嫌気性微生物の定量方法
【課題】 本発明は、嫌気性微生物を精度よく定量する方法を提供することを課題とした。
【解決手段】 本発明は、嫌気性微生物の定量方法であって、被験試料を滅菌希釈液で段階的に希釈したものを夫々複数調製し、大腸菌を添加した液体培地に上記段階希釈液を加えて密閉状態で培養し、当該培養の結果生じる培養物をＭＰＮ法により検定することを特徴とする嫌気性微生物の定量方法を提供することで上記課題を解決するに到ることができた。
【解決手段】 本発明は、嫌気性微生物の定量方法であって、被験試料を滅菌希釈液で段階的に希釈したものを夫々複数調製し、大腸菌を添加した液体培地に上記段階希釈液を加えて密閉状態で培養し、当該培養の結果生じる培養物をＭＰＮ法により検定することを特徴とする嫌気性微生物の定量方法を提供することで上記課題を解決するに到ることができた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＰＮ法を用いた嫌気性微生物を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、土壌や河川などの環境サンプル中に存在する微生物をモニタリングする手法では、選択培地を用いた希釈平板法（プレート法、ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ：ＣＦＵ）が用いられていた。上記方法は、選択物質（アンピシリン耐性微生物であればアンピシリン）を添加して寒天などで固めた培地に環境サンプルをプレーティングして培養し、コロニーが形成されるか否かから目的とする微生物の存在の有無を確認している。
【０００３】
上記方法はコロニーを形成する微生物では有用であるものの、コロニーを形成し難い微生物のモニタリングには適していなかった。そのためコロニーを形成し難い微生物のモニタリングでは、被験試料を液体培地に添加して培養し、目的とする微生物の働きによって生成される培養物の有無を基にして微生物の定量を行なうＭＰＮ法が用いられている。特許文献１では、重油が流出した表層海水から石油分解細菌を検出・定量する方法が開示されている。上記文献ではＭＰＮ法を用い、炭素源（ｎ−テトラデカンおよび灯油、Ｃ重油）を添加したＮＰ培地に上記表層海水を加えて培養し、培養後、培地の濁度や浮遊する石油の変化などから石油分解細菌の菌数を算出している。
【０００４】
ときに有機塩素系化合物の一種であり、ドライクリーニングやフロンガスの製造原料、金属部品の脱脂洗浄用の薬剤、繊維の精錬加工で用いる薬剤として長年使用されているＰＣＥは、発ガン性を有することや中枢神経や肝臓・腎臓に障害を与えることが動物実験で報告されている。またＰＣＥは自然環境下では分解され難く、土壌や地下水などの環境中に放出されると、環境中から除去するのが困難であった。そこで微生物を用いてＰＣＥを処理する方法が検討されているが、ＰＣＥなどの有機塩素系化合物を脱塩素化する微生物（以下、「ＰＣＥ脱塩素化微生物」とも称する）の多くはコロニーを形成し難くいため、該微生物のモニタリングにはＭＰＮ法を用いなければならなかった。
【特許文献１】特開平１０−０３４１２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＭＰＮ法は、上述のように微生物の働きによって生成される培養物を指標としているため、定量精度を高めるには目的とする微生物の生育に適した環境条件を形成する必要がある。しかしＭＰＮ法を用いたＰＣＥ脱塩素化微生物などの嫌気性微生物の定量では、生育に適した環境条件を形成することが難しく、嫌気性微生物を精度よく定量できなかった。
【０００６】
本発明は上記問題点を認識して成されたものであり、嫌気性微生物を精度よく定量する方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、嫌気性微生物をＭＰＮ法で定量する際の培養方法について鋭意研究を行なった結果、大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養することで嫌気性微生物の生育に適した環境を容易に形成することができ、その結果被験試料中での嫌気性微生物を精度よく定量できることを見出し本発明に至った。
【０００８】
本発明の嫌気性微生物の定量方法は、
被験試料を滅菌希釈液で段階的に希釈したものを夫々複数調製し、大腸菌を添加した液体培地に上記段階希釈液を加えて密閉状態で培養し、当該培養の結果生じる培養物を指標としてＭＰＮ法により検定することを特徴としている。
【０００９】
上記定量方法では、液体培地中の大腸菌の濃度を、１×１０6個／ｍｌ以上にすることが好ましい。
【００１０】
上記定量方法では、液体培地へさらに有機塩素系化合物を添加し、上記培養の結果生じる上記有機塩素系化合物由来の脱塩素化物を指標としてＭＰＮ法を行なうことで、脱塩素化菌を定量することもできる。その際、有機塩素系化合物として塩素化エチレン（特にテトラクロロエチレン）を添加してもよい。また上記脱塩素化物としてトリクロロエチレンおよびｃｉｓ−ジクロロエチレンの少なくともいずれか１方を指標としてもよい。
【００１１】
上記定量方法では、液体培地へさらに硫酸・亜硫酸・チオ硫酸ならびにそれらの塩からなる群より選択される硫黄化合物と、鉄化合物とを添加し、上記培養の結果生じる硫化鉄の沈殿物を指標としてＭＰＮ法を行なうことで、硫酸還元菌を定量することもできる。上記硫黄化合物の中では亜硫酸塩が好ましい。
【００１２】
これら定量方法はＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）の定量のために行なうこともできる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の定量方法では、大腸菌を添加した液体培地に被験試料を添加して密閉状態で培養することで、培養器内を目的とする嫌気性微生物の生育に適した環境状態に近づけられる。そして目的とする嫌気性微生物が生育することによって生じる特定の培養物を指標としているため、目的とする嫌気性微生物を精度よく定量できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の嫌気性微生物の定量方法では、被験試料を滅菌希釈液で段階的に希釈したものを夫々複数調製し、大腸菌を添加した液体培地に上記段階希釈液を加えて密閉状態で培養し、当該培養の結果生じる培養物を最確数法（ＭＰＮ法）により検定することからなり、ＭＰＮ法で嫌気性微生物を定量する際に、大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養する点に特徴を有している。
【００１５】
ＭＰＮ法は、公知の方法（３本法や５本法など）を適用することができる。例えば、被験試料を滅菌希釈液で希釈（５倍や１０倍）したもの夫々複数（３本法であれば３本、５本法であれば５本）調製して第１希釈液を作製する。被験試料を滅菌希釈液でさらに希釈（５2倍や１０2倍）希釈したものを調製して第２希釈液（３本法であれば３本、５本法であれば５本）を作製する。同様な操作を繰り返して第３希釈液を作製する。また被験試料中での目的とする微生物の濃度に応じて、同様な方法でさらに希釈した希釈液を作製してもよい。次に上記希釈液を、大腸菌を添加した液体培地に添加し、密閉状態で培養し、上記希釈液ごとに指標となる物質（培養物）が存在するか否か（存在していれば陽性と判断し、存在していなければ陰性と判断する）を判定する。そして希釈液ごとに陽性の数を計測し、陽性の数が分散する箇所を基にして、その前後での希釈液での陽性の数を最確数表に照らし合わせて最確値（ＭＰＮ値）を求める。例えば上述の３本法で第７希釈液まで作製して検定を行なった結果、第１希釈液・第２希釈液・第３希釈液・・・第７希釈液での陽性の数が（３・３・３・２・１・０・０）であれば、第３〜５希釈液（陽性の数：３・２・１）または第４〜６希釈液（陽性の数：２・１・０）の結果をＷｏｏｄｗａｒｄらが提唱している最確数表に照らし合わせてＭＰＮ値［前者であれば１５０、後者であれば１５］を算出する。
【００１６】
そして上記で選択した希釈液の組み合わせ（以下、希釈系列とも称する。）のうち、中央に位置する希釈液（前者であれば第４希釈液にあたり、後者であれば第５希釈液にあたる）の希釈率（前者であれば１０4、後者であれば１０5）に、上記ＭＰＮ値を掛け合わせることで被験試料中での目的とする微生物の濃度を定量できる［ＭＰＮ値は１０を底とする対数の値であるため、微生物の濃度は、前者であればｌｏｇ10（１５０）×１０4×（大腸菌を添加した液体培地で希釈液を希釈した希釈率）、後者であればｌｏｇ10（１５）×１０5×（大腸菌を添加した液体培地で希釈液を希釈した希釈率）］。その際、被験試料を予めある一定の割合に希釈した後に、希釈液を作製してもよい。最確数表は、Ｗｏｏｄｗａｒｄらが提唱している最確数表に限定されるものではなく、測定結果に応じてＨｕｒｌｅｙ＆Ｒｏｓｃｏｅらが提唱している最確数表やＳａｌａｍａらが提唱している最確数表なども適用することができる。
【００１７】
上記嫌気性微生物は酸素存在下では生育できない偏性嫌気性微生物に限るものではなく、酸素存在下でも生育できる通性嫌気性微生物も含む。
【００１８】
上記被験試料は、海水や河川・下水・工業廃水などや土壌微生物を抽出した抽出液、ならびにそれらを希釈した希釈液などを用いることができる。被験試料を段階的に希釈する滅菌希釈液は被験試料と相溶性を示し、かつ目的とする嫌気性微生物が存在しない液体の中から選択すればよく、水溶性の被験試料では滅菌蒸留水などを用いることができる。
【００１９】
上記大腸菌は酸素の有無によらず生育できる通性嫌気性細菌であるため、幅広い酸素分圧での嫌気的条件でも生育できる。そのため目的とする嫌気性微生物の耐酸素特性に応じて、幅広い酸素分圧での嫌気的状態を形成し易い。さらに上記大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養することで、培養初期に大腸菌が生育して容器内の酸素を徐々に消費し、その結果培養器内を、嫌気性微生物が生育し易い環境に徐々に近づけられるため、目的とする嫌気性微生物の酸素に対する耐性を予め調査することなく嫌気性微生物を定量できる。それ以外に、大腸菌の代謝によって液体培地中の物質（培地成分など）が変化し、嫌気性微生物の生育に適した環境が形成されることも考えられる。このように大腸菌を添加した液体培地を密閉条件で培養することで、段階希釈液（被験試料）中に嫌気性微生物が存在すれば、培養器内の環境条件が次第に該嫌気性微生物の生育に適した環境条件（培養器内の酸素分圧など）に近づき、その結果目的とする嫌気性微生物の生育が活発となり、嫌気性微生物の代謝によって生成される培養物（培養結果物）が生成され易くなる。
【００２０】
上記大腸菌は、液体培地の成分や大腸菌の特性（酸素消費効率や薬剤などに対する耐性など）・培養器の大きさ・液体培地の量によって公知の大腸菌（天然の大腸菌のみならず、組換え体の大腸菌も含む）の中から適宜選択すればよい。特に後述するような有機塩素系化合物などの有害物質を添加した液体培地では、大腸菌は、添加する有害物質に対する耐性を有することが好ましいが、必ずしも完全な耐性を有しておく必要はなく、ある一定の耐性を示していればよい。ある一定の耐性を示すとは、培養器内で酸素を消費し、目的とする嫌気性微生物の生育に適した環境を形成できるまで生育しうる程度の耐性を意味する。有機塩素系化合物を有害物質として添加した液体培地では、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３８６８号などの大腸菌を、液体培地に対して１０6個／ｍｌ以上（好ましくは１０8個／ｍｌ以上）添加して０〜３日程度培養することで、培養器内に有機塩素系化合物を脱塩素化しうる嫌気性微生物が生育できる環境を形成することができる。また耐性が弱い大腸菌でも液体培地に添加する量を調節することで対応することができる。さらに目的とする嫌気性微生物の酸素に対する耐性に応じて大腸菌の添加量や培養期間を調節することができる。具体的には、酸素に対する耐性が弱い嫌気性微生物では、大腸菌の添加量を増やしたり、培養期間を延ばしたりして調節することができる。添加時の大腸菌の状態は、より効率よく嫌気状態を形成する観点から、生育が盛んな対数増殖期の状態であることが好ましい。液体培地は目的とする嫌気性微生物と添加する大腸菌に応じて適宜選択すればよく、ＬＢ培地やＮＰ培地などが挙げられる。
【００２１】
上記密閉状態は、酸素の出入りなどが全くない完全な密閉状態以外に、目的とする嫌気性微生物が生育・増殖できうる程度に酸素が多少出入りする状態も含まれる。培養器は、上記密閉状態を維持できるものであれば特には限定されず、目的とする微生物の耐酸素特性によっては口の部分をブチルゴム栓・アルミシールしたバイアル瓶なども用いることができる。培養温度などの培養条件は、大腸菌の種類や所望する嫌気性微生物の特性などに応じて適宜選択すればよい。
【００２２】
上記培養物は、液体培地の成分や目的とする嫌気性微生物の特性に応じて選択すればよく、培養物をメタンとすることでメタン細菌を定量することができる。
【００２３】
また液体培地に有機塩素系化合物を添加し、該有機塩素系化合物由来の脱塩素化物を指標とすることで、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｏｉｄｅｓ属やＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（特にＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株）などの有機塩素系化合物を脱塩素化する嫌気性微生物の定量もできる。有機塩素系化合物は、特には限定されず、塩素化エチレンやポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、ダイオキシンなどが挙げられる。中でも塩素化エチレン［特にテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）］を選択することが推奨される。液体培地中での有機塩素系化合物の濃度は、有機塩素系化合物の種類（例えば毒性の程度）や目的とする嫌気性微生物の上記化合物に対する耐性の程度によるが、通常１ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲内で選択すればよい。ＰＣＥを脱塩素化し得る嫌気性微生物を得るには、液体培地あたりＰＣＥを０．０１ｐｐｍ以上（好ましくは１ｐｐｍ以上）であり、１６０ｐｐｍ以下（好ましくは５０ｐｐｍ以下）程度添加すればよい。有機塩素系化合物は予め液体培地に添加していてもよいし、大腸菌の有機塩素系化合物に対する耐性によっては、培養途中（嫌気的条件を形成した後など）で添加してもよい。指標となる培養物（有機塩素系化合物由来の脱塩素化物）としては、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）やｃｉｓ−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）、ビニルクロライド（ＶＣ）、エチレン（ＥＴＨ）などが挙げられる。
【００２４】
また液体培地に鉄化合物と硫黄化合物を添加し、培養物として硫化鉄の沈殿物を指標とすることで、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属やＤｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｔｏｍａｃｕｌｕｍ属などの硫酸（塩）還元菌やＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株などの硫酸還元能を有する菌を定量することができる。鉄化合物とは液体培地中で鉄イオンを形成しうる化合物やその塩類を意味し、鉄元素を有し液体培地に可溶な化合物の中から選択すればよい。具体的には後述する表５に記載した液体培地では、硫酸第一鉄やクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムなどを用いることができる。硫黄化合物とは、液体培地中で硫酸・亜硫酸・チオ硫酸やそれらの塩類であり、液体培地に可溶な化合物の中から目的とする元菌の還元対象に応じて適宜選択すればよい。
【実施例】
【００２５】
本実施例は、ＫＢＣ−１株（ＰＣＥを脱塩素化する微生物）が存在する河川（利根川）を想定したものであり、該河川中でのＫＢＣ−１株の定量を行なうものである。
【００２６】
上記ＫＢＣ−１株はＰＣＥをＴＣＥに脱塩素化することができ、かつ亜硫酸塩と鉄化合物が含まれている液体培地で培養すると、硫化鉄の沈殿を生じさせる硫酸還元能を有する嫌気性微生物である。
【００２７】
＜検定サンプル＞
下記する液体培地を作製し、５ｍｌのバイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、１２１℃・２０分間、オートクレーブにて滅菌処理を施して検定サンプルを作製した。なお、下記Ｗｏｌｆｅｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎの調製では、試薬を溶解させるために、フィルター滅菌を施した塩酸を適宜滴下して行なった。
【００２８】
【表１】
ＳＬ-１０ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
【００２９】
【表２】
Ｗｏｌｆｅｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
【００３０】
【表３】
【００３１】
＜被験試料の調製＞
有機塩素系化合物としてＰＣＥを用い、脱塩素化物としてＴＣＥを選択した。
【００３２】
ＫＢＣ−１株を上記液体培地に植菌し、３０℃で３日間培養した。培養後、血球計算盤にて培養液中でのＫＢＣ−１株の菌濃度を測定し、菌濃度が１×１０9ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように上記液体培地を用いて調製した（ＫＢＣ−１培養液）。
【００３３】
上記ＫＢＣ−１培養液を利根川の水で１０2倍希釈して被験試料（ＫＢＣ−１株を、１×１０7ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で含む利根川の水）を調製した。
【００３４】
＜大腸菌の調製＞
１２１℃で２０分間オートクレーブ処理を施した下記するＬＢ液体培地に、大腸菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３８６８）を植菌し、３７℃にて２４時間（±６時間）振とう培養（回転数：１００〜２００回／分）した。培養後、血球計算盤を用いて大腸菌の濃度を測定した（大腸菌培養液）。
【００３５】
【表４】
【００３６】
＜ガスクロマトグラフィーでの検定条件＞
ＴＣＥの有無の判定は、培養後の気相の一部（１００μｌ）を採取し、下記する条件でガスクロマトグラフィーを用い、Ｒｔ：５分付近でのピークの有無を基にして行なった。
・分析機器：島津製作所製電子捕獲型検出器（ＥＣＤ）付きガスクロマトグラフ（ＧＣ１４Ｂ）
・キャピラリーカラム：Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製 ＤＢ−６２４（内径：０．２５ｍｍ、長さ：６０ｍ、膜厚：１．４μｍ）
・分析条件：
各部の温度；カラム槽：１５０℃、注入口：２５０℃、検出器：２５０℃
キャリアーガス；高純度ヘリウム、１．０ｍｌ／分
スプリット比；１：１０
注入量；１００μｌ
【００３７】
実施例１：有機塩素系化合物（ＰＣＥ）を添加した液体培地中での大腸菌の添加量が、有機化合物を脱塩素化する微生物の定量に与える影響
≪１×１０2ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌が添加された液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫
上記大腸菌培養液を大腸菌濃度が１×１０4ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように、滅菌蒸留水を用いて希釈し、１×１０4大腸菌培養液を調製した。
【００３８】
＜希釈系列の作製＞
滅菌蒸留水を用いて被験試料を１０倍希釈し、１０1倍希釈試料を調製した。得られた１０1希釈試料から一部を取り出し、滅菌蒸留水を用いて上記被験試料を１０倍希釈し、１０2倍希釈試料を調製した。同様にして１０3〜１０7まで段階希釈した希釈試料を調製した。
【００３９】
（第１希釈液の作製）
上記１０1倍希釈試料１００μｌと１×１０4大腸菌培養液２００μｌとＰＣＥ３０ｐｐｍとを検定サンプルに添加して第１希釈液を作製し、同様にして計３本の第１希釈液を作製した。
【００４０】
（第２希釈液の作製）
１０1倍希釈試料の代わりに１０2倍希釈試料を用いた以外は“（第１希釈液の作製）”と同様な方法で、３本の第２希釈液を作製した。
【００４１】
（第３〜第７希釈液の作製）
１０1倍希釈試料の代わりに１０3〜１０7まで段階希釈した希釈試料を用いた以外は“（第１希釈液の作製）”と同様な方法で、第３〜７希釈液を各々３本ずつ作製した。
【００４２】
（ＭＰＮ試験）
上記第１〜第７希釈液（計２１本）を３０℃・暗条件下で７日間培養する。培養後、マイクロシリンジを用いて、バイアル瓶の気相から１００μｌ採取し、ガスクロマトグラフィーにてＴＣＥのピーク（Ｒｔ：５分付近）の有無を検定し、ＴＣＥの存在が認められたものを陽性とし、認められなかったものを陰性とした。上記第１〜第７希釈液の各々ので得られた陽性の数を計数し、陽性の数が分散する箇所を基にして希釈系列を選択し、Ｗｏｏｄｗａｒｄらが提唱している最確数表に照らし合わせてＭＰＮ値を求め、上述のように、［ｌｏｇ10（ＭＰＮ値）×［上記で選択した希釈系列のうち、中央に位置する希釈液の希釈率］×（大腸菌を添加した液体培地で希釈液を希釈した希釈率）］の式から被験試料中でのＫＢＣ−１株の濃度を定量した。
【００４３】
≪１×１０4および、１０6、１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌が添加された液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫
上記大腸菌培養液を大腸菌濃度が１×１０6および１０8、１０10ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように、滅菌蒸留水を用いて希釈した１×１０6および１０8、１０10大腸菌培養液を作製した。１×１０4大腸菌培養液の代わりに上記大腸菌培養液を用いた以外は“≪１×１０2ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌が添加された液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫”で述べたのと同様な方法を採用し、１×１０4および１０6、１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌が添加された液体培地でＫＢＣ−１株の定量を行なった結果を図１に示した。なお、比較として大腸菌を含まない液体培地でのＫＢＣ−１株の定量を行なった結果と顕微鏡（血球計算盤）にて観察したサンプル中に含まれるＫＢＣ−１株の濃度（検鏡）の結果についても記載した。
【００４４】
図１は横軸に大腸菌添加濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取り、縦軸にＫＢＣ−１株の検出濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取ったものである。上記の結果、大腸菌濃度が１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ以上の液体培地では、大腸菌を添加しなかったものと比べ、検出されるＫＢＣ−１株の濃度が多く、またその濃度は顕微鏡にて観察した濃度とほぼ同じであった。このことから、嫌気性微生物をＭＰＮ法で定量する際に、大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養することで、より精度よく嫌気性微生物を定量できることが分かった。
【００４５】
実施例２：硫黄化合物と鉄化合物を添加した液体培地中での大腸菌の添加量が、硫酸還元菌の定量に与える影響
液体培地として、硫黄化合物（亜硫酸ナトリウム）と鉄化合物（硫酸第一鉄）を添加した下記するＰＣＥ３０ｐｐｍを添加していない液体培地（表５）を用い、ＴＣＥの有無の代わりに硫化鉄の黒い沈殿の有無を検定し（沈殿が認められれば陽性と判断し、認められなければ陰性と判断する）、それを基にしてＭＰＮ法にて硫酸還元菌の定量を行なった以外は、実施例１と同様な方法で行ない、得られた結果を図２に示した。
【００４６】
【表５】
【００４７】
図２は横軸に大腸菌添加濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取り、縦軸にＫＢＣ−１株の検出濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取ったものである。上記の結果、大腸菌濃度が１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ以上の液体培地では、大腸菌を添加しなかったものと比べ、検出されるＫＢＣ−１株の濃度が多く、またその濃度は顕微鏡にて観察した濃度（検鏡）とほぼ同じであった。このことから、嫌気性の硫酸還元菌をＭＰＮ法で定量する際に、硫黄化合物と鉄化合物を含み大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養することで、精度よく嫌気性の硫酸還元菌を定量できることが分かった。
【００４８】
実施例３：有機塩素系化合物（ＰＣＥ）の添加量が、有機化合物を脱塩素化する微生物の定量に与える影響
上記大腸菌培養液を滅菌蒸留水にて菌濃度が１×１０8ｃｅｌｌ／ｍｌなるように希釈した希釈培養液を作製する。前述の検定サンプルに上記希釈液２００μｌとＰＣＥ０．０５ｐｐｍを添加してＰＣＥ０．０５ｐｐｍ添加液体培地を作製する。同様にしてＰＣＥ０．０５ｐｐｍの代わりに、ＰＣＥを０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１６０ｐｐｍ添加したものを作製する。
【００４９】
＜希釈系列の作製＞
≪ＰＣＥを０．０５ｐｐｍ添加した液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫
滅菌蒸留水を用いて被験試料を１０倍希釈し、１０1希釈試料を調製した。得られた１０1希釈試料から一部を取り出し、滅菌蒸留水を用いて上記被験試料を１０倍希釈し、１０2希釈試料を調製した。同様にして１０3〜１０7まで段階希釈した希釈試料を調製した。
【００５０】
（第１希釈液の作製）
上記ＰＣＥ０．０５ｐｐｍ添加液体培地に上記１０1希釈試料１００μｌを添加して第１希釈液を作製し、同様にして計３本の第１希釈液を作製した。
【００５１】
（第２希釈液の作製）
１０1倍希釈試料の代わりに１０2倍希釈試料を用いた以外は“（第１希釈液の作製）”と同様な方法で、３本の第２希釈液を作製した。
【００５２】
（第３〜第７希釈液の作製）
１０1倍希釈試料の代わりに１０3〜１０7まで段階希釈した希釈試料を用いた以外は“（第１希釈液の作製）”と同様な方法で、第３〜７希釈液を各々３本ずつ作製した。
【００５３】
実施例１と同様な方法で行なった。
≪ＰＣＥを０．１、１、１０、１００、１６０ｐｐｍ添加した液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫
ＰＣＥ０．０５ｐｐｍ添加液体培地の代わりに、ＰＣＥを０．１、１、１０、１００、１６０ｐｐｍずつ添加した液体培地を用いた以外は、“≪ＰＣＥを０．０５ｐｐｍ添加した液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫”で述べたのと同様な方法で行なった。
【００５４】
なお、ＭＰＮ試験は実施例１と同様な方法で行ない、得られた結果を図３に示した。
【００５５】
図３は横軸にＰＣＥ添加濃度（ｐｐｍ）を取り、縦軸に検出濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取ったものであり、比較として実施例１と同様な方法で測定した顕微鏡観察での結果（検鏡）も示した。上記の結果、ＫＢＣ−１株をＭＰＮ法で定量する際に、大腸菌を添加した液体培地にＰＣＥを添加して密閉状態で培養することで、顕微鏡で観察した結果（検鏡）と同程度の精度でＫＢＣ−１株を定量することができた。さらに０．０５ｐｐｍといった僅かな濃度のＰＣＥを添加するだけでも、十分な精度が得られることが分かった。このことから、大腸菌を添加した液体培地にＰＣＥを添加して密閉状態で培養することで、より精度よく嫌気性のＰＣＥを脱塩素化する微生物（ＫＢＣ−１株）を定量できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】液体培地中での大腸菌の添加量が、ＫＢＣ−１株の定量に与える影響について記したグラフである。
【図２】硫黄化合物と鉄化合物を添加した液体培地中での大腸菌の添加量が、硫酸還元菌の定量に与える影響について記したグラフである。
【図３】液体培地へのＰＣＥの添加量の違いがＫＢＣ−１株の定量に与える影響について記したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＰＮ法を用いた嫌気性微生物を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、土壌や河川などの環境サンプル中に存在する微生物をモニタリングする手法では、選択培地を用いた希釈平板法（プレート法、ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ：ＣＦＵ）が用いられていた。上記方法は、選択物質（アンピシリン耐性微生物であればアンピシリン）を添加して寒天などで固めた培地に環境サンプルをプレーティングして培養し、コロニーが形成されるか否かから目的とする微生物の存在の有無を確認している。
【０００３】
上記方法はコロニーを形成する微生物では有用であるものの、コロニーを形成し難い微生物のモニタリングには適していなかった。そのためコロニーを形成し難い微生物のモニタリングでは、被験試料を液体培地に添加して培養し、目的とする微生物の働きによって生成される培養物の有無を基にして微生物の定量を行なうＭＰＮ法が用いられている。特許文献１では、重油が流出した表層海水から石油分解細菌を検出・定量する方法が開示されている。上記文献ではＭＰＮ法を用い、炭素源（ｎ−テトラデカンおよび灯油、Ｃ重油）を添加したＮＰ培地に上記表層海水を加えて培養し、培養後、培地の濁度や浮遊する石油の変化などから石油分解細菌の菌数を算出している。
【０００４】
ときに有機塩素系化合物の一種であり、ドライクリーニングやフロンガスの製造原料、金属部品の脱脂洗浄用の薬剤、繊維の精錬加工で用いる薬剤として長年使用されているＰＣＥは、発ガン性を有することや中枢神経や肝臓・腎臓に障害を与えることが動物実験で報告されている。またＰＣＥは自然環境下では分解され難く、土壌や地下水などの環境中に放出されると、環境中から除去するのが困難であった。そこで微生物を用いてＰＣＥを処理する方法が検討されているが、ＰＣＥなどの有機塩素系化合物を脱塩素化する微生物（以下、「ＰＣＥ脱塩素化微生物」とも称する）の多くはコロニーを形成し難くいため、該微生物のモニタリングにはＭＰＮ法を用いなければならなかった。
【特許文献１】特開平１０−０３４１２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＭＰＮ法は、上述のように微生物の働きによって生成される培養物を指標としているため、定量精度を高めるには目的とする微生物の生育に適した環境条件を形成する必要がある。しかしＭＰＮ法を用いたＰＣＥ脱塩素化微生物などの嫌気性微生物の定量では、生育に適した環境条件を形成することが難しく、嫌気性微生物を精度よく定量できなかった。
【０００６】
本発明は上記問題点を認識して成されたものであり、嫌気性微生物を精度よく定量する方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、嫌気性微生物をＭＰＮ法で定量する際の培養方法について鋭意研究を行なった結果、大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養することで嫌気性微生物の生育に適した環境を容易に形成することができ、その結果被験試料中での嫌気性微生物を精度よく定量できることを見出し本発明に至った。
【０００８】
本発明の嫌気性微生物の定量方法は、
被験試料を滅菌希釈液で段階的に希釈したものを夫々複数調製し、大腸菌を添加した液体培地に上記段階希釈液を加えて密閉状態で培養し、当該培養の結果生じる培養物を指標としてＭＰＮ法により検定することを特徴としている。
【０００９】
上記定量方法では、液体培地中の大腸菌の濃度を、１×１０6個／ｍｌ以上にすることが好ましい。
【００１０】
上記定量方法では、液体培地へさらに有機塩素系化合物を添加し、上記培養の結果生じる上記有機塩素系化合物由来の脱塩素化物を指標としてＭＰＮ法を行なうことで、脱塩素化菌を定量することもできる。その際、有機塩素系化合物として塩素化エチレン（特にテトラクロロエチレン）を添加してもよい。また上記脱塩素化物としてトリクロロエチレンおよびｃｉｓ−ジクロロエチレンの少なくともいずれか１方を指標としてもよい。
【００１１】
上記定量方法では、液体培地へさらに硫酸・亜硫酸・チオ硫酸ならびにそれらの塩からなる群より選択される硫黄化合物と、鉄化合物とを添加し、上記培養の結果生じる硫化鉄の沈殿物を指標としてＭＰＮ法を行なうことで、硫酸還元菌を定量することもできる。上記硫黄化合物の中では亜硫酸塩が好ましい。
【００１２】
これら定量方法はＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）の定量のために行なうこともできる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の定量方法では、大腸菌を添加した液体培地に被験試料を添加して密閉状態で培養することで、培養器内を目的とする嫌気性微生物の生育に適した環境状態に近づけられる。そして目的とする嫌気性微生物が生育することによって生じる特定の培養物を指標としているため、目的とする嫌気性微生物を精度よく定量できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の嫌気性微生物の定量方法では、被験試料を滅菌希釈液で段階的に希釈したものを夫々複数調製し、大腸菌を添加した液体培地に上記段階希釈液を加えて密閉状態で培養し、当該培養の結果生じる培養物を最確数法（ＭＰＮ法）により検定することからなり、ＭＰＮ法で嫌気性微生物を定量する際に、大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養する点に特徴を有している。
【００１５】
ＭＰＮ法は、公知の方法（３本法や５本法など）を適用することができる。例えば、被験試料を滅菌希釈液で希釈（５倍や１０倍）したもの夫々複数（３本法であれば３本、５本法であれば５本）調製して第１希釈液を作製する。被験試料を滅菌希釈液でさらに希釈（５2倍や１０2倍）希釈したものを調製して第２希釈液（３本法であれば３本、５本法であれば５本）を作製する。同様な操作を繰り返して第３希釈液を作製する。また被験試料中での目的とする微生物の濃度に応じて、同様な方法でさらに希釈した希釈液を作製してもよい。次に上記希釈液を、大腸菌を添加した液体培地に添加し、密閉状態で培養し、上記希釈液ごとに指標となる物質（培養物）が存在するか否か（存在していれば陽性と判断し、存在していなければ陰性と判断する）を判定する。そして希釈液ごとに陽性の数を計測し、陽性の数が分散する箇所を基にして、その前後での希釈液での陽性の数を最確数表に照らし合わせて最確値（ＭＰＮ値）を求める。例えば上述の３本法で第７希釈液まで作製して検定を行なった結果、第１希釈液・第２希釈液・第３希釈液・・・第７希釈液での陽性の数が（３・３・３・２・１・０・０）であれば、第３〜５希釈液（陽性の数：３・２・１）または第４〜６希釈液（陽性の数：２・１・０）の結果をＷｏｏｄｗａｒｄらが提唱している最確数表に照らし合わせてＭＰＮ値［前者であれば１５０、後者であれば１５］を算出する。
【００１６】
そして上記で選択した希釈液の組み合わせ（以下、希釈系列とも称する。）のうち、中央に位置する希釈液（前者であれば第４希釈液にあたり、後者であれば第５希釈液にあたる）の希釈率（前者であれば１０4、後者であれば１０5）に、上記ＭＰＮ値を掛け合わせることで被験試料中での目的とする微生物の濃度を定量できる［ＭＰＮ値は１０を底とする対数の値であるため、微生物の濃度は、前者であればｌｏｇ10（１５０）×１０4×（大腸菌を添加した液体培地で希釈液を希釈した希釈率）、後者であればｌｏｇ10（１５）×１０5×（大腸菌を添加した液体培地で希釈液を希釈した希釈率）］。その際、被験試料を予めある一定の割合に希釈した後に、希釈液を作製してもよい。最確数表は、Ｗｏｏｄｗａｒｄらが提唱している最確数表に限定されるものではなく、測定結果に応じてＨｕｒｌｅｙ＆Ｒｏｓｃｏｅらが提唱している最確数表やＳａｌａｍａらが提唱している最確数表なども適用することができる。
【００１７】
上記嫌気性微生物は酸素存在下では生育できない偏性嫌気性微生物に限るものではなく、酸素存在下でも生育できる通性嫌気性微生物も含む。
【００１８】
上記被験試料は、海水や河川・下水・工業廃水などや土壌微生物を抽出した抽出液、ならびにそれらを希釈した希釈液などを用いることができる。被験試料を段階的に希釈する滅菌希釈液は被験試料と相溶性を示し、かつ目的とする嫌気性微生物が存在しない液体の中から選択すればよく、水溶性の被験試料では滅菌蒸留水などを用いることができる。
【００１９】
上記大腸菌は酸素の有無によらず生育できる通性嫌気性細菌であるため、幅広い酸素分圧での嫌気的条件でも生育できる。そのため目的とする嫌気性微生物の耐酸素特性に応じて、幅広い酸素分圧での嫌気的状態を形成し易い。さらに上記大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養することで、培養初期に大腸菌が生育して容器内の酸素を徐々に消費し、その結果培養器内を、嫌気性微生物が生育し易い環境に徐々に近づけられるため、目的とする嫌気性微生物の酸素に対する耐性を予め調査することなく嫌気性微生物を定量できる。それ以外に、大腸菌の代謝によって液体培地中の物質（培地成分など）が変化し、嫌気性微生物の生育に適した環境が形成されることも考えられる。このように大腸菌を添加した液体培地を密閉条件で培養することで、段階希釈液（被験試料）中に嫌気性微生物が存在すれば、培養器内の環境条件が次第に該嫌気性微生物の生育に適した環境条件（培養器内の酸素分圧など）に近づき、その結果目的とする嫌気性微生物の生育が活発となり、嫌気性微生物の代謝によって生成される培養物（培養結果物）が生成され易くなる。
【００２０】
上記大腸菌は、液体培地の成分や大腸菌の特性（酸素消費効率や薬剤などに対する耐性など）・培養器の大きさ・液体培地の量によって公知の大腸菌（天然の大腸菌のみならず、組換え体の大腸菌も含む）の中から適宜選択すればよい。特に後述するような有機塩素系化合物などの有害物質を添加した液体培地では、大腸菌は、添加する有害物質に対する耐性を有することが好ましいが、必ずしも完全な耐性を有しておく必要はなく、ある一定の耐性を示していればよい。ある一定の耐性を示すとは、培養器内で酸素を消費し、目的とする嫌気性微生物の生育に適した環境を形成できるまで生育しうる程度の耐性を意味する。有機塩素系化合物を有害物質として添加した液体培地では、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３８６８号などの大腸菌を、液体培地に対して１０6個／ｍｌ以上（好ましくは１０8個／ｍｌ以上）添加して０〜３日程度培養することで、培養器内に有機塩素系化合物を脱塩素化しうる嫌気性微生物が生育できる環境を形成することができる。また耐性が弱い大腸菌でも液体培地に添加する量を調節することで対応することができる。さらに目的とする嫌気性微生物の酸素に対する耐性に応じて大腸菌の添加量や培養期間を調節することができる。具体的には、酸素に対する耐性が弱い嫌気性微生物では、大腸菌の添加量を増やしたり、培養期間を延ばしたりして調節することができる。添加時の大腸菌の状態は、より効率よく嫌気状態を形成する観点から、生育が盛んな対数増殖期の状態であることが好ましい。液体培地は目的とする嫌気性微生物と添加する大腸菌に応じて適宜選択すればよく、ＬＢ培地やＮＰ培地などが挙げられる。
【００２１】
上記密閉状態は、酸素の出入りなどが全くない完全な密閉状態以外に、目的とする嫌気性微生物が生育・増殖できうる程度に酸素が多少出入りする状態も含まれる。培養器は、上記密閉状態を維持できるものであれば特には限定されず、目的とする微生物の耐酸素特性によっては口の部分をブチルゴム栓・アルミシールしたバイアル瓶なども用いることができる。培養温度などの培養条件は、大腸菌の種類や所望する嫌気性微生物の特性などに応じて適宜選択すればよい。
【００２２】
上記培養物は、液体培地の成分や目的とする嫌気性微生物の特性に応じて選択すればよく、培養物をメタンとすることでメタン細菌を定量することができる。
【００２３】
また液体培地に有機塩素系化合物を添加し、該有機塩素系化合物由来の脱塩素化物を指標とすることで、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｏｉｄｅｓ属やＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（特にＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株）などの有機塩素系化合物を脱塩素化する嫌気性微生物の定量もできる。有機塩素系化合物は、特には限定されず、塩素化エチレンやポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、ダイオキシンなどが挙げられる。中でも塩素化エチレン［特にテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）］を選択することが推奨される。液体培地中での有機塩素系化合物の濃度は、有機塩素系化合物の種類（例えば毒性の程度）や目的とする嫌気性微生物の上記化合物に対する耐性の程度によるが、通常１ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲内で選択すればよい。ＰＣＥを脱塩素化し得る嫌気性微生物を得るには、液体培地あたりＰＣＥを０．０１ｐｐｍ以上（好ましくは１ｐｐｍ以上）であり、１６０ｐｐｍ以下（好ましくは５０ｐｐｍ以下）程度添加すればよい。有機塩素系化合物は予め液体培地に添加していてもよいし、大腸菌の有機塩素系化合物に対する耐性によっては、培養途中（嫌気的条件を形成した後など）で添加してもよい。指標となる培養物（有機塩素系化合物由来の脱塩素化物）としては、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）やｃｉｓ−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）、ビニルクロライド（ＶＣ）、エチレン（ＥＴＨ）などが挙げられる。
【００２４】
また液体培地に鉄化合物と硫黄化合物を添加し、培養物として硫化鉄の沈殿物を指標とすることで、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属やＤｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｔｏｍａｃｕｌｕｍ属などの硫酸（塩）還元菌やＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株などの硫酸還元能を有する菌を定量することができる。鉄化合物とは液体培地中で鉄イオンを形成しうる化合物やその塩類を意味し、鉄元素を有し液体培地に可溶な化合物の中から選択すればよい。具体的には後述する表５に記載した液体培地では、硫酸第一鉄やクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムなどを用いることができる。硫黄化合物とは、液体培地中で硫酸・亜硫酸・チオ硫酸やそれらの塩類であり、液体培地に可溶な化合物の中から目的とする元菌の還元対象に応じて適宜選択すればよい。
【実施例】
【００２５】
本実施例は、ＫＢＣ−１株（ＰＣＥを脱塩素化する微生物）が存在する河川（利根川）を想定したものであり、該河川中でのＫＢＣ−１株の定量を行なうものである。
【００２６】
上記ＫＢＣ−１株はＰＣＥをＴＣＥに脱塩素化することができ、かつ亜硫酸塩と鉄化合物が含まれている液体培地で培養すると、硫化鉄の沈殿を生じさせる硫酸還元能を有する嫌気性微生物である。
【００２７】
＜検定サンプル＞
下記する液体培地を作製し、５ｍｌのバイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、１２１℃・２０分間、オートクレーブにて滅菌処理を施して検定サンプルを作製した。なお、下記Ｗｏｌｆｅｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎの調製では、試薬を溶解させるために、フィルター滅菌を施した塩酸を適宜滴下して行なった。
【００２８】
【表１】
ＳＬ-１０ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
【００２９】
【表２】
Ｗｏｌｆｅｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
【００３０】
【表３】
【００３１】
＜被験試料の調製＞
有機塩素系化合物としてＰＣＥを用い、脱塩素化物としてＴＣＥを選択した。
【００３２】
ＫＢＣ−１株を上記液体培地に植菌し、３０℃で３日間培養した。培養後、血球計算盤にて培養液中でのＫＢＣ−１株の菌濃度を測定し、菌濃度が１×１０9ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように上記液体培地を用いて調製した（ＫＢＣ−１培養液）。
【００３３】
上記ＫＢＣ−１培養液を利根川の水で１０2倍希釈して被験試料（ＫＢＣ−１株を、１×１０7ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で含む利根川の水）を調製した。
【００３４】
＜大腸菌の調製＞
１２１℃で２０分間オートクレーブ処理を施した下記するＬＢ液体培地に、大腸菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３８６８）を植菌し、３７℃にて２４時間（±６時間）振とう培養（回転数：１００〜２００回／分）した。培養後、血球計算盤を用いて大腸菌の濃度を測定した（大腸菌培養液）。
【００３５】
【表４】
【００３６】
＜ガスクロマトグラフィーでの検定条件＞
ＴＣＥの有無の判定は、培養後の気相の一部（１００μｌ）を採取し、下記する条件でガスクロマトグラフィーを用い、Ｒｔ：５分付近でのピークの有無を基にして行なった。
・分析機器：島津製作所製電子捕獲型検出器（ＥＣＤ）付きガスクロマトグラフ（ＧＣ１４Ｂ）
・キャピラリーカラム：Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製 ＤＢ−６２４（内径：０．２５ｍｍ、長さ：６０ｍ、膜厚：１．４μｍ）
・分析条件：
各部の温度；カラム槽：１５０℃、注入口：２５０℃、検出器：２５０℃
キャリアーガス；高純度ヘリウム、１．０ｍｌ／分
スプリット比；１：１０
注入量；１００μｌ
【００３７】
実施例１：有機塩素系化合物（ＰＣＥ）を添加した液体培地中での大腸菌の添加量が、有機化合物を脱塩素化する微生物の定量に与える影響
≪１×１０2ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌が添加された液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫
上記大腸菌培養液を大腸菌濃度が１×１０4ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように、滅菌蒸留水を用いて希釈し、１×１０4大腸菌培養液を調製した。
【００３８】
＜希釈系列の作製＞
滅菌蒸留水を用いて被験試料を１０倍希釈し、１０1倍希釈試料を調製した。得られた１０1希釈試料から一部を取り出し、滅菌蒸留水を用いて上記被験試料を１０倍希釈し、１０2倍希釈試料を調製した。同様にして１０3〜１０7まで段階希釈した希釈試料を調製した。
【００３９】
（第１希釈液の作製）
上記１０1倍希釈試料１００μｌと１×１０4大腸菌培養液２００μｌとＰＣＥ３０ｐｐｍとを検定サンプルに添加して第１希釈液を作製し、同様にして計３本の第１希釈液を作製した。
【００４０】
（第２希釈液の作製）
１０1倍希釈試料の代わりに１０2倍希釈試料を用いた以外は“（第１希釈液の作製）”と同様な方法で、３本の第２希釈液を作製した。
【００４１】
（第３〜第７希釈液の作製）
１０1倍希釈試料の代わりに１０3〜１０7まで段階希釈した希釈試料を用いた以外は“（第１希釈液の作製）”と同様な方法で、第３〜７希釈液を各々３本ずつ作製した。
【００４２】
（ＭＰＮ試験）
上記第１〜第７希釈液（計２１本）を３０℃・暗条件下で７日間培養する。培養後、マイクロシリンジを用いて、バイアル瓶の気相から１００μｌ採取し、ガスクロマトグラフィーにてＴＣＥのピーク（Ｒｔ：５分付近）の有無を検定し、ＴＣＥの存在が認められたものを陽性とし、認められなかったものを陰性とした。上記第１〜第７希釈液の各々ので得られた陽性の数を計数し、陽性の数が分散する箇所を基にして希釈系列を選択し、Ｗｏｏｄｗａｒｄらが提唱している最確数表に照らし合わせてＭＰＮ値を求め、上述のように、［ｌｏｇ10（ＭＰＮ値）×［上記で選択した希釈系列のうち、中央に位置する希釈液の希釈率］×（大腸菌を添加した液体培地で希釈液を希釈した希釈率）］の式から被験試料中でのＫＢＣ−１株の濃度を定量した。
【００４３】
≪１×１０4および、１０6、１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌が添加された液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫
上記大腸菌培養液を大腸菌濃度が１×１０6および１０8、１０10ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように、滅菌蒸留水を用いて希釈した１×１０6および１０8、１０10大腸菌培養液を作製した。１×１０4大腸菌培養液の代わりに上記大腸菌培養液を用いた以外は“≪１×１０2ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌が添加された液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫”で述べたのと同様な方法を採用し、１×１０4および１０6、１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの大腸菌が添加された液体培地でＫＢＣ−１株の定量を行なった結果を図１に示した。なお、比較として大腸菌を含まない液体培地でのＫＢＣ−１株の定量を行なった結果と顕微鏡（血球計算盤）にて観察したサンプル中に含まれるＫＢＣ−１株の濃度（検鏡）の結果についても記載した。
【００４４】
図１は横軸に大腸菌添加濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取り、縦軸にＫＢＣ−１株の検出濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取ったものである。上記の結果、大腸菌濃度が１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ以上の液体培地では、大腸菌を添加しなかったものと比べ、検出されるＫＢＣ−１株の濃度が多く、またその濃度は顕微鏡にて観察した濃度とほぼ同じであった。このことから、嫌気性微生物をＭＰＮ法で定量する際に、大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養することで、より精度よく嫌気性微生物を定量できることが分かった。
【００４５】
実施例２：硫黄化合物と鉄化合物を添加した液体培地中での大腸菌の添加量が、硫酸還元菌の定量に与える影響
液体培地として、硫黄化合物（亜硫酸ナトリウム）と鉄化合物（硫酸第一鉄）を添加した下記するＰＣＥ３０ｐｐｍを添加していない液体培地（表５）を用い、ＴＣＥの有無の代わりに硫化鉄の黒い沈殿の有無を検定し（沈殿が認められれば陽性と判断し、認められなければ陰性と判断する）、それを基にしてＭＰＮ法にて硫酸還元菌の定量を行なった以外は、実施例１と同様な方法で行ない、得られた結果を図２に示した。
【００４６】
【表５】
【００４７】
図２は横軸に大腸菌添加濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取り、縦軸にＫＢＣ−１株の検出濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取ったものである。上記の結果、大腸菌濃度が１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ以上の液体培地では、大腸菌を添加しなかったものと比べ、検出されるＫＢＣ−１株の濃度が多く、またその濃度は顕微鏡にて観察した濃度（検鏡）とほぼ同じであった。このことから、嫌気性の硫酸還元菌をＭＰＮ法で定量する際に、硫黄化合物と鉄化合物を含み大腸菌を添加した液体培地を密閉状態で培養することで、精度よく嫌気性の硫酸還元菌を定量できることが分かった。
【００４８】
実施例３：有機塩素系化合物（ＰＣＥ）の添加量が、有機化合物を脱塩素化する微生物の定量に与える影響
上記大腸菌培養液を滅菌蒸留水にて菌濃度が１×１０8ｃｅｌｌ／ｍｌなるように希釈した希釈培養液を作製する。前述の検定サンプルに上記希釈液２００μｌとＰＣＥ０．０５ｐｐｍを添加してＰＣＥ０．０５ｐｐｍ添加液体培地を作製する。同様にしてＰＣＥ０．０５ｐｐｍの代わりに、ＰＣＥを０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１６０ｐｐｍ添加したものを作製する。
【００４９】
＜希釈系列の作製＞
≪ＰＣＥを０．０５ｐｐｍ添加した液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫
滅菌蒸留水を用いて被験試料を１０倍希釈し、１０1希釈試料を調製した。得られた１０1希釈試料から一部を取り出し、滅菌蒸留水を用いて上記被験試料を１０倍希釈し、１０2希釈試料を調製した。同様にして１０3〜１０7まで段階希釈した希釈試料を調製した。
【００５０】
（第１希釈液の作製）
上記ＰＣＥ０．０５ｐｐｍ添加液体培地に上記１０1希釈試料１００μｌを添加して第１希釈液を作製し、同様にして計３本の第１希釈液を作製した。
【００５１】
（第２希釈液の作製）
１０1倍希釈試料の代わりに１０2倍希釈試料を用いた以外は“（第１希釈液の作製）”と同様な方法で、３本の第２希釈液を作製した。
【００５２】
（第３〜第７希釈液の作製）
１０1倍希釈試料の代わりに１０3〜１０7まで段階希釈した希釈試料を用いた以外は“（第１希釈液の作製）”と同様な方法で、第３〜７希釈液を各々３本ずつ作製した。
【００５３】
実施例１と同様な方法で行なった。
≪ＰＣＥを０．１、１、１０、１００、１６０ｐｐｍ添加した液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫
ＰＣＥ０．０５ｐｐｍ添加液体培地の代わりに、ＰＣＥを０．１、１、１０、１００、１６０ｐｐｍずつ添加した液体培地を用いた以外は、“≪ＰＣＥを０．０５ｐｐｍ添加した液体培地でのＫＢＣ−１株の定量≫”で述べたのと同様な方法で行なった。
【００５４】
なお、ＭＰＮ試験は実施例１と同様な方法で行ない、得られた結果を図３に示した。
【００５５】
図３は横軸にＰＣＥ添加濃度（ｐｐｍ）を取り、縦軸に検出濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）を取ったものであり、比較として実施例１と同様な方法で測定した顕微鏡観察での結果（検鏡）も示した。上記の結果、ＫＢＣ−１株をＭＰＮ法で定量する際に、大腸菌を添加した液体培地にＰＣＥを添加して密閉状態で培養することで、顕微鏡で観察した結果（検鏡）と同程度の精度でＫＢＣ−１株を定量することができた。さらに０．０５ｐｐｍといった僅かな濃度のＰＣＥを添加するだけでも、十分な精度が得られることが分かった。このことから、大腸菌を添加した液体培地にＰＣＥを添加して密閉状態で培養することで、より精度よく嫌気性のＰＣＥを脱塩素化する微生物（ＫＢＣ−１株）を定量できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】液体培地中での大腸菌の添加量が、ＫＢＣ−１株の定量に与える影響について記したグラフである。
【図２】硫黄化合物と鉄化合物を添加した液体培地中での大腸菌の添加量が、硫酸還元菌の定量に与える影響について記したグラフである。
【図３】液体培地へのＰＣＥの添加量の違いがＫＢＣ−１株の定量に与える影響について記したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性微生物の定量方法であって、被験試料を滅菌希釈液で段階的に希釈したものを夫々複数調製し、大腸菌を添加した液体培地に上記段階希釈液を加えて密閉状態で培養し、当該培養の結果生じる培養物をＭＰＮ法により検定することを特徴とする嫌気性微生物の定量方法。
【請求項２】
上記液体培地中の大腸菌の濃度を、１×１０6個／ｍｌ以上とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記液体培地へさらに有機塩素系化合物を添加し、上記培養の結果生じる上記有機塩素系化合物由来の脱塩素化物を指標としてＭＰＮ法を行い、脱塩素化菌を定量する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記有機塩素系化合物として塩素化エチレンを添加する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記塩素化エチレンとしてテトラクロロエチレンを添加する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記脱塩素化物としてトリクロロエチレンおよびｃｉｓ−ジクロロエチレンの少なくともいずれか１方を指標とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記液体培地へさらに硫酸・亜硫酸・チオ硫酸ならびにそれらの塩からなる群より選択される硫黄化合物と、鉄化合物とを添加し、上記培養の結果生じる硫化鉄の沈殿物を指標としてＭＰＮ法を行い、硫酸還元菌を定量する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記硫黄化合物が亜硫酸塩である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）の定量を行うものである請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１】
嫌気性微生物の定量方法であって、被験試料を滅菌希釈液で段階的に希釈したものを夫々複数調製し、大腸菌を添加した液体培地に上記段階希釈液を加えて密閉状態で培養し、当該培養の結果生じる培養物をＭＰＮ法により検定することを特徴とする嫌気性微生物の定量方法。
【請求項２】
上記液体培地中の大腸菌の濃度を、１×１０6個／ｍｌ以上とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記液体培地へさらに有機塩素系化合物を添加し、上記培養の結果生じる上記有機塩素系化合物由来の脱塩素化物を指標としてＭＰＮ法を行い、脱塩素化菌を定量する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記有機塩素系化合物として塩素化エチレンを添加する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記塩素化エチレンとしてテトラクロロエチレンを添加する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記脱塩素化物としてトリクロロエチレンおよびｃｉｓ−ジクロロエチレンの少なくともいずれか１方を指標とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記液体培地へさらに硫酸・亜硫酸・チオ硫酸ならびにそれらの塩からなる群より選択される硫黄化合物と、鉄化合物とを添加し、上記培養の結果生じる硫化鉄の沈殿物を指標としてＭＰＮ法を行い、硫酸還元菌を定量する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記硫黄化合物が亜硫酸塩である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）の定量を行うものである請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２７１３１８（Ｐ２００６−２７１３１８Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−９８８４５（Ｐ２００５−９８８４５）
【出願日】平成１７年３月３０日（２００５．３．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発」に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００１０５２）株式会社クボタ (4,415)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３０日（２００５．３．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発」に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００１０５２）株式会社クボタ (4,415)
【Ｆターム（参考）】
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