小型ＲＮＡを検出する方法
【課題】被験試料に含まれる鎖長が２００ヌクレオチド以下と短く、配列は非常に類似する、非常に微量な小型ＲＮＡを高感度、かつ高精度に検出できる方法を提供する
【解決手段】担体表面に凹凸部を有し、該凹凸部の凸部の頂面に選択結合性物質が固定化された選択結合性物質固定化担体を用いて、被験試料に含まれる小型ＲＮＡを検出する方法であって、該小型ＲＮＡまたは該小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの少なくとも一方の末端に標識物質を結合させた標識体を選択結合性物質と反応させることにより小型ＲＮＡを検出する。
【解決手段】担体表面に凹凸部を有し、該凹凸部の凸部の頂面に選択結合性物質が固定化された選択結合性物質固定化担体を用いて、被験試料に含まれる小型ＲＮＡを検出する方法であって、該小型ＲＮＡまたは該小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの少なくとも一方の末端に標識物質を結合させた標識体を選択結合性物質と反応させることにより小型ＲＮＡを検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡおよびｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ分子のような小型ＲＮＡを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）とは、タンパク質をコードしないＲＮＡの総称であり、ハウスキーピングＲＮＡと調節系のＲＮＡとに大別される。前者のハウスキーピングＲＮＡとしては、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、スプライシングに関与する核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｒＲＮＡの修飾に関与する核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）等が知られている。一方、後者の調節系ＲＮＡについては、生体機能の解明に重要な機能を果たしている因子として、近年特に注目を集めているものであり、遺伝子発現やＲＮＡの細胞内分布を調節し遺伝子発現抑制機構に重要な役割を担っていることが最近になって明らかにされつつある。この調節系ＲＮＡが機能する遺伝子発現抑制機構は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれ、１９８８年に線虫を用いた実験で明らかにされ、その後、ショウジョウバエや哺乳類細胞でも同様の機構の存在が明らかとなった。この調節系ＲＮＡとしてのｎｃＲＮＡは、鎖長がおよそ２０〜２５塩基であり、その作用機序は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）による翻訳抑制と、ｓｎａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による標的ｍＲＮＡの切断及び標的ＤＮＡ領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシングとに大別される。
【０００３】
ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡからヘアピン様構造のＲＮＡ（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素（Ｄｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、ｍｉＲＮＡは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、ｍｉＲＮＡをターゲット（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。ｍｉＲＮＡは１５〜２５塩基のＲＮＡからなり、様々な生物でその存在が確認されている。
【０００４】
一方、ｓｉＲＮＡは、ウイルス、トランスポゾン、トランスジーン、内在性ｄｓＲＮＡ等の長鎖ｄｓＲＮＡから、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素（Ｄｉｃｅｒ）により切り出される。その後、ｄｓＲＮＡの片方のアンチセンスＲＮＡが、ＲＩＳＣ、又はＲＩＴＳと称するタンパク質複合体に取り込まれ、複合体としてｍＲＮＡの分解又は転写抑制に関与する。従って、ｓｉＲＮＡの取り得る態様としては、ｄｓＲＮＡとしての二本鎖の状態、ＲＩＳＣとの複合体を形成している一本鎖の状態もあるので、通常、ｓｉＲＮＡをターゲット（検出対象）とする場合は、長鎖ｄｓＲＮＡ、切断後のｓｉＲＮＡ、又は一本鎖等の各種形態を考慮する必要がある。
【０００５】
ところで、一般に、核酸固定化基板（ＤＮＡチップ）を用いた発現解析では、数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブが固定された基板を用いて被験試料をＤＮＡチップに添加することによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被験試料中の遺伝子量を知ることができる。ＤＮＡチップ上に固定化するプローブに対応した遺伝子の選択は自由である。しかしながら、検出対象が上記の小型ＲＮＡの場合、細胞又は組織に含まれる上記の小型ＲＮＡは鎖長が２００ヌクレオチド以下と短く、また配列は非常に類似するため、ＤＮＡチップ上で特異的に上記の小型ＲＮＡを区別することは難しく、さらに細胞又は組織に含まれる上記の小型ＲＮＡは微量であるため、高感度に上記の小型ＲＮＡを区別することは難しい。
【０００６】
従って、上記の小型ＲＮＡの短い鎖長の核酸を検出し解析しようとする分野においては、高感度かつ高精度に上記の小型ＲＮＡを検出できる有効な技術の確立が急務の課題となっている。
【０００７】
その解決策の一つとして、上記の小型ＲＮＡに含まれるグアニン塩基を特異的に認識するプローブを用いて上記の小型ＲＮＡを標識した被験試料をＤＮＡチップに添加してｍｉＲＮＡを測定する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、通常、上記の小型ＲＮＡに含まれるグアニン塩基の位置は多様であり、上記の小型ＲＮＡに含まれるグアニン塩基の数は一定でないため、上記の小型ＲＮＡに含まれるグアニン塩基の数によっては検出が困難な上記の小型ＲＮＡが生じる。
【０００８】
また上記の小型ＲＮＡの３’末端にアミノ修飾されたアデニン塩基を酵素的に複数個付加し、付加したアミノ修飾済みアデニン塩基にプローブを標識した被験試料をＤＮＡチップに添加してｍｉＲＮＡを測定する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、３’末端へ付与されるアデニン塩基数にはバラツキが存在し、上記の小型ＲＮＡへ標識されるプローブ数は一定にならないため、上記の小型ＲＮＡへの３’末端へ付与されるアデニン塩基数によっては検出が困難なｍｉＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ等が生じる。
【０００９】
また、上記の小型ＲＮＡを脱リン酸化した３’末端にプローブが１つ標識された１つのシトシン塩基を付加した被験試料をＤＮＡチップに添加してｍｉＲＮＡを測定する方法などが提案されている（例えば、特許文献３、非特許文献１参照）。しかしながら、通常、一個のシトシン塩基の大きさは小さく、標識するプローブの大きさは大きいため、１個のグアニン塩基を付与するだけでは標識プローブの立体障害によって検出が困難な上記の小型ＲＮＡが生じる。また、上記の小型ＲＮＡは微量のため、１個のプローブの標識だけでは十分に強いシグナルが得られず検出が困難な上記の小型ＲＮＡが生じる。
【００１０】
また、ビオチン標識したランダムプライマーを用いて小型ＲＮＡを逆転写し、ビオチン標識した相補ＤＮＡを検出する方法（非特許文献２参照）が知られているが、５μｇの被験資料を必要とするため、被検資料によっては測定できない場合もある。
【００１１】
また小型ＲＮＡの３’末端を化学修飾し、ビオチン化して検出する方法（非特許文献３参照）が知られているが、修飾の作業工程が多いため測定ノイズが入ってしまう。
【特許文献１】米国特許第６，２６２，２５２号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／１１８８０６号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０１７２８４５号明細書
【非特許文献１】「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，２００４，Ｖｏｌ.３２，Ｎｏ.１１，ｅ８６
【非特許文献２】「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」，Ｊｕｎｅ ２９,２００４，ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．２６，９７４０−９７４４
【非特許文献３】「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，２００５,Ｖｏｌ.３３(Ｎｏ．２)，ｅ１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の解決しようとする課題は、被験試料に含まれる鎖長が２００ヌクレオチド以下と短く、配列は非常に類似する、非常に微量な上記の小型ＲＮＡを高感度、かつ高精度に検出できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の特徴を有する。
【００１４】
本発明は第一の実施態様において、担体表面に凹凸部を有し、該凹凸部の凸部の頂面に選択結合性物質が固定化された選択結合性物質固定化担体を用いて、被験試料に含まれる小型ＲＮＡを検出する方法であって、該小型ＲＮＡまたは該小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの少なくとも一方の末端に標識物質を結合させた標識体を選択結合性物質と反応させることを特徴とする、小型ＲＮＡを検出する方法である。
【００１５】
また別の実施形態において、前記標識体が、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの３’末端に標識物質を結合させた標識体である、小型ＲＮＡを検出する方法である。
【００１６】
また別の実施形態において、前記標識体が、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの３’末端にリンカー配列を介して標識物質を結合させた標識体である、小型ＲＮＡを検出する方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、微量のＲＮＡサンプルに含まれる小型ＲＮＡを高いＳ／Ｎ比で検出する方法を提供するものであり、これにより小型ＲＮＡを高感度に検出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明をさらに具体的に説明する。
【００１９】
本明細書において小型ＲＮＡとは、脊椎動物、ホヤ類、半索類、軟体動物類、環形動物および節足動物を含む多くの進化的に分岐した生物種を構成する２００塩基長未満の範囲であるＲＮＡを意味する。また、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は小型ＲＮＡに含まれる１５〜２５塩基の一本鎖ＲＮＡであり、様々な生物でその存在が確認されている。
【００２０】
本明細書において、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。さらに「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含する核酸として用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【００２１】
本発明の小型ＲＮＡを検出する方法は、担体表面に固定化された選択結合性物質に、その選択結合性物質と反応する小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを含む溶液を接触させ、接触した状態を観察することで小型ＲＮＡを検出する。
【００２２】
相補配列（相補鎖、逆鎖）とは、小型ＲＮＡを構成する塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
【００２３】
本発明において、選択結合性物質固定化担体としては、例えば特開２００６-７８１９７号公報に記載のものを用いることができるで。
【００２４】
選択結合性物質とは、被験試料に含まれる小型ＲＮＡと直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味する。本発明の小型ＲＮＡを検出する方法においては、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【００２５】
特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。選択結合性物質として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。
【００２６】
検出したい小型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）であっても良い。その情報は例えば、http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtmlにアクセスすることで知ることができる。目的とするｍｉＲＮＡを検出するには、検出対象のｍｉＲＮＡと相補な配列を有する核酸を選択結合性物質として用いればよい。
【００２７】
小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡは、被験試料に含まれる小型ＲＮＡを、逆転写酵素などを用いて得ることができる。
【００２８】
本明細書において検出・診断対象となる被験試料としては、組織試料、生物体全体、細胞培養物、または体液などからなる天然源等が挙げられる。
【００２９】
本発明では、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡの相補配列を有するＤＮＡ少なくとも３’末端または５’末端のいずれかに標識物質を結合させることで標識した標識体を用いる。好ましくは、３’末端に標識物質を結合させる。標識物質の結合には酵素反応、化学反応などを用いることができる。好ましくは、酵素を用いて反応させる。さらに好ましくは、小型ＲＮＡの３’末端に標識体を結合させる。
【００３０】
標識物質は、少なくとも２つ以上の核酸の重合体であるリンカー配列を含んでいても良い。酵素反応には、Ｔ４ ＲＮＡ ＬｉｇａｓｅやＴｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｉｔｉｄｉｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｐｏｌｙ Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを用いても良い。
【００３１】
本発明において、使用できる標識物質としては、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられる。
【００３２】
蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いることができる。
【００３３】
また、標識体として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、シルバーインジウム硫化亜鉛（ＡｇＩｎＺｎＳ）などが挙げられる。
【００３４】
小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの末端へ標識体を結合させる方法は、酵素反応を用いて行うことができる。酵素反応として、Ｔ４ＲＮＡＬｉｇａｓｅを用いることも好ましい。
【実施例】
【００３５】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
（ＤＮＡチップ）
選択結合性物質固定化担体として「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」（東レ株式会社；ＴＲＴ-ＸＲ３１１）を用いた。
【００３７】
（ＲＮＡの標識）
末端に標識物質を結合させる方法として、「ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｈｙ５ Ｐｏｗｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ」（エキシコン社；２０８０３０-Ａ）を用いた。被験試料には、ｍｉＲＮＡの含有が確認されたＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ＡＢＩ社；ＡＭ７９６０）を用いた。上述のｔｏｔａｌＲＮＡ １００ｎｇ、３００ｎｇ、５００ｎｇ、１０００ｎｇのそれぞれについて、メーカー推奨のプロトコールでｍｉＲＮＡを標識した。
【００３８】
（ハイブリダイゼーション）
全ての標識済みｍｉＲＮＡをそれぞれ「ハイブリダイゼーションバッファー」（東レ株式会社；ＴＲＴ-ＸＲ３０１）に溶解し、３７℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び４２℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した条件で洗浄した。
【００３９】
（遺伝子発現量の測定）
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＤＮＡチップスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ、パーキンエルマージャパン）を用いてスキャンし、画像を取得してＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ５．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）にて蛍光強度を数値化した。統計学的処理は「Ｓｐｅｅｄ Ｔ．著，「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ」，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ／ＣＲＣ」及び「Ｃａｕｓｔｏｎ Ｈ．Ｃ．ら著「Ａｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ」を参考にして行った。すなわち、ハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、各々のｍｉＲＮＡについてシグナル強度を算出した。
【００４０】
「３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」（東レ株式会社；ＴＲＴ-ＸＲ３１１）は約８００種のマイクロＲＮＡを検出することができるが、この中から配列番号１，２，３，４で表されるＲＮＡを選択し解析に用いた。
【００４１】
その結果を「Ａｒｒａｙ３」として図１，２，３，４、５に示す。配列番号１のＲＮＡの結果を図１に、配列番号２のＲＮＡの結果を図２、配列番号３のＲＮＡの結果を図３、配列番号４のＲＮＡの結果を図４に示す。図５に実施例および比較例１、比較例２のノイズの値を示している。比較例１、および比較例２については後述する。
【００４２】
各図は実施例１および比較例１、２の結果から得られたシグナル強度を縦軸にした棒グラフで表している。左からＡｒｒａｙ１-１０００ｎｇ（比較例１）、Ａｒｒａｙ２-３０００ｎｇ（比較例２）、Ａｒｒａｙ３-１００ｎｇ（実施例１においてｔｏｔａｌＲＮＡが１００ｎｇの場合）、Ａｒｒａｙ３-３００ｎｇ（実施例１においてｔｏｔａｌＲＮＡが３００ｎｇの場合）、Ａｒｒａｙ３-５００ｎｇ（実施例１においてｔｏｔａｌＲＮＡが５００ｎｇの場合）、Ａｒｒａｙ３-１０００ｎｇ（実施例１においてｔｏｔａｌＲＮＡが１０００ｎｇの場合の結果を示している。）の結果を示す。
【００４３】
図１，２，３，４から、実施例においてはｔｏｔａｌＲＮＡの量が増加するにしたがってシグナル強度が増加していることがわかる。また、ノイズの値はｔｏｔａｌＲＮＡの量に関係しないことが図５から分かる。
【００４４】
比較例１
凹凸部が設けられていない平坦なガラス基板で作成されたＤＮＡチップの場合と比較した。
【００４５】
基板として、「ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライドガラス」（松浪硝子）を用いた。以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。配列番号１、２，３，４のＲＮＡと相補配列のＤＮＡ（約２０塩基、５’末端アミノ化）を合成した。この配列番号１，２，３，４のＲＮＡと相補配列のＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。このオリゴヌクレオチドを、終濃度が０．０３ｎｍｏｌおよびμＬとなるようにＤＮＡマイクロアレイ用ＳｐｏｔｔｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ（松浪硝子）に溶解した。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；ＧｅｎｅＳｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、計４点スポットした。以上のようにして得られた分析用チップを、「Ａｒｒａｙ１」とした。
【００４６】
ＲＮＡの標識は、「ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｈｙ５ Ｐｏｗｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ」（エキシコン社；２０８０３０-Ａ）を用いた。被験試料には、ｍｉＲＮＡの含有が確認されたＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ ＴｏｔａｌＲＮＡ（ＡＢＩ社；ＡＭ７９６０）を用いた。上述のｔｏｔａｌＲＮＡ１０００ｎｇを用いた。ハイブリダイゼーションは、マイクロピペットを用いてＡｒｒａｙ１のオリゴヌクレオチドがスポットされた面にアプライした。ギャップカバーガラス（松浪硝子）を被験試料溶液がアプライされた面に載せて、ハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットし、３７℃で１６時間反応させた。遺伝子発現量の測定は実施例と同様である。その結果を図１，２，３，４、５に「Ａｒｒａｙ１-１０００ｎｇ」として示す。
【００４７】
図１，２，３，４から分かるように、Ａｒｒａｙ１-１０００ｎｇのシグナル強度は、実施例におけるｔｏｔａｌＲＮＡが３００ｎｇの場合よりも低い。また、図５からノイズの値が同等であることから、実施例１は比較例１より少ないｔｏｔａｌＲＮＡ量を用いても高いＳ／Ｎ比で検出することができているといえる。
【００４８】
比較例２
異なる標識方法との比較として、グアニン塩基を特異的に認識して標識する方法を比較した。標識にはＬａｂｅｌ ＩＴｍｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ，Ｃｙ５（タカラバイオ社；Ｖ８６１０）を用い、上述のｔｏｔａｌＲＮＡ３０００ｎｇについて、メーカー推奨のプロトコールでｍｉＲＮＡを標識した。標識方法以外は実施例１と同様である。その結果を図１，２，３，４、５に「Ａｒｒａｙ２-３０００ｎｇ」として示す。
【００４９】
図１，２，３，４から分かるように、Ａｒｒａｙ２-３０００ｎｇのシグナル強度は、実施例においてｔｏｔａｌＲＮＡが１０００ｎｇの場合よりも低い（図１，２，３，４参照）。また、図５からノイズの値が同等であることから、実施例１は比較例２より少ないｔｏｔａｌＲＮＡ量を用いても高いＳ／Ｎ比で検出することができているといえる。
【００５０】
以上の実施例１、比較例１および比較例２の結果から、実施例１に示した方法を用いることで比較例１および比較例２よりも少ない被験試料からｍｉＲＮＡを高いＳ／Ｎ比で検出することができているといえる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】配列番号１のＲＮＡを用いた実施例１、比較例１、比較例２の結果を表す。
【図２】配列番号２のＲＮＡを用いた実施例１、比較例１、比較例２の結果を表す。
【図３】配列番号３のＲＮＡを用いた実施例１、比較例１、比較例２の結果を表す。
【図４】配列番号４のＲＮＡを用いた実施例１、比較例１、比較例２の結果を表す。
【図５】実施例１、比較例１、比較例２のノイズの値を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡおよびｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ分子のような小型ＲＮＡを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）とは、タンパク質をコードしないＲＮＡの総称であり、ハウスキーピングＲＮＡと調節系のＲＮＡとに大別される。前者のハウスキーピングＲＮＡとしては、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、スプライシングに関与する核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｒＲＮＡの修飾に関与する核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）等が知られている。一方、後者の調節系ＲＮＡについては、生体機能の解明に重要な機能を果たしている因子として、近年特に注目を集めているものであり、遺伝子発現やＲＮＡの細胞内分布を調節し遺伝子発現抑制機構に重要な役割を担っていることが最近になって明らかにされつつある。この調節系ＲＮＡが機能する遺伝子発現抑制機構は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれ、１９８８年に線虫を用いた実験で明らかにされ、その後、ショウジョウバエや哺乳類細胞でも同様の機構の存在が明らかとなった。この調節系ＲＮＡとしてのｎｃＲＮＡは、鎖長がおよそ２０〜２５塩基であり、その作用機序は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）による翻訳抑制と、ｓｎａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による標的ｍＲＮＡの切断及び標的ＤＮＡ領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシングとに大別される。
【０００３】
ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡからヘアピン様構造のＲＮＡ（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素（Ｄｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、ｍｉＲＮＡは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、ｍｉＲＮＡをターゲット（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。ｍｉＲＮＡは１５〜２５塩基のＲＮＡからなり、様々な生物でその存在が確認されている。
【０００４】
一方、ｓｉＲＮＡは、ウイルス、トランスポゾン、トランスジーン、内在性ｄｓＲＮＡ等の長鎖ｄｓＲＮＡから、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素（Ｄｉｃｅｒ）により切り出される。その後、ｄｓＲＮＡの片方のアンチセンスＲＮＡが、ＲＩＳＣ、又はＲＩＴＳと称するタンパク質複合体に取り込まれ、複合体としてｍＲＮＡの分解又は転写抑制に関与する。従って、ｓｉＲＮＡの取り得る態様としては、ｄｓＲＮＡとしての二本鎖の状態、ＲＩＳＣとの複合体を形成している一本鎖の状態もあるので、通常、ｓｉＲＮＡをターゲット（検出対象）とする場合は、長鎖ｄｓＲＮＡ、切断後のｓｉＲＮＡ、又は一本鎖等の各種形態を考慮する必要がある。
【０００５】
ところで、一般に、核酸固定化基板（ＤＮＡチップ）を用いた発現解析では、数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブが固定された基板を用いて被験試料をＤＮＡチップに添加することによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被験試料中の遺伝子量を知ることができる。ＤＮＡチップ上に固定化するプローブに対応した遺伝子の選択は自由である。しかしながら、検出対象が上記の小型ＲＮＡの場合、細胞又は組織に含まれる上記の小型ＲＮＡは鎖長が２００ヌクレオチド以下と短く、また配列は非常に類似するため、ＤＮＡチップ上で特異的に上記の小型ＲＮＡを区別することは難しく、さらに細胞又は組織に含まれる上記の小型ＲＮＡは微量であるため、高感度に上記の小型ＲＮＡを区別することは難しい。
【０００６】
従って、上記の小型ＲＮＡの短い鎖長の核酸を検出し解析しようとする分野においては、高感度かつ高精度に上記の小型ＲＮＡを検出できる有効な技術の確立が急務の課題となっている。
【０００７】
その解決策の一つとして、上記の小型ＲＮＡに含まれるグアニン塩基を特異的に認識するプローブを用いて上記の小型ＲＮＡを標識した被験試料をＤＮＡチップに添加してｍｉＲＮＡを測定する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、通常、上記の小型ＲＮＡに含まれるグアニン塩基の位置は多様であり、上記の小型ＲＮＡに含まれるグアニン塩基の数は一定でないため、上記の小型ＲＮＡに含まれるグアニン塩基の数によっては検出が困難な上記の小型ＲＮＡが生じる。
【０００８】
また上記の小型ＲＮＡの３’末端にアミノ修飾されたアデニン塩基を酵素的に複数個付加し、付加したアミノ修飾済みアデニン塩基にプローブを標識した被験試料をＤＮＡチップに添加してｍｉＲＮＡを測定する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、３’末端へ付与されるアデニン塩基数にはバラツキが存在し、上記の小型ＲＮＡへ標識されるプローブ数は一定にならないため、上記の小型ＲＮＡへの３’末端へ付与されるアデニン塩基数によっては検出が困難なｍｉＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ等が生じる。
【０００９】
また、上記の小型ＲＮＡを脱リン酸化した３’末端にプローブが１つ標識された１つのシトシン塩基を付加した被験試料をＤＮＡチップに添加してｍｉＲＮＡを測定する方法などが提案されている（例えば、特許文献３、非特許文献１参照）。しかしながら、通常、一個のシトシン塩基の大きさは小さく、標識するプローブの大きさは大きいため、１個のグアニン塩基を付与するだけでは標識プローブの立体障害によって検出が困難な上記の小型ＲＮＡが生じる。また、上記の小型ＲＮＡは微量のため、１個のプローブの標識だけでは十分に強いシグナルが得られず検出が困難な上記の小型ＲＮＡが生じる。
【００１０】
また、ビオチン標識したランダムプライマーを用いて小型ＲＮＡを逆転写し、ビオチン標識した相補ＤＮＡを検出する方法（非特許文献２参照）が知られているが、５μｇの被験資料を必要とするため、被検資料によっては測定できない場合もある。
【００１１】
また小型ＲＮＡの３’末端を化学修飾し、ビオチン化して検出する方法（非特許文献３参照）が知られているが、修飾の作業工程が多いため測定ノイズが入ってしまう。
【特許文献１】米国特許第６，２６２，２５２号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／１１８８０６号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０１７２８４５号明細書
【非特許文献１】「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，２００４，Ｖｏｌ.３２，Ｎｏ.１１，ｅ８６
【非特許文献２】「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」，Ｊｕｎｅ ２９,２００４，ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．２６，９７４０−９７４４
【非特許文献３】「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，２００５,Ｖｏｌ.３３(Ｎｏ．２)，ｅ１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の解決しようとする課題は、被験試料に含まれる鎖長が２００ヌクレオチド以下と短く、配列は非常に類似する、非常に微量な上記の小型ＲＮＡを高感度、かつ高精度に検出できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の特徴を有する。
【００１４】
本発明は第一の実施態様において、担体表面に凹凸部を有し、該凹凸部の凸部の頂面に選択結合性物質が固定化された選択結合性物質固定化担体を用いて、被験試料に含まれる小型ＲＮＡを検出する方法であって、該小型ＲＮＡまたは該小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの少なくとも一方の末端に標識物質を結合させた標識体を選択結合性物質と反応させることを特徴とする、小型ＲＮＡを検出する方法である。
【００１５】
また別の実施形態において、前記標識体が、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの３’末端に標識物質を結合させた標識体である、小型ＲＮＡを検出する方法である。
【００１６】
また別の実施形態において、前記標識体が、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの３’末端にリンカー配列を介して標識物質を結合させた標識体である、小型ＲＮＡを検出する方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、微量のＲＮＡサンプルに含まれる小型ＲＮＡを高いＳ／Ｎ比で検出する方法を提供するものであり、これにより小型ＲＮＡを高感度に検出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明をさらに具体的に説明する。
【００１９】
本明細書において小型ＲＮＡとは、脊椎動物、ホヤ類、半索類、軟体動物類、環形動物および節足動物を含む多くの進化的に分岐した生物種を構成する２００塩基長未満の範囲であるＲＮＡを意味する。また、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は小型ＲＮＡに含まれる１５〜２５塩基の一本鎖ＲＮＡであり、様々な生物でその存在が確認されている。
【００２０】
本明細書において、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。さらに「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含する核酸として用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【００２１】
本発明の小型ＲＮＡを検出する方法は、担体表面に固定化された選択結合性物質に、その選択結合性物質と反応する小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを含む溶液を接触させ、接触した状態を観察することで小型ＲＮＡを検出する。
【００２２】
相補配列（相補鎖、逆鎖）とは、小型ＲＮＡを構成する塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
【００２３】
本発明において、選択結合性物質固定化担体としては、例えば特開２００６-７８１９７号公報に記載のものを用いることができるで。
【００２４】
選択結合性物質とは、被験試料に含まれる小型ＲＮＡと直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味する。本発明の小型ＲＮＡを検出する方法においては、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【００２５】
特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。選択結合性物質として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。
【００２６】
検出したい小型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）であっても良い。その情報は例えば、http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtmlにアクセスすることで知ることができる。目的とするｍｉＲＮＡを検出するには、検出対象のｍｉＲＮＡと相補な配列を有する核酸を選択結合性物質として用いればよい。
【００２７】
小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡは、被験試料に含まれる小型ＲＮＡを、逆転写酵素などを用いて得ることができる。
【００２８】
本明細書において検出・診断対象となる被験試料としては、組織試料、生物体全体、細胞培養物、または体液などからなる天然源等が挙げられる。
【００２９】
本発明では、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡの相補配列を有するＤＮＡ少なくとも３’末端または５’末端のいずれかに標識物質を結合させることで標識した標識体を用いる。好ましくは、３’末端に標識物質を結合させる。標識物質の結合には酵素反応、化学反応などを用いることができる。好ましくは、酵素を用いて反応させる。さらに好ましくは、小型ＲＮＡの３’末端に標識体を結合させる。
【００３０】
標識物質は、少なくとも２つ以上の核酸の重合体であるリンカー配列を含んでいても良い。酵素反応には、Ｔ４ ＲＮＡ ＬｉｇａｓｅやＴｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｉｔｉｄｉｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｐｏｌｙ Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを用いても良い。
【００３１】
本発明において、使用できる標識物質としては、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられる。
【００３２】
蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いることができる。
【００３３】
また、標識体として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、シルバーインジウム硫化亜鉛（ＡｇＩｎＺｎＳ）などが挙げられる。
【００３４】
小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの末端へ標識体を結合させる方法は、酵素反応を用いて行うことができる。酵素反応として、Ｔ４ＲＮＡＬｉｇａｓｅを用いることも好ましい。
【実施例】
【００３５】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
（ＤＮＡチップ）
選択結合性物質固定化担体として「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」（東レ株式会社；ＴＲＴ-ＸＲ３１１）を用いた。
【００３７】
（ＲＮＡの標識）
末端に標識物質を結合させる方法として、「ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｈｙ５ Ｐｏｗｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ」（エキシコン社；２０８０３０-Ａ）を用いた。被験試料には、ｍｉＲＮＡの含有が確認されたＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ＡＢＩ社；ＡＭ７９６０）を用いた。上述のｔｏｔａｌＲＮＡ １００ｎｇ、３００ｎｇ、５００ｎｇ、１０００ｎｇのそれぞれについて、メーカー推奨のプロトコールでｍｉＲＮＡを標識した。
【００３８】
（ハイブリダイゼーション）
全ての標識済みｍｉＲＮＡをそれぞれ「ハイブリダイゼーションバッファー」（東レ株式会社；ＴＲＴ-ＸＲ３０１）に溶解し、３７℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び４２℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した条件で洗浄した。
【００３９】
（遺伝子発現量の測定）
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＤＮＡチップスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ、パーキンエルマージャパン）を用いてスキャンし、画像を取得してＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ５．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）にて蛍光強度を数値化した。統計学的処理は「Ｓｐｅｅｄ Ｔ．著，「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ」，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ／ＣＲＣ」及び「Ｃａｕｓｔｏｎ Ｈ．Ｃ．ら著「Ａｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ」を参考にして行った。すなわち、ハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、各々のｍｉＲＮＡについてシグナル強度を算出した。
【００４０】
「３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」（東レ株式会社；ＴＲＴ-ＸＲ３１１）は約８００種のマイクロＲＮＡを検出することができるが、この中から配列番号１，２，３，４で表されるＲＮＡを選択し解析に用いた。
【００４１】
その結果を「Ａｒｒａｙ３」として図１，２，３，４、５に示す。配列番号１のＲＮＡの結果を図１に、配列番号２のＲＮＡの結果を図２、配列番号３のＲＮＡの結果を図３、配列番号４のＲＮＡの結果を図４に示す。図５に実施例および比較例１、比較例２のノイズの値を示している。比較例１、および比較例２については後述する。
【００４２】
各図は実施例１および比較例１、２の結果から得られたシグナル強度を縦軸にした棒グラフで表している。左からＡｒｒａｙ１-１０００ｎｇ（比較例１）、Ａｒｒａｙ２-３０００ｎｇ（比較例２）、Ａｒｒａｙ３-１００ｎｇ（実施例１においてｔｏｔａｌＲＮＡが１００ｎｇの場合）、Ａｒｒａｙ３-３００ｎｇ（実施例１においてｔｏｔａｌＲＮＡが３００ｎｇの場合）、Ａｒｒａｙ３-５００ｎｇ（実施例１においてｔｏｔａｌＲＮＡが５００ｎｇの場合）、Ａｒｒａｙ３-１０００ｎｇ（実施例１においてｔｏｔａｌＲＮＡが１０００ｎｇの場合の結果を示している。）の結果を示す。
【００４３】
図１，２，３，４から、実施例においてはｔｏｔａｌＲＮＡの量が増加するにしたがってシグナル強度が増加していることがわかる。また、ノイズの値はｔｏｔａｌＲＮＡの量に関係しないことが図５から分かる。
【００４４】
比較例１
凹凸部が設けられていない平坦なガラス基板で作成されたＤＮＡチップの場合と比較した。
【００４５】
基板として、「ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライドガラス」（松浪硝子）を用いた。以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。配列番号１、２，３，４のＲＮＡと相補配列のＤＮＡ（約２０塩基、５’末端アミノ化）を合成した。この配列番号１，２，３，４のＲＮＡと相補配列のＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。このオリゴヌクレオチドを、終濃度が０．０３ｎｍｏｌおよびμＬとなるようにＤＮＡマイクロアレイ用ＳｐｏｔｔｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ（松浪硝子）に溶解した。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；ＧｅｎｅＳｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、計４点スポットした。以上のようにして得られた分析用チップを、「Ａｒｒａｙ１」とした。
【００４６】
ＲＮＡの標識は、「ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｈｙ５ Ｐｏｗｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ」（エキシコン社；２０８０３０-Ａ）を用いた。被験試料には、ｍｉＲＮＡの含有が確認されたＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ ＴｏｔａｌＲＮＡ（ＡＢＩ社；ＡＭ７９６０）を用いた。上述のｔｏｔａｌＲＮＡ１０００ｎｇを用いた。ハイブリダイゼーションは、マイクロピペットを用いてＡｒｒａｙ１のオリゴヌクレオチドがスポットされた面にアプライした。ギャップカバーガラス（松浪硝子）を被験試料溶液がアプライされた面に載せて、ハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットし、３７℃で１６時間反応させた。遺伝子発現量の測定は実施例と同様である。その結果を図１，２，３，４、５に「Ａｒｒａｙ１-１０００ｎｇ」として示す。
【００４７】
図１，２，３，４から分かるように、Ａｒｒａｙ１-１０００ｎｇのシグナル強度は、実施例におけるｔｏｔａｌＲＮＡが３００ｎｇの場合よりも低い。また、図５からノイズの値が同等であることから、実施例１は比較例１より少ないｔｏｔａｌＲＮＡ量を用いても高いＳ／Ｎ比で検出することができているといえる。
【００４８】
比較例２
異なる標識方法との比較として、グアニン塩基を特異的に認識して標識する方法を比較した。標識にはＬａｂｅｌ ＩＴｍｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ，Ｃｙ５（タカラバイオ社；Ｖ８６１０）を用い、上述のｔｏｔａｌＲＮＡ３０００ｎｇについて、メーカー推奨のプロトコールでｍｉＲＮＡを標識した。標識方法以外は実施例１と同様である。その結果を図１，２，３，４、５に「Ａｒｒａｙ２-３０００ｎｇ」として示す。
【００４９】
図１，２，３，４から分かるように、Ａｒｒａｙ２-３０００ｎｇのシグナル強度は、実施例においてｔｏｔａｌＲＮＡが１０００ｎｇの場合よりも低い（図１，２，３，４参照）。また、図５からノイズの値が同等であることから、実施例１は比較例２より少ないｔｏｔａｌＲＮＡ量を用いても高いＳ／Ｎ比で検出することができているといえる。
【００５０】
以上の実施例１、比較例１および比較例２の結果から、実施例１に示した方法を用いることで比較例１および比較例２よりも少ない被験試料からｍｉＲＮＡを高いＳ／Ｎ比で検出することができているといえる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】配列番号１のＲＮＡを用いた実施例１、比較例１、比較例２の結果を表す。
【図２】配列番号２のＲＮＡを用いた実施例１、比較例１、比較例２の結果を表す。
【図３】配列番号３のＲＮＡを用いた実施例１、比較例１、比較例２の結果を表す。
【図４】配列番号４のＲＮＡを用いた実施例１、比較例１、比較例２の結果を表す。
【図５】実施例１、比較例１、比較例２のノイズの値を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体表面に凹凸部を有し、該凹凸部の凸部の頂面に選択結合性物質が固定化された選択結合性物質固定化担体を用いて、被験試料に含まれる小型ＲＮＡを検出する方法であって、該小型ＲＮＡまたは該小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの少なくとも一方の末端に標識物質を結合させた標識体を選択結合性物質と反応させることを特徴とする、小型ＲＮＡを検出する方法。
【請求項２】
前記標識体が、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの３’末端に標識物質を結合させた標識体である、請求項１に記載の小型ＲＮＡを検出する方法。
【請求項３】
前記標識体が、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの３’末端にリンカー配列を介して標識物質を結合させた標識体である、請求項１または２に記載の小型ＲＮＡを検出する方法。
【請求項１】
担体表面に凹凸部を有し、該凹凸部の凸部の頂面に選択結合性物質が固定化された選択結合性物質固定化担体を用いて、被験試料に含まれる小型ＲＮＡを検出する方法であって、該小型ＲＮＡまたは該小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの少なくとも一方の末端に標識物質を結合させた標識体を選択結合性物質と反応させることを特徴とする、小型ＲＮＡを検出する方法。
【請求項２】
前記標識体が、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの３’末端に標識物質を結合させた標識体である、請求項１に記載の小型ＲＮＡを検出する方法。
【請求項３】
前記標識体が、小型ＲＮＡまたは小型ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡの３’末端にリンカー配列を介して標識物質を結合させた標識体である、請求項１または２に記載の小型ＲＮＡを検出する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−９４０７５（Ｐ２０１０−９４０７５Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６７５６８（Ｐ２００８−２６７５６８）
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]