局所感染と全身感染を区別するための遺伝子活性検出用ポリヌクレオチドの使用
【課題】生体試料中の疾患関連遺伝子の発現変化を鑑別することによって、局所感染と全身感染の区別、診断並びに／若しくは経過観察及び／又は治療を可能にする手段と方法の提供
【解決手段】本発明は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性の検出に対するSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはそれらの遺伝子座及び／又はそれらの転写産物に従うそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドの使用に関する。ここではSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に従う配列のすべてが使用される。同時に方法及びこの方法を実行するためのキットに関する。
【解決手段】本発明は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性の検出に対するSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはそれらの遺伝子座及び／又はそれらの転写産物に従うそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドの使用に関する。ここではSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に従う配列のすべてが使用される。同時に方法及びこの方法を実行するためのキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１に基づけば、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性検出用のポリヌクレオチド並びに／若しくはその遺伝座及び／又はその転写産物の使用に関する。また請求項３及び請求項１５に基づけば、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するために、患者の試料から得られた遺伝子活性を使用することに関する。本発明は、さらに請求項１７に基づけば、インビトロにおける遺伝子活性の測定方法に関し、また、請求項２５に基づけばキットに関する。
【０００２】
本発明は、特に、遺伝子発現分析により局所感染と全身感染を区別するためのマーカー遺伝子並びに／若しくはその断片及びそれらの使用に関する。さらに本発明は、マーカー遺伝子に由来するＰＣＲプライマー及びプローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
リポ多糖などの細菌細胞壁成分は血中サイトカイン濃度の変化をもたらす（Mathiak
2003）。また、プロカルシトニン（ＰＣＴ）やマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）などそれぞれのタンパク質マーカーは、術後感染の指標として用いられる（Siassi 2005）。細菌病原体に対する血液の免疫反応は、また、機能ゲノミクスによって特徴づけることができ（Feezor and Moldawer 2003, M. Foti et al., 2006）、さらに細菌タンパク質は、宿主細胞の転写と翻訳に変化を引き起こす原因となる（Flo 2004）。従って遺伝子発現プロフィールは、抗菌物質の作用機構の決定に使用することができる（Hutter 2004）。血液試料中の遺伝子の転写分析は、生存する敗血症患者と生存しない敗血症患者の相違を明らかにすることに利用される（Pachot 2006）。
【０００４】
さまざまな疾患においてそれぞれの遺伝子の発現変化が知られており、また局所感染の場合、それぞれの発現変化がマウス筋肉組織において記述されており（A. Boelen, 2005）、さらにニワトリ（X. Wang, 2006）又はブタの腸管粘膜（T. A. Niewold, 2006）において局所ウイルス感染した上皮細胞におけるいくつかの遺伝子変化についの記述があるが、局所感染と全身感染の区別のために、マーカー遺伝子とそれらの転写産物についても、また全血試料と血液細胞から得られるいくつかの定量的転写値を組み合わせた使用についても知られていない。また一方、動物モデルで実施された発現分析は、必ずしもヒトの病態生理に置き換えることができるとは限らないことが文献（Rittirsch et al., 2006 and Esmond, 2004）から知られている。
【０００５】
全血中に局在しており、血液、血液細胞及び臓器並びに末梢組織からの細胞に由来する可変濃度の転写産物（またｍＲＮＡや低分子ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡや付加ＲＮＡ）の定量は、血液に基づく診断支援のための必須条件である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Boelen A, Kwakkel J, Alkemade A, et al.Induction of type 3 deiodinase activity in inflammatory cells of mice withchronic local inflammation. Endocrinology.2005 Dec;146(12):5128-34. Epub 2005 Sep 8.
【０００７】
【非特許文献２】BoxG, Cox D. An analysis of transformations (with discussion). Journal of theRoyal Society B 1964; 26, 211-252.
【０００８】
【非特許文献３】Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J, et al., Minimum information about amicroarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat Genet.2001Dec;29(4):365-71.
【０００９】
【非特許文献４】FeezorRJ, Moldawer LL. Genetic Polymorphisms, Functional Genomics and the HostInflammatory Response to Injury and Inflammation. Nestle Nutr Workshop Ser ClinPerform Programme. 2003;8:15-32; discussion 32-7.
【００１０】
【非特許文献５】FloTH, Smith KD, Sato S, et al. Lipocalin 2 mediates an innate immune response tobacterial infection by sequestrating iron. Nature. 2004 Dec16;432(7019):917-21. Epub 2004 Nov 7.
【００１１】
【非特許文献６】FotiM, Granucci F, Pelizzola M, et al. Dendritic cells in pathogen recognition andinduction of immune responses: a functional genomics approach. J Leukoc Biol.2006 May;79(5):913-6.
【００１２】
【非特許文献７】HodgesJL, Lehmann EL. Estimates of location based on rank tests. The Annales ofMathematical Statistics 1963; 34, 598-611.
【００１３】
【非特許文献８】Hutter B, Schaab C, Albrecht S, et al.Prediction of Mechanisms of Action of Antibacterial Compounds by GeneExpression Profiling. AntimicrobAgents Chemother. 2004 Aug;48(8):2838-44.
【００１４】
【非特許文献９】MathiakG, Kabir K, Grass G, et al. Lipopolysaccharides from different bacterialsources elicit disparate cytokine responses in whole blood assays. Int J MolMed. 2003 Jan;11(1):41-4.
【００１５】
【非特許文献１０】NiewoldTA, Veldhuizen EJ, van der Meulen J, et al. The early transcriptional responseof pig small intestinal mucosa to invasion by Salmonella enterica serovartyphimurium DT104. Mol Immunol. 2007 Feb;44(6):1316-22. Epub 2006 Aug 1.
【００１６】
【非特許文献１１】PachotA, Lepape A, Vey S, et al. Systemic transcriptional analysis in survivor andnon-survivor septic shock patients: a preliminary study. Immunol Lett. 2006 Jul15;106(1):63-71. Epub 2006 May 17.
【００１７】
【非特許文献１２】HasteT, Tibshirani R, Friedman J. The Elements of Statistical Learning; Data mining,Inference, and Prediction. Springer 2001.
【００１８】
【非特許文献１３】SiassiM, Riese J, Steffensen R, et al. Mannan-binding lectin and procalcitoninmeasurement for prediction of post-operative infection. Crit Care. 2005 Oct5;9(5):R483-9. Epub 2005 Jul 19.
【００１９】
【非特許文献１４】WangX, Rosa AJ, Oliverira HN, et al. Transcriptome of local innate and adaptiveimmunity during early phase of infectious bronchitis viral infection. VitalImmunol. 2006 Winter;19(4):768-74.
【発明の概要】
【００２０】
本特許出願において開示される発明の出発点は、局所感染や全身感染した場合に、個体試料の血液細胞中に存在している種々の遺伝子の遺伝子活性は、局所感染も全身感染もないと診断された当該個体の遺伝子の遺伝子活性とは異なっており、また血液からの転写産物の疾患依存的な濃度変化を伴うマーカー遺伝子として、共同で又は単独で使用することができるという発見である。これら遺伝子の活性の正規化又は相対的定量化は、診断、予後診断、治療観察及び経過観察を補助するものとして利用することができる。
【００２１】
従って本発明は、生体試料中の疾患関連遺伝子の発現変化を鑑別することによって、局所感染と全身感染の区別、診断並びに／若しくは経過観察及び／又は治療を可能にする手段と方法を提供するという目的に基づく。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】局所感染及び全身感染を区別するため、関連遺伝子からの無作為選択を説明するためのいわゆるヒートマップを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
この目的は、請求項１、３及び１５の特徴によって達成される。
【００２４】
方法に関しては、この目的は請求項１７の特徴によって達成される。
【００２５】
請求項２５に基づくキットは、同様にこの目的を達成する。
【００２６】
従属する請求項は、本発明の好ましい実施態様を示す。
【００２７】
定義
本発明の目的のために、以下の定義を用いる。
【００２８】
局所感染：局所感染とは、病原体が感染部位にとどまり、さらに体内に広がることなく、この位置でのみ症状を引き起こす感染である。例として局所感染には気道感染、下痢、又は皮膚のできものがある。
【００２９】
全身感染とは、病原体が臓器系全体又は生物全体にわたって広がる感染である。
【００３０】
体液：本発明が意図するものの範囲内で、体液とはヒトを含む哺乳動物の任意の体液であると理解される。
【００３１】
遺伝子：遺伝子とは、生物学的に活性のあるリボ核酸（ＲＮＡ）を産生するための基本情報を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上の部分である。本発明が意図するものの範囲内で遺伝子はさらに、導き出された任意のＤＮＡ配列、部分配列及び合成類似体（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ））であると理解される。従ってＲＮＡレベルでの遺伝子発現の測定に関する本発明の記述は、ある制限を構成するものではなく、応用例を構成するものである。
【００３２】
遺伝子座：遺伝子座とはゲノムにおける遺伝子の位置である。ゲノムがいくつかの染色体から成る場合には、遺伝子座は遺伝子がある染色体内の位置をいう。この遺伝子のさまざまな発現又は変異体は対立遺伝子と呼ばれ、すべてが染色体すなわち遺伝子座上の同じ位置にある。従って遺伝子座という用語には、一方においては特定の遺伝子産物に対する純粋な遺伝情報が含まれ、他方では、遺伝子座での遺伝子によって任意の機能又は非機能状況にある任意の調節ＤＮＡ部分及び任意の付加ＤＮＡ配列が含まれる。
【００３３】
遺伝子活性：遺伝子活性とは、転写される遺伝子及び／又は翻訳産物を生成する遺伝子の能力の程度であると理解される。
【００３４】
遺伝子発現とは、遺伝子の生成過程及び／又は遺伝子型の表現型への発現である。
【００３５】
マーカー遺伝子：マーカー遺伝子とは、異なるＲＮＡ試料について、遺伝子の発現及び転写が疾患に関連して変化を示す遺伝子であり、また遺伝子活性の変化が、異なる試料について診断、経過観察及び治療観察の目的に役立つことを示す遺伝子である。
【００３６】
ハイブリダイゼーション条件とは、当業者によく知られており、自由分子と結合分子の熱力学的平衡の達成に影響し得る物理的及び化学的なパラメーターである。最適なハイブリダイゼーション条件のために、プローブ分子とサンプル分子の接触時間、ハイブリダイゼーション緩衝液中のカチオン濃度、温度、容量及びハイブリダイズする分子の濃度や濃度比を相互に調和させなければならない。
【００３７】
増幅条件とは、核酸の形を持つ出発物質の再生産を可能にする、周期的に変化する反応条件である。反応混合物中には、出発物質の相補領域に付着することができる短いオリゴヌクレオチドと同じような、核酸生成のための１つの成分（デオキシヌクレオチド）の他に、ポリメラーゼと呼ばれる核酸合成酵素が存在している。当業者によく知られているカチオン濃度、ｐＨ値、容量及び周期的に繰り返される１つの反応ステップの時間と温度は、増幅の進捗に重要である。
【００３８】
プライマー：本発明の構成においてプライマーと呼ばれるものは、例えばＤＮＡポリメラーゼなどＤＮＡ複製酵素のための出発点としての役目を果たすオリゴヌクレオチドである。プライマーはＤＮＡのみならずＲＮＡでもまた作成される（Primer3；例えば、ＭＩＴの http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
を参照）。
【００３９】
プローブ：本出願においてプローブとは、分子標識（例えば蛍光標識、特に分子ビーコン、TaqMan（登録商標）プローブ、同位体標識など）を備えてもよく、また、標的ＤＮＡ分子及び／又は標的ＲＮＡ分子の配列特異的な検出に用いられる核酸断片（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。
【００４０】
ＰＣＲとは、英語名称である“Polymerase Chain Reaction”の略号である。ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）は、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いて、生体外のインビトロでＤＮＡを複製する方法である。ＰＣＲは、特に本発明に基づけば、興味のあるＤＮＡ鎖の約３０００塩基対までの短い一部を複製するために用いられる。ＤＮＡ鎖は、遺伝子若しくは遺伝子のごく一部、又は非コードＤＮＡ配列であってもよい。当業者は、ＰＣＲ法のすべては“ＰＣＲ”の表現に含まれ、多くのＰＣＲ法は先行技術として知られていることを十分理解している。これは特に“リアルタイムＰＣＲ”について当てはまる。
【００４１】
ＰＣＲプライマー：ＰＣＲは一般的に２本のプライマーを必要とするが、これは、複製されるべき領域が両側で限定される個別の２つの一本鎖ＤＮＡに関して、ＤＮＡ合成のための出発点を固定するためである。このようなプライマーは当業者によく知られており、例えばウェブサイトである“Primer3”；ＭＩＴの http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
を参照することができる。
【００４２】
転写産物：本発明の目的に対して、転写産物とはＤＮＡ鋳型を用いて産生される任意のＲＮＡ産物であると理解される。
【００４３】
低分子ＲＮＡ：一般的な低分子ＲＮＡである。しかしながらこのグループの代表は特に排他的ではない。
ａ）ｓｃＲＮＡ（低分子細胞質ＲＮＡ）は真核生物の細胞質中にあるいくつかの低分子ＲＮＡ分子のひとつである。
ｂ）ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）は細胞核にのみ存在する多くの低分子ＲＮＡ種のひとつである。ｓｎＲＮＡのあるものは、スプライシング又は他のＲＮＡ処理反応に関与する。
ｃ）低分子非タンパク質コードＲＮＡは、いわゆる低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含み、遺伝子発現を多様なレベルで可能にするが、多様なレベルにはクロマチン構造、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ安定性、翻訳、及び、場合により転写とスプライシングも含まれる。一般的にこれらのＲＮＡは、タンパク質コード転写産物を含むより長い一次転写産物であるイントロンとエクソンから、複数の経路を介して処理される。
ヒトゲノムのおよそ１．２％だけがタンパク質をコードするが、それにもかかわらず大部分は転写される。実際のところ、哺乳動物やヒトで見いだされる転写産物のおよそ９８％は、タンパク質コード遺伝子のイントロンや非タンパク質コード遺伝子のエクソンとイントロンといった非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）で構成されており、タンパク質コード遺伝子のアンチセンス又はこれらが重複したものを多く含む。
【００４４】
低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、標的ＲＮＡにおいてヌクレオチドの配列特異的な修飾を調節している。ここで２種類の修飾が生じており、すなわち、2'-O-リボースメチル化と偽ウリジル化であり、これらは、一方でボックスＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡと呼ばれ、他方ではボックスＨ／ＡＣＡ
ｓｎｏＲＮＡと呼ばれる２つの大きなｓｎｏＲＮＡファミリーによって調節されている。そのようなｓｎｏＲＮＡはおよそ６０から３００ヌクレオチドの長さを示す。
【００４５】
ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）とｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）は同じくらいのより低分子のＲＮＡであり、一般的に２１個から２５個のヌクレオチドを有する。ｍｉＲＮＡは内在性の低分子ヘアピン前駆体構造から生じ、翻訳抑制の標的として類似しているが同一ではない配列を持つ他の遺伝子座を使用する。
【００４６】
ｓｉＲＮＡは、しばしば外因性の起源であるより長い二本鎖ＲＮＡ又は長いヘアピンから生じる。ｓｉＲＮＡは、通常、試料の遺伝子座又はゲノム中の他の位置にある相同配列を標的とし、そこでいわゆる遺伝子抑制、ＲＮＡｉともいわれる現象に関与する。
しかしながら、ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとの境界は流動的である。
【００４７】
ｄ）さらに“低分子ＲＮＡ”の表現は、いわゆる転移因子（ＴＥ）、特にレトロエレメントも含むことができる。これらは本発明の目的に対して、“低分子ＲＮＡ”の表現で理解される。
【００４８】
本発明は、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ及び他の測定系で、血液及び血液細胞から正規化され定量的な発現データを測定するための、血液からの新たなマーカー遺伝子の同定、適切なマイクロアレイプローブ及びこれらの使用、さらにこれらを組み合わせた使用について記述する。そして局所炎症の判定のため、また一般的な全身炎症、感染及び全身反応において結果としてそこに生じる免疫反応を区別するため、測定には増幅の有無及び定量化や可視化のさまざまな可能性が伴う。
【００４９】
本発明の方法は、個体の体液サンプル、特に血液サンプル又は組織サンプルについて、局所感染と全身感染を区別することが可能であるということに特徴付けられる。それは、１個又は数個のマーカー遺伝子の活性を用いて、参照遺伝子の遺伝子産物量と比較した、又は当業者に知られたさらなる方法により正規化又は定量化された遺伝子産物の存在と量を確認することによる。
【００５０】
この目的のために開示されるものは、血液及び血液細胞から得られる遺伝子配列とそれらに由来するプローブであり、これらは遺伝子活性と転写産物の測定、可視化、正規化及び定量化に用いることができる。好ましい実施態様におけるオリゴヌクレオチドプローブの配列は表１〜５に示され、添付された配列プロトコールSEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に対応する。ここで、５０〜１００ヌクレオチドの長さをもつ好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドプローブの配列からさらなる配列を推測してもよく、これらは、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69の配列をもつ表１〜５に示された遺伝子の転写産物に特異的に結合する。ＰＣＲなどの増幅方法において使用される配列の長さと組み合わせは、これらが目的とする酵素的な操作と増幅に対応する限りは任意なものでよい。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【００５３】
【表３】
【００５４】
【表４】
【００５５】
【表５】
【００５６】
マーカー遺伝子は単独で使用してもよく、又はいくつかを組み合わせて使用してもよい。ここで記述するように、通常、マーカー遺伝子の活性は、マイクロアレイ用のハイブリダイゼーションプローブを用いて、又はＰＣＲプライマーとリアルタイムＰＣＲを用いて測定することができる。しかしながらマーカー遺伝子とその発現産物は、当業者に知られる他の方法、例えばＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）やさまざまな組み合わせなどでも測定することができる。また、マーカー遺伝子とその発現産物は多くの方法又は可視化を可能にするもの、例えば鎖置換の利用又はモノクローナル抗体の利用などによっても測定することができる。プローブは遺伝子、発現産物（ｍＲＮＡ）、断片又は完全にはｍＲＮＡに加工されない発現中間産物に対して使用することができる。
【００５７】
さらなる実施態様において、プローブは、本発明で開示されるマーカー遺伝子又はこれらの転写産物の特異領域に結合する。また一方で、プローブは、ここで開示される遺伝子配列又はそれから転写された配列の任意の領域と相互作用してもよい。プライマーとプローブは連続する塩基対合を介して相互作用してもよいが、必ずしも全相補配列と連続的に相互作用する必要はない。すなわち、ここでは緩衝液組成、塩濃度、洗浄手段及び温度を可変的に選択することができる。
【００５８】
同様に、マーカー遺伝子の変化は、１つ又はいくつかの参照サンプルの発現値（又はこれらから得られる平均値などのデータ）と比較することができる。参照サンプルは標的サンプルと同時に測定する必要はないが、例えば較正様式又は値若しくは表としてデータベースに保存する。
【００５９】
本発明の１つの実施態様では、発現値は、表１〜５に記載されたマーカー遺伝子の他に、血液及び血液細胞から得られるマーカー遺伝子の核酸及び転写産物を用いて測定される。測定は、１つ又はいくつかの参照サンプルと発現値を比較することにより（公開されていないドイツ国特許出願DE 10 2007 010 252.8号明細書にあるように）及びマーカー核酸との関連でマーカー遺伝子発現を定量することにより行われる。
【００６０】
本発明の他の実施態様は、表１〜５に記載の配列を持つ核酸及びＤＮＡプローブ、及び低分子ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ並びに／若しくは繰り返し体の結合及び／又は血液中に又は血液細胞から得られる表１〜５に記載の転写産物（ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）の結合は、溶液中又は表面若しくは粒子若しくはビーズへの固定化を任意に組み合わせて用いられ、かつ、核酸の結合量（発現値）とプローブに結合した１つ又はいくつかのマーカー核酸を比較することによる正規化及び結合したマーカー核酸と比較する定量化のために、結合した遺伝子転写産物を使用することを特徴とする。
【００６１】
本発明の１つの実施態様には以下の特徴がある。すなわち、参照遺伝子及びマーカー遺伝子に由来するＲＮＡ量の相関に基づいた局所感染と全身感染を、エクスビボ又はインビトロで区別する方法には次のステップが含まれる。すなわち、第２〜４相臨床試験において局所感染又は全身感染を伴う患者の選定基準又は除外基準として請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用。
【００６２】
本発明の他の実施態様は、マーカー遺伝子ＲＮＡを測定する前にマーカー遺伝子ＲＮＡをＤＮＡとハイブリダイズさせ、そして、参照ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のマーキングシグナルを検出し、ある所定の場合においてはさらに変換し、またある所定の場合においては較正曲線又は表の形式で保存することを特徴とする。
【００６３】
本発明の他の実施態様は、マーカー遺伝子又はその一部分のＲＮＡが、配列決定又は部分配列決定によって、例えばピロシーケンスによって同定及び定量されることを特徴とする。
【００６４】
本発明の他の実施態様は、ｍＲＮＡ又はマイクロＲＮＡがマーカー遺伝子ＲＮＡとして使用されることを特徴とする。
【００６５】
本発明の他の実施態様では、ＤＮＡは、マーカー遺伝子ＲＮＡ又はそのインビトロ転写産物の特異結合に使われるマイクロアレイの形態を持つ支持体上の、予め決められた領域において、特に固定化されて用意されることを特徴とする。
【００６６】
本発明の他の実施態様では、生体試料はヒトのものであることが特徴である。
【００６７】
配列ID No.1〜配列ID
No.69の配列は本発明の範囲に含まれ、６９個の配列を含む添付の配列プロトコールに詳細が開示されているので、本発明の一部を構成している。
【００６８】
本発明の他の実施態様では、表１〜５に対応する配列から導かれる固定化又は遊離プローブは標識されていることが特徴である。この実施態様に対して、分子ビーコンと呼ばれる自己相補的オリゴヌクレオチドがプローブとして使用される。このプローブの末端には蛍光色素分子／消光剤対があるので、相補的配列が存在しない場合でもこのプローブは折り畳みヘアピン構造で存在し、対応する試料配列とのみ蛍光シグナルを与える。分子ビーコンのヘアピン構造は、試料が特異的捕捉配列とハイブリダイズし、コンフォーメーション変化とレポーター蛍光の遊離をもたらすまで安定である。
【００６９】
本発明の意味するところの範囲内で、マーカー遺伝子は任意の派生するＤＮＡ配列、すなわち部分配列並びに合成類似体（例えばペプチド核酸、ＰＮＡ）及びアプタマーであると理解される。ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の測定と関連する本発明の記述は、限定を意味するものではなく、応用例を示すものである。
【００７０】
本発明の方法に係る１つの応用は、局所感染と全身感染を区別するために、全血から得られる異なる遺伝子発現の測定データを決定することである。そのために、マーカー遺伝子のＲＮＡは対応する患者の全血から単離される。その後ＲＮＡは標識される。標識には、例えば３２Ｐによる放射活性標識又は色素分子（蛍光）による標識がある。この目的のために、従来から知られている任意の分子及び／又は検出シグナルを標識分子として利用することができる。対応する分子及び／又は方法は、当業者に等しく知られている。
【００７１】
１．上記のように標識したＲＮＡは、次いで、マイクロアレイ上に固定化したＤＮＡ分子とハイブリダイズさせる。本発明に従えば、マイクロアレイ上に固定化したＤＮＡ分子は、局所感染と全身感染を区別するための遺伝子の特異的選択性を示す。
【００７２】
２．続いて、ハイブリダイズした分子のシグナル強度は、従来よく知られている適切な測定装置（蛍光体撮像装置、マイクロアレイスキャナー）で測定され、さらにソフトウェア支援評価により分析される。患者試料のマーカー遺伝子と参照遺伝子間の発現比率は、測定されたシグナル強度から決定される。下方及び／又は上方に制御された遺伝子の発現比率から、以下に示される実験のように、局所感染と全身感染の区別に関する結果を出すことが可能である。
【００７３】
３．本発明の方法に係る他の応用は、計画された治療に患者が反応する可能性を、治療しながら判定すること、及び／又は特殊な治療への反応を判定し、並びに／若しくは全身感染が確認された患者において“薬物モニタリング”という意味における治療の終点の固定と全身感染の重症度の判定のための、特異的な遺伝子発現の測定にある。そのために、ＲＮＡ（検査ＲＮＡ及び参照ＲＮＡ）は、経時的に集められた患者の血液試料から単離される。異なるＲＮＡ試料は一緒に標識され、マイクロアレイ上に固定化された選択されたマーカー遺伝子及び参照遺伝子とハイブリダイズさせる。１つ又はいくつかの参照遺伝子とマーカー遺伝子間の発現比率に基づき、計画された治療に患者が反応する可能性、及び／又は開始された治療が有効であるかどうか、並びに／若しくはどれくらい長く患者は対応して治療を受けなければならいのか、並びに／若しくは用いられた用量と継続期間で最大治療効果にすでに達したのかどうか、を評価することが可能である。
【００７４】
本発明の方法に係る他の応用は、ハイブリダイゼーション非依存的方法、特に酵素又は化学的加水分解、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、それに続く核酸及び／又はこの誘導体並びに／若しくは断片の定量化により定量的情報を得るため、本発明に基づく遺伝子のＲＮＡを使用することにある。
【００７５】
４．ＰＣＲ（また例えばＮＡＳＢＡなどの付加的増幅方法）により増幅及び定量された参照遺伝子の転写産物は、局所並びに全身感染及びそれらの重症度の判別における遺伝子発現データの正規化のために、本発明に従う他の実施態様を構成する。増幅された転写産物のシグナル強度は、次いで適切な測定装置（ＰＣＲ蛍光検出器）により測定され、さらにソフトウェア支援評価により分析される。測定されたシグナル強度から患者試料のマーカー遺伝子と参照遺伝子間の発現比率が測定される。以下で示される試験の通り、下方及び／又は上方に制御された遺伝子の発現比率に基づき、局所感染と全身感染の区別及び所定の場合にはそれらの重症度に関する結果を出すことが可能である。
【００７６】
本発明の方法に係る他の応用は、いくつかの試料において、任意に増幅したｍＲＮＡ定量の正規化にある。これには、ａ）異なる試料にわたって、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69より選択された１つ又はいくつかの核酸の発現値の比較；ｂ）いくつかの試料にわたって、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69より選択された１つ又はいくつかの核酸の発現値の正規化のための値の導出、及びｃ）前記ステップｂ）に基づき、いくつかの試料から単離された他の核酸の発現についての正規化、が含まれる。
【００７７】
本発明はさらに、マーカー遺伝子としての使用を目的とし、患者試料における遺伝子発現プロフィールのインビトロ測定を行うため、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載の配列及び／又は少なくとも１〜１００個、好ましい実施態様では１〜５個及び１〜１０個の核酸を含むこれらの遺伝子断片をもつポリヌクレオチドの選択を含むキットに関する。
【００７８】
本発明はさらに、マーカー遺伝子としての使用を目的とし、患者試料における遺伝子発現プロフィールのインビトロ測定を行うため、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載のハイブリダイゼーションプローブ及び／又は少なくとも５０個のヌクレオチドを含むこれらの遺伝子断片の選択を含むキットに関する。
【００７９】
本発明の別の実施態様は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するために、少なくとも１つの患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性を使用することにある。当該遺伝子活性は、下記のステップを含む方法により得られる：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）増幅条件下で、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載の核酸配列と標識又は非標識合成オリゴヌクレオチドプライマーの接触と再生。ここで、再生部分の長さは５０から３０００ヌクレオチドを含み、マーカーは、局所又は全身感染した患者において異なる量で存在するこれらの遺伝子産物を示す；
ｃ）再生核酸鎖の定性的、半定量的又は定量的測定による再生の進捗の検出、及び増幅された核酸量の評価基準である増幅シグナルと参照核酸量の増幅シグナルとの比較による一連の活性データの作成。
【００８０】
マイクロアレイ又はその他の定量法、例えばリアルタイムＰＣＲにより測定された遺伝子活性と遺伝子発現についての他の応用は、診断目的（例えば、特に細菌感染における個体の免疫反応の重症度を評価するため、また患者データ管理システム又はエキスパートシステムの枠組みにおけるもの）のソフトウェアを作成するためのさらなる電子的処理のための、又は細胞情報伝達経路のモデル化のための、局所及び全身感染の判別を目的とした利用にある。
【００８１】
本発明の他の実施態様は、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つ、特に核酸プローブ又は相補体は、マーカー遺伝子の転写産物又はその相補体との結合に用いられることを特徴とする。
【００８２】
本発明の他の実施態様は、参照遺伝子の転写産物と結合するマーカー遺伝子の合成類似体又は合成オリゴヌクレオチドが、特におよそ６０塩基対を含むことを特徴とする。
【００８３】
本発明の他の実施態様は、放射活性標識、特に３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３３Ｐ又は３Ｈを検出可能な標識として用いることを特徴とする。
【００８４】
本発明の他の実施態様は、非放射活性標識、特に色素又は蛍光標識、酵素標識若しくは免疫標識及び／又は量子ドット若しくは電気的に測定可能なシグナル、特に、例えばハイブリダイゼーションにおける電位並びに／若しくは伝導度及び／又は容量の変化を検出可能な標識として用いることを特徴とする。
【００８５】
本発明の他の実施態様は、マーカー遺伝子ＲＮＡ並びに参照ＲＮＡ及び／又はそれらの酵素的若しくは化学的誘導体は同じ標識を持つことを特徴とする。
【００８６】
本発明の他の実施態様は、マーカー遺伝子ＲＮＡ並びに参照ＲＮＡ及び／又は酵素的若しくは化学的誘導体は異なる標識を持つことを特徴とする。
【００８７】
本発明の他の実施態様は、核酸プローブは支持体材料、例えばガラス又はプラスチックなどに固定化されることを特徴とする。
【００８８】
本発明の他の実施態様は、個々のＤＮＡ分子は共有結合により支持体材料に固定化されることを特徴とする。
【００８９】
本発明の他の実施態様は、個々のＤＮＡ分子は、静電相互作用並びに／若しくは双極子間相互作用並びに／若しく疎水性相互作用及び／又は水素ブリッジによって支持体材料に固定化されることを特徴とする。
【００９０】
当業者は、請求項及び明細書に示された本発明の個々の特徴は、なんら制限されることなく任意にお互いを結びつけることができるということを承知する。
【００９１】
請求項２５に記載のキット及びポリヌクレオチドの集団は、等しく本発明の目的を達成する。
【００９２】
さらに本発明は、局所又は全身感染を伴う患者の治療に伴う経過評価に役立つ。
【００９３】
また本発明は、“インシリコ”エキスパートシステムの作成及び／又は細胞情報伝達経路の“インシリコ”モデル化に対して使用することができる。
【００９４】
本発明に従って遺伝子発現プロフィールを作成するため、表１〜５に記載されたSEQ ID
No.1〜SEQ ID No.69から成る群、及び少なくとも５〜２０００個、好ましくは２０〜２００個、さらに好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むこれらの遺伝子断片から選ばれる複数の特異遺伝子及び／又は遺伝子断片が用いられる。
【００９５】
さらに本発明は、標的遺伝子の不活性化若しくは活性化及び／又は活性変換のための、及び／又は、局所又は全身感染及び局所感染から全身感染への患者の経過を監視するための遺伝子活性の測定のための、患者試料からインビトロで得られた遺伝子発現プロフィールの使用、及び／又は、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69から成る群及び少なくとも５〜２０００個、好ましくは２０〜２００個、さらに好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むこれらの遺伝子断片より選ばれ、この目的のために使用されるプローブの使用に関する。
【００９６】
本発明の他の実施態様は、特異マーカー遺伝子及び／又は遺伝子断片の少なくとも１つは、SEQ
ID No.1〜SEQ ID No.69から成る群及び少なくとも５〜２０００個、好ましくは２０〜２００個、さらに好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むこれらの遺伝子断片より選ばれることを特徴とする。
【００９７】
本発明の他の実施態様は、少なくとも２〜６９個の異なるｃＤＮＡが使用されることを特徴とする。
【００９８】
本発明の他の実施態様は、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載された遺伝子若しくは遺伝子断片及び／又はそれらのＲＮＡから導かれる配列は、対応する合成類似体、アプタマー及びペプチド核酸と置き換えられることを特徴とする。
【００９９】
本発明の他の実施態様は、遺伝子の合成類似体は５〜１００塩基対、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする。
【０１００】
本発明の他の実施態様は、遺伝子活性がハイブリダイゼーション法により測定されることを特徴とする。
【０１０１】
本発明の他の実施態様は、遺伝子活性がマイクロアレイにより測定されることを特徴とする。
【０１０２】
本発明の他の実施態様は、遺伝子活性がハイブリダイゼーション非依存性の方法、特に酵素的及び／又は増幅方法、好ましくはＰＣＲとそれに続く核酸並びに／若しくは誘導体及び／又はこれらの断片の定量、により測定されることを特徴とする。
【０１０３】
本発明の他の実施態様は、細胞内容物を遊離させるため、細胞試料を任意に溶解処理することを特徴とする。
【０１０４】
血液に関連する本発明の記述は、本発明の１つの応用例を示すのみである。
【０１０５】
本教示の完全な開示のために、最初に提出された特許請求の範囲は当業者が関係する任意の請求項及び／又は請求項の組み合わせの開示を含むということに留意する。
【０１０６】
患者データは表６〜８より取得することができる。
追加的な有利な点と特徴は実施例と図面に由来する。
図１は、局所感染及び全身感染を区別するため、関連遺伝子からの無作為選択を説明するためのヒートマップを示す。
【実施例】
【０１０７】
マイクロアレイ実験の説明
（Brazma et al. 2001に基づくMinimum Information About a Microarray Experiment [MIAME] checklist − 新版January 2005に従う。）。これは参考文献としてここに完全に組み込まれる。
【０１０８】
スライドの読み込み／スキャナー技術仕様
ａ）スキャナー：GenePix 4000B共焦点落射式蛍光スキャナー（アキソン・インスツルメンツ（Axon Instruments））
ｂ）スキャニングソフトウェア：GenePix Pro 4.0又は5.0
ｃ）スキャン条件：レーザー出力： Ｃｙ３チャンネル−１００％
Ｃｙ５チャンネル−１００％
ＰＭＴ電圧： Ｃｙ３チャンネル−７００Ｖ
Ｃｙ５チャンネル−８００Ｖ
ｄ）空間分解能（画素空間）−１０μｍ
【０１０９】
データの出力と処理
実験の枠組みにおいて、患者の５９個の血液試料からのＲＮＡをハイブリダイズした。それぞれのＲＮＡ対（患者対比較ＲＮＡ）はマイクロアレイ上で共ハイブリダイズした。患者ＲＮＡは赤色蛍光色素で標識し、比較ＲＮＡは緑色蛍光色素で標識した。ハイブリダイズアレイのデジタル画像はアキソン・インスツルメンツのGenePix Pro 4.0又は5.0により評価した。スポットの検出、シグナルの定量化及びスポット特性の評価のために、GenePix（登録商標）分析ソフトウェアを使用した。GenePix（登録商標）ソフトウェアの設定に従い、スポットは１００＝“良”、０＝“検出”、−５０＝“未検出”、−７５＝“不存在”、−１００＝“偽”として分類した。生データは対応するファイルに保存した。
【０１１０】
正規化、変換及びデータ選択方法
ｅ）シグナルデータの変換及び正規化
シグナルデータはボックス−コックスべき変換（Box and Cox 1964）、中央値及びＭＡＤ（中央値からの絶対偏差の中央値）を用いて正規化した。
【０１１１】
ｆ）除去
マイクロアレイ上の技術上の反復（同一試料についての重複スポット）は、スポット特性に基づいて、修正及び変換シグナル強度から除去した。それぞれのスポットについて、最高の特性評価をした反復を選び、関連したシグナル強度を平均した。まったく測定できない反復をもつスポット発現は“ＮＡ”（利用不可）に指定した。
【０１１２】
実施例１
血液及び血液細胞から局所感染又は全身感染の識別に用いるマーカー遺伝子の同定：
遺伝子発現の測定
５１例の集中治療室（ＩＣＵ）患者について遺伝子発現を測定した。そこには１５例の局所感染患者及び３６例の全身感染患者がいた。分析において、患者一人あたり１日のＩＣＵ日で検討した（表６）。SIG-M5細胞株からの全ＲＮＡを参照試料とした。すべての患者試料は個別のマイクロアレイ上で参照試料と共ハイブリダイズさせた。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
実験の説明
血液の採取とＲＮＡの単離
患者の全血は、PAXGeneキットを用いて製造者（キアゲン（Qiagen））の仕様書に従い、集中治療室において患者から採取した。全血の採取後、試料の全ＲＮＡはPAXGene血液ＲＮＡキットを用いて製造者（キアゲン（Qiagen））仕様書に従い単離した。
【０１１５】
細胞培養
細胞培養（対照試料）について、１９本の冷凍培養細胞（SIGM5）（液体窒素中で冷凍させたもの）を利用した。細胞はそれぞれ２ｍｌの２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）添加イスコフ培地（Biochrom AG）に播種した。培養細胞は１２ウェルプレート中、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間培養した。次いで１２ウェルの内容物を等量の２部に分割し、最終的に同一形式の３枚のプレートを得た（全部で３６ウェル）。培養は同一条件で２４時間継続した。この後、各プレートの１２ウェルから得られた培養物をまとめ、遠心分離（１０００×ｇ、５分、室温）した。その上清を捨て、細胞沈殿物は上記に特定した培地４０ｍｌに懸濁した。この４０ｍｌの懸濁細胞は、２本の２５０ｍｌ試験管に等しく分け入れ、４８時間の培養後、上記に特定した培地を５ｍｌ追加してもう一度培養した。残り２枚のプレートに残っている２ｍｌのうち８０μｌを、予め１ｍｌの培地を入れて用意していた同一プレートの空ウェルに入れた。４８時間の培養後、１２ウェルプレートの1つのみを次のように処理した：各ウェルより５００μｌを採取しまとめた。結果として得られた６ｍｌを、およそ１０ｍｌの新鮮培地を含む１本の２５０ｍｌ試験管に入れた。この混合物を室温で１０００×ｇ、５分間遠心分離し、上記に特定した培地１０ｍｌに懸濁した。その後の細胞計測では次の結果が得られた：１ｍｌあたりの細胞数は１．５×１０７個、全容量は１０ｍｌ、全細胞数は１．５×１０８個。細胞数がまだ十分ではなかったので、上記に特定した細胞懸濁液の２．５ｍｌを、２５０ｍｌ（７５ｃｍ２）試験管（全部で４本の試験管）中で上記に特定した培地３０ｍｌ中に入れた。７２時間の培養後、新鮮培地のそれぞれ２０ｍｌを試験管に入れた。２４時間の培養後、上記記載に従って細胞計測を行い、全細胞数は３．８×１０８個となった。所望する細胞数である２×１０６個を得るため、細胞を４本の試験管中で上記に特定した培地４７．５ｍｌ中に再懸濁した。２４時間の培養時間後、細胞を遠心分離し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋不含リン酸緩衝液（Biochrom AG）で２回洗浄した。
【０１１６】
全ＲＮＡの単離は、NucleoSpin ＲＮＡ Ｌキット（Machery & Nagel）を用い製造者仕様書に従って行った。上述の手順は所要の細胞数が得られるまで繰り返した。これは全ＲＮＡの所要量６ｍｇを得るために必要であり、１０８個の細胞あたり６００μｇのＲＮＡ効率におおよそ対応していた。
【０１１７】
逆転写／標識／ハイブリダイゼーション
全血採取後、試料の全ＲＮＡを単離し、その特性についてPAXGene血液ＲＮＡキット（PreAnalytiX）を用い製造者仕様書に従って調べた。各サンプルから１０μｇの全ＲＮＡを取り出し、参照ＲＮＡとしてSIGM5細胞からの全ＲＮＡの１０μｇと一緒に、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩ（インビトロジェン（Invitrogen））を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ書き換えた。続いてＲＮＡをアルカリ加水分解によりバッチより除去した。反応バッチにおいてｄＴＴＰの一部は、後でｃＤＮＡへの蛍光色素のカップリングを可能にするため、アミノアリルｄＵＴＰ（ＡＡ−ｄＵＴＰ）と置き換えた。
【０１１８】
反応バッチの精製後、試料及び対照のｃＤＮＡを蛍光色素のＡｌｅｘａ６４７及びＡｌｅｘａ５５５と共有結合させて標識し、SIRS-Lab社のマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。使用したマイクロアレイ上には５５〜７０塩基対の長さをもつ固定化ポリヌクレオチドが５３０８個あり、それぞれは１つのヒト遺伝子、及び品質保証のための対照スポットに相当する。１つの例示のマイクロアレイは、１５×１５のラスタースポットを有する２８個のサブアレイに分割される。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション及び引き続く洗浄並びに乾燥は、それぞれハイブリダイゼーションステーションＨＳ４００（テカン（Tacan））中で製造者仕様書に従い、４２℃で１０．５時間行った。使用したハイブリダイゼーション溶液は、それぞれの標識ｃＤＮＡ試料、３．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）、０．３％ドデシル硫酸ナトリウム（ｖ／ｖ）、２５％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、及び０．８μｇ／μｌ cot-1 ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ並びにポリ−Ａ ＲＮＡそれぞれから成る。引き続くマイクロアレイの洗浄は、以下のプログラムにより室温で行った：洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．０３％ドデシル硫酸ナトリウム）、洗浄緩衝液２（１×ＳＳＣ）、及び最後に洗浄緩衝液３（０．２×ＳＳＣ）でそれぞれ９０秒の洗浄。次いでマイクロアレイは窒素流下、２．５バールの圧力で３０℃、１５０秒間乾燥させた。
【０１２０】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルはGenePix
4000Bスキャナー（Axon）を用いて読み出し、区別された発現遺伝子の発現比率をソフトウェアGenePix Pro 4.0（Axon）を用いて測定した。
【０１２１】
評価：
評価のために、スポットの平均強度を関連スポット画素の中央値として測定した。
【０１２２】
正規化：
追加分析のためには赤色シグナル強度のみを使用した。それぞれのアレイは、ボックス−コックスべき変換（Box and Cox 1964）、中央値及びＭＡＤ（中央値からの絶対偏差の中央値）を用いて個々に正規化した。
【０１２３】
分類遺伝子試料の選択：
分類遺伝子試料の選択は、いわゆるフィルターを用いて行った。最初に、最大の変動係数をもつ１０００個の遺伝子試料を決定した。次いで２つのグループ（局所感染と全身感染）を、これら１０００個の遺伝子に基づいてマンホイットニー検定を用いて相互に比較した。ｐ値が０．００１以下である遺伝子試料をホッジス−レーマン推定量を用いて用意し、最高の推定値（絶対量）を示す遺伝子プローブを分類に用いた。
【０１２４】
分類：
分類のために、ｋ−最近隣法をｋ＝３で用いた。分類誤算は１０倍相互検証の１００回繰り返しによって推定した。
【０１２５】
遺伝子試料の最適数：
相互検証によって推定した分類誤差の最小値は、６９個の遺伝子試料で実現された。表１〜５に示された６９個の遺伝子試料への固定は、ブートストラップ法を用いて実行された。従って、ブートストラップ試料による最良の６９個の遺伝子試料の選択は５０００回繰り返され、その後、遺伝子試料はそれらの選択頻度に従って分類された。
【０１２６】
分類誤差：
表１〜５に示された６９個の遺伝子試料について、１０倍相互検証の１００回繰り返しによって推定した分類誤差は全体で１５．７％である。局所感染患者群では分類誤差は２６．７％であり、全身感染患者群では分類誤差は１１．１％である。従って全身感染患者では、約９０％の安全性であることが確認される。
【０１２７】
実施例２
全身感染から局所感染への患者経過による分類遺伝子の検証
【０１２８】
遺伝子発現の測定：
無作為に選択したＩＣＵ患者で、感染が全身から局所に変化した患者の遺伝子発現を測定した。分析においては、患者についての８連続ＩＣＵ日で検討した。
細胞株SIG-M5から得た全ＲＮＡを参照試料とした。
すべての患者試料は、それぞれのマイクロアレイ上で参照試料とともに共ハイブリダイズした（表７、８）。
【０１２９】
【表７】
【０１３０】
【表８】
【０１３１】
正規化：
追加分析のためには赤色シグナル強度のみを利用した。それぞれのアレイは、ボックス−コックスべき変換、中央値及びＭＡＤ（中央値からの絶対偏差の中央値）を用いて個々に正規化した。
【０１３２】
分類遺伝子試料の選択：
患者日の分類のため、３１個の遺伝子プローブの一部を用いた。その構成は次の通りである。
Seq ID： 5, 6, 9,
10 - 14, 17, 18, 23〜26, 31, 37, 38, 40, 43, 45〜48, 51, 53, 55〜57, 62, 66, 67.
【０１３３】
分類：
分類はｋ−最近隣法をｋ＝３で行った。訓練データセットとして、実施例１に記載した患者を用いた。
【０１３４】
分類誤差：
すべての患者日（第１〜６日：全身感染、第７、８日：局所感染）は正確に分類された。
【０１３５】
以下には発明の他の実施態様を示し、これらもまた本目的を達成するために適している。
【０１３６】
Ａ）局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性の検出に対するSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはそれらの遺伝子座及び／又はそれらの転写産物に従うそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつ少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載の配列の少なくとも１つが用いられる使用。
【０１３７】
Ｂ）遺伝子活性が、ハイブリダイゼーション法、特にマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション法及び／又は酵素法、特に増幅法、好ましくはＰＣＲ、より好ましくはリアルタイムＰＣＲ法により証明されることを特徴とする、Ａに記載の使用。
【０１３８】
Ｃ）局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための、少なくとも１個の患者試料からインビトロで得られる遺伝子活性の使用であって、当該遺伝子活性は以下のステップを含む方法に基づき得られるところの使用：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）検出可能な標識体による試料核酸及び／又はプローブ核酸の標識。ここでプローブ核酸は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別が可能な遺伝子並びに／若しくは遺伝子座又はそれらの転写産物を示し、プローブ核酸は、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載された少なくとも１つのポリヌクレオチド又はSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載されたそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつ少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む；
ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、試料核酸とプローブ核酸の接触；
ｄ）ハイブリダイズした試料核酸とプローブ核酸の標識シグナルの、特に定量的な検出；
ｅ）局所感染を伴う状態又は全身感染を伴う状態が患者に存在するのかどうかを告知するための、ステップｄ）で得られた標識シグナルと少なくとも１つの参照値の比較。
【０１３９】
Ｄ）局所感染から全身感染若しくは全身感染から局所感染となる感染の治療に伴う経過評価のため及び／又は適切な治療の決定のための、Ｃ）に記載の遺伝子活性データの使用。
【０１４０】
Ｅ）局所又は全身感染を伴う患者の分類のための、Ｃ）又はＤ）に記載の使用。
【０１４１】
Ｆ）発現挙動が同程度であるSEQ ID No. 1〜69をもつポリヌクレオチドの遺伝子活性を遺伝子活性集団と連結させる、Ｃ）〜Ｅ）に記載の使用。
【０１４２】
Ｇ）第２〜４相臨床試験において局所感染又は全身感染を伴う患者の選定基準又は除外基準として、Ｃ）〜Ｄ）に記載の使用。
【０１４３】
Ｈ）さらなる電子的処理のための遺伝子活性データを作成するための、Ｃ）〜Ｇ）に記載の使用。
【０１４４】
Ｉ）診断目的及び／又は患者データ管理システムを支援するものとして、患者個人の予後診断及び／又は疾患経過を記述するためのソフトウェア作成のため、得られた遺伝子活性データを使用する、Ｃ）〜Ｈ）に記載の使用。
【０１４５】
Ｊ）臨床エキスパートシステムの作成及び／又は細胞情報伝達経路のモデル化のために、患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性データを使用する、Ｃ）〜Ｉ）に記載の使用。
【０１４６】
Ｋ）遺伝子活性データの作成のため、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のポリヌクレオチド配列をもち、少なくとも約１０％、特に約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を示す特異遺伝子及び／又は遺伝子断片を使用する、Ｃ）〜Ｊ）に記載の使用。
【０１４７】
Ｌ）遺伝子断片が特に５〜１０００個、好ましくは２０〜２００個、より好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含む、Ｋ）に記載の使用。
【０１４８】
Ｍ）試料核酸はＲＮＡ、特に全ＲＮＡであり、プローブ核酸はＤＮＡ、特にｃＤＮＡであり、又はｍＲＮＡであることを特徴とする、Ｃ）〜Ｌ）に記載の使用。
【０１４９】
Ｎ）遺伝子活性データが遺伝子発現プロフィールを形成することを特徴とする、Ｃ）〜Ｍ）に記載の使用。
【０１５０】
Ｏ）局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別のための、少なくとも１つの患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性の使用であって、当該遺伝子活性は下記のステップを含む方法に基づいて得られるところの使用：
ａ．患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ．増幅条件下で、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載された核酸配列の少なくとも１つと、標識又は非標識合成オリゴヌクレオチドプライマーの接触と再生。ここで、再生部分の長さは５０から２０００ヌクレオチドを含み、マーカーは、局所又は全身感染した患者において異なる量で存在する遺伝子産物を示す；
ｃ．再生核酸鎖の定性的、半定量的又は定量的測定による再生の進捗の検出、及び、増幅された核酸量の評価基準である増幅シグナルを参照核酸量の増幅シグナルと比較することによる一連の活性データの作成。
【０１５１】
Ｐ）増幅バッチは、追加成分、特にデオキシヌクレオチド、ポリメラーゼ、塩、緩衝液、及び核酸に結合する蛍光色素を含むことを特徴とする、Ｏ）に記載の使用。
【０１５２】
Ｑ）局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性のインビトロ測定方法であって、当該方法が以下のステップを含むところの方法：
ａ．患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ．検出可能な標識体による試料核酸及び／又は少なくとも１つのプローブ核酸の標識。
ここでプローブ核酸は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別が可能な遺伝子並びに／若しくは遺伝子座及び／又はそれらの転写産物を示し、プローブ核酸は、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド又はSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドを含む；
ｃ．ハイブリダイゼーション条件下で、試料核酸とプローブ核酸の接触；
ｄ．ハイブリダイズした試料核酸とプローブ核酸の標識シグナルの定量的検出；
ｅ．局所感染を伴う状態又は全身感染を伴う状態が患者に存在するのかどうかを告知するための、ステップｄ）で得られた標識シグナルと少なくとも１つの参照値の比較。
【０１５３】
Ｒ）遺伝子断片が５〜１０００、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むことを特徴とする、Ｑ）に記載の方法。
【０１５４】
Ｓ）SEQ ID No. 1〜SEQ
ID No. 69及び／又はそれらから導かれる配列に従うポリヌクレオチドは、合成類似体、アプタマー、スピーゲルマー（spiegelmers）、及びペプチド拡核酸若しくはモルフォリノ核酸と置き換えられることを特徴とする、Ｑ）〜Ｒ）に記載の方法。
【０１５５】
Ｔ）遺伝子の合成類似体は５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする、Ｓ）に記載の方法。
【０１５６】
Ｕ）遺伝子活性がマイクロアレイにより測定されることを特徴とする、Ｑ）〜Ｔ）に記載の方法。
【０１５７】
Ｖ）試料が、組織、体液、特に血液、血清、血漿、尿、唾液又は細胞若しくは細胞成分、又はこれらの混合物から選択されることを特徴とする、Ｑ）〜Ｕ）に記載の方法。
【０１５８】
Ｗ）細胞内容物を遊離させるため、試料、特に細胞試料を溶解処理することを特徴とする、Ｑ）〜Ｖ）に記載の方法。
【０１５９】
Ｘ）試料核酸はＲＮＡ、特に全ＲＮＡであり、プローブ核酸はＤＮＡ、特にｃＤＮＡであり、又はｍＲＮＡであることを特徴とする、Ｑ）〜Ｗ）に記載の方法。
【０１６０】
Ｙ）ポリヌクレオチド配列SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはプライマー並びに／若しくはプローブ及び／又はこれらに対するアンチセンス、又はこれらが患者の感染状態（局所又は全身）を特異的に確定するもの、及び／又は、患者試料中の遺伝子活性をインビトロで測定するため及び／又は局所から全身へ若しくは全身から局所へという患者の感染経過を確定するための、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチド、を少なくとも１つ含むキット。
【０１６１】
Ｚ）ポリヌクレオチド配列が、遺伝子座、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、特にｓｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ又は転移因子をも含むことを特徴とする、Ｙ）に記載のキット。
【０１６２】
図１において、局所感染及び全身感染を区別するため、関連遺伝子からの無作為選択を説明するためのいわゆるヒートマップが示されている。
図１は、横列において平均値（すなわち、それぞれの遺伝子についてすべての患者の平均値）を中心に置いたそれぞれの転写産物の正規化発現データを説明する。縦列は異なる患者を示す。淡灰色／白色は平均値より高い発現を示し、濃灰色／黒色は平均値より低い発現を示す。
ヒートマップ上部にある淡灰色バーは局所感染を伴う患者を示し、濃灰色バーは全身感染を伴う患者を示す。
さらに当業者に知られている“完全”法を用いて、階層的クラスタリングが横列（転写産物）に対して実行された。ここで用いられた距離はピアソンに従う相関距離である。左側の系統樹によって、転写産物は基本的に４つのクラスターに分類されることがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１に基づけば、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性検出用のポリヌクレオチド並びに／若しくはその遺伝座及び／又はその転写産物の使用に関する。また請求項３及び請求項１５に基づけば、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するために、患者の試料から得られた遺伝子活性を使用することに関する。本発明は、さらに請求項１７に基づけば、インビトロにおける遺伝子活性の測定方法に関し、また、請求項２５に基づけばキットに関する。
【０００２】
本発明は、特に、遺伝子発現分析により局所感染と全身感染を区別するためのマーカー遺伝子並びに／若しくはその断片及びそれらの使用に関する。さらに本発明は、マーカー遺伝子に由来するＰＣＲプライマー及びプローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
リポ多糖などの細菌細胞壁成分は血中サイトカイン濃度の変化をもたらす（Mathiak
2003）。また、プロカルシトニン（ＰＣＴ）やマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）などそれぞれのタンパク質マーカーは、術後感染の指標として用いられる（Siassi 2005）。細菌病原体に対する血液の免疫反応は、また、機能ゲノミクスによって特徴づけることができ（Feezor and Moldawer 2003, M. Foti et al., 2006）、さらに細菌タンパク質は、宿主細胞の転写と翻訳に変化を引き起こす原因となる（Flo 2004）。従って遺伝子発現プロフィールは、抗菌物質の作用機構の決定に使用することができる（Hutter 2004）。血液試料中の遺伝子の転写分析は、生存する敗血症患者と生存しない敗血症患者の相違を明らかにすることに利用される（Pachot 2006）。
【０００４】
さまざまな疾患においてそれぞれの遺伝子の発現変化が知られており、また局所感染の場合、それぞれの発現変化がマウス筋肉組織において記述されており（A. Boelen, 2005）、さらにニワトリ（X. Wang, 2006）又はブタの腸管粘膜（T. A. Niewold, 2006）において局所ウイルス感染した上皮細胞におけるいくつかの遺伝子変化についの記述があるが、局所感染と全身感染の区別のために、マーカー遺伝子とそれらの転写産物についても、また全血試料と血液細胞から得られるいくつかの定量的転写値を組み合わせた使用についても知られていない。また一方、動物モデルで実施された発現分析は、必ずしもヒトの病態生理に置き換えることができるとは限らないことが文献（Rittirsch et al., 2006 and Esmond, 2004）から知られている。
【０００５】
全血中に局在しており、血液、血液細胞及び臓器並びに末梢組織からの細胞に由来する可変濃度の転写産物（またｍＲＮＡや低分子ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡや付加ＲＮＡ）の定量は、血液に基づく診断支援のための必須条件である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Boelen A, Kwakkel J, Alkemade A, et al.Induction of type 3 deiodinase activity in inflammatory cells of mice withchronic local inflammation. Endocrinology.2005 Dec;146(12):5128-34. Epub 2005 Sep 8.
【０００７】
【非特許文献２】BoxG, Cox D. An analysis of transformations (with discussion). Journal of theRoyal Society B 1964; 26, 211-252.
【０００８】
【非特許文献３】Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J, et al., Minimum information about amicroarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat Genet.2001Dec;29(4):365-71.
【０００９】
【非特許文献４】FeezorRJ, Moldawer LL. Genetic Polymorphisms, Functional Genomics and the HostInflammatory Response to Injury and Inflammation. Nestle Nutr Workshop Ser ClinPerform Programme. 2003;8:15-32; discussion 32-7.
【００１０】
【非特許文献５】FloTH, Smith KD, Sato S, et al. Lipocalin 2 mediates an innate immune response tobacterial infection by sequestrating iron. Nature. 2004 Dec16;432(7019):917-21. Epub 2004 Nov 7.
【００１１】
【非特許文献６】FotiM, Granucci F, Pelizzola M, et al. Dendritic cells in pathogen recognition andinduction of immune responses: a functional genomics approach. J Leukoc Biol.2006 May;79(5):913-6.
【００１２】
【非特許文献７】HodgesJL, Lehmann EL. Estimates of location based on rank tests. The Annales ofMathematical Statistics 1963; 34, 598-611.
【００１３】
【非特許文献８】Hutter B, Schaab C, Albrecht S, et al.Prediction of Mechanisms of Action of Antibacterial Compounds by GeneExpression Profiling. AntimicrobAgents Chemother. 2004 Aug;48(8):2838-44.
【００１４】
【非特許文献９】MathiakG, Kabir K, Grass G, et al. Lipopolysaccharides from different bacterialsources elicit disparate cytokine responses in whole blood assays. Int J MolMed. 2003 Jan;11(1):41-4.
【００１５】
【非特許文献１０】NiewoldTA, Veldhuizen EJ, van der Meulen J, et al. The early transcriptional responseof pig small intestinal mucosa to invasion by Salmonella enterica serovartyphimurium DT104. Mol Immunol. 2007 Feb;44(6):1316-22. Epub 2006 Aug 1.
【００１６】
【非特許文献１１】PachotA, Lepape A, Vey S, et al. Systemic transcriptional analysis in survivor andnon-survivor septic shock patients: a preliminary study. Immunol Lett. 2006 Jul15;106(1):63-71. Epub 2006 May 17.
【００１７】
【非特許文献１２】HasteT, Tibshirani R, Friedman J. The Elements of Statistical Learning; Data mining,Inference, and Prediction. Springer 2001.
【００１８】
【非特許文献１３】SiassiM, Riese J, Steffensen R, et al. Mannan-binding lectin and procalcitoninmeasurement for prediction of post-operative infection. Crit Care. 2005 Oct5;9(5):R483-9. Epub 2005 Jul 19.
【００１９】
【非特許文献１４】WangX, Rosa AJ, Oliverira HN, et al. Transcriptome of local innate and adaptiveimmunity during early phase of infectious bronchitis viral infection. VitalImmunol. 2006 Winter;19(4):768-74.
【発明の概要】
【００２０】
本特許出願において開示される発明の出発点は、局所感染や全身感染した場合に、個体試料の血液細胞中に存在している種々の遺伝子の遺伝子活性は、局所感染も全身感染もないと診断された当該個体の遺伝子の遺伝子活性とは異なっており、また血液からの転写産物の疾患依存的な濃度変化を伴うマーカー遺伝子として、共同で又は単独で使用することができるという発見である。これら遺伝子の活性の正規化又は相対的定量化は、診断、予後診断、治療観察及び経過観察を補助するものとして利用することができる。
【００２１】
従って本発明は、生体試料中の疾患関連遺伝子の発現変化を鑑別することによって、局所感染と全身感染の区別、診断並びに／若しくは経過観察及び／又は治療を可能にする手段と方法を提供するという目的に基づく。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】局所感染及び全身感染を区別するため、関連遺伝子からの無作為選択を説明するためのいわゆるヒートマップを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
この目的は、請求項１、３及び１５の特徴によって達成される。
【００２４】
方法に関しては、この目的は請求項１７の特徴によって達成される。
【００２５】
請求項２５に基づくキットは、同様にこの目的を達成する。
【００２６】
従属する請求項は、本発明の好ましい実施態様を示す。
【００２７】
定義
本発明の目的のために、以下の定義を用いる。
【００２８】
局所感染：局所感染とは、病原体が感染部位にとどまり、さらに体内に広がることなく、この位置でのみ症状を引き起こす感染である。例として局所感染には気道感染、下痢、又は皮膚のできものがある。
【００２９】
全身感染とは、病原体が臓器系全体又は生物全体にわたって広がる感染である。
【００３０】
体液：本発明が意図するものの範囲内で、体液とはヒトを含む哺乳動物の任意の体液であると理解される。
【００３１】
遺伝子：遺伝子とは、生物学的に活性のあるリボ核酸（ＲＮＡ）を産生するための基本情報を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上の部分である。本発明が意図するものの範囲内で遺伝子はさらに、導き出された任意のＤＮＡ配列、部分配列及び合成類似体（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ））であると理解される。従ってＲＮＡレベルでの遺伝子発現の測定に関する本発明の記述は、ある制限を構成するものではなく、応用例を構成するものである。
【００３２】
遺伝子座：遺伝子座とはゲノムにおける遺伝子の位置である。ゲノムがいくつかの染色体から成る場合には、遺伝子座は遺伝子がある染色体内の位置をいう。この遺伝子のさまざまな発現又は変異体は対立遺伝子と呼ばれ、すべてが染色体すなわち遺伝子座上の同じ位置にある。従って遺伝子座という用語には、一方においては特定の遺伝子産物に対する純粋な遺伝情報が含まれ、他方では、遺伝子座での遺伝子によって任意の機能又は非機能状況にある任意の調節ＤＮＡ部分及び任意の付加ＤＮＡ配列が含まれる。
【００３３】
遺伝子活性：遺伝子活性とは、転写される遺伝子及び／又は翻訳産物を生成する遺伝子の能力の程度であると理解される。
【００３４】
遺伝子発現とは、遺伝子の生成過程及び／又は遺伝子型の表現型への発現である。
【００３５】
マーカー遺伝子：マーカー遺伝子とは、異なるＲＮＡ試料について、遺伝子の発現及び転写が疾患に関連して変化を示す遺伝子であり、また遺伝子活性の変化が、異なる試料について診断、経過観察及び治療観察の目的に役立つことを示す遺伝子である。
【００３６】
ハイブリダイゼーション条件とは、当業者によく知られており、自由分子と結合分子の熱力学的平衡の達成に影響し得る物理的及び化学的なパラメーターである。最適なハイブリダイゼーション条件のために、プローブ分子とサンプル分子の接触時間、ハイブリダイゼーション緩衝液中のカチオン濃度、温度、容量及びハイブリダイズする分子の濃度や濃度比を相互に調和させなければならない。
【００３７】
増幅条件とは、核酸の形を持つ出発物質の再生産を可能にする、周期的に変化する反応条件である。反応混合物中には、出発物質の相補領域に付着することができる短いオリゴヌクレオチドと同じような、核酸生成のための１つの成分（デオキシヌクレオチド）の他に、ポリメラーゼと呼ばれる核酸合成酵素が存在している。当業者によく知られているカチオン濃度、ｐＨ値、容量及び周期的に繰り返される１つの反応ステップの時間と温度は、増幅の進捗に重要である。
【００３８】
プライマー：本発明の構成においてプライマーと呼ばれるものは、例えばＤＮＡポリメラーゼなどＤＮＡ複製酵素のための出発点としての役目を果たすオリゴヌクレオチドである。プライマーはＤＮＡのみならずＲＮＡでもまた作成される（Primer3；例えば、ＭＩＴの http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
を参照）。
【００３９】
プローブ：本出願においてプローブとは、分子標識（例えば蛍光標識、特に分子ビーコン、TaqMan（登録商標）プローブ、同位体標識など）を備えてもよく、また、標的ＤＮＡ分子及び／又は標的ＲＮＡ分子の配列特異的な検出に用いられる核酸断片（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。
【００４０】
ＰＣＲとは、英語名称である“Polymerase Chain Reaction”の略号である。ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）は、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いて、生体外のインビトロでＤＮＡを複製する方法である。ＰＣＲは、特に本発明に基づけば、興味のあるＤＮＡ鎖の約３０００塩基対までの短い一部を複製するために用いられる。ＤＮＡ鎖は、遺伝子若しくは遺伝子のごく一部、又は非コードＤＮＡ配列であってもよい。当業者は、ＰＣＲ法のすべては“ＰＣＲ”の表現に含まれ、多くのＰＣＲ法は先行技術として知られていることを十分理解している。これは特に“リアルタイムＰＣＲ”について当てはまる。
【００４１】
ＰＣＲプライマー：ＰＣＲは一般的に２本のプライマーを必要とするが、これは、複製されるべき領域が両側で限定される個別の２つの一本鎖ＤＮＡに関して、ＤＮＡ合成のための出発点を固定するためである。このようなプライマーは当業者によく知られており、例えばウェブサイトである“Primer3”；ＭＩＴの http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
を参照することができる。
【００４２】
転写産物：本発明の目的に対して、転写産物とはＤＮＡ鋳型を用いて産生される任意のＲＮＡ産物であると理解される。
【００４３】
低分子ＲＮＡ：一般的な低分子ＲＮＡである。しかしながらこのグループの代表は特に排他的ではない。
ａ）ｓｃＲＮＡ（低分子細胞質ＲＮＡ）は真核生物の細胞質中にあるいくつかの低分子ＲＮＡ分子のひとつである。
ｂ）ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）は細胞核にのみ存在する多くの低分子ＲＮＡ種のひとつである。ｓｎＲＮＡのあるものは、スプライシング又は他のＲＮＡ処理反応に関与する。
ｃ）低分子非タンパク質コードＲＮＡは、いわゆる低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含み、遺伝子発現を多様なレベルで可能にするが、多様なレベルにはクロマチン構造、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ安定性、翻訳、及び、場合により転写とスプライシングも含まれる。一般的にこれらのＲＮＡは、タンパク質コード転写産物を含むより長い一次転写産物であるイントロンとエクソンから、複数の経路を介して処理される。
ヒトゲノムのおよそ１．２％だけがタンパク質をコードするが、それにもかかわらず大部分は転写される。実際のところ、哺乳動物やヒトで見いだされる転写産物のおよそ９８％は、タンパク質コード遺伝子のイントロンや非タンパク質コード遺伝子のエクソンとイントロンといった非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）で構成されており、タンパク質コード遺伝子のアンチセンス又はこれらが重複したものを多く含む。
【００４４】
低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、標的ＲＮＡにおいてヌクレオチドの配列特異的な修飾を調節している。ここで２種類の修飾が生じており、すなわち、2'-O-リボースメチル化と偽ウリジル化であり、これらは、一方でボックスＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡと呼ばれ、他方ではボックスＨ／ＡＣＡ
ｓｎｏＲＮＡと呼ばれる２つの大きなｓｎｏＲＮＡファミリーによって調節されている。そのようなｓｎｏＲＮＡはおよそ６０から３００ヌクレオチドの長さを示す。
【００４５】
ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）とｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）は同じくらいのより低分子のＲＮＡであり、一般的に２１個から２５個のヌクレオチドを有する。ｍｉＲＮＡは内在性の低分子ヘアピン前駆体構造から生じ、翻訳抑制の標的として類似しているが同一ではない配列を持つ他の遺伝子座を使用する。
【００４６】
ｓｉＲＮＡは、しばしば外因性の起源であるより長い二本鎖ＲＮＡ又は長いヘアピンから生じる。ｓｉＲＮＡは、通常、試料の遺伝子座又はゲノム中の他の位置にある相同配列を標的とし、そこでいわゆる遺伝子抑制、ＲＮＡｉともいわれる現象に関与する。
しかしながら、ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとの境界は流動的である。
【００４７】
ｄ）さらに“低分子ＲＮＡ”の表現は、いわゆる転移因子（ＴＥ）、特にレトロエレメントも含むことができる。これらは本発明の目的に対して、“低分子ＲＮＡ”の表現で理解される。
【００４８】
本発明は、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ及び他の測定系で、血液及び血液細胞から正規化され定量的な発現データを測定するための、血液からの新たなマーカー遺伝子の同定、適切なマイクロアレイプローブ及びこれらの使用、さらにこれらを組み合わせた使用について記述する。そして局所炎症の判定のため、また一般的な全身炎症、感染及び全身反応において結果としてそこに生じる免疫反応を区別するため、測定には増幅の有無及び定量化や可視化のさまざまな可能性が伴う。
【００４９】
本発明の方法は、個体の体液サンプル、特に血液サンプル又は組織サンプルについて、局所感染と全身感染を区別することが可能であるということに特徴付けられる。それは、１個又は数個のマーカー遺伝子の活性を用いて、参照遺伝子の遺伝子産物量と比較した、又は当業者に知られたさらなる方法により正規化又は定量化された遺伝子産物の存在と量を確認することによる。
【００５０】
この目的のために開示されるものは、血液及び血液細胞から得られる遺伝子配列とそれらに由来するプローブであり、これらは遺伝子活性と転写産物の測定、可視化、正規化及び定量化に用いることができる。好ましい実施態様におけるオリゴヌクレオチドプローブの配列は表１〜５に示され、添付された配列プロトコールSEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に対応する。ここで、５０〜１００ヌクレオチドの長さをもつ好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドプローブの配列からさらなる配列を推測してもよく、これらは、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69の配列をもつ表１〜５に示された遺伝子の転写産物に特異的に結合する。ＰＣＲなどの増幅方法において使用される配列の長さと組み合わせは、これらが目的とする酵素的な操作と増幅に対応する限りは任意なものでよい。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【００５３】
【表３】
【００５４】
【表４】
【００５５】
【表５】
【００５６】
マーカー遺伝子は単独で使用してもよく、又はいくつかを組み合わせて使用してもよい。ここで記述するように、通常、マーカー遺伝子の活性は、マイクロアレイ用のハイブリダイゼーションプローブを用いて、又はＰＣＲプライマーとリアルタイムＰＣＲを用いて測定することができる。しかしながらマーカー遺伝子とその発現産物は、当業者に知られる他の方法、例えばＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）やさまざまな組み合わせなどでも測定することができる。また、マーカー遺伝子とその発現産物は多くの方法又は可視化を可能にするもの、例えば鎖置換の利用又はモノクローナル抗体の利用などによっても測定することができる。プローブは遺伝子、発現産物（ｍＲＮＡ）、断片又は完全にはｍＲＮＡに加工されない発現中間産物に対して使用することができる。
【００５７】
さらなる実施態様において、プローブは、本発明で開示されるマーカー遺伝子又はこれらの転写産物の特異領域に結合する。また一方で、プローブは、ここで開示される遺伝子配列又はそれから転写された配列の任意の領域と相互作用してもよい。プライマーとプローブは連続する塩基対合を介して相互作用してもよいが、必ずしも全相補配列と連続的に相互作用する必要はない。すなわち、ここでは緩衝液組成、塩濃度、洗浄手段及び温度を可変的に選択することができる。
【００５８】
同様に、マーカー遺伝子の変化は、１つ又はいくつかの参照サンプルの発現値（又はこれらから得られる平均値などのデータ）と比較することができる。参照サンプルは標的サンプルと同時に測定する必要はないが、例えば較正様式又は値若しくは表としてデータベースに保存する。
【００５９】
本発明の１つの実施態様では、発現値は、表１〜５に記載されたマーカー遺伝子の他に、血液及び血液細胞から得られるマーカー遺伝子の核酸及び転写産物を用いて測定される。測定は、１つ又はいくつかの参照サンプルと発現値を比較することにより（公開されていないドイツ国特許出願DE 10 2007 010 252.8号明細書にあるように）及びマーカー核酸との関連でマーカー遺伝子発現を定量することにより行われる。
【００６０】
本発明の他の実施態様は、表１〜５に記載の配列を持つ核酸及びＤＮＡプローブ、及び低分子ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ並びに／若しくは繰り返し体の結合及び／又は血液中に又は血液細胞から得られる表１〜５に記載の転写産物（ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）の結合は、溶液中又は表面若しくは粒子若しくはビーズへの固定化を任意に組み合わせて用いられ、かつ、核酸の結合量（発現値）とプローブに結合した１つ又はいくつかのマーカー核酸を比較することによる正規化及び結合したマーカー核酸と比較する定量化のために、結合した遺伝子転写産物を使用することを特徴とする。
【００６１】
本発明の１つの実施態様には以下の特徴がある。すなわち、参照遺伝子及びマーカー遺伝子に由来するＲＮＡ量の相関に基づいた局所感染と全身感染を、エクスビボ又はインビトロで区別する方法には次のステップが含まれる。すなわち、第２〜４相臨床試験において局所感染又は全身感染を伴う患者の選定基準又は除外基準として請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用。
【００６２】
本発明の他の実施態様は、マーカー遺伝子ＲＮＡを測定する前にマーカー遺伝子ＲＮＡをＤＮＡとハイブリダイズさせ、そして、参照ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のマーキングシグナルを検出し、ある所定の場合においてはさらに変換し、またある所定の場合においては較正曲線又は表の形式で保存することを特徴とする。
【００６３】
本発明の他の実施態様は、マーカー遺伝子又はその一部分のＲＮＡが、配列決定又は部分配列決定によって、例えばピロシーケンスによって同定及び定量されることを特徴とする。
【００６４】
本発明の他の実施態様は、ｍＲＮＡ又はマイクロＲＮＡがマーカー遺伝子ＲＮＡとして使用されることを特徴とする。
【００６５】
本発明の他の実施態様では、ＤＮＡは、マーカー遺伝子ＲＮＡ又はそのインビトロ転写産物の特異結合に使われるマイクロアレイの形態を持つ支持体上の、予め決められた領域において、特に固定化されて用意されることを特徴とする。
【００６６】
本発明の他の実施態様では、生体試料はヒトのものであることが特徴である。
【００６７】
配列ID No.1〜配列ID
No.69の配列は本発明の範囲に含まれ、６９個の配列を含む添付の配列プロトコールに詳細が開示されているので、本発明の一部を構成している。
【００６８】
本発明の他の実施態様では、表１〜５に対応する配列から導かれる固定化又は遊離プローブは標識されていることが特徴である。この実施態様に対して、分子ビーコンと呼ばれる自己相補的オリゴヌクレオチドがプローブとして使用される。このプローブの末端には蛍光色素分子／消光剤対があるので、相補的配列が存在しない場合でもこのプローブは折り畳みヘアピン構造で存在し、対応する試料配列とのみ蛍光シグナルを与える。分子ビーコンのヘアピン構造は、試料が特異的捕捉配列とハイブリダイズし、コンフォーメーション変化とレポーター蛍光の遊離をもたらすまで安定である。
【００６９】
本発明の意味するところの範囲内で、マーカー遺伝子は任意の派生するＤＮＡ配列、すなわち部分配列並びに合成類似体（例えばペプチド核酸、ＰＮＡ）及びアプタマーであると理解される。ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の測定と関連する本発明の記述は、限定を意味するものではなく、応用例を示すものである。
【００７０】
本発明の方法に係る１つの応用は、局所感染と全身感染を区別するために、全血から得られる異なる遺伝子発現の測定データを決定することである。そのために、マーカー遺伝子のＲＮＡは対応する患者の全血から単離される。その後ＲＮＡは標識される。標識には、例えば３２Ｐによる放射活性標識又は色素分子（蛍光）による標識がある。この目的のために、従来から知られている任意の分子及び／又は検出シグナルを標識分子として利用することができる。対応する分子及び／又は方法は、当業者に等しく知られている。
【００７１】
１．上記のように標識したＲＮＡは、次いで、マイクロアレイ上に固定化したＤＮＡ分子とハイブリダイズさせる。本発明に従えば、マイクロアレイ上に固定化したＤＮＡ分子は、局所感染と全身感染を区別するための遺伝子の特異的選択性を示す。
【００７２】
２．続いて、ハイブリダイズした分子のシグナル強度は、従来よく知られている適切な測定装置（蛍光体撮像装置、マイクロアレイスキャナー）で測定され、さらにソフトウェア支援評価により分析される。患者試料のマーカー遺伝子と参照遺伝子間の発現比率は、測定されたシグナル強度から決定される。下方及び／又は上方に制御された遺伝子の発現比率から、以下に示される実験のように、局所感染と全身感染の区別に関する結果を出すことが可能である。
【００７３】
３．本発明の方法に係る他の応用は、計画された治療に患者が反応する可能性を、治療しながら判定すること、及び／又は特殊な治療への反応を判定し、並びに／若しくは全身感染が確認された患者において“薬物モニタリング”という意味における治療の終点の固定と全身感染の重症度の判定のための、特異的な遺伝子発現の測定にある。そのために、ＲＮＡ（検査ＲＮＡ及び参照ＲＮＡ）は、経時的に集められた患者の血液試料から単離される。異なるＲＮＡ試料は一緒に標識され、マイクロアレイ上に固定化された選択されたマーカー遺伝子及び参照遺伝子とハイブリダイズさせる。１つ又はいくつかの参照遺伝子とマーカー遺伝子間の発現比率に基づき、計画された治療に患者が反応する可能性、及び／又は開始された治療が有効であるかどうか、並びに／若しくはどれくらい長く患者は対応して治療を受けなければならいのか、並びに／若しくは用いられた用量と継続期間で最大治療効果にすでに達したのかどうか、を評価することが可能である。
【００７４】
本発明の方法に係る他の応用は、ハイブリダイゼーション非依存的方法、特に酵素又は化学的加水分解、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、それに続く核酸及び／又はこの誘導体並びに／若しくは断片の定量化により定量的情報を得るため、本発明に基づく遺伝子のＲＮＡを使用することにある。
【００７５】
４．ＰＣＲ（また例えばＮＡＳＢＡなどの付加的増幅方法）により増幅及び定量された参照遺伝子の転写産物は、局所並びに全身感染及びそれらの重症度の判別における遺伝子発現データの正規化のために、本発明に従う他の実施態様を構成する。増幅された転写産物のシグナル強度は、次いで適切な測定装置（ＰＣＲ蛍光検出器）により測定され、さらにソフトウェア支援評価により分析される。測定されたシグナル強度から患者試料のマーカー遺伝子と参照遺伝子間の発現比率が測定される。以下で示される試験の通り、下方及び／又は上方に制御された遺伝子の発現比率に基づき、局所感染と全身感染の区別及び所定の場合にはそれらの重症度に関する結果を出すことが可能である。
【００７６】
本発明の方法に係る他の応用は、いくつかの試料において、任意に増幅したｍＲＮＡ定量の正規化にある。これには、ａ）異なる試料にわたって、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69より選択された１つ又はいくつかの核酸の発現値の比較；ｂ）いくつかの試料にわたって、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69より選択された１つ又はいくつかの核酸の発現値の正規化のための値の導出、及びｃ）前記ステップｂ）に基づき、いくつかの試料から単離された他の核酸の発現についての正規化、が含まれる。
【００７７】
本発明はさらに、マーカー遺伝子としての使用を目的とし、患者試料における遺伝子発現プロフィールのインビトロ測定を行うため、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載の配列及び／又は少なくとも１〜１００個、好ましい実施態様では１〜５個及び１〜１０個の核酸を含むこれらの遺伝子断片をもつポリヌクレオチドの選択を含むキットに関する。
【００７８】
本発明はさらに、マーカー遺伝子としての使用を目的とし、患者試料における遺伝子発現プロフィールのインビトロ測定を行うため、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載のハイブリダイゼーションプローブ及び／又は少なくとも５０個のヌクレオチドを含むこれらの遺伝子断片の選択を含むキットに関する。
【００７９】
本発明の別の実施態様は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するために、少なくとも１つの患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性を使用することにある。当該遺伝子活性は、下記のステップを含む方法により得られる：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）増幅条件下で、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載の核酸配列と標識又は非標識合成オリゴヌクレオチドプライマーの接触と再生。ここで、再生部分の長さは５０から３０００ヌクレオチドを含み、マーカーは、局所又は全身感染した患者において異なる量で存在するこれらの遺伝子産物を示す；
ｃ）再生核酸鎖の定性的、半定量的又は定量的測定による再生の進捗の検出、及び増幅された核酸量の評価基準である増幅シグナルと参照核酸量の増幅シグナルとの比較による一連の活性データの作成。
【００８０】
マイクロアレイ又はその他の定量法、例えばリアルタイムＰＣＲにより測定された遺伝子活性と遺伝子発現についての他の応用は、診断目的（例えば、特に細菌感染における個体の免疫反応の重症度を評価するため、また患者データ管理システム又はエキスパートシステムの枠組みにおけるもの）のソフトウェアを作成するためのさらなる電子的処理のための、又は細胞情報伝達経路のモデル化のための、局所及び全身感染の判別を目的とした利用にある。
【００８１】
本発明の他の実施態様は、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つ、特に核酸プローブ又は相補体は、マーカー遺伝子の転写産物又はその相補体との結合に用いられることを特徴とする。
【００８２】
本発明の他の実施態様は、参照遺伝子の転写産物と結合するマーカー遺伝子の合成類似体又は合成オリゴヌクレオチドが、特におよそ６０塩基対を含むことを特徴とする。
【００８３】
本発明の他の実施態様は、放射活性標識、特に３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３３Ｐ又は３Ｈを検出可能な標識として用いることを特徴とする。
【００８４】
本発明の他の実施態様は、非放射活性標識、特に色素又は蛍光標識、酵素標識若しくは免疫標識及び／又は量子ドット若しくは電気的に測定可能なシグナル、特に、例えばハイブリダイゼーションにおける電位並びに／若しくは伝導度及び／又は容量の変化を検出可能な標識として用いることを特徴とする。
【００８５】
本発明の他の実施態様は、マーカー遺伝子ＲＮＡ並びに参照ＲＮＡ及び／又はそれらの酵素的若しくは化学的誘導体は同じ標識を持つことを特徴とする。
【００８６】
本発明の他の実施態様は、マーカー遺伝子ＲＮＡ並びに参照ＲＮＡ及び／又は酵素的若しくは化学的誘導体は異なる標識を持つことを特徴とする。
【００８７】
本発明の他の実施態様は、核酸プローブは支持体材料、例えばガラス又はプラスチックなどに固定化されることを特徴とする。
【００８８】
本発明の他の実施態様は、個々のＤＮＡ分子は共有結合により支持体材料に固定化されることを特徴とする。
【００８９】
本発明の他の実施態様は、個々のＤＮＡ分子は、静電相互作用並びに／若しくは双極子間相互作用並びに／若しく疎水性相互作用及び／又は水素ブリッジによって支持体材料に固定化されることを特徴とする。
【００９０】
当業者は、請求項及び明細書に示された本発明の個々の特徴は、なんら制限されることなく任意にお互いを結びつけることができるということを承知する。
【００９１】
請求項２５に記載のキット及びポリヌクレオチドの集団は、等しく本発明の目的を達成する。
【００９２】
さらに本発明は、局所又は全身感染を伴う患者の治療に伴う経過評価に役立つ。
【００９３】
また本発明は、“インシリコ”エキスパートシステムの作成及び／又は細胞情報伝達経路の“インシリコ”モデル化に対して使用することができる。
【００９４】
本発明に従って遺伝子発現プロフィールを作成するため、表１〜５に記載されたSEQ ID
No.1〜SEQ ID No.69から成る群、及び少なくとも５〜２０００個、好ましくは２０〜２００個、さらに好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むこれらの遺伝子断片から選ばれる複数の特異遺伝子及び／又は遺伝子断片が用いられる。
【００９５】
さらに本発明は、標的遺伝子の不活性化若しくは活性化及び／又は活性変換のための、及び／又は、局所又は全身感染及び局所感染から全身感染への患者の経過を監視するための遺伝子活性の測定のための、患者試料からインビトロで得られた遺伝子発現プロフィールの使用、及び／又は、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69から成る群及び少なくとも５〜２０００個、好ましくは２０〜２００個、さらに好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むこれらの遺伝子断片より選ばれ、この目的のために使用されるプローブの使用に関する。
【００９６】
本発明の他の実施態様は、特異マーカー遺伝子及び／又は遺伝子断片の少なくとも１つは、SEQ
ID No.1〜SEQ ID No.69から成る群及び少なくとも５〜２０００個、好ましくは２０〜２００個、さらに好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むこれらの遺伝子断片より選ばれることを特徴とする。
【００９７】
本発明の他の実施態様は、少なくとも２〜６９個の異なるｃＤＮＡが使用されることを特徴とする。
【００９８】
本発明の他の実施態様は、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載された遺伝子若しくは遺伝子断片及び／又はそれらのＲＮＡから導かれる配列は、対応する合成類似体、アプタマー及びペプチド核酸と置き換えられることを特徴とする。
【００９９】
本発明の他の実施態様は、遺伝子の合成類似体は５〜１００塩基対、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする。
【０１００】
本発明の他の実施態様は、遺伝子活性がハイブリダイゼーション法により測定されることを特徴とする。
【０１０１】
本発明の他の実施態様は、遺伝子活性がマイクロアレイにより測定されることを特徴とする。
【０１０２】
本発明の他の実施態様は、遺伝子活性がハイブリダイゼーション非依存性の方法、特に酵素的及び／又は増幅方法、好ましくはＰＣＲとそれに続く核酸並びに／若しくは誘導体及び／又はこれらの断片の定量、により測定されることを特徴とする。
【０１０３】
本発明の他の実施態様は、細胞内容物を遊離させるため、細胞試料を任意に溶解処理することを特徴とする。
【０１０４】
血液に関連する本発明の記述は、本発明の１つの応用例を示すのみである。
【０１０５】
本教示の完全な開示のために、最初に提出された特許請求の範囲は当業者が関係する任意の請求項及び／又は請求項の組み合わせの開示を含むということに留意する。
【０１０６】
患者データは表６〜８より取得することができる。
追加的な有利な点と特徴は実施例と図面に由来する。
図１は、局所感染及び全身感染を区別するため、関連遺伝子からの無作為選択を説明するためのヒートマップを示す。
【実施例】
【０１０７】
マイクロアレイ実験の説明
（Brazma et al. 2001に基づくMinimum Information About a Microarray Experiment [MIAME] checklist − 新版January 2005に従う。）。これは参考文献としてここに完全に組み込まれる。
【０１０８】
スライドの読み込み／スキャナー技術仕様
ａ）スキャナー：GenePix 4000B共焦点落射式蛍光スキャナー（アキソン・インスツルメンツ（Axon Instruments））
ｂ）スキャニングソフトウェア：GenePix Pro 4.0又は5.0
ｃ）スキャン条件：レーザー出力： Ｃｙ３チャンネル−１００％
Ｃｙ５チャンネル−１００％
ＰＭＴ電圧： Ｃｙ３チャンネル−７００Ｖ
Ｃｙ５チャンネル−８００Ｖ
ｄ）空間分解能（画素空間）−１０μｍ
【０１０９】
データの出力と処理
実験の枠組みにおいて、患者の５９個の血液試料からのＲＮＡをハイブリダイズした。それぞれのＲＮＡ対（患者対比較ＲＮＡ）はマイクロアレイ上で共ハイブリダイズした。患者ＲＮＡは赤色蛍光色素で標識し、比較ＲＮＡは緑色蛍光色素で標識した。ハイブリダイズアレイのデジタル画像はアキソン・インスツルメンツのGenePix Pro 4.0又は5.0により評価した。スポットの検出、シグナルの定量化及びスポット特性の評価のために、GenePix（登録商標）分析ソフトウェアを使用した。GenePix（登録商標）ソフトウェアの設定に従い、スポットは１００＝“良”、０＝“検出”、−５０＝“未検出”、−７５＝“不存在”、−１００＝“偽”として分類した。生データは対応するファイルに保存した。
【０１１０】
正規化、変換及びデータ選択方法
ｅ）シグナルデータの変換及び正規化
シグナルデータはボックス−コックスべき変換（Box and Cox 1964）、中央値及びＭＡＤ（中央値からの絶対偏差の中央値）を用いて正規化した。
【０１１１】
ｆ）除去
マイクロアレイ上の技術上の反復（同一試料についての重複スポット）は、スポット特性に基づいて、修正及び変換シグナル強度から除去した。それぞれのスポットについて、最高の特性評価をした反復を選び、関連したシグナル強度を平均した。まったく測定できない反復をもつスポット発現は“ＮＡ”（利用不可）に指定した。
【０１１２】
実施例１
血液及び血液細胞から局所感染又は全身感染の識別に用いるマーカー遺伝子の同定：
遺伝子発現の測定
５１例の集中治療室（ＩＣＵ）患者について遺伝子発現を測定した。そこには１５例の局所感染患者及び３６例の全身感染患者がいた。分析において、患者一人あたり１日のＩＣＵ日で検討した（表６）。SIG-M5細胞株からの全ＲＮＡを参照試料とした。すべての患者試料は個別のマイクロアレイ上で参照試料と共ハイブリダイズさせた。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
実験の説明
血液の採取とＲＮＡの単離
患者の全血は、PAXGeneキットを用いて製造者（キアゲン（Qiagen））の仕様書に従い、集中治療室において患者から採取した。全血の採取後、試料の全ＲＮＡはPAXGene血液ＲＮＡキットを用いて製造者（キアゲン（Qiagen））仕様書に従い単離した。
【０１１５】
細胞培養
細胞培養（対照試料）について、１９本の冷凍培養細胞（SIGM5）（液体窒素中で冷凍させたもの）を利用した。細胞はそれぞれ２ｍｌの２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）添加イスコフ培地（Biochrom AG）に播種した。培養細胞は１２ウェルプレート中、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間培養した。次いで１２ウェルの内容物を等量の２部に分割し、最終的に同一形式の３枚のプレートを得た（全部で３６ウェル）。培養は同一条件で２４時間継続した。この後、各プレートの１２ウェルから得られた培養物をまとめ、遠心分離（１０００×ｇ、５分、室温）した。その上清を捨て、細胞沈殿物は上記に特定した培地４０ｍｌに懸濁した。この４０ｍｌの懸濁細胞は、２本の２５０ｍｌ試験管に等しく分け入れ、４８時間の培養後、上記に特定した培地を５ｍｌ追加してもう一度培養した。残り２枚のプレートに残っている２ｍｌのうち８０μｌを、予め１ｍｌの培地を入れて用意していた同一プレートの空ウェルに入れた。４８時間の培養後、１２ウェルプレートの1つのみを次のように処理した：各ウェルより５００μｌを採取しまとめた。結果として得られた６ｍｌを、およそ１０ｍｌの新鮮培地を含む１本の２５０ｍｌ試験管に入れた。この混合物を室温で１０００×ｇ、５分間遠心分離し、上記に特定した培地１０ｍｌに懸濁した。その後の細胞計測では次の結果が得られた：１ｍｌあたりの細胞数は１．５×１０７個、全容量は１０ｍｌ、全細胞数は１．５×１０８個。細胞数がまだ十分ではなかったので、上記に特定した細胞懸濁液の２．５ｍｌを、２５０ｍｌ（７５ｃｍ２）試験管（全部で４本の試験管）中で上記に特定した培地３０ｍｌ中に入れた。７２時間の培養後、新鮮培地のそれぞれ２０ｍｌを試験管に入れた。２４時間の培養後、上記記載に従って細胞計測を行い、全細胞数は３．８×１０８個となった。所望する細胞数である２×１０６個を得るため、細胞を４本の試験管中で上記に特定した培地４７．５ｍｌ中に再懸濁した。２４時間の培養時間後、細胞を遠心分離し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋不含リン酸緩衝液（Biochrom AG）で２回洗浄した。
【０１１６】
全ＲＮＡの単離は、NucleoSpin ＲＮＡ Ｌキット（Machery & Nagel）を用い製造者仕様書に従って行った。上述の手順は所要の細胞数が得られるまで繰り返した。これは全ＲＮＡの所要量６ｍｇを得るために必要であり、１０８個の細胞あたり６００μｇのＲＮＡ効率におおよそ対応していた。
【０１１７】
逆転写／標識／ハイブリダイゼーション
全血採取後、試料の全ＲＮＡを単離し、その特性についてPAXGene血液ＲＮＡキット（PreAnalytiX）を用い製造者仕様書に従って調べた。各サンプルから１０μｇの全ＲＮＡを取り出し、参照ＲＮＡとしてSIGM5細胞からの全ＲＮＡの１０μｇと一緒に、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩ（インビトロジェン（Invitrogen））を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ書き換えた。続いてＲＮＡをアルカリ加水分解によりバッチより除去した。反応バッチにおいてｄＴＴＰの一部は、後でｃＤＮＡへの蛍光色素のカップリングを可能にするため、アミノアリルｄＵＴＰ（ＡＡ−ｄＵＴＰ）と置き換えた。
【０１１８】
反応バッチの精製後、試料及び対照のｃＤＮＡを蛍光色素のＡｌｅｘａ６４７及びＡｌｅｘａ５５５と共有結合させて標識し、SIRS-Lab社のマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。使用したマイクロアレイ上には５５〜７０塩基対の長さをもつ固定化ポリヌクレオチドが５３０８個あり、それぞれは１つのヒト遺伝子、及び品質保証のための対照スポットに相当する。１つの例示のマイクロアレイは、１５×１５のラスタースポットを有する２８個のサブアレイに分割される。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション及び引き続く洗浄並びに乾燥は、それぞれハイブリダイゼーションステーションＨＳ４００（テカン（Tacan））中で製造者仕様書に従い、４２℃で１０．５時間行った。使用したハイブリダイゼーション溶液は、それぞれの標識ｃＤＮＡ試料、３．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）、０．３％ドデシル硫酸ナトリウム（ｖ／ｖ）、２５％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、及び０．８μｇ／μｌ cot-1 ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ並びにポリ−Ａ ＲＮＡそれぞれから成る。引き続くマイクロアレイの洗浄は、以下のプログラムにより室温で行った：洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．０３％ドデシル硫酸ナトリウム）、洗浄緩衝液２（１×ＳＳＣ）、及び最後に洗浄緩衝液３（０．２×ＳＳＣ）でそれぞれ９０秒の洗浄。次いでマイクロアレイは窒素流下、２．５バールの圧力で３０℃、１５０秒間乾燥させた。
【０１２０】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルはGenePix
4000Bスキャナー（Axon）を用いて読み出し、区別された発現遺伝子の発現比率をソフトウェアGenePix Pro 4.0（Axon）を用いて測定した。
【０１２１】
評価：
評価のために、スポットの平均強度を関連スポット画素の中央値として測定した。
【０１２２】
正規化：
追加分析のためには赤色シグナル強度のみを使用した。それぞれのアレイは、ボックス−コックスべき変換（Box and Cox 1964）、中央値及びＭＡＤ（中央値からの絶対偏差の中央値）を用いて個々に正規化した。
【０１２３】
分類遺伝子試料の選択：
分類遺伝子試料の選択は、いわゆるフィルターを用いて行った。最初に、最大の変動係数をもつ１０００個の遺伝子試料を決定した。次いで２つのグループ（局所感染と全身感染）を、これら１０００個の遺伝子に基づいてマンホイットニー検定を用いて相互に比較した。ｐ値が０．００１以下である遺伝子試料をホッジス−レーマン推定量を用いて用意し、最高の推定値（絶対量）を示す遺伝子プローブを分類に用いた。
【０１２４】
分類：
分類のために、ｋ−最近隣法をｋ＝３で用いた。分類誤算は１０倍相互検証の１００回繰り返しによって推定した。
【０１２５】
遺伝子試料の最適数：
相互検証によって推定した分類誤差の最小値は、６９個の遺伝子試料で実現された。表１〜５に示された６９個の遺伝子試料への固定は、ブートストラップ法を用いて実行された。従って、ブートストラップ試料による最良の６９個の遺伝子試料の選択は５０００回繰り返され、その後、遺伝子試料はそれらの選択頻度に従って分類された。
【０１２６】
分類誤差：
表１〜５に示された６９個の遺伝子試料について、１０倍相互検証の１００回繰り返しによって推定した分類誤差は全体で１５．７％である。局所感染患者群では分類誤差は２６．７％であり、全身感染患者群では分類誤差は１１．１％である。従って全身感染患者では、約９０％の安全性であることが確認される。
【０１２７】
実施例２
全身感染から局所感染への患者経過による分類遺伝子の検証
【０１２８】
遺伝子発現の測定：
無作為に選択したＩＣＵ患者で、感染が全身から局所に変化した患者の遺伝子発現を測定した。分析においては、患者についての８連続ＩＣＵ日で検討した。
細胞株SIG-M5から得た全ＲＮＡを参照試料とした。
すべての患者試料は、それぞれのマイクロアレイ上で参照試料とともに共ハイブリダイズした（表７、８）。
【０１２９】
【表７】
【０１３０】
【表８】
【０１３１】
正規化：
追加分析のためには赤色シグナル強度のみを利用した。それぞれのアレイは、ボックス−コックスべき変換、中央値及びＭＡＤ（中央値からの絶対偏差の中央値）を用いて個々に正規化した。
【０１３２】
分類遺伝子試料の選択：
患者日の分類のため、３１個の遺伝子プローブの一部を用いた。その構成は次の通りである。
Seq ID： 5, 6, 9,
10 - 14, 17, 18, 23〜26, 31, 37, 38, 40, 43, 45〜48, 51, 53, 55〜57, 62, 66, 67.
【０１３３】
分類：
分類はｋ−最近隣法をｋ＝３で行った。訓練データセットとして、実施例１に記載した患者を用いた。
【０１３４】
分類誤差：
すべての患者日（第１〜６日：全身感染、第７、８日：局所感染）は正確に分類された。
【０１３５】
以下には発明の他の実施態様を示し、これらもまた本目的を達成するために適している。
【０１３６】
Ａ）局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性の検出に対するSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはそれらの遺伝子座及び／又はそれらの転写産物に従うそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつ少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載の配列の少なくとも１つが用いられる使用。
【０１３７】
Ｂ）遺伝子活性が、ハイブリダイゼーション法、特にマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション法及び／又は酵素法、特に増幅法、好ましくはＰＣＲ、より好ましくはリアルタイムＰＣＲ法により証明されることを特徴とする、Ａに記載の使用。
【０１３８】
Ｃ）局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための、少なくとも１個の患者試料からインビトロで得られる遺伝子活性の使用であって、当該遺伝子活性は以下のステップを含む方法に基づき得られるところの使用：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）検出可能な標識体による試料核酸及び／又はプローブ核酸の標識。ここでプローブ核酸は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別が可能な遺伝子並びに／若しくは遺伝子座又はそれらの転写産物を示し、プローブ核酸は、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載された少なくとも１つのポリヌクレオチド又はSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載されたそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつ少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む；
ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、試料核酸とプローブ核酸の接触；
ｄ）ハイブリダイズした試料核酸とプローブ核酸の標識シグナルの、特に定量的な検出；
ｅ）局所感染を伴う状態又は全身感染を伴う状態が患者に存在するのかどうかを告知するための、ステップｄ）で得られた標識シグナルと少なくとも１つの参照値の比較。
【０１３９】
Ｄ）局所感染から全身感染若しくは全身感染から局所感染となる感染の治療に伴う経過評価のため及び／又は適切な治療の決定のための、Ｃ）に記載の遺伝子活性データの使用。
【０１４０】
Ｅ）局所又は全身感染を伴う患者の分類のための、Ｃ）又はＤ）に記載の使用。
【０１４１】
Ｆ）発現挙動が同程度であるSEQ ID No. 1〜69をもつポリヌクレオチドの遺伝子活性を遺伝子活性集団と連結させる、Ｃ）〜Ｅ）に記載の使用。
【０１４２】
Ｇ）第２〜４相臨床試験において局所感染又は全身感染を伴う患者の選定基準又は除外基準として、Ｃ）〜Ｄ）に記載の使用。
【０１４３】
Ｈ）さらなる電子的処理のための遺伝子活性データを作成するための、Ｃ）〜Ｇ）に記載の使用。
【０１４４】
Ｉ）診断目的及び／又は患者データ管理システムを支援するものとして、患者個人の予後診断及び／又は疾患経過を記述するためのソフトウェア作成のため、得られた遺伝子活性データを使用する、Ｃ）〜Ｈ）に記載の使用。
【０１４５】
Ｊ）臨床エキスパートシステムの作成及び／又は細胞情報伝達経路のモデル化のために、患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性データを使用する、Ｃ）〜Ｉ）に記載の使用。
【０１４６】
Ｋ）遺伝子活性データの作成のため、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のポリヌクレオチド配列をもち、少なくとも約１０％、特に約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を示す特異遺伝子及び／又は遺伝子断片を使用する、Ｃ）〜Ｊ）に記載の使用。
【０１４７】
Ｌ）遺伝子断片が特に５〜１０００個、好ましくは２０〜２００個、より好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含む、Ｋ）に記載の使用。
【０１４８】
Ｍ）試料核酸はＲＮＡ、特に全ＲＮＡであり、プローブ核酸はＤＮＡ、特にｃＤＮＡであり、又はｍＲＮＡであることを特徴とする、Ｃ）〜Ｌ）に記載の使用。
【０１４９】
Ｎ）遺伝子活性データが遺伝子発現プロフィールを形成することを特徴とする、Ｃ）〜Ｍ）に記載の使用。
【０１５０】
Ｏ）局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別のための、少なくとも１つの患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性の使用であって、当該遺伝子活性は下記のステップを含む方法に基づいて得られるところの使用：
ａ．患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ．増幅条件下で、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載された核酸配列の少なくとも１つと、標識又は非標識合成オリゴヌクレオチドプライマーの接触と再生。ここで、再生部分の長さは５０から２０００ヌクレオチドを含み、マーカーは、局所又は全身感染した患者において異なる量で存在する遺伝子産物を示す；
ｃ．再生核酸鎖の定性的、半定量的又は定量的測定による再生の進捗の検出、及び、増幅された核酸量の評価基準である増幅シグナルを参照核酸量の増幅シグナルと比較することによる一連の活性データの作成。
【０１５１】
Ｐ）増幅バッチは、追加成分、特にデオキシヌクレオチド、ポリメラーゼ、塩、緩衝液、及び核酸に結合する蛍光色素を含むことを特徴とする、Ｏ）に記載の使用。
【０１５２】
Ｑ）局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性のインビトロ測定方法であって、当該方法が以下のステップを含むところの方法：
ａ．患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ．検出可能な標識体による試料核酸及び／又は少なくとも１つのプローブ核酸の標識。
ここでプローブ核酸は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別が可能な遺伝子並びに／若しくは遺伝子座及び／又はそれらの転写産物を示し、プローブ核酸は、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド又はSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドを含む；
ｃ．ハイブリダイゼーション条件下で、試料核酸とプローブ核酸の接触；
ｄ．ハイブリダイズした試料核酸とプローブ核酸の標識シグナルの定量的検出；
ｅ．局所感染を伴う状態又は全身感染を伴う状態が患者に存在するのかどうかを告知するための、ステップｄ）で得られた標識シグナルと少なくとも１つの参照値の比較。
【０１５３】
Ｒ）遺伝子断片が５〜１０００、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むことを特徴とする、Ｑ）に記載の方法。
【０１５４】
Ｓ）SEQ ID No. 1〜SEQ
ID No. 69及び／又はそれらから導かれる配列に従うポリヌクレオチドは、合成類似体、アプタマー、スピーゲルマー（spiegelmers）、及びペプチド拡核酸若しくはモルフォリノ核酸と置き換えられることを特徴とする、Ｑ）〜Ｒ）に記載の方法。
【０１５５】
Ｔ）遺伝子の合成類似体は５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする、Ｓ）に記載の方法。
【０１５６】
Ｕ）遺伝子活性がマイクロアレイにより測定されることを特徴とする、Ｑ）〜Ｔ）に記載の方法。
【０１５７】
Ｖ）試料が、組織、体液、特に血液、血清、血漿、尿、唾液又は細胞若しくは細胞成分、又はこれらの混合物から選択されることを特徴とする、Ｑ）〜Ｕ）に記載の方法。
【０１５８】
Ｗ）細胞内容物を遊離させるため、試料、特に細胞試料を溶解処理することを特徴とする、Ｑ）〜Ｖ）に記載の方法。
【０１５９】
Ｘ）試料核酸はＲＮＡ、特に全ＲＮＡであり、プローブ核酸はＤＮＡ、特にｃＤＮＡであり、又はｍＲＮＡであることを特徴とする、Ｑ）〜Ｗ）に記載の方法。
【０１６０】
Ｙ）ポリヌクレオチド配列SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはプライマー並びに／若しくはプローブ及び／又はこれらに対するアンチセンス、又はこれらが患者の感染状態（局所又は全身）を特異的に確定するもの、及び／又は、患者試料中の遺伝子活性をインビトロで測定するため及び／又は局所から全身へ若しくは全身から局所へという患者の感染経過を確定するための、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチド、を少なくとも１つ含むキット。
【０１６１】
Ｚ）ポリヌクレオチド配列が、遺伝子座、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、特にｓｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ又は転移因子をも含むことを特徴とする、Ｙ）に記載のキット。
【０１６２】
図１において、局所感染及び全身感染を区別するため、関連遺伝子からの無作為選択を説明するためのいわゆるヒートマップが示されている。
図１は、横列において平均値（すなわち、それぞれの遺伝子についてすべての患者の平均値）を中心に置いたそれぞれの転写産物の正規化発現データを説明する。縦列は異なる患者を示す。淡灰色／白色は平均値より高い発現を示し、濃灰色／黒色は平均値より低い発現を示す。
ヒートマップ上部にある淡灰色バーは局所感染を伴う患者を示し、濃灰色バーは全身感染を伴う患者を示す。
さらに当業者に知られている“完全”法を用いて、階層的クラスタリングが横列（転写産物）に対して実行された。ここで用いられた距離はピアソンに従う相関距離である。左側の系統樹によって、転写産物は基本的に４つのクラスターに分類されることがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性の検出に対するSEQ
ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはそれらの遺伝子座及び／又はそれらの転写産物に従うそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドの使用であって、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載の配列のすべてが用いられる使用。
【請求項２】
前記遺伝子活性が、ハイブリダイゼーション法、特にマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション法及び／又は酵素法、特に増幅法、好ましくはＰＣＲ，より好ましくはリアルタイムＰＣＲ法により検出されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための、少なくとも１個の患者試料からインビトロで得られる遺伝子活性の使用であって、当該遺伝子活性は以下のステップを含む方法に基づき得られるところの使用：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）検出可能な標識体による試料核酸及び／又はプローブ核酸の標識。ここでプローブ核酸は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別が可能な遺伝子並びに／若しくは遺伝子座又はそれらの転写産物を示し、またプローブ核酸は、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載されたすべてのポリヌクレオチド又はSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載されたそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドを含む；
ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、試料核酸とプローブ核酸の接触；
ｄ）ハイブリダイズした試料核酸とプローブ核酸の標識シグナルの定量的な検出；
ｅ）局所感染を伴う状態又は全身感染を伴う状態が患者に存在するのかどうかを告知するための、ステップｄ）で得られた標識シグナルと少なくとも１つの参照値の比較。
【請求項４】
局所感染から全身感染若しくは全身感染から局所感染となる感染の治療に伴う経過評価のため及び／又は適切な治療の決定のための、請求項３に記載の遺伝子活性データの使用。
【請求項５】
局所又は全身感染を伴う患者の分類のための、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
発現挙動が同程度であるSEQ ID No. 1〜69をもつポリヌクレオチドの遺伝子活性を遺伝子活性集団と連結させる、請求項３〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
第２〜４相臨床試験において局所感染又は全身感染を伴う患者の選定基準又は除外基準として、請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
さらなる電子的処理のための遺伝子活性データを作成するための、請求項３〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
診断目的及び／又は患者データ管理システムを支援するものとして、患者個人の予後診断及び／又は疾患経過を記述するためのソフトウェア作成のため、得られた遺伝子活性データを使用する、請求項３〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
臨床エキスパートシステムの作成及び／又は細胞情報伝達経路のモデル化のために、患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性データを使用する、請求項３〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
遺伝子活性データの作成のために、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のポリヌクレオチド配列をもち、少なくとも約１０％、特に約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を示す特異遺伝子及び／又は遺伝子断片を使用する、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
遺伝子断片が特に５〜１０００個、好ましくは２０〜２００個、より好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
試料核酸はＲＮＡ、特に全ＲＮＡであり、プローブ核酸はＤＮＡ、特にｃＤＮＡであり、又はｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
遺伝子活性データが遺伝子発現プロフィールを形成することを特徴とする、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別のための、少なくとも１つの患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性の使用であって、当該遺伝子活性は下記のステップを含む方法に基づいて得られるところの使用：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）増幅条件下で、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載された核酸配列と標識又は非標識合成オリゴヌクレオチドプライマーの接触と再生。ここで、再生部分の長さは５０から２０００ヌクレオチドを含み、マーカーは、局所又は全身感染した患者において異なる量で存在する遺伝子産物を示す；
ｃ）再生核酸鎖の定性的、半定量的又は定量的測定による再生の進捗の検出、及び、増幅された核酸量の評価基準である増幅シグナルを参照核酸量の増幅シグナルと比較することによる一連の活性データの作成。
【請求項１６】
増幅バッチは、追加成分、特にデオキシヌクレオチド、ポリメラーゼ、塩、緩衝液、及び核酸に結合する蛍光色素を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性のインビトロ測定方法であって、当該方法が以下のステップを含むところの方法：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）検出可能な標識体による試料核酸及び／又はプローブ核酸の標識。ここでプローブ核酸は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別が可能な遺伝子並びに／若しくは遺伝子座又はそれらの転写産物を示し、またプローブ核酸は、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のすべてのポリヌクレオチド又はSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドを含む；
ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、試料核酸とプローブ核酸の接触；
ｄ）ハイブリダイズした試料核酸とプローブ核酸の標識シグナルの定量的検出；
ｅ）局所感染を伴う状態又は全身感染を伴う状態が患者に存在するのかどうかを告知するための、ステップｄ）で得られた標識シグナルと少なくとも１つの参照値の比較。
【請求項１８】
遺伝子断片が５〜１０００、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
SEQ ID No. 1〜SEQ ID
No. 69及び／又はそれらから導かれる配列に従うポリヌクレオチドは、合成類似体、アプタマー、スピーゲルマー（spiegelmers）、及びペプチド拡核酸若しくはモルフォリノ核酸と置き換えられることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子の合成類似体は５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子活性がマイクロアレイにより測定されることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
試料が、組織、体液、特に血液、血清、血漿、尿、唾液又は細胞若しくは細胞成分、又はこれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞内容物を遊離させるため、試料、特に細胞試料を溶解処理することを特徴とする、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
試料核酸はＲＮＡ、特に全ＲＮＡであり、プローブ核酸はＤＮＡ、特にｃＤＮＡであり、又はｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチド配列SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはプライマー並びに／若しくはプローブ及び／又はこれらに対するアンチセンス、又はこれらが患者の感染状態（局所又は全身）を特異的に確定するもの、及び／又は、患者試料中の遺伝子活性をインビトロで測定するため及び／又は局所から全身へ若しくは全身から局所へという患者の感染経過を確定するための、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチド、を含むキット。
【請求項２６】
ポリヌクレオチド配列が、遺伝子座、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、特にｓｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ又は転移因子をも含むことを特徴とする、請求項２５に記載のキット。
【請求項１】
局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性の検出に対するSEQ
ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはそれらの遺伝子座及び／又はそれらの転写産物に従うそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドの使用であって、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載の配列のすべてが用いられる使用。
【請求項２】
前記遺伝子活性が、ハイブリダイゼーション法、特にマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション法及び／又は酵素法、特に増幅法、好ましくはＰＣＲ，より好ましくはリアルタイムＰＣＲ法により検出されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための、少なくとも１個の患者試料からインビトロで得られる遺伝子活性の使用であって、当該遺伝子活性は以下のステップを含む方法に基づき得られるところの使用：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）検出可能な標識体による試料核酸及び／又はプローブ核酸の標識。ここでプローブ核酸は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別が可能な遺伝子並びに／若しくは遺伝子座又はそれらの転写産物を示し、またプローブ核酸は、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載されたすべてのポリヌクレオチド又はSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載されたそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドを含む；
ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、試料核酸とプローブ核酸の接触；
ｄ）ハイブリダイズした試料核酸とプローブ核酸の標識シグナルの定量的な検出；
ｅ）局所感染を伴う状態又は全身感染を伴う状態が患者に存在するのかどうかを告知するための、ステップｄ）で得られた標識シグナルと少なくとも１つの参照値の比較。
【請求項４】
局所感染から全身感染若しくは全身感染から局所感染となる感染の治療に伴う経過評価のため及び／又は適切な治療の決定のための、請求項３に記載の遺伝子活性データの使用。
【請求項５】
局所又は全身感染を伴う患者の分類のための、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
発現挙動が同程度であるSEQ ID No. 1〜69をもつポリヌクレオチドの遺伝子活性を遺伝子活性集団と連結させる、請求項３〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
第２〜４相臨床試験において局所感染又は全身感染を伴う患者の選定基準又は除外基準として、請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
さらなる電子的処理のための遺伝子活性データを作成するための、請求項３〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
診断目的及び／又は患者データ管理システムを支援するものとして、患者個人の予後診断及び／又は疾患経過を記述するためのソフトウェア作成のため、得られた遺伝子活性データを使用する、請求項３〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
臨床エキスパートシステムの作成及び／又は細胞情報伝達経路のモデル化のために、患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性データを使用する、請求項３〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
遺伝子活性データの作成のために、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のポリヌクレオチド配列をもち、少なくとも約１０％、特に約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を示す特異遺伝子及び／又は遺伝子断片を使用する、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
遺伝子断片が特に５〜１０００個、好ましくは２０〜２００個、より好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
試料核酸はＲＮＡ、特に全ＲＮＡであり、プローブ核酸はＤＮＡ、特にｃＤＮＡであり、又はｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
遺伝子活性データが遺伝子発現プロフィールを形成することを特徴とする、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別のための、少なくとも１つの患者試料からインビトロで得られた遺伝子活性の使用であって、当該遺伝子活性は下記のステップを含む方法に基づいて得られるところの使用：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）増幅条件下で、SEQ ID No.1〜SEQ ID No.69に記載された核酸配列と標識又は非標識合成オリゴヌクレオチドプライマーの接触と再生。ここで、再生部分の長さは５０から２０００ヌクレオチドを含み、マーカーは、局所又は全身感染した患者において異なる量で存在する遺伝子産物を示す；
ｃ）再生核酸鎖の定性的、半定量的又は定量的測定による再生の進捗の検出、及び、増幅された核酸量の評価基準である増幅シグナルを参照核酸量の増幅シグナルと比較することによる一連の活性データの作成。
【請求項１６】
増幅バッチは、追加成分、特にデオキシヌクレオチド、ポリメラーゼ、塩、緩衝液、及び核酸に結合する蛍光色素を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者を区別するための遺伝子活性のインビトロ測定方法であって、当該方法が以下のステップを含むところの方法：
ａ）患者に由来する試料から試料核酸の単離；
ｂ）検出可能な標識体による試料核酸及び／又はプローブ核酸の標識。ここでプローブ核酸は、局所感染を伴う状態と全身感染を伴う状態の患者の区別が可能な遺伝子並びに／若しくは遺伝子座又はそれらの転写産物を示し、またプローブ核酸は、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のすべてのポリヌクレオチド又はSEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチドを含む；
ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、試料核酸とプローブ核酸の接触；
ｄ）ハイブリダイズした試料核酸とプローブ核酸の標識シグナルの定量的検出；
ｅ）局所感染を伴う状態又は全身感染を伴う状態が患者に存在するのかどうかを告知するための、ステップｄ）で得られた標識シグナルと少なくとも１つの参照値の比較。
【請求項１８】
遺伝子断片が５〜１０００、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０個のヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
SEQ ID No. 1〜SEQ ID
No. 69及び／又はそれらから導かれる配列に従うポリヌクレオチドは、合成類似体、アプタマー、スピーゲルマー（spiegelmers）、及びペプチド拡核酸若しくはモルフォリノ核酸と置き換えられることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子の合成類似体は５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子活性がマイクロアレイにより測定されることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
試料が、組織、体液、特に血液、血清、血漿、尿、唾液又は細胞若しくは細胞成分、又はこれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞内容物を遊離させるため、試料、特に細胞試料を溶解処理することを特徴とする、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
試料核酸はＲＮＡ、特に全ＲＮＡであり、プローブ核酸はＤＮＡ、特にｃＤＮＡであり、又はｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチド配列SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69並びに／若しくはプライマー並びに／若しくはプローブ及び／又はこれらに対するアンチセンス、又はこれらが患者の感染状態（局所又は全身）を特異的に確定するもの、及び／又は、患者試料中の遺伝子活性をインビトロで測定するため及び／又は局所から全身へ若しくは全身から局所へという患者の感染経過を確定するための、SEQ ID No. 1〜SEQ ID No. 69に記載のそれぞれの配列のヌクレオチド数に対して２〜１００％の長さをもつポリヌクレオチド、を含むキット。
【請求項２６】
ポリヌクレオチド配列が、遺伝子座、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、特にｓｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ又は転移因子をも含むことを特徴とする、請求項２５に記載のキット。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５３５０１７（Ｐ２０１０−５３５０１７Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１８５６６（Ｐ２０１０−５１８５６６）
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００６３３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８９６２
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０７１２３３０５）エスアイアールエス‐ラブ ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００６３３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８９６２
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０７１２３３０５）エスアイアールエス‐ラブ ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]