多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための方法
本発明は、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用に関する。または本発明は、生体外での遺伝子発現プロファイルを測定するための方法と、多臓器不全の非感染性および／または感染性原因に対する活性物質をスクリーニングするための、前記遺伝子発現プロファイルおよび／またはそこで使用されるプローブの使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、請求項１に記載される、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用、および請求項１１に記載される、そのような生体外遺伝子発現プロファイルを測定するための方法、ならびに請求項２５に記載される、非感染性／感染性多臓器不全に対する活性物質をスクリーニングするためにおよび／または非感染性／感染性多臓器不全に対する活性物質の治療効果を評価するために、標的遺伝子の活性を切り換えおよび／または変更しおよび／または遺伝子活性を検出するための、遺伝子発現プロファイルの使用および／またはこのプロファイルで使用されるプローブの使用に関する。
【０００２】
本発明はさらに、多臓器不全の患者での遺伝子活性（転写）の変化の発生と併せて、実験的に検証された病識から得ることができる、患者の多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための新たな可能性に関する。
【０００３】
病態生理学的理解および支持治療の進歩にも関わらず、多臓器不全症候群（ＭＯＦＳ）および多臓器不全（ＭＯＦ）はそれぞれ、集中治療中の患者が死亡する最多の原因であり、世界的に増加しつつある。この進行の結果は、個々の患者に極めて重大であるばかりでなく、国民医療保障制度のコストおよび多くの医療分野での医学的進歩にも膨大な影響をもたらす。
【０００４】
多臓器不全は、同時にまたは短期間で生ずる２種以上の生命維持器官系の不全と定義される。多臓器不全症候群（ＭＯＦＳ）は、初期器官不全としてＭＯＦよりも先に生ずる［１］。多臓器不全の今日の定義は、同時にまたは短期間内に生ずる２種以上の器官の機能障害であるが、慢性的に持続する器官不全は除外することができる［２］。ＭＯＦの予後は、関与する器官系の数に密接に関係する。１つの器官が機能しない場合、２４時間以内の死亡率は２２％であり、７日後では４１％である。３つの器官系が機能しない場合、死亡率は、第１日目で８０％まで上昇し、４日後には１００％になる［３］。
【０００５】
ＭＯＦＳおよびＭＯＦの重症度のクリニカルスコアでは、ＧＯＲＩＳなどの多臓器不全スコア（ＭＯＦ−スコア）［４］、あるいは敗血症関連の器官不全評価（ＳＯＦＡ）スコアが日常的に使用される［５］。ＭＯＦスコアは、器官機能の３つのグレードへの迅速で臨床上単純な分類を可能にする。臨床文献では、ＭＯＦスコア＞４が、ＭＯＦであると通常は記述される［６］。ＳＯＦＡスコアは、下記の器官系の機能、すなわち呼吸（肺）、凝固、肝臓、心血管系、中枢神経系、および腎臓の機能の臨床評価を迅速に記録するポイントシステムである。このスコアシステムでは、４つのグレードが使用される。
【０００６】
臨床上、ＭＯＦは３段階で進む［７］。
【０００７】
１．ショックを受ける器官： 引き金になる病態生理学的メカニズムは、起源の非常に異なる血流不全である。これは、数時間のうちに生じ、それでも永久的な損傷には至らない。
【０００８】
２．器官機能障害： 持続的な血流不足が、次の２〜３日の間続く場合、これは、局所浮腫および細胞損傷と共にＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群、［８］により分類される）の発症をもたらすことになる。この段階を、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）と呼ぶ。
【０００９】
３．器官不全： 持続的な血流不足は、内臓領域のうっ血をもたらし、それが、重複感染および腸からのエンドトキシンの移行に繋がる。これは、臨床症状の増強をもたらし、敗血症の全体像に至る。器官機能障害は、器官不全になる。
【００１０】
ＭＯＤＳおよびＭＯＦは、複雑な病態生理学を有する臨床像である。その発症の正確な分子的原因と、ＳＩＲＳを引き起こす可能性のある重症感染および外傷に対する免疫学的炎症性宿主応答の複雑さと、これに対応する心循環的作用は、今日まで完全に理解されていない［９］。
【００１１】
ＭＯＤＳおよびＭＯＦは、感染学的および非感染学的起源の両方である可能性がある。ＭＯＤＳおよびＭＯＦは通常、敗血症患者の臨床上重大な合併症として、また外傷によって引き起こされたショックの後に、また人工心肺を使用した手術後の患者に、また臓器移植の後などに発症する（図１）。ＭＯＤＳおよびＭＯＦの発症に関する重要な病原的メカニズムは、全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ、［８］）の発症である。ＳＩＲＳに関連して開始される病態生理学的プロセスは、免疫系の全ての構成要素をまき込むだけでなく、心循環系の全てのレベルを妨害し、心筋抑制および血管拡張に制限されない。特に微小循環レベルの心循環変化は、共通の最終距離を形成し、多臓器不全の病因の重要な補助因子と見なされる組織低酸素症をもたらす。
【００１２】
図１は、今日の基準によるＭＯＤＳおよびＭＯＦの発症の、最も重要なメカニズムの例示的な説明を示し［１０］：過敏な免疫系は、多臓器不全の発症に決定的な役割を演ずる。この文脈において、内皮は、サイトカインを分泌することによって、また白血球付着をもたらすことによって、中心的な重要な役割を演ずる。シグナル伝達カスケードは、内皮細胞内で活性化され、その結果、転写因子の発現および活性化に繋がる。
【００１３】
感染性原因と非感染性原因とを区別することができる、感度の高い／特異的な診断が依然として存在しない理由は、ＭＯＤＳおよびＭＯＦの初期プロセスに関する知識が依然として不完全だからである。現在なお遺伝子発現レベルにある新しいタイプの生物マーカーおよび診断は、多臓器不全の早期診断、ならびにＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に、本質的な診断情報を提供することができる。さらに、これらのマーカーおよび診断は、全身性炎症の病態生理学的メカニズムの分類に寄与するのに重要である。
【００１４】
熱や白血球増多症、頻脈、および頻呼吸のように、臨床実習でしばしば使用される前駆症状は、ＭＯＤＳまたはＭＯＦの診断ならびにＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に関しては、完全に非特異的である。初期段階で微小循環の不規則性を検出するパラメータ、例えば腸粘膜のｐＨ［１１］および毛細血管床のラクテートレベル［１２、１３］の変化、原因が肺にはない呼吸不全の出現［２］、白血球エラスターゼの上昇［１４、１５］、ネオプテリンレベルの高さ［１６］、多形核白血球の活性化、およびＩＬ−６−レベルの高さ［１７］などは、限られた程度にのみＭＯＤＳおよびＭＯＦが後期発症する際の初期パラメータとして適しているが、これらはＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に寄与することができない。したがって、非感染性および感染性のＭＯＤＳまたはＭＯＦを初期段階で区別するための、また患者が特定の治療にどのように応答するか予測するための、当業者の能力を改善する新規な診断方法が緊急に求められている。
【００１５】
しかし、この上なく医学的に重要なものは、まさしくＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別であり、例えば抗生物質は、この区別と共により効率的に使用することができ、これが著しいコスト削減ならびに抗生物質の非特異的施用により引き起こされる副作用の回避に寄与する。非感染性ＭＯＤＳまたはＭＯＦの場合はさらに、感染のそれぞれの部位を特定するための患者に非常にストレスが多い（例えばＣＴ／ＭＲＩに送られるなど）、時間と人手のかかる診断手段や、包括的な微生物学的方法の実現（例えば、患者が大量の血液も与えなければならない血液培養物の検査）だけでなく、静脈カテーテルなどの、患者に接続する全てのプラスチック材料の危険な交換もまた、回避することが可能である。逆もまた同様であり、ＭＯＤＳまたはＭＯＦの感染性原因の迅速な特定は、これらの手段を迅速に行うことを確実にすることができ、したがって死亡率を低下させることができる。
【００１６】
技術的な進歩、特にマイクロアレイ技術の開発により、現在当業者は、１００００個以上の遺伝子およびその遺伝子産物を同時に比較することが可能である。そのようなマイクロアレイ技術の使用は、現在、健康状態、調節メカニズム、生化学的相互作用、およびシグナル伝達物質ネットワークに関する情報を提供することができる。生物体が感染症にどのように反応するかについての理解が、この方法を改善するので、これは、敗血症障害の検出、診断、および療法の、機能強化されたモダリティの開発を促進すべきである。
【００１７】
マイクロアレイは、その起源が「サザンブロット法」［１９］にあり、これは固体マトリックス上で３次元で対処することができるように、ＤＮＡ分子を固定化する最初の手法であった。最初のマイクロアレイは、しばしば未知の配列を有するＤＮＡ断片からなるものであり、多孔質膜（通常はナイロン）上に１ドットずつ付着させた。通常、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはプラスミドライブラリーを用い、ハイブリダイズした材料を放射性基で標識した［２０〜２２］。
【００１８】
最近、非常に高い密度で核酸を合成し利用するための新たな技術の開発と共に、基板としてガラスを使用し検出のために蛍光を使用することによって、核酸アレイを小型化することが可能になった。同時に、実験のスループットおよび情報量が増大した［２３〜２５］。
【００１９】
さらに、国際公開第０３／００２７６３号パンフレットから、敗血症および敗血症のような状態の診断に、マイクロアレイを基本的に使用できることがわかる。
【００２０】
マイクロアレイ技術の利用可能性に関する最初の説明は、癌研究分野での臨床試験を通して得られた。この場合、発現プロファイルは、ある臨床表現型に相関する個々の遺伝子または遺伝子群の活性の同定に関して、価値あることが証明された［２６］。急性白血病またびまん性Ｂ細胞リンパ腫に罹っているまたは罹っていない個人の多くのサンプルを分析し、遺伝子発現標識（ＲＮＡ）を見出し、引き続きこれを、臨床上関連あるこれらのタイプの癌の分類に用いた［２６、２７］。Ｇｏｌｕｂらは、個々の遺伝子が、信頼性ある予測を行うのに十分ではないが、しかし５３個の遺伝子（アレイ上に存在する６０００個よりも多くの遺伝子から選択された）の転写の変化に基づく予測は、非常に正確であることを見出した［２６］。
【００２１】
Ａｌｉｓａｄｅｈら［２７］は、大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の試験をした。発現プロファイルは、著者らによって「リンパチップ」で後処理され、すなわちこれは、リンパ球の通常のおよび異常な発生に関わる遺伝子をモニタするために開発された、相補ＤＮＡの１８０００個のクローンを有するマイクロアレイである。クラスター分析を使用することによって、患者の生存のチャンスに関して大きな相違を示した２つのカテゴリに、ＤＬＢＣＬを何とか分類した。これらサブタイプの遺伝子発現プロフィルは、Ｂ細胞分化の２つの重要な段階に相関していた。
【００２２】
出願人の、まだ公開されていないドイツ特許出願ＤＥ１０３４０３９５．７、ＤＥ１０３３６５１１．７、ＤＥ１０３１５０３１．５、および１０２００４００９９５２．９は、遺伝子発現プロファイルが、例えばＳＩＲＳ、全身性炎症性炎症、敗血症、および重症敗血症の診断にマイクロアレイ技術を用いることによって、原則として使用可能であることを述べている。これらの出願を、参考文献により本明細書に組み込む。
【００２３】
Ｆｅｅｚｏｒら［２８］からは、その外科治療の結果として多臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）と共にＳＩＲＳを発症した患者の遺伝子活性が、同じ外科治療の結果としてＭＯＤＳを伴わずにＳＩＲＳを発症した患者の遺伝子活性と異なることがわかる。しかし、これらの研究は、患者が感染を示さなかったので、感染性ＭＯＦと比較した非感染性ＭＯＦの区別について述べることができない。
【００２４】
非感染性ＭＯＦと感染性ＭＯＦとを区別するための遺伝子発現プロフィルの使用については、依然として記述されなかった。
【００２５】
本出願に開示される発明は、非感染性ＭＯＦを持つ患者の遺伝子活性が、感染性ＭＯＦを持つ患者の遺伝子活性とは異なるという認識に基づいている。したがって、遺伝子活性におけるこれらの相違は、遺伝子発現を用いることによって、感染性ＭＯＦと非感染性ＭＯＦとの区別を可能にする。従来使用されてきた臨床パラメータは、そのような区別を可能にしないが、これは集中治療での専門的療法の開始に非常に重要である。
【００２６】
したがって本発明の目的は、遺伝子活性マーカーを用いることによって、非感染性ＭＯＦと感染性ＭＯＦとを区別することである。
【００２７】
この目的は、請求項１、１１、および２５に記載の特徴によって解決される。
【００２８】
本発明は特に、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用に関する。
【００２９】
本発明はさらに、治療中に多臓器不全の非感染性および感染性原因に苦しむ患者の経過を評価するのに使用可能である。
【００３０】
本発明はさらに、２〜４期の臨床試験における、多臓器不全の非感染性または感染性原因を有する患者の試験対象基準または試験除外基準として使用可能である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態は、さらなる電子処理のための、ならびに敗血症患者の個々の予後を記述し、診断および／または患者のデータ管理システムのためのソフトウェアを作成するための、遺伝子活性データの作成である。
【００３２】
本発明は、「コンピュータ内」エキスパートシステム作成、および／または細胞がシグナル伝達する方法の「コンピュータ内」変調に使用してもよい。
【００３３】
本発明による遺伝子発現プロファイルの作成では、配列番号１〜配列番号１２９７、ならびに５〜２０００またはそれ以上、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された、多数の特異的遺伝子および／または遺伝子断片を使用する。
【００３４】
配列番号１から配列番号１２９７を有するこれらの配列は、本発明の範囲に組み込まれ、よって発明の記述の一部でありしたがって本発明の開示の一部でもある１２９７個の配列を含んだ同封の配列表に開示される。配列表では、配列番号１から配列番号１２９７を有する個々の配列がさらに、そのＧｅｎＢａｎｋアクセション番号に割り当てられている（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００３５】
本発明はさらに、標的遺伝子の活性および／または、多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する活性物質をスクリーニングするための遺伝子活性の決定を、切り換えおよび／または変更するために、および／または多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する効果を評価するために、配列番号１〜配列番号１２９７ならびに少なくとも５〜２０００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された、患者サンプルから生体外で得られる遺伝子発現プロファイル、および／またはそのために使用されるプローブの使用に関する。
【００３６】
この文脈において、列挙されたプローブのハイブリダイズ可能な合成アナログを使用してもよい。
【００３７】
さらに、多臓器不全の非感染性または感染性の原因に苦しむ患者の遺伝子活性は、生体液における２〜４期の臨床研究で決定することができ、この「値」から、疾患の経過、生存のチャンス、治療の経過、または臨床試験で敗血症患者を含みまたは除外する可能性に関する結論を導き出すことができる。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、特異的遺伝子および／または遺伝子断片が、配列番号１〜配列番号１２９７、ならびに５〜２０００またはそれ以上、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択されることを特徴とする。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、少なくとも２〜１００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、少なくとも２００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、少なくとも２００〜５００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、少なくとも５００〜１０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１０００〜２０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、請求項９に列挙される遺伝子または遺伝子断片および／またはそれらのＲＮＡから得られる配列を、合成類似体、アプタマー、ならびにペプチド核酸配列に代えることを特徴とする。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、遺伝子の合成アナログが、５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、ハイブリダイゼーション法を用いて決定することを特徴とする。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、マイクロアレイを用いて決定することを特徴とする。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、ハイブリダイゼーション非依存的方法によって、特に酵素的および／または化学的加水分解、および／または増幅方法、好ましくはＰＣＲを行い、その後、核酸および／またはその誘導体および／またはその断片の定量を行うことによって、決定することを特徴とする。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、サンプルを、体液、特に血液、髄液、尿、腹水、精液、唾液、穿刺液、細胞内容物、またはこれらの混合物から選択することを特徴とする。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、細胞サンプルを、その細胞内容物を遊離させるために必要に応じて溶解処理にかけることを特徴とする。
【００５１】
当業者には、請求項に示される本発明の個々の特徴を、任意の所望の方法によって互いに組み合わせることができることが明らかである。
【００５２】
本発明で使用されるマーカー遺伝子という用語は、全ての得られたＤＮＡ配列、部分配列、および合成アナログ（例えばペプチド−核酸、ＰＮＡ）を包含する。ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の決定に言及する本発明の記述は、限定を求めるものではなく、本発明の例示的適用にすぎない。
【００５３】
血液に言及する本発明の記述は、本発明の単なる例示的実施形態である。本発明で使用される生体液という用語は、ヒトの体液全てを包含する。
【００５４】
本発明のさらなる利点および特徴は、実施形態の記述ならびに図面から明らかにされよう。
【００５５】
図１は、異なる病状から始まる多臓器不全の病理的経過を示す。
【実施例】
【００５６】
多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、差次的遺伝子発現試験。
【００５７】
外科集中治療室での治療を受けている５７名の患者の全血サンプルを、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための差次的遺伝子発現の測定に関して検査をした。
【００５８】
外科集中治療室での治療中、感染性ＭＯＦ［以下、重症敗血症または敗血症性ショックと呼び、８により分類される］を発症した３１名の患者の全血サンプル。
【００５９】
さらに全血サンプルを、外科手術集中治療室での治療中に非感染性ＭＯＦ［８により分類される］発症した２６名の患者から得た。
【００６０】
参照サンプルとして、細胞系ＳＩＧ−Ｍ５からのｔｏｔａｌ ＲＮＡを使用した。
【００６１】
両方の患者群の特性範囲を、表１に示す。この表には、年齢、性別、ならびに器官系の機能に関する測定値としてのＳＯＦＡ−スコアに関する情報が、示されている。同様に、プロカルシトニン（ＰＣＴ）およびＣＲＰの血漿タンパク質レベル、白血球の数、ならびに患者の最も一般的なＣＤＣ（疾病管理センター）基準が示されている。
【００６２】
患者サンプルの全てを、１つのマイクロアレイごとに参照サンプルとコハイブリダイゼーションを行った。
【表１】
実験の説明：
全血を採取した後、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の使用説明書に従ってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキットを使用して、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離した。
【００６３】
細胞培養
【００６４】
細胞培養（対照サンプル）では、１９種の凍結細胞培養物（ＳＩＧＭ５）（液体窒素で凍結）を使用した。これらの細胞をそれぞれ、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が追加された２ｍｌのＩｓｃｏｖｅ培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）に接種した。続いて、細胞培養物を、１２ウェルのプレートで２４時間、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。続いて、最終的に同じフォーマットの３枚のプレートが利用可能になるように（合計で３６ウェル）、１８ウェルの内容物を、同じ体積の２つのパートに分けた。その後、同じ条件下で２４時間培養を続けた。その後、各プレートの１１ウェルから得られた培養物を、一緒にし、遠心分離にかけた（１０００×ｇ、５分、室温）。上清を除去し、細胞ペレットを上述の培地４０ｍｌに溶解した。これらの溶解した細胞４０ｍｌを、等しい割合で２個の２５０ｍｌフラスコに分配し、上述の培地を５ｍｌ添加した後にインキュベートした。２枚の残りのプレートに残された２ｍｌのうち、８０μｌを、上述の培地１ｍｌで事前に調製してある同じプレートの空のウェルに入れた。４８時間のインキュベーション後、１２ウェルプレートの１つだけを、下記の通り処理し、すなわち５００μｌを各ウェルから抽出して一緒にした。得られた６ｍｌを、約１０ｍｌの新鮮な培地が入っている２５０ｍｌフラスコに導入した。この混合物を、１０００×ｇで５分間、室温で遠心分離にかけ、上述の培地１０ｍｌに溶解した。続いて細胞を計数することによって、下記の結果が得られた：１．５×１０７細胞／ｍｌ、合計１０ｍｌ、細胞の総数：１．５×１０８個。細胞の数は依然として十分でないので、上述の細胞懸濁液２．５ｍｌを、２５０ｍｌ（７５ｃｍ２）フラスコ（合計４個のフラスコ）中の上述の培地３０ｍｌに導入した。７２時間のインキュベーション後、新鮮な培地２０ｍｌを各フラスコに添加した。引き続きインキュベーションを２４時間行った後、細胞を上述のように計数した。細胞の総数は３．８×１０８細胞であった。所望の数の細胞である２×１０６細胞を得るために、細胞を、４個のフラスコ内で上述の培地４７．５ｍｌ中に再懸濁した。２４時間のインキュベーション時間の後、細胞を遠心分離にかけ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）を含まないリン酸緩衝液で２回洗浄した。
【００６５】
ｔｏｔａｌ ＲＮＡの単離は、製造業者の使用説明書に従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｌキット（Ｍａｃｈｅｒｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を用いて行う。上述のプロセスを、必要な細胞数が得られるまで繰り返した。これは、１０８細胞当たりＲＮＡが６００μｇという効率に対応した、必要量である６ｍｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを得るのに必要であった。
【００６６】
逆転写／標識／ハイブリダイゼーション
【００６７】
全血を採取した後、サンプルのｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離し、製造業者の使用説明書に従ってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）を使用して、品質の試験をした。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対する参照ＲＮＡとしての、ＳＩＧＭ５細胞からの１０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡと共に、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０μｇを各サンプルから分取し、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、転写した。その後、アルカリ加水分解によって、ＲＮＡを混合物から除去する。反応混合物中、後の時点で蛍光色素とｃＤＮＡとの結合を可能にするために、ｄＴＴＰの一部をアミノアリル−ｄＵＴＰ（ＡＡ−ｄＵＴＰ）に代えた。
【００６８】
反応混合物の精製後、サンプルおよび対照のｃＤＮＡを、蛍光色素Ａｌｅｘａ ６４７およびＡｌｅｘａ ５５５で共有結合標識し、ＳＩＲＳ−Ｌａｂ社のマイクロアレイ上でハイブリダイズした。使用したマイクロアレイ上には、長さが５５〜７０塩基対である５３０８の異なるポリヌクレオチドが固定化された。ポリヌクレオチドのそれぞれは、ヒト遺伝子である。さらに、品質保証のための対象スポットが存在した。１つのマイクロアレイを２８のサブアレイに分割し、このサブアレイのそれぞれを、１５×１５スポットのグリッドに並べた。
【００６９】
ハイブリダイゼーションと、その後に行われる洗浄および乾燥はそれぞれ、４２℃で１０．５時間にわたり、製造業者の使用説明書に従ってハイブリダイゼーションステーションＨＳ ４００（Ｔｅｃｏｎ）を使用して実施した。使用したハイブリダイゼーション溶液は、それぞれ標識されたｃＤＮＡサンプル、３．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム（ｖ／ｖ）、２５％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、およびそれぞれ０．８μｇ μｌ−１のｃｏｔ−１ ＤＮＡ、酵母ｔ−ＲＮＡ、およびポリ−Ａ ＲＮＡからなるものであった。その後行われるマイクロアレイの洗浄は、下記のスキームに従い室温で実施した：洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．０３％ラウリル硫酸ナトリウム）、洗浄緩衝液２（１×ＳＳＣ）、および最後に洗浄緩衝液３（０．２×ＳＳＣ）での濯ぎをそれぞれ９０秒。その後、マイクロアレイを、２．５バールの圧力の窒素流中で１５０秒よりも長く、３０℃で乾燥した。
【００７０】
処理したマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルを、その後ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ）スキャナを用いて読み取り、種々の発現遺伝子の発現比を、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４．０（Ａｘｏｎ）ソフトウェアを用いて決定した。
【００７１】
評価：
【００７２】
分析のため、１つのスポットの平均強度を、対応するスポット画素の中央値として決定した。
【００７３】
システムエラーの補正：
【００７４】
Ｈｕｂｅｒら（２００２）の手法に従って、システムエラーを補正した。この手法に従って、マイクロアレイの加法的および乗法的なバイアスを、存在する遺伝子サンプルの７０％を基にして推定した。さらなる全ての計算のために、逆双曲線正弦関数を用いてシグナルを変換した。
【００７５】
分析では、患者サンプルのシグナルの、正規化され変換された相対比を、対照に対して計算した。これは、患者番号ｎの遺伝子番号ｊの計算によって、データＧｊ，ｎ＝ａｒｃｓｉｎｈ（Ｓｃｙ５（ｊ，ｎ））−ａｒｃｓｉｎｈ（Ｓｃｙ３（ｊ，ｎ））が明らかにされたことを意味する（式中、［ＳＣｙ３（ｊ，ｎ）、ＳＣｙ５（ｊ、ｎ）］は、関連したシグナル対である）。スポットを、患者に関して分析できなかった場合（例えば、スキャンされた画像が汚れている）、関連する値を「欠測値」と記した。
【００７６】
統計的比較：
【００７７】
比較のため、対応ランダムステューデント検定を遺伝子ごとに用いた。ランダムサンプルは共に、非感染性ＭＯＦおよび感染性ＭＯＦの患者群の値をそれぞれ含んでいた。種々に発現した遺伝子を選択するために、関連したｐ値および欠測値の数を評価した。これを、関連するｐ値が０．０５よりも小さい選択された遺伝子の群に適用した。
【００７８】
試験をした遺伝子の格付けに関する基準は、各遺伝子の発現比のレベルであった。感染性ＭＯＦに罹っている患者と比較した、非感染性ＭＯＦに罹っている患者の最も過剰発現しまたは発現が弱い遺伝子はそれぞれ、興味深いものであった。
【００７９】
表２は、患者サンプルの７２１個の遺伝子が見出されたことを示すが、これらは、非感染性ＭＯＦを有する患者と比べた場合、感染性ＭＯＦを有する患者で著しく過剰発現したものであった。さらに表３は、非感染性ＭＯＦを有する患者と比べた場合、感染性ＭＯＦを有する患者の５７６個の遺伝子が著しく発現が弱かったことを示す。これらの結果から、表２および表３に列挙された遺伝子活性は、多臓器不全の非感染性原因と多臓器不全の感染性原因とを区別することが明らかである。したがって、列挙された遺伝子活性は、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するためのマーカーを提供する。
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【表２−６】
【表２−７】
【表２−８】
【表２−９】
【表２−１０】
【表２−１１】
【表２−１２】
【表２−１３】
【表２−１４】
【表２−１５】
【表２−１６】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【表３−８】
【表３−９】
【表３−１０】
【表３−１１】
【表３−１２】
【表３−１３】
表２および３で特徴付けられた変化を、請求項１に記載の本発明のプロセスに使用することができる。
【００８０】
個々の配列の、表２および３に示されるＧｅｎＢａｎｋアクセション番号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を介するインターネットアクセス）は、添付の配列表に関連付けられており、箇条書きにされ、またはそれぞれ１つの配列に関して詳細に記述されている（配列番号１から配列番号１２９７まで）。
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【００８１】
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【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、請求項１に記載される、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用、および請求項１１に記載される、そのような生体外遺伝子発現プロファイルを測定するための方法、ならびに請求項２５に記載される、非感染性／感染性多臓器不全に対する活性物質をスクリーニングするためにおよび／または非感染性／感染性多臓器不全に対する活性物質の治療効果を評価するために、標的遺伝子の活性を切り換えおよび／または変更しおよび／または遺伝子活性を検出するための、遺伝子発現プロファイルの使用および／またはこのプロファイルで使用されるプローブの使用に関する。
【０００２】
本発明はさらに、多臓器不全の患者での遺伝子活性（転写）の変化の発生と併せて、実験的に検証された病識から得ることができる、患者の多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための新たな可能性に関する。
【０００３】
病態生理学的理解および支持治療の進歩にも関わらず、多臓器不全症候群（ＭＯＦＳ）および多臓器不全（ＭＯＦ）はそれぞれ、集中治療中の患者が死亡する最多の原因であり、世界的に増加しつつある。この進行の結果は、個々の患者に極めて重大であるばかりでなく、国民医療保障制度のコストおよび多くの医療分野での医学的進歩にも膨大な影響をもたらす。
【０００４】
多臓器不全は、同時にまたは短期間で生ずる２種以上の生命維持器官系の不全と定義される。多臓器不全症候群（ＭＯＦＳ）は、初期器官不全としてＭＯＦよりも先に生ずる［１］。多臓器不全の今日の定義は、同時にまたは短期間内に生ずる２種以上の器官の機能障害であるが、慢性的に持続する器官不全は除外することができる［２］。ＭＯＦの予後は、関与する器官系の数に密接に関係する。１つの器官が機能しない場合、２４時間以内の死亡率は２２％であり、７日後では４１％である。３つの器官系が機能しない場合、死亡率は、第１日目で８０％まで上昇し、４日後には１００％になる［３］。
【０００５】
ＭＯＦＳおよびＭＯＦの重症度のクリニカルスコアでは、ＧＯＲＩＳなどの多臓器不全スコア（ＭＯＦ−スコア）［４］、あるいは敗血症関連の器官不全評価（ＳＯＦＡ）スコアが日常的に使用される［５］。ＭＯＦスコアは、器官機能の３つのグレードへの迅速で臨床上単純な分類を可能にする。臨床文献では、ＭＯＦスコア＞４が、ＭＯＦであると通常は記述される［６］。ＳＯＦＡスコアは、下記の器官系の機能、すなわち呼吸（肺）、凝固、肝臓、心血管系、中枢神経系、および腎臓の機能の臨床評価を迅速に記録するポイントシステムである。このスコアシステムでは、４つのグレードが使用される。
【０００６】
臨床上、ＭＯＦは３段階で進む［７］。
【０００７】
１．ショックを受ける器官： 引き金になる病態生理学的メカニズムは、起源の非常に異なる血流不全である。これは、数時間のうちに生じ、それでも永久的な損傷には至らない。
【０００８】
２．器官機能障害： 持続的な血流不足が、次の２〜３日の間続く場合、これは、局所浮腫および細胞損傷と共にＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群、［８］により分類される）の発症をもたらすことになる。この段階を、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）と呼ぶ。
【０００９】
３．器官不全： 持続的な血流不足は、内臓領域のうっ血をもたらし、それが、重複感染および腸からのエンドトキシンの移行に繋がる。これは、臨床症状の増強をもたらし、敗血症の全体像に至る。器官機能障害は、器官不全になる。
【００１０】
ＭＯＤＳおよびＭＯＦは、複雑な病態生理学を有する臨床像である。その発症の正確な分子的原因と、ＳＩＲＳを引き起こす可能性のある重症感染および外傷に対する免疫学的炎症性宿主応答の複雑さと、これに対応する心循環的作用は、今日まで完全に理解されていない［９］。
【００１１】
ＭＯＤＳおよびＭＯＦは、感染学的および非感染学的起源の両方である可能性がある。ＭＯＤＳおよびＭＯＦは通常、敗血症患者の臨床上重大な合併症として、また外傷によって引き起こされたショックの後に、また人工心肺を使用した手術後の患者に、また臓器移植の後などに発症する（図１）。ＭＯＤＳおよびＭＯＦの発症に関する重要な病原的メカニズムは、全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ、［８］）の発症である。ＳＩＲＳに関連して開始される病態生理学的プロセスは、免疫系の全ての構成要素をまき込むだけでなく、心循環系の全てのレベルを妨害し、心筋抑制および血管拡張に制限されない。特に微小循環レベルの心循環変化は、共通の最終距離を形成し、多臓器不全の病因の重要な補助因子と見なされる組織低酸素症をもたらす。
【００１２】
図１は、今日の基準によるＭＯＤＳおよびＭＯＦの発症の、最も重要なメカニズムの例示的な説明を示し［１０］：過敏な免疫系は、多臓器不全の発症に決定的な役割を演ずる。この文脈において、内皮は、サイトカインを分泌することによって、また白血球付着をもたらすことによって、中心的な重要な役割を演ずる。シグナル伝達カスケードは、内皮細胞内で活性化され、その結果、転写因子の発現および活性化に繋がる。
【００１３】
感染性原因と非感染性原因とを区別することができる、感度の高い／特異的な診断が依然として存在しない理由は、ＭＯＤＳおよびＭＯＦの初期プロセスに関する知識が依然として不完全だからである。現在なお遺伝子発現レベルにある新しいタイプの生物マーカーおよび診断は、多臓器不全の早期診断、ならびにＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に、本質的な診断情報を提供することができる。さらに、これらのマーカーおよび診断は、全身性炎症の病態生理学的メカニズムの分類に寄与するのに重要である。
【００１４】
熱や白血球増多症、頻脈、および頻呼吸のように、臨床実習でしばしば使用される前駆症状は、ＭＯＤＳまたはＭＯＦの診断ならびにＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に関しては、完全に非特異的である。初期段階で微小循環の不規則性を検出するパラメータ、例えば腸粘膜のｐＨ［１１］および毛細血管床のラクテートレベル［１２、１３］の変化、原因が肺にはない呼吸不全の出現［２］、白血球エラスターゼの上昇［１４、１５］、ネオプテリンレベルの高さ［１６］、多形核白血球の活性化、およびＩＬ−６−レベルの高さ［１７］などは、限られた程度にのみＭＯＤＳおよびＭＯＦが後期発症する際の初期パラメータとして適しているが、これらはＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に寄与することができない。したがって、非感染性および感染性のＭＯＤＳまたはＭＯＦを初期段階で区別するための、また患者が特定の治療にどのように応答するか予測するための、当業者の能力を改善する新規な診断方法が緊急に求められている。
【００１５】
しかし、この上なく医学的に重要なものは、まさしくＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別であり、例えば抗生物質は、この区別と共により効率的に使用することができ、これが著しいコスト削減ならびに抗生物質の非特異的施用により引き起こされる副作用の回避に寄与する。非感染性ＭＯＤＳまたはＭＯＦの場合はさらに、感染のそれぞれの部位を特定するための患者に非常にストレスが多い（例えばＣＴ／ＭＲＩに送られるなど）、時間と人手のかかる診断手段や、包括的な微生物学的方法の実現（例えば、患者が大量の血液も与えなければならない血液培養物の検査）だけでなく、静脈カテーテルなどの、患者に接続する全てのプラスチック材料の危険な交換もまた、回避することが可能である。逆もまた同様であり、ＭＯＤＳまたはＭＯＦの感染性原因の迅速な特定は、これらの手段を迅速に行うことを確実にすることができ、したがって死亡率を低下させることができる。
【００１６】
技術的な進歩、特にマイクロアレイ技術の開発により、現在当業者は、１００００個以上の遺伝子およびその遺伝子産物を同時に比較することが可能である。そのようなマイクロアレイ技術の使用は、現在、健康状態、調節メカニズム、生化学的相互作用、およびシグナル伝達物質ネットワークに関する情報を提供することができる。生物体が感染症にどのように反応するかについての理解が、この方法を改善するので、これは、敗血症障害の検出、診断、および療法の、機能強化されたモダリティの開発を促進すべきである。
【００１７】
マイクロアレイは、その起源が「サザンブロット法」［１９］にあり、これは固体マトリックス上で３次元で対処することができるように、ＤＮＡ分子を固定化する最初の手法であった。最初のマイクロアレイは、しばしば未知の配列を有するＤＮＡ断片からなるものであり、多孔質膜（通常はナイロン）上に１ドットずつ付着させた。通常、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはプラスミドライブラリーを用い、ハイブリダイズした材料を放射性基で標識した［２０〜２２］。
【００１８】
最近、非常に高い密度で核酸を合成し利用するための新たな技術の開発と共に、基板としてガラスを使用し検出のために蛍光を使用することによって、核酸アレイを小型化することが可能になった。同時に、実験のスループットおよび情報量が増大した［２３〜２５］。
【００１９】
さらに、国際公開第０３／００２７６３号パンフレットから、敗血症および敗血症のような状態の診断に、マイクロアレイを基本的に使用できることがわかる。
【００２０】
マイクロアレイ技術の利用可能性に関する最初の説明は、癌研究分野での臨床試験を通して得られた。この場合、発現プロファイルは、ある臨床表現型に相関する個々の遺伝子または遺伝子群の活性の同定に関して、価値あることが証明された［２６］。急性白血病またびまん性Ｂ細胞リンパ腫に罹っているまたは罹っていない個人の多くのサンプルを分析し、遺伝子発現標識（ＲＮＡ）を見出し、引き続きこれを、臨床上関連あるこれらのタイプの癌の分類に用いた［２６、２７］。Ｇｏｌｕｂらは、個々の遺伝子が、信頼性ある予測を行うのに十分ではないが、しかし５３個の遺伝子（アレイ上に存在する６０００個よりも多くの遺伝子から選択された）の転写の変化に基づく予測は、非常に正確であることを見出した［２６］。
【００２１】
Ａｌｉｓａｄｅｈら［２７］は、大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の試験をした。発現プロファイルは、著者らによって「リンパチップ」で後処理され、すなわちこれは、リンパ球の通常のおよび異常な発生に関わる遺伝子をモニタするために開発された、相補ＤＮＡの１８０００個のクローンを有するマイクロアレイである。クラスター分析を使用することによって、患者の生存のチャンスに関して大きな相違を示した２つのカテゴリに、ＤＬＢＣＬを何とか分類した。これらサブタイプの遺伝子発現プロフィルは、Ｂ細胞分化の２つの重要な段階に相関していた。
【００２２】
出願人の、まだ公開されていないドイツ特許出願ＤＥ１０３４０３９５．７、ＤＥ１０３３６５１１．７、ＤＥ１０３１５０３１．５、および１０２００４００９９５２．９は、遺伝子発現プロファイルが、例えばＳＩＲＳ、全身性炎症性炎症、敗血症、および重症敗血症の診断にマイクロアレイ技術を用いることによって、原則として使用可能であることを述べている。これらの出願を、参考文献により本明細書に組み込む。
【００２３】
Ｆｅｅｚｏｒら［２８］からは、その外科治療の結果として多臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）と共にＳＩＲＳを発症した患者の遺伝子活性が、同じ外科治療の結果としてＭＯＤＳを伴わずにＳＩＲＳを発症した患者の遺伝子活性と異なることがわかる。しかし、これらの研究は、患者が感染を示さなかったので、感染性ＭＯＦと比較した非感染性ＭＯＦの区別について述べることができない。
【００２４】
非感染性ＭＯＦと感染性ＭＯＦとを区別するための遺伝子発現プロフィルの使用については、依然として記述されなかった。
【００２５】
本出願に開示される発明は、非感染性ＭＯＦを持つ患者の遺伝子活性が、感染性ＭＯＦを持つ患者の遺伝子活性とは異なるという認識に基づいている。したがって、遺伝子活性におけるこれらの相違は、遺伝子発現を用いることによって、感染性ＭＯＦと非感染性ＭＯＦとの区別を可能にする。従来使用されてきた臨床パラメータは、そのような区別を可能にしないが、これは集中治療での専門的療法の開始に非常に重要である。
【００２６】
したがって本発明の目的は、遺伝子活性マーカーを用いることによって、非感染性ＭＯＦと感染性ＭＯＦとを区別することである。
【００２７】
この目的は、請求項１、１１、および２５に記載の特徴によって解決される。
【００２８】
本発明は特に、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用に関する。
【００２９】
本発明はさらに、治療中に多臓器不全の非感染性および感染性原因に苦しむ患者の経過を評価するのに使用可能である。
【００３０】
本発明はさらに、２〜４期の臨床試験における、多臓器不全の非感染性または感染性原因を有する患者の試験対象基準または試験除外基準として使用可能である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態は、さらなる電子処理のための、ならびに敗血症患者の個々の予後を記述し、診断および／または患者のデータ管理システムのためのソフトウェアを作成するための、遺伝子活性データの作成である。
【００３２】
本発明は、「コンピュータ内」エキスパートシステム作成、および／または細胞がシグナル伝達する方法の「コンピュータ内」変調に使用してもよい。
【００３３】
本発明による遺伝子発現プロファイルの作成では、配列番号１〜配列番号１２９７、ならびに５〜２０００またはそれ以上、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された、多数の特異的遺伝子および／または遺伝子断片を使用する。
【００３４】
配列番号１から配列番号１２９７を有するこれらの配列は、本発明の範囲に組み込まれ、よって発明の記述の一部でありしたがって本発明の開示の一部でもある１２９７個の配列を含んだ同封の配列表に開示される。配列表では、配列番号１から配列番号１２９７を有する個々の配列がさらに、そのＧｅｎＢａｎｋアクセション番号に割り当てられている（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００３５】
本発明はさらに、標的遺伝子の活性および／または、多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する活性物質をスクリーニングするための遺伝子活性の決定を、切り換えおよび／または変更するために、および／または多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する効果を評価するために、配列番号１〜配列番号１２９７ならびに少なくとも５〜２０００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された、患者サンプルから生体外で得られる遺伝子発現プロファイル、および／またはそのために使用されるプローブの使用に関する。
【００３６】
この文脈において、列挙されたプローブのハイブリダイズ可能な合成アナログを使用してもよい。
【００３７】
さらに、多臓器不全の非感染性または感染性の原因に苦しむ患者の遺伝子活性は、生体液における２〜４期の臨床研究で決定することができ、この「値」から、疾患の経過、生存のチャンス、治療の経過、または臨床試験で敗血症患者を含みまたは除外する可能性に関する結論を導き出すことができる。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、特異的遺伝子および／または遺伝子断片が、配列番号１〜配列番号１２９７、ならびに５〜２０００またはそれ以上、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択されることを特徴とする。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、少なくとも２〜１００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、少なくとも２００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、少なくとも２００〜５００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、少なくとも５００〜１０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１０００〜２０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、請求項９に列挙される遺伝子または遺伝子断片および／またはそれらのＲＮＡから得られる配列を、合成類似体、アプタマー、ならびにペプチド核酸配列に代えることを特徴とする。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、遺伝子の合成アナログが、５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、ハイブリダイゼーション法を用いて決定することを特徴とする。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、マイクロアレイを用いて決定することを特徴とする。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、ハイブリダイゼーション非依存的方法によって、特に酵素的および／または化学的加水分解、および／または増幅方法、好ましくはＰＣＲを行い、その後、核酸および／またはその誘導体および／またはその断片の定量を行うことによって、決定することを特徴とする。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、サンプルを、体液、特に血液、髄液、尿、腹水、精液、唾液、穿刺液、細胞内容物、またはこれらの混合物から選択することを特徴とする。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、細胞サンプルを、その細胞内容物を遊離させるために必要に応じて溶解処理にかけることを特徴とする。
【００５１】
当業者には、請求項に示される本発明の個々の特徴を、任意の所望の方法によって互いに組み合わせることができることが明らかである。
【００５２】
本発明で使用されるマーカー遺伝子という用語は、全ての得られたＤＮＡ配列、部分配列、および合成アナログ（例えばペプチド−核酸、ＰＮＡ）を包含する。ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の決定に言及する本発明の記述は、限定を求めるものではなく、本発明の例示的適用にすぎない。
【００５３】
血液に言及する本発明の記述は、本発明の単なる例示的実施形態である。本発明で使用される生体液という用語は、ヒトの体液全てを包含する。
【００５４】
本発明のさらなる利点および特徴は、実施形態の記述ならびに図面から明らかにされよう。
【００５５】
図１は、異なる病状から始まる多臓器不全の病理的経過を示す。
【実施例】
【００５６】
多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、差次的遺伝子発現試験。
【００５７】
外科集中治療室での治療を受けている５７名の患者の全血サンプルを、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための差次的遺伝子発現の測定に関して検査をした。
【００５８】
外科集中治療室での治療中、感染性ＭＯＦ［以下、重症敗血症または敗血症性ショックと呼び、８により分類される］を発症した３１名の患者の全血サンプル。
【００５９】
さらに全血サンプルを、外科手術集中治療室での治療中に非感染性ＭＯＦ［８により分類される］発症した２６名の患者から得た。
【００６０】
参照サンプルとして、細胞系ＳＩＧ−Ｍ５からのｔｏｔａｌ ＲＮＡを使用した。
【００６１】
両方の患者群の特性範囲を、表１に示す。この表には、年齢、性別、ならびに器官系の機能に関する測定値としてのＳＯＦＡ−スコアに関する情報が、示されている。同様に、プロカルシトニン（ＰＣＴ）およびＣＲＰの血漿タンパク質レベル、白血球の数、ならびに患者の最も一般的なＣＤＣ（疾病管理センター）基準が示されている。
【００６２】
患者サンプルの全てを、１つのマイクロアレイごとに参照サンプルとコハイブリダイゼーションを行った。
【表１】
実験の説明：
全血を採取した後、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の使用説明書に従ってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキットを使用して、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離した。
【００６３】
細胞培養
【００６４】
細胞培養（対照サンプル）では、１９種の凍結細胞培養物（ＳＩＧＭ５）（液体窒素で凍結）を使用した。これらの細胞をそれぞれ、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が追加された２ｍｌのＩｓｃｏｖｅ培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）に接種した。続いて、細胞培養物を、１２ウェルのプレートで２４時間、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。続いて、最終的に同じフォーマットの３枚のプレートが利用可能になるように（合計で３６ウェル）、１８ウェルの内容物を、同じ体積の２つのパートに分けた。その後、同じ条件下で２４時間培養を続けた。その後、各プレートの１１ウェルから得られた培養物を、一緒にし、遠心分離にかけた（１０００×ｇ、５分、室温）。上清を除去し、細胞ペレットを上述の培地４０ｍｌに溶解した。これらの溶解した細胞４０ｍｌを、等しい割合で２個の２５０ｍｌフラスコに分配し、上述の培地を５ｍｌ添加した後にインキュベートした。２枚の残りのプレートに残された２ｍｌのうち、８０μｌを、上述の培地１ｍｌで事前に調製してある同じプレートの空のウェルに入れた。４８時間のインキュベーション後、１２ウェルプレートの１つだけを、下記の通り処理し、すなわち５００μｌを各ウェルから抽出して一緒にした。得られた６ｍｌを、約１０ｍｌの新鮮な培地が入っている２５０ｍｌフラスコに導入した。この混合物を、１０００×ｇで５分間、室温で遠心分離にかけ、上述の培地１０ｍｌに溶解した。続いて細胞を計数することによって、下記の結果が得られた：１．５×１０７細胞／ｍｌ、合計１０ｍｌ、細胞の総数：１．５×１０８個。細胞の数は依然として十分でないので、上述の細胞懸濁液２．５ｍｌを、２５０ｍｌ（７５ｃｍ２）フラスコ（合計４個のフラスコ）中の上述の培地３０ｍｌに導入した。７２時間のインキュベーション後、新鮮な培地２０ｍｌを各フラスコに添加した。引き続きインキュベーションを２４時間行った後、細胞を上述のように計数した。細胞の総数は３．８×１０８細胞であった。所望の数の細胞である２×１０６細胞を得るために、細胞を、４個のフラスコ内で上述の培地４７．５ｍｌ中に再懸濁した。２４時間のインキュベーション時間の後、細胞を遠心分離にかけ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）を含まないリン酸緩衝液で２回洗浄した。
【００６５】
ｔｏｔａｌ ＲＮＡの単離は、製造業者の使用説明書に従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｌキット（Ｍａｃｈｅｒｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を用いて行う。上述のプロセスを、必要な細胞数が得られるまで繰り返した。これは、１０８細胞当たりＲＮＡが６００μｇという効率に対応した、必要量である６ｍｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを得るのに必要であった。
【００６６】
逆転写／標識／ハイブリダイゼーション
【００６７】
全血を採取した後、サンプルのｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離し、製造業者の使用説明書に従ってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）を使用して、品質の試験をした。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対する参照ＲＮＡとしての、ＳＩＧＭ５細胞からの１０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡと共に、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０μｇを各サンプルから分取し、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、転写した。その後、アルカリ加水分解によって、ＲＮＡを混合物から除去する。反応混合物中、後の時点で蛍光色素とｃＤＮＡとの結合を可能にするために、ｄＴＴＰの一部をアミノアリル−ｄＵＴＰ（ＡＡ−ｄＵＴＰ）に代えた。
【００６８】
反応混合物の精製後、サンプルおよび対照のｃＤＮＡを、蛍光色素Ａｌｅｘａ ６４７およびＡｌｅｘａ ５５５で共有結合標識し、ＳＩＲＳ−Ｌａｂ社のマイクロアレイ上でハイブリダイズした。使用したマイクロアレイ上には、長さが５５〜７０塩基対である５３０８の異なるポリヌクレオチドが固定化された。ポリヌクレオチドのそれぞれは、ヒト遺伝子である。さらに、品質保証のための対象スポットが存在した。１つのマイクロアレイを２８のサブアレイに分割し、このサブアレイのそれぞれを、１５×１５スポットのグリッドに並べた。
【００６９】
ハイブリダイゼーションと、その後に行われる洗浄および乾燥はそれぞれ、４２℃で１０．５時間にわたり、製造業者の使用説明書に従ってハイブリダイゼーションステーションＨＳ ４００（Ｔｅｃｏｎ）を使用して実施した。使用したハイブリダイゼーション溶液は、それぞれ標識されたｃＤＮＡサンプル、３．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム（ｖ／ｖ）、２５％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、およびそれぞれ０．８μｇ μｌ−１のｃｏｔ−１ ＤＮＡ、酵母ｔ−ＲＮＡ、およびポリ−Ａ ＲＮＡからなるものであった。その後行われるマイクロアレイの洗浄は、下記のスキームに従い室温で実施した：洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．０３％ラウリル硫酸ナトリウム）、洗浄緩衝液２（１×ＳＳＣ）、および最後に洗浄緩衝液３（０．２×ＳＳＣ）での濯ぎをそれぞれ９０秒。その後、マイクロアレイを、２．５バールの圧力の窒素流中で１５０秒よりも長く、３０℃で乾燥した。
【００７０】
処理したマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルを、その後ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ）スキャナを用いて読み取り、種々の発現遺伝子の発現比を、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４．０（Ａｘｏｎ）ソフトウェアを用いて決定した。
【００７１】
評価：
【００７２】
分析のため、１つのスポットの平均強度を、対応するスポット画素の中央値として決定した。
【００７３】
システムエラーの補正：
【００７４】
Ｈｕｂｅｒら（２００２）の手法に従って、システムエラーを補正した。この手法に従って、マイクロアレイの加法的および乗法的なバイアスを、存在する遺伝子サンプルの７０％を基にして推定した。さらなる全ての計算のために、逆双曲線正弦関数を用いてシグナルを変換した。
【００７５】
分析では、患者サンプルのシグナルの、正規化され変換された相対比を、対照に対して計算した。これは、患者番号ｎの遺伝子番号ｊの計算によって、データＧｊ，ｎ＝ａｒｃｓｉｎｈ（Ｓｃｙ５（ｊ，ｎ））−ａｒｃｓｉｎｈ（Ｓｃｙ３（ｊ，ｎ））が明らかにされたことを意味する（式中、［ＳＣｙ３（ｊ，ｎ）、ＳＣｙ５（ｊ、ｎ）］は、関連したシグナル対である）。スポットを、患者に関して分析できなかった場合（例えば、スキャンされた画像が汚れている）、関連する値を「欠測値」と記した。
【００７６】
統計的比較：
【００７７】
比較のため、対応ランダムステューデント検定を遺伝子ごとに用いた。ランダムサンプルは共に、非感染性ＭＯＦおよび感染性ＭＯＦの患者群の値をそれぞれ含んでいた。種々に発現した遺伝子を選択するために、関連したｐ値および欠測値の数を評価した。これを、関連するｐ値が０．０５よりも小さい選択された遺伝子の群に適用した。
【００７８】
試験をした遺伝子の格付けに関する基準は、各遺伝子の発現比のレベルであった。感染性ＭＯＦに罹っている患者と比較した、非感染性ＭＯＦに罹っている患者の最も過剰発現しまたは発現が弱い遺伝子はそれぞれ、興味深いものであった。
【００７９】
表２は、患者サンプルの７２１個の遺伝子が見出されたことを示すが、これらは、非感染性ＭＯＦを有する患者と比べた場合、感染性ＭＯＦを有する患者で著しく過剰発現したものであった。さらに表３は、非感染性ＭＯＦを有する患者と比べた場合、感染性ＭＯＦを有する患者の５７６個の遺伝子が著しく発現が弱かったことを示す。これらの結果から、表２および表３に列挙された遺伝子活性は、多臓器不全の非感染性原因と多臓器不全の感染性原因とを区別することが明らかである。したがって、列挙された遺伝子活性は、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するためのマーカーを提供する。
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【表２−６】
【表２−７】
【表２−８】
【表２−９】
【表２−１０】
【表２−１１】
【表２−１２】
【表２−１３】
【表２−１４】
【表２−１５】
【表２−１６】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【表３−８】
【表３−９】
【表３−１０】
【表３−１１】
【表３−１２】
【表３−１３】
表２および３で特徴付けられた変化を、請求項１に記載の本発明のプロセスに使用することができる。
【００８０】
個々の配列の、表２および３に示されるＧｅｎＢａｎｋアクセション番号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を介するインターネットアクセス）は、添付の配列表に関連付けられており、箇条書きにされ、またはそれぞれ１つの配列に関して詳細に記述されている（配列番号１から配列番号１２９７まで）。
【参考文献】
【００８１】
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・ Ｇｏｌｕｂ ＴＲ， Ｓｌｏｎｉｍ ＤＫ， Ｔａｍａｙｏ Ｐ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ： ｃｌａｓｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１−５３７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用。
【請求項２】
治療中、非感染性および感染性の多臓器不全における疾患の経過を評価するための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
多臓器不全の非感染性原因または感染性原因を有する患者を分類するための、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
第２〜４期の臨床研究における、多臓器不全の非感染性原因または感染性原因を有する患者の試験対象基準または試験除外基準としての、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
さらなる電子処理に向けた遺伝子活性データを作成するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
診断目的でおよび／または患者データ管理システムのために、患者の個々の予後を記述するソフトウェア作成のため遺伝子活性データを使用する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
臨床エキスパートシステムの作成のために、および／または細胞シグナル伝達経路をモデル化するために遺伝子活性データを使用する、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
遺伝子発現プロファイルを作成するために、配列番号１〜配列番号１３２６、ならびに少なくとも５〜２０００を有するその遺伝子断片からなる群から選択された特異的遺伝子および／または遺伝子断片を使用する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子断片が、２０〜２００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
遺伝子発現プロファイルが、特にマイクロアレイ上でハイブリダイズ法を用いて確認される、請求項１〜９に記載の使用。
【請求項１１】
患者サンプルにおける多臓器不全の非感染性原因および感染性原因に関連した複数の特異的遺伝子の遺伝子活性を決定し、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するのに特異的である遺伝子および／または遺伝子断片が、配列番号１〜配列番号１３２６、ならびに少なくとも５〜２０００ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択される、請求項１〜９の少なくともいずれか一項に記載の使用のための、遺伝子発現プロファイルの生体外測定方法。
【請求項１２】
遺伝子断片が２０〜２００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも２〜１００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２００〜５００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも５００〜１０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１０００〜２０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１で挙げられた遺伝子または遺伝子断片および／またはそのＲＮＡから得られた配列を、合成類似体、アプタマー、ミラーマー（ｍｉｒｒｏｒｍｅｒ）、ならびにペプチド−およびモルホリン核酸に代えることを特徴とする、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子および／または遺伝子断片の合成アナログが、５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子活性を、ハイブリダイゼーション法を用いて決定することを特徴とする、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子活性を、マイクロアレイを用いて決定することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子活性を、ハイブリダイゼーションと独立した方法によって、特に酵素的および／または化学的加水分解および／または増幅法によって、好ましくはＰＣＲによって決定し、その後、核酸および／またはその誘導体および／またはその断片を定量することを特徴とする、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
サンプルが、体液、特に血液、髄液、尿、腹水、精液、唾液、穿刺液、細胞内容物、またはこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞サンプルを、その細胞内容物を遊離させるために必要に応じて溶解処理にかけることを特徴とする、請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
標的遺伝子の活性および／または、多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する活性物質をスクリーニングするための遺伝子活性の決定を、切り換えおよび／または変更するために、および／または多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する効果を評価するために、配列番号１〜配列番号１３２６ならびに少なくとも５〜２０００ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された、患者サンプルから生体外で得られる遺伝子発現プロファイル、および／またはそのために使用されるプローブの使用。
【請求項２６】
請求項２５に挙げたプローブのハイブリダイズ可能な合成アナログを使用することを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
遺伝子および／または遺伝子断片が、２０〜２００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２５または２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１】
多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用。
【請求項２】
治療中、非感染性および感染性の多臓器不全における疾患の経過を評価するための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
多臓器不全の非感染性原因または感染性原因を有する患者を分類するための、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
第２〜４期の臨床研究における、多臓器不全の非感染性原因または感染性原因を有する患者の試験対象基準または試験除外基準としての、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
さらなる電子処理に向けた遺伝子活性データを作成するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
診断目的でおよび／または患者データ管理システムのために、患者の個々の予後を記述するソフトウェア作成のため遺伝子活性データを使用する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
臨床エキスパートシステムの作成のために、および／または細胞シグナル伝達経路をモデル化するために遺伝子活性データを使用する、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
遺伝子発現プロファイルを作成するために、配列番号１〜配列番号１３２６、ならびに少なくとも５〜２０００を有するその遺伝子断片からなる群から選択された特異的遺伝子および／または遺伝子断片を使用する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子断片が、２０〜２００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
遺伝子発現プロファイルが、特にマイクロアレイ上でハイブリダイズ法を用いて確認される、請求項１〜９に記載の使用。
【請求項１１】
患者サンプルにおける多臓器不全の非感染性原因および感染性原因に関連した複数の特異的遺伝子の遺伝子活性を決定し、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するのに特異的である遺伝子および／または遺伝子断片が、配列番号１〜配列番号１３２６、ならびに少なくとも５〜２０００ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択される、請求項１〜９の少なくともいずれか一項に記載の使用のための、遺伝子発現プロファイルの生体外測定方法。
【請求項１２】
遺伝子断片が２０〜２００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも２〜１００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２００〜５００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも５００〜１０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１０００〜２０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１で挙げられた遺伝子または遺伝子断片および／またはそのＲＮＡから得られた配列を、合成類似体、アプタマー、ミラーマー（ｍｉｒｒｏｒｍｅｒ）、ならびにペプチド−およびモルホリン核酸に代えることを特徴とする、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子および／または遺伝子断片の合成アナログが、５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子活性を、ハイブリダイゼーション法を用いて決定することを特徴とする、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子活性を、マイクロアレイを用いて決定することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子活性を、ハイブリダイゼーションと独立した方法によって、特に酵素的および／または化学的加水分解および／または増幅法によって、好ましくはＰＣＲによって決定し、その後、核酸および／またはその誘導体および／またはその断片を定量することを特徴とする、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
サンプルが、体液、特に血液、髄液、尿、腹水、精液、唾液、穿刺液、細胞内容物、またはこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞サンプルを、その細胞内容物を遊離させるために必要に応じて溶解処理にかけることを特徴とする、請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
標的遺伝子の活性および／または、多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する活性物質をスクリーニングするための遺伝子活性の決定を、切り換えおよび／または変更するために、および／または多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する効果を評価するために、配列番号１〜配列番号１３２６ならびに少なくとも５〜２０００ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された、患者サンプルから生体外で得られる遺伝子発現プロファイル、および／またはそのために使用されるプローブの使用。
【請求項２６】
請求項２５に挙げたプローブのハイブリダイズ可能な合成アナログを使用することを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
遺伝子および／または遺伝子断片が、２０〜２００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２５または２６のいずれか一項に記載の使用。
【公表番号】特表２００８−５１６５８８（Ｐ２００８−５１６５８８Ａ）
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３６００９（Ｐ２００７−５３６００９）
【出願日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８９６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２５８１
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１２３３０５）エスアイアールエス‐ラブ ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８９６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２５８１
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１２３３０５）エスアイアールエス‐ラブ ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
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