妊孕性診断方法、妊孕性診断キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体
【課題】精子における卵子への融合能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断方法、並びに該方法に用いられるポリヌクレオチド及び妊孕性診断キットの提供。
【解決手段】ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有することを特徴とする妊孕性診断方法、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の塩基配列または当該遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、妊孕性と相関性の高い一塩基置換変異の変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、及びヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性診断キット。
【解決手段】ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有することを特徴とする妊孕性診断方法、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の塩基配列または当該遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、妊孕性と相関性の高い一塩基置換変異の変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、及びヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものである。具体的には、妊孕可能性と相関性のある遺伝子の欠損又は変異を検出し、妊孕可能性を診断する方法、並びに、該方法に用いることができるキット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。実際に、非特許文献１では、子供を望む夫婦のうちの約１５％が２年たっても妊娠できないことが報告されており、有効な不妊治療法の開発が強く望まれている。
【０００３】
近年では、体外受精（ＩＶＦ；In Vitro Fertilization）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっている。しかしながら、不妊の背後にある分子メカニズムの詳細は依然として明らかになっておらず、このため、適切な治療法の選択が困難な場合がある。
【０００４】
一方で、非特許文献２によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。たとえば、雄性胚細胞特異抗原であるＣａｌｍｅｇｉｎは小胞体に局在するカルシウム結合性蛋白質であり、普遍的に発現している小胞体分子シャペロンである膜蛋白質Ｃａｌｎｅｘｉｎ（たとえば、非特許文献３参照。）のホモログである。Ｃａｌｍｅｇｉｎ遺伝子の雄ノックアウトマウス（−／−）は殆ど不妊となり、その精子は卵細胞外マトリックス（透明体）に接着できないことが報告されている（非特許文献４参照）。これは、Ｃａｌｍｅｇｉｎが精子の卵子への接着に関わる蛋白質のシャペロン分子であり、当該分子の異常若しくは発現の低下によって、融合や接着に関わるＡＤＡＭｓやＩｚｕｍｏ分子など（非特許文献５）のフォールディングに支障をきたす結果、不妊となるのではないかと考えられている。
【０００５】
一方で、Ｃａｌｍｅｇｉｎと同様に精巣で特異的に発現しているタンパク質として、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（Ｃａｌｒ３）がある。Ｃａｌｒ３はカルシウム結合性シャペロンとして主に小胞体に局在しており、新たに生合成される糖蛋白質のフォールディングにおいて、Ｃａｌｍｅｇｉｎと協奏的に機能していることが示唆されている（非特許文献６）。Ｃａｌｒ３遺伝子は、まだ不妊過程における機能が明らかになっていないが、本出願の発明者らによって、３９ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（２００６年）において、Ｃａｌｒ３ノックアウトマウスが不妊となることが報告された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】デ・クレスター（de Kretser）、外１名、ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism）、１９９９年、第８４巻、第３４４３〜３４５０ページ。
【０００７】
【非特許文献２】マザック（Matzuk）、外１名、ネイチャー・セル・バイオロジー（Nature Cell Biology）、２００２年、第４（Ｓｕｐｐ１）巻、Ｓ４１〜Ｓ４９。
【０００８】
【非特許文献３】ベルゲロン（Bergeron）、外３名、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシズ(Trends In Biochemical Sciences)、１９９４年、第１９巻、第１２４〜１２８ページ。
【０００９】
【非特許文献４】イカワ（Ikawa）、外６名、ネイチャー（Nature）、１９９７年、第３８７巻、第６０７〜６１１ページ。
【００１０】
【非特許文献５】ルービンスタイン（Rubinstein）、外４名、セミナー・イン・セル・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー（Seminars in cell and developmental biology）、２００６年、第１７巻第２号、第２５４〜２６３ページ。
【００１１】
【非特許文献６】パーソン（Persson）、外２名、ジーン（Gene）、２００２年、第２９７巻第１−２号、第１５１〜１５８ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
男性不妊を診断するための有効な遺伝子診断方法は未だ十分に確立されていない。男性不妊の原因は生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な病態の原因を特定できる診断法が望まれている。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、精子における卵子への融合能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、Ｃａｌｒ３遺伝子に機能的に類似したＣａｌｍｅｇｉｎ遺伝子が欠損したマウスのオスが不妊症になること、Ｃａｌｍｅｇｉｎ分子の抗体が精子と卵子の融合を阻害すること、Ｃａｌｒ３分子はその発現部位から精子の卵子への接着に関わる蛋白質のシャペロン分子であることが予想されること、及びＣａｌｒ３ノックアウトマウスが不妊になることから、Ｃａｌｒ３分子が妊孕性に関連し、Ｃａｌｒ３タンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす（或いは引き起こしやすい）と考え、ヒトＣａｌｒ３遺伝子配列を解析し、ヒトＣａｌｒ３遺伝子に男性不妊症に関連した変異を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の、第１２８位の塩基、第１２９位の塩基、第２３３位の塩基、第２５１位の塩基、第３１３位の塩基、第３２８位の塩基、第３４６位の塩基、第３７０位の塩基、第３８５位の塩基、第５８４位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第７８２位の塩基、第７８３位の塩基、第８２０位の塩基、第９４５位の塩基、第９４６位の塩基、第９４７位の塩基、第９７０位の塩基、第９７６位の塩基、第９８１位の塩基、第１０２２位の塩基、第１０２３位の塩基、第１０３４位の塩基、第１０４６位の塩基、第１０５６位の塩基、第１０５８位の塩基、第１０６３位の塩基、第１０７４位の塩基、第１０８３位の塩基、第１０８６位の塩基、及び第１１１１位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする、妊孕性診断方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列において、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、又は第１０５８位の塩基が置換されており、この置換された塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
また、本発明は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第２３３位の塩基がアデニン、第５８６位の塩基がチミン、第６１６位の塩基がチミン、第６４４位の塩基がチミン、第６４７位の塩基がチミン、第７４２位の塩基がチミン、第８２０位の塩基がアデニン、第９７６位の塩基がアデニン、第１０５６位の塩基がチミン、又は第１０５８位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供することを目的とする。
また、本発明は、配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて、第１２８位の塩基がチミン、第１２９位の塩基がアデニン、第２５１位の塩基がアデニン、第３１３位の塩基がアデニン、第３２８位の塩基がチミン、第３４６位の塩基がチミン、第３７０位の塩基がチミン、第３８５位の塩基がアデニン、第５８４位の塩基がチミン、第７８２位の塩基がチミン、第７８３位の塩基がアデニン、第９４５位の塩基がアデニン、第９４６位の塩基がアデニン、第９４７位の塩基がアデニン、第９７０位の塩基がアデニン、第９８１位の塩基がアデニン、第１０２２位の塩基がチミン、第１０２３位の塩基がチミン、第１０３４位の塩基がチミン、第１０４６位の塩基がチミン、第１０６３位の塩基がチミン、第１０７４位の塩基がチミン、第１０８３位の塩基がアデニン、第１０８６位の塩基がチミン、又は第１１１１位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キットを提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の妊孕性診断方法や妊孕性診断キットを用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を、高精度かつ簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトＣａｌｒ３遺伝子構造と配列解析に用いたＰＣＲのアンプリコンを示す物理地図である。
【図２】インベーダー法の原理を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に係る妊孕性診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有することを特徴とする。ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損や特定の塩基の変異は、男性不妊との相関性が高い。したがって、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のＣａｌｒ３遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
【００１８】
配列番号１は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＮＣ＿００００１９．８で登録されている野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号１に示すように、野生型ヒトＣａｌｒ３遺伝子は、１１５５ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号２は、野生型ヒトＣａｌｒ３タンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。
【００１９】
図１は、野生型ヒトＣａｌｒ３遺伝子の構造を示す模式図である。野生型ヒトＣａｌｒ３遺伝子のうち、細線部分がイントロンであり、太線部分がエクソンである。また、「ＭＥＴ」は開始コドンであり、「ＴＥＲ」終止コドンである。さらに、野生型ヒトＣａｌｒ３遺伝子の下の各数値は、転写開始点を１としたときの塩基数を示している。なお、ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトＣａｌｒ３遺伝子は、ヒト１９番染色体長腕に位置している（１９ｐ１３．１１）。
【００２０】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号１に示すヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域において塩基が置換している患者がいることを見出した。一方、これらの塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では見られなかった。
【００２１】
ヒトＣａｌｒ３遺伝子に上記の置換変異が起こると、正常なタンパク質が発現しなくなってしまう。それゆえ、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の置換変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なＣａｌｒ３タンパク質の翻訳量が低下することにより、或いは、変異型Ｃａｌｒ３タンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【００２２】
本発明において、変異とは、遺伝子の塩基配列において、塩基が欠失・置換・挿入されていることを意味する。本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程において検出されるＣａｌｒ３遺伝子の変異は、男性不妊との相関性が高い変異である。具体的には、以下に述べるＸＸ個の変異を検出することにより、検出工程に用いられた生体サンプルを採取されたヒトが、妊孕させやすいか否か、不妊症であると診断されている場合には、不妊症の原因がＣａｌｒ３遺伝子の変異によるものであるか否かを判断することができる。なお、「Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」とは、「翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」を意味する。
【００２３】
男性不妊との相関性が高い変異として、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４３位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。
【００２４】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４３位のアスパラギン酸がグルタミン酸にコードされるようになる。
【００２５】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第７８位のセリンがチロシンにコードされるようになる。
【００２６】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第８４位のフェニルアラニンがチロシンにコードされるようになる。
【００２７】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１０５位のシステインがセリンにコードされるようになる。
【００２８】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１０位のイソロイシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
【００２９】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１６位のアスパラギン酸がチロシンにコードされるようになる。
【００３０】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１２４位のグリシンがコードされなくなる（終止コドン）。
【００３１】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１２９位のチロシンがアスパラギンにコードされるようになる。
【００３２】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９５位のセリンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００３３】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９６位のイソロイシンがロイシンにコードされるようになる。
【００３４】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２０６位のリジンがコードされなくなる（終止コドン）。
【００３５】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１５位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
【００３６】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１６位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。
【００３７】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２４８位のアスパラギン酸がチロシンにコードされるようになる。
【００３８】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６１位のチロシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
【００３９】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６１位のチロシンがコードされなくなる（終止コドン）。
【００４０】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２７４位のバリンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００４１】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１５位のアスパラギンがリジンにコードされるようになる。
【００４２】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１６位のフェニルアラニンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００４３】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１６位のフェニルアラニンがチロシンにコードされるようになる。
【００４４】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２４位のチロシンがアスパラギンにコードされるようになる。
【００４５】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２６位のアスパラギン酸がアスパラギンにコードされるようになる。
【００４６】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２７位のアスパラギンがリジンにコードされるようになる。
【００４７】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４１位のアルギニンがメチオニンにコードされるようになる。
【００４８】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４１位のアルギニンがセリンにコードされるようになる。
【００４９】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４５位のアラニンがバリンにコードされるようになる。
【００５０】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４９位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
【００５１】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５２位のメチオニンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００５２】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５３位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
【００５３】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５５位のアラニンがセリンにコードされるようになる。
【００５４】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５８位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
【００５５】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３６１位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
【００５６】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３６２位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
【００５７】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１１１１位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３７１位のヒスチジンがチロシンにコードされるようになる。
【００５８】
本発明に係る妊孕性診断方法においては、特に、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、又は第１０５８位の塩基を検出することが好ましい。より妊孕性との相関性が高いためである。また、本発明に係る妊孕性診断方法においては、上記の変異のうち、１種類の変異を検出するものであってもよく、複数種類の変異を検出するものであってもよい。
【００５９】
本発明に係る妊孕性診断方法は、これらの一塩基変異を、妊孕性の遺伝子マーカーとして用いるものである。たとえば、これらの塩基の変異が検出されなかった場合、検出工程に用いられた生体サンプルが回収された被験者は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、Ｃａｌｒ３遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。一方、変異が検出された場合は、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。また、被験者が不妊症患者であれば、その原因がＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異により、Ｃａｌｒ３分子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。したがって、そのような被験者に対して、たとえばＴＥＳＥ−ＩＣＳＩ（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｓｐｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；精巣生検−顕微授精）等の適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。すなわち、本発明に係る妊孕性診断方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした診断方法ともいえるものであり、該方法により、不妊症の診断を行う上で重要な情報が提供されるため、被験者に対して、現存の治療法の中から適格な選択を提示することができる。このため、本発明に係る妊孕性診断方法等は、低妊孕性又は不妊症の診断において好ましく用いることができる。
【００６０】
本発明に係る妊孕性診断方法において用いられる生体サンプルは、ヒトから採取されたものであって、Ｃａｌｒ３遺伝子由来の核酸やタンパク質を含有することが期待できるサンプルであれば、特に限定されるものではなく、たとえば、血液、血清、血漿、頬の内側等の粘膜、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を挙げることができる。ここで、Ｃａｌｒ３遺伝子由来の核酸とは、Ｃａｌｒ３遺伝子のゲノムＤＮＡや、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ等を意味する。また、Ｃａｌｒ３遺伝子由来のタンパク質とは、Ｃａｌｒ３遺伝子から発現されるタンパク質であるＣａｌｒ３分子やその分解物等を意味する。特に、Ｃａｌｒ３遺伝子由来のタンパク質を検出対象とする場合には、生体サンプルとして、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を用いることが好ましい。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊等されることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。
【００６１】
なお、生体サンプルを適宜希釈等することによりそのまま検出工程に用いてもよく、該生体サンプルから予め抽出したゲノムＤＮＡ等のＤＮＡを用いてもよい。また、該生体サンプルからｍＲＮＡ等のＲＮＡを抽出した後、逆転写反応により該ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを検出工程に用いてもよい。
【００６２】
本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程において、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、遺伝子の変異や多型の検出等において用いられる公知の各種手法、たとえば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、Ｔａｑｍａｎプローブ法、ＳＭＭＤ法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＡＳＡ法、及び塩基伸長法、並びにそれらを改変した方法等を用いることができる。検出感度及び精度に優れているため、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法等のように、変異部位を特異的に認識する塩基配列を有するプローブやプライマーを用いて検出する方法であることが好ましい。
【００６３】
ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプローブやプライマーは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子及びその周辺の塩基配列に基づき、常法により設計し、合成することができる。なお、ヒトＣａｌｒ３遺伝子及びその周辺の塩基配列は、たとえばＮＣＢＩヒトゲノムリソース（ＮＣＢＩ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／）等の公知のデータベースから当業者であれば容易に入手することができる。
【００６４】
たとえば、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列、すなわち、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第２３３位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第２３３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第２３３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じくヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドにおいて、当該第２３３位の塩基がシトシンであり、当該第２３３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｃａｌｒ３遺伝子の塩基配列中の当該第２３３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基に相当する。すなわち、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第２３３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第５８６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第５８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第５８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１０３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第５８６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位の塩基に相当する。
【００６６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第６１６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６１６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第６１６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１３３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１３３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第６１６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１３３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位の塩基に相当する。
【００６７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては配列番号１で表される塩基配列において、第６４４位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第６４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１６１番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１６１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第６４４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１６１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１６１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位の塩基に相当する。
【００６８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第６４７位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第６４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１６４番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１６４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第６４７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１６４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１６４番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位の塩基に相当する。
【００６９】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第７４２位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第７４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第７４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号６で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７４２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号６で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号６で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位の塩基に相当する。
【００７０】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第８２０位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第８２０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第８２０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号７で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第８２０位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号７で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号７で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位の塩基に相当する。
【００７１】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９７６位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第９７６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９７６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１３２番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１３２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９７６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１３２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位の塩基に相当する。
【００７２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０５６位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０５６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０５６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１３５番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１３５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０５６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１３５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３５番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位の塩基に相当する。
【００７３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０５８位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１０５８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０５８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１３７番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０５８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３７番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位の塩基に相当する。
【００７４】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１２８位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１２８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１２８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１２８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号３で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基に相当する。
【００７５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１２９位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第１２９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１２９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号３で表される塩基配列において、１０２番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１２９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列において、１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号３で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位の塩基に相当する。
【００７６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第２５１位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第２５１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第２５１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、１１９番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１１９番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第２５１位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、１１９番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１１９番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位の塩基に相当する。
【００７７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３１３位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第３１３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３１３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、１８１番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３１３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、１８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１８１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位の塩基に相当する。
【００７８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３２８位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第３２８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３２８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、１９６番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１９６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３２８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、１９６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１９６番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位の塩基に相当する。
【００７９】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３４６位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第３４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、２１４番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該２１４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３４６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、２１４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、２１４番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位の塩基に相当する。
【００８０】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３７０位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第３７０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３７０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、２３８番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該２３８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３７０位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、２３８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、２３８番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位の塩基に相当する。
【００８１】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３８５位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第３８５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３８５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、２５３番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該２５３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３８５位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、２５３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、２５３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位の塩基に相当する。
【００８２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第５８４位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第５８４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第５８４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第５８４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位の塩基に相当する。
【００８３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第７８２位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第７８２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第７８２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号６で表される塩基配列において、１４１番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１４１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７８２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号６で表される塩基配列において、１４１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号６で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１４１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位の塩基に相当する。
【００８４】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第７８３位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第７８３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第７８３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号６で表される塩基配列において、１４２番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１４２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７８３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号６で表される塩基配列において、１４２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号６で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１４２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位の塩基に相当する。
【００８５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９４５位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第９４５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９４５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９４５位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位の塩基に相当する。
【００８６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９４６位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１０２番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９４６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位の塩基に相当する。
【００８７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９４７位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや配列番号１で表される塩基配列において、第９４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１０３番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９４７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位の塩基に相当する。
【００８８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９７０位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９７０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９７０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１２６番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１２６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９７０位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１２６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１２６番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位の塩基に相当する。
【００８９】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９８１位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９８１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９８１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１３７番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９８１位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３７番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位の塩基に相当する。
【００９０】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０２２位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０２２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０２２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０２２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位の塩基に相当する。
【００９１】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０２３位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０２３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０２３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１０２番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０２３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位の塩基に相当する。
【００９２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０３４位の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該第１０３４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０３４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１１３番目の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該１１３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０３４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１１３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１１３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位の塩基に相当する。
【００９３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０４６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１０４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１２５番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１２５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０４６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１２５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１２５番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位の塩基に相当する。
【００９４】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０６３位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０６３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０６３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１４２番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１４２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０６３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１４２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１４２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位の塩基に相当する。
【００９５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０７４位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１０７４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０７４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１５３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１５３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０７４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１５３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１５３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位の塩基に相当する。
【００９６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０８３位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第１０８３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０８３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１６２番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１６２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０８３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１６２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１６２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位の塩基に相当する。
【００９７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０８６位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１６５番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１６５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０８６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１６５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１６５番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位の塩基に相当する。
【００９８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡや、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１１１１位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１１１１位の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該第１１１１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１１１１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００９９】
このように、上述する各変異の有無を検出するためのプライマー等としては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることができる。また、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子のゲノムＤＮＡにおいて、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることもできる。これらのポリヌクレオチドの長さとしては、１０〜７０塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましく、１０〜３０塩基長であることがさらに好ましい。なお、変異の有無の検出精度が改善されるため、該ポリヌクレオチド中、当該変異部位の塩基と対合し得る塩基の位置は特に限定されるものではないが、３’末端から１〜５塩基以内にあることが好ましく、３’末端にあることがより好ましい。
【０１００】
なお、ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性診断キットを用いることにより、本発明に係る妊孕性診断方法をより簡便に行うことができる。本発明に係る妊孕性診断キットとしては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基、第１２９位の塩基、第２３３位の塩基、第２５１位の塩基、第３１３位の塩基、第３２８位の塩基、第３４６位の塩基、第３７０位の塩基、第３８５位の塩基、第５８４位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第７８２位の塩基、第７８３位の塩基、第８２０位の塩基、第９４５位の塩基、第９４６位の塩基、第９４７位の塩基、第９７０位の塩基、第９７６位の塩基、第９８１位の塩基、第１０２２位の塩基、第１０２３位の塩基、第１０３４位の塩基、第１０４６位の塩基、第１０５６位の塩基、第１０５８位の塩基、第１０６３位の塩基、第１０７４位の塩基、第１０８３位の塩基、第１０８６位の塩基、又は第１１１１位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることが好ましく、第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、又は第１０５８位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることがより好ましい。また、これらの変異のうちの、１種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよく、複数種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよい。
【０１０１】
これらの塩基の変異を検出するための試薬としては、たとえば、当該塩基を含む核酸領域をＰＣＲ等により増幅させるためのプライマーの組と、得られた増幅産物の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。該塩基配列決定試薬としては、たとえば、上述したヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の塩基配列又はその翻訳領域の塩基配列において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、予め蛍光色素等により標識したハイブリダイゼーションプローブ等が挙げられる。その他、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異を検出する方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である場合には、該ＲＦＬＰ法において用いられる制限酵素であってもよい。
【０１０２】
また、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。たとえば、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトＣａｌｒ３遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよく、被験者のヒトＣａｌｒ３遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。
たとえば、上述する変異の存在を検出するものである場合、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、これらの変異が少なくとも一方のアレルにおいて起こっていることを検出できればよい。一方、これらの変異の非存在を検出するものである場合、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、これらの変異が双方のアレルにおいて起こっていないことを検出することが好ましい。
【０１０３】
より具体的には、一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子内の領域のうち、上記の各変異部位のうちの少なくとも一方（以下、「変異検出部位」という）の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【０１０４】
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲを行うことにより、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行うことにより、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、たとえば、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.）等を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
【０１０５】
また、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のプライマーを、塩基配列の決定に用いられるプライマーとして用いてもよい。すなわち、妊孕性診断キットには、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組と、塩基配列の決定に用いられるプライマーとを含んでいてもよい。
【０１０６】
上記のＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【０１０７】
また、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の変異検出部位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【０１０８】
なお、それぞれのプライマーは、Ｃａｌｒ３遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。Ｃａｌｒ３遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、Ｃａｌｒ３遺伝子の各変異部位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【０１０９】
上記のプライマーの組としては、たとえば、それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９で表される塩基配列からなるプライマー（図１の１、２ｒ、３、４ｒ、５．１、６．１ｒ、７、８ｒ、９及び１０Ｒ）を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＣａｌｒ３遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）等を用いてプライマーを設計することができる。
各プライマーは、たとえばホスホロアミダイト法等の公知の方法によって合成することができ、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.の３９２型シンセサイザー等を取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
【０１１０】
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼ等がさらに含まれていてもよい。
【０１１１】
一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無を、インベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【０１１２】
図２は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダーオリゴ２及びアレルオリゴ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される（いずれの塩基とも相補的な塩基ではない）。一方、アレルオリゴ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに相補するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
このように設計されたインベーダープローブ２とアレルオリゴ３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、ターゲット遺伝子１に対してアレルオリゴ３とインベーダープローブ２が重なり合った構造をとりながらハイブリダイズし、変異検出部位１ａにおいてインベーダープローブ２がアレルオリゴ３の下に１塩基のみ侵入する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）」ともいう）４がこの侵入構造を認識し、アレルオリゴ３を重なった塩基の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、 ３’末端がフラップ遊離体３ｃと相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３進入構造が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの侵入構造を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
【０１１３】
従って、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無をインベーダー法により検出するものであってもよい。この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、インベーダープローブ２、アレルオリゴ３及びフレットプローブ５等が含まれることが好ましい。
【０１１４】
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合には、インベーダープローブ２は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型Ｃａｌｒ３遺伝子の各変異型塩基と対応するように設計される（但し、相補的でない）。また、アレルオリゴ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型Ｃａｌｒ３遺伝子の上記の変異型塩基と相補するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記アレルオリゴ３が変異型Ｃａｌｒ３遺伝子とハイブリダイズしてインベーダープローブ２による侵入構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
上記の構成により、被験者のＣａｌｒ３遺伝子において上記の塩基が変異型置換している場合は、ターゲット遺伝子にハイブリダイズしたヌクレオチド３ａの５’末端にインベーダープローブ２の３’末端が侵入することにより、ヌクレオチド３ｃが切り出されて蛍光が生じる。一方、被験者のＣａｌｒ３遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分による侵入構造が形成されないのでヌクレオチド３ｃが切り出されないため蛍光が生じない。
【０１１５】
また、上記の例では、被験者の有するＣａｌｒ３遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＣａｌｒ３遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、或いは野生型と変異型で異なった蛍光色素を使用するなど様々に改変することができる。
なお、上記の各方法において、Ｃａｌｒ３遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【０１１６】
本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無をタンパク質レベルで検出するものであってもよい。すなわち、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて、正常なヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、異常なヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。ここで、正常タンパク質とは、ヒト野生型Ｃａｌｒ３ポリペプチドであり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。一方、異常タンパク質とは、たとえば、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、上述するいずれかの一塩基置換変異が生じているポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。具体的には、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドにおいて、第２３３位の塩基がアデニン、第５８６位の塩基がチミン、第６１６位の塩基がチミン、第６４４位の塩基がチミン、第６４７位の塩基がチミン、第７４２位の塩基がチミン、第８２０位の塩基がアデニン、第９７６位の塩基がアデニン、第１０５６位の塩基がチミン、又は第１０５８位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドである。また、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１２８位の塩基がチミン、第１２９位の塩基がアデニン、第２５１位の塩基がアデニン、第３１３位の塩基がアデニン、第３２８位の塩基がチミン、第３４６位の塩基がチミン、第３７０位の塩基がチミン、第３８５位の塩基がアデニン、第５８４位の塩基がチミン、第７８２位の塩基がチミン、第７８３位の塩基がアデニン、第９４５位の塩基がアデニン、第９４６位の塩基がアデニン、第９４７位の塩基がアデニン、第９７０位の塩基がアデニン、第９８１位の塩基がアデニン、第１０２２位の塩基がチミン、第１０２３位の塩基がチミン、第１０３４位の塩基がチミン、第１０４６位の塩基がチミン、第１０６３位の塩基がチミン、第１０７４位の塩基がチミン、第１０８３位の塩基がアデニン、第１０８６位の塩基がチミン、又は第１１１１位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドであってもよい。
【０１１７】
なお、生体サンプル中に含まれているヒトＣａｌｒ３タンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出する方法としては、特に限定されるものではない。たとえば、第３７０位や６１６位の変異のように、正常タンパク質と異常タンパク質とが明らかに分子量が異なる場合には、電気泳動法等により生体サンプル中に含まれているヒトＣａｌｒ３タンパク質の大きさを調べることによって、異常タンパク質が存在しているか否かを検出することができる。また、抗体を用いることにより、生体サンプル中に含まれているヒトＣａｌｒ３タンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを、より高精度に検出することもできる。
【０１１８】
具体的には、たとえば、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程は、上述した各変異のうちの少なくとも１種の変異を含むヒト変異型Ｃａｌｒ３遺伝子によってコードされるヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質（正常タンパク質）と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中に異常タンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＣａｌｒ３の異常タンパク質と結合し、かつ、正常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いてもよい。なお、このような抗体は、ヒトＣａｌｒ３の異常タンパク質を抗原として、常法により作製したポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の中から、ヒトＣａｌｒ３の正常タンパク質と交差しないものを選択することにより、得ることができる。
【０１１９】
より具体的には、本発明に係る抗体は、上述したアミノ酸の置換変異を含むヒト変異型Ｃａｌｒ３ポリペプチドまたは変異部分を含むそのフラグメントを抗原として実験動物を免疫処置することにより、製造することができる（たとえば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354n (1985)を参照のこと。）
一般的には、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（たとえば、ヒーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキシド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。たとえば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを腹腔内及び／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが望ましい。
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型Ｃａｌｒ３ポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型Ｃａｌｒ３ポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型Ｃａｌｒ３ポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが望ましい。
【０１２０】
このように、一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、上述した各変異のうち少なくとも一方の塩基置換を含むヒト変異型Ｃａｌｒ３遺伝子によってコードされるヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質が発現しているかを判定するものであってもよい。
上記抗体を用いてヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質が発現されていると判定された場合は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＣａｌｒ３遺伝子の異常に起因していると推定することができる。
【０１２１】
また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて正常なヒトＣａｌｒ３蛋白質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。より具体的には、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程が、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合し、かつ、異常ヒトＣａｌｒ３タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中にヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合し、かつ、異常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体（抗Ｃａｌｒ３抗体）を用いてもよい。
抗Ｃａｌｒ３抗体を用いてヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現していないと判定された場合は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。
【０１２２】
抗体を用いて、生体サンプル中のヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質またはヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質を検出する手法は、特に限定されず、公知のいずれの手法を用いてもよい。たとえば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）等が挙げられる。
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用する妊孕性診断方法に好適なキットである場合、妊孕性診断キットには、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、抗ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質抗体または抗Ｃａｌｒ３抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼ等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。
【実施例】
【０１２３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１２４】
［実施例１］
本実施例においては、ヒトＣａｌｒ３遺伝子配列を解析し、ヒトＣａｌｒ３遺伝子に男性不妊症に関連した変異の検出を行った。
［解析対象者］
非閉塞性不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝１０００以上）を、精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１３％は非閉塞性無精子症であり、３１％は重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であり、３３％が運動無力症であり、残り２３％が形態的に異常のないものであった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317）。コントロール群（Ｎ＝２００以上）は産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親であり、妊孕性が確認された男性とした。全ての提供者からは、サンプルがゲノムＤＮＡ解析に使用される旨のインフォームドコンセントを取得した（大阪大学病院泌尿器科）。
【０１２５】
［変異スクリーニング］
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理とフェノール抽出により血液サンプル又は精液サンプルから単離し調製した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。血液由来ゲノムＤＮＡはＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて増幅したＤＮＡを使用した。
Ｃａｌｒ３遺伝子は図１に示すように９個のエクソンからアミノ酸コード領域が形成されるが、それぞれのエクソンを増幅させるため、図１に示すように、５つの複製単位（アンプリコン）に分け、ＰＣＲ用プライマーをデザインした。表１にそれぞれのプライマーを、表２にＰＣＲの反応条件を示す。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
これらのプライマーを用いて表２記載の反応条件でＰＣＲ反応を行い。得られたＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＭＰｕｒｅ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した。この精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを鋳型とし、それぞれのアンプリコンを増幅した際に使用したプライマーを用いて、シーケンシング反応を行った。具体的には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、ＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３７３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。
【０１２９】
［シークエンス解析結果］
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、プライマー１と２ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー３と４ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー５．１と６．１ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー７と９．５ｒで増幅されるアンプリコン、及びプライマー９と１０ｒで増幅されるアンプリコンの、それぞれの塩基配列を解析したところ、表３〜５に示すように、既知のＳＮＰｓ（５ヶ所）を含めた置換変異が合計４４個検出された。このうち、アミノ酸の変化を伴う３５個の置換変異が不妊症被験者に検出され、妊孕性確認被験者からはこれらの置換変異は全く検出されず、妊孕性との相関性があることが確認された。以下、この３５個の置換変異について、それぞれ説明する。
【０１３０】
【表３】
【０１３１】
【表４】
【０１３２】
【表５】
【０１３３】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６３４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４３位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６３４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４３位のアスパラギン酸がグルタミン酸にコードされるようになる。
【０１３４】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第７８位のセリンがチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第８４位のフェニルアラニンがチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１０５位のシステインがセリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１０位のイソロイシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１６位のアスパラギン酸がチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１２４位のグリシンがコードされなくなる（終止コドン）。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１２９位のチロシンがアスパラギンにコードされるようになる。
【０１３５】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９５位のセリンがイソロイシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に３人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９６位のイソロイシンがロイシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に４人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２０６位のリジンがコードされなくなる（終止コドン）。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１５位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１６位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。
【０１３６】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１５人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２４８位のアスパラギン酸がチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６１位のチロシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６１位のチロシンがコードされなくなる（終止コドン）。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１９人、両方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２７４位のバリンがイソロイシンにコードされるようになる。
【０１３７】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１５位のアスパラギンがリジンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１６位のフェニルアラニンがイソロイシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１６位のフェニルアラニンがチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２４位のチロシンがアスパラギンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に６人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２６位のアスパラギン酸がアスパラギンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２７位のアスパラギンがリジンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４１位のアルギニンがメチオニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４１位のアルギニンがセリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４５位のアラニンがバリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４９位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５２位のメチオニンがイソロイシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に２７人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５３位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５５位のアラニンがセリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５８位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３６１位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３６２位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１１１１位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３７１位のヒスチジンがチロシンにコードされるようになる。
【０１３８】
これらの置換変異の中でも、特に、第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、又は第１０５８位の塩基の置換変異の出現率が高く、男性不妊症との相関性が高かった。
【０１３９】
上記の置換変異が見出された被験者は、正常なＣａｌｒ３の蛋白質の翻訳量が低減したことにより、或いは、変異型Ｃａｌｒ３蛋白質がドミナントネガティブに作用することにより、Ｃａｌｒ３蛋白質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。
【０１４０】
なお、本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がＣａｌｒ３遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明に係る妊孕性診断方法等を用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を行うことができ、妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。
【符号の説明】
【０１４２】
１…ターゲット遺伝子、１ａ…変異（又は一塩基多型）検出部位、２…インベーダーオリゴ、３…アレルオリゴ、３ａ…ヌクレオチド、３ｂ…フラップ、３ｃ…フラップ遊離体、４…フラップエンドヌクレアーゼ、５…フレットプローブ、５ａ…ヌクレオチド、５ｂ…蛍光色素、５ｃ…クエンチャー（発光抑制体）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものである。具体的には、妊孕可能性と相関性のある遺伝子の欠損又は変異を検出し、妊孕可能性を診断する方法、並びに、該方法に用いることができるキット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。実際に、非特許文献１では、子供を望む夫婦のうちの約１５％が２年たっても妊娠できないことが報告されており、有効な不妊治療法の開発が強く望まれている。
【０００３】
近年では、体外受精（ＩＶＦ；In Vitro Fertilization）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっている。しかしながら、不妊の背後にある分子メカニズムの詳細は依然として明らかになっておらず、このため、適切な治療法の選択が困難な場合がある。
【０００４】
一方で、非特許文献２によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。たとえば、雄性胚細胞特異抗原であるＣａｌｍｅｇｉｎは小胞体に局在するカルシウム結合性蛋白質であり、普遍的に発現している小胞体分子シャペロンである膜蛋白質Ｃａｌｎｅｘｉｎ（たとえば、非特許文献３参照。）のホモログである。Ｃａｌｍｅｇｉｎ遺伝子の雄ノックアウトマウス（−／−）は殆ど不妊となり、その精子は卵細胞外マトリックス（透明体）に接着できないことが報告されている（非特許文献４参照）。これは、Ｃａｌｍｅｇｉｎが精子の卵子への接着に関わる蛋白質のシャペロン分子であり、当該分子の異常若しくは発現の低下によって、融合や接着に関わるＡＤＡＭｓやＩｚｕｍｏ分子など（非特許文献５）のフォールディングに支障をきたす結果、不妊となるのではないかと考えられている。
【０００５】
一方で、Ｃａｌｍｅｇｉｎと同様に精巣で特異的に発現しているタンパク質として、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（Ｃａｌｒ３）がある。Ｃａｌｒ３はカルシウム結合性シャペロンとして主に小胞体に局在しており、新たに生合成される糖蛋白質のフォールディングにおいて、Ｃａｌｍｅｇｉｎと協奏的に機能していることが示唆されている（非特許文献６）。Ｃａｌｒ３遺伝子は、まだ不妊過程における機能が明らかになっていないが、本出願の発明者らによって、３９ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（２００６年）において、Ｃａｌｒ３ノックアウトマウスが不妊となることが報告された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】デ・クレスター（de Kretser）、外１名、ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism）、１９９９年、第８４巻、第３４４３〜３４５０ページ。
【０００７】
【非特許文献２】マザック（Matzuk）、外１名、ネイチャー・セル・バイオロジー（Nature Cell Biology）、２００２年、第４（Ｓｕｐｐ１）巻、Ｓ４１〜Ｓ４９。
【０００８】
【非特許文献３】ベルゲロン（Bergeron）、外３名、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシズ(Trends In Biochemical Sciences)、１９９４年、第１９巻、第１２４〜１２８ページ。
【０００９】
【非特許文献４】イカワ（Ikawa）、外６名、ネイチャー（Nature）、１９９７年、第３８７巻、第６０７〜６１１ページ。
【００１０】
【非特許文献５】ルービンスタイン（Rubinstein）、外４名、セミナー・イン・セル・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー（Seminars in cell and developmental biology）、２００６年、第１７巻第２号、第２５４〜２６３ページ。
【００１１】
【非特許文献６】パーソン（Persson）、外２名、ジーン（Gene）、２００２年、第２９７巻第１−２号、第１５１〜１５８ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
男性不妊を診断するための有効な遺伝子診断方法は未だ十分に確立されていない。男性不妊の原因は生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な病態の原因を特定できる診断法が望まれている。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、精子における卵子への融合能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、Ｃａｌｒ３遺伝子に機能的に類似したＣａｌｍｅｇｉｎ遺伝子が欠損したマウスのオスが不妊症になること、Ｃａｌｍｅｇｉｎ分子の抗体が精子と卵子の融合を阻害すること、Ｃａｌｒ３分子はその発現部位から精子の卵子への接着に関わる蛋白質のシャペロン分子であることが予想されること、及びＣａｌｒ３ノックアウトマウスが不妊になることから、Ｃａｌｒ３分子が妊孕性に関連し、Ｃａｌｒ３タンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす（或いは引き起こしやすい）と考え、ヒトＣａｌｒ３遺伝子配列を解析し、ヒトＣａｌｒ３遺伝子に男性不妊症に関連した変異を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の、第１２８位の塩基、第１２９位の塩基、第２３３位の塩基、第２５１位の塩基、第３１３位の塩基、第３２８位の塩基、第３４６位の塩基、第３７０位の塩基、第３８５位の塩基、第５８４位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第７８２位の塩基、第７８３位の塩基、第８２０位の塩基、第９４５位の塩基、第９４６位の塩基、第９４７位の塩基、第９７０位の塩基、第９７６位の塩基、第９８１位の塩基、第１０２２位の塩基、第１０２３位の塩基、第１０３４位の塩基、第１０４６位の塩基、第１０５６位の塩基、第１０５８位の塩基、第１０６３位の塩基、第１０７４位の塩基、第１０８３位の塩基、第１０８６位の塩基、及び第１１１１位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする、妊孕性診断方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列において、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、又は第１０５８位の塩基が置換されており、この置換された塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
また、本発明は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第２３３位の塩基がアデニン、第５８６位の塩基がチミン、第６１６位の塩基がチミン、第６４４位の塩基がチミン、第６４７位の塩基がチミン、第７４２位の塩基がチミン、第８２０位の塩基がアデニン、第９７６位の塩基がアデニン、第１０５６位の塩基がチミン、又は第１０５８位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供することを目的とする。
また、本発明は、配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて、第１２８位の塩基がチミン、第１２９位の塩基がアデニン、第２５１位の塩基がアデニン、第３１３位の塩基がアデニン、第３２８位の塩基がチミン、第３４６位の塩基がチミン、第３７０位の塩基がチミン、第３８５位の塩基がアデニン、第５８４位の塩基がチミン、第７８２位の塩基がチミン、第７８３位の塩基がアデニン、第９４５位の塩基がアデニン、第９４６位の塩基がアデニン、第９４７位の塩基がアデニン、第９７０位の塩基がアデニン、第９８１位の塩基がアデニン、第１０２２位の塩基がチミン、第１０２３位の塩基がチミン、第１０３４位の塩基がチミン、第１０４６位の塩基がチミン、第１０６３位の塩基がチミン、第１０７４位の塩基がチミン、第１０８３位の塩基がアデニン、第１０８６位の塩基がチミン、又は第１１１１位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キットを提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の妊孕性診断方法や妊孕性診断キットを用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を、高精度かつ簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトＣａｌｒ３遺伝子構造と配列解析に用いたＰＣＲのアンプリコンを示す物理地図である。
【図２】インベーダー法の原理を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に係る妊孕性診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有することを特徴とする。ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損や特定の塩基の変異は、男性不妊との相関性が高い。したがって、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のＣａｌｒ３遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
【００１８】
配列番号１は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＮＣ＿００００１９．８で登録されている野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号１に示すように、野生型ヒトＣａｌｒ３遺伝子は、１１５５ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号２は、野生型ヒトＣａｌｒ３タンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。
【００１９】
図１は、野生型ヒトＣａｌｒ３遺伝子の構造を示す模式図である。野生型ヒトＣａｌｒ３遺伝子のうち、細線部分がイントロンであり、太線部分がエクソンである。また、「ＭＥＴ」は開始コドンであり、「ＴＥＲ」終止コドンである。さらに、野生型ヒトＣａｌｒ３遺伝子の下の各数値は、転写開始点を１としたときの塩基数を示している。なお、ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトＣａｌｒ３遺伝子は、ヒト１９番染色体長腕に位置している（１９ｐ１３．１１）。
【００２０】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号１に示すヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域において塩基が置換している患者がいることを見出した。一方、これらの塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では見られなかった。
【００２１】
ヒトＣａｌｒ３遺伝子に上記の置換変異が起こると、正常なタンパク質が発現しなくなってしまう。それゆえ、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の置換変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なＣａｌｒ３タンパク質の翻訳量が低下することにより、或いは、変異型Ｃａｌｒ３タンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【００２２】
本発明において、変異とは、遺伝子の塩基配列において、塩基が欠失・置換・挿入されていることを意味する。本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程において検出されるＣａｌｒ３遺伝子の変異は、男性不妊との相関性が高い変異である。具体的には、以下に述べるＸＸ個の変異を検出することにより、検出工程に用いられた生体サンプルを採取されたヒトが、妊孕させやすいか否か、不妊症であると診断されている場合には、不妊症の原因がＣａｌｒ３遺伝子の変異によるものであるか否かを判断することができる。なお、「Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」とは、「翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」を意味する。
【００２３】
男性不妊との相関性が高い変異として、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４３位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。
【００２４】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４３位のアスパラギン酸がグルタミン酸にコードされるようになる。
【００２５】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第７８位のセリンがチロシンにコードされるようになる。
【００２６】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第８４位のフェニルアラニンがチロシンにコードされるようになる。
【００２７】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１０５位のシステインがセリンにコードされるようになる。
【００２８】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１０位のイソロイシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
【００２９】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１６位のアスパラギン酸がチロシンにコードされるようになる。
【００３０】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１２４位のグリシンがコードされなくなる（終止コドン）。
【００３１】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１２９位のチロシンがアスパラギンにコードされるようになる。
【００３２】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９５位のセリンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００３３】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９６位のイソロイシンがロイシンにコードされるようになる。
【００３４】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２０６位のリジンがコードされなくなる（終止コドン）。
【００３５】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１５位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
【００３６】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１６位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。
【００３７】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２４８位のアスパラギン酸がチロシンにコードされるようになる。
【００３８】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６１位のチロシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
【００３９】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６１位のチロシンがコードされなくなる（終止コドン）。
【００４０】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２７４位のバリンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００４１】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１５位のアスパラギンがリジンにコードされるようになる。
【００４２】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１６位のフェニルアラニンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００４３】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１６位のフェニルアラニンがチロシンにコードされるようになる。
【００４４】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２４位のチロシンがアスパラギンにコードされるようになる。
【００４５】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２６位のアスパラギン酸がアスパラギンにコードされるようになる。
【００４６】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２７位のアスパラギンがリジンにコードされるようになる。
【００４７】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４１位のアルギニンがメチオニンにコードされるようになる。
【００４８】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４１位のアルギニンがセリンにコードされるようになる。
【００４９】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４５位のアラニンがバリンにコードされるようになる。
【００５０】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４９位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
【００５１】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５２位のメチオニンがイソロイシンにコードされるようになる。
【００５２】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５３位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
【００５３】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５５位のアラニンがセリンにコードされるようになる。
【００５４】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５８位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
【００５５】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位のチミンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３６１位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
【００５６】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３６２位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
【００５７】
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１１１１位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３７１位のヒスチジンがチロシンにコードされるようになる。
【００５８】
本発明に係る妊孕性診断方法においては、特に、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、又は第１０５８位の塩基を検出することが好ましい。より妊孕性との相関性が高いためである。また、本発明に係る妊孕性診断方法においては、上記の変異のうち、１種類の変異を検出するものであってもよく、複数種類の変異を検出するものであってもよい。
【００５９】
本発明に係る妊孕性診断方法は、これらの一塩基変異を、妊孕性の遺伝子マーカーとして用いるものである。たとえば、これらの塩基の変異が検出されなかった場合、検出工程に用いられた生体サンプルが回収された被験者は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、Ｃａｌｒ３遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。一方、変異が検出された場合は、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。また、被験者が不妊症患者であれば、その原因がＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異により、Ｃａｌｒ３分子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。したがって、そのような被験者に対して、たとえばＴＥＳＥ−ＩＣＳＩ（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｓｐｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；精巣生検−顕微授精）等の適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。すなわち、本発明に係る妊孕性診断方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした診断方法ともいえるものであり、該方法により、不妊症の診断を行う上で重要な情報が提供されるため、被験者に対して、現存の治療法の中から適格な選択を提示することができる。このため、本発明に係る妊孕性診断方法等は、低妊孕性又は不妊症の診断において好ましく用いることができる。
【００６０】
本発明に係る妊孕性診断方法において用いられる生体サンプルは、ヒトから採取されたものであって、Ｃａｌｒ３遺伝子由来の核酸やタンパク質を含有することが期待できるサンプルであれば、特に限定されるものではなく、たとえば、血液、血清、血漿、頬の内側等の粘膜、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を挙げることができる。ここで、Ｃａｌｒ３遺伝子由来の核酸とは、Ｃａｌｒ３遺伝子のゲノムＤＮＡや、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ等を意味する。また、Ｃａｌｒ３遺伝子由来のタンパク質とは、Ｃａｌｒ３遺伝子から発現されるタンパク質であるＣａｌｒ３分子やその分解物等を意味する。特に、Ｃａｌｒ３遺伝子由来のタンパク質を検出対象とする場合には、生体サンプルとして、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を用いることが好ましい。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊等されることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。
【００６１】
なお、生体サンプルを適宜希釈等することによりそのまま検出工程に用いてもよく、該生体サンプルから予め抽出したゲノムＤＮＡ等のＤＮＡを用いてもよい。また、該生体サンプルからｍＲＮＡ等のＲＮＡを抽出した後、逆転写反応により該ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを検出工程に用いてもよい。
【００６２】
本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程において、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、遺伝子の変異や多型の検出等において用いられる公知の各種手法、たとえば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、Ｔａｑｍａｎプローブ法、ＳＭＭＤ法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＡＳＡ法、及び塩基伸長法、並びにそれらを改変した方法等を用いることができる。検出感度及び精度に優れているため、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法等のように、変異部位を特異的に認識する塩基配列を有するプローブやプライマーを用いて検出する方法であることが好ましい。
【００６３】
ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプローブやプライマーは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子及びその周辺の塩基配列に基づき、常法により設計し、合成することができる。なお、ヒトＣａｌｒ３遺伝子及びその周辺の塩基配列は、たとえばＮＣＢＩヒトゲノムリソース（ＮＣＢＩ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／）等の公知のデータベースから当業者であれば容易に入手することができる。
【００６４】
たとえば、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列、すなわち、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第２３３位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第２３３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第２３３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じくヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドにおいて、当該第２３３位の塩基がシトシンであり、当該第２３３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、Ｃａｌｒ３遺伝子の塩基配列中の当該第２３３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基に相当する。すなわち、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等として、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第２３３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００６５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第５８６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第５８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第５８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１０３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第５８６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位の塩基に相当する。
【００６６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第６１６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６１６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第６１６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１３３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１３３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第６１６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１３３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位の塩基に相当する。
【００６７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては配列番号１で表される塩基配列において、第６４４位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第６４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１６１番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１６１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第６４４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１６１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１６１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位の塩基に相当する。
【００６８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第６４７位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第６４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１６４番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１６４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第６４７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１６４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１６４番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位の塩基に相当する。
【００６９】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第７４２位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第７４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第７４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号６で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７４２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号６で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号６で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位の塩基に相当する。
【００７０】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第８２０位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第８２０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第８２０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号７で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第８２０位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号７で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号７で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位の塩基に相当する。
【００７１】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９７６位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第９７６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９７６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１３２番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１３２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９７６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１３２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位の塩基に相当する。
【００７２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０５６位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０５６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０５６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１３５番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１３５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０５６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１３５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３５番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位の塩基に相当する。
【００７３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０５８位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１０５８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０５８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１３７番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０５８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３７番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位の塩基に相当する。
【００７４】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１２８位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１２８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１２８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１２８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号３で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基に相当する。
【００７５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１２９位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第１２９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１２９位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号３で表される塩基配列において、１０２番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１２９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列において、１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号３で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位の塩基に相当する。
【００７６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第２５１位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第２５１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第２５１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、１１９番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１１９番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第２５１位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、１１９番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１１９番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位の塩基に相当する。
【００７７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３１３位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第３１３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３１３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、１８１番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３１３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、１８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１８１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位の塩基に相当する。
【００７８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３２８位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第３２８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３２８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、１９６番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１９６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３２８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、１９６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１９６番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位の塩基に相当する。
【００７９】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３４６位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第３４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、２１４番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該２１４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３４６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、２１４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、２１４番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位の塩基に相当する。
【００８０】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３７０位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第３７０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３７０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、２３８番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該２３８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３７０位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、２３８番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、２３８番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位の塩基に相当する。
【００８１】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第３８５位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第３８５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第３８５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、２５３番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該２５３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第３８５位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、２５３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、２５３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位の塩基に相当する。
【００８２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第５８４位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第５８４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第５８４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第５８４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位の塩基に相当する。
【００８３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第７８２位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第７８２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第７８２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号６で表される塩基配列において、１４１番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１４１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７８２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号６で表される塩基配列において、１４１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号６で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１４１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位の塩基に相当する。
【００８４】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第７８３位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第７８３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第７８３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号６で表される塩基配列において、１４２番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１４２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７８３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号６で表される塩基配列において、１４２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号６で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１４２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位の塩基に相当する。
【００８５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９４５位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第９４５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９４５位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９４５位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位の塩基に相当する。
【００８６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９４６位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１０２番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９４６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位の塩基に相当する。
【００８７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９４７位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや配列番号１で表される塩基配列において、第９４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１０３番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９４７位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位の塩基に相当する。
【００８８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９７０位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９７０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９７０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１２６番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１２６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９７０位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１２６番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１２６番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位の塩基に相当する。
【００８９】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第９８１位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第９８１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第９８１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号８で表される塩基配列において、１３７番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第９８１位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号８で表される塩基配列において、１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号８で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１３７番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位の塩基に相当する。
【００９０】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０２２位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０２２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０２２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０２２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位の塩基に相当する。
【００９１】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０２３位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０２３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０２３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１０２番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０２３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１０２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１０２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位の塩基に相当する。
【００９２】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０３４位の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該第１０３４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０３４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１１３番目の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該１１３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０３４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１１３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１１３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位の塩基に相当する。
【００９３】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０４６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１０４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０４６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１２５番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１２５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０４６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１２５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１２５番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位の塩基に相当する。
【００９４】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０６３位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０６３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０６３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１４２番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１４２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０６３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１４２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１４２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位の塩基に相当する。
【００９５】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０７４位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１０７４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０７４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１５３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１５３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０７４位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１５３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１５３番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位の塩基に相当する。
【００９６】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０８３位の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該第１０８３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０８３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１６２番目の塩基がチミンからアデニンに置換されており、当該１６２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０８３位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１６２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１６２番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位の塩基に相当する。
【００９７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１０８６位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１０８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
一方、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位の塩基の変異を検出するためのプライマー等としては、配列番号９で表される塩基配列において、１６５番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１６５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１０８６位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号９で表される塩基配列において、１６５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号９で表される塩基配列は、Ｃａｌｒ３遺伝子の部分塩基配列であって、１６５番目の塩基が、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位の塩基に相当する。
【００９８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡや、ゲノムＤＮＡを用いて、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１１１１位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号１で表される塩基配列において、第１１１１位の塩基がシトシンからチミンに置換されており、当該第１１１１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１で表される塩基配列において、第１１１１位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００９９】
このように、上述する各変異の有無を検出するためのプライマー等としては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることができる。また、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子のゲノムＤＮＡにおいて、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることもできる。これらのポリヌクレオチドの長さとしては、１０〜７０塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましく、１０〜３０塩基長であることがさらに好ましい。なお、変異の有無の検出精度が改善されるため、該ポリヌクレオチド中、当該変異部位の塩基と対合し得る塩基の位置は特に限定されるものではないが、３’末端から１〜５塩基以内にあることが好ましく、３’末端にあることがより好ましい。
【０１００】
なお、ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性診断キットを用いることにより、本発明に係る妊孕性診断方法をより簡便に行うことができる。本発明に係る妊孕性診断キットとしては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基、第１２９位の塩基、第２３３位の塩基、第２５１位の塩基、第３１３位の塩基、第３２８位の塩基、第３４６位の塩基、第３７０位の塩基、第３８５位の塩基、第５８４位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第７８２位の塩基、第７８３位の塩基、第８２０位の塩基、第９４５位の塩基、第９４６位の塩基、第９４７位の塩基、第９７０位の塩基、第９７６位の塩基、第９８１位の塩基、第１０２２位の塩基、第１０２３位の塩基、第１０３４位の塩基、第１０４６位の塩基、第１０５６位の塩基、第１０５８位の塩基、第１０６３位の塩基、第１０７４位の塩基、第１０８３位の塩基、第１０８６位の塩基、又は第１１１１位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることが好ましく、第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、又は第１０５８位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることがより好ましい。また、これらの変異のうちの、１種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよく、複数種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよい。
【０１０１】
これらの塩基の変異を検出するための試薬としては、たとえば、当該塩基を含む核酸領域をＰＣＲ等により増幅させるためのプライマーの組と、得られた増幅産物の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。該塩基配列決定試薬としては、たとえば、上述したヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の塩基配列又はその翻訳領域の塩基配列において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、予め蛍光色素等により標識したハイブリダイゼーションプローブ等が挙げられる。その他、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異を検出する方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である場合には、該ＲＦＬＰ法において用いられる制限酵素であってもよい。
【０１０２】
また、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。たとえば、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトＣａｌｒ３遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよく、被験者のヒトＣａｌｒ３遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。
たとえば、上述する変異の存在を検出するものである場合、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、これらの変異が少なくとも一方のアレルにおいて起こっていることを検出できればよい。一方、これらの変異の非存在を検出するものである場合、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、これらの変異が双方のアレルにおいて起こっていないことを検出することが好ましい。
【０１０３】
より具体的には、一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子内の領域のうち、上記の各変異部位のうちの少なくとも一方（以下、「変異検出部位」という）の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【０１０４】
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲを行うことにより、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行うことにより、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、たとえば、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.）等を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
【０１０５】
また、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のプライマーを、塩基配列の決定に用いられるプライマーとして用いてもよい。すなわち、妊孕性診断キットには、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組と、塩基配列の決定に用いられるプライマーとを含んでいてもよい。
【０１０６】
上記のＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【０１０７】
また、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の変異検出部位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【０１０８】
なお、それぞれのプライマーは、Ｃａｌｒ３遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。Ｃａｌｒ３遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、Ｃａｌｒ３遺伝子の各変異部位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【０１０９】
上記のプライマーの組としては、たとえば、それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９で表される塩基配列からなるプライマー（図１の１、２ｒ、３、４ｒ、５．１、６．１ｒ、７、８ｒ、９及び１０Ｒ）を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＣａｌｒ３遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）等を用いてプライマーを設計することができる。
各プライマーは、たとえばホスホロアミダイト法等の公知の方法によって合成することができ、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.の３９２型シンセサイザー等を取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
【０１１０】
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼ等がさらに含まれていてもよい。
【０１１１】
一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無を、インベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【０１１２】
図２は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダーオリゴ２及びアレルオリゴ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される（いずれの塩基とも相補的な塩基ではない）。一方、アレルオリゴ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに相補するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
このように設計されたインベーダープローブ２とアレルオリゴ３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、ターゲット遺伝子１に対してアレルオリゴ３とインベーダープローブ２が重なり合った構造をとりながらハイブリダイズし、変異検出部位１ａにおいてインベーダープローブ２がアレルオリゴ３の下に１塩基のみ侵入する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）」ともいう）４がこの侵入構造を認識し、アレルオリゴ３を重なった塩基の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、 ３’末端がフラップ遊離体３ｃと相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３進入構造が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの侵入構造を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
【０１１３】
従って、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無をインベーダー法により検出するものであってもよい。この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、インベーダープローブ２、アレルオリゴ３及びフレットプローブ５等が含まれることが好ましい。
【０１１４】
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合には、インベーダープローブ２は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型Ｃａｌｒ３遺伝子の各変異型塩基と対応するように設計される（但し、相補的でない）。また、アレルオリゴ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型Ｃａｌｒ３遺伝子の上記の変異型塩基と相補するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記アレルオリゴ３が変異型Ｃａｌｒ３遺伝子とハイブリダイズしてインベーダープローブ２による侵入構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
上記の構成により、被験者のＣａｌｒ３遺伝子において上記の塩基が変異型置換している場合は、ターゲット遺伝子にハイブリダイズしたヌクレオチド３ａの５’末端にインベーダープローブ２の３’末端が侵入することにより、ヌクレオチド３ｃが切り出されて蛍光が生じる。一方、被験者のＣａｌｒ３遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分による侵入構造が形成されないのでヌクレオチド３ｃが切り出されないため蛍光が生じない。
【０１１５】
また、上記の例では、被験者の有するＣａｌｒ３遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＣａｌｒ３遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、或いは野生型と変異型で異なった蛍光色素を使用するなど様々に改変することができる。
なお、上記の各方法において、Ｃａｌｒ３遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【０１１６】
本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無をタンパク質レベルで検出するものであってもよい。すなわち、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて、正常なヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、異常なヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。ここで、正常タンパク質とは、ヒト野生型Ｃａｌｒ３ポリペプチドであり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。一方、異常タンパク質とは、たとえば、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、上述するいずれかの一塩基置換変異が生じているポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。具体的には、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドにおいて、第２３３位の塩基がアデニン、第５８６位の塩基がチミン、第６１６位の塩基がチミン、第６４４位の塩基がチミン、第６４７位の塩基がチミン、第７４２位の塩基がチミン、第８２０位の塩基がアデニン、第９７６位の塩基がアデニン、第１０５６位の塩基がチミン、又は第１０５８位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドである。また、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１２８位の塩基がチミン、第１２９位の塩基がアデニン、第２５１位の塩基がアデニン、第３１３位の塩基がアデニン、第３２８位の塩基がチミン、第３４６位の塩基がチミン、第３７０位の塩基がチミン、第３８５位の塩基がアデニン、第５８４位の塩基がチミン、第７８２位の塩基がチミン、第７８３位の塩基がアデニン、第９４５位の塩基がアデニン、第９４６位の塩基がアデニン、第９４７位の塩基がアデニン、第９７０位の塩基がアデニン、第９８１位の塩基がアデニン、第１０２２位の塩基がチミン、第１０２３位の塩基がチミン、第１０３４位の塩基がチミン、第１０４６位の塩基がチミン、第１０６３位の塩基がチミン、第１０７４位の塩基がチミン、第１０８３位の塩基がアデニン、第１０８６位の塩基がチミン、又は第１１１１位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドであってもよい。
【０１１７】
なお、生体サンプル中に含まれているヒトＣａｌｒ３タンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出する方法としては、特に限定されるものではない。たとえば、第３７０位や６１６位の変異のように、正常タンパク質と異常タンパク質とが明らかに分子量が異なる場合には、電気泳動法等により生体サンプル中に含まれているヒトＣａｌｒ３タンパク質の大きさを調べることによって、異常タンパク質が存在しているか否かを検出することができる。また、抗体を用いることにより、生体サンプル中に含まれているヒトＣａｌｒ３タンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを、より高精度に検出することもできる。
【０１１８】
具体的には、たとえば、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程は、上述した各変異のうちの少なくとも１種の変異を含むヒト変異型Ｃａｌｒ３遺伝子によってコードされるヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質（正常タンパク質）と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中に異常タンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＣａｌｒ３の異常タンパク質と結合し、かつ、正常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いてもよい。なお、このような抗体は、ヒトＣａｌｒ３の異常タンパク質を抗原として、常法により作製したポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の中から、ヒトＣａｌｒ３の正常タンパク質と交差しないものを選択することにより、得ることができる。
【０１１９】
より具体的には、本発明に係る抗体は、上述したアミノ酸の置換変異を含むヒト変異型Ｃａｌｒ３ポリペプチドまたは変異部分を含むそのフラグメントを抗原として実験動物を免疫処置することにより、製造することができる（たとえば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354n (1985)を参照のこと。）
一般的には、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（たとえば、ヒーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキシド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。たとえば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを腹腔内及び／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが望ましい。
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型Ｃａｌｒ３ポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型Ｃａｌｒ３ポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型Ｃａｌｒ３ポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが望ましい。
【０１２０】
このように、一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、上述した各変異のうち少なくとも一方の塩基置換を含むヒト変異型Ｃａｌｒ３遺伝子によってコードされるヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質が発現しているかを判定するものであってもよい。
上記抗体を用いてヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質が発現されていると判定された場合は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＣａｌｒ３遺伝子の異常に起因していると推定することができる。
【０１２１】
また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて正常なヒトＣａｌｒ３蛋白質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。より具体的には、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程が、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合し、かつ、異常ヒトＣａｌｒ３タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中にヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質と結合し、かつ、異常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体（抗Ｃａｌｒ３抗体）を用いてもよい。
抗Ｃａｌｒ３抗体を用いてヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現していないと判定された場合は、ヒトＣａｌｒ３遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＣａｌｒ３タンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。
【０１２２】
抗体を用いて、生体サンプル中のヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質またはヒト変異型Ｃａｌｒ３タンパク質を検出する手法は、特に限定されず、公知のいずれの手法を用いてもよい。たとえば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）等が挙げられる。
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用する妊孕性診断方法に好適なキットである場合、妊孕性診断キットには、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、抗ヒト野生型Ｃａｌｒ３タンパク質抗体または抗Ｃａｌｒ３抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼ等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。
【実施例】
【０１２３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１２４】
［実施例１］
本実施例においては、ヒトＣａｌｒ３遺伝子配列を解析し、ヒトＣａｌｒ３遺伝子に男性不妊症に関連した変異の検出を行った。
［解析対象者］
非閉塞性不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝１０００以上）を、精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１３％は非閉塞性無精子症であり、３１％は重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であり、３３％が運動無力症であり、残り２３％が形態的に異常のないものであった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317）。コントロール群（Ｎ＝２００以上）は産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親であり、妊孕性が確認された男性とした。全ての提供者からは、サンプルがゲノムＤＮＡ解析に使用される旨のインフォームドコンセントを取得した（大阪大学病院泌尿器科）。
【０１２５】
［変異スクリーニング］
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理とフェノール抽出により血液サンプル又は精液サンプルから単離し調製した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。血液由来ゲノムＤＮＡはＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて増幅したＤＮＡを使用した。
Ｃａｌｒ３遺伝子は図１に示すように９個のエクソンからアミノ酸コード領域が形成されるが、それぞれのエクソンを増幅させるため、図１に示すように、５つの複製単位（アンプリコン）に分け、ＰＣＲ用プライマーをデザインした。表１にそれぞれのプライマーを、表２にＰＣＲの反応条件を示す。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
これらのプライマーを用いて表２記載の反応条件でＰＣＲ反応を行い。得られたＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＭＰｕｒｅ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した。この精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを鋳型とし、それぞれのアンプリコンを増幅した際に使用したプライマーを用いて、シーケンシング反応を行った。具体的には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、ＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３７３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。
【０１２９】
［シークエンス解析結果］
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、プライマー１と２ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー３と４ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー５．１と６．１ｒで増幅されるアンプリコン、プライマー７と９．５ｒで増幅されるアンプリコン、及びプライマー９と１０ｒで増幅されるアンプリコンの、それぞれの塩基配列を解析したところ、表３〜５に示すように、既知のＳＮＰｓ（５ヶ所）を含めた置換変異が合計４４個検出された。このうち、アミノ酸の変化を伴う３５個の置換変異が不妊症被験者に検出され、妊孕性確認被験者からはこれらの置換変異は全く検出されず、妊孕性との相関性があることが確認された。以下、この３５個の置換変異について、それぞれ説明する。
【０１３０】
【表３】
【０１３１】
【表４】
【０１３２】
【表５】
【０１３３】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６３４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４３位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２９位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６３４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４３位のアスパラギン酸がグルタミン酸にコードされるようになる。
【０１３４】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２３３位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第７８位のセリンがチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第２５１位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第８４位のフェニルアラニンがチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３１３位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１０５位のシステインがセリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３２８位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１０位のイソロイシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３４６位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１６位のアスパラギン酸がチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３７０位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１２４位のグリシンがコードされなくなる（終止コドン）。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第３８５位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７８４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１２９位のチロシンがアスパラギンにコードされるようになる。
【０１３５】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８４位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９５位のセリンがイソロイシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第５８６位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に３人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９６位のイソロイシンがロイシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６１６位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に４人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２０６位のリジンがコードされなくなる（終止コドン）。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４４位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１５位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第６４７位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者３００人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１６位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。
【０１３６】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７４２位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１５人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２４８位のアスパラギン酸がチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８２位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６１位のチロシンがフェニルアラニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第７８３位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６１位のチロシンがコードされなくなる（終止コドン）。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第８２０位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１９人、両方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６７１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２７４位のバリンがイソロイシンにコードされるようになる。
【０１３７】
Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４５位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１５位のアスパラギンがリジンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４６位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１６位のフェニルアラニンがイソロイシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９４７位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１６位のフェニルアラニンがチロシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７０位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２４位のチロシンがアスパラギンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９７６位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に６人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２６位のアスパラギン酸がアスパラギンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第９８１位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３２７位のアスパラギンがリジンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２２位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４１位のアルギニンがメチオニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０２３位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４１位のアルギニンがセリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０３４位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４５位のアラニンがバリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０４６位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３４９位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５６位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５２位のメチオニンがイソロイシンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０５８位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に２７人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５３位のリジンがメチオニンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０６３位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５５位のアラニンがセリンにコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０７４位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３５８位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８３位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３６１位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１０８６位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３６２位のグルタミン酸がアスパラギン酸にコードされるようになる。
また、Ｃａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１１１１位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４６４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３７１位のヒスチジンがチロシンにコードされるようになる。
【０１３８】
これらの置換変異の中でも、特に、第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、又は第１０５８位の塩基の置換変異の出現率が高く、男性不妊症との相関性が高かった。
【０１３９】
上記の置換変異が見出された被験者は、正常なＣａｌｒ３の蛋白質の翻訳量が低減したことにより、或いは、変異型Ｃａｌｒ３蛋白質がドミナントネガティブに作用することにより、Ｃａｌｒ３蛋白質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。
【０１４０】
なお、本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がＣａｌｒ３遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明に係る妊孕性診断方法等を用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を行うことができ、妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。
【符号の説明】
【０１４２】
１…ターゲット遺伝子、１ａ…変異（又は一塩基多型）検出部位、２…インベーダーオリゴ、３…アレルオリゴ、３ａ…ヌクレオチド、３ｂ…フラップ、３ｃ…フラップ遊離体、４…フラップエンドヌクレアーゼ、５…フレットプローブ、５ａ…ヌクレオチド、５ｂ…蛍光色素、５ｃ…クエンチャー（発光抑制体）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、
前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の、第１２８位の塩基、第１２９位の塩基、第２３３位の塩基、第２５１位の塩基、第３１３位の塩基、第３２８位の塩基、第３４６位の塩基、第３７０位の塩基、第３８５位の塩基、第５８４位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第７８２位の塩基、第７８３位の塩基、第８２０位の塩基、第９４５位の塩基、第９４６位の塩基、第９４７位の塩基、第９７０位の塩基、第９７６位の塩基、第９８１位の塩基、第１０２２位の塩基、第１０２３位の塩基、第１０３４位の塩基、第１０４６位の塩基、第１０５６位の塩基、第１０５８位の塩基、第１０６３位の塩基、第１０７４位の塩基、第１０８３位の塩基、第１０８６位の塩基、及び第１１１１位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする、妊孕性診断方法。
【請求項２】
前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の、第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、及び第１０５８位の塩基からなる群より選択される１以上の変異の有無を検出することを特徴とする請求項１記載の妊孕性診断方法。
【請求項３】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第２３３位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第２３３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項４】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第５８６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第５８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１０３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項５】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第６１６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６１６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１３３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１３３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項６】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第６４４位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１６１番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１６１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項７】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第６４７位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１６４番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１６４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項８】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第７４２位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第７４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項９】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第８２０位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第８２０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号７で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１０】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第９７６位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第９７６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号８で表される塩基配列において、１３２番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１３２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１１】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第１０５６位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０５６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号９で表される塩基配列において、１３５番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１３５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１２】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第１０５８位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１０５８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号９で表される塩基配列において、１３７番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１３】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第２３３位の塩基がアデニン、第５８６位の塩基がチミン、第６１６位の塩基がチミン、第６４４位の塩基がチミン、第６４７位の塩基がチミン、第７４２位の塩基がチミン、第８２０位の塩基がアデニン、第９７６位の塩基がアデニン、第１０５６位の塩基がチミン、又は第１０５８位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１２８位の塩基がチミン、第１２９位の塩基がアデニン、第２５１位の塩基がアデニン、第３１３位の塩基がアデニン、第３２８位の塩基がチミン、第３４６位の塩基がチミン、第３７０位の塩基がチミン、第３８５位の塩基がアデニン、第５８４位の塩基がチミン、第７８２位の塩基がチミン、第７８３位の塩基がアデニン、第９４５位の塩基がアデニン、第９４６位の塩基がアデニン、第９４７位の塩基がアデニン、第９７０位の塩基がアデニン、第９８１位の塩基がアデニン、第１０２２位の塩基がチミン、第１０２３位の塩基がチミン、第１０３４位の塩基がチミン、第１０４６位の塩基がチミン、第１０６３位の塩基がチミン、第１０７４位の塩基がチミン、第１０８３位の塩基がアデニン、第１０８６位の塩基がチミン、又は第１１１１位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項１７】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおいて発現しているＣａｌｒ３ポリペプチドの変異の有無を、請求項１６に記載の抗体によって検出する検出工程を有することを特徴とする、妊孕性診断方法。
【請求項１８】
ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項１９】
翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基、第１２９位の塩基、第２３３位の塩基、第２５１位の塩基、第３１３位の塩基、第３２８位の塩基、第３４６位の塩基、第３７０位の塩基、第３８５位の塩基、第５８４位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第７８２位の塩基、第７８３位の塩基、第８２０位の塩基、第９４５位の塩基、第９４６位の塩基、第９４７位の塩基、第９７０位の塩基、第９７６位の塩基、第９８１位の塩基、第１０２２位の塩基、第１０２３位の塩基、第１０３４位の塩基、第１０４６位の塩基、第１０５６位の塩基、第１０５８位の塩基、第１０６３位の塩基、第１０７４位の塩基、第１０８３位の塩基、第１０８６位の塩基、及び第１１１１位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする請求項１８記載の妊孕性診断キット。
【請求項２０】
前記試薬が、抗Ｃａｌｒ３抗体であることを特徴とする請求項１９記載の妊孕性診断キット。
【請求項１】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、
前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の、第１２８位の塩基、第１２９位の塩基、第２３３位の塩基、第２５１位の塩基、第３１３位の塩基、第３２８位の塩基、第３４６位の塩基、第３７０位の塩基、第３８５位の塩基、第５８４位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第７８２位の塩基、第７８３位の塩基、第８２０位の塩基、第９４５位の塩基、第９４６位の塩基、第９４７位の塩基、第９７０位の塩基、第９７６位の塩基、第９８１位の塩基、第１０２２位の塩基、第１０２３位の塩基、第１０３４位の塩基、第１０４６位の塩基、第１０５６位の塩基、第１０５８位の塩基、第１０６３位の塩基、第１０７４位の塩基、第１０８３位の塩基、第１０８６位の塩基、及び第１１１１位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする、妊孕性診断方法。
【請求項２】
前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の、第２３３位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第８２０位の塩基、第９７６位の塩基、第１０５６位の塩基、及び第１０５８位の塩基からなる群より選択される１以上の変異の有無を検出することを特徴とする請求項１記載の妊孕性診断方法。
【請求項３】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第２３３位の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該第２３３位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がシトシンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項４】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第５８６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第５８６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１０３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１０３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項５】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第６１６位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６１６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１３３番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１３３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項６】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第６４４位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６４４位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１６１番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１６１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項７】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第６４７位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第６４７位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１６４番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１６４番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項８】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第７４２位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第７４２位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項９】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第８２０位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第８２０位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号７で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１０】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第９７６位の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該第９７６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号８で表される塩基配列において、１３２番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１３２番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１１】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第１０５６位の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該第１０５６位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号９で表される塩基配列において、１３５番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１３５番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１２】
下記の（ａ）〜（ｄ）の何れかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列において、第１０５８位の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該第１０５８位の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）配列番号９で表される塩基配列において、１３７番目の塩基がアデニンからチミンに置換されており、当該１３７番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
【請求項１３】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第２３３位の塩基がアデニン、第５８６位の塩基がチミン、第６１６位の塩基がチミン、第６４４位の塩基がチミン、第６４７位の塩基がチミン、第７４２位の塩基がチミン、第８２０位の塩基がアデニン、第９７６位の塩基がアデニン、第１０５６位の塩基がチミン、又は第１０５８位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１２８位の塩基がチミン、第１２９位の塩基がアデニン、第２５１位の塩基がアデニン、第３１３位の塩基がアデニン、第３２８位の塩基がチミン、第３４６位の塩基がチミン、第３７０位の塩基がチミン、第３８５位の塩基がアデニン、第５８４位の塩基がチミン、第７８２位の塩基がチミン、第７８３位の塩基がアデニン、第９４５位の塩基がアデニン、第９４６位の塩基がアデニン、第９４７位の塩基がアデニン、第９７０位の塩基がアデニン、第９８１位の塩基がアデニン、第１０２２位の塩基がチミン、第１０２３位の塩基がチミン、第１０３４位の塩基がチミン、第１０４６位の塩基がチミン、第１０６３位の塩基がチミン、第１０７４位の塩基がチミン、第１０８３位の塩基がアデニン、第１０８６位の塩基がチミン、又は第１１１１位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項１７】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおいて発現しているＣａｌｒ３ポリペプチドの変異の有無を、請求項１６に記載の抗体によって検出する検出工程を有することを特徴とする、妊孕性診断方法。
【請求項１８】
ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項１９】
翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＣａｌｒ３遺伝子の翻訳領域の第１２８位の塩基、第１２９位の塩基、第２３３位の塩基、第２５１位の塩基、第３１３位の塩基、第３２８位の塩基、第３４６位の塩基、第３７０位の塩基、第３８５位の塩基、第５８４位の塩基、第５８６位の塩基、第６１６位の塩基、第６４４位の塩基、第６４７位の塩基、第７４２位の塩基、第７８２位の塩基、第７８３位の塩基、第８２０位の塩基、第９４５位の塩基、第９４６位の塩基、第９４７位の塩基、第９７０位の塩基、第９７６位の塩基、第９８１位の塩基、第１０２２位の塩基、第１０２３位の塩基、第１０３４位の塩基、第１０４６位の塩基、第１０５６位の塩基、第１０５８位の塩基、第１０６３位の塩基、第１０７４位の塩基、第１０８３位の塩基、第１０８６位の塩基、及び第１１１１位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする請求項１８記載の妊孕性診断キット。
【請求項２０】
前記試薬が、抗Ｃａｌｒ３抗体であることを特徴とする請求項１９記載の妊孕性診断キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１５８１８８（Ｐ２０１０−１５８１８８Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６９６（Ｐ２００９−１６９６）
【出願日】平成２１年１月７日（２００９．１．７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、受託研究「男性不妊症患者のＳＮＰｓライブラリー及びマイクロアレー作成」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月７日（２００９．１．７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、受託研究「男性不妊症患者のＳＮＰｓライブラリー及びマイクロアレー作成」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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