大腸癌予防物質のスクリーニング方法
【課題】
癌、特に大腸癌の予防に効果のある物質のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】
本発明の課題は、ラットに被検物質を投与し、大腸組織における、ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定し、その発現量が低下した物質をスクリーニングすることによって解決できる。この方法により得られた化合物を摂取することにより、大腸癌を予防することが可能である。
癌、特に大腸癌の予防に効果のある物質のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】
本発明の課題は、ラットに被検物質を投与し、大腸組織における、ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定し、その発現量が低下した物質をスクリーニングすることによって解決できる。この方法により得られた化合物を摂取することにより、大腸癌を予防することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、特に大腸癌の予防物質のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、癌の予防に関連する特定のタンパク質のｍＲＮＡを測定することにより、短時間に、且つ、安価に癌の予防効果を予測し、予防物質を簡便にスクリーニングすることができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本において平均寿命が長くなると共に、癌による死亡率が高くなっている。また、食生活の変化に伴い、消化器系の癌、特に大腸癌の発症率が高くなってきている。この大腸癌の発症に対して、発癌抑制作用を有する食品が報告されており、例えば、マウスにアゾキシメタン（ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ）を投与すると大腸腫瘍が発症するが、その大腸腫瘍の発症がビタミンＢ６の摂取量の増加により顕著に抑制されることが知られている（非特許文献１）。更に、以前の疫学的研究においても，ビタミンＢ６の摂取により大腸癌の発症が抑制されること、又は血中ビタミンＢ６濃度と大腸癌の発症との間に高い負の相関があることが報告されている（非特許文献２、および非特許文献３）。
【０００３】
このように大腸癌の発症率が高まっている中で、食品などに含まれている前記ビタミンＢ６などの大腸癌を予防することのできる化合物を探索し、それらの化合物の摂取を促すことにより、大腸癌の予防又は治療につなげることが期待されている。しかしながら、そのような化合物のスクリーニングは、モデル動物に大腸癌を発症させ、その動物に被検試料を投与し、大腸癌の発症が抑制されるかを確かめることによって行わなければならないため、多くの実験動物を用い、また大腸癌の発症に数ヶ月を要することから、長期の時間がかかり、時間的にも経済的にも負担の多いものであった。
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｏｍａｔｓｕ Ｓ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈ， Ｏｋａ Ｔ， Ｔｓｕｇｅ Ｈ， Ｎｉｉ Ｈ， Ｋａｔｏ Ｎ （２００１） Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ−６−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｄｉｅｔｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｗ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ−６ ｄｉｅｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ Ｎｕｔｒ １３１ ： ２２０４−２２０７．
【非特許文献２】Ｓｌａｔｔｅｒｙ ＭＬ， Ｐｏｔｔｅｒ ＪＤ， Ｃｏａｔｅｓ Ａ， Ｍａ ＫＮ， Ｂｅｒｒｙ ＴＤ， Ｄｕｃａｎ ＤＭ， Ｃａａｎ ＤＪ （１９９７） Ｐｌａｎｔ ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ： ａｎ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ （Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）． Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｕｓｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ８ ： ５７５−５９０．
【非特許文献３】Ｊａｎｓｅｎ ＭＣ， Ｂｕｅｎｏ−ｄｅ−Ｍｅｓｑｕｉｔａ ＨＢ， Ｂｕｚｉｎａ Ｒ， Ｆｉｄａｎｚａ Ｆ， Ｍｅｎｏｔｔｉ Ａ， Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ Ｈ， Ｎｉｓｓｉｎｅｎ ＡＭ， Ｋｏｋ ＦＪ， Ｋｒｏｍｈｏｕｔ Ｄ （１９９９） Ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｆｏｏｄｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ： ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ ｓｔｕｄｙ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８１ ： １７４−１７９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、動物実験や疫学的調査によって明らかになったビタミンＢ６の大腸癌予防効果に着目し，ビタミンＢ６の摂取時にラット大腸組織において発現量が著しく変動する遺伝子群を網羅的に探索した。その結果、大腸癌の発症が抑えられるラットにおいて、ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量が顕著に低下することを見出した。そして、これらのｍＲＮＡをスクリーニングマーカーとすることによって、大腸癌を予防することのできる化合物をスクリーニングできることを見出した。
【０００６】
本発明はこうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、 大腸癌予防物質のスクリーニング方法であって、
（１）実験動物に被検試料を投与する工程、
（２）実験動物から大腸組織を採取する工程、
（３）前記大腸組織におけるＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質および／またはＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定する工程、及び
（４）前記ｍＲＮＡの発現量の減少から大腸癌の予防効果を判定する工程、
を含む前記スクリーニング方法。に関する。
【０００８】
本発明によるスクリーニング方法の好ましい態様においては、 実験動物がラットであるスクリーニング方法である。
【０００９】
本発明によるスクリーニング方法の別の好ましい態様においては、投与する期間が１４日〜28日であるスクリーニング方法である。
【００１０】
本発明によるスクリーニング方法の別の好ましい態様においては、上記ｍＲＮＡの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、あるいはＤＮＡチップ法、またはＲＴ−ＰＣＲ法である、スクリーニング法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ビタミンＢ６の大腸癌予防効果の解析過程で見出された遺伝子群を予防効果のマーカーとして利用することにより、数ヶ月以上要していた動物実験による癌の予防物質のスクリーニングを短期間で行なうことが可能であり、実験に要する時間的及び経済的負担を軽減し、また実験に供する実験動物数を縮小することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法によって、スクリーニングすることのできる大腸癌予防物質は、大腸癌の発症を予防又は抑制する可能性のある化合物であれば特に限定されることはなく、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質、糖、脂質、及び核酸などを含む。本発明のスクリーニング方法において動物に投与される被検試料は、化合物そのものでもよいが、前記大腸癌予防物質を含む可能性のあるものであれば、特に限定されず、例えば、食品、植物からの抽出物、は合成された化合物などを挙げることができる。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法は、
（１）被検試料投与工程、
（２）大腸組織採取工程、
（３）ｍＲＮＡ発現量測定工程、及び
（４）大腸癌予防効果判定工程、を含み、原則として前記工程をこの順序で実施することが好ましい。
【００１５】
前記被検試料投与工程（１）においては、実験動物に被検試料を投与する。被検試料の投与方法としては、具体的には、被験試料の物性等により経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与等の投与形態を使い分けることができ、また、大腸への局所投与も可能である。被検試料が食品の場合は、経口投与が好ましいが、飼料への混合する混飼により摂取させる方法、注射筒などによる経口投与、又は経口チューブなどを用いた強制投与などを行なうことも可能である。
【００１６】
被検試料の投与期間は、被検試料の効果が得られる期間であれば、特に限定されるものではなく、例えば、静脈内投与などの場合は、一回の投与でもよいため、その注入時間のみでもよい。また、飼料への混飼による摂取の場合では、好ましくは１日〜３ヶ月、より好ましくは５日〜２ヶ月、最も好ましくは１４〜２８日である。
【００１７】
被検試料を投与される実験動物は、特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ミニブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、及び魚類等の脊椎動物を挙げることができる。本発明において、飼育及び操作上の点から、好ましくはマウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類であり、特に好ましくはラットである。具体的な、ラットの系統としては、ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットを用いることができる。本発明において測定対象とするｍＲＮＡは、少なくともマウス、およびラットにおいては存在することは確認済みである。
【００１８】
大腸組織採取工程（２）においては、被検試料を投与された実験動物から大腸組織を採取する。例えば、ラットの場合は被検試料の経口投与終了後、６時間絶食させ、ジエチルエーテルで麻酔し、その後頚椎脱臼法で屠殺する。大腸組織を摘出し、ｍＲＮＡの測定に用いる。採取する大腸組織の部位は、特に限定されるものではない。
【００１９】
更に、本発明の別の実施態様としては、実験動物の代わりに実験動物又はヒトから分離された大腸由来の培養細胞を用いることも可能である。この態様の場合、被検試料投与工程（１）は、培養細胞に被検試料を接触させることにより実施することができ、具体的には培養細胞の培養液中に被検試料を添加すればよい。培養細胞に被検試料を接触させる期間（時間）は、実験動物を用いる態様と比較して、一般的には短くすることが可能であり、例えば、数時間〜３日で行なうことができる。また、大腸組織採取工程（２）は、培養細胞を回収することによって実施することが可能である。回収した培養細胞からのｍＲＮＡの回収は、後述のｍＲＮＡ発現量測定工程（３）と同様の方法にて行なうことができる。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法において測定することのできる候補遺伝子群は、実験動物において、大腸癌の予防効果と関連して変動するものであれば、特に限定されるものではなく、その変動も上昇でも、下降（低下又は減少）でもよいが、好ましくは低下である。また、候補遺伝子群は、実験動物によって異なっていてもよく、動物種によって測定される遺伝子が異なることもある。更に、測定される遺伝子の組み合わせも限定されるものではなく、１つの遺伝子の変動が大腸癌の予防効果と関連している場合は、１つの遺伝子を測定することができ、２種類以上の遺伝子が関連して大腸癌の予防効果と関連する場合は、組み合わせて測定することが好ましい。
【００２１】
例えば、ラットにおける候補遺伝子群としては、ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡを挙げることができる。これらのｍＲＮＡは、ビタミンＢ６の投与により低下する遺伝子群であり、本発明のスクリーニング方法においては、これらの遺伝子群の少なくとも１つの低下を測定することにより、被検試料の大腸癌の予防効果をスクリーニングすることが可能であるが、最も好ましくは、これらの遺伝子群の全てを測定し、すべてのｍＲＮＡの発現が低下していることが好ましい。
【００２２】
ＴＦＦ２タンパク質はｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ ２であり、ＰＩＴＸ２タンパク質はｐａｉｒｅｄ−ｌｉｋｅ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２ であり、ＲＥＧ４タンパク質はｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｍｉｌｙ， ｍｅｍｂｅｒ ４であり、ＡＢＣＡ１２タンパク質はＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ， ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ Ａ （ＡＢＣ１）， ｍｅｍｂｅｒ １２であり、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質はｎｕｃｌｅａｒ ｃａｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ２相同性タンパク質であり、ＦＡＢＰ１タンパク質はｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １であり、ＲＥＧ３Ｇタンパク質はｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ３ ｇａｍｍａであり、ＰＲＬＰＭタンパク質はｐｒｏｌａｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍであり、ＰＡＰタンパク質はｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎである。
【００２３】
ｍＲＮＡの測定法としては、その発現量を測定できる測定法であれば、特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法を用いることが可能である。具体的には、ｍＲＮＡを直接測定するノーザンブロット分析、ドットブロット法、及びＲＮＡｓｅプロテクション法並びにｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し分析するＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ノーザンブロット分析法を挙げることができる。更に、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、及びクロスハイブリダイゼーション法等をｍＲＮＡの発現の解析に用いることも可能であるが、最も好ましくは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、及びＤＮＡチップ法である。以下に、ｍＲＮＡの発現解析の方法として、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、及びＲＴ−ＰＣＲ法を例として説明する。
【００２４】
本願発明のスクリーニング方法におけるｍＲＮＡ発現量測定工程（３）は、以下のように行なうことができる。ｍＲＮＡの解析のためには、ＲＮＡの抽出を行なう。ｍＲＮＡの抽出は、公知の方法を用いることが可能であり、例えば、塩酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法やＡＧＰＣ変法、或いはＲＮＡが結合するカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出用キットなどを用いることが可能である。また、市販のＲＮＡ抽出キットとしては、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）などを用いることもできる。
【００２５】
ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイを用いてｍＲＮＡの発現を解析する場合は、ｍＲＮＡをそのまま解析することも可能であるが、通常ｍＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行なう。ｃＤＮＡ合成は、公知の方法を利用することが可能であり、例えば、モレキュラークローニングアラボラトリーマニュアル第３版［ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行，（２００１）］等に記載の逆転写酵素を用いる逆転写反応により実施できる。逆転写酵素としては、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ又はＡＭＶリバーストランスクリプターゼ等を用いることが可能である。ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーは、ポリＴプライマーを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成したり、６ｍｅｒ〜９ｍｅｒのランダムプライマ−を用いてｃＤＮＡを合成することも可能である。また、ｃＤＮＡは、ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイでの解析を容易にするために、蛍光色素などでラベルされることが好ましい。
【００２６】
ＤＮＡマイクロアレイは、１枚のスライドガラスやチップなどの基板上に、数千から数万の遺伝子を異なるスポットとして固定させたものである。このアレイ又はチップに、前記の合成したｃＤＮＡをハイブリダイズさせ、遺伝子の発現パターンを同時に観察する。例えば、遺伝子発現解析に用いるマイクロアレイに結合させるＤＮＡとして、プラスミドのクローン、ＰＣＲによる増幅断片、合成オリゴヌクレオテチドなどを使用して作製できる。本発明において、マイクロアレイに結合させるＤＮＡは、大腸癌の予防効果と関連して変動するものであれば、特に限定されるものではないが、特にはＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質をコードするＤＮＡが好ましい。また、その鎖長はｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズすることが可能であれば限定されないが、１０ｍｅｒ以上が好ましい。これらのマイクロアレイ、マイクロチップは、ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社、株式会社ＤＮＡチップ研究所、宝酒造株式会社などから市販されている。
【００２７】
本発明において、試験試料を投与された試験群と対照群との遺伝子発現を比較する場合、試験群と対照群のｍＲＮＡをそれぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素で蛍光標識したヌクレオチドを用いて逆転写し、逆転写の際に異なる蛍光色素を取り込ませた標識ｃＤＮＡを得ることが好ましい。得られた２種類のｃＤＮＡを１枚のＤＮＡマイクロアレイ上で同時にハイブリダイズさせ、マイクロアレイ用のスキャナー等で画像データとして読み取り、マイクロアレイ上の蛍光発光量を測定する。測定されたマイクロアレイの画像データから、定量化のソフトウェアを用いて、ｃＤＮＡ量の解析を行なう。
【００２８】
また、ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ法で測定することが可能である。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡ合成後に、ＰＣＲを行ってもよいが、リアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、及びサイバーグリーン法）で、ｍＲＮＡから直接測定することも可能であり、微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で好ましい。ＲＴ−ＰＣＲでは、検出すべき遺伝子、例えばＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質をコードする遺伝子（それぞれ、配列番号１〜９で示す）のｍＲＮＡを逆転写し、これらの遺伝子を特異的に増幅するプライマー（例えば、配列番号１０〜２７に示される塩基配列からなるプライマー）を用い、ＰＣＲにより増幅する。増幅産物は、電気泳動等により分離し、定量することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法、例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いる場合には、５’端を蛍光色素（レポーター）で、３’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出を行う。前記プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側に設定したプライマーによってＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
【００２９】
測定されたｍＲＮＡの発現量の変動を大腸癌予防効果判定工程（４）により、判断することによって、被検試料に含まれる化合物の大腸癌予防効果を判定することができる。前記のｍＲＮＡの測定による発現量の変動は、発現量の上昇でも、下降（低下）でもよく、発現量の変化は、２倍以上、好ましくは３倍以上、最も好ましくは５倍以上である。
【００３０】
前記の遺伝子に関する情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の遺伝子配列データベースから入手することができる。例えば、表１のＧｅｎｅＮａｍｅ及びＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｎａｍｅから検索することができる。
【００３１】
【表１】
【００３２】
前記のＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーは、前記の遺伝子配列から作製することができる。以下に例示として示す。
Ｔｆｆ２（１）：５’−ＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＡＧＴ−３’（配列番号１）
Ｔｆｆ２（２）：５’−ＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧ−３’ （配列番号２）
Ｒｅｇ４（１）：５’−ＡＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣ−３’ （配列番号３）
Ｒｅｇ４（２）：５’−ＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧ−３’ （配列番号４）
Ｐｉｔｘ２（１）：５’−ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＣＴＴＡＣＧＧＡＡＧＣ−３’ （配列番号５）
Ｐｉｔｘ２（２）：５’−ＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣ−３’ （配列番号６）
ＡＢＣＡ１２（１）：５’−ＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡ−３’ （配列番号７）
ＡＢＣＡ１２（２）：５’−ＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡ−３’ （配列番号８）
ＬＯＣ６８９１１６（１）：５’−ＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＣ−３’ （配列番号９）
ＬＯＣ６８９１１６（２）：５’−ＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴ−３’ （配列番号１０）
ＦＡＢＰ１（１）：５’−ＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＣ−３’ （配列番号１１）
ＦＡＢＰ１（２）：５’−ＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＣＧ−３’ （配列番号１２）
ＲＥＧ３Ｇ（１）：５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧ−３’ （配列番号１３）
ＲＥＧ３Ｇ（２）：５’−ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣ−３’ （配列番号１４）
ＰＲＬＰＭ（１）：５’−ＧＧＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＣＴＴＡＧＴＡＡＧＧＡ−３’ （配列番号１５）
ＰＲＬＰＭ（２）：５’−ＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＴＡＧＴＴＣＴＣＡＴＣ−３’ （配列番号１６）
ＰＡＰ（１）：５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧ−３’ （配列番号１７）
ＰＡＰ（２）：５’−ＴＧＣＡＧＡＣＧＴＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣ−３’ （配列番号１８）
前記のプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲに用いることができるが、ハイブリダイゼーションの原理を用いたｍＲＮＡ検出法、例えば、ノーザンブロット分析、又はドットブロット法においては、プローブとして用いることも可能である。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１》
本実施例１では、ラットにビタミンＢ６を投与し、大腸組織のＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの量をＤＮＡマイクロアレイ法で測定した。
（Ａ）実験動物への被検試料の投与（被検試料投与工程）
５週齢のＳＤ雄ラット（日本チャールス・リバー株式会社）を、１２時間明暗サイクル（８：００〜２１：００は明，２１：００〜８：００は暗）、恒温（２４±１℃）で飼育した。馴化期間として、購入後１週間は、脱イオン水と固形飼料を自由摂取させ、体重を記録した。５匹ずつ、２つの群に分け、試験群には、ビタミンＢ６を含んだ試験食（ビタミン含有量は、５００ｍｇ／ｋｇ ｄｉｅｔ）を３５日間、さらにコントロール群（ビタミン含有量は、１ｍｇ／ｋｇ ｄｉｅｔ）を３５日間飼育した。試験食では、ラット１匹あたり、一日平均 ８ｍｇのビタミンＢ６を摂取した。対照群は、ビタミンＢ６を含まない以外は試験群と同じ飼料を与えた。
（Ｂ）実験動物からの大腸癌組織の摘出（大腸組織採取工程）
ラットは、３５日間の被検試料の投与終了後、６時間絶食させ、ジエチルエーテルで麻酔し頚椎脱臼法で屠殺した。開腹後、大腸を摘出し、ＰＢＳを入れたシャーレに回収した。
（Ｃ）ＲＮＡの回収
大腸組織を、１５ｍｌ容チューブに入れ、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）７．２ｍｌを加え、ホモジナイザーで完全に破砕した。クロロホルムを１．５ｍｌずつ添加し、１５秒間激しくボルテクスをかけ、室温で３分間静置した。３、０００×Ｇで室温、１０分間遠心し、上清を新しい１５ｍｌ容チューブに回収した。得られた上清に、等量のフェノールクロロホルムを加え、激しくボルテクスをかけ、再度遠心して（３，０００×Ｇ、室温、１０分間）上清を回収した。回収した上清と等量のイソプロパノール行い、減圧乾燥させ、１ｍｌのＤＥＰＣ処理水（０．１％Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＳＩＧＭＡ社）を加えた。６０℃で１０分間熱処理して、ＲＮＡを溶解し、ＯＤ２６０で濃度を測定した。約５００μｇのトータルＲＮＡが得られた。
（Ｄ）ｃＲＮＡの合成、および精製−８０℃でエタノール沈殿したＲＮＡを解凍し、遠心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）した後、上清を除去し、３００μｌの７０％エタノールで洗浄して減圧乾燥させた。１００μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮａｓｅ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を加え、８５℃で１０分間熱処理してＲＮＡ溶液とし、ＯＤ２６０で濃度を測定した。７００ｎｇ相当のＲＮＡにＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ１．０μｌとＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水を加え、６５℃で１０分間熱処理し、氷上で５分間静置した。を加えよく転倒混合し、室温で１０分間静置した。７、０００ｒｐｍで４℃、１０分間、遠心し、上清を除去して７０％エタノールを３．０ｍｌずつ加え、−８０℃で保存した。解凍後、遠心（７，０００ｒｐｍ，４℃，５分間）を１サンプルあたり以下の反応液（５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ２．７μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ １．３μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ０．７μｌ、ＭＭＬＶ−ＲＴ ０．７μｌ、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ ０．３μｌ）を加え、穏やかに混合して４０℃で２時間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。６５℃で１５分間熱処理して反応を停止し、氷上で５分間静置した。１サンプルあたり以下の反応液（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ 水 １０．２μｌ、４×Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １３．３３μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ４．０μｌ、ＮＴＰ Ｍｉｘ ５．３３μｌ、５０％ＰＥＧ ４．２７μｌ、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ ０．３３μｌ、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ０．４０μｌ、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５３μｌ）を加え、穏やかに混合した。さらにサンプルを加えたチューブを遮光し、Ｃｙａｎｉｎｅ３（緑発色）、Ｃｙａｎｉｎｅ５（赤発色）を１サンプルあたり１．６μｌずつ加え、穏やかに混合して４０℃で２時間、遮光してインキュベートした。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてｃＲＮＡの精製を行った。１サンプルあたりＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）４６．６μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ３５０μｌ、１００％エタノール２５０μｌを加え、よく混合し、全量をカラムに流し込んで遠心し（１３，０００ｒｐｍ、４℃、３０秒）、フロースルーを捨てた。カラムを新しいコレクションチューブに移し、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ５００μｌをカラムに加え、遠心し（１３，０００ｒｐｍ、４℃、３０秒）、フロースルーを捨て、これを計２回行った。カラムを新しいコレクションチューブに移し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを３０μｌずつカラムの中央に滴下し、１分間静置した。遠心し（１３，０００ｒｐｍ、４℃、１分間）、フラクションをＲＮＡ溶液とし、ＯＤ２６０でＲＮＡ濃度を、ＯＤ５５２、およびＯＤ６５０でＣｙａｎｉｎｅ３、Ｃｙａｎｉｎｅ５の色素の波長を測定した。
【００３４】
ハイブリダイゼーション、およびデータ解析
８２５ｎｇ相当のＣｙａｎｉｎｅ３、およびＣｙａｎｉｎｅ５ラベル標識したｃＲＮＡ溶液をマイクロアレイハイブリダイゼーションのサンプルとして用いた。ハイブリダイゼーションはオリゴＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションプロトコール（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に従い、ラットゲノムアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて行った。
（Ｅ）ＤＮＡマイクロアレイでのｃＤＮＡの解析
ハイブリダイゼーション終了後にＤＮＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてデータスキャンして解析を行った解析の結果、対照群のラットと比較して試験群のラットのＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現が有意に低下していた。
【００３５】
本実施例２では、ビタミンＢ６の投与によって、ＴＦＦ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質のｍＲＮＡの大腸における低下をＲＴ−ＰＣＲによって測定した。前記実施例１の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）で得られたＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった。
【００３６】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて，ｃＤＮＡ溶液を作製した。１．０μｇのＲＮＡ溶液にＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ（３．０μｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１．０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、液量が１１．０μｌになるようにＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えた。６５℃で５分間熱処理し，氷上で１分間静置した。１サンプルあたり、反応液（５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ４．０μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ１．０μｌ、ＲＮａｓｅ ＯＵＴＴＭ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １．０μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ ＲＴ １．０μｌ）７μＬを加え，穏やかに均一にした後、２５℃で５分間、更に５０℃で６０分間インキュベートし、７０℃で１５分間熱処理することにより反応を停止させた。１サンプルにつき１００μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水を加え、ｃＤＮＡ溶液とした。
【００３７】
得られｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲを行い、目的のＲＮＡを定量した。ＰＣＲはＥＸ−Ｔａｑ（宝酒造製）を用いｃＤＮＡ １．０μｌを用いて、ＰＣＲ反応液を調製し，９５℃ で２分間熱処理し、変性９５℃、４０秒、アニーリング５５℃、４０秒、エクステンション７２℃、１分を、計３０サイクルの条件下でＰＣＲ反応を行った。プライマーは下記のプライマーを用いた。
Ｔｆｆ２（１）：５’−ＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＡＧＴ−３’
Ｔｆｆ２（２）：５’−ＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧ−３’
Ｒｅｇ４（１）：５’−ＡＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣ−３’
Ｒｅｇ４（２）：５’−ＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧ−３’
Ｐｉｔｘ２（１）：５’−ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＣＴＴＡＣＧＧＡＡＧＣ−３’
Ｐｉｔｘ２（２）：５’−ＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣ−３’
ＡＢＣＡ１２（１）：５’−ＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡ−３’
ＡＢＣＡ１２（２）：５’−ＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡ−３’
ＬＯＣ６８９１１６（１）：５’−ＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＣ−３’
ＬＯＣ６８９１１６（２）：５’−ＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴ−３’
ＦＡＢＰ１（１）：５’−ＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＣ−３’
ＦＡＢＰ１（２）：５’−ＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＣＧ−３’
ＲＥＧ３Ｇ（１）：５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧ−３’
ＲＥＧ３Ｇ（２）：５’−ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣ−３’
ＰＲＬＰＭ（１）：５’−ＧＧＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＣＴＴＡＧＴＡＡＧＧＡ−３’
ＰＲＬＰＭ（２）：５’−ＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＴＡＧＴＴＣＴＣＡＴＣ−３’
ＰＡＰ（１）：５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧ−３’
ＰＡＰ（２）：５’−ＴＧＣＡＧＡＣＧＴＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣ−３’
ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの低下が観察された（図１）。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の大腸癌予防物質のスクリーニング方法により、大腸癌を予防又は治療することのできる化合物、又はそのような化合物を含む食品をスクリーニングすることが可能である。更に、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を摂取することにより、大腸癌を予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】は、ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの低下を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１は、Ｔｆｆ２タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４１】
配列番号２は、Ｐｉｔｘタンパク質をコードする核酸配列である。
【００４２】
配列番号３は、Ｒｅｇ４タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４３】
配列番号４は、ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４４】
配列番号５は、ＬＯＣ６８９１１６ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４５】
配列番号６は、ＦＡＢＰ１タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４６】
配列番号７は、ＲＥＧ３Ｇタンパク質をコードする核酸配列である。
【００４７】
配列番号８は、ＰＲＬＰＭタンパク質をコードする核酸配列である。
【００４８】
配列番号９は、ＰＡＰタンパク質をコードする核酸配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、特に大腸癌の予防物質のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、癌の予防に関連する特定のタンパク質のｍＲＮＡを測定することにより、短時間に、且つ、安価に癌の予防効果を予測し、予防物質を簡便にスクリーニングすることができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本において平均寿命が長くなると共に、癌による死亡率が高くなっている。また、食生活の変化に伴い、消化器系の癌、特に大腸癌の発症率が高くなってきている。この大腸癌の発症に対して、発癌抑制作用を有する食品が報告されており、例えば、マウスにアゾキシメタン（ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ）を投与すると大腸腫瘍が発症するが、その大腸腫瘍の発症がビタミンＢ６の摂取量の増加により顕著に抑制されることが知られている（非特許文献１）。更に、以前の疫学的研究においても，ビタミンＢ６の摂取により大腸癌の発症が抑制されること、又は血中ビタミンＢ６濃度と大腸癌の発症との間に高い負の相関があることが報告されている（非特許文献２、および非特許文献３）。
【０００３】
このように大腸癌の発症率が高まっている中で、食品などに含まれている前記ビタミンＢ６などの大腸癌を予防することのできる化合物を探索し、それらの化合物の摂取を促すことにより、大腸癌の予防又は治療につなげることが期待されている。しかしながら、そのような化合物のスクリーニングは、モデル動物に大腸癌を発症させ、その動物に被検試料を投与し、大腸癌の発症が抑制されるかを確かめることによって行わなければならないため、多くの実験動物を用い、また大腸癌の発症に数ヶ月を要することから、長期の時間がかかり、時間的にも経済的にも負担の多いものであった。
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｏｍａｔｓｕ Ｓ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈ， Ｏｋａ Ｔ， Ｔｓｕｇｅ Ｈ， Ｎｉｉ Ｈ， Ｋａｔｏ Ｎ （２００１） Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ−６−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｄｉｅｔｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｗ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ−６ ｄｉｅｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ Ｎｕｔｒ １３１ ： ２２０４−２２０７．
【非特許文献２】Ｓｌａｔｔｅｒｙ ＭＬ， Ｐｏｔｔｅｒ ＪＤ， Ｃｏａｔｅｓ Ａ， Ｍａ ＫＮ， Ｂｅｒｒｙ ＴＤ， Ｄｕｃａｎ ＤＭ， Ｃａａｎ ＤＪ （１９９７） Ｐｌａｎｔ ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ： ａｎ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ （Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）． Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｕｓｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ８ ： ５７５−５９０．
【非特許文献３】Ｊａｎｓｅｎ ＭＣ， Ｂｕｅｎｏ−ｄｅ−Ｍｅｓｑｕｉｔａ ＨＢ， Ｂｕｚｉｎａ Ｒ， Ｆｉｄａｎｚａ Ｆ， Ｍｅｎｏｔｔｉ Ａ， Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ Ｈ， Ｎｉｓｓｉｎｅｎ ＡＭ， Ｋｏｋ ＦＪ， Ｋｒｏｍｈｏｕｔ Ｄ （１９９９） Ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｆｏｏｄｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ： ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ ｓｔｕｄｙ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８１ ： １７４−１７９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、動物実験や疫学的調査によって明らかになったビタミンＢ６の大腸癌予防効果に着目し，ビタミンＢ６の摂取時にラット大腸組織において発現量が著しく変動する遺伝子群を網羅的に探索した。その結果、大腸癌の発症が抑えられるラットにおいて、ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量が顕著に低下することを見出した。そして、これらのｍＲＮＡをスクリーニングマーカーとすることによって、大腸癌を予防することのできる化合物をスクリーニングできることを見出した。
【０００６】
本発明はこうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、 大腸癌予防物質のスクリーニング方法であって、
（１）実験動物に被検試料を投与する工程、
（２）実験動物から大腸組織を採取する工程、
（３）前記大腸組織におけるＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質および／またはＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定する工程、及び
（４）前記ｍＲＮＡの発現量の減少から大腸癌の予防効果を判定する工程、
を含む前記スクリーニング方法。に関する。
【０００８】
本発明によるスクリーニング方法の好ましい態様においては、 実験動物がラットであるスクリーニング方法である。
【０００９】
本発明によるスクリーニング方法の別の好ましい態様においては、投与する期間が１４日〜28日であるスクリーニング方法である。
【００１０】
本発明によるスクリーニング方法の別の好ましい態様においては、上記ｍＲＮＡの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、あるいはＤＮＡチップ法、またはＲＴ−ＰＣＲ法である、スクリーニング法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ビタミンＢ６の大腸癌予防効果の解析過程で見出された遺伝子群を予防効果のマーカーとして利用することにより、数ヶ月以上要していた動物実験による癌の予防物質のスクリーニングを短期間で行なうことが可能であり、実験に要する時間的及び経済的負担を軽減し、また実験に供する実験動物数を縮小することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法によって、スクリーニングすることのできる大腸癌予防物質は、大腸癌の発症を予防又は抑制する可能性のある化合物であれば特に限定されることはなく、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質、糖、脂質、及び核酸などを含む。本発明のスクリーニング方法において動物に投与される被検試料は、化合物そのものでもよいが、前記大腸癌予防物質を含む可能性のあるものであれば、特に限定されず、例えば、食品、植物からの抽出物、は合成された化合物などを挙げることができる。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法は、
（１）被検試料投与工程、
（２）大腸組織採取工程、
（３）ｍＲＮＡ発現量測定工程、及び
（４）大腸癌予防効果判定工程、を含み、原則として前記工程をこの順序で実施することが好ましい。
【００１５】
前記被検試料投与工程（１）においては、実験動物に被検試料を投与する。被検試料の投与方法としては、具体的には、被験試料の物性等により経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与等の投与形態を使い分けることができ、また、大腸への局所投与も可能である。被検試料が食品の場合は、経口投与が好ましいが、飼料への混合する混飼により摂取させる方法、注射筒などによる経口投与、又は経口チューブなどを用いた強制投与などを行なうことも可能である。
【００１６】
被検試料の投与期間は、被検試料の効果が得られる期間であれば、特に限定されるものではなく、例えば、静脈内投与などの場合は、一回の投与でもよいため、その注入時間のみでもよい。また、飼料への混飼による摂取の場合では、好ましくは１日〜３ヶ月、より好ましくは５日〜２ヶ月、最も好ましくは１４〜２８日である。
【００１７】
被検試料を投与される実験動物は、特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ミニブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、及び魚類等の脊椎動物を挙げることができる。本発明において、飼育及び操作上の点から、好ましくはマウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類であり、特に好ましくはラットである。具体的な、ラットの系統としては、ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットを用いることができる。本発明において測定対象とするｍＲＮＡは、少なくともマウス、およびラットにおいては存在することは確認済みである。
【００１８】
大腸組織採取工程（２）においては、被検試料を投与された実験動物から大腸組織を採取する。例えば、ラットの場合は被検試料の経口投与終了後、６時間絶食させ、ジエチルエーテルで麻酔し、その後頚椎脱臼法で屠殺する。大腸組織を摘出し、ｍＲＮＡの測定に用いる。採取する大腸組織の部位は、特に限定されるものではない。
【００１９】
更に、本発明の別の実施態様としては、実験動物の代わりに実験動物又はヒトから分離された大腸由来の培養細胞を用いることも可能である。この態様の場合、被検試料投与工程（１）は、培養細胞に被検試料を接触させることにより実施することができ、具体的には培養細胞の培養液中に被検試料を添加すればよい。培養細胞に被検試料を接触させる期間（時間）は、実験動物を用いる態様と比較して、一般的には短くすることが可能であり、例えば、数時間〜３日で行なうことができる。また、大腸組織採取工程（２）は、培養細胞を回収することによって実施することが可能である。回収した培養細胞からのｍＲＮＡの回収は、後述のｍＲＮＡ発現量測定工程（３）と同様の方法にて行なうことができる。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法において測定することのできる候補遺伝子群は、実験動物において、大腸癌の予防効果と関連して変動するものであれば、特に限定されるものではなく、その変動も上昇でも、下降（低下又は減少）でもよいが、好ましくは低下である。また、候補遺伝子群は、実験動物によって異なっていてもよく、動物種によって測定される遺伝子が異なることもある。更に、測定される遺伝子の組み合わせも限定されるものではなく、１つの遺伝子の変動が大腸癌の予防効果と関連している場合は、１つの遺伝子を測定することができ、２種類以上の遺伝子が関連して大腸癌の予防効果と関連する場合は、組み合わせて測定することが好ましい。
【００２１】
例えば、ラットにおける候補遺伝子群としては、ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡを挙げることができる。これらのｍＲＮＡは、ビタミンＢ６の投与により低下する遺伝子群であり、本発明のスクリーニング方法においては、これらの遺伝子群の少なくとも１つの低下を測定することにより、被検試料の大腸癌の予防効果をスクリーニングすることが可能であるが、最も好ましくは、これらの遺伝子群の全てを測定し、すべてのｍＲＮＡの発現が低下していることが好ましい。
【００２２】
ＴＦＦ２タンパク質はｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ ２であり、ＰＩＴＸ２タンパク質はｐａｉｒｅｄ−ｌｉｋｅ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２ であり、ＲＥＧ４タンパク質はｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｍｉｌｙ， ｍｅｍｂｅｒ ４であり、ＡＢＣＡ１２タンパク質はＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ， ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ Ａ （ＡＢＣ１）， ｍｅｍｂｅｒ １２であり、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質はｎｕｃｌｅａｒ ｃａｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ２相同性タンパク質であり、ＦＡＢＰ１タンパク質はｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １であり、ＲＥＧ３Ｇタンパク質はｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ３ ｇａｍｍａであり、ＰＲＬＰＭタンパク質はｐｒｏｌａｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍであり、ＰＡＰタンパク質はｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎである。
【００２３】
ｍＲＮＡの測定法としては、その発現量を測定できる測定法であれば、特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法を用いることが可能である。具体的には、ｍＲＮＡを直接測定するノーザンブロット分析、ドットブロット法、及びＲＮＡｓｅプロテクション法並びにｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し分析するＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ノーザンブロット分析法を挙げることができる。更に、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、及びクロスハイブリダイゼーション法等をｍＲＮＡの発現の解析に用いることも可能であるが、最も好ましくは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、及びＤＮＡチップ法である。以下に、ｍＲＮＡの発現解析の方法として、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、及びＲＴ−ＰＣＲ法を例として説明する。
【００２４】
本願発明のスクリーニング方法におけるｍＲＮＡ発現量測定工程（３）は、以下のように行なうことができる。ｍＲＮＡの解析のためには、ＲＮＡの抽出を行なう。ｍＲＮＡの抽出は、公知の方法を用いることが可能であり、例えば、塩酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法やＡＧＰＣ変法、或いはＲＮＡが結合するカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出用キットなどを用いることが可能である。また、市販のＲＮＡ抽出キットとしては、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）などを用いることもできる。
【００２５】
ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイを用いてｍＲＮＡの発現を解析する場合は、ｍＲＮＡをそのまま解析することも可能であるが、通常ｍＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行なう。ｃＤＮＡ合成は、公知の方法を利用することが可能であり、例えば、モレキュラークローニングアラボラトリーマニュアル第３版［ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行，（２００１）］等に記載の逆転写酵素を用いる逆転写反応により実施できる。逆転写酵素としては、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ又はＡＭＶリバーストランスクリプターゼ等を用いることが可能である。ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーは、ポリＴプライマーを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成したり、６ｍｅｒ〜９ｍｅｒのランダムプライマ−を用いてｃＤＮＡを合成することも可能である。また、ｃＤＮＡは、ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイでの解析を容易にするために、蛍光色素などでラベルされることが好ましい。
【００２６】
ＤＮＡマイクロアレイは、１枚のスライドガラスやチップなどの基板上に、数千から数万の遺伝子を異なるスポットとして固定させたものである。このアレイ又はチップに、前記の合成したｃＤＮＡをハイブリダイズさせ、遺伝子の発現パターンを同時に観察する。例えば、遺伝子発現解析に用いるマイクロアレイに結合させるＤＮＡとして、プラスミドのクローン、ＰＣＲによる増幅断片、合成オリゴヌクレオテチドなどを使用して作製できる。本発明において、マイクロアレイに結合させるＤＮＡは、大腸癌の予防効果と関連して変動するものであれば、特に限定されるものではないが、特にはＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質をコードするＤＮＡが好ましい。また、その鎖長はｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズすることが可能であれば限定されないが、１０ｍｅｒ以上が好ましい。これらのマイクロアレイ、マイクロチップは、ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社、株式会社ＤＮＡチップ研究所、宝酒造株式会社などから市販されている。
【００２７】
本発明において、試験試料を投与された試験群と対照群との遺伝子発現を比較する場合、試験群と対照群のｍＲＮＡをそれぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素で蛍光標識したヌクレオチドを用いて逆転写し、逆転写の際に異なる蛍光色素を取り込ませた標識ｃＤＮＡを得ることが好ましい。得られた２種類のｃＤＮＡを１枚のＤＮＡマイクロアレイ上で同時にハイブリダイズさせ、マイクロアレイ用のスキャナー等で画像データとして読み取り、マイクロアレイ上の蛍光発光量を測定する。測定されたマイクロアレイの画像データから、定量化のソフトウェアを用いて、ｃＤＮＡ量の解析を行なう。
【００２８】
また、ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ法で測定することが可能である。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡ合成後に、ＰＣＲを行ってもよいが、リアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、及びサイバーグリーン法）で、ｍＲＮＡから直接測定することも可能であり、微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で好ましい。ＲＴ−ＰＣＲでは、検出すべき遺伝子、例えばＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質をコードする遺伝子（それぞれ、配列番号１〜９で示す）のｍＲＮＡを逆転写し、これらの遺伝子を特異的に増幅するプライマー（例えば、配列番号１０〜２７に示される塩基配列からなるプライマー）を用い、ＰＣＲにより増幅する。増幅産物は、電気泳動等により分離し、定量することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法、例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いる場合には、５’端を蛍光色素（レポーター）で、３’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出を行う。前記プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側に設定したプライマーによってＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
【００２９】
測定されたｍＲＮＡの発現量の変動を大腸癌予防効果判定工程（４）により、判断することによって、被検試料に含まれる化合物の大腸癌予防効果を判定することができる。前記のｍＲＮＡの測定による発現量の変動は、発現量の上昇でも、下降（低下）でもよく、発現量の変化は、２倍以上、好ましくは３倍以上、最も好ましくは５倍以上である。
【００３０】
前記の遺伝子に関する情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の遺伝子配列データベースから入手することができる。例えば、表１のＧｅｎｅＮａｍｅ及びＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｎａｍｅから検索することができる。
【００３１】
【表１】
【００３２】
前記のＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーは、前記の遺伝子配列から作製することができる。以下に例示として示す。
Ｔｆｆ２（１）：５’−ＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＡＧＴ−３’（配列番号１）
Ｔｆｆ２（２）：５’−ＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧ−３’ （配列番号２）
Ｒｅｇ４（１）：５’−ＡＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣ−３’ （配列番号３）
Ｒｅｇ４（２）：５’−ＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧ−３’ （配列番号４）
Ｐｉｔｘ２（１）：５’−ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＣＴＴＡＣＧＧＡＡＧＣ−３’ （配列番号５）
Ｐｉｔｘ２（２）：５’−ＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣ−３’ （配列番号６）
ＡＢＣＡ１２（１）：５’−ＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡ−３’ （配列番号７）
ＡＢＣＡ１２（２）：５’−ＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡ−３’ （配列番号８）
ＬＯＣ６８９１１６（１）：５’−ＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＣ−３’ （配列番号９）
ＬＯＣ６８９１１６（２）：５’−ＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴ−３’ （配列番号１０）
ＦＡＢＰ１（１）：５’−ＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＣ−３’ （配列番号１１）
ＦＡＢＰ１（２）：５’−ＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＣＧ−３’ （配列番号１２）
ＲＥＧ３Ｇ（１）：５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧ−３’ （配列番号１３）
ＲＥＧ３Ｇ（２）：５’−ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣ−３’ （配列番号１４）
ＰＲＬＰＭ（１）：５’−ＧＧＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＣＴＴＡＧＴＡＡＧＧＡ−３’ （配列番号１５）
ＰＲＬＰＭ（２）：５’−ＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＴＡＧＴＴＣＴＣＡＴＣ−３’ （配列番号１６）
ＰＡＰ（１）：５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧ−３’ （配列番号１７）
ＰＡＰ（２）：５’−ＴＧＣＡＧＡＣＧＴＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣ−３’ （配列番号１８）
前記のプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲに用いることができるが、ハイブリダイゼーションの原理を用いたｍＲＮＡ検出法、例えば、ノーザンブロット分析、又はドットブロット法においては、プローブとして用いることも可能である。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１》
本実施例１では、ラットにビタミンＢ６を投与し、大腸組織のＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの量をＤＮＡマイクロアレイ法で測定した。
（Ａ）実験動物への被検試料の投与（被検試料投与工程）
５週齢のＳＤ雄ラット（日本チャールス・リバー株式会社）を、１２時間明暗サイクル（８：００〜２１：００は明，２１：００〜８：００は暗）、恒温（２４±１℃）で飼育した。馴化期間として、購入後１週間は、脱イオン水と固形飼料を自由摂取させ、体重を記録した。５匹ずつ、２つの群に分け、試験群には、ビタミンＢ６を含んだ試験食（ビタミン含有量は、５００ｍｇ／ｋｇ ｄｉｅｔ）を３５日間、さらにコントロール群（ビタミン含有量は、１ｍｇ／ｋｇ ｄｉｅｔ）を３５日間飼育した。試験食では、ラット１匹あたり、一日平均 ８ｍｇのビタミンＢ６を摂取した。対照群は、ビタミンＢ６を含まない以外は試験群と同じ飼料を与えた。
（Ｂ）実験動物からの大腸癌組織の摘出（大腸組織採取工程）
ラットは、３５日間の被検試料の投与終了後、６時間絶食させ、ジエチルエーテルで麻酔し頚椎脱臼法で屠殺した。開腹後、大腸を摘出し、ＰＢＳを入れたシャーレに回収した。
（Ｃ）ＲＮＡの回収
大腸組織を、１５ｍｌ容チューブに入れ、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）７．２ｍｌを加え、ホモジナイザーで完全に破砕した。クロロホルムを１．５ｍｌずつ添加し、１５秒間激しくボルテクスをかけ、室温で３分間静置した。３、０００×Ｇで室温、１０分間遠心し、上清を新しい１５ｍｌ容チューブに回収した。得られた上清に、等量のフェノールクロロホルムを加え、激しくボルテクスをかけ、再度遠心して（３，０００×Ｇ、室温、１０分間）上清を回収した。回収した上清と等量のイソプロパノール行い、減圧乾燥させ、１ｍｌのＤＥＰＣ処理水（０．１％Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＳＩＧＭＡ社）を加えた。６０℃で１０分間熱処理して、ＲＮＡを溶解し、ＯＤ２６０で濃度を測定した。約５００μｇのトータルＲＮＡが得られた。
（Ｄ）ｃＲＮＡの合成、および精製−８０℃でエタノール沈殿したＲＮＡを解凍し、遠心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）した後、上清を除去し、３００μｌの７０％エタノールで洗浄して減圧乾燥させた。１００μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮａｓｅ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を加え、８５℃で１０分間熱処理してＲＮＡ溶液とし、ＯＤ２６０で濃度を測定した。７００ｎｇ相当のＲＮＡにＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ１．０μｌとＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水を加え、６５℃で１０分間熱処理し、氷上で５分間静置した。を加えよく転倒混合し、室温で１０分間静置した。７、０００ｒｐｍで４℃、１０分間、遠心し、上清を除去して７０％エタノールを３．０ｍｌずつ加え、−８０℃で保存した。解凍後、遠心（７，０００ｒｐｍ，４℃，５分間）を１サンプルあたり以下の反応液（５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ２．７μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ １．３μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ０．７μｌ、ＭＭＬＶ−ＲＴ ０．７μｌ、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ ０．３μｌ）を加え、穏やかに混合して４０℃で２時間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。６５℃で１５分間熱処理して反応を停止し、氷上で５分間静置した。１サンプルあたり以下の反応液（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ 水 １０．２μｌ、４×Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １３．３３μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ４．０μｌ、ＮＴＰ Ｍｉｘ ５．３３μｌ、５０％ＰＥＧ ４．２７μｌ、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ ０．３３μｌ、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ０．４０μｌ、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５３μｌ）を加え、穏やかに混合した。さらにサンプルを加えたチューブを遮光し、Ｃｙａｎｉｎｅ３（緑発色）、Ｃｙａｎｉｎｅ５（赤発色）を１サンプルあたり１．６μｌずつ加え、穏やかに混合して４０℃で２時間、遮光してインキュベートした。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてｃＲＮＡの精製を行った。１サンプルあたりＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）４６．６μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ３５０μｌ、１００％エタノール２５０μｌを加え、よく混合し、全量をカラムに流し込んで遠心し（１３，０００ｒｐｍ、４℃、３０秒）、フロースルーを捨てた。カラムを新しいコレクションチューブに移し、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ５００μｌをカラムに加え、遠心し（１３，０００ｒｐｍ、４℃、３０秒）、フロースルーを捨て、これを計２回行った。カラムを新しいコレクションチューブに移し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを３０μｌずつカラムの中央に滴下し、１分間静置した。遠心し（１３，０００ｒｐｍ、４℃、１分間）、フラクションをＲＮＡ溶液とし、ＯＤ２６０でＲＮＡ濃度を、ＯＤ５５２、およびＯＤ６５０でＣｙａｎｉｎｅ３、Ｃｙａｎｉｎｅ５の色素の波長を測定した。
【００３４】
ハイブリダイゼーション、およびデータ解析
８２５ｎｇ相当のＣｙａｎｉｎｅ３、およびＣｙａｎｉｎｅ５ラベル標識したｃＲＮＡ溶液をマイクロアレイハイブリダイゼーションのサンプルとして用いた。ハイブリダイゼーションはオリゴＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションプロトコール（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に従い、ラットゲノムアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて行った。
（Ｅ）ＤＮＡマイクロアレイでのｃＤＮＡの解析
ハイブリダイゼーション終了後にＤＮＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてデータスキャンして解析を行った解析の結果、対照群のラットと比較して試験群のラットのＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現が有意に低下していた。
【００３５】
本実施例２では、ビタミンＢ６の投与によって、ＴＦＦ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質のｍＲＮＡの大腸における低下をＲＴ−ＰＣＲによって測定した。前記実施例１の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）で得られたＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった。
【００３６】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて，ｃＤＮＡ溶液を作製した。１．０μｇのＲＮＡ溶液にＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ（３．０μｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１．０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、液量が１１．０μｌになるようにＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えた。６５℃で５分間熱処理し，氷上で１分間静置した。１サンプルあたり、反応液（５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ４．０μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ１．０μｌ、ＲＮａｓｅ ＯＵＴＴＭ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １．０μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ ＲＴ １．０μｌ）７μＬを加え，穏やかに均一にした後、２５℃で５分間、更に５０℃で６０分間インキュベートし、７０℃で１５分間熱処理することにより反応を停止させた。１サンプルにつき１００μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水を加え、ｃＤＮＡ溶液とした。
【００３７】
得られｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲを行い、目的のＲＮＡを定量した。ＰＣＲはＥＸ−Ｔａｑ（宝酒造製）を用いｃＤＮＡ １．０μｌを用いて、ＰＣＲ反応液を調製し，９５℃ で２分間熱処理し、変性９５℃、４０秒、アニーリング５５℃、４０秒、エクステンション７２℃、１分を、計３０サイクルの条件下でＰＣＲ反応を行った。プライマーは下記のプライマーを用いた。
Ｔｆｆ２（１）：５’−ＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＡＧＴ−３’
Ｔｆｆ２（２）：５’−ＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧ−３’
Ｒｅｇ４（１）：５’−ＡＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣ−３’
Ｒｅｇ４（２）：５’−ＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧ−３’
Ｐｉｔｘ２（１）：５’−ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＣＴＴＡＣＧＧＡＡＧＣ−３’
Ｐｉｔｘ２（２）：５’−ＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣ−３’
ＡＢＣＡ１２（１）：５’−ＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡ−３’
ＡＢＣＡ１２（２）：５’−ＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡ−３’
ＬＯＣ６８９１１６（１）：５’−ＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＣ−３’
ＬＯＣ６８９１１６（２）：５’−ＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴ−３’
ＦＡＢＰ１（１）：５’−ＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＣ−３’
ＦＡＢＰ１（２）：５’−ＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＣＧ−３’
ＲＥＧ３Ｇ（１）：５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧ−３’
ＲＥＧ３Ｇ（２）：５’−ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣ−３’
ＰＲＬＰＭ（１）：５’−ＧＧＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＣＴＴＡＧＴＡＡＧＧＡ−３’
ＰＲＬＰＭ（２）：５’−ＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＴＡＧＴＴＣＴＣＡＴＣ−３’
ＰＡＰ（１）：５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧ−３’
ＰＡＰ（２）：５’−ＴＧＣＡＧＡＣＧＴＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣ−３’
ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの低下が観察された（図１）。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の大腸癌予防物質のスクリーニング方法により、大腸癌を予防又は治療することのできる化合物、又はそのような化合物を含む食品をスクリーニングすることが可能である。更に、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を摂取することにより、大腸癌を予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】は、ＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質及びＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの低下を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１は、Ｔｆｆ２タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４１】
配列番号２は、Ｐｉｔｘタンパク質をコードする核酸配列である。
【００４２】
配列番号３は、Ｒｅｇ４タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４３】
配列番号４は、ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４４】
配列番号５は、ＬＯＣ６８９１１６ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４５】
配列番号６は、ＦＡＢＰ１タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４６】
配列番号７は、ＲＥＧ３Ｇタンパク質をコードする核酸配列である。
【００４７】
配列番号８は、ＰＲＬＰＭタンパク質をコードする核酸配列である。
【００４８】
配列番号９は、ＰＡＰタンパク質をコードする核酸配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌予防物質のスクリーニング方法であって、
（１）実験動物に被検試料を投与する工程、
（２）実験動物から大腸組織を採取する工程、
（３）前記大腸組織におけるＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質および／またはＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定する工程、及び
（４）前記ｍＲＮＡの発現量の減少から大腸癌の予防効果を判定する工程、
を含む前記スクリーニング方法。
【請求項２】
実験動物がラットである請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記被検試料を投与する期間が１４日〜２８日である請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、あるいはＤＮＡチップ法である請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
大腸癌予防物質のスクリーニング方法であって、
（１）実験動物に被検試料を投与する工程、
（２）実験動物から大腸組織を採取する工程、
（３）前記大腸組織におけるＴＦＦ２タンパク質、ＰＩＴＸ２タンパク質、ＲＥＧ４タンパク質、ＡＢＣＡ１２タンパク質、ＬＯＣ６８９１１６タンパク質、ＦＡＢＰ１タンパク質、ＲＥＧ３Ｇタンパク質、ＰＲＬＰＭタンパク質および／またはＰＡＰタンパク質のｍＲＮＡの発現量を測定する工程、及び
（４）前記ｍＲＮＡの発現量の減少から大腸癌の予防効果を判定する工程、
を含む前記スクリーニング方法。
【請求項２】
実験動物がラットである請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記被検試料を投与する期間が１４日〜２８日である請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、あるいはＤＮＡチップ法である請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−４５０４１（Ｐ２００９−４５０４１Ａ）
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１６６３４（Ｐ２００７−２１６６３４）
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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