大腸癌を検出する方法及び組成物
【課題】癌の診断及び治療のための新たな方法を提供する。
【解決手段】被験者における結腸新生物を検出する方法であって、該被験者からの試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の発現を検出することを含む当該方法。
【解決手段】被験者における結腸新生物を検出する方法であって、該被験者からの試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の発現を検出することを含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２００１年には、１２０万症例を超えるヒトの癌が診断され、５０万人を超える人々が、癌により死亡するであろう(米国癌学会の推計)。それにもかかわらず、これまでよりも多くの人々が、癌と共に生活し、癌にもかかわらず生存している。例えば、１９９７年には、約８９０万人の生きている米国人が、癌の病歴を有した(国立癌研究所の推計)。人々は、ますます、早期に診断されれば、治療が一層上首尾となるので、癌にもかかわらずに生存するようになりそうである。初期の検出は、質の高い方法の利用可能性に依存している。かかる方法は又、患者の予後予測、治療法の選択、治療に対する応答の監視及び更なる治療を受けさせる患者の選択の決定にも有用である。従って、特異的で、正確で、侵襲性が最小で、技術的に簡単で且つ安価な癌の診断法への要求がある。
【背景技術】
【０００２】
例えば、結腸直腸癌(即ち、結腸又は直腸の癌)は、特に重要な種類のヒトの癌の一つである。結腸直腸癌は、米国成人の癌による死亡の第二位の死因である(Landis等、1999, CA Cancer J Clin, 49:8-31)。結腸直腸癌を有する個人の約４０％が死亡する。２００１年には、１３５，４００症例の新たな結腸直腸癌(９８，２００症例の結腸癌及び３７，２００症例の直腸癌)と、その病気による５６，７００人の死亡(４８，０００の結腸癌死及び８，８００の直腸癌死)があると推計されている(米国癌学会)。他の癌と同様に、これらの率は、改良された診断方法によって減少させることができる。結腸癌を検出するための他の方法があるにもかかわらず、それらの方法は、理想的なものではない。例えば、指による直腸検査(即ち、医師の手による直腸の検査)は、比較的安価であるが、不愉快であり且つ不正確でありうる。便潜血試験(即ち、大便中の血液の検出)は、大便中の血液は、多数の原因があるので、非特異的である。結腸内視鏡検査及びＳ状結腸鏡検査法(即ち、結腸の、可撓性の直視用機器を用いた直接的検査法)は、両方とも、不愉快であり且つ高価である。二重造影バリウム注腸(即ち、バリウムを充填した結腸のＸ線撮影)も又、通常放射線専門医により行なわれる高価な手順である。
【０００３】
癌を検出し又は治療するための既存の方法の不便さの故に、癌の診断及び治療のための新たな方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Landis等、1999, CA Cancer J Clin, 49:8-31
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ある面において、本発明は、部分的に、出願人の、特定のヒトゲノムＤＮＡ領域であって、ヒトの癌(例えば、結腸癌)由来の組織におけるＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンが差次的にメチル化されている当該領域の発見及び該領域の正常組織における非メチル化の発見に基づいている。該領域を、以後、「ビメンチン−メチル化標的領域」(例えば、図４５中のSEQ ID NO:４５)と称する。本発明の方法は又、部分的に、ヒトの癌に由来する組織におけるビメンチン転写物のレベルが、正常組織におけるビメンチン転写物のレベルより低いという出願人の発見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一具体例において、この方法は、被験者からの組織試料又は体液試料における、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列の存在(例えば、ビメンチンメチル化標的領域中)のアッセイを含む。好適な体液には、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、結腸排出物又は尿が含まれる。一具体例において、この方法は、制限酵素／メチル化感受性ＰＣＲを包含する。他の具体例において、この方法は、試料由来のＤＮＡの、非メチル化シトシン塩基(「変換感受性」シトシンとも呼ばれる)を異なるヌクレオチド塩基に変換するがメチル化シトシン塩基は変換しない化学化合物との反応を含む。好適具体例において、この化学化合物は、重亜硫酸ナトリウムであり、これは、非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する。この化合物で変換したＤＮＡを、次いで、この化合物で変換されたＤＮＡテンプレートを、もし試料由来のＤＮＡのＣｐＧジヌクレオチド中のシトシン塩基がメチル化されていれば増幅するプライマーを利用するメチル化感受性ポリメラーゼ連鎖反応(ＭＳＰ)を利用して増幅する。ＰＣＲ産物の生成は、被験者が、癌又は前癌性腺腫を有していることを示している。メチル化ＤＮＡの存在をアッセイするための他の方法は、当分野で公知である。
【０００７】
他の具体例において、この方法は、試料中の減少したレベルのビメンチン転写物のアッセイを包含する。かかるアッセイの例には、ビメンチンのコード配列に由来するプライマーを利用するＲＴ−ＰＣＲアッセイが含まれる。このビメンチンｃＤＮＡ配列は、例えば、ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＭ＿００３３８０において見出すことができる。
【０００８】
他の具体例において、本発明は、癌を有する又は有することが疑われる被験者における、癌(例えば、結腸癌)の予後予測のための検出方法を提供する。かかる方法は、被験者に由来する組織試料又は体液中の、メチル化ビメンチンＤＮＡ(例えば、ビメンチンメチル化標的領域中)の存在についてのアッセイを含む。ある症例においては、メチル化ビメンチンＤＮＡの血液画分における検出は、進行癌(例えば、進行した結腸癌)を指示するものであるということが予想される。他の症例においては、組織若しくは大便由来の試料又は他の体液由来の試料における、メチル化ビメンチンＤＮＡの検出は、ＤＮＡを脱メチル化し、又はビメンチン遺伝子の発現を再活性化する治療剤に応答するであろう癌を指示するものでありうる。
【０００９】
他の具体例において、本発明は、被験者の癌(例えば、結腸癌)の状態を経時的に監視する方法を提供する。この方法は、第一の時点で被験者から採った組織試料又は体液及び第二の時点で被験者から採った対応する組織試料又は体液において、メチル化ビメンチンＤＮＡの存在について(例えば、ビメンチンメチル化標的領域で)アッセイすることを含む。第一の時点で採った組織試料又は体液由来のメチル化ビメンチンＤＮＡの非存在及び第二の時点で採った組織試料又は体液におけるメチル化ビメンチンＤＮＡの存在は、癌が進行中であることを示している。第一の時点で採った組織試料又は体液中のメチル化ビメンチンＤＮＡの存在及び第二の時点で採った組織試料又は体液中のメチル化ビメンチンＤＮＡの非存在は、癌が退行していることを示している。
【００１０】
他の具体例において、本発明は、癌(例えば、結腸癌)を有し又は有すると疑われる被験者における治療を評価する方法を提供する。この方法は、治療前に被験者から採った組織試料又は体液及び治療中又は治療後に被験者から採った対応する組織試料又は体液において、メチル化ビメンチンＤＮＡの存在について(例えば、ビメンチンメチル化標的領域で)アッセイすることを含む。治療後又は治療中に採った試料中のメチル化ビメンチンＤＮＡのレベルの喪失又は治療前に採った試料中のメチル化ビメンチンＤＮＡのレベルと比較しての減少は、該治療を受けた被験者における癌の退行に対する該治療の正の効果を示している。
【００１１】
本発明は又、ビメンチン遺伝子のメチル化状態を検出するためにデザインされたアッセイ(例えば、メチル化感受性ＰＣＲアッセイ又はＨｐａＩＩアッセイ)における利用のためのオリゴヌクレオチドプライマー配列にも関係している。
【００１２】
本発明は又、癌細胞(例えば、結腸癌)の成長を阻害し又は減じる方法をも提供する。この方法は、ビメンチンタンパク質の癌細胞におけるレベルを増加させることを含む。一具体例において、これらの細胞を、ビメンチンタンパク質又は生物学的に活性な同等物又はそれらの断片と、該タンパク質又は断片の取込みを可能にする条件下で接触させる。他の具体例においては、これらの細胞を、ビメンチンタンパク質をコードし且つ癌細胞中で活性なプロモーターを含有する核酸と(該プロモーターは、ビメンチンタンパク質をコードする領域と作動的に結合されている)、該核酸の該癌細胞による取込みを可能にする条件下で接触させる。他の具体例において、この方法は、メチル化ビメンチンＤＮＡの脱メチル化或はサイレンシングを受けたビメンチンプロモーターの再活性化を含む。
【００１３】
他の具体例において、この出願は、単離された又は組換えによるビメンチンヌクレオチド配列(SEQ ID NO:２〜７及び４５〜５０の何れか一つのヌクレオチド配列、並びに該配列の１０、１５、２０、２５、５０、１００又は１５０塩基対長の断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は同一であるもの)であって、ビメンチン関連疾患の細胞において差次的にメチル化される当該単離された又は組換えによるビメンチンヌクレオチド配列を提供する。
【００１４】
他の具体例において、この出願は、結腸癌を検出する方法であって、ａ）患者から試料を得ること；及びｂ）該試料を、ビメンチン、ＳＬＣ５Ａ８、ＨＬＴＦ、ｐ１６及びｈＭＬＨ１よりなる群から選択する少なくとも２つの遺伝子内の核酸配列のメチル化の存在についてアッセイすることを含み、これらの２つの遺伝子内のヌクレオチド配列のメチル化が結腸癌を示す当該方法を提供する。かかる方法において、この試料は、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿、及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である。例えば、体液は、結腸癌を有すると疑われる被験者又は結腸癌を有することが既知の被験者から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣｐＧジヌクレオチドの位置を、ビメンチン遺伝子(ヌクレオチド１〜６２００)の５’ゲノム領域中のバルーンとして示している。この領域の４つのサブドメイン(Ａ〜Ｄ)は、結腸癌における異所的メチル化につき試験される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＬ１３３４１５配列の塩基対５６，１２３〜６２，３４０に対応するビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列(SEQ ID NO:５１)を示している。
【図２】図２は、ビメンチンが正常な結腸細胞株ではよく発現されるが、結腸癌細胞株では、発現が乏しいというＲＴ−ＰＣＲの結果を示している。このビメンチンの発現は、脱メチル化剤５−アザシチジンによって、１２の結腸癌細胞株中の９株において誘導されている。
【図３】図３は、３０サイクル(上パネル)又は４０サイクル(下パネル)のＰＣＲ増幅によるＣ領域内のビメンチンメチル化についてのＨｐａＩＩアッセイの結果を示している。これらのＰＣＲ反応は、未消化(Ｕ)、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩでの消化(Ｈ)、又はメチル化に中立な酵素Ｍｓｐ１での消化(Ｍ)後に行なわれる。３つの癌でない正常組織(ＮＮ１、ＮＮ２及びＮＮ３)は、すべてメチル化されていないが、１０の結腸癌細胞株全部のうちの９つは、メチル化を示している。
【図４】図４は、１０対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料(Ｎ１〜１０及びＴ１〜１０)のＣ領域内のビメンチンのメチル化についての、ＨｐａＩＩによる制限酵素消化後の４０サイクルのＰＣＲ増幅による、ＨｐａＩＩアッセイの結果を示している。
【図５】図５は、２２対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料(Ｎ１１〜３２及びＴ１１〜３２)のＣ領域内のビメンチンのメチル化についての、ＨｐａＩＩによる制限酵素消化後の４０サイクルのＰＣＲ増幅による、ＨｐａＩＩアッセイの結果を示している。
【図６】図６は、ビメンチン遺伝子の更なる図式描写を示している。Ｂ及びＣ領域内のＭＳ−ＰＣＲのためのプライマーの位置を、ＭＳ−ＰＣＲ対１〜５として示してある。
【図７】図７は、ビメンチンのゲノム配列のＢ及びＣ領域を部分的にカバーするプライマー対１〜５を利用するＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。プライマー対１、４及び５は、すべて、４０サイクルのＭＳ−ＰＣＲによりアッセイした場合、正常結腸組織(Ｎで示してある)においてビメンチンのメチル化を検出している。対照的に、プライマー対３は、ビメンチン非発現性結腸癌細胞株においてメチル化されるが正常結腸組織又はビメンチン発現性細胞株ＳＷ４８０ではメチル化されない差次的メチル化領域を規定している。
【図８】図８は、プライマー対ＭＳ３を利用するＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。ビメンチンのメチル化は、癌以外の切除術由来の１４の正常結腸組織試料(ＮＮで示してある)の何れにおいても、ＭＳ３反応を、順次的な４０サイクルの反応を２回行なうことにより、ＰＣＲの８０サイクルまで行なった場合でさえ、検出されていない。
【図９】図９は、１０対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料でのＣ領域におけるビメンチンのメチル化を検出するための、ＨｐａＩＩアッセイ(上段)の、ＭＳＰ３を４０サイクルで利用するＭＳ−ＰＣＲ(下段)に対する比較を示している。
【図１０】図１０は、２０対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料(Ｎ１〜２０及びＴ１〜２０)におけるビメンチンのメチル化を検出するための、ＭＳＰ３プライマーを４０サイクルで利用するＭＳ−ＰＣＲを示している。
【図１１】図１１は、２６対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料(Ｎ２１〜４６及びＴ２１〜４６)におけるビメンチンのメチル化を検出するための、ＭＳＰ３プライマーを４０サイクルで利用するＭＳ−ＰＣＲを示している。
【図１２】図１２は、一組の結腸癌細胞株におけるビメンチンのメチル化を検出するための、ＭＳＰ３プライマーを４０サイクルで利用するＭＳ−ＰＣＲを示している。
【図１３】図１３は、Ａ、Ｃ及びＤ領域におけるビメンチンヌクレオチド配列を増幅するための、ＨｐａＩＩアッセイにおけるプライマー配列を示している。Ａ．フォワードＰＣＲプライマー ＶＭ−ＨｐａＩＩ−６７９Ｕ(SEQ ID NO:８)及びリバースＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−１２６６Ｄ(SEQ ID NO:９)は、ＨｐａＩＩでの消化後に、Ａ領域内のメチル化されているビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。非メチル化ＤＮＡは、ＨｐａＩＩにより切断され、それ故、ＰＣＲ増幅されえない。Ｂ．フォワードＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−１８２６Ｕ(SEQ ID NO:１０)及びリバースＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−２１９５Ｄ(SEQ ID NO:１１)は、ＨｐａＩＩでの消化後に、Ｃ領域内のメチル化されたビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。Ｃ．フォワードＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−２２６４Ｕ(SEQ ID NO:１２)及びリバースＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−２６９５Ｄ(SEQ ID NO:１３)は、ＨｐａＩＩでの消化後に、Ｄ領域内のメチル化されたビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。
【図１４】図１４は、ビメンチンのメチル化を検出するためのＭＳＰ−ＰＣＲプライマーのセット１〜５の配列を示している。ＭＳＰ１、ＭＳＰ１−２、及びＭＳＰ３は、二本鎖メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換されたセンス鎖を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１３７４ＭＦ(SEQ ID NO:１４)及びリバースプライマーＶＩＭ１５０４ＭＲ(SEQ ID NO:１５)；フォワードプライマーＶＩＭ１３７４ＭＦ(SEQ ID NO:１４)及びリバースプライマーＶＩＭ１５０６ＭＲ(SEQ ID NO:１８)；フォワードプライマーＶＩＭ１７７６ＭＦ(SEQ ID NO:２３)及びリバースプライマーＶＩＭ１９８２ＭＲ(SEQ ID NO:２４)を含んでいる。ＭＳＰ２及びＭＳＰ５は、二本鎖メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換されたアンチセンス鎖を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１６５５ＭＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:１９)及びリバースプライマーＶＩＭ１７９７ＭＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２０)；フォワードプライマーＶＩＭ１９３５ＭＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２７)及びリバースプライマーＶＩＭ２０９４ＭＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２８)を含んでいる。下線を付けた配列は、二本鎖非メチル化ビメンチンＤＮＡ(ＵＦ又はＵＲとして示してある)の重亜硫酸塩変換された配列(センス又はアンチセンス)を増幅するために用いるコントロールプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１３６８ＵＦ(SEQ ID NO:１６)及びリバースプライマーＶＩＭ１５０６ＵＲ(SEQ ID NO:１７)；フォワードプライマーＶＩＭ１６５１ＵＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２１)及びリバースプライマーＶＩＭ１７９９ＵＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２２)；フォワードプライマーＶＩＭ１７７１ＵＦ(SEQ ID NO:２５)及びリバースプライマーＶＩＭ１９８６ＵＲ(SEQ ID NO:２６)；フォワードプライマーＶＩＭ１９３４ＵＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２９)及びリバースプライマーＶＩＭ２０８９ＵＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:３０)を含んでいる。
【図１５】図１５は、ビメンチンのメチル化を検出するためのＭＳＰ−ＰＣＲプライマーセット６〜１０の配列を示している。ＭＳＰ６、ＭＳＰ７、ＭＳＰ８及びＭＳＰ９は、二本鎖メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換されたセンス配列を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１６５５ＭＦ(SEQ ID NO:３１)及びリバースプライマーＶＩＭ１７９２ＭＲ(SEQ ID NO:３２)；フォワードプライマーＶＩＭ１６５５ＭＦ(SEQ ID NO:３１)及びリバースプライマーＶＩＭ１７９６ＭＲ(SEQ ID NO:３５)；フォワードプライマーＶＩＭ１６５５ＭＦ(SEQ ID NO:３１)及びリバースプライマーＶＩＭ１８０４ＭＲ(SEQ ID NO:３６)；フォワードプライマーＶＩＭ１８４３ＭＦ(SEQ ID NO:３７)及びリバースプライマーＶＩＭ１９８２ＭＲ(SEQ ID NO:２４)を含んでいる。ＭＳＰ１０は、二本鎖メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換されたアンチセンス配列を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１９２９ＭＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:３９)及びリバースプライマーＶＩＭ２０９４ＭＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２８)を含んでいる。下線を引いた配列は、二本鎖非メチル化ビメンチンＤＮＡ(ＵＦ又はＵＲと示してある)の重亜硫酸塩変換された配列(センス又はアンチセンス)を増幅するのに利用されるコントロールプライマーであり、フォワードプライマーＶＩＭ１６５１ＵＦ(SEQ ID NO:３３)及びリバースプライマーＶＩＭ１８００ＵＲ(SEQ ID NO:３４)；フォワードプライマーＶＩＭ１８４３ＵＲ(SEQ ID NO:３８)及びリバースプライマーＶＩＭ１９８６ＵＲ(SEQ ID NO:２６)；フォワードプライマーＶＩＭ１９３４ＵＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２９)及びリバースプライマーＶＩＭ２０８９ＵＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:３０)を含んでいる。
【図１６】図１６は、ビメンチン遺伝子の図式描写を示している。１０対のＭＳ−ＰＣＲプライマーセットをデザインした(それは、ｂｐ１３４７と２０９４の間のビメンチンＢ及びＣ領域の部分を調べた)。これらのプライマー対により調べられた領域を、図式表示してある。
【図１７】図１７は、１２の癌でない正常試料と１２の結腸癌細胞株における、ビメンチンのメチル化の検出のための、３対のプライマーセットＭＳＰ１、ＭＳＰ１−２、及びＭＳＰ３を利用するＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。
【図１８】図１８は、１２の癌でない正常組織と１２の結腸癌細胞株における、ビメンチンのメチル化の検出のための、３対のプライマーセットＭＳＰ５、ＭＳＰ６、ＭＳＰ７、ＭＳＰ８、ＭＳＰ９、及びＭＳＰ１０を利用する、ＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。
【図１９】図１９は、顕微解剖した異常な凹窩病巣(ＡＣＦ、「Ａ」で示してある)における、ビメンチンのメチル化の検出のための、２対のプライマーセットＭＳＰ３及びＭＳＰ１−２を利用する、ＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。
【図２０】図２０は、ヒトのビメンチンタンパク質のアミノ酸配列(SEQ ID NO:１)を示している。
【図２１】図２１〜２６は、ビメンチンの５’ゲノム領域の決定的配列を与えるものである。各図は、領域Ａ〜Ｄを包含するビメンチン遺伝子の５’領域に及ぶＮＣＢＩヒトゲノムクローンＡＬ１３３４１５の塩基対５６，８２２〜５８，８２２に対応する配列を与える。各図は、結腸癌において差次的にメチル化される塩基対５７，４２７〜５８，３２６の領域を太字で示している。その上、各図において、ＭＳ−ＰＣＲプライマーにより調べられる特殊な配列に下線を引いてある。図２１は、ＡＬ１３３４１５配列(SEQ ID NO:２)の塩基対５６，８２２〜５８，８２２に対応するビメンチンのセンス鎖配列を５’〜３’方向で示している。塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４５)の、差次的にメチル化された領域は、太字にしてある(図４５も参照されたい)。
【図２２】図２２は、図２１に示したビメンチン遺伝子のセンス鎖(SEQ ID NO:３)に由来する、メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてある塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４６)である。
【図２３】図２３は、図２１に示したビメンチン遺伝子のセンス鎖に由来する未メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:４)を示している。この差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてある塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４７)である。
【図２４】図２４は、ＡＬ１３３４１５配列(SEQ ID NO:５)の塩基対５６，８２２〜５８，８２２に対応する、ビメンチンのアンチセンス鎖の配列(３’〜５’)を示している。この差次的にメチル化された領域は、太字にしてある塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４８)である。
【図２５】図２５は、図２４に示したビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖(３’〜５’)に由来するメチル化されたテンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:６)を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてあり、塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４９)である。
【図２６】図２６は、図２４に示したビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖(３’〜５’)に由来する未メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:７)を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてあり、塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:５０)である。
【図２７】図２７は、ＨｐａＩＩアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「Ａ領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５６７９９〜５７３８５、SEQ ID NO:４０)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド６７９〜１２６６とも呼ばれた。
【図２８】図２８は、ＨｐａＩＩアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「Ｂ領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５７４３６〜５７７８１、SEQ ID NO:４１)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド１３１７〜１６６１とも呼ばれた。
【図２９】図２９は、ＨｐａＩＩアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「Ｃ領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５７９４６〜５８３１５、SEQ ID NO:４２)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド１８２６〜２１９５とも呼ばれた。
【図３０】図３０は、ＨｐａＩＩアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「Ｄ領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５８３８４〜５８８１５、SEQ ID NO:４３)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド２２６４〜２６９５とも呼ばれた。
【図３１】図３１は、Ｂ領域並びにＢ領域とＣ領域の間のギャップをカバーする「Ｂ’領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５７４３６〜５７９４５、SEQ ID NO:４４)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド１３１７〜１８２５とも呼ばれた。このＢ’領域は又、差次的メチル化領域をも包含する。
【図３２】図３２は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列エントリーＡＬ１３３４１５の、塩基対５６７００〜５８８００の、ビメンチンの５’ゲノム領域の図式表示を示している。ボックスは、ビメンチンの領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを示している。バルーンは、潜在的メチル化の標的であるＣｐＧジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、個体群多型であるＣｐＧを示している。図３２は、領域Ａ〜Ｂを示し、図３３〜３４は、領域Ｃ〜Ｄを示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的ＰＣＲ領域により調べられる領域を示している(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０と番号付けられている)。これらの図において、ＭＳ−ＰＣＲ反応の第一の結果は、ＭＳ−ＰＣＲプライマーに次いで示してある。これらの反応物の最も左側のセットは、１２の癌でない正常試料におけるＭＳ−ＰＣＲの結果であり；陰性の結果は、好適な結果である。これらの反応物の最も右側のセットは、１１の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり；好適な結果は、陽性反応である。
【図３３】図３３は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列エントリーＡＬ１３３４１５の、塩基対５６７００〜５８８００の、ビメンチンの５’ゲノム領域の図式表示を示している。ボックスは、ビメンチンの領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを示している。バルーンは、潜在的メチル化の標的であるＣｐＧジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、個体群多型であるＣｐＧを示している。図３２は、領域Ａ〜Ｂを示し、図３３〜３４は、領域Ｃ〜Ｄを示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的ＰＣＲ領域により調べられる領域を示している(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０と番号付けられている)。これらの図において、ＭＳ−ＰＣＲ反応の第一の結果は、ＭＳ−ＰＣＲプライマーに次いで示してある。これらの反応物の最も左側のセットは、１２の癌でない正常試料におけるＭＳ−ＰＣＲの結果であり；陰性の結果は、好適な結果である。これらの反応物の最も右側のセットは、１１の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり；好適な結果は、陽性反応である。
【図３４】図３４は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列エントリーＡＬ１３３４１５の、塩基対５６７００〜５８８００の、ビメンチンの５’ゲノム領域の図式表示を示している。ボックスは、ビメンチンの領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを示している。バルーンは、潜在的メチル化の標的であるＣｐＧジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、個体群多型であるＣｐＧを示している。図３２は、領域Ａ〜Ｂを示し、図３３〜３４は、領域Ｃ〜Ｄを示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的ＰＣＲ領域により調べられる領域を示している(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０と番号付けられている)。これらの図において、ＭＳ−ＰＣＲ反応の第一の結果は、ＭＳ−ＰＣＲプライマーに次いで示してある。これらの反応物の最も左側のセットは、１２の癌でない正常試料におけるＭＳ−ＰＣＲの結果であり；陰性の結果は、好適な結果である。これらの反応物の最も右側のセットは、１１の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり；好適な結果は、陽性反応である。
【図３５】図３５は、図３２〜３４にまとめたＭＳ−ＰＣＲ反応のためのプライマー配列(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０)を与える。ＭＦは、フォワードプライマーを示し、ＭＲは、リバースプライマーを示している。プライマーは、センスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅すると仮定されている。アンチセンスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅するプライマーは、(ＡＳＳ)により示してある。この表は又、増幅生成物に対応するゲノム位置(クローンＡＬ１３３４１５の塩基対ナンバリングシステムに対するもの)をも与える。この表は又、増幅された断片の長さをも与える。影を付けたプライマーは、最良の及び好適な反応を与える。SEQ ID NO:１４、１５、１８、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３６、３７、３９及び５２〜７２を、この図中に見出すことができる。
【図３６】図３６は、種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの技術的な感度及び特異性を示している。左奥には、癌でない正常結腸組織について行なった４５又は９０サイクルのＭＳ−ＰＣＲ反応の結果を示してある。９０サイクルの反応は、４５サイクルＰＣＲ反応物からアリコートを採って、それを新鮮なＰＣＲ反応物中に希釈して、更なる４５サイクルを反復することにより行なった。これらの示した反応物につき、ＭＳ−ＰＣＲ反応は、正常組織についての９０サイクル以下のＰＣＲにおいて偽陽性を検出しなかった。陽性対照の結腸癌細胞株を、すぐ右に並べて示してある。右奥には、種々のＭＳ−ＰＣＲ反応の技術的な感度のアッセイを示してある。中央の及び最も右側の反応物のセットは、Ｖａｃｏ５(ビメンチンのメチル化を有する細胞株)由来のＤＮＡについて行なったＭＳ−ＰＣＲの希釈シリーズを示している。投入メチル化Ｖａｃｏ５ＤＮＡの１００ピコグラムのレベルまで陽性反応が得られている。
【図３７】図３７は、更なるプライマーセットについての種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの技術的な感度及び特異性を示している。左欄は、４５サイクルのＭＳ−ＰＣＲでの、１１の結腸癌細胞株のパネルのアッセイの結果を示している。右側の結果は、一群の癌でない正常組織の４５及び９０サイクルのＭＳ−ＰＣＲ反応を評価する欄を示している。次は、候補の反応物を増大するＶａｃｏ５ＤＮＡ希釈物に対してアッセイする希釈シリーズのアッセイを示す２つの欄を示している。最良の希釈物(例えば、ＶＩＭ−ＭＳＰ５０Ｍ)は、殆どの結腸癌細胞株の検出に関する高度の技術的感度を示し、正常結腸についての低い陽性率、及び投入ＤＮＡの５０ピコグラムまでのＶａｃｏ５ＤＮＡの希釈物の検出に関する高度の感度を示している。右側に示したこれら２つの希釈シリーズは、それらが、予め重亜硫酸塩処理した正常及びＶａｃｏ５ＤＮＡを混合することにより為された(中央欄)か、先ずＶａｃｏ５及び正常ＤＮＡを混合し；該混合物を希釈してから；該希釈混合物を重亜硫酸塩処理することにより行なった(最右欄)かどうかで異なっている。
【図３８】図３８は、正常及び腫瘍の対の、種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。
【図３９】図３９は、正常な結腸及び癌の対、結腸腺腫、及び結腸癌細胞株の、種々のＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。
【図４０】図４０は、結腸癌細胞株及び癌でない正常な結腸試料の、種々のＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。
【図４１】図４１は、図３７を補って、更に、ビメンチンＤＮＡメチル化についての種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの技術的感度を示している。２つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ及びＭＳＰ５０Ｍ)を試験した。
【図４２】図４２は、図３８を補って、更に、ビメンチンＤＮＡメチル化についての種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの臨床的感度を示している。この一次データは、正常及び腫瘍の対のアッセイから得られた。３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ、ＭＳＰ４７Ｍ、及びＭＳＰ５０Ｍ)を利用した。
【図４３】図４３は、図３９及び４０を補って、更に、ビメンチンＤＮＡメチル化についての種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの臨床的感度を示している。この一次データは、結腸癌細胞株、癌でない正常な結腸試料(Ｎ.Ｃ.Ｎ)、結腸の正常／腫瘍対、及び結腸腺腫のアッセイから得られた。３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ、ＭＳＰ４７Ｍ、及びＭＳＰ５０Ｍ)を利用した。
【図４４】図４４は、ＭＳＰ２９、ＭＳＰ４７、及びＭＳＰ５０を利用するＭＳ−ＰＣＲからの生のデータを与える。このデータは、細胞株Ｎ／Ｔ対、及び結腸腺腫試料それぞれについての３つの表で示されている。メチル化試料は、赤く暗号化されてＭと標識されているが、非メチル化試料は、緑色に暗号化されてＵと標識されている。Ｖ−ＭＳＰ２９、ＶＭＳＰ−４７、及びＶ−ＭＳＰ５０が、ビメンチンプライマーである。Ｈ−ＭＳＰ５は、比較のためのコントロールプライマー(ＨＬＴＦ−ＭＳＰ５)である。
【図４５】図４５は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：センス鎖(SEQ ID NO:４５)を示している。
【図４６】図４６は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：センス鎖(重亜硫酸塩変換／メチル化したもの)(SEQ ID NO:４６)を示している。
【図４７】図４７は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：センス鎖(重亜硫酸塩変換し／メチル化してないもの)(SEQ ID NO:４７)を示している。
【図４８】図４８は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：アンチセンス鎖(SEQ ID NO:４８)を示している。
【図４９】図４９は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：アンチセンス鎖(重亜硫酸塩変換／メチル化したもの)(SEQ ID NO:４９)を示している。
【図５０】図５０は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：アンチセンス鎖(重亜硫酸塩変換し／メチル化してないもの)(SEQ ID NO:５０)を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．定義
便宜のために、明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いた幾らかの用語を、ここに集めた。別途規定しない限り、ここで用いるすべての技術及び科学用語は、この発明が属する分野の当業者に普通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１７】
本願では、単数表現のものであっても、複数の場合をも指すものとする。例えば、「エレメント」は、１つのエレメント又は１つより多くのエレメントを意味する。
【００１８】
用語「腺腫」、「結腸腺腫」及び「ポリープ」は、ここでは、結腸の任意の前癌性新生物を記載するために用いる。
【００１９】
用語「結腸」は、ここで用いる場合、右結腸(盲腸を含む)、横行結腸、左結腸、及び直腸を包含することを意図している。
【００２０】
用語「結腸直腸癌」及び「結腸癌」は、ここでは、結腸(上記のように、直腸を含む)の任意の癌性新生物を指すために交換可能に用いる。
【００２１】
用語「血液由来の画分」は、ここでは、全血液の構成成分を指す。全血液は、液体部分(即ち、血漿)及び固体部分(即ち、血液細胞)を含む。血液の液体部分及び固体部分は、各々、多数の成分例えば、血漿中の種々のタンパク質又は固体部分の種々bの細胞型よりなる。これらの成分の一つ又はこれらの成分の何れかの混合物は、全血液中で見出される少なくとも一つの成分が失われているならば、血液由来の画分である。
【００２２】
「細胞」、「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」は、ここでは、交換可能に用いる用語である。かかる用語は、特定の主題の細胞を指すだけでなく、かかる細胞の子孫又は潜在的子孫をも指すということは理解される。ある種の改変は、突然変異又は環境の影響のために続く世代で起こりうるので、かかる子孫は、実際は、親細胞と同一でないかもしれないが、やはり、ここで用いる場合、この用語の範囲に含まれる。
【００２３】
用語「化合物」、「試験化合物」、「薬剤」及び「分子」は、ここでは、交換可能に用いて、ペプチド、核酸、炭水化物、小型有機分子、天然物抽出物ライブラリー、及び任意の他の分子(化学物質、金属、及び有機金属化合物を含むが、これらに限られない)を含むことを意味する(但し、これらに限られない)。
【００２４】
用語「化合物変換されたＤＮＡ」は、ここでは、ＤＮＡ中の非メチル化Ｃ塩基を異なるヌクレオチド塩基に変換する化学化合物で処理し又は該化合物と反応させたＤＮＡを指す。例えば、一つのかかる化合物は、重亜硫酸ナトリウムであり、これは、非メチル化ＣをＵに変換する。もし変換感受性シトシンを含むＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理したならば、この化合物変換されたＤＮＡは、Ｃの代わりにＵを含むであろう。もし重亜硫酸ナトリウムで処理したＤＮＡがメチルシトシンのみを含むならば、その化合物変換されたＤＮＡは、メチルシトシンの代わりにウラシルを含まないであろう。
【００２５】
用語「脱メチル化剤」は、ここで用いる場合、該剤での処理に際して、メチル化によるサイレンシングを受けた標的遺伝子の活性及び／又は遺伝子発現を回復する薬剤を指す。かかる薬剤の例には、制限はしないが、５−アザシチジン及び５−アザ−２’−デオキシシチジンが含まれる。
【００２６】
ここで用いる場合、用語「遺伝子発現」又は「タンパク質発現」は、試料中に存在する遺伝子転写物又はタンパク質の量に関係する任意の情報、並びに、遺伝子又はタンパク質が生成され又は蓄積し又は分解される速度に関する情報(例えば、レポーター遺伝子のデータ、核流出実験からのデータ、パルスチェースデータなど)を含む。ある種のデータは、遺伝子及びタンパク質発現の両方に関係していると見ることができる。例えば、細胞中のタンパク質レベルは、タンパク質のレベル並びに転写のレベルを反映しており、かかるデータは、句「遺伝子又はタンパク質発現の情報」に含まれるべきものである。かかる情報は、細胞当たりの量の形態、コントロール遺伝子又はタンパク質に対する量、ユニットレス測定などで与えられうる。用語「情報」は、如何なる特定の表現手段に限られるものではなく、適切な情報を与える任意の表現を意味することを意図している。用語「発現レベル」は、遺伝子転写物の蓄積又はタンパク質の蓄積又はタンパク質合成速度などを指向するものであっても、遺伝子又はタンパク質発現データに反映され又はそれから導き出せる質を指している。
【００２７】
用語「検出」は、ここで用いる場合、生物学的試料中の、マーカー、又はマーカーの変化(例えば、マーカーのメチル化状態の変化など)を観察する任意の方法を指す(マーカー又はマーカーの変化が現実に検出されるか否かにかかわらず)。換言すれば、試料をマーカー又はマーカーの変化についてプローブ検出する行為は、たとえマーカーが存在しないと測定され又は感度レベルより低いと測定されたとしても、「検出」である。検出は、定量的、半定量的又は非定量的観察であってよい。
【００２８】
用語「差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列」は、ビメンチン関連新生物においてメチル化されていることが見出されるビメンチンヌクレオチド配列の領域、例えば結腸癌組織又は細胞株においてメチル化されていることが見出されるが正常組織又は細胞株においてはメチル化されていないビメンチンヌクレオチド配列の領域を指す。例えば、図４５は、ＮＣＢＩ ＡＬ１３３４１５配列(SEQ ID NO:４５)の塩基対５７４２７〜５８３２６に対応する差次的にメチル化されるビメンチン領域を与える。この配列は、主として、Ｂ及びＣ領域内にある。
【００２９】
「発現ベクター」は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるために用いられる複製可能なＤＮＡ構築物を指し、これは、(１)遺伝子発現における調節の役割を有する遺伝子エレメント例えばプロモーター、オペレーター又はエンハンサー、(２)これらに作動的に結合された所望のタンパク質(本件では、ビメンチンタンパク質)をコードして、ｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列、及び(３)適当な転写及び翻訳の開始及び終結用配列のアセンブリを含む転写ユニットを含む。プロモーター及び他の調節エレメントの選択は、一般に、宿主細胞によって変化する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用なベクターは、しばしば、「プラスミド」の形態であり、これは、環状二本鎖のＤＮＡループであって、それらのベクター型では、染色体に結合していない。本明細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、交換可能に用いる。しかしながら、この発明は、かかる他の形態の発現ベクターであって同等の機能を果すものを包含することを意図しており、それらは、以下で公知となろう。
【００３０】
これらの発現ベクターにおいて、転写又は翻訳を制御する調節エレメントは、一般に、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来するものであってよい。宿主において複製する能力(通常、複製起点により与えられる)及びトランスフォーマントの認識を容易にする選択用遺伝子を追加的に組み込むことができる。ウイルス例えばレトロウイルス、アデノウイルスなどに由来するベクターを利用することができる。
【００３１】
用語「健康な」、「正常な」及び「非新生物の」は、ここでは、ビメンチンと関係する新生物形成(例えば、メチル化によるビメンチン遺伝子発現のサイレンシングと関係する新生物)などの病気でない被験者又は特定の細胞若しくは組織を指すために交換可能に用いる。これらの用語は、ここでは、しばしば、結腸の組織及び細胞に関して用いられる。従って、この出願の目的に関して、重い心臓病を有しているが、ビメンチンサイレンシングに関係した病気を有しない患者は、「健康な」者と呼ばれる。
【００３２】
「ビメンチンと関係した新生物」は、ビメンチン遺伝子の減少した発現又は無発現と関係した新生物を指す。ビメンチンと関係した新生物の例には、胃腸内新生物及び結腸新生物などが含まれる。
【００３３】
「ビメンチン関連増殖性疾患」は、ビメンチン遺伝子の減少した発現又は過剰発現と関連した病気を指す。
【００３４】
「ビメンチンメチル化標的領域」は、ここで用いる場合、差次的にメチル化されることが見出されているビメンチンの領域を指す。例えば、図４５は、ある一定の配列が差次的にメチル化される(例えば、SEQ ID NO:４５)ビメンチン領域を開示している。
【００３５】
「ビメンチンヌクレオチド配列」又は「ビメンチン核酸配列」は、ここで用いる場合、SEQ ID NO:２〜７に示したビメンチンのゲノム配列及びそれらの断片を指す。
【００３６】
「ビメンチンのサイレンシングと関連する疾患」は、ここで用いる場合、ビメンチン関連新生物を包含する。
【００３７】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間の又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性及び同一性は、各々、比較の目的のために整列させうる各配列中の一つの位置を比較することにより決定される。比較した配列中の同等の位置が、同じ塩基又はアミノ酸により占められていたならば、それらの分子は、その位置で同一であり；同等の部位が同じ又は類似のアミノ酸残基(例えば、立体的及び／又は電子的性質が類似している)により占められていたならば、それらの分子は、その位置で相同(類似)であるいうことができる。相同性／類似性又は同一性のパーセンテージによる表現は、比較した配列に共有される位置の同一又は類似のアミノ酸の数の関数を指す。「無関係」又は「相同でない」配列は、本発明の配列と、４０％未満の、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。２つの配列の比較において、残基(アミノ酸又は核酸)の非存在又は余分な残基の存在も又、同一性及び相同性／類似性を減少させる。
【００３８】
用語「相同性」は、類似の機能又はモチーフを有する遺伝子又はタンパク質を同定するのに用いられる配列類似性の数学に基づく比較を記載する。本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列又は同族体を同定するために、公開されたデータベースに対する検索を実行するための「問合わせ配列」として利用することができる。かかる検索は、Altschul等、(1990) J Mol.Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)を利用して行なうことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム(スコア＝１００、ワードレングス＝１２)を用いて行なって、この発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム(スコア＝５０、ワードレングス＝３)を用いて行なって、この発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためにギャップ入りのアラインメントを得るために、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Altschul等、(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されたように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメーターを利用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov を参照されたい。
【００３９】
ここで用いる場合、「同一性」は、配列を、配列マッチングが最大になるように整列させた場合(即ち、ギャップ及び挿入を考慮する)に、２つ以上の配列における対応する位置の同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。同一性は、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編、Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編、Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.及びGriffin, H.G.編、Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；及びSequence Analysis Primer, Gribskov, M.及びDevereux, J.編、M Stockton Press, New York, 1991；及びCarillo, H.及びLipman, D., SIAM J.Applied Math., 48:1073, 1988に記載されたものを含む(但し、これらに限られない)公知の方法によって、容易に計算することができる。同一性を決定する方法は、試験した配列の間の最大のマッチングを与えるようにデザインされる。その上、同一性を決定する方法は、公衆が利用可能なコンピュータープログラム中に編集されている。２つの配列の間の同一性を決定するコンピュータープログラムによる方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J.等、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ(Altschul, S.F.等、J.Molec.Biol. 215:403-410(1990))及びAltschul等、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402(1997))を含むが、これらに、限られない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給者（ＢＬＡＳＴ Manual, Altschul, S.等、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Bethesda, Md. 20894;Altschul, S.等、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)）から公衆に利用可能となっている。周知のSmith Watermanアルゴリズムを利用して同一性を決定することもできる。
【００４０】
用語「含む」は、ここで用いる場合、句「含むが、〜に限られない」を意味し、該句と交換可能に用いられる。
【００４１】
用語「単離された」は、核酸例えばＤＮＡ又はＲＮＡに関してここで用いる場合、天然に存在しない形態の分子を指す。その上、「単離された核酸」は、天然には断片として存在せず且つ自然状態では見出されない核酸断片を含むことを意味する。
【００４２】
用語「メチル化感受性ＰＣＲ」(即ち、ＭＳＰ)は、ここでは、化合物で変換されたテンプレート配列の増幅を行なうポリメラーゼ連鎖反応を指す。２つのプライマーセットを、ＭＳＰで用いるためにデザインする。各プライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。メチル化特異的プライマーと呼ばれる１セットのプライマー(下記参照)は、もしビメンチンＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチド中のＣ塩基がメチル化されているなら、化合物で変換されたテンプレート配列を増幅するであろう。非メチル化特異的プライマーと呼ばれる他のプライマーセット(下記参照)は、ビメンチンＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチド中のＣ塩基がメチル化されていないならば、化合物で変換されたテンプレート配列を増幅するであろう。
【００４３】
ここで用いる場合、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)及び適宜リボ核酸(ＲＮＡ)などのポリヌクレオチドを指す。この用語は又、同等物として、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡ又はＤＮＡの類似体をも包含し、記載した具体例に適用可能であれば、一本鎖(センス又はアンチセンスなど)及び二本鎖ポリヌクレオチドをも包含すると理解されるべきである。
【００４４】
「作動的に結合された」は、２つのＤＮＡ領域間の関係を記載する場合には、単に、それらが互いに機能的に関係していることを意味している。例えば、プロモーター又は他の転写調節配列は、もしコード配列の転写を制御するならば、該コード配列に作動的に結合される。
【００４５】
用語「又は」は、ここでは、用語「及び／又は」を意味するように用いられ、該用語と交換可能に用いられる(文脈的に明らかに違う場合を除く)。
【００４６】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ここでは、交換可能に用いられる。
【００４７】
「試料」は、分子マーカー又は分子マーカー例えばメチル化状態の変化の検出のために得られ又は調製される任意の物質を包含し、又は分子マーカー若しくは分子マーカーの変化の検出の目的のために検出試薬若しくは検出装置と接触される任意の物質を包含する。
【００４８】
「被験者」は、任意の関心ある生物体、一般には哺乳動物被験者例えばマウス好ましくはヒトの被験者である。
【００４９】
ここで用いる場合、用語「特異的にハイブリダイズする」は、この発明の核酸プローブ／プライマーの、標的配列、又はその相補鎖、又はその天然の変異体の少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又は１００個の連続するヌクレオチドにハイブリダイズする能力を指し、それで、標的遺伝子以外の細胞性核酸(例えば、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ)に対する１５％未満の、好ましくは１０％未満の、一層好ましくは５％未満のバックグラウンドハイブリダイゼーションを有する当該能力を指す。様々なハイブリダイゼーション条件を利用して、特異的ハイブリダイゼーションを検出することができ、ストリンジェンシーは、主に、ハイブリダイゼーションアッセイの洗浄段階により決定される。一般に、高温及び低塩濃度は、高いストリンジェンシーを与え、低温及び高塩濃度は、低いストリンジェンシーを与える。低いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、例えば、約２．０×ＳＳＣによる５０℃での洗浄により達成され、高いストリンジェンシーは、約０．２×ＳＳＣによる５０℃での洗浄により達成される。更なるストリンジェンシーの記載は、下記に与える。
【００５０】
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的な配列同一性」は、２つのペプチド配列がデフォルトギャップを利用するプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列させたときに、少なくとも９０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、一層好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性又はそれより高い配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。例えば、類似の化学的特性例えば電荷又は極性を有するアミノ酸の置換が、タンパク質の性質に影響することはありそうにない。例には、アスパラギンに対するグルタミン又はアスパラギン酸に対するグルタミン酸が含まれる。
【００５１】
ここで用いる場合、用語「導入遺伝子」は、それを導入されるトランスジェニック動物又は細胞にとって部分的に又は完全に異質(即ち、外来性)であるか、又は該動物又は細胞の内因性遺伝子にとって同質であるが、該動物のゲノムに該ゲノムを変化させるような仕方(例えば、それは、天然遺伝子とは異なる位置に挿入され又はその挿入がノックアウトを生じるような仕方)で挿入されるようにデザインされ又は挿入されている核酸配列(例えば、ビメンチンポリペプチドをコードする)を意味する。ビメンチン導入遺伝子は、少なくとも一つの転写調節配列及び任意の他の核酸例えばイントロン(選択した核酸の最適な発現に必要でありうる)を含むことができる。ビメンチン導入遺伝子は、ビメンチンヌクレオチド(SEQ ID NO:２)又はその断片を含む。
【００５２】
ＩＩ．概観
ある面において、この発明は、患者が、結腸新生物を有することがありそうであるか、ありそうもないかどうかを決定する方法に関係する。結腸新生物は、結腸内に位置し、又は結腸に由来する、任意の癌性又は前癌性の増殖物である。結腸は、腸管の一部であり、約３フィート長であって、小腸の最後から直腸に至る。横断面で見ると、結腸は、消化された物質が通過する内腔と呼ばれる内部空間を囲む同心環状に配置された４つの識別可能な層からなっている。内腔から外側に向かって順に、これらの層は、粘膜、粘膜下組織、筋層及び漿膜下層と呼ばれている。この粘膜は、上皮層(内腔に隣接する細胞)、基底膜、固有層及び粘膜筋板を含んでいる。一般に、結腸の「壁」は、粘膜下組織及び該組織の外側の層を指すことが意図されている。「裏打ち」は、この粘膜である。
【００５３】
前癌性結腸新生物は、腺腫又は腺腫性ポリープと呼ばれる。腺腫は、典型的には、結腸の裏打ち上の小さいマシュルーム様又はイボ様増殖物であり、結腸壁に侵入しない。腺腫は、結腸内視鏡又は可撓性のＳ字結腸鏡などの装置により見ることができる。幾つかの研究は、腺腫のスクリーニング及び除去を受けた患者は、結腸癌による死亡率が低下することを示した。これ及び他の理由の故に、一般に、腺腫が結腸癌の大部分の真性前駆体であるということは受け入れられている。
【００５４】
結腸新生物が結腸の基底膜に侵入する場合は、それは、結腸癌と考えられる(本願では、用語「結腸癌」を用いるので)。結腸癌の記載において、この明細書は、一般に、いわゆる「Dukes」結腸癌ステージシステムに従う。癌を記載する特徴は、一般に、認識可能なステージを記載するのに用いられる特定の用語より一層重要である。最も広く用いられているステージシステムは、一般に、次の特徴の少なくとも一つを利用する：腫瘍の結腸壁中への貫入の程度(一層大きい貫入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；腫瘍の結腸壁を通っての他の近隣組織への侵入の程度(一層大きい侵入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；腫瘍の局所リンパ節への侵入の程度(一層大きい侵入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；及び一層遠い組織(例えば、肝臓)への転移性侵入の程度(一層大きい転移性の侵入は、一般に、一層危険な病気ステージと相関する)。
【００５５】
「Dukes A」及び「Dukes B」の結腸癌は、結腸壁に侵入したが他の組織には広がっていない新生物である。Dukes A の結腸癌は、粘膜下組織を超えて侵入してない癌である。Dukes B の結腸癌は、２つの群Dukes B１と Dukes B２に細分される。「Dukes B１」結腸癌は、筋層まで侵入しているがそれを通過してない新生物である。Dukes B２結腸癌は、筋層を完全に破っている癌である。５年間にわたって、Dukes Aの癌の外科手術(即ち、患部組織の切除)を受けた患者は、９０％を超える生存率を有している。同じ期間にわたって、Dukes B１及びDukes B２の癌の外科手術を受けた患者は、それぞれ、約８５％及び７５％の生存率を有している。Dukes A、B１及びB２の癌は、Ｔ１、Ｔ２及びＴ３〜Ｔ４の癌とも呼ばれる。
【００５６】
「Dukes C」結腸癌は、局所リンパ節例えば消化管のリンパ節まで広がった癌である。外科治療だけを受けたDukes C の癌患者は、５年にわたる３５％の生存率を有するが、この生存率は、化学療法を受けた患者では６０％まで増加する。
【００５７】
「Dukes D」結腸癌は、他の器官に転移した癌である。肝臓は、転移性結腸癌が見出される最も一般的な臓器である。Dukes D結腸癌の患者は、治療養生法の如何によらず、５年にわたる５％未満の生存率を有する。
【００５８】
一般に、結腸新生物は、染色体不安定性、ミクロサテライト不安定性、及びＣｐＧアイランドメチレーター表現型(ＣＩＭＰ)と呼ばれる少なくとも３つの異なる経路の１つによって発達する。幾らかの重複はあるが、これらの経路は、幾分異なる生物学的挙動を与える傾向がある。腫瘍の発達の経路、関連する標的遺伝子、及び遺伝的不安定の根底にある機構の理解によって、種々の型の結腸新生物を検出して治療するためのストラテジーを実行することが可能である。
【００５９】
この出願は、少なくとも部分的に、ある種の標的遺伝子は、標的遺伝子の５’隣接又はプロモーター領域内のＣｐＧアイランドの差次的メチル化によって、サイレンシング又は不活性化することができるという認識に基づいている。ＣｐＧアイランドは、ＤＮＡ配列中のシトシン−グアニン残基のクラスターであり、これは、我々のゲノムにおいて、約半分の遺伝子の５’隣接領域又はプロモーター領域内に顕著に表れる。特に、この出願は、少なくとも部分的に、ビメンチンヌクレオチド配列の差次的メチル化は結腸新生物を示すことができるという認識に基づいている。一面において、この出願は、ビメンチン遺伝子が、癌細胞(例えば、結腸新生物)におけるメチル化及び後成的遺伝子サイレンシングの一般的標的でありえて、候補の腫瘍抑制遺伝子として機能しうることを開示する。
【００６０】
ビメンチンは、細胞質の中間径フィラメント(ＩＦ)を形成する細胞骨格タンパク質の一つである。細胞骨格は、マイクロフィラメント、微小管、及び中間径フィラメント３つの異なるクラスからなる。中間径フィラメントは、高等真核生物の細胞骨格の腫瘍成分である。ビメンチンは、繊維芽細胞及び内皮細胞などの間充織細胞に特徴的なＩＦタンパク質である(例えば、Evans, 1998, BioEssays, 20:79-86参照)。ビメンチンの発現は、発生において調節され、これは、このタンパク質の細胞内の足場としての役割以外の重要な機能を示唆している。ビメンチンは、ｃ−ｆｏｓ、ｆｒａ１、ＣＲＥＢ及びｃ−ｊｕｎなどのある種の転写因子のＤＮＡ結合領域と構造的配列類似性を共有しており、これは、ビメンチンの調節的役割を更に示唆している(例えば、Capetanaki等、1990, Oncogene, 5:645-655参照)。最近、ビメンチンが、サイトゾルホスホリパーゼＡ２の機能的核周囲アダプターとして作用するということが示され、これは、プロスタグランジンの生合成の調節におけるビメンチンＩＦの役割を示唆している(例えば、Murakami等、2000, Biochem Biophys Acta, 1488:159-66参照)。幾つかのタンパク質は、ビメンチンとの幾らかの相互作用を有するとして報告されている：例えば １）フィラメント結合タンパク質例えばプレクチン及びＩＡＦ−３００(Svitkina等、1996, J Cell Biol, 135:991-1007；Yang等、1985, J Cell Biol, 100:620-631)；２）シャペロンタンパク質例えばＨｓｃ７０及びアルファ−クリスタリン(Lee等、1995, J Cell Biol, 57:150-162；Nicholl等、1994, EMBO J, 13:945-953)；３）キナーゼ例えばプロテインキナーゼＣ(ＰＫＣ)、ｃＧＭＰキナーゼ及びＹｅｓキナーゼ(Murti等、1992, Exp Cell Res, 202:36-44；Owen等、1996, Exp Cell Res, 225:366-373；Pryzwansky等、1995, Blood, 85:222-230；Ciesielski-Treska等、1996, Eur J Cell Biol, 68:369-376)。加えて、ビメンチンの１４−３−３タンパク質との会合を、ホスファターゼインヒビターカリクレインＡによる処理により誘導することができる(Tzivion等、2000, J Biol Chem, 275:29772-8)。１４−３−３タンパク質は、それらの標的に、該標的タンパク質上に存在する特異的なセリン／スレオニンリン酸化モチーフによって結合する。この結合が、シグナル変換及び細胞周期の制御に関与する様々なキータンパク質のリン酸化依存性の調節において決定的なステップであることはありそうなことである。更に、Ｃｄｃ４２Ｈ及びＲａｃ１ ＧＴＰアーゼ(２つのＲｈｏファミリーメンバー)は、チロシンリン酸化事象を含むビメンチンＩＦの組織化を制御することができるということが示されている。例えば、活性なＣｄｃ４２Ｈ及びＲａｃ１の発現は、核周囲の崩壊を示すＩＦネットワークの再編成へと導いた(Meriane等、2000, J Biol Chem, 275:33046-52)。
【００６１】
上記のように、結腸新生物の初期の検出は、適当な介入と共に、患者の生存率の増加のために重要である。現在の結腸新生物をスクリーニングするためのシステムは、特異性及び／又は感度の欠如(例えば、便潜血試験、可撓性Ｓ字結腸鏡検査)又は高いコスト及び医用資源(例えば、結腸鏡検査)の集中的利用を含む様々な理由の故に、不十分なものである。結腸新生物の検出のための別のシステムは、広範な他の臨床環境でも有用であろう。例えば、結腸癌の外科手術及び／又は薬物療法を受ける患者は、再発を経験しうる。かかる患者が、再発した結腸新生物を有するかどうかを測定する別のシステムを有することは有利であろう。更なる例として、別の診断システムは、結腸新生物を有することが知られた患者における結腸新生物の増減又は残存の監視を容易にするであろう。化学療法を受ける患者を監視して、該両方の効力を評価することができる。
【００６２】
ＩＩＩ．ビメンチンの核酸、ポリペプチド、及び抗体
本発明は、少なくとも部分的に、ビメンチンのヌクレオチド配列は、ある種のビメンチン関連新生物例えば結腸新生物において、差次的にメチル化されるという観察に基づいている。一面において、この出願は、ビメンチン関連新生物において差次的にメチル化されるある領域を有するビメンチンのヌクレオチド配列例えばSEQ ID NO:２及び４５並びにそれらの断片を開示する。従って、一具体例において、この出願は、差次的にメチル化された核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である単離された又は組換えにより生成されたヌクレオチド配列を提供する(ここに、差次的メチル化核酸配列の何れか一つにおけるメチル化の検出は、ビメンチン関連新生物例えば結腸新生物を示す)。当業者は、SEQ ID NO:２及び４５並びにそれらの変異体と相補的なビメンチン核酸配列も又、この発明の範囲内にあることを認めるであろう。かかる変異体ヌクレオチド配列は、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加又は欠失により異なる配列例えばアレル変異体を包含する。
【００６３】
更に別の具体例において、ビメンチンヌクレオチド配列は又、高度にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:２又は４５に示したヌクレオチド配列並びにそれらの断片とハイブリダイズするヌクレオチド配列をも包含する。上記のように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件が変化しうることを容易に理解するであろう。例えば、ハイブリダイゼーションを、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)で、約４５℃で行なってから、２．０×ＳＳＣで、５０℃での洗浄を行なうことができる。例えば、洗浄ステップでの塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ(５０℃)の低ストリンジェンシーから約０．２×ＳＳＣ(５０℃)の高ストリンジェンシーから選択することができる。加えて、洗浄ステップの温度は、室温(約２２℃)の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増大させることができる。温度と塩の両方を変えることもできるし、又は温度若しくは塩濃度を一定に維持しつつ他の変数を変えることもできる。一具体例において、この発明は、６×ＳＳＣ(室温)の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸(ハイブリダイズ後、室温で２×ＳＳＣで洗浄する)を提供する。
【００６４】
更に別の面において、この出願は、SEQ ID NO:２若しくは４５又はこれらの断片のヌクレオチド配列のメチル化形態(該配列中に存在するＣｐＧアイランドのシトシン塩基はメチル化されている)を提供する。換言すれば、これらのビメンチンヌクレオチド配列は、メチル化された状態(例えば、ビメンチン関連新生物で見られるように)であってもよいし、メチル化されていない状態(例えば、正常細胞で見られるように)であってもよい。更なる具体例において、この発明のビメンチンヌクレオチド配列は、単離することができ、組換えによるものであってよく、及び／又は異質ヌクレオチド配列と融合したものであってよいし、或はＤＮＡライブラリー中にあってもよい。
【００６５】
差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列に加えて、構成的にメチル化されたヌクレオチド配列も又、ビメンチン配列中に存在する(例えば、Ａｌｕリピート及びＣ領域内のＡｌｕでない構成的にメチル化された領域)。構成的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列は、正常細胞及び癌細胞の両方でメチル化されているので、当業者は、ここに与えたように差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列を検出することの重要性を認めるであろう。
【００６６】
ある具体例において、本発明は、重亜硫酸塩変換されたビメンチンテンプレートＤＮＡ配列例えばSEQ ID NO:３〜４、６〜７、４６〜４７及び４９〜５０並びにこれらの断片を提供する。かかる重亜硫酸塩変換されたビメンチンテンプレートＤＮＡは、例えばＭＳＰ反応により又は直接的配列決定によって、メチル化状態の検出に利用することができる。これらの重亜硫酸塩変換されたビメンチン配列は又、重亜硫酸塩変換後に、メチル化又は非メチル化ビメンチンテンプレートを特異的に検出するＭＳ−ＰＣＲ反応用のプライマーのデザインにも有用である。更に別の具体例において、この発明の重亜硫酸塩変換されたビメンチンヌクレオチド配列は又、高度にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:３〜４、６〜７、４６〜４７及び４９〜５０から選択する任意のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列をも包含する。
【００６７】
更なる面において、この出願は、かかる重亜硫酸塩変換されたヌクレオチド配列を製造する方法を提供し、例えば、この出願は、ヌクレオチド配列を、重亜硫酸塩剤で処理し、それで、非メチル化シトシン塩基が異なるヌクレオチド塩基例えばウラシルに変換される方法を提供する。
【００６８】
更に別の面において、この出願は、SEQ ID NO:８〜３９の何れか一つ又は図３５に列記した何れか一つのビメンチン核酸配列内の領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。ある面において、一対のオリゴヌクレオチドプライマー(例えば、SEQ ID NO:８〜１３)は、検出アッセイ例えばＨｐａＩＩアッセイにおいて利用することができる。ある面において、ＭＳＰ反応で利用するプライマーは、特異的に、メチル化ビメンチンＤＮＡと非メチル化ビメンチンＤＮＡ(例えば、SEQ ID NO:１４〜３９又は図３５に列記したプライマー)を識別することができる。
【００６９】
この発明のプライマーは、ビメンチン核酸の増幅の特異的な開始を与えるのに、十分な長さ及び適当な配列を有している。この発明のプライマーは、増幅すべきビメンチン核酸配列の各鎖に「実質的に」相補的であるようにデザインされる。典型的プライマーは、SEQ ID NO:８〜３９及び図３５に与えてあるが、SEQ ID NO:２又は４５の重亜硫酸塩変換されたビメンチン配列とハイブリダイズする任意のプライマーは、この発明の範囲内に含まれ且つ上記のように、メチル化核酸を検出するためのこの発明の方法において有用であるということは理解される。同様に、SEQ ID NO:２又は４５の差次的メチル化領域内のメチル化感受性制限部位を増幅するのに役立つであろう任意のプライマーが、この発明の範囲内に含まれること及びそれが、記載したように、メチル化核酸の検出のためのこの発明の方法において有用であるということは理解される。
【００７０】
この発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の適当な方法例えば慣用のホスホトリエステル及びホスホジエステル法又はその自動化された具体例を利用することにより、製造することができる。かかる自動化された具体例の一つにおいて、ジエチルホスホルアミダイトが、出発物質として利用され、Beaucage等により記載されたように合成することができる(Tetrahedron Letters, 22:1859-1862, 1981)。改変固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成のための一つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【００７１】
この出願で利用した様々な配列同定番号(配列番号)を下記の表Ｉにまとめた。
【００７２】
【表１−１】
【００７３】
【表１−２】
【００７４】
ある別の面において、この発明は、SEQ ID NO:１のビメンチンポリペプチドをコードするビメンチン核酸及びその変異体と関係する。変異体は、少なくとも一つのヌクレオチドの置換、付加又は欠失によって異なる配列(アレル変異体など)を含み、それ故、このコード配列のヌクレオチド配列と、例えば遺伝コードの縮重のために異なるコード配列を含む。ある具体例において、変異型核酸は、高度にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:１をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列をも含む。
【００７５】
遺伝コードの縮重のためにSEQ ID NO:１をコードする核酸と異なる単離されたビメンチン核酸も又、この発明の範囲内にある。例えば、幾らかのアミノ酸は、一つより多くのトリプレットにより示される。同じアミノ酸を特定するコドン、即ちシノニム(例えば、CAUとCACは、ヒスチジンに対するシノニムである)は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じうる。しかしながら、主題のタンパク質のアミノ酸配列の変化へと導くＤＮＡ配列の多型が哺乳動物細胞中に存在するであろうことは予想される。当業者は、これらの、特定のタンパク質をコードする核酸の少なくとも１ヌクレオチド(最大でヌクレオチドの約３〜５％)の変異が、所定の種の個体中に、自然のアレル変異のために存在しうることを認めるであろう。任意の及びすべてのかかるヌクレオチド変異及びその結果生じるアミノ酸多型は、この発明の範囲内にある。
【００７６】
ある具体例において、組換えビメンチン核酸は、発現用構築物において、少なくとも１つの調節用ヌクレオチド配列と作動的に結合させることができる。調節用ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために用いる宿主細胞に適している。様々な宿主細胞用の、多くの種類の適当な発現ベクター及び適当な調節用配列が、当分野では知られている。典型的には、該少なくとも一つの調節用ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結用配列、翻訳開始及び終結用配列ならびにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれうるが、これらに限られない。当分野で公知の構成的又は誘導性プロモーターは、この発明により企図される。これらのプロモーターは、天然のプロモーターであってもよいし、一つより多くのプロモーターのエレメントを合わせたハイブリッドプロモーターであってもよい。発現用構築物は、細胞内で、エピソーム上にプラスミドとして存在しうるし、又は染色体中に組み込まれることもできる。好適具体例において、この発現ベクターは、トランスフォームされた宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、当分野で周知であり、用いる宿主細胞によって変化する。
【００７７】
ある面において、この発明は、ここに記載のビメンチンポリペプチド(SEQ ID NO:１)及びその変異体ポリペプチドに関係する。ある具体例において、変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO:１に示したアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する。他の具体例において、この変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO:１に示したアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７８】
ある面において、変異型ビメンチンポリペプチドは、SEQ ID NO:１に示したビメンチンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストである。これらのポリペプチドの変異体は、過度の又は構成的な活性を有しうるし、或は、ビメンチンの腫瘍抑制性を妨げうる。例えば、少なくとも一つのドメインを欠く先端切除型は、優性ネガティブ効果を有しうる。
【００７９】
ある面において、ビメンチンポリペプチドの単離されたペプチド性部分は、SEQ ID NO:１に示したポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えにより生成したポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、断片は、当分野で公知の技術例えば慣用のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学を利用して、化学合成することができる。これらの断片を生成し(組換えにより又は化学合成によって)、試験して、ビメンチンの腫瘍抑制機能のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能しうるペプチド性断片を同定することができる。
【００８０】
ある面において、様々なビメンチンポリペプチドは、少なくとも一つの融合ドメインを含む。かかる融合ドメインの周知の例には、例えば、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＣ、及び免疫グロブリン重鎖定常領域(Ｆｃ)、マルトース結合性タンパク質(ＭＢＰ)が含まれ、これらは、融合ポリペプチドのアフィニティークロマトグラフィーによる単離に特に有用である。アフィニティー精製の目的のためには、アフィニティークロマトグラフィー用の適当なマトリクス例えばグルタチオン−、アミラーゼ−、及びニッケル−又はコバルト−結合された樹脂を利用する。多くのかかるマトリクスは、(HIS6)融合パートナーを利用すると有用であるPharmacia GST 精製システム及びQIAexpress(商標)システム(Qiagen)などの「キット」形態で入手可能である。当分野で周知の他の融合ドメインは、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)である。この融合パートナーは、蛍光「タグ」として役立ち、これは、この発明の融合ポリペプチドを、蛍光顕微鏡により又はフローサイトメトリーによって同定することを可能にする。このＧＦＰタグは、融合ビメンチンポリペプチドの細胞内局在性を評価する場合に、有用である。このＧＦＰタグは又、融合ビメンチンポリペプチドを発現する細胞の、蛍光活性化セルソーティング(ＦＡＣＳ)などのフローサイトメトリー法による単離にも有用である。融合ドメインは又、「エピトープタグ」をも包含し、これらは、通常、短いペプチド配列であって、それらに対する特異的モノクローナル抗体を利用することができる。特異的モノクローナル抗体を容易に利用することのできる周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(ＨＡ)、及びｃ−ｍｙｃタグが含まれる。幾つかの場合に、これらの融合ドメインは、適当なプロテアーゼが融合ビメンチンポリペプチドを部分消化し、それにより組換えポリペプチドがそこから遊離することを可能にするプロテアーゼ開裂部位(例えば、因子Ｘａ又はトロンビン用)を有する。遊離したポリペプチドは、その後、融合パートナーから、引き続いてのクロマトグラフィーによる分離によって単離することができる。
【００８１】
この発明の他の面は、ビメンチンポリペプチドのエピトープと特異的に免疫反応性の単離された抗体と関係する。例えば、ビメンチンポリペプチドに由来する免疫原を利用することにより(例えば、ｃＤＮＡ配列に基づいて)、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体を、標準的プロトコール(例えば、Antibodies：A Laboratory Manual Harlow及びLane編(Cold Spring Harbor Press: 1988)参照)により作成することができる。哺乳動物例えばマウス、ハムスター又はウサギを、ビメンチンペプチドの免疫原型で免疫化することができる。タンパク質又はペプチドに免疫原性を与えるための技術には、キャリアーへの結合又は他の当分野で周知の技術が含まれる。ポリペプチドの免疫原性部分をアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価の検出によりモニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡ又は他の免疫アッセイを、免疫原を抗原として利用して、抗体レベルを評価することができる。
【００８２】
ある具体例において、この発明の抗体は、ビメンチン関連疾患の検出又は治療のための診断剤又は治療剤として有用でありうる。
【００８３】
用語「抗体」は、ここで用いる場合、ビメンチンポリペプチドの一つとやはり特異的に反応するその断片を包含することを意図している。抗体は、慣用の技術を利用して、断片化することができ、それらの断片は、有用性について、全抗体について上記したものと同じ仕方でスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ab)2断片は、抗体をパパインで処理することにより生成することができる。その結果生成したＦ(ab)2断片を、ジスルフィドブリッジを還元するように処理して、Ｆab断片を生成することができる。この発明の抗体は、更に、ビメンチンタンパク質に対する親和性を有する複特異性、一本鎖、並びにキメラ及びヒト化分子を含むことを意図している。好適具体例において、この抗体は、更に、それに結合されて検出されうる標識(例えば、この標識は、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素又は酵素の補因子であってよい)をも含む。
【００８４】
ＩＶ．アッセイ及び薬物スクリーニング方法論
ある面において、この出願は、ビメンチンヌクレオチド配列を、健康な細胞とビメンチン関連疾患の細胞を識別する分子マーカーとして利用するアッセイ及び方法を提供する。例えば、一具体例において、この出願は、ビメンチンヌクレオチド配列を、健康な細胞と結腸新生物細胞を識別するマーカーとして利用する方法及びアッセイを提供する。一面において、この発明の分子マーカーは、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列である。他の面において、ここに与える他のマーカーは、ビメンチン遺伝子の発現産物である。
【００８５】
ある具体例において、この発明は、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列例えばＢ及びＣ領域内に見られる差次的メチル化パターン(例えば、SEQ ID NO:４５)を検出するためのアッセイを提供する。従って、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列は、そのメチル化状態において、ビメンチン関連新生物特異的改変でありうる(それは、ここに記載した様々な方法及び、この出願の教示の故に、当業者の知識範囲の内にある方法を利用する検出のための標的として役立つ)。
【００８６】
ある面において、メチル化ビメンチンヌクレオチド配列を検出するためのかかる方法は、ビメンチンのゲノムＤＮＡの、非メチル化Ｃを異なるヌクレオチド塩基に変換するが、メチル化Ｃ(即ち、５ｍＣ)は変換しない化学化合物での処理に基づいている。一つのかかる化合物は、重亜硫酸ナトリウムであり、これは、ＣをＵに変換するが、５ｍＣは変換しない。ＤＮＡの重亜硫酸塩での処理方法は、当分野で公知である(Herman等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93:9821-6；Herman及びBaylin, 1998, Current Protocols in Human Genetics, N.E.A. Dracopoli編、John Wiley & Sons, 2:10.6.1-10.6.10；米国特許第５，７８６，１４６号)。説明のために、非メチル化Ｃヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を重亜硫酸ナトリウムで処理して化合物変換されたＤＮＡとする場合には、そのＤＮＡの配列は、変化する(Ｃ→Ｕ)。変換されたヌクレオチド配列中のＵの検出は、非メチル化Ｃを示す。
【００８７】
化合物変換されたヌクレオチド配列中に存在する異なるヌクレオチド塩基(例えば、Ｕ)は、その後、様々な方法で検出することができる。好適具体例において、本発明は、化合物変換されたビメンチンＤＮＡ配列中のＵを、「メチル化感受性ＰＣＲ」(ＭＳＰ)を利用することにより検出する方法を提供する(例えば、Herman等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93:9821-9826；米国特許第６，２６５，１７１号；米国特許第６，０１７，７０４号；米国特許第６，２００，７５６号参照)。ＭＳＰにおいて、一組のプライマー(即ち、フォワード及びリバースプライマー)は、この化合物変換されたテンプレート配列を、もしビメンチンＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されているなら、増幅する。このプライマーのセットは、「メチル化特異的プライマー」と呼ばれる。他のプライマーのセットは、化合物変換されたテンプレート配列を、もしビメンチン５’隣接配列中のＣｐＧジヌクレオチド内のＣ塩基がメチル化されてないならば、増幅する。このプライマーのセットは、「非メチル化特異的プライマー」と呼ばれる。
【００８８】
ＭＳ−ＰＣＲにおいて、これらの反応は、被験者の試料由来の化合物変換されたＤＮＡを利用する。ビメンチンメチル化ＤＮＡのアッセイにおいては、メチル化特異的プライマーを利用する。そのＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチド中のＣがメチル化されている場合には、これらのメチル化特異的プライマーは、化合物変換されたテンプレート配列をポリメラーゼの存在下で増幅し、ＭＳＰ産物が生成されるであろう。もしＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチド中のＣがメチル化されていなければ、メチル化特異的プライマーは、ポリメラーゼの存在下でも化合物変換されたテンプレートを増幅せず、ＭＳＰ産物も生成されないであろう。
【００８９】
非メチル化ビメンチンＤＮＡの検出のために対照用反応を行なうことは、やはり、しばしば有用である。これらの反応は、被験者の試料由来の化合物変換されたＤＮＡを利用し、非メチル化特異的プライマーを利用する。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチド中のＣがメチル化されていない場合には、非メチル化特異的プライマーは、ポリメラーゼの存在下で化合物変換されたテンプレート配列を増幅して、ＭＳＰ産物が生成されるであろう。もしＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチド中のＣがメチル化されていれば、非メチル化特異的プライマーは、ポリメラーゼの存在下でも化合物変換されたテンプレート配列を増幅せず、ＭＳＰ産物は、生成されないであろう。生物学的試料は、しばしば、メチル化特異的プライマーによりシグナルを生じる新生物細胞と、非メチル化特異的プライマーによりシグナルを生じる正常細胞エレメントの両方の混合物を含むことに注意されたい。非メチル化特異的シグナルは、しばしば、対照用反応として有用であるが、この場合は、メチル化特異的プライマーを利用する反応に由来する陽性シグナルにより示されるように、結腸新生物の非存在を意味しない。
【００９０】
ＭＳＰ反応のためのプライマーは、化合物変換されたビメンチンテンプレート配列から導かれる。ここでは、「から導かれる」は、それらのプライマーの配列が、化合物変換されたテンプレート配列をＭＳＰ反応において増幅するように選択されることを意味する。各プライマーは、少なくとも８ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡ断片を含む。好ましくは、これらのプライマーは、５０ヌクレオチド長未満であり、一層好ましくは、１５〜３５ヌクレオチド長である。化合物変換されたビメンチンテンプレート配列は、重亜硫酸ナトリウムで処理される二本鎖ＤＮＡのワトソン鎖又はクリック鎖の何れであってもよいので、これらのプライマーの配列は、ワトソン又はクリック化合物変換されたテンプレート配列の何れが、ＭＳＰにおいて増幅するために選択されるかどうかに依存している。ワトソン又はクリック鎖の何れも、増幅するために選択することができる。
【００９１】
この化合物変換されたビメンチンテンプレート配列(及び、それ故、ＭＳＰ反応の産物)は、２０〜３０００ヌクレオチド長、好ましくは５０〜５００ヌクレオチド長、一層好ましくは８０〜１５０ヌクレオチド長であってよい。好ましくは、これらのメチル化特異的プライマーは、非メチル化特異的プライマーにより生成されたＭＳＰ産物とは異なる長さのＭＳＰ産物を生じる。
【００９２】
様々な方法を利用して、ＭＳＰ産物が、反応アッセイにおいて生成されたかどうかを決定することができる。ＭＳＰ産物がこの反応アッセイで生成されたかどうかを決定するための一つの方法は、その反応の一部分をアガロースゲル電気泳動によって分析することである。例えば、０．６〜２．０％アガロースの水平アガロースゲルを作成して、ＭＳＰ反応混合物の一部分を、そのアガロースゲル中を電気泳動させる。ＭＳＰ産物は、紫外光によるイルミネーション中に見れば、可視的である。標準化したサイズマーカーとの比較により、ＭＳＰ産物が、正しい予想されたサイズのものであるかどうかを決定することができる。
【００９３】
他の方法を利用して、産物がＭＳＰ反応において作られたかどうかを決定することもできる。一つのかかる方法は、「リアルタイムＰＣＲ」と呼ばれる。リアルタイムＰＣＲは、螢光計(即ち、蛍光を測定する機器)を組み込んだサーマルサイクラー(即ち、ＰＣＲ反応に必要な温度変化を与える機器)を利用する。このリアルタイムＰＣＲ反応用混合物は又、産物への組込みを定量することができて、その定量がテンプレート中のその配列のコピー数を示す試薬をも含有する。一つのかかる試薬は、選択的に二本鎖ＤＮＡに結合して、その蛍光が二本鎖ＤＮＡに結合することによって大幅に増強されるＳＹＢＲグリーンＩ(Molecular Probes, Inc.; オレゴン、Eugene在)と呼ばれる蛍光染料である。ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲグリーンＩの存在下で行なう場合には、その結果生成したＤＮＡ産物は、ＳＹＢＲグリーンＩに結合して、蛍光を生じる。この蛍光は、蛍光計によって検出されて定量される。かかる技術は、ＰＣＲ反応における産物の量の定量に特に有用である。加えて、このＰＣＲ反応の産物は、「リアルタイムＰＣＲ」において、その産物にハイブリダイズする様々なプローブ(ＴａｑＭａｎプローブ及び分子ビーコンを含む)を利用して定量することができる。測定は、絶対的基礎の上にあってよいし、又は構成的にメチル化されたＤＮＡ鎖に対して相対的なものであってもよいし、又はメチル化されてないＤＮＡ鎖に対するものであってもよい。一例において、メチル化ビメンチン由来の産物の非メチル化由来のビメンチン産物に対する比を構築することができる。
【００９４】
この発明においてビメンチンＤＮＡのメチル化を検出する方法は、ＭＳＰに限られず、ＤＮＡのメチル化を検出するための任意のアッセイをカバーすることができる。ビメンチンＤＮＡのメチル化を検出するための他の例の方法は、「メチル化感受性」制限エンドヌクレアーゼの利用によるものである。かかる方法は、被験者から単離したゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理してからその制限エンドヌクレアーゼ処理したＤＮＡをＰＣＲ反応においてテンプレートとして利用することを含む。ここでは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ中の特異的配列を認識して、もし認識配列中のＣ塩基がメチル化されてなければ開裂させる。もしこの制限エンドヌクレアーゼの認識配列中のＣ塩基がメチル化されていれば、そのＤＮＡは開裂されない。かかるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの例には、ＨｐａＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩＩ、ＥａｇＩ、ＭｓｐＩ、ＢｓｔＵＩ及びＢｓｓＨＩＩが含まれるが、これらに限られない。この技術において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのための認識配列は、テンプレートＤＮＡ中に、ＰＣＲ反応に利用されるフォワード及びリバースプライマーの間に位置している。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ認識配列中のＣ塩基がメチル化されていない場合には、該エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡテンプレートを開裂し、該ＰＣＲ反応において該ＤＮＡがテンプレートとして利用された場合にはＰＣＲ産物は形成されないであろう。このメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ認識配列中のＣ塩基がメチル化されている場合には、該エンドヌクレアーゼは、該ＤＮＡテンプレートを開裂せず、該ＤＮＡがＰＣＲ反応においてテンプレートとして利用された場合にはＰＣＲ産物が形成されるであろう。それ故、Ｃ塩基のメチル化は、ＰＣＲ産物の存否によって測定されうる(Kane等、1997, Cancer Res, 57:808-11)。この技術では、重亜硫酸ナトリウムは、利用しない。
【００９５】
ビメンチンＤＮＡのメチル化を検出するための、更に別の典型的方法は、改変ＭＳＰと呼ばれ、この方法は、ＭＳＰ反応の産物が、化合物変換されたテンプレート配列がＣｐＧジヌクレオチドを含むかＵｐＧジヌクレオチドを含むかに依って、制限エンドヌクレアーゼによる消化を受けることができるようにデザインされて選ばれたプライマーを利用する。
【００９６】
ビメンチンＤＮＡのメチル化を検出するための更に別の方法には、ＭＳ−ＳｎｕＰＥ法が含まれる。この方法は、化合物変換されたビメンチンＤＮＡを、プライマー伸長反応におけるテンプレートとして利用し、該反応において、利用したプライマーは、産物を、化合物変換されたテンプレートがＣｐＧジヌクレオチドを含むかＵｐＧジヌクレオチドを含むかに依存して生成する(例えば、Gonzalgo等、1997, Nucleic Acids Res., 25:2529-31参照)。
【００９７】
ビメンチンＤＮＡのメチル化を検出するための別の典型的な方法は、ＣＯＢＲＡ(即ち、combined bisulfite restriction analysis)と呼ばれる。この方法は、ＤＮＡのメチル化の検出のために日常的に用いられてきており、当分野で周知である(例えば、Xiong等、1997, Nucleic Acids Res, 25:2532-4参照)。
【００９８】
ある具体例において、この発明は、ＭＳＰ反応から生成した産物を直接配列決定して、化合物変換されたビメンチンテンプレート配列がＣｐＧジヌクレオチドを含むのかＵｐＧジヌクレオチドを含むのかを決定することを含む方法を提供する。分子生物学の技術例えばＰＣＲ産物の直接的配列決定は、当分野で周知である。
【００９９】
別の具体例において、当業者は、本発明が、部分的に、ビメンチンは、腫瘍抑制遺伝子として機能しうるという認識に基づいていることを認めるであろう。従って、ある面において、この発明は、健康な細胞とビメンチン関連疾患の細胞例えば結腸新生物細胞を識別する分子マーカーを検出するためのアッセイを提供する。上記のように、本願の分子マーカーの一つは、メチル化ビメンチンヌクレオチド配列を含む。従って、一具体例において、このビメンチンヌクレオチド配列のメチル化状態のアッセイは、ビメンチンサイレンシング関連疾患の検出のために、モニターすることができる。
【０１００】
この出願は、更に、別の分子マーカーであるビメンチン遺伝子の発現転写物又は遺伝子産物をも提供する。従って、他の具体例において、このビメンチン核酸又はタンパク質の発現を、ビメンチンサイレンシング関連疾患例えば結腸新生物の検出のために、モニターすることができる。
【０１０１】
ある具体例において、この発明は、患者が病気を有するかどうかを決定するために、上記のビメンチン分子マーカーをアッセイすることによる検出方法を提供する。更に、かかる病気は、ここに記載のビメンチン核酸又はタンパク質の減少した発現により特徴付けることができる。ある具体例において、この発明は、患者がビメンチン関連疾患を有することがありそうなことであるかどうかを、ビメンチンヌクレオチド配列の発現を検出することによって決定する方法を提供する。更なる具体例において、この発明は、患者が再発を有するかどうか又は患者の癌が治療に応答性であるかどうかを決定する方法を提供する。
【０１０２】
好適具体例において、この出願は、結腸新生物を検出する方法を提供する。ある具体例において、本発明は、ビメンチン遺伝子のサイレンシングと関連する結腸新生物を検出する方法を提供する。かかる方法は、メチル化されたビメンチンヌクレオチド配列の、被験者から得られた試料における存在についてアッセイすることを含む。他の面において、この発明は、患者が、結腸癌を有することがありそうかどうかを決定する方法と関係する。更なる面において、この発明は、被験者における結腸新生物をモニターする方法と関係する。
【０１０３】
ある具体例において、この発明は、ここに記載のビメンチンタンパク質又は核酸転写物を検出するためのアッセイを提供する。ある具体例において、この発明の方法は、生物学的試料を用意して、その生物学的試料を、ビメンチンの発現(ビメンチンのタンパク質又は核酸転写物を含む)につきプローブ検出することを含む。ビメンチンの発現状態(及び、適宜、ビメンチン発現の定量的レベル)に関する情報は、次いで、生物学的試料の性質に関する推論を引き出すために利用することができ、もしその生物学的試料が被験者から得られたものであるならば、その被験者の健康状態に関する推論を引き出すために利用することができる。
【０１０４】
ある具体例において、この発明の方法は、試料中のビメンチンタンパク質の存在を検出することを含む。適宜、この方法は、試料中のビメンチンタンパク質の定量的測定を得ることを含む。この明細書の故に、当業者は、他の泊質の存在を検出し、適宜、定量するために利用することのできる広範な技術を認識するであろう。好適具体例において、ビメンチンタンパク質は、抗体により検出される。多くの具体例において、抗体ベースの検出アッセイは、試料と抗体を接触させ、それで、該抗体が、対応するエピトープを有するタンパク質と結合する機会を有するようにすることを含む。多くの具体例において、抗体ベースの検出アッセイは又、典型的には、抗体エピトープ複合体の存在を検出し、それにより、対応するエピトープを有するタンパク質の存在の検出を達成するためのシステムをも含む。抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、免疫沈降、ウエスタンブロットを含む様々な検出技術において利用することができる。タンパク質の同定のための、抗体に依存しない技術も又、利用することができる。例えば、質量分析(特に、液体クロマトグラフィーと組み合せたもの)は、試料中の多数のタンパク質の検出と定量を可能にする。２次元ゲル電気泳動も又、タンパク質を同定するために利用することができ、質量分析又は他の検出技術例えばＮ末端タンパク質配列決定法と組み合せることができる。関心あるタンパク質に対する特異的結合を有するＲＮＡアプタマーも又、生成して、検出用試薬として利用することができる。
【０１０５】
試料は、一般に、用いる検出システムと一致する仕方で調製すべきである。例えば、タンパク質検出システムで利用される試料は、一般に、プロテアーゼの非存在下で調製すべきである。同様に、核酸検出システムで利用する試料は、一般に、ヌクレアーゼの非存在下で調製すべきである。多くの場合に、抗体ベースの検出システムで利用するための試料は、実質的な製造工程にかけられないであろう。例えば、尿は、唾液及び血液のように、直接利用されうる(血液は、ある種の好適具体例においては、血漿及び血清などの画分に分離されるが)。
【０１０６】
ある具体例において、この発明の方法は、試料中のビメンチンの発現された核酸例えばｍＲＮＡの存在を検出することを含む。適宜、この方法は、試料中のビメンチンの発現された核酸の定量的測定を得ることを含む。この明細書の故に、当業者は、核酸の存在を検出し、適宜、定量するために利用できる広範な技術を認めるであろう。核酸検出システムは、一般に、試料の精製核酸画分を調製すること、及び試料を直接検出アッセイ又は増幅工程とその後の検出アッセイにかけることを含む。増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写酵素(ＲＴ)及び結合させたＲＴ−ＰＣＲによって達成することができる。核酸の検出は、一般に、精製核酸画分を、関心ある核酸にハイブリダイズするプローブでプローブ検出することによって達成され、多くの場合に、検出は、増幅をも包含する。ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲは、すべて、試料中の核酸を検出するための周知の方法である。
【０１０７】
ある具体例において、この発明は、ビメンチン核酸に特異的に結合する核酸プローブを提供する。かかるプローブは、例えば、蛍光性成分、放射性核種、酵素又は親和性タグ例えばビオチン成分によって標識することができる。例えば、ＴａｑＭａｎ(登録商標)システムは、プローブが遊離のときに蛍光シグナルが消光し、一層大きい核酸に組み込まれたときに輝くような仕方で標識した核酸プローブを利用する。
【０１０８】
ビメンチンマーカーに向けられたモノクローナル抗体を利用するイムノシンチグラフィーを利用して、癌を検出及び／又は診断することができる。例えば、99テクネチウム、111インジウム、125ヨウ素で標識したビメンチンマーカーに対するモノクローナル抗体は、かかるイメージングに効果的に利用することができる。当業者には明らかとなるであろうが、投与すべき放射性同位体の量は、放射性同位体に依存している。当業者は、投与すべきイメージング剤の量を、活性成分として利用する所与の放射性核種の比放射能及びエネルギーに基づいて、容易に配合することができる。典型的には、投与量当たり０．１〜１００ミリキュリー、好ましくは、１〜１０ミリキュリー、最もしばしば、２〜５ミリキュリーのイメージング剤を投与する。従って、放射性成分と結合された標的成分を含むイメージング剤として有用な本発明の組成物は、０．１〜１００ミリキュリーを、幾つかの具体例において好ましくは１〜１０ミリキュリーを、幾つかの具体例において好ましくは２〜５ミリキュリーを、幾つかの具体例において一層好ましくは１〜５ミリキュリーを含む。
【０１０９】
ある具体例において、本発明は、ビメンチン遺伝子の腫瘍抑制機能を強化する試験化合物を同定するための薬物スクリーニングアッセイを提供する。一面において、これらのアッセイは、ビメンチンの発現レベルを強化する試験化合物を検出する。他の面において、これらのアッセイは、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化を阻止する試験化合物を検出する。ある具体例において、試験化合物を、それらの、ビメンチンポリペプチドの安定性又は機能に干渉する能力に基づいて検出する薬物スクリーニングアッセイを生成することができる。或は、単一の結合アッセイを利用して、ビメンチンポリペプチドとその相互作用するタンパク質(例えば、プレクチン、ＩＦＡＰ−３００、Ｈｓｃ７０、アルファ−クルスタリン、ＰＫＣ、ｃＧＭＰキナーゼ、又はＹｅｓキナーゼ)との間の相互作用又はビメンチンポリペプチドの標的ＤＮＡへの結合を阻止し又は強化する化合物を検出することができる。
【０１１０】
様々なアッセイ形式を利用することができ、本開示に照らして、ここに明白に記載していないものであっても、当業者の視野の内にあると考えられよう。アッセイ形式は、ビメンチン発現レベル、ビメンチン配列のメチル化状態、腫瘍抑制活性、中間フィラメント形成活性などの条件に近づくことができ、多くの異なる形態で生成することができる。多くの具体例において、この発明は、無細胞系と無傷の細胞を利用する細胞ベースのアッセイの両方を含むアッセイを提供する。
【０１１１】
試験すべき化合物は、例えば、細菌、酵母又は他の生物により生成することができ(例えば、天然物)、化学的に生成することができ(例えば、ペプチド模倣物を含む低分子)、又は組換えにより生成することができる。この化合物の効力は、様々な濃度の試験化合物を利用して得られたデータから投与量応答曲線を生成することにより評価することができる。その上、対照用アッセイを行なって、比較のためのベースラインを与えることもできる。対照用アッセイにおいては、複合体の形成を、試験化合物の非存在下で定量する。
【０１１２】
化合物のライブラリー及び天然抽出物を試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、高スループットアッセイは、所定時間内に調べられる化合物数を最大化するために望ましい。無細胞系(精製した若しくは半精製したタンパク質又は溶解物を利用して開発しうるものなど)において好適な本発明のアッセイは、しばしば、迅速な開発及び分子標的の試験化合物により媒介される変化の比較的容易な検出を可能にするように生成されうる点において、「一次」スクリーニングとして選ばれる。その上、試験化合物の細胞毒性の効果及び／又はバイオアベイラビリティーは、一般に、イン・ビトロ系では無視されうる。該アッセイは、主として、分子標的の他のタンパク質との結合親和性の変化又は酵素的特性の変化において現れうるような、薬物の分子標的に対する効果に集中する。
【０１１３】
ある具体例において、これらのアッセイから同定される試験化合物は、ビメンチン関連増殖性疾患を治療するための治療方法において利用することができる。
【０１１４】
この出願の更に別の面は、異質ビメンチン遺伝子を発現し、又は少なくとも一種類の組織又は細胞型において少なくとも一つのゲノムビメンチン遺伝子が破壊されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。例えば、ビメンチン遺伝子座が破壊されているトランスジェニックマウスを生成することができる。
【０１１５】
他の面において、この出願は、誤発現されるビメンチンアレルを有するビメンチン関連増殖性疾患についての動物モデルを提供する。例えば、ビメンチンアレルが欠失したマウス、又は少なくとも一つのビメンチンエキソンの全部又は部分が欠失したマウスを繁殖させることができる。かかるマウスモデルは、その後、ビメンチン遺伝子の誤発現から生じる病気の研究に利用することができる。
【０１１６】
従って、本願は、トランスジェニック動物であって、ビメンチン導入遺伝子を含む細胞(当該動物の細胞)からなり、好ましくは(適宜)、その動物の少なくとも一つの細胞において外因性ビメンチンタンパク質を発現する当該トランスジェニック動物を開示する。このビメンチン導入遺伝子は、このタンパク質の野生型をコードすることができ、又はその同族体(アゴニスト及びアンタゴニストの両方を含む)並びにアンチセンス構築物をコードすることができる。このビメンチン導入遺伝子は、ビメンチンヌクレオチド配列(例えば、SEQ ID NO:２)又はその断片を含むことができる。好適具体例において、この導入遺伝子の発現は、例えば、発現を所望のパターンに制御するシス作動性配列を利用する特定の細胞、組織又は発生段階のサブセットに限られる。
【０１１７】
位置特異的遺伝子操作によりイン・ビボで調節されうる導入遺伝子の発現を可能にする遺伝子技術は、当業者に公知である。例えば、標的配列の遺伝的組換えを触媒するレコンビナーゼの調節された発現を可能にする遺伝子システムが、利用可能である。ここで用いる場合、語句「標的配列」は、レコンビナーゼにより遺伝的組換えを受けるヌクレオチド配列を指す。この標的配列は、レコンビナーゼ認識配列と隣接しており、一般に、レコンビナーゼ活性を発現する細胞で切り出され又は逆転される。レコンビナーゼに触媒される組換え事象は、標的配列の組換えが、ビメンチンポリペプチドの発現の活性化又は抑制を生じるようにデザインすることができる。例えば、組換えビメンチン遺伝子の発現に干渉する標的配列の切り出しをデザインして、その遺伝子の発現を活性化することができる。このタンパク質の発現への干渉は、様々な機構例えばビメンチン遺伝子のプロモーターエレメントからの空間的分離又は内部の停止コドンにより生じうる。その上、この導入遺伝子は、該遺伝子のコード配列が、レコンビナーゼ認識配列と隣接し、最初に、プロモーターエレメントに対して３’〜５’の向きで細胞にトランスフェクトされるようにすることができる。かかる場合において、標的配列の逆位は、主題の遺伝子に、コード配列の５’末端をプロモーターエレメントに関してプロモーターに駆動された転写活性化を可能にする方向に置くことによって、新しい方向を与える。
【０１１８】
説明用の具体例において、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステム(Lakso等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236；Orban等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6861-6865)又はサッカロミセス・セレビシエのＦＬＰレコンビナーゼシステム(O'Gorman等(1991)Science 251:1351-1355；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６９４)を利用して、イン・ビボの位置特異的な遺伝的組換えシステムを生成することができる。Ｃｒｅレコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列の間に位置する介在性標的配列の位置特異的な組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅレコンビナーゼが結合し、Ｃｒｅレコンビナーゼ媒介の遺伝的組換えに必要とされる、３４塩基対のヌクレオチドの反復配列である。ｌｏｘＰ配列の向きは、介在性標的配列が、Ｃｒｅレコンビナーゼが存在する場合に、切り出される又は逆転されるかどうかを決定し(Abremski等(1984)J.Biol.Chem.259:1509-1514)；ｌｏｘＰ配列が直列反復方向であれば標的配列の切り出しを触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆向反復の向きであれば標的配列の逆転を触媒する。
【０１１９】
Ｖ．被験者及び試料
ある面において、この発明は、ビメンチン関連疾患例えば結腸新生物を有することが疑われ又は有する被験者に関係する。或は、被験者は、日常的スクリーニングを受けていてよいし、必ずしもかかるビメンチン関連疾患を有することが疑われていなくてもよい。好適具体例において、この被験者は、ヒトの被験者であり、ビメンチン関連疾患は、結腸新生物である。
【０１２０】
結腸新生物を有することが知られていない被験者からの試料における上記のビメンチンマーカーについてのアッセイは、その被験者におけるかかる結腸新生物の診断において助けとなりうる。説明のために、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化状態のＭＳＰによる検出は、それだけで利用できるし、又は他の様々なアッセイと組み合わせて利用することにより、結腸新生物の検出の感度及び／又は特異性を改良することができる。好ましくは、かかる検出は、癌の発生の初期の段階でなされ、それで、治療が有効であることは、一層ありそうなこととなる。
【０１２１】
診断に加えて、結腸新生物を有することが知られていない被験者からの試料におけるビメンチンマーカーのアッセイは、その被験者の予後予測となりうる(即ち、この病気のありそうな経過を指示する)。説明のために、結腸新生物を発生する素因を有する被験者は、メチル化ビメンチンヌクレオチド配列を有しうる。被験者からの試料におけるビメンチンマーカーのアッセイは又、その被験者の結腸新生物に対して特に有効な特定の治療を選択するために、又は有効でありそうにない治療を排除するために利用することもできる。
【０１２２】
ビメンチン遺伝子のサイレンシングと関係する癌を有する(又は有していた)ことが知られている被験者からの試料におけるビメンチンマーカーのアッセイも又、有用である。例えば、本発明の方法を利用して、治療がある被験者にとって有効かどうかを同定することができる。少なくとも一つの試料を、同じ被験者から、治療の前後に採取して、ビメンチンマーカーについてアッセイする。治療前に採った試料中にビメンチンマーカーが存在して治療後には存在しない(又は、低レベルである)という発見は、その治療が有効であって変更する必要がないことを示している。治療前に採った試料中及び治療後に採った試料中にビメンチンマーカーが存在する場合には、癌が被験者において根絶される見込みを増大させるために治療を変更することが望ましい。従って、本発明の方法は、治療に対する患者の応答を測定するために用いられる一層侵襲的な手順を実行する必要性を回避することができる。
【０１２３】
癌は、進行癌の患者において、治療後に頻繁に再発する。この場合及び他の場合において、この発明のアッセイは、ビメンチン遺伝子のサイレンシングと関連する癌の状態を経時的にモニターするのに有用である。癌が進行している被験者については、最初の試料を採取したときには幾つかの又はすべての試料にビメンチンマーカーが存在せず、その後、第二の試料を採取したときに少なくとも一つの試料に出現することがありうる。癌が退行している被験者については、ビメンチンマーカーは、最初の試料を採ったときに一つ又は幾つかの試料中に存在して、その後、第二の試料を採ったときにはこれらの試料の幾つか又は全部に存在しないことがありうる。
【０１２４】
ここに記載した方法を利用する試料は、本質的に、関心ある如何なる生物学的材料であってもよい。例えば、試料は、被験者からの体液試料、被験者からの組織試料、被験者からの固体又は半固体試料、被験者に由来する一次細胞培養物又は組織培養物、細胞株からの細胞、又は細胞若しくは組織培養物からの培地若しくは他の細胞外物質、又は異種移植片(第二の被験者例えば免疫無防備マウス中で培養された第一の被験者例えばヒトからの癌の試料を意味する)であってよい。用語「試料」は、ここで用いる場合、被験者から直接得られる生物学的材料(一次試料として記載されうる)並びに一次試料の任意の操作された形態又は部分の両方を包含することを意図している。試料は又、生物学的材料を外因性液体と接触させて、その接触した生物学的材料の幾らかの部分を含む洗浄液を生成することによっても得ることができる。その上、用語「試料」は、少なくとも一種の添加剤例えば防腐剤、キレート化剤、抗凝固因子などと混合した後の一次試料を包含することを意図している。
【０１２５】
ある具体例において、体液試料は、血液試料である。この場合には、用語「試料」は、患者から直接得られた血液のみならず、血液の画分例えば血漿、血清、細胞画分(例えば、血小板、赤血球及びリンパ球)、タンパク質調製物、核酸調製物などをも包含することを意図している。ある具体例において、体液試料は、尿試料又は結腸排出物試料である。ある具体例において、体液試料は、大便試料である。
【０１２６】
被験者は、好ましくは、ヒトの被験者であるが、ここに開示した分子マーカー(特に、他の動物に由来するそれらの同族体)は、他の動物においても同様に有用であるということは予想される。他の具体例において、生物学的材料の分離した部分を得ることなく、生物体中で直接ビメンチンマーカーを検出することは可能であろう。かかる場合には、用語「試料」は、検出工程に含まれる試薬又はデバイスと接触する生物学的材料の部分を包含することを意図している。
【０１２７】
ある具体例においては、ＭＳＰ反応においてテンプレートとして利用されるＤＮＡは、体液試料から得られる。好適な体液の例は、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、結腸排出物又は尿である。他の体液も又、利用することができる。それらは、被験者から容易に得ることができ、多くの病気についてのスクリーニングのために利用することができ、血液及び血液由来の画分は、特に有用である。例えば、結腸直腸癌の患者におけるＤＮＡの変化を、被験者の血液において検出することができるということが示されている(Hibi等、1998, Cancer Res, 58:1405-7)。血液由来の画分は、血液、血清、血漿、又は他の画分を含むことができる。例えば、細胞画分は、５ｍｌの全血液を１０分間重力の８００倍で遠心分離することによって、「バフィーコート」(即ち、白血球富化血液部分)として調製することができる。赤血球は、最も速く沈降し、遠心管の最も底の画分として存在する。バフィーコートは、赤血球の上に薄いクリーム状の白い層として存在する。血液の血漿部分は、バフィーコートの上に層を形成する。血液由来の画分は又、他の様々な方法で単離することもできる。一つの方法は、特定のサイズ又は密度の細胞を富化させるための遠心分離で用いる勾配から画分を採取することによるものである。
【０１２８】
次いで、これらの体液由来の試料からＤＮＡを単離する。かかる試料からのＤＮＡの単離のための手順は、当業者には周知である。一般に、かかるＤＮＡの単離手順は、例えば、試料中に存在する任意の細胞の洗剤を利用した溶解を含む。細胞溶解後、一般に、タンパク質を様々なプロテアーゼを用いてＤＮＡから除去する。ＲＮＡは、ＲＮアーゼを用いて除去する。次いで、一般に、ＤＮＡを、フェノールを用いて抽出し、アルコール中で沈殿させて、水溶液中に溶解させる。
【０１２９】
ＶＩ．ビメンチン関連疾患の治療方法
この出願の更に別の面は、細胞におけるビメンチン遺伝子の減少した発現又は過剰発現から生じるビメンチン関連疾患の治療方法に関係する。かかるビメンチン関連増殖性疾患(例えば、結腸新生物)は、様々な病的細胞増殖状態から生じうる。ある具体例において、ビメンチン関連増殖性疾患の治療には、ビメンチン遺伝子発現又はビメンチン活性の調節が含まれる。用語「調節する」は、ビメンチンが過剰発現される場合にはその発現の抑制を、又はビメンチンが過少発現される場合にはその発現の増大を構想している。
【０１３０】
一具体例において、本発明は、ビメンチン遺伝子構築物を、ビメンチンタンパク質が誤発現され又は発現されない細胞におけるビメンチンタンパク質(SEQ ID NO:１)の機能を再構成するなどのための、遺伝子治療プロトコールの一部分として利用することによる治療方法を提供する。説明のために、病的な又は異常な増殖を示す細胞型は、おそらく、少なくとも部分的に、ビメンチンタンパク質の機能に依存している。例えば、ビメンチンタンパク質をコードする遺伝子治療用構築物は、ビメンチン遺伝子のサイレンシングと関係する結腸新生物において利用することができる。
【０１３１】
ある具体例において、この発明は、ビメンチンの再発現を誘導する薬剤を利用する治療方法を提供する。ビメンチン関連疾患細胞におけるビメンチン遺伝子発現の喪失は、少なくとも部分的に、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化のためでありえて、メチル化抑制剤例えば５−デオキシアザシチジン又は５−アザシチジンを、それらの病気の細胞に導入することができる。他の類似の薬剤は、当業者に公知であろう。好適具体例において、このビメンチン関連疾患は、ビメンチンヌクレオチド配列の増大したメチル化と関係する結腸新生物である。
【０１３２】
ある具体例において、この発明は、核酸アプローチ例えばアンチセンス核酸、リボザイム又はトリプレックス剤を利用して、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸若しくはトリプレックス剤でマスクすることにより又はそれをリボザイムで開裂させることによって、特異的なビメンチンｍＲＮＡの転写又は翻訳をブロックする治療方法を提供する。かかる病気には、例えば、神経退行性疾患が含まれる。アンチセンス核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990)。この細胞において、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。これらのアンチセンス核酸は、このｍＲＮＡの翻訳に干渉する(二本鎖のｍＲＮＡは、翻訳されないので)。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好適である(それらは、容易に合成されて、標的のビメンチンを過剰生産する細胞に導入したときに問題を引き起こすことが一層長い分子よりもありそうにないので)。転写を失速させるためのオリゴヌクレオチドの利用は、該オリゴマーが二重らせんＤＮＡに巻き付いて三重らせんを形成するので、トリプレックス戦略として公知である。それ故、これらのトリプレックス化合物は、選択した遺伝子上のユニーク部位を認識するようにデザインすることができる(Maher等、Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991；Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991)。リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡを、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似した仕方で、特異的に開裂させる能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の改変によって、ＲＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列を認識してそれを開裂させる分子を工作することができる(Cech, J.Amer.Med.Assn., 260:3030, 1988)。
【０１３３】
本発明は又、ビメンチンタンパク質により媒介される増殖性又は遺伝学的疾患を治療するための遺伝子治療をも提供する。かかる治療は、その治療効果を、ビメンチンアンチセンスポリヌクレオチドの、増殖異常を有する細胞への導入によって達成する。或は、完全長のビメンチンをコードするポリヌクレオチドを病気の細胞に導入することは望ましいであろう。
【０１３４】
アンチセンスビメンチンポリヌクレオチド又はビメンチン遺伝子の送達は、組換え発現ベクター例えばキメラウイルス又はコロイド分散系を利用して達成することができる。アンチセンス配列の治療用の送達のために特に好適なのは、標的を定めたリポソームの利用である。ここに教示した遺伝子治療に利用することのできる様々なウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は好ましくはＲＮＡウイルス例えばレトロウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウス又はトリレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入することのできるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス(ＭｏＭｕＬＶ)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(ＨａＭｕＳＶ)、マウス乳癌ウイルス(ＭｕＭＴＶ)及びラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)が含まれるが、これらに限られない。好ましくは、被験者がヒトである場合には、ベクター例えばテナガザル白血病ウイルス(ＧａＬＶ)が利用される。幾つかの更なるレトロウイルスベクターは、多くの遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターのすべては、形質導入された細胞を同定して生成することができるように、選択マーカーをトランスファーし又は組み込むことができる。関心あるビメンチン配列を、例えば、特異的標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする他の遺伝子と共に、ウイルスベクターに挿入すれば、そのベクターは、標的特異的である。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質又はタンパク質を結合することにより、標的特異的とすることができる。好適なターゲティングは、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を利用することにより達成される。当業者は、レトロウイルスゲノムに挿入することができ又はウイルスエンベロープに結合させて、アンチセンスビメンチンポリヌクレオチド又はビメンチン遺伝子を含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にする特異的ポリヌクレオチド配列を知るであろう(或は、過度の実験をすることなく、容易に確かめることができる)。
【０１３５】
この発明は又、ビメンチン５’隣接ポリヌクレオチド又はビメンチン構造遺伝子に作動的に結合されたビメンチン５’隣接ポリヌクレオチドを製薬上許容しうる賦形剤又は媒質中に含む医薬又は医薬組成物であって、ビメンチン関連細胞増殖性疾患例えば結腸新生物の治療に利用される当該医薬又は医薬組成物にも関係する。
【０１３６】
典型的具体例
この発明は、今や、一般的に記載されており、それは、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう(該実施例は、単に、本発明のある面及び具体例の説明の目的のために含まれるものであり、この発明を制限することを意図するものではない)。
【実施例】
【０１３７】
実施例１：
１．細胞培養及び５−アザシチジン処理
これらの培養物を生育させて、以前に記載されたように処理した(Veigl等、1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:8698-8702)。最適許容投与量を、各処理される株について測定し、幾つかの株については、１〜３μｇ／ｍｌに及ぶ２種類の投与量を用いた。
【０１３８】
２．メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼアッセイ(例えば、ＨｐａＩＩアッセイ)
我々は、潜在的にメチル化されうるＣｐＧ濃密領域を含むビメンチン遺伝子の上流及び該遺伝子内のゲノム配列(ここでは、５’−ビメンチンゲノム配列と呼ぶ)を試験した(図１及び６参照)。このＣｐＧリッチな領域のメチル化を試験するために、我々は、先ず、ＨｐａＩＩアッセイを利用した。試料のＤＮＡを、メチル化感受性酵素のＨｐａＩＩで消化してから、ＰＣＲプライマー対によって増幅した。ＤＮＡがメチル化されている場合には、それは、ＨｐａＩＩ消化に耐性であり、従って、ＰＣＲ産物が生成される。他方、ＤＮＡがメチル化されていない場合には、それは、ＨｐａＩＩ消化を受けやすく、従って、ＰＣＲ産物は生成されない。ＣｐＧジヌクレオチドの位置は、ビメンチン遺伝子の５’ゲノム領域内にバルーンとして示されており、このゲノム領域の４つのサブドメインＡ〜Ｄを、結腸癌における異所的メチル化について試験した(図１)。これらのＨｐａＩＩアッセイに用いたＰＣＲプライマーの位置も又、図１に示してある。ＨｐａＩＩアッセイにおいてＡ、Ｃ及びＤ領域を増幅するために利用したＰＣＲプライマーの配列は、図１３に与えてある。
【０１３９】
３．結腸癌細胞における減少したビメンチン発現
ＲＴ−ＰＣＲは、ビメンチンが、正常な結腸では十分に発現されるが、結腸癌細胞株では僅かしか発現されないことを示した(図２)。メチル化がビメンチン遺伝子発現のサイレンシングの原因であるということを確立するために、ビメンチンＤＮＡのメチル化を有する細胞株を、５−アザシチジン(５−アザＣ)(脱メチル化剤)で処理した。図２に示したように、５−アザＣ処理は、１２の結腸癌細胞株の内の９つ(Ｖ４００、Ｖ４２９、Ｖ５０３、ＲＣＡ、Ｖ５、ＲＫＯ、Ｖ４３２、Ｖ７０３及びＶ４５７)でビメンチン発現を再活性化した。
【０１４０】
４．ビメンチンは、結腸癌細胞株で、頻繁にメチル化されて、サイレンシグを受ける
Ｃ領域内のビメンチンゲノム配列のメチル化を、結腸癌細胞株(図３)又は結腸腫瘍(図４〜５)におけるＨｐａＩＩアッセイにより検出した。ＰＣＲ増幅を、未消化(Ｕ)、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩでの消化(Ｈ)、又はメチル化に関係ない酵素Ｍｓｐ１での消化(Ｍ)後に、３０又は４０サイクルで行なった。３つの癌でない正常組織(ＮＮ)は、すべてメチル化されていないが、１０の結腸癌細胞株の９つは、すべてメチル化を示している(図３)。Ｃ領域のビメンチンゲノム配列のメチル化は又、対にした正常試料／腫瘍試料においてもＨｐａＩＩアッセイにより検出された。図４及び５に示したように、Ｃ領域におけるビメンチンの差次的メチル化は、４０サイクルのＰＣＲ増幅後に、３１の結腸腫瘍中１６で検出された。
【０１４１】
全体として、ＨｐａＩＩアッセイは、７４％の結腸癌の診断の感度で且つ９３％の特異性(結腸癌を有しない者の正常組織における２つの偽陽性)で、Ｃ領域におけるビメンチンのメチル化を示している。これらの結果は、ビメンチンを、結腸癌において差次的にメチル化される遺伝子として確立している。
【０１４２】
加えて、類似のＨｐａＩＩアッセイの結果は、結腸癌におけるビメンチンヌクレオチド配列の異所的メチル化の発生率は、Ａ及びＤ領域(全ブロックとして)においてＣ領域より一層少ないことを示唆した。しかしながら、Ｂ領域及びＡ領域の３’部分も又、Ｃ領域に加えて、ビメンチンの癌特異的な異所的メチル化を有しうる良好な候補領域であり続けている。結腸癌細胞株におけるＡ、Ｃ、Ｄ領域のＨｐａＩＩアッセイの結果は、すぐ下の表ＩＩにまとめてある。
【０１４３】
【表２】
【０１４４】
５．メチル化特異的ＰＣＲ(ＭＳ−ＰＣＲ)
各試料からの５００ｎｇのＤＮＡ(５０μｌの容積)を、ＮａＯＨ(新しく生成した、終濃度０．２Ｍのもの)により、３７℃で、１５分間変性させた。次に、３０μｌの１０ｍＭハイドロキノン(新鮮)及び５２０μｌの３．０Ｍ ＮａＨＳＯ４(新たに調製した重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ５．０)を加えて、５５℃で１６時間インキュベートした。改変ＤＮＡを、ウィザードＤＮＡクリーンアップシステム(Promega)を利用して精製した。この反応を、終濃度０．３ＭのＮａＯＨによって、室温で、１５分間、脱スルホン化して、１０Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ(ｐＨ７．０)を終濃度３Ｍまで加えることにより中和した。ＤＮＡを、３容の無水エタノールにより、３０分間、−８０℃で沈殿させた。このＤＮＡペレットを、次いで、蒸留水に溶解させて、約１０ｎｇ／μｌとした。重亜硫酸ナトリウム処理したＤＮＡを、その後のメチル化特異的ＰＣＲのためのテンプレートとして利用した。
【０１４５】
ビメンチンゲノム配列のＢ及びＣ領域内のＭＳ−ＰＣＲ用のプライマーの位置は、ＭＳ−ＰＣＲ対１〜５として示してある(図６)。更なるＭＳ−ＰＣＲプライマー対１〜２及びＭＳＰ対６〜１０の位置は、図１６に示してある。これらのすべてのプライマー配列は、ビメンチン５’ゲノム配列に基づいてデザインされ、完全に改変されたＤＮＡに特異的であった。ＭＳＰ−ＰＣＲプライマーセット１、１−２及び３−１０の配列は、図１４及び１５に示してある。二本鎖非メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換された配列(センス又はアンチセンス)(ＵＦ又はＵＲとして示してある)を増幅するために用いる対照用プライマーセットの配列も又、図１４及び１５に与えてある。ＰＣＲを行って、該ＰＣＲ産物を、３．０％アガロースゲル上で泳動させた。
【０１４６】
６．ビメンチンのメチル化を検出するためのＭＳ−ＰＣＲの改良された感度及び特異性
我々は、更に、メチル化又は非メチル化ＤＮＡテンプレートの増幅に特異的なＰＣＲプライマーを利用して、メチル化特異的ＰＣＲ技術を、ビメンチンのＣｐＧリッチ領域のメチル化の試験に利用した(図７〜１２)。図７に示したように、ＭＳ−ＰＣＲプライマー対１、４及び５は、すべて、４０サイクルのＰＣＲによりアッセイした際に正常結腸組織でメチル化を検出した。対照的に、ＭＳ−ＰＣＲプライマー対３は、差次的にメチル化した領域を限定し、それは、ビメンチンを発現しない結腸癌細胞株でメチル化されるが、正常結腸組織又はビメンチンを発現する細胞株ＳＷ４８０ではメチル化されない。独立したＭＳ−ＰＣＲアッセイは、ＭＳ-ＰＣＲプライマー対ＭＳ３が、ビメンチンのメチル化を、癌でない切除物からの正常結腸切除物において、たとえＰＣＲ反応を、２つの順次的４０サイクル反応によって８０サイクル行なった場合でも、検出しないことを確認した(図８)。
【０１４７】
図９に示したように、プライマー対ＭＳＰ３を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイを、１０対の正常／腫瘍試料におけるＣ領域内のビメンチンのメチル化についてＨｐａＩＩアッセイと比較した。これらの１０の場合において、プライマー対ＭＳＰ３を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイは、下記の表ＩＩＩにまとめたように、ビメンチンのメチル化の検出について実質的に改良された感度及び特異性を示した。特に、ＭＳ−ＰＣＲアッセイにおいて、ＭＳＰ３プライマーは、結腸癌の検出について、７０％の感度と９０％の特異性(非メチル化腫瘍による１つの偽陽性)を示している。
【０１４８】
【表３】
【０１４９】
ＭＳＰ３プライマーを利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイを、更に、図１０(試料Ｎ１〜２０及びＴ１〜２０)及び図１１(試料Ｎ２１〜４６及びＴ２１〜４６)に示した４６対の正常／腫瘍試料の分析にまで拡張した。これらの４６対の試料を、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化(Ｍ)又は非メチル化(Ｕ)についてのＭＳＰ３プライマーを利用する４０サイクルのＭＳ−ＰＣＲによってアッセイした。これらの４６のケースにおいて、プライマー対ＭＳＰ３を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイは、結腸癌の検出について、下記の表ＩＶにまとめたように、８４％の感度及び９６％の特異性を示した。
【０１５０】
【表４】
【０１５１】
このＭＳ−ＰＣＲ反応を、更に、図１２に示した一組の結腸癌細胞株を特性決定するために利用した。これらの３９の細胞株試料において、ビメンチンのメチル化についてのＭＳ−ＰＣＲアッセイにおいて用いたＭＳＰ３プライマーは、結腸癌の検出について、８２％の感度である。
【０１５２】
上記の結果は、ビメンチンゲノム配列(ヌクレオチド１〜６２００、SEQ ID NO:２)が、結腸癌ではメチル化されているが正常組織ではメチル化されていない差次的メチル化領域を含むことを示している。これらのＨｐａＩＩアッセイ及びＭＳＰ３プライマー対を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイは、ビメンチン５’隣接領域及びエキソン１−イントロン１領域内の差次的メチル化のアッセイに利用することができる。体液及び排出物例えば血液及び大便におけるメチル化ビメンチンの検出は、結腸癌及び前癌性結腸腺腫の有用な初期診断を与えることができる。
【０１５３】
７．ビメンチンのメチル化の検出のためのＭＳ−ＰＣＲアッセイの更なる結果
ビメンチンゲノム配列における差次的メチル化の程度を更に研究するために、更なる６対のＭＳ−ＰＣＲプライマーのセットを、Ｂ及びＣ領域内でデザインした。すべてのＭＳ−ＰＣＲプライマーの配列を、図１４及び１５に示し、それらの位置を図１６に示してある。
【０１５４】
これらのＭＳ−ＰＣＲプライマーを、１２の癌でない正常試料と１２の結腸癌細胞株のセットにおいて評価した(図１７及び１８)。図１４で太字で示したように、実行できる最良のプライマーセットは、最初に評価したプライマーＭＳＰ３、及び新たなプライマーセットのＭＳＰ１−２である。従って、ＭＳＰ１−２は、Ｂ領域内にある新しい差次的メチル化領域を同定する。
【０１５５】
更に、ビメンチンヌクレオチド配列の異所的メチル化は、結腸新生物における初期事象であるようである。１３の結腸腺腫試料を、ビメンチンＤＮＡの異所的メチル化についてＭＳＰ３プライマーを利用するＭＳ−ＰＣＲ反応によりアッセイしたところ、かかるメチル化が１３例中７つという結果であった。これらの結果を、下記の表Ｖにまとめた。
【０１５６】
【表５】
【０１５７】
加えて、図１９は、顕微鏡的な初期の結腸新生物である幾つかの顕微解剖した異所的凹窩病巣(即ち、ＡＣＦ、図１９では、「Ａ」と略記してある)におけるビメンチンの異所的メチル化の検出の結果を示している。対照的に、このビメンチンのメチル化は、同じ個人の顕微解剖された正常組織(図１９では、「Ｎ」と略記してある)では検出されなかった。
【０１５８】
結論として、本発明は、ビメンチンのメチル化の少なくとも３つのアッセイ：１）ＭＳＰ３プライマーを利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイ；２）ＭＳＰ１−２を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイ；及び３）ＨｐａＩＩアッセイを開示する。これらのすべてのアッセイは、ビメンチンゲノム配列の差次的メチル化を癌細胞において(正常細胞ではない)同定するために利用することができる。ビメンチンゲノム配列中に存在する他のＣｐＧ配列に対する類似のアッセイを形成することができるというのはありそうなことである。かかるアッセイは、体液に適用した場合、癌例えば結腸癌、前癌性結腸腺腫の初期の検出のために、及び多くの異所的凹窩病巣のために結腸癌の発生の増大した危険にある個人の検出のために利用することができる。
【０１５９】
実施例２：
下記の実験及びデータは、更に、メチル化が結腸癌の高頻度マーカーであるビメンチンの特異的領域及びそれらの配列を特定する。加えて、これらのデータは、これらの配列についてのアッセイを特定する。
【０１６０】
図３２〜３４は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列エントリーＡＬ１３３４１５の塩基対５６７００〜５８８００のビメンチン５’ゲノム領域の図式表示を示す概要である。ボックスは、ビメンチンのＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ領域を示している。以前のＨｐａＩＩ消化アッセイは、Ａ及びＤ領域が、癌ではメチル化されていないことを示した。従って、Ｃ中の領域を、メチル化特異的ＰＣＲアッセイによって徹底的に調べた。図上のバルーンは、潜在的メチル化の標的であるＣｐＧジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、集団多型であるＣｐＧを示している。図３２は、Ａ〜Ｂ領域を示しており、図３３〜３４は、Ｃ〜Ｄ領域を示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的ＰＣＲ反応(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０と番号付けられたものなど)によって調べられた領域を示している。これらの図において、ＭＳ−ＰＣＲ反応の主な結果は、バーの隣りに示されている。最も左側の反応のセットは、１２の癌でない正常試料におけるＭＳ−ＰＣＲの結果であり；陰性の結果が、好適な結果である。最も右側の反応のセットは、１１の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり；好適な結果は、陽性反応である。
【０１６１】
図３２〜３４のＭＳ−ＰＣＲアッセイは、１１の結腸癌細胞株の、１２の癌でない正常結腸試料と比較しての、４５サイクルのＭＳ−ＰＣＲでのアッセイにより測定して、５つの異なるグループに類別された。第一のグループ(図３２のＭＳＰ１、ＭＳＰ１４、ＭＳＰ１７；図３３のＭＳＰ３、ＭＳＰ２０Ａ、ＭＳＰ２９、ＭＳＰ３０、ＭＳＰ３１；及び図３４のＭＳＰ５０を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、強いＭＳ−ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料では０％のメチル化を検出したアッセイを示す。これらの反応の最良のものは、更に、下線を付けた数字で示されており、これらの内で最も良いものは、更に、下線を付けた太字の数字で示されている。第二のグループ(図３３のＭＳＰ８、ＭＳＰ２２Ａ、ＭＳＰ２３、ＭＳＰ２４、ＭＳＰ３２を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、弱いＭＳ−ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料では０％のメチル化を検出したアッセイを示す。第三のグループ(図３３のＭＳＰ３３；図３４のＭＳＰ３５、ＭＳＰ３６、ＭＳＰ３７、ＭＳＰ４０、ＭＳＰ４１、ＭＳＰ４７を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、強いＭＳ−ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料中で１０％のメチル化を有する試料を検出したアッセイを示す。第四のグループ(図３３のＭＳＰ２１；及び図３４のＭＳＰ１０、ＭＳＰ３８、ＭＳＰ３９、ＭＳＰ４３、ＭＳＰ４４、ＭＳＰ４５を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、強いＭＳ-ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料中で２０％のメチル化を有する試料を検出したアッセイを示す。第五のグループ(図３３のＭＳＰ２、ＭＳＰ６、ＭＳＰ７、ＭＳＰ９、ＭＳＰ２５Ａ、ＭＳＰ２６、ＭＳＰ２７、ＭＳＰ２８；図３４のＭＳＰ５、ＭＳＰ４２、ＭＳＰ４６、ＭＳＰ４８、ＭＳＰ４９を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、強いＭＳ−ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料中で３０％のメチル化を有する試料を検出したアッセイを示す。
【０１６２】
図３５は、図３２〜３４にまとめたＭＳ−ＰＣＲ反応のためのプライマーの配列を与えている。ＭＦは、フォワードプライマーを示し、ＭＲは、リバースプライマーを示している。プライマーは、センスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅すると推定される。アンチセンスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅するプライマーは、(ＡＳＳ)により示されている。この表は又、増幅生成物に対応するゲノム中の位置(クローンＡＬ１３３４１５の塩基対ナンバリングシステムに対するもの)をも与える。この表は又、増幅された断片の長さをも与える。暗い影を付けたプライマーは、最良の及び好適な反応を与える。
【０１６３】
図３６〜３７は、種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの技術的感度及び特異性を示している。図４１は、更に試験した２つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ及びＭＳＰ５０Ｍ)で、図３６及び３７を補っている。
【０１６４】
図３６の左側は、種々のＭＳ−ＰＣＲ反応についての技術的特異性を示している。左奥には、癌でない正常な結腸組織において、４５又は９０サイクルのＰＣＲで行われたＭＳ-ＰＣＲ反応の結果が示されている。９０サイクルの反応は、４５サイクルのＰＣＲ反応物からアリコートを採り、新たなＰＣＲ反応物中希釈して、更なる４５サイクルにつき反応させることにより行われた。示したこれらの反応について、ＭＳ−ＰＣＲ反応は、正常組織についての９０サイクルまでのＰＣＲにおいて偽陽性を検出しない。陽性対照の結腸癌細胞株は、すぐ右隣に示してある。右奥には、異なるＭＳ-ＰＣＲ反応の技術的感度が示されている。中央及び右端の反応のセットは、Ｖａｃｏ５(ビメンチンのメチル化を有する細胞株)からのＤＮＡに対して行なったＭＳ−ＰＣＲの希釈シリーズを示している。メチル化したＶａｃｏ５ＤＮＡ投入量の１００ピコグラムのレベルまで陽性反応が得られている。
【０１６５】
図３７は、更なるプライマーセットについての、同様のデータを示している。左蘭は、１１の結腸癌細胞株の４５サイクルのＭＳ−ＰＣＲのパネルに対するアッセイの結果を示している。右側の結果は、癌でない正常組織のグループに対する４５及び９０サイクルのＭＳ−ＰＣＲを評価する欄を示している。隣りは、Ｖａｃｏ５ＤＮＡの増大する希釈物に対して候補の反応物をアッセイしている希釈シリーズのアッセイを示す２つの欄を示している。最良の反応物例えばＶＩＭ−ＭＳＰ５０Ｍは、殆どの結腸癌細胞株の検出について高い技術的感度を示し、正常結腸の検出についての低い陽性率を示し、そしてＶａｃｏ５ＤＮＡの希釈物の検出についての高い感度(投入ＤＮＡの５０ピコグラムまで)を示している。右側に示したこれらの２つの希釈シリーズは、予め重亜硫酸塩処理した正常及びＶａｃｏ５ＤＮＡを混合して行なう(中央欄)か、先ずＶａｃｏ５及び正常ＤＮＡを混合し；その後、その希釈混合物を重亜硫酸塩処理することにより行なう(右端欄)かどうかで異なっている。
【０１６６】
種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲプライマーを、４７の結腸癌細胞株におけるメチル化の検出につき評価した。これらのアッセイにおいて、ＭＳＰ−２９は、最大感度であり、細胞株の８０％でメチル化を検出している。増大した感度は、ＭＳＰ−２９をＭＳＰ−１４又はＭＳＰ−１７と組み合せることにより達成されたものであろう。別々の実験において、種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲプライマーを、同様に、結腸癌患者の広範なグループに由来するマッチした結腸癌組織及び対にした正常結腸組織のパネルにおいて評価した。結腸癌の検出感度は、これらのアッセイにおいて、８５％を超えている。ＭＳＰ−２９は、一つの正常試料をメチル化されているとして検出しただけで、８５％の感度を示しており、それ故、好適な反応である。他の別々の実験において、種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲプライマーは、同様に、１３の結腸腺腫試料のパネルにおいて評価された。６２〜６９％の感度が、腺腫試料における異所的メチル化の検出について達成されている。
【０１６７】
図２１〜２６は、ビメンチンゲノム領域の限定的配列を与えている。配列は、センス及びアンチセンスビメンチンゲノム領域について、ビメンチンセンス鎖のメチル化及び非メチル化形態に由来するテンプレートの重亜硫酸塩変換された配列について、及びビメンチンアンチセンス鎖のメチル化及び非メチル化形態に由来するテンプレートの重亜硫酸塩変換された配列について与えられている。各図は、Ａ〜Ｄ領域を包含するビメンチン遺伝子の５’領域に及ぶ、ＮＣＢＩヒトゲノムクローンＡＬ１３３４１５の塩基対５６，８２２〜５８，８２２に対応する配列を与えている。各図は、結腸癌で差次的にメチル化されることが示されている(即ち、結腸癌において高頻度でメチル化されており、正常結腸組織ではメチル化されていない)塩基対５７，４２７〜５８，３２６からの領域を太字で示している。この領域は、我々が限定した高品質ＭＳ−ＰＣＲ反応のすべてを包含する。その上、各図は、ｂｅｓｔＭＳ−ＰＣＲ反応に対応するＭＳ−ＰＣＲプライマーによって調べられる特定の配列に下線を付してある。
【０１６８】
特に、図２１は、ＡＬ１３３４１５配列の５６，８２２〜５８，８２２に対応するビメンチンセンス鎖配列を５’〜３’方向で示しており、５７，４２７〜５８，３２６の差次的にメチル化される領域を太字で示してある。図２２は、図２１に対応するビメンチン遺伝子のセンス鎖に由来するメチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示しており、差次的にメチル化される領域５７，４２７〜５８，３２６に由来する配列を太字で示している。図２３は、図２１に対応するビメンチン遺伝子センス鎖に由来する非メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示しており、差次的にメチル化される領域５７，４２７〜５８，３２６に由来する配列を太字で示している。図２４は、ＡＬ１３３４１５配列の５６，８２２〜５８，８２２に対応するビメンチンアンチセンス鎖の配列を示しており、５７，４２７〜５８，３２６に由来する差次的にメチル化される領域を太字で示している。配列が３’〜５’方向で書かれていることに注意されたい。図２５は、図２４に対応するビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖に由来するメチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示しており、差次的にメチル化される領域５７，４２７〜５８，３２６に由来する配列を太字で示している。配列が３’〜５’方向に書かれていることに注意されたい。図２６は、図２４に対応するビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖に由来する非メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示しており、差次的にメチル化される領域５７，４２７〜５８，３２６に由来する配列を太字で示している。配列が３’〜５’方向に書かれていることに注意されたい。
【０１６９】
上記のデータは、差次的メチル化がヒトの結腸癌及び前癌性腺腫の特異的マーカーであるビメンチン遺伝子の領域を発見したこの発明の最終的開示にとって核となる情報を提供する。この出願は又、下記のように、幾つかの更なる支持データも提供する。
【０１７０】
図３８は、正常及び腫瘍の対の種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。図４２は、図３８を補うものであり、更に、３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ、ＭＳＰ４７Ｍ及びＭＳＰ５０Ｍ)を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイの臨床的感度を示している。
【０１７１】
図３９及び４０は、結腸の正常／腫瘍対、結腸腺腫、結腸癌細胞株、及び癌でない正常結腸試料(Ｎ.Ｃ.Ｎ)についての種々のＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。図４３は、図３９及び４０を補うものであり、更に、３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ、ＭＳＰ４７Ｍ及びＭＳＰ５０Ｍ)を利用する種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの臨床的感度を示している。
【０１７２】
図４４は、３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９、ＭＳＰ４７及びＭＳＰ５０)を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイからの生データを与える。これらのデータは、細胞株、Ｎ／Ｔ対及び結腸腺腫試料についての３つの表に、それぞれ示してある。メチル化試料を赤で暗号化してＭと標識し、非メチル化試料を緑色で暗号化してＵと標識した。Ｖ−ＭＳＰ２９、ＶＭＳＰ−４７、及びＶ−ＭＳＰ５０は、ビメンチンプライマーである。Ｈ−ＭＳＰ５は、比較のためのコントロールプライマー(ＨＬＴＦ−ＭＳＰ５)である。上記の感度データのまとめを下記の表ＶＩに列記した。例えば、ＭＳＰ２９は、を示している。細胞株の同定について８０％の感度を示しており(４１株を試験)、腫瘍の同定について８５％の感度を示している(４６腫瘍を試験)。ＭＳＰ５０は、結腸癌細胞株の同定について７３％の感度を示し、結腸癌腫瘍の同定について８７％の感度を示している。
【０１７３】
【表６】
【０１７４】
まとめると、このデータは、ビメンチン遺伝子配列の塩基対５７，４２７〜５８，３２６の結腸癌及び腺腫特異的な異所的メチル化の説明を与え、癌特異的反応における異所的メチル化を単一反応で約８５％の感度で検出することができ、他のＭＳ−ＰＣＲ反応によるパネルとの組合せにおいては約９０％の感度で検出することのできるＭＳ−ＰＣＲ反応を与えている。
【０１７５】
参考文献の組込み
本書で言及したすべての刊行物及び特許を、個々の刊行物又は特許が特に、個別に、参考として援用されると示されているかのように、参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する。矛盾が生じた場合には、本願(定義を含む)が、調整する。
【０１７６】
同等物
主題の発明の特定の具体例を論じてきたが、上記の明細書は、説明のためのものであって、制限するためのものではない。この明細書及び請求の範囲を概観すれば、この発明の多くの変形物が、当業者には明らかとなろう。この発明の全範囲は、同等物の全範囲と共に請求の範囲を及びかかる変形物と共に明細書を参照することによって決められるべきものである。
【技術分野】
【０００１】
２００１年には、１２０万症例を超えるヒトの癌が診断され、５０万人を超える人々が、癌により死亡するであろう(米国癌学会の推計)。それにもかかわらず、これまでよりも多くの人々が、癌と共に生活し、癌にもかかわらず生存している。例えば、１９９７年には、約８９０万人の生きている米国人が、癌の病歴を有した(国立癌研究所の推計)。人々は、ますます、早期に診断されれば、治療が一層上首尾となるので、癌にもかかわらずに生存するようになりそうである。初期の検出は、質の高い方法の利用可能性に依存している。かかる方法は又、患者の予後予測、治療法の選択、治療に対する応答の監視及び更なる治療を受けさせる患者の選択の決定にも有用である。従って、特異的で、正確で、侵襲性が最小で、技術的に簡単で且つ安価な癌の診断法への要求がある。
【背景技術】
【０００２】
例えば、結腸直腸癌(即ち、結腸又は直腸の癌)は、特に重要な種類のヒトの癌の一つである。結腸直腸癌は、米国成人の癌による死亡の第二位の死因である(Landis等、1999, CA Cancer J Clin, 49:8-31)。結腸直腸癌を有する個人の約４０％が死亡する。２００１年には、１３５，４００症例の新たな結腸直腸癌(９８，２００症例の結腸癌及び３７，２００症例の直腸癌)と、その病気による５６，７００人の死亡(４８，０００の結腸癌死及び８，８００の直腸癌死)があると推計されている(米国癌学会)。他の癌と同様に、これらの率は、改良された診断方法によって減少させることができる。結腸癌を検出するための他の方法があるにもかかわらず、それらの方法は、理想的なものではない。例えば、指による直腸検査(即ち、医師の手による直腸の検査)は、比較的安価であるが、不愉快であり且つ不正確でありうる。便潜血試験(即ち、大便中の血液の検出)は、大便中の血液は、多数の原因があるので、非特異的である。結腸内視鏡検査及びＳ状結腸鏡検査法(即ち、結腸の、可撓性の直視用機器を用いた直接的検査法)は、両方とも、不愉快であり且つ高価である。二重造影バリウム注腸(即ち、バリウムを充填した結腸のＸ線撮影)も又、通常放射線専門医により行なわれる高価な手順である。
【０００３】
癌を検出し又は治療するための既存の方法の不便さの故に、癌の診断及び治療のための新たな方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Landis等、1999, CA Cancer J Clin, 49:8-31
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ある面において、本発明は、部分的に、出願人の、特定のヒトゲノムＤＮＡ領域であって、ヒトの癌(例えば、結腸癌)由来の組織におけるＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンが差次的にメチル化されている当該領域の発見及び該領域の正常組織における非メチル化の発見に基づいている。該領域を、以後、「ビメンチン−メチル化標的領域」(例えば、図４５中のSEQ ID NO:４５)と称する。本発明の方法は又、部分的に、ヒトの癌に由来する組織におけるビメンチン転写物のレベルが、正常組織におけるビメンチン転写物のレベルより低いという出願人の発見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一具体例において、この方法は、被験者からの組織試料又は体液試料における、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列の存在(例えば、ビメンチンメチル化標的領域中)のアッセイを含む。好適な体液には、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、結腸排出物又は尿が含まれる。一具体例において、この方法は、制限酵素／メチル化感受性ＰＣＲを包含する。他の具体例において、この方法は、試料由来のＤＮＡの、非メチル化シトシン塩基(「変換感受性」シトシンとも呼ばれる)を異なるヌクレオチド塩基に変換するがメチル化シトシン塩基は変換しない化学化合物との反応を含む。好適具体例において、この化学化合物は、重亜硫酸ナトリウムであり、これは、非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する。この化合物で変換したＤＮＡを、次いで、この化合物で変換されたＤＮＡテンプレートを、もし試料由来のＤＮＡのＣｐＧジヌクレオチド中のシトシン塩基がメチル化されていれば増幅するプライマーを利用するメチル化感受性ポリメラーゼ連鎖反応(ＭＳＰ)を利用して増幅する。ＰＣＲ産物の生成は、被験者が、癌又は前癌性腺腫を有していることを示している。メチル化ＤＮＡの存在をアッセイするための他の方法は、当分野で公知である。
【０００７】
他の具体例において、この方法は、試料中の減少したレベルのビメンチン転写物のアッセイを包含する。かかるアッセイの例には、ビメンチンのコード配列に由来するプライマーを利用するＲＴ−ＰＣＲアッセイが含まれる。このビメンチンｃＤＮＡ配列は、例えば、ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＭ＿００３３８０において見出すことができる。
【０００８】
他の具体例において、本発明は、癌を有する又は有することが疑われる被験者における、癌(例えば、結腸癌)の予後予測のための検出方法を提供する。かかる方法は、被験者に由来する組織試料又は体液中の、メチル化ビメンチンＤＮＡ(例えば、ビメンチンメチル化標的領域中)の存在についてのアッセイを含む。ある症例においては、メチル化ビメンチンＤＮＡの血液画分における検出は、進行癌(例えば、進行した結腸癌)を指示するものであるということが予想される。他の症例においては、組織若しくは大便由来の試料又は他の体液由来の試料における、メチル化ビメンチンＤＮＡの検出は、ＤＮＡを脱メチル化し、又はビメンチン遺伝子の発現を再活性化する治療剤に応答するであろう癌を指示するものでありうる。
【０００９】
他の具体例において、本発明は、被験者の癌(例えば、結腸癌)の状態を経時的に監視する方法を提供する。この方法は、第一の時点で被験者から採った組織試料又は体液及び第二の時点で被験者から採った対応する組織試料又は体液において、メチル化ビメンチンＤＮＡの存在について(例えば、ビメンチンメチル化標的領域で)アッセイすることを含む。第一の時点で採った組織試料又は体液由来のメチル化ビメンチンＤＮＡの非存在及び第二の時点で採った組織試料又は体液におけるメチル化ビメンチンＤＮＡの存在は、癌が進行中であることを示している。第一の時点で採った組織試料又は体液中のメチル化ビメンチンＤＮＡの存在及び第二の時点で採った組織試料又は体液中のメチル化ビメンチンＤＮＡの非存在は、癌が退行していることを示している。
【００１０】
他の具体例において、本発明は、癌(例えば、結腸癌)を有し又は有すると疑われる被験者における治療を評価する方法を提供する。この方法は、治療前に被験者から採った組織試料又は体液及び治療中又は治療後に被験者から採った対応する組織試料又は体液において、メチル化ビメンチンＤＮＡの存在について(例えば、ビメンチンメチル化標的領域で)アッセイすることを含む。治療後又は治療中に採った試料中のメチル化ビメンチンＤＮＡのレベルの喪失又は治療前に採った試料中のメチル化ビメンチンＤＮＡのレベルと比較しての減少は、該治療を受けた被験者における癌の退行に対する該治療の正の効果を示している。
【００１１】
本発明は又、ビメンチン遺伝子のメチル化状態を検出するためにデザインされたアッセイ(例えば、メチル化感受性ＰＣＲアッセイ又はＨｐａＩＩアッセイ)における利用のためのオリゴヌクレオチドプライマー配列にも関係している。
【００１２】
本発明は又、癌細胞(例えば、結腸癌)の成長を阻害し又は減じる方法をも提供する。この方法は、ビメンチンタンパク質の癌細胞におけるレベルを増加させることを含む。一具体例において、これらの細胞を、ビメンチンタンパク質又は生物学的に活性な同等物又はそれらの断片と、該タンパク質又は断片の取込みを可能にする条件下で接触させる。他の具体例においては、これらの細胞を、ビメンチンタンパク質をコードし且つ癌細胞中で活性なプロモーターを含有する核酸と(該プロモーターは、ビメンチンタンパク質をコードする領域と作動的に結合されている)、該核酸の該癌細胞による取込みを可能にする条件下で接触させる。他の具体例において、この方法は、メチル化ビメンチンＤＮＡの脱メチル化或はサイレンシングを受けたビメンチンプロモーターの再活性化を含む。
【００１３】
他の具体例において、この出願は、単離された又は組換えによるビメンチンヌクレオチド配列(SEQ ID NO:２〜７及び４５〜５０の何れか一つのヌクレオチド配列、並びに該配列の１０、１５、２０、２５、５０、１００又は１５０塩基対長の断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は同一であるもの)であって、ビメンチン関連疾患の細胞において差次的にメチル化される当該単離された又は組換えによるビメンチンヌクレオチド配列を提供する。
【００１４】
他の具体例において、この出願は、結腸癌を検出する方法であって、ａ）患者から試料を得ること；及びｂ）該試料を、ビメンチン、ＳＬＣ５Ａ８、ＨＬＴＦ、ｐ１６及びｈＭＬＨ１よりなる群から選択する少なくとも２つの遺伝子内の核酸配列のメチル化の存在についてアッセイすることを含み、これらの２つの遺伝子内のヌクレオチド配列のメチル化が結腸癌を示す当該方法を提供する。かかる方法において、この試料は、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿、及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である。例えば、体液は、結腸癌を有すると疑われる被験者又は結腸癌を有することが既知の被験者から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣｐＧジヌクレオチドの位置を、ビメンチン遺伝子(ヌクレオチド１〜６２００)の５’ゲノム領域中のバルーンとして示している。この領域の４つのサブドメイン(Ａ〜Ｄ)は、結腸癌における異所的メチル化につき試験される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＬ１３３４１５配列の塩基対５６，１２３〜６２，３４０に対応するビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列(SEQ ID NO:５１)を示している。
【図２】図２は、ビメンチンが正常な結腸細胞株ではよく発現されるが、結腸癌細胞株では、発現が乏しいというＲＴ−ＰＣＲの結果を示している。このビメンチンの発現は、脱メチル化剤５−アザシチジンによって、１２の結腸癌細胞株中の９株において誘導されている。
【図３】図３は、３０サイクル(上パネル)又は４０サイクル(下パネル)のＰＣＲ増幅によるＣ領域内のビメンチンメチル化についてのＨｐａＩＩアッセイの結果を示している。これらのＰＣＲ反応は、未消化(Ｕ)、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩでの消化(Ｈ)、又はメチル化に中立な酵素Ｍｓｐ１での消化(Ｍ)後に行なわれる。３つの癌でない正常組織(ＮＮ１、ＮＮ２及びＮＮ３)は、すべてメチル化されていないが、１０の結腸癌細胞株全部のうちの９つは、メチル化を示している。
【図４】図４は、１０対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料(Ｎ１〜１０及びＴ１〜１０)のＣ領域内のビメンチンのメチル化についての、ＨｐａＩＩによる制限酵素消化後の４０サイクルのＰＣＲ増幅による、ＨｐａＩＩアッセイの結果を示している。
【図５】図５は、２２対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料(Ｎ１１〜３２及びＴ１１〜３２)のＣ領域内のビメンチンのメチル化についての、ＨｐａＩＩによる制限酵素消化後の４０サイクルのＰＣＲ増幅による、ＨｐａＩＩアッセイの結果を示している。
【図６】図６は、ビメンチン遺伝子の更なる図式描写を示している。Ｂ及びＣ領域内のＭＳ−ＰＣＲのためのプライマーの位置を、ＭＳ−ＰＣＲ対１〜５として示してある。
【図７】図７は、ビメンチンのゲノム配列のＢ及びＣ領域を部分的にカバーするプライマー対１〜５を利用するＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。プライマー対１、４及び５は、すべて、４０サイクルのＭＳ−ＰＣＲによりアッセイした場合、正常結腸組織(Ｎで示してある)においてビメンチンのメチル化を検出している。対照的に、プライマー対３は、ビメンチン非発現性結腸癌細胞株においてメチル化されるが正常結腸組織又はビメンチン発現性細胞株ＳＷ４８０ではメチル化されない差次的メチル化領域を規定している。
【図８】図８は、プライマー対ＭＳ３を利用するＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。ビメンチンのメチル化は、癌以外の切除術由来の１４の正常結腸組織試料(ＮＮで示してある)の何れにおいても、ＭＳ３反応を、順次的な４０サイクルの反応を２回行なうことにより、ＰＣＲの８０サイクルまで行なった場合でさえ、検出されていない。
【図９】図９は、１０対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料でのＣ領域におけるビメンチンのメチル化を検出するための、ＨｐａＩＩアッセイ(上段)の、ＭＳＰ３を４０サイクルで利用するＭＳ−ＰＣＲ(下段)に対する比較を示している。
【図１０】図１０は、２０対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料(Ｎ１〜２０及びＴ１〜２０)におけるビメンチンのメチル化を検出するための、ＭＳＰ３プライマーを４０サイクルで利用するＭＳ−ＰＣＲを示している。
【図１１】図１１は、２６対の正常結腸組織試料／腫瘍結腸組織試料(Ｎ２１〜４６及びＴ２１〜４６)におけるビメンチンのメチル化を検出するための、ＭＳＰ３プライマーを４０サイクルで利用するＭＳ−ＰＣＲを示している。
【図１２】図１２は、一組の結腸癌細胞株におけるビメンチンのメチル化を検出するための、ＭＳＰ３プライマーを４０サイクルで利用するＭＳ−ＰＣＲを示している。
【図１３】図１３は、Ａ、Ｃ及びＤ領域におけるビメンチンヌクレオチド配列を増幅するための、ＨｐａＩＩアッセイにおけるプライマー配列を示している。Ａ．フォワードＰＣＲプライマー ＶＭ−ＨｐａＩＩ−６７９Ｕ(SEQ ID NO:８)及びリバースＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−１２６６Ｄ(SEQ ID NO:９)は、ＨｐａＩＩでの消化後に、Ａ領域内のメチル化されているビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。非メチル化ＤＮＡは、ＨｐａＩＩにより切断され、それ故、ＰＣＲ増幅されえない。Ｂ．フォワードＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−１８２６Ｕ(SEQ ID NO:１０)及びリバースＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−２１９５Ｄ(SEQ ID NO:１１)は、ＨｐａＩＩでの消化後に、Ｃ領域内のメチル化されたビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。Ｃ．フォワードＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−２２６４Ｕ(SEQ ID NO:１２)及びリバースＰＣＲプライマーＶＭ−ＨｐａＩＩ−２６９５Ｄ(SEQ ID NO:１３)は、ＨｐａＩＩでの消化後に、Ｄ領域内のメチル化されたビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。
【図１４】図１４は、ビメンチンのメチル化を検出するためのＭＳＰ−ＰＣＲプライマーのセット１〜５の配列を示している。ＭＳＰ１、ＭＳＰ１−２、及びＭＳＰ３は、二本鎖メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換されたセンス鎖を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１３７４ＭＦ(SEQ ID NO:１４)及びリバースプライマーＶＩＭ１５０４ＭＲ(SEQ ID NO:１５)；フォワードプライマーＶＩＭ１３７４ＭＦ(SEQ ID NO:１４)及びリバースプライマーＶＩＭ１５０６ＭＲ(SEQ ID NO:１８)；フォワードプライマーＶＩＭ１７７６ＭＦ(SEQ ID NO:２３)及びリバースプライマーＶＩＭ１９８２ＭＲ(SEQ ID NO:２４)を含んでいる。ＭＳＰ２及びＭＳＰ５は、二本鎖メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換されたアンチセンス鎖を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１６５５ＭＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:１９)及びリバースプライマーＶＩＭ１７９７ＭＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２０)；フォワードプライマーＶＩＭ１９３５ＭＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２７)及びリバースプライマーＶＩＭ２０９４ＭＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２８)を含んでいる。下線を付けた配列は、二本鎖非メチル化ビメンチンＤＮＡ(ＵＦ又はＵＲとして示してある)の重亜硫酸塩変換された配列(センス又はアンチセンス)を増幅するために用いるコントロールプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１３６８ＵＦ(SEQ ID NO:１６)及びリバースプライマーＶＩＭ１５０６ＵＲ(SEQ ID NO:１７)；フォワードプライマーＶＩＭ１６５１ＵＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２１)及びリバースプライマーＶＩＭ１７９９ＵＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２２)；フォワードプライマーＶＩＭ１７７１ＵＦ(SEQ ID NO:２５)及びリバースプライマーＶＩＭ１９８６ＵＲ(SEQ ID NO:２６)；フォワードプライマーＶＩＭ１９３４ＵＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２９)及びリバースプライマーＶＩＭ２０８９ＵＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:３０)を含んでいる。
【図１５】図１５は、ビメンチンのメチル化を検出するためのＭＳＰ−ＰＣＲプライマーセット６〜１０の配列を示している。ＭＳＰ６、ＭＳＰ７、ＭＳＰ８及びＭＳＰ９は、二本鎖メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換されたセンス配列を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１６５５ＭＦ(SEQ ID NO:３１)及びリバースプライマーＶＩＭ１７９２ＭＲ(SEQ ID NO:３２)；フォワードプライマーＶＩＭ１６５５ＭＦ(SEQ ID NO:３１)及びリバースプライマーＶＩＭ１７９６ＭＲ(SEQ ID NO:３５)；フォワードプライマーＶＩＭ１６５５ＭＦ(SEQ ID NO:３１)及びリバースプライマーＶＩＭ１８０４ＭＲ(SEQ ID NO:３６)；フォワードプライマーＶＩＭ１８４３ＭＦ(SEQ ID NO:３７)及びリバースプライマーＶＩＭ１９８２ＭＲ(SEQ ID NO:２４)を含んでいる。ＭＳＰ１０は、二本鎖メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換されたアンチセンス配列を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーＶＩＭ１９２９ＭＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:３９)及びリバースプライマーＶＩＭ２０９４ＭＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２８)を含んでいる。下線を引いた配列は、二本鎖非メチル化ビメンチンＤＮＡ(ＵＦ又はＵＲと示してある)の重亜硫酸塩変換された配列(センス又はアンチセンス)を増幅するのに利用されるコントロールプライマーであり、フォワードプライマーＶＩＭ１６５１ＵＦ(SEQ ID NO:３３)及びリバースプライマーＶＩＭ１８００ＵＲ(SEQ ID NO:３４)；フォワードプライマーＶＩＭ１８４３ＵＲ(SEQ ID NO:３８)及びリバースプライマーＶＩＭ１９８６ＵＲ(SEQ ID NO:２６)；フォワードプライマーＶＩＭ１９３４ＵＦ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:２９)及びリバースプライマーＶＩＭ２０８９ＵＲ(ＡＳＳ)(SEQ ID NO:３０)を含んでいる。
【図１６】図１６は、ビメンチン遺伝子の図式描写を示している。１０対のＭＳ−ＰＣＲプライマーセットをデザインした(それは、ｂｐ１３４７と２０９４の間のビメンチンＢ及びＣ領域の部分を調べた)。これらのプライマー対により調べられた領域を、図式表示してある。
【図１７】図１７は、１２の癌でない正常試料と１２の結腸癌細胞株における、ビメンチンのメチル化の検出のための、３対のプライマーセットＭＳＰ１、ＭＳＰ１−２、及びＭＳＰ３を利用するＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。
【図１８】図１８は、１２の癌でない正常組織と１２の結腸癌細胞株における、ビメンチンのメチル化の検出のための、３対のプライマーセットＭＳＰ５、ＭＳＰ６、ＭＳＰ７、ＭＳＰ８、ＭＳＰ９、及びＭＳＰ１０を利用する、ＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。
【図１９】図１９は、顕微解剖した異常な凹窩病巣(ＡＣＦ、「Ａ」で示してある)における、ビメンチンのメチル化の検出のための、２対のプライマーセットＭＳＰ３及びＭＳＰ１−２を利用する、ＭＳ−ＰＣＲの結果を示している。
【図２０】図２０は、ヒトのビメンチンタンパク質のアミノ酸配列(SEQ ID NO:１)を示している。
【図２１】図２１〜２６は、ビメンチンの５’ゲノム領域の決定的配列を与えるものである。各図は、領域Ａ〜Ｄを包含するビメンチン遺伝子の５’領域に及ぶＮＣＢＩヒトゲノムクローンＡＬ１３３４１５の塩基対５６，８２２〜５８，８２２に対応する配列を与える。各図は、結腸癌において差次的にメチル化される塩基対５７，４２７〜５８，３２６の領域を太字で示している。その上、各図において、ＭＳ−ＰＣＲプライマーにより調べられる特殊な配列に下線を引いてある。図２１は、ＡＬ１３３４１５配列(SEQ ID NO:２)の塩基対５６，８２２〜５８，８２２に対応するビメンチンのセンス鎖配列を５’〜３’方向で示している。塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４５)の、差次的にメチル化された領域は、太字にしてある(図４５も参照されたい)。
【図２２】図２２は、図２１に示したビメンチン遺伝子のセンス鎖(SEQ ID NO:３)に由来する、メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてある塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４６)である。
【図２３】図２３は、図２１に示したビメンチン遺伝子のセンス鎖に由来する未メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:４)を示している。この差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてある塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４７)である。
【図２４】図２４は、ＡＬ１３３４１５配列(SEQ ID NO:５)の塩基対５６，８２２〜５８，８２２に対応する、ビメンチンのアンチセンス鎖の配列(３’〜５’)を示している。この差次的にメチル化された領域は、太字にしてある塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４８)である。
【図２５】図２５は、図２４に示したビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖(３’〜５’)に由来するメチル化されたテンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:６)を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてあり、塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:４９)である。
【図２６】図２６は、図２４に示したビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖(３’〜５’)に由来する未メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:７)を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてあり、塩基対５７，４２７〜５８，３２６(SEQ ID NO:５０)である。
【図２７】図２７は、ＨｐａＩＩアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「Ａ領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５６７９９〜５７３８５、SEQ ID NO:４０)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド６７９〜１２６６とも呼ばれた。
【図２８】図２８は、ＨｐａＩＩアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「Ｂ領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５７４３６〜５７７８１、SEQ ID NO:４１)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド１３１７〜１６６１とも呼ばれた。
【図２９】図２９は、ＨｐａＩＩアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「Ｃ領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５７９４６〜５８３１５、SEQ ID NO:４２)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド１８２６〜２１９５とも呼ばれた。
【図３０】図３０は、ＨｐａＩＩアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「Ｄ領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５８３８４〜５８８１５、SEQ ID NO:４３)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド２２６４〜２６９５とも呼ばれた。
【図３１】図３１は、Ｂ領域並びにＢ領域とＣ領域の間のギャップをカバーする「Ｂ’領域」の配列(ＡＬ１３３４１５の塩基対５７４３６〜５７９４５、SEQ ID NO:４４)を示している。この配列は又、図１Ａ及び１Ｂに示したSEQ ID NO:５１のヌクレオチド１３１７〜１８２５とも呼ばれた。このＢ’領域は又、差次的メチル化領域をも包含する。
【図３２】図３２は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列エントリーＡＬ１３３４１５の、塩基対５６７００〜５８８００の、ビメンチンの５’ゲノム領域の図式表示を示している。ボックスは、ビメンチンの領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを示している。バルーンは、潜在的メチル化の標的であるＣｐＧジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、個体群多型であるＣｐＧを示している。図３２は、領域Ａ〜Ｂを示し、図３３〜３４は、領域Ｃ〜Ｄを示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的ＰＣＲ領域により調べられる領域を示している(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０と番号付けられている)。これらの図において、ＭＳ−ＰＣＲ反応の第一の結果は、ＭＳ−ＰＣＲプライマーに次いで示してある。これらの反応物の最も左側のセットは、１２の癌でない正常試料におけるＭＳ−ＰＣＲの結果であり；陰性の結果は、好適な結果である。これらの反応物の最も右側のセットは、１１の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり；好適な結果は、陽性反応である。
【図３３】図３３は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列エントリーＡＬ１３３４１５の、塩基対５６７００〜５８８００の、ビメンチンの５’ゲノム領域の図式表示を示している。ボックスは、ビメンチンの領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを示している。バルーンは、潜在的メチル化の標的であるＣｐＧジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、個体群多型であるＣｐＧを示している。図３２は、領域Ａ〜Ｂを示し、図３３〜３４は、領域Ｃ〜Ｄを示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的ＰＣＲ領域により調べられる領域を示している(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０と番号付けられている)。これらの図において、ＭＳ−ＰＣＲ反応の第一の結果は、ＭＳ−ＰＣＲプライマーに次いで示してある。これらの反応物の最も左側のセットは、１２の癌でない正常試料におけるＭＳ−ＰＣＲの結果であり；陰性の結果は、好適な結果である。これらの反応物の最も右側のセットは、１１の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり；好適な結果は、陽性反応である。
【図３４】図３４は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列エントリーＡＬ１３３４１５の、塩基対５６７００〜５８８００の、ビメンチンの５’ゲノム領域の図式表示を示している。ボックスは、ビメンチンの領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを示している。バルーンは、潜在的メチル化の標的であるＣｐＧジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、個体群多型であるＣｐＧを示している。図３２は、領域Ａ〜Ｂを示し、図３３〜３４は、領域Ｃ〜Ｄを示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的ＰＣＲ領域により調べられる領域を示している(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０と番号付けられている)。これらの図において、ＭＳ−ＰＣＲ反応の第一の結果は、ＭＳ−ＰＣＲプライマーに次いで示してある。これらの反応物の最も左側のセットは、１２の癌でない正常試料におけるＭＳ−ＰＣＲの結果であり；陰性の結果は、好適な結果である。これらの反応物の最も右側のセットは、１１の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり；好適な結果は、陽性反応である。
【図３５】図３５は、図３２〜３４にまとめたＭＳ−ＰＣＲ反応のためのプライマー配列(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０)を与える。ＭＦは、フォワードプライマーを示し、ＭＲは、リバースプライマーを示している。プライマーは、センスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅すると仮定されている。アンチセンスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅するプライマーは、(ＡＳＳ)により示してある。この表は又、増幅生成物に対応するゲノム位置(クローンＡＬ１３３４１５の塩基対ナンバリングシステムに対するもの)をも与える。この表は又、増幅された断片の長さをも与える。影を付けたプライマーは、最良の及び好適な反応を与える。SEQ ID NO:１４、１５、１８、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３６、３７、３９及び５２〜７２を、この図中に見出すことができる。
【図３６】図３６は、種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの技術的な感度及び特異性を示している。左奥には、癌でない正常結腸組織について行なった４５又は９０サイクルのＭＳ−ＰＣＲ反応の結果を示してある。９０サイクルの反応は、４５サイクルＰＣＲ反応物からアリコートを採って、それを新鮮なＰＣＲ反応物中に希釈して、更なる４５サイクルを反復することにより行なった。これらの示した反応物につき、ＭＳ−ＰＣＲ反応は、正常組織についての９０サイクル以下のＰＣＲにおいて偽陽性を検出しなかった。陽性対照の結腸癌細胞株を、すぐ右に並べて示してある。右奥には、種々のＭＳ−ＰＣＲ反応の技術的な感度のアッセイを示してある。中央の及び最も右側の反応物のセットは、Ｖａｃｏ５(ビメンチンのメチル化を有する細胞株)由来のＤＮＡについて行なったＭＳ−ＰＣＲの希釈シリーズを示している。投入メチル化Ｖａｃｏ５ＤＮＡの１００ピコグラムのレベルまで陽性反応が得られている。
【図３７】図３７は、更なるプライマーセットについての種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの技術的な感度及び特異性を示している。左欄は、４５サイクルのＭＳ−ＰＣＲでの、１１の結腸癌細胞株のパネルのアッセイの結果を示している。右側の結果は、一群の癌でない正常組織の４５及び９０サイクルのＭＳ−ＰＣＲ反応を評価する欄を示している。次は、候補の反応物を増大するＶａｃｏ５ＤＮＡ希釈物に対してアッセイする希釈シリーズのアッセイを示す２つの欄を示している。最良の希釈物(例えば、ＶＩＭ−ＭＳＰ５０Ｍ)は、殆どの結腸癌細胞株の検出に関する高度の技術的感度を示し、正常結腸についての低い陽性率、及び投入ＤＮＡの５０ピコグラムまでのＶａｃｏ５ＤＮＡの希釈物の検出に関する高度の感度を示している。右側に示したこれら２つの希釈シリーズは、それらが、予め重亜硫酸塩処理した正常及びＶａｃｏ５ＤＮＡを混合することにより為された(中央欄)か、先ずＶａｃｏ５及び正常ＤＮＡを混合し；該混合物を希釈してから；該希釈混合物を重亜硫酸塩処理することにより行なった(最右欄)かどうかで異なっている。
【図３８】図３８は、正常及び腫瘍の対の、種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。
【図３９】図３９は、正常な結腸及び癌の対、結腸腺腫、及び結腸癌細胞株の、種々のＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。
【図４０】図４０は、結腸癌細胞株及び癌でない正常な結腸試料の、種々のＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。
【図４１】図４１は、図３７を補って、更に、ビメンチンＤＮＡメチル化についての種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの技術的感度を示している。２つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ及びＭＳＰ５０Ｍ)を試験した。
【図４２】図４２は、図３８を補って、更に、ビメンチンＤＮＡメチル化についての種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの臨床的感度を示している。この一次データは、正常及び腫瘍の対のアッセイから得られた。３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ、ＭＳＰ４７Ｍ、及びＭＳＰ５０Ｍ)を利用した。
【図４３】図４３は、図３９及び４０を補って、更に、ビメンチンＤＮＡメチル化についての種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの臨床的感度を示している。この一次データは、結腸癌細胞株、癌でない正常な結腸試料(Ｎ.Ｃ.Ｎ)、結腸の正常／腫瘍対、及び結腸腺腫のアッセイから得られた。３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ、ＭＳＰ４７Ｍ、及びＭＳＰ５０Ｍ)を利用した。
【図４４】図４４は、ＭＳＰ２９、ＭＳＰ４７、及びＭＳＰ５０を利用するＭＳ−ＰＣＲからの生のデータを与える。このデータは、細胞株Ｎ／Ｔ対、及び結腸腺腫試料それぞれについての３つの表で示されている。メチル化試料は、赤く暗号化されてＭと標識されているが、非メチル化試料は、緑色に暗号化されてＵと標識されている。Ｖ−ＭＳＰ２９、ＶＭＳＰ−４７、及びＶ−ＭＳＰ５０が、ビメンチンプライマーである。Ｈ−ＭＳＰ５は、比較のためのコントロールプライマー(ＨＬＴＦ−ＭＳＰ５)である。
【図４５】図４５は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：センス鎖(SEQ ID NO:４５)を示している。
【図４６】図４６は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：センス鎖(重亜硫酸塩変換／メチル化したもの)(SEQ ID NO:４６)を示している。
【図４７】図４７は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：センス鎖(重亜硫酸塩変換し／メチル化してないもの)(SEQ ID NO:４７)を示している。
【図４８】図４８は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：アンチセンス鎖(SEQ ID NO:４８)を示している。
【図４９】図４９は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：アンチセンス鎖(重亜硫酸塩変換／メチル化したもの)(SEQ ID NO:４９)を示している。
【図５０】図５０は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＬ１３３４１５の塩基対５７，４２７〜５８，３２６に対応するヒトビメンチン遺伝子の５’ゲノム配列：アンチセンス鎖(重亜硫酸塩変換し／メチル化してないもの)(SEQ ID NO:５０)を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．定義
便宜のために、明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いた幾らかの用語を、ここに集めた。別途規定しない限り、ここで用いるすべての技術及び科学用語は、この発明が属する分野の当業者に普通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１７】
本願では、単数表現のものであっても、複数の場合をも指すものとする。例えば、「エレメント」は、１つのエレメント又は１つより多くのエレメントを意味する。
【００１８】
用語「腺腫」、「結腸腺腫」及び「ポリープ」は、ここでは、結腸の任意の前癌性新生物を記載するために用いる。
【００１９】
用語「結腸」は、ここで用いる場合、右結腸(盲腸を含む)、横行結腸、左結腸、及び直腸を包含することを意図している。
【００２０】
用語「結腸直腸癌」及び「結腸癌」は、ここでは、結腸(上記のように、直腸を含む)の任意の癌性新生物を指すために交換可能に用いる。
【００２１】
用語「血液由来の画分」は、ここでは、全血液の構成成分を指す。全血液は、液体部分(即ち、血漿)及び固体部分(即ち、血液細胞)を含む。血液の液体部分及び固体部分は、各々、多数の成分例えば、血漿中の種々のタンパク質又は固体部分の種々bの細胞型よりなる。これらの成分の一つ又はこれらの成分の何れかの混合物は、全血液中で見出される少なくとも一つの成分が失われているならば、血液由来の画分である。
【００２２】
「細胞」、「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」は、ここでは、交換可能に用いる用語である。かかる用語は、特定の主題の細胞を指すだけでなく、かかる細胞の子孫又は潜在的子孫をも指すということは理解される。ある種の改変は、突然変異又は環境の影響のために続く世代で起こりうるので、かかる子孫は、実際は、親細胞と同一でないかもしれないが、やはり、ここで用いる場合、この用語の範囲に含まれる。
【００２３】
用語「化合物」、「試験化合物」、「薬剤」及び「分子」は、ここでは、交換可能に用いて、ペプチド、核酸、炭水化物、小型有機分子、天然物抽出物ライブラリー、及び任意の他の分子(化学物質、金属、及び有機金属化合物を含むが、これらに限られない)を含むことを意味する(但し、これらに限られない)。
【００２４】
用語「化合物変換されたＤＮＡ」は、ここでは、ＤＮＡ中の非メチル化Ｃ塩基を異なるヌクレオチド塩基に変換する化学化合物で処理し又は該化合物と反応させたＤＮＡを指す。例えば、一つのかかる化合物は、重亜硫酸ナトリウムであり、これは、非メチル化ＣをＵに変換する。もし変換感受性シトシンを含むＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理したならば、この化合物変換されたＤＮＡは、Ｃの代わりにＵを含むであろう。もし重亜硫酸ナトリウムで処理したＤＮＡがメチルシトシンのみを含むならば、その化合物変換されたＤＮＡは、メチルシトシンの代わりにウラシルを含まないであろう。
【００２５】
用語「脱メチル化剤」は、ここで用いる場合、該剤での処理に際して、メチル化によるサイレンシングを受けた標的遺伝子の活性及び／又は遺伝子発現を回復する薬剤を指す。かかる薬剤の例には、制限はしないが、５−アザシチジン及び５−アザ−２’−デオキシシチジンが含まれる。
【００２６】
ここで用いる場合、用語「遺伝子発現」又は「タンパク質発現」は、試料中に存在する遺伝子転写物又はタンパク質の量に関係する任意の情報、並びに、遺伝子又はタンパク質が生成され又は蓄積し又は分解される速度に関する情報(例えば、レポーター遺伝子のデータ、核流出実験からのデータ、パルスチェースデータなど)を含む。ある種のデータは、遺伝子及びタンパク質発現の両方に関係していると見ることができる。例えば、細胞中のタンパク質レベルは、タンパク質のレベル並びに転写のレベルを反映しており、かかるデータは、句「遺伝子又はタンパク質発現の情報」に含まれるべきものである。かかる情報は、細胞当たりの量の形態、コントロール遺伝子又はタンパク質に対する量、ユニットレス測定などで与えられうる。用語「情報」は、如何なる特定の表現手段に限られるものではなく、適切な情報を与える任意の表現を意味することを意図している。用語「発現レベル」は、遺伝子転写物の蓄積又はタンパク質の蓄積又はタンパク質合成速度などを指向するものであっても、遺伝子又はタンパク質発現データに反映され又はそれから導き出せる質を指している。
【００２７】
用語「検出」は、ここで用いる場合、生物学的試料中の、マーカー、又はマーカーの変化(例えば、マーカーのメチル化状態の変化など)を観察する任意の方法を指す(マーカー又はマーカーの変化が現実に検出されるか否かにかかわらず)。換言すれば、試料をマーカー又はマーカーの変化についてプローブ検出する行為は、たとえマーカーが存在しないと測定され又は感度レベルより低いと測定されたとしても、「検出」である。検出は、定量的、半定量的又は非定量的観察であってよい。
【００２８】
用語「差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列」は、ビメンチン関連新生物においてメチル化されていることが見出されるビメンチンヌクレオチド配列の領域、例えば結腸癌組織又は細胞株においてメチル化されていることが見出されるが正常組織又は細胞株においてはメチル化されていないビメンチンヌクレオチド配列の領域を指す。例えば、図４５は、ＮＣＢＩ ＡＬ１３３４１５配列(SEQ ID NO:４５)の塩基対５７４２７〜５８３２６に対応する差次的にメチル化されるビメンチン領域を与える。この配列は、主として、Ｂ及びＣ領域内にある。
【００２９】
「発現ベクター」は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるために用いられる複製可能なＤＮＡ構築物を指し、これは、(１)遺伝子発現における調節の役割を有する遺伝子エレメント例えばプロモーター、オペレーター又はエンハンサー、(２)これらに作動的に結合された所望のタンパク質(本件では、ビメンチンタンパク質)をコードして、ｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列、及び(３)適当な転写及び翻訳の開始及び終結用配列のアセンブリを含む転写ユニットを含む。プロモーター及び他の調節エレメントの選択は、一般に、宿主細胞によって変化する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用なベクターは、しばしば、「プラスミド」の形態であり、これは、環状二本鎖のＤＮＡループであって、それらのベクター型では、染色体に結合していない。本明細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、交換可能に用いる。しかしながら、この発明は、かかる他の形態の発現ベクターであって同等の機能を果すものを包含することを意図しており、それらは、以下で公知となろう。
【００３０】
これらの発現ベクターにおいて、転写又は翻訳を制御する調節エレメントは、一般に、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来するものであってよい。宿主において複製する能力(通常、複製起点により与えられる)及びトランスフォーマントの認識を容易にする選択用遺伝子を追加的に組み込むことができる。ウイルス例えばレトロウイルス、アデノウイルスなどに由来するベクターを利用することができる。
【００３１】
用語「健康な」、「正常な」及び「非新生物の」は、ここでは、ビメンチンと関係する新生物形成(例えば、メチル化によるビメンチン遺伝子発現のサイレンシングと関係する新生物)などの病気でない被験者又は特定の細胞若しくは組織を指すために交換可能に用いる。これらの用語は、ここでは、しばしば、結腸の組織及び細胞に関して用いられる。従って、この出願の目的に関して、重い心臓病を有しているが、ビメンチンサイレンシングに関係した病気を有しない患者は、「健康な」者と呼ばれる。
【００３２】
「ビメンチンと関係した新生物」は、ビメンチン遺伝子の減少した発現又は無発現と関係した新生物を指す。ビメンチンと関係した新生物の例には、胃腸内新生物及び結腸新生物などが含まれる。
【００３３】
「ビメンチン関連増殖性疾患」は、ビメンチン遺伝子の減少した発現又は過剰発現と関連した病気を指す。
【００３４】
「ビメンチンメチル化標的領域」は、ここで用いる場合、差次的にメチル化されることが見出されているビメンチンの領域を指す。例えば、図４５は、ある一定の配列が差次的にメチル化される(例えば、SEQ ID NO:４５)ビメンチン領域を開示している。
【００３５】
「ビメンチンヌクレオチド配列」又は「ビメンチン核酸配列」は、ここで用いる場合、SEQ ID NO:２〜７に示したビメンチンのゲノム配列及びそれらの断片を指す。
【００３６】
「ビメンチンのサイレンシングと関連する疾患」は、ここで用いる場合、ビメンチン関連新生物を包含する。
【００３７】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間の又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性及び同一性は、各々、比較の目的のために整列させうる各配列中の一つの位置を比較することにより決定される。比較した配列中の同等の位置が、同じ塩基又はアミノ酸により占められていたならば、それらの分子は、その位置で同一であり；同等の部位が同じ又は類似のアミノ酸残基(例えば、立体的及び／又は電子的性質が類似している)により占められていたならば、それらの分子は、その位置で相同(類似)であるいうことができる。相同性／類似性又は同一性のパーセンテージによる表現は、比較した配列に共有される位置の同一又は類似のアミノ酸の数の関数を指す。「無関係」又は「相同でない」配列は、本発明の配列と、４０％未満の、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。２つの配列の比較において、残基(アミノ酸又は核酸)の非存在又は余分な残基の存在も又、同一性及び相同性／類似性を減少させる。
【００３８】
用語「相同性」は、類似の機能又はモチーフを有する遺伝子又はタンパク質を同定するのに用いられる配列類似性の数学に基づく比較を記載する。本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列又は同族体を同定するために、公開されたデータベースに対する検索を実行するための「問合わせ配列」として利用することができる。かかる検索は、Altschul等、(1990) J Mol.Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)を利用して行なうことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム(スコア＝１００、ワードレングス＝１２)を用いて行なって、この発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム(スコア＝５０、ワードレングス＝３)を用いて行なって、この発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためにギャップ入りのアラインメントを得るために、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Altschul等、(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されたように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメーターを利用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov を参照されたい。
【００３９】
ここで用いる場合、「同一性」は、配列を、配列マッチングが最大になるように整列させた場合(即ち、ギャップ及び挿入を考慮する)に、２つ以上の配列における対応する位置の同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。同一性は、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編、Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編、Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.及びGriffin, H.G.編、Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；及びSequence Analysis Primer, Gribskov, M.及びDevereux, J.編、M Stockton Press, New York, 1991；及びCarillo, H.及びLipman, D., SIAM J.Applied Math., 48:1073, 1988に記載されたものを含む(但し、これらに限られない)公知の方法によって、容易に計算することができる。同一性を決定する方法は、試験した配列の間の最大のマッチングを与えるようにデザインされる。その上、同一性を決定する方法は、公衆が利用可能なコンピュータープログラム中に編集されている。２つの配列の間の同一性を決定するコンピュータープログラムによる方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J.等、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ(Altschul, S.F.等、J.Molec.Biol. 215:403-410(1990))及びAltschul等、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402(1997))を含むが、これらに、限られない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給者（ＢＬＡＳＴ Manual, Altschul, S.等、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Bethesda, Md. 20894;Altschul, S.等、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)）から公衆に利用可能となっている。周知のSmith Watermanアルゴリズムを利用して同一性を決定することもできる。
【００４０】
用語「含む」は、ここで用いる場合、句「含むが、〜に限られない」を意味し、該句と交換可能に用いられる。
【００４１】
用語「単離された」は、核酸例えばＤＮＡ又はＲＮＡに関してここで用いる場合、天然に存在しない形態の分子を指す。その上、「単離された核酸」は、天然には断片として存在せず且つ自然状態では見出されない核酸断片を含むことを意味する。
【００４２】
用語「メチル化感受性ＰＣＲ」(即ち、ＭＳＰ)は、ここでは、化合物で変換されたテンプレート配列の増幅を行なうポリメラーゼ連鎖反応を指す。２つのプライマーセットを、ＭＳＰで用いるためにデザインする。各プライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。メチル化特異的プライマーと呼ばれる１セットのプライマー(下記参照)は、もしビメンチンＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチド中のＣ塩基がメチル化されているなら、化合物で変換されたテンプレート配列を増幅するであろう。非メチル化特異的プライマーと呼ばれる他のプライマーセット(下記参照)は、ビメンチンＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチド中のＣ塩基がメチル化されていないならば、化合物で変換されたテンプレート配列を増幅するであろう。
【００４３】
ここで用いる場合、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)及び適宜リボ核酸(ＲＮＡ)などのポリヌクレオチドを指す。この用語は又、同等物として、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡ又はＤＮＡの類似体をも包含し、記載した具体例に適用可能であれば、一本鎖(センス又はアンチセンスなど)及び二本鎖ポリヌクレオチドをも包含すると理解されるべきである。
【００４４】
「作動的に結合された」は、２つのＤＮＡ領域間の関係を記載する場合には、単に、それらが互いに機能的に関係していることを意味している。例えば、プロモーター又は他の転写調節配列は、もしコード配列の転写を制御するならば、該コード配列に作動的に結合される。
【００４５】
用語「又は」は、ここでは、用語「及び／又は」を意味するように用いられ、該用語と交換可能に用いられる(文脈的に明らかに違う場合を除く)。
【００４６】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ここでは、交換可能に用いられる。
【００４７】
「試料」は、分子マーカー又は分子マーカー例えばメチル化状態の変化の検出のために得られ又は調製される任意の物質を包含し、又は分子マーカー若しくは分子マーカーの変化の検出の目的のために検出試薬若しくは検出装置と接触される任意の物質を包含する。
【００４８】
「被験者」は、任意の関心ある生物体、一般には哺乳動物被験者例えばマウス好ましくはヒトの被験者である。
【００４９】
ここで用いる場合、用語「特異的にハイブリダイズする」は、この発明の核酸プローブ／プライマーの、標的配列、又はその相補鎖、又はその天然の変異体の少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又は１００個の連続するヌクレオチドにハイブリダイズする能力を指し、それで、標的遺伝子以外の細胞性核酸(例えば、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ)に対する１５％未満の、好ましくは１０％未満の、一層好ましくは５％未満のバックグラウンドハイブリダイゼーションを有する当該能力を指す。様々なハイブリダイゼーション条件を利用して、特異的ハイブリダイゼーションを検出することができ、ストリンジェンシーは、主に、ハイブリダイゼーションアッセイの洗浄段階により決定される。一般に、高温及び低塩濃度は、高いストリンジェンシーを与え、低温及び高塩濃度は、低いストリンジェンシーを与える。低いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、例えば、約２．０×ＳＳＣによる５０℃での洗浄により達成され、高いストリンジェンシーは、約０．２×ＳＳＣによる５０℃での洗浄により達成される。更なるストリンジェンシーの記載は、下記に与える。
【００５０】
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的な配列同一性」は、２つのペプチド配列がデフォルトギャップを利用するプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列させたときに、少なくとも９０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、一層好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性又はそれより高い配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。例えば、類似の化学的特性例えば電荷又は極性を有するアミノ酸の置換が、タンパク質の性質に影響することはありそうにない。例には、アスパラギンに対するグルタミン又はアスパラギン酸に対するグルタミン酸が含まれる。
【００５１】
ここで用いる場合、用語「導入遺伝子」は、それを導入されるトランスジェニック動物又は細胞にとって部分的に又は完全に異質(即ち、外来性)であるか、又は該動物又は細胞の内因性遺伝子にとって同質であるが、該動物のゲノムに該ゲノムを変化させるような仕方(例えば、それは、天然遺伝子とは異なる位置に挿入され又はその挿入がノックアウトを生じるような仕方)で挿入されるようにデザインされ又は挿入されている核酸配列(例えば、ビメンチンポリペプチドをコードする)を意味する。ビメンチン導入遺伝子は、少なくとも一つの転写調節配列及び任意の他の核酸例えばイントロン(選択した核酸の最適な発現に必要でありうる)を含むことができる。ビメンチン導入遺伝子は、ビメンチンヌクレオチド(SEQ ID NO:２)又はその断片を含む。
【００５２】
ＩＩ．概観
ある面において、この発明は、患者が、結腸新生物を有することがありそうであるか、ありそうもないかどうかを決定する方法に関係する。結腸新生物は、結腸内に位置し、又は結腸に由来する、任意の癌性又は前癌性の増殖物である。結腸は、腸管の一部であり、約３フィート長であって、小腸の最後から直腸に至る。横断面で見ると、結腸は、消化された物質が通過する内腔と呼ばれる内部空間を囲む同心環状に配置された４つの識別可能な層からなっている。内腔から外側に向かって順に、これらの層は、粘膜、粘膜下組織、筋層及び漿膜下層と呼ばれている。この粘膜は、上皮層(内腔に隣接する細胞)、基底膜、固有層及び粘膜筋板を含んでいる。一般に、結腸の「壁」は、粘膜下組織及び該組織の外側の層を指すことが意図されている。「裏打ち」は、この粘膜である。
【００５３】
前癌性結腸新生物は、腺腫又は腺腫性ポリープと呼ばれる。腺腫は、典型的には、結腸の裏打ち上の小さいマシュルーム様又はイボ様増殖物であり、結腸壁に侵入しない。腺腫は、結腸内視鏡又は可撓性のＳ字結腸鏡などの装置により見ることができる。幾つかの研究は、腺腫のスクリーニング及び除去を受けた患者は、結腸癌による死亡率が低下することを示した。これ及び他の理由の故に、一般に、腺腫が結腸癌の大部分の真性前駆体であるということは受け入れられている。
【００５４】
結腸新生物が結腸の基底膜に侵入する場合は、それは、結腸癌と考えられる(本願では、用語「結腸癌」を用いるので)。結腸癌の記載において、この明細書は、一般に、いわゆる「Dukes」結腸癌ステージシステムに従う。癌を記載する特徴は、一般に、認識可能なステージを記載するのに用いられる特定の用語より一層重要である。最も広く用いられているステージシステムは、一般に、次の特徴の少なくとも一つを利用する：腫瘍の結腸壁中への貫入の程度(一層大きい貫入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；腫瘍の結腸壁を通っての他の近隣組織への侵入の程度(一層大きい侵入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；腫瘍の局所リンパ節への侵入の程度(一層大きい侵入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；及び一層遠い組織(例えば、肝臓)への転移性侵入の程度(一層大きい転移性の侵入は、一般に、一層危険な病気ステージと相関する)。
【００５５】
「Dukes A」及び「Dukes B」の結腸癌は、結腸壁に侵入したが他の組織には広がっていない新生物である。Dukes A の結腸癌は、粘膜下組織を超えて侵入してない癌である。Dukes B の結腸癌は、２つの群Dukes B１と Dukes B２に細分される。「Dukes B１」結腸癌は、筋層まで侵入しているがそれを通過してない新生物である。Dukes B２結腸癌は、筋層を完全に破っている癌である。５年間にわたって、Dukes Aの癌の外科手術(即ち、患部組織の切除)を受けた患者は、９０％を超える生存率を有している。同じ期間にわたって、Dukes B１及びDukes B２の癌の外科手術を受けた患者は、それぞれ、約８５％及び７５％の生存率を有している。Dukes A、B１及びB２の癌は、Ｔ１、Ｔ２及びＴ３〜Ｔ４の癌とも呼ばれる。
【００５６】
「Dukes C」結腸癌は、局所リンパ節例えば消化管のリンパ節まで広がった癌である。外科治療だけを受けたDukes C の癌患者は、５年にわたる３５％の生存率を有するが、この生存率は、化学療法を受けた患者では６０％まで増加する。
【００５７】
「Dukes D」結腸癌は、他の器官に転移した癌である。肝臓は、転移性結腸癌が見出される最も一般的な臓器である。Dukes D結腸癌の患者は、治療養生法の如何によらず、５年にわたる５％未満の生存率を有する。
【００５８】
一般に、結腸新生物は、染色体不安定性、ミクロサテライト不安定性、及びＣｐＧアイランドメチレーター表現型(ＣＩＭＰ)と呼ばれる少なくとも３つの異なる経路の１つによって発達する。幾らかの重複はあるが、これらの経路は、幾分異なる生物学的挙動を与える傾向がある。腫瘍の発達の経路、関連する標的遺伝子、及び遺伝的不安定の根底にある機構の理解によって、種々の型の結腸新生物を検出して治療するためのストラテジーを実行することが可能である。
【００５９】
この出願は、少なくとも部分的に、ある種の標的遺伝子は、標的遺伝子の５’隣接又はプロモーター領域内のＣｐＧアイランドの差次的メチル化によって、サイレンシング又は不活性化することができるという認識に基づいている。ＣｐＧアイランドは、ＤＮＡ配列中のシトシン−グアニン残基のクラスターであり、これは、我々のゲノムにおいて、約半分の遺伝子の５’隣接領域又はプロモーター領域内に顕著に表れる。特に、この出願は、少なくとも部分的に、ビメンチンヌクレオチド配列の差次的メチル化は結腸新生物を示すことができるという認識に基づいている。一面において、この出願は、ビメンチン遺伝子が、癌細胞(例えば、結腸新生物)におけるメチル化及び後成的遺伝子サイレンシングの一般的標的でありえて、候補の腫瘍抑制遺伝子として機能しうることを開示する。
【００６０】
ビメンチンは、細胞質の中間径フィラメント(ＩＦ)を形成する細胞骨格タンパク質の一つである。細胞骨格は、マイクロフィラメント、微小管、及び中間径フィラメント３つの異なるクラスからなる。中間径フィラメントは、高等真核生物の細胞骨格の腫瘍成分である。ビメンチンは、繊維芽細胞及び内皮細胞などの間充織細胞に特徴的なＩＦタンパク質である(例えば、Evans, 1998, BioEssays, 20:79-86参照)。ビメンチンの発現は、発生において調節され、これは、このタンパク質の細胞内の足場としての役割以外の重要な機能を示唆している。ビメンチンは、ｃ−ｆｏｓ、ｆｒａ１、ＣＲＥＢ及びｃ−ｊｕｎなどのある種の転写因子のＤＮＡ結合領域と構造的配列類似性を共有しており、これは、ビメンチンの調節的役割を更に示唆している(例えば、Capetanaki等、1990, Oncogene, 5:645-655参照)。最近、ビメンチンが、サイトゾルホスホリパーゼＡ２の機能的核周囲アダプターとして作用するということが示され、これは、プロスタグランジンの生合成の調節におけるビメンチンＩＦの役割を示唆している(例えば、Murakami等、2000, Biochem Biophys Acta, 1488:159-66参照)。幾つかのタンパク質は、ビメンチンとの幾らかの相互作用を有するとして報告されている：例えば １）フィラメント結合タンパク質例えばプレクチン及びＩＡＦ−３００(Svitkina等、1996, J Cell Biol, 135:991-1007；Yang等、1985, J Cell Biol, 100:620-631)；２）シャペロンタンパク質例えばＨｓｃ７０及びアルファ−クリスタリン(Lee等、1995, J Cell Biol, 57:150-162；Nicholl等、1994, EMBO J, 13:945-953)；３）キナーゼ例えばプロテインキナーゼＣ(ＰＫＣ)、ｃＧＭＰキナーゼ及びＹｅｓキナーゼ(Murti等、1992, Exp Cell Res, 202:36-44；Owen等、1996, Exp Cell Res, 225:366-373；Pryzwansky等、1995, Blood, 85:222-230；Ciesielski-Treska等、1996, Eur J Cell Biol, 68:369-376)。加えて、ビメンチンの１４−３−３タンパク質との会合を、ホスファターゼインヒビターカリクレインＡによる処理により誘導することができる(Tzivion等、2000, J Biol Chem, 275:29772-8)。１４−３−３タンパク質は、それらの標的に、該標的タンパク質上に存在する特異的なセリン／スレオニンリン酸化モチーフによって結合する。この結合が、シグナル変換及び細胞周期の制御に関与する様々なキータンパク質のリン酸化依存性の調節において決定的なステップであることはありそうなことである。更に、Ｃｄｃ４２Ｈ及びＲａｃ１ ＧＴＰアーゼ(２つのＲｈｏファミリーメンバー)は、チロシンリン酸化事象を含むビメンチンＩＦの組織化を制御することができるということが示されている。例えば、活性なＣｄｃ４２Ｈ及びＲａｃ１の発現は、核周囲の崩壊を示すＩＦネットワークの再編成へと導いた(Meriane等、2000, J Biol Chem, 275:33046-52)。
【００６１】
上記のように、結腸新生物の初期の検出は、適当な介入と共に、患者の生存率の増加のために重要である。現在の結腸新生物をスクリーニングするためのシステムは、特異性及び／又は感度の欠如(例えば、便潜血試験、可撓性Ｓ字結腸鏡検査)又は高いコスト及び医用資源(例えば、結腸鏡検査)の集中的利用を含む様々な理由の故に、不十分なものである。結腸新生物の検出のための別のシステムは、広範な他の臨床環境でも有用であろう。例えば、結腸癌の外科手術及び／又は薬物療法を受ける患者は、再発を経験しうる。かかる患者が、再発した結腸新生物を有するかどうかを測定する別のシステムを有することは有利であろう。更なる例として、別の診断システムは、結腸新生物を有することが知られた患者における結腸新生物の増減又は残存の監視を容易にするであろう。化学療法を受ける患者を監視して、該両方の効力を評価することができる。
【００６２】
ＩＩＩ．ビメンチンの核酸、ポリペプチド、及び抗体
本発明は、少なくとも部分的に、ビメンチンのヌクレオチド配列は、ある種のビメンチン関連新生物例えば結腸新生物において、差次的にメチル化されるという観察に基づいている。一面において、この出願は、ビメンチン関連新生物において差次的にメチル化されるある領域を有するビメンチンのヌクレオチド配列例えばSEQ ID NO:２及び４５並びにそれらの断片を開示する。従って、一具体例において、この出願は、差次的にメチル化された核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である単離された又は組換えにより生成されたヌクレオチド配列を提供する(ここに、差次的メチル化核酸配列の何れか一つにおけるメチル化の検出は、ビメンチン関連新生物例えば結腸新生物を示す)。当業者は、SEQ ID NO:２及び４５並びにそれらの変異体と相補的なビメンチン核酸配列も又、この発明の範囲内にあることを認めるであろう。かかる変異体ヌクレオチド配列は、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加又は欠失により異なる配列例えばアレル変異体を包含する。
【００６３】
更に別の具体例において、ビメンチンヌクレオチド配列は又、高度にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:２又は４５に示したヌクレオチド配列並びにそれらの断片とハイブリダイズするヌクレオチド配列をも包含する。上記のように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件が変化しうることを容易に理解するであろう。例えば、ハイブリダイゼーションを、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)で、約４５℃で行なってから、２．０×ＳＳＣで、５０℃での洗浄を行なうことができる。例えば、洗浄ステップでの塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ(５０℃)の低ストリンジェンシーから約０．２×ＳＳＣ(５０℃)の高ストリンジェンシーから選択することができる。加えて、洗浄ステップの温度は、室温(約２２℃)の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増大させることができる。温度と塩の両方を変えることもできるし、又は温度若しくは塩濃度を一定に維持しつつ他の変数を変えることもできる。一具体例において、この発明は、６×ＳＳＣ(室温)の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸(ハイブリダイズ後、室温で２×ＳＳＣで洗浄する)を提供する。
【００６４】
更に別の面において、この出願は、SEQ ID NO:２若しくは４５又はこれらの断片のヌクレオチド配列のメチル化形態(該配列中に存在するＣｐＧアイランドのシトシン塩基はメチル化されている)を提供する。換言すれば、これらのビメンチンヌクレオチド配列は、メチル化された状態(例えば、ビメンチン関連新生物で見られるように)であってもよいし、メチル化されていない状態(例えば、正常細胞で見られるように)であってもよい。更なる具体例において、この発明のビメンチンヌクレオチド配列は、単離することができ、組換えによるものであってよく、及び／又は異質ヌクレオチド配列と融合したものであってよいし、或はＤＮＡライブラリー中にあってもよい。
【００６５】
差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列に加えて、構成的にメチル化されたヌクレオチド配列も又、ビメンチン配列中に存在する(例えば、Ａｌｕリピート及びＣ領域内のＡｌｕでない構成的にメチル化された領域)。構成的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列は、正常細胞及び癌細胞の両方でメチル化されているので、当業者は、ここに与えたように差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列を検出することの重要性を認めるであろう。
【００６６】
ある具体例において、本発明は、重亜硫酸塩変換されたビメンチンテンプレートＤＮＡ配列例えばSEQ ID NO:３〜４、６〜７、４６〜４７及び４９〜５０並びにこれらの断片を提供する。かかる重亜硫酸塩変換されたビメンチンテンプレートＤＮＡは、例えばＭＳＰ反応により又は直接的配列決定によって、メチル化状態の検出に利用することができる。これらの重亜硫酸塩変換されたビメンチン配列は又、重亜硫酸塩変換後に、メチル化又は非メチル化ビメンチンテンプレートを特異的に検出するＭＳ−ＰＣＲ反応用のプライマーのデザインにも有用である。更に別の具体例において、この発明の重亜硫酸塩変換されたビメンチンヌクレオチド配列は又、高度にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:３〜４、６〜７、４６〜４７及び４９〜５０から選択する任意のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列をも包含する。
【００６７】
更なる面において、この出願は、かかる重亜硫酸塩変換されたヌクレオチド配列を製造する方法を提供し、例えば、この出願は、ヌクレオチド配列を、重亜硫酸塩剤で処理し、それで、非メチル化シトシン塩基が異なるヌクレオチド塩基例えばウラシルに変換される方法を提供する。
【００６８】
更に別の面において、この出願は、SEQ ID NO:８〜３９の何れか一つ又は図３５に列記した何れか一つのビメンチン核酸配列内の領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。ある面において、一対のオリゴヌクレオチドプライマー(例えば、SEQ ID NO:８〜１３)は、検出アッセイ例えばＨｐａＩＩアッセイにおいて利用することができる。ある面において、ＭＳＰ反応で利用するプライマーは、特異的に、メチル化ビメンチンＤＮＡと非メチル化ビメンチンＤＮＡ(例えば、SEQ ID NO:１４〜３９又は図３５に列記したプライマー)を識別することができる。
【００６９】
この発明のプライマーは、ビメンチン核酸の増幅の特異的な開始を与えるのに、十分な長さ及び適当な配列を有している。この発明のプライマーは、増幅すべきビメンチン核酸配列の各鎖に「実質的に」相補的であるようにデザインされる。典型的プライマーは、SEQ ID NO:８〜３９及び図３５に与えてあるが、SEQ ID NO:２又は４５の重亜硫酸塩変換されたビメンチン配列とハイブリダイズする任意のプライマーは、この発明の範囲内に含まれ且つ上記のように、メチル化核酸を検出するためのこの発明の方法において有用であるということは理解される。同様に、SEQ ID NO:２又は４５の差次的メチル化領域内のメチル化感受性制限部位を増幅するのに役立つであろう任意のプライマーが、この発明の範囲内に含まれること及びそれが、記載したように、メチル化核酸の検出のためのこの発明の方法において有用であるということは理解される。
【００７０】
この発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の適当な方法例えば慣用のホスホトリエステル及びホスホジエステル法又はその自動化された具体例を利用することにより、製造することができる。かかる自動化された具体例の一つにおいて、ジエチルホスホルアミダイトが、出発物質として利用され、Beaucage等により記載されたように合成することができる(Tetrahedron Letters, 22:1859-1862, 1981)。改変固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成のための一つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【００７１】
この出願で利用した様々な配列同定番号(配列番号)を下記の表Ｉにまとめた。
【００７２】
【表１−１】
【００７３】
【表１−２】
【００７４】
ある別の面において、この発明は、SEQ ID NO:１のビメンチンポリペプチドをコードするビメンチン核酸及びその変異体と関係する。変異体は、少なくとも一つのヌクレオチドの置換、付加又は欠失によって異なる配列(アレル変異体など)を含み、それ故、このコード配列のヌクレオチド配列と、例えば遺伝コードの縮重のために異なるコード配列を含む。ある具体例において、変異型核酸は、高度にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:１をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列をも含む。
【００７５】
遺伝コードの縮重のためにSEQ ID NO:１をコードする核酸と異なる単離されたビメンチン核酸も又、この発明の範囲内にある。例えば、幾らかのアミノ酸は、一つより多くのトリプレットにより示される。同じアミノ酸を特定するコドン、即ちシノニム(例えば、CAUとCACは、ヒスチジンに対するシノニムである)は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じうる。しかしながら、主題のタンパク質のアミノ酸配列の変化へと導くＤＮＡ配列の多型が哺乳動物細胞中に存在するであろうことは予想される。当業者は、これらの、特定のタンパク質をコードする核酸の少なくとも１ヌクレオチド(最大でヌクレオチドの約３〜５％)の変異が、所定の種の個体中に、自然のアレル変異のために存在しうることを認めるであろう。任意の及びすべてのかかるヌクレオチド変異及びその結果生じるアミノ酸多型は、この発明の範囲内にある。
【００７６】
ある具体例において、組換えビメンチン核酸は、発現用構築物において、少なくとも１つの調節用ヌクレオチド配列と作動的に結合させることができる。調節用ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために用いる宿主細胞に適している。様々な宿主細胞用の、多くの種類の適当な発現ベクター及び適当な調節用配列が、当分野では知られている。典型的には、該少なくとも一つの調節用ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結用配列、翻訳開始及び終結用配列ならびにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれうるが、これらに限られない。当分野で公知の構成的又は誘導性プロモーターは、この発明により企図される。これらのプロモーターは、天然のプロモーターであってもよいし、一つより多くのプロモーターのエレメントを合わせたハイブリッドプロモーターであってもよい。発現用構築物は、細胞内で、エピソーム上にプラスミドとして存在しうるし、又は染色体中に組み込まれることもできる。好適具体例において、この発現ベクターは、トランスフォームされた宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、当分野で周知であり、用いる宿主細胞によって変化する。
【００７７】
ある面において、この発明は、ここに記載のビメンチンポリペプチド(SEQ ID NO:１)及びその変異体ポリペプチドに関係する。ある具体例において、変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO:１に示したアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する。他の具体例において、この変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO:１に示したアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７８】
ある面において、変異型ビメンチンポリペプチドは、SEQ ID NO:１に示したビメンチンポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストである。これらのポリペプチドの変異体は、過度の又は構成的な活性を有しうるし、或は、ビメンチンの腫瘍抑制性を妨げうる。例えば、少なくとも一つのドメインを欠く先端切除型は、優性ネガティブ効果を有しうる。
【００７９】
ある面において、ビメンチンポリペプチドの単離されたペプチド性部分は、SEQ ID NO:１に示したポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えにより生成したポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、断片は、当分野で公知の技術例えば慣用のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学を利用して、化学合成することができる。これらの断片を生成し(組換えにより又は化学合成によって)、試験して、ビメンチンの腫瘍抑制機能のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能しうるペプチド性断片を同定することができる。
【００８０】
ある面において、様々なビメンチンポリペプチドは、少なくとも一つの融合ドメインを含む。かかる融合ドメインの周知の例には、例えば、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＣ、及び免疫グロブリン重鎖定常領域(Ｆｃ)、マルトース結合性タンパク質(ＭＢＰ)が含まれ、これらは、融合ポリペプチドのアフィニティークロマトグラフィーによる単離に特に有用である。アフィニティー精製の目的のためには、アフィニティークロマトグラフィー用の適当なマトリクス例えばグルタチオン−、アミラーゼ−、及びニッケル−又はコバルト−結合された樹脂を利用する。多くのかかるマトリクスは、(HIS6)融合パートナーを利用すると有用であるPharmacia GST 精製システム及びQIAexpress(商標)システム(Qiagen)などの「キット」形態で入手可能である。当分野で周知の他の融合ドメインは、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)である。この融合パートナーは、蛍光「タグ」として役立ち、これは、この発明の融合ポリペプチドを、蛍光顕微鏡により又はフローサイトメトリーによって同定することを可能にする。このＧＦＰタグは、融合ビメンチンポリペプチドの細胞内局在性を評価する場合に、有用である。このＧＦＰタグは又、融合ビメンチンポリペプチドを発現する細胞の、蛍光活性化セルソーティング(ＦＡＣＳ)などのフローサイトメトリー法による単離にも有用である。融合ドメインは又、「エピトープタグ」をも包含し、これらは、通常、短いペプチド配列であって、それらに対する特異的モノクローナル抗体を利用することができる。特異的モノクローナル抗体を容易に利用することのできる周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(ＨＡ)、及びｃ−ｍｙｃタグが含まれる。幾つかの場合に、これらの融合ドメインは、適当なプロテアーゼが融合ビメンチンポリペプチドを部分消化し、それにより組換えポリペプチドがそこから遊離することを可能にするプロテアーゼ開裂部位(例えば、因子Ｘａ又はトロンビン用)を有する。遊離したポリペプチドは、その後、融合パートナーから、引き続いてのクロマトグラフィーによる分離によって単離することができる。
【００８１】
この発明の他の面は、ビメンチンポリペプチドのエピトープと特異的に免疫反応性の単離された抗体と関係する。例えば、ビメンチンポリペプチドに由来する免疫原を利用することにより(例えば、ｃＤＮＡ配列に基づいて)、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体を、標準的プロトコール(例えば、Antibodies：A Laboratory Manual Harlow及びLane編(Cold Spring Harbor Press: 1988)参照)により作成することができる。哺乳動物例えばマウス、ハムスター又はウサギを、ビメンチンペプチドの免疫原型で免疫化することができる。タンパク質又はペプチドに免疫原性を与えるための技術には、キャリアーへの結合又は他の当分野で周知の技術が含まれる。ポリペプチドの免疫原性部分をアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価の検出によりモニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡ又は他の免疫アッセイを、免疫原を抗原として利用して、抗体レベルを評価することができる。
【００８２】
ある具体例において、この発明の抗体は、ビメンチン関連疾患の検出又は治療のための診断剤又は治療剤として有用でありうる。
【００８３】
用語「抗体」は、ここで用いる場合、ビメンチンポリペプチドの一つとやはり特異的に反応するその断片を包含することを意図している。抗体は、慣用の技術を利用して、断片化することができ、それらの断片は、有用性について、全抗体について上記したものと同じ仕方でスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ab)2断片は、抗体をパパインで処理することにより生成することができる。その結果生成したＦ(ab)2断片を、ジスルフィドブリッジを還元するように処理して、Ｆab断片を生成することができる。この発明の抗体は、更に、ビメンチンタンパク質に対する親和性を有する複特異性、一本鎖、並びにキメラ及びヒト化分子を含むことを意図している。好適具体例において、この抗体は、更に、それに結合されて検出されうる標識(例えば、この標識は、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素又は酵素の補因子であってよい)をも含む。
【００８４】
ＩＶ．アッセイ及び薬物スクリーニング方法論
ある面において、この出願は、ビメンチンヌクレオチド配列を、健康な細胞とビメンチン関連疾患の細胞を識別する分子マーカーとして利用するアッセイ及び方法を提供する。例えば、一具体例において、この出願は、ビメンチンヌクレオチド配列を、健康な細胞と結腸新生物細胞を識別するマーカーとして利用する方法及びアッセイを提供する。一面において、この発明の分子マーカーは、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列である。他の面において、ここに与える他のマーカーは、ビメンチン遺伝子の発現産物である。
【００８５】
ある具体例において、この発明は、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列例えばＢ及びＣ領域内に見られる差次的メチル化パターン(例えば、SEQ ID NO:４５)を検出するためのアッセイを提供する。従って、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列は、そのメチル化状態において、ビメンチン関連新生物特異的改変でありうる(それは、ここに記載した様々な方法及び、この出願の教示の故に、当業者の知識範囲の内にある方法を利用する検出のための標的として役立つ)。
【００８６】
ある面において、メチル化ビメンチンヌクレオチド配列を検出するためのかかる方法は、ビメンチンのゲノムＤＮＡの、非メチル化Ｃを異なるヌクレオチド塩基に変換するが、メチル化Ｃ(即ち、５ｍＣ)は変換しない化学化合物での処理に基づいている。一つのかかる化合物は、重亜硫酸ナトリウムであり、これは、ＣをＵに変換するが、５ｍＣは変換しない。ＤＮＡの重亜硫酸塩での処理方法は、当分野で公知である(Herman等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93:9821-6；Herman及びBaylin, 1998, Current Protocols in Human Genetics, N.E.A. Dracopoli編、John Wiley & Sons, 2:10.6.1-10.6.10；米国特許第５，７８６，１４６号)。説明のために、非メチル化Ｃヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を重亜硫酸ナトリウムで処理して化合物変換されたＤＮＡとする場合には、そのＤＮＡの配列は、変化する(Ｃ→Ｕ)。変換されたヌクレオチド配列中のＵの検出は、非メチル化Ｃを示す。
【００８７】
化合物変換されたヌクレオチド配列中に存在する異なるヌクレオチド塩基(例えば、Ｕ)は、その後、様々な方法で検出することができる。好適具体例において、本発明は、化合物変換されたビメンチンＤＮＡ配列中のＵを、「メチル化感受性ＰＣＲ」(ＭＳＰ)を利用することにより検出する方法を提供する(例えば、Herman等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93:9821-9826；米国特許第６，２６５，１７１号；米国特許第６，０１７，７０４号；米国特許第６，２００，７５６号参照)。ＭＳＰにおいて、一組のプライマー(即ち、フォワード及びリバースプライマー)は、この化合物変換されたテンプレート配列を、もしビメンチンＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されているなら、増幅する。このプライマーのセットは、「メチル化特異的プライマー」と呼ばれる。他のプライマーのセットは、化合物変換されたテンプレート配列を、もしビメンチン５’隣接配列中のＣｐＧジヌクレオチド内のＣ塩基がメチル化されてないならば、増幅する。このプライマーのセットは、「非メチル化特異的プライマー」と呼ばれる。
【００８８】
ＭＳ−ＰＣＲにおいて、これらの反応は、被験者の試料由来の化合物変換されたＤＮＡを利用する。ビメンチンメチル化ＤＮＡのアッセイにおいては、メチル化特異的プライマーを利用する。そのＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチド中のＣがメチル化されている場合には、これらのメチル化特異的プライマーは、化合物変換されたテンプレート配列をポリメラーゼの存在下で増幅し、ＭＳＰ産物が生成されるであろう。もしＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチド中のＣがメチル化されていなければ、メチル化特異的プライマーは、ポリメラーゼの存在下でも化合物変換されたテンプレートを増幅せず、ＭＳＰ産物も生成されないであろう。
【００８９】
非メチル化ビメンチンＤＮＡの検出のために対照用反応を行なうことは、やはり、しばしば有用である。これらの反応は、被験者の試料由来の化合物変換されたＤＮＡを利用し、非メチル化特異的プライマーを利用する。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチド中のＣがメチル化されていない場合には、非メチル化特異的プライマーは、ポリメラーゼの存在下で化合物変換されたテンプレート配列を増幅して、ＭＳＰ産物が生成されるであろう。もしＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチド中のＣがメチル化されていれば、非メチル化特異的プライマーは、ポリメラーゼの存在下でも化合物変換されたテンプレート配列を増幅せず、ＭＳＰ産物は、生成されないであろう。生物学的試料は、しばしば、メチル化特異的プライマーによりシグナルを生じる新生物細胞と、非メチル化特異的プライマーによりシグナルを生じる正常細胞エレメントの両方の混合物を含むことに注意されたい。非メチル化特異的シグナルは、しばしば、対照用反応として有用であるが、この場合は、メチル化特異的プライマーを利用する反応に由来する陽性シグナルにより示されるように、結腸新生物の非存在を意味しない。
【００９０】
ＭＳＰ反応のためのプライマーは、化合物変換されたビメンチンテンプレート配列から導かれる。ここでは、「から導かれる」は、それらのプライマーの配列が、化合物変換されたテンプレート配列をＭＳＰ反応において増幅するように選択されることを意味する。各プライマーは、少なくとも８ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡ断片を含む。好ましくは、これらのプライマーは、５０ヌクレオチド長未満であり、一層好ましくは、１５〜３５ヌクレオチド長である。化合物変換されたビメンチンテンプレート配列は、重亜硫酸ナトリウムで処理される二本鎖ＤＮＡのワトソン鎖又はクリック鎖の何れであってもよいので、これらのプライマーの配列は、ワトソン又はクリック化合物変換されたテンプレート配列の何れが、ＭＳＰにおいて増幅するために選択されるかどうかに依存している。ワトソン又はクリック鎖の何れも、増幅するために選択することができる。
【００９１】
この化合物変換されたビメンチンテンプレート配列(及び、それ故、ＭＳＰ反応の産物)は、２０〜３０００ヌクレオチド長、好ましくは５０〜５００ヌクレオチド長、一層好ましくは８０〜１５０ヌクレオチド長であってよい。好ましくは、これらのメチル化特異的プライマーは、非メチル化特異的プライマーにより生成されたＭＳＰ産物とは異なる長さのＭＳＰ産物を生じる。
【００９２】
様々な方法を利用して、ＭＳＰ産物が、反応アッセイにおいて生成されたかどうかを決定することができる。ＭＳＰ産物がこの反応アッセイで生成されたかどうかを決定するための一つの方法は、その反応の一部分をアガロースゲル電気泳動によって分析することである。例えば、０．６〜２．０％アガロースの水平アガロースゲルを作成して、ＭＳＰ反応混合物の一部分を、そのアガロースゲル中を電気泳動させる。ＭＳＰ産物は、紫外光によるイルミネーション中に見れば、可視的である。標準化したサイズマーカーとの比較により、ＭＳＰ産物が、正しい予想されたサイズのものであるかどうかを決定することができる。
【００９３】
他の方法を利用して、産物がＭＳＰ反応において作られたかどうかを決定することもできる。一つのかかる方法は、「リアルタイムＰＣＲ」と呼ばれる。リアルタイムＰＣＲは、螢光計(即ち、蛍光を測定する機器)を組み込んだサーマルサイクラー(即ち、ＰＣＲ反応に必要な温度変化を与える機器)を利用する。このリアルタイムＰＣＲ反応用混合物は又、産物への組込みを定量することができて、その定量がテンプレート中のその配列のコピー数を示す試薬をも含有する。一つのかかる試薬は、選択的に二本鎖ＤＮＡに結合して、その蛍光が二本鎖ＤＮＡに結合することによって大幅に増強されるＳＹＢＲグリーンＩ(Molecular Probes, Inc.; オレゴン、Eugene在)と呼ばれる蛍光染料である。ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲグリーンＩの存在下で行なう場合には、その結果生成したＤＮＡ産物は、ＳＹＢＲグリーンＩに結合して、蛍光を生じる。この蛍光は、蛍光計によって検出されて定量される。かかる技術は、ＰＣＲ反応における産物の量の定量に特に有用である。加えて、このＰＣＲ反応の産物は、「リアルタイムＰＣＲ」において、その産物にハイブリダイズする様々なプローブ(ＴａｑＭａｎプローブ及び分子ビーコンを含む)を利用して定量することができる。測定は、絶対的基礎の上にあってよいし、又は構成的にメチル化されたＤＮＡ鎖に対して相対的なものであってもよいし、又はメチル化されてないＤＮＡ鎖に対するものであってもよい。一例において、メチル化ビメンチン由来の産物の非メチル化由来のビメンチン産物に対する比を構築することができる。
【００９４】
この発明においてビメンチンＤＮＡのメチル化を検出する方法は、ＭＳＰに限られず、ＤＮＡのメチル化を検出するための任意のアッセイをカバーすることができる。ビメンチンＤＮＡのメチル化を検出するための他の例の方法は、「メチル化感受性」制限エンドヌクレアーゼの利用によるものである。かかる方法は、被験者から単離したゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理してからその制限エンドヌクレアーゼ処理したＤＮＡをＰＣＲ反応においてテンプレートとして利用することを含む。ここでは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ中の特異的配列を認識して、もし認識配列中のＣ塩基がメチル化されてなければ開裂させる。もしこの制限エンドヌクレアーゼの認識配列中のＣ塩基がメチル化されていれば、そのＤＮＡは開裂されない。かかるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの例には、ＨｐａＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩＩ、ＥａｇＩ、ＭｓｐＩ、ＢｓｔＵＩ及びＢｓｓＨＩＩが含まれるが、これらに限られない。この技術において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのための認識配列は、テンプレートＤＮＡ中に、ＰＣＲ反応に利用されるフォワード及びリバースプライマーの間に位置している。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ認識配列中のＣ塩基がメチル化されていない場合には、該エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡテンプレートを開裂し、該ＰＣＲ反応において該ＤＮＡがテンプレートとして利用された場合にはＰＣＲ産物は形成されないであろう。このメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ認識配列中のＣ塩基がメチル化されている場合には、該エンドヌクレアーゼは、該ＤＮＡテンプレートを開裂せず、該ＤＮＡがＰＣＲ反応においてテンプレートとして利用された場合にはＰＣＲ産物が形成されるであろう。それ故、Ｃ塩基のメチル化は、ＰＣＲ産物の存否によって測定されうる(Kane等、1997, Cancer Res, 57:808-11)。この技術では、重亜硫酸ナトリウムは、利用しない。
【００９５】
ビメンチンＤＮＡのメチル化を検出するための、更に別の典型的方法は、改変ＭＳＰと呼ばれ、この方法は、ＭＳＰ反応の産物が、化合物変換されたテンプレート配列がＣｐＧジヌクレオチドを含むかＵｐＧジヌクレオチドを含むかに依って、制限エンドヌクレアーゼによる消化を受けることができるようにデザインされて選ばれたプライマーを利用する。
【００９６】
ビメンチンＤＮＡのメチル化を検出するための更に別の方法には、ＭＳ−ＳｎｕＰＥ法が含まれる。この方法は、化合物変換されたビメンチンＤＮＡを、プライマー伸長反応におけるテンプレートとして利用し、該反応において、利用したプライマーは、産物を、化合物変換されたテンプレートがＣｐＧジヌクレオチドを含むかＵｐＧジヌクレオチドを含むかに依存して生成する(例えば、Gonzalgo等、1997, Nucleic Acids Res., 25:2529-31参照)。
【００９７】
ビメンチンＤＮＡのメチル化を検出するための別の典型的な方法は、ＣＯＢＲＡ(即ち、combined bisulfite restriction analysis)と呼ばれる。この方法は、ＤＮＡのメチル化の検出のために日常的に用いられてきており、当分野で周知である(例えば、Xiong等、1997, Nucleic Acids Res, 25:2532-4参照)。
【００９８】
ある具体例において、この発明は、ＭＳＰ反応から生成した産物を直接配列決定して、化合物変換されたビメンチンテンプレート配列がＣｐＧジヌクレオチドを含むのかＵｐＧジヌクレオチドを含むのかを決定することを含む方法を提供する。分子生物学の技術例えばＰＣＲ産物の直接的配列決定は、当分野で周知である。
【００９９】
別の具体例において、当業者は、本発明が、部分的に、ビメンチンは、腫瘍抑制遺伝子として機能しうるという認識に基づいていることを認めるであろう。従って、ある面において、この発明は、健康な細胞とビメンチン関連疾患の細胞例えば結腸新生物細胞を識別する分子マーカーを検出するためのアッセイを提供する。上記のように、本願の分子マーカーの一つは、メチル化ビメンチンヌクレオチド配列を含む。従って、一具体例において、このビメンチンヌクレオチド配列のメチル化状態のアッセイは、ビメンチンサイレンシング関連疾患の検出のために、モニターすることができる。
【０１００】
この出願は、更に、別の分子マーカーであるビメンチン遺伝子の発現転写物又は遺伝子産物をも提供する。従って、他の具体例において、このビメンチン核酸又はタンパク質の発現を、ビメンチンサイレンシング関連疾患例えば結腸新生物の検出のために、モニターすることができる。
【０１０１】
ある具体例において、この発明は、患者が病気を有するかどうかを決定するために、上記のビメンチン分子マーカーをアッセイすることによる検出方法を提供する。更に、かかる病気は、ここに記載のビメンチン核酸又はタンパク質の減少した発現により特徴付けることができる。ある具体例において、この発明は、患者がビメンチン関連疾患を有することがありそうなことであるかどうかを、ビメンチンヌクレオチド配列の発現を検出することによって決定する方法を提供する。更なる具体例において、この発明は、患者が再発を有するかどうか又は患者の癌が治療に応答性であるかどうかを決定する方法を提供する。
【０１０２】
好適具体例において、この出願は、結腸新生物を検出する方法を提供する。ある具体例において、本発明は、ビメンチン遺伝子のサイレンシングと関連する結腸新生物を検出する方法を提供する。かかる方法は、メチル化されたビメンチンヌクレオチド配列の、被験者から得られた試料における存在についてアッセイすることを含む。他の面において、この発明は、患者が、結腸癌を有することがありそうかどうかを決定する方法と関係する。更なる面において、この発明は、被験者における結腸新生物をモニターする方法と関係する。
【０１０３】
ある具体例において、この発明は、ここに記載のビメンチンタンパク質又は核酸転写物を検出するためのアッセイを提供する。ある具体例において、この発明の方法は、生物学的試料を用意して、その生物学的試料を、ビメンチンの発現(ビメンチンのタンパク質又は核酸転写物を含む)につきプローブ検出することを含む。ビメンチンの発現状態(及び、適宜、ビメンチン発現の定量的レベル)に関する情報は、次いで、生物学的試料の性質に関する推論を引き出すために利用することができ、もしその生物学的試料が被験者から得られたものであるならば、その被験者の健康状態に関する推論を引き出すために利用することができる。
【０１０４】
ある具体例において、この発明の方法は、試料中のビメンチンタンパク質の存在を検出することを含む。適宜、この方法は、試料中のビメンチンタンパク質の定量的測定を得ることを含む。この明細書の故に、当業者は、他の泊質の存在を検出し、適宜、定量するために利用することのできる広範な技術を認識するであろう。好適具体例において、ビメンチンタンパク質は、抗体により検出される。多くの具体例において、抗体ベースの検出アッセイは、試料と抗体を接触させ、それで、該抗体が、対応するエピトープを有するタンパク質と結合する機会を有するようにすることを含む。多くの具体例において、抗体ベースの検出アッセイは又、典型的には、抗体エピトープ複合体の存在を検出し、それにより、対応するエピトープを有するタンパク質の存在の検出を達成するためのシステムをも含む。抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、免疫沈降、ウエスタンブロットを含む様々な検出技術において利用することができる。タンパク質の同定のための、抗体に依存しない技術も又、利用することができる。例えば、質量分析(特に、液体クロマトグラフィーと組み合せたもの)は、試料中の多数のタンパク質の検出と定量を可能にする。２次元ゲル電気泳動も又、タンパク質を同定するために利用することができ、質量分析又は他の検出技術例えばＮ末端タンパク質配列決定法と組み合せることができる。関心あるタンパク質に対する特異的結合を有するＲＮＡアプタマーも又、生成して、検出用試薬として利用することができる。
【０１０５】
試料は、一般に、用いる検出システムと一致する仕方で調製すべきである。例えば、タンパク質検出システムで利用される試料は、一般に、プロテアーゼの非存在下で調製すべきである。同様に、核酸検出システムで利用する試料は、一般に、ヌクレアーゼの非存在下で調製すべきである。多くの場合に、抗体ベースの検出システムで利用するための試料は、実質的な製造工程にかけられないであろう。例えば、尿は、唾液及び血液のように、直接利用されうる(血液は、ある種の好適具体例においては、血漿及び血清などの画分に分離されるが)。
【０１０６】
ある具体例において、この発明の方法は、試料中のビメンチンの発現された核酸例えばｍＲＮＡの存在を検出することを含む。適宜、この方法は、試料中のビメンチンの発現された核酸の定量的測定を得ることを含む。この明細書の故に、当業者は、核酸の存在を検出し、適宜、定量するために利用できる広範な技術を認めるであろう。核酸検出システムは、一般に、試料の精製核酸画分を調製すること、及び試料を直接検出アッセイ又は増幅工程とその後の検出アッセイにかけることを含む。増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写酵素(ＲＴ)及び結合させたＲＴ−ＰＣＲによって達成することができる。核酸の検出は、一般に、精製核酸画分を、関心ある核酸にハイブリダイズするプローブでプローブ検出することによって達成され、多くの場合に、検出は、増幅をも包含する。ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲは、すべて、試料中の核酸を検出するための周知の方法である。
【０１０７】
ある具体例において、この発明は、ビメンチン核酸に特異的に結合する核酸プローブを提供する。かかるプローブは、例えば、蛍光性成分、放射性核種、酵素又は親和性タグ例えばビオチン成分によって標識することができる。例えば、ＴａｑＭａｎ(登録商標)システムは、プローブが遊離のときに蛍光シグナルが消光し、一層大きい核酸に組み込まれたときに輝くような仕方で標識した核酸プローブを利用する。
【０１０８】
ビメンチンマーカーに向けられたモノクローナル抗体を利用するイムノシンチグラフィーを利用して、癌を検出及び／又は診断することができる。例えば、99テクネチウム、111インジウム、125ヨウ素で標識したビメンチンマーカーに対するモノクローナル抗体は、かかるイメージングに効果的に利用することができる。当業者には明らかとなるであろうが、投与すべき放射性同位体の量は、放射性同位体に依存している。当業者は、投与すべきイメージング剤の量を、活性成分として利用する所与の放射性核種の比放射能及びエネルギーに基づいて、容易に配合することができる。典型的には、投与量当たり０．１〜１００ミリキュリー、好ましくは、１〜１０ミリキュリー、最もしばしば、２〜５ミリキュリーのイメージング剤を投与する。従って、放射性成分と結合された標的成分を含むイメージング剤として有用な本発明の組成物は、０．１〜１００ミリキュリーを、幾つかの具体例において好ましくは１〜１０ミリキュリーを、幾つかの具体例において好ましくは２〜５ミリキュリーを、幾つかの具体例において一層好ましくは１〜５ミリキュリーを含む。
【０１０９】
ある具体例において、本発明は、ビメンチン遺伝子の腫瘍抑制機能を強化する試験化合物を同定するための薬物スクリーニングアッセイを提供する。一面において、これらのアッセイは、ビメンチンの発現レベルを強化する試験化合物を検出する。他の面において、これらのアッセイは、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化を阻止する試験化合物を検出する。ある具体例において、試験化合物を、それらの、ビメンチンポリペプチドの安定性又は機能に干渉する能力に基づいて検出する薬物スクリーニングアッセイを生成することができる。或は、単一の結合アッセイを利用して、ビメンチンポリペプチドとその相互作用するタンパク質(例えば、プレクチン、ＩＦＡＰ−３００、Ｈｓｃ７０、アルファ−クルスタリン、ＰＫＣ、ｃＧＭＰキナーゼ、又はＹｅｓキナーゼ)との間の相互作用又はビメンチンポリペプチドの標的ＤＮＡへの結合を阻止し又は強化する化合物を検出することができる。
【０１１０】
様々なアッセイ形式を利用することができ、本開示に照らして、ここに明白に記載していないものであっても、当業者の視野の内にあると考えられよう。アッセイ形式は、ビメンチン発現レベル、ビメンチン配列のメチル化状態、腫瘍抑制活性、中間フィラメント形成活性などの条件に近づくことができ、多くの異なる形態で生成することができる。多くの具体例において、この発明は、無細胞系と無傷の細胞を利用する細胞ベースのアッセイの両方を含むアッセイを提供する。
【０１１１】
試験すべき化合物は、例えば、細菌、酵母又は他の生物により生成することができ(例えば、天然物)、化学的に生成することができ(例えば、ペプチド模倣物を含む低分子)、又は組換えにより生成することができる。この化合物の効力は、様々な濃度の試験化合物を利用して得られたデータから投与量応答曲線を生成することにより評価することができる。その上、対照用アッセイを行なって、比較のためのベースラインを与えることもできる。対照用アッセイにおいては、複合体の形成を、試験化合物の非存在下で定量する。
【０１１２】
化合物のライブラリー及び天然抽出物を試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、高スループットアッセイは、所定時間内に調べられる化合物数を最大化するために望ましい。無細胞系(精製した若しくは半精製したタンパク質又は溶解物を利用して開発しうるものなど)において好適な本発明のアッセイは、しばしば、迅速な開発及び分子標的の試験化合物により媒介される変化の比較的容易な検出を可能にするように生成されうる点において、「一次」スクリーニングとして選ばれる。その上、試験化合物の細胞毒性の効果及び／又はバイオアベイラビリティーは、一般に、イン・ビトロ系では無視されうる。該アッセイは、主として、分子標的の他のタンパク質との結合親和性の変化又は酵素的特性の変化において現れうるような、薬物の分子標的に対する効果に集中する。
【０１１３】
ある具体例において、これらのアッセイから同定される試験化合物は、ビメンチン関連増殖性疾患を治療するための治療方法において利用することができる。
【０１１４】
この出願の更に別の面は、異質ビメンチン遺伝子を発現し、又は少なくとも一種類の組織又は細胞型において少なくとも一つのゲノムビメンチン遺伝子が破壊されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。例えば、ビメンチン遺伝子座が破壊されているトランスジェニックマウスを生成することができる。
【０１１５】
他の面において、この出願は、誤発現されるビメンチンアレルを有するビメンチン関連増殖性疾患についての動物モデルを提供する。例えば、ビメンチンアレルが欠失したマウス、又は少なくとも一つのビメンチンエキソンの全部又は部分が欠失したマウスを繁殖させることができる。かかるマウスモデルは、その後、ビメンチン遺伝子の誤発現から生じる病気の研究に利用することができる。
【０１１６】
従って、本願は、トランスジェニック動物であって、ビメンチン導入遺伝子を含む細胞(当該動物の細胞)からなり、好ましくは(適宜)、その動物の少なくとも一つの細胞において外因性ビメンチンタンパク質を発現する当該トランスジェニック動物を開示する。このビメンチン導入遺伝子は、このタンパク質の野生型をコードすることができ、又はその同族体(アゴニスト及びアンタゴニストの両方を含む)並びにアンチセンス構築物をコードすることができる。このビメンチン導入遺伝子は、ビメンチンヌクレオチド配列(例えば、SEQ ID NO:２)又はその断片を含むことができる。好適具体例において、この導入遺伝子の発現は、例えば、発現を所望のパターンに制御するシス作動性配列を利用する特定の細胞、組織又は発生段階のサブセットに限られる。
【０１１７】
位置特異的遺伝子操作によりイン・ビボで調節されうる導入遺伝子の発現を可能にする遺伝子技術は、当業者に公知である。例えば、標的配列の遺伝的組換えを触媒するレコンビナーゼの調節された発現を可能にする遺伝子システムが、利用可能である。ここで用いる場合、語句「標的配列」は、レコンビナーゼにより遺伝的組換えを受けるヌクレオチド配列を指す。この標的配列は、レコンビナーゼ認識配列と隣接しており、一般に、レコンビナーゼ活性を発現する細胞で切り出され又は逆転される。レコンビナーゼに触媒される組換え事象は、標的配列の組換えが、ビメンチンポリペプチドの発現の活性化又は抑制を生じるようにデザインすることができる。例えば、組換えビメンチン遺伝子の発現に干渉する標的配列の切り出しをデザインして、その遺伝子の発現を活性化することができる。このタンパク質の発現への干渉は、様々な機構例えばビメンチン遺伝子のプロモーターエレメントからの空間的分離又は内部の停止コドンにより生じうる。その上、この導入遺伝子は、該遺伝子のコード配列が、レコンビナーゼ認識配列と隣接し、最初に、プロモーターエレメントに対して３’〜５’の向きで細胞にトランスフェクトされるようにすることができる。かかる場合において、標的配列の逆位は、主題の遺伝子に、コード配列の５’末端をプロモーターエレメントに関してプロモーターに駆動された転写活性化を可能にする方向に置くことによって、新しい方向を与える。
【０１１８】
説明用の具体例において、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステム(Lakso等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236；Orban等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6861-6865)又はサッカロミセス・セレビシエのＦＬＰレコンビナーゼシステム(O'Gorman等(1991)Science 251:1351-1355；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６９４)を利用して、イン・ビボの位置特異的な遺伝的組換えシステムを生成することができる。Ｃｒｅレコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列の間に位置する介在性標的配列の位置特異的な組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅレコンビナーゼが結合し、Ｃｒｅレコンビナーゼ媒介の遺伝的組換えに必要とされる、３４塩基対のヌクレオチドの反復配列である。ｌｏｘＰ配列の向きは、介在性標的配列が、Ｃｒｅレコンビナーゼが存在する場合に、切り出される又は逆転されるかどうかを決定し(Abremski等(1984)J.Biol.Chem.259:1509-1514)；ｌｏｘＰ配列が直列反復方向であれば標的配列の切り出しを触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆向反復の向きであれば標的配列の逆転を触媒する。
【０１１９】
Ｖ．被験者及び試料
ある面において、この発明は、ビメンチン関連疾患例えば結腸新生物を有することが疑われ又は有する被験者に関係する。或は、被験者は、日常的スクリーニングを受けていてよいし、必ずしもかかるビメンチン関連疾患を有することが疑われていなくてもよい。好適具体例において、この被験者は、ヒトの被験者であり、ビメンチン関連疾患は、結腸新生物である。
【０１２０】
結腸新生物を有することが知られていない被験者からの試料における上記のビメンチンマーカーについてのアッセイは、その被験者におけるかかる結腸新生物の診断において助けとなりうる。説明のために、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化状態のＭＳＰによる検出は、それだけで利用できるし、又は他の様々なアッセイと組み合わせて利用することにより、結腸新生物の検出の感度及び／又は特異性を改良することができる。好ましくは、かかる検出は、癌の発生の初期の段階でなされ、それで、治療が有効であることは、一層ありそうなこととなる。
【０１２１】
診断に加えて、結腸新生物を有することが知られていない被験者からの試料におけるビメンチンマーカーのアッセイは、その被験者の予後予測となりうる(即ち、この病気のありそうな経過を指示する)。説明のために、結腸新生物を発生する素因を有する被験者は、メチル化ビメンチンヌクレオチド配列を有しうる。被験者からの試料におけるビメンチンマーカーのアッセイは又、その被験者の結腸新生物に対して特に有効な特定の治療を選択するために、又は有効でありそうにない治療を排除するために利用することもできる。
【０１２２】
ビメンチン遺伝子のサイレンシングと関係する癌を有する(又は有していた)ことが知られている被験者からの試料におけるビメンチンマーカーのアッセイも又、有用である。例えば、本発明の方法を利用して、治療がある被験者にとって有効かどうかを同定することができる。少なくとも一つの試料を、同じ被験者から、治療の前後に採取して、ビメンチンマーカーについてアッセイする。治療前に採った試料中にビメンチンマーカーが存在して治療後には存在しない(又は、低レベルである)という発見は、その治療が有効であって変更する必要がないことを示している。治療前に採った試料中及び治療後に採った試料中にビメンチンマーカーが存在する場合には、癌が被験者において根絶される見込みを増大させるために治療を変更することが望ましい。従って、本発明の方法は、治療に対する患者の応答を測定するために用いられる一層侵襲的な手順を実行する必要性を回避することができる。
【０１２３】
癌は、進行癌の患者において、治療後に頻繁に再発する。この場合及び他の場合において、この発明のアッセイは、ビメンチン遺伝子のサイレンシングと関連する癌の状態を経時的にモニターするのに有用である。癌が進行している被験者については、最初の試料を採取したときには幾つかの又はすべての試料にビメンチンマーカーが存在せず、その後、第二の試料を採取したときに少なくとも一つの試料に出現することがありうる。癌が退行している被験者については、ビメンチンマーカーは、最初の試料を採ったときに一つ又は幾つかの試料中に存在して、その後、第二の試料を採ったときにはこれらの試料の幾つか又は全部に存在しないことがありうる。
【０１２４】
ここに記載した方法を利用する試料は、本質的に、関心ある如何なる生物学的材料であってもよい。例えば、試料は、被験者からの体液試料、被験者からの組織試料、被験者からの固体又は半固体試料、被験者に由来する一次細胞培養物又は組織培養物、細胞株からの細胞、又は細胞若しくは組織培養物からの培地若しくは他の細胞外物質、又は異種移植片(第二の被験者例えば免疫無防備マウス中で培養された第一の被験者例えばヒトからの癌の試料を意味する)であってよい。用語「試料」は、ここで用いる場合、被験者から直接得られる生物学的材料(一次試料として記載されうる)並びに一次試料の任意の操作された形態又は部分の両方を包含することを意図している。試料は又、生物学的材料を外因性液体と接触させて、その接触した生物学的材料の幾らかの部分を含む洗浄液を生成することによっても得ることができる。その上、用語「試料」は、少なくとも一種の添加剤例えば防腐剤、キレート化剤、抗凝固因子などと混合した後の一次試料を包含することを意図している。
【０１２５】
ある具体例において、体液試料は、血液試料である。この場合には、用語「試料」は、患者から直接得られた血液のみならず、血液の画分例えば血漿、血清、細胞画分(例えば、血小板、赤血球及びリンパ球)、タンパク質調製物、核酸調製物などをも包含することを意図している。ある具体例において、体液試料は、尿試料又は結腸排出物試料である。ある具体例において、体液試料は、大便試料である。
【０１２６】
被験者は、好ましくは、ヒトの被験者であるが、ここに開示した分子マーカー(特に、他の動物に由来するそれらの同族体)は、他の動物においても同様に有用であるということは予想される。他の具体例において、生物学的材料の分離した部分を得ることなく、生物体中で直接ビメンチンマーカーを検出することは可能であろう。かかる場合には、用語「試料」は、検出工程に含まれる試薬又はデバイスと接触する生物学的材料の部分を包含することを意図している。
【０１２７】
ある具体例においては、ＭＳＰ反応においてテンプレートとして利用されるＤＮＡは、体液試料から得られる。好適な体液の例は、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、結腸排出物又は尿である。他の体液も又、利用することができる。それらは、被験者から容易に得ることができ、多くの病気についてのスクリーニングのために利用することができ、血液及び血液由来の画分は、特に有用である。例えば、結腸直腸癌の患者におけるＤＮＡの変化を、被験者の血液において検出することができるということが示されている(Hibi等、1998, Cancer Res, 58:1405-7)。血液由来の画分は、血液、血清、血漿、又は他の画分を含むことができる。例えば、細胞画分は、５ｍｌの全血液を１０分間重力の８００倍で遠心分離することによって、「バフィーコート」(即ち、白血球富化血液部分)として調製することができる。赤血球は、最も速く沈降し、遠心管の最も底の画分として存在する。バフィーコートは、赤血球の上に薄いクリーム状の白い層として存在する。血液の血漿部分は、バフィーコートの上に層を形成する。血液由来の画分は又、他の様々な方法で単離することもできる。一つの方法は、特定のサイズ又は密度の細胞を富化させるための遠心分離で用いる勾配から画分を採取することによるものである。
【０１２８】
次いで、これらの体液由来の試料からＤＮＡを単離する。かかる試料からのＤＮＡの単離のための手順は、当業者には周知である。一般に、かかるＤＮＡの単離手順は、例えば、試料中に存在する任意の細胞の洗剤を利用した溶解を含む。細胞溶解後、一般に、タンパク質を様々なプロテアーゼを用いてＤＮＡから除去する。ＲＮＡは、ＲＮアーゼを用いて除去する。次いで、一般に、ＤＮＡを、フェノールを用いて抽出し、アルコール中で沈殿させて、水溶液中に溶解させる。
【０１２９】
ＶＩ．ビメンチン関連疾患の治療方法
この出願の更に別の面は、細胞におけるビメンチン遺伝子の減少した発現又は過剰発現から生じるビメンチン関連疾患の治療方法に関係する。かかるビメンチン関連増殖性疾患(例えば、結腸新生物)は、様々な病的細胞増殖状態から生じうる。ある具体例において、ビメンチン関連増殖性疾患の治療には、ビメンチン遺伝子発現又はビメンチン活性の調節が含まれる。用語「調節する」は、ビメンチンが過剰発現される場合にはその発現の抑制を、又はビメンチンが過少発現される場合にはその発現の増大を構想している。
【０１３０】
一具体例において、本発明は、ビメンチン遺伝子構築物を、ビメンチンタンパク質が誤発現され又は発現されない細胞におけるビメンチンタンパク質(SEQ ID NO:１)の機能を再構成するなどのための、遺伝子治療プロトコールの一部分として利用することによる治療方法を提供する。説明のために、病的な又は異常な増殖を示す細胞型は、おそらく、少なくとも部分的に、ビメンチンタンパク質の機能に依存している。例えば、ビメンチンタンパク質をコードする遺伝子治療用構築物は、ビメンチン遺伝子のサイレンシングと関係する結腸新生物において利用することができる。
【０１３１】
ある具体例において、この発明は、ビメンチンの再発現を誘導する薬剤を利用する治療方法を提供する。ビメンチン関連疾患細胞におけるビメンチン遺伝子発現の喪失は、少なくとも部分的に、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化のためでありえて、メチル化抑制剤例えば５−デオキシアザシチジン又は５−アザシチジンを、それらの病気の細胞に導入することができる。他の類似の薬剤は、当業者に公知であろう。好適具体例において、このビメンチン関連疾患は、ビメンチンヌクレオチド配列の増大したメチル化と関係する結腸新生物である。
【０１３２】
ある具体例において、この発明は、核酸アプローチ例えばアンチセンス核酸、リボザイム又はトリプレックス剤を利用して、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸若しくはトリプレックス剤でマスクすることにより又はそれをリボザイムで開裂させることによって、特異的なビメンチンｍＲＮＡの転写又は翻訳をブロックする治療方法を提供する。かかる病気には、例えば、神経退行性疾患が含まれる。アンチセンス核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990)。この細胞において、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。これらのアンチセンス核酸は、このｍＲＮＡの翻訳に干渉する(二本鎖のｍＲＮＡは、翻訳されないので)。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好適である(それらは、容易に合成されて、標的のビメンチンを過剰生産する細胞に導入したときに問題を引き起こすことが一層長い分子よりもありそうにないので)。転写を失速させるためのオリゴヌクレオチドの利用は、該オリゴマーが二重らせんＤＮＡに巻き付いて三重らせんを形成するので、トリプレックス戦略として公知である。それ故、これらのトリプレックス化合物は、選択した遺伝子上のユニーク部位を認識するようにデザインすることができる(Maher等、Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991；Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991)。リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡを、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似した仕方で、特異的に開裂させる能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の改変によって、ＲＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列を認識してそれを開裂させる分子を工作することができる(Cech, J.Amer.Med.Assn., 260:3030, 1988)。
【０１３３】
本発明は又、ビメンチンタンパク質により媒介される増殖性又は遺伝学的疾患を治療するための遺伝子治療をも提供する。かかる治療は、その治療効果を、ビメンチンアンチセンスポリヌクレオチドの、増殖異常を有する細胞への導入によって達成する。或は、完全長のビメンチンをコードするポリヌクレオチドを病気の細胞に導入することは望ましいであろう。
【０１３４】
アンチセンスビメンチンポリヌクレオチド又はビメンチン遺伝子の送達は、組換え発現ベクター例えばキメラウイルス又はコロイド分散系を利用して達成することができる。アンチセンス配列の治療用の送達のために特に好適なのは、標的を定めたリポソームの利用である。ここに教示した遺伝子治療に利用することのできる様々なウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は好ましくはＲＮＡウイルス例えばレトロウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウス又はトリレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入することのできるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス(ＭｏＭｕＬＶ)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(ＨａＭｕＳＶ)、マウス乳癌ウイルス(ＭｕＭＴＶ)及びラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)が含まれるが、これらに限られない。好ましくは、被験者がヒトである場合には、ベクター例えばテナガザル白血病ウイルス(ＧａＬＶ)が利用される。幾つかの更なるレトロウイルスベクターは、多くの遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターのすべては、形質導入された細胞を同定して生成することができるように、選択マーカーをトランスファーし又は組み込むことができる。関心あるビメンチン配列を、例えば、特異的標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする他の遺伝子と共に、ウイルスベクターに挿入すれば、そのベクターは、標的特異的である。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質又はタンパク質を結合することにより、標的特異的とすることができる。好適なターゲティングは、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を利用することにより達成される。当業者は、レトロウイルスゲノムに挿入することができ又はウイルスエンベロープに結合させて、アンチセンスビメンチンポリヌクレオチド又はビメンチン遺伝子を含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にする特異的ポリヌクレオチド配列を知るであろう(或は、過度の実験をすることなく、容易に確かめることができる)。
【０１３５】
この発明は又、ビメンチン５’隣接ポリヌクレオチド又はビメンチン構造遺伝子に作動的に結合されたビメンチン５’隣接ポリヌクレオチドを製薬上許容しうる賦形剤又は媒質中に含む医薬又は医薬組成物であって、ビメンチン関連細胞増殖性疾患例えば結腸新生物の治療に利用される当該医薬又は医薬組成物にも関係する。
【０１３６】
典型的具体例
この発明は、今や、一般的に記載されており、それは、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう(該実施例は、単に、本発明のある面及び具体例の説明の目的のために含まれるものであり、この発明を制限することを意図するものではない)。
【実施例】
【０１３７】
実施例１：
１．細胞培養及び５−アザシチジン処理
これらの培養物を生育させて、以前に記載されたように処理した(Veigl等、1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:8698-8702)。最適許容投与量を、各処理される株について測定し、幾つかの株については、１〜３μｇ／ｍｌに及ぶ２種類の投与量を用いた。
【０１３８】
２．メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼアッセイ(例えば、ＨｐａＩＩアッセイ)
我々は、潜在的にメチル化されうるＣｐＧ濃密領域を含むビメンチン遺伝子の上流及び該遺伝子内のゲノム配列(ここでは、５’−ビメンチンゲノム配列と呼ぶ)を試験した(図１及び６参照)。このＣｐＧリッチな領域のメチル化を試験するために、我々は、先ず、ＨｐａＩＩアッセイを利用した。試料のＤＮＡを、メチル化感受性酵素のＨｐａＩＩで消化してから、ＰＣＲプライマー対によって増幅した。ＤＮＡがメチル化されている場合には、それは、ＨｐａＩＩ消化に耐性であり、従って、ＰＣＲ産物が生成される。他方、ＤＮＡがメチル化されていない場合には、それは、ＨｐａＩＩ消化を受けやすく、従って、ＰＣＲ産物は生成されない。ＣｐＧジヌクレオチドの位置は、ビメンチン遺伝子の５’ゲノム領域内にバルーンとして示されており、このゲノム領域の４つのサブドメインＡ〜Ｄを、結腸癌における異所的メチル化について試験した(図１)。これらのＨｐａＩＩアッセイに用いたＰＣＲプライマーの位置も又、図１に示してある。ＨｐａＩＩアッセイにおいてＡ、Ｃ及びＤ領域を増幅するために利用したＰＣＲプライマーの配列は、図１３に与えてある。
【０１３９】
３．結腸癌細胞における減少したビメンチン発現
ＲＴ−ＰＣＲは、ビメンチンが、正常な結腸では十分に発現されるが、結腸癌細胞株では僅かしか発現されないことを示した(図２)。メチル化がビメンチン遺伝子発現のサイレンシングの原因であるということを確立するために、ビメンチンＤＮＡのメチル化を有する細胞株を、５−アザシチジン(５−アザＣ)(脱メチル化剤)で処理した。図２に示したように、５−アザＣ処理は、１２の結腸癌細胞株の内の９つ(Ｖ４００、Ｖ４２９、Ｖ５０３、ＲＣＡ、Ｖ５、ＲＫＯ、Ｖ４３２、Ｖ７０３及びＶ４５７)でビメンチン発現を再活性化した。
【０１４０】
４．ビメンチンは、結腸癌細胞株で、頻繁にメチル化されて、サイレンシグを受ける
Ｃ領域内のビメンチンゲノム配列のメチル化を、結腸癌細胞株(図３)又は結腸腫瘍(図４〜５)におけるＨｐａＩＩアッセイにより検出した。ＰＣＲ増幅を、未消化(Ｕ)、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩでの消化(Ｈ)、又はメチル化に関係ない酵素Ｍｓｐ１での消化(Ｍ)後に、３０又は４０サイクルで行なった。３つの癌でない正常組織(ＮＮ)は、すべてメチル化されていないが、１０の結腸癌細胞株の９つは、すべてメチル化を示している(図３)。Ｃ領域のビメンチンゲノム配列のメチル化は又、対にした正常試料／腫瘍試料においてもＨｐａＩＩアッセイにより検出された。図４及び５に示したように、Ｃ領域におけるビメンチンの差次的メチル化は、４０サイクルのＰＣＲ増幅後に、３１の結腸腫瘍中１６で検出された。
【０１４１】
全体として、ＨｐａＩＩアッセイは、７４％の結腸癌の診断の感度で且つ９３％の特異性(結腸癌を有しない者の正常組織における２つの偽陽性)で、Ｃ領域におけるビメンチンのメチル化を示している。これらの結果は、ビメンチンを、結腸癌において差次的にメチル化される遺伝子として確立している。
【０１４２】
加えて、類似のＨｐａＩＩアッセイの結果は、結腸癌におけるビメンチンヌクレオチド配列の異所的メチル化の発生率は、Ａ及びＤ領域(全ブロックとして)においてＣ領域より一層少ないことを示唆した。しかしながら、Ｂ領域及びＡ領域の３’部分も又、Ｃ領域に加えて、ビメンチンの癌特異的な異所的メチル化を有しうる良好な候補領域であり続けている。結腸癌細胞株におけるＡ、Ｃ、Ｄ領域のＨｐａＩＩアッセイの結果は、すぐ下の表ＩＩにまとめてある。
【０１４３】
【表２】
【０１４４】
５．メチル化特異的ＰＣＲ(ＭＳ−ＰＣＲ)
各試料からの５００ｎｇのＤＮＡ(５０μｌの容積)を、ＮａＯＨ(新しく生成した、終濃度０．２Ｍのもの)により、３７℃で、１５分間変性させた。次に、３０μｌの１０ｍＭハイドロキノン(新鮮)及び５２０μｌの３．０Ｍ ＮａＨＳＯ４(新たに調製した重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ５．０)を加えて、５５℃で１６時間インキュベートした。改変ＤＮＡを、ウィザードＤＮＡクリーンアップシステム(Promega)を利用して精製した。この反応を、終濃度０．３ＭのＮａＯＨによって、室温で、１５分間、脱スルホン化して、１０Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ(ｐＨ７．０)を終濃度３Ｍまで加えることにより中和した。ＤＮＡを、３容の無水エタノールにより、３０分間、−８０℃で沈殿させた。このＤＮＡペレットを、次いで、蒸留水に溶解させて、約１０ｎｇ／μｌとした。重亜硫酸ナトリウム処理したＤＮＡを、その後のメチル化特異的ＰＣＲのためのテンプレートとして利用した。
【０１４５】
ビメンチンゲノム配列のＢ及びＣ領域内のＭＳ−ＰＣＲ用のプライマーの位置は、ＭＳ−ＰＣＲ対１〜５として示してある(図６)。更なるＭＳ−ＰＣＲプライマー対１〜２及びＭＳＰ対６〜１０の位置は、図１６に示してある。これらのすべてのプライマー配列は、ビメンチン５’ゲノム配列に基づいてデザインされ、完全に改変されたＤＮＡに特異的であった。ＭＳＰ−ＰＣＲプライマーセット１、１−２及び３−１０の配列は、図１４及び１５に示してある。二本鎖非メチル化ビメンチンＤＮＡの重亜硫酸塩変換された配列(センス又はアンチセンス)(ＵＦ又はＵＲとして示してある)を増幅するために用いる対照用プライマーセットの配列も又、図１４及び１５に与えてある。ＰＣＲを行って、該ＰＣＲ産物を、３．０％アガロースゲル上で泳動させた。
【０１４６】
６．ビメンチンのメチル化を検出するためのＭＳ−ＰＣＲの改良された感度及び特異性
我々は、更に、メチル化又は非メチル化ＤＮＡテンプレートの増幅に特異的なＰＣＲプライマーを利用して、メチル化特異的ＰＣＲ技術を、ビメンチンのＣｐＧリッチ領域のメチル化の試験に利用した(図７〜１２)。図７に示したように、ＭＳ−ＰＣＲプライマー対１、４及び５は、すべて、４０サイクルのＰＣＲによりアッセイした際に正常結腸組織でメチル化を検出した。対照的に、ＭＳ−ＰＣＲプライマー対３は、差次的にメチル化した領域を限定し、それは、ビメンチンを発現しない結腸癌細胞株でメチル化されるが、正常結腸組織又はビメンチンを発現する細胞株ＳＷ４８０ではメチル化されない。独立したＭＳ−ＰＣＲアッセイは、ＭＳ-ＰＣＲプライマー対ＭＳ３が、ビメンチンのメチル化を、癌でない切除物からの正常結腸切除物において、たとえＰＣＲ反応を、２つの順次的４０サイクル反応によって８０サイクル行なった場合でも、検出しないことを確認した(図８)。
【０１４７】
図９に示したように、プライマー対ＭＳＰ３を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイを、１０対の正常／腫瘍試料におけるＣ領域内のビメンチンのメチル化についてＨｐａＩＩアッセイと比較した。これらの１０の場合において、プライマー対ＭＳＰ３を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイは、下記の表ＩＩＩにまとめたように、ビメンチンのメチル化の検出について実質的に改良された感度及び特異性を示した。特に、ＭＳ−ＰＣＲアッセイにおいて、ＭＳＰ３プライマーは、結腸癌の検出について、７０％の感度と９０％の特異性(非メチル化腫瘍による１つの偽陽性)を示している。
【０１４８】
【表３】
【０１４９】
ＭＳＰ３プライマーを利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイを、更に、図１０(試料Ｎ１〜２０及びＴ１〜２０)及び図１１(試料Ｎ２１〜４６及びＴ２１〜４６)に示した４６対の正常／腫瘍試料の分析にまで拡張した。これらの４６対の試料を、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化(Ｍ)又は非メチル化(Ｕ)についてのＭＳＰ３プライマーを利用する４０サイクルのＭＳ−ＰＣＲによってアッセイした。これらの４６のケースにおいて、プライマー対ＭＳＰ３を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイは、結腸癌の検出について、下記の表ＩＶにまとめたように、８４％の感度及び９６％の特異性を示した。
【０１５０】
【表４】
【０１５１】
このＭＳ−ＰＣＲ反応を、更に、図１２に示した一組の結腸癌細胞株を特性決定するために利用した。これらの３９の細胞株試料において、ビメンチンのメチル化についてのＭＳ−ＰＣＲアッセイにおいて用いたＭＳＰ３プライマーは、結腸癌の検出について、８２％の感度である。
【０１５２】
上記の結果は、ビメンチンゲノム配列(ヌクレオチド１〜６２００、SEQ ID NO:２)が、結腸癌ではメチル化されているが正常組織ではメチル化されていない差次的メチル化領域を含むことを示している。これらのＨｐａＩＩアッセイ及びＭＳＰ３プライマー対を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイは、ビメンチン５’隣接領域及びエキソン１−イントロン１領域内の差次的メチル化のアッセイに利用することができる。体液及び排出物例えば血液及び大便におけるメチル化ビメンチンの検出は、結腸癌及び前癌性結腸腺腫の有用な初期診断を与えることができる。
【０１５３】
７．ビメンチンのメチル化の検出のためのＭＳ−ＰＣＲアッセイの更なる結果
ビメンチンゲノム配列における差次的メチル化の程度を更に研究するために、更なる６対のＭＳ−ＰＣＲプライマーのセットを、Ｂ及びＣ領域内でデザインした。すべてのＭＳ−ＰＣＲプライマーの配列を、図１４及び１５に示し、それらの位置を図１６に示してある。
【０１５４】
これらのＭＳ−ＰＣＲプライマーを、１２の癌でない正常試料と１２の結腸癌細胞株のセットにおいて評価した(図１７及び１８)。図１４で太字で示したように、実行できる最良のプライマーセットは、最初に評価したプライマーＭＳＰ３、及び新たなプライマーセットのＭＳＰ１−２である。従って、ＭＳＰ１−２は、Ｂ領域内にある新しい差次的メチル化領域を同定する。
【０１５５】
更に、ビメンチンヌクレオチド配列の異所的メチル化は、結腸新生物における初期事象であるようである。１３の結腸腺腫試料を、ビメンチンＤＮＡの異所的メチル化についてＭＳＰ３プライマーを利用するＭＳ−ＰＣＲ反応によりアッセイしたところ、かかるメチル化が１３例中７つという結果であった。これらの結果を、下記の表Ｖにまとめた。
【０１５６】
【表５】
【０１５７】
加えて、図１９は、顕微鏡的な初期の結腸新生物である幾つかの顕微解剖した異所的凹窩病巣(即ち、ＡＣＦ、図１９では、「Ａ」と略記してある)におけるビメンチンの異所的メチル化の検出の結果を示している。対照的に、このビメンチンのメチル化は、同じ個人の顕微解剖された正常組織(図１９では、「Ｎ」と略記してある)では検出されなかった。
【０１５８】
結論として、本発明は、ビメンチンのメチル化の少なくとも３つのアッセイ：１）ＭＳＰ３プライマーを利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイ；２）ＭＳＰ１−２を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイ；及び３）ＨｐａＩＩアッセイを開示する。これらのすべてのアッセイは、ビメンチンゲノム配列の差次的メチル化を癌細胞において(正常細胞ではない)同定するために利用することができる。ビメンチンゲノム配列中に存在する他のＣｐＧ配列に対する類似のアッセイを形成することができるというのはありそうなことである。かかるアッセイは、体液に適用した場合、癌例えば結腸癌、前癌性結腸腺腫の初期の検出のために、及び多くの異所的凹窩病巣のために結腸癌の発生の増大した危険にある個人の検出のために利用することができる。
【０１５９】
実施例２：
下記の実験及びデータは、更に、メチル化が結腸癌の高頻度マーカーであるビメンチンの特異的領域及びそれらの配列を特定する。加えて、これらのデータは、これらの配列についてのアッセイを特定する。
【０１６０】
図３２〜３４は、ＮＣＢＩヒトゲノム配列エントリーＡＬ１３３４１５の塩基対５６７００〜５８８００のビメンチン５’ゲノム領域の図式表示を示す概要である。ボックスは、ビメンチンのＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ領域を示している。以前のＨｐａＩＩ消化アッセイは、Ａ及びＤ領域が、癌ではメチル化されていないことを示した。従って、Ｃ中の領域を、メチル化特異的ＰＣＲアッセイによって徹底的に調べた。図上のバルーンは、潜在的メチル化の標的であるＣｐＧジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、集団多型であるＣｐＧを示している。図３２は、Ａ〜Ｂ領域を示しており、図３３〜３４は、Ｃ〜Ｄ領域を示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的ＰＣＲ反応(ＭＳＰ１〜ＭＳＰ５０と番号付けられたものなど)によって調べられた領域を示している。これらの図において、ＭＳ−ＰＣＲ反応の主な結果は、バーの隣りに示されている。最も左側の反応のセットは、１２の癌でない正常試料におけるＭＳ−ＰＣＲの結果であり；陰性の結果が、好適な結果である。最も右側の反応のセットは、１１の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり；好適な結果は、陽性反応である。
【０１６１】
図３２〜３４のＭＳ−ＰＣＲアッセイは、１１の結腸癌細胞株の、１２の癌でない正常結腸試料と比較しての、４５サイクルのＭＳ−ＰＣＲでのアッセイにより測定して、５つの異なるグループに類別された。第一のグループ(図３２のＭＳＰ１、ＭＳＰ１４、ＭＳＰ１７；図３３のＭＳＰ３、ＭＳＰ２０Ａ、ＭＳＰ２９、ＭＳＰ３０、ＭＳＰ３１；及び図３４のＭＳＰ５０を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、強いＭＳ−ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料では０％のメチル化を検出したアッセイを示す。これらの反応の最良のものは、更に、下線を付けた数字で示されており、これらの内で最も良いものは、更に、下線を付けた太字の数字で示されている。第二のグループ(図３３のＭＳＰ８、ＭＳＰ２２Ａ、ＭＳＰ２３、ＭＳＰ２４、ＭＳＰ３２を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、弱いＭＳ−ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料では０％のメチル化を検出したアッセイを示す。第三のグループ(図３３のＭＳＰ３３；図３４のＭＳＰ３５、ＭＳＰ３６、ＭＳＰ３７、ＭＳＰ４０、ＭＳＰ４１、ＭＳＰ４７を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、強いＭＳ−ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料中で１０％のメチル化を有する試料を検出したアッセイを示す。第四のグループ(図３３のＭＳＰ２１；及び図３４のＭＳＰ１０、ＭＳＰ３８、ＭＳＰ３９、ＭＳＰ４３、ＭＳＰ４４、ＭＳＰ４５を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、強いＭＳ-ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料中で２０％のメチル化を有する試料を検出したアッセイを示す。第五のグループ(図３３のＭＳＰ２、ＭＳＰ６、ＭＳＰ７、ＭＳＰ９、ＭＳＰ２５Ａ、ＭＳＰ２６、ＭＳＰ２７、ＭＳＰ２８；図３４のＭＳＰ５、ＭＳＰ４２、ＭＳＰ４６、ＭＳＰ４８、ＭＳＰ４９を含む)は、結腸癌細胞株の高いパーセンテージで、強いＭＳ−ＰＣＲゲルバンドで、メチル化を検出し、癌でない正常試料中で３０％のメチル化を有する試料を検出したアッセイを示す。
【０１６２】
図３５は、図３２〜３４にまとめたＭＳ−ＰＣＲ反応のためのプライマーの配列を与えている。ＭＦは、フォワードプライマーを示し、ＭＲは、リバースプライマーを示している。プライマーは、センスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅すると推定される。アンチセンスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅するプライマーは、(ＡＳＳ)により示されている。この表は又、増幅生成物に対応するゲノム中の位置(クローンＡＬ１３３４１５の塩基対ナンバリングシステムに対するもの)をも与える。この表は又、増幅された断片の長さをも与える。暗い影を付けたプライマーは、最良の及び好適な反応を与える。
【０１６３】
図３６〜３７は、種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの技術的感度及び特異性を示している。図４１は、更に試験した２つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ及びＭＳＰ５０Ｍ)で、図３６及び３７を補っている。
【０１６４】
図３６の左側は、種々のＭＳ−ＰＣＲ反応についての技術的特異性を示している。左奥には、癌でない正常な結腸組織において、４５又は９０サイクルのＰＣＲで行われたＭＳ-ＰＣＲ反応の結果が示されている。９０サイクルの反応は、４５サイクルのＰＣＲ反応物からアリコートを採り、新たなＰＣＲ反応物中希釈して、更なる４５サイクルにつき反応させることにより行われた。示したこれらの反応について、ＭＳ−ＰＣＲ反応は、正常組織についての９０サイクルまでのＰＣＲにおいて偽陽性を検出しない。陽性対照の結腸癌細胞株は、すぐ右隣に示してある。右奥には、異なるＭＳ-ＰＣＲ反応の技術的感度が示されている。中央及び右端の反応のセットは、Ｖａｃｏ５(ビメンチンのメチル化を有する細胞株)からのＤＮＡに対して行なったＭＳ−ＰＣＲの希釈シリーズを示している。メチル化したＶａｃｏ５ＤＮＡ投入量の１００ピコグラムのレベルまで陽性反応が得られている。
【０１６５】
図３７は、更なるプライマーセットについての、同様のデータを示している。左蘭は、１１の結腸癌細胞株の４５サイクルのＭＳ−ＰＣＲのパネルに対するアッセイの結果を示している。右側の結果は、癌でない正常組織のグループに対する４５及び９０サイクルのＭＳ−ＰＣＲを評価する欄を示している。隣りは、Ｖａｃｏ５ＤＮＡの増大する希釈物に対して候補の反応物をアッセイしている希釈シリーズのアッセイを示す２つの欄を示している。最良の反応物例えばＶＩＭ−ＭＳＰ５０Ｍは、殆どの結腸癌細胞株の検出について高い技術的感度を示し、正常結腸の検出についての低い陽性率を示し、そしてＶａｃｏ５ＤＮＡの希釈物の検出についての高い感度(投入ＤＮＡの５０ピコグラムまで)を示している。右側に示したこれらの２つの希釈シリーズは、予め重亜硫酸塩処理した正常及びＶａｃｏ５ＤＮＡを混合して行なう(中央欄)か、先ずＶａｃｏ５及び正常ＤＮＡを混合し；その後、その希釈混合物を重亜硫酸塩処理することにより行なう(右端欄)かどうかで異なっている。
【０１６６】
種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲプライマーを、４７の結腸癌細胞株におけるメチル化の検出につき評価した。これらのアッセイにおいて、ＭＳＰ−２９は、最大感度であり、細胞株の８０％でメチル化を検出している。増大した感度は、ＭＳＰ−２９をＭＳＰ−１４又はＭＳＰ−１７と組み合せることにより達成されたものであろう。別々の実験において、種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲプライマーを、同様に、結腸癌患者の広範なグループに由来するマッチした結腸癌組織及び対にした正常結腸組織のパネルにおいて評価した。結腸癌の検出感度は、これらのアッセイにおいて、８５％を超えている。ＭＳＰ−２９は、一つの正常試料をメチル化されているとして検出しただけで、８５％の感度を示しており、それ故、好適な反応である。他の別々の実験において、種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲプライマーは、同様に、１３の結腸腺腫試料のパネルにおいて評価された。６２〜６９％の感度が、腺腫試料における異所的メチル化の検出について達成されている。
【０１６７】
図２１〜２６は、ビメンチンゲノム領域の限定的配列を与えている。配列は、センス及びアンチセンスビメンチンゲノム領域について、ビメンチンセンス鎖のメチル化及び非メチル化形態に由来するテンプレートの重亜硫酸塩変換された配列について、及びビメンチンアンチセンス鎖のメチル化及び非メチル化形態に由来するテンプレートの重亜硫酸塩変換された配列について与えられている。各図は、Ａ〜Ｄ領域を包含するビメンチン遺伝子の５’領域に及ぶ、ＮＣＢＩヒトゲノムクローンＡＬ１３３４１５の塩基対５６，８２２〜５８，８２２に対応する配列を与えている。各図は、結腸癌で差次的にメチル化されることが示されている(即ち、結腸癌において高頻度でメチル化されており、正常結腸組織ではメチル化されていない)塩基対５７，４２７〜５８，３２６からの領域を太字で示している。この領域は、我々が限定した高品質ＭＳ−ＰＣＲ反応のすべてを包含する。その上、各図は、ｂｅｓｔＭＳ−ＰＣＲ反応に対応するＭＳ−ＰＣＲプライマーによって調べられる特定の配列に下線を付してある。
【０１６８】
特に、図２１は、ＡＬ１３３４１５配列の５６，８２２〜５８，８２２に対応するビメンチンセンス鎖配列を５’〜３’方向で示しており、５７，４２７〜５８，３２６の差次的にメチル化される領域を太字で示してある。図２２は、図２１に対応するビメンチン遺伝子のセンス鎖に由来するメチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示しており、差次的にメチル化される領域５７，４２７〜５８，３２６に由来する配列を太字で示している。図２３は、図２１に対応するビメンチン遺伝子センス鎖に由来する非メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示しており、差次的にメチル化される領域５７，４２７〜５８，３２６に由来する配列を太字で示している。図２４は、ＡＬ１３３４１５配列の５６，８２２〜５８，８２２に対応するビメンチンアンチセンス鎖の配列を示しており、５７，４２７〜５８，３２６に由来する差次的にメチル化される領域を太字で示している。配列が３’〜５’方向で書かれていることに注意されたい。図２５は、図２４に対応するビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖に由来するメチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示しており、差次的にメチル化される領域５７，４２７〜５８，３２６に由来する配列を太字で示している。配列が３’〜５’方向に書かれていることに注意されたい。図２６は、図２４に対応するビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖に由来する非メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示しており、差次的にメチル化される領域５７，４２７〜５８，３２６に由来する配列を太字で示している。配列が３’〜５’方向に書かれていることに注意されたい。
【０１６９】
上記のデータは、差次的メチル化がヒトの結腸癌及び前癌性腺腫の特異的マーカーであるビメンチン遺伝子の領域を発見したこの発明の最終的開示にとって核となる情報を提供する。この出願は又、下記のように、幾つかの更なる支持データも提供する。
【０１７０】
図３８は、正常及び腫瘍の対の種々のビメンチンＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。図４２は、図３８を補うものであり、更に、３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ、ＭＳＰ４７Ｍ及びＭＳＰ５０Ｍ)を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイの臨床的感度を示している。
【０１７１】
図３９及び４０は、結腸の正常／腫瘍対、結腸腺腫、結腸癌細胞株、及び癌でない正常結腸試料(Ｎ.Ｃ.Ｎ)についての種々のＭＳ−ＰＣＲ反応によるアッセイからの一次データを示している。図４３は、図３９及び４０を補うものであり、更に、３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９Ｍ、ＭＳＰ４７Ｍ及びＭＳＰ５０Ｍ)を利用する種々のＭＳ−ＰＣＲアッセイの臨床的感度を示している。
【０１７２】
図４４は、３つのプライマーセット(ＭＳＰ２９、ＭＳＰ４７及びＭＳＰ５０)を利用するＭＳ−ＰＣＲアッセイからの生データを与える。これらのデータは、細胞株、Ｎ／Ｔ対及び結腸腺腫試料についての３つの表に、それぞれ示してある。メチル化試料を赤で暗号化してＭと標識し、非メチル化試料を緑色で暗号化してＵと標識した。Ｖ−ＭＳＰ２９、ＶＭＳＰ−４７、及びＶ−ＭＳＰ５０は、ビメンチンプライマーである。Ｈ−ＭＳＰ５は、比較のためのコントロールプライマー(ＨＬＴＦ−ＭＳＰ５)である。上記の感度データのまとめを下記の表ＶＩに列記した。例えば、ＭＳＰ２９は、を示している。細胞株の同定について８０％の感度を示しており(４１株を試験)、腫瘍の同定について８５％の感度を示している(４６腫瘍を試験)。ＭＳＰ５０は、結腸癌細胞株の同定について７３％の感度を示し、結腸癌腫瘍の同定について８７％の感度を示している。
【０１７３】
【表６】
【０１７４】
まとめると、このデータは、ビメンチン遺伝子配列の塩基対５７，４２７〜５８，３２６の結腸癌及び腺腫特異的な異所的メチル化の説明を与え、癌特異的反応における異所的メチル化を単一反応で約８５％の感度で検出することができ、他のＭＳ−ＰＣＲ反応によるパネルとの組合せにおいては約９０％の感度で検出することのできるＭＳ−ＰＣＲ反応を与えている。
【０１７５】
参考文献の組込み
本書で言及したすべての刊行物及び特許を、個々の刊行物又は特許が特に、個別に、参考として援用されると示されているかのように、参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する。矛盾が生じた場合には、本願(定義を含む)が、調整する。
【０１７６】
同等物
主題の発明の特定の具体例を論じてきたが、上記の明細書は、説明のためのものであって、制限するためのものではない。この明細書及び請求の範囲を概観すれば、この発明の多くの変形物が、当業者には明らかとなろう。この発明の全範囲は、同等物の全範囲と共に請求の範囲を及びかかる変形物と共に明細書を参照することによって決められるべきものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における結腸新生物を検出する方法であって、該被験者からの試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の発現を検出することを含む当該方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記検出することが、前記試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の量を定量的に測定することを含む当該方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記定量的に測定することが、前記試料におけるコントロールのタンパク質及び核酸の量に対しての、前記試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の量を測定することを含む当該方法。
【請求項４】
試料が、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿、及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料が、固体又は半固体試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料が、組織試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料が、結腸腫瘍由来の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試料が、結腸新生物を有すると疑われる被験者、又は結腸新生物を有することが既知の被験者に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記結腸新生物が結腸癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記結腸新生物が腺腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ビメンチンタンパク質をイムノアッセイにより検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ビメンチン核酸を直接検出アッセイにより検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ビメンチン核酸を増幅アッセイにより検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ビメンチン核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写（ＲＴ）、ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲのうち１以上を使用することを含む方法により検出する、該方法。
【請求項１５】
結腸新生物を経時的にモニターする方法であって、該方法は、下記：
ａ）被験者からの試料中のビメンチンタンパク質又は核酸発現を最初に検出し；そして
ｂ）同じ被験者からの試料中のビメンチンタンパク質又は核酸発現を一層遅い時点で検出する；
ことを含み、
最初の時点で採ったビメンチンタンパク質又は核酸発現に対する一層遅い時点で採ったビメンチンタンパク質又は核酸発現の増加は、癌の退行を示し；
最初の時点で採ったビメンチンタンパク質又は核酸発現に対する一層遅い時点で採ったビメンチンタンパク質又は核酸発現の減少は、癌の進行を示す
当該方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記検出することが、前記試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の量を定量的に測定することを含む当該方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記定量的に測定することが、前記試料におけるコントロールのタンパク質及び核酸の量に対しての、前記試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の量を測定することを含む当該方法。
【請求項１８】
試料が、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿、及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
試料が、固体又は半固体試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
試料が、組織試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
試料が、結腸腫瘍由来の細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
試料が、結腸新生物を有すると疑われる被験者、又は結腸新生物を有することが既知の被験者に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記結腸新生物が結腸癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記結腸新生物が腺腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ビメンチンタンパク質をイムノアッセイにより検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
ビメンチン核酸を直接検出アッセイにより検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
ビメンチン核酸を増幅アッセイにより検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１５に記載の方法であって、ビメンチン核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写（ＲＴ）、ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲのうち１以上を使用することを含む方法により検出する、該方法。
【請求項１】
被験者における結腸新生物を検出する方法であって、該被験者からの試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の発現を検出することを含む当該方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記検出することが、前記試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の量を定量的に測定することを含む当該方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記定量的に測定することが、前記試料におけるコントロールのタンパク質及び核酸の量に対しての、前記試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の量を測定することを含む当該方法。
【請求項４】
試料が、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿、及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料が、固体又は半固体試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料が、組織試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料が、結腸腫瘍由来の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試料が、結腸新生物を有すると疑われる被験者、又は結腸新生物を有することが既知の被験者に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記結腸新生物が結腸癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記結腸新生物が腺腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ビメンチンタンパク質をイムノアッセイにより検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ビメンチン核酸を直接検出アッセイにより検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ビメンチン核酸を増幅アッセイにより検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ビメンチン核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写（ＲＴ）、ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲのうち１以上を使用することを含む方法により検出する、該方法。
【請求項１５】
結腸新生物を経時的にモニターする方法であって、該方法は、下記：
ａ）被験者からの試料中のビメンチンタンパク質又は核酸発現を最初に検出し；そして
ｂ）同じ被験者からの試料中のビメンチンタンパク質又は核酸発現を一層遅い時点で検出する；
ことを含み、
最初の時点で採ったビメンチンタンパク質又は核酸発現に対する一層遅い時点で採ったビメンチンタンパク質又は核酸発現の増加は、癌の退行を示し；
最初の時点で採ったビメンチンタンパク質又は核酸発現に対する一層遅い時点で採ったビメンチンタンパク質又は核酸発現の減少は、癌の進行を示す
当該方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記検出することが、前記試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の量を定量的に測定することを含む当該方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記定量的に測定することが、前記試料におけるコントロールのタンパク質及び核酸の量に対しての、前記試料におけるビメンチンタンパク質又は核酸の量を測定することを含む当該方法。
【請求項１８】
試料が、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿、及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
試料が、固体又は半固体試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
試料が、組織試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
試料が、結腸腫瘍由来の細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
試料が、結腸新生物を有すると疑われる被験者、又は結腸新生物を有することが既知の被験者に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記結腸新生物が結腸癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記結腸新生物が腺腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ビメンチンタンパク質をイムノアッセイにより検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
ビメンチン核酸を直接検出アッセイにより検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
ビメンチン核酸を増幅アッセイにより検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１５に記載の方法であって、ビメンチン核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写（ＲＴ）、ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲのうち１以上を使用することを含む方法により検出する、該方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【公開番号】特開２０１１−２００２３７（Ｐ２０１１−２００２３７Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０５７９８（Ｐ２０１１−１０５７９８）
【出願日】平成２３年５月１１日（２０１１．５．１１）
【分割の表示】特願２００６−５２３４３２（Ｐ２００６−５２３４３２）の分割
【原出願日】平成１６年８月１６日（２００４．８．１６）
【出願人】（５９７１３８０６９）ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１１日（２０１１．５．１１）
【分割の表示】特願２００６−５２３４３２（Ｐ２００６−５２３４３２）の分割
【原出願日】平成１６年８月１６日（２００４．８．１６）
【出願人】（５９７１３８０６９）ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ (16)
【Ｆターム（参考）】
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