安定化免疫調節オリゴヌクレオチド
【課題】ＣｐＧ含有核酸の免疫賦活活性を増大または低減するための方法を提供する。
【解決手段】少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドおよび5'または3'末端に二次構造を有する免疫賦活オリゴヌクレオチド。これらのオリゴヌクレオチドは免疫賦活特性を低減するか、または改善する。さらに、5'末端二次構造が3'末端のそれらよりも有意に免疫賦活活性に影響することを確証した。
【解決手段】少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドおよび5'または3'末端に二次構造を有する免疫賦活オリゴヌクレオチド。これらのオリゴヌクレオチドは免疫賦活特性を低減するか、または改善する。さらに、5'末端二次構造が3'末端のそれらよりも有意に免疫賦活活性に影響することを確証した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
関連出願
本願は、2003年6月11日提出の米国仮出願No. 60/477,608、2003年8月29日提出の米国仮出願No. 60/499,038、および2003年9月18日提出の米国仮出願60/504,279の利益を請求し、これらの全体は参照として組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学、免疫学および医薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫賦活（immunostimulatory）オリゴヌクレオチドおよびそれらの治療的使用に関する。
【０００３】
関連技術の概要
免疫系は、細菌やウイルスなどの病原体のＤＮＡに一般的に生じる非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含むＤＮＡを特異的に認識するように進化してきた。結果として、非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡは、脊椎動物の免疫系の強力な賦活因子（stimulator）である。ＤＮＡによる免疫賦活の最初の報告は、細菌のＤＮＡおよび回文配列を含むＤＮＡの短い断片を用いた研究に発し、これら両方ともホスホジエステル骨格を有する二本鎖構造であった。Tokunaga, T., et al., (J Natl. Cancer Inst. 72: 955-962 (1984))は、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）ＢＣＧから単離されたＤＮＡに対して強力な抗腫瘍活性を示した。Kataoka, T, et al., (Jpn. J. Cancer Res. 83: 244-247 (1992))、Hartmann et al. (European. Journal of Immunology 33: 1673-1641 (2003))、Marshall et al. Journal of Leukocyte Biology 73: 781-792 (2003)は、ウシ型結核菌ＢＣＧのｃＤＮＡ配列に基づいて設計した、合成オリゴデオキシヌクレオチドに対して同種の抗腫瘍活性を示した。
【０００４】
Sato, Y, et al., (Science 273: 352-354 (1996))は、ＤＮＡワクチンの適用においてＣｐＧ含有ＤＮＡの重要性を示した(Gurunathan S., et al. (Annu. Rev. Immunol. 18 : 927-974 (2000)も参照)。Pisetsky, D. S., et al., (Mol. Biol. Rep. 18: 217-221 (1993))およびKrieg, A. M., et al., (Nature 374: 546-549 (1995))は、特定の配列のコンテクストにおけるＤＮＡ含有非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＮＡ）が、脊椎動物の免疫系を活性化し、Ｂ細胞の増殖並びにマクロファージ、単球、ＮＫ細胞および樹状細胞の活性化を導くことを示した。ＣｐＧ ＤＮＡ活性化に応じて、免疫細胞が、IL-12、IFN-γ、INF-α、IL-6およびTNF-αを含む多数のサイトカインを分泌し、いくつかの共賦活（co-stimulatory）分子を発現する（例えば、前掲Pisetsky, D. S., et al.およびKrieg, A. M., et al.参照）。
【０００５】
Kandimalla, E. R., et al., (Curr. Opin. Mol. Ther. 4 122-129 (2002))は、ＣｐＧジヌクレオチドの存在および位置並びにそれに隣接する配列が、免疫賦活活性に重大な意味をもつことを示した。Agrawal, S., et al. (Current Cancer Drug Targets 1: 197-209 (2001))は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの隣接配列（flanking sequences）におけるリボースの修飾による有意な効果を開示した。これらの効果は、2'-O-メトキシエトキシおよび2'-または3'-O-メチル基を含む置換基の位置と性質に依存する。Yu, D., et al. (Bioorg. Med. Chem. 9: 2803-2808 (2001))は、ホスフェート修飾が、その位置に依存する免疫賦活活性を増大または低減することもできることを示した。Yu D., et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 2263-2267 (2001))およびYu D., et al. (Bioorg. Med Chem. 11: 459-464 (2003))は、ある核酸塩基の欠失によって活性が増大し得ることを開示した。加えて、Yu D., et al. (Bioorg. Med Chem. 11: 459-464 (2003))は、ある隣接ヌクレオチドを非ヌクレオチドリンカーと置換することによって、免疫賦活活性が増大しうることを開示した。
【０００６】
Yu D., et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2585-2588 (2000))、Yu D., et al. (Nucleic Acids Res. 30: 4460-4469 (2002))、Yu D., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90 (2002))、Bhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003))およびKandimalla E. R., et al. (Nucleic Acids Res. 31: 2393-2400 (2003)は、既に、5'末端がレセプター認識に含まれること、およびこの末端の近接性（accessibility）が活性に重要な意味をもつことを示している。Kandimalla E. R., et al. (Bioconj. Chem. 13: 966-974 (2002))は、フルオレセインまたは5'-5'連鎖ジヌクレオチドよりも大きなリガンドの5'末端接合に続く免疫賦活活性の損失を開示した。3'接合は効果がないので、取り込みの変化によって結果を説明することはできない（前掲）。しかしながら、結果として起きる免疫反応においてＤＮＡの二次構造の役割を解明するための組織的な研究は全くなかった。ここで本発明は、5'-および3'-ヘアピンループまたは二重に形成し得る付着末端を有する免疫賦活ＤＮＡによる免疫賦活における情報を提供する。
【０００７】
Thlサイトカイン産生を誘導するためおよび増強したイムノグロブリン産生とのCTL反応を促進するための免疫賦活ＤＮＡの能力は、癌、ウイルス性および細菌性感染症、炎症性疾患を含む広範囲の疾患の兆候の処置のために、そして免疫治療において、アジュバントとして用いられている。したがって、免疫賦活ＤＮＡ活性を改善することまたは調節することの利益は明らかであり、そして改善した免疫賦活核酸を開発するため、当該分野における必要性が未だ存在する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、増大または低減した免疫賦活特性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドを含む内容の新規組成物を提供する。本発明はまた、増大または低減した免疫賦活特性を備えた、または増大した代謝安定性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドの設計を可能にする方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端への二次構造の導入によって、免疫賦活活性およびこれらのオリゴヌクレオチドの安定性に有意な影響が与えられることを見出した。
【０００９】
第１の面において、本発明は免疫賦活核酸を提供する。該免疫賦活核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、シチジン、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。
【００１０】
ある態様において、免疫賦活核酸は、約２〜約５０ヌクレオチド長である。ある態様において、免疫賦活核酸は、約１２〜約２６ヌクレオチド長である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは夫々、約３〜約３５のヌクレオシド残基を有し、好ましくは、約４〜約３０のヌクレオシド残基を有し、より好ましくは、約４〜約２０のヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有する。ここで用いたように、「約」との用語は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、前記の各態様の均等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド有している。
【００１１】
ある態様において、免疫賦活核酸は、3'末端ステムループ二次構造を有している。ある態様において、免疫賦活核酸は、相補配列との水素結合によって、3'末端において二次構造を有する。ある態様において、免疫賦活核酸は、配列番号２、３、４、９、１２、１３、１４、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群から選択される。
【００１２】
第２の面において、本発明は、低減した免疫賦活活性を有する核酸を提供する。この面において、該核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【００１３】
ある態様において、免疫賦活核酸は、約２〜約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。ある態様において、免疫賦活核酸は、約１２〜約２６ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。
【００１４】
ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、5'末端ステムループ二次構造を形成する。ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、相補配列との水素結合によって、5'末端において二次構造を有する。ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、配列番号５、６、７、１０、１５、１６および１７からなる群から選択される。
【００１５】
第３の面において、本発明は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活核酸であって、該免疫賦活核酸は二次構造を有する、前記免疫賦活核酸を提供する。この面において、該免疫賦活核酸は式（Ｉ）に記載の構造を含む。
ＤｏｍａｉｎＡ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＤｏｍａｉｎＣ （Ｉ）
各Ｄｏｍａｉｎは、約２〜約１２ヌクレオチド長であってもよい。ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、グアノシンまたは2-デオキシグアノシン、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよい。ある態様において、ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される２以上のジヌクレオチドを有する。
【００１６】
ＤｏｍａｉｎＢ（以下、「Ｘ」と示す）は、ＤｏｍａｉｎＡおよびＣを結びつけるリンカーで、3'-5'連鎖、2'-5'連鎖、3'-3'連鎖、ホスフェート基、ヌクレオシドまたは、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコールまたは複素環部分であってもよい非ヌクレオシドリンカーである。ある態様において、ＤｏｍａｉｎＢは、好ましくは、ＤｏｍａｉｎＡおよびＤｏｍａｉｎＣのオリゴヌクレオチドを連鎖する非ヌクレオチドリンカーであり、「イムノマー（immunomers）」という。
【００１７】
ＤｏｍａｉｎＣは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ Poly I-Poly Cであってもよい。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。ある好ましい態様において、ＤｏｍａｉｎＣは、ジヌクレオチドＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊またはＣｐＧ＊を有さない。
【００１８】
ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、約２〜約５０ヌクレオチド長である。ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、約１２〜約２６ヌクレオチド長である。
【００１９】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＩ）に記載の構造を有する。
【数１】
当業者が認めるであろうとおり、分子内ステムループの形状で分子の3'末端に二次構造要素がある。
【００２０】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＩＩ）に記載の構造を有する。
【数２】
式（ＩＩＩ）に示した構造は、２つの3'末端の配列が相補的で、分子間水素結合を可能にし、２つの分子の3'末端がブロックされているので、本明細書で「ターミナルダイマー（terminal dimmer）」という。さらに、ＤｏｍａｉｎＡおよびＡ’は同一であってもなくてもよく、ＤｏｍａｉｎＢおよびＢ’は同一であってもなくてもよく、ＤｏｍａｉｎＣおよびＣ’は同一であってもなくてもよい。
【００２１】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＶ）に記載の構造を有する。
【数３】
当業者が認めるであろうとおり、3'末端の相補配列がこの領域と水素結合しているので、示した分子の3'末端は二次構造を有する。
【００２２】
ある態様において、本発明の免疫賦活核酸は、配列番号１〜３８からなる群から選択される配列を有する。ある態様において、本発明の免疫賦活核酸は、配列番号３９〜６８からなる群から選択される配列を有する。
【００２３】
第４の面において、本発明は、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を低減または消失する方法を提供する。該方法は、オリゴヌクレオチドの5'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造は、ステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の5'末端へ相補配列を水素結合することによって得られる。
【００２４】
第５の面において、本発明は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの安定性を増大するための方法を提供する。該方法は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造はステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の3'末端に相補配列を水素結合することによって得られる。
【００２５】
第６の面において、本発明は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性の調節方法を提供する。該方法は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端に二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造は、ステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の3'末端または5'末端に相補配列を水素結合することによって得られる。
【００２６】
第７の面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第１、第２、第３、第４、第５および第６の面に開示した組成物のいずれか１つを単独で、または組み合わせて、そして薬学的に許容し得る担体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａは、1.0μg/mLの濃度で、BALB/cマウス脾臓細胞培養において、オリゴ１、２および５によって誘導された細胞増殖を示す概略図である。 図１Ｂは、BALB/cマウスに5 mg/kgの用量で腹腔内投与したオリゴ１、２および５によって誘導された脾腫を示す概略図である。
【図２】図２は、3μg/mLの濃度で、オリゴヌクレオチド１〜７とのインキュベーションの２４時間後のBALB/cマウス脾臓細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6の誘導を示す概略図である。
【図３】図３は、3μg/mLの濃度で、オリゴヌクレオチド８〜１０とのインキュベーションの２４時間後のBALB/cマウス脾臓細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6の誘導を示す概略図である。
【図４】図４は、10μg/mLのオリゴ１〜８で賦活後１時間のJ774マクロファージにおけるNF-κB経路の活性を示す図である。Mは、培地で処理した対照を表し、Cは、非ＣｐＧオリゴで処理した細胞である。
【図５】図５は、オリゴ１〜７の10μg/mLの濃度で、J774マクロファージ細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6の誘導を示す概略図である。Mは、PBSで処理した対照を表す。NDは検出なしを示す。
【図６】図６は、10μg/mLで、オリゴ１１、１２、１４、１５および１７に曝した後の形質細胞様樹状細胞におけるインターフェロンα（IFN-α）の誘導を示す概略図である。
【図７】図７は、10μg/mlで、オリゴ１８、１９、２０および２１に曝した後の形質細胞様樹状細胞におけるインターフェロンα（IFN-α）の誘導を示す概略図である。
【図８】図８は、10μg/mlで、オリゴ４１、４４、４５および２１に曝した後の形質細胞様樹状細胞におけるインターフェロンα（IFN-α）の誘導を示す概略図である。
【図９】図９は、本発明のイムノマーのパラレル合成の合成スキームである。DMTr＝4,4'-ジメトキシトリチル;CE＝シアノエチル。
【図１０】図１０は、本発明のイムノマーのリニア合成に適した典型的な低分子リンカーのグループを示す。
【図１１】図１１は、本発明のイムノマーのリニア合成の合成スキームである。DMTr＝4,4'-ジメトキシトリチル;CE＝シアノエチル。
【図１２】図１２は、本発明のイムノマーのパラレル合成に適した典型的な低分子リンカーのグループを示す。
【図１３】図１３ 自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡは、（Ａ）ヒトpDCによるIFN-αの分泌および（Ｂ）培養中のヒトＢ細胞増殖を誘導する。（Ａ）pDCは、５〜８人の健康なドナーから得られたヒトPBMCから単離し、２４時間、10μg/mLのＣｐＧ ＤＮＡで賦活化し、上清をELISAによってIFN-αの分泌を分析した。（Ｂ）Ｂ細胞は、４〜７人の健康なドナーから得られたヒトPBMCから単離し、1μg/mLのＣｐＧ ＤＮＡで７２時間賦活化し、[3H]-チミジンの取り込みを測定した。符号は、各ドナーから得られたデータを表し、プラス記号は両パネルで全てのドナーの平均値を表す。
【図１４】図１４ ヒトＢ細胞増殖のＣｐＧ ＤＮＡ濃度依存性。Ｂ細胞は、４〜６人の健康なドナーから得られたヒトPBMCから単離し、異なる濃度のＣｐＧ ＤＮＡで７２時間賦活化した。示したデータは、平均±SDである。
【図１５】図１５（Ａ）ＣｐＧモチーフおよび二次構造の存在が、ヒトpDCによるINF-αの分泌の誘導に要求される。示したデータは、10μg/mLの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、６〜８人のヒトドナーの平均±SDである。（Ｂ）ヒトＢ細胞増殖は、ＣｐＧ賦活化モチーフを要求するが、ＤＮＡの二次構造は要求しない。示したデータは、1μg/mLの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、５〜８人のドナーの平均±SDである。
【図１６】図１６ ヘアピン二次構造における2'-O-メチルリボヌクレオチドセグメントの、（Ａ）ヒトpDCによるIFN-α分泌および（Ｂ）ヒトＢ細胞増殖に対する影響。示したデータは、pDC培養における10μg/mLの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、６〜８人のヒトドナーの平均±SDであり、Ｂ細胞培養における1μg/mLの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、５〜８人のドナーの平均±SDである。
【００２８】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、増大または低減した免疫賦活特性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドを含む内容の新規組成物を提供する。本発明はまた、増大または低減した免疫賦活特性を備えた、または増大した代謝安定性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドの設計を可能にする方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端への二次構造の導入によって、免疫賦活活性およびこれらのオリゴヌクレオチドの安定性に有意な影響が与えられることを見出した。
発行済みの特許公報、特許出願および文献として本明細書に挙げたものは、参照によって組み込まれるところ、その程度は、それぞれが詳細に、別個に参照によって本明細書に組み込まれることが示された場合と同一である。本明細書に述べたいかなる文献のいかなる教示と本明細書との間が矛盾する場合、発明の目的のために本明細書が優先される。
【００２９】
第１の面において、本発明は免疫賦活核酸を提供する。該免疫賦活核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、ここでオリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。
【００３０】
ある態様において、免疫賦活核酸は、約２〜約５０ヌクレオチド長である。ある態様において、免疫賦活核酸は、約１２〜約２６ヌクレオチド長である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは夫々、約３〜約３５のヌクレオシド残基を有し、好ましくは、約４〜約３０のヌクレオシド残基を有し、より好ましくは、約４〜約２０のヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有する。ここで用いたように、「約」との用語は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、前記の各態様の均等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド有している。
【００３１】
ある態様において、免疫賦活核酸は、3'末端ステムループ二次構造を有している。ある態様において、免疫賦活核酸は、相補配列との水素結合によって、3'末端において二次構造を有する。ある態様において、免疫賦活核酸は、配列番号２、３、４、９、１２、１３、１４、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群から選択される。
【００３２】
本発明のためには「オリゴヌクレオチド」とは、複数の連鎖したヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドをいう。前記オリゴヌクレオチドはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成方法により産生される。好ましい態様においては、各ヌクレオシド単位は複素環塩基および、ペントフラノシル、2'−デオキシペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、2'−デオキシ−2'−置換アラビノース、2'-O-置換アラビノースまたは六単糖基を含む。ヌクレオシド残基は多くの知られたヌクレオシド間連鎖によって互いに結合され得る。前記ヌクレオシド間連鎖は限定されることなく、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間連鎖を含む。用語「オリゴヌクレオチド」はまた1または2以上の立体特異的ヌクレオシド間連鎖（例えば、(RP)−または(SP)−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、あるいはホスホトリエステル連鎖）を有するポリヌクレオシドをも含む。ここでいう用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、いずれの前記ヌクレオシド間連鎖を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを明確に意味し、前記連鎖はホスフェート基を含むか含まないかを問わない。ある好ましい態様においては、これらヌクレオシド間連鎖はホスホジエステル、ホスホロチオエート、あるいはホスホロジチオネート連鎖、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００３３】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定なく、タンパク質基、親油性基、インターカレート剤、ジアミン、葉酸、コレステロール、およびアダマンタンを含む付加的置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定なくペプチド核酸(PNA)、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、ロックド核酸(LNA)、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチドおよびアルキルリンカーやアミノリンカーをもつ骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含む、ポリマーを包含する他のいかなる核酸塩基をも含む。
【００３４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはこれらの混合物を含むことができる。ここでいう用語「修飾ヌクレオシド」とは、修飾複素環塩基、修飾糖部分またはそれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ここで述べるような非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。ある態様おいては、修飾ヌクレオシドは2'−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは2'−デオキシ−2'−置換アラビノシドである。
【００３５】
本発明のためには、用語「2'−置換リボヌクレオシド」または「2'−置換アラビノシド」は、ペントース部分の２’位におけるヒドロキシル基が置換されて2'−置換または2'-O-置換リボヌクレオシドとなるリボヌクレオシドを含む。好ましくは、そのような置換は、1〜6の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、あるいは、6〜10の炭素原子を有するアリール基によりなされ、そのようなアルキルまたはアリール基は置換されていなくてもよく、あるいは、例えばハロ（halo）、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基に置換されていてもよい。そのような2'-O-置換リボヌクレオシドまたは2'-O-置換アラビノシドの例は、限定なく2'-O-メチルリボヌクレオシドまたは2'-O-メチルアラビノシドおよび2'-O-メトキシエチルリボヌクレオシドまたは2'-O-メトキシエチルアラビノシドを含む。
【００３６】
用語「2'−置換リボヌクレオシド」または「2'−置換アラビノシド」はまた、2'−ヒドロキシル基が1〜6個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、または、アミノもしくはハロ基により置換されているリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。そのような2'−置換リボヌクレオシドまたは2'−置換アラビノシドの例は、限定なく2'−アミノ、2'−フルオロ、2'−アリル、および2'−プロパルジルリボヌクレオシドまたはアラビノシドを含む。
【００３７】
用語「オリゴヌクレオチド」はハイブリッドまたはキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、1種以上のヌクレオシド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドである。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの好ましい例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、またはホスホロジチオネート部位およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート連鎖などの非イオン連鎖を含む(例えばPederson et al. U.S. Patent No. 5,635,377および5,366,878などを参照)。
【００３８】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１種以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの好ましい例は、リボヌクレオチド、または2'−置換リボヌクレオチド部位、およびデオキシリボヌクレオチド部位を含む(例えばMetelevおよびAgrawal、U. S. Patent No. 5,652,355、6,346,614および6,143,881を参照)。
【００３９】
ここで用いたとおり、用語「二次構造」は、分子内および分子間水素結合を意味する。分子内水素結合によって、ステムループ構造が形成される。分子間水素結合によって、二本鎖核酸分子が形成される。
【００４０】
ここで用いたとおり、用語「約」は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、本発明の目的のため、前記の各態様の均等物として考慮される。
【００４１】
ここで用いたとおり、用語「相補」は、核酸とハイブリダイズする可能性を有することを意味する。このようなハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖間の水素結合の結果であり、水素結合の他の様式ではあるが、好ましくは、Watson-CrickまたはHoogsteen塩基対を形成し、また塩基スタッキング（base stacking）もまたハイブリダイゼーションを導き得る。
【００４２】
第２の面において、本発明は、低減した免疫賦活活性を有する核酸を提供する。この面において、該核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、ここで、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の5'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【００４３】
ある態様において、免疫賦活核酸は、約２〜約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。ある態様において、免疫賦活核酸は、約１２〜約２６ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは夫々約３〜約３５ヌクレオシド残基、好ましくは約４〜約３０ヌクレオシド残基、より好ましくは約４〜約２０ヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８、または約５〜約１４ヌクレオシド残基を有する。ここで用いたように、「約」との用語は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、前記の各態様の均等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド有している。
【００４４】
ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、5'末端ステムループ二次構造を形成する。ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、相補配列との水素結合によって、5'末端において二次構造を有する。ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、配列番号５、６、７、１０、１５、１６および１７からなる群から選択される。
【００４５】
第３の面において、本発明は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活核酸であって、該免疫賦活核酸は二次構造を有する、前記免疫賦活核酸を提供する。この面において、該免疫賦活核酸は式（Ｉ）に記載の構造を含む。
ＤｏｍａｉｎＡ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＤｏｍａｉｎＣ （Ｉ）
【００４６】
各Ｄｏｍａｉｎは、約２〜約１２ヌクレオチド長であってもよい。ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよく、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはＣｐＧでない。
【００４７】
ある態様において、ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される２以上のジヌクレオチドを有する。
【００４８】
ＤｏｍａｉｎＢ（以下、「Ｘ」と示す）は、ＤｏｍａｉｎＡおよびＣを結びつけるリンカーで、3'-5'連鎖、2'-5'連鎖、3'-3'連鎖、ホスフェート基、ヌクレオシドまたは、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコールまたは複素環部分であってもよい非ヌクレオシドリンカーである。
【００４９】
ＤｏｍａｉｎＣは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ Poly I-Poly Cであってもよい。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。ある態様において、ＤｏｍａｉｎＢは、好ましくは、ＤｏｍａｉｎＡおよびＤｏｍａｉｎＣのオリゴヌクレオチドを連鎖する非ヌクレオチドリンカーであり、「イムノマー（immunomers）」という。ある好ましい態様において、ＤｏｍａｉｎＣは、ジヌクレオチドＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊またはＣｐＧ＊を有さない。
【００５０】
ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、約２〜約５０ヌクレオチド長である。ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、約１２〜約２６ヌクレオチド長である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは夫々、約３〜約３５ヌクレオシド残基、好ましくは約４〜約３０ヌクレオシド残基、より好ましくは約４〜約２０ヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有する。ここで用いたように、「約」との用語は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、前記の各態様の均等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド有している。
【００５１】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＩ）に記載の構造を有する。
【数４】
当業者が認めるであろうとおり、分子内ステムループの形状で分子の3'末端に二次構造要素がある。
【００５２】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＩＩ）に記載の構造を有する。
【数５】
式（ＩＩＩ）に示した構造は、２つの3'末端の配列が相補的で、分子間水素結合を可能にし、２つの分子の3'末端がブロックされているので、本明細書で「ターミナルダイマー（terminal dimmer）」という。さらに、ＤｏｍａｉｎＡおよびＡ’は同一であってもなくてもよく、ＤｏｍａｉｎＢおよびＢ’は同一であってもなくてもよく、ＤｏｍａｉｎＣおよびＣ’は同一であってもなくてもよい。
【００５３】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＶ）に記載の構造を有する。
【数６】
当業者が認めるであろうとおり、3'末端の相補配列がこの領域と水素結合しているので、示した分子の3'末端は二次構造を有する。ある態様において、リガンドなどの分子は、細胞の取り込みを促進するためまたは分子の安定性を改善するために3'末端に着けられていてもよい。
【００５４】
本発明のいくつかの核酸分子の限定的でない例を表１に示す。
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
＊:大文字-PS;小文字-PO;太字-2'-O-メチル-リボヌクレオチド（２６および２７中）;G-2'-デオキシ-7-デアザ-G（２８中）;G-araG（２９中）;X-C3-リンカー（３７および３８中）。
【００５８】
代替的に、本発明の核酸分子は、非ヌクレオチドリンカーによって結合した２つのイムノマーであり得る。これら分子の限定されない例を表２に示す。
【表５】
【００５９】
【表６】
＊大文字-PS;小文字-PO、X-C3-リンカー;Y-テトラエチレングリコールリンカー;Z-ヘキサエチレングリコールリンカー、太字-2'-O-メチルリボヌクレオチド（４４および５７中）;G-2'-デオキシ-7-デアザ-G（４５中）。
【００６０】
ある態様において、本発明の免疫賦活核酸は、配列番号１〜３８からなる群から選択される配列を有する。ある態様において、本発明の免疫賦活核酸は、配列番号３９〜６８からなる群から選択される配列を有する。
【００６１】
ある態様において、イムノマーの少なくとも１つの免疫賦活オリゴヌクレオチドは、式：5'-Pyr-Pur-3'で表される免疫賦活ジヌクレオチドを含み、式中、Pyrは天然ピリミジンヌクレオシドまたはその類縁体であり、Purは天然プリンヌクレオシドまたはその類縁体である。本明細書において、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がピリミジン塩基であるヌクレオシドをいう。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がプリン塩基であるヌクレオシドをいう。本発明のためには、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンまたはプリン塩基、天然に存在しない糖部分、またはこれらの組み合わせを含む。
【００６２】
本発明による方法において用いられる免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける好ましいピリミジンヌクレオシドは、構造（Ｉ）：
【化１】
式中、
Ｄは、水素結合供与体（hydrogen bond donor）であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体（hydrogen bond acceptor）、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ａ’は、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ｘは、炭素または窒素であり；そして
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００６３】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類縁体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばシトシンのＮ３を含む。
【００６４】
ある態様において、（Ｉ）の塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。天然に存在しない好ましいピリミジン塩基の例は、限定なく、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくはＮ４−エチルシトシンおよび４−チオウラシルを含む。ある態様において（Ｉ）の糖部分Ｓ’は、天然に存在しない糖部分である。本発明のためには、「天然に存在する糖部分」は、例えばリボースおよび２’−デオキシリボースなどの、核酸の一部として天然に存在する糖部分であり、「天然に存在しない糖部分」は、核酸の一部として天然に存在しない任意の糖であるが、ヘキソースなどのオリゴヌクレオチドの骨格において用いることのできるものである。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、好ましい糖部分の例である。
【００６５】
本発明による方法において用いられる免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける、好ましいプリンヌクレオシド類縁体は、構造（ＩＩ）：
【化２】
式中、
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ｘは、炭素または窒素であり；
各Ｌは、独立してＣ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択され；そして、
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００６６】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類縁体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのＮ１を含む。
【００６７】
ある態様において、（ＶＩ）の塩基部分は、天然に存在しないプリン塩基である。天然に存在しない好ましいプリン塩基の例は、限定なく、６−チオグアニンおよび７−デアザグアニンを含む。ある態様において、（ＩＩ）の糖部分Ｓ’は、構造（Ｉ）について上記したように、天然に存在する糖部分である。
【００６８】
第４の面において、本発明は、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を低減または消失する方法を提供する。該方法は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの5'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造は、ステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の5'末端へ相補配列を水素結合することによって得られる。
【００６９】
第５の面において、本発明は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの安定性を増大するための方法を提供する。該方法は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造はステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の3'末端に相補配列を水素結合することによって得られる。
【００７０】
第６の面において、本発明は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性の調節方法を提供する。該方法は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端に二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造は、ステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の3'末端または5'末端に相補配列を水素結合することによって得られる。
【００７１】
ここで用いたとおり、用語「調節」または「調節する」は、元の（parent）免疫賦活核酸の免疫賦活活性に比べて、免疫賦活核酸の免疫賦活活性を増大するかまたは低減することを意味する。
【００７２】
第７の面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第１、第２および第３の面に開示した組成物のいずれか１つを単独で、または組合わせて、そして薬学的に許容し得る担体を含む。
【００７３】
ここで用いたとおり、用語「薬学的に許容される」は、本発明の第１、第２または第３の面の組成物の効能を妨げず、細胞、細胞培養物、組織または生物などの生体システムと親和性のある物質をいう。好ましくは、前記生体システムは、脊椎動物などの生きた生物である。
【００７４】
ここで用いたとおり、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、または医薬処方における用途の分野においてよく知られた他の物質を含む。担体、賦形剤または希釈剤の特徴は、特定用途への投与ルートに依存するものと理解される。これらの物質を含む薬学的に許容される処方の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990, ISBN: 0-912734- 04-3に記載されている。
【００７５】
本発明の医薬組成物はまた、EFG、抗イディオタイプ癌ワクチン、Gp75抗原、GMKメラノーマワクチン、MGVガングリオシド結合ワクチン、Her2/new、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL theratope、BLP25 (MUC-1)、リポソームイディオタイプワクチン、Melacine、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、MVAに基づくワクチン、PACIS、BCGワクチン、TA-HPV、TA-CIN、DISC-ウイルスおよびImmunCyst/TheraCysからなる群から選択される癌ワクチンを含む癌ワクチンを含み得る。
【００７６】
本発明の種々の態様において、本発明の第１、第２、第３、第４、第５または第６の面の組成物は、抗原または抗原に作動可能に結合する他のものと共有結合していてもよい。ここで用いたとおり、用語「作動可能に結合する」は、本発明の第１、第２または第３の面の組成物と抗原との両方の活性を維持する任意の結合をいう。かかる作動的結合の限定的でない例には、同じリポソームの部分または他のこのようなデリバリービヒクルまたは試薬になることを含む。本発明の第１、第２または第３の面の組成物が抗原に共有結合している態様において、かかる共有結合は、好ましくは、免疫賦活オリゴヌクレオチドのアクセス可能な5'末端以外で、本発明の第１、第２または第３の面の組成物の任意の位置である。例えば、抗原は、細胞間連鎖に付着し得るか、または非ヌクレオチドリンカーに付着し得る。代替的に、抗原は、それ自体、非ヌクレオチドリンカーであり得る。
【００７７】
本発明の種々の態様において、本発明の第１、第２、第３、第４、第５または第６の面の組成物は、アンチセンス活性を備えたオリゴヌクレオチドを含み得る。ここで用いたとおり、「アンチセンス活性」は、細胞または動物の中へ導入された場合に、オリゴヌクレオチドによって、それに対し相補的である遺伝子の発現における低減をもたらす。
【００７８】
本発明の種々の態様において、本発明の第１、第２、第３、第４、第５または第６の面の組成物は、アプタマーであるオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。アプタマーは、他の分子と結合する能力に基づいてランダムプール（random pools）から選択される核酸分子である。アプタマーは、核酸、タンパク質、小さな有機化合物および完全な生物にさえも結合するものが選択される。これらの新規な分子は、医薬およびテクノロジーにおいて多くの潜在的な用途を有する（例えば、Burgstaller P., et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 5: 690- 700 (2002)参照）。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、限定されないが、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、を含む任意の好適なルートで、遺伝子銃や皮膚パッチにより、または、目薬またはうがい薬の形で投与され得る。該医薬組成物は、既知の手順で、例えば、癌の処置、感染症の処置および自己免疫疾患の処置などの所望の効果を得る有効期間および用量で供給することができる。全身に投与する場合、医薬組成物は、好ましくは、本発明の第１、第２および／または第３の面の組成物の血中レベルが約０．０００１μＭ〜約１０μＭに達するのに十分な用量で投与される。局所投与には、これよりもはるかに低い濃度が効果的である可能性があり、また、はるかに高い濃度も容認され得る。好ましくは、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーのの総用量は、１日あたり患者一人あたり約０．０００１ｍｇ〜１日あたり体重１ｋｇあたり約２００ｍｇの範囲である。同時にまたは連続して治療に有効な量の１または２以上の本発明の治療用組成物を単一の処置症状の個々に投与することが好ましい。
【００８０】
さらに、免疫賦活オリゴヌクレオチドをイムノマーとして創出する場合、次のプロトコールが合成のために用いられる。本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、図９および１１に概略的に示したように、自動シンセサイザーおよびホスホルアミデートアプローチを用いて、簡便に合成し得る。いくつかの態様において、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、リニア合成アプローチによって合成される（図９）。この合成のための典型的なリンカーを図１０に示す。ここで用いるように、「リニア合成」との用語は、イムノマーの一端から始まり、他端へ直線的に進行する合成を意味する。リニア合成は、（長さ、塩基組成および／または取り込まれた化学修飾において）同一または同一でないモノマーユニットを免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーへ取り込むことを可能にする。
【００８１】
イムノマーに対する代替的な合成法は、「パラレル合成」であり、これは中心のリンカー部分から外側に合成が進む（図１１参照）。この合成方法のための典型的なリンカーを図１２に示す。リンカーに付着する固体支持体は、米国特許第5,912,332号に記載のとおり、パラレル合成のために用いることができる。代替的に、制御された多孔性ガラス支持体に付着するホスフェートなどの一般的な固体支持体が用いられ得る。
【００８２】
イムノマーのパラレル合成はリニア合成に対し、いくつかの利点を有する：（１）パラレル合成は同一のモノマーユニットを取り込むことができる；（２）リニア合成と異なり、両方（または全ての）モノマーユニットが同時に合成され、これにより合成ステップ数および合成に要する時間がモノマーユニットのそれらと同じである；および（３）合成ステップの低減によって、最終イムノマー製品の純度および収量を改善する。
【００８３】
リニア合成またはパラレル合成プロトコールによる合成の最後に、本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは簡便に、濃アンモニア溶液で、または、修飾されたヌクレオシドが取り込まれている場合は、ホスホルアミデートの供給者により勧められているもので脱保護し得る。得られた免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、好ましくは、逆相ＨＰＬＣで精製し、脱トリチル化し、脱塩し、そして透析した。
【００８４】
ＣｐＧ ＤＮＡ１８〜２１の賦活化ドメインは、ヒト特異的「ＧＴＣＧＴＴ」モチーフを5'末端に含む。構造ドメイン領域において、７、１１、１５または１９塩基対（ｂｐ）のヘアピンステムループ構造を形成する相補配列は、賦活化ドメインの3'末端の近傍に取り込まれている（表３）。自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡは、賦活化ドメインがいかなる構造モチーフをも含まず（塩基対化）、ＣｐＧ賦活化モチーフが構造ドメインに存在しないようにデザインされる。ＣｐＧ ＤＮＡにおける賦活化モチーフおよび二次構造の両方が、ｐＤＣ活性化に要求される。ＣｐＧ ＤＮＡは、培養中、ヒトＢ細胞の強い濃度依存的増殖を誘導する。しかしながら、Ｂ細胞の増殖は、ヘアピン二重鎖の長さには依存しない。自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡがｐＤＣおよびＢ細胞の両方を活性化できることによって、癌、喘息、アレルギーおよび感染症に対して用いる治療剤およびＢ細胞またはｐＤＣを賦活化するものより強力なアジュバントの開発を可能にすることができる。
【００８５】
配列２２は、賦活化ドメインを有するが、その3'末端にヘアピン構造（構造ドメイン）を形成するために要求される相補性を含まない。これに対し、ＣｐＧ ＤＮＡ３０はヘアピン構造（構造ドメイン）を形成するが、賦活化モチーフは有していない（表３）。配列６９、配列１９の類縁体は、ヘアピン配列の１つの鎖に2'-O-メチル−リボヌクレオチドを含む。
【００８６】
ＣｐＧ ＤＮＡによる安定したヘアピン構造の形成は、熱融解およびＥＭＳＡの調査によって確認した（表３）。予測どおり、ＣｐＧ ＤＮＡ１８〜２１は、異なる長さのオリゴヌクレオチドマーカーと比較した非変性ポリアクリルアミドゲルにおける要求される移動性でバンドを示し、構造がヘアピン構造形成であることを確認した（データ示さず）。
【００８７】
ヒトｐＤＣはＴＬＲ９を発現し、ＣｐＧ ＤＮＡ誘導ＩＦＮ−αの主なソースであると信じられている。ＣｐＧ ＤＮＡ１８〜２１は、図１３に示すように、ヒトｐＤＣ培養において、ＩＦＮ−αの産生を誘導する。ＩＦＮ−αの分泌のレベルは、ヘアピン二重鎖構造の長さに依存する。１９ｂｐの二重鎖を形成するＣｐＧ ＤＮＡ２１は、ＩＦＮ−αを最も高いレベルで誘導した（図１３）。応答はドナーからドナーへ変化するが、傾向はＣｐＧ ＤＮＡの間で一貫していた（図１３）。ポリ（ｄＧ）配列を含む回文のＣｐＧオリゴで、ヒトｐＤＣを賦活化することが知られているＣｐＧ ＤＮＡ７０を、ポジティブコントロールとして用いた。
【００８８】
全４つのＣｐＧ ＤＮＡは、培養におけるヒトＢ細胞の強い濃度依存的増殖を誘導する（図１４）。しかしながら、Ｂ細胞の増殖は、ヘアピン二重鎖の長さに依存しなかった（図１３）。
【００８９】
ＣｐＧ ＤＮＡ１８、１９、２２および３０によるＩＦＮ−αを誘導するヒトｐＤＣの活性を調査した。前の実験においてみられたように、１８および１９の両方ともＩＦＮ−αの産生を誘導した（図１５）。賦活化モチーフを備えるが二次構造をもたない配列２２および賦活化モチーフをもたず二次構造を備えた配列３０は、ｐＤＣ培養においてＩＦＮ−α産生を誘導しなかった（図１５）。これらの結果は、ＣｐＧ ＤＮＡにおいて賦活化モチーフと二次構造との両方がｐＤＣ活性化に必要であることを示唆している。
【００９０】
図４Ｂに示したＢ細胞増殖のデータは、二次構造を形成するＣｐＧ ＤＮＡ１８および１９並びに形成しないＣｐＧ ＤＮＡ２２が強いＢ細胞増殖を誘導したことを示している。賦活化モチーフをもたない配列３０は、最小限の増殖を誘導し、ＣｐＧモチーフは活性化に要求されるが、二次構造は要求されないことが示唆された。
【００９１】
ＴＬＲ９は、ＣｐＧ ＤＮＡを特異的に認識するが、ＲＮＡは特異的に認識しない。しかしながら、フランキング配列のＣｐＧジヌクレオチドに遠位の2'-O-アルキルリボヌクレオチドの部位特異的な取り込みは許容される。本発明者らは、ループ領域を含み3'末端に近接するステム配列が、2'-O-メチルリボヌクレオチドで置換されたＣｐＧ ＤＮＡ１９の類縁体を合成した。ＣｐＧ ＤＮＡ６９および１９の両方は、ヒトｐＤＣ培養において（図１６）およびヒトＢ細胞増殖において（図１６）、同様のレベルのＩＦＮ−α分泌を誘導した。これらの結果は、2'-O-メチルリボヌクレオチド置換またはこれらの置換によって生じたコンホメーション変化は、ｐＤＣまたはＢ細胞の活性化を阻害しないことを示した。
【００９２】
トール様レセプター９（ＴＬＲ９）は、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡを認識し、ストレス−キナーゼおよびＮＦ−κＢ経路を含むいくつかのシグナル経路を活性化し、インビトロおよびインビボでのＩＦＮ−α／β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを含む多くのケモカインおよびサイトカインの分泌を導く。しかしながら、ＣｐＧ ＤＮＡおよびそのレセプターＴＬＲ９の間の直接的な相互作用は、未だ立証されていない。ＣｐＧ ＤＮＡ免疫賦活化において、代替レセプターまたはコレセプターの果たし得る役割が提案されてきた。異なる骨格、配列および構造を有するＣｐＧ ＤＮＡが細胞特異的であるがＴＬＲ９依存した形で免疫系を活性化する。
【００９３】
ＣｐＧ ＤＮＡの3'末端での二次構造の最適配置によって、異なるサイトカインプロフィールを誘導することができる。ヒト特異的モチーフを備えたＣｐＧ ＤＮＡ構造は、ヒトｐＤＣ培養において高いレベルのＩＦＮ−αを誘導し、二次構造がｐＤＣ活性化に必要であり得ることが示された。
【００９４】
本ＣｐＧ ＤＮＡは、5'末端にＣｐＧモチーフを備えた賦活化ドメインおよび3'末端にヘアピン二重鎖の構成を可能にする配列を含む構造ドメインの２つの明確なドメインを含むようにデザインされる。これらＣｐＧ ＤＮＡの分子内二次構造を形成することができることによって、ユビキタスな3'−ヌクレアーゼに対して、さらなる安定性が提供され、自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡと名付けられる。自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡは、構造ドメイン領域においてＣｐＧモチーフを有さないことにより、早くに報告されている分子間二重構造を形成する回文ＣｐＧ ＤＮＡと異なる。
【００９５】
ＣｐＧジヌクレオチドを含む回文配列は、ＩＦＮ−α／βおよびγを産生するように免疫細胞を活性化する。ここに述べる自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡにより、本発明者らは、ヒトＢ細胞およびｐＤＣの両方により認識されたＣｐＧ ＤＮＡの賦活化および構造の特徴を分析することができた。ＣｐＧ ＤＮＡ１８〜２１は、ヘアピン二重鎖の長さに依存する形でｐＤＣを活性化する。構造ドメインのないコントロールＤＮＡ分子２２および賦活化ドメインのないＤＮＡ分子３０の両方とも、ＩＦＮ−αの分泌を誘導せず、賦活化ドメインおよび構造ドメインの両方がｐＤＣ活性化に要求されることを示した。これに対し、Ｂ細胞の活性化には、賦活化ドメインだけが要求され、構造ドメインは要求されない。ＣｐＧ ＤＮＡ２０および２１のより低い活性化は、ＣｐＧ ＤＮＡの二次構造が、Ｂ細胞活性化を阻害し得ることを示している。実際、構造ドメインをもたず、ＣｐＧ ＤＮＡ１８と同じヌクレオチド長のＣｐＧ ＤＮＡ３０は、ＣｐＧ ＤＮＡ１９と同じレベルでＢ細胞を活性化し、一本鎖ＤＮＡがＢ細胞の活性化には好ましいことを示した。ＣｐＧ ＤＮＡ３０と観察したＢ細胞のより低い活性化は、非特異的活性に関係する可能性がある。
【００９６】
ＣｐＧ ＤＮＡ６９での本結果は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドへテロ二重鎖がｐＤＣまたはＢ細胞活性を妨げないことを示している。これらの結果は、構造ドメイン領域での2'-O-メチルリボヌクレオチド置換によるＢからＡへのコンホメーション変化が、免疫賦活化にほとんどまたは全く影響しないことを示しており、したがって、これらの位置での置換が許容される。
【００９７】
結論として、これらの調査において、本発明者らは、ヒト免疫細胞、ｐＤＣおよびＢ細胞のＴＬＲ９−ポジティブ部分の最適活性のために、ＣｐＧ ＤＮＡの賦活化ドメインおよび構造ドメインの合理的な組み合わせを提供する。ここに示す調査により、ｐＤＣおよびＢ細胞の活性化に要求されるＣｐＧ ＤＮＡの特異的な特徴を決定することができる。ＣｐＧ賦活化モチーフは、ヒトＢ細胞の活性化に要求され、また賦活化モチーフおよびさらなる構造ドメインの両方がヒトｐＤＣの活性化に要求される。同じＴＬＲ９レセプターが、２つの異なる細胞増殖における賦活化のためのリガンドの異なる構造特性を要求する理由は明確でない。ｐＤＣおよびＢ細胞でのＴＬＲ９シグナリングにおいて異なるアダプター分子の関与を示すことができたことは事実である。
【００９８】
自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡがｐＤＣおよびＢ細胞の両方を活性化することができることによって、癌、喘息、アレルギーおよび感染症に用いる治療剤およびＢ細胞またはｐＤＣを賦活化するものより強力なアジュバントの開発が可能である。
【００９９】
【表７】
ａ：主要な賦活化ドメインおよび構造ドメインを示す新規なＣｐＧ ＤＮＡデザイン（ボックス）の概略図。賦活化ドメインは適切なＣｐＧモチーフを含むが、構造ドメインは含まない；
ｂ：全ての配列は７０を除いてホスホロチオエート修飾した。６９においてイタリックで示したヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチドを示し、７０において下線のヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を示す；
c：ＮＤ−測定せず
【０１００】
以下の例は、本発明のある好ましい態様をさらに示そうとするものであり、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【０１０１】
例
例１：オリゴヌクレオチド合成、精製および末端融解プロフィール
ＣｐＧオリゴは、シアノエチルホスホルアミデートをPerSeptive Biosystem's 8909 Expedite ＤＮＡ synthesizer (PerSeptive Biosystem, Boston, MA)を用いて、１〜２μｍｏｌのスケールで合成した。ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴのホスホルアミデートは、PE Biosystems (Foster City, CA)から得た。Iyer R. P., et al. (J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990))に記載のように、イオジン酸化剤をホスホロチオエート骨格の修飾を得るために用いた。全てのオリゴを、標準のプロトコールを用いて脱保護し、ＨＰＬＣによって精製し、そして洗浄のためＵＳＰ品質の滅菌水に対して透析した。オリゴを凍結乾燥し、蒸留水に再び溶解し、そして濃度を２６０ｎｍでのＵＶ吸光度から測定した。すべてのオリゴは、純度および分子量の夫々をＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計(Applied Biosystem's Voyager-DETM STR BiospectrometryTM Workstation)によって特徴付けた。全長のオリゴの純度は９０〜９６％の範囲であり、残りは、ＣＧＥおよび／または変性ＰＡＧＥによって測定すると、１または２ヌクレオチド短い（ｎ−１およびｎ−２）。全てのオリゴは、Limulus assay (Bio-Whittaker now known as Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MD)によって測定し、＜０．１ＥＵ／ｍＬよりも少ないエンドトキシンを含んでいた。
【０１０２】
熱融解（thermal melting）の調査は、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むｐＨ７．２±０．２の１０ｍＭ リン酸水素二ナトリウムの１ｍＬにおいて行った。該溶液を９５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと室温になるように放置して、４℃で一晩貯蔵した。オリゴヌクレオチド鎖の終濃度は、２．０μＭであった。ＵＶ熱融解測定は、ペルチェ熱コントローラーとパーソナルコンピュータの付属したPerkin-Elmer Lambda 20 Spectrophotometerによって２６０ｎｍで、１ｃｍ経路長石英キュベットを用いて、加熱速度０．５℃／分にて行った。融点（Ｔｍ）を半解離の温度として取り、一次導関数のプロットを得た。各Ｔｍ値は、２または３つの独立した実験の平均であり、値は±１．０℃以内である。
【０１０３】
'GACGTT'のヘキサマーモチーフを含む１７マーのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（１）をポジティブコントロールとして用いた（表１）。オリゴヌクレオチド２〜７は、オリゴヌクレオチド１の部分に相補的な５、１１または１７のヌクレオチドの付加配列を含む（表１）。伸張は3'末端（２〜４）または5'末端（５〜７）に結合し、Hirao,I.,et al.(Nucleic Acids Res. 22: 576-582 (1994))に記載のとおり、安定なステムループを形成可能なGAAトリマーを含む。オリゴヌクレオチド２〜７のヘアピンの形成は、ＵＶ熱融解実験で測定した。１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸ナトリウム中、４０〜６６℃のＴｍ値は、オリゴヌクレオチド２〜７が実験条件下で安定な二次構造を形成したことを示している（表１）。かかる条件は、形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cells）におけるインターフェロンα（ＩＦＮ−α）を１０μｇ／ｍｌでオリゴ１８、１９、２０および２１に曝した後の条件である。
【０１０４】
例２：細胞培養条件および試薬
４〜８週齢のBALB/c、C57BL/6またはC3H/HeJマウス由来の脾臓細胞を、Zhao,Q.,et al.(Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996))およびBranda,R.F.,etal.(Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993))に記載のとおり、RPMI完全培地にて培養した。マウスJ774マクロファージ(American Type Culture Collection, Manassas, VA)を１０％（v/v）ウシ胎仔血清および抗生物質（ペニシリンＧ／ストレプトマイシン １００ＩＵ／ｍＬ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。他のすべての試薬は、Mediatech (Gaithersburg, MD)から入手した。
【０１０５】
例３：脾臓細胞増殖アッセイ
典型的には、マウス（Balb-C）脾臓細胞を、０．１、１．０および１０．０μｇ／ｍｌの濃度のＣｐＧオリゴと共に４８時間培養し、細胞増殖をZhao,Q.,et al.(Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996))に記載のとおり、３Ｈ−ウリジン取り込みにより測定される。
【０１０６】
はじめに、オリゴ１、２および５を、それらの培養中におけるBALB/cマウス脾臓細胞の増殖を誘導する能力について試験した。オリゴ１および２は、用量依存的な脾臓細胞増殖を誘導した。ステムループをもたない、もとの（parent）オリゴ１は、１．０μｇ／ｍＬの濃度で、増殖指数６．０±０．３を示した（図１Ａ）。3'末端でステムループ構造を形成するオリゴ２は、同じ濃度で、増殖指数９．０±２．５を示した。しかしながら、5'末端にステムループを形成するオリゴ５は、同じ濃度で、より低い増殖指数１．５±０．３を示し、これはＰＢＳコントロールのそれと同様であった（図１Ａ）。
【０１０７】
例４：サイトカイン誘導アッセイ
マウス脾臓細胞またはJ774細胞を、それぞれ５×１０６または１×１０６細胞／ｍＬを用いて、２４ウェルディッシュに播いた。ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解したＣｐＧオリゴを、細胞培養に対し、終濃度０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬで添加した。次いで細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡアッセイ用に集めた。実験は、各ＣｐＧオリゴに対し２または３回行い、各濃度で３回行った。ＩＬ−２およびＩＬ−６の分泌は、Bhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003))に記載のとおり、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標品を含む必要な試薬は、BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA)から入手した。
【０１０８】
ＣｐＧオリゴは、ＩＬ−１２およびＩＬ−６を含む多数のサイトカインを誘導する。BALB/cマウス脾臓細胞培養において、試験化合物１および２は、濃度依存メカニズムによって、ＩＬ−１２およびＩＬ−６を誘導した。もとのオリゴ１は、３．０μｇ／ｍＬの濃度で、１５１４±１１３ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２および７６８１±８３９ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を誘導した（図２）。3'ヘアピンを含むオリゴ２は、わずかに多くのＩＬ−１２（１７７１±２８６ｐｇ／ｍＬ）および少ないＩＬ−６（２５８２±３００ｐｇ／ｍＬ）を誘導した。しかしながら、5'ヘアピンを有するオリゴ５は、サイトカイン分泌を誘導しなかった。これらの結果は、3'末端ではなく5'末端の安定的なヘアピンループによって、免疫賦活活性がブロックされることが示された。
【０１０９】
ＣｐＧ ＤＮＡ３および４は、GACGTTモチーフに広がるかまたは5'末端まで伸張する3'ヘアピンステムを有する。この結果、それらは２つのＣｐＧモチーフ、トップ鎖にGACGTT、その相補配列AACGTCを下に含む（表１）。オリゴ６および７は同様の長い5'ヘアピンを有する。２つのＣｐＧモチーフを有するにもかかわらず、オリゴ３および４は、オリゴ１に比べ、より少ないＩＬ−１２を誘導し、ＩＬ−６を最小限誘導するかまたは全く誘導しない（図２）。5'ヘアピンを備えたオリゴ６および７の両方が、同じ実験条件下でサイトカイン分泌を誘導しなかった。オリゴ４による最小限のサイトカインの誘導によって、5'末端へのステム構造の伸張が有害で、おそらく認識と続く免疫賦活化を阻害することが示される。これらの結果は、5'末端に伸張する二重鎖のステム構造が免疫賦活化を阻害することを示している。
【０１１０】
オリゴ４の5'末端での塩基対化は免疫賦活化を抑制するので、両末端での二重鎖形成をＣｐＧ ＤＮＡ８〜１０を用いて調査した。オリゴ８は１８ヌクレオチドを含み、オリゴ１と同じGACGTTモチーフを含む。オリゴ９および１０の自己相補的3'伸張または5'伸張は、付着末端のように、８塩基対のダイマーを形成するように作用する（表１）。
これらの二重鎖はホスホジエステル連鎖を含み、免疫賦活化への任意の長さ依存的ホスホロチオエート効果を低減する。オリゴ９は、3'末端でダイマー化し、もとのオリゴ８と同様のＩＬ−１２およびＩＬ−６の誘導を示した（図３）。しかしながら、5'二重鎖を形成するオリゴ１０は最小限のＩＬ−１２およびＩＬ−６を誘導した（図３）。したがって、5'二重鎖を形成するという特徴は、免疫賦活の消失と強い相関がある。これらの結果は、3'末端ではなく5'末端での二重鎖が、免疫賦活化を阻害することを示している。
【０１１１】
J774細胞培養においてサイトカイン分泌を誘導するオリゴ１〜７の能力もまた調査した。オリゴ濃度１０μｇ／ｍＬで得たＩＬ−１２およびＩＬ−６のデータ（図５）は、脾細胞培養アッセイで得た結果を補足する。これらの結果によってさらに、レセプターがＣｐＧ ＤＮＡ配列を、その5'末端から読み、アクセス可能な5'末端がＣｐＧ ＤＮＡ活性には要求されることが確認された。ＣｐＧオリゴの5'末端に伸張する二次構造の存在は、レセプターの読み込みとそれによる免疫賦活活性を阻害し得る。
【０１１２】
本発明のオリゴヌクレオチドの、形質樹状細胞におけるインターフェロンα（ＩＮＦ−α）の産生する能力についても調べた。これらの細胞の単離および培養のため、Krug, A., et al. (Eur. J. Immunol, 31: 2154- 2163 (2001)を参照せよ。結果を図６、７および８に示す。これらのデータは、3'ヘアピン構造を備えた本発明の核酸分子が、インターフェロンαの産生を賦活化し、5'末端ヘアピン構造が免疫賦活活性、すなわちこれら分子のインターフェロンαの産生を阻害することを示す。
【０１１３】
例５：マウス脾腫アッセイ
雌BALB/cマウス（４〜６週齢、１９〜２１ｇｍ）を３匹のマウスのグループに分けた。ＣｐＧオリゴを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、マウスに５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下（ＳＣ）投与した。Zhao,Q.,et al.(BiochemPharmacol. 51: 173-182 (1996))およびBranda, R.F.,et al.(Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993))に記載のとおり、マウスを４８時間後に安楽死させ、脾臓を回収し、重さを量った。
【０１１４】
オリゴヌクレオチド１、２および５をBALB/cマウスに５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、それらがインビボで脾腫肥大を誘導するかについて測定した。ＰＢＳを注射したコントロール群に比較し、オリゴ処置に応答した脾臓の重量の増大は、ＣｐＧオリゴの免疫賦活活性の結果であると考えられる（Zhao, Q., et al. Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996); Branda, R. F., et al. Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993)）。インビボでの調査の結果を図１Ｂに示す。ステムループ構造をもたないオリゴ１および5'末端にステムループ形成配列を有するオリゴ５は、ＰＢＳを受けたコントロール群と比べ、それぞれ約２９％および約１５％の脾臓の重量が増加した。これに対し、3'末端にステムループ構造を有するオリゴ２は、コントロール群に比べ、脾臓の重量の約４８％の増大を引き起こした。
【０１１５】
例６：ＮＦ−κＢ経路の活性化
トール様レセプター９（ＴＬＲ９）は、細菌のプラスミドおよび合成ＤＮＡで非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド(Hemmi H. , et al. Nature 408 : 740-745 (2000))、および活性ストレスキナーゼ(Yi A. K., et al. J. Immunol. 161: 4493- 4497 (1998))、およびＮＦ−κＢ経路(Stacey K. J., et al. J. Immunol. 157: 2116-2122 (1996))を認識することが示されてきた。ＣｐＧ ＤＮＡで処理したJ774細胞におけるＮＦ−κＢ活性は、Yu D., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90 (2002))およびBhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003))に記載のとおり、EMSAで行われ、分析された。
【０１１６】
J774におけるＮＦ−κＢ経路のオリゴ１〜７による活性化は、EMSAを用いて、マウスマクロファージ細胞核抽出物において調査した。図４は、得られた結果を示す。もとのオリゴ１および８の両方が、複合体の存在により示されたとおり、ＮＦ−κＢを活性化した。3'末端にループを有するオリゴ２〜４もまた適当な複合体の存在により示されるように、ＮＦ−κＢを活性化した。これに対し、5'末端ループオリゴ５〜７は、J774細胞において転写因子ＮＦ−κＢを活性化しなかった（図４）。コントロールの非ＣｐＧオリゴは、同じ実験条件下でＮＦ−κＢを活性化しなかった（レーンＣ）。これらの結果は、マウス脾臓細胞培養アッセイにおいて得られたデータと一致する。
【０１１７】
例７：電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）
約０．２ＯＤのＣｐＧ ＤＮＡおよび他のマーカーを２５μＬの１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２バッファーに溶解し、９０℃で１５分間加熱し、室温まで放置し、ゲルで分析するまで４℃で貯蔵した。調製したＤＮＡサンプルをグリセロールバッファーと混合し、１５％非変性ポリアクリルアミドゲルに溶解した。ゲルを２６０ｎｍＵＶ光で可視化した。
【０１１８】
例８：ヒトＢ細胞および形質樹状細胞（ｐＤＣ）の単離
新鮮に採取された健常なボランティアの血液のＰＢＭＣ(CBR Laboratories, Boston, MA)をフィコール密度勾配遠心分離法(Histopaque-1077, Sigma)で単離し、ＰＢＭＣからＢ細胞を、製造者の説明書にしたがいＣＤ１９細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて、ポジティブ選択によって単離した。
【０１１９】
例９：Ｂ細胞増殖アッセイ
１×１０５Ｂ細胞／２００μｌの全量を０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬのＣｐＧ ＤＮＡ濃度で６４時間賦活化し、次いで０．７５μＣｉの[3H]−チミジンを添加し、８時間後に回収した。放射線の取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。表４は、終濃度１０．０μｇ／ｍＬでの６ＣｐＧ ＤＮＡに対するＢ細胞増殖の平均±ＳＤを示す。
【０１２０】
表４ イムノマー構造およびヒトＢ細胞増殖アッセイにおける免疫賦活活性（７２時間）
【表８】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す。
【０１２１】
例１０：ヒトｐＤＣ培養およびＩＦＮ−αのＥＬＩＳＡ
ｐＤＣは、BDCA-4細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用い、製造者の説明書にしたがい、ヒトＰＢＭＣから単離した。ｐＤＣを１×１０６細胞／ｍＬを用いて２００μＬ／ウェルで、９６ウェルプレートに播いた。オリゴヌクレオチドは、終濃度０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬで細胞培養に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで上清を回収し、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１０をＥＬＩＳＡキット(PBL)を用いてアッセイした。表５Ａおよび５Ｂは、１０．０μｇ／ｍＬの濃度での６オリゴヌクレオチドに対する平均±ＳＤを示す。
【０１２２】
表５Ａ イムノマー構造およびヒト樹状細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表９】
【０１２３】
【表１０】
【０１２４】
【表１１】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【０１２５】
表５Ｂ イムノマー構造およびヒト樹状細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１２】
【０１２６】
【表１３】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-リボヌクレオシドを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【０１２７】
例１１：サイトカインアッセイ
脊椎動物細胞、好ましくはBALB/cマウス脾臓細胞またはヒトＰＢＭＣにおけるＩＮＦ−２およびＩＬ−６の分泌は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体およびサイトカイン標品を含む必要な試薬は、PharMingen, San Diego, CAから入手した。ＥＬＩＳＡプレート(Costar)を、ＰＢＳＮバッファー（ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中、５μｇ／ｍＬの適当な抗体と４℃で一晩インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックした。細胞培養上清およびサイトカイン標品をＰＢＳ／１０％ＦＢＳで適当に希釈し、３つプレートに添加し、そして２５℃で２時間インキュベートした。１μｇ／ｍＬで適当なビオチン化抗体を重ね、２５℃で１．５時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔバッファー（ＰＢＳ／０．０５％ Tween 20）で広範に洗浄し、ペルオキシダーゼ(Sigma, St. Louis, MO)を結合したストレプトアビジンを添加後、さらに２５℃で１．５時間インキュベートした。プレートを発色試薬を含むSure Blue（登録商標）(Kirkegaard and Perry)で現像し、反応を停止液(Kirkegaard and Perry)を添加することにより止まった。色の変化をCeres 900 HDI Spectrophotometer (Bio-Tek Instruments)で測定した。
【０１２８】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常なボランティアの末梢血から、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離(Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)によって単離した。簡単には、ヘパリン処理した血液をHistopaque-1077（等容量）にコニカル遠心管において積層し、４００×ｇで３０分間、室温で遠心分離した。単核細胞を含む軟膜を慎重に除去し、等張のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２５０×ｇで１０分間遠心分離することにより２回洗浄した。次いで、得られた細胞ペレットをＬ−グルタミンを含むin RPMI 1640培地(MediaTech, Inc., Herndon, VA)に再懸濁し、１０％加熱不活性化ＦＣＳおよびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加した。細胞を１×１０６細胞／ｍｌ／ウェルで２４ウェルプレートで、オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で種々の期間培養した。インキュベーション期間の終わりに、上清を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡでＩＬ−６(BD Pharmingen, San Diego, CA)およびＩＦＮ−α(BioSource International)を含む種々のサイトカインをアッセイするまで、−７０℃で貯蔵した。結果を以下の表６Ａおよび６Ｂに示す。
【０１２９】
全ての場合に、細胞培養上清におけるＩＦＮ−２およびＩＬ−６のレベルは、ＩＦＮ−２およびＩＬ−６のそれぞれ同じ実験条件下で作成した標準曲線から計算した。
【０１３０】
表６Ａ イムノマー構造およびヒトPBMCアッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１４】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMe-リボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【０１３１】
表６Ｂ イムノマー構造およびヒトPBMCアッセイにいおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１５】
【０１３２】
【表１６】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【０１３３】
例１２：Ｂ細胞アッセイ
Ｂ細胞を、１×１０６細胞／ｍＬ、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播いた。オリゴヌクレオチドを終濃度０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬで細胞培養物に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、上清を採取し、ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ提供）を用いてＩＬ−６に対してアッセイした。表７は、終濃度１０．０μｇ／ｍＬでオリゴヌクレオチドを加えたドナー５〜１０に対する平均±ＳＤを示す。
【０１３４】
表７ イムノマー構造およびヒトＢ細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１７】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【０１３５】
フローサイトメトリーアッセイ
細胞表面マーカーのＣＤ６９およびＣＤ８６をBD Pharmingen (San Diego, USA)から購入した抗ヒトＣＤ６９−FitcおよびＣＤ８６−Fitcを用いて、Coulter Epics- XL Flow Cytometerで検出した。染色方法を次に簡単に示す。活性化した培養細胞を、染色バッファー（１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３のＰＢＳ）中、１０％ヒトＡＢ血清(Sigma)で、４℃１時間ブロックし、抗体で４℃一晩染色した。ＰＢＭＣ（４×１０５）をＣＤ６９−FitcおよびＣＤ８６−Fitcで染色した。ＰＤＣ（２×１０５）をＣＤ８６−Fitcで染色した。細胞染色データは、Coulter System IIソフトウェアで取得し、分析した。
【０１３６】
表８ イムノマー構造およびヒトPBMCからのBCの発現（２４時間）
【表１８】
【０１３７】
【表１９】
【０１３８】
【表２０】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【０１３９】
表９ イムノマー構造およびヒトPBMCからのDCの発現（２４時間）
【表２１】
【０１４０】
【表２２】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【０１４１】
均等
前述の発明を、明確さと理解のためにある程度詳細に記述したが、この開示を読んだ当業者には、本発明の真の範囲および付属のクレームから乖離することなく、形態および詳細についての種々の改変が可能であることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
関連出願
本願は、2003年6月11日提出の米国仮出願No. 60/477,608、2003年8月29日提出の米国仮出願No. 60/499,038、および2003年9月18日提出の米国仮出願60/504,279の利益を請求し、これらの全体は参照として組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学、免疫学および医薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫賦活（immunostimulatory）オリゴヌクレオチドおよびそれらの治療的使用に関する。
【０００３】
関連技術の概要
免疫系は、細菌やウイルスなどの病原体のＤＮＡに一般的に生じる非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含むＤＮＡを特異的に認識するように進化してきた。結果として、非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡは、脊椎動物の免疫系の強力な賦活因子（stimulator）である。ＤＮＡによる免疫賦活の最初の報告は、細菌のＤＮＡおよび回文配列を含むＤＮＡの短い断片を用いた研究に発し、これら両方ともホスホジエステル骨格を有する二本鎖構造であった。Tokunaga, T., et al., (J Natl. Cancer Inst. 72: 955-962 (1984))は、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）ＢＣＧから単離されたＤＮＡに対して強力な抗腫瘍活性を示した。Kataoka, T, et al., (Jpn. J. Cancer Res. 83: 244-247 (1992))、Hartmann et al. (European. Journal of Immunology 33: 1673-1641 (2003))、Marshall et al. Journal of Leukocyte Biology 73: 781-792 (2003)は、ウシ型結核菌ＢＣＧのｃＤＮＡ配列に基づいて設計した、合成オリゴデオキシヌクレオチドに対して同種の抗腫瘍活性を示した。
【０００４】
Sato, Y, et al., (Science 273: 352-354 (1996))は、ＤＮＡワクチンの適用においてＣｐＧ含有ＤＮＡの重要性を示した(Gurunathan S., et al. (Annu. Rev. Immunol. 18 : 927-974 (2000)も参照)。Pisetsky, D. S., et al., (Mol. Biol. Rep. 18: 217-221 (1993))およびKrieg, A. M., et al., (Nature 374: 546-549 (1995))は、特定の配列のコンテクストにおけるＤＮＡ含有非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＮＡ）が、脊椎動物の免疫系を活性化し、Ｂ細胞の増殖並びにマクロファージ、単球、ＮＫ細胞および樹状細胞の活性化を導くことを示した。ＣｐＧ ＤＮＡ活性化に応じて、免疫細胞が、IL-12、IFN-γ、INF-α、IL-6およびTNF-αを含む多数のサイトカインを分泌し、いくつかの共賦活（co-stimulatory）分子を発現する（例えば、前掲Pisetsky, D. S., et al.およびKrieg, A. M., et al.参照）。
【０００５】
Kandimalla, E. R., et al., (Curr. Opin. Mol. Ther. 4 122-129 (2002))は、ＣｐＧジヌクレオチドの存在および位置並びにそれに隣接する配列が、免疫賦活活性に重大な意味をもつことを示した。Agrawal, S., et al. (Current Cancer Drug Targets 1: 197-209 (2001))は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの隣接配列（flanking sequences）におけるリボースの修飾による有意な効果を開示した。これらの効果は、2'-O-メトキシエトキシおよび2'-または3'-O-メチル基を含む置換基の位置と性質に依存する。Yu, D., et al. (Bioorg. Med. Chem. 9: 2803-2808 (2001))は、ホスフェート修飾が、その位置に依存する免疫賦活活性を増大または低減することもできることを示した。Yu D., et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 2263-2267 (2001))およびYu D., et al. (Bioorg. Med Chem. 11: 459-464 (2003))は、ある核酸塩基の欠失によって活性が増大し得ることを開示した。加えて、Yu D., et al. (Bioorg. Med Chem. 11: 459-464 (2003))は、ある隣接ヌクレオチドを非ヌクレオチドリンカーと置換することによって、免疫賦活活性が増大しうることを開示した。
【０００６】
Yu D., et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2585-2588 (2000))、Yu D., et al. (Nucleic Acids Res. 30: 4460-4469 (2002))、Yu D., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90 (2002))、Bhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003))およびKandimalla E. R., et al. (Nucleic Acids Res. 31: 2393-2400 (2003)は、既に、5'末端がレセプター認識に含まれること、およびこの末端の近接性（accessibility）が活性に重要な意味をもつことを示している。Kandimalla E. R., et al. (Bioconj. Chem. 13: 966-974 (2002))は、フルオレセインまたは5'-5'連鎖ジヌクレオチドよりも大きなリガンドの5'末端接合に続く免疫賦活活性の損失を開示した。3'接合は効果がないので、取り込みの変化によって結果を説明することはできない（前掲）。しかしながら、結果として起きる免疫反応においてＤＮＡの二次構造の役割を解明するための組織的な研究は全くなかった。ここで本発明は、5'-および3'-ヘアピンループまたは二重に形成し得る付着末端を有する免疫賦活ＤＮＡによる免疫賦活における情報を提供する。
【０００７】
Thlサイトカイン産生を誘導するためおよび増強したイムノグロブリン産生とのCTL反応を促進するための免疫賦活ＤＮＡの能力は、癌、ウイルス性および細菌性感染症、炎症性疾患を含む広範囲の疾患の兆候の処置のために、そして免疫治療において、アジュバントとして用いられている。したがって、免疫賦活ＤＮＡ活性を改善することまたは調節することの利益は明らかであり、そして改善した免疫賦活核酸を開発するため、当該分野における必要性が未だ存在する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、増大または低減した免疫賦活特性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドを含む内容の新規組成物を提供する。本発明はまた、増大または低減した免疫賦活特性を備えた、または増大した代謝安定性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドの設計を可能にする方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端への二次構造の導入によって、免疫賦活活性およびこれらのオリゴヌクレオチドの安定性に有意な影響が与えられることを見出した。
【０００９】
第１の面において、本発明は免疫賦活核酸を提供する。該免疫賦活核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、シチジン、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。
【００１０】
ある態様において、免疫賦活核酸は、約２〜約５０ヌクレオチド長である。ある態様において、免疫賦活核酸は、約１２〜約２６ヌクレオチド長である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは夫々、約３〜約３５のヌクレオシド残基を有し、好ましくは、約４〜約３０のヌクレオシド残基を有し、より好ましくは、約４〜約２０のヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有する。ここで用いたように、「約」との用語は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、前記の各態様の均等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド有している。
【００１１】
ある態様において、免疫賦活核酸は、3'末端ステムループ二次構造を有している。ある態様において、免疫賦活核酸は、相補配列との水素結合によって、3'末端において二次構造を有する。ある態様において、免疫賦活核酸は、配列番号２、３、４、９、１２、１３、１４、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群から選択される。
【００１２】
第２の面において、本発明は、低減した免疫賦活活性を有する核酸を提供する。この面において、該核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【００１３】
ある態様において、免疫賦活核酸は、約２〜約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。ある態様において、免疫賦活核酸は、約１２〜約２６ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。
【００１４】
ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、5'末端ステムループ二次構造を形成する。ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、相補配列との水素結合によって、5'末端において二次構造を有する。ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、配列番号５、６、７、１０、１５、１６および１７からなる群から選択される。
【００１５】
第３の面において、本発明は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活核酸であって、該免疫賦活核酸は二次構造を有する、前記免疫賦活核酸を提供する。この面において、該免疫賦活核酸は式（Ｉ）に記載の構造を含む。
ＤｏｍａｉｎＡ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＤｏｍａｉｎＣ （Ｉ）
各Ｄｏｍａｉｎは、約２〜約１２ヌクレオチド長であってもよい。ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、グアノシンまたは2-デオキシグアノシン、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよい。ある態様において、ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される２以上のジヌクレオチドを有する。
【００１６】
ＤｏｍａｉｎＢ（以下、「Ｘ」と示す）は、ＤｏｍａｉｎＡおよびＣを結びつけるリンカーで、3'-5'連鎖、2'-5'連鎖、3'-3'連鎖、ホスフェート基、ヌクレオシドまたは、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコールまたは複素環部分であってもよい非ヌクレオシドリンカーである。ある態様において、ＤｏｍａｉｎＢは、好ましくは、ＤｏｍａｉｎＡおよびＤｏｍａｉｎＣのオリゴヌクレオチドを連鎖する非ヌクレオチドリンカーであり、「イムノマー（immunomers）」という。
【００１７】
ＤｏｍａｉｎＣは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ Poly I-Poly Cであってもよい。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。ある好ましい態様において、ＤｏｍａｉｎＣは、ジヌクレオチドＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊またはＣｐＧ＊を有さない。
【００１８】
ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、約２〜約５０ヌクレオチド長である。ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、約１２〜約２６ヌクレオチド長である。
【００１９】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＩ）に記載の構造を有する。
【数１】
当業者が認めるであろうとおり、分子内ステムループの形状で分子の3'末端に二次構造要素がある。
【００２０】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＩＩ）に記載の構造を有する。
【数２】
式（ＩＩＩ）に示した構造は、２つの3'末端の配列が相補的で、分子間水素結合を可能にし、２つの分子の3'末端がブロックされているので、本明細書で「ターミナルダイマー（terminal dimmer）」という。さらに、ＤｏｍａｉｎＡおよびＡ’は同一であってもなくてもよく、ＤｏｍａｉｎＢおよびＢ’は同一であってもなくてもよく、ＤｏｍａｉｎＣおよびＣ’は同一であってもなくてもよい。
【００２１】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＶ）に記載の構造を有する。
【数３】
当業者が認めるであろうとおり、3'末端の相補配列がこの領域と水素結合しているので、示した分子の3'末端は二次構造を有する。
【００２２】
ある態様において、本発明の免疫賦活核酸は、配列番号１〜３８からなる群から選択される配列を有する。ある態様において、本発明の免疫賦活核酸は、配列番号３９〜６８からなる群から選択される配列を有する。
【００２３】
第４の面において、本発明は、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を低減または消失する方法を提供する。該方法は、オリゴヌクレオチドの5'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造は、ステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の5'末端へ相補配列を水素結合することによって得られる。
【００２４】
第５の面において、本発明は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの安定性を増大するための方法を提供する。該方法は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造はステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の3'末端に相補配列を水素結合することによって得られる。
【００２５】
第６の面において、本発明は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性の調節方法を提供する。該方法は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端に二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造は、ステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の3'末端または5'末端に相補配列を水素結合することによって得られる。
【００２６】
第７の面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第１、第２、第３、第４、第５および第６の面に開示した組成物のいずれか１つを単独で、または組み合わせて、そして薬学的に許容し得る担体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａは、1.0μg/mLの濃度で、BALB/cマウス脾臓細胞培養において、オリゴ１、２および５によって誘導された細胞増殖を示す概略図である。 図１Ｂは、BALB/cマウスに5 mg/kgの用量で腹腔内投与したオリゴ１、２および５によって誘導された脾腫を示す概略図である。
【図２】図２は、3μg/mLの濃度で、オリゴヌクレオチド１〜７とのインキュベーションの２４時間後のBALB/cマウス脾臓細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6の誘導を示す概略図である。
【図３】図３は、3μg/mLの濃度で、オリゴヌクレオチド８〜１０とのインキュベーションの２４時間後のBALB/cマウス脾臓細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6の誘導を示す概略図である。
【図４】図４は、10μg/mLのオリゴ１〜８で賦活後１時間のJ774マクロファージにおけるNF-κB経路の活性を示す図である。Mは、培地で処理した対照を表し、Cは、非ＣｐＧオリゴで処理した細胞である。
【図５】図５は、オリゴ１〜７の10μg/mLの濃度で、J774マクロファージ細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6の誘導を示す概略図である。Mは、PBSで処理した対照を表す。NDは検出なしを示す。
【図６】図６は、10μg/mLで、オリゴ１１、１２、１４、１５および１７に曝した後の形質細胞様樹状細胞におけるインターフェロンα（IFN-α）の誘導を示す概略図である。
【図７】図７は、10μg/mlで、オリゴ１８、１９、２０および２１に曝した後の形質細胞様樹状細胞におけるインターフェロンα（IFN-α）の誘導を示す概略図である。
【図８】図８は、10μg/mlで、オリゴ４１、４４、４５および２１に曝した後の形質細胞様樹状細胞におけるインターフェロンα（IFN-α）の誘導を示す概略図である。
【図９】図９は、本発明のイムノマーのパラレル合成の合成スキームである。DMTr＝4,4'-ジメトキシトリチル;CE＝シアノエチル。
【図１０】図１０は、本発明のイムノマーのリニア合成に適した典型的な低分子リンカーのグループを示す。
【図１１】図１１は、本発明のイムノマーのリニア合成の合成スキームである。DMTr＝4,4'-ジメトキシトリチル;CE＝シアノエチル。
【図１２】図１２は、本発明のイムノマーのパラレル合成に適した典型的な低分子リンカーのグループを示す。
【図１３】図１３ 自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡは、（Ａ）ヒトpDCによるIFN-αの分泌および（Ｂ）培養中のヒトＢ細胞増殖を誘導する。（Ａ）pDCは、５〜８人の健康なドナーから得られたヒトPBMCから単離し、２４時間、10μg/mLのＣｐＧ ＤＮＡで賦活化し、上清をELISAによってIFN-αの分泌を分析した。（Ｂ）Ｂ細胞は、４〜７人の健康なドナーから得られたヒトPBMCから単離し、1μg/mLのＣｐＧ ＤＮＡで７２時間賦活化し、[3H]-チミジンの取り込みを測定した。符号は、各ドナーから得られたデータを表し、プラス記号は両パネルで全てのドナーの平均値を表す。
【図１４】図１４ ヒトＢ細胞増殖のＣｐＧ ＤＮＡ濃度依存性。Ｂ細胞は、４〜６人の健康なドナーから得られたヒトPBMCから単離し、異なる濃度のＣｐＧ ＤＮＡで７２時間賦活化した。示したデータは、平均±SDである。
【図１５】図１５（Ａ）ＣｐＧモチーフおよび二次構造の存在が、ヒトpDCによるINF-αの分泌の誘導に要求される。示したデータは、10μg/mLの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、６〜８人のヒトドナーの平均±SDである。（Ｂ）ヒトＢ細胞増殖は、ＣｐＧ賦活化モチーフを要求するが、ＤＮＡの二次構造は要求しない。示したデータは、1μg/mLの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、５〜８人のドナーの平均±SDである。
【図１６】図１６ ヘアピン二次構造における2'-O-メチルリボヌクレオチドセグメントの、（Ａ）ヒトpDCによるIFN-α分泌および（Ｂ）ヒトＢ細胞増殖に対する影響。示したデータは、pDC培養における10μg/mLの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、６〜８人のヒトドナーの平均±SDであり、Ｂ細胞培養における1μg/mLの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、５〜８人のドナーの平均±SDである。
【００２８】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、増大または低減した免疫賦活特性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドを含む内容の新規組成物を提供する。本発明はまた、増大または低減した免疫賦活特性を備えた、または増大した代謝安定性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドの設計を可能にする方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端への二次構造の導入によって、免疫賦活活性およびこれらのオリゴヌクレオチドの安定性に有意な影響が与えられることを見出した。
発行済みの特許公報、特許出願および文献として本明細書に挙げたものは、参照によって組み込まれるところ、その程度は、それぞれが詳細に、別個に参照によって本明細書に組み込まれることが示された場合と同一である。本明細書に述べたいかなる文献のいかなる教示と本明細書との間が矛盾する場合、発明の目的のために本明細書が優先される。
【００２９】
第１の面において、本発明は免疫賦活核酸を提供する。該免疫賦活核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、ここでオリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。
【００３０】
ある態様において、免疫賦活核酸は、約２〜約５０ヌクレオチド長である。ある態様において、免疫賦活核酸は、約１２〜約２６ヌクレオチド長である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは夫々、約３〜約３５のヌクレオシド残基を有し、好ましくは、約４〜約３０のヌクレオシド残基を有し、より好ましくは、約４〜約２０のヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有する。ここで用いたように、「約」との用語は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、前記の各態様の均等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド有している。
【００３１】
ある態様において、免疫賦活核酸は、3'末端ステムループ二次構造を有している。ある態様において、免疫賦活核酸は、相補配列との水素結合によって、3'末端において二次構造を有する。ある態様において、免疫賦活核酸は、配列番号２、３、４、９、１２、１３、１４、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群から選択される。
【００３２】
本発明のためには「オリゴヌクレオチド」とは、複数の連鎖したヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドをいう。前記オリゴヌクレオチドはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成方法により産生される。好ましい態様においては、各ヌクレオシド単位は複素環塩基および、ペントフラノシル、2'−デオキシペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、2'−デオキシ−2'−置換アラビノース、2'-O-置換アラビノースまたは六単糖基を含む。ヌクレオシド残基は多くの知られたヌクレオシド間連鎖によって互いに結合され得る。前記ヌクレオシド間連鎖は限定されることなく、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間連鎖を含む。用語「オリゴヌクレオチド」はまた1または2以上の立体特異的ヌクレオシド間連鎖（例えば、(RP)−または(SP)−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、あるいはホスホトリエステル連鎖）を有するポリヌクレオシドをも含む。ここでいう用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、いずれの前記ヌクレオシド間連鎖を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを明確に意味し、前記連鎖はホスフェート基を含むか含まないかを問わない。ある好ましい態様においては、これらヌクレオシド間連鎖はホスホジエステル、ホスホロチオエート、あるいはホスホロジチオネート連鎖、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００３３】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定なく、タンパク質基、親油性基、インターカレート剤、ジアミン、葉酸、コレステロール、およびアダマンタンを含む付加的置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定なくペプチド核酸(PNA)、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、ロックド核酸(LNA)、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチドおよびアルキルリンカーやアミノリンカーをもつ骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含む、ポリマーを包含する他のいかなる核酸塩基をも含む。
【００３４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはこれらの混合物を含むことができる。ここでいう用語「修飾ヌクレオシド」とは、修飾複素環塩基、修飾糖部分またはそれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ここで述べるような非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。ある態様おいては、修飾ヌクレオシドは2'−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは2'−デオキシ−2'−置換アラビノシドである。
【００３５】
本発明のためには、用語「2'−置換リボヌクレオシド」または「2'−置換アラビノシド」は、ペントース部分の２’位におけるヒドロキシル基が置換されて2'−置換または2'-O-置換リボヌクレオシドとなるリボヌクレオシドを含む。好ましくは、そのような置換は、1〜6の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、あるいは、6〜10の炭素原子を有するアリール基によりなされ、そのようなアルキルまたはアリール基は置換されていなくてもよく、あるいは、例えばハロ（halo）、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基に置換されていてもよい。そのような2'-O-置換リボヌクレオシドまたは2'-O-置換アラビノシドの例は、限定なく2'-O-メチルリボヌクレオシドまたは2'-O-メチルアラビノシドおよび2'-O-メトキシエチルリボヌクレオシドまたは2'-O-メトキシエチルアラビノシドを含む。
【００３６】
用語「2'−置換リボヌクレオシド」または「2'−置換アラビノシド」はまた、2'−ヒドロキシル基が1〜6個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、または、アミノもしくはハロ基により置換されているリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。そのような2'−置換リボヌクレオシドまたは2'−置換アラビノシドの例は、限定なく2'−アミノ、2'−フルオロ、2'−アリル、および2'−プロパルジルリボヌクレオシドまたはアラビノシドを含む。
【００３７】
用語「オリゴヌクレオチド」はハイブリッドまたはキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、1種以上のヌクレオシド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドである。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの好ましい例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、またはホスホロジチオネート部位およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート連鎖などの非イオン連鎖を含む(例えばPederson et al. U.S. Patent No. 5,635,377および5,366,878などを参照)。
【００３８】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１種以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの好ましい例は、リボヌクレオチド、または2'−置換リボヌクレオチド部位、およびデオキシリボヌクレオチド部位を含む(例えばMetelevおよびAgrawal、U. S. Patent No. 5,652,355、6,346,614および6,143,881を参照)。
【００３９】
ここで用いたとおり、用語「二次構造」は、分子内および分子間水素結合を意味する。分子内水素結合によって、ステムループ構造が形成される。分子間水素結合によって、二本鎖核酸分子が形成される。
【００４０】
ここで用いたとおり、用語「約」は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、本発明の目的のため、前記の各態様の均等物として考慮される。
【００４１】
ここで用いたとおり、用語「相補」は、核酸とハイブリダイズする可能性を有することを意味する。このようなハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖間の水素結合の結果であり、水素結合の他の様式ではあるが、好ましくは、Watson-CrickまたはHoogsteen塩基対を形成し、また塩基スタッキング（base stacking）もまたハイブリダイゼーションを導き得る。
【００４２】
第２の面において、本発明は、低減した免疫賦活活性を有する核酸を提供する。この面において、該核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、ここで、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の5'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【００４３】
ある態様において、免疫賦活核酸は、約２〜約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。ある態様において、免疫賦活核酸は、約１２〜約２６ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは夫々約３〜約３５ヌクレオシド残基、好ましくは約４〜約３０ヌクレオシド残基、より好ましくは約４〜約２０ヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８、または約５〜約１４ヌクレオシド残基を有する。ここで用いたように、「約」との用語は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、前記の各態様の均等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド有している。
【００４４】
ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、5'末端ステムループ二次構造を形成する。ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、相補配列との水素結合によって、5'末端において二次構造を有する。ある態様において、低減された免疫賦活活性を有する核酸は、配列番号５、６、７、１０、１５、１６および１７からなる群から選択される。
【００４５】
第３の面において、本発明は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活核酸であって、該免疫賦活核酸は二次構造を有する、前記免疫賦活核酸を提供する。この面において、該免疫賦活核酸は式（Ｉ）に記載の構造を含む。
ＤｏｍａｉｎＡ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＤｏｍａｉｎＣ （Ｉ）
【００４６】
各Ｄｏｍａｉｎは、約２〜約１２ヌクレオチド長であってもよい。ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよく、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはＣｐＧでない。
【００４７】
ある態様において、ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される２以上のジヌクレオチドを有する。
【００４８】
ＤｏｍａｉｎＢ（以下、「Ｘ」と示す）は、ＤｏｍａｉｎＡおよびＣを結びつけるリンカーで、3'-5'連鎖、2'-5'連鎖、3'-3'連鎖、ホスフェート基、ヌクレオシドまたは、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコールまたは複素環部分であってもよい非ヌクレオシドリンカーである。
【００４９】
ＤｏｍａｉｎＣは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ Poly I-Poly Cであってもよい。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。ある態様において、ＤｏｍａｉｎＢは、好ましくは、ＤｏｍａｉｎＡおよびＤｏｍａｉｎＣのオリゴヌクレオチドを連鎖する非ヌクレオチドリンカーであり、「イムノマー（immunomers）」という。ある好ましい態様において、ＤｏｍａｉｎＣは、ジヌクレオチドＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊またはＣｐＧ＊を有さない。
【００５０】
ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、約２〜約５０ヌクレオチド長である。ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは、約１２〜約２６ヌクレオチド長である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは夫々、約３〜約３５ヌクレオシド残基、好ましくは約４〜約３０ヌクレオシド残基、より好ましくは約４〜約２０ヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有する。ここで用いたように、「約」との用語は、厳密な数字が重要な意味を持たないことを含意する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要な意味を持たず、１または数個少ないヌクレオシド残基または１〜数個付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、前記の各態様の均等物として考慮される。ある態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド有している。
【００５１】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＩ）に記載の構造を有する。
【数４】
当業者が認めるであろうとおり、分子内ステムループの形状で分子の3'末端に二次構造要素がある。
【００５２】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＩＩ）に記載の構造を有する。
【数５】
式（ＩＩＩ）に示した構造は、２つの3'末端の配列が相補的で、分子間水素結合を可能にし、２つの分子の3'末端がブロックされているので、本明細書で「ターミナルダイマー（terminal dimmer）」という。さらに、ＤｏｍａｉｎＡおよびＡ’は同一であってもなくてもよく、ＤｏｍａｉｎＢおよびＢ’は同一であってもなくてもよく、ＤｏｍａｉｎＣおよびＣ’は同一であってもなくてもよい。
【００５３】
限定的でない例によって、この面のある態様において、免疫賦活核酸は、式（ＩＶ）に記載の構造を有する。
【数６】
当業者が認めるであろうとおり、3'末端の相補配列がこの領域と水素結合しているので、示した分子の3'末端は二次構造を有する。ある態様において、リガンドなどの分子は、細胞の取り込みを促進するためまたは分子の安定性を改善するために3'末端に着けられていてもよい。
【００５４】
本発明のいくつかの核酸分子の限定的でない例を表１に示す。
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
＊:大文字-PS;小文字-PO;太字-2'-O-メチル-リボヌクレオチド（２６および２７中）;G-2'-デオキシ-7-デアザ-G（２８中）;G-araG（２９中）;X-C3-リンカー（３７および３８中）。
【００５８】
代替的に、本発明の核酸分子は、非ヌクレオチドリンカーによって結合した２つのイムノマーであり得る。これら分子の限定されない例を表２に示す。
【表５】
【００５９】
【表６】
＊大文字-PS;小文字-PO、X-C3-リンカー;Y-テトラエチレングリコールリンカー;Z-ヘキサエチレングリコールリンカー、太字-2'-O-メチルリボヌクレオチド（４４および５７中）;G-2'-デオキシ-7-デアザ-G（４５中）。
【００６０】
ある態様において、本発明の免疫賦活核酸は、配列番号１〜３８からなる群から選択される配列を有する。ある態様において、本発明の免疫賦活核酸は、配列番号３９〜６８からなる群から選択される配列を有する。
【００６１】
ある態様において、イムノマーの少なくとも１つの免疫賦活オリゴヌクレオチドは、式：5'-Pyr-Pur-3'で表される免疫賦活ジヌクレオチドを含み、式中、Pyrは天然ピリミジンヌクレオシドまたはその類縁体であり、Purは天然プリンヌクレオシドまたはその類縁体である。本明細書において、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がピリミジン塩基であるヌクレオシドをいう。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がプリン塩基であるヌクレオシドをいう。本発明のためには、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンまたはプリン塩基、天然に存在しない糖部分、またはこれらの組み合わせを含む。
【００６２】
本発明による方法において用いられる免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける好ましいピリミジンヌクレオシドは、構造（Ｉ）：
【化１】
式中、
Ｄは、水素結合供与体（hydrogen bond donor）であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体（hydrogen bond acceptor）、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ａ’は、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ｘは、炭素または窒素であり；そして
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００６３】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類縁体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばシトシンのＮ３を含む。
【００６４】
ある態様において、（Ｉ）の塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。天然に存在しない好ましいピリミジン塩基の例は、限定なく、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくはＮ４−エチルシトシンおよび４−チオウラシルを含む。ある態様において（Ｉ）の糖部分Ｓ’は、天然に存在しない糖部分である。本発明のためには、「天然に存在する糖部分」は、例えばリボースおよび２’−デオキシリボースなどの、核酸の一部として天然に存在する糖部分であり、「天然に存在しない糖部分」は、核酸の一部として天然に存在しない任意の糖であるが、ヘキソースなどのオリゴヌクレオチドの骨格において用いることのできるものである。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、好ましい糖部分の例である。
【００６５】
本発明による方法において用いられる免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける、好ましいプリンヌクレオシド類縁体は、構造（ＩＩ）：
【化２】
式中、
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ｘは、炭素または窒素であり；
各Ｌは、独立してＣ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択され；そして、
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００６６】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類縁体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのＮ１を含む。
【００６７】
ある態様において、（ＶＩ）の塩基部分は、天然に存在しないプリン塩基である。天然に存在しない好ましいプリン塩基の例は、限定なく、６−チオグアニンおよび７−デアザグアニンを含む。ある態様において、（ＩＩ）の糖部分Ｓ’は、構造（Ｉ）について上記したように、天然に存在する糖部分である。
【００６８】
第４の面において、本発明は、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を低減または消失する方法を提供する。該方法は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの5'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造は、ステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の5'末端へ相補配列を水素結合することによって得られる。
【００６９】
第５の面において、本発明は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの安定性を増大するための方法を提供する。該方法は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造はステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の3'末端に相補配列を水素結合することによって得られる。
【００７０】
第６の面において、本発明は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性の調節方法を提供する。該方法は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端に二次構造を含む核酸配列を導入することを含む。この面のある態様において、二次構造は、ステムループ構造である。この面のある態様において、二次構造は、オリゴヌクレオチド配列の3'末端または5'末端に相補配列を水素結合することによって得られる。
【００７１】
ここで用いたとおり、用語「調節」または「調節する」は、元の（parent）免疫賦活核酸の免疫賦活活性に比べて、免疫賦活核酸の免疫賦活活性を増大するかまたは低減することを意味する。
【００７２】
第７の面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第１、第２および第３の面に開示した組成物のいずれか１つを単独で、または組合わせて、そして薬学的に許容し得る担体を含む。
【００７３】
ここで用いたとおり、用語「薬学的に許容される」は、本発明の第１、第２または第３の面の組成物の効能を妨げず、細胞、細胞培養物、組織または生物などの生体システムと親和性のある物質をいう。好ましくは、前記生体システムは、脊椎動物などの生きた生物である。
【００７４】
ここで用いたとおり、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、または医薬処方における用途の分野においてよく知られた他の物質を含む。担体、賦形剤または希釈剤の特徴は、特定用途への投与ルートに依存するものと理解される。これらの物質を含む薬学的に許容される処方の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990, ISBN: 0-912734- 04-3に記載されている。
【００７５】
本発明の医薬組成物はまた、EFG、抗イディオタイプ癌ワクチン、Gp75抗原、GMKメラノーマワクチン、MGVガングリオシド結合ワクチン、Her2/new、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL theratope、BLP25 (MUC-1)、リポソームイディオタイプワクチン、Melacine、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、MVAに基づくワクチン、PACIS、BCGワクチン、TA-HPV、TA-CIN、DISC-ウイルスおよびImmunCyst/TheraCysからなる群から選択される癌ワクチンを含む癌ワクチンを含み得る。
【００７６】
本発明の種々の態様において、本発明の第１、第２、第３、第４、第５または第６の面の組成物は、抗原または抗原に作動可能に結合する他のものと共有結合していてもよい。ここで用いたとおり、用語「作動可能に結合する」は、本発明の第１、第２または第３の面の組成物と抗原との両方の活性を維持する任意の結合をいう。かかる作動的結合の限定的でない例には、同じリポソームの部分または他のこのようなデリバリービヒクルまたは試薬になることを含む。本発明の第１、第２または第３の面の組成物が抗原に共有結合している態様において、かかる共有結合は、好ましくは、免疫賦活オリゴヌクレオチドのアクセス可能な5'末端以外で、本発明の第１、第２または第３の面の組成物の任意の位置である。例えば、抗原は、細胞間連鎖に付着し得るか、または非ヌクレオチドリンカーに付着し得る。代替的に、抗原は、それ自体、非ヌクレオチドリンカーであり得る。
【００７７】
本発明の種々の態様において、本発明の第１、第２、第３、第４、第５または第６の面の組成物は、アンチセンス活性を備えたオリゴヌクレオチドを含み得る。ここで用いたとおり、「アンチセンス活性」は、細胞または動物の中へ導入された場合に、オリゴヌクレオチドによって、それに対し相補的である遺伝子の発現における低減をもたらす。
【００７８】
本発明の種々の態様において、本発明の第１、第２、第３、第４、第５または第６の面の組成物は、アプタマーであるオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。アプタマーは、他の分子と結合する能力に基づいてランダムプール（random pools）から選択される核酸分子である。アプタマーは、核酸、タンパク質、小さな有機化合物および完全な生物にさえも結合するものが選択される。これらの新規な分子は、医薬およびテクノロジーにおいて多くの潜在的な用途を有する（例えば、Burgstaller P., et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 5: 690- 700 (2002)参照）。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、限定されないが、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、を含む任意の好適なルートで、遺伝子銃や皮膚パッチにより、または、目薬またはうがい薬の形で投与され得る。該医薬組成物は、既知の手順で、例えば、癌の処置、感染症の処置および自己免疫疾患の処置などの所望の効果を得る有効期間および用量で供給することができる。全身に投与する場合、医薬組成物は、好ましくは、本発明の第１、第２および／または第３の面の組成物の血中レベルが約０．０００１μＭ〜約１０μＭに達するのに十分な用量で投与される。局所投与には、これよりもはるかに低い濃度が効果的である可能性があり、また、はるかに高い濃度も容認され得る。好ましくは、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーのの総用量は、１日あたり患者一人あたり約０．０００１ｍｇ〜１日あたり体重１ｋｇあたり約２００ｍｇの範囲である。同時にまたは連続して治療に有効な量の１または２以上の本発明の治療用組成物を単一の処置症状の個々に投与することが好ましい。
【００８０】
さらに、免疫賦活オリゴヌクレオチドをイムノマーとして創出する場合、次のプロトコールが合成のために用いられる。本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、図９および１１に概略的に示したように、自動シンセサイザーおよびホスホルアミデートアプローチを用いて、簡便に合成し得る。いくつかの態様において、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、リニア合成アプローチによって合成される（図９）。この合成のための典型的なリンカーを図１０に示す。ここで用いるように、「リニア合成」との用語は、イムノマーの一端から始まり、他端へ直線的に進行する合成を意味する。リニア合成は、（長さ、塩基組成および／または取り込まれた化学修飾において）同一または同一でないモノマーユニットを免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーへ取り込むことを可能にする。
【００８１】
イムノマーに対する代替的な合成法は、「パラレル合成」であり、これは中心のリンカー部分から外側に合成が進む（図１１参照）。この合成方法のための典型的なリンカーを図１２に示す。リンカーに付着する固体支持体は、米国特許第5,912,332号に記載のとおり、パラレル合成のために用いることができる。代替的に、制御された多孔性ガラス支持体に付着するホスフェートなどの一般的な固体支持体が用いられ得る。
【００８２】
イムノマーのパラレル合成はリニア合成に対し、いくつかの利点を有する：（１）パラレル合成は同一のモノマーユニットを取り込むことができる；（２）リニア合成と異なり、両方（または全ての）モノマーユニットが同時に合成され、これにより合成ステップ数および合成に要する時間がモノマーユニットのそれらと同じである；および（３）合成ステップの低減によって、最終イムノマー製品の純度および収量を改善する。
【００８３】
リニア合成またはパラレル合成プロトコールによる合成の最後に、本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは簡便に、濃アンモニア溶液で、または、修飾されたヌクレオシドが取り込まれている場合は、ホスホルアミデートの供給者により勧められているもので脱保護し得る。得られた免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、好ましくは、逆相ＨＰＬＣで精製し、脱トリチル化し、脱塩し、そして透析した。
【００８４】
ＣｐＧ ＤＮＡ１８〜２１の賦活化ドメインは、ヒト特異的「ＧＴＣＧＴＴ」モチーフを5'末端に含む。構造ドメイン領域において、７、１１、１５または１９塩基対（ｂｐ）のヘアピンステムループ構造を形成する相補配列は、賦活化ドメインの3'末端の近傍に取り込まれている（表３）。自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡは、賦活化ドメインがいかなる構造モチーフをも含まず（塩基対化）、ＣｐＧ賦活化モチーフが構造ドメインに存在しないようにデザインされる。ＣｐＧ ＤＮＡにおける賦活化モチーフおよび二次構造の両方が、ｐＤＣ活性化に要求される。ＣｐＧ ＤＮＡは、培養中、ヒトＢ細胞の強い濃度依存的増殖を誘導する。しかしながら、Ｂ細胞の増殖は、ヘアピン二重鎖の長さには依存しない。自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡがｐＤＣおよびＢ細胞の両方を活性化できることによって、癌、喘息、アレルギーおよび感染症に対して用いる治療剤およびＢ細胞またはｐＤＣを賦活化するものより強力なアジュバントの開発を可能にすることができる。
【００８５】
配列２２は、賦活化ドメインを有するが、その3'末端にヘアピン構造（構造ドメイン）を形成するために要求される相補性を含まない。これに対し、ＣｐＧ ＤＮＡ３０はヘアピン構造（構造ドメイン）を形成するが、賦活化モチーフは有していない（表３）。配列６９、配列１９の類縁体は、ヘアピン配列の１つの鎖に2'-O-メチル−リボヌクレオチドを含む。
【００８６】
ＣｐＧ ＤＮＡによる安定したヘアピン構造の形成は、熱融解およびＥＭＳＡの調査によって確認した（表３）。予測どおり、ＣｐＧ ＤＮＡ１８〜２１は、異なる長さのオリゴヌクレオチドマーカーと比較した非変性ポリアクリルアミドゲルにおける要求される移動性でバンドを示し、構造がヘアピン構造形成であることを確認した（データ示さず）。
【００８７】
ヒトｐＤＣはＴＬＲ９を発現し、ＣｐＧ ＤＮＡ誘導ＩＦＮ−αの主なソースであると信じられている。ＣｐＧ ＤＮＡ１８〜２１は、図１３に示すように、ヒトｐＤＣ培養において、ＩＦＮ−αの産生を誘導する。ＩＦＮ−αの分泌のレベルは、ヘアピン二重鎖構造の長さに依存する。１９ｂｐの二重鎖を形成するＣｐＧ ＤＮＡ２１は、ＩＦＮ−αを最も高いレベルで誘導した（図１３）。応答はドナーからドナーへ変化するが、傾向はＣｐＧ ＤＮＡの間で一貫していた（図１３）。ポリ（ｄＧ）配列を含む回文のＣｐＧオリゴで、ヒトｐＤＣを賦活化することが知られているＣｐＧ ＤＮＡ７０を、ポジティブコントロールとして用いた。
【００８８】
全４つのＣｐＧ ＤＮＡは、培養におけるヒトＢ細胞の強い濃度依存的増殖を誘導する（図１４）。しかしながら、Ｂ細胞の増殖は、ヘアピン二重鎖の長さに依存しなかった（図１３）。
【００８９】
ＣｐＧ ＤＮＡ１８、１９、２２および３０によるＩＦＮ−αを誘導するヒトｐＤＣの活性を調査した。前の実験においてみられたように、１８および１９の両方ともＩＦＮ−αの産生を誘導した（図１５）。賦活化モチーフを備えるが二次構造をもたない配列２２および賦活化モチーフをもたず二次構造を備えた配列３０は、ｐＤＣ培養においてＩＦＮ−α産生を誘導しなかった（図１５）。これらの結果は、ＣｐＧ ＤＮＡにおいて賦活化モチーフと二次構造との両方がｐＤＣ活性化に必要であることを示唆している。
【００９０】
図４Ｂに示したＢ細胞増殖のデータは、二次構造を形成するＣｐＧ ＤＮＡ１８および１９並びに形成しないＣｐＧ ＤＮＡ２２が強いＢ細胞増殖を誘導したことを示している。賦活化モチーフをもたない配列３０は、最小限の増殖を誘導し、ＣｐＧモチーフは活性化に要求されるが、二次構造は要求されないことが示唆された。
【００９１】
ＴＬＲ９は、ＣｐＧ ＤＮＡを特異的に認識するが、ＲＮＡは特異的に認識しない。しかしながら、フランキング配列のＣｐＧジヌクレオチドに遠位の2'-O-アルキルリボヌクレオチドの部位特異的な取り込みは許容される。本発明者らは、ループ領域を含み3'末端に近接するステム配列が、2'-O-メチルリボヌクレオチドで置換されたＣｐＧ ＤＮＡ１９の類縁体を合成した。ＣｐＧ ＤＮＡ６９および１９の両方は、ヒトｐＤＣ培養において（図１６）およびヒトＢ細胞増殖において（図１６）、同様のレベルのＩＦＮ−α分泌を誘導した。これらの結果は、2'-O-メチルリボヌクレオチド置換またはこれらの置換によって生じたコンホメーション変化は、ｐＤＣまたはＢ細胞の活性化を阻害しないことを示した。
【００９２】
トール様レセプター９（ＴＬＲ９）は、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡを認識し、ストレス−キナーゼおよびＮＦ−κＢ経路を含むいくつかのシグナル経路を活性化し、インビトロおよびインビボでのＩＦＮ−α／β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを含む多くのケモカインおよびサイトカインの分泌を導く。しかしながら、ＣｐＧ ＤＮＡおよびそのレセプターＴＬＲ９の間の直接的な相互作用は、未だ立証されていない。ＣｐＧ ＤＮＡ免疫賦活化において、代替レセプターまたはコレセプターの果たし得る役割が提案されてきた。異なる骨格、配列および構造を有するＣｐＧ ＤＮＡが細胞特異的であるがＴＬＲ９依存した形で免疫系を活性化する。
【００９３】
ＣｐＧ ＤＮＡの3'末端での二次構造の最適配置によって、異なるサイトカインプロフィールを誘導することができる。ヒト特異的モチーフを備えたＣｐＧ ＤＮＡ構造は、ヒトｐＤＣ培養において高いレベルのＩＦＮ−αを誘導し、二次構造がｐＤＣ活性化に必要であり得ることが示された。
【００９４】
本ＣｐＧ ＤＮＡは、5'末端にＣｐＧモチーフを備えた賦活化ドメインおよび3'末端にヘアピン二重鎖の構成を可能にする配列を含む構造ドメインの２つの明確なドメインを含むようにデザインされる。これらＣｐＧ ＤＮＡの分子内二次構造を形成することができることによって、ユビキタスな3'−ヌクレアーゼに対して、さらなる安定性が提供され、自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡと名付けられる。自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡは、構造ドメイン領域においてＣｐＧモチーフを有さないことにより、早くに報告されている分子間二重構造を形成する回文ＣｐＧ ＤＮＡと異なる。
【００９５】
ＣｐＧジヌクレオチドを含む回文配列は、ＩＦＮ−α／βおよびγを産生するように免疫細胞を活性化する。ここに述べる自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡにより、本発明者らは、ヒトＢ細胞およびｐＤＣの両方により認識されたＣｐＧ ＤＮＡの賦活化および構造の特徴を分析することができた。ＣｐＧ ＤＮＡ１８〜２１は、ヘアピン二重鎖の長さに依存する形でｐＤＣを活性化する。構造ドメインのないコントロールＤＮＡ分子２２および賦活化ドメインのないＤＮＡ分子３０の両方とも、ＩＦＮ−αの分泌を誘導せず、賦活化ドメインおよび構造ドメインの両方がｐＤＣ活性化に要求されることを示した。これに対し、Ｂ細胞の活性化には、賦活化ドメインだけが要求され、構造ドメインは要求されない。ＣｐＧ ＤＮＡ２０および２１のより低い活性化は、ＣｐＧ ＤＮＡの二次構造が、Ｂ細胞活性化を阻害し得ることを示している。実際、構造ドメインをもたず、ＣｐＧ ＤＮＡ１８と同じヌクレオチド長のＣｐＧ ＤＮＡ３０は、ＣｐＧ ＤＮＡ１９と同じレベルでＢ細胞を活性化し、一本鎖ＤＮＡがＢ細胞の活性化には好ましいことを示した。ＣｐＧ ＤＮＡ３０と観察したＢ細胞のより低い活性化は、非特異的活性に関係する可能性がある。
【００９６】
ＣｐＧ ＤＮＡ６９での本結果は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドへテロ二重鎖がｐＤＣまたはＢ細胞活性を妨げないことを示している。これらの結果は、構造ドメイン領域での2'-O-メチルリボヌクレオチド置換によるＢからＡへのコンホメーション変化が、免疫賦活化にほとんどまたは全く影響しないことを示しており、したがって、これらの位置での置換が許容される。
【００９７】
結論として、これらの調査において、本発明者らは、ヒト免疫細胞、ｐＤＣおよびＢ細胞のＴＬＲ９−ポジティブ部分の最適活性のために、ＣｐＧ ＤＮＡの賦活化ドメインおよび構造ドメインの合理的な組み合わせを提供する。ここに示す調査により、ｐＤＣおよびＢ細胞の活性化に要求されるＣｐＧ ＤＮＡの特異的な特徴を決定することができる。ＣｐＧ賦活化モチーフは、ヒトＢ細胞の活性化に要求され、また賦活化モチーフおよびさらなる構造ドメインの両方がヒトｐＤＣの活性化に要求される。同じＴＬＲ９レセプターが、２つの異なる細胞増殖における賦活化のためのリガンドの異なる構造特性を要求する理由は明確でない。ｐＤＣおよびＢ細胞でのＴＬＲ９シグナリングにおいて異なるアダプター分子の関与を示すことができたことは事実である。
【００９８】
自己安定化ＣｐＧ ＤＮＡがｐＤＣおよびＢ細胞の両方を活性化することができることによって、癌、喘息、アレルギーおよび感染症に用いる治療剤およびＢ細胞またはｐＤＣを賦活化するものより強力なアジュバントの開発が可能である。
【００９９】
【表７】
ａ：主要な賦活化ドメインおよび構造ドメインを示す新規なＣｐＧ ＤＮＡデザイン（ボックス）の概略図。賦活化ドメインは適切なＣｐＧモチーフを含むが、構造ドメインは含まない；
ｂ：全ての配列は７０を除いてホスホロチオエート修飾した。６９においてイタリックで示したヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチドを示し、７０において下線のヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を示す；
c：ＮＤ−測定せず
【０１００】
以下の例は、本発明のある好ましい態様をさらに示そうとするものであり、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【０１０１】
例
例１：オリゴヌクレオチド合成、精製および末端融解プロフィール
ＣｐＧオリゴは、シアノエチルホスホルアミデートをPerSeptive Biosystem's 8909 Expedite ＤＮＡ synthesizer (PerSeptive Biosystem, Boston, MA)を用いて、１〜２μｍｏｌのスケールで合成した。ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴのホスホルアミデートは、PE Biosystems (Foster City, CA)から得た。Iyer R. P., et al. (J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990))に記載のように、イオジン酸化剤をホスホロチオエート骨格の修飾を得るために用いた。全てのオリゴを、標準のプロトコールを用いて脱保護し、ＨＰＬＣによって精製し、そして洗浄のためＵＳＰ品質の滅菌水に対して透析した。オリゴを凍結乾燥し、蒸留水に再び溶解し、そして濃度を２６０ｎｍでのＵＶ吸光度から測定した。すべてのオリゴは、純度および分子量の夫々をＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計(Applied Biosystem's Voyager-DETM STR BiospectrometryTM Workstation)によって特徴付けた。全長のオリゴの純度は９０〜９６％の範囲であり、残りは、ＣＧＥおよび／または変性ＰＡＧＥによって測定すると、１または２ヌクレオチド短い（ｎ−１およびｎ−２）。全てのオリゴは、Limulus assay (Bio-Whittaker now known as Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MD)によって測定し、＜０．１ＥＵ／ｍＬよりも少ないエンドトキシンを含んでいた。
【０１０２】
熱融解（thermal melting）の調査は、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むｐＨ７．２±０．２の１０ｍＭ リン酸水素二ナトリウムの１ｍＬにおいて行った。該溶液を９５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと室温になるように放置して、４℃で一晩貯蔵した。オリゴヌクレオチド鎖の終濃度は、２．０μＭであった。ＵＶ熱融解測定は、ペルチェ熱コントローラーとパーソナルコンピュータの付属したPerkin-Elmer Lambda 20 Spectrophotometerによって２６０ｎｍで、１ｃｍ経路長石英キュベットを用いて、加熱速度０．５℃／分にて行った。融点（Ｔｍ）を半解離の温度として取り、一次導関数のプロットを得た。各Ｔｍ値は、２または３つの独立した実験の平均であり、値は±１．０℃以内である。
【０１０３】
'GACGTT'のヘキサマーモチーフを含む１７マーのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（１）をポジティブコントロールとして用いた（表１）。オリゴヌクレオチド２〜７は、オリゴヌクレオチド１の部分に相補的な５、１１または１７のヌクレオチドの付加配列を含む（表１）。伸張は3'末端（２〜４）または5'末端（５〜７）に結合し、Hirao,I.,et al.(Nucleic Acids Res. 22: 576-582 (1994))に記載のとおり、安定なステムループを形成可能なGAAトリマーを含む。オリゴヌクレオチド２〜７のヘアピンの形成は、ＵＶ熱融解実験で測定した。１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸ナトリウム中、４０〜６６℃のＴｍ値は、オリゴヌクレオチド２〜７が実験条件下で安定な二次構造を形成したことを示している（表１）。かかる条件は、形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cells）におけるインターフェロンα（ＩＦＮ−α）を１０μｇ／ｍｌでオリゴ１８、１９、２０および２１に曝した後の条件である。
【０１０４】
例２：細胞培養条件および試薬
４〜８週齢のBALB/c、C57BL/6またはC3H/HeJマウス由来の脾臓細胞を、Zhao,Q.,et al.(Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996))およびBranda,R.F.,etal.(Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993))に記載のとおり、RPMI完全培地にて培養した。マウスJ774マクロファージ(American Type Culture Collection, Manassas, VA)を１０％（v/v）ウシ胎仔血清および抗生物質（ペニシリンＧ／ストレプトマイシン １００ＩＵ／ｍＬ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。他のすべての試薬は、Mediatech (Gaithersburg, MD)から入手した。
【０１０５】
例３：脾臓細胞増殖アッセイ
典型的には、マウス（Balb-C）脾臓細胞を、０．１、１．０および１０．０μｇ／ｍｌの濃度のＣｐＧオリゴと共に４８時間培養し、細胞増殖をZhao,Q.,et al.(Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996))に記載のとおり、３Ｈ−ウリジン取り込みにより測定される。
【０１０６】
はじめに、オリゴ１、２および５を、それらの培養中におけるBALB/cマウス脾臓細胞の増殖を誘導する能力について試験した。オリゴ１および２は、用量依存的な脾臓細胞増殖を誘導した。ステムループをもたない、もとの（parent）オリゴ１は、１．０μｇ／ｍＬの濃度で、増殖指数６．０±０．３を示した（図１Ａ）。3'末端でステムループ構造を形成するオリゴ２は、同じ濃度で、増殖指数９．０±２．５を示した。しかしながら、5'末端にステムループを形成するオリゴ５は、同じ濃度で、より低い増殖指数１．５±０．３を示し、これはＰＢＳコントロールのそれと同様であった（図１Ａ）。
【０１０７】
例４：サイトカイン誘導アッセイ
マウス脾臓細胞またはJ774細胞を、それぞれ５×１０６または１×１０６細胞／ｍＬを用いて、２４ウェルディッシュに播いた。ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解したＣｐＧオリゴを、細胞培養に対し、終濃度０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬで添加した。次いで細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡアッセイ用に集めた。実験は、各ＣｐＧオリゴに対し２または３回行い、各濃度で３回行った。ＩＬ−２およびＩＬ−６の分泌は、Bhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003))に記載のとおり、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標品を含む必要な試薬は、BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA)から入手した。
【０１０８】
ＣｐＧオリゴは、ＩＬ−１２およびＩＬ−６を含む多数のサイトカインを誘導する。BALB/cマウス脾臓細胞培養において、試験化合物１および２は、濃度依存メカニズムによって、ＩＬ−１２およびＩＬ−６を誘導した。もとのオリゴ１は、３．０μｇ／ｍＬの濃度で、１５１４±１１３ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２および７６８１±８３９ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を誘導した（図２）。3'ヘアピンを含むオリゴ２は、わずかに多くのＩＬ−１２（１７７１±２８６ｐｇ／ｍＬ）および少ないＩＬ−６（２５８２±３００ｐｇ／ｍＬ）を誘導した。しかしながら、5'ヘアピンを有するオリゴ５は、サイトカイン分泌を誘導しなかった。これらの結果は、3'末端ではなく5'末端の安定的なヘアピンループによって、免疫賦活活性がブロックされることが示された。
【０１０９】
ＣｐＧ ＤＮＡ３および４は、GACGTTモチーフに広がるかまたは5'末端まで伸張する3'ヘアピンステムを有する。この結果、それらは２つのＣｐＧモチーフ、トップ鎖にGACGTT、その相補配列AACGTCを下に含む（表１）。オリゴ６および７は同様の長い5'ヘアピンを有する。２つのＣｐＧモチーフを有するにもかかわらず、オリゴ３および４は、オリゴ１に比べ、より少ないＩＬ−１２を誘導し、ＩＬ−６を最小限誘導するかまたは全く誘導しない（図２）。5'ヘアピンを備えたオリゴ６および７の両方が、同じ実験条件下でサイトカイン分泌を誘導しなかった。オリゴ４による最小限のサイトカインの誘導によって、5'末端へのステム構造の伸張が有害で、おそらく認識と続く免疫賦活化を阻害することが示される。これらの結果は、5'末端に伸張する二重鎖のステム構造が免疫賦活化を阻害することを示している。
【０１１０】
オリゴ４の5'末端での塩基対化は免疫賦活化を抑制するので、両末端での二重鎖形成をＣｐＧ ＤＮＡ８〜１０を用いて調査した。オリゴ８は１８ヌクレオチドを含み、オリゴ１と同じGACGTTモチーフを含む。オリゴ９および１０の自己相補的3'伸張または5'伸張は、付着末端のように、８塩基対のダイマーを形成するように作用する（表１）。
これらの二重鎖はホスホジエステル連鎖を含み、免疫賦活化への任意の長さ依存的ホスホロチオエート効果を低減する。オリゴ９は、3'末端でダイマー化し、もとのオリゴ８と同様のＩＬ−１２およびＩＬ−６の誘導を示した（図３）。しかしながら、5'二重鎖を形成するオリゴ１０は最小限のＩＬ−１２およびＩＬ−６を誘導した（図３）。したがって、5'二重鎖を形成するという特徴は、免疫賦活の消失と強い相関がある。これらの結果は、3'末端ではなく5'末端での二重鎖が、免疫賦活化を阻害することを示している。
【０１１１】
J774細胞培養においてサイトカイン分泌を誘導するオリゴ１〜７の能力もまた調査した。オリゴ濃度１０μｇ／ｍＬで得たＩＬ−１２およびＩＬ−６のデータ（図５）は、脾細胞培養アッセイで得た結果を補足する。これらの結果によってさらに、レセプターがＣｐＧ ＤＮＡ配列を、その5'末端から読み、アクセス可能な5'末端がＣｐＧ ＤＮＡ活性には要求されることが確認された。ＣｐＧオリゴの5'末端に伸張する二次構造の存在は、レセプターの読み込みとそれによる免疫賦活活性を阻害し得る。
【０１１２】
本発明のオリゴヌクレオチドの、形質樹状細胞におけるインターフェロンα（ＩＮＦ−α）の産生する能力についても調べた。これらの細胞の単離および培養のため、Krug, A., et al. (Eur. J. Immunol, 31: 2154- 2163 (2001)を参照せよ。結果を図６、７および８に示す。これらのデータは、3'ヘアピン構造を備えた本発明の核酸分子が、インターフェロンαの産生を賦活化し、5'末端ヘアピン構造が免疫賦活活性、すなわちこれら分子のインターフェロンαの産生を阻害することを示す。
【０１１３】
例５：マウス脾腫アッセイ
雌BALB/cマウス（４〜６週齢、１９〜２１ｇｍ）を３匹のマウスのグループに分けた。ＣｐＧオリゴを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、マウスに５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下（ＳＣ）投与した。Zhao,Q.,et al.(BiochemPharmacol. 51: 173-182 (1996))およびBranda, R.F.,et al.(Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993))に記載のとおり、マウスを４８時間後に安楽死させ、脾臓を回収し、重さを量った。
【０１１４】
オリゴヌクレオチド１、２および５をBALB/cマウスに５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、それらがインビボで脾腫肥大を誘導するかについて測定した。ＰＢＳを注射したコントロール群に比較し、オリゴ処置に応答した脾臓の重量の増大は、ＣｐＧオリゴの免疫賦活活性の結果であると考えられる（Zhao, Q., et al. Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996); Branda, R. F., et al. Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993)）。インビボでの調査の結果を図１Ｂに示す。ステムループ構造をもたないオリゴ１および5'末端にステムループ形成配列を有するオリゴ５は、ＰＢＳを受けたコントロール群と比べ、それぞれ約２９％および約１５％の脾臓の重量が増加した。これに対し、3'末端にステムループ構造を有するオリゴ２は、コントロール群に比べ、脾臓の重量の約４８％の増大を引き起こした。
【０１１５】
例６：ＮＦ−κＢ経路の活性化
トール様レセプター９（ＴＬＲ９）は、細菌のプラスミドおよび合成ＤＮＡで非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド(Hemmi H. , et al. Nature 408 : 740-745 (2000))、および活性ストレスキナーゼ(Yi A. K., et al. J. Immunol. 161: 4493- 4497 (1998))、およびＮＦ−κＢ経路(Stacey K. J., et al. J. Immunol. 157: 2116-2122 (1996))を認識することが示されてきた。ＣｐＧ ＤＮＡで処理したJ774細胞におけるＮＦ−κＢ活性は、Yu D., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90 (2002))およびBhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003))に記載のとおり、EMSAで行われ、分析された。
【０１１６】
J774におけるＮＦ−κＢ経路のオリゴ１〜７による活性化は、EMSAを用いて、マウスマクロファージ細胞核抽出物において調査した。図４は、得られた結果を示す。もとのオリゴ１および８の両方が、複合体の存在により示されたとおり、ＮＦ−κＢを活性化した。3'末端にループを有するオリゴ２〜４もまた適当な複合体の存在により示されるように、ＮＦ−κＢを活性化した。これに対し、5'末端ループオリゴ５〜７は、J774細胞において転写因子ＮＦ−κＢを活性化しなかった（図４）。コントロールの非ＣｐＧオリゴは、同じ実験条件下でＮＦ−κＢを活性化しなかった（レーンＣ）。これらの結果は、マウス脾臓細胞培養アッセイにおいて得られたデータと一致する。
【０１１７】
例７：電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）
約０．２ＯＤのＣｐＧ ＤＮＡおよび他のマーカーを２５μＬの１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２バッファーに溶解し、９０℃で１５分間加熱し、室温まで放置し、ゲルで分析するまで４℃で貯蔵した。調製したＤＮＡサンプルをグリセロールバッファーと混合し、１５％非変性ポリアクリルアミドゲルに溶解した。ゲルを２６０ｎｍＵＶ光で可視化した。
【０１１８】
例８：ヒトＢ細胞および形質樹状細胞（ｐＤＣ）の単離
新鮮に採取された健常なボランティアの血液のＰＢＭＣ(CBR Laboratories, Boston, MA)をフィコール密度勾配遠心分離法(Histopaque-1077, Sigma)で単離し、ＰＢＭＣからＢ細胞を、製造者の説明書にしたがいＣＤ１９細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて、ポジティブ選択によって単離した。
【０１１９】
例９：Ｂ細胞増殖アッセイ
１×１０５Ｂ細胞／２００μｌの全量を０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬのＣｐＧ ＤＮＡ濃度で６４時間賦活化し、次いで０．７５μＣｉの[3H]−チミジンを添加し、８時間後に回収した。放射線の取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。表４は、終濃度１０．０μｇ／ｍＬでの６ＣｐＧ ＤＮＡに対するＢ細胞増殖の平均±ＳＤを示す。
【０１２０】
表４ イムノマー構造およびヒトＢ細胞増殖アッセイにおける免疫賦活活性（７２時間）
【表８】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す。
【０１２１】
例１０：ヒトｐＤＣ培養およびＩＦＮ−αのＥＬＩＳＡ
ｐＤＣは、BDCA-4細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用い、製造者の説明書にしたがい、ヒトＰＢＭＣから単離した。ｐＤＣを１×１０６細胞／ｍＬを用いて２００μＬ／ウェルで、９６ウェルプレートに播いた。オリゴヌクレオチドは、終濃度０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬで細胞培養に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで上清を回収し、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１０をＥＬＩＳＡキット(PBL)を用いてアッセイした。表５Ａおよび５Ｂは、１０．０μｇ／ｍＬの濃度での６オリゴヌクレオチドに対する平均±ＳＤを示す。
【０１２２】
表５Ａ イムノマー構造およびヒト樹状細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表９】
【０１２３】
【表１０】
【０１２４】
【表１１】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【０１２５】
表５Ｂ イムノマー構造およびヒト樹状細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１２】
【０１２６】
【表１３】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-リボヌクレオシドを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【０１２７】
例１１：サイトカインアッセイ
脊椎動物細胞、好ましくはBALB/cマウス脾臓細胞またはヒトＰＢＭＣにおけるＩＮＦ−２およびＩＬ−６の分泌は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体およびサイトカイン標品を含む必要な試薬は、PharMingen, San Diego, CAから入手した。ＥＬＩＳＡプレート(Costar)を、ＰＢＳＮバッファー（ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中、５μｇ／ｍＬの適当な抗体と４℃で一晩インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックした。細胞培養上清およびサイトカイン標品をＰＢＳ／１０％ＦＢＳで適当に希釈し、３つプレートに添加し、そして２５℃で２時間インキュベートした。１μｇ／ｍＬで適当なビオチン化抗体を重ね、２５℃で１．５時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔバッファー（ＰＢＳ／０．０５％ Tween 20）で広範に洗浄し、ペルオキシダーゼ(Sigma, St. Louis, MO)を結合したストレプトアビジンを添加後、さらに２５℃で１．５時間インキュベートした。プレートを発色試薬を含むSure Blue（登録商標）(Kirkegaard and Perry)で現像し、反応を停止液(Kirkegaard and Perry)を添加することにより止まった。色の変化をCeres 900 HDI Spectrophotometer (Bio-Tek Instruments)で測定した。
【０１２８】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常なボランティアの末梢血から、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離(Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)によって単離した。簡単には、ヘパリン処理した血液をHistopaque-1077（等容量）にコニカル遠心管において積層し、４００×ｇで３０分間、室温で遠心分離した。単核細胞を含む軟膜を慎重に除去し、等張のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２５０×ｇで１０分間遠心分離することにより２回洗浄した。次いで、得られた細胞ペレットをＬ−グルタミンを含むin RPMI 1640培地(MediaTech, Inc., Herndon, VA)に再懸濁し、１０％加熱不活性化ＦＣＳおよびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加した。細胞を１×１０６細胞／ｍｌ／ウェルで２４ウェルプレートで、オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で種々の期間培養した。インキュベーション期間の終わりに、上清を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡでＩＬ−６(BD Pharmingen, San Diego, CA)およびＩＦＮ−α(BioSource International)を含む種々のサイトカインをアッセイするまで、−７０℃で貯蔵した。結果を以下の表６Ａおよび６Ｂに示す。
【０１２９】
全ての場合に、細胞培養上清におけるＩＦＮ−２およびＩＬ−６のレベルは、ＩＦＮ−２およびＩＬ−６のそれぞれ同じ実験条件下で作成した標準曲線から計算した。
【０１３０】
表６Ａ イムノマー構造およびヒトPBMCアッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１４】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMe-リボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【０１３１】
表６Ｂ イムノマー構造およびヒトPBMCアッセイにいおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１５】
【０１３２】
【表１６】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【０１３３】
例１２：Ｂ細胞アッセイ
Ｂ細胞を、１×１０６細胞／ｍＬ、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播いた。オリゴヌクレオチドを終濃度０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬで細胞培養物に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、上清を採取し、ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ提供）を用いてＩＬ−６に対してアッセイした。表７は、終濃度１０．０μｇ／ｍＬでオリゴヌクレオチドを加えたドナー５〜１０に対する平均±ＳＤを示す。
【０１３４】
表７ イムノマー構造およびヒトＢ細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１７】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【０１３５】
フローサイトメトリーアッセイ
細胞表面マーカーのＣＤ６９およびＣＤ８６をBD Pharmingen (San Diego, USA)から購入した抗ヒトＣＤ６９−FitcおよびＣＤ８６−Fitcを用いて、Coulter Epics- XL Flow Cytometerで検出した。染色方法を次に簡単に示す。活性化した培養細胞を、染色バッファー（１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３のＰＢＳ）中、１０％ヒトＡＢ血清(Sigma)で、４℃１時間ブロックし、抗体で４℃一晩染色した。ＰＢＭＣ（４×１０５）をＣＤ６９−FitcおよびＣＤ８６−Fitcで染色した。ＰＤＣ（２×１０５）をＣＤ８６−Fitcで染色した。細胞染色データは、Coulter System IIソフトウェアで取得し、分析した。
【０１３６】
表８ イムノマー構造およびヒトPBMCからのBCの発現（２４時間）
【表１８】
【０１３７】
【表１９】
【０１３８】
【表２０】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【０１３９】
表９ イムノマー構造およびヒトPBMCからのDCの発現（２４時間）
【表２１】
【０１４０】
【表２２】
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【０１４１】
均等
前述の発明を、明確さと理解のためにある程度詳細に記述したが、この開示を読んだ当業者には、本発明の真の範囲および付属のクレームから乖離することなく、形態および詳細についての種々の改変が可能であることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、免疫賦活核酸であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
ここで前記オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する、前記免疫賦活核酸。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約５０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項３】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約２６ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド配列が、3'末端ステムループ二次構造を形成する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項５】
オリゴヌクレオチド配列が、3'末端に回文配列または相補配列を有する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項６】
配列番号２、３、４、９、１２、１３、１４、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項７】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、低減された免疫賦活活性を有する免疫賦活核酸であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
ここで前記オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の5'末端に二次構造を有する、前記免疫賦活核酸。
【請求項８】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約５０ヌクレオチド長である、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約２６ヌクレオチド長である、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド配列が、5'末端ステムループ二次構造を形成する、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド配列が、5'末端に回文配列または相補配列を有する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１２】
配列番号５、６、７、１０、１５、１６および１７からなる群から選択される、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１３】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を低減または消失する方法であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、そして
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
前記オリゴヌクレオチド配列の5'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む、前記方法。
【請求項１４】
二次構造が、ステムループ構造である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
二次構造が、回文配列または相補配列との水素結合である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の免疫賦活核酸および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項７に記載の免疫賦活核酸および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活核酸であって、該免疫賦活核酸は二次構造を有し、そして該免疫賦活核酸は一般構造：
ＤｏｍａｉｎＡ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＤｏｍａｉｎＣ （Ｉ）
を含み、
式中、ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよく、
ＤｏｍａｉｎＢは、ＤｏｍａｉｎＡおよびＣを結びつけるリンカーで、3'-5'連鎖、2'-5'連鎖、3'-3'連鎖、ホスフェート基、ヌクレオシドまたは、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコールまたは複素環部分であってもよい非ヌクレオシドリンカーであり、
ＤｏｍａｉｎＣは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ Poly I-Poly Cであってもよい、前記免疫賦活核酸。
【請求項１９】
配列番号１〜３８からなる群から選択される配列を有する、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【請求項２０】
配列番号３９〜６８からなる群から選択される配列を有する、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、免疫賦活核酸であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
ここで前記オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する、前記免疫賦活核酸。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約５０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項３】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約２６ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド配列が、3'末端ステムループ二次構造を形成する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項５】
オリゴヌクレオチド配列が、3'末端に回文配列または相補配列を有する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項６】
配列番号２、３、４、９、１２、１３、１４、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項７】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、低減された免疫賦活活性を有する免疫賦活核酸であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
ここで前記オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の5'末端に二次構造を有する、前記免疫賦活核酸。
【請求項８】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約５０ヌクレオチド長である、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約２６ヌクレオチド長である、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド配列が、5'末端ステムループ二次構造を形成する、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド配列が、5'末端に回文配列または相補配列を有する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１２】
配列番号５、６、７、１０、１５、１６および１７からなる群から選択される、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１３】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を低減または消失する方法であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、そして
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
前記オリゴヌクレオチド配列の5'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む、前記方法。
【請求項１４】
二次構造が、ステムループ構造である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
二次構造が、回文配列または相補配列との水素結合である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の免疫賦活核酸および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項７に記載の免疫賦活核酸および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活核酸であって、該免疫賦活核酸は二次構造を有し、そして該免疫賦活核酸は一般構造：
ＤｏｍａｉｎＡ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＤｏｍａｉｎＣ （Ｉ）
を含み、
式中、ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよく、
ＤｏｍａｉｎＢは、ＤｏｍａｉｎＡおよびＣを結びつけるリンカーで、3'-5'連鎖、2'-5'連鎖、3'-3'連鎖、ホスフェート基、ヌクレオシドまたは、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコールまたは複素環部分であってもよい非ヌクレオシドリンカーであり、
ＤｏｍａｉｎＣは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ Poly I-Poly Cであってもよい、前記免疫賦活核酸。
【請求項１９】
配列番号１〜３８からなる群から選択される配列を有する、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【請求項２０】
配列番号３９〜６８からなる群から選択される配列を有する、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１１−２００２４８（Ｐ２０１１−２００２４８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２２４５６（Ｐ２０１１−１２２４５６）
【出願日】平成２３年５月３１日（２０１１．５．３１）
【分割の表示】特願２００６−５３３７６０（Ｐ２００６−５３３７６０）の分割
【原出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月３１日（２０１１．５．３１）
【分割の表示】特願２００６−５３３７６０（Ｐ２００６−５３３７６０）の分割
【原出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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