大規模並列核酸分析方法
【課題】複数種類の核酸試料の混合物中に含まれる核酸をそれぞれ個別に並列増幅する技術を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、少なくとも複数の鋳型核酸と、一種類以上の増幅用プローブを表面に固定した固相担体を均一な溶媒からなる反応溶液中に保持して増幅反応を行い、1固相担体には2つ以上の鋳型核酸に起因した増幅産物が複製されない増幅手段を具備する核酸分析方法である。本発明により、解析対象となる複数種類の混合状態の核酸試料を、それぞれ並列に個別増幅することが可能となる。一固相担体一核酸であるため、増幅産物が得られた固相担体を集積することが容易であり、増幅産物の解析スループット向上へとつなげられる。また増幅反応工程は全て均一な溶媒条件下において反応を行っているため、作業工程が簡便で自動化に適する。
【解決手段】本発明は、少なくとも複数の鋳型核酸と、一種類以上の増幅用プローブを表面に固定した固相担体を均一な溶媒からなる反応溶液中に保持して増幅反応を行い、1固相担体には2つ以上の鋳型核酸に起因した増幅産物が複製されない増幅手段を具備する核酸分析方法である。本発明により、解析対象となる複数種類の混合状態の核酸試料を、それぞれ並列に個別増幅することが可能となる。一固相担体一核酸であるため、増幅産物が得られた固相担体を集積することが容易であり、増幅産物の解析スループット向上へとつなげられる。また増幅反応工程は全て均一な溶媒条件下において反応を行っているため、作業工程が簡便で自動化に適する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体上にあらかじめ固定されたプライマーを用いて、核酸混合物中に含まれる核酸試料をそれぞれ個別に並列増幅し分析する方法に関する。本発明はまた、個別並列増幅および分析に必要とするキットおよび装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列決定、遺伝子診断や遺伝子発現の解析、変異の解析にあたっては、その検出精度を保つため、あらかじめ解析対象となる核酸を分析に十分な量に増幅する必要がある。核酸を増幅することにより、オリジナルの核酸の配列や量比を正確に反映できず、分析結果に問題があるとする意見もあり、増幅を行わず一分子をそのまま検出するという技術（単分子計測）の開発も精力的に進められている。しかし現実的に実用化されるまでにはまだ超えなければならないハードルが高く、現時点においては、核酸解析工程において解析対象核酸を増幅する、という工程は必須となっている。
【０００３】
一方、解析対象核酸は、ほとんどの場合異種配列を有する核酸が混合物の状態で提供される。混合物中の核酸すべてを解析対象とする場合においても、特定の核酸のみを対象とする場合においても、混合物中に含まれる核酸を個別に増幅する必要がある。
【０００４】
核酸を増幅させる技術としては、大きく2種類ある。ひとつは大腸菌等を用いて生物的に増幅させるクローニングの技術である。もう一つは、酵素を用いて化学的な反応によりin vitroで増幅を行う技術である(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【０００５】
クローニング法では、一般にまず核酸断片をベクター中に挿入し、次いで注目する断片を含有するベクターを大腸菌などの宿主に導入する。通常、宿主は増殖培地（たとえば寒天プレート）上においてコロニーを形成する。各コロニーは、個々の宿主に起因し、それぞれが数百万のオーダーで増幅された宿主により形成されている。各コロニーを個々に容器に移し、液体培地内でさらに宿主細胞を複製させることで、個別に更なる増幅が可能となる。この増幅された宿主細胞から標的核酸を回収し、分析を行う。この手法の場合、当初核酸が複数種類の混合物であってもコロニーを形成する段階で単離することができ、続く液体培地での複製により、個別増幅が可能となる。一方で、宿主細胞の生物的増幅の速度が全工程の律速となり、膨大な作業時間を要する。その上、煩雑な作業工程は自動化および大規模化に適さないという問題もある。
【０００６】
一方、酵素を用いた増幅法では代表的な技術としてPCR (Polymerase Chain Reaction)法が挙げられる。この方法では、着目する核酸領域の両末端の配列と相補的な配列を有する短い核酸（プライマー）をあらかじめ用意する。耐熱性DNA Polymeraseを用い、プライマーを伸長させた後、高温条件下で核酸を変性させ、次いで温度を下げることにより、あらかじめ大過剰に投入された余剰プライマーが再び標的核酸に相補鎖結合し伸長反応が起こる。このプライマーの伸長産物を増幅産物とする方法である。温度の上げ下げを繰り返すことで最終的には2ｎ（ｎは温度上げ下げの回数）の核酸を得ることができる。他にもバクテリオファージ由来の鎖置換能を持つDNA Polymeraseを利用して鋳型となる環状DNA相補鎖を連続合成して増幅するRolling Circle Amplification法などがある。この方法でも環状DNAを指数関数的に最大109コピーにまで増幅することが可能である。いずれの方法においても、チューブ内で飛躍的な量の核酸を、短時間で得ることができる。さらにこれらの方法は作業工程が単純なため、自動化にも適している。一方で、クローニング法とは異なり、複数種類の核酸試料混合物の個別増幅には不向きである。即ち、同時増幅は可能だが、異種核酸を単離することができないのである。一般的にPCR法において混合物中から標的核酸を単離するには、プライマーの配列を各々の核酸に特異的なものにする、増幅後に電気泳動などにより産物を分離する、などの方法が考えられるが、いずれも作業が非常に煩雑であるため、多量サンプルの解析には向かない。また、プライマーの配列を特異的なものにするということは、既知配列にしか対応できない手段であり、未知配列を有する解析対象には使えないという問題もある。
【０００７】
上記クローニング法およびPCR法の欠点を克服し、長所を活かした核酸の増幅技術として、特表平10-505492に記載されている固相担体上でのPCR増幅がある。これは複数種類の核酸試料混合物中に標的核酸が存在するかを検出するため、標的核酸に特異的な増幅用プライマーがあらかじめ固定された固相担体上でPCR反応を行い、増幅産物の有無で判定を行う方法である。具体的には、ガラス基板もしくはそれに準ずる固相上に、注目する核酸を増幅するのに必要な標的核酸に特異的プライマーが固定されている。固相表面はPCR反応溶液で覆われているが、増幅に使用されるプライマーが固定されているため、増幅産物は反応溶液中に流出することはなく、固相上に固定された形で生成される。生成した産物はその産物長の範囲内に存在する固定化プライマーと相補鎖結合し次の増幅工程に入る。この増幅工程を数十回繰り返すことで、最終的に産物の片側末端が固相上に固定された形で増幅産物を得ることができる。この方法の場合、混合物中に含まれる標的核酸を単離個別増幅しその産物の有無で標的核酸の有無を判定できるが、一方で標的核酸に特異的なプライマーをあらかじめ設計する必要があり、解析対象が限定されてしまうという決定的な問題がある。この点を解決した固相担体上でのPCR増幅法として、特表2002−503954およびNucleic Acid Research vol.28 e87 (2000)がある。この方法では、解析対象となる複数種類の核酸試料混合物に含まれる全ての核酸が、増幅反応に使用される共通プライマーと相補鎖を形成できる配列部分を有していることが前述の技術と異なる点である。このため、固相上にあらかじめ固定された共通プライマーを使用することで混合試料中に含まれる全ての核酸を増幅することが可能となる。固相上に固定されたプライマーに対して非常に少ない分子数の複数種類の核酸試料混合物を固相表面に展開することで、核酸分子は固相担体上に固定されたプライマーとランダムに相補鎖を形成する。プライマーの相補鎖伸長産物はその産物長の範囲内に存在する最寄りの固定化プライマーと相補鎖結合し次の増幅工程に入る。この増幅工程を数十回繰り返すことで、最終的に最初に生成した相補鎖伸長産物を中心としたある一定の範囲内で増幅物が凝集し、増幅産物はあたかもクローニング法のコロニーと同じような形で得られる。本方法の場合、複数種類の核酸試料混合物に含まれるそれぞれの核酸は固相上において増幅産物が個別のコロニーという形態で単離供給される。そのため、混合物の状態で提供される解析対象核酸試料のそれぞれの核酸の解析が可能となり、クローニング法およびPCR法のデメリットを克服した方法であるといえる。また、同様の方法が特表2002-525125でも記載されている。固相担体上に固定されたプライマーを用いてコロニー様の増幅産物を得る点は同じだが、本法の場合増幅対象核酸をあらかじめ固相上に固定した状態でスタートする点において、相補鎖伸長産物からスタートする前述の方法とは異なる。いずれの手法においても、増幅産物は固相担体上にランダムにプロットされたコロニーとして得られる点において共通である。
【０００８】
更に、PCR反応をオイルの中に分散した各水滴を独立した反応槽として増幅反応を行うエマルジョンPCR法が報告されている(Margulies1 M.，Egholm1 M.，Altman1 W. E.，Rothberg1 J. M. et al.Nature 437(7057), 376-80 (2005)) 。多数の核酸試料をそれぞれ隔離された水滴内で同時に増幅することのできる技術である。
【０００９】
【特許文献１】特表平10-505492
【特許文献２】特表2002−503954
【特許文献３】特表2002-525125
【非特許文献１】Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献２】Nucleic Acid Research vol.28 e87 (2000)
【非特許文献３】Margulies1 M.，Egholm1 M.，Altman1 W. E.，Rothberg1 J. M. et al. Nature 437(7057), 376-80 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
遺伝子の分析ビジネスの市場においては、その分析スピードがビジネスの勝敗を決定するといっても過言ではない。解析工程においては、対象遺伝子の前処理、即ち解析を行うために増幅を行ったり精製を行ったりする工程が最も煩雑であり、この工程がいかに簡便であり精度よい方法であるか、また自動化に適した方法であるかがポイントとなる。
【００１１】
そのため、解析対象となる複数種類の核酸試料混合物を、続く分析工程にスムーズに移行できる形態で、個々に並列増幅できる方法の開発が望まれる。上述の固相担体上に固定された解析対象核酸に共通のプライマーを用いたPCR法による増幅反応は非常に有望な手法である。しかし、特表2002-503954では、あるひとつの固相担体表面上に多くの異なる核酸の増幅産物集合体（即ちコロニー）を得ることを特徴としており、この場合、複数のコロニーが一固相担体上に位置していることになる。そもそも最初に固定される増幅用プライマーは基板上に均一に配置することが可能であるが、続いて添加される増幅対象核酸を均一に展開することはきわめて難しい。ある程度希薄な密度で展開されなければコロニー同士が融合してしまう可能性がある。一方、融合を恐れて非常に希薄な核酸試料を用いた場合、混合試料数が多ければ多いほど固相担体の表面積を拡大していく必要がある。更に核酸増幅産物の分析工程において、固相担体上でのコロニー密度が低いということは処理効率が下がるということになる。コロニーが形成された部分の固相のみを物理的に切出す等の作業によりコロニーの集積化が可能とも考えられるが、現実的に平均2〜3.3μm2の大きさとされるコロニーを含む固相をコロニー毎に切出すのは不可能である。特表2002-525125においては、固相担体としてラテックスビーズやデキストランビーズ等のビーズ類をガラス表面に代表される平面支持体以外の例として挙げている。しかし、これらのビーズを基板として用いた場合でも同様に、コロニー間の距離の制御を行うことは非常に難しい。固相担体表面上の個別並列増幅産物の固相担体表面積に対しての集積化が続く解析のスループット向上にもつながるといえ、この点を解決する手段の開発が課題となっている。
【００１２】
一方、エマルジョンPCR法では、オイル中に均一なPCR溶液からなるエマルジョンを調製することが必ずしも簡単ではない。また最大の問題はエマルジョン中に増幅された産物の回収が容易ではない点にある。この問題を解決するため、エマルジョンのようにオイル相と液相のような2種以上の溶媒の混合物からなる不均一分布な反応溶液ではなく、均一溶液中での個別増幅法の開発が課題となる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記にあげた課題を解決するため、1固相担体1核酸となるように試料の調製を行い、この固相担体は均一な溶媒からなる核酸増幅のための反応溶液中に分散させるが、固相担体の極表面近傍でのみ増幅反応が起こるように工夫した。1固相担体1核酸であるため、コロニー間の融合、即ち異種核酸増幅産物間の融合は起こらず、容易に個別並列増幅が可能となる。一方で1固相担体1核酸を可能とする試料調製の弊害として、全く核酸が結合していない基板が多数生じてしまうという問題点が挙げられるが、固相担体上の増幅産物の有無を検出することにより増幅処理後に核酸が結合している固相担体のみを選別することによりこの問題を解決できる。即ち、これが上記で課題として挙げられた個別並列増幅産物の集積化につながる。単独試料の増幅産物が結合した固相担体のみを対象として解析を行うことができるため、分析作業を高効率に行うことが可能となった。上記の従来法 特表2002-525125においては、固相担体としてビーズが列挙されているが、1ビーズ1核酸という発想に基づくものではない。また上記固相担体上での並列増幅法における従来法全てに共通して、固相担体上の増幅産物エリアのみを集積化するという構想ではなく、また実際に固相担体を物理的に切断集積化することも不可能といえ、上記従来法と増幅エリアの選別集積化を組み合わせることにより本発明と同様の目的を達成することはできない。
【００１４】
以下本発明を実現するための手段について詳細に説明する。
本発明の第１態様は、複数の核酸試料を同時に分析する方法であって、１種類以上の増幅用プローブを表面に固定した１つの固相担体に対して、1分子の鋳型核酸の3’末端を含む端部が前記プローブを介して結合しうるように、複数の前記鋳型核酸を導入する第1の工程と、
前記鋳型核酸を鋳型として、前記プローブを伸長させて第1の伸長型プローブとする第2の工程と、
前記第1の伸長型プローブから前記鋳型核酸を解離させる第3の工程と、
前記鋳型核酸を除去する第4の工程と、
（1）前記伸長型プローブの3’末端を含む端部を、伸長していないプローブに結合させる工程と、(2)前記第1の伸長型プローブを鋳型として、前記伸長していないプローブを伸長させて第2の伸長型プローブとする工程と、(3)前記第2の伸長型プローブから前記第1の伸長型プローブを解離させる工程を繰り返して、前記第1の伸長型プローブと前記第2の伸長型プローブを増幅させ、前記担体上に多数の前記第１の伸長型プローブと前記第2の伸長型プローブを生じさせる第5の工程と、
前記第1の伸長型プローブが結合する担体と、前記第1の伸長型プローブが結合しない担体とを選別する第6の工程を含む核酸分析方法である。
【００１５】
本発明の第２態様は、前記第１の工程の前に、前記鋳型核酸の3’末端に第1配列を有するアダプターを導入し、かつ前記鋳型核酸の5’末端に前記第1配列と異なる第2配列を有するアダプターを導入する工程をさらに有し、
１の前記担体に固定される前記複数のプローブは、前記第1配列の相補配列もしくは前記第2配列の相補配列のいずれかを有することを特徴とする、第１態様に記載の核酸分析方法である。
【００１６】
本発明の第３態様は、前記第１の工程の前に、前記鋳型核酸の3’末端に第1配列を有するアダプターを導入し、かつ前記鋳型核酸の5’末端に前記第1配列の相補配列を有するアダプターを導入する工程をさらに有し、
１の前記担体に固定される前記複数のプローブは、前記第1配列の相補配列を有することを特徴とする、第1態様に記載の核酸分析方法である。
【００１７】
本発明の第４態様は、前記第１の工程乃至第４の工程は共通の容器で行い、前記第5の工程は前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器で各々行うことを特徴とする、第１態様に記載の核酸分析方法である。
【００１８】
本発明の第５態様は、前記第１の工程乃至第５の工程を、前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器で各々行うことを特徴とする、第１態様に記載の核酸分析方法である。
【００１９】
本発明の第６態様は、前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器において、前記反応を行う溶液が共通であることを特徴とする、第4または5態様に記載の核酸分析方法である。
【００２０】
本発明の第７態様は、前記第５の工程において、(1) 前記第１の伸長型プローブを鋳型として、同一固相担体上の近接するプローブにＵの字を形成するように相補鎖を伸長させて湾曲形状の第２の伸長型プローブとし、(2) 熱変性により前記湾曲形状をほどいて前記担体上に固定された一本鎖核酸とし、次サイクルの鋳型とする工程を繰り返すことを特徴とする、第１〜６態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２１】
本発明の第８態様は、前記第１の工程乃至第5の工程において、反応溶液を常時撹拌することを特徴とする、第１〜７態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２２】
本発明の第９態様は、前記第１の工程乃至第5の工程において、前記複数の担体を鋳型核酸の長さより長い距離を確保して配置することを特徴とする、第１〜７態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２３】
本発明の第１０態様は、複数の核酸試料を同時に分析する方法であって、１種類の固定プローブを表面に固定した１つの固相担体に対して、1分子の鋳型核酸の3’末端を含む端部が前記プローブを介して結合しうるように、複数の前記鋳型核酸を導入する第1の工程と、
前記鋳型核酸を鋳型として、前記固定プローブを伸長させて第1の伸長型プローブとする第2の工程と、
前記第1の伸長型プローブから前記鋳型核酸を解離させる第3の工程と、
前記鋳型核酸を除去する第4の工程と、
（1）前記第1の伸長型プローブの3’末端を含む端部を、反応溶液中に加えられたもう１種類の浮遊プローブに結合させる工程と、(2)前記第1の伸長型プローブを鋳型として、前記浮遊プローブを伸長させて第2の伸長型プローブとする工程と、(3)前記第2の伸長型プローブから前記第1の伸長型プローブを解離させる工程を繰り返して、前記第1の伸長型プローブと前記第2の伸長型プローブを増幅させ、前記担体上に多数の前記第１の伸長型プローブと前記第2の伸長型プローブを生じさせる第5の工程と、
前記第1の伸長型プローブが結合する担体と、前記第1の伸長型プローブが結合しない担体とを選別する第6の工程を含む核酸分析方法である。
【００２４】
本発明の第11態様は、前記第5工程の(3)において、前記第1の伸長型プローブと第2の伸長型プローブからなる2本鎖核酸の末端部分のみを部分的に解離させ1本鎖となった末端部に、前記固定プローブもしくは前記浮遊プローブを相補鎖結合させ、鎖置換能のあるDNAポリメラーゼを用いて鋳型核酸の2本鎖部分を剥がしながら伸長反応を行うことを特徴とする、第10態様に記載の核酸分析方法である。
【００２５】
本発明の第12態様は、前記反応溶液中に、変性時（70℃〜100℃）に粘性が増加あるいはゲル化し、相補鎖結合時（20℃〜60℃）に粘性が低下あるいは溶液状態となる物質を共存させ、
前記担体に鋳型核酸を捕獲した後、浮遊プローブをゲル中に分散させた状態で核酸増幅反応を行うことを特徴とする、第10態様に記載の核酸分析方法である。
【００２６】
本発明の第13態様は、鋳型核酸の5'末端に導入されるプローブ配列に前記アダプターの第１配列および第２配列とは相補的でなくまた同一でもない選別用のアンカー配列を付加した上で、前記第１の工程乃至第5の工程を行い、前記第6の工程において前記アンカー配列に相補的なプローブが結合したカラムを利用し、増幅産物が得られた固相担体のみを選別することを特徴とする、第1〜12態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２７】
本発明の第14態様は、鋳型核酸の5'末端に導入されるプローブ配列に前記アダプターの第1配列および第2配列とは相補的でなくまた同一でもない第3配列を付加した上で、前記第１の工程乃至第４の工程を行い、前記第3配列に相補的な配列を有するプライマーを使用して、増幅産物でない鋳型核酸の配列解析を行う工程をさらに含む、第1〜12態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２８】
本発明の第15態様は、2本鎖特異的インターカレーターを増幅反応溶液、もしくは増幅反応終了後の固相担体懸濁液に添加し、前記インターカレーター由来の蛍光を発する固相担体のみを前記溶液から検出・回収することにより、増幅産物が得られた固相担体のみを選別することを特徴とする、第1〜14態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２９】
本発明の第16態様は、１つの固相担体に2つ以上の鋳型核酸に起因した増幅産物が複製されないようにするために、固相担体106個を用いた反応系に対して鋳型核酸分子が103個以下となるよう反応液を調製することを特徴とする、第1〜15態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００３０】
本発明の第17態様は、均一な溶媒からなる溶液中で増幅反応を行うことを特徴とする、第1〜16態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００３１】
本発明の第18態様は、固相担体がビーズであることを特徴とする、第1〜17態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
１．第一の方法
本発明の第一の方法として、固相担体表面にPCRに使用するプライマーの5’末端が固定されており、PCRはこの固相担体上に滴下もしくは液相中に浸された固相上において行われる形態が挙げられる。（以下、固相上に固定されるプライマーをプローブとする。）
【００３３】
１．１ プローブ
プローブの種類は好ましくは2種類であるが、1種類でも可能であり、2種類以上でも可能である。また、プローブの固相担体上への固定方法は特に限定されず、共有結合やイオン結合、物理吸着、生物学的結合（例えばビオチンとアビジン、またはストレプトアビジンとの結合、抗原と抗体との結合など）等による方法が挙げられる。
【００３４】
１．２ 固相担体
固定する固相担体は、ここでは粒径1〜100μm程度の磁気ビーズ粒子を想定する。しかし固相担体の材料としては水不溶性であれば特に限定されるものではなく、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金、チタン、ニッケル等の金属、ステンレスやジュラルミンなどの合金、シリコン、ガラス、石英ガラス、セラミクス等のガラス材料、ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン樹脂、ナイロン、エポキシ樹脂、および塩化ビニル樹脂等のプラスチック、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、キトサン等が挙げられる。また、担体の形状についても特に限定は無い。
【００３５】
１．３ 解析対象試料の調製
解析対象となる核酸試料は、個々の試料塩基長がゲノムサンプルのように長い場合（例えば1000〜2000塩基以上）、あらかじめ制限酵素切断や超音波切断などで短断片化しておく。切断する手段はこれ以外にも、例えば非常に細い針の中を核酸試料を含む溶液のアップダウンにより切断することも可能であり、物理的に切断されるのであれば手段は問わない。cDNAサンプルやRNAサンプル等数千塩基長が最大塩基長の断片群から構成される混合試料の場合は、この切断工程は省略することができる。ここでは核酸試料として超音波切断により短断片化されたDNAを想定する。
【００３６】
１．４ 解析対象試料へのアダプターの挿入
続いて、DNA試料の両末端に、固相担体上に固定されたプローブが１種類の場合は、該プローブと相補的な配列を有する部位（アダプター）および同じ配列を有する部位を挿入する。固定されたプローブが2種類の場合は、一方のプローブと相補的な配列を有する部位（アダプター）およびもう一方のプローブと同じ配列を有するアダプターを挿入する。プローブが2種類以上の場合は、いずれかのプローブと相補的な配列を有するアダプターおよび、いずれかのプローブと同じ配列を有するアダプターが含まれていればよい。
【００３７】
１．５ PCR反応
アダプターが挿入された解析対象DNAの分子と１対１で結合できる量のプローブ固定化ビーズをあらかじめマイクロチューブに用意する。そこへ、PCR反応溶液（反応用バッファー、dNTP Mixture、マグネシウム溶液）を加え、更に解析対象DNAを加える。最後に耐熱性DNAポリメラーゼを滴下し、サーマルサイクラーにセットする。反応は、まず95℃程度でDNAを完全に熱変性により一本鎖化し、その後温度を55℃程度まで降下させ、DNAのアダプター部分とビーズ上の固定プローブを相補鎖結合させる。続いて温度を72℃まで上昇させ、相補鎖結合したDNAを鋳型としたプローブの伸長反応を行う。この後一旦反応溶液を全て除去し、更にアルカリ溶液などの変性作用をもつ溶液を添加するか、もしくは同じく変性作用を持つホルムアミド等の添加と熱による作用を組み合わせることでプローブの相補鎖伸長産物と鋳型となったDNAを変性解離させる。その後、この溶液を完全に除去する。
【００３８】
この後、必要であればさらに10 mM Trisバッファーもしくは1×TE(10 mM Tris、1 mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸））バッファーで洗浄し、溶液を完全に除去する。この工程で、プローブの相補鎖伸長の際鋳型となったDNAおよび最初に投入され相補鎖結合に関与しなかった余剰DNAは全て除去され、次に続く反応中に他のビーズとDNAが相補鎖結合すること、およびビーズへDNAが非特異に吸着することを防止することができる。この洗浄除去の工程は、1固相担体1核酸を実現する上で非常に重要な工程である。上記洗浄処理後、再びPCR反応溶液を加え、DNAポリメラーゼを滴下し、サーマルサイクラーにセットする。続いて、熱サイクル反応((94℃30秒→55℃30秒→72℃60秒)を30〜50回)をスタートさせる。この工程においては、最初の工程でのビーズ固定プローブの相補鎖伸長産物のみが鋳型として働く。この相補鎖伸長産物の末端部分がビーズ上に固定されたプローブと再度相補鎖を形成し、プローブが伸長することで新たなDNA鎖（プローブの相補鎖伸長産物）がビーズ上に生成されることになる。この際、鋳型となる固相上のDNAは、同一ビーズ上の近接するプローブにＵの字を形成するように湾曲して相補鎖を形成する必要がある。一方で隣接する他のビーズ上に固定されるプローブと相補鎖を形成してしまうと、一固相担体一核酸、即ち個別増幅ではなくなる。このため、ビーズとビーズはあらかじめ解析対象DNAの長さ以上に距離を保ち反応を行う必要がある。
【００３９】
１．６ ビーズ間の距離を保つ方法
反応溶液を常時懸濁し溶液中においてビーズ間の距離を保つ、もしくは、個々のビーズを捕捉するのが可能な径の孔があらかじめ掘られたプレート様のセル（マイクロセル）を使用することが考えられる。この場合、ビーズはあらかじめセルの孔に1つずつ配置されこの孔およびビーズ周囲に反応溶液が充填されている状態となる。ビーズとビーズは十分に距離を保つことが可能で、ビーズ間での伸長反応の乗り移りの防止が完全となる。ビーズを配置する手段としては、ビーズを捕捉するための孔を設ける以外に、ビーズの径より小さめの複数孔があいた平面上にビーズを展開し、孔下部から吸引することにより孔上部にビーズを捕捉する方法、平面基板下部にピン上に配置されたマグネットを利用してそのピン上に磁気ビーズを配置する方法などが考えられる。
上記方法で増幅されたDNAは、ビーズ1つに対して一種類のDNAとなり、混合物からスタートした解析対象をビーズ毎に個別に増幅することが可能となる。
【００４０】
２．第二の方法
本発明の第二の方法として、ビーズ表面に1種類のプローブを固定し、もう1種の浮遊プローブ（反応溶液液相中に拡散している未固定プライマー）と組み合わせて増幅を行う形態が挙げられる。この方法において特徴とすべきは、相補鎖伸長鎖の二本鎖部分を完全には変性解離せず、末端部のみ部分的に変性させることにある。二本鎖の相補鎖伸長鎖を完全に変性解離させるには90℃以上の温度が必要であるが、60〜80℃程度の温度条件下で変性させることにより、変性しやすい末端部のみを部分的に一本鎖状態にすることが可能となる。
【００４１】
この部分的に変性した相補鎖のうちビーズ表面に近いほうの末端変性部分には、固相表面に固定されたプローブが、反対側末端には溶液中に拡散している未固定プライマーが相補鎖結合する。その後、鎖置換能のあるDNAポリメラーゼ（例えばRepliPHITM Phi29 DNA Polymerase (100 units/μL)(EPICENTRE社)）を用いて、鋳型となる末端が部分的に変性した二本鎖DNAの二本鎖部分の相補鎖結合を解きながら伸長反応を進める。部分変性の温度条件と相補鎖結合および伸長反応の温度条件の反応工程を複数回繰り返すことで、ビーズ上に増幅産物を得ることができる。
【００４２】
この方法では通常のPCRのように90℃以上の高温条件下で変性を行わないため、二本鎖のいずれかの部分が常にビーズ上に固定されている鎖と相補鎖結合している状態にあり、液相中に拡散するプライマーから得られる相補鎖伸長鎖もビーズ表面から離れて拡散することが無い。また、上記第一の方法と異なり、増幅反応時に使用されるプライマーの一方が未固定のものであり、固定化プライマーに比べその自由度が格段に高い。このため、増幅効率も固定化プライマーのみを使用したときに比べ格段に上昇するという特徴がある。
【００４３】
３．第三の方法
本発明の第三の方法として、DNAを変性させるために必要となる高温条件下において、粘性の増加する媒体を溶液中に加えておく方法が挙げられる。上記、第二の方法と同様、増幅用プライマーのうち一方をビーズに固定し、もう一方は未固定のまま反応溶液中に拡散させた状態で反応を行う。双方共に固定化プライマーを使用する場合に比べ、増幅効率が上昇することが期待できる。一方で、未固定プライマーの相補鎖伸長鎖が、90oC以上の高温条件下で二本鎖状態が完全に変性し解離してしまった状態において、ビーズ表面近傍から移動できないようにする必要がある。
【００４４】
そこで、高温条件（70℃〜100℃）下において粘性が高まる溶媒（例えば、メビオールゲルTM（メビオール株式会社）やメチルセルロースゲル等）を反応液に加えて行う。完全に変性する条件である高温条件下においては、未固定プライマーから得られる伸長鎖は自由に移動できなくなる。一方で、相補鎖結合を生成させる温度条件（20℃〜60℃）下においては反応用液の粘性は低下しており、溶液中に拡散する未固定プライマーが自由に移動できる。このため、相補鎖伸長反応は、ビーズ表面において滞りなく進む。
【００４５】
このように相補鎖結合で生成したDNA伸長産物がビーズ表面近傍から離れることを阻止するいくつかの工夫により、均一な溶液中でDNA鎖を個別に増幅し、かつ簡単に回収することを可能にする。
【００４６】
４．解析対象となるビーズの選別
続いて、増幅産物が結合した解析対象となるビーズのみの選別を行う。産物のないビーズを除去することにより続く解析工程におけるスループットを向上させることが可能である。選別の手段としては、増幅産物のビーズに固定された末端とは異なるもう一方の末端に導入されるプローブ配列に、選別用のアンカー配列を付け加え、この配列に相補的なプローブが結合したカラムを利用する手段が考えられる。カラムに増幅反応後のビーズを添加し、増幅産物があるビーズはカラム上のプローブにトラップされるが、産物のないビーズはトラップされずにカラムを通過する。続いて、低塩濃度の溶液をカラムに添加し、ビーズ上増幅産物とカラム上プローブとの相補鎖結合を解消させビーズを溶液中に溶出させこれを回収すればよい。
【００４７】
または、増幅産物は2本鎖の形状を取っていることを利用する手段も考えられる。2本鎖特異的インターカレーターを増幅反応溶液中、もしくは増幅反応終了後のビーズ懸濁液に添加する。この溶液を、例えばフローサイトメーター等を利用し、ある一定の蛍光を出すビーズのみを検出・回収することにより、容易に増幅産物のあるビーズのみを回収することが可能となる。
【００４８】
以下、本発明を実施例により説明する。
【実施例】
【００４９】
[実施例１]
本実施例の工程概略を図1に示す。固相担体として、表面にカルボン酸基が修飾された磁気ビーズ(直径2.8μm、Dynal BIOTECH社）を使用した。あらかじめよく懸濁したカルボン酸基修飾磁気ビーズ溶液50μL (1×108ビーズ)を2.0mLマイクロチューブに測りとった。チューブ側面にマグネットを配置し磁気ビーズを捕捉した状態で上清を除去した。ビーズを洗浄する目的で、100μLのMES Buffer (25mM MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid) (pH6.0)、 0.1％(w/v) Tween20)を加え室温で10分間攪拌振とうした後、上清を除去した。本工程を再度繰返し、上清を除去した。続いて、MES Bufferで2.5pmol/μLに希釈したプローブAおよびプローブB溶液をそれぞれ30μL加え、室温で30分間撹拌振とうした。プローブAおよびプローブBはその5’末端にアミノ基が挿入されており、アミノ基とプローブ塩基配列の間にはスペーサーとして18原子からなるヘキサエチレングリコールが挿入されている。スペーサーの長さは限定されず、またスペーサーとして、通常塩基（例えばポリT配列など）を使用することも可能である。その後、30μLのEDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)solution (MES Bufferで0.1mg/μLに調製した溶液）および10μLのMES Bufferを加え、4℃条件下で一晩撹拌振とうし、磁気ビーズにプローブを固定した。反応終了後上清を除去し、ビーズ上においてプローブが結合しなかったカルボン酸基のブロッキング処理を行った。即ち200μLのBlocking Buffer (50mM Tris (pH7.5)，0.1％(w/v) Tween20)を加え、室温で15分間撹拌振とうした後上清を除去した。本工程を4回繰り返した後、200μLの10mM Tris(pH7.5)-0.1％(w/v)Tween20溶液を加え、最終濃度5×105ビーズ/μLのプローブ固定化ビーズを得た。図1において、磁気ビーズは111で、磁気ビーズ上に固定されたプローブAは112でプローブBは113でそれぞれ示される。
【００５０】
続いて、解析対象DNA試料の調製を行った。DNA試料は数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片101〜105の混合物である。二本鎖DNA断片101〜105の両末端には、106および107からなるアダプターAおよび108および109からなるアダプターBをあらかじめライゲーションにより導入した。アダプターAを構成する106の塩基配列は107と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また107は磁気ビーズ111に固定されたプローブB113と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。アダプターBを構成する108の塩基配列は109と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また109は磁気ビーズ111に固定されたプローブA112と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。
【００５１】
続いて、上記プローブA(112)およびプローブB(113)が固定された磁気ビーズ111とアダプターA(106および107)およびアダプターB(108および109)が挿入された2本鎖DNA断片を混合し、磁気ビーズ上のプローブとDNA断片を相補鎖結合させる処理を行った。ここで重要となるのは、ビーズとDNA断片の混合比率である。反応に使用するビーズの個数をＮ、DNA分子の数（DNA一本鎖を分子数1とする、二本鎖は分子数2）をｎとした場合、1個当たりビーズに結合するDNA分子の平均値（λ）はｎ/Ｎで表され、この値が1より大きくならない結合反応条件が必要となる。ポアソン確率からこの反応条件を算出すると、1つのビーズに2分子以上のDNAが結合する確率（Ｐ）は、
Ｐ＝１−（１＋λ）ｅ−λ
で表すことができる。ビーズ106個を用いた反応系におけるビーズ一個当たりに2分子以上のDNAが固定される確率のプロットを行った（図2）。このプロットから、1ビーズ1DNA（1固相担体1核酸）を実現するために、ビーズ106個を用いた反応系において2分子以上が固定されるビーズを1個以下にするには、DNA分子103以下で反応液を調製する必要があることがわかった。そこで本実施例においては、ビーズ106個に対し、2本鎖DNA断片を5×102分子混合し反応を行った（図1(1)）。上記ビーズとDNA断片混合液に10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）4μL、50 mM MgSO4 1.6μL、10mM dNTP Mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液) 0.8μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen社) (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を40μLに調製した反応溶液を準備した。続いて、94℃60秒間でDNA断片を一本鎖に完全に変性させ、続いて50℃120秒間→72℃120秒間のインキュベーションにより相補鎖形成および伸長反応を行った。この工程で、DNA分子（106、101および109で構成）はその末端に導入されたアダプター106がビーズ上プローブB 113と相補鎖結合し、プローブB 113がDNA分子101および109を鋳型として伸長した（図1(2)および(3)）。プローブの相補鎖伸長産物は図１中121および122で示され、伸長産物の末端には、ビーズ上に固定されたもう一種類のプローブA 112と相補的な配列をもつ部分122が導入された。この相補鎖形成および伸長反応工程において重要となるのは、DNA分子がプローブと相補鎖を形成した上で伸長反応が進むことである。DNA分子が非特異吸着によりビーズ上に存在した場合、望むべきでない産物が生じる可能性がある。また、ビーズという固相担体上での反応であるがゆえに、DNA分子が高次構造をとっていると、ビーズ上のプローブとの相補鎖形成効率が顕著に低下する恐れがある。そこで、非特異吸着防止剤としてデンハルト溶液（50×デンハルト溶液の組成：1％ bovine serum albumin(BSA)、1％ Ficoll、1％ polyvinylpyrrolidone）もしくは変性剤としてDMSO（dimethyl sulfoxide）の非特異吸着および相補鎖形成効率への影響を調べてみた。その結果、上記試薬を添加することで、非特異吸着防止の効果が確認できた（図3）。非特異吸着防止や、相補鎖形成効率上昇をサポートするための添加物としては上記試薬以外に、吸着防止剤としてPEG（polyethylene glycol）などの高分子化合物や、変性剤としてホルムアミドの添加などが有効である。本実施例においては、最終濃度BSA0.1％およびDMSO8％を加え反応を行った。
【００５２】
続いて、相補鎖結合・相補鎖伸長で鋳型として使用された一本鎖DNA試料（106、101および109で構成）、ビーズ表面に吸着したDNA試料および結合に関与しなかった余剰DNA試料を取り除く目的で，(i) 0.5N NaOH (室温，1分×2回)、(ii) 1×ＴＥ (94℃，1分×1回)、および(iii) 10 mM Tris (pH7.5) (94℃，1分×1回)の溶液で洗浄処理を行い、上清を除去した（図１中破線151内に含まれるDNA試料）。洗浄溶液には、必要に応じてビーズの凝集やピペットチップ内部壁への吸着を防ぐ目的で、最終濃度0.01〜0.1％(w/v)程度のTween20を加えても良い。本洗浄除去工程は、1ビーズ1DNAを実現するためには必須の工程であり、この工程がないと続く増幅工程において、残存のDNA試料が既に相補鎖伸長産物を持つビーズのプローブと第二の相補鎖伸長産物を形成してしまい、1ビーズ複数種のDNA増幅産物となってしまう。
【００５３】
続いて、洗浄後のビーズ上相補鎖伸長産物の増幅を行った。洗浄済みビーズ106個に対し、10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）4μL、50 mM MgSO4 1.6μL、10mM dNTP Mix 0.8μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen社) (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を40μLに調製した反応溶液を準備しこの溶液中にビーズを懸濁した。94℃ 30秒間（熱変性によるDNAの一本鎖化)→55℃ 120秒間（ビーズ上固定プローブとの相補鎖結合)→72℃ 45秒間（プローブの相補鎖伸長反応）のサイクルを50回行い（図1(5)）、最後に72℃ 10分間を経て室温に下げた。この増幅工程においては、最初の工程でのビーズ固定プローブの相補鎖伸長産物（121および122）が鋳型として働く。この相補鎖伸長産物（121および122）の末端部122がビーズ上に固定されたプローブA 112と相補鎖を形成し、プローブA 112が伸長することで新たなDNA鎖（プローブの相補鎖伸長産物131および132）がビーズ上に生成された。この際、鋳型となる固相上のDNAは、同一ビーズ上の近接するプローブにＵの字を形成するように湾曲して相補鎖を形成し伸長産物も湾曲した形状をとる。熱変性による一本鎖化の工程において、この湾曲形状がほどかれビーズ上に固定された一本鎖DNAとなって次サイクルにおける鋳型となる。最終的にはビーズ上に多数の増幅産物が得られる（図1(6)）。
【００５４】
本増幅工程において、反応溶液はビーズ同士が伸長するDNA鎖以上の距離を常に保つ必要がある。これは、ビーズ同士が伸長産物長以下に近接してしまうと、伸長産物のビーズに固定されているのとは反対側の末端が、固定されているビーズとは別のビーズ上の固定プローブと相補鎖を形成してしまい、複数ビーズ間でDNA伸長産物が生成されることになり、1ビーズ1DNAと相反するためである。本実施例においては、ビーズ対DNA分子の濃度を調整し、常時攪拌することによりビーズが常に拡散している条件下において反応を行うことでビーズ間の距離を確保した。撹拌の方法としては、水平方向の撹拌でもローテーターを使用した垂直方向回転撹拌でもよい。本工程においては、常に反応溶液中のビーズが均一に懸濁されている状況を保てる条件下で反応を行うことが必須である。また、上記ビーズ上へのDNA試料導入（相補鎖伸長産物生成）の工程と同様に、ビーズ上への増幅産物の非特異吸着および高次構造の解消が効果的であるため、本実施例において増幅反応時は、反応溶液には最終濃度でBSA0.1％およびDMSO8%を加え、水平攪拌処理を行いながら熱サイクル反応を行った。以上の工程により、ビーズ上に一種DNA試料からスタートしたDNA増幅産物を得た。ビーズ上のDNA分子の数を、リアルタイムPCR法により定量した。リアルタイムPCR測定にはABI7900HT（Applied Biosystems社）を使用し、反応および測定の手順はApplied Biosystems社推奨の方法に準拠した。相補鎖伸長産物生成時と増幅反応処理後のビーズ上のDNA分子数を定量した結果、ビーズ上に相補鎖伸長産物の増幅産物が生成されていることを確認した。また、リアルタイムでの計測時に、ネガティブコントロールとしてビーズにプローブが固定されていない試料を用意し、このビーズに関しても同様の条件で反応を行った。プローブが固定されていないビーズから検出されるシグナルは、ビーズ上に非特異に吸着したDNA分子が原因と考えられる。コントロールとの比較の結果、上記リアルタイムPCR測定結果の値が確かにビーズ上に特異的に結合して増幅された産物であることが確認できた。
【００５５】
[実施例２]
固相担体として、表面にカルボン酸基が修飾された磁気ビーズ(直径2.8μm、Dynal BIOTECH社）を使用した。あらかじめよく懸濁したカルボン酸基修飾磁気ビーズ溶液50μL (1×108ビーズ)を2.0mLマイクロチューブに測りとった。チューブ側面にマグネットを配置し磁気ビーズを捕捉した状態で、上清を除去した。ビーズを洗浄する目的で、100μLのMES Buffer (25mM MES (pH6.0), 0.1％(w/v) Tween20)を加え室温で10分間攪拌振とうした後、上清を除去した。本工程を再度繰返し、上清を除去した。続いて、MES Bufferで2.5pmol/μLに希釈したプローブAおよびプローブB溶液をそれぞれ30μL加え、室温で30分間撹拌振とうした。その後、30μLのEDC solution (MES Bufferで0.1mg/μLに調製した溶液）および10μLのMES Bufferを加え、4℃条件下で一晩撹拌振とうし、磁気ビーズにプローブを固定した。反応終了後上清を除去し、プローブが結合しなかったカルボン酸基のブロッキング処理を行った。即ち200μLのBlocking Buffer (50mM Tris (pH7.5)，0.1％(w/v) Tween20)を加え、室温で15分間撹拌振とうした後上清を除去した。本工程を4回繰り返した後、200μLの10mM Tris(pH7.5)、 0.1％(w/v)Tween20を加え最終濃度5×105ビーズ/μLのプローブ固定化ビーズを得た。
【００５６】
続いて、解析対象DNA試料の調製を行った。DNA試料は数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片の混合物である。図1に示すように、二本鎖DNA断片101〜105の両末端には、106および107からなるアダプターAおよび108および109からなるアダプターBをあらかじめライゲーションにより導入した。アダプターAを構成する106の塩基配列は107と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また107は磁気ビーズ111に固定されたプローブB113と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。アダプターBを構成する108の塩基配列は109と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また109は磁気ビーズ111に固定されたプローブA112と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。
【００５７】
続いて、上記プローブA(112)およびプローブB(113)が固定された磁気ビーズ111とアダプターA(106および107)およびアダプターB(108および109)が挿入された2本鎖DNA断片を混合し、磁気ビーズ上のプローブとDNA断片を相補鎖結合させる処理を行った。反応においては、ビーズ間の距離が伸長するDNA鎖以上の距離を確保するため、ビーズをあらかじめ専用のビーズ捕捉用反応セル上に配置し以下の反応を行った。反応セルの構成を図4に示す。セル401にはビーズ412を保持することが可能な径（本実施例において使用した2.8μmビーズ使用時には孔径は3〜3.5μm程度）の孔411がビーズの数だけ配置されている。非常に微細な孔のため、きわめて狭い面積に膨大な孔を配置することが可能である。具体的には、解析対象試料DNAの塩基長は、塩基-塩基間距離が約3.5Åであることから、例えば300塩基長であれば約0.03μm、1000塩基長であれば約0.1μm程度となる。このため、例えば直径3.5μmの孔を1μm間隔で配置した場合、1cm四方に約6×108の孔を配置することが可能である。ビーズ懸濁溶液を図4に示す捕捉セル401上に注入口402より注入し、反対側の排出口403から排出した溶液を再度セル内401に戻し、溶液の注出入操作により孔411にビーズを配置する(図4(2))。その後反応セル401をカバー405で覆いビーズ412が流出するのを防ぐ。この際、カバーがあるためビーズは孔から出ることができないが、注入口402から注ぎ込まれる溶液は、ビーズ周囲（孔の中も含めて）を自由に移動でき、また不要になった溶液は排出口403から除去することができる。このような反応セル401を使用することで、ビーズ間の距離を保ちつつ、反応溶液や洗浄溶液を自由にビーズ表面に供給することが可能となった。セルの形状としては、図4に示すような形状以外に図5に示す形状のようなものも可能である。即ち、ビーズを保持するのは孔ではなく、平面501に平面を貫通するようにあけられた穴502である。穴の径はビーズ511より小さい。また穴下部から吸引521することで、吸引しているときは穴の上にビーズを保持することが可能であり、吸引していないときにはビーズを自由に移動させることが可能となる。ビーズは吸引していないときは平面状を自由に行き来できるが（図5-1(1)）、穴下部より吸引されると穴に固定され（図5-1(2)）、この平面に溶液を保持できるカバー503をかぶせることで、ビーズ周囲に溶液504を保持することが可能となる（図5-1(3)）。カバー503には、溶液の注入口505および排出口506が設けられている。反応溶液の注入排出時、反応時、また洗浄時には吸引することでビーズを保持し、増幅反応が終わった際に吸引を解けば容易にビーズを回収することが可能となる。上記方法以外にも、図5-2に示すように、平面551にピン状に配置された磁石552を使ってビーズ511を平面状に配置保持することも可能である。この場合、ビーズ511と磁石522の間に磁力遮蔽板553を抜き差しすることで、ビーズを捕捉したり開放したりコントロールすることが可能となり、上記吸引でビーズを捕捉した場合と同様の効果が得られる。
【００５８】
上記反応セルに、ビーズ106個に対し、5×102分子の2本鎖DNA断片溶液、反応混合溶液（1×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9))、18 mM Ammonium Sulfate）、2 mM MgSO4、0.2mM dNTP、および Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (0.05units/μL) ）を注入し反応セル内を十分に満たした。続いて、94℃ 60秒間→50℃ 120秒間→72℃ 120秒間のインキュベーションを行った。ビーズ上へのDNA試料の非特異吸着および高次構造の解消を目的として、反応溶液には最終濃度BSA0.1％およびDMSO8%を加え上記反応を行った。続いて相補鎖結合・相補鎖伸長で鋳型として使用された一本鎖DNA試料、ビーズ表面に吸着したDNA試料および結合に関与しなかった余剰DNA試料を取り除く目的で、(i) 0.5N NaOH (1分×2回)、(ii) 1×ＴＥ (1分×1回)、および(iii) 10 mM Tris (pH7.5) (1分×1回)の溶液を所望の時間フローさせて、セル内の洗浄処理を行い、最終的に溶液を完全に除去した。
【００５９】
続いて、洗浄後のビーズ上相補鎖伸長産物の増幅を行った。洗浄済みビーズ106個に対し、反応混合溶液（1×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9))、18 mM Ammonium Sulfate）、2 mM MgSO4、0.2mM dNTP、および Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (0.05units/μL) ）を注入し反応セル内を十分に満たした。続いて、94℃ 30秒間→55℃ 120秒間→72℃ 45秒間のサイクルを50回行い、最後に72℃ 10分間を経て室温に下げた。ビーズ上へのDNA試料の非特異吸着および高次構造の解消を目的として、反応溶液には最終濃度BSA0.1％およびDMSO8%を加え上記反応を行った。以上の工程により、ビーズ上に一種DNA試料からスタートしたDNA増幅産物を得た。
【００６０】
[実施例３]
本発明において重要となるのは、ビーズとDNA断片の混合比率である。図2に示すポアソン確率から、1ビーズ1核酸を実現するために、ビーズ106個を用いた反応系において2分子以上が固定されるビーズを1個以下にするには、DNA分子103以下で反応液を調製する必要がある。一方で全体の98.4%にあたる998,400個のビーズにはDNA断片が何も結合していない計算となる。DNA断片が結合し、続く増幅工程において産物が得られたビーズのみを回収することにより、飛躍的に増幅産物解析工程のスループットを上昇させることが可能となる。
【００６１】
本実施例においては、選別の手段として増幅産物の末端に導入されるプローブ配列に選別用のアンカー配列を付け加え、この配列に相補的なプローブが結合したカラムを利用し選別を行った（図6および図7）。ビーズ表面に固定するプローブは、配列Aを持つプローブ1および配列BおよびCからなるプローブ2である(図6-1(1))。解析対象DNA断片の両末端には、図6に示す、配列AおよびAと相補的な配列であるA’からなるアダプター1および配列BおよびBと相補的な配列であるB’からなるアダプター2がライゲーションにより挿入されている。図6-1(1)に示すように、DNA断片の片鎖がビーズ表面のプローブ1と相補鎖結合し、伸長反応へと進む(図6-1 (2))。鋳型となったDNA鎖を変性させ洗浄処理を施した後(図6-1 (3))、続く増幅工程において、相補鎖伸長産物は、ビーズ表面のプローブ2と相補鎖結合し(図6-1 (4))プローブの伸長反応へと進む(図6-1 (5))。熱変性の後(図6-2(6)、それぞれの伸長産物が最寄りのプローブと相補鎖結合し、伸長反応へと進む(図6-2(7)および(8))。最終的にビーズ表面上に生成されるプローブ伸長産物は、図6-2(9)の配列構成の鎖がメインとなる。一方で、図7に示す分離精製用のカラム701にはあらかじめCと同じ配列を持つプローブが固定されている。このカラム701に増幅反応後のビーズ702を添加することにより、増幅産物がビーズ上にある場合は、その産物の末端に配置されるC’配列部分がカラム701のプローブと相補鎖結合し、ビーズ711が捕捉される（図7(2)）。一方で産物のないビーズは、C配列と相補鎖結合できる配列を持たないので、カラム701に捕捉されることなく通過してしまう(図7(2)712で示されるビーズ)。ビーズ溶液を添加後、相補鎖結合を解消するため、低塩濃度のバッファー（10 mM Tris (pH7.5)）でカラムを洗浄し、溶出されたビーズ713を回収した（図7(3)）。
【００６２】
増幅産物が結合したビーズのみを回収する別の手段を説明する(図(8))。増幅反応中に、DNAの2本鎖部分に特異的に入り込む蛍光色素（インターカレーター）を添加するか、増幅反応後に上記インターカレーターを含む溶液中にビーズを懸濁させビーズ上増幅産物2本鎖部分に蛍光色素を取り込ませた。インターカレーターとしては、Pico Green(Invitrogen社)やSYBR Green(Invitrogen社)などが考えられる。この溶液を、フローサイトメーターを利用し、蛍光を発するビーズ801のみを検出・選別回収することにより、増幅産物のあるビーズ801のみを回収した(図8)。
【００６３】
[実施例４]
単分子計測の前処理工程において、複数種類のDNA試料混合物を一分子ずつ単離することは非常に難しい。1ビーズ1DNA分子での結合が可能であっても、これを実現するための反応条件下ではほとんどのビーズにはDNAが結合していないため、DNAが結合しているビーズの選別が必要となる。一方で、DNA試料を増幅せずに計測する単分子計測の利点は、増幅することによりオリジナルの配列や量比を正確に反映できないのではないか、という懸念が払拭される点にある。そこで、本発明において最初の工程で相補鎖伸長産物として得られるDNA鎖を解析対象とし、増幅産物はビーズ選別のためのフラグとして利用する手法について以下実施例を説明する。
【００６４】
本実施例の工程概略を図9に示す。固相担体として、表面にカルボン酸基が修飾された磁気ビーズ(直径2.8μm、Dynal BIOTECH社）を使用した。あらかじめよく懸濁したカルボン酸基修飾磁気ビーズ溶液50μL (1×108ビーズ)を2.0mLマイクロチューブに測りとった。チューブ側面にマグネットを配置し磁気ビーズを捕捉した状態で、上清を除去した。ビーズを洗浄する目的で、100μLのMES Buffer (25mM MES (pH6.0)、 0.1％(w/v) Tween20)を加え室温で10分間攪拌振とうした後、上清を除去した。本工程を再度繰返し、上清を除去した。続いて，MES Bufferで2.5pmol/μLに希釈したプローブAおよびプローブB溶液をそれぞれ30μL加え、室温で30分間撹拌振とうした。その後，30μLのEDC solution (MES Bufferで0.1mg/μLに調製した溶液）および10μLのMES Bufferを加え、4℃条件下で一晩撹拌振とうし、磁気ビーズにプローブを固定した。反応終了後上清を除去し、プローブが結合しなかったカルボン酸基のブロッキング処理を行った。即ち200μLのBlocking Buffer (50mM Tris (pH7.5) 、0.1％(w/v) Tween20)を加え、室温で15分間撹拌振とうした後上清を除去した。本工程を4回繰り返した後，200μLの10m M Tris(pH7.5)、0.1％(w/v)Tween20を加え最終濃度5×105ビーズ/μLのプローブ固定化ビーズを得た。図9-1において、磁気ビーズは901で、磁気ビーズ上に固定されたプローブAは912でプローブBは913でそれぞれ示される。図9においては反応の構成をわかりやすくするためするため、ビーズ一個だけの記載とするが、実際には上述の通り1×108ビーズが共存している。
【００６５】
続いて、解析対象DNA試料の調製を行った。DNA試料は数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖ＤＮＡ断片の混合物である。二本鎖ＤＮＡ断片916、917の両末端には、921および922からなるアダプターAおよび923、924および925、926からなるアダプターCをあらかじめライゲーションにより導入した。アダプターAを構成する922の塩基配列は921と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また922は磁気ビーズ901に固定されたプローブB913と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。アダプターCを構成する923の塩基配列は924と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また923は磁気ビーズ901に固定されたプローブA912と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。アダプターCを構成する925および925と一部もしくは全部が相補的な配列を持つ926の塩基配列は、磁気ビーズ上に固定されたプローブ912、913およびDNA試料に挿入されたアダプター921、922、923および924のいずれの配列とも、相補的ではなく、また同一ではない。
【００６６】
続いて、上記プローブA（912）およびプローブB（913）が固定された磁気ビーズ901とアダプターA（921および922）およびアダプターC（923、924、925および926）が挿入された2本鎖DNA断片を混合し、磁気ビーズ上のプローブとDNA断片を相補鎖結合させる処理を行った。ビーズ106個に対し、2本鎖DNA断片を5×102分子混合し反応を行った。（図9においては反応の構成をわかりやすくするためするため、DNA断片が一種だけの記載とするが、実際には5×102分子のDNA断片が共存している。）上記ビーズとDNA断片混合液に10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）4μL、50 mM MgSO4 1.6μL、10mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液) 0.8μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を40μLに調製した反応溶液を準備した。続いて、94℃60秒間でDNA断片を一本鎖に完全に変性させ、続いて50℃120秒間→72℃120秒間のインキュベーションにより相補鎖形成および伸長反応を行った。この工程で、DNA分子（925、923、916および921で構成）はその末端に導入されたアダプター921がビーズ上プローブB 913と相補鎖結合し、プローブB 913がDNA分子916、923および925を鋳型として伸長した（図9-1(2)および(3)）。
【００６７】
続いて、相補鎖結合・相補鎖伸長で鋳型として使用された一本鎖DNA試料およびビーズ表面に吸着したDNA試料を取り除く目的で、(i) 0.5N NaOH (室温、1分×2回)、(ii) 1×ＴＥ (94℃、1分×1回)、および(iii) 10 mM Tris (pH7.5) (94℃、1分×1回)の溶液で洗浄処理を行い、上清を除去した。洗浄溶液には、必要に応じてビーズの凝集やピペットチップ内部壁への吸着を防ぐ目的で最終濃度0.01〜0.1％(w/v)程度のTween20を加えても良い。本洗浄除去工程は、一ビーズ一DNA分子を実現するためには必須の工程であり、この工程がないと、続く増幅工程において、残存のDNA試料が既に相補鎖伸長産物を持つビーズのプローブと第二の相補鎖伸長産物を形成してしまい、一ビーズ複数種のDNA増幅産物となってしまう。洗浄後にビーズ上に残った相補鎖伸長産物の3’末端には、アダプターCを構成する926と同一の配列を有する933部が導入された。
【００６８】
続いて、洗浄後のビーズ上相補鎖伸長産物の増幅を行った。洗浄済みビーズ106個に対し、10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）4μL、50 mM MgSO4 1.6μL、10mM dNTP 0.8μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を40μLに調製した反応溶液を準備した。続いて、94℃ 30秒間（熱変性によるDNAの一本鎖化)→55℃ 120秒間（ビーズ上プローブとの相補鎖結合)→72℃ 45秒間（プローブの伸長反応）のサイクルを50回行い（図9-2(5)）、最後に72℃ 10分間を経て室温に下げた。この増幅工程においては、最初の工程でのビーズ固定プローブの相補鎖伸長産物（931、932および933）が鋳型として働く。この相補鎖伸長産物（931、932および933）の932配列部分がビーズ上に固定されたプローブA 912と相補鎖を形成し、プローブA 912が伸長することで新たなDNA鎖（プローブの相補鎖伸長産物941および942）がビーズ上に生成された。この際、鋳型となる固相上のDNAは、同一ビーズ上の近接するプローブにＵの字を形成するように湾曲して相補鎖を形成し伸長産物も湾曲した形状をとっている。熱変性による一本鎖化の工程において、この湾曲形状がほどかれビーズ上に固定された一本鎖DNAとなって次サイクルにおける鋳型となる。最終的にはビーズ上に多数の増幅産物が得られる（図9-2(6)）。1ビーズ1種DNA試料を実現するため、図2にも記載の通り、ビーズ106個を用いた反応系において2分子以上が固定されるビーズを１個以下にするには、DNA分子103以下で反応液を調製する必要がある。一方で全体の98.4%にあたる998,400個のビーズにはDNA断片が何も結合していない計算となる。そこで、実施例3に記載のいずれかの方法を用いて増幅産物が得られたビーズのみを選別回収した。この際、図７に記載のカラムでの選別を行う場合、カラムに固定するプローブの配列は図9に示す固定プローブ912もしくは913の末端に補捉用配列Cが付加されたものとなる（図10(1)）。このプローブを使用して増幅した場合、主たる増幅産物のビーズ表面固定化とは反対側の末端部分にはCと相補的な配列C’が挿入される（図10(2)）。一方でカラムにはCの配列をもつプローブが固定されていれば、増幅産物があるビーズ、即ちC’の配列をもつビーズのみがカラムに捕捉され、増幅産物のないビーズはカラムを通過してしまう。このようにして、増幅産物のあるビーズのみを選別回収することが可能である。
【００６９】
一方でビーズに生成された増幅産物は、最初の工程で得られた相補鎖伸長産物と、その後の工程で得られる増幅産物でその配列構成に違いがあり、最初の伸長産物の末端にのみ、アダプターCを構成する926と同一の配列を有し、ビーズ上のプローブ配列とは相補的でなくまた同一でもない配列部分933が付加されている。このオリジナルのDNA分子の相補鎖伸長で得られた配列部分933に相補的な配列を有するプライマーを利用して周知のDNA塩基配列決定法に従い塩基配列決定を行えば、増幅産物ではなく、1ビーズ1分子のDNA解析が可能となる。即ち、ビーズ上の増幅産物を利用して、混合状態で提供されるDNA試料を単離し、最初の相補鎖伸長産物を解析することで増幅というバイアスがかからないオリジナルのDNAの単分子計測が可能となった。
【００７０】
[実施例５]
1ビーズ1DNAとした個別並列増幅を実現するために、増幅産物がビーズの表面ごく近傍でしか移動することができない場合、増幅用プローブを必ずしもビーズに固定する必要はない。この実施例では、(1)鋳型となる核酸試料の末端部には前記固定プローブと相補的な配列を持つアダプターが導入されており、反対側末端には浮遊プローブと同じ配列を持つアダプターが導入されており、(2)鋳型となる核酸試料が前記固定プローブと相補鎖結合することが可能であり、(3)前記相補鎖結合した固定プローブの伸長産物が浮遊プローブと相補鎖結合することが可能であり、(4)前記固定プローブの伸長産物および浮遊プローブの伸長産物からなる2本鎖核酸試料の末端部分のみ部分的に変性を行うことを特徴とする核酸分析方法を示す。実施例は、図11および12を用いて説明する。
【００７１】
固相担体として、表面にストレプトアビジン基が修飾されたセファロースビーズ(直径約34μm、GE ヘルスケアバイオサイエンス社）を使用し、プローブAを固定した。ここで使用するプローブAの5’末端部には、ストレプトアビジンとの結合を可能とするビオチン修飾が施されている。またビオチン修飾と塩基配列の間には、スペーサーとしてカーボン18分子が挿入されている。あらかじめよく懸濁したセファロースビーズ100μL (1×106ビーズ)をスピンカラム（Ultra free-MC, durapore PVDF 0.5μm、ミリポア社）に添加し、12,000×gで1分間遠心し上清をのぞく。カラム上のビーズを2×Binding Buffer(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、2 M NaCl、0.01％(w/v) Tween20) 150μLで懸濁し2.0mLのマイクロチューブに移す。そこへ10pmol/μLのプローブA溶液50μLを加え、滅菌水で全量を300μLにした。ローテーターを用いて、室温条件下で1時間混和させ、ビーズ上のストレプトアビジンとプローブ末端のビオチン基を結合させた。上記ビオチンの代わりに、2個のビオチン基が連続して配置されるデュアルビオチン基を修飾してストレプトアビジンとの結合効率を高めることも可能である。図11(1)において、セファロースビーズを201で、ストレプトアビジン−ビオチン結合で固定されたプローブAを212で示す。簡略化のため、図においてはビーズ１個のみを記載している。続いて、解析対象DNA試料の調製を行った。DNA試料は数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片の混合物である。図11-1(1)で示される213および214で示される。簡略化のため、DNA鎖は一断片のみを記載している。二本鎖DNA断片213および214の両末端には、215および216からなるアダプターAをライゲーション反応により導入した。アダプターAを構成する215の塩基配列は216と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また215はセファロースビーズ201に固定されたプローブA 212と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。
【００７２】
続いて、上記プローブA(212)が固定されたセファロースビーズ201とアダプターA(215および216)が挿入された2本鎖DNA断片を混合し、セファロースビーズ上のプローブとDNA断片を相補鎖結合させる処理を行った。ビーズ104個に対し、2本鎖DNA断片を1×105分子、1×104分子、もしくは1×103分子（それぞれビーズ当り10分子、1分子もしくは0.1分子に相当）混合したチューブを3本用意しそれぞれについて反応を行った（図11-1(2)）。上記ビーズとDNA断片混合液に10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）2μL、50 mM MgSO4 0.8μL、10mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液) 0.4μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を20μLに調製した反応溶液を準備した。続いて、94℃60秒間でDNA断片を一本鎖に完全に変性させ、続いて50℃120秒間→72℃120秒間のインキュベーションにより相補鎖形成および伸長反応を行った。この工程で、DNA分子（216、214および215で構成）はその末端に導入されたアダプター216がビーズ上プローブA 212と相補鎖結合し、プローブA 212がDNA分子214および215を鋳型として202の方向に伸長した（図11-1(2)および(3)）。プローブの相補鎖伸長産物は図11-1中231および232で示され、伸長産物の末端には、ビーズ上に固定されたプローブA 212と相補的な配列をもつ部分232が導入された。続いて、相補鎖結合・相補鎖伸長で鋳型として使用された一本鎖DNA試料（216、214および215で構成）、ビーズ表面に吸着したDNA試料および結合に関与しなかった余剰DNA試料を取り除く目的で、(i) 0.5N NaOH (室温，1分×2回) 、(ii) 1×ＴＥ (94℃、1分×1回)，および(iii) 10 mM Tris (pH7.5) (94℃、1分×1回)の溶液で洗浄処理を行い、上清を除去した（図11-1中破線内241に含まれるDNA試料）。上清の除去の工程は次の通りである。即ち、遠心分離によりセファロースビーズをチューブ底部に沈殿させ、静かにピペットで上清を除去した。洗浄液を加えた後には必ずボルテックスなどを用いて十分に撹拌処理を行い、再度上清を除去した（図11-1(4)）。
【００７３】
続いて、洗浄後のビーズ上相補鎖伸長産物の増幅を行った。洗浄済みビーズ104個に対し、10 pmol/μLに滅菌水で希釈したプライマーAを2μLおよび10×反応溶液（200 mM Tris- HCl(pH8.8)、100 mM KCl、100 mM (NH4)2SO4、 20 mM MgSO4、1.0% Triton X-100) 2μL、10mM dNTP 1μL、およびBst DNA Polymerase (8 units/μL)(New England Biolabs社)1μLを混合し、滅菌水で全溶液量を20μLに調製した反応溶液を準備しこの溶液中にビーズを懸濁した。ここで使用するBst DNA Polymeraseは鎖置換能をもつポリメラーゼで、鋳型DNAに増幅用プライマーが相補鎖結合した後、伸長鎖は伸長方向の鋳型が2本鎖であってもその鎖を解きながら相補鎖を合成していくことができる酵素である。本実施例においては、Bst DNA Polymeraseを使用したが、鎖置換能を持つDNA PolymeraseであればBst DNA Polymeraseには限定されず、Deep VentR DNA Polymerase(New England Biolabs社)や9NmTM DNA Polymerase(New England Biolabs社)でも同様の効果が期待できる。その後、反応溶液を65℃に保ち、90分間反応させた後、94℃2分間で酵素を失活させた。65℃一定温度条件において、溶液中に拡散しているプライマーA(235)がビーズ上の相補鎖伸長鎖の末端部分232と相補鎖結合し（図11-2(5)）、伸長反応が起こり、産物（図11-2(6)235、236および237で記載）を得た。図の簡略化のため、図11-2における最初の相補鎖伸長産物（212、231および232で記載）を図12中250で、上記相補鎖伸長産物と相補的な配列を持つ伸長産物（235、236および237で記載）を251で表す。65℃条件下においては、生成した二本鎖DNAは、その末端部分255および256のみが部分的に変性した状態となっている。この部分的に変性した一本鎖部分256には溶液中に拡散しているプライマーA（235）が相補鎖結合し、また反対側末端部の255には末端部近傍に存在するビーズ上のプローブA（212）が相補鎖結合する（図12(3））。その後、241および242の方向に、鋳型となる二本鎖の相補鎖結合部分を解きながら伸長反応が進み（図12(4））、図12(5）に示す産物が得られる。その後も、65℃条件下においては上記産物の末端部分のみが部分的に変性状態となっているため、243および244の変性部分には反応溶液中に拡散しているプライマーAが、また反対側末端部分の変性部分245および246には、ビーズ上の最寄り固定プローブAが相補鎖結合し、新たな伸長反応へと進む。このようにして、一定温度条件において最終的にはビーズ上に複数の相補鎖伸長産物を得ることができた。結果を図13に示す。ビーズ当り相補鎖伸長生成物は図11（4）に相当し、増幅時の鋳型となる分子数となる。一方、ビーズ当り増幅産物は前記伸長生成物が増幅した後の分子数となる。本実施例に記載の反応条件下においては、10４ビーズに対して1/10量のDNA分子を投入して反応させた系において最も良好な増幅結果が得られ、11.5倍に増幅することができた。
【００７４】
通常のPCRの反応条件では、変性を94℃程度で行うため、相補鎖伸長産物の2本鎖構造は完全に解離してしまい、末端が固定されていないほうの鎖は溶液中に拡散してしまう。しかし、本実施例のように鎖置換能をもつ酵素を用いれば、相補鎖伸長産物は完全に解離しないため、ビーズから離れて溶液中に拡散することは無く、産物は最後まで最初に結合したビーズの表面上でしか反応に寄与しない。
【００７５】
また、通常のPCR用酵素を使用してPCR反応を行った場合も、末端を固定化していないプローブを、例えば高温条件下において粘性が高まる溶媒（例えば転移温度以上においてゲル状、転移温度以下においては流動性のゾルといった特徴をもつメビオールゲルTM（メビオール株式会社）やメチルセルロースゲル等を反応溶液に加えることにより、増幅産物がビーズの表面ごく近傍でしか移動することができない場合、相補鎖伸長産物はビーズから離れて溶液中に拡散することは無く、本実施例と同様の効果を得ることが可能である。
【００７６】
このようにして、1ビーズ1DNAの個別並列増幅が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の反応工程の一実施形態を示す図である。
【図２】1固相担体1核酸を実現するためのポアソン確率解析の結果である。
【図３】ビーズ上へのDNA分子非特異吸着防止の効果を説明する図である。
【図４】ビーズ間の距離を確保するためのセルの構成図である。
【図５−１】ビーズ間の距離を確保するためのセルの構成図である。
【図５−２】ビーズ間の距離を確保するためのセルの構成図である。
【図６−１】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するためのプローブを導入する工程の概略図である。
【図６−２】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するためのプローブを導入する工程の概略図である。
【図７】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するための工程の概略図である。
【図８】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するための工程の概略図である。
【図９−１】ビーズ上の増幅産物を利用して単分子計測を行う反応工程の概略図である。
【図９−２】ビーズ上の増幅産物を利用して単分子計測を行う反応工程の概略図である。
【図１０】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するためのプローブを導入する工程の概略図である。
【図１１−１】本発明の反応工程の一実施形態を示す図である。
【図１１−２】本発明の反応工程の一実施形態を示す図である。
【図１２】本発明の反応工程の一実施形態を示す図である。
【図１３】本発明の反応工程の一実施形態の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７８】
101〜105：数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片(DNA試料）
106：アダプターA（107と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
107：アダプターA（113と一部もしくは全体が同一の塩基配列)
108：アダプターB（109と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
109：アダプターB（112と一部もしくは全体が同一の塩基配列）
111：磁気ビーズ
112：磁気ビーズ上に固定されたプローブA
113：磁気ビーズ上に固定されたプローブB
121：プローブの相補鎖伸長産物
122：プローブの相補鎖伸長産物（112と相補的な配列）
131：112が伸長した新たなDNA産物
132：112が伸長した新たなDNA産物
401：捕捉セル（反応セル）
402：注入口
403：排出口
405：カバー
411：孔
412：ビーズ
501：平面
502：穴
503：カバー
504：溶液
505：注入口
506：排出口
511：ビーズ
521：吸引
551：平面
552：磁石
553：磁力遮蔽版
701：分離精製用のカラム
702：増幅反応後のビーズ
711：捕捉された産物のあるビーズ
712：捕捉された産物のないビーズ
713：溶出されたビーズ
801：蛍光を発する捕捉された産物のあるビーズ
901：磁気ビーズ
912：磁気ビーズ上に固定されたプローブA
913：磁気ビーズ上に固定されたプローブB
916：二本鎖DNA断片の片鎖
917：916の相補鎖
921：アダプターA
922：アダプターA（913と一部もしくは全体が同一の塩基配列）
923：アダプターB（912と一部もしくは全体が同一の塩基配列）
924：アダプターB（923と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
925：アダプターC
926：アダプターC（925と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
931：912の相補鎖伸長産物
932：912の相補鎖伸長産物
933：912の相補鎖伸長産物
941：912が伸長した新たなDNA産物
942：912が伸長した新たなDNA産物
201：セファロースビーズ
202：212が伸長する方向
212：ビーズ上に固定されたプローブA
213：数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片の片鎖
214：213の相補鎖
215：アダプターAを構成する塩基配列（216と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
216：アダプターAを構成する塩基配列
231：最初の相補鎖伸長産物
232：最初の相補鎖伸長産物
235：232と相補的な配列をもつ伸長産物
236：231と相補的な配列をもつ伸長産物
237：212と相補的な配列をもつ伸長産物
241：鋳型となる二本鎖の相補鎖結合部分を解きながら伸長反応が進む方向
242：鋳型となる二本鎖の相補鎖結合部分を解きながら伸長反応が進む方向
243：部分的な変性部分
244：部分的な変性部分
245：反対側の末端部分の変性部分
246：反対側の末端部分の変性部分
250：最初の相補鎖伸長産物
251：250と相補的な配列をもつ伸長産物
255：反対側の末端部分の変性部分
256：末端部分の変性部分
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体上にあらかじめ固定されたプライマーを用いて、核酸混合物中に含まれる核酸試料をそれぞれ個別に並列増幅し分析する方法に関する。本発明はまた、個別並列増幅および分析に必要とするキットおよび装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列決定、遺伝子診断や遺伝子発現の解析、変異の解析にあたっては、その検出精度を保つため、あらかじめ解析対象となる核酸を分析に十分な量に増幅する必要がある。核酸を増幅することにより、オリジナルの核酸の配列や量比を正確に反映できず、分析結果に問題があるとする意見もあり、増幅を行わず一分子をそのまま検出するという技術（単分子計測）の開発も精力的に進められている。しかし現実的に実用化されるまでにはまだ超えなければならないハードルが高く、現時点においては、核酸解析工程において解析対象核酸を増幅する、という工程は必須となっている。
【０００３】
一方、解析対象核酸は、ほとんどの場合異種配列を有する核酸が混合物の状態で提供される。混合物中の核酸すべてを解析対象とする場合においても、特定の核酸のみを対象とする場合においても、混合物中に含まれる核酸を個別に増幅する必要がある。
【０００４】
核酸を増幅させる技術としては、大きく2種類ある。ひとつは大腸菌等を用いて生物的に増幅させるクローニングの技術である。もう一つは、酵素を用いて化学的な反応によりin vitroで増幅を行う技術である(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【０００５】
クローニング法では、一般にまず核酸断片をベクター中に挿入し、次いで注目する断片を含有するベクターを大腸菌などの宿主に導入する。通常、宿主は増殖培地（たとえば寒天プレート）上においてコロニーを形成する。各コロニーは、個々の宿主に起因し、それぞれが数百万のオーダーで増幅された宿主により形成されている。各コロニーを個々に容器に移し、液体培地内でさらに宿主細胞を複製させることで、個別に更なる増幅が可能となる。この増幅された宿主細胞から標的核酸を回収し、分析を行う。この手法の場合、当初核酸が複数種類の混合物であってもコロニーを形成する段階で単離することができ、続く液体培地での複製により、個別増幅が可能となる。一方で、宿主細胞の生物的増幅の速度が全工程の律速となり、膨大な作業時間を要する。その上、煩雑な作業工程は自動化および大規模化に適さないという問題もある。
【０００６】
一方、酵素を用いた増幅法では代表的な技術としてPCR (Polymerase Chain Reaction)法が挙げられる。この方法では、着目する核酸領域の両末端の配列と相補的な配列を有する短い核酸（プライマー）をあらかじめ用意する。耐熱性DNA Polymeraseを用い、プライマーを伸長させた後、高温条件下で核酸を変性させ、次いで温度を下げることにより、あらかじめ大過剰に投入された余剰プライマーが再び標的核酸に相補鎖結合し伸長反応が起こる。このプライマーの伸長産物を増幅産物とする方法である。温度の上げ下げを繰り返すことで最終的には2ｎ（ｎは温度上げ下げの回数）の核酸を得ることができる。他にもバクテリオファージ由来の鎖置換能を持つDNA Polymeraseを利用して鋳型となる環状DNA相補鎖を連続合成して増幅するRolling Circle Amplification法などがある。この方法でも環状DNAを指数関数的に最大109コピーにまで増幅することが可能である。いずれの方法においても、チューブ内で飛躍的な量の核酸を、短時間で得ることができる。さらにこれらの方法は作業工程が単純なため、自動化にも適している。一方で、クローニング法とは異なり、複数種類の核酸試料混合物の個別増幅には不向きである。即ち、同時増幅は可能だが、異種核酸を単離することができないのである。一般的にPCR法において混合物中から標的核酸を単離するには、プライマーの配列を各々の核酸に特異的なものにする、増幅後に電気泳動などにより産物を分離する、などの方法が考えられるが、いずれも作業が非常に煩雑であるため、多量サンプルの解析には向かない。また、プライマーの配列を特異的なものにするということは、既知配列にしか対応できない手段であり、未知配列を有する解析対象には使えないという問題もある。
【０００７】
上記クローニング法およびPCR法の欠点を克服し、長所を活かした核酸の増幅技術として、特表平10-505492に記載されている固相担体上でのPCR増幅がある。これは複数種類の核酸試料混合物中に標的核酸が存在するかを検出するため、標的核酸に特異的な増幅用プライマーがあらかじめ固定された固相担体上でPCR反応を行い、増幅産物の有無で判定を行う方法である。具体的には、ガラス基板もしくはそれに準ずる固相上に、注目する核酸を増幅するのに必要な標的核酸に特異的プライマーが固定されている。固相表面はPCR反応溶液で覆われているが、増幅に使用されるプライマーが固定されているため、増幅産物は反応溶液中に流出することはなく、固相上に固定された形で生成される。生成した産物はその産物長の範囲内に存在する固定化プライマーと相補鎖結合し次の増幅工程に入る。この増幅工程を数十回繰り返すことで、最終的に産物の片側末端が固相上に固定された形で増幅産物を得ることができる。この方法の場合、混合物中に含まれる標的核酸を単離個別増幅しその産物の有無で標的核酸の有無を判定できるが、一方で標的核酸に特異的なプライマーをあらかじめ設計する必要があり、解析対象が限定されてしまうという決定的な問題がある。この点を解決した固相担体上でのPCR増幅法として、特表2002−503954およびNucleic Acid Research vol.28 e87 (2000)がある。この方法では、解析対象となる複数種類の核酸試料混合物に含まれる全ての核酸が、増幅反応に使用される共通プライマーと相補鎖を形成できる配列部分を有していることが前述の技術と異なる点である。このため、固相上にあらかじめ固定された共通プライマーを使用することで混合試料中に含まれる全ての核酸を増幅することが可能となる。固相上に固定されたプライマーに対して非常に少ない分子数の複数種類の核酸試料混合物を固相表面に展開することで、核酸分子は固相担体上に固定されたプライマーとランダムに相補鎖を形成する。プライマーの相補鎖伸長産物はその産物長の範囲内に存在する最寄りの固定化プライマーと相補鎖結合し次の増幅工程に入る。この増幅工程を数十回繰り返すことで、最終的に最初に生成した相補鎖伸長産物を中心としたある一定の範囲内で増幅物が凝集し、増幅産物はあたかもクローニング法のコロニーと同じような形で得られる。本方法の場合、複数種類の核酸試料混合物に含まれるそれぞれの核酸は固相上において増幅産物が個別のコロニーという形態で単離供給される。そのため、混合物の状態で提供される解析対象核酸試料のそれぞれの核酸の解析が可能となり、クローニング法およびPCR法のデメリットを克服した方法であるといえる。また、同様の方法が特表2002-525125でも記載されている。固相担体上に固定されたプライマーを用いてコロニー様の増幅産物を得る点は同じだが、本法の場合増幅対象核酸をあらかじめ固相上に固定した状態でスタートする点において、相補鎖伸長産物からスタートする前述の方法とは異なる。いずれの手法においても、増幅産物は固相担体上にランダムにプロットされたコロニーとして得られる点において共通である。
【０００８】
更に、PCR反応をオイルの中に分散した各水滴を独立した反応槽として増幅反応を行うエマルジョンPCR法が報告されている(Margulies1 M.，Egholm1 M.，Altman1 W. E.，Rothberg1 J. M. et al.Nature 437(7057), 376-80 (2005)) 。多数の核酸試料をそれぞれ隔離された水滴内で同時に増幅することのできる技術である。
【０００９】
【特許文献１】特表平10-505492
【特許文献２】特表2002−503954
【特許文献３】特表2002-525125
【非特許文献１】Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献２】Nucleic Acid Research vol.28 e87 (2000)
【非特許文献３】Margulies1 M.，Egholm1 M.，Altman1 W. E.，Rothberg1 J. M. et al. Nature 437(7057), 376-80 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
遺伝子の分析ビジネスの市場においては、その分析スピードがビジネスの勝敗を決定するといっても過言ではない。解析工程においては、対象遺伝子の前処理、即ち解析を行うために増幅を行ったり精製を行ったりする工程が最も煩雑であり、この工程がいかに簡便であり精度よい方法であるか、また自動化に適した方法であるかがポイントとなる。
【００１１】
そのため、解析対象となる複数種類の核酸試料混合物を、続く分析工程にスムーズに移行できる形態で、個々に並列増幅できる方法の開発が望まれる。上述の固相担体上に固定された解析対象核酸に共通のプライマーを用いたPCR法による増幅反応は非常に有望な手法である。しかし、特表2002-503954では、あるひとつの固相担体表面上に多くの異なる核酸の増幅産物集合体（即ちコロニー）を得ることを特徴としており、この場合、複数のコロニーが一固相担体上に位置していることになる。そもそも最初に固定される増幅用プライマーは基板上に均一に配置することが可能であるが、続いて添加される増幅対象核酸を均一に展開することはきわめて難しい。ある程度希薄な密度で展開されなければコロニー同士が融合してしまう可能性がある。一方、融合を恐れて非常に希薄な核酸試料を用いた場合、混合試料数が多ければ多いほど固相担体の表面積を拡大していく必要がある。更に核酸増幅産物の分析工程において、固相担体上でのコロニー密度が低いということは処理効率が下がるということになる。コロニーが形成された部分の固相のみを物理的に切出す等の作業によりコロニーの集積化が可能とも考えられるが、現実的に平均2〜3.3μm2の大きさとされるコロニーを含む固相をコロニー毎に切出すのは不可能である。特表2002-525125においては、固相担体としてラテックスビーズやデキストランビーズ等のビーズ類をガラス表面に代表される平面支持体以外の例として挙げている。しかし、これらのビーズを基板として用いた場合でも同様に、コロニー間の距離の制御を行うことは非常に難しい。固相担体表面上の個別並列増幅産物の固相担体表面積に対しての集積化が続く解析のスループット向上にもつながるといえ、この点を解決する手段の開発が課題となっている。
【００１２】
一方、エマルジョンPCR法では、オイル中に均一なPCR溶液からなるエマルジョンを調製することが必ずしも簡単ではない。また最大の問題はエマルジョン中に増幅された産物の回収が容易ではない点にある。この問題を解決するため、エマルジョンのようにオイル相と液相のような2種以上の溶媒の混合物からなる不均一分布な反応溶液ではなく、均一溶液中での個別増幅法の開発が課題となる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記にあげた課題を解決するため、1固相担体1核酸となるように試料の調製を行い、この固相担体は均一な溶媒からなる核酸増幅のための反応溶液中に分散させるが、固相担体の極表面近傍でのみ増幅反応が起こるように工夫した。1固相担体1核酸であるため、コロニー間の融合、即ち異種核酸増幅産物間の融合は起こらず、容易に個別並列増幅が可能となる。一方で1固相担体1核酸を可能とする試料調製の弊害として、全く核酸が結合していない基板が多数生じてしまうという問題点が挙げられるが、固相担体上の増幅産物の有無を検出することにより増幅処理後に核酸が結合している固相担体のみを選別することによりこの問題を解決できる。即ち、これが上記で課題として挙げられた個別並列増幅産物の集積化につながる。単独試料の増幅産物が結合した固相担体のみを対象として解析を行うことができるため、分析作業を高効率に行うことが可能となった。上記の従来法 特表2002-525125においては、固相担体としてビーズが列挙されているが、1ビーズ1核酸という発想に基づくものではない。また上記固相担体上での並列増幅法における従来法全てに共通して、固相担体上の増幅産物エリアのみを集積化するという構想ではなく、また実際に固相担体を物理的に切断集積化することも不可能といえ、上記従来法と増幅エリアの選別集積化を組み合わせることにより本発明と同様の目的を達成することはできない。
【００１４】
以下本発明を実現するための手段について詳細に説明する。
本発明の第１態様は、複数の核酸試料を同時に分析する方法であって、１種類以上の増幅用プローブを表面に固定した１つの固相担体に対して、1分子の鋳型核酸の3’末端を含む端部が前記プローブを介して結合しうるように、複数の前記鋳型核酸を導入する第1の工程と、
前記鋳型核酸を鋳型として、前記プローブを伸長させて第1の伸長型プローブとする第2の工程と、
前記第1の伸長型プローブから前記鋳型核酸を解離させる第3の工程と、
前記鋳型核酸を除去する第4の工程と、
（1）前記伸長型プローブの3’末端を含む端部を、伸長していないプローブに結合させる工程と、(2)前記第1の伸長型プローブを鋳型として、前記伸長していないプローブを伸長させて第2の伸長型プローブとする工程と、(3)前記第2の伸長型プローブから前記第1の伸長型プローブを解離させる工程を繰り返して、前記第1の伸長型プローブと前記第2の伸長型プローブを増幅させ、前記担体上に多数の前記第１の伸長型プローブと前記第2の伸長型プローブを生じさせる第5の工程と、
前記第1の伸長型プローブが結合する担体と、前記第1の伸長型プローブが結合しない担体とを選別する第6の工程を含む核酸分析方法である。
【００１５】
本発明の第２態様は、前記第１の工程の前に、前記鋳型核酸の3’末端に第1配列を有するアダプターを導入し、かつ前記鋳型核酸の5’末端に前記第1配列と異なる第2配列を有するアダプターを導入する工程をさらに有し、
１の前記担体に固定される前記複数のプローブは、前記第1配列の相補配列もしくは前記第2配列の相補配列のいずれかを有することを特徴とする、第１態様に記載の核酸分析方法である。
【００１６】
本発明の第３態様は、前記第１の工程の前に、前記鋳型核酸の3’末端に第1配列を有するアダプターを導入し、かつ前記鋳型核酸の5’末端に前記第1配列の相補配列を有するアダプターを導入する工程をさらに有し、
１の前記担体に固定される前記複数のプローブは、前記第1配列の相補配列を有することを特徴とする、第1態様に記載の核酸分析方法である。
【００１７】
本発明の第４態様は、前記第１の工程乃至第４の工程は共通の容器で行い、前記第5の工程は前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器で各々行うことを特徴とする、第１態様に記載の核酸分析方法である。
【００１８】
本発明の第５態様は、前記第１の工程乃至第５の工程を、前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器で各々行うことを特徴とする、第１態様に記載の核酸分析方法である。
【００１９】
本発明の第６態様は、前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器において、前記反応を行う溶液が共通であることを特徴とする、第4または5態様に記載の核酸分析方法である。
【００２０】
本発明の第７態様は、前記第５の工程において、(1) 前記第１の伸長型プローブを鋳型として、同一固相担体上の近接するプローブにＵの字を形成するように相補鎖を伸長させて湾曲形状の第２の伸長型プローブとし、(2) 熱変性により前記湾曲形状をほどいて前記担体上に固定された一本鎖核酸とし、次サイクルの鋳型とする工程を繰り返すことを特徴とする、第１〜６態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２１】
本発明の第８態様は、前記第１の工程乃至第5の工程において、反応溶液を常時撹拌することを特徴とする、第１〜７態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２２】
本発明の第９態様は、前記第１の工程乃至第5の工程において、前記複数の担体を鋳型核酸の長さより長い距離を確保して配置することを特徴とする、第１〜７態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２３】
本発明の第１０態様は、複数の核酸試料を同時に分析する方法であって、１種類の固定プローブを表面に固定した１つの固相担体に対して、1分子の鋳型核酸の3’末端を含む端部が前記プローブを介して結合しうるように、複数の前記鋳型核酸を導入する第1の工程と、
前記鋳型核酸を鋳型として、前記固定プローブを伸長させて第1の伸長型プローブとする第2の工程と、
前記第1の伸長型プローブから前記鋳型核酸を解離させる第3の工程と、
前記鋳型核酸を除去する第4の工程と、
（1）前記第1の伸長型プローブの3’末端を含む端部を、反応溶液中に加えられたもう１種類の浮遊プローブに結合させる工程と、(2)前記第1の伸長型プローブを鋳型として、前記浮遊プローブを伸長させて第2の伸長型プローブとする工程と、(3)前記第2の伸長型プローブから前記第1の伸長型プローブを解離させる工程を繰り返して、前記第1の伸長型プローブと前記第2の伸長型プローブを増幅させ、前記担体上に多数の前記第１の伸長型プローブと前記第2の伸長型プローブを生じさせる第5の工程と、
前記第1の伸長型プローブが結合する担体と、前記第1の伸長型プローブが結合しない担体とを選別する第6の工程を含む核酸分析方法である。
【００２４】
本発明の第11態様は、前記第5工程の(3)において、前記第1の伸長型プローブと第2の伸長型プローブからなる2本鎖核酸の末端部分のみを部分的に解離させ1本鎖となった末端部に、前記固定プローブもしくは前記浮遊プローブを相補鎖結合させ、鎖置換能のあるDNAポリメラーゼを用いて鋳型核酸の2本鎖部分を剥がしながら伸長反応を行うことを特徴とする、第10態様に記載の核酸分析方法である。
【００２５】
本発明の第12態様は、前記反応溶液中に、変性時（70℃〜100℃）に粘性が増加あるいはゲル化し、相補鎖結合時（20℃〜60℃）に粘性が低下あるいは溶液状態となる物質を共存させ、
前記担体に鋳型核酸を捕獲した後、浮遊プローブをゲル中に分散させた状態で核酸増幅反応を行うことを特徴とする、第10態様に記載の核酸分析方法である。
【００２６】
本発明の第13態様は、鋳型核酸の5'末端に導入されるプローブ配列に前記アダプターの第１配列および第２配列とは相補的でなくまた同一でもない選別用のアンカー配列を付加した上で、前記第１の工程乃至第5の工程を行い、前記第6の工程において前記アンカー配列に相補的なプローブが結合したカラムを利用し、増幅産物が得られた固相担体のみを選別することを特徴とする、第1〜12態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２７】
本発明の第14態様は、鋳型核酸の5'末端に導入されるプローブ配列に前記アダプターの第1配列および第2配列とは相補的でなくまた同一でもない第3配列を付加した上で、前記第１の工程乃至第４の工程を行い、前記第3配列に相補的な配列を有するプライマーを使用して、増幅産物でない鋳型核酸の配列解析を行う工程をさらに含む、第1〜12態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２８】
本発明の第15態様は、2本鎖特異的インターカレーターを増幅反応溶液、もしくは増幅反応終了後の固相担体懸濁液に添加し、前記インターカレーター由来の蛍光を発する固相担体のみを前記溶液から検出・回収することにより、増幅産物が得られた固相担体のみを選別することを特徴とする、第1〜14態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００２９】
本発明の第16態様は、１つの固相担体に2つ以上の鋳型核酸に起因した増幅産物が複製されないようにするために、固相担体106個を用いた反応系に対して鋳型核酸分子が103個以下となるよう反応液を調製することを特徴とする、第1〜15態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００３０】
本発明の第17態様は、均一な溶媒からなる溶液中で増幅反応を行うことを特徴とする、第1〜16態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【００３１】
本発明の第18態様は、固相担体がビーズであることを特徴とする、第1〜17態様のいずれかに記載の核酸分析方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
１．第一の方法
本発明の第一の方法として、固相担体表面にPCRに使用するプライマーの5’末端が固定されており、PCRはこの固相担体上に滴下もしくは液相中に浸された固相上において行われる形態が挙げられる。（以下、固相上に固定されるプライマーをプローブとする。）
【００３３】
１．１ プローブ
プローブの種類は好ましくは2種類であるが、1種類でも可能であり、2種類以上でも可能である。また、プローブの固相担体上への固定方法は特に限定されず、共有結合やイオン結合、物理吸着、生物学的結合（例えばビオチンとアビジン、またはストレプトアビジンとの結合、抗原と抗体との結合など）等による方法が挙げられる。
【００３４】
１．２ 固相担体
固定する固相担体は、ここでは粒径1〜100μm程度の磁気ビーズ粒子を想定する。しかし固相担体の材料としては水不溶性であれば特に限定されるものではなく、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金、チタン、ニッケル等の金属、ステンレスやジュラルミンなどの合金、シリコン、ガラス、石英ガラス、セラミクス等のガラス材料、ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン樹脂、ナイロン、エポキシ樹脂、および塩化ビニル樹脂等のプラスチック、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、キトサン等が挙げられる。また、担体の形状についても特に限定は無い。
【００３５】
１．３ 解析対象試料の調製
解析対象となる核酸試料は、個々の試料塩基長がゲノムサンプルのように長い場合（例えば1000〜2000塩基以上）、あらかじめ制限酵素切断や超音波切断などで短断片化しておく。切断する手段はこれ以外にも、例えば非常に細い針の中を核酸試料を含む溶液のアップダウンにより切断することも可能であり、物理的に切断されるのであれば手段は問わない。cDNAサンプルやRNAサンプル等数千塩基長が最大塩基長の断片群から構成される混合試料の場合は、この切断工程は省略することができる。ここでは核酸試料として超音波切断により短断片化されたDNAを想定する。
【００３６】
１．４ 解析対象試料へのアダプターの挿入
続いて、DNA試料の両末端に、固相担体上に固定されたプローブが１種類の場合は、該プローブと相補的な配列を有する部位（アダプター）および同じ配列を有する部位を挿入する。固定されたプローブが2種類の場合は、一方のプローブと相補的な配列を有する部位（アダプター）およびもう一方のプローブと同じ配列を有するアダプターを挿入する。プローブが2種類以上の場合は、いずれかのプローブと相補的な配列を有するアダプターおよび、いずれかのプローブと同じ配列を有するアダプターが含まれていればよい。
【００３７】
１．５ PCR反応
アダプターが挿入された解析対象DNAの分子と１対１で結合できる量のプローブ固定化ビーズをあらかじめマイクロチューブに用意する。そこへ、PCR反応溶液（反応用バッファー、dNTP Mixture、マグネシウム溶液）を加え、更に解析対象DNAを加える。最後に耐熱性DNAポリメラーゼを滴下し、サーマルサイクラーにセットする。反応は、まず95℃程度でDNAを完全に熱変性により一本鎖化し、その後温度を55℃程度まで降下させ、DNAのアダプター部分とビーズ上の固定プローブを相補鎖結合させる。続いて温度を72℃まで上昇させ、相補鎖結合したDNAを鋳型としたプローブの伸長反応を行う。この後一旦反応溶液を全て除去し、更にアルカリ溶液などの変性作用をもつ溶液を添加するか、もしくは同じく変性作用を持つホルムアミド等の添加と熱による作用を組み合わせることでプローブの相補鎖伸長産物と鋳型となったDNAを変性解離させる。その後、この溶液を完全に除去する。
【００３８】
この後、必要であればさらに10 mM Trisバッファーもしくは1×TE(10 mM Tris、1 mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸））バッファーで洗浄し、溶液を完全に除去する。この工程で、プローブの相補鎖伸長の際鋳型となったDNAおよび最初に投入され相補鎖結合に関与しなかった余剰DNAは全て除去され、次に続く反応中に他のビーズとDNAが相補鎖結合すること、およびビーズへDNAが非特異に吸着することを防止することができる。この洗浄除去の工程は、1固相担体1核酸を実現する上で非常に重要な工程である。上記洗浄処理後、再びPCR反応溶液を加え、DNAポリメラーゼを滴下し、サーマルサイクラーにセットする。続いて、熱サイクル反応((94℃30秒→55℃30秒→72℃60秒)を30〜50回)をスタートさせる。この工程においては、最初の工程でのビーズ固定プローブの相補鎖伸長産物のみが鋳型として働く。この相補鎖伸長産物の末端部分がビーズ上に固定されたプローブと再度相補鎖を形成し、プローブが伸長することで新たなDNA鎖（プローブの相補鎖伸長産物）がビーズ上に生成されることになる。この際、鋳型となる固相上のDNAは、同一ビーズ上の近接するプローブにＵの字を形成するように湾曲して相補鎖を形成する必要がある。一方で隣接する他のビーズ上に固定されるプローブと相補鎖を形成してしまうと、一固相担体一核酸、即ち個別増幅ではなくなる。このため、ビーズとビーズはあらかじめ解析対象DNAの長さ以上に距離を保ち反応を行う必要がある。
【００３９】
１．６ ビーズ間の距離を保つ方法
反応溶液を常時懸濁し溶液中においてビーズ間の距離を保つ、もしくは、個々のビーズを捕捉するのが可能な径の孔があらかじめ掘られたプレート様のセル（マイクロセル）を使用することが考えられる。この場合、ビーズはあらかじめセルの孔に1つずつ配置されこの孔およびビーズ周囲に反応溶液が充填されている状態となる。ビーズとビーズは十分に距離を保つことが可能で、ビーズ間での伸長反応の乗り移りの防止が完全となる。ビーズを配置する手段としては、ビーズを捕捉するための孔を設ける以外に、ビーズの径より小さめの複数孔があいた平面上にビーズを展開し、孔下部から吸引することにより孔上部にビーズを捕捉する方法、平面基板下部にピン上に配置されたマグネットを利用してそのピン上に磁気ビーズを配置する方法などが考えられる。
上記方法で増幅されたDNAは、ビーズ1つに対して一種類のDNAとなり、混合物からスタートした解析対象をビーズ毎に個別に増幅することが可能となる。
【００４０】
２．第二の方法
本発明の第二の方法として、ビーズ表面に1種類のプローブを固定し、もう1種の浮遊プローブ（反応溶液液相中に拡散している未固定プライマー）と組み合わせて増幅を行う形態が挙げられる。この方法において特徴とすべきは、相補鎖伸長鎖の二本鎖部分を完全には変性解離せず、末端部のみ部分的に変性させることにある。二本鎖の相補鎖伸長鎖を完全に変性解離させるには90℃以上の温度が必要であるが、60〜80℃程度の温度条件下で変性させることにより、変性しやすい末端部のみを部分的に一本鎖状態にすることが可能となる。
【００４１】
この部分的に変性した相補鎖のうちビーズ表面に近いほうの末端変性部分には、固相表面に固定されたプローブが、反対側末端には溶液中に拡散している未固定プライマーが相補鎖結合する。その後、鎖置換能のあるDNAポリメラーゼ（例えばRepliPHITM Phi29 DNA Polymerase (100 units/μL)(EPICENTRE社)）を用いて、鋳型となる末端が部分的に変性した二本鎖DNAの二本鎖部分の相補鎖結合を解きながら伸長反応を進める。部分変性の温度条件と相補鎖結合および伸長反応の温度条件の反応工程を複数回繰り返すことで、ビーズ上に増幅産物を得ることができる。
【００４２】
この方法では通常のPCRのように90℃以上の高温条件下で変性を行わないため、二本鎖のいずれかの部分が常にビーズ上に固定されている鎖と相補鎖結合している状態にあり、液相中に拡散するプライマーから得られる相補鎖伸長鎖もビーズ表面から離れて拡散することが無い。また、上記第一の方法と異なり、増幅反応時に使用されるプライマーの一方が未固定のものであり、固定化プライマーに比べその自由度が格段に高い。このため、増幅効率も固定化プライマーのみを使用したときに比べ格段に上昇するという特徴がある。
【００４３】
３．第三の方法
本発明の第三の方法として、DNAを変性させるために必要となる高温条件下において、粘性の増加する媒体を溶液中に加えておく方法が挙げられる。上記、第二の方法と同様、増幅用プライマーのうち一方をビーズに固定し、もう一方は未固定のまま反応溶液中に拡散させた状態で反応を行う。双方共に固定化プライマーを使用する場合に比べ、増幅効率が上昇することが期待できる。一方で、未固定プライマーの相補鎖伸長鎖が、90oC以上の高温条件下で二本鎖状態が完全に変性し解離してしまった状態において、ビーズ表面近傍から移動できないようにする必要がある。
【００４４】
そこで、高温条件（70℃〜100℃）下において粘性が高まる溶媒（例えば、メビオールゲルTM（メビオール株式会社）やメチルセルロースゲル等）を反応液に加えて行う。完全に変性する条件である高温条件下においては、未固定プライマーから得られる伸長鎖は自由に移動できなくなる。一方で、相補鎖結合を生成させる温度条件（20℃〜60℃）下においては反応用液の粘性は低下しており、溶液中に拡散する未固定プライマーが自由に移動できる。このため、相補鎖伸長反応は、ビーズ表面において滞りなく進む。
【００４５】
このように相補鎖結合で生成したDNA伸長産物がビーズ表面近傍から離れることを阻止するいくつかの工夫により、均一な溶液中でDNA鎖を個別に増幅し、かつ簡単に回収することを可能にする。
【００４６】
４．解析対象となるビーズの選別
続いて、増幅産物が結合した解析対象となるビーズのみの選別を行う。産物のないビーズを除去することにより続く解析工程におけるスループットを向上させることが可能である。選別の手段としては、増幅産物のビーズに固定された末端とは異なるもう一方の末端に導入されるプローブ配列に、選別用のアンカー配列を付け加え、この配列に相補的なプローブが結合したカラムを利用する手段が考えられる。カラムに増幅反応後のビーズを添加し、増幅産物があるビーズはカラム上のプローブにトラップされるが、産物のないビーズはトラップされずにカラムを通過する。続いて、低塩濃度の溶液をカラムに添加し、ビーズ上増幅産物とカラム上プローブとの相補鎖結合を解消させビーズを溶液中に溶出させこれを回収すればよい。
【００４７】
または、増幅産物は2本鎖の形状を取っていることを利用する手段も考えられる。2本鎖特異的インターカレーターを増幅反応溶液中、もしくは増幅反応終了後のビーズ懸濁液に添加する。この溶液を、例えばフローサイトメーター等を利用し、ある一定の蛍光を出すビーズのみを検出・回収することにより、容易に増幅産物のあるビーズのみを回収することが可能となる。
【００４８】
以下、本発明を実施例により説明する。
【実施例】
【００４９】
[実施例１]
本実施例の工程概略を図1に示す。固相担体として、表面にカルボン酸基が修飾された磁気ビーズ(直径2.8μm、Dynal BIOTECH社）を使用した。あらかじめよく懸濁したカルボン酸基修飾磁気ビーズ溶液50μL (1×108ビーズ)を2.0mLマイクロチューブに測りとった。チューブ側面にマグネットを配置し磁気ビーズを捕捉した状態で上清を除去した。ビーズを洗浄する目的で、100μLのMES Buffer (25mM MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid) (pH6.0)、 0.1％(w/v) Tween20)を加え室温で10分間攪拌振とうした後、上清を除去した。本工程を再度繰返し、上清を除去した。続いて、MES Bufferで2.5pmol/μLに希釈したプローブAおよびプローブB溶液をそれぞれ30μL加え、室温で30分間撹拌振とうした。プローブAおよびプローブBはその5’末端にアミノ基が挿入されており、アミノ基とプローブ塩基配列の間にはスペーサーとして18原子からなるヘキサエチレングリコールが挿入されている。スペーサーの長さは限定されず、またスペーサーとして、通常塩基（例えばポリT配列など）を使用することも可能である。その後、30μLのEDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)solution (MES Bufferで0.1mg/μLに調製した溶液）および10μLのMES Bufferを加え、4℃条件下で一晩撹拌振とうし、磁気ビーズにプローブを固定した。反応終了後上清を除去し、ビーズ上においてプローブが結合しなかったカルボン酸基のブロッキング処理を行った。即ち200μLのBlocking Buffer (50mM Tris (pH7.5)，0.1％(w/v) Tween20)を加え、室温で15分間撹拌振とうした後上清を除去した。本工程を4回繰り返した後、200μLの10mM Tris(pH7.5)-0.1％(w/v)Tween20溶液を加え、最終濃度5×105ビーズ/μLのプローブ固定化ビーズを得た。図1において、磁気ビーズは111で、磁気ビーズ上に固定されたプローブAは112でプローブBは113でそれぞれ示される。
【００５０】
続いて、解析対象DNA試料の調製を行った。DNA試料は数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片101〜105の混合物である。二本鎖DNA断片101〜105の両末端には、106および107からなるアダプターAおよび108および109からなるアダプターBをあらかじめライゲーションにより導入した。アダプターAを構成する106の塩基配列は107と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また107は磁気ビーズ111に固定されたプローブB113と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。アダプターBを構成する108の塩基配列は109と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また109は磁気ビーズ111に固定されたプローブA112と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。
【００５１】
続いて、上記プローブA(112)およびプローブB(113)が固定された磁気ビーズ111とアダプターA(106および107)およびアダプターB(108および109)が挿入された2本鎖DNA断片を混合し、磁気ビーズ上のプローブとDNA断片を相補鎖結合させる処理を行った。ここで重要となるのは、ビーズとDNA断片の混合比率である。反応に使用するビーズの個数をＮ、DNA分子の数（DNA一本鎖を分子数1とする、二本鎖は分子数2）をｎとした場合、1個当たりビーズに結合するDNA分子の平均値（λ）はｎ/Ｎで表され、この値が1より大きくならない結合反応条件が必要となる。ポアソン確率からこの反応条件を算出すると、1つのビーズに2分子以上のDNAが結合する確率（Ｐ）は、
Ｐ＝１−（１＋λ）ｅ−λ
で表すことができる。ビーズ106個を用いた反応系におけるビーズ一個当たりに2分子以上のDNAが固定される確率のプロットを行った（図2）。このプロットから、1ビーズ1DNA（1固相担体1核酸）を実現するために、ビーズ106個を用いた反応系において2分子以上が固定されるビーズを1個以下にするには、DNA分子103以下で反応液を調製する必要があることがわかった。そこで本実施例においては、ビーズ106個に対し、2本鎖DNA断片を5×102分子混合し反応を行った（図1(1)）。上記ビーズとDNA断片混合液に10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）4μL、50 mM MgSO4 1.6μL、10mM dNTP Mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液) 0.8μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen社) (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を40μLに調製した反応溶液を準備した。続いて、94℃60秒間でDNA断片を一本鎖に完全に変性させ、続いて50℃120秒間→72℃120秒間のインキュベーションにより相補鎖形成および伸長反応を行った。この工程で、DNA分子（106、101および109で構成）はその末端に導入されたアダプター106がビーズ上プローブB 113と相補鎖結合し、プローブB 113がDNA分子101および109を鋳型として伸長した（図1(2)および(3)）。プローブの相補鎖伸長産物は図１中121および122で示され、伸長産物の末端には、ビーズ上に固定されたもう一種類のプローブA 112と相補的な配列をもつ部分122が導入された。この相補鎖形成および伸長反応工程において重要となるのは、DNA分子がプローブと相補鎖を形成した上で伸長反応が進むことである。DNA分子が非特異吸着によりビーズ上に存在した場合、望むべきでない産物が生じる可能性がある。また、ビーズという固相担体上での反応であるがゆえに、DNA分子が高次構造をとっていると、ビーズ上のプローブとの相補鎖形成効率が顕著に低下する恐れがある。そこで、非特異吸着防止剤としてデンハルト溶液（50×デンハルト溶液の組成：1％ bovine serum albumin(BSA)、1％ Ficoll、1％ polyvinylpyrrolidone）もしくは変性剤としてDMSO（dimethyl sulfoxide）の非特異吸着および相補鎖形成効率への影響を調べてみた。その結果、上記試薬を添加することで、非特異吸着防止の効果が確認できた（図3）。非特異吸着防止や、相補鎖形成効率上昇をサポートするための添加物としては上記試薬以外に、吸着防止剤としてPEG（polyethylene glycol）などの高分子化合物や、変性剤としてホルムアミドの添加などが有効である。本実施例においては、最終濃度BSA0.1％およびDMSO8％を加え反応を行った。
【００５２】
続いて、相補鎖結合・相補鎖伸長で鋳型として使用された一本鎖DNA試料（106、101および109で構成）、ビーズ表面に吸着したDNA試料および結合に関与しなかった余剰DNA試料を取り除く目的で，(i) 0.5N NaOH (室温，1分×2回)、(ii) 1×ＴＥ (94℃，1分×1回)、および(iii) 10 mM Tris (pH7.5) (94℃，1分×1回)の溶液で洗浄処理を行い、上清を除去した（図１中破線151内に含まれるDNA試料）。洗浄溶液には、必要に応じてビーズの凝集やピペットチップ内部壁への吸着を防ぐ目的で、最終濃度0.01〜0.1％(w/v)程度のTween20を加えても良い。本洗浄除去工程は、1ビーズ1DNAを実現するためには必須の工程であり、この工程がないと続く増幅工程において、残存のDNA試料が既に相補鎖伸長産物を持つビーズのプローブと第二の相補鎖伸長産物を形成してしまい、1ビーズ複数種のDNA増幅産物となってしまう。
【００５３】
続いて、洗浄後のビーズ上相補鎖伸長産物の増幅を行った。洗浄済みビーズ106個に対し、10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）4μL、50 mM MgSO4 1.6μL、10mM dNTP Mix 0.8μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen社) (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を40μLに調製した反応溶液を準備しこの溶液中にビーズを懸濁した。94℃ 30秒間（熱変性によるDNAの一本鎖化)→55℃ 120秒間（ビーズ上固定プローブとの相補鎖結合)→72℃ 45秒間（プローブの相補鎖伸長反応）のサイクルを50回行い（図1(5)）、最後に72℃ 10分間を経て室温に下げた。この増幅工程においては、最初の工程でのビーズ固定プローブの相補鎖伸長産物（121および122）が鋳型として働く。この相補鎖伸長産物（121および122）の末端部122がビーズ上に固定されたプローブA 112と相補鎖を形成し、プローブA 112が伸長することで新たなDNA鎖（プローブの相補鎖伸長産物131および132）がビーズ上に生成された。この際、鋳型となる固相上のDNAは、同一ビーズ上の近接するプローブにＵの字を形成するように湾曲して相補鎖を形成し伸長産物も湾曲した形状をとる。熱変性による一本鎖化の工程において、この湾曲形状がほどかれビーズ上に固定された一本鎖DNAとなって次サイクルにおける鋳型となる。最終的にはビーズ上に多数の増幅産物が得られる（図1(6)）。
【００５４】
本増幅工程において、反応溶液はビーズ同士が伸長するDNA鎖以上の距離を常に保つ必要がある。これは、ビーズ同士が伸長産物長以下に近接してしまうと、伸長産物のビーズに固定されているのとは反対側の末端が、固定されているビーズとは別のビーズ上の固定プローブと相補鎖を形成してしまい、複数ビーズ間でDNA伸長産物が生成されることになり、1ビーズ1DNAと相反するためである。本実施例においては、ビーズ対DNA分子の濃度を調整し、常時攪拌することによりビーズが常に拡散している条件下において反応を行うことでビーズ間の距離を確保した。撹拌の方法としては、水平方向の撹拌でもローテーターを使用した垂直方向回転撹拌でもよい。本工程においては、常に反応溶液中のビーズが均一に懸濁されている状況を保てる条件下で反応を行うことが必須である。また、上記ビーズ上へのDNA試料導入（相補鎖伸長産物生成）の工程と同様に、ビーズ上への増幅産物の非特異吸着および高次構造の解消が効果的であるため、本実施例において増幅反応時は、反応溶液には最終濃度でBSA0.1％およびDMSO8%を加え、水平攪拌処理を行いながら熱サイクル反応を行った。以上の工程により、ビーズ上に一種DNA試料からスタートしたDNA増幅産物を得た。ビーズ上のDNA分子の数を、リアルタイムPCR法により定量した。リアルタイムPCR測定にはABI7900HT（Applied Biosystems社）を使用し、反応および測定の手順はApplied Biosystems社推奨の方法に準拠した。相補鎖伸長産物生成時と増幅反応処理後のビーズ上のDNA分子数を定量した結果、ビーズ上に相補鎖伸長産物の増幅産物が生成されていることを確認した。また、リアルタイムでの計測時に、ネガティブコントロールとしてビーズにプローブが固定されていない試料を用意し、このビーズに関しても同様の条件で反応を行った。プローブが固定されていないビーズから検出されるシグナルは、ビーズ上に非特異に吸着したDNA分子が原因と考えられる。コントロールとの比較の結果、上記リアルタイムPCR測定結果の値が確かにビーズ上に特異的に結合して増幅された産物であることが確認できた。
【００５５】
[実施例２]
固相担体として、表面にカルボン酸基が修飾された磁気ビーズ(直径2.8μm、Dynal BIOTECH社）を使用した。あらかじめよく懸濁したカルボン酸基修飾磁気ビーズ溶液50μL (1×108ビーズ)を2.0mLマイクロチューブに測りとった。チューブ側面にマグネットを配置し磁気ビーズを捕捉した状態で、上清を除去した。ビーズを洗浄する目的で、100μLのMES Buffer (25mM MES (pH6.0), 0.1％(w/v) Tween20)を加え室温で10分間攪拌振とうした後、上清を除去した。本工程を再度繰返し、上清を除去した。続いて、MES Bufferで2.5pmol/μLに希釈したプローブAおよびプローブB溶液をそれぞれ30μL加え、室温で30分間撹拌振とうした。その後、30μLのEDC solution (MES Bufferで0.1mg/μLに調製した溶液）および10μLのMES Bufferを加え、4℃条件下で一晩撹拌振とうし、磁気ビーズにプローブを固定した。反応終了後上清を除去し、プローブが結合しなかったカルボン酸基のブロッキング処理を行った。即ち200μLのBlocking Buffer (50mM Tris (pH7.5)，0.1％(w/v) Tween20)を加え、室温で15分間撹拌振とうした後上清を除去した。本工程を4回繰り返した後、200μLの10mM Tris(pH7.5)、 0.1％(w/v)Tween20を加え最終濃度5×105ビーズ/μLのプローブ固定化ビーズを得た。
【００５６】
続いて、解析対象DNA試料の調製を行った。DNA試料は数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片の混合物である。図1に示すように、二本鎖DNA断片101〜105の両末端には、106および107からなるアダプターAおよび108および109からなるアダプターBをあらかじめライゲーションにより導入した。アダプターAを構成する106の塩基配列は107と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また107は磁気ビーズ111に固定されたプローブB113と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。アダプターBを構成する108の塩基配列は109と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また109は磁気ビーズ111に固定されたプローブA112と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。
【００５７】
続いて、上記プローブA(112)およびプローブB(113)が固定された磁気ビーズ111とアダプターA(106および107)およびアダプターB(108および109)が挿入された2本鎖DNA断片を混合し、磁気ビーズ上のプローブとDNA断片を相補鎖結合させる処理を行った。反応においては、ビーズ間の距離が伸長するDNA鎖以上の距離を確保するため、ビーズをあらかじめ専用のビーズ捕捉用反応セル上に配置し以下の反応を行った。反応セルの構成を図4に示す。セル401にはビーズ412を保持することが可能な径（本実施例において使用した2.8μmビーズ使用時には孔径は3〜3.5μm程度）の孔411がビーズの数だけ配置されている。非常に微細な孔のため、きわめて狭い面積に膨大な孔を配置することが可能である。具体的には、解析対象試料DNAの塩基長は、塩基-塩基間距離が約3.5Åであることから、例えば300塩基長であれば約0.03μm、1000塩基長であれば約0.1μm程度となる。このため、例えば直径3.5μmの孔を1μm間隔で配置した場合、1cm四方に約6×108の孔を配置することが可能である。ビーズ懸濁溶液を図4に示す捕捉セル401上に注入口402より注入し、反対側の排出口403から排出した溶液を再度セル内401に戻し、溶液の注出入操作により孔411にビーズを配置する(図4(2))。その後反応セル401をカバー405で覆いビーズ412が流出するのを防ぐ。この際、カバーがあるためビーズは孔から出ることができないが、注入口402から注ぎ込まれる溶液は、ビーズ周囲（孔の中も含めて）を自由に移動でき、また不要になった溶液は排出口403から除去することができる。このような反応セル401を使用することで、ビーズ間の距離を保ちつつ、反応溶液や洗浄溶液を自由にビーズ表面に供給することが可能となった。セルの形状としては、図4に示すような形状以外に図5に示す形状のようなものも可能である。即ち、ビーズを保持するのは孔ではなく、平面501に平面を貫通するようにあけられた穴502である。穴の径はビーズ511より小さい。また穴下部から吸引521することで、吸引しているときは穴の上にビーズを保持することが可能であり、吸引していないときにはビーズを自由に移動させることが可能となる。ビーズは吸引していないときは平面状を自由に行き来できるが（図5-1(1)）、穴下部より吸引されると穴に固定され（図5-1(2)）、この平面に溶液を保持できるカバー503をかぶせることで、ビーズ周囲に溶液504を保持することが可能となる（図5-1(3)）。カバー503には、溶液の注入口505および排出口506が設けられている。反応溶液の注入排出時、反応時、また洗浄時には吸引することでビーズを保持し、増幅反応が終わった際に吸引を解けば容易にビーズを回収することが可能となる。上記方法以外にも、図5-2に示すように、平面551にピン状に配置された磁石552を使ってビーズ511を平面状に配置保持することも可能である。この場合、ビーズ511と磁石522の間に磁力遮蔽板553を抜き差しすることで、ビーズを捕捉したり開放したりコントロールすることが可能となり、上記吸引でビーズを捕捉した場合と同様の効果が得られる。
【００５８】
上記反応セルに、ビーズ106個に対し、5×102分子の2本鎖DNA断片溶液、反応混合溶液（1×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9))、18 mM Ammonium Sulfate）、2 mM MgSO4、0.2mM dNTP、および Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (0.05units/μL) ）を注入し反応セル内を十分に満たした。続いて、94℃ 60秒間→50℃ 120秒間→72℃ 120秒間のインキュベーションを行った。ビーズ上へのDNA試料の非特異吸着および高次構造の解消を目的として、反応溶液には最終濃度BSA0.1％およびDMSO8%を加え上記反応を行った。続いて相補鎖結合・相補鎖伸長で鋳型として使用された一本鎖DNA試料、ビーズ表面に吸着したDNA試料および結合に関与しなかった余剰DNA試料を取り除く目的で、(i) 0.5N NaOH (1分×2回)、(ii) 1×ＴＥ (1分×1回)、および(iii) 10 mM Tris (pH7.5) (1分×1回)の溶液を所望の時間フローさせて、セル内の洗浄処理を行い、最終的に溶液を完全に除去した。
【００５９】
続いて、洗浄後のビーズ上相補鎖伸長産物の増幅を行った。洗浄済みビーズ106個に対し、反応混合溶液（1×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9))、18 mM Ammonium Sulfate）、2 mM MgSO4、0.2mM dNTP、および Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (0.05units/μL) ）を注入し反応セル内を十分に満たした。続いて、94℃ 30秒間→55℃ 120秒間→72℃ 45秒間のサイクルを50回行い、最後に72℃ 10分間を経て室温に下げた。ビーズ上へのDNA試料の非特異吸着および高次構造の解消を目的として、反応溶液には最終濃度BSA0.1％およびDMSO8%を加え上記反応を行った。以上の工程により、ビーズ上に一種DNA試料からスタートしたDNA増幅産物を得た。
【００６０】
[実施例３]
本発明において重要となるのは、ビーズとDNA断片の混合比率である。図2に示すポアソン確率から、1ビーズ1核酸を実現するために、ビーズ106個を用いた反応系において2分子以上が固定されるビーズを1個以下にするには、DNA分子103以下で反応液を調製する必要がある。一方で全体の98.4%にあたる998,400個のビーズにはDNA断片が何も結合していない計算となる。DNA断片が結合し、続く増幅工程において産物が得られたビーズのみを回収することにより、飛躍的に増幅産物解析工程のスループットを上昇させることが可能となる。
【００６１】
本実施例においては、選別の手段として増幅産物の末端に導入されるプローブ配列に選別用のアンカー配列を付け加え、この配列に相補的なプローブが結合したカラムを利用し選別を行った（図6および図7）。ビーズ表面に固定するプローブは、配列Aを持つプローブ1および配列BおよびCからなるプローブ2である(図6-1(1))。解析対象DNA断片の両末端には、図6に示す、配列AおよびAと相補的な配列であるA’からなるアダプター1および配列BおよびBと相補的な配列であるB’からなるアダプター2がライゲーションにより挿入されている。図6-1(1)に示すように、DNA断片の片鎖がビーズ表面のプローブ1と相補鎖結合し、伸長反応へと進む(図6-1 (2))。鋳型となったDNA鎖を変性させ洗浄処理を施した後(図6-1 (3))、続く増幅工程において、相補鎖伸長産物は、ビーズ表面のプローブ2と相補鎖結合し(図6-1 (4))プローブの伸長反応へと進む(図6-1 (5))。熱変性の後(図6-2(6)、それぞれの伸長産物が最寄りのプローブと相補鎖結合し、伸長反応へと進む(図6-2(7)および(8))。最終的にビーズ表面上に生成されるプローブ伸長産物は、図6-2(9)の配列構成の鎖がメインとなる。一方で、図7に示す分離精製用のカラム701にはあらかじめCと同じ配列を持つプローブが固定されている。このカラム701に増幅反応後のビーズ702を添加することにより、増幅産物がビーズ上にある場合は、その産物の末端に配置されるC’配列部分がカラム701のプローブと相補鎖結合し、ビーズ711が捕捉される（図7(2)）。一方で産物のないビーズは、C配列と相補鎖結合できる配列を持たないので、カラム701に捕捉されることなく通過してしまう(図7(2)712で示されるビーズ)。ビーズ溶液を添加後、相補鎖結合を解消するため、低塩濃度のバッファー（10 mM Tris (pH7.5)）でカラムを洗浄し、溶出されたビーズ713を回収した（図7(3)）。
【００６２】
増幅産物が結合したビーズのみを回収する別の手段を説明する(図(8))。増幅反応中に、DNAの2本鎖部分に特異的に入り込む蛍光色素（インターカレーター）を添加するか、増幅反応後に上記インターカレーターを含む溶液中にビーズを懸濁させビーズ上増幅産物2本鎖部分に蛍光色素を取り込ませた。インターカレーターとしては、Pico Green(Invitrogen社)やSYBR Green(Invitrogen社)などが考えられる。この溶液を、フローサイトメーターを利用し、蛍光を発するビーズ801のみを検出・選別回収することにより、増幅産物のあるビーズ801のみを回収した(図8)。
【００６３】
[実施例４]
単分子計測の前処理工程において、複数種類のDNA試料混合物を一分子ずつ単離することは非常に難しい。1ビーズ1DNA分子での結合が可能であっても、これを実現するための反応条件下ではほとんどのビーズにはDNAが結合していないため、DNAが結合しているビーズの選別が必要となる。一方で、DNA試料を増幅せずに計測する単分子計測の利点は、増幅することによりオリジナルの配列や量比を正確に反映できないのではないか、という懸念が払拭される点にある。そこで、本発明において最初の工程で相補鎖伸長産物として得られるDNA鎖を解析対象とし、増幅産物はビーズ選別のためのフラグとして利用する手法について以下実施例を説明する。
【００６４】
本実施例の工程概略を図9に示す。固相担体として、表面にカルボン酸基が修飾された磁気ビーズ(直径2.8μm、Dynal BIOTECH社）を使用した。あらかじめよく懸濁したカルボン酸基修飾磁気ビーズ溶液50μL (1×108ビーズ)を2.0mLマイクロチューブに測りとった。チューブ側面にマグネットを配置し磁気ビーズを捕捉した状態で、上清を除去した。ビーズを洗浄する目的で、100μLのMES Buffer (25mM MES (pH6.0)、 0.1％(w/v) Tween20)を加え室温で10分間攪拌振とうした後、上清を除去した。本工程を再度繰返し、上清を除去した。続いて，MES Bufferで2.5pmol/μLに希釈したプローブAおよびプローブB溶液をそれぞれ30μL加え、室温で30分間撹拌振とうした。その後，30μLのEDC solution (MES Bufferで0.1mg/μLに調製した溶液）および10μLのMES Bufferを加え、4℃条件下で一晩撹拌振とうし、磁気ビーズにプローブを固定した。反応終了後上清を除去し、プローブが結合しなかったカルボン酸基のブロッキング処理を行った。即ち200μLのBlocking Buffer (50mM Tris (pH7.5) 、0.1％(w/v) Tween20)を加え、室温で15分間撹拌振とうした後上清を除去した。本工程を4回繰り返した後，200μLの10m M Tris(pH7.5)、0.1％(w/v)Tween20を加え最終濃度5×105ビーズ/μLのプローブ固定化ビーズを得た。図9-1において、磁気ビーズは901で、磁気ビーズ上に固定されたプローブAは912でプローブBは913でそれぞれ示される。図9においては反応の構成をわかりやすくするためするため、ビーズ一個だけの記載とするが、実際には上述の通り1×108ビーズが共存している。
【００６５】
続いて、解析対象DNA試料の調製を行った。DNA試料は数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖ＤＮＡ断片の混合物である。二本鎖ＤＮＡ断片916、917の両末端には、921および922からなるアダプターAおよび923、924および925、926からなるアダプターCをあらかじめライゲーションにより導入した。アダプターAを構成する922の塩基配列は921と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また922は磁気ビーズ901に固定されたプローブB913と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。アダプターCを構成する923の塩基配列は924と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また923は磁気ビーズ901に固定されたプローブA912と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。アダプターCを構成する925および925と一部もしくは全部が相補的な配列を持つ926の塩基配列は、磁気ビーズ上に固定されたプローブ912、913およびDNA試料に挿入されたアダプター921、922、923および924のいずれの配列とも、相補的ではなく、また同一ではない。
【００６６】
続いて、上記プローブA（912）およびプローブB（913）が固定された磁気ビーズ901とアダプターA（921および922）およびアダプターC（923、924、925および926）が挿入された2本鎖DNA断片を混合し、磁気ビーズ上のプローブとDNA断片を相補鎖結合させる処理を行った。ビーズ106個に対し、2本鎖DNA断片を5×102分子混合し反応を行った。（図9においては反応の構成をわかりやすくするためするため、DNA断片が一種だけの記載とするが、実際には5×102分子のDNA断片が共存している。）上記ビーズとDNA断片混合液に10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）4μL、50 mM MgSO4 1.6μL、10mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液) 0.8μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を40μLに調製した反応溶液を準備した。続いて、94℃60秒間でDNA断片を一本鎖に完全に変性させ、続いて50℃120秒間→72℃120秒間のインキュベーションにより相補鎖形成および伸長反応を行った。この工程で、DNA分子（925、923、916および921で構成）はその末端に導入されたアダプター921がビーズ上プローブB 913と相補鎖結合し、プローブB 913がDNA分子916、923および925を鋳型として伸長した（図9-1(2)および(3)）。
【００６７】
続いて、相補鎖結合・相補鎖伸長で鋳型として使用された一本鎖DNA試料およびビーズ表面に吸着したDNA試料を取り除く目的で、(i) 0.5N NaOH (室温、1分×2回)、(ii) 1×ＴＥ (94℃、1分×1回)、および(iii) 10 mM Tris (pH7.5) (94℃、1分×1回)の溶液で洗浄処理を行い、上清を除去した。洗浄溶液には、必要に応じてビーズの凝集やピペットチップ内部壁への吸着を防ぐ目的で最終濃度0.01〜0.1％(w/v)程度のTween20を加えても良い。本洗浄除去工程は、一ビーズ一DNA分子を実現するためには必須の工程であり、この工程がないと、続く増幅工程において、残存のDNA試料が既に相補鎖伸長産物を持つビーズのプローブと第二の相補鎖伸長産物を形成してしまい、一ビーズ複数種のDNA増幅産物となってしまう。洗浄後にビーズ上に残った相補鎖伸長産物の3’末端には、アダプターCを構成する926と同一の配列を有する933部が導入された。
【００６８】
続いて、洗浄後のビーズ上相補鎖伸長産物の増幅を行った。洗浄済みビーズ106個に対し、10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）4μL、50 mM MgSO4 1.6μL、10mM dNTP 0.8μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を40μLに調製した反応溶液を準備した。続いて、94℃ 30秒間（熱変性によるDNAの一本鎖化)→55℃ 120秒間（ビーズ上プローブとの相補鎖結合)→72℃ 45秒間（プローブの伸長反応）のサイクルを50回行い（図9-2(5)）、最後に72℃ 10分間を経て室温に下げた。この増幅工程においては、最初の工程でのビーズ固定プローブの相補鎖伸長産物（931、932および933）が鋳型として働く。この相補鎖伸長産物（931、932および933）の932配列部分がビーズ上に固定されたプローブA 912と相補鎖を形成し、プローブA 912が伸長することで新たなDNA鎖（プローブの相補鎖伸長産物941および942）がビーズ上に生成された。この際、鋳型となる固相上のDNAは、同一ビーズ上の近接するプローブにＵの字を形成するように湾曲して相補鎖を形成し伸長産物も湾曲した形状をとっている。熱変性による一本鎖化の工程において、この湾曲形状がほどかれビーズ上に固定された一本鎖DNAとなって次サイクルにおける鋳型となる。最終的にはビーズ上に多数の増幅産物が得られる（図9-2(6)）。1ビーズ1種DNA試料を実現するため、図2にも記載の通り、ビーズ106個を用いた反応系において2分子以上が固定されるビーズを１個以下にするには、DNA分子103以下で反応液を調製する必要がある。一方で全体の98.4%にあたる998,400個のビーズにはDNA断片が何も結合していない計算となる。そこで、実施例3に記載のいずれかの方法を用いて増幅産物が得られたビーズのみを選別回収した。この際、図７に記載のカラムでの選別を行う場合、カラムに固定するプローブの配列は図9に示す固定プローブ912もしくは913の末端に補捉用配列Cが付加されたものとなる（図10(1)）。このプローブを使用して増幅した場合、主たる増幅産物のビーズ表面固定化とは反対側の末端部分にはCと相補的な配列C’が挿入される（図10(2)）。一方でカラムにはCの配列をもつプローブが固定されていれば、増幅産物があるビーズ、即ちC’の配列をもつビーズのみがカラムに捕捉され、増幅産物のないビーズはカラムを通過してしまう。このようにして、増幅産物のあるビーズのみを選別回収することが可能である。
【００６９】
一方でビーズに生成された増幅産物は、最初の工程で得られた相補鎖伸長産物と、その後の工程で得られる増幅産物でその配列構成に違いがあり、最初の伸長産物の末端にのみ、アダプターCを構成する926と同一の配列を有し、ビーズ上のプローブ配列とは相補的でなくまた同一でもない配列部分933が付加されている。このオリジナルのDNA分子の相補鎖伸長で得られた配列部分933に相補的な配列を有するプライマーを利用して周知のDNA塩基配列決定法に従い塩基配列決定を行えば、増幅産物ではなく、1ビーズ1分子のDNA解析が可能となる。即ち、ビーズ上の増幅産物を利用して、混合状態で提供されるDNA試料を単離し、最初の相補鎖伸長産物を解析することで増幅というバイアスがかからないオリジナルのDNAの単分子計測が可能となった。
【００７０】
[実施例５]
1ビーズ1DNAとした個別並列増幅を実現するために、増幅産物がビーズの表面ごく近傍でしか移動することができない場合、増幅用プローブを必ずしもビーズに固定する必要はない。この実施例では、(1)鋳型となる核酸試料の末端部には前記固定プローブと相補的な配列を持つアダプターが導入されており、反対側末端には浮遊プローブと同じ配列を持つアダプターが導入されており、(2)鋳型となる核酸試料が前記固定プローブと相補鎖結合することが可能であり、(3)前記相補鎖結合した固定プローブの伸長産物が浮遊プローブと相補鎖結合することが可能であり、(4)前記固定プローブの伸長産物および浮遊プローブの伸長産物からなる2本鎖核酸試料の末端部分のみ部分的に変性を行うことを特徴とする核酸分析方法を示す。実施例は、図11および12を用いて説明する。
【００７１】
固相担体として、表面にストレプトアビジン基が修飾されたセファロースビーズ(直径約34μm、GE ヘルスケアバイオサイエンス社）を使用し、プローブAを固定した。ここで使用するプローブAの5’末端部には、ストレプトアビジンとの結合を可能とするビオチン修飾が施されている。またビオチン修飾と塩基配列の間には、スペーサーとしてカーボン18分子が挿入されている。あらかじめよく懸濁したセファロースビーズ100μL (1×106ビーズ)をスピンカラム（Ultra free-MC, durapore PVDF 0.5μm、ミリポア社）に添加し、12,000×gで1分間遠心し上清をのぞく。カラム上のビーズを2×Binding Buffer(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、2 M NaCl、0.01％(w/v) Tween20) 150μLで懸濁し2.0mLのマイクロチューブに移す。そこへ10pmol/μLのプローブA溶液50μLを加え、滅菌水で全量を300μLにした。ローテーターを用いて、室温条件下で1時間混和させ、ビーズ上のストレプトアビジンとプローブ末端のビオチン基を結合させた。上記ビオチンの代わりに、2個のビオチン基が連続して配置されるデュアルビオチン基を修飾してストレプトアビジンとの結合効率を高めることも可能である。図11(1)において、セファロースビーズを201で、ストレプトアビジン−ビオチン結合で固定されたプローブAを212で示す。簡略化のため、図においてはビーズ１個のみを記載している。続いて、解析対象DNA試料の調製を行った。DNA試料は数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片の混合物である。図11-1(1)で示される213および214で示される。簡略化のため、DNA鎖は一断片のみを記載している。二本鎖DNA断片213および214の両末端には、215および216からなるアダプターAをライゲーション反応により導入した。アダプターAを構成する215の塩基配列は216と一部もしくは全体が相補的な塩基配列であり、また215はセファロースビーズ201に固定されたプローブA 212と一部もしくは全部が同一の塩基配列である。
【００７２】
続いて、上記プローブA(212)が固定されたセファロースビーズ201とアダプターA(215および216)が挿入された2本鎖DNA断片を混合し、セファロースビーズ上のプローブとDNA断片を相補鎖結合させる処理を行った。ビーズ104個に対し、2本鎖DNA断片を1×105分子、1×104分子、もしくは1×103分子（それぞれビーズ当り10分子、1分子もしくは0.1分子に相当）混合したチューブを3本用意しそれぞれについて反応を行った（図11-1(2)）。上記ビーズとDNA断片混合液に10×PCRバッファー(600 mM Tris-SO4 (pH8.9)、180 mM Ammonium Sulfate）2μL、50 mM MgSO4 0.8μL、10mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液) 0.4μL、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (5units/μL) 0.4μLを混合し、滅菌水で全溶液量を20μLに調製した反応溶液を準備した。続いて、94℃60秒間でDNA断片を一本鎖に完全に変性させ、続いて50℃120秒間→72℃120秒間のインキュベーションにより相補鎖形成および伸長反応を行った。この工程で、DNA分子（216、214および215で構成）はその末端に導入されたアダプター216がビーズ上プローブA 212と相補鎖結合し、プローブA 212がDNA分子214および215を鋳型として202の方向に伸長した（図11-1(2)および(3)）。プローブの相補鎖伸長産物は図11-1中231および232で示され、伸長産物の末端には、ビーズ上に固定されたプローブA 212と相補的な配列をもつ部分232が導入された。続いて、相補鎖結合・相補鎖伸長で鋳型として使用された一本鎖DNA試料（216、214および215で構成）、ビーズ表面に吸着したDNA試料および結合に関与しなかった余剰DNA試料を取り除く目的で、(i) 0.5N NaOH (室温，1分×2回) 、(ii) 1×ＴＥ (94℃、1分×1回)，および(iii) 10 mM Tris (pH7.5) (94℃、1分×1回)の溶液で洗浄処理を行い、上清を除去した（図11-1中破線内241に含まれるDNA試料）。上清の除去の工程は次の通りである。即ち、遠心分離によりセファロースビーズをチューブ底部に沈殿させ、静かにピペットで上清を除去した。洗浄液を加えた後には必ずボルテックスなどを用いて十分に撹拌処理を行い、再度上清を除去した（図11-1(4)）。
【００７３】
続いて、洗浄後のビーズ上相補鎖伸長産物の増幅を行った。洗浄済みビーズ104個に対し、10 pmol/μLに滅菌水で希釈したプライマーAを2μLおよび10×反応溶液（200 mM Tris- HCl(pH8.8)、100 mM KCl、100 mM (NH4)2SO4、 20 mM MgSO4、1.0% Triton X-100) 2μL、10mM dNTP 1μL、およびBst DNA Polymerase (8 units/μL)(New England Biolabs社)1μLを混合し、滅菌水で全溶液量を20μLに調製した反応溶液を準備しこの溶液中にビーズを懸濁した。ここで使用するBst DNA Polymeraseは鎖置換能をもつポリメラーゼで、鋳型DNAに増幅用プライマーが相補鎖結合した後、伸長鎖は伸長方向の鋳型が2本鎖であってもその鎖を解きながら相補鎖を合成していくことができる酵素である。本実施例においては、Bst DNA Polymeraseを使用したが、鎖置換能を持つDNA PolymeraseであればBst DNA Polymeraseには限定されず、Deep VentR DNA Polymerase(New England Biolabs社)や9NmTM DNA Polymerase(New England Biolabs社)でも同様の効果が期待できる。その後、反応溶液を65℃に保ち、90分間反応させた後、94℃2分間で酵素を失活させた。65℃一定温度条件において、溶液中に拡散しているプライマーA(235)がビーズ上の相補鎖伸長鎖の末端部分232と相補鎖結合し（図11-2(5)）、伸長反応が起こり、産物（図11-2(6)235、236および237で記載）を得た。図の簡略化のため、図11-2における最初の相補鎖伸長産物（212、231および232で記載）を図12中250で、上記相補鎖伸長産物と相補的な配列を持つ伸長産物（235、236および237で記載）を251で表す。65℃条件下においては、生成した二本鎖DNAは、その末端部分255および256のみが部分的に変性した状態となっている。この部分的に変性した一本鎖部分256には溶液中に拡散しているプライマーA（235）が相補鎖結合し、また反対側末端部の255には末端部近傍に存在するビーズ上のプローブA（212）が相補鎖結合する（図12(3））。その後、241および242の方向に、鋳型となる二本鎖の相補鎖結合部分を解きながら伸長反応が進み（図12(4））、図12(5）に示す産物が得られる。その後も、65℃条件下においては上記産物の末端部分のみが部分的に変性状態となっているため、243および244の変性部分には反応溶液中に拡散しているプライマーAが、また反対側末端部分の変性部分245および246には、ビーズ上の最寄り固定プローブAが相補鎖結合し、新たな伸長反応へと進む。このようにして、一定温度条件において最終的にはビーズ上に複数の相補鎖伸長産物を得ることができた。結果を図13に示す。ビーズ当り相補鎖伸長生成物は図11（4）に相当し、増幅時の鋳型となる分子数となる。一方、ビーズ当り増幅産物は前記伸長生成物が増幅した後の分子数となる。本実施例に記載の反応条件下においては、10４ビーズに対して1/10量のDNA分子を投入して反応させた系において最も良好な増幅結果が得られ、11.5倍に増幅することができた。
【００７４】
通常のPCRの反応条件では、変性を94℃程度で行うため、相補鎖伸長産物の2本鎖構造は完全に解離してしまい、末端が固定されていないほうの鎖は溶液中に拡散してしまう。しかし、本実施例のように鎖置換能をもつ酵素を用いれば、相補鎖伸長産物は完全に解離しないため、ビーズから離れて溶液中に拡散することは無く、産物は最後まで最初に結合したビーズの表面上でしか反応に寄与しない。
【００７５】
また、通常のPCR用酵素を使用してPCR反応を行った場合も、末端を固定化していないプローブを、例えば高温条件下において粘性が高まる溶媒（例えば転移温度以上においてゲル状、転移温度以下においては流動性のゾルといった特徴をもつメビオールゲルTM（メビオール株式会社）やメチルセルロースゲル等を反応溶液に加えることにより、増幅産物がビーズの表面ごく近傍でしか移動することができない場合、相補鎖伸長産物はビーズから離れて溶液中に拡散することは無く、本実施例と同様の効果を得ることが可能である。
【００７６】
このようにして、1ビーズ1DNAの個別並列増幅が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の反応工程の一実施形態を示す図である。
【図２】1固相担体1核酸を実現するためのポアソン確率解析の結果である。
【図３】ビーズ上へのDNA分子非特異吸着防止の効果を説明する図である。
【図４】ビーズ間の距離を確保するためのセルの構成図である。
【図５−１】ビーズ間の距離を確保するためのセルの構成図である。
【図５−２】ビーズ間の距離を確保するためのセルの構成図である。
【図６−１】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するためのプローブを導入する工程の概略図である。
【図６−２】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するためのプローブを導入する工程の概略図である。
【図７】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するための工程の概略図である。
【図８】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するための工程の概略図である。
【図９−１】ビーズ上の増幅産物を利用して単分子計測を行う反応工程の概略図である。
【図９−２】ビーズ上の増幅産物を利用して単分子計測を行う反応工程の概略図である。
【図１０】増幅産物が得られたビーズと得られなかったビーズを選別するためのプローブを導入する工程の概略図である。
【図１１−１】本発明の反応工程の一実施形態を示す図である。
【図１１−２】本発明の反応工程の一実施形態を示す図である。
【図１２】本発明の反応工程の一実施形態を示す図である。
【図１３】本発明の反応工程の一実施形態の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７８】
101〜105：数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片(DNA試料）
106：アダプターA（107と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
107：アダプターA（113と一部もしくは全体が同一の塩基配列)
108：アダプターB（109と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
109：アダプターB（112と一部もしくは全体が同一の塩基配列）
111：磁気ビーズ
112：磁気ビーズ上に固定されたプローブA
113：磁気ビーズ上に固定されたプローブB
121：プローブの相補鎖伸長産物
122：プローブの相補鎖伸長産物（112と相補的な配列）
131：112が伸長した新たなDNA産物
132：112が伸長した新たなDNA産物
401：捕捉セル（反応セル）
402：注入口
403：排出口
405：カバー
411：孔
412：ビーズ
501：平面
502：穴
503：カバー
504：溶液
505：注入口
506：排出口
511：ビーズ
521：吸引
551：平面
552：磁石
553：磁力遮蔽版
701：分離精製用のカラム
702：増幅反応後のビーズ
711：捕捉された産物のあるビーズ
712：捕捉された産物のないビーズ
713：溶出されたビーズ
801：蛍光を発する捕捉された産物のあるビーズ
901：磁気ビーズ
912：磁気ビーズ上に固定されたプローブA
913：磁気ビーズ上に固定されたプローブB
916：二本鎖DNA断片の片鎖
917：916の相補鎖
921：アダプターA
922：アダプターA（913と一部もしくは全体が同一の塩基配列）
923：アダプターB（912と一部もしくは全体が同一の塩基配列）
924：アダプターB（923と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
925：アダプターC
926：アダプターC（925と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
931：912の相補鎖伸長産物
932：912の相補鎖伸長産物
933：912の相補鎖伸長産物
941：912が伸長した新たなDNA産物
942：912が伸長した新たなDNA産物
201：セファロースビーズ
202：212が伸長する方向
212：ビーズ上に固定されたプローブA
213：数百〜1kb程度の塩基長の二本鎖DNA断片の片鎖
214：213の相補鎖
215：アダプターAを構成する塩基配列（216と一部もしくは全体が相補的な塩基配列）
216：アダプターAを構成する塩基配列
231：最初の相補鎖伸長産物
232：最初の相補鎖伸長産物
235：232と相補的な配列をもつ伸長産物
236：231と相補的な配列をもつ伸長産物
237：212と相補的な配列をもつ伸長産物
241：鋳型となる二本鎖の相補鎖結合部分を解きながら伸長反応が進む方向
242：鋳型となる二本鎖の相補鎖結合部分を解きながら伸長反応が進む方向
243：部分的な変性部分
244：部分的な変性部分
245：反対側の末端部分の変性部分
246：反対側の末端部分の変性部分
250：最初の相補鎖伸長産物
251：250と相補的な配列をもつ伸長産物
255：反対側の末端部分の変性部分
256：末端部分の変性部分
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の核酸試料を同時に分析する方法であって、１種類以上の増幅用プローブを表面に固定した１つの固相担体に対して、１分子の鋳型核酸の３’末端を含む端部が前記プローブを介して結合しうるように、複数の前記鋳型核酸を導入する第１の工程と、
前記鋳型核酸を鋳型として、前記プローブを伸長させて第１の伸長型プローブとする第２の工程と、
前記第１の伸長型プローブから前記鋳型核酸を解離させる第３の工程と、
前記鋳型核酸を除去する第４の工程と、
（１）前記伸長型プローブの３’末端を含む端部を、伸長していないプローブに結合させる工程と、(２)前記第１の伸長型プローブを鋳型として、前記伸長していないプローブを伸長させて第２の伸長型プローブとする工程と、(３)前記第２の伸長型プローブから前記第１の伸長型プローブを解離させる工程を繰り返して、前記第１の伸長型プローブと前記第２の伸長型プローブを増幅させ、前記担体上に多数の前記第１の伸長型プローブと前記第２の伸長型プローブを生じさせる第５の工程と、
前記第１の伸長型プローブが結合する担体と、前記第１の伸長型プローブが結合しない担体とを選別する第６の工程を含む核酸分析方法。
【請求項２】
前記第１の工程の前に、前記鋳型核酸の３’末端に第１配列を有するアダプターを導入し、かつ前記鋳型核酸の５’末端に前記第１配列と異なる第２配列を有するアダプターを導入する工程をさらに有し、
１の前記担体に固定される前記複数のプローブは、前記第１配列の相補配列もしくは前記第２配列の相補配列のいずれかを有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
【請求項３】
前記第１の工程の前に、前記鋳型核酸の３’末端に第１配列を有するアダプターを導入し、かつ前記鋳型核酸の５’末端に前記第１配列の相補配列を有するアダプターを導入する工程をさらに有し、
１の前記担体に固定される前記複数のプローブは、前記第１配列の相補配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
【請求項４】
前記第１の工程乃至第４の工程は共通の容器で行い、前記第５の工程は前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器で各々行うことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
【請求項５】
前記第１の工程乃至第５の工程を、前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器で各々行うことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
【請求項６】
前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器において、前記反応を行う溶液が共通であることを特徴とする、請求項４または５に記載の核酸分析方法。
【請求項７】
前記第５の工程において、(１) 前記第１の伸長型プローブを鋳型として、同一固相担体上の近接するプローブにＵの字を形成するように相補鎖を伸長させて湾曲形状の第２の伸長型プローブとし、(２) 熱変性により前記湾曲形状をほどいて前記担体上に固定された一本鎖核酸とし、次サイクルの鋳型とする工程を繰り返すことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項８】
前記第１の工程乃至第５の工程において、反応溶液を常時撹拌することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項９】
前記第１の工程乃至第５の工程において、前記複数の担体を鋳型核酸の長さより長い距離を確保して配置することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１０】
複数の核酸試料を同時に分析する方法であって、１種類の固定プローブを表面に固定した１つの固相担体に対して、１分子の鋳型核酸の３’末端を含む端部が前記プローブを介して結合しうるように、複数の前記鋳型核酸を導入する第１の工程と、
前記鋳型核酸を鋳型として、前記固定プローブを伸長させて第１の伸長型プローブとする第２の工程と、
前記第１の伸長型プローブから前記鋳型核酸を解離させる第３の工程と、
前記鋳型核酸を除去する第４の工程と、
（１）前記第１の伸長型プローブの３’末端を含む端部を、反応溶液中に加えられたもう１種類の浮遊プローブに結合させる工程と、(２)前記第１の伸長型プローブを鋳型として、前記浮遊プローブを伸長させて第２の伸長型プローブとする工程と、(３)前記第２の伸長型プローブから前記第１の伸長型プローブを解離させる工程を繰り返して、前記第１の伸長型プローブと前記第２の伸長型プローブを増幅させ、前記担体上に多数の前記第１の伸長型プローブと前記第２の伸長型プローブを生じさせる第５の工程と、
前記第１の伸長型プローブが結合する担体と、前記第１の伸長型プローブが結合しない担体とを選別する第６の工程を含む核酸分析方法。
【請求項１１】
前記第５工程の(３)において、前記第１の伸長型プローブと第２の伸長型プローブからなる２本鎖核酸の末端部分のみを部分的に解離させ１本鎖となった末端部に、前記固定プローブもしくは前記浮遊プローブを相補鎖結合させ、鎖置換能のあるDNAポリメラーゼを用いて鋳型核酸の２本鎖部分を剥がしながら伸長反応を行うことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分析方法。
【請求項１２】
前記反応溶液中に、変性時に粘性が増加あるいはゲル化し、相補鎖結合時に粘性が低下あるいは溶液状態となる物質を共存させ、
前記担体に鋳型核酸を捕獲した後、浮遊プローブをゲル中に分散させた状態で核酸増幅反応を行うことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分析方法。
【請求項１３】
鋳型核酸の５'末端に導入されるプローブ配列に前記アダプターの第１配列および第２配列とは相補的でなくまた同一でもない選別用のアンカー配列を付加した上で、前記第１の工程乃至第５の工程を行い、前記第６の工程において前記アンカー配列に相補的なプローブが結合したカラムを利用し、増幅産物が得られた固相担体のみを選別することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１４】
鋳型核酸の５'末端に導入されるプローブ配列に前記アダプターの第１配列および第２配列とは相補的でなくまた同一でもない第３配列を付加した上で、前記第１の工程乃至第４の工程を行い、前記第３配列に相補的な配列を有するプライマーを使用して、増幅産物でない鋳型核酸の配列解析を行う工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１５】
２本鎖特異的インターカレーターを増幅反応溶液、もしくは増幅反応終了後の固相担体懸濁液に添加し、前記インターカレーター由来の蛍光を発する固相担体のみを前記溶液から検出・回収することにより、増幅産物が得られた固相担体のみを選別することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１６】
１つの固相担体に２つ以上の鋳型核酸に起因した増幅産物が複製されないようにするために、固相担体106個を用いた反応系に対して鋳型核酸分子が103個以下となるよう反応液を調製することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１７】
均一な溶媒からなる溶液中で増幅反応を行うことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１８】
固相担体がビーズであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１】
複数の核酸試料を同時に分析する方法であって、１種類以上の増幅用プローブを表面に固定した１つの固相担体に対して、１分子の鋳型核酸の３’末端を含む端部が前記プローブを介して結合しうるように、複数の前記鋳型核酸を導入する第１の工程と、
前記鋳型核酸を鋳型として、前記プローブを伸長させて第１の伸長型プローブとする第２の工程と、
前記第１の伸長型プローブから前記鋳型核酸を解離させる第３の工程と、
前記鋳型核酸を除去する第４の工程と、
（１）前記伸長型プローブの３’末端を含む端部を、伸長していないプローブに結合させる工程と、(２)前記第１の伸長型プローブを鋳型として、前記伸長していないプローブを伸長させて第２の伸長型プローブとする工程と、(３)前記第２の伸長型プローブから前記第１の伸長型プローブを解離させる工程を繰り返して、前記第１の伸長型プローブと前記第２の伸長型プローブを増幅させ、前記担体上に多数の前記第１の伸長型プローブと前記第２の伸長型プローブを生じさせる第５の工程と、
前記第１の伸長型プローブが結合する担体と、前記第１の伸長型プローブが結合しない担体とを選別する第６の工程を含む核酸分析方法。
【請求項２】
前記第１の工程の前に、前記鋳型核酸の３’末端に第１配列を有するアダプターを導入し、かつ前記鋳型核酸の５’末端に前記第１配列と異なる第２配列を有するアダプターを導入する工程をさらに有し、
１の前記担体に固定される前記複数のプローブは、前記第１配列の相補配列もしくは前記第２配列の相補配列のいずれかを有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
【請求項３】
前記第１の工程の前に、前記鋳型核酸の３’末端に第１配列を有するアダプターを導入し、かつ前記鋳型核酸の５’末端に前記第１配列の相補配列を有するアダプターを導入する工程をさらに有し、
１の前記担体に固定される前記複数のプローブは、前記第１配列の相補配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
【請求項４】
前記第１の工程乃至第４の工程は共通の容器で行い、前記第５の工程は前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器で各々行うことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
【請求項５】
前記第１の工程乃至第５の工程を、前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器で各々行うことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
【請求項６】
前記複数の担体の各々を個別に収めるための容器において、前記反応を行う溶液が共通であることを特徴とする、請求項４または５に記載の核酸分析方法。
【請求項７】
前記第５の工程において、(１) 前記第１の伸長型プローブを鋳型として、同一固相担体上の近接するプローブにＵの字を形成するように相補鎖を伸長させて湾曲形状の第２の伸長型プローブとし、(２) 熱変性により前記湾曲形状をほどいて前記担体上に固定された一本鎖核酸とし、次サイクルの鋳型とする工程を繰り返すことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項８】
前記第１の工程乃至第５の工程において、反応溶液を常時撹拌することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項９】
前記第１の工程乃至第５の工程において、前記複数の担体を鋳型核酸の長さより長い距離を確保して配置することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１０】
複数の核酸試料を同時に分析する方法であって、１種類の固定プローブを表面に固定した１つの固相担体に対して、１分子の鋳型核酸の３’末端を含む端部が前記プローブを介して結合しうるように、複数の前記鋳型核酸を導入する第１の工程と、
前記鋳型核酸を鋳型として、前記固定プローブを伸長させて第１の伸長型プローブとする第２の工程と、
前記第１の伸長型プローブから前記鋳型核酸を解離させる第３の工程と、
前記鋳型核酸を除去する第４の工程と、
（１）前記第１の伸長型プローブの３’末端を含む端部を、反応溶液中に加えられたもう１種類の浮遊プローブに結合させる工程と、(２)前記第１の伸長型プローブを鋳型として、前記浮遊プローブを伸長させて第２の伸長型プローブとする工程と、(３)前記第２の伸長型プローブから前記第１の伸長型プローブを解離させる工程を繰り返して、前記第１の伸長型プローブと前記第２の伸長型プローブを増幅させ、前記担体上に多数の前記第１の伸長型プローブと前記第２の伸長型プローブを生じさせる第５の工程と、
前記第１の伸長型プローブが結合する担体と、前記第１の伸長型プローブが結合しない担体とを選別する第６の工程を含む核酸分析方法。
【請求項１１】
前記第５工程の(３)において、前記第１の伸長型プローブと第２の伸長型プローブからなる２本鎖核酸の末端部分のみを部分的に解離させ１本鎖となった末端部に、前記固定プローブもしくは前記浮遊プローブを相補鎖結合させ、鎖置換能のあるDNAポリメラーゼを用いて鋳型核酸の２本鎖部分を剥がしながら伸長反応を行うことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分析方法。
【請求項１２】
前記反応溶液中に、変性時に粘性が増加あるいはゲル化し、相補鎖結合時に粘性が低下あるいは溶液状態となる物質を共存させ、
前記担体に鋳型核酸を捕獲した後、浮遊プローブをゲル中に分散させた状態で核酸増幅反応を行うことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分析方法。
【請求項１３】
鋳型核酸の５'末端に導入されるプローブ配列に前記アダプターの第１配列および第２配列とは相補的でなくまた同一でもない選別用のアンカー配列を付加した上で、前記第１の工程乃至第５の工程を行い、前記第６の工程において前記アンカー配列に相補的なプローブが結合したカラムを利用し、増幅産物が得られた固相担体のみを選別することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１４】
鋳型核酸の５'末端に導入されるプローブ配列に前記アダプターの第１配列および第２配列とは相補的でなくまた同一でもない第３配列を付加した上で、前記第１の工程乃至第４の工程を行い、前記第３配列に相補的な配列を有するプライマーを使用して、増幅産物でない鋳型核酸の配列解析を行う工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１５】
２本鎖特異的インターカレーターを増幅反応溶液、もしくは増幅反応終了後の固相担体懸濁液に添加し、前記インターカレーター由来の蛍光を発する固相担体のみを前記溶液から検出・回収することにより、増幅産物が得られた固相担体のみを選別することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１６】
１つの固相担体に２つ以上の鋳型核酸に起因した増幅産物が複製されないようにするために、固相担体106個を用いた反応系に対して鋳型核酸分子が103個以下となるよう反応液を調製することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１７】
均一な溶媒からなる溶液中で増幅反応を行うことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項１８】
固相担体がビーズであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００９−７０（Ｐ２００９−７０Ａ）
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６５４５１（Ｐ２００７−１６５４５１）
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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