 Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、 Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３ 、Ｐｅｔｌ を含む転写調節因子請求項１１２の方法。
【請求項１１４】
コリン作用性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、ＭＡＳＨｌ、 Ｐｈｏｘ２ａ またＲＥＳＴ４を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１５】
ＧＡＢＡ神経が望む細胞であり、その細胞がＬｌＦ、ＮＴ３、ＮＧＦを引き起こす分化培養物の中で培養されるために、ＭＡＳＨｌ、Ｐｈｏｘ２ａ、ＲＥＳＴ４を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１６】
ノルアドレナリン神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈｌ、ｄｌＩ（ＨＡＮＤ２）、Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｇａｔａ２ またＧａｔａ３を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１７】
ＧＡＢＡ神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、ＰＩＴＸ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、Ｈｅｓ１をターゲットとするＲＮＡ を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１８】
ノルアドレナリン神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈｌ、ｄｌＩ（ＨＡＮＤ２）、 Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ。Ｇａｔａ２またＧａｔａ３を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１９】
膵臓ランゲルハンス島細胞、または内胚葉細胞が望む細胞であり、選択された細胞はＦｏｘａ２、Ｓｏｘｌ７、ＨＬＸＢ９またＰｄｘｌを含む転写調節因子と共に核酸移入する。そして付加された分化作用因子はソディウム酪酸、アクチビンＡ、レチノイン酸、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ノギン、インスリン様成長因子ＩＩ、ニコチンアミドから選ばれるとする請求項１０８の方法。
【請求項１２０】
必要な細胞は造血細胞であり、前記細胞はＲｕｎｘｌ／ＡＭＬｌを符号化するヌクレオチド配列とにトランスフェクトされ、分化分化作用因子は、必要な細胞型に適したＶＥＧＦ、血小板産生因子、コロニー刺激因子から選択される請求項１０８の方法。
【請求項１２１】
腹部機関や筋組織、心臓、中枢神経、血液、他の組織の不調を患っていて、治療が必要な患者に処置する方法であって、
祖先／種族の細胞と骨髄や末梢神経、胎盤の血液、羊水、臍帯血、肌、脂肪細胞、ヒト以外の胎芽、造血細胞、精原細胞、精巣の原始細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、他の体細胞、そして遺伝子的に改造された骨髄や末梢神経、胎盤の血液、羊水、臍帯血、肌、脂肪細胞、ヒト以外の胎芽、造血細胞、精原細胞、精巣の原始細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージから抽出された体細胞細胞を選択するステップと、
細胞が哺乳類の長（ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ −＋）アイソフォームと共に起こる核酸移入は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタティンを含む付加されたヌクレオチド配列と同じくらいたんぱく質を和らげるステップと、
選択されだ細胞が最初の成長率で育ち、分化培養物の中で培養するステップと、
核酸移入は効果的な分化培養物の中で育つ選択された細胞は、その倍の成長率で成長させるステップと、成長媒介物と呼ばれる効果的な分化は、選択された細胞の２倍の時間と決められている成長率を伸ばす、というような効果的な成長過程で細胞を発達させるステップと、
そして望む個体数を獲得するまでこの環境で細胞を保存するステップと、
選択された細胞は異なる媒介物の中で第２の成長率で成長し、成長率は選択された細胞の２倍の時間がかかるとされており、第２の成長率は１０％から９０％の間の成長率であり、
このような効果的な発達過程で細胞を発達させるステップと、
分化作用物質は、レチノイン酸や神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、他の望む細胞タイプに適した誘導体からなるステップを含む方法。。
【請求項１２２】
請求項１２１に記載の方法であって、
望まれる細胞へと分化させるよう促すヌクレオチド配列、特に転写調節因子と共に細胞を核酸移入させるステップと。
そして細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） ＮｕｍｂまたはＰＲＲ＋ ｎｕｍｂアイソフォームを符号化したヌクレオチド配列と共に核酸移入させるステップとを更に含む方法。
【請求項１２３】
選択された細胞は望まれる細胞の個体数を獲得した後に成長媒体から分離され、患者の循環組織、神経組織、他の細胞に注入されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１２４】
（Ｐｒｒ＋） ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ノッチ導入遺伝子、Ｈｏｘｂ４，ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦを含む核酸、オンコスタティン、オンコスタティン受動体、心臓毒、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、Ｌ−１１、ｇｐｌ３０を含むたんぱく質が、選択された細胞へと導入され、自己再生、多能、多能性細胞の集団を獲得する方法。
【請求項１２５】
請求項１２４に記載の方法であって、前記トランスフェクション方法がは、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避ける別の方法、あるいは、または細胞遺伝子の恣意的な変質である方法。
【請求項１２６】
自己再生、多能、多能性細胞の集団を獲得する方法であって、単一の遺伝子あるいはその一部に対応する核酸あるいはたんぱく質が過剰発言あるいは誘発され、選択された細胞となる方法であって、これらの核酸あるいはたんぱく質が長（Ｐｒｒ＋） Ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ活動を有するトランス遺伝子、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、 ＬＩＦ、 ＬＩＦＲ、 ＣＮＴＦ、ＯＳＭ、 ＯＳＭＲ、カーディオトロフィン−１ 、 ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、 ＩＬ−１ １、 ｇｐｌ３０を符号化する核酸あるいはたんぱく質から選択された１つに対応する方法。
【請求項１２７】
核酸移入の方法の利用は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞遺伝子のランダムな変質である請求項１２１の方法。
【請求項１２８】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に発生させた自己再生、多能、多能化および／あるいは分化細胞を３次元または２次元で構成される請求項１２１の方法。
【請求項１２９】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能化細胞、または分化した細胞は、細胞膜形成器官か細胞膜形成組織が培養されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３０】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能性、またくは分化した細胞はインクジェット印刷の技術と合わせ利用するとする請求項１２１の方法。
【請求項１３１】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能化細胞、または分化した細胞は懸滴で分化されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３２】
神経細胞は遺伝子的に引き起こされる自己再生、多能、多能化細胞を供給するとする請求項１２１の方法。
【請求項１３３】
核酸は自己再生、多能、多能性細胞を低下させ、その配列は電気穿孔法、ナノカプセルまたナノヴォールトを利用して選択された細胞を促進させるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３４】
自己再生、多能、多能性細胞を低下させる能力のために核酸をスクリーニングし、その配列が電気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールトを利用して選択されだ細胞を促進させる分化を始めるとする請求項１０８の方法。
【請求項１３１】
分化細胞が所望され、所望な分化細胞中に通常存在する一つまたは一つより多い転写因子に対応する核酸またはタンパク質の過剰発現または導入による、遺伝子賛成、自己再生、多能、および／または多能性細胞から産生される、請求項１２１の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５２８６１３（Ｐ２０１０−５２８６１３Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０４７２（Ｐ２０１０−５１０４７２）
【出願日】平成２０年５月２８日（２００８．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５００７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５０８１４
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０９３２８４６７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２８日（２００８．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５００７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５０８１４
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０９３２８４６７）
【Ｆターム（参考）】
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