大豆加工ストリームからＫｕｎｉｔｚトリプシンインヒビタータンパク質を回収する方法
加工ストリームから、少なくとも９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度を有するＫＴＩ生成物を回収し単離する方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、２００９年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２９１，３１２号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は大豆加工ストリームから、精製Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）タンパク質を回収する方法を提供する。具体的には、本開示は、ＫＴＩ生成物をクロマトグラフ分離するステップを含み、ＫＴＩ生成物を単離し除去する１つまたは複数の分離技術を含んでいてもよい方法を提供し、ＫＴＩ生成物は、少なくとも約９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度で表される純度を有する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質分解酵素を阻害するタンパク質は、多数の種子および他の植物貯蔵器官中に高濃度で見られることが多い。インヒビタータンパク質はまた、実質的に全ての動物組織および体液中に見られる。動物および微生物からのタンパク質分解酵素と複合体を形成して阻害する能力のために、これらのタンパク質は、長年にわたって相当数の研究の対象である。阻害物質は、医学と生物学において、タンパク質分解を研究する有益なツールになっている。プロテアーゼインヒビターは、膵臓炎、ショック、および肺気腫などのいくつかの障害に関与するプロテイナーゼの制御におけるそれらの治療的な可能性のために、そして哺乳類の受精を調節する作用物質として特に興味深い。
【０００４】
大豆加工ストリームは、相当量のプロテアーゼインヒビターを含有する。プロテアーゼインヒビターは、少なくともトリプシン、キモトリプシンを阻害し、そして一連の様々な重要代謝機能を制御する、多様な他の重要な膜貫通プロテアーゼを潜在的に阻害することが知られている。プロテアーゼインヒビターの局所投与は、数カ所に局在していてもまたは身体の大きな部分に関わっていてもよい、皮膚炎症の一般的な形態であるアトピー性皮膚炎などの病状において用途がある。プロテアーゼインヒビターの色素除去活性、および紫外線誘発色素沈着を予防するそれらの能力は、生体外および生体内の双方で実証されている（例えば、Ｐａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１６：５８７−５９５［２００１］を参照されたい）。プロテアーゼインヒビターはまた、創傷治癒を促進することが報告されている。例えば分泌型白血球プロテアーゼインヒビターを局所的に塗布すると、組織破壊が逆転し、創傷治癒過程を加速することが実証された。さらにセリンプロテアーゼインヒビターは、紅斑性狼瘡患者において疼痛を軽減させる一助にもなり得る（例えば、米国特許第６，５３７，９６８号明細書を参照されたい）。
【０００５】
天然プロテアーゼインヒビターは、穀類（オート麦、大麦、およびトウモロコシ）、芽キャベツ、タマネギ、ビート根、小麦、シコクビエ、および落花生などの多様な食物に見られる。関心のもたれる供給源は、大豆である。
【０００６】
大豆および他のマメ科植物から、２つの大まかなクラスのプロテアーゼインヒビタースーパーファミリーが同定されており、各クラスはいくつかのイソインヒビターを有する。Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）は、第１のクラスの主要メンバーであり、そのメンバーはおよそ１７０〜２００個のアミノ酸、２０〜２５ｋＤａの分子量を有し、主にトリプシンに対して作用する。Ｋｕｎｉｔｚトリプシンプロテイナーゼ阻害物質は、大抵は一本鎖ポリペプチドであり、４個のシステインが２つのジスルフィド架橋中に連結され、１つの反応部位がジスルフィド架橋によって画定されるループ内に位置する。第２のクラスの阻害物質は、６０〜８５個のアミノ酸を含有し、６〜１０ｋＤａの分子量範囲を有し、より多数のジスルフィド結合を有して、比較的熱安定性であり、独立した結合部位でトリプシンおよびキモトリプシンの双方を阻害する。ボーマン・バークインヒビター（ＢＢＩ）は、このクラスの一例である。大豆中に存在するプロテアーゼインヒビターの平均レベルは、２つの最重要なプロテアーゼインヒビターであるＫＴＩおよびＢＢＩで、それぞれ約１．４％および０．６％である。とりわけこれらの低レベルは、臨床用途のために天然プロテアーゼインヒビターを単離することを非実用的なものとする。
【０００７】
先行技術は、酸抽出もアルコール抽出も、アセトン沈殿もなしに大豆タンパク質源から得られる、高い純度レベルを有するＫＴＩ生成物について、記載していない。当該技術分野で開示される、ＫＴＩ生成物を単離する方法は、以下の特定の参考文献に記載されているが、高度に純粋なＫＴＩ生成物の単離はもたらされていない。Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．３９（５）：８６２−８６６（１９９１）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３０：１６７−１７０（２００３）；Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５７（１５）：７０２２−７０２９（２００９）；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９４（１，２）：１４１−１４３（１９９１）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５４（３）：６０６−６１７（１９８９）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（３）：１０６９−１０８６（２００１）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（２）：２０５−２０９（１９８７）；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ａｎｄ Ｉｋｅｎａｋａ，Ｔ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｉ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），６２（２），１４１−１４９（１９６７）；Ｂｉｒｋ，Ｙ．，Ｔｈｅ Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ｔｒｙｐｓｉｎ−ａｎｄ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ ｓｏｙｂｅａｎｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，２５（２）．１１３−１３１（１９８５）；Ｈｗａｎｇ，Ｄ．，Ｄａｖｉｓ Ｌｉｎ，Ｋ．Ｔ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，Ｆｏａｒｄ，Ｄ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｉａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，４９５，３６９−３８２（１９７７）；Ｆｒａｔｔａｌｉ，Ｖ．，Ｓｏｙｂｅａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ − ＩＩＩ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４４（２），２７４−２８０（１９６９）；Ｋａｓｓｅｌｌ，Ｂ．，Ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｙｂｅａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６６（ｃ），８５３（１９７０）；Ｂｉｒｋ，Ｙ．，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｌｅｇｕｍｅ Ｓｅｅｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５７，６９７；およびＢｉｒｋ，Ｙ．，Ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｙｂｅａｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５８，７００。したがって高純度プロテアーゼインヒビターと変異型、具体的にはＫＴＩの製造に適した方法と組成物に対する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明は、本明細書で開示される方法を通じて、ＫＴＩ生成物を高純度形態で単離する方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、高度にＫＴＩタンパク質に富んだ組成物を生成する新規方法を記載する。特に本発明は、ＫＴＩタンパク質の回収のための基材として適切な精製画分を生成するための、大豆ホエーから様々な他の構成要素を除去する一連の逐次分離操作を通じた、大豆加工ストリーム濃縮について述べる。本明細書の他の箇所でさらに詳述されるように、本発明は、水性大豆ホエーの様々な構成要素を回収するために設計された、１つまたは複数の膜分離（濾過）操作またはクロマトグラフ分離操作を含んでなる方法を通じた、大豆加工ストリームからの精製画分の回収について述べる。大豆加工ストリームの様々な構成要素の除去は、典型的には、その構成要素の除去の前および／または最中に、大豆加工ストリームを濃縮するステップを含む。
【００１０】
典型的には、大豆加工ストリームからの１つまたは複数の不純物（例えば微生物またはミネラル）、１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質（すなわちグリシニンおよびβ−コングリシニン）、１つまたは複数の大豆ホエータンパク質、および／または１つまたは複数の糖類の除去によって、精製画分を調製する。高純度のＫＴＩタンパク質の回収は、希釈により純度を損なう加工ストリームのその他の主要構成要素（例えば貯蔵タンパク質、ミネラル、脂質、微生物、および糖類）を除去しながら、タンパク質の拮抗物質でありおよび／または有害効果がある構成要素（例えば内毒素）の除去を通じて、タンパク質画分を精製することで、同様に総ＫＴＩタンパク質濃度を改善することによって改善される。具体的には、本開示は、少なくとも約９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度で表される純度を有する、ＫＴＩ生成物の単離および除去をもたらす方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法は、最初に、分離膜の片側と接する濾過供給ゾーンに大豆加工ストリームを導入するステップと；流体を膜に通過させて、濾過供給ゾーン内に少なくとも１つの大豆貯蔵タンパク質および少なくとも１つの大豆ホエータンパク質を含んでなる第１の残余分と、透過液ゾーン内に１つまたは複数の糖類、水、および１つまたは複数のミネラルを含んでなる第１の透過液を生成するステップと；第１の残余分またはその一部を第２の分離膜の片側と接する第２の濾過供給ゾーンに導入するステップと；流体を第２の膜に通過させて、第２の濾過供給ゾーン内に１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質を含んでなる第２の残余分と、第２の透過液ゾーン内に水、１つまたは複数の大豆ホエータンパク質、および糖類を含んでなる第２の透過液とを生成するステップと；含有されるイオン交換樹脂を中に含んでなるイオン交換ユニット内に、タンパク質濃縮大豆加工ストリームを導入するステップと；大豆ホエーストリームを分割してイオン交換のための複数の供給材料画分を提供するステップと；複数の供給材料画分をイオン交換ゾーン内に導入するステップと；複数の供給材料画分のそれぞれをイオン交換樹脂と接触させ、イオン交換樹脂に対する親和力によってＫＴＩ生成物を除去するステップと；イオン交換樹脂を溶出媒質と接触させてイオン交換樹脂からＫＴＩ生成物を除去して、溶出ＫＴＩタンパク質画分を形成するステップとを含む。
【００１２】
本開示は、最初に水が大豆ホエー固形分から分離され、微生物を大豆ホエー固形分から分離する技術がそれに続き、タンパク質を大豆ホエー固形分から分離する技術がそれに続き、糖類を大豆ホエー固形分から分離する技術がそれに続き、最後に水を含んでなる精製されたストリームの形成がそれに続く、多様な技術を使用する方法をさらに包含する。本明細書で開示される工程の順序は、本発明の特定の一実施形態を提供するが、本明細書で開示される工程は、任意の順に実施してもよいことに留意すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】加工ストリームから精製大豆ホエータンパク質を回収する方法における、工程０〜４を示す概略工程図である。
【図１Ｂ】加工ストリームから精製大豆ホエータンパク質を回収する方法における、工程５、６、１４、１５、１６、および１７を示す概略工程図である。
【図１Ｃ】加工ストリームから精製大豆ホエータンパク質を回収する方法における工程７〜１３を示す概略工程図である。
【図１Ｄ】水性大豆ホエーストリームから精製ＫＴＩ生成物を回収する方法を示す概略工程図である。
【図２】ＫＴＩのＰｏｒｏｓ ＨＳ５０イオン交換画分のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。
【図３】濃縮ＫＴＩ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４】ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦイオン交換画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図５】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析されたＫＴＩバンドを示す。
【図６】Ｍｉｍｏ６ＨＥ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書に記載されるのは、大豆タンパク質単離物の製造において発生する、（大豆ホエーストリームおよび大豆糖蜜ストリームをはじめとする）多様なマメ科植物加工ストリームから、高度精製ＫＴＩタンパク質および他の生成物を回収する新規プロセスである。例えば本開示の方法は、ＫＴＩタンパク質または他の生成物の回収、または大豆ホエーストリームの様々な構成要素の分離、または双方を提供するように選択され設計された、１つまたは複数の分離技術または方法（例えばクロマトグラフ分離または膜分離）を含んでなる。ＫＴＩタンパク質、および大豆ホエーストリームの１つまたは複数の他の構成要素（例えばオリゴ糖類をはじめとする様々な糖類）の回収は、複数の分離技術（例えば膜、クロマトグラフ、沈殿、遠心分離、または濾過）を利用してもよい。特定の分離技術は、加工ストリームのその他の構成要素から分離することで回収される、所望の構成要素によって決まる。
【００１５】
例えば精製ＫＴＩ画分は、典型的には、大豆ホエーから、最初に１つまたは複数の不純物（例えば微生物またはミネラル）を除去し、続いて１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質（すなわちグリシニンおよびβ−コングリシニン）をはじめとする追加的不純物を除去し、続いて１つまたは複数の大豆ホエータンパク質（例えばＢＢＩおよび他の非ＫＴＩタンパク質またはペプチドをはじめとする）を除去し、および／または続いて糖類をはじめとする１つまたは複数の追加的不純物を除去することで調製される。高純度形態のＫＴＩタンパク質の回収は、希釈により純度を損なうホエーストリームのその他の主要構成要素（例えば貯蔵タンパク質、ミネラル、および糖類）を除去しながら、タンパク質の拮抗物質でありおよび／または有害効果がある構成要素（例えば内毒素）の除去を通じて、タンパク質画分を精製することで、同様に純度を改善することによって改善される。大豆ホエーの様々な構成要素除去は、典型的には、大豆ホエー構成要素を除去する前および／または最中に、大豆ホエーを濃縮するステップを含む。本発明の方法はまた、大量の水性廃棄物を処理することから生じる汚染を低下させる。
【００１６】
貯蔵タンパク質、糖類、ミネラル、およびその他の不純物の除去は、所望のＫＴＩタンパク質に富み、拮抗物質または毒素であることもでき、さもなければ有害効果を及ぼすこともできる不純物を含まない画分を生じる。例えば典型的には、大豆貯蔵タンパク質富化画分を１つまたは複数の大豆ホエータンパク質に富んだ画分と共に回収することもできる。もう１種の糖類（例えばオリゴ糖類および／または多糖類）に富んだ画分もまた、典型的に調製される。したがって本方法は、ＫＴＩタンパク質の回収用基材として適した画分を提供し、水性大豆ホエーからの他の有用な生成物の回収のために使用し得る他の画分もまた提供する。例えば大豆ホエーストリームから糖類および／またはミネラルを除去することで、それから糖類をさらに分離し得る有用な画分が生成され、ひいては次の追加的な有用な画分が生じる。濃縮糖および（クエン酸を含んでもよい）ミネラル画分、および行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として再循環されてもよい比較的純粋な水性画分。このようにして生成されたプロセス水は、本方法を実施する上で特に有用であることもできる。したがって本方法のさらなる利点は、従来の単離物調製法と比較して、減少したプロセス水の所要量であることもできる。
【００１７】
本開示の方法は、少なくとも２つの点で、大豆タンパク質単離物および濃縮物を製造する従来の方法と比較して利点を提供する。言及されたように、大豆タンパク質材料を製造する従来の方法は、典型的には大豆ホエーストリーム（例えば水性大豆ホエーまたは大豆糖蜜）を廃棄する。したがって本開示の方法によって回収される生成物は、付加産物に相当し、従来の大豆タンパク質単離物および大豆タンパク質濃縮物製造との関連で、目下実現されていない収入源に相当する。さらに商品性のある生成物を回収する大豆ホエーストリームまたは大豆糖蜜の処理は、好適には、大豆ホエーストリームまたは大豆糖蜜の処理および廃棄に付随するコストを低減させる。例えば本明細書の他の箇所で詳述する本発明の様々な方法は、比較的純粋な加工ストリームを提供し、それは様々な他の工程で容易に利用され、または行うとしても最小の処理で廃棄されてもよく、それによって方法の環境影響を低下させる。本開示の方法に関連した特定のコストは存在するが、単離される付加産物の利益および廃棄物処理の最小化は、あらゆる付加費用を代償すると考えられる。
【００１８】
Ａ．酸可溶性タンパク質
大豆タンパク質単離物は、典型的には、大豆貯蔵タンパク質の等電点（例えばｐＨ約４．５）において、脱脂大豆フレークまたは大豆粉の水性抽出物から沈殿する。したがって大豆タンパク質単離物は、一般に、酸性液体媒質中で可溶性でないタンパク質を含む。同様に、２番目に最も精製された大豆タンパク質材料である、大豆タンパク質濃縮物のタンパク質は、同じく酸性液体媒質中で一般に可溶性でない。しかし本開示の方法によって回収される大豆ホエータンパク質は、一般に酸可溶性であり、すなわちそれらは酸性液体媒質中で可溶性である。
【００１９】
例えば本開示は、水性大豆ホエーに由来して、周囲条件（例えば約２５℃の温度）において、比較的広範なｐＨの水性（典型的には酸性）媒質（例えばｐＨ約２〜約１０、約２〜約７、または約２〜約６を有する水性媒質）中で有利な溶解度を示す、大豆タンパク質組成物を提供する。典型的には大豆タンパク質組成物の溶解度は、１リットル当たり少なくとも約１０グラム（ｇ／Ｌ）であり、より典型的には少なくとも約１５ｇ／Ｌであり、なおもより典型的には少なくとも約２０ｇ／Ｌである。（添付の特許請求に含まれる）ｐＨ範囲にわたる溶解度への言及は、特定溶解度が、特定ｐＨ範囲内に入るいずれかのそして全てのｐＨ値で達成されることを示唆するものと理解される。例えば約２〜約１０のｐＨ範囲にわたる少なくとも約１０ｇ／Ｌの溶解度への言及は、特定溶解度が、３、４、５、６などのｐＨで達成されることを示唆する。
【００２０】
本開示の方法による酸可溶性大豆タンパク質の回収は、当該技術分野における顕著な進歩に相当する。本明細書で言及されるように、典型的には廃棄される大豆ホエーストリームから、酸可溶性タンパク質が回収される。
【００２１】
Ｂ．Ｋｕｎｉｔｚトリプシンプロテアーゼインヒビター
本明細書で考察するように、例えば大豆ホエーストリームおよび大豆糖蜜ストリームをはじめとする大豆加工ストリームは、Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）タンパク質を含有する。このプロテアーゼインヒビターは、少なくともトリプシンを阻害し、そして一連の重要代謝機能を調節する多様な他の重要プロテアーゼを潜在的に阻害することが知られている。
【００２２】
本実施形態に従って単離されるＫＴＩタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなってもよい。一実施形態では、ＫＴＩタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一であり、より好適には配列番号１と少なくとも８０％同一であり、なおもより好ましくは配列番号１と少なくとも９０％同一であり、最も好適には配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【００２３】
本実施形態の別の態様では、アミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である。
【００２４】
本発明の特定の態様では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、アミノ酸配列を比較することで判定される。本発明の特定の態様では、配列同一性は、アミノ酸配列と、その保存アミノ酸置換とを比較することで判定され得る。本発明の別の態様では、本発明のタンパク質は、１つまたは複数の保存的置換を有し得る。本発明の別の態様では、本発明のタンパク質は、１つまたは複数の非保存的置換を有し得る。
【００２５】
天然アミノ酸としては、例えばアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）が挙げられる。
【００２６】
保存的および非保存的アミノ酸置換は当業者に知られており、例えば酸性アミノ酸で別の酸性アミノ酸を置き換えることは、保存的置換と見なすこともできるのに対し、塩基性アミノ酸で酸性アミノ酸を置き換えることは、非保存的置換と見なすこともできる。同様に、極性アミノ酸で別の極性アミノ酸を置き換えることは、保存的置換と見なすこともできるのに対し、非極性アミノ酸で極性アミノ酸を置き換えることは、非保存的置換と見なすこともできる。アミノ酸は一般に、（置換が保存的または非保存的かどうかを判定する指針として使用し得る）以下のカテゴリーに分けられる。（１）極性／親水性：Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｃ、およびＹ；（２）非極性／疎水性：Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、およびＭ；（３）酸性：Ｄ、Ｅ、およびＣ；（４）塩基性：Ｋ、Ｒ、およびＨ；（５）芳香族：Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＨ；および（６）脂肪族：Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＰ。
【００２７】
１つまたは複数のアミノ酸配列が配列番号１と同一でない本発明の特定の態様では、このような１つまたは複数のアミノ酸配列もまた、トリプシン活性を阻害することが知られているＫＴＩタンパク質として機能する。これらの機能を確認する方法は本明細書に記載され、当業者に知られている。
【００２８】
組成物が、配列番号１と同一でない１つまたは複数のアミノ酸配列を含んでなる本発明の他の態様では、このような１つまたは複数のアミノ酸配列もまた、トリプシンを阻害することが知られているＫＴＩタンパク質として機能する。これらの機能を確認する方法は本明細書に記載され、当業者に知られている。
【００２９】
ＫＴＩタンパク質は、１７０〜２００個のアミノ酸残基と、およそ２個のジスルフィド架橋からなる。ＫＴＩタンパク質の一次構造は１９７３年より知られている（Ｋｏｉｄｅ，Ｔ．，ａｎｄ Ｉｋｅｎａｋａ，Ｔ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．３．Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２，４１７，１９７３参照）。
【００３０】
本開示のＫＴＩ生成物の純度は、他のＫＴＩ生成物と比較して、かつて達成されたことのないレベルの純度に相当する。ＫＴＩ画分の純度は、総ＫＴＩタンパク質濃度、比活性（トリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質で測定される）、およびＫＴＩの拮抗物質として機能する構成要素、毒素、またはＫＴＩ単位量当たりの効率を単に希釈する以上に有害効果を及ぼす他の構成要素の不在の関数である。一般に、本開示のＫＴＩ生成物の総ＫＴＩタンパク質濃度は、少なくとも約７０重量％、または少なくとも約８０重量％である。典型的には、本開示のＫＴＩ生成物の総ＫＴＩタンパク質濃度は、少なくとも約９０重量％、好適には少なくとも約９５重量％、およびより好適には少なくとも約９９重量％である。
【００３１】
「純粋」モノマータンパク質は、一次元または二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動後に単一バンドを生じ、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはイオン交換カラムから単一の対称的吸光度ピークとして溶出され、単一セットの質量分光測定、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはＷ吸光度スペクトルシグナルを生じ、該当する場合は汚染酵素活性を含まない。絶対純度は確立され得ないので、慣例的に単純な純度基準、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、単一バンドを超えるタンパク質が検出できないことが使用される。（Ｍｏｈａｎ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１，３０７−３２３（１９９２）を参照されたい）。図３は、一次元ゲル電気泳動に続く本発明のＫＴＩタンパク質を示す。図３が示すように、本発明のＫＴＩタンパク質は、等電点が異なる２１ｋＤａの分子量標準に対応する単一バンドとして示される。
【００３２】
ＫＴＩ画分の純度は、総ＫＴＩタンパク質濃度、比活性（トリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質で測定される）、およびＫＴＩの拮抗物質として機能する構成要素、毒素、またはＫＴＩ単位量当たりの効率を単に希釈する以上に有害効果を及ぼす他の構成要素の不在の関数である。一般に、本開示のＫＴＩ生成物の総ＫＴＩタンパク質濃度は、少なくとも約７０重量％、または少なくとも約８０重量％である。典型的には、本開示のＫＴＩ生成物の総ＫＴＩタンパク質濃度は、少なくとも約９０重量％、好適には少なくとも約９５重量％、およびより好適には少なくとも約９９重量％である。
【００３３】
ＫＴＩ純度と共に、本開示のＫＴＩ生成物の総タンパク質含量は有利であり、および／または技術分野の進歩に相当する。本開示の生成物のＫＴＩタンパク質含量は、例えばＯｈｎｉｓｈｉ，Ｓ．Ｔ．，ａｎｄ Ｂａｒｒ，Ｊ．Ｋ．，Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｕｒｅｔ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８６，１９３（１９７８）に記載されるＬｏｗｒｙ法をはじめとする、当該技術分野で知られている従来の方法によって測定することもできる。一般に、本開示のＫＴＩ生成物の総タンパク含量は、少なくとも約６０重量％（乾燥重量基準）、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、または少なくとも約８５重量％である。典型的には、本開示のＫＴＩ生成物の総タンパク量含量は、少なくとも約９０重量％、好適には少なくとも約９５重量％、より好適には少なくとも約９９重量％である。
【００３４】
ＫＴＩタンパク質はトリプシンのみを阻害することが知られている一方で、タンパク質含有組成物の他の構成要素（例えばＢＢＩタンパク質）は、トリプシンとキモトリプシンの双方を阻害することが知られている。したがって本発明のトリプシン阻害調製品中のキモトリプシン阻害物質活性の不在は、ＫＴＩタンパク質の存在を示唆する。
【００３５】
同様に、本開示のＫＴＩ生成物のトリプシン阻害物質活性（トリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質、またはＴＩＵ／ｇタンパク質を単位として表される）は、例えばｐＨ８．２および３７℃で、ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン（ＢＡＰＡニトロアニリン）を基質として、その中で１ＴＩＵが１ｍｇのトリプシンを阻害し得る基質量と定義され、１トリプシン単位が１０分間あたり０．０１９のΔＡ４１０に等しい方法をはじめとする、当該技術分野で知られている従来の方法によって測定されてもよい。概して本開示のＫＴＩ生成物のトリプシン阻害物質活性は、少なくとも約３００ＴＩＵ／ｇタンパク質、典型的には少なくとも約５００ＴＩＵ／ｇタンパク質、より典型的には少なくとも約９５０ＴＩＵ／ｇタンパク質、およびなおもより典型的には、少なくとも約１５００ＴＩＵ／ｇタンパク質である。
【００３６】
ＫＴＩ生成物が、目下、適していると考えられる様々な用途は、内毒素含量が比較的低いことを必要とする。例えば様々な治療用途は、ＫＴＩ生成物が、製薬等級材料に適用される規制を満たすことを必要とする。したがって様々な好ましい態様では、ＫＴＩ生成物の総内毒素含量は、好適には約１．５ＥＵ／ｇタンパク質以下、より好適には約１ＥＵ／ｇタンパク質以下、さらにより好適には約０．５ＥＵ／ｇタンパク質以下、なおもより好ましくは、約０．２５ＥＵ／ｇタンパク質以下である。例えばこのような様々な態様に従って、ＫＴＩ生成物の総内毒素含量は、典型的には約０．１〜約１．５ＥＵ／ｇタンパク質、より典型的には約０．１〜約１．０ＥＵ／ｇタンパク質、なおもより典型的には約０．１〜約０．５ＥＵ／ｇタンパク質（例えば約０．１〜約０．２５ＥＵ／ｇタンパク質）である。さらにまたは代案としては、本開示のＫＴＩ生成物の総内毒素含量は、１グラムのタンパク質当たり約５．０内毒素単位（ＥＵ／ｇタンパク質）以下であり、または約２．５ＥＵ／ｇタンパク質以下である。例えば様々な態様で、総内毒素含量は、約０．１〜約５．０ＥＵ／ｇタンパク質、または約０．１〜約２．５ＥＵ／ｇタンパク質である。
【００３７】
本開示のＫＴＩ生成物は、上で特定される特性の１つ、組み合わせ、または全部を示してもよいものと理解される。例えば、本開示のＫＴＩ生成物は、特定されるＫＴＩ純度および総タンパク量含量を示してもよい。ＫＴＩ生成物はまた、特定されるＫＴＩ純度、トリプシン阻害物質活性、および本明細書で開示される配列を示してもよい。さらなる例として、ＫＴＩ生成物は、特定されるＫＴＩタンパク質濃度および総内毒素含量を示してもよい。これらの態様で、そしてなおも別の態様で、本開示のＫＴＩ生成物は、特定される総大豆タンパク質濃度およびトリプシン阻害物質活性を示してもよい。さらなる例として、本開示のＫＴＩ生成物は、特定される総大豆タンパク質濃度および総内毒素含量を示してもよい。これらのＫＴＩ生成物の諸特性の組み合わせは例示的であり、この一覧が網羅的であることは意図されない。すなわち本開示に従って、ＫＴＩ生成物は、上で特定される何れかの範囲内の上で特定される何れかの値で、上記の諸特性のあらゆる組み合わせを示してもよい。
【００３８】
本発明のＫＴＩは、天然植物ベースのマトリックスからＫＴＩを分離、単離、または精製できるようにする、あらゆる原料またはあらゆるプロセスから入手し得る。非限定的例として、天然植物ベースのマトリックスは、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ ｌｅａｆ ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スメイルメディックシード（ｓｎａｉｌ ｍｅｄｉｃ ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロファ属、緑藻類、およびそれらの組み合わせをはじめとする、マメ科植物に由来し得る。本発明の特定の態様では、ＫＴＩは様々な加工ストリーム中で大豆から得られる。様々な大豆加工ストリームとしては、例えば水性大豆抽出物ストリーム（脱脂大豆材料からなど、その中で大豆ストリームタンパク質の構成要素が可溶性形態であるあらゆるストリーム）、水性豆乳抽出物ストリーム（その中で大豆ストリームタンパク質の構成要素が可溶性形態であるホールまたは部分的脱脂大豆材料からのあらゆるストリーム）、水性大豆ホエーストリーム（貯蔵タンパク質の沈殿または塩析から得られるあらゆるホエーストリーム；沈殿法としては熱ならびに化学処理が挙げられる）、水性大豆糖蜜ストリーム（水性大豆ホエーストリームからの水分除去によって発生するあらゆるストリーム）、水性大豆タンパク質濃縮物大豆糖蜜ストリーム（大豆タンパク質濃縮工程からの可溶性糖類のアルコール抽出からのあらゆるストリーム）、水性大豆透過液ストリーム（より小さな分子量タンパク質が膜を通過する、異なる分子量タンパク質画分の分離から得られるあらゆるストリーム）、および水性豆腐ホエーストリーム（豆腐凝固工程から得られるあらゆるホエーストリームを含む）が挙げられる。本発明の方法によって単離されるＫＴＩ生成物の量は、１グラム程度にわずかであってもよく（実験室規模単離）、または数メートルトンであってもよい（工業的または大規模単離）。
【００３９】
Ｃ．水性ホエーストリーム
大豆加工ストリームの一種である水性ホエーストリームおよび糖蜜ストリームは、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程から発生する。ホールマメ科植物または油糧種子は、多様な適切な植物に由来してもよい。非限定的例として、適切な植物としては、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ ｌｅａｆ ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スネイルメディックシード（ｓｎａｉｌ ｍｅｄｉｃ ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロファ属、緑藻類、およびそれらの組み合わせをはじめとするマメ科植物が挙げられる。一実施形態では、マメ科植物は大豆であり、大豆の精製過程から発生する水性ホエーストリームは、水性大豆ホエーストリームである。
【００４０】
大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されており、典型的には廃棄物として廃棄される。特に水性大豆ホエーストリームは、典型的には約１０重量％未満、典型的には約７．５重量％未満、なおもより典型的には約５重量％未満の総固形分を有する。例えば様々な態様で、水性大豆ホエーストリームの固形分は約０．５〜約１０重量％、約１重量％〜約４重量％、または約１〜約３重量％（例えば約２重量％）である。したがって工業的大豆タンパク質単離物製造中に、処理または廃棄しなくてはならない顕著な体積の廃水が発生する。
【００４１】
大豆ホエーストリームは、典型的には、出発原料大豆の最初の大豆タンパク質含量のかなりの部分を含有する。本明細書の用法では「大豆タンパク質」という用語は、概して、大豆に天然のあらゆるそして全てのタンパク質を指す。天然大豆タンパク質は、概して、親水性シェルで取り囲まれる疎水性コアを有する球形タンパク質である。例えばグリシニンやβ−コングリシニンなどの貯蔵タンパク質をはじめとする、多数の大豆タンパク質が同定されている。大豆タンパク質は同様に、上記のＫＴＩタンパク質などのプロテアーゼインヒビターを含む。大豆タンパク質はまた、レクチン、リポキシゲナーゼ、β−アミラーゼ、およびルナシンなどの赤血球凝集素も含む。大豆植物は、形質転換されて、常態では大豆植物によって発現されない他のタンパク質を産生しうることに留意されたい。本明細書の「大豆タンパク質」への言及は、このようにして生成されたタンパク質を同様に考察するものと理解される。
【００４２】
乾燥重量基準で、大豆タンパク質は、大豆ホエーストリームの少なくとも約１０重量％、少なくとも約１５重量％、または少なくとも約２０重量％（乾燥重量基準）を構成する。典型的には、大豆タンパク質は、大豆ホエーストリームの約１０〜約４０重量％、または約２０重量％〜約３０重量％（乾燥重量基準）を構成する。大豆タンパク質単離物は、典型的には、大豆の貯蔵タンパク質のかなりの部分を含有する。しかし単離沈殿後に残留する大豆ホエーストリームも、同様に１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質を含有する。
【００４３】
様々な大豆タンパク質に加えて、水性大豆ホエーストリームは、同様に１つまたは複数の炭水化物（すなわち糖類）を含んでなる。概して、糖類は大豆ホエーストリームの少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４５重量％を（乾燥重量基準）を構成する。典型的には、糖類は大豆ホエーストリームの約２５％〜約７５％、より典型的には約３５％〜約６５％、なおもより典型的には、約４０％〜約６０重量％（乾燥重量基準）を構成する。
【００４４】
大豆ホエーストリームの糖類は、概して１つまたは複数の単糖類、および／または１つまたは複数のオリゴ糖類または多糖類を含む。例えば様々な態様で、大豆ホエーストリームは、グルコース、果糖、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される単糖類を含んでなる。典型的には単糖類は大豆ホエーストリーム（乾燥重量基準）の約０．５％〜約１０重量％、より典型的には約１％〜約５重量％を構成する。さらにこれらの態様および様々な他の態様に従って、大豆ホエーストリームは、スクロース、ラフィノース、スタキオース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるオリゴ糖類を含んでなる。典型的にはオリゴ糖類は、大豆ホエーストリームの約３０％〜約６０％、より典型的には、約４０％〜約５０重量％（乾燥重量基準）を構成する。
【００４５】
水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、例えば様々なミネラル、フィチン酸、クエン酸、およびビタミンをはじめとする多様な構成要素を含む、灰画分を含んでなる。大豆ホエーストリーム中に典型的に存在するミネラルとしては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン、マグネシウム、塩化物、鉄、マンガン、亜鉛、銅、およびそれらの組み合わせが挙げられる。大豆ホエーストリーム中に存在するビタミンとしては、例えばチアミンおよびリボフラビンが挙げられる。その正確な組成にかかわらず、灰画分は、典型的には大豆ホエーストリームの約５％〜約３０％、より典型的には約１０％〜約２５重量％（乾燥重量基準）を構成する。
【００４６】
水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、概して大豆ホエーストリームの約０．１％〜約５重量％（乾燥重量基準）を構成する、脂肪画分を含んでなる。本発明の特定の態様では、脂肪含量は酸加水分解によって測定され、大豆ホエーストリームの約３重量％（乾燥重量基準）である。
【００４７】
上の構成要素に加えて、水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、例えば様々な細菌、カビ、および酵母をはじめとする、１つまたは複数の微生物を含んでなる。これらの構成要素の比率は、典型的には、ミリリットル当たり約１００〜約１×１０9コロニー形成単位（ＣＦＵ）で変動する。本明細書の他の箇所で詳述されるように、様々な態様で、タンパク質の回収および／または単離に先だって、水性大豆ホエーストリームを処理してこれらの構成要素を除去する。
【００４８】
言及されたように、大豆タンパク質単離物の従来の製造は、典型的には大豆タンパク質単離物の単離後に残留する、水性大豆ホエーストリームの廃棄を含む。本開示に従って、１つまたは複数のタンパク質および様々な他の構成要素（例えば糖類およびミネラル）の回収は、比較的純粋な水性ホエーストリームをもたらす。タンパク質および１つまたは複数の構成要素が除去されていない従来の大豆ホエーストリームは、概して廃棄および／または再利用に先だって処理が必要である。本開示の様々な態様に従って、水性ホエーストリームは、行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として利用されてもよい。例えば水性ホエーストリームは、本開示の１つまたは複数の濾過（例えば透析濾過）操作で使用されてもよい。
【００４９】
大豆糖蜜ストリームは追加的タイプの大豆加工ストリームであることから、本明細書に記載される方法は、大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリームからのＫＴＩタンパク質の回収に加えて、同様に、大豆タンパク質濃縮物の製造において発生する大豆糖蜜ストリームの１つまたは複数の構成要素の回収に適するものと理解される。
【００５０】
Ｄ．ＫＴＩタンパク質の回収
本明細書に記載される方法は、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程から発生する水性ホエーストリーム中に存在する、精製ＫＴＩタンパク質の回収および単離を対象とする。上で考察したように、ホールマメ科植物または油糧種子は、多様な適切な植物に由来してもよい。非限定的例として、適切な植物としては、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦，オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ ｌｅａｆ ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スネイルメディックシード（ｓｎａｉｌ ｍｅｄｉｃ ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロファ、緑藻類、およびそれらの混合物をはじめとするマメ科植物が挙げられる。一実施形態では、マメ科植物は大豆であり、大豆精製過程から発生する水性ホエーストリームは、水性大豆ホエーストリームである。
【００５１】
様々な態様で、本開示は大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリーム中に存在する、ＫＴＩタンパク質を回収および単離する方法を提供する。本発明の方法が、大豆ホエーまたは大豆糖蜜ストリームに限定されるものではなく、多種多様なマメ科植物加工ストリームから、タンパク質および様々な他の構成要素を回収するのに使用されてもよいことに留意すべきである。様々な態様で、高比率のＫＴＩタンパク質を含んでなる画分が、大豆ホエーストリームから回収される。
【００５２】
本開示の方法によって処理された大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されている。ＫＴＩタンパク質の回収および／または単離を促進するために、ホエーストリームは好適には、方法の初期段階で濃縮される。大豆ホエーストリームを濃縮することは、ホエーストリームからのＫＴＩタンパク質の回収および分離を助ける。例えば本開示の好ましい実施形態では、ＫＴＩタンパク質の回収に先だって、水性大豆ホエーまたはその画分を分離膜に接触させ、水性大豆ホエーを含んでなる残余分と、水を含んでなる透過液とを形成することで、水性大豆ホエーから水を除去する。本開示の別の実施形態では、当該技術分野で知られているあらゆる方法を通じて、例えば蒸発によって、水を大豆ホエーから除去してもよい。
【００５３】
ＫＴＩタンパク質の回収と共に、本開示の方法は、典型的には、大豆ホエーストリーム中に存在する糖類からタンパク質を分離する。場合により、本開示の方法は、大豆ホエーストリームの糖類を１つまたは複数の画分（例えば単糖類に富む画分および／またはオリゴ糖類に富む画分）に分離するように、構成され制御されていてもよい。これは多段階で実施して、タンパク質から異なる糖類を分離してもよい。大豆ホエーストリームからの糖類の回収は、このようにしてさらなる生成流を提供する。言及されたように、糖の除去は、典型的には、それから糖類を分離し得る画分を生成し、濃縮糖画分、および行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として再循環されてもよい比較的純粋な水性画分の双方が生じる。
【００５４】
糖類を除去する残余分の処理に続き、残余分をさらに処理して追加的構成要素を除去する。言及されたように、本開示によって処理されてもよい様々な大豆ホエーストリームは、１つまたは複数のミネラル（例えばリンおよびカルシウム）を含む。１つまたは複数のミネラルの存在は、例えば膜の汚損と、回収を所望する構成要素（すなわちＫＴＩタンパク質）からの分離の困難さによって、後処理過程に難題をもたらすこともあることが観察されている。これらの所望の構成要素の回収に加えて、概して大豆ホエーからのミネラルの除去は、目下、純度がより高いことを特徴とするＫＴＩ生成物の回収にも寄与すると考えられている。本明細書の他の箇所で詳述されるように、大豆ホエーからのミネラル除去は、概して、例えば沈殿および遠心分離をはじめとする、当該技術分野で知られている方法に従って進行させてもよい。フィチン酸が、典型的には、本方法によって処理された水性大豆ホエーストリーム中に存在するので、カルシウムおよびマグネシウムなどのミネラルは、典型的にはフィチン酸カルシウムおよびフィチン酸マグネシウムの形態で回収される。除去される他のミネラルとしては、例えばナトリウム、カリウム、亜鉛、鉄、マンガン、および銅もまた挙げられる。
【００５５】
本開示は、大豆タンパク質単離物の製造において発生する、水性大豆ホエーストリームからのＫＴＩタンパク質の回収に適した多様な方法を包含する。概して、本開示の方法は、水性大豆ホエーストリーム特定の構成要素を分離するように設計され設定された１つまたは複数の操作を含み、それによってホエーストリームを濃縮し、精製ＫＴＩタンパク質をそれから回収できるようにする。
【００５６】
概して、本開示に従って、例えば以下をはじめとする、当該技術分野で良く知られている多様な分離または精製技術の何れかを利用して、水性大豆ホエー中に見られる様々な妨害性構成要素を除去し、それから精製ＫＴＩタンパク質を単離してもよい。膜分離技術（例えば限外濾過、精密濾過、ナノ濾過などの濾過、および／または逆浸透）、クロマトグラフ分離技術（例えばイオン交換クロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、および例えばアニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーをはじめとする親和性クロマトグラフィー、模擬移動床クロマトグラフィー、膨張床吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および／または混合床イオン交換）、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、およびそれらの組み合わせ。濾過用途では、濾過媒質の透過度が、サンプルの化学、分子または静電諸特性によって影響され得るが、様々な構成要素分離の主要原理は分子サイズである。本明細書の他の箇所で詳述されるように（例えば下の図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄへの言及）、本開示の方法は、典型的には、除去するホエーストリームの特定構成要素次第で、１つを超えるタイプの分離膜を利用する。例えば方法の一工程は限外濾過分離膜を利用し、ナノ濾過分離膜を用いる１つまたは複数の工程がそれに続いてもよい。
【００５７】
不溶性固形物の除去の特定の態様では、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、およびそれらの組み合わせを使用してもよい。これらの方法によって除去される不溶性固形物は、典型的には２０μｍを超える。
【００５８】
精密濾過は、精密濾過膜を使用することで、固体粒子を流体から分離する方法である。適切な精密濾過膜は、例えばポリスルホン、変性ポリスルホン、セラミック、およびステンレス鋼をはじめとする当該技術分野で知られている適切な材料から構成される。精密濾過膜は、典型的には、約０．１ミクロン（μｍ）〜約２０μｍの範囲の孔径を有する。特定の態様では、精密濾過膜は約０．２μｍ〜約２μｍにわたる孔径を有する。
【００５９】
限外濾過は精密濾過と類似するが、分離膜の孔径の点で異なる。限外濾過膜は、典型的には、より低い分子量を有する分子から、（例えばタンパク質をはじめとする）高分子量を有する分子を分離するのに使用される。適切な限外濾過膜は、典型的には、例えばポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニリデンフッ化物（ＰＶＤＦ）、再生セルロース（ＲＣ）、セラミック、ステンレス鋼、または薄膜複合材などの当該技術分野で知られている適切な材料から構成される。限外濾過膜は、典型的には約１〜約３００キロダルトン（ｋＤａ）または約５〜約５０ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する。さらにまたは代案としては、適切な限外濾過膜は、約０．００２μｍ〜約０．５μｍの孔径を有してもよい。
【００６０】
ナノ濾過を使用して、流体から小分子が除去される。適切なナノ濾過膜は、典型的には、当該技術分野で知られている適切な材料（例えばポリエステル上のポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セラミック、およびポリアミド−タイプの薄膜複合材）から構成され、典型的には約０．１〜約５ｋＤａまたは約１〜約４ｋＤａのＭＷＣＯを有する。さらにまたは代案としては、適切なナノ濾過膜は、約０．０００９μｍ〜約０．００９μｍの孔径を有してもよい。
【００６１】
逆浸透（または超濾過）は、典型的には糖類の濃縮のために使用される。適切な逆浸透膜としては、概して当該技術分野で知られているもの（例えば孔径が０．５ｎｍ未満の膜）が挙げられる。
【００６２】
本発明の濾過工程で利用される分離膜は、単独でまたは組み合わせで、当該技術分野で知られている、１つまたは複数の立体配置に従って配置されもよい。例えば膜は、その中で（任意の分離スクリーン層と共に）膜層が共に組み合わされた、平板、またはカセットモジュールの形態に構成されてもよい。水性大豆ホエーは、概して重なりの一端の交互の溝内に導入され、流体は膜を通過して、１つまたは複数の濾液または透過液溝に入る。分離膜はまた、その中で膜の交互の層が中空の中核周囲に巻かれる、らせん巻きモジュールに配列されてもよい。水性大豆ホエーがモジュールの一端に導入される一方で、流体は膜の交互の層を通過して、モジュールのコア内に向かう。さらなる例として、分離膜は、比較的細い膜管束を含んでなる中空繊維モジュールに配列されてもよい。水性大豆ホエーがモジュール内に導入され、流体は、モジュールを通過する大豆ホエー流を横断する膜管束を通過する。適切な膜配置は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，９４６，０７５号明細書に記載される。
【００６３】
本発明の濾過工程は、本明細書でさらに詳しく述べるように、正流（垂線流）濾過または接線流（十字流）濾過を利用してもよい。正流または垂線流濾過では、流体（すなわち水性大豆ホエー）は、そのまま分離膜に向かって運ばれる。代案としては、接線流または十字流濾過では、流体（すなわち水性大豆ホエー）は、分離膜表面に沿って接線方向に運ばれてもよい。接線流または十字流濾過の１つの利点は、水性大豆ホエー流によって膜上に接線方向に及ぼされる摩擦または掃引力が、典型的には、流動速度を保つのを助けることである。したがって本開示の方法の様々な態様において、１つまたは複数のステップ、およびそれらの組み合わせは、十字流濾過として操作される。適切な十字流フィルターとしては、米国特許第６，９４６，０７５号明細書に記載されるものをはじめとする、概して当該技術分野で知られているものが挙げられる。液体通過は、適切には、正流および／または接線（すなわち十字）流に従って進行してもよいものと理解される。図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄに示される実施形態、およびその他の態様との関連で、本明細書の他の箇所で詳述される他の膜分離ユニットを通る液体の通過は、これらの機序のどちらかまたは双方に従って進行してもよいものとさらに理解される。
【００６４】
本発明によって記載される方法は、大豆ホエーストリームから様々な構成物を逐次除去し、またはＫＴＩ生成物を回収または単離する、適切な分離操作または操作の組み合わせの選択を伴い、ＫＴＩ生成物は、当該技術分野でかつて達成されたことのない純度レベルを有する。概して、および本明細書の他の箇所で詳述されるように、ＫＴＩタンパク質を回収する方法は、膜分離と（例えばイオン交換）クロマトグラフ分離操作の組み合わせを利用する。
【００６５】
本明細書の他の箇所で言及されるように、本開示の方法によって処理された水性大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されている。様々な態様で、水性大豆ホエーは、標的とされる個々のタンパク質の回収に先だって、水分除去により少なくとも約２（例えば約３または約６）の濃縮係数に濃縮される。
【００６６】
ＫＴＩタンパク質を回収する他の方法と比較して、模擬移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーによるＫＴＩタンパク質の回収は、概して、少なくともある程度は水性大豆ホエーの複数サンプル処理への適応性に起因する、コスト低下、処理能力、および／または順応性の利点もまた提供してもよい。
【００６７】
大豆ホエーストリームの１つまたは複数の構成要素が、ＫＴＩタンパク質の回収を妨げることもあることが観察されている。例えば大豆タンパク質単離物の製造中に、典型的にはシリコーンであるケイ素化合物が、通常、Ｈｙｄｒｉｔｅ ＣｈｅｍｉｃａｌまたはＥｍｅｒａｌｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓから市販されるものなどのケイ素含有化合物の形態で、脱泡剤として導入されることが多い。正確な起源を問わず、有機ケイ素化合物は、典型的には、ケイ素含量を基準にして約１５百万分率（ｐｐｍ）まで、約１０ｐｐｍまで、または約５ｐｐｍまでの濃度で、大豆ホエーストリーム中に存在する。有機ケイ素化合物の存在は大豆ホエーストリームのＫＴＩタンパク質の回収を妨げることもあるので、概して望まれない。
【００６８】
したがって本明細書の他の箇所で詳述されるように、ＫＴＩタンパク質の回収および分離処理に先だって、様々な態様で、大豆ホエーストリームからシリコーンおよび／または他の有機ケイ素化合物が除去される。好適には、ケイ素化合物は、本明細書でさらに詳述するように、大豆ホエーが痕跡量以下のレベルの有機ケイ素を含有する程度まで、除去される。さらにまたは代案としては、水性大豆ホエーは、水性大豆ホエーの所望の構成要素の回収を妨げることもあり、および／または方法の最終回収生成物中で望まれない、１つまたは複数の微生物を含むこともある。
【００６９】
これらの妨害性構成要素を除去するために、ケイ素脱泡剤および／または１つまたは複数の微生物の保持に対して選択的である分離膜を使用して、大豆ホエーストリームを濾過して、ケイ素および／または１つまたは複数の微生物を含んでなる残余分と、水性大豆ホエーを含んでなる透過液とを得てもよい。この最初の精製で使用される（例えば精密濾過をはじめとする）特定の膜は、除去する構成要素を考慮して選択される。選択される膜のタイプ、および大豆ホエーストリームから除去する構成要素にかかわらず、好適には所望のＫＴＩタンパク質の少なくともかなりの部分が、そして好適には実質的に全部が、残余分中に見られる。さらにこの点において、水性大豆ホエーを含んでなる透過液への言及は、１つまたは複数の不純物を除去するホエーストリームの処理が大豆ホエーストリームの他の構成要素に及ぼす影響は、たとえあったとしてもわずかであることを示唆することに留意されたい。
【００７０】
様々な代案の態様で、ホエーストリームに含有される細菌は、タンパク質回収に先だって加熱により死滅させてもよい。細菌を破壊するための大豆ホエーストリームの加熱様式は厳密に決定的でなく、概して、当該技術分野で知られている従来の方法に従って行ってもよい。
【００７１】
分離は決して１００％でないため、各ストリーム中に残留構成要素があり得ることが分離技術当業者によって理解される。さらに当業者は、分離技術が出発原料次第で異なり得ることを理解する。
【００７２】
工程０（図１Ａ参照）−ホエータンパク質前処理は、単離大豆タンパク質（ＩＳＰ）糖蜜、ＩＳＰホエー、大豆タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）糖蜜、ＳＰＣホエー、機能性大豆タンパク質濃縮物（ＦＳＰＣ）ホエー、およびそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、供給流から出発し得る。ホエータンパク質前処理工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、塩酸、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ｐＨを調節した後の工程０のｐＨは、約３．０〜約６．０、または３．５〜５．５、または約５．３であり得る。温度は約７０℃〜約９５℃、または約８５℃であり得る。温度保持時間は約０分間〜約２０分間で異なり、または約１０分間であり得る。保持時間後、ホエーストリームから沈殿物を分離するために、典型的には間欠排出ディスク清澄化遠心分離である遠心分離工程にストリームを通過させる。ホエータンパク質前処理からの生成物としては、ストリーム０ａ中のホエーストリーム（前処理大豆ホエー）（分子量約５０キロダルトン（ｋＤａ）以下）の水相中の可溶性構成要素と、前処理大豆ホエー、貯蔵タンパク質、およびそれらの組み合わせなどのストリーム０ｂ中の不溶性のより大きな分子量のタンパク質（約３００ｋＤａ〜約５０ｋＤａ）とが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
工程１（図１Ａ参照）−微生物学減少（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）は、前処理大豆ホエーをはじめとするが、これに限定されるものではない、ホエータンパク質前処理工程の生成物から出発し得る。この工程は、前処理大豆ホエーの精密濾過を伴う。この工程のプロセス変量および代替物としては、遠心分離、全量濾過、加熱滅菌、紫外線滅菌、精密濾過、十字流膜濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約３．５〜約５．５、または約５．３であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃または約５０℃であり得る。工程１からの生成物としては、ストリーム１ａ中の貯蔵タンパク質、微生物、ケイ素、およびそれらの組み合わせと、ストリーム１ｂ中の精製前処理大豆ホエーが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７４】
工程２（図１Ａ参照）−水およびミネラル除去は、ストリーム１ｂまたは４ａからの精製前処理大豆ホエー、またはストリーム０ｂからの前処理大豆ホエーから出発し得る。それは水除去および部分的ミネラル除去のためのナノ濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、十字流膜濾過、逆浸透、蒸発、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程２のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約３．５〜約５．５、または約５．３であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。この水除去工程からの生成物としては、ストリーム２ａ中の精製前処理大豆ホエーと、ストリーム２ｂ中の水、幾種かのミネラル、一価のカチオン、およびそれらの組み合わせとが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７５】
工程３（図１Ａ参照）−ミネラル沈殿工程は、ストリーム２ａからの精製前処理大豆ホエー、またはストリーム０ａまたは１ｂからの前処理大豆ホエーから出発し得る。それはｐＨおよび／または温度変化による沈殿工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、撹拌または再循環反応タンクが挙げられるが、これに限定されるものではない。ミネラル沈殿工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩酸、塩化ナトリウム、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程３のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約８．０であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ｐＨ保持時間は、約０分間〜約６０分間、または約５分間〜約２０分間で異なり、または約１０分間であり得る。ストリーム３の生成物は、精製前処理大豆ホエーと沈殿したミネラルとの懸濁液である。
【００７６】
工程４（図１Ａ参照）−ミネラル除去工程は、ストリーム３からの精製前処理ホエーと沈殿したミネラルとの懸濁液から出発し得る。それは遠心分離工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、遠心分離、濾過、全量濾過、十字流膜濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ミネラル除去工程からの生成物としては、ストリーム４ａ中の脱ミネラル前処理ホエーと、ストリーム４ｂ中の幾種かのタンパク質ミネラル複合体がある不溶性ミネラルとが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７７】
工程５（図１Ｂ参照）−タンパク質分離および濃縮工程は、ストリーム４ａからの精製前処理ホエー、またはストリーム０ａ、１ｂ、または２ａからのホエーから出発し得る。それは限外濾過工程を含む。限外濾過工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩酸、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この工程のプロセス変量および代替物としては、十字流膜濾過、限外濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程５のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約８．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム５ａからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム５ｂからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７８】
工程６（図１Ｂ参照）−タンパク質の洗浄および精製工程は、ストリーム４ａまたは５ａからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、または精製前処理ホエー、またはストリーム０ａ、１ｂ、または２ａからのホエーから出発し得る。それは透析濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、再スラリー化、十字流膜濾過、限外濾過、水透析濾過、緩衝液透析濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。タンパク質洗浄および精製工程で使用し得る加工助剤としては、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程６のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム６ａからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム６ｂからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７９】
工程７（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム５ｂおよび／またはストリーム６ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それはナノ濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、逆浸透、蒸発、ナノ濾過、水透析濾過、緩衝液透析濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程７のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム７ａからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム７ｂからの生成物としては、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８０】
工程８（図１Ｃ参照）−ミネラル除去工程は、ストリーム５ｂ、６ｂ、７ａ、および／または１２ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それは電気透析膜工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、イオン交換カラム、クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。このミネラル除去工程で使用し得る加工助剤としては、水、酵素、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。酵素としては、プロテアーゼ、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程８のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜５０℃、または約４０℃であり得る。ストリーム８ａからの生成物としては、導電率が約１０ミリジーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍ）〜約０．５ｍＳ／ｃｍ、または約２ｍＳ／ｃｍの脱ミネラル大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム８ｂからの生成物としては、ミネラル、水、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
工程９（図１Ｃ参照）−色除去工程は、ストリーム８ａ、５ｂ、６ｂ、１２ｂ、および／または７ａ）からの脱ミネラル大豆オリゴ糖類から出発し得る。それは活性炭素床を利用する。この工程のプロセス変量および代替物としては、イオン交換が挙げられるが、これに限定されるものではない。この色除去工程で使用し得る加工助剤としては、活性炭素、イオン交換樹脂、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。温度は、約５℃〜約９０℃、または約４０℃であり得る。９ａからの生成物ストリームとしては、着色化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム９ｂは脱色溶液である。ストリーム９ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８２】
工程１０（図１Ｃ参照）−大豆オリゴ糖類分画工程は、ストリーム９ｂ、５ｂ、６ｂ、７ａ、および／または８ａからの大豆オリゴ糖類、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それはクロマトグラフィー工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、クロマトグラフィー、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この大豆オリゴ糖類分画工程で使用し得る加工助剤としては、当業者なら使用樹脂に基づいて分かるであろう、ｐＨを調節するための酸または塩基が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１０ａからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１０ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
工程１１（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム９ｂ、５ｂ、６ｂ、７ａ、８ａ、および／または１０ｂからの大豆オリゴ糖類から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、蒸発、逆浸透、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。水除去工程で使用し得る加工助剤としては、脱泡剤、蒸気、真空、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。温度は、約５℃〜約９０℃、または約６０℃であり得る。ストリーム１１ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１１ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
工程１２（図１Ｃ参照）−大豆オリゴ糖類工程からの追加的タンパク質分離は、ストリーム７ａ、５ｂ、および／または６ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それは限外濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、十字流膜濾過、孔径約５０ｋＤａ〜約１ｋＤａの限外濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この糖類工程からのタンパク質分離で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、プロテアーゼ、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１２のｐＨは約２．０〜約１２．０、約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム１２ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１２ａからの生成物としては、ペプチド、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８５】
工程１３（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム１２ａからのペプチド、および他のタンパク質から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、逆浸透、ナノ濾過、噴霧乾燥、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１３ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１３ｂからの生成物としては、ペプチド、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
工程１４（図１Ｂ参照）−タンパク質分画工程は、ストリーム６ａおよび／または５ａからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせから出発して実施されてもよい。それは限外濾過（孔径３００ｋＤａ〜１０ｋＤａ）工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、十字流膜濾過、限外濾過、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１４のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム１４ａからの生成物としては、貯蔵タンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１４ｂからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８７】
工程１５（図１Ｂ参照）−水分除去工程は、ストリーム６ａ、５ａ、および／または１４ｂからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、蒸発、ナノ濾過、ＲＯ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１５ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１５ｂの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８８】
工程１６（図１Ｂ参照）−熱処理およびフラッシュ冷却工程は、ストリーム６ａ、５ａ、１４ｂ、および／または１５ｂからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質から出発し得る。それは超高温工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、加熱滅菌、蒸発、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この熱処理およびフラッシュ冷却工程で使用し得る加工助剤としては、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。加熱工程の温度は、約１２９℃〜約１６０℃、または約１５２℃であり得る。温度保持時間は、約８秒間〜約１５秒間、または約９秒間であり得る。フラッシュ冷却時には、温度は約５０℃〜約９５℃、または約８２℃であり得る。ストリーム１６からの生成物としては、大豆ホエータンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
工程１７（図１Ｂ参照）−乾燥工程は、ストリーム６ａ、５ａ、１４ｂ、１５ｂ、および／または１６からの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質から出発し得る。それは乾燥工程を含む。液体供給温度は、約５０℃〜約９５℃、または約８２℃であり得る。入口温度は、約１７５℃〜約３７０℃、または約２９０であり得る℃。排気温度は、約６５℃〜約９８℃、または約８８℃であり得る。１７ａからの生成物ストリームとしては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１７ｂからの生成物としては、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質を含む、大豆ホエータンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９０】
図１Ｄは大豆タンパク質単離物の製造において発生する大豆ホエーストリームから、１つまたは複数の個々のタンパク質を回収する、本開示の方法の実施形態を示す。
【００９１】
図１Ｄには示されないが、ホエータンパク質の前処理は、単離大豆タンパク質（ＩＳＰ）糖蜜、ＩＳＰホエー、大豆タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）糖蜜、ＳＰＣホエー、機能性大豆タンパク質濃縮物（ＦＳＰＣ）ホエー、およびそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない加工ストリームから出発し得る。前処理工程で使用し得る加工助剤ホエータンパク質としては、酸、塩基、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、塩酸、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。前処理工程のｐＨは、約３．０〜約６．０、好適には４．５であり得る。温度は約７０℃〜約９５℃、好適には約８５℃であり得る。温度保持時間は、約０分間〜約２０分間で異なり得て、好適には約１０分間である。ホエータンパク質の前処理からの生成物としては、残余分中のホエーストリームの水相中の可溶性構成要素（前処理大豆ホエー）（分子量約５０キロダルトン（ｋＤａ）以下）と、前処理大豆ホエー、貯蔵タンパク質、およびそれらの組み合わせなどの透過液中の不溶性の大きな分子量のタンパク質（約３００ｋＤａ〜約５０ｋＤａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９２】
図１Ｄに示されるように、（前処理されてもよい）大豆ホエー１は、膜の反対側の第１の透過液ゾーン８内の圧力よりも高い圧力で分離膜７の片側と接する、第１の濾過供給ゾーン６を含んでなる膜分離ユニット５内に誘導される。好適には膜分離ユニット５は、少なくとも１つの精密濾過膜を含んでなる。
【００９３】
膜分離ユニット５内の分離膜７を横切る膜貫通圧力は、概して少なくとも約１ｐｓｉ、少なくとも約５ｐｓｉ、少なくとも約１０ｐｓｉ、少なくとも約２０ｐｓｉ、少なくとも約３０ｐｓｉ、少なくとも約４０ｐｓｉ、少なくとも約５０ｐｓｉ、または少なくとも約７５ｐｓｉである。流体は、典型的には少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2、または約１〜約４００リットル流体／時間−ｍ2の流れ方向を横断する膜断面積の体積流量または流速で膜を通過する。流速は、例えば濾過のタイプ、膜の汚損などによって影響されることもある。大豆ホエーは、典型的には約０℃〜約１００℃の温度、より典型的には約２５℃〜約７５℃の温度で、膜分離ユニットの濾過供給ゾーン内に導入される。典型的には水性大豆ホエー１は、残余分のために体積が約５％減少する。分離膜を通過する液体通過は、第１の透過液ゾーン８内に、第１の残余分９と第１の透過液１３をもたらす。第１の残余分９は、主として１つまたは複数の微生物と不溶性物質を含んでなり、特に第１の残余分９は、典型的には第１の透過液１３と比較して微生物に富む。好適には、第１の残余分９は、水性大豆ホエーの微生物含量の実質的に全部でないとしても、かなりの部分を含有する。なおもより好ましくは、第１の残余分９はまた、消泡剤（例えば水性大豆ホエー中に存在する、有機ケイ素または脂質含有化合物のケイ素）のかなりの部分を含んでなり、特に好適には、消泡剤含量を基準にして、水性大豆ホエーの消泡剤含量の少なくとも約７０重量％、より好適には少なくとも約８０重量％、さらにより好適には少なくとも約９０重量％を含んでなる。第１の透過液１３は、主として、可溶性大豆貯蔵タンパク質、大豆ホエータンパク質、様々な糖類、水、ミネラル、イソフラボン、およびビタミンなどの水性大豆ホエーストリームの様々な残りの構成要素の全てを含んでなる。
【００９４】
再度図１Ｄに言及すると、第１の透過液１３は、第２の透過液ゾーン２０内の圧力よりも高い圧力で分離膜１９の片側に接する第２の濾過供給ゾーン１８を含んでなる、膜分離ユニット１７内に導入される。膜分離ユニット１７は、好適には分離膜１９として、少なくとも１つの限外濾過膜を含んでなる。膜分離ユニット１７内の分離膜１９を越える膜貫通圧力は、概して少なくとも約５ｐｓｉ、少なくとも約１０ｐｓｉ、少なくとも約２５ｐｓｉ、少なくとも約５０ｐｓｉ、少なくとも約１００ｐｓｉ、または少なくとも約１５０ｐｓｉである。流体は、典型的には、以下の体積流量または流速で膜を通過する。少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2、または約１〜約１５０リットル流体／時間−ｍ2の流れ方向を横断する膜断面積。大豆ホエーは、典型的には、約０℃〜約１００℃の温度、より典型的には約２５℃〜約７５℃の温度で、膜分離ユニットの濾過供給ゾーン内に導入される。典型的には、水性大豆ホエー１は、少なくとも約５、または約５〜約７５（例えば約２５）の濃縮係数に濃縮される。限外濾過工程には透析濾過が含まれていてもよい。透析濾過体積は、典型的には、残余分１部当たり約１〜約１０部の透析濾過体積に及んでもよい。
【００９５】
分離膜を通る液体通過は、第２の残余分２１と第２の透過液２５をもたらす。第２の残余分２１は水性大豆ホエーのタンパク質含量の顕著な画分を含んでなり、したがってＫＴＩタンパク質の回収のためにさらに処理される。好適には第２の残余分２１は、第１の濾過供給ゾーン６内に導入された水性大豆ホエー中に存在する様々な大豆ホエータンパク質の少なくとも約２５重量％〜少なくとも約９０重量％（例えば少なくとも約５０重量％）（乾燥重量基準）を含んでなる。
【００９６】
再度図１Ｄに言及すると、第２の透過液２５は、概して、第２の残余分２１中で回収されないあらゆるタンパク質と、大豆ホエーストリームの様々な他の構成要素（例えば様々な糖類、水、ミネラル、ビタミン、およびイソフラボン）とを含んでなる。図１Ｄには示されないが、水性ホエーストリームから個々の構成要素を単離しおよび／または除去するために、適切な分離操作に従って、第２の透過液２５の構成要素をさらに処理してもよい。追加的分離工程に続いて、廃棄または使用に先立って、行うとしても最小の処理を要する、比較的純粋な水ストリームが好適には形成される。したがって本明細書に記載される本発明は、例えば環境の質を改善することで環境上の利点もまた有する。
【００９７】
第２の残余分２１をキャリアストリーム２３と合わせて、少なくとも１つのイオン交換樹脂３０を含有する、イオン交換カラムまたはユニット２９への供給材料２４を形成する。キャリアストリームの正確な組成は、厳密に決定的ではない。典型的には、キャリアストリームのｐＨは、約１〜約７、より典型的には約２〜約６、なおもより典型的には約２〜約５で、なおもより典型的には約３〜約４である。ＫＴＩタンパク質の回収の様々な態様において、キャリアストリームは、例えばクエン酸ナトリウムをはじめとする非揮発性緩衝液、または例えばギ酸アンモニウムをはじめとする揮発性緩衝液を含んでなる。例えば様々な態様において、キャリアストリームは、約１０〜約３０ミリモル濃度（例えば２０ｍＭ）の濃度で水性混合物中に対イオンを含有する、緩衝液を含んでなる。
【００９８】
第２の残余分２１および／または供給流２４のｐＨは大豆タンパク質の溶解度に影響を及ぼし、沈殿タンパク質はイオン交換カラムの汚損をもたらすこともある。したがって特定限度内で、イオン交換カラムへの供給材料の（例えば緩衝による）ｐＨ調節が所望されることもある。必要ならば供給材料のｐＨは、例えば第２の残余分の希釈、キャリアストリーム、および／または残余分とキャリアストリームの組み合わせによって提供される供給材料によって、範囲内に保たれてもよい。希釈剤の組成は厳密に決定的でなく、典型的には、当業者に容易に選択されてもよい水性媒体（例えば脱イオン水）である。供給材料のｐＨに影響を及ぼすのに加えて、希釈はまた、典型的には供給材料の固有イオン強度を低下させ、それはタンパク質とイオン交換樹脂の結合を促進する。さらにまたは代案としては、供給材料のｐＨは、キャリアストリームの選択によって制御されてもよい。
【００９９】
イオン交換樹脂は、第２の残余分２１および供給材料２４中に存在する、１つまたは複数のタンパク質の選択的保持および回収に適するように選択される。様々な態様で、イオン交換樹脂は、ＫＴＩタンパク質を非ＫＴＩタンパク質から分離するように、選択的なＫＴＩタンパク質保持または非ＫＴＩタンパク質保持について選択される。以下の考察は、水性大豆ホエー（すなわち第２の残余分２１）からのＫＴＩタンパク質の回収および単離に注目する。しかし以下の手順は、他の標的タンパク質（例えばＢＢＩタンパク質）ならびに水性以外の（例えば噴霧乾燥から戻された）他の各種受け入れストリームの回収のために、容易に適合できるものと理解される。
【０１００】
イオン交換ユニットの正確な構成にかかわらず、ＫＴＩタンパク質の回収のための適切なイオン交換樹脂としては、多様なカチオンおよびアニオン交換樹脂が挙げられる。イオン交換カラムへの供給材料次第で、カチオン交換樹脂とアニオン交換樹脂の両方がＫＴＩタンパク質の回収に適するが、様々な態様でイオン交換樹脂はカチオン交換樹脂を含んでなる。例えばその等電点（ｐＩ）未満のｐＨに曝露したタンパク質は正電荷域を有する可能性がより高く、したがってカチオン交換樹脂とより密接に結合する。供給流中のほとんどのタンパク質（例えば大豆貯蔵タンパク質）は、ＫＴＩ、そして供給材料の典型的なｐＨよりも高いｐＩを有する。したがってこれらのタンパク質は、典型的には樹脂とより密接に結合する。ＫＴＩタンパク質含有画分は、樹脂を適切な溶離液に接触させることにより、イオン交換カラムから容易に溶出させることもできる。
【０１０１】
代案としては、供給材料のｐＨがＫＴＩタンパク質のｐＩを下回るように調節して、イオン交換樹脂によるＫＴＩタンパク質の保持を提供してもよい。他のタンパク質（例えばＢＢＩタンパク質）もまた、樹脂に結合する。しかし所望の画分の回収は、タンパク質画分の差次的溶出のために、イオン交換樹脂を適切な溶離液と接触させることで進行させてもよい。
【０１０２】
適切なカチオン交換樹脂としては、当該技術分野で良く知られている多様な樹脂が挙げられる。少なくとも１つの実施形態では、イオン交換樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されるＰｏｒｏｓ ２０ ＨＳを含んでなり、これはスルホプロピル基（例えばプロピルスルホン酸、（ＯＨ）2Ｓ（Ｏ）−（ＣＨ2）3−）で官能化されたポリヒドロキシル化ポリマーで表面被覆された、架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックスである。
【０１０３】
再度図１Ｄに言及すると、供給材料２４のイオン交換カラム３０通過後、溶出ＫＴＩタンパク質ストリーム３３を回収する。ＫＴＩタンパク質ストリーム３３をさらに精製して９５％以上の純度を達成するために、親和性クロマトグラフィーの使用を通じてＫＴＩタンパク質ストリーム３３を単離してもよい（図１Ｄには示されない）。親和性クロマトグラフィーは、典型的には単一工程で純度＞９５％を提供する精製技術である。それは標的分子の特定の天然のまたは追加された特性を利用して、サンプル中の全ての汚染物質から標的分子を単離する。ＫＴＩタンパク質ストリーム３３を精製するために、先の工程で除去されなかった残留汚染物質、主に大豆レクチンは、親和性クロマトグラフィーを通じて容易に除去し得る。例えばＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン樹脂のカラム（カタログ番号Ａ２７８７、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）など、あらゆる既製の特定用途向け樹脂（すなわち分離される化合物に対して特異的なリガンドがその表面に付着された樹脂）を使用して平衡化し得る。当該技術分野で知られている方法を使用して、ＫＴＩタンパク質ストリーム３３を樹脂と同一の緩衝液組成に対して調節し、アフィニティカラムに注入して、それにより汚染物質を樹脂に付着させ、通過画分を精製ＫＴＩ画分として収集する。
【０１０４】
図２は、ＫＴＩタンパク質ストリーム３３をはじめとする、図１Ｄで示される本発明の方法において単離された、様々な残余分および透過液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析を図示する。レーン１は分離に先立つ大豆ホエーの組成を示し、複数成分の存在が示唆される。対照的に、レーン５は、図１Ｄに示される複数の分離操作に続く濃縮ＫＴＩ画分（すなわちＫＴＩタンパク質ストリーム３３）を示す。２つのバンドの存在は、図１Ｄの分離工程に続いて、ＫＴＩタンパク質と１つの他の汚染物質（ＫＴＩ画分の分子量に基づいて大豆レクチンであると推定される）が、大豆ホエーから単離されたことを示唆する。実質的に追加的構成要素を含まず、かつ高純度レベル（＞９５％）を有するＫＴＩ生成物を得るために、実施例に記載されるようにして、残留汚染物質（すなわち大豆レクチン）の除去を親和性クロマトグラフィーを通じて達成し得る。
【０１０５】
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄに示されるプロセススキームは、使用出発原料や、上述の大豆ホエー構成要素の分離および回収順序に限定されるものではなく、例えば、添付の特許請求の範囲に記載されるものをはじめとする、上で論じたものと異なる加工ストリームを調製するのに利用してもよい。
【０１０６】
Ｅ．ＫＴＩを製造する方法
特定の実施形態では、本発明のＫＴＩタンパク質は、例えば組換え手段によって、または合成的に生成される。本発明のタンパク質の組換え生産は、当業者に知られている標準技術を使用して行われる。このような方法としては、例えば１つまたは複数のコード核酸配列を作成することが挙げられ、それは全長ｃＤＮＡ配列をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法によって実施し得る。所望の核酸配列の生成に続いて、配列を（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｐＣＡＬ−ｎ発現プラスミドをはじめとする）発現プラスミドに挿入し、次にそれを微生物に形質移入する；次に（例えば抗生物質耐性選択マーカーまたは発光選択マーカーをはじめとする）選択マーカーを使用して、所望の配列を含有するプラスミドを含有するクローン選択を実施する；所望の配列を含有するプラスミドを含有するクローンの大量生産がそれに続く；所望のクローンからペプチドを精製する（例えばＧｏｒｌａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１，４１０７−４１１６に記載される方法；米国特許第４，９８０，４５６号明細書を参照されたい）。代案としては本発明のペプチドは、合成手段または半合成手段（例えば組換え生産と合成手段の組み合わせ）によって製造し得る。
【０１０７】
合成的製造は、例えばＣａｒｐｉｎｏ Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｈａｎ．ＧＹ、Ｊ．（Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１；３７；３４０４−３４０９）に記載のフルオレニルメチロキシカルボニル（ＦＭＯＣ）−保護基ストラテジーを応用し、またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）−保護基ストラテジーを応用することで実施し得る。ペプチドは、例えば多重ペプチド合成装置を使用して、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ．（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３；８５，２１４９−２１５４）に記載の固相ペプチド合成手段によって合成される。次に粗製ペプチドを精製する。
【０１０８】
本発明のタンパク質を合成製造するための例示的方法は、続く節に記載される。装填量０．２４ｍｍｏｌ／ｇで、１００ｍｇのＴｅｎｔａｇｅｌ−Ｓ−ＲＡＭ（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）を市販のペプチド合成装置（ＰＳＭＭ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ））に移し、そこでペプチド配列をカルボジイミド／ＨＯＢｔ法に従って段階的に構築する。ＦＭＯＣ−アミノ酸誘導体は、５倍等モル過剰量のジ−イソプロピル−カルボジイミド（ＤＩＣ）、ジ−イソプロピル−エチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を添加してあらかじめ活性化され、反応容器に移した後に樹脂担体と３０分間混合された。洗浄工程は、例えばＤＭＦの添加と、１分間にわたる完全混合によって実施される。切断工程は、例えばＤＭＦ中のピペリジンの添加と、４分間にわたる完全混合によって実施される。個々の反応および洗浄溶液の除去は、溶液を反応容器底のフリットを通して押し出すことで達成される。アミノ酸誘導体ＦＭＯＣ−Ａｌａ、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、ＦＭＯＣ−Ａｓｐ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、ＦＭＯＣ−Ｉｌｅ、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、およびＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（Ｏｒｐｅｇｅｎ）が用いられる。合成が完了したら、ペプチド樹脂を乾燥させる。トリフルオロ酢酸／ＴＩＳ／ＥＤＴ／水（９５：２：２：１ｖｏｌ）による室温で２時間の処理により、ペプチドアミドを引き続いて切断する。濾過、溶液濃縮、および氷冷ジエチルエーテル添加による沈殿の手段を通じて、粗生成物を固体として得る。次に０．１％ＴＦＡ中のＲＰ−ＨＰＬＣによって、６０％アセトニトリル上の勾配５、流速１２ｍｌ／分で４０分間、および２１５ｎｍにおけるＵＶ検出の手段による溶離剤の評価で、プチドを精製する。個々の画分の純度は、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析法によって判定される。
【０１０９】
Ｆ．使用方法
本発明の様々な態様で、皮膚健康を促進するのに本発明のＫＴＩタンパク質を使用し得る。皮膚健康促進の例としては、皮膚変色または色素沈着の減少、炎症の低下、皺の最小化、皺の除去、脱色、着色、皮膚軟化、皮膚スムージング、除毛、およびクレンジングが挙げられる。皮膚健康の他の例と、それに関連した実験法は、米国特許出願公開第２０１０００９３０２８号明細書、米国特許出願公開第２０１０００９２４０９号明細書、米国特許出願公開第２００９０１１１１６０号明細書、米国特許出願公開第２００８０２４９０２９号明細書、米国特許第６，５５５，１４３号明細書にある（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，８４：１５５１−１５５９ ａｎｄ Ｐａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００１ Ａｐｒ；１１６（４）：５８７−９５もまた参照されたい）。
【０１１０】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下で定義する。
【０１１１】
「酸可溶性」という用語は、本明細書の用法では、約２〜約７のｐＨを有する水媒質中において、１リットル（ｇ／Ｌ）当たり１０グラムの濃度で、少なくとも約８０％の溶解度を有する物質を指す。
【０１１２】
「大豆タンパク質単離物」または「単離大豆タンパク質」という用語は、本明細書の用法では、無水ベースで少なくとも約９０％大豆タンパク質のタンパク質含量を有する大豆材料を指す。
【０１１３】
「対象（単数）」または「対象（複数）」という用語は、本明細書の用法では、病的状態の治療を必要とする、哺乳類（好適にはヒト）、鳥、魚、爬虫類、または両生類を指し、病的状態としては、筋肉、無制御な細胞増殖、自己免疫疾患、および癌と関連付けられている疾患が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１４】
「加工ストリーム」という用語は、本明細書の用法では、例えば水性大豆抽出物ストリーム、水性豆乳抽出物ストリーム、水性大豆ホエーストリーム、水性大豆糖蜜ストリーム、水性大豆タンパク質濃縮物大豆糖蜜ストリーム、水性大豆透過液ストリーム、および水性豆腐ホエーストリームをはじめとし、さらに例えば本明細書で開示される方法に従って中間生成物として回収され得る、液体および乾燥粉末双方の形態の大豆ホエータンパク質をはじめとする、水性ストリームまたは溶剤ストリームをはじめとする、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程に由来する、二次的または偶発的生成物を指す。
【０１１５】
「大豆ホエータンパク質」という用語は、本明細書の用法では、大豆貯蔵タンパク質が典型的には不溶性であるｐＨで可溶性であるタンパク質を指し、ＢＢＩ、ＫＴＩ、ルナシン、リポキシゲナーゼ、デヒドリン、レクチン、ペプチド、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではなく、貯蔵タンパク質をさらに包含する。
【０１１６】
本明細書全体を通じて言及されるその他のタンパク質は、ルナシン、レクチン、デヒドリン、リポキシゲナーゼ、およびそれらの組み合わせを含むが、これに限定されないと定義される。
【０１１７】
大豆オリゴ糖類としては、糖が挙げられるが、これに限定されないと定義される。糖としては、スクロース、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコース、単糖類、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されないと定義される。
【０１１８】
本発明の要素またはその好ましい実施形態を述べる際の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」と言う冠詞、および「ｓａｉｄ」は、１つ以上の要素を意味することが意図される。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｈａｖｉｎｇ」は、包括的であることが意図され、列挙される要素以外の追加的要素があってもよいことを意味する。
【０１１９】
本発明の範囲を逸脱することなく、上の化合物、生成物、および方法には様々な変更を加え得るので、上の説明および下の実施例に包含される全ての事項は例示的であり、限定的でないと解釈されるものとする。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：大豆ホエータンパク質からのＫＴＩタンパク質の回収
およそ３．７重量％の総タンパク量含量と、２２．５重量％（乾燥重量基準）の総固形分を有する水性大豆ホエー（１４５ｌ）をＢＴＳ−２５またはＭＭＭ０．４５ミクロン精密濾過膜を含有するＯＰＴＩＳＥＰ ７０００濾過モジュール内に導入する。膜に水性大豆ホエーを通過させると、水性大豆ホエーを含有する透過液（３．２重量％の固形分を有する１３２Ｌ）と、大豆ホエーの最初の細菌含量の９９％以上、および大豆ホエーのケイ素脱泡剤含量の９０％以上を含有する残余分とが形成される。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
精密濾過モジュールからの透過液（１３２ｌ）を孔径およそ１００ｋＤａを有する再生セルロース（ＲＣ）限外濾過膜を含有する、ＯＰＴＩＳＥＰ ７０００濾過モジュール内に導入した。透過液を限外濾過膜に通過させると、糖類、ミネラル、およびビタミンを含有する第２の透過液と、およそ２５．４重量％の固形分およびおよそ８３重量％（乾燥ベース）の総大豆タンパク質含量を有する第２の残余分（約２Ｌ）とが形成された。
【０１２３】
Ｖｉｒｔｉｓ Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ ２５ＸＬを使用して、凍結乾燥によって第２の残余分を乾燥させた。乾燥サンプルのアリコート（５３ｍｇ）を水で最終固形分濃度２５％のスラリーにして、次に混合しながら、室温で１０分間インキュベートして可溶化を促進した。２０００×ｇで１０分間の遠心分離により不溶性物質を除去し、上清を２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０でさらに５倍に希釈した。結果として起きたｐＨ低下は、混合物の一部の構成要素の沈殿をもたらし、それを引き続いて２０００×ｇで５分間の遠心分離によって除去した。
【０１２４】
７×２５ｍｍ Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳカラム（０．８ｍｌカラム床体積；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０緩衝液であらかじめ平衡化した。０．４５ミクロンシリンジフィルターを通してサンプルを濾過し、０．５ｍｌをカラムに流速１ｍｌ／分で注入した。２０カラム体積の平衡緩衝液で、非結合タンパク質をカラムから洗い出し、次に４０カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０中の０〜１００％直線濃度勾配１Ｍ塩化ナトリウムを使用して、結合画分を１ｍｌの画分中で回収した。クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、各画分を分析した。ＫＴＩappは、ＭＷappに基づいて画分２５〜３２に局在した（図２参照）。画分２９および３０をプールし、修正Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｃｒｏ−Ｌｏｗｒｙ、ＯｎｉｓｈｉおよびＢａｒｒ変法）を使用して、総タンパク量についてアッセイした。Ｋａｋａｄｅらの方法（Ｋａｋａｄｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｉｍｏｎｓ，Ｎ．，ａｎｄ Ｌｉｅｎｅｒ，Ｉ．Ｅ．，１９６９．Ａｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ ｖｓ． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ａｎｔｉｔｒｙｐｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎｓ． Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．４６：５１８）を使用して、ＫＴＩ活性を推計した。プールしたサンプルのタンパク質濃度は０．４８ｍｇ／ｍｌであり、比活性は７０８ Ｔｉ単位／ｇタンパク質であることが分かった。濃縮ＫＴＩサンプルはまた、（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｎ．，Ｓｐｒｏｗｓ，Ｊ．，Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｏ．，Ｌａｚａｒｕｓ，Ｇ．，Ｃｏｏｐｅｒｍａｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ，Ｈ．，１９８９．Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｃｈｙｍａｓｅ ｗｉｔｈ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１３０８−２１３１５．Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｖ．，Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｋｙｌｅ，Ｗ．Ｓ．Ａ．，ａｎｄ Ｅｌｍｏｒｅ，Ｄ．Ｔ．，１９７３．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌａｒｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅα−Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ，Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ Ｘα ｂｙ Ｓｐｅｃｔｒｏ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３１：１０７−１１７を使用して）キモトリプシン阻害活性についてもアッセイし、本質的に全く含有しないことが分かった。したがってこの実施例に記載されるようにして調製されたＫＴＩは、汚染ＢＢＩ活性を含まない。
【０１２５】
ＫＴＩ精製中に調製された様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３に示す。＞９５％純度のＫＴＩは、親和性クロマトグラフィーを使用して、レーン５に示される残留汚染物質を除去して得られる。したがってＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン樹脂のカラム（カタログ番号Ａ２７８７、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で平衡化される。当該技術分野で知られている方法を使用して、濃縮ＫＴＩ画分をこれと同一の緩衝液組成物に対して調節し、アフィニティカラムに注入する。汚染物質を樹脂に結合させ、カラム通過画分は精製ＫＴＩ画分として収集する。
【０１２６】
実施例２：質量分析法によるＫＴＩアイデンティティの確認
以下の手順を使用して、ＫＴＩをおよそ９０％の純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく）に精製した。１グラムの大豆ボーマン・バークインヒビター濃縮物（ＢＢＩＣ、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｙａ Ｃｏ．ロット番号０２１７６−２）を２０ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．８に再懸濁し、５％（ｗ／ｖ）スラリーを得た。磁気撹拌棒を使用して、スラリーを撹拌プレート上で、ビーカー内において室温で２０分間撹拌し材料を完全に水和して、次に１０．０００×ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質を除去した。得られた上清をデカントして０．２μｍフィルターを通して濾過し、１ｍｌの濾液を出発緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で１０ｍｌに希釈した。次に希釈サンプルを出発緩衝液中で平衡化された１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−５０５５−０１）に１ｍｌ／分の流速で直接注入した。非結合タンパク質を洗い出した後、カラムを４０カラム体積の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中の０−１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。溶出中に１ｍｌの画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４参照）。ＫＴＩappは、画分８〜１５中に同定された。画分Ａ１１は純度およそ９０％のＫＴＩを含有し、質量分析法による分析のために選択された。このようにして１２．５μｌのこの画分を１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、クーマシー染色して、質量分析法分析のために提出した（図５参照）。
【０１２７】
分析は、Ｄｏｎａｌｄ Ｄａｎｆｏｒｔｈ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で実施された。このようにしてゲル内トリプシン消化手順を使用してＫＴＩappバンドをペプチドに断片化し、ＱＳｔａｒ ＸＬナノスプレーＱＴＯＦ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。ＮＣＢＩｎｒおよびＴＩＧＲ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）データベースの双方に対してスペクトルを検索し、それにトリプシンの（ｔｒｙｐｉｃ）ペプチドが由来するタンパク質を同定した。バンド１ＡはＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘからのトリプシン阻害物質サブタイプＡと同定された、図５。同定された特定のペプチドは、ＫＴＩからのＮＥＬＤＫＧＩＧＴＩＩＳＳＰＹＲ（ａａ ７３〜８８）、ＦＩＡＥＧＨＰＬＳＬＫ（ａａ ９１〜１０１）、ＩＧＥＮＫＤＡＭＤＧＷＦＲ（ａａ １３２〜１４４）、ＶＳＤＤＥＦＮＮＹＫ（ａａ １４８〜１５７）、およびＮＫＰＬＶＶＱＦＱＫ（ａａ １９１〜２００）であった。
【０１２８】
実施例３：膨張床吸着（ＥＢＡ）クロマトグラフィーを使用したバルク大豆ホエータンパク質からのＫＴＩの精製
総固形分１．９２％を有する２００ｍｌの水性大豆ホエーを水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調節して、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中で平衡化されたＭｉｍｏ６ＨＥ樹脂の１×２５ｃｍカラム（ＵｐＦｒｏｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｄｅｎｍａｒｋ）に注入した。７．５ｃｍ／分の線流速を使用して、２０〜２５℃で、材料をボトムアップ式にカラムに装填した。後で分析するために、カラム通過物のサンプルを定期的に収集した。非結合材料を１０カラム体積の平衡緩衝液でカラムから洗い出し、結合材料を次に３０ｍＭ水酸化ナトリウムで溶出して回収した。大豆ホエー粉末懸濁液のＥＢＡクロマトグラフィー中に回収された各画分の１０μｌを４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離して、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０染色で染色した。カラム装填物、通過物、洗浄液、および水酸化ナトリウム溶出液サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図６に示す。図６の凡例。ＲＭ：原料（カラム装填物）；ＲＴ１〜４：装填中に等間隔で収集された通過物（流出物）；合計：総流出物画分；Ｗ：カラム洗浄液；Ｅ：カラム溶出液。装填タンパク質の大半は、通過物中に溶出することがはっきりと見られる一方で、ＫＴＩタンパク質の大半は樹脂に結合したままであった。溶出液中において、その大半がＫＴＩである合計３５５ｍｇのタンパク質を１．８ｍｇ／ｍｌ出発原料の収率で回収した。これらの条件下で、この樹脂の性能は１ｍｌの吸収材あたり１７．８ｍｇのＫＴＩ（プラス微量汚染物質）であることが示された。
【０１２９】
９５％以上の純度を達成するために、材料を凍結乾燥し、次に最小体積の緩衝液（例えば１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中で再度可溶化して、同一緩衝液中で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６サイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入した。カラムを１分当たり流速０．５ｍｌで展開し、溶出液の波長２８０ｎｍの吸光度を連続的にモニターした。１カラム排除容積の溶出に続いて画分の収集を即座に開始し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、精製ＫＴＩのある特定の画分を見つけ出した。ＫＴＩ含有画分をプールし、トリプシン阻害についてアッセイして純度を確認した。
【０１３０】
当業者は、本明細書に記載される方法および組成物が例示的な実施形態を代表するものであり、本発明の範囲に対する制限を意図するものでないことを容易に理解するであろう。発明の範囲と精神を逸脱することなく、様々な置換と修正を本明細書で開示される本開示に加えてもよいことが、当業者にはすぐに分かるであろう。
【０１３１】
本明細書中で言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の水準を示す。全ての特許および刊行物は、各々の個々の刊行物が具体的に個々に参考として援用されて示されるかのように、同じ程度までその全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１３２】
本明細書に例証的に記載される本開示は、適切には、本明細書で具体的に開示されないあらゆる要素または要素群、制限または制限群の不在下で実施されてもよい。したがって例えば本明細書の各場合において、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」、および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」の何れかは、他の２つのどちらかの用語で置き換えてもよい。用いられた用語および表現は、限定でなく説明の用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示され記載される徴群のいかなる同等物もまたはその一部も排除することは意図されず、本開示が特許請求する範囲内で、様々な修正が可能であることが認識される。したがって本開示は、好ましい実施形態と任意の徴群によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正形態およびバリエーションが、当業者によって用いられてもよいものと理解すべきである。このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲内であると見なされる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、２００９年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２９１，３１２号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は大豆加工ストリームから、精製Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）タンパク質を回収する方法を提供する。具体的には、本開示は、ＫＴＩ生成物をクロマトグラフ分離するステップを含み、ＫＴＩ生成物を単離し除去する１つまたは複数の分離技術を含んでいてもよい方法を提供し、ＫＴＩ生成物は、少なくとも約９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度で表される純度を有する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質分解酵素を阻害するタンパク質は、多数の種子および他の植物貯蔵器官中に高濃度で見られることが多い。インヒビタータンパク質はまた、実質的に全ての動物組織および体液中に見られる。動物および微生物からのタンパク質分解酵素と複合体を形成して阻害する能力のために、これらのタンパク質は、長年にわたって相当数の研究の対象である。阻害物質は、医学と生物学において、タンパク質分解を研究する有益なツールになっている。プロテアーゼインヒビターは、膵臓炎、ショック、および肺気腫などのいくつかの障害に関与するプロテイナーゼの制御におけるそれらの治療的な可能性のために、そして哺乳類の受精を調節する作用物質として特に興味深い。
【０００４】
大豆加工ストリームは、相当量のプロテアーゼインヒビターを含有する。プロテアーゼインヒビターは、少なくともトリプシン、キモトリプシンを阻害し、そして一連の様々な重要代謝機能を制御する、多様な他の重要な膜貫通プロテアーゼを潜在的に阻害することが知られている。プロテアーゼインヒビターの局所投与は、数カ所に局在していてもまたは身体の大きな部分に関わっていてもよい、皮膚炎症の一般的な形態であるアトピー性皮膚炎などの病状において用途がある。プロテアーゼインヒビターの色素除去活性、および紫外線誘発色素沈着を予防するそれらの能力は、生体外および生体内の双方で実証されている（例えば、Ｐａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１６：５８７−５９５［２００１］を参照されたい）。プロテアーゼインヒビターはまた、創傷治癒を促進することが報告されている。例えば分泌型白血球プロテアーゼインヒビターを局所的に塗布すると、組織破壊が逆転し、創傷治癒過程を加速することが実証された。さらにセリンプロテアーゼインヒビターは、紅斑性狼瘡患者において疼痛を軽減させる一助にもなり得る（例えば、米国特許第６，５３７，９６８号明細書を参照されたい）。
【０００５】
天然プロテアーゼインヒビターは、穀類（オート麦、大麦、およびトウモロコシ）、芽キャベツ、タマネギ、ビート根、小麦、シコクビエ、および落花生などの多様な食物に見られる。関心のもたれる供給源は、大豆である。
【０００６】
大豆および他のマメ科植物から、２つの大まかなクラスのプロテアーゼインヒビタースーパーファミリーが同定されており、各クラスはいくつかのイソインヒビターを有する。Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）は、第１のクラスの主要メンバーであり、そのメンバーはおよそ１７０〜２００個のアミノ酸、２０〜２５ｋＤａの分子量を有し、主にトリプシンに対して作用する。Ｋｕｎｉｔｚトリプシンプロテイナーゼ阻害物質は、大抵は一本鎖ポリペプチドであり、４個のシステインが２つのジスルフィド架橋中に連結され、１つの反応部位がジスルフィド架橋によって画定されるループ内に位置する。第２のクラスの阻害物質は、６０〜８５個のアミノ酸を含有し、６〜１０ｋＤａの分子量範囲を有し、より多数のジスルフィド結合を有して、比較的熱安定性であり、独立した結合部位でトリプシンおよびキモトリプシンの双方を阻害する。ボーマン・バークインヒビター（ＢＢＩ）は、このクラスの一例である。大豆中に存在するプロテアーゼインヒビターの平均レベルは、２つの最重要なプロテアーゼインヒビターであるＫＴＩおよびＢＢＩで、それぞれ約１．４％および０．６％である。とりわけこれらの低レベルは、臨床用途のために天然プロテアーゼインヒビターを単離することを非実用的なものとする。
【０００７】
先行技術は、酸抽出もアルコール抽出も、アセトン沈殿もなしに大豆タンパク質源から得られる、高い純度レベルを有するＫＴＩ生成物について、記載していない。当該技術分野で開示される、ＫＴＩ生成物を単離する方法は、以下の特定の参考文献に記載されているが、高度に純粋なＫＴＩ生成物の単離はもたらされていない。Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．３９（５）：８６２−８６６（１９９１）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３０：１６７−１７０（２００３）；Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５７（１５）：７０２２−７０２９（２００９）；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９４（１，２）：１４１−１４３（１９９１）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５４（３）：６０６−６１７（１９８９）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（３）：１０６９−１０８６（２００１）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（２）：２０５−２０９（１９８７）；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ａｎｄ Ｉｋｅｎａｋａ，Ｔ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｉ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），６２（２），１４１−１４９（１９６７）；Ｂｉｒｋ，Ｙ．，Ｔｈｅ Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ｔｒｙｐｓｉｎ−ａｎｄ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ ｓｏｙｂｅａｎｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，２５（２）．１１３−１３１（１９８５）；Ｈｗａｎｇ，Ｄ．，Ｄａｖｉｓ Ｌｉｎ，Ｋ．Ｔ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，Ｆｏａｒｄ，Ｄ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｉａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，４９５，３６９−３８２（１９７７）；Ｆｒａｔｔａｌｉ，Ｖ．，Ｓｏｙｂｅａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ − ＩＩＩ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４４（２），２７４−２８０（１９６９）；Ｋａｓｓｅｌｌ，Ｂ．，Ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｙｂｅａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６６（ｃ），８５３（１９７０）；Ｂｉｒｋ，Ｙ．，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｌｅｇｕｍｅ Ｓｅｅｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５７，６９７；およびＢｉｒｋ，Ｙ．，Ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｙｂｅａｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５８，７００。したがって高純度プロテアーゼインヒビターと変異型、具体的にはＫＴＩの製造に適した方法と組成物に対する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明は、本明細書で開示される方法を通じて、ＫＴＩ生成物を高純度形態で単離する方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、高度にＫＴＩタンパク質に富んだ組成物を生成する新規方法を記載する。特に本発明は、ＫＴＩタンパク質の回収のための基材として適切な精製画分を生成するための、大豆ホエーから様々な他の構成要素を除去する一連の逐次分離操作を通じた、大豆加工ストリーム濃縮について述べる。本明細書の他の箇所でさらに詳述されるように、本発明は、水性大豆ホエーの様々な構成要素を回収するために設計された、１つまたは複数の膜分離（濾過）操作またはクロマトグラフ分離操作を含んでなる方法を通じた、大豆加工ストリームからの精製画分の回収について述べる。大豆加工ストリームの様々な構成要素の除去は、典型的には、その構成要素の除去の前および／または最中に、大豆加工ストリームを濃縮するステップを含む。
【００１０】
典型的には、大豆加工ストリームからの１つまたは複数の不純物（例えば微生物またはミネラル）、１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質（すなわちグリシニンおよびβ−コングリシニン）、１つまたは複数の大豆ホエータンパク質、および／または１つまたは複数の糖類の除去によって、精製画分を調製する。高純度のＫＴＩタンパク質の回収は、希釈により純度を損なう加工ストリームのその他の主要構成要素（例えば貯蔵タンパク質、ミネラル、脂質、微生物、および糖類）を除去しながら、タンパク質の拮抗物質でありおよび／または有害効果がある構成要素（例えば内毒素）の除去を通じて、タンパク質画分を精製することで、同様に総ＫＴＩタンパク質濃度を改善することによって改善される。具体的には、本開示は、少なくとも約９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度で表される純度を有する、ＫＴＩ生成物の単離および除去をもたらす方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法は、最初に、分離膜の片側と接する濾過供給ゾーンに大豆加工ストリームを導入するステップと；流体を膜に通過させて、濾過供給ゾーン内に少なくとも１つの大豆貯蔵タンパク質および少なくとも１つの大豆ホエータンパク質を含んでなる第１の残余分と、透過液ゾーン内に１つまたは複数の糖類、水、および１つまたは複数のミネラルを含んでなる第１の透過液を生成するステップと；第１の残余分またはその一部を第２の分離膜の片側と接する第２の濾過供給ゾーンに導入するステップと；流体を第２の膜に通過させて、第２の濾過供給ゾーン内に１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質を含んでなる第２の残余分と、第２の透過液ゾーン内に水、１つまたは複数の大豆ホエータンパク質、および糖類を含んでなる第２の透過液とを生成するステップと；含有されるイオン交換樹脂を中に含んでなるイオン交換ユニット内に、タンパク質濃縮大豆加工ストリームを導入するステップと；大豆ホエーストリームを分割してイオン交換のための複数の供給材料画分を提供するステップと；複数の供給材料画分をイオン交換ゾーン内に導入するステップと；複数の供給材料画分のそれぞれをイオン交換樹脂と接触させ、イオン交換樹脂に対する親和力によってＫＴＩ生成物を除去するステップと；イオン交換樹脂を溶出媒質と接触させてイオン交換樹脂からＫＴＩ生成物を除去して、溶出ＫＴＩタンパク質画分を形成するステップとを含む。
【００１２】
本開示は、最初に水が大豆ホエー固形分から分離され、微生物を大豆ホエー固形分から分離する技術がそれに続き、タンパク質を大豆ホエー固形分から分離する技術がそれに続き、糖類を大豆ホエー固形分から分離する技術がそれに続き、最後に水を含んでなる精製されたストリームの形成がそれに続く、多様な技術を使用する方法をさらに包含する。本明細書で開示される工程の順序は、本発明の特定の一実施形態を提供するが、本明細書で開示される工程は、任意の順に実施してもよいことに留意すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】加工ストリームから精製大豆ホエータンパク質を回収する方法における、工程０〜４を示す概略工程図である。
【図１Ｂ】加工ストリームから精製大豆ホエータンパク質を回収する方法における、工程５、６、１４、１５、１６、および１７を示す概略工程図である。
【図１Ｃ】加工ストリームから精製大豆ホエータンパク質を回収する方法における工程７〜１３を示す概略工程図である。
【図１Ｄ】水性大豆ホエーストリームから精製ＫＴＩ生成物を回収する方法を示す概略工程図である。
【図２】ＫＴＩのＰｏｒｏｓ ＨＳ５０イオン交換画分のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。
【図３】濃縮ＫＴＩ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４】ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦイオン交換画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図５】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析されたＫＴＩバンドを示す。
【図６】Ｍｉｍｏ６ＨＥ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書に記載されるのは、大豆タンパク質単離物の製造において発生する、（大豆ホエーストリームおよび大豆糖蜜ストリームをはじめとする）多様なマメ科植物加工ストリームから、高度精製ＫＴＩタンパク質および他の生成物を回収する新規プロセスである。例えば本開示の方法は、ＫＴＩタンパク質または他の生成物の回収、または大豆ホエーストリームの様々な構成要素の分離、または双方を提供するように選択され設計された、１つまたは複数の分離技術または方法（例えばクロマトグラフ分離または膜分離）を含んでなる。ＫＴＩタンパク質、および大豆ホエーストリームの１つまたは複数の他の構成要素（例えばオリゴ糖類をはじめとする様々な糖類）の回収は、複数の分離技術（例えば膜、クロマトグラフ、沈殿、遠心分離、または濾過）を利用してもよい。特定の分離技術は、加工ストリームのその他の構成要素から分離することで回収される、所望の構成要素によって決まる。
【００１５】
例えば精製ＫＴＩ画分は、典型的には、大豆ホエーから、最初に１つまたは複数の不純物（例えば微生物またはミネラル）を除去し、続いて１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質（すなわちグリシニンおよびβ−コングリシニン）をはじめとする追加的不純物を除去し、続いて１つまたは複数の大豆ホエータンパク質（例えばＢＢＩおよび他の非ＫＴＩタンパク質またはペプチドをはじめとする）を除去し、および／または続いて糖類をはじめとする１つまたは複数の追加的不純物を除去することで調製される。高純度形態のＫＴＩタンパク質の回収は、希釈により純度を損なうホエーストリームのその他の主要構成要素（例えば貯蔵タンパク質、ミネラル、および糖類）を除去しながら、タンパク質の拮抗物質でありおよび／または有害効果がある構成要素（例えば内毒素）の除去を通じて、タンパク質画分を精製することで、同様に純度を改善することによって改善される。大豆ホエーの様々な構成要素除去は、典型的には、大豆ホエー構成要素を除去する前および／または最中に、大豆ホエーを濃縮するステップを含む。本発明の方法はまた、大量の水性廃棄物を処理することから生じる汚染を低下させる。
【００１６】
貯蔵タンパク質、糖類、ミネラル、およびその他の不純物の除去は、所望のＫＴＩタンパク質に富み、拮抗物質または毒素であることもでき、さもなければ有害効果を及ぼすこともできる不純物を含まない画分を生じる。例えば典型的には、大豆貯蔵タンパク質富化画分を１つまたは複数の大豆ホエータンパク質に富んだ画分と共に回収することもできる。もう１種の糖類（例えばオリゴ糖類および／または多糖類）に富んだ画分もまた、典型的に調製される。したがって本方法は、ＫＴＩタンパク質の回収用基材として適した画分を提供し、水性大豆ホエーからの他の有用な生成物の回収のために使用し得る他の画分もまた提供する。例えば大豆ホエーストリームから糖類および／またはミネラルを除去することで、それから糖類をさらに分離し得る有用な画分が生成され、ひいては次の追加的な有用な画分が生じる。濃縮糖および（クエン酸を含んでもよい）ミネラル画分、および行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として再循環されてもよい比較的純粋な水性画分。このようにして生成されたプロセス水は、本方法を実施する上で特に有用であることもできる。したがって本方法のさらなる利点は、従来の単離物調製法と比較して、減少したプロセス水の所要量であることもできる。
【００１７】
本開示の方法は、少なくとも２つの点で、大豆タンパク質単離物および濃縮物を製造する従来の方法と比較して利点を提供する。言及されたように、大豆タンパク質材料を製造する従来の方法は、典型的には大豆ホエーストリーム（例えば水性大豆ホエーまたは大豆糖蜜）を廃棄する。したがって本開示の方法によって回収される生成物は、付加産物に相当し、従来の大豆タンパク質単離物および大豆タンパク質濃縮物製造との関連で、目下実現されていない収入源に相当する。さらに商品性のある生成物を回収する大豆ホエーストリームまたは大豆糖蜜の処理は、好適には、大豆ホエーストリームまたは大豆糖蜜の処理および廃棄に付随するコストを低減させる。例えば本明細書の他の箇所で詳述する本発明の様々な方法は、比較的純粋な加工ストリームを提供し、それは様々な他の工程で容易に利用され、または行うとしても最小の処理で廃棄されてもよく、それによって方法の環境影響を低下させる。本開示の方法に関連した特定のコストは存在するが、単離される付加産物の利益および廃棄物処理の最小化は、あらゆる付加費用を代償すると考えられる。
【００１８】
Ａ．酸可溶性タンパク質
大豆タンパク質単離物は、典型的には、大豆貯蔵タンパク質の等電点（例えばｐＨ約４．５）において、脱脂大豆フレークまたは大豆粉の水性抽出物から沈殿する。したがって大豆タンパク質単離物は、一般に、酸性液体媒質中で可溶性でないタンパク質を含む。同様に、２番目に最も精製された大豆タンパク質材料である、大豆タンパク質濃縮物のタンパク質は、同じく酸性液体媒質中で一般に可溶性でない。しかし本開示の方法によって回収される大豆ホエータンパク質は、一般に酸可溶性であり、すなわちそれらは酸性液体媒質中で可溶性である。
【００１９】
例えば本開示は、水性大豆ホエーに由来して、周囲条件（例えば約２５℃の温度）において、比較的広範なｐＨの水性（典型的には酸性）媒質（例えばｐＨ約２〜約１０、約２〜約７、または約２〜約６を有する水性媒質）中で有利な溶解度を示す、大豆タンパク質組成物を提供する。典型的には大豆タンパク質組成物の溶解度は、１リットル当たり少なくとも約１０グラム（ｇ／Ｌ）であり、より典型的には少なくとも約１５ｇ／Ｌであり、なおもより典型的には少なくとも約２０ｇ／Ｌである。（添付の特許請求に含まれる）ｐＨ範囲にわたる溶解度への言及は、特定溶解度が、特定ｐＨ範囲内に入るいずれかのそして全てのｐＨ値で達成されることを示唆するものと理解される。例えば約２〜約１０のｐＨ範囲にわたる少なくとも約１０ｇ／Ｌの溶解度への言及は、特定溶解度が、３、４、５、６などのｐＨで達成されることを示唆する。
【００２０】
本開示の方法による酸可溶性大豆タンパク質の回収は、当該技術分野における顕著な進歩に相当する。本明細書で言及されるように、典型的には廃棄される大豆ホエーストリームから、酸可溶性タンパク質が回収される。
【００２１】
Ｂ．Ｋｕｎｉｔｚトリプシンプロテアーゼインヒビター
本明細書で考察するように、例えば大豆ホエーストリームおよび大豆糖蜜ストリームをはじめとする大豆加工ストリームは、Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）タンパク質を含有する。このプロテアーゼインヒビターは、少なくともトリプシンを阻害し、そして一連の重要代謝機能を調節する多様な他の重要プロテアーゼを潜在的に阻害することが知られている。
【００２２】
本実施形態に従って単離されるＫＴＩタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなってもよい。一実施形態では、ＫＴＩタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一であり、より好適には配列番号１と少なくとも８０％同一であり、なおもより好ましくは配列番号１と少なくとも９０％同一であり、最も好適には配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【００２３】
本実施形態の別の態様では、アミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％までも同一である。
【００２４】
本発明の特定の態様では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、アミノ酸配列を比較することで判定される。本発明の特定の態様では、配列同一性は、アミノ酸配列と、その保存アミノ酸置換とを比較することで判定され得る。本発明の別の態様では、本発明のタンパク質は、１つまたは複数の保存的置換を有し得る。本発明の別の態様では、本発明のタンパク質は、１つまたは複数の非保存的置換を有し得る。
【００２５】
天然アミノ酸としては、例えばアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）が挙げられる。
【００２６】
保存的および非保存的アミノ酸置換は当業者に知られており、例えば酸性アミノ酸で別の酸性アミノ酸を置き換えることは、保存的置換と見なすこともできるのに対し、塩基性アミノ酸で酸性アミノ酸を置き換えることは、非保存的置換と見なすこともできる。同様に、極性アミノ酸で別の極性アミノ酸を置き換えることは、保存的置換と見なすこともできるのに対し、非極性アミノ酸で極性アミノ酸を置き換えることは、非保存的置換と見なすこともできる。アミノ酸は一般に、（置換が保存的または非保存的かどうかを判定する指針として使用し得る）以下のカテゴリーに分けられる。（１）極性／親水性：Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｃ、およびＹ；（２）非極性／疎水性：Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、およびＭ；（３）酸性：Ｄ、Ｅ、およびＣ；（４）塩基性：Ｋ、Ｒ、およびＨ；（５）芳香族：Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＨ；および（６）脂肪族：Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＰ。
【００２７】
１つまたは複数のアミノ酸配列が配列番号１と同一でない本発明の特定の態様では、このような１つまたは複数のアミノ酸配列もまた、トリプシン活性を阻害することが知られているＫＴＩタンパク質として機能する。これらの機能を確認する方法は本明細書に記載され、当業者に知られている。
【００２８】
組成物が、配列番号１と同一でない１つまたは複数のアミノ酸配列を含んでなる本発明の他の態様では、このような１つまたは複数のアミノ酸配列もまた、トリプシンを阻害することが知られているＫＴＩタンパク質として機能する。これらの機能を確認する方法は本明細書に記載され、当業者に知られている。
【００２９】
ＫＴＩタンパク質は、１７０〜２００個のアミノ酸残基と、およそ２個のジスルフィド架橋からなる。ＫＴＩタンパク質の一次構造は１９７３年より知られている（Ｋｏｉｄｅ，Ｔ．，ａｎｄ Ｉｋｅｎａｋａ，Ｔ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．３．Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２，４１７，１９７３参照）。
【００３０】
本開示のＫＴＩ生成物の純度は、他のＫＴＩ生成物と比較して、かつて達成されたことのないレベルの純度に相当する。ＫＴＩ画分の純度は、総ＫＴＩタンパク質濃度、比活性（トリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質で測定される）、およびＫＴＩの拮抗物質として機能する構成要素、毒素、またはＫＴＩ単位量当たりの効率を単に希釈する以上に有害効果を及ぼす他の構成要素の不在の関数である。一般に、本開示のＫＴＩ生成物の総ＫＴＩタンパク質濃度は、少なくとも約７０重量％、または少なくとも約８０重量％である。典型的には、本開示のＫＴＩ生成物の総ＫＴＩタンパク質濃度は、少なくとも約９０重量％、好適には少なくとも約９５重量％、およびより好適には少なくとも約９９重量％である。
【００３１】
「純粋」モノマータンパク質は、一次元または二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動後に単一バンドを生じ、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはイオン交換カラムから単一の対称的吸光度ピークとして溶出され、単一セットの質量分光測定、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはＷ吸光度スペクトルシグナルを生じ、該当する場合は汚染酵素活性を含まない。絶対純度は確立され得ないので、慣例的に単純な純度基準、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、単一バンドを超えるタンパク質が検出できないことが使用される。（Ｍｏｈａｎ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１，３０７−３２３（１９９２）を参照されたい）。図３は、一次元ゲル電気泳動に続く本発明のＫＴＩタンパク質を示す。図３が示すように、本発明のＫＴＩタンパク質は、等電点が異なる２１ｋＤａの分子量標準に対応する単一バンドとして示される。
【００３２】
ＫＴＩ画分の純度は、総ＫＴＩタンパク質濃度、比活性（トリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質で測定される）、およびＫＴＩの拮抗物質として機能する構成要素、毒素、またはＫＴＩ単位量当たりの効率を単に希釈する以上に有害効果を及ぼす他の構成要素の不在の関数である。一般に、本開示のＫＴＩ生成物の総ＫＴＩタンパク質濃度は、少なくとも約７０重量％、または少なくとも約８０重量％である。典型的には、本開示のＫＴＩ生成物の総ＫＴＩタンパク質濃度は、少なくとも約９０重量％、好適には少なくとも約９５重量％、およびより好適には少なくとも約９９重量％である。
【００３３】
ＫＴＩ純度と共に、本開示のＫＴＩ生成物の総タンパク質含量は有利であり、および／または技術分野の進歩に相当する。本開示の生成物のＫＴＩタンパク質含量は、例えばＯｈｎｉｓｈｉ，Ｓ．Ｔ．，ａｎｄ Ｂａｒｒ，Ｊ．Ｋ．，Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｕｒｅｔ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８６，１９３（１９７８）に記載されるＬｏｗｒｙ法をはじめとする、当該技術分野で知られている従来の方法によって測定することもできる。一般に、本開示のＫＴＩ生成物の総タンパク含量は、少なくとも約６０重量％（乾燥重量基準）、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、または少なくとも約８５重量％である。典型的には、本開示のＫＴＩ生成物の総タンパク量含量は、少なくとも約９０重量％、好適には少なくとも約９５重量％、より好適には少なくとも約９９重量％である。
【００３４】
ＫＴＩタンパク質はトリプシンのみを阻害することが知られている一方で、タンパク質含有組成物の他の構成要素（例えばＢＢＩタンパク質）は、トリプシンとキモトリプシンの双方を阻害することが知られている。したがって本発明のトリプシン阻害調製品中のキモトリプシン阻害物質活性の不在は、ＫＴＩタンパク質の存在を示唆する。
【００３５】
同様に、本開示のＫＴＩ生成物のトリプシン阻害物質活性（トリプシン阻害物質単位／ｇタンパク質、またはＴＩＵ／ｇタンパク質を単位として表される）は、例えばｐＨ８．２および３７℃で、ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン（ＢＡＰＡニトロアニリン）を基質として、その中で１ＴＩＵが１ｍｇのトリプシンを阻害し得る基質量と定義され、１トリプシン単位が１０分間あたり０．０１９のΔＡ４１０に等しい方法をはじめとする、当該技術分野で知られている従来の方法によって測定されてもよい。概して本開示のＫＴＩ生成物のトリプシン阻害物質活性は、少なくとも約３００ＴＩＵ／ｇタンパク質、典型的には少なくとも約５００ＴＩＵ／ｇタンパク質、より典型的には少なくとも約９５０ＴＩＵ／ｇタンパク質、およびなおもより典型的には、少なくとも約１５００ＴＩＵ／ｇタンパク質である。
【００３６】
ＫＴＩ生成物が、目下、適していると考えられる様々な用途は、内毒素含量が比較的低いことを必要とする。例えば様々な治療用途は、ＫＴＩ生成物が、製薬等級材料に適用される規制を満たすことを必要とする。したがって様々な好ましい態様では、ＫＴＩ生成物の総内毒素含量は、好適には約１．５ＥＵ／ｇタンパク質以下、より好適には約１ＥＵ／ｇタンパク質以下、さらにより好適には約０．５ＥＵ／ｇタンパク質以下、なおもより好ましくは、約０．２５ＥＵ／ｇタンパク質以下である。例えばこのような様々な態様に従って、ＫＴＩ生成物の総内毒素含量は、典型的には約０．１〜約１．５ＥＵ／ｇタンパク質、より典型的には約０．１〜約１．０ＥＵ／ｇタンパク質、なおもより典型的には約０．１〜約０．５ＥＵ／ｇタンパク質（例えば約０．１〜約０．２５ＥＵ／ｇタンパク質）である。さらにまたは代案としては、本開示のＫＴＩ生成物の総内毒素含量は、１グラムのタンパク質当たり約５．０内毒素単位（ＥＵ／ｇタンパク質）以下であり、または約２．５ＥＵ／ｇタンパク質以下である。例えば様々な態様で、総内毒素含量は、約０．１〜約５．０ＥＵ／ｇタンパク質、または約０．１〜約２．５ＥＵ／ｇタンパク質である。
【００３７】
本開示のＫＴＩ生成物は、上で特定される特性の１つ、組み合わせ、または全部を示してもよいものと理解される。例えば、本開示のＫＴＩ生成物は、特定されるＫＴＩ純度および総タンパク量含量を示してもよい。ＫＴＩ生成物はまた、特定されるＫＴＩ純度、トリプシン阻害物質活性、および本明細書で開示される配列を示してもよい。さらなる例として、ＫＴＩ生成物は、特定されるＫＴＩタンパク質濃度および総内毒素含量を示してもよい。これらの態様で、そしてなおも別の態様で、本開示のＫＴＩ生成物は、特定される総大豆タンパク質濃度およびトリプシン阻害物質活性を示してもよい。さらなる例として、本開示のＫＴＩ生成物は、特定される総大豆タンパク質濃度および総内毒素含量を示してもよい。これらのＫＴＩ生成物の諸特性の組み合わせは例示的であり、この一覧が網羅的であることは意図されない。すなわち本開示に従って、ＫＴＩ生成物は、上で特定される何れかの範囲内の上で特定される何れかの値で、上記の諸特性のあらゆる組み合わせを示してもよい。
【００３８】
本発明のＫＴＩは、天然植物ベースのマトリックスからＫＴＩを分離、単離、または精製できるようにする、あらゆる原料またはあらゆるプロセスから入手し得る。非限定的例として、天然植物ベースのマトリックスは、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ ｌｅａｆ ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スメイルメディックシード（ｓｎａｉｌ ｍｅｄｉｃ ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロファ属、緑藻類、およびそれらの組み合わせをはじめとする、マメ科植物に由来し得る。本発明の特定の態様では、ＫＴＩは様々な加工ストリーム中で大豆から得られる。様々な大豆加工ストリームとしては、例えば水性大豆抽出物ストリーム（脱脂大豆材料からなど、その中で大豆ストリームタンパク質の構成要素が可溶性形態であるあらゆるストリーム）、水性豆乳抽出物ストリーム（その中で大豆ストリームタンパク質の構成要素が可溶性形態であるホールまたは部分的脱脂大豆材料からのあらゆるストリーム）、水性大豆ホエーストリーム（貯蔵タンパク質の沈殿または塩析から得られるあらゆるホエーストリーム；沈殿法としては熱ならびに化学処理が挙げられる）、水性大豆糖蜜ストリーム（水性大豆ホエーストリームからの水分除去によって発生するあらゆるストリーム）、水性大豆タンパク質濃縮物大豆糖蜜ストリーム（大豆タンパク質濃縮工程からの可溶性糖類のアルコール抽出からのあらゆるストリーム）、水性大豆透過液ストリーム（より小さな分子量タンパク質が膜を通過する、異なる分子量タンパク質画分の分離から得られるあらゆるストリーム）、および水性豆腐ホエーストリーム（豆腐凝固工程から得られるあらゆるホエーストリームを含む）が挙げられる。本発明の方法によって単離されるＫＴＩ生成物の量は、１グラム程度にわずかであってもよく（実験室規模単離）、または数メートルトンであってもよい（工業的または大規模単離）。
【００３９】
Ｃ．水性ホエーストリーム
大豆加工ストリームの一種である水性ホエーストリームおよび糖蜜ストリームは、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程から発生する。ホールマメ科植物または油糧種子は、多様な適切な植物に由来してもよい。非限定的例として、適切な植物としては、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ ｌｅａｆ ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スネイルメディックシード（ｓｎａｉｌ ｍｅｄｉｃ ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロファ属、緑藻類、およびそれらの組み合わせをはじめとするマメ科植物が挙げられる。一実施形態では、マメ科植物は大豆であり、大豆の精製過程から発生する水性ホエーストリームは、水性大豆ホエーストリームである。
【００４０】
大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されており、典型的には廃棄物として廃棄される。特に水性大豆ホエーストリームは、典型的には約１０重量％未満、典型的には約７．５重量％未満、なおもより典型的には約５重量％未満の総固形分を有する。例えば様々な態様で、水性大豆ホエーストリームの固形分は約０．５〜約１０重量％、約１重量％〜約４重量％、または約１〜約３重量％（例えば約２重量％）である。したがって工業的大豆タンパク質単離物製造中に、処理または廃棄しなくてはならない顕著な体積の廃水が発生する。
【００４１】
大豆ホエーストリームは、典型的には、出発原料大豆の最初の大豆タンパク質含量のかなりの部分を含有する。本明細書の用法では「大豆タンパク質」という用語は、概して、大豆に天然のあらゆるそして全てのタンパク質を指す。天然大豆タンパク質は、概して、親水性シェルで取り囲まれる疎水性コアを有する球形タンパク質である。例えばグリシニンやβ−コングリシニンなどの貯蔵タンパク質をはじめとする、多数の大豆タンパク質が同定されている。大豆タンパク質は同様に、上記のＫＴＩタンパク質などのプロテアーゼインヒビターを含む。大豆タンパク質はまた、レクチン、リポキシゲナーゼ、β−アミラーゼ、およびルナシンなどの赤血球凝集素も含む。大豆植物は、形質転換されて、常態では大豆植物によって発現されない他のタンパク質を産生しうることに留意されたい。本明細書の「大豆タンパク質」への言及は、このようにして生成されたタンパク質を同様に考察するものと理解される。
【００４２】
乾燥重量基準で、大豆タンパク質は、大豆ホエーストリームの少なくとも約１０重量％、少なくとも約１５重量％、または少なくとも約２０重量％（乾燥重量基準）を構成する。典型的には、大豆タンパク質は、大豆ホエーストリームの約１０〜約４０重量％、または約２０重量％〜約３０重量％（乾燥重量基準）を構成する。大豆タンパク質単離物は、典型的には、大豆の貯蔵タンパク質のかなりの部分を含有する。しかし単離沈殿後に残留する大豆ホエーストリームも、同様に１つまたは複数の大豆貯蔵タンパク質を含有する。
【００４３】
様々な大豆タンパク質に加えて、水性大豆ホエーストリームは、同様に１つまたは複数の炭水化物（すなわち糖類）を含んでなる。概して、糖類は大豆ホエーストリームの少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４５重量％を（乾燥重量基準）を構成する。典型的には、糖類は大豆ホエーストリームの約２５％〜約７５％、より典型的には約３５％〜約６５％、なおもより典型的には、約４０％〜約６０重量％（乾燥重量基準）を構成する。
【００４４】
大豆ホエーストリームの糖類は、概して１つまたは複数の単糖類、および／または１つまたは複数のオリゴ糖類または多糖類を含む。例えば様々な態様で、大豆ホエーストリームは、グルコース、果糖、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される単糖類を含んでなる。典型的には単糖類は大豆ホエーストリーム（乾燥重量基準）の約０．５％〜約１０重量％、より典型的には約１％〜約５重量％を構成する。さらにこれらの態様および様々な他の態様に従って、大豆ホエーストリームは、スクロース、ラフィノース、スタキオース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるオリゴ糖類を含んでなる。典型的にはオリゴ糖類は、大豆ホエーストリームの約３０％〜約６０％、より典型的には、約４０％〜約５０重量％（乾燥重量基準）を構成する。
【００４５】
水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、例えば様々なミネラル、フィチン酸、クエン酸、およびビタミンをはじめとする多様な構成要素を含む、灰画分を含んでなる。大豆ホエーストリーム中に典型的に存在するミネラルとしては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン、マグネシウム、塩化物、鉄、マンガン、亜鉛、銅、およびそれらの組み合わせが挙げられる。大豆ホエーストリーム中に存在するビタミンとしては、例えばチアミンおよびリボフラビンが挙げられる。その正確な組成にかかわらず、灰画分は、典型的には大豆ホエーストリームの約５％〜約３０％、より典型的には約１０％〜約２５重量％（乾燥重量基準）を構成する。
【００４６】
水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、概して大豆ホエーストリームの約０．１％〜約５重量％（乾燥重量基準）を構成する、脂肪画分を含んでなる。本発明の特定の態様では、脂肪含量は酸加水分解によって測定され、大豆ホエーストリームの約３重量％（乾燥重量基準）である。
【００４７】
上の構成要素に加えて、水性大豆ホエーストリームはまた、典型的には、例えば様々な細菌、カビ、および酵母をはじめとする、１つまたは複数の微生物を含んでなる。これらの構成要素の比率は、典型的には、ミリリットル当たり約１００〜約１×１０9コロニー形成単位（ＣＦＵ）で変動する。本明細書の他の箇所で詳述されるように、様々な態様で、タンパク質の回収および／または単離に先だって、水性大豆ホエーストリームを処理してこれらの構成要素を除去する。
【００４８】
言及されたように、大豆タンパク質単離物の従来の製造は、典型的には大豆タンパク質単離物の単離後に残留する、水性大豆ホエーストリームの廃棄を含む。本開示に従って、１つまたは複数のタンパク質および様々な他の構成要素（例えば糖類およびミネラル）の回収は、比較的純粋な水性ホエーストリームをもたらす。タンパク質および１つまたは複数の構成要素が除去されていない従来の大豆ホエーストリームは、概して廃棄および／または再利用に先だって処理が必要である。本開示の様々な態様に従って、水性ホエーストリームは、行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として利用されてもよい。例えば水性ホエーストリームは、本開示の１つまたは複数の濾過（例えば透析濾過）操作で使用されてもよい。
【００４９】
大豆糖蜜ストリームは追加的タイプの大豆加工ストリームであることから、本明細書に記載される方法は、大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリームからのＫＴＩタンパク質の回収に加えて、同様に、大豆タンパク質濃縮物の製造において発生する大豆糖蜜ストリームの１つまたは複数の構成要素の回収に適するものと理解される。
【００５０】
Ｄ．ＫＴＩタンパク質の回収
本明細書に記載される方法は、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程から発生する水性ホエーストリーム中に存在する、精製ＫＴＩタンパク質の回収および単離を対象とする。上で考察したように、ホールマメ科植物または油糧種子は、多様な適切な植物に由来してもよい。非限定的例として、適切な植物としては、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦，オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド（ｌａｎｃｅｐｏｄｓ）（例えば、アップルリーフシード（ａｐｐｌｅ ｌｅａｆ ｓｅｅｄ））、アルファルファ、スネイルメディックシード（ｓｎａｉｌ ｍｅｄｉｃ ｓｅｅｄｓ）、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル（ｃｈａｐｕｌｅ）、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロファ、緑藻類、およびそれらの混合物をはじめとするマメ科植物が挙げられる。一実施形態では、マメ科植物は大豆であり、大豆精製過程から発生する水性ホエーストリームは、水性大豆ホエーストリームである。
【００５１】
様々な態様で、本開示は大豆タンパク質単離物の製造において発生する水性大豆ホエーストリーム中に存在する、ＫＴＩタンパク質を回収および単離する方法を提供する。本発明の方法が、大豆ホエーまたは大豆糖蜜ストリームに限定されるものではなく、多種多様なマメ科植物加工ストリームから、タンパク質および様々な他の構成要素を回収するのに使用されてもよいことに留意すべきである。様々な態様で、高比率のＫＴＩタンパク質を含んでなる画分が、大豆ホエーストリームから回収される。
【００５２】
本開示の方法によって処理された大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されている。ＫＴＩタンパク質の回収および／または単離を促進するために、ホエーストリームは好適には、方法の初期段階で濃縮される。大豆ホエーストリームを濃縮することは、ホエーストリームからのＫＴＩタンパク質の回収および分離を助ける。例えば本開示の好ましい実施形態では、ＫＴＩタンパク質の回収に先だって、水性大豆ホエーまたはその画分を分離膜に接触させ、水性大豆ホエーを含んでなる残余分と、水を含んでなる透過液とを形成することで、水性大豆ホエーから水を除去する。本開示の別の実施形態では、当該技術分野で知られているあらゆる方法を通じて、例えば蒸発によって、水を大豆ホエーから除去してもよい。
【００５３】
ＫＴＩタンパク質の回収と共に、本開示の方法は、典型的には、大豆ホエーストリーム中に存在する糖類からタンパク質を分離する。場合により、本開示の方法は、大豆ホエーストリームの糖類を１つまたは複数の画分（例えば単糖類に富む画分および／またはオリゴ糖類に富む画分）に分離するように、構成され制御されていてもよい。これは多段階で実施して、タンパク質から異なる糖類を分離してもよい。大豆ホエーストリームからの糖類の回収は、このようにしてさらなる生成流を提供する。言及されたように、糖の除去は、典型的には、それから糖類を分離し得る画分を生成し、濃縮糖画分、および行うとしても最小の処理で廃棄され、またはプロセス水として再循環されてもよい比較的純粋な水性画分の双方が生じる。
【００５４】
糖類を除去する残余分の処理に続き、残余分をさらに処理して追加的構成要素を除去する。言及されたように、本開示によって処理されてもよい様々な大豆ホエーストリームは、１つまたは複数のミネラル（例えばリンおよびカルシウム）を含む。１つまたは複数のミネラルの存在は、例えば膜の汚損と、回収を所望する構成要素（すなわちＫＴＩタンパク質）からの分離の困難さによって、後処理過程に難題をもたらすこともあることが観察されている。これらの所望の構成要素の回収に加えて、概して大豆ホエーからのミネラルの除去は、目下、純度がより高いことを特徴とするＫＴＩ生成物の回収にも寄与すると考えられている。本明細書の他の箇所で詳述されるように、大豆ホエーからのミネラル除去は、概して、例えば沈殿および遠心分離をはじめとする、当該技術分野で知られている方法に従って進行させてもよい。フィチン酸が、典型的には、本方法によって処理された水性大豆ホエーストリーム中に存在するので、カルシウムおよびマグネシウムなどのミネラルは、典型的にはフィチン酸カルシウムおよびフィチン酸マグネシウムの形態で回収される。除去される他のミネラルとしては、例えばナトリウム、カリウム、亜鉛、鉄、マンガン、および銅もまた挙げられる。
【００５５】
本開示は、大豆タンパク質単離物の製造において発生する、水性大豆ホエーストリームからのＫＴＩタンパク質の回収に適した多様な方法を包含する。概して、本開示の方法は、水性大豆ホエーストリーム特定の構成要素を分離するように設計され設定された１つまたは複数の操作を含み、それによってホエーストリームを濃縮し、精製ＫＴＩタンパク質をそれから回収できるようにする。
【００５６】
概して、本開示に従って、例えば以下をはじめとする、当該技術分野で良く知られている多様な分離または精製技術の何れかを利用して、水性大豆ホエー中に見られる様々な妨害性構成要素を除去し、それから精製ＫＴＩタンパク質を単離してもよい。膜分離技術（例えば限外濾過、精密濾過、ナノ濾過などの濾過、および／または逆浸透）、クロマトグラフ分離技術（例えばイオン交換クロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、および例えばアニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーをはじめとする親和性クロマトグラフィー、模擬移動床クロマトグラフィー、膨張床吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および／または混合床イオン交換）、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、およびそれらの組み合わせ。濾過用途では、濾過媒質の透過度が、サンプルの化学、分子または静電諸特性によって影響され得るが、様々な構成要素分離の主要原理は分子サイズである。本明細書の他の箇所で詳述されるように（例えば下の図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄへの言及）、本開示の方法は、典型的には、除去するホエーストリームの特定構成要素次第で、１つを超えるタイプの分離膜を利用する。例えば方法の一工程は限外濾過分離膜を利用し、ナノ濾過分離膜を用いる１つまたは複数の工程がそれに続いてもよい。
【００５７】
不溶性固形物の除去の特定の態様では、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、およびそれらの組み合わせを使用してもよい。これらの方法によって除去される不溶性固形物は、典型的には２０μｍを超える。
【００５８】
精密濾過は、精密濾過膜を使用することで、固体粒子を流体から分離する方法である。適切な精密濾過膜は、例えばポリスルホン、変性ポリスルホン、セラミック、およびステンレス鋼をはじめとする当該技術分野で知られている適切な材料から構成される。精密濾過膜は、典型的には、約０．１ミクロン（μｍ）〜約２０μｍの範囲の孔径を有する。特定の態様では、精密濾過膜は約０．２μｍ〜約２μｍにわたる孔径を有する。
【００５９】
限外濾過は精密濾過と類似するが、分離膜の孔径の点で異なる。限外濾過膜は、典型的には、より低い分子量を有する分子から、（例えばタンパク質をはじめとする）高分子量を有する分子を分離するのに使用される。適切な限外濾過膜は、典型的には、例えばポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニリデンフッ化物（ＰＶＤＦ）、再生セルロース（ＲＣ）、セラミック、ステンレス鋼、または薄膜複合材などの当該技術分野で知られている適切な材料から構成される。限外濾過膜は、典型的には約１〜約３００キロダルトン（ｋＤａ）または約５〜約５０ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する。さらにまたは代案としては、適切な限外濾過膜は、約０．００２μｍ〜約０．５μｍの孔径を有してもよい。
【００６０】
ナノ濾過を使用して、流体から小分子が除去される。適切なナノ濾過膜は、典型的には、当該技術分野で知られている適切な材料（例えばポリエステル上のポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セラミック、およびポリアミド−タイプの薄膜複合材）から構成され、典型的には約０．１〜約５ｋＤａまたは約１〜約４ｋＤａのＭＷＣＯを有する。さらにまたは代案としては、適切なナノ濾過膜は、約０．０００９μｍ〜約０．００９μｍの孔径を有してもよい。
【００６１】
逆浸透（または超濾過）は、典型的には糖類の濃縮のために使用される。適切な逆浸透膜としては、概して当該技術分野で知られているもの（例えば孔径が０．５ｎｍ未満の膜）が挙げられる。
【００６２】
本発明の濾過工程で利用される分離膜は、単独でまたは組み合わせで、当該技術分野で知られている、１つまたは複数の立体配置に従って配置されもよい。例えば膜は、その中で（任意の分離スクリーン層と共に）膜層が共に組み合わされた、平板、またはカセットモジュールの形態に構成されてもよい。水性大豆ホエーは、概して重なりの一端の交互の溝内に導入され、流体は膜を通過して、１つまたは複数の濾液または透過液溝に入る。分離膜はまた、その中で膜の交互の層が中空の中核周囲に巻かれる、らせん巻きモジュールに配列されてもよい。水性大豆ホエーがモジュールの一端に導入される一方で、流体は膜の交互の層を通過して、モジュールのコア内に向かう。さらなる例として、分離膜は、比較的細い膜管束を含んでなる中空繊維モジュールに配列されてもよい。水性大豆ホエーがモジュール内に導入され、流体は、モジュールを通過する大豆ホエー流を横断する膜管束を通過する。適切な膜配置は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，９４６，０７５号明細書に記載される。
【００６３】
本発明の濾過工程は、本明細書でさらに詳しく述べるように、正流（垂線流）濾過または接線流（十字流）濾過を利用してもよい。正流または垂線流濾過では、流体（すなわち水性大豆ホエー）は、そのまま分離膜に向かって運ばれる。代案としては、接線流または十字流濾過では、流体（すなわち水性大豆ホエー）は、分離膜表面に沿って接線方向に運ばれてもよい。接線流または十字流濾過の１つの利点は、水性大豆ホエー流によって膜上に接線方向に及ぼされる摩擦または掃引力が、典型的には、流動速度を保つのを助けることである。したがって本開示の方法の様々な態様において、１つまたは複数のステップ、およびそれらの組み合わせは、十字流濾過として操作される。適切な十字流フィルターとしては、米国特許第６，９４６，０７５号明細書に記載されるものをはじめとする、概して当該技術分野で知られているものが挙げられる。液体通過は、適切には、正流および／または接線（すなわち十字）流に従って進行してもよいものと理解される。図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄに示される実施形態、およびその他の態様との関連で、本明細書の他の箇所で詳述される他の膜分離ユニットを通る液体の通過は、これらの機序のどちらかまたは双方に従って進行してもよいものとさらに理解される。
【００６４】
本発明によって記載される方法は、大豆ホエーストリームから様々な構成物を逐次除去し、またはＫＴＩ生成物を回収または単離する、適切な分離操作または操作の組み合わせの選択を伴い、ＫＴＩ生成物は、当該技術分野でかつて達成されたことのない純度レベルを有する。概して、および本明細書の他の箇所で詳述されるように、ＫＴＩタンパク質を回収する方法は、膜分離と（例えばイオン交換）クロマトグラフ分離操作の組み合わせを利用する。
【００６５】
本明細書の他の箇所で言及されるように、本開示の方法によって処理された水性大豆ホエーストリームは、概して比較的希釈されている。様々な態様で、水性大豆ホエーは、標的とされる個々のタンパク質の回収に先だって、水分除去により少なくとも約２（例えば約３または約６）の濃縮係数に濃縮される。
【００６６】
ＫＴＩタンパク質を回収する他の方法と比較して、模擬移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーによるＫＴＩタンパク質の回収は、概して、少なくともある程度は水性大豆ホエーの複数サンプル処理への適応性に起因する、コスト低下、処理能力、および／または順応性の利点もまた提供してもよい。
【００６７】
大豆ホエーストリームの１つまたは複数の構成要素が、ＫＴＩタンパク質の回収を妨げることもあることが観察されている。例えば大豆タンパク質単離物の製造中に、典型的にはシリコーンであるケイ素化合物が、通常、Ｈｙｄｒｉｔｅ ＣｈｅｍｉｃａｌまたはＥｍｅｒａｌｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓから市販されるものなどのケイ素含有化合物の形態で、脱泡剤として導入されることが多い。正確な起源を問わず、有機ケイ素化合物は、典型的には、ケイ素含量を基準にして約１５百万分率（ｐｐｍ）まで、約１０ｐｐｍまで、または約５ｐｐｍまでの濃度で、大豆ホエーストリーム中に存在する。有機ケイ素化合物の存在は大豆ホエーストリームのＫＴＩタンパク質の回収を妨げることもあるので、概して望まれない。
【００６８】
したがって本明細書の他の箇所で詳述されるように、ＫＴＩタンパク質の回収および分離処理に先だって、様々な態様で、大豆ホエーストリームからシリコーンおよび／または他の有機ケイ素化合物が除去される。好適には、ケイ素化合物は、本明細書でさらに詳述するように、大豆ホエーが痕跡量以下のレベルの有機ケイ素を含有する程度まで、除去される。さらにまたは代案としては、水性大豆ホエーは、水性大豆ホエーの所望の構成要素の回収を妨げることもあり、および／または方法の最終回収生成物中で望まれない、１つまたは複数の微生物を含むこともある。
【００６９】
これらの妨害性構成要素を除去するために、ケイ素脱泡剤および／または１つまたは複数の微生物の保持に対して選択的である分離膜を使用して、大豆ホエーストリームを濾過して、ケイ素および／または１つまたは複数の微生物を含んでなる残余分と、水性大豆ホエーを含んでなる透過液とを得てもよい。この最初の精製で使用される（例えば精密濾過をはじめとする）特定の膜は、除去する構成要素を考慮して選択される。選択される膜のタイプ、および大豆ホエーストリームから除去する構成要素にかかわらず、好適には所望のＫＴＩタンパク質の少なくともかなりの部分が、そして好適には実質的に全部が、残余分中に見られる。さらにこの点において、水性大豆ホエーを含んでなる透過液への言及は、１つまたは複数の不純物を除去するホエーストリームの処理が大豆ホエーストリームの他の構成要素に及ぼす影響は、たとえあったとしてもわずかであることを示唆することに留意されたい。
【００７０】
様々な代案の態様で、ホエーストリームに含有される細菌は、タンパク質回収に先だって加熱により死滅させてもよい。細菌を破壊するための大豆ホエーストリームの加熱様式は厳密に決定的でなく、概して、当該技術分野で知られている従来の方法に従って行ってもよい。
【００７１】
分離は決して１００％でないため、各ストリーム中に残留構成要素があり得ることが分離技術当業者によって理解される。さらに当業者は、分離技術が出発原料次第で異なり得ることを理解する。
【００７２】
工程０（図１Ａ参照）−ホエータンパク質前処理は、単離大豆タンパク質（ＩＳＰ）糖蜜、ＩＳＰホエー、大豆タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）糖蜜、ＳＰＣホエー、機能性大豆タンパク質濃縮物（ＦＳＰＣ）ホエー、およびそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、供給流から出発し得る。ホエータンパク質前処理工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、塩酸、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ｐＨを調節した後の工程０のｐＨは、約３．０〜約６．０、または３．５〜５．５、または約５．３であり得る。温度は約７０℃〜約９５℃、または約８５℃であり得る。温度保持時間は約０分間〜約２０分間で異なり、または約１０分間であり得る。保持時間後、ホエーストリームから沈殿物を分離するために、典型的には間欠排出ディスク清澄化遠心分離である遠心分離工程にストリームを通過させる。ホエータンパク質前処理からの生成物としては、ストリーム０ａ中のホエーストリーム（前処理大豆ホエー）（分子量約５０キロダルトン（ｋＤａ）以下）の水相中の可溶性構成要素と、前処理大豆ホエー、貯蔵タンパク質、およびそれらの組み合わせなどのストリーム０ｂ中の不溶性のより大きな分子量のタンパク質（約３００ｋＤａ〜約５０ｋＤａ）とが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
工程１（図１Ａ参照）−微生物学減少（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）は、前処理大豆ホエーをはじめとするが、これに限定されるものではない、ホエータンパク質前処理工程の生成物から出発し得る。この工程は、前処理大豆ホエーの精密濾過を伴う。この工程のプロセス変量および代替物としては、遠心分離、全量濾過、加熱滅菌、紫外線滅菌、精密濾過、十字流膜濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約３．５〜約５．５、または約５．３であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃または約５０℃であり得る。工程１からの生成物としては、ストリーム１ａ中の貯蔵タンパク質、微生物、ケイ素、およびそれらの組み合わせと、ストリーム１ｂ中の精製前処理大豆ホエーが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７４】
工程２（図１Ａ参照）−水およびミネラル除去は、ストリーム１ｂまたは４ａからの精製前処理大豆ホエー、またはストリーム０ｂからの前処理大豆ホエーから出発し得る。それは水除去および部分的ミネラル除去のためのナノ濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、十字流膜濾過、逆浸透、蒸発、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程２のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約３．５〜約５．５、または約５．３であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。この水除去工程からの生成物としては、ストリーム２ａ中の精製前処理大豆ホエーと、ストリーム２ｂ中の水、幾種かのミネラル、一価のカチオン、およびそれらの組み合わせとが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７５】
工程３（図１Ａ参照）−ミネラル沈殿工程は、ストリーム２ａからの精製前処理大豆ホエー、またはストリーム０ａまたは１ｂからの前処理大豆ホエーから出発し得る。それはｐＨおよび／または温度変化による沈殿工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、撹拌または再循環反応タンクが挙げられるが、これに限定されるものではない。ミネラル沈殿工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩酸、塩化ナトリウム、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程３のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約８．０であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ｐＨ保持時間は、約０分間〜約６０分間、または約５分間〜約２０分間で異なり、または約１０分間であり得る。ストリーム３の生成物は、精製前処理大豆ホエーと沈殿したミネラルとの懸濁液である。
【００７６】
工程４（図１Ａ参照）−ミネラル除去工程は、ストリーム３からの精製前処理ホエーと沈殿したミネラルとの懸濁液から出発し得る。それは遠心分離工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、遠心分離、濾過、全量濾過、十字流膜濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ミネラル除去工程からの生成物としては、ストリーム４ａ中の脱ミネラル前処理ホエーと、ストリーム４ｂ中の幾種かのタンパク質ミネラル複合体がある不溶性ミネラルとが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７７】
工程５（図１Ｂ参照）−タンパク質分離および濃縮工程は、ストリーム４ａからの精製前処理ホエー、またはストリーム０ａ、１ｂ、または２ａからのホエーから出発し得る。それは限外濾過工程を含む。限外濾過工程で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩酸、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この工程のプロセス変量および代替物としては、十字流膜濾過、限外濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程５のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約８．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、または約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム５ａからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム５ｂからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７８】
工程６（図１Ｂ参照）−タンパク質の洗浄および精製工程は、ストリーム４ａまたは５ａからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、または精製前処理ホエー、またはストリーム０ａ、１ｂ、または２ａからのホエーから出発し得る。それは透析濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、再スラリー化、十字流膜濾過、限外濾過、水透析濾過、緩衝液透析濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。タンパク質洗浄および精製工程で使用し得る加工助剤としては、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程６のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム６ａからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム６ｂからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７９】
工程７（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム５ｂおよび／またはストリーム６ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それはナノ濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、逆浸透、蒸発、ナノ濾過、水透析濾過、緩衝液透析濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程７のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム７ａからの生成物としては、ペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム７ｂからの生成物としては、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８０】
工程８（図１Ｃ参照）−ミネラル除去工程は、ストリーム５ｂ、６ｂ、７ａ、および／または１２ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それは電気透析膜工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、イオン交換カラム、クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。このミネラル除去工程で使用し得る加工助剤としては、水、酵素、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。酵素としては、プロテアーゼ、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程８のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜５０℃、または約４０℃であり得る。ストリーム８ａからの生成物としては、導電率が約１０ミリジーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍ）〜約０．５ｍＳ／ｃｍ、または約２ｍＳ／ｃｍの脱ミネラル大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム８ｂからの生成物としては、ミネラル、水、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
工程９（図１Ｃ参照）−色除去工程は、ストリーム８ａ、５ｂ、６ｂ、１２ｂ、および／または７ａ）からの脱ミネラル大豆オリゴ糖類から出発し得る。それは活性炭素床を利用する。この工程のプロセス変量および代替物としては、イオン交換が挙げられるが、これに限定されるものではない。この色除去工程で使用し得る加工助剤としては、活性炭素、イオン交換樹脂、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。温度は、約５℃〜約９０℃、または約４０℃であり得る。９ａからの生成物ストリームとしては、着色化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム９ｂは脱色溶液である。ストリーム９ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８２】
工程１０（図１Ｃ参照）−大豆オリゴ糖類分画工程は、ストリーム９ｂ、５ｂ、６ｂ、７ａ、および／または８ａからの大豆オリゴ糖類、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それはクロマトグラフィー工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、クロマトグラフィー、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この大豆オリゴ糖類分画工程で使用し得る加工助剤としては、当業者なら使用樹脂に基づいて分かるであろう、ｐＨを調節するための酸または塩基が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１０ａからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１０ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
工程１１（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム９ｂ、５ｂ、６ｂ、７ａ、８ａ、および／または１０ｂからの大豆オリゴ糖類から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、蒸発、逆浸透、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。水除去工程で使用し得る加工助剤としては、脱泡剤、蒸気、真空、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。温度は、約５℃〜約９０℃、または約６０℃であり得る。ストリーム１１ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１１ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
工程１２（図１Ｃ参照）−大豆オリゴ糖類工程からの追加的タンパク質分離は、ストリーム７ａ、５ｂ、および／または６ｂからのペプチド、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせから出発し得る。それは限外濾過工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、十字流膜濾過、孔径約５０ｋＤａ〜約１ｋＤａの限外濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この糖類工程からのタンパク質分離で使用し得る加工助剤としては、酸、塩基、プロテアーゼ、フィターゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１２のｐＨは約２．０〜約１２．０、約７．０であり得る。温度は、約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム１２ｂからの生成物としては、大豆オリゴ糖類、水、ミネラル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１２ａからの生成物としては、ペプチド、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８５】
工程１３（図１Ｃ参照）−水分除去工程は、ストリーム１２ａからのペプチド、および他のタンパク質から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、逆浸透、ナノ濾過、噴霧乾燥、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１３ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１３ｂからの生成物としては、ペプチド、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
工程１４（図１Ｂ参照）−タンパク質分画工程は、ストリーム６ａおよび／または５ａからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、貯蔵タンパク質、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせから出発して実施されてもよい。それは限外濾過（孔径３００ｋＤａ〜１０ｋＤａ）工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、十字流膜濾過、限外濾過、ナノ濾過、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。十字流膜濾過としては、らせん巻き、平板、中空繊維、セラミック、動的または回転ディスク、ナノファイバー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。工程１４のｐＨは、約２．０〜約１２．０、または約６．０〜約９．０、または約７．０であり得る。温度は約５℃〜約９０℃、約２５℃〜７５℃、または約５０℃であり得る。ストリーム１４ａからの生成物としては、貯蔵タンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１４ｂからの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８７】
工程１５（図１Ｂ参照）−水分除去工程は、ストリーム６ａ、５ａ、および／または１４ｂからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質から出発し得る。それは蒸発工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、蒸発、ナノ濾過、ＲＯ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１５ａからの生成物としては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１５ｂの生成物としては、大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、他のタンパク質、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８８】
工程１６（図１Ｂ参照）−熱処理およびフラッシュ冷却工程は、ストリーム６ａ、５ａ、１４ｂ、および／または１５ｂからの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質から出発し得る。それは超高温工程を含む。この工程のプロセス変量および代替物としては、加熱滅菌、蒸発、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。この熱処理およびフラッシュ冷却工程で使用し得る加工助剤としては、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。加熱工程の温度は、約１２９℃〜約１６０℃、または約１５２℃であり得る。温度保持時間は、約８秒間〜約１５秒間、または約９秒間であり得る。フラッシュ冷却時には、温度は約５０℃〜約９５℃、または約８２℃であり得る。ストリーム１６からの生成物としては、大豆ホエータンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
工程１７（図１Ｂ参照）−乾燥工程は、ストリーム６ａ、５ａ、１４ｂ、１５ｂ、および／または１６からの大豆ホエータンパク質、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質から出発し得る。それは乾燥工程を含む。液体供給温度は、約５０℃〜約９５℃、または約８２℃であり得る。入口温度は、約１７５℃〜約３７０℃、または約２９０であり得る℃。排気温度は、約６５℃〜約９８℃、または約８８℃であり得る。１７ａからの生成物ストリームとしては、水が挙げられるが、これに限定されるものではない。ストリーム１７ｂからの生成物としては、ＢＢＩ、ＫＴＩ、および他のタンパク質を含む、大豆ホエータンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９０】
図１Ｄは大豆タンパク質単離物の製造において発生する大豆ホエーストリームから、１つまたは複数の個々のタンパク質を回収する、本開示の方法の実施形態を示す。
【００９１】
図１Ｄには示されないが、ホエータンパク質の前処理は、単離大豆タンパク質（ＩＳＰ）糖蜜、ＩＳＰホエー、大豆タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）糖蜜、ＳＰＣホエー、機能性大豆タンパク質濃縮物（ＦＳＰＣ）ホエー、およびそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない加工ストリームから出発し得る。前処理工程で使用し得る加工助剤ホエータンパク質としては、酸、塩基、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、塩酸、水、蒸気、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。前処理工程のｐＨは、約３．０〜約６．０、好適には４．５であり得る。温度は約７０℃〜約９５℃、好適には約８５℃であり得る。温度保持時間は、約０分間〜約２０分間で異なり得て、好適には約１０分間である。ホエータンパク質の前処理からの生成物としては、残余分中のホエーストリームの水相中の可溶性構成要素（前処理大豆ホエー）（分子量約５０キロダルトン（ｋＤａ）以下）と、前処理大豆ホエー、貯蔵タンパク質、およびそれらの組み合わせなどの透過液中の不溶性の大きな分子量のタンパク質（約３００ｋＤａ〜約５０ｋＤａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９２】
図１Ｄに示されるように、（前処理されてもよい）大豆ホエー１は、膜の反対側の第１の透過液ゾーン８内の圧力よりも高い圧力で分離膜７の片側と接する、第１の濾過供給ゾーン６を含んでなる膜分離ユニット５内に誘導される。好適には膜分離ユニット５は、少なくとも１つの精密濾過膜を含んでなる。
【００９３】
膜分離ユニット５内の分離膜７を横切る膜貫通圧力は、概して少なくとも約１ｐｓｉ、少なくとも約５ｐｓｉ、少なくとも約１０ｐｓｉ、少なくとも約２０ｐｓｉ、少なくとも約３０ｐｓｉ、少なくとも約４０ｐｓｉ、少なくとも約５０ｐｓｉ、または少なくとも約７５ｐｓｉである。流体は、典型的には少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2、または約１〜約４００リットル流体／時間−ｍ2の流れ方向を横断する膜断面積の体積流量または流速で膜を通過する。流速は、例えば濾過のタイプ、膜の汚損などによって影響されることもある。大豆ホエーは、典型的には約０℃〜約１００℃の温度、より典型的には約２５℃〜約７５℃の温度で、膜分離ユニットの濾過供給ゾーン内に導入される。典型的には水性大豆ホエー１は、残余分のために体積が約５％減少する。分離膜を通過する液体通過は、第１の透過液ゾーン８内に、第１の残余分９と第１の透過液１３をもたらす。第１の残余分９は、主として１つまたは複数の微生物と不溶性物質を含んでなり、特に第１の残余分９は、典型的には第１の透過液１３と比較して微生物に富む。好適には、第１の残余分９は、水性大豆ホエーの微生物含量の実質的に全部でないとしても、かなりの部分を含有する。なおもより好ましくは、第１の残余分９はまた、消泡剤（例えば水性大豆ホエー中に存在する、有機ケイ素または脂質含有化合物のケイ素）のかなりの部分を含んでなり、特に好適には、消泡剤含量を基準にして、水性大豆ホエーの消泡剤含量の少なくとも約７０重量％、より好適には少なくとも約８０重量％、さらにより好適には少なくとも約９０重量％を含んでなる。第１の透過液１３は、主として、可溶性大豆貯蔵タンパク質、大豆ホエータンパク質、様々な糖類、水、ミネラル、イソフラボン、およびビタミンなどの水性大豆ホエーストリームの様々な残りの構成要素の全てを含んでなる。
【００９４】
再度図１Ｄに言及すると、第１の透過液１３は、第２の透過液ゾーン２０内の圧力よりも高い圧力で分離膜１９の片側に接する第２の濾過供給ゾーン１８を含んでなる、膜分離ユニット１７内に導入される。膜分離ユニット１７は、好適には分離膜１９として、少なくとも１つの限外濾過膜を含んでなる。膜分離ユニット１７内の分離膜１９を越える膜貫通圧力は、概して少なくとも約５ｐｓｉ、少なくとも約１０ｐｓｉ、少なくとも約２５ｐｓｉ、少なくとも約５０ｐｓｉ、少なくとも約１００ｐｓｉ、または少なくとも約１５０ｐｓｉである。流体は、典型的には、以下の体積流量または流速で膜を通過する。少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2、または約１〜約１５０リットル流体／時間−ｍ2の流れ方向を横断する膜断面積。大豆ホエーは、典型的には、約０℃〜約１００℃の温度、より典型的には約２５℃〜約７５℃の温度で、膜分離ユニットの濾過供給ゾーン内に導入される。典型的には、水性大豆ホエー１は、少なくとも約５、または約５〜約７５（例えば約２５）の濃縮係数に濃縮される。限外濾過工程には透析濾過が含まれていてもよい。透析濾過体積は、典型的には、残余分１部当たり約１〜約１０部の透析濾過体積に及んでもよい。
【００９５】
分離膜を通る液体通過は、第２の残余分２１と第２の透過液２５をもたらす。第２の残余分２１は水性大豆ホエーのタンパク質含量の顕著な画分を含んでなり、したがってＫＴＩタンパク質の回収のためにさらに処理される。好適には第２の残余分２１は、第１の濾過供給ゾーン６内に導入された水性大豆ホエー中に存在する様々な大豆ホエータンパク質の少なくとも約２５重量％〜少なくとも約９０重量％（例えば少なくとも約５０重量％）（乾燥重量基準）を含んでなる。
【００９６】
再度図１Ｄに言及すると、第２の透過液２５は、概して、第２の残余分２１中で回収されないあらゆるタンパク質と、大豆ホエーストリームの様々な他の構成要素（例えば様々な糖類、水、ミネラル、ビタミン、およびイソフラボン）とを含んでなる。図１Ｄには示されないが、水性ホエーストリームから個々の構成要素を単離しおよび／または除去するために、適切な分離操作に従って、第２の透過液２５の構成要素をさらに処理してもよい。追加的分離工程に続いて、廃棄または使用に先立って、行うとしても最小の処理を要する、比較的純粋な水ストリームが好適には形成される。したがって本明細書に記載される本発明は、例えば環境の質を改善することで環境上の利点もまた有する。
【００９７】
第２の残余分２１をキャリアストリーム２３と合わせて、少なくとも１つのイオン交換樹脂３０を含有する、イオン交換カラムまたはユニット２９への供給材料２４を形成する。キャリアストリームの正確な組成は、厳密に決定的ではない。典型的には、キャリアストリームのｐＨは、約１〜約７、より典型的には約２〜約６、なおもより典型的には約２〜約５で、なおもより典型的には約３〜約４である。ＫＴＩタンパク質の回収の様々な態様において、キャリアストリームは、例えばクエン酸ナトリウムをはじめとする非揮発性緩衝液、または例えばギ酸アンモニウムをはじめとする揮発性緩衝液を含んでなる。例えば様々な態様において、キャリアストリームは、約１０〜約３０ミリモル濃度（例えば２０ｍＭ）の濃度で水性混合物中に対イオンを含有する、緩衝液を含んでなる。
【００９８】
第２の残余分２１および／または供給流２４のｐＨは大豆タンパク質の溶解度に影響を及ぼし、沈殿タンパク質はイオン交換カラムの汚損をもたらすこともある。したがって特定限度内で、イオン交換カラムへの供給材料の（例えば緩衝による）ｐＨ調節が所望されることもある。必要ならば供給材料のｐＨは、例えば第２の残余分の希釈、キャリアストリーム、および／または残余分とキャリアストリームの組み合わせによって提供される供給材料によって、範囲内に保たれてもよい。希釈剤の組成は厳密に決定的でなく、典型的には、当業者に容易に選択されてもよい水性媒体（例えば脱イオン水）である。供給材料のｐＨに影響を及ぼすのに加えて、希釈はまた、典型的には供給材料の固有イオン強度を低下させ、それはタンパク質とイオン交換樹脂の結合を促進する。さらにまたは代案としては、供給材料のｐＨは、キャリアストリームの選択によって制御されてもよい。
【００９９】
イオン交換樹脂は、第２の残余分２１および供給材料２４中に存在する、１つまたは複数のタンパク質の選択的保持および回収に適するように選択される。様々な態様で、イオン交換樹脂は、ＫＴＩタンパク質を非ＫＴＩタンパク質から分離するように、選択的なＫＴＩタンパク質保持または非ＫＴＩタンパク質保持について選択される。以下の考察は、水性大豆ホエー（すなわち第２の残余分２１）からのＫＴＩタンパク質の回収および単離に注目する。しかし以下の手順は、他の標的タンパク質（例えばＢＢＩタンパク質）ならびに水性以外の（例えば噴霧乾燥から戻された）他の各種受け入れストリームの回収のために、容易に適合できるものと理解される。
【０１００】
イオン交換ユニットの正確な構成にかかわらず、ＫＴＩタンパク質の回収のための適切なイオン交換樹脂としては、多様なカチオンおよびアニオン交換樹脂が挙げられる。イオン交換カラムへの供給材料次第で、カチオン交換樹脂とアニオン交換樹脂の両方がＫＴＩタンパク質の回収に適するが、様々な態様でイオン交換樹脂はカチオン交換樹脂を含んでなる。例えばその等電点（ｐＩ）未満のｐＨに曝露したタンパク質は正電荷域を有する可能性がより高く、したがってカチオン交換樹脂とより密接に結合する。供給流中のほとんどのタンパク質（例えば大豆貯蔵タンパク質）は、ＫＴＩ、そして供給材料の典型的なｐＨよりも高いｐＩを有する。したがってこれらのタンパク質は、典型的には樹脂とより密接に結合する。ＫＴＩタンパク質含有画分は、樹脂を適切な溶離液に接触させることにより、イオン交換カラムから容易に溶出させることもできる。
【０１０１】
代案としては、供給材料のｐＨがＫＴＩタンパク質のｐＩを下回るように調節して、イオン交換樹脂によるＫＴＩタンパク質の保持を提供してもよい。他のタンパク質（例えばＢＢＩタンパク質）もまた、樹脂に結合する。しかし所望の画分の回収は、タンパク質画分の差次的溶出のために、イオン交換樹脂を適切な溶離液と接触させることで進行させてもよい。
【０１０２】
適切なカチオン交換樹脂としては、当該技術分野で良く知られている多様な樹脂が挙げられる。少なくとも１つの実施形態では、イオン交換樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されるＰｏｒｏｓ ２０ ＨＳを含んでなり、これはスルホプロピル基（例えばプロピルスルホン酸、（ＯＨ）2Ｓ（Ｏ）−（ＣＨ2）3−）で官能化されたポリヒドロキシル化ポリマーで表面被覆された、架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックスである。
【０１０３】
再度図１Ｄに言及すると、供給材料２４のイオン交換カラム３０通過後、溶出ＫＴＩタンパク質ストリーム３３を回収する。ＫＴＩタンパク質ストリーム３３をさらに精製して９５％以上の純度を達成するために、親和性クロマトグラフィーの使用を通じてＫＴＩタンパク質ストリーム３３を単離してもよい（図１Ｄには示されない）。親和性クロマトグラフィーは、典型的には単一工程で純度＞９５％を提供する精製技術である。それは標的分子の特定の天然のまたは追加された特性を利用して、サンプル中の全ての汚染物質から標的分子を単離する。ＫＴＩタンパク質ストリーム３３を精製するために、先の工程で除去されなかった残留汚染物質、主に大豆レクチンは、親和性クロマトグラフィーを通じて容易に除去し得る。例えばＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン樹脂のカラム（カタログ番号Ａ２７８７、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）など、あらゆる既製の特定用途向け樹脂（すなわち分離される化合物に対して特異的なリガンドがその表面に付着された樹脂）を使用して平衡化し得る。当該技術分野で知られている方法を使用して、ＫＴＩタンパク質ストリーム３３を樹脂と同一の緩衝液組成に対して調節し、アフィニティカラムに注入して、それにより汚染物質を樹脂に付着させ、通過画分を精製ＫＴＩ画分として収集する。
【０１０４】
図２は、ＫＴＩタンパク質ストリーム３３をはじめとする、図１Ｄで示される本発明の方法において単離された、様々な残余分および透過液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析を図示する。レーン１は分離に先立つ大豆ホエーの組成を示し、複数成分の存在が示唆される。対照的に、レーン５は、図１Ｄに示される複数の分離操作に続く濃縮ＫＴＩ画分（すなわちＫＴＩタンパク質ストリーム３３）を示す。２つのバンドの存在は、図１Ｄの分離工程に続いて、ＫＴＩタンパク質と１つの他の汚染物質（ＫＴＩ画分の分子量に基づいて大豆レクチンであると推定される）が、大豆ホエーから単離されたことを示唆する。実質的に追加的構成要素を含まず、かつ高純度レベル（＞９５％）を有するＫＴＩ生成物を得るために、実施例に記載されるようにして、残留汚染物質（すなわち大豆レクチン）の除去を親和性クロマトグラフィーを通じて達成し得る。
【０１０５】
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄに示されるプロセススキームは、使用出発原料や、上述の大豆ホエー構成要素の分離および回収順序に限定されるものではなく、例えば、添付の特許請求の範囲に記載されるものをはじめとする、上で論じたものと異なる加工ストリームを調製するのに利用してもよい。
【０１０６】
Ｅ．ＫＴＩを製造する方法
特定の実施形態では、本発明のＫＴＩタンパク質は、例えば組換え手段によって、または合成的に生成される。本発明のタンパク質の組換え生産は、当業者に知られている標準技術を使用して行われる。このような方法としては、例えば１つまたは複数のコード核酸配列を作成することが挙げられ、それは全長ｃＤＮＡ配列をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法によって実施し得る。所望の核酸配列の生成に続いて、配列を（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｐＣＡＬ−ｎ発現プラスミドをはじめとする）発現プラスミドに挿入し、次にそれを微生物に形質移入する；次に（例えば抗生物質耐性選択マーカーまたは発光選択マーカーをはじめとする）選択マーカーを使用して、所望の配列を含有するプラスミドを含有するクローン選択を実施する；所望の配列を含有するプラスミドを含有するクローンの大量生産がそれに続く；所望のクローンからペプチドを精製する（例えばＧｏｒｌａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１，４１０７−４１１６に記載される方法；米国特許第４，９８０，４５６号明細書を参照されたい）。代案としては本発明のペプチドは、合成手段または半合成手段（例えば組換え生産と合成手段の組み合わせ）によって製造し得る。
【０１０７】
合成的製造は、例えばＣａｒｐｉｎｏ Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｈａｎ．ＧＹ、Ｊ．（Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１；３７；３４０４−３４０９）に記載のフルオレニルメチロキシカルボニル（ＦＭＯＣ）−保護基ストラテジーを応用し、またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）−保護基ストラテジーを応用することで実施し得る。ペプチドは、例えば多重ペプチド合成装置を使用して、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ．（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３；８５，２１４９−２１５４）に記載の固相ペプチド合成手段によって合成される。次に粗製ペプチドを精製する。
【０１０８】
本発明のタンパク質を合成製造するための例示的方法は、続く節に記載される。装填量０．２４ｍｍｏｌ／ｇで、１００ｍｇのＴｅｎｔａｇｅｌ−Ｓ−ＲＡＭ（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）を市販のペプチド合成装置（ＰＳＭＭ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ））に移し、そこでペプチド配列をカルボジイミド／ＨＯＢｔ法に従って段階的に構築する。ＦＭＯＣ−アミノ酸誘導体は、５倍等モル過剰量のジ−イソプロピル−カルボジイミド（ＤＩＣ）、ジ−イソプロピル−エチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を添加してあらかじめ活性化され、反応容器に移した後に樹脂担体と３０分間混合された。洗浄工程は、例えばＤＭＦの添加と、１分間にわたる完全混合によって実施される。切断工程は、例えばＤＭＦ中のピペリジンの添加と、４分間にわたる完全混合によって実施される。個々の反応および洗浄溶液の除去は、溶液を反応容器底のフリットを通して押し出すことで達成される。アミノ酸誘導体ＦＭＯＣ−Ａｌａ、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、ＦＭＯＣ−Ａｓｐ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、ＦＭＯＣ−Ｉｌｅ、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、およびＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（Ｏｒｐｅｇｅｎ）が用いられる。合成が完了したら、ペプチド樹脂を乾燥させる。トリフルオロ酢酸／ＴＩＳ／ＥＤＴ／水（９５：２：２：１ｖｏｌ）による室温で２時間の処理により、ペプチドアミドを引き続いて切断する。濾過、溶液濃縮、および氷冷ジエチルエーテル添加による沈殿の手段を通じて、粗生成物を固体として得る。次に０．１％ＴＦＡ中のＲＰ−ＨＰＬＣによって、６０％アセトニトリル上の勾配５、流速１２ｍｌ／分で４０分間、および２１５ｎｍにおけるＵＶ検出の手段による溶離剤の評価で、プチドを精製する。個々の画分の純度は、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析法によって判定される。
【０１０９】
Ｆ．使用方法
本発明の様々な態様で、皮膚健康を促進するのに本発明のＫＴＩタンパク質を使用し得る。皮膚健康促進の例としては、皮膚変色または色素沈着の減少、炎症の低下、皺の最小化、皺の除去、脱色、着色、皮膚軟化、皮膚スムージング、除毛、およびクレンジングが挙げられる。皮膚健康の他の例と、それに関連した実験法は、米国特許出願公開第２０１０００９３０２８号明細書、米国特許出願公開第２０１０００９２４０９号明細書、米国特許出願公開第２００９０１１１１６０号明細書、米国特許出願公開第２００８０２４９０２９号明細書、米国特許第６，５５５，１４３号明細書にある（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，８４：１５５１−１５５９ ａｎｄ Ｐａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００１ Ａｐｒ；１１６（４）：５８７−９５もまた参照されたい）。
【０１１０】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下で定義する。
【０１１１】
「酸可溶性」という用語は、本明細書の用法では、約２〜約７のｐＨを有する水媒質中において、１リットル（ｇ／Ｌ）当たり１０グラムの濃度で、少なくとも約８０％の溶解度を有する物質を指す。
【０１１２】
「大豆タンパク質単離物」または「単離大豆タンパク質」という用語は、本明細書の用法では、無水ベースで少なくとも約９０％大豆タンパク質のタンパク質含量を有する大豆材料を指す。
【０１１３】
「対象（単数）」または「対象（複数）」という用語は、本明細書の用法では、病的状態の治療を必要とする、哺乳類（好適にはヒト）、鳥、魚、爬虫類、または両生類を指し、病的状態としては、筋肉、無制御な細胞増殖、自己免疫疾患、および癌と関連付けられている疾患が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１４】
「加工ストリーム」という用語は、本明細書の用法では、例えば水性大豆抽出物ストリーム、水性豆乳抽出物ストリーム、水性大豆ホエーストリーム、水性大豆糖蜜ストリーム、水性大豆タンパク質濃縮物大豆糖蜜ストリーム、水性大豆透過液ストリーム、および水性豆腐ホエーストリームをはじめとし、さらに例えば本明細書で開示される方法に従って中間生成物として回収され得る、液体および乾燥粉末双方の形態の大豆ホエータンパク質をはじめとする、水性ストリームまたは溶剤ストリームをはじめとする、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程に由来する、二次的または偶発的生成物を指す。
【０１１５】
「大豆ホエータンパク質」という用語は、本明細書の用法では、大豆貯蔵タンパク質が典型的には不溶性であるｐＨで可溶性であるタンパク質を指し、ＢＢＩ、ＫＴＩ、ルナシン、リポキシゲナーゼ、デヒドリン、レクチン、ペプチド、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではなく、貯蔵タンパク質をさらに包含する。
【０１１６】
本明細書全体を通じて言及されるその他のタンパク質は、ルナシン、レクチン、デヒドリン、リポキシゲナーゼ、およびそれらの組み合わせを含むが、これに限定されないと定義される。
【０１１７】
大豆オリゴ糖類としては、糖が挙げられるが、これに限定されないと定義される。糖としては、スクロース、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコース、単糖類、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されないと定義される。
【０１１８】
本発明の要素またはその好ましい実施形態を述べる際の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」と言う冠詞、および「ｓａｉｄ」は、１つ以上の要素を意味することが意図される。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｈａｖｉｎｇ」は、包括的であることが意図され、列挙される要素以外の追加的要素があってもよいことを意味する。
【０１１９】
本発明の範囲を逸脱することなく、上の化合物、生成物、および方法には様々な変更を加え得るので、上の説明および下の実施例に包含される全ての事項は例示的であり、限定的でないと解釈されるものとする。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：大豆ホエータンパク質からのＫＴＩタンパク質の回収
およそ３．７重量％の総タンパク量含量と、２２．５重量％（乾燥重量基準）の総固形分を有する水性大豆ホエー（１４５ｌ）をＢＴＳ−２５またはＭＭＭ０．４５ミクロン精密濾過膜を含有するＯＰＴＩＳＥＰ ７０００濾過モジュール内に導入する。膜に水性大豆ホエーを通過させると、水性大豆ホエーを含有する透過液（３．２重量％の固形分を有する１３２Ｌ）と、大豆ホエーの最初の細菌含量の９９％以上、および大豆ホエーのケイ素脱泡剤含量の９０％以上を含有する残余分とが形成される。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
精密濾過モジュールからの透過液（１３２ｌ）を孔径およそ１００ｋＤａを有する再生セルロース（ＲＣ）限外濾過膜を含有する、ＯＰＴＩＳＥＰ ７０００濾過モジュール内に導入した。透過液を限外濾過膜に通過させると、糖類、ミネラル、およびビタミンを含有する第２の透過液と、およそ２５．４重量％の固形分およびおよそ８３重量％（乾燥ベース）の総大豆タンパク質含量を有する第２の残余分（約２Ｌ）とが形成された。
【０１２３】
Ｖｉｒｔｉｓ Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ ２５ＸＬを使用して、凍結乾燥によって第２の残余分を乾燥させた。乾燥サンプルのアリコート（５３ｍｇ）を水で最終固形分濃度２５％のスラリーにして、次に混合しながら、室温で１０分間インキュベートして可溶化を促進した。２０００×ｇで１０分間の遠心分離により不溶性物質を除去し、上清を２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０でさらに５倍に希釈した。結果として起きたｐＨ低下は、混合物の一部の構成要素の沈殿をもたらし、それを引き続いて２０００×ｇで５分間の遠心分離によって除去した。
【０１２４】
７×２５ｍｍ Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳカラム（０．８ｍｌカラム床体積；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０緩衝液であらかじめ平衡化した。０．４５ミクロンシリンジフィルターを通してサンプルを濾過し、０．５ｍｌをカラムに流速１ｍｌ／分で注入した。２０カラム体積の平衡緩衝液で、非結合タンパク質をカラムから洗い出し、次に４０カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０中の０〜１００％直線濃度勾配１Ｍ塩化ナトリウムを使用して、結合画分を１ｍｌの画分中で回収した。クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、各画分を分析した。ＫＴＩappは、ＭＷappに基づいて画分２５〜３２に局在した（図２参照）。画分２９および３０をプールし、修正Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｃｒｏ−Ｌｏｗｒｙ、ＯｎｉｓｈｉおよびＢａｒｒ変法）を使用して、総タンパク量についてアッセイした。Ｋａｋａｄｅらの方法（Ｋａｋａｄｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｉｍｏｎｓ，Ｎ．，ａｎｄ Ｌｉｅｎｅｒ，Ｉ．Ｅ．，１９６９．Ａｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ ｖｓ． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ａｎｔｉｔｒｙｐｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎｓ． Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．４６：５１８）を使用して、ＫＴＩ活性を推計した。プールしたサンプルのタンパク質濃度は０．４８ｍｇ／ｍｌであり、比活性は７０８ Ｔｉ単位／ｇタンパク質であることが分かった。濃縮ＫＴＩサンプルはまた、（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｎ．，Ｓｐｒｏｗｓ，Ｊ．，Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｏ．，Ｌａｚａｒｕｓ，Ｇ．，Ｃｏｏｐｅｒｍａｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ，Ｈ．，１９８９．Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｃｈｙｍａｓｅ ｗｉｔｈ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１３０８−２１３１５．Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｖ．，Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｋｙｌｅ，Ｗ．Ｓ．Ａ．，ａｎｄ Ｅｌｍｏｒｅ，Ｄ．Ｔ．，１９７３．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌａｒｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅα−Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ，Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ Ｘα ｂｙ Ｓｐｅｃｔｒｏ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３１：１０７−１１７を使用して）キモトリプシン阻害活性についてもアッセイし、本質的に全く含有しないことが分かった。したがってこの実施例に記載されるようにして調製されたＫＴＩは、汚染ＢＢＩ活性を含まない。
【０１２５】
ＫＴＩ精製中に調製された様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３に示す。＞９５％純度のＫＴＩは、親和性クロマトグラフィーを使用して、レーン５に示される残留汚染物質を除去して得られる。したがってＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン樹脂のカラム（カタログ番号Ａ２７８７、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で平衡化される。当該技術分野で知られている方法を使用して、濃縮ＫＴＩ画分をこれと同一の緩衝液組成物に対して調節し、アフィニティカラムに注入する。汚染物質を樹脂に結合させ、カラム通過画分は精製ＫＴＩ画分として収集する。
【０１２６】
実施例２：質量分析法によるＫＴＩアイデンティティの確認
以下の手順を使用して、ＫＴＩをおよそ９０％の純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく）に精製した。１グラムの大豆ボーマン・バークインヒビター濃縮物（ＢＢＩＣ、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｙａ Ｃｏ．ロット番号０２１７６−２）を２０ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．８に再懸濁し、５％（ｗ／ｖ）スラリーを得た。磁気撹拌棒を使用して、スラリーを撹拌プレート上で、ビーカー内において室温で２０分間撹拌し材料を完全に水和して、次に１０．０００×ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質を除去した。得られた上清をデカントして０．２μｍフィルターを通して濾過し、１ｍｌの濾液を出発緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で１０ｍｌに希釈した。次に希釈サンプルを出発緩衝液中で平衡化された１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−５０５５−０１）に１ｍｌ／分の流速で直接注入した。非結合タンパク質を洗い出した後、カラムを４０カラム体積の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中の０−１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。溶出中に１ｍｌの画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４参照）。ＫＴＩappは、画分８〜１５中に同定された。画分Ａ１１は純度およそ９０％のＫＴＩを含有し、質量分析法による分析のために選択された。このようにして１２．５μｌのこの画分を１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、クーマシー染色して、質量分析法分析のために提出した（図５参照）。
【０１２７】
分析は、Ｄｏｎａｌｄ Ｄａｎｆｏｒｔｈ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で実施された。このようにしてゲル内トリプシン消化手順を使用してＫＴＩappバンドをペプチドに断片化し、ＱＳｔａｒ ＸＬナノスプレーＱＴＯＦ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。ＮＣＢＩｎｒおよびＴＩＧＲ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）データベースの双方に対してスペクトルを検索し、それにトリプシンの（ｔｒｙｐｉｃ）ペプチドが由来するタンパク質を同定した。バンド１ＡはＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘからのトリプシン阻害物質サブタイプＡと同定された、図５。同定された特定のペプチドは、ＫＴＩからのＮＥＬＤＫＧＩＧＴＩＩＳＳＰＹＲ（ａａ ７３〜８８）、ＦＩＡＥＧＨＰＬＳＬＫ（ａａ ９１〜１０１）、ＩＧＥＮＫＤＡＭＤＧＷＦＲ（ａａ １３２〜１４４）、ＶＳＤＤＥＦＮＮＹＫ（ａａ １４８〜１５７）、およびＮＫＰＬＶＶＱＦＱＫ（ａａ １９１〜２００）であった。
【０１２８】
実施例３：膨張床吸着（ＥＢＡ）クロマトグラフィーを使用したバルク大豆ホエータンパク質からのＫＴＩの精製
総固形分１．９２％を有する２００ｍｌの水性大豆ホエーを水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調節して、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中で平衡化されたＭｉｍｏ６ＨＥ樹脂の１×２５ｃｍカラム（ＵｐＦｒｏｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｄｅｎｍａｒｋ）に注入した。７．５ｃｍ／分の線流速を使用して、２０〜２５℃で、材料をボトムアップ式にカラムに装填した。後で分析するために、カラム通過物のサンプルを定期的に収集した。非結合材料を１０カラム体積の平衡緩衝液でカラムから洗い出し、結合材料を次に３０ｍＭ水酸化ナトリウムで溶出して回収した。大豆ホエー粉末懸濁液のＥＢＡクロマトグラフィー中に回収された各画分の１０μｌを４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離して、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０染色で染色した。カラム装填物、通過物、洗浄液、および水酸化ナトリウム溶出液サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図６に示す。図６の凡例。ＲＭ：原料（カラム装填物）；ＲＴ１〜４：装填中に等間隔で収集された通過物（流出物）；合計：総流出物画分；Ｗ：カラム洗浄液；Ｅ：カラム溶出液。装填タンパク質の大半は、通過物中に溶出することがはっきりと見られる一方で、ＫＴＩタンパク質の大半は樹脂に結合したままであった。溶出液中において、その大半がＫＴＩである合計３５５ｍｇのタンパク質を１．８ｍｇ／ｍｌ出発原料の収率で回収した。これらの条件下で、この樹脂の性能は１ｍｌの吸収材あたり１７．８ｍｇのＫＴＩ（プラス微量汚染物質）であることが示された。
【０１２９】
９５％以上の純度を達成するために、材料を凍結乾燥し、次に最小体積の緩衝液（例えば１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中で再度可溶化して、同一緩衝液中で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６サイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入した。カラムを１分当たり流速０．５ｍｌで展開し、溶出液の波長２８０ｎｍの吸光度を連続的にモニターした。１カラム排除容積の溶出に続いて画分の収集を即座に開始し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、精製ＫＴＩのある特定の画分を見つけ出した。ＫＴＩ含有画分をプールし、トリプシン阻害についてアッセイして純度を確認した。
【０１３０】
当業者は、本明細書に記載される方法および組成物が例示的な実施形態を代表するものであり、本発明の範囲に対する制限を意図するものでないことを容易に理解するであろう。発明の範囲と精神を逸脱することなく、様々な置換と修正を本明細書で開示される本開示に加えてもよいことが、当業者にはすぐに分かるであろう。
【０１３１】
本明細書中で言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の水準を示す。全ての特許および刊行物は、各々の個々の刊行物が具体的に個々に参考として援用されて示されるかのように、同じ程度までその全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１３２】
本明細書に例証的に記載される本開示は、適切には、本明細書で具体的に開示されないあらゆる要素または要素群、制限または制限群の不在下で実施されてもよい。したがって例えば本明細書の各場合において、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」、および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」の何れかは、他の２つのどちらかの用語で置き換えてもよい。用いられた用語および表現は、限定でなく説明の用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示され記載される徴群のいかなる同等物もまたはその一部も排除することは意図されず、本開示が特許請求する範囲内で、様々な修正が可能であることが認識される。したがって本開示は、好ましい実施形態と任意の徴群によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正形態およびバリエーションが、当業者によって用いられてもよいものと理解すべきである。このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲内であると見なされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆タンパク質加工ストリームを少なくとも１つの分離操作に通過させて、精製ＫＴＩタンパク質ストリームを単離するステップを含む、少なくとも９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度を有するＫＴＩ生成物を分離し精製する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの分離操作が、膜分離、クロマトグラフ分離、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、重力分離、およびあらゆるその組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの分離操作が膜分離である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記大豆加工ストリームを少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2の体積流量で少なくとも１つの分離膜に通過させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記体積流量が約１〜約１５０リットル流体／時間−ｍ2である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記大豆加工ストリームを約０℃〜約１００℃の温度で、前記少なくとも１つの分離膜に通過させる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記大豆加工ストリームを約２５℃〜約７５℃の温度で、前記少なくとも１つの分離膜に通過させる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの分離膜が、前記大豆加工ストリームから不純物を除去するための精密濾過膜を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記精密濾過膜の孔径が約０．１μｍ〜約２０μｍである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの分離操作が、クロマトグラフ分離をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記クロマトグラフ分離がイオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記精製ＫＴＩ生成物が、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記精製ＫＴＩ生成物が、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記精製ＫＴＩ生成物が、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記精製ＫＴＩ生成物が、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度を有するＫＴＩ生成物を分離し精製する方法であって、
（ａ）大豆タンパク質と、大豆貯蔵タンパク質、微生物、ミネラル、および糖類からなる不純物とを含有する大豆加工ストリームを、少なくとも１つの分離技術に通過させて、前記大豆タンパク質を含んでなる第１の透過液、および前記不純物を含んでなる第１の残余分を形成するステップと；
（ｂ）前記第１の透過液を少なくとも１つの分離操作に通過させて、不純物を含んでなる第２の透過液、および大量のタンパク質留分を含んでなる第２の残余分を形成するステップと；
（ｃ）少なくとも１つの分離操作に通過させるために、前記第２の残余分をキャリアストリームと合わせて、前記加工ストリーム中の他のタンパク質からＫＴＩタンパク質ストリームを単離して、部分的に精製されたＫＴＩ生成物を形成するステップと；
（ｄ）前記部分的に精製されたＫＴＩ生成物を少なくとも１つのクロマトグラフ分離操作に通過させ、少なくとも９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度を有する精製ＫＴＩ生成物が形成するステップと
を含む、方法。
【請求項１】
大豆タンパク質加工ストリームを少なくとも１つの分離操作に通過させて、精製ＫＴＩタンパク質ストリームを単離するステップを含む、少なくとも９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度を有するＫＴＩ生成物を分離し精製する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの分離操作が、膜分離、クロマトグラフ分離、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、重力分離、およびあらゆるその組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの分離操作が膜分離である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記大豆加工ストリームを少なくとも約１リットル流体／時間−ｍ2の体積流量で少なくとも１つの分離膜に通過させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記体積流量が約１〜約１５０リットル流体／時間−ｍ2である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記大豆加工ストリームを約０℃〜約１００℃の温度で、前記少なくとも１つの分離膜に通過させる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記大豆加工ストリームを約２５℃〜約７５℃の温度で、前記少なくとも１つの分離膜に通過させる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの分離膜が、前記大豆加工ストリームから不純物を除去するための精密濾過膜を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記精密濾過膜の孔径が約０．１μｍ〜約２０μｍである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの分離操作が、クロマトグラフ分離をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記クロマトグラフ分離がイオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記精製ＫＴＩ生成物が、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記精製ＫＴＩ生成物が、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記精製ＫＴＩ生成物が、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記精製ＫＴＩ生成物が、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度を有するＫＴＩ生成物を分離し精製する方法であって、
（ａ）大豆タンパク質と、大豆貯蔵タンパク質、微生物、ミネラル、および糖類からなる不純物とを含有する大豆加工ストリームを、少なくとも１つの分離技術に通過させて、前記大豆タンパク質を含んでなる第１の透過液、および前記不純物を含んでなる第１の残余分を形成するステップと；
（ｂ）前記第１の透過液を少なくとも１つの分離操作に通過させて、不純物を含んでなる第２の透過液、および大量のタンパク質留分を含んでなる第２の残余分を形成するステップと；
（ｃ）少なくとも１つの分離操作に通過させるために、前記第２の残余分をキャリアストリームと合わせて、前記加工ストリーム中の他のタンパク質からＫＴＩタンパク質ストリームを単離して、部分的に精製されたＫＴＩ生成物を形成するステップと；
（ｄ）前記部分的に精製されたＫＴＩ生成物を少なくとも１つのクロマトグラフ分離操作に通過させ、少なくとも９５重量％の総ＫＴＩタンパク質濃度を有する精製ＫＴＩ生成物が形成するステップと
を含む、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５１６４３２（Ｐ２０１３−５１６４３２Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４７３１７（Ｐ２０１２−５４７３１７）
【出願日】平成２２年１２月３０日（２０１０．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６２５９４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８２３６０
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（５０４１４０２９９）ソレイ リミテッド ライアビリティ カンパニー (42)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月３０日（２０１０．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６２５９４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８２３６０
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（５０４１４０２９９）ソレイ リミテッド ライアビリティ カンパニー (42)
【Ｆターム（参考）】
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