妊娠成績についての高い能力を有する卵母細胞およびコンピテントな胚を選択するための方法
本発明は、コンピテントな卵母細胞またはコンピテントな胚を選択するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、コンピテントな卵母細胞またはコンピテントな胚を選択するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
補助生殖医療（ＡＲＴ）における体外受精（ＩＶＦ）の試みの後の妊娠率および出生率は依然として低い。実際に、３回中２回のＩＶＦサイクルが妊娠に失敗し（ＳＡＲＴ ２００４）、そして１０中８を超える移植された胚が着床に失敗している(KovalevskyおよびPatrizio, 2005)。さらに、ＩＶＦにより生まれた赤ん坊の５０％超が、多胎妊娠による(Reddy et al., 2007)。ＡＲＴによって引き起こされる多胎妊娠から生じる早産は、年間、約８億９０００万米ドルを占めると推定されている(BromerおよびSeli, 2008)。
【０００３】
主観的で形態学的なパラメーターが依然として、ＩＶＦおよびＩＣＳＩプログラムにおいて使用するための健康な胚を選択するための判断基準である。しかしながら、このような判断基準は、胚のコンピテンスを真に予測しない。多くの研究が、いくつかの異なる形態学的な判断基準の組合せにより、より正確な胚の選択が行なわれることを示した(BalabanおよびUrman, 2006; La Sala et al., 2008; Scott et al., 2000)。胚選択のための形態学的な判断基準は移植日に評価され、そして主に早期胚分割（精子注入から２５〜２７時間後）、２日目または３日目における卵割球の数およびサイズ、フラグメンテーション率、並びに４細胞期または８細胞期における多核形成の存在に基づく(Fenwick et al., 2002)。
【０００４】
しかしながら、近年の研究は、精子注入のための卵母細胞の選択が、その品質に関係なく、全ての利用可能な胚の移植と比較して、ＡＲＴの成績を改善しないことを示した(La Sala et al., 2008)。ＩＶＦの成功率を高める最も高い着床力を有する生存可能な胚を同定し、新たに補充するための胚の数を減少させ、そして多胎妊娠率を低下させる必要がある。
【０００５】
全てのこれらの理由のために、胚の選択のためのいくつかのバイオマーカーが現在調査されている(Haouzi et al., 2008; Pearson, 2006)。妊娠をもたらす胚は、妊娠をもたらさない胚と比較してその代謝プロファイルが異なるので、いくつかの研究は、胚培養培地の非侵襲的な評価によって検出することのできる分子サインを同定しようと努力している(Brison et al., 2004; Gardner et al., 2001; SakkasおよびGardner, 2005; Seli et al., 2007; Zhu et al., 2007)。
【０００６】
ゲノミクスもまた、胚発達中の重要な遺伝子的および細胞的機能の知識を提供する。(McKenzie et al., 2004)および(Feuerstein et al., 2007)は、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）などの卵丘細胞におけるいくつかの遺伝子の発現が、卵母細胞および胚の品質を示したことを報告した。グレムリン１（ＧＲＥＭ１）、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳＴＡＲ）、ステアロイル補酵素Ａ不飽和酵素１および５（ＳＣＤ１および５）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）およびペントラキシン３（ＰＴＸ３）もまた、胚の品質に正に相関していることが示された(Zhang et al., 2005)。より最近では、ヒト卵丘細胞におけるグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ３）、ケモカインレセプター４（ＣＸＣＲ４）、サイクリンＤ２（ＣＣＮＤ２）およびカテニンδ１（ＣＴＮＮＤ１）の発現が、胚発達中の早期分割率に基づいて、胚の品質に負に相関していることが示された(van Montfoort et al., 2008)。しかし、早期分割が妊娠を予測するための信頼性のあるバイオマーカーであることが示されたという事実にも関わらず(Lundin et al., 2001; Van Montfoort et al., 2004; Yang et al., 2007)、卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルは妊娠成績について研究されてこなかった。
【０００７】
発明の要約：
本発明は、卵母細胞を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、前記のコンピテントな卵母細胞を選択するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【０００８】
本発明はまた、胚を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな胚を選択するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【０００９】
本発明はまた、卵母細胞または胚を囲む卵丘細胞において、Ａ群、Ｂ群またはＣ群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな卵母細胞またはコンピテントな胚を選択するための方法に関し、Ａ群はＰＣＫ１、ＡＤＰＲＨ、ＣＡＢＰ４、ＳＬＡＭＦ６、ＣＡＭＴＡ１、ＣＳＰＧ２およびＰＲＦ１からなり；Ｂ群はＦＯＳＢ、ＮＬＧＮ２、ＰＤＥ５Ａ、ＰＬＡ２Ｇ５、ＧＰＣ６およびＥＧＲ３からなり；そしてＣ群はＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｇ０Ｓ２、ＧＩＲＫ５およびＲＢＭＳ１からなる。
【００１０】
Ａ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、妊娠に至るコンピテントな卵母細胞または胚を予測する。Ｂ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、非コンピテントな卵母細胞または胚を予測し、前記胚は着床することができない。Ｃ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、早期胚停止に因る非コンピテントな卵母細胞または胚を予測する。
【００１１】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、卵丘細胞において発現される遺伝子のセットを、胚の能力および妊娠成績についてのバイオバーカーとして決定した。本発明者らは、卵母細胞を囲む卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルが異なる妊娠成績に相関し、これが妊娠に向けて発達する胚の特異的な発現サインの同定を可能とすることを実証した。本発明者らの結果は、卵母細胞を囲む卵丘細胞の分析が、胚の選択のための非侵襲的なアプローチであることを示す。
【００１２】
予測遺伝子のセット：
本発明に関する全ての遺伝子はそれ自体公知であり、そして以下の表ＡおよびＢに列挙されている。表ＡおよびＢは、その合わせた発現プロファイルが、コンピテントな卵母細胞を選択するための、または妊娠に至る高い着床力を有するコンピテントな胚を選択するための情報となることが示された遺伝子セットを提示する。
【００１３】
【表１】
【００１４】
本発明の目的は、卵母細胞を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな卵母細胞を選択するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【００１５】
本明細書において使用する「コンピテントな卵母細胞」という用語は、受精すると妊娠に至る高い着床率を有する生存可能な胚を産生する、雌性配偶子または雌性卵を指す。
【００１６】
本発明によると、卵母細胞は、天然サイクル、改変された天然サイクル、またはｃＩＶＦもしくはＩＣＳＩのために刺激されたサイクルから生じ得る。「天然サイクル」という用語は、雌または女性が卵母細胞を産生する天然サイクルを指す。「改変された天然サイクル」という用語は、雌または女性が、組換えＦＳＨまたはｈＭＧと合わせたＧｎＲＨアンタゴニストを用いての穏やかな卵巣刺激下において１つまたは２つの卵母細胞を産生する過程を指す。「刺激されたサイクル」という用語は、雌または女性が、組換えＦＳＨまたはｈＭＧと合わせたＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストを用いての刺激下において１つ以上の卵母細胞を産生する過程を指す。
【００１７】
「卵丘細胞」という用語は、卵母細胞を囲む細胞塊に含まれる細胞を指す。これらの細胞は、卵母細胞に、その栄養的ないくらかのエネルギー、およびまたは受精時に生存可能な胚を生じるに必要な他の必要条件を提供することに関与すると考えられている。
【００１８】
本発明の方法は、さらに、試料中の遺伝子の発現レベルを対照と比較することからなる工程を含み得、試料と対照との間の前記遺伝子の発現レベルの差異の検出は、前記卵母細胞がコンピテントであるかどうかを示す。対照は、コンピテントな卵母細胞を伴う卵丘細胞を含む試料、または授精していない卵母細胞を伴う卵丘細胞を含む試料からなり得る。
【００１９】
本発明の方法は、女性に好ましくは適用可能であるが、他の哺乳動物（例えば霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシなど）にも適用可能であり得る。
【００２０】
本発明の方法は、特に、体外受精による処置の効力を評価するのに適している。従って、本発明は、また、
ｉ）前記の雌被験体から、少なくとも１つの卵母細胞をその卵丘細胞と共に準備する工程；
ｉｉ）本発明の方法によって、前記卵母細胞がコンピテントな卵母細胞であるかどうかを決定する工程
を含む、雌の被験体における調節卵巣過剰刺激（ＣＯＳ）プロトコールの効力を評価するための方法にも関する。
【００２１】
その後、このような方法の後、発生学者はコンピテントな卵母細胞を選択し得、そしてそれらを、古典的な体外受精（ｃＩＶＦ）プロトコールによってか、または卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）プロトコール下で体外受精し得る。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、
ｉ）前記女性から、天然サイクル、改変サイクルまたは刺激されたサイクル下において、少なくとも１つの卵母細胞をその卵丘細胞と共に単離する工程；
ｉｉ）本発明の方法によって、前記卵母細胞がコンピテントな卵母細胞であるかどうかを決定する工程；
ｉｉｉ）そして、それがコンピテントな卵母細胞を生じるかどうかに基づいて、ＣＯＳ処置の効力をモニタリングする工程
を含む、調節卵巣過剰刺激（ＣＯＳ）プロトコールの効力をモニタリングするための方法に関する。
【００２３】
ＣＯＳ処置は、組換えＦＳＨまたはｈＭＧと合わせたＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの活性成分に基づき得る。
【００２４】
本発明はまた、胚を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな胚を選択するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【００２５】
「胚」という用語は、受精した卵母細胞または接合体を指す。前記受精は、古典的な体外受精（ｃＩＶＦ）下または卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）プロトコール下において介入し得る。
【００２６】
「古典的な体外受精」すなわち「ｃＩＶＦ」という用語は、卵母細胞が、生体外でin vitroにおいて精子によって受精する過程を指す。ＩＶＦは、in vivoにおける受胎が失敗した場合の不妊の主要な処置である。「卵細胞質内精子注入」すなわち「ＩＣＳＩ」という用語は、１つの精子が直接的に卵母細胞に注入される体外受精手順を指す。この手順は、男性不妊要因を克服するために最も一般的に使用されるが、卵母細胞が精子によって容易に貫通されることができない場合、および時に精子提供に特に関連した体外受精の方法として使用され得る。
【００２７】
「コンピテントな胚」という用語は、妊娠に至る高い着床率を有する胚を指す。「高い着床率」という用語は、子宮に移植された場合に、子宮環境に着床し、そして生存可能な胎児を生じ、次いで前記妊娠を中途で終える手順または事象を伴うことなく生存可能な子孫を発達させる、胚の能力を意味する。
【００２８】
本発明の方法は、試料中の前記遺伝子の発現レベルを対照と比較することからなる工程をさらに含み得、試料と対照との間の前記遺伝子の発現レベルの差異の検出は、前記胚がコンピテントであるかどうかを示す。対照は、生存可能な胎児を生じる胚に関連した卵丘細胞を含む試料、または生存可能な胎児を生じない胚に関連した卵丘細胞を含む試料からなり得る。
【００２９】
本発明の方法が胚の形態学的な考察に依存しないことは特筆すべきことである。２つの胚は同じ形態学的な局面を有し得るが、本発明の方法によって、妊娠に至る異なる着床率を提示し得る。
【００３０】
本発明の方法は、女性に好ましくは適用可能であるが、他の哺乳動物（例えば霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシなど）にも適用可能であり得る。
【００３１】
本発明はまた、胚を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定することからなる工程を含む、胚がコンピテントな胚であるかどうかを決定するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【００３２】
本発明は、また、
ｉ）卵母細胞をその卵丘細胞と共に準備する工程、
ｉｉ）前記卵母細胞を体外受精する工程
ｉｉｉ）本発明の方法によって工程ｉ）の前記卵母細胞がコンピテントな卵母細胞であるかどうかを決定することによって、工程ｉｉ）から生じた胚がコンピテントであるかどうかを決定する工程
を含む、胚がコンピテントな胚であるかどうかを決定するための方法にも関する。
【００３３】
本発明は、また、卵母細胞または胚を囲む卵丘細胞において、Ａ群、Ｂ群またはＣ群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、前記のコンピテントな卵母細胞または前記のコンピテントな胚を選択するための方法にも関し、Ａ群はＰＣＫ１、ＡＤＰＲＨ、ＣＡＢＰ４、ＳＬＡＭＦ６、ＣＡＭＴＡ１、ＣＳＰＧ２およびＰＲＦ１からなり；Ｂ群はＦＯＳＢ、ＮＬＧＮ２、ＰＤＥ５Ａ、ＰＬＡ２Ｇ５、ＧＰＣ６およびＥＧＲ３からなり；そしてＣ群はＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｇ０Ｓ２、ＧＩＲＫ５およびＲＢＭＳ１からなる。
【００３４】
Ａ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、妊娠に至るコンピテントな卵母細胞または胚を予測する。Ｂ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、非コンピテントな卵母細胞または胚を予測し、前記胚は着床することができない。Ｃ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、早期胚停止に因る非コンピテントな卵母細胞または胚を予測する。
【００３５】
前記の１つ以上の遺伝子を、例えば、Ａ群のみ、Ｂ群のみ、またはＣ群のみから選択し得る。
【００３６】
典型的には、１、２、３、４、５、６または７個の遺伝子をＡ群から選択し得る。
【００３７】
典型的には、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＢ群から選択し得る。
【００３８】
典型的には、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＣ群から選択し得る。
【００３９】
あるいは、前記遺伝子を、Ａ群およびＢ群から、Ａ群およびＣ群から、Ｂ群およびＣ群から、またはＡ群、Ｂ群およびＣ群から選択し得る。
【００４０】
典型的には、１、２、３、４、５、６または７個の遺伝子をＡ群から選択し得、そして０、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＢ群から選択し得、そして０、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＣ群から選択し得る。
【００４１】
典型的には、０、１、２、３、４、５、６または７個の遺伝子をＡ群から選択し得、そして１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＢ群から選択し得、そして０、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＣ群から選択し得る。
【００４２】
典型的には、０、１、２、３、４、５、６または７個の遺伝子をＡ群から選択し得、そして０、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＢ群から選択し得、そして１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＣ群から選択し得る。
【００４３】
本発明の方法は、雌の妊娠成績を増強するのに特に適している。従って、本発明は、また、
ｉ）本発明の方法を実施することによってコンピテントな胚を選択する工程、
ｉｉ）前記雌の子宮に工程ｉ）において選択された胚を着床させる工程
を含む、雌の妊娠成績を増強するための方法にも関する。
【００４４】
前記したような方法は、従って、発生学者が、妊娠成績について低い能力を有する胚の子宮への移植を回避するのを助ける。
【００４５】
前記したような方法はまた、着床および妊娠に至ることのできるコンピテントな胚を選択することによって、多胎妊娠を回避するのに特に適している。
【００４６】
上の全ての場合において、前記方法は、卵丘細胞および胚の遺伝子発現プロファイルと、妊娠成績との間の関係を記載した。
【００４７】
本発明の遺伝子の発現レベルを決定するための方法：
表ＡおよびＢにおいて前記したような遺伝子の発現レベルの決定を、多種多様な技術によって実施することができる。一般的には、決定されたような発現レベルは、相対的な発現レベルである。
【００４８】
より好ましくは、決定は、試料を、プローブ、プライマーまたはリガンドなどの選択的試薬と接触させ、そしてこれにより、試料中に元来存在する対象のポリペプチドまたは核酸の存在を検出またはその量を測定することを含む。接触は、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験チューブ、ウェル、ガラス、カラムなどの任意の適切な器具においてであり得る。特別な態様において、接触は、核酸アレイまたは特異的なリガンドアレイなどの試薬でコーティングされた基材上で行なう。基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体などの固体状または半固体状の基材であり得る。基材は、種々の形状およびサイズのものであり得、例えばスライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどであり得る。接触は、核酸ハイブリッドまたは抗体−抗原複合体などの検出可能な複合体が、試薬と、試料の核酸またはポリペプチドとの間で形成されるのに適した任意の条件下で行なわれ得る。
【００４９】
好ましい態様において、発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。
【００５０】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、試料中に含まれる核酸（例えば患者から調製された細胞または組織）をまず、例えば溶解酵素または化学溶液を使用して標準的な方法に従って抽出するか、あるいは製造業者の指示に従って核酸結合樹脂によって抽出する。その後、抽出されたｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノザンブロット分析）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。好ましくは定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。
【００５１】
増幅の他の方法としては、リガンド連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換型増幅法（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００５２】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、そして対象のｍＲＮＡに対する配列相補性または相同性を示す核酸は、本明細書において、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用性を見出す。このような核酸は同一である必要はないが、典型的には同等なサイズの相同領域に対して少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、さらにより好ましくは９０〜９５％同一であることが理解される。特定の態様において、ハイブリダイゼーションの検出のために、検出可能な標識などの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利である。当技術分野において、蛍光リガンド、放射能リガンド、酵素リガンドまたは他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）を含む、多種多様な適切な指示薬が知られている。
【００５３】
プローブは、典型的には、１０〜１０００、例えば１０〜８００、より好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００のヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅しようとする対象の核酸と完全にまたはほぼ完全に一致するように設計された、１０〜２５ヌクレオチド長の、より短い一本鎖核酸である。プローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイゼーションする核酸に対して「特異的」であり、すなわち、それらは好ましくは高いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下において（最も高い融解温度Ｔｍに相当する、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ。ＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａである）ハイブリダイゼーションする。
【００５４】
上の増幅法および検出法において使用される核酸プライマーまたはプローブは、キットしてまとめられていてもよい。このようなキットは、共通プライマーおよび分子プローブを含む。好ましいキットはまた、増幅が起こったかどうかを決定するのに必要な成分を含む。前記キットはまた、例えばＰＣＲ緩衝液および酵素：正の対照配列、反応対照プライマー；および、特異的な配列を増幅および検出するための説明書を含み得る。
【００５５】
特定の態様において、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出した全ＲＮＡを準備する工程、そして、より特定すると定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、前記ＲＮＡを増幅し特異的なプローブに対するハイブリダイゼーションにかける工程を含む。
【００５６】
別の好ましい態様において、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。このようなＤＮＡチップまたは核酸マイクロアレイは、基材（マイクロチップ、スライドガラスまたはマイクロスフィアのサイズのビーズであり得る）に化学的に付着させた種々の核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカまたはシリカをベースとした材料、炭素、金属、無機ガラスまたはニトロセルロースから構成され得る。プローブは、約１０〜約６０塩基対であり得るｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドなどの核酸を含む。発現レベルを決定するために、場合により最初に逆転写にかけた試験被験体からの試料を標識し、そしてマイクロアレイ表面に付着させたプローブ配列に対して相補的であるターゲット核酸との間に複合体の形成をもたらすハイブリダイゼーション条件においてマイクロアレイと接触させる。その後、標識されハイブリダイゼーションされた複合体を検出し、そして定量または半定量することができる。標識を、種々の方法によって、例えば放射能標識または蛍光標識を使用することによって行なうことができる。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの改変形が当業者には利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210による総説を参照）。
【００５７】
この脈絡において、本発明はさらに、表ＡまたはＢにおいて列挙した遺伝子に対して特異的である核酸を有する固相支持体を含むＤＮＡチップを提供する。
【００５８】
前記遺伝子の発現レベルを決定するための他の方法は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質の量の決定を含む。
【００５９】
このような方法は、試料を、試料中に存在するマーカータンパク質と選択的に相互作用することのできる結合対と接触させることを含む。結合対は、一般的に、ポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る抗体である。
【００６０】
タンパク質の存在を、競合、直接的な反応またはサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む、標準的な電気泳動技術および免疫診断技術を使用して検出することができる。このようなアッセイは、ウェスタンブロット；凝集試験；酵素標識イムノアッセイおよび酵素イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降などを含むがそれらに限定されない。反応は、一般的に、蛍光標識、化学発光標識、放射能標識、酵素標識またはダイ分子などの顕現化標識、または抗原と、それと反応する抗体または抗体群との間の複合体の形成を検出するための他の方法を含む。
【００６１】
前記のアッセイは、一般的に、抗原−抗体複合体が結合した固相支持体からの、液相中の非結合タンパク質の分離を含む。本発明の実施に使用することのできる固相支持体は、ニトロセルロース（例えば膜またはマイクロタイターウェルの形状）；ポリビニルクロライド（例えばシートまたはマイクロタイターのウェル）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリビニリデンフルオライド；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気反応性ビーズなどの基材を含む。
【００６２】
より特定すると、ＥＬＩＳＡ法を使用することができ、マイクロタイタープレートのウェルは、試験しようとするタンパク質に対する抗体でコーティングされている。マーカータンパク質を含むまたは含むことが疑われる生物学的試料を、その後、コーティングされたウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能とするに十分なインキュベーション期間の後、プレート（群）を洗浄して、非結合部分を除去し、そして検出可能となるように標識された二次結合分子を加えることができる。二次結合分子を、あらゆる捕捉される試料マーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、そして二次結合分子の存在を当技術分野において周知の方法を使用して検出する。
【００６３】
あるいは、免疫組織化学（ＩＨＣ）法が好ましくあり得る。ＩＨＣは、特異的に、in situにおいて試料または組織標本中のターゲットを検出する方法を提供する。試料の全体的な細胞の完全性がＩＨＣにおいては維持され、従って、対象のターゲットの存在および位置の両方の検出が可能となる。典型的には、試料をホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、そして染色およびその後の光学顕微鏡による検査のために切片に切断する。ＩＨＣの現在の方法は、直接的な標識または二次抗体に基づいたもしくはハプテンに基づいた標識のいずれかを使用する。公知のＩＨＣシステムの例としては、例えば、EnVision(TM) (DakoCytomation)、Powervision(R) (Immunovision, Springdale, AZ)、NBA(TM)キット(Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA)、HistoFine(R) (Nichirei Corp, Tokyo, Japan)が挙げられる。
【００６４】
特定の態様において、組織切片（例えば卵丘細胞を含む試料）を、対象の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して作られた抗体と共にインキュベーションした後、スライドまたは他の支持体上に載せ得る。その後、適切な固相支持体上に載せられた試料の顕微鏡による検査を行ない得る。顕微鏡写真の作成のために、切片を含む試料をスライドガラスまたは他の平面の支持体上に載せて、対象のタンパク質の存在を選択的に染色することによって強調し得る。
【００６５】
それ故、ＩＨＣ試料は、例えば、（ａ）卵丘細胞を含む調製物（ｂ）固定および包埋された前記細胞および（ｃ）前記の細胞試料中における対象のタンパク質の検出を含み得る。いくつかの態様において、ＩＨＣ染色手順は、組織の切断および整え、固定、脱水、パラフィン浸透、薄い切片へと切断、スライドガラス上への積載、ベーキング、脱パラフィン処理、親水化、抗原回収、遮断工程、一次抗体のアプライ、洗浄、（場合により適切な検出可能な標識に結合させた）二次抗体のアプライ、洗浄、対比染色および顕微鏡による検査などの工程を含み得る。
【００６６】
本発明は、また、前記したような方法を実施するためのキットにも関し、前記キットは、卵母細胞または胚がコンピテントであるかどうかを示す、表ＡまたはＢの遺伝子の発現レベルを測定するための手段を含む。
【００６７】
本発明は、さらに、以下の図面および実施例によって説明される。しかしながら、これらの実施例および図面をいずれにしても、本発明の範囲を制限するものとは解釈すべきではない。
【００６８】
実施例：ヒト卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルによって胚の能力を評価するための非侵襲的な試験
実施例１
材料および方法：
患者およびＩＶＦ処置：この後向き研究において、３０．９±２．５歳の年齢で、男性不妊要因のために本発明者らのＩＣＳＩ（卵細胞質内精子注入）センターに問い合わせられた通常の応答患者（ｎ＝３０）を研究した。患者を、組換えＦＳＨ（GonalF、Puregon；それぞれMerck-SeronoおよびOrganon）またはｈＭＧ（Menopur, Ferring）とＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストの組合せを用いて刺激した。卵巣応答を、血清中エストラジオールレベルおよび超音波検査によって評価して、卵胞の発達をモニタリングした。卵母細胞の回収を、超音波の指針下で、ｈＣＧ投与（５０００ＩＵ）の投与から３６時間後に実施した。
【００６９】
胚の品質の評価：マイクロインジェクションから２日後および３日後に、個々に培養した胚の品質パラメーターを、卵割球の数およびフラグメンテーション度を判断基準として使用して評価した（グレード１〜２：等しいサイズの卵割球および０〜２０％のフラグメンテーション、グレード３〜４：等しいサイズの卵割球は全くなく、２０％を超えるフラグメンテーション）。最高品質の胚は、３日目に、６〜８細胞、等しいサイズの卵割球、およびフラグメンテーションが全くないとして定義された。１つまたは２つの胚を、卵母細胞を回収した３日後に移植した。臨床的な妊娠を、血清中β−ｈＣＧおよび超音波検査（心拍と胎嚢の存在）にそれぞれ基づいて、胚移植の２週間後および６週間後に評価した。
【００７０】
卵丘細胞：全ての卵丘細胞（ＣＣ）試料を、卵収集日に凍結させた。その後、患者１人あたり１〜３つのＣＣ試料をマイクロアレイ分析のために無作為に選択した。全部で５０個のＣＣ試料を５０個の単一の卵母細胞から収集し、そして個々に分析した：グレード１〜２の胚からの３４個のＣＣ（ｎ＝２０人の患者）、グレード３〜４の胚からの１１個のＣＣ（ｎ＝１０人の患者）および受精していない卵母細胞からの５つのＣＣ（ｎ＝５人の患者）（表１）。
【００７１】
【表２】
【００７２】
データ分析を、マイクロアレイをハイブリダイゼーションさせた後にのみ妊娠成績を開示する二重盲検条件下において実施した。妊娠成績に関して、受精した卵母細胞からの４５個のＣＣは、妊娠をもたらさなかったグレード１〜２の胚からの１６個のＣＣ（ｎ＝９人の患者）、正の妊娠成績に関連した１８個のＣＣ（ｎ＝１１人の患者）、および移植されなかったグレード３〜４の胚からの１１個のＣＣを含んでいた。卵丘細胞を、卵母細胞の回収後にすぐに剥ぎ取った（ｈＣＧ投与から４０時間後未満）。卵丘細胞を機械で除去し、そして培養培地中で洗浄し、そして直ちに−８０℃でＲＬＴ ＲＮＡ抽出緩衝液（RNeasyキット, Qiagen, Valencia, CA, USA）中で凍結させて、その後、ＲＮＡ抽出を行なった。
【００７３】
顆粒膜細胞：男性不妊要因のためにＩＣＳＩプログラムに問い合わせられた正常な応答患者（ｎ＝８）（３４．８±３．２歳）の独立した群を、顆粒膜細胞の収集のために選択した（８個の試料）。卵母細胞の回収後直ちに、同じ患者の成熟した卵胞（１７mmを超える）の卵胞液を、卵丘卵母細胞複合体の除去後にプールし、そして、５０mlのバッチ中のＨＢＳＳ溶液（BioWhittaker）の１／３容量に希釈して、これは１つの試料を示す。顆粒膜細胞の精製は、(Kolena et al., 1983)によるプロトコールから適応させた。２０分間のスイングするバケツ中における５００ｇでの遠心分離後に、顆粒膜細胞をフィコールクッション（１２mlのリンパ球分離培地、BioWhittaker）上に収集した。それらを、ＨＢＳＳおよびＰＢＳ中で連続的に洗浄し、血液溶解緩衝液（ＫＨＣＯ３１０mM、ＮＨ４Ｃｌ １５０mM、ＥＤＴＡ ０．１mM）中で５分間インキュベーションして赤血球を除去し、計測し、ＰＢＳ中でペレット化し、その後、ＲＬＴ緩衝液（Quiagen）中に溶解し、そして−８０℃で保存した。卵胞穿刺の回数および精製顆粒膜細胞の数は、それぞれ、６〜１２回および２×１０６〜９×１０６個であった。
【００７４】
相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）調製およびマイクロアレイハイブリダイゼーション：ＣＣおよび顆粒膜細胞のＲＮＡを、マイクロＲＮｅａｓｙキット（Quiagen）を使用して抽出した。全ＲＮＡの量を、Nanodrop ND-1000分光光度計（Nanodrop Technologies Inc., DE, USA）を用いて測定し、そしてＲＮＡの完全性を、Agilent 2100バイオアナライザー（Agilent, Palo Alto, CA, USA）を用いて評価した。ｃＲＮＡを、全ＲＮＡ（７０ng〜１００ngまで）から開始して製造業者のプロトコール「２回増幅」（Two-Cycle cDNA Synthesis Kit, Invitrogen）に従って２回の増幅により調製した。１回目の増幅後に得られたｃＲＮＡは０．１μg/μl〜１．９μg/μlであり、そして２回目の増幅後では１．６μg/μl〜４．５μg/μlであった。
【００７５】
標識され断片化されたｃＲＮＡ（１２μg）を、約３００００個の独特なヒト遺伝子または予測される遺伝子に対応する５４６７５セットのオリゴヌクレオチドプローブ（「プローブセット」）を含む、Affymetrix HG-U133 Plus 2.0アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションさせた。各卵丘および顆粒膜試料を、マイクロアレイチップ上に個々に置いた。
【００７６】
データ処理：走査したGeneChip画像を、Affymetrix GCOS 1.4ソフトウェアを使用して処理し、デフォールト分析設定およびグローバルスケーリングを最初の標準化法として使用して、各々のアレイの整えられた平均ターゲット強度値（ＴＧＴ）を任意に１００と設定して、各プローブセットについての強度値および検出コール（有、辺縁域、または無）を得た。プローブ強度をＭＡＳ５．０アルゴリズムを使用して導いた。このアルゴリズムはまた、遺伝子が規定の信頼レベルで発現されているかまたは発現されていないかどうかを決定する（「検出コール」）。この「コール」は「有」（完全に一致するプローブが、ミスマッチプローブよりも有意により多くハイブリダイゼーションする場合、ｐ値＜０．０４）、「辺縁域」（ｐ値＞０．０４および＜０．０６）または「無」（ｐ値＞０．０６）のいずれかであり得る。マイクロアレイデータは、本発明者らの研究室においてMinimal Information about a Microarray Experiment MIAMEの推奨(Brazma et al. 2001)と一致して得られた。
【００７７】
データ分析および可視化：マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）（Tusher et al., 2001) (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/）を使用して、発現が試料群間で有意に異なる遺伝子を同定した。ＳＡＭは、データ並べ替えに基づいた倍率変化（ＦＣ）の平均値または中央値および偽陽性比率（ＦＤＲ）の信頼度％を提供する（倍率変化平均＞２、およびＦＤＲ＜５％）。卵丘細胞試料と顆粒膜細胞試料との間の遺伝子発現プロファイルの比較を可能とするアレイ分析は、まず、有意なＲＮＡ検出（検出コール「有」または「無」）に基づき、そしてその後、ＳＡＭ（マイクロアレイの有意性分析）に提出され、発現が試料群間で有意に変化した遺伝子が同定される。胚の品質および／または妊娠成績により卵丘細胞試料間の遺伝子発現プロファイルの比較を行なうために、変動係数（ＣＶ≧４０％）および無／有「検出コール」フィルターを使用したプローブセットの教師なしの選択をＳＡＭの前に実施した。変化した（グレード３〜４）および良好な（グレード１〜２）胚の発達からの、または妊娠に至るもしくは至らない胚からの卵丘細胞のプロファイル発現を比較するために、本発明者らは、主成分分析（ＰＣＡ）および階層的なクラスタリングの両方を用いて教師なし分類を実施した（de Hoon et al., 2004; Eisen et al., 1998)。ＰＣＡは、ＲＡＧＥｗｅｂインターフェース(http://rage.montp.inserm.fr) (Reme et al., 2008)を通したＲ統計ソフトウェアに基づいた元来のスクリプトを含んでいた。種々のプローブの発現レベルに基づいた階層的なクラスタリング分析を、ＣＬＵＳＴＥＲおよびＴＲＥＥＶＩＥＷソフトウェアパッケージを用いて実施した。機能的な生物学的なネットワークおよび一番定型的な経路を明らかにするために、本発明者らは、遺伝子発現サインをIngenuity Pathways Analysis (IPA)ソフトウェア(Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA)にインポートした。
【００７８】
定量ＲＴ−ＰＣＲ分析：ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、マイクロアレイ実験に使用する１０個のＣＣ試料を、その妊娠成績に従って選択した（１０人の患者に相当する、負の成績に関連する５個のＣＣ試料および正の成績に関連する５個のＣＣ試料）。患者からの標識されたｃＲＮＡ（１μg）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを生成した。これらのｃＤＮＡ（１／１０希釈の５μl）を、製造業者の推奨に従って（Applied Biosytems）リアルタイム定量ＰＣＲ反応のために使用した。２０μlの反応混合物はｃＤＮＡ（５μl）、１μMのプライマーおよび１０μlのTaqman Universal PCR Master Mix（Applied Biosystem）からなっていた。増幅を６０℃のアニーリング温度で４０サイクルの間に測定した。ＰＣＲ反応の全てのサイクル工程において産生されたＰＣＲ産物の量を、TaqManプローブによってモニタリングする。閾値は増殖曲線の指数関数期に設定され、これからサイクル数（「サイクル閾値（Cycle Threshold）については「Ｃｔ」）を解読する。Ｃｔ値を、相対的なｍＲＮＡ転写レベルの計算に使用する。ＰＣＲの有効性（Ｅ）を測定した。この有効性は、使用するプライマーに対応する標準曲線によって得られる。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出システム（Applied Biosystems）を使用して実施し、そして以下の式を使用して各試料についてＰＧＫ１に正規化した：Ｅ試験したプライマーΔＣｔ／ＥＰＧＫ１ΔＣｔ（Ｅ＝１０−１／勾配）、ΔＣｔ＝Ｃｔ対照−Ｃｔ未知、対照＝非妊娠群の１つのＣＣ試料）。各試料を２回分析し、そして複数の水のブランクを分析に含めた。
【００７９】
結果
胚の成績によるＣＣの遺伝子発現プロファイル：胚の成績に相関したＣＣの遺伝子発現プロファイルを同定するために、本発明者らは、各々の成績カテゴリーについての遺伝子発現サインを確立した：受精していない卵母細胞のＣＣ、胚の発達をもたらすが広範なフラグメンテーションをもたらした（グレード３〜４）卵母細胞のＣＣ、および全くフラグメンテーションがないかまたは限定されたフラグメンテーションを伴う胚の発達をもたらした（グレード１〜２）卵母細胞のＣＣ。顆粒膜細胞試料を、リファレンス組織（対照）と捉えた。実際に、顆粒膜細胞は、他の成体組織とは異なり、ＣＣに密接に関連した細胞である。このリファレンス組織の使用は、粗の系統差異に関連した異なって発現される遺伝子の数を低下させ、従って、ＣＣ／卵母細胞の相互作用における僅かな変化の同定を促進する。ＳＡＭ分析は、受精されていない群において２６０５個の遺伝子が、グレード３／４群において２７３９個の遺伝子が、グレード１〜２群において２４８２個の遺伝子がＦＤＲ＜５％でアップレギュレーションされていたことを示した。逆に、それぞれ４２７０個、４３４９個および４４８３個の遺伝子がダウンレギュレーションされた。その後、遺伝子のこれらのリストを交差させて、その重複を決定した。４４９個の上昇発現および８９０個の下降発現した遺伝子が、３つ全ての群において共通し、各カテゴリーは特異的な遺伝子発現プロファイルを示した。興味深いことに、８６０個のアップレギュレーションされた遺伝子（例えばガラニンおよびギャップジャンクションＡ５（ＧＪＡ５）を含む）および１４１６個のダウンレギュレーションされた遺伝子（ＨＬＡ−ＧおよびＥＧＲ１を含む）が、良好な形態学的な胚の品質を伴う卵丘細胞において特異的にモデュレーションされていた。グレード１〜２の群は、強力な遺伝子発現プロファイルを示したが、この群は妊娠成績に関して不均一であり、そして妊娠をもたらす胚に関連した１８個のＣＣ試料（４つの双胎妊娠を含む）を含んだが、妊娠をもたらすことに失敗した胚に関連した１６個のＣＣ試料も含んでいたことを注記しなければならない。
【００８０】
妊娠成績によるＣＣの遺伝子発現プロファイル：それ故、ＣＣ試料を妊娠成績により比較した。ＳＡＭ分析は２つの患者群間（妊娠ｖｓ非妊娠）で有意に（ＦＤＲ＜５％）変化した６３０個の遺伝子の「妊娠成績」のリストを描写した。ＰＣＡおよび階層的クラスタリングは、この６３０個の遺伝子のリストが実際に、妊娠に関連したＣＣ試料の大半を、非妊娠に関連したものから分離したことを確認した。特筆すべきは、「妊娠成績」リストの遺伝子は、主に、良好な成績を伴う試料においてアップレギュレーションされていた。「妊娠成績」発現サインは、「妊娠」群に関連した胚からの１０個のＣＣ試料の亜群において特に顕著であった。
【００８１】
妊娠成績遺伝子リストの機能的アノテーション：妊娠を達成する胚に関連した生物学的過程を調べるために、Ingenuity社およびPubmedデータベースを使用して、「妊娠成績」遺伝子リストからの６３０個の遺伝子をアノテーションした。その過剰発現が妊娠に関連している遺伝子の中で、最も有意に過剰提示されている経路は「酸化的ストレス」、「ＴＲ／ＲＸＲ活性化」、「細胞周期のＧ２／Ｍ移行」、「異物代謝」および「ＮＦ−κＢ」シグナル伝達であった。これらの経路の中で、最も代表的な遺伝子はインターロイキン、ケモカイン、アダプタータンパク質、およびキナーゼであった：ＩＬ１β（非妊娠に対して妊娠試料において４．５倍、Ｐ＝０．００１）、ＩＬ１６（４．８倍、Ｐ＝０．００１）、ＩＬ８（２．６倍、Ｐ＝０．００７）、ＩＬ１ＲＮ（２．１倍、Ｐ＝０．００５１）、ＩＬ１７ＲＣ（３．６倍、Ｐ＝０．００１）、ＴＩＲＡＰ（８．０倍、Ｐ＝０．００１）、ＣＸＣＬ１２（３．１倍、Ｐ＝０．００１）、ＣＣＲ５（２．６倍、Ｐ＝０．００５１）、およびＰＣＫ１（３．４倍、Ｐ＝０．００１）。顕著には、アポトーシスの調節に関与する多くの遺伝子が、妊娠をもたらす卵母細胞のＣＣ試料において有意にモデュレーションされていた。これらの遺伝子は、ＢＣＬ２Ｌ１１（６．９倍、Ｐ＜０．００１）、ＣＲＡＤＤ（２倍、Ｐ＝０．００３６）、ＮＥＭＯ（４．６倍、Ｐ＜０．００１）、ＢＣＬ１０（３．１倍、Ｐ＝＜０．００１）、ＳＥＲＰＩＮＢ８（９．１倍、Ｐ＜０．００１）およびＴＮＦＳＦ１３（２．５倍、Ｐ＝０．００３８）であった。
【００８２】
他方で、非妊娠に関連する遺伝子は、以下の経路に関連していた：Ｇ２／Ｍ ＤＮＡ傷害および細胞周期チェックポイント、「ソニックヘッジホッグ」、「ＩＧＦ-１」、「補体系」および「Ｗｎｔ／β−カテニン」シグナル伝達。非妊娠に関連する代表的な遺伝子としては、ＮＦＩＢ（０．３倍、Ｐ＜０．００１）、ＭＡＤ２Ｌ１（０．４倍、Ｐ＜０．００１）およびＩＧＦ１Ｒ（０．４倍、Ｐ＜０．００１）が挙げられた。
【００８３】
胚の能力についてのＣＣにおいて発現される候補遺伝子：妊娠成績によるＣＣのＳＡＭ分析は、ＣＣ分析の遺伝子発現に基づいて、妊娠をもたらす胚を産生する卵母細胞と、妊娠をもたらさなかったものとの間で異なるであろう胚の能力についてのバイオマーカーである表Ａの４５個の遺伝子を同定した。ＱＲＴ−ＰＣＲを使用してマイクロアレイデータを独立的に確認した。本発明者らは、妊娠を達成しなかったグレード１〜２の胚のＣＣと、妊娠を達成したグレード１〜２の胚のＣＣとの間の、３６個のアップレギュレーションされた遺伝子および９個のダウンレギュレーションされた遺伝子の異なる発現を分析した。
【００８４】
結論：
ヒトを含む大半の哺乳動物種において、卵母細胞を囲む卵丘細胞は、依然として受精時に輸卵管に存在し、そして胚が着床するまで留まる。卵丘内および周辺における細胞外マトリックス再構築はおそらく、これらの両方の工程において重要な役割を果たしている。これに関して、本発明者らは、胚の能力および妊娠成績についてのバイオマーカーである卵丘細胞において発現されている４５個の遺伝子を同定した。本発明者らの研究において、本発明者らは、卵母細胞を囲むＣＣの遺伝子発現プロファイルが異なる成績に関連し、これは妊娠に向けて発達している胚の特異的な発現サインの同定を可能とすることを実証した。結論すると、本発明者らはＩＣＳＩまたはＩＶＦのために問い合わせられた患者の異なる妊娠成績をもたらす、卵母細胞に由来するヒト卵丘細胞間における異なる遺伝子発現を発見した。本発明者らの結果は、卵母細胞を囲む卵丘細胞の分析が、胚の選択のための非侵襲的なアプローチであることを示す。典型的には、ＣＣを卵母細胞のピックアップ後直ちに収集することができ、ＣＣをゲノム検査（Ｇ検査）を用いて分析して、胚の能力を評価することができ、そしてその後、Ｇ検査結果に基づいて新たに補充するための胚を選択することができる。
【００８５】
実施例２
４５個の遺伝子のリストの信頼性を検査するために、本発明者らは、男性不妊のために本発明者らのＩＣＳＩセンターに問い合わせられた若い（３６歳未満）通常の応答患者を含む、前向き研究を実施した。胚の選択は、ＣＣの遺伝子発現プロファイルに従って（第１群）、または形態学的な局面に従って（対照として使用した第２群）のいずれかで行なった。各群について２つの胚を補充した。最初の６０人の患者について（１群につき３０人の患者）、卵収集日に、第１群において、各ＣＣ試料を個々に収集し、そして遺伝子発現分析のために処理した。ＣＣ試料（ｎ＝２６７）を分析した。定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して、ＣＣにおける対象の遺伝子の転写物の相対量を測定し、そして全てのバイオマーカーについての発現データを全ての試料から得た。両群における全ての患者は３日目に新たな胚の移植を受けた。２群間の比較は、着床率および進行する妊娠率／ピックアップ（それぞれ４０．０％ｖｓ２６．７％および７０．０％ｖｓ４６．７％：ｐ＜０．０５）についての有意な差異を明らかとする。本発明者らは第１群において５つの双胎妊娠を認めたが、これに対して対照として使用した第２群においては０であった。さらに、本発明者らは、形態学的局面とＣＣ遺伝子発現プロファイルとの間の関係が全くないことを観察した。２６７個のＣＣ試料の分析に基づいて、本発明者らは、ＣＣの２７％が、妊娠を達成することのできる胚を予測する遺伝子を発現し、ＣＣの４２％が発現せず、ＣＣの３１％が胚発達の早期停止についての遺伝子発現を示したことを認めた。
【００８６】
選択された候補バイオマーカーを以下の表Ｂに列挙する。表Ｂは、異なる臨床条件を予測することのできる卵丘細胞における遺伝子セットを提示する：（Ａ）妊娠、（Ｂ）妊娠せずおよび（Ｃ）早期胚停止。
【００８７】
【表３】
【００８８】
参考文献：
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本明細書において、本開示への参照により組み入れられる。
【００８９】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、コンピテントな卵母細胞またはコンピテントな胚を選択するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
補助生殖医療（ＡＲＴ）における体外受精（ＩＶＦ）の試みの後の妊娠率および出生率は依然として低い。実際に、３回中２回のＩＶＦサイクルが妊娠に失敗し（ＳＡＲＴ ２００４）、そして１０中８を超える移植された胚が着床に失敗している(KovalevskyおよびPatrizio, 2005)。さらに、ＩＶＦにより生まれた赤ん坊の５０％超が、多胎妊娠による(Reddy et al., 2007)。ＡＲＴによって引き起こされる多胎妊娠から生じる早産は、年間、約８億９０００万米ドルを占めると推定されている(BromerおよびSeli, 2008)。
【０００３】
主観的で形態学的なパラメーターが依然として、ＩＶＦおよびＩＣＳＩプログラムにおいて使用するための健康な胚を選択するための判断基準である。しかしながら、このような判断基準は、胚のコンピテンスを真に予測しない。多くの研究が、いくつかの異なる形態学的な判断基準の組合せにより、より正確な胚の選択が行なわれることを示した(BalabanおよびUrman, 2006; La Sala et al., 2008; Scott et al., 2000)。胚選択のための形態学的な判断基準は移植日に評価され、そして主に早期胚分割（精子注入から２５〜２７時間後）、２日目または３日目における卵割球の数およびサイズ、フラグメンテーション率、並びに４細胞期または８細胞期における多核形成の存在に基づく(Fenwick et al., 2002)。
【０００４】
しかしながら、近年の研究は、精子注入のための卵母細胞の選択が、その品質に関係なく、全ての利用可能な胚の移植と比較して、ＡＲＴの成績を改善しないことを示した(La Sala et al., 2008)。ＩＶＦの成功率を高める最も高い着床力を有する生存可能な胚を同定し、新たに補充するための胚の数を減少させ、そして多胎妊娠率を低下させる必要がある。
【０００５】
全てのこれらの理由のために、胚の選択のためのいくつかのバイオマーカーが現在調査されている(Haouzi et al., 2008; Pearson, 2006)。妊娠をもたらす胚は、妊娠をもたらさない胚と比較してその代謝プロファイルが異なるので、いくつかの研究は、胚培養培地の非侵襲的な評価によって検出することのできる分子サインを同定しようと努力している(Brison et al., 2004; Gardner et al., 2001; SakkasおよびGardner, 2005; Seli et al., 2007; Zhu et al., 2007)。
【０００６】
ゲノミクスもまた、胚発達中の重要な遺伝子的および細胞的機能の知識を提供する。(McKenzie et al., 2004)および(Feuerstein et al., 2007)は、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）などの卵丘細胞におけるいくつかの遺伝子の発現が、卵母細胞および胚の品質を示したことを報告した。グレムリン１（ＧＲＥＭ１）、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳＴＡＲ）、ステアロイル補酵素Ａ不飽和酵素１および５（ＳＣＤ１および５）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）およびペントラキシン３（ＰＴＸ３）もまた、胚の品質に正に相関していることが示された(Zhang et al., 2005)。より最近では、ヒト卵丘細胞におけるグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ３）、ケモカインレセプター４（ＣＸＣＲ４）、サイクリンＤ２（ＣＣＮＤ２）およびカテニンδ１（ＣＴＮＮＤ１）の発現が、胚発達中の早期分割率に基づいて、胚の品質に負に相関していることが示された(van Montfoort et al., 2008)。しかし、早期分割が妊娠を予測するための信頼性のあるバイオマーカーであることが示されたという事実にも関わらず(Lundin et al., 2001; Van Montfoort et al., 2004; Yang et al., 2007)、卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルは妊娠成績について研究されてこなかった。
【０００７】
発明の要約：
本発明は、卵母細胞を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、前記のコンピテントな卵母細胞を選択するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【０００８】
本発明はまた、胚を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな胚を選択するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【０００９】
本発明はまた、卵母細胞または胚を囲む卵丘細胞において、Ａ群、Ｂ群またはＣ群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな卵母細胞またはコンピテントな胚を選択するための方法に関し、Ａ群はＰＣＫ１、ＡＤＰＲＨ、ＣＡＢＰ４、ＳＬＡＭＦ６、ＣＡＭＴＡ１、ＣＳＰＧ２およびＰＲＦ１からなり；Ｂ群はＦＯＳＢ、ＮＬＧＮ２、ＰＤＥ５Ａ、ＰＬＡ２Ｇ５、ＧＰＣ６およびＥＧＲ３からなり；そしてＣ群はＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｇ０Ｓ２、ＧＩＲＫ５およびＲＢＭＳ１からなる。
【００１０】
Ａ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、妊娠に至るコンピテントな卵母細胞または胚を予測する。Ｂ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、非コンピテントな卵母細胞または胚を予測し、前記胚は着床することができない。Ｃ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、早期胚停止に因る非コンピテントな卵母細胞または胚を予測する。
【００１１】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、卵丘細胞において発現される遺伝子のセットを、胚の能力および妊娠成績についてのバイオバーカーとして決定した。本発明者らは、卵母細胞を囲む卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルが異なる妊娠成績に相関し、これが妊娠に向けて発達する胚の特異的な発現サインの同定を可能とすることを実証した。本発明者らの結果は、卵母細胞を囲む卵丘細胞の分析が、胚の選択のための非侵襲的なアプローチであることを示す。
【００１２】
予測遺伝子のセット：
本発明に関する全ての遺伝子はそれ自体公知であり、そして以下の表ＡおよびＢに列挙されている。表ＡおよびＢは、その合わせた発現プロファイルが、コンピテントな卵母細胞を選択するための、または妊娠に至る高い着床力を有するコンピテントな胚を選択するための情報となることが示された遺伝子セットを提示する。
【００１３】
【表１】
【００１４】
本発明の目的は、卵母細胞を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな卵母細胞を選択するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【００１５】
本明細書において使用する「コンピテントな卵母細胞」という用語は、受精すると妊娠に至る高い着床率を有する生存可能な胚を産生する、雌性配偶子または雌性卵を指す。
【００１６】
本発明によると、卵母細胞は、天然サイクル、改変された天然サイクル、またはｃＩＶＦもしくはＩＣＳＩのために刺激されたサイクルから生じ得る。「天然サイクル」という用語は、雌または女性が卵母細胞を産生する天然サイクルを指す。「改変された天然サイクル」という用語は、雌または女性が、組換えＦＳＨまたはｈＭＧと合わせたＧｎＲＨアンタゴニストを用いての穏やかな卵巣刺激下において１つまたは２つの卵母細胞を産生する過程を指す。「刺激されたサイクル」という用語は、雌または女性が、組換えＦＳＨまたはｈＭＧと合わせたＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストを用いての刺激下において１つ以上の卵母細胞を産生する過程を指す。
【００１７】
「卵丘細胞」という用語は、卵母細胞を囲む細胞塊に含まれる細胞を指す。これらの細胞は、卵母細胞に、その栄養的ないくらかのエネルギー、およびまたは受精時に生存可能な胚を生じるに必要な他の必要条件を提供することに関与すると考えられている。
【００１８】
本発明の方法は、さらに、試料中の遺伝子の発現レベルを対照と比較することからなる工程を含み得、試料と対照との間の前記遺伝子の発現レベルの差異の検出は、前記卵母細胞がコンピテントであるかどうかを示す。対照は、コンピテントな卵母細胞を伴う卵丘細胞を含む試料、または授精していない卵母細胞を伴う卵丘細胞を含む試料からなり得る。
【００１９】
本発明の方法は、女性に好ましくは適用可能であるが、他の哺乳動物（例えば霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシなど）にも適用可能であり得る。
【００２０】
本発明の方法は、特に、体外受精による処置の効力を評価するのに適している。従って、本発明は、また、
ｉ）前記の雌被験体から、少なくとも１つの卵母細胞をその卵丘細胞と共に準備する工程；
ｉｉ）本発明の方法によって、前記卵母細胞がコンピテントな卵母細胞であるかどうかを決定する工程
を含む、雌の被験体における調節卵巣過剰刺激（ＣＯＳ）プロトコールの効力を評価するための方法にも関する。
【００２１】
その後、このような方法の後、発生学者はコンピテントな卵母細胞を選択し得、そしてそれらを、古典的な体外受精（ｃＩＶＦ）プロトコールによってか、または卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）プロトコール下で体外受精し得る。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、
ｉ）前記女性から、天然サイクル、改変サイクルまたは刺激されたサイクル下において、少なくとも１つの卵母細胞をその卵丘細胞と共に単離する工程；
ｉｉ）本発明の方法によって、前記卵母細胞がコンピテントな卵母細胞であるかどうかを決定する工程；
ｉｉｉ）そして、それがコンピテントな卵母細胞を生じるかどうかに基づいて、ＣＯＳ処置の効力をモニタリングする工程
を含む、調節卵巣過剰刺激（ＣＯＳ）プロトコールの効力をモニタリングするための方法に関する。
【００２３】
ＣＯＳ処置は、組換えＦＳＨまたはｈＭＧと合わせたＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの活性成分に基づき得る。
【００２４】
本発明はまた、胚を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな胚を選択するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【００２５】
「胚」という用語は、受精した卵母細胞または接合体を指す。前記受精は、古典的な体外受精（ｃＩＶＦ）下または卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）プロトコール下において介入し得る。
【００２６】
「古典的な体外受精」すなわち「ｃＩＶＦ」という用語は、卵母細胞が、生体外でin vitroにおいて精子によって受精する過程を指す。ＩＶＦは、in vivoにおける受胎が失敗した場合の不妊の主要な処置である。「卵細胞質内精子注入」すなわち「ＩＣＳＩ」という用語は、１つの精子が直接的に卵母細胞に注入される体外受精手順を指す。この手順は、男性不妊要因を克服するために最も一般的に使用されるが、卵母細胞が精子によって容易に貫通されることができない場合、および時に精子提供に特に関連した体外受精の方法として使用され得る。
【００２７】
「コンピテントな胚」という用語は、妊娠に至る高い着床率を有する胚を指す。「高い着床率」という用語は、子宮に移植された場合に、子宮環境に着床し、そして生存可能な胎児を生じ、次いで前記妊娠を中途で終える手順または事象を伴うことなく生存可能な子孫を発達させる、胚の能力を意味する。
【００２８】
本発明の方法は、試料中の前記遺伝子の発現レベルを対照と比較することからなる工程をさらに含み得、試料と対照との間の前記遺伝子の発現レベルの差異の検出は、前記胚がコンピテントであるかどうかを示す。対照は、生存可能な胎児を生じる胚に関連した卵丘細胞を含む試料、または生存可能な胎児を生じない胚に関連した卵丘細胞を含む試料からなり得る。
【００２９】
本発明の方法が胚の形態学的な考察に依存しないことは特筆すべきことである。２つの胚は同じ形態学的な局面を有し得るが、本発明の方法によって、妊娠に至る異なる着床率を提示し得る。
【００３０】
本発明の方法は、女性に好ましくは適用可能であるが、他の哺乳動物（例えば霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシなど）にも適用可能であり得る。
【００３１】
本発明はまた、胚を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定することからなる工程を含む、胚がコンピテントな胚であるかどうかを決定するための方法に関し、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである。
【００３２】
本発明は、また、
ｉ）卵母細胞をその卵丘細胞と共に準備する工程、
ｉｉ）前記卵母細胞を体外受精する工程
ｉｉｉ）本発明の方法によって工程ｉ）の前記卵母細胞がコンピテントな卵母細胞であるかどうかを決定することによって、工程ｉｉ）から生じた胚がコンピテントであるかどうかを決定する工程
を含む、胚がコンピテントな胚であるかどうかを決定するための方法にも関する。
【００３３】
本発明は、また、卵母細胞または胚を囲む卵丘細胞において、Ａ群、Ｂ群またはＣ群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、前記のコンピテントな卵母細胞または前記のコンピテントな胚を選択するための方法にも関し、Ａ群はＰＣＫ１、ＡＤＰＲＨ、ＣＡＢＰ４、ＳＬＡＭＦ６、ＣＡＭＴＡ１、ＣＳＰＧ２およびＰＲＦ１からなり；Ｂ群はＦＯＳＢ、ＮＬＧＮ２、ＰＤＥ５Ａ、ＰＬＡ２Ｇ５、ＧＰＣ６およびＥＧＲ３からなり；そしてＣ群はＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｇ０Ｓ２、ＧＩＲＫ５およびＲＢＭＳ１からなる。
【００３４】
Ａ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、妊娠に至るコンピテントな卵母細胞または胚を予測する。Ｂ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、非コンピテントな卵母細胞または胚を予測し、前記胚は着床することができない。Ｃ群から選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現は、早期胚停止に因る非コンピテントな卵母細胞または胚を予測する。
【００３５】
前記の１つ以上の遺伝子を、例えば、Ａ群のみ、Ｂ群のみ、またはＣ群のみから選択し得る。
【００３６】
典型的には、１、２、３、４、５、６または７個の遺伝子をＡ群から選択し得る。
【００３７】
典型的には、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＢ群から選択し得る。
【００３８】
典型的には、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＣ群から選択し得る。
【００３９】
あるいは、前記遺伝子を、Ａ群およびＢ群から、Ａ群およびＣ群から、Ｂ群およびＣ群から、またはＡ群、Ｂ群およびＣ群から選択し得る。
【００４０】
典型的には、１、２、３、４、５、６または７個の遺伝子をＡ群から選択し得、そして０、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＢ群から選択し得、そして０、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＣ群から選択し得る。
【００４１】
典型的には、０、１、２、３、４、５、６または７個の遺伝子をＡ群から選択し得、そして１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＢ群から選択し得、そして０、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＣ群から選択し得る。
【００４２】
典型的には、０、１、２、３、４、５、６または７個の遺伝子をＡ群から選択し得、そして０、１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＢ群から選択し得、そして１、２、３、４、５または６個の遺伝子をＣ群から選択し得る。
【００４３】
本発明の方法は、雌の妊娠成績を増強するのに特に適している。従って、本発明は、また、
ｉ）本発明の方法を実施することによってコンピテントな胚を選択する工程、
ｉｉ）前記雌の子宮に工程ｉ）において選択された胚を着床させる工程
を含む、雌の妊娠成績を増強するための方法にも関する。
【００４４】
前記したような方法は、従って、発生学者が、妊娠成績について低い能力を有する胚の子宮への移植を回避するのを助ける。
【００４５】
前記したような方法はまた、着床および妊娠に至ることのできるコンピテントな胚を選択することによって、多胎妊娠を回避するのに特に適している。
【００４６】
上の全ての場合において、前記方法は、卵丘細胞および胚の遺伝子発現プロファイルと、妊娠成績との間の関係を記載した。
【００４７】
本発明の遺伝子の発現レベルを決定するための方法：
表ＡおよびＢにおいて前記したような遺伝子の発現レベルの決定を、多種多様な技術によって実施することができる。一般的には、決定されたような発現レベルは、相対的な発現レベルである。
【００４８】
より好ましくは、決定は、試料を、プローブ、プライマーまたはリガンドなどの選択的試薬と接触させ、そしてこれにより、試料中に元来存在する対象のポリペプチドまたは核酸の存在を検出またはその量を測定することを含む。接触は、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験チューブ、ウェル、ガラス、カラムなどの任意の適切な器具においてであり得る。特別な態様において、接触は、核酸アレイまたは特異的なリガンドアレイなどの試薬でコーティングされた基材上で行なう。基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体などの固体状または半固体状の基材であり得る。基材は、種々の形状およびサイズのものであり得、例えばスライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどであり得る。接触は、核酸ハイブリッドまたは抗体−抗原複合体などの検出可能な複合体が、試薬と、試料の核酸またはポリペプチドとの間で形成されるのに適した任意の条件下で行なわれ得る。
【００４９】
好ましい態様において、発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。
【００５０】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、試料中に含まれる核酸（例えば患者から調製された細胞または組織）をまず、例えば溶解酵素または化学溶液を使用して標準的な方法に従って抽出するか、あるいは製造業者の指示に従って核酸結合樹脂によって抽出する。その後、抽出されたｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノザンブロット分析）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。好ましくは定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。
【００５１】
増幅の他の方法としては、リガンド連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換型増幅法（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００５２】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、そして対象のｍＲＮＡに対する配列相補性または相同性を示す核酸は、本明細書において、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用性を見出す。このような核酸は同一である必要はないが、典型的には同等なサイズの相同領域に対して少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、さらにより好ましくは９０〜９５％同一であることが理解される。特定の態様において、ハイブリダイゼーションの検出のために、検出可能な標識などの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利である。当技術分野において、蛍光リガンド、放射能リガンド、酵素リガンドまたは他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）を含む、多種多様な適切な指示薬が知られている。
【００５３】
プローブは、典型的には、１０〜１０００、例えば１０〜８００、より好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００のヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅しようとする対象の核酸と完全にまたはほぼ完全に一致するように設計された、１０〜２５ヌクレオチド長の、より短い一本鎖核酸である。プローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイゼーションする核酸に対して「特異的」であり、すなわち、それらは好ましくは高いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下において（最も高い融解温度Ｔｍに相当する、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ。ＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａである）ハイブリダイゼーションする。
【００５４】
上の増幅法および検出法において使用される核酸プライマーまたはプローブは、キットしてまとめられていてもよい。このようなキットは、共通プライマーおよび分子プローブを含む。好ましいキットはまた、増幅が起こったかどうかを決定するのに必要な成分を含む。前記キットはまた、例えばＰＣＲ緩衝液および酵素：正の対照配列、反応対照プライマー；および、特異的な配列を増幅および検出するための説明書を含み得る。
【００５５】
特定の態様において、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出した全ＲＮＡを準備する工程、そして、より特定すると定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、前記ＲＮＡを増幅し特異的なプローブに対するハイブリダイゼーションにかける工程を含む。
【００５６】
別の好ましい態様において、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。このようなＤＮＡチップまたは核酸マイクロアレイは、基材（マイクロチップ、スライドガラスまたはマイクロスフィアのサイズのビーズであり得る）に化学的に付着させた種々の核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカまたはシリカをベースとした材料、炭素、金属、無機ガラスまたはニトロセルロースから構成され得る。プローブは、約１０〜約６０塩基対であり得るｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドなどの核酸を含む。発現レベルを決定するために、場合により最初に逆転写にかけた試験被験体からの試料を標識し、そしてマイクロアレイ表面に付着させたプローブ配列に対して相補的であるターゲット核酸との間に複合体の形成をもたらすハイブリダイゼーション条件においてマイクロアレイと接触させる。その後、標識されハイブリダイゼーションされた複合体を検出し、そして定量または半定量することができる。標識を、種々の方法によって、例えば放射能標識または蛍光標識を使用することによって行なうことができる。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの改変形が当業者には利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210による総説を参照）。
【００５７】
この脈絡において、本発明はさらに、表ＡまたはＢにおいて列挙した遺伝子に対して特異的である核酸を有する固相支持体を含むＤＮＡチップを提供する。
【００５８】
前記遺伝子の発現レベルを決定するための他の方法は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質の量の決定を含む。
【００５９】
このような方法は、試料を、試料中に存在するマーカータンパク質と選択的に相互作用することのできる結合対と接触させることを含む。結合対は、一般的に、ポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る抗体である。
【００６０】
タンパク質の存在を、競合、直接的な反応またはサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む、標準的な電気泳動技術および免疫診断技術を使用して検出することができる。このようなアッセイは、ウェスタンブロット；凝集試験；酵素標識イムノアッセイおよび酵素イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降などを含むがそれらに限定されない。反応は、一般的に、蛍光標識、化学発光標識、放射能標識、酵素標識またはダイ分子などの顕現化標識、または抗原と、それと反応する抗体または抗体群との間の複合体の形成を検出するための他の方法を含む。
【００６１】
前記のアッセイは、一般的に、抗原−抗体複合体が結合した固相支持体からの、液相中の非結合タンパク質の分離を含む。本発明の実施に使用することのできる固相支持体は、ニトロセルロース（例えば膜またはマイクロタイターウェルの形状）；ポリビニルクロライド（例えばシートまたはマイクロタイターのウェル）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリビニリデンフルオライド；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気反応性ビーズなどの基材を含む。
【００６２】
より特定すると、ＥＬＩＳＡ法を使用することができ、マイクロタイタープレートのウェルは、試験しようとするタンパク質に対する抗体でコーティングされている。マーカータンパク質を含むまたは含むことが疑われる生物学的試料を、その後、コーティングされたウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能とするに十分なインキュベーション期間の後、プレート（群）を洗浄して、非結合部分を除去し、そして検出可能となるように標識された二次結合分子を加えることができる。二次結合分子を、あらゆる捕捉される試料マーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、そして二次結合分子の存在を当技術分野において周知の方法を使用して検出する。
【００６３】
あるいは、免疫組織化学（ＩＨＣ）法が好ましくあり得る。ＩＨＣは、特異的に、in situにおいて試料または組織標本中のターゲットを検出する方法を提供する。試料の全体的な細胞の完全性がＩＨＣにおいては維持され、従って、対象のターゲットの存在および位置の両方の検出が可能となる。典型的には、試料をホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、そして染色およびその後の光学顕微鏡による検査のために切片に切断する。ＩＨＣの現在の方法は、直接的な標識または二次抗体に基づいたもしくはハプテンに基づいた標識のいずれかを使用する。公知のＩＨＣシステムの例としては、例えば、EnVision(TM) (DakoCytomation)、Powervision(R) (Immunovision, Springdale, AZ)、NBA(TM)キット(Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA)、HistoFine(R) (Nichirei Corp, Tokyo, Japan)が挙げられる。
【００６４】
特定の態様において、組織切片（例えば卵丘細胞を含む試料）を、対象の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して作られた抗体と共にインキュベーションした後、スライドまたは他の支持体上に載せ得る。その後、適切な固相支持体上に載せられた試料の顕微鏡による検査を行ない得る。顕微鏡写真の作成のために、切片を含む試料をスライドガラスまたは他の平面の支持体上に載せて、対象のタンパク質の存在を選択的に染色することによって強調し得る。
【００６５】
それ故、ＩＨＣ試料は、例えば、（ａ）卵丘細胞を含む調製物（ｂ）固定および包埋された前記細胞および（ｃ）前記の細胞試料中における対象のタンパク質の検出を含み得る。いくつかの態様において、ＩＨＣ染色手順は、組織の切断および整え、固定、脱水、パラフィン浸透、薄い切片へと切断、スライドガラス上への積載、ベーキング、脱パラフィン処理、親水化、抗原回収、遮断工程、一次抗体のアプライ、洗浄、（場合により適切な検出可能な標識に結合させた）二次抗体のアプライ、洗浄、対比染色および顕微鏡による検査などの工程を含み得る。
【００６６】
本発明は、また、前記したような方法を実施するためのキットにも関し、前記キットは、卵母細胞または胚がコンピテントであるかどうかを示す、表ＡまたはＢの遺伝子の発現レベルを測定するための手段を含む。
【００６７】
本発明は、さらに、以下の図面および実施例によって説明される。しかしながら、これらの実施例および図面をいずれにしても、本発明の範囲を制限するものとは解釈すべきではない。
【００６８】
実施例：ヒト卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルによって胚の能力を評価するための非侵襲的な試験
実施例１
材料および方法：
患者およびＩＶＦ処置：この後向き研究において、３０．９±２．５歳の年齢で、男性不妊要因のために本発明者らのＩＣＳＩ（卵細胞質内精子注入）センターに問い合わせられた通常の応答患者（ｎ＝３０）を研究した。患者を、組換えＦＳＨ（GonalF、Puregon；それぞれMerck-SeronoおよびOrganon）またはｈＭＧ（Menopur, Ferring）とＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストの組合せを用いて刺激した。卵巣応答を、血清中エストラジオールレベルおよび超音波検査によって評価して、卵胞の発達をモニタリングした。卵母細胞の回収を、超音波の指針下で、ｈＣＧ投与（５０００ＩＵ）の投与から３６時間後に実施した。
【００６９】
胚の品質の評価：マイクロインジェクションから２日後および３日後に、個々に培養した胚の品質パラメーターを、卵割球の数およびフラグメンテーション度を判断基準として使用して評価した（グレード１〜２：等しいサイズの卵割球および０〜２０％のフラグメンテーション、グレード３〜４：等しいサイズの卵割球は全くなく、２０％を超えるフラグメンテーション）。最高品質の胚は、３日目に、６〜８細胞、等しいサイズの卵割球、およびフラグメンテーションが全くないとして定義された。１つまたは２つの胚を、卵母細胞を回収した３日後に移植した。臨床的な妊娠を、血清中β−ｈＣＧおよび超音波検査（心拍と胎嚢の存在）にそれぞれ基づいて、胚移植の２週間後および６週間後に評価した。
【００７０】
卵丘細胞：全ての卵丘細胞（ＣＣ）試料を、卵収集日に凍結させた。その後、患者１人あたり１〜３つのＣＣ試料をマイクロアレイ分析のために無作為に選択した。全部で５０個のＣＣ試料を５０個の単一の卵母細胞から収集し、そして個々に分析した：グレード１〜２の胚からの３４個のＣＣ（ｎ＝２０人の患者）、グレード３〜４の胚からの１１個のＣＣ（ｎ＝１０人の患者）および受精していない卵母細胞からの５つのＣＣ（ｎ＝５人の患者）（表１）。
【００７１】
【表２】
【００７２】
データ分析を、マイクロアレイをハイブリダイゼーションさせた後にのみ妊娠成績を開示する二重盲検条件下において実施した。妊娠成績に関して、受精した卵母細胞からの４５個のＣＣは、妊娠をもたらさなかったグレード１〜２の胚からの１６個のＣＣ（ｎ＝９人の患者）、正の妊娠成績に関連した１８個のＣＣ（ｎ＝１１人の患者）、および移植されなかったグレード３〜４の胚からの１１個のＣＣを含んでいた。卵丘細胞を、卵母細胞の回収後にすぐに剥ぎ取った（ｈＣＧ投与から４０時間後未満）。卵丘細胞を機械で除去し、そして培養培地中で洗浄し、そして直ちに−８０℃でＲＬＴ ＲＮＡ抽出緩衝液（RNeasyキット, Qiagen, Valencia, CA, USA）中で凍結させて、その後、ＲＮＡ抽出を行なった。
【００７３】
顆粒膜細胞：男性不妊要因のためにＩＣＳＩプログラムに問い合わせられた正常な応答患者（ｎ＝８）（３４．８±３．２歳）の独立した群を、顆粒膜細胞の収集のために選択した（８個の試料）。卵母細胞の回収後直ちに、同じ患者の成熟した卵胞（１７mmを超える）の卵胞液を、卵丘卵母細胞複合体の除去後にプールし、そして、５０mlのバッチ中のＨＢＳＳ溶液（BioWhittaker）の１／３容量に希釈して、これは１つの試料を示す。顆粒膜細胞の精製は、(Kolena et al., 1983)によるプロトコールから適応させた。２０分間のスイングするバケツ中における５００ｇでの遠心分離後に、顆粒膜細胞をフィコールクッション（１２mlのリンパ球分離培地、BioWhittaker）上に収集した。それらを、ＨＢＳＳおよびＰＢＳ中で連続的に洗浄し、血液溶解緩衝液（ＫＨＣＯ３１０mM、ＮＨ４Ｃｌ １５０mM、ＥＤＴＡ ０．１mM）中で５分間インキュベーションして赤血球を除去し、計測し、ＰＢＳ中でペレット化し、その後、ＲＬＴ緩衝液（Quiagen）中に溶解し、そして−８０℃で保存した。卵胞穿刺の回数および精製顆粒膜細胞の数は、それぞれ、６〜１２回および２×１０６〜９×１０６個であった。
【００７４】
相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）調製およびマイクロアレイハイブリダイゼーション：ＣＣおよび顆粒膜細胞のＲＮＡを、マイクロＲＮｅａｓｙキット（Quiagen）を使用して抽出した。全ＲＮＡの量を、Nanodrop ND-1000分光光度計（Nanodrop Technologies Inc., DE, USA）を用いて測定し、そしてＲＮＡの完全性を、Agilent 2100バイオアナライザー（Agilent, Palo Alto, CA, USA）を用いて評価した。ｃＲＮＡを、全ＲＮＡ（７０ng〜１００ngまで）から開始して製造業者のプロトコール「２回増幅」（Two-Cycle cDNA Synthesis Kit, Invitrogen）に従って２回の増幅により調製した。１回目の増幅後に得られたｃＲＮＡは０．１μg/μl〜１．９μg/μlであり、そして２回目の増幅後では１．６μg/μl〜４．５μg/μlであった。
【００７５】
標識され断片化されたｃＲＮＡ（１２μg）を、約３００００個の独特なヒト遺伝子または予測される遺伝子に対応する５４６７５セットのオリゴヌクレオチドプローブ（「プローブセット」）を含む、Affymetrix HG-U133 Plus 2.0アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションさせた。各卵丘および顆粒膜試料を、マイクロアレイチップ上に個々に置いた。
【００７６】
データ処理：走査したGeneChip画像を、Affymetrix GCOS 1.4ソフトウェアを使用して処理し、デフォールト分析設定およびグローバルスケーリングを最初の標準化法として使用して、各々のアレイの整えられた平均ターゲット強度値（ＴＧＴ）を任意に１００と設定して、各プローブセットについての強度値および検出コール（有、辺縁域、または無）を得た。プローブ強度をＭＡＳ５．０アルゴリズムを使用して導いた。このアルゴリズムはまた、遺伝子が規定の信頼レベルで発現されているかまたは発現されていないかどうかを決定する（「検出コール」）。この「コール」は「有」（完全に一致するプローブが、ミスマッチプローブよりも有意により多くハイブリダイゼーションする場合、ｐ値＜０．０４）、「辺縁域」（ｐ値＞０．０４および＜０．０６）または「無」（ｐ値＞０．０６）のいずれかであり得る。マイクロアレイデータは、本発明者らの研究室においてMinimal Information about a Microarray Experiment MIAMEの推奨(Brazma et al. 2001)と一致して得られた。
【００７７】
データ分析および可視化：マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）（Tusher et al., 2001) (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/）を使用して、発現が試料群間で有意に異なる遺伝子を同定した。ＳＡＭは、データ並べ替えに基づいた倍率変化（ＦＣ）の平均値または中央値および偽陽性比率（ＦＤＲ）の信頼度％を提供する（倍率変化平均＞２、およびＦＤＲ＜５％）。卵丘細胞試料と顆粒膜細胞試料との間の遺伝子発現プロファイルの比較を可能とするアレイ分析は、まず、有意なＲＮＡ検出（検出コール「有」または「無」）に基づき、そしてその後、ＳＡＭ（マイクロアレイの有意性分析）に提出され、発現が試料群間で有意に変化した遺伝子が同定される。胚の品質および／または妊娠成績により卵丘細胞試料間の遺伝子発現プロファイルの比較を行なうために、変動係数（ＣＶ≧４０％）および無／有「検出コール」フィルターを使用したプローブセットの教師なしの選択をＳＡＭの前に実施した。変化した（グレード３〜４）および良好な（グレード１〜２）胚の発達からの、または妊娠に至るもしくは至らない胚からの卵丘細胞のプロファイル発現を比較するために、本発明者らは、主成分分析（ＰＣＡ）および階層的なクラスタリングの両方を用いて教師なし分類を実施した（de Hoon et al., 2004; Eisen et al., 1998)。ＰＣＡは、ＲＡＧＥｗｅｂインターフェース(http://rage.montp.inserm.fr) (Reme et al., 2008)を通したＲ統計ソフトウェアに基づいた元来のスクリプトを含んでいた。種々のプローブの発現レベルに基づいた階層的なクラスタリング分析を、ＣＬＵＳＴＥＲおよびＴＲＥＥＶＩＥＷソフトウェアパッケージを用いて実施した。機能的な生物学的なネットワークおよび一番定型的な経路を明らかにするために、本発明者らは、遺伝子発現サインをIngenuity Pathways Analysis (IPA)ソフトウェア(Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA)にインポートした。
【００７８】
定量ＲＴ−ＰＣＲ分析：ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、マイクロアレイ実験に使用する１０個のＣＣ試料を、その妊娠成績に従って選択した（１０人の患者に相当する、負の成績に関連する５個のＣＣ試料および正の成績に関連する５個のＣＣ試料）。患者からの標識されたｃＲＮＡ（１μg）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを生成した。これらのｃＤＮＡ（１／１０希釈の５μl）を、製造業者の推奨に従って（Applied Biosytems）リアルタイム定量ＰＣＲ反応のために使用した。２０μlの反応混合物はｃＤＮＡ（５μl）、１μMのプライマーおよび１０μlのTaqman Universal PCR Master Mix（Applied Biosystem）からなっていた。増幅を６０℃のアニーリング温度で４０サイクルの間に測定した。ＰＣＲ反応の全てのサイクル工程において産生されたＰＣＲ産物の量を、TaqManプローブによってモニタリングする。閾値は増殖曲線の指数関数期に設定され、これからサイクル数（「サイクル閾値（Cycle Threshold）については「Ｃｔ」）を解読する。Ｃｔ値を、相対的なｍＲＮＡ転写レベルの計算に使用する。ＰＣＲの有効性（Ｅ）を測定した。この有効性は、使用するプライマーに対応する標準曲線によって得られる。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出システム（Applied Biosystems）を使用して実施し、そして以下の式を使用して各試料についてＰＧＫ１に正規化した：Ｅ試験したプライマーΔＣｔ／ＥＰＧＫ１ΔＣｔ（Ｅ＝１０−１／勾配）、ΔＣｔ＝Ｃｔ対照−Ｃｔ未知、対照＝非妊娠群の１つのＣＣ試料）。各試料を２回分析し、そして複数の水のブランクを分析に含めた。
【００７９】
結果
胚の成績によるＣＣの遺伝子発現プロファイル：胚の成績に相関したＣＣの遺伝子発現プロファイルを同定するために、本発明者らは、各々の成績カテゴリーについての遺伝子発現サインを確立した：受精していない卵母細胞のＣＣ、胚の発達をもたらすが広範なフラグメンテーションをもたらした（グレード３〜４）卵母細胞のＣＣ、および全くフラグメンテーションがないかまたは限定されたフラグメンテーションを伴う胚の発達をもたらした（グレード１〜２）卵母細胞のＣＣ。顆粒膜細胞試料を、リファレンス組織（対照）と捉えた。実際に、顆粒膜細胞は、他の成体組織とは異なり、ＣＣに密接に関連した細胞である。このリファレンス組織の使用は、粗の系統差異に関連した異なって発現される遺伝子の数を低下させ、従って、ＣＣ／卵母細胞の相互作用における僅かな変化の同定を促進する。ＳＡＭ分析は、受精されていない群において２６０５個の遺伝子が、グレード３／４群において２７３９個の遺伝子が、グレード１〜２群において２４８２個の遺伝子がＦＤＲ＜５％でアップレギュレーションされていたことを示した。逆に、それぞれ４２７０個、４３４９個および４４８３個の遺伝子がダウンレギュレーションされた。その後、遺伝子のこれらのリストを交差させて、その重複を決定した。４４９個の上昇発現および８９０個の下降発現した遺伝子が、３つ全ての群において共通し、各カテゴリーは特異的な遺伝子発現プロファイルを示した。興味深いことに、８６０個のアップレギュレーションされた遺伝子（例えばガラニンおよびギャップジャンクションＡ５（ＧＪＡ５）を含む）および１４１６個のダウンレギュレーションされた遺伝子（ＨＬＡ−ＧおよびＥＧＲ１を含む）が、良好な形態学的な胚の品質を伴う卵丘細胞において特異的にモデュレーションされていた。グレード１〜２の群は、強力な遺伝子発現プロファイルを示したが、この群は妊娠成績に関して不均一であり、そして妊娠をもたらす胚に関連した１８個のＣＣ試料（４つの双胎妊娠を含む）を含んだが、妊娠をもたらすことに失敗した胚に関連した１６個のＣＣ試料も含んでいたことを注記しなければならない。
【００８０】
妊娠成績によるＣＣの遺伝子発現プロファイル：それ故、ＣＣ試料を妊娠成績により比較した。ＳＡＭ分析は２つの患者群間（妊娠ｖｓ非妊娠）で有意に（ＦＤＲ＜５％）変化した６３０個の遺伝子の「妊娠成績」のリストを描写した。ＰＣＡおよび階層的クラスタリングは、この６３０個の遺伝子のリストが実際に、妊娠に関連したＣＣ試料の大半を、非妊娠に関連したものから分離したことを確認した。特筆すべきは、「妊娠成績」リストの遺伝子は、主に、良好な成績を伴う試料においてアップレギュレーションされていた。「妊娠成績」発現サインは、「妊娠」群に関連した胚からの１０個のＣＣ試料の亜群において特に顕著であった。
【００８１】
妊娠成績遺伝子リストの機能的アノテーション：妊娠を達成する胚に関連した生物学的過程を調べるために、Ingenuity社およびPubmedデータベースを使用して、「妊娠成績」遺伝子リストからの６３０個の遺伝子をアノテーションした。その過剰発現が妊娠に関連している遺伝子の中で、最も有意に過剰提示されている経路は「酸化的ストレス」、「ＴＲ／ＲＸＲ活性化」、「細胞周期のＧ２／Ｍ移行」、「異物代謝」および「ＮＦ−κＢ」シグナル伝達であった。これらの経路の中で、最も代表的な遺伝子はインターロイキン、ケモカイン、アダプタータンパク質、およびキナーゼであった：ＩＬ１β（非妊娠に対して妊娠試料において４．５倍、Ｐ＝０．００１）、ＩＬ１６（４．８倍、Ｐ＝０．００１）、ＩＬ８（２．６倍、Ｐ＝０．００７）、ＩＬ１ＲＮ（２．１倍、Ｐ＝０．００５１）、ＩＬ１７ＲＣ（３．６倍、Ｐ＝０．００１）、ＴＩＲＡＰ（８．０倍、Ｐ＝０．００１）、ＣＸＣＬ１２（３．１倍、Ｐ＝０．００１）、ＣＣＲ５（２．６倍、Ｐ＝０．００５１）、およびＰＣＫ１（３．４倍、Ｐ＝０．００１）。顕著には、アポトーシスの調節に関与する多くの遺伝子が、妊娠をもたらす卵母細胞のＣＣ試料において有意にモデュレーションされていた。これらの遺伝子は、ＢＣＬ２Ｌ１１（６．９倍、Ｐ＜０．００１）、ＣＲＡＤＤ（２倍、Ｐ＝０．００３６）、ＮＥＭＯ（４．６倍、Ｐ＜０．００１）、ＢＣＬ１０（３．１倍、Ｐ＝＜０．００１）、ＳＥＲＰＩＮＢ８（９．１倍、Ｐ＜０．００１）およびＴＮＦＳＦ１３（２．５倍、Ｐ＝０．００３８）であった。
【００８２】
他方で、非妊娠に関連する遺伝子は、以下の経路に関連していた：Ｇ２／Ｍ ＤＮＡ傷害および細胞周期チェックポイント、「ソニックヘッジホッグ」、「ＩＧＦ-１」、「補体系」および「Ｗｎｔ／β−カテニン」シグナル伝達。非妊娠に関連する代表的な遺伝子としては、ＮＦＩＢ（０．３倍、Ｐ＜０．００１）、ＭＡＤ２Ｌ１（０．４倍、Ｐ＜０．００１）およびＩＧＦ１Ｒ（０．４倍、Ｐ＜０．００１）が挙げられた。
【００８３】
胚の能力についてのＣＣにおいて発現される候補遺伝子：妊娠成績によるＣＣのＳＡＭ分析は、ＣＣ分析の遺伝子発現に基づいて、妊娠をもたらす胚を産生する卵母細胞と、妊娠をもたらさなかったものとの間で異なるであろう胚の能力についてのバイオマーカーである表Ａの４５個の遺伝子を同定した。ＱＲＴ−ＰＣＲを使用してマイクロアレイデータを独立的に確認した。本発明者らは、妊娠を達成しなかったグレード１〜２の胚のＣＣと、妊娠を達成したグレード１〜２の胚のＣＣとの間の、３６個のアップレギュレーションされた遺伝子および９個のダウンレギュレーションされた遺伝子の異なる発現を分析した。
【００８４】
結論：
ヒトを含む大半の哺乳動物種において、卵母細胞を囲む卵丘細胞は、依然として受精時に輸卵管に存在し、そして胚が着床するまで留まる。卵丘内および周辺における細胞外マトリックス再構築はおそらく、これらの両方の工程において重要な役割を果たしている。これに関して、本発明者らは、胚の能力および妊娠成績についてのバイオマーカーである卵丘細胞において発現されている４５個の遺伝子を同定した。本発明者らの研究において、本発明者らは、卵母細胞を囲むＣＣの遺伝子発現プロファイルが異なる成績に関連し、これは妊娠に向けて発達している胚の特異的な発現サインの同定を可能とすることを実証した。結論すると、本発明者らはＩＣＳＩまたはＩＶＦのために問い合わせられた患者の異なる妊娠成績をもたらす、卵母細胞に由来するヒト卵丘細胞間における異なる遺伝子発現を発見した。本発明者らの結果は、卵母細胞を囲む卵丘細胞の分析が、胚の選択のための非侵襲的なアプローチであることを示す。典型的には、ＣＣを卵母細胞のピックアップ後直ちに収集することができ、ＣＣをゲノム検査（Ｇ検査）を用いて分析して、胚の能力を評価することができ、そしてその後、Ｇ検査結果に基づいて新たに補充するための胚を選択することができる。
【００８５】
実施例２
４５個の遺伝子のリストの信頼性を検査するために、本発明者らは、男性不妊のために本発明者らのＩＣＳＩセンターに問い合わせられた若い（３６歳未満）通常の応答患者を含む、前向き研究を実施した。胚の選択は、ＣＣの遺伝子発現プロファイルに従って（第１群）、または形態学的な局面に従って（対照として使用した第２群）のいずれかで行なった。各群について２つの胚を補充した。最初の６０人の患者について（１群につき３０人の患者）、卵収集日に、第１群において、各ＣＣ試料を個々に収集し、そして遺伝子発現分析のために処理した。ＣＣ試料（ｎ＝２６７）を分析した。定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して、ＣＣにおける対象の遺伝子の転写物の相対量を測定し、そして全てのバイオマーカーについての発現データを全ての試料から得た。両群における全ての患者は３日目に新たな胚の移植を受けた。２群間の比較は、着床率および進行する妊娠率／ピックアップ（それぞれ４０．０％ｖｓ２６．７％および７０．０％ｖｓ４６．７％：ｐ＜０．０５）についての有意な差異を明らかとする。本発明者らは第１群において５つの双胎妊娠を認めたが、これに対して対照として使用した第２群においては０であった。さらに、本発明者らは、形態学的局面とＣＣ遺伝子発現プロファイルとの間の関係が全くないことを観察した。２６７個のＣＣ試料の分析に基づいて、本発明者らは、ＣＣの２７％が、妊娠を達成することのできる胚を予測する遺伝子を発現し、ＣＣの４２％が発現せず、ＣＣの３１％が胚発達の早期停止についての遺伝子発現を示したことを認めた。
【００８６】
選択された候補バイオマーカーを以下の表Ｂに列挙する。表Ｂは、異なる臨床条件を予測することのできる卵丘細胞における遺伝子セットを提示する：（Ａ）妊娠、（Ｂ）妊娠せずおよび（Ｃ）早期胚停止。
【００８７】
【表３】
【００８８】
参考文献：
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本明細書において、本開示への参照により組み入れられる。
【００８９】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵母細胞または胚を囲む卵丘細胞において、Ａ群、Ｂ群またはＣ群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、前記のコンピテントな卵母細胞または前記のコンピテントな胚を選択するための方法であって、Ａ群はＰＣＫ１、ＡＤＰＲＨ、ＣＡＢＰ４、ＳＬＡＭＦ６、ＣＡＭＴＡ１、ＣＳＰＧ２およびＰＲＦ１からなり；Ｂ群はＦＯＳＢ、ＮＬＧＮ２、ＰＤＥ５Ａ、ＰＬＡ２Ｇ５、ＧＰＣ６およびＥＧＲ３からなり；そしてＣ群はＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｇ０Ｓ２、ＧＩＲＫ５およびＲＢＭＳ１からなる、前記方法。
【請求項２】
卵母細胞を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな卵母細胞を選択するための方法であって、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである、前記方法。
【請求項３】
胚を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな胚を選択するための方法であって、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである、前記方法。
【請求項４】
試料中の前記遺伝子の発現レベルを対照と比較することからなる工程をさらに含み、試料と対照との間の前記遺伝子の発現レベルの差異の検出は、前記卵母細胞または前記胚がコンピテントであるかどうかを示す、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項１】
卵母細胞または胚を囲む卵丘細胞において、Ａ群、Ｂ群またはＣ群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、前記のコンピテントな卵母細胞または前記のコンピテントな胚を選択するための方法であって、Ａ群はＰＣＫ１、ＡＤＰＲＨ、ＣＡＢＰ４、ＳＬＡＭＦ６、ＣＡＭＴＡ１、ＣＳＰＧ２およびＰＲＦ１からなり；Ｂ群はＦＯＳＢ、ＮＬＧＮ２、ＰＤＥ５Ａ、ＰＬＡ２Ｇ５、ＧＰＣ６およびＥＧＲ３からなり；そしてＣ群はＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｇ０Ｓ２、ＧＩＲＫ５およびＲＢＭＳ１からなる、前記方法。
【請求項２】
卵母細胞を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな卵母細胞を選択するための方法であって、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである、前記方法。
【請求項３】
胚を囲む卵丘細胞において４５個の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む、コンピテントな胚を選択するための方法であって、前記遺伝子は、ＷＮＴ６、ＬＲＣＨ４、ＰＡＸ８、ＣＡＢＰ４、ＰＤＥ５Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＣＫ１、ＴＣＦ２０、ＳＬＡＭＦ６、ＥＰＯＲ、ＣＡＣＮＧ６、ＮＬＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ１、ＡＴＦ３、ＫＲＴＡＰ８、ＧＲＩＫ５、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣＡ１０Ａ２、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ５、ＭＧ２９、ＮＬＧＮ２、ＰＲＫＡＣＡ、ＦＯＳＢ、ＳＩＡＴ６、ＬＯＸＬ２、ＰＲＦ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＰＢＢ３、ＥＧＲ３、ＣＮＲ２、ＩＦＩＴＭ１、ＰＬＡ２Ｇ５、ＣＡＭＴＡ１、ＳＯＸ４、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＣ、ＲＢＭＳ１、Ｇ０Ｓ２、ＦＡＴ３、ＳＬＣ４０Ａ１、ＧＰＣ６およびＩＧＦ１Ｒである、前記方法。
【請求項４】
試料中の前記遺伝子の発現レベルを対照と比較することからなる工程をさらに含み、試料と対照との間の前記遺伝子の発現レベルの差異の検出は、前記卵母細胞または前記胚がコンピテントであるかどうかを示す、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【公表番号】特表２０１２−５２３８２６（Ｐ２０１２−５２３８２６Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５１３０（Ｐ２０１２−５０５１３０）
【出願日】平成２２年４月９日（２０１０．４．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４７１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１８９９１
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月９日（２０１０．４．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４７１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１８９９１
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
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