工学操作された微小胞を用いての直接的なタンパク質の送達
本発明は、工学操作された微小胞を用いての直接的なタンパク質の送達に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、工学操作された微小胞を用いての直接的なタンパク質の送達に関する。
【０００２】
発明の背景
ターゲット細胞への対象のタンパク質の一過性導入は大きな挑戦であり、基礎研究、応用科学および治療分野において多くの適用がある。
【０００３】
何十年間も、ターゲット細胞への対象のタンパク質の導入は、トランスフェクションとして知られる、前記の対象のタンパク質をコードする遺伝子材料の導入によって間接的に行なわれてきた。
【０００４】
リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔法およびリポフェクションなどの多くのトランスフェクション技術が何年もかけて開発されてきた。
【０００５】
しかしながら、これらの技術は、その使用を制限し得るいくつかの不便がある。ターゲット細胞への対象のタンパク質をコードする遺伝子の導入は、ターゲット細胞の転写および翻訳の機械に依拠する。従って、所望のタンパク質の発現は遅く、そしていくつかの望ましくない効果が観察され得る（トランスフェクション試薬自体の毒性、インターフェロン応答の活性化など）。
【０００６】
さらに、特定の細胞型、典型的には非分裂細胞、例えばニューロンはあまり良好にトランスフェクションできない。形質導入として知られる他の遺伝子導入技術が、この欠点を回避するためにより最近になって開発された。形質導入は、ターゲット細胞に遺伝子材料を導入する際にウイルスベクターの使用に依拠する。この趣旨でレトロウイルスに基づいたシステムがしばしば使用される。しかしながら、これらの技術にはいくつかの欠点がある。第一に、レトロウイルスベクターが不活性化されていても、前記レトロウイルスベクターの使用に関連した衛生上のリスクがある。第二に、レトロウイルス粒子の産生は非常に退屈で時間がかかる。実際に、ウイルスベクター粒子の形成に必要な種々のタンパク質をコードする大量の４または５種類の異なるプラスミドの産生を含む。最後に、ターゲット細胞に観察される効果は速効性ではない。典型的には、対象のタンパク質は、少なくとも２４時間、通常４８〜７２時間の遅延の後にターゲット細胞において発現され、その間に転写および翻訳が起こる。
【０００７】
以前の研究は、レトロウイルスベクターと同時に産生されるバイスタンダード物質によるレポータータンパク質の予期せぬ導入を記載した（Liu et al., Journal of virology 70, 2497-2502 (1996); Gallardo et al., Blood 90, 952-957 (1997)）。例えば、これらの著者は、レトロウイルスにより媒介される遺伝子導入に対して非許容性であることが知られるターゲット細胞へとβ−ガラクトシダーゼを送達する、そのウイルス調製物の能力を記載した。偽形質導入と呼ばれるこの望ましくない形質導入の人工産物は、処理細胞に導入されたタンパク質を一過性に発現したが、一方、レトロウイルスによる形質導入は、送達された導入遺伝子の安定した長期の発現を確実にする。興味深いことに、これらの著者は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を用いて偽型化されたレトロウイルスベクターを使用して、偽形質導入が特に、濃縮されたＶＳＶ−Ｇでコーティングされたレトロウイルス粒子を用いて起こっていることを観察した。しかしながら、これらの研究は、このタンパク質により媒介される偽形質導入の基礎をなす決定的な機序の証拠は全く提供しておらず、そして導入されたタンパク質はウイルスエンベロープに組み込まれている可能性が最も高いと考えられた（Schnell et al., PNAS, 1996, 93, 11359-11365）。それ故、この偽形質導入は、膜タンパク質に限定されると考えられた。さらに、それは、遺伝子により媒介されるレトロウイルスによる形質導入から分離できないと考えられた。
【０００８】
ターゲット細胞に対象のタンパク質を特異的で時間制御的に送達するために、別の利用可能な技術は、ターゲット細胞へのマイクロインジェクションである。しかしながら、この技術では、マイクロインジェクション前に対象のタンパク質を得ることが必要である。ペプチドは化学合成によって得ることができるが、より大きなタンパク質は、特別な産生手順および精製手順を必要とする。従って、これらの方法は費用がかかり、そしてラージスケールの用途には良好に順応できない。
【０００９】
他の研究は、ＨＩＶ ｔａｔおよびポリアルギニンなどの、タンパク質の形質導入を媒介する短いペプチドとタンパク質をコンジュゲーションすることによる前記タンパク質の送達に焦点を当てる。しかしながら、これらの技術もまた、組換えタンパク質に依拠しているので、ラージスケールでの実行は困難である。
【００１０】
従って、ターゲット細胞に対象のタンパク質を送達するための迅速で安全で効率的な方法が当技術分野において依然として必要である。
【００１１】
発明の要約
本発明は、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞に関する。
【００１２】
本発明はまた、本発明による真核細胞によって分泌される微小胞に関し、前記微小胞は、前記ウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む。
【００１３】
本発明はまた、ターゲット細胞を、対象のタンパク質を含む本発明による微小胞と接触させることによって、前記ターゲット細胞に前記の対象のタンパク質をin vitroで送達するための方法に関する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明者らは、対象のタンパク質を発現する真核細胞におけるウイルス膜融合タンパク質の過剰発現は、前記の膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む微小胞の分泌をもたらし得ることを発見した。さらに、本発明者らは、前記の微小胞を使用して、前記タンパク質の機能を変化させることなく、ターゲット細胞に前記の対象のタンパク質を効率的に送達することができることを実証した。従って、本発明の方法は、ターゲット細胞における機能的タンパク質の一過性かつ迅速な導入に適切である。
【００１５】
従って、本発明は、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞に関する。前記真核細胞は、前記ウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む微小胞を分泌することができる。
【００１６】
１つの態様において、本発明による真核細胞は、全くウイルス構造タンパク質を発現せず、そしてこのような真核細胞によって分泌された微小胞は、全くウイルス構造タンパク質を含まない。従って、本発明による微小胞は、この点において、例えばＷＯ２００６／０５９１４１に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）（前記ＶＬＰは、ＨＩＶ１ Ｇａｇなどのウイルス構造タンパク質を含む）とは異なる。
【００１７】
本明細書において使用する「ウイルス構造タンパク質」という用語は、ウイルスのカプシドタンパク質またはコアタンパク質の全体構造に寄与するウイルスタンパク質を指す。「ウイルス構造タンパク質」という用語はさらに、ウイルスのカプシドタンパク質またはコアタンパク質の構造に寄与するこのようなウイルスタンパク質の機能的フラグメントまたは誘導体を含む。ウイルス構造タンパク質の一例はＨＩＶ１ Ｇａｇである。ウイルス膜融合タンパク質はウイルス構造タンパク質とは考えない。典型的には、前記ウイルス構造タンパク質は微小胞内に局在化している。
【００１８】
本発明者らは、実際に、全くウイルス構造タンパク質を発現しないが、膜融合タンパク質（例えばＶＳＶ−Ｇ）または他の膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞において、対象のタンパク質を含む微小胞が産生され得ることを示した。
【００１９】
さらに、本発明による微小胞は、対象のタンパク質をコードする核酸を全く含まないかもしれない。もちろん、痕跡量の核酸が、特にプロデューサー細胞からの痕跡量のｍＲＮＡ、またはさらには以前のトランスフェクションから生じたＤＮＡが前記微小胞に含まれていることは除外できない。しかしながら、本発明者らは、このような痕跡量の核酸（存在する場合）は、微小胞によるタンパク質機能の導入の少なくとも９０％については関与しないことを実証した。
【００２０】
典型的には、真核細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、ニワトリ細胞、または昆虫細胞である。適切な哺乳動物細胞の例は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞であるがそれらに限定されるわけではない。適切な昆虫細胞の例としては、Ｈｉｇｈ５細胞およびＳｆ９細胞が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。昆虫細胞はいくつかの利点を提示する。特に、それらは望ましくないヒトタンパク質に欠け、そしてその培養は動物の血清を必要としない。
【００２１】
「過剰発現する」によって、所与の細胞によって発現されるタンパク質の量を増強するための当技術分野において知られている任意の手段を意味する。実際的には、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質は、前記真核細胞において、前記真核細胞が、全くウイルス構造タンパク質を発現する必要を伴わず、前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む微小胞を分泌することができるレベルまで発現される。
【００２２】
典型的には、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質の過剰発現は、真核細胞を、ウイルス膜融合タンパク質をコードする発現ベクター、および対象のタンパク質をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクションすることによって達成され得る。
【００２３】
別の態様において、本発明による前記の真核細胞は、ウイルス膜融合タンパク質としてのＶＳＶ−Ｇおよび対象のタンパク質を過剰発現するが、他のウイルスタンパク質は全く、特にウイルス構造タンパク質は全く過剰発現しない。前記態様に従って分泌される微小胞は、ＶＳＶ−Ｇおよび前記の対象のタンパク質を含むが、ウイルス構造タンパク質は全く含まない。
【００２４】
別の特定の態様において、真核細胞は、ウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質のみを過剰発現する。この態様において、ウイルス膜融合タンパク質、例えばＶＳＶ−Ｇの発現は、細胞において過剰発現されたタンパク質の少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％を示し得る。
【００２５】
１つの態様において、前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質は２つの異なるベクターによってコードされ得る。
【００２６】
１つの態様において、前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質は、バイシストロン性発現カセットを含む単一のベクターによって保有され得る。関連する態様において、前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質は互いに共有結合されていない。
【００２７】
１つの態様において、発現ベクターは、エピソーム複製プラスミド、および例えば、ＳＶ４０ ＯＲＩまたはＥＢＶ ＯＲＩ配列などのウイルス性の起点配列を含むプラスミドを含み得る。
【００２８】
発現ベクターを介する過剰発現は、分子生物学の分野において知られている任意の遺伝子導入法を含み得る。好ましい態様において、過剰発現は外来性ＤＮＡのトランスフェクションによって得られる。適切なトランスフェクション法は、当業者に公知の古典的な方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを使用するトランスフェクション（リポフェクションとしても知られる）または電気穿孔法である。所与の細胞に対して適切なトランスフェクション法を選択することは当業者の技能の範囲内である。
【００２９】
好ましい態様において、過剰発現はウイルス形質導入によって得られる。
【００３０】
過剰発現は一過性過剰発現または安定な過剰発現であり得る。
【００３１】
一過性の過剰発現を使用する場合、細胞は、典型的には、トランスフェクションから４８時間後から７２時間後までの間に最適量のウイルス膜融合タンパク質および／または対象のタンパク質を過剰発現する。
【００３２】
「過剰発現」という用語はまた、内因性タンパク質、すなわち真核細胞によって天然に発現されるタンパク質の過剰発現を含む。過剰発現は、前記タンパク質をコードする遺伝子のさらなるコピーの導入、または内因性タンパク質の発現の刺激のいずれかに存し得る。例えば、真核細胞を、前記内因性タンパク質の発現を増強することが知られる培養条件下に置くことができる。
【００３３】
本発明の態様において、真核細胞は、２〜５つの異なる対象のタンパク質を過剰発現する。
【００３４】
典型的には、前記ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩウイルス膜融合タンパク質、例えばインフルエンザウイルスヘマグルチニン、クラスＩＩウイルス膜融合タンパク質またはクラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質である（クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質に関する総説Backovic et al, Curr Opin Struct Biol 2009, 19(2):189-96またはCourtney et al, Virology Journal 2008, 5:28を参照されたい）。
【００３５】
好ましい態様において、前記ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩウイルス膜融合タンパク質である。
【００３６】
クラスＩウイルス膜融合タンパク質の例は、バキュロウイルスＦタンパク質、特に核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質、例えばSpodoptera exiguaＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）Ｆタンパク質およびLymantria dispar ＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）Ｆタンパク質である。
【００３７】
好ましい態様において、前記ウイルス膜融合タンパク質はクラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質である。
【００３８】
クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質の例は、ラブドウイルスＧ（例えば水疱性口内炎ウイルスの膜融合タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ））、ヘルペスウイルスｇＢ（例えばヘルペス単純ウイルス１の糖タンパク質Ｂ（ＨＳＶ−１ ｇＢ））、ＥＢＶ ｇＢ、ソゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（例えばAutographa California multiple NPV (AcMNPV) gp64）、およびボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶ Ｇ）である。
【００３９】
より好ましい態様において、前記のウイルス膜融合タンパク質はＶＳＶ−Ｇまたはバキュロウイルスｇｐ６４である。１つの態様において、前記ウイルス膜融合タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ：Ｍ３５２１９．１に定義されているようなＶＳＶ−Ｇポリペプチド、または膜融合特性を保持した任意の機能的フラグメントまたはその機能的誘導体である。
【００４０】
本明細書において使用する「膜融合性」という用語は、ターゲット細胞の膜への微小胞の形質膜の融合を誘導し得るウイルスタンパク質を指す。
【００４１】
本発明の１つの態様において、本発明による真核細胞はさらに、膜発芽を誘導するタンパク質を過剰発現する。この態様において、微小胞の産生が増強される。
【００４２】
本明細書において使用する「膜発芽を誘導するタンパク質」という表現は、脂質二重層の変形を促進し得、そして小胞の形成を媒介し得る、任意のタンパク質を指す。
【００４３】
所与の試験タンパク質が膜発芽を誘導する能力は、以下のin vitroの試験「Ａ」に従って評価することができ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を試験タンパク質でトランスフェクションするか、または空ベクターを用いて偽トランスフェクションする。トランスフェクションから２０時間後、細胞培地をＲ１８含有培地（２０μg/ml）と交換する。Ｒ１８、すなわちオクタデシルローダミンＢクロライドは、膜に結合し、そして５６０nmでの励起時に５９０nmで蛍光を発する親油性化合物である。Ｒ１８を細胞膜へと取り込ませるための６時間のインキュベーション後、培地を、Ｒ１８を含まない新しい培地と交換する。トランスフェクションから７２時間後、トランスフェクションした細胞および偽トランスフェクションした細胞からの培地を回収し、清澄化し、そして蛍光光度計によって分析した。レサズリンに基づいたアッセイによって計測した生細胞の数に対して規準化した、Ｒ１８に関連した蛍光の量は、各条件において細胞によって放出される膜の量を反映する。
【００４４】
試験タンパク質は、上記の試験「Ａ」によって測定したところ、細胞あたりのＲ１８に関連する蛍光の量を増加させるならば、膜発芽を誘導すると考えられる。
【００４５】
種々の細胞タンパク質およびウイルスタンパク質が膜発芽を誘導することが知られている。
【００４６】
膜発芽を誘導する細胞タンパク質の例は、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１（Trajkovic et al. 2008 Science, vol 319, p 1244-1247）、クラスリンアダプター複合体ＡＰ１（Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203）、脂質特性を改変するタンパク質、例えばフリッパーゼ、スクランブラーゼ、非古典的経路を介して分泌を促進するタンパク質、例えばＴＳＡＰ６（Yu et al. 2006 Cancer Res vol 66, p4795-4801）およびＣＨＭＰ４Ｃ（Yu et al. 2009, FEBS J. vol 276, p2201-2212）である。
【００４７】
膜発芽を誘導するウイルスタンパク質の例は、テテリン（tetherin）／ＣＤ３１７アンタゴニスト、例えばＨＩＶのＶｐｕタンパク質（Neil et al. 2008. Nature vol451, p425-4431）および種々のウイルス構造タンパク質、例えばレトロウイルスＧＡＧ（Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203）およびエボラＶＰ４０（Timmins et al., Virology 2001）である。
【００４８】
膜発芽は、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞の細胞培養条件、例えば温度、Ｃａ２＋、濃度などを改変することによっても誘導され得る。
【００４９】
本明細書において使用するような、前記の対象のタンパク質は、ターゲット細胞へと導入されることが望まれる任意のタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの態様において、前記の対象のタンパク質は、全くウイルス膜融合タンパク質または全く前記のウイルス膜融合タンパク質のフラグメントまたは膜融合特性を保持した誘導体を含まない。
【００５０】
典型的には、前記の対象のタンパク質は、異種タンパク質、例えば膜タンパク質、細胞質タンパク質、ウイルスタンパク質または核タンパク質であり得る。本明細書に使用するような「異種」という用語は、前記タンパク質が、前記の対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞のゲノムに天然に見られる遺伝子からは発現されないことを意味する。
【００５１】
あるいは、前記の対象のタンパク質は、内因性タンパク質、例えば特定の細胞系において高い量で天然に発現されているタンパク質であり得る。この態様において、高い量で対象のタンパク質を天然に発現する細胞株は、前記の対象のタンパク質および前記の膜融合タンパク質を含む微小胞を産生するように、ＶＳＶ−Ｇなどの膜融合タンパク質をさらに過剰発現するように工学操作されている。
【００５２】
適切な膜タンパク質の例は、膜レセプター、ＣＤ８１、ｍＣＡＴ−１（同種指向性（Ecotropic）レセプター）、ＣＸＣＲ４およびホーミングタンパク質、ＣＤ４、ＣＣＲ５、シアル酸リッチタンパク質、クローディン、ＣＤ２１、Ｔ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプター、ＣＦＴＲおよびＴＮＦＲ１である。
【００５３】
適切な細胞質タンパク質の例は、アポトーシス因子、例えばＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、ＦａｓＬおよび蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ、ＹＰＦ、Ｖｅｎｕｓ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ、Ｃｈｅｒｒｙ-Ｒｅｄ、およびＤｓＲｅｄ２である。
【００５４】
ウイルスタンパク質の例は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｇｐｌ２０、ＧＰ４１（ＨＩＶ−１／２、ＳＩＶ）、ｖｐｘ（ＳＩＶ）、ｔａｘ、ｒｅｘ（ＨＴＬＶ−１）、ＥＢ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ１、ＢＨＲＦ１（ＥＢＶ）、ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｃｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２（ＨＣＶ）、スモールＴ抗原、ラージＴ抗原（ＳＶ４０）、ＮＳ１、ノイラミニダーゼおよびＨＡ（インフルエンザ）である。
【００５５】
核タンパク質の例は、転写因子または補因子、ｔＴＡテトラサイクリントランス活性化因子、ＶＰ１６およびＶＰ１６含有融合タンパク質、ＣＲＥリコンビナーゼ、Ｃｒｅ−Ｅｒｔ２リコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼまたはフリッパーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ／ＲＡＤ５１、Ｔｒｅリコンビナーゼ、メガヌクレアーゼ、例えばＩ−Ｓｃｅ１、転写因子、例えばＧＡＴＡ−１、ＦＯＧ、ＮＦ−Ｅ２、ＴＡＬ１／ＳＣＬ、ＥＫＬＦ、ＦＢＩ−１、ＲＵＮＸ１、ＰＵ．１、レチノイン酸レセプター、ビタミンＢ３レセプター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質、イカロス、Ｐａｘ５、ヤヌスキナーゼ、Ｅ２Ａ、Ｂｃｌ−６、ＥＢＦファミリー、Ｅｇｒ２および３、ＫｌＦ５、ＴｃＦ４、ＭｙｏＤ、ＳＵＭ−１、ミオゲニン、ｍｙｆ−５、ＭＲＦ４、Ｐｉｔｘ２、Ｅｇｒ２およびＥｇｒ３、ＮＦｋＢ、ＡＰ１、ＡＰ２、ＰＯＵ因子、Ｓｐ１／Ｓｐ３、ｂＨＬＨ、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ２、Ｆｏｘｇ１、ＥＬＦ３、Ｅｒｍ、Ｏｌｆ−１、Ｐａｘ６、α−Ｐａｌ／Ｎｒｆ−１、Ｎｕｒｒ１およびＰｉｔｘ３である。
【００５６】
有利には、本発明者らは、対象のタンパク質が、一旦、ターゲット細胞に導入されると、その機能性を保持することを示した。特に、前記の対象のタンパク質はターゲット細胞においては開裂しない。例えば、前記の膜レセプターは、その対応するリガンドを認識することができるように、微小胞による送達後に細胞膜中に正しく局在する。別の態様において、前記の対象のタンパク質は、転写因子によって調節される遺伝子の転写を刺激または抑制することができるように、微小胞による送達後に核内に正しく局在する転写因子または対応する補因子である。
【００５７】
本発明の態様において、対象のタンパク質は、細胞膜に局在するように修飾されていてもよい。
【００５８】
１つの態様において、対象のタンパク質は、ウイルス膜融合タンパク質に融合している。有利には、対象のタンパク質は、酸性条件下で開裂できるタンパク質分解開裂部位を導入することによって、酸性条件下で膜から放出されるようにさらに修飾されていてもよい。酸性条件下で開裂されるタンパク質分解開裂部位の例は、ｆｌｕＨＡ開裂部位、ＮｉｐａｈウイルスＦタンパク質開裂部位またはカテプシン開裂部位である。
【００５９】
代替的な態様において、対象のタンパク質は、ウイルス膜融合タンパク質に融合していない。実際に、前記の対象のタンパク質は、ウイルス膜融合タンパク質と共に過剰発現されると、微小胞中に共局在し得ることが示された。典型的には、タンパク質のファルネシル化に関与するファルネシルモチーフおよび／またはタンパク質のミリスチル化に関与するミリスチルモチーフを導入して、タンパク質を膜へと指向させ得る。
【００６０】
１つの態様において、ウイルス膜融合タンパク質および／または対象のタンパク質は、真核細胞から放出される微小胞の精製を可能とするタグを含み得る。前記タグは、例えば、ウイルス膜融合タンパク質の外部ドメインに局在し得る。適切なタグとしては、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓ６タグが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。適切なタグおよび前記タグの適切な精製法を選択するのは当業者の技能範囲内である。適切な精製法としては、免疫沈降法、アフィニティクロマトグラフィー、および抗タグ特異的抗体でコーティングされた磁気ビーズが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【００６１】
好ましい態様において、本発明による真核細胞はウイルスを含まず、特に、前記真核細胞は、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸を全く含まない。
【００６２】
本発明はまた、本発明による真核細胞によって分泌される微小胞に関し、前記微小胞は、前記ウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む。別の態様において、前記微小胞は、前記のウイルス膜融合タンパク質に共有結合していない前記の対象のタンパク質を含む本発明による真核細胞から得られる。
【００６３】
理論によって固めたくはないが、前記微小胞はエキソソーム様であり、４０〜１５０nm、例えば４０〜１００nmのサイズ、例えば約１００nmの平均サイズであると考えられている。典型的には、本発明による微小胞は、１．０８g/ml〜１．１２g/mlの密度を有する。好ましくは、本発明による微小胞は１．０９g/ml〜１．１１g/mlの密度を有する。典型的には、前記密度は、実施例１に定義したような連続的なイオジキサノール勾配を通しての沈降によって測定され得る。
【００６４】
ウイルス膜融合タンパク質および／または対象のタンパク質の一過性過剰発現が使用される場合、微小胞は、典型的には、トランスフェクションから４８〜７２時間後の細胞上清から収集される。典型的には、本発明による微小胞は、本発明による真核細胞の細胞上清の濾過（例えば０．４５μmの孔径のフィルター）および超遠心分離、例えば１１０，０００ｇで１．５時間の超遠心分離によって単離され得る。有利には、本発明による微小胞は、ターゲット細胞へ材料を導入する能力を失うことなく−８０℃で凍結および保存され得る。
【００６５】
別の態様において、本発明による前記微小胞は、前記の対象のタンパク質をコードする核酸を全く含まない。
【００６６】
好ましい態様において、本発明による微小胞はウイルスを含まない。
【００６７】
当初は免疫系細胞について記載されたが、細胞から放出された微小胞は、in vivoにおいて多くの体液中に見出される（Simpson et al. Proteomics 8, 4083-4099 (2008)）。多くの研究が、免疫応答のモデュレーションおよび細胞間情報伝達におけるこれらの微小胞の役割を強調している。
【００６８】
理論によって固めたくはないが、本発明の微小胞はエキソーム様の小胞であり、そしてウイルス膜融合タンパク質の存在は、前記の微小胞が、前記微小胞に含まれる材料をターゲット細胞に効率的に送達することを可能としていると考えられる。
【００６９】
本発明はまた、前記のターゲット細胞を、前記の対象のタンパク質を含む本発明の微小胞と接触させることによって、対象のタンパク質をターゲット細胞にin vitroで送達するための方法に関する。
【００７０】
ターゲット細胞の例は、普通の実験細胞株、例えばＨｅｌａ細胞および誘導体、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞および誘導体、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＵＨ７細胞および誘導体、小細胞肺癌細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｌ９２９細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＴＨＰ１細胞、Ｕ９３７細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＰＣ１２細胞；骨髄から、血液から、臍帯血から精製したヒト造血細胞ＣＤ３４＋；単球からまたはＣＤ３４＋細胞から分化した樹状細胞（ＤＣ）；Ｔ細胞（ＣＤ８およびＣＤ４）、Ｂ細胞（記憶Ｂ細胞を含む）、肥満細胞、マクロファージ、ＤＣｓ、ＮＫ細胞を含む、血液から精製した初代ヒト細胞；Ｔ細胞（ＣＤ８およびＣＤ４）、Ｂ細胞（記憶Ｂ細胞を含む）、肥満細胞、マクロファージ、ＤＣｓ、ＮＫ細胞を含む、血液から精製した初代マウス細胞；ＭＲＣ５細胞、ＩＭＲ９０細胞を含む初代ヒト線維芽細胞；初代マウス線維芽細胞、およびヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ウサギ起源の胚幹細胞（ＥＳ）である。
【００７１】
本発明の微小胞の指向性は、使用されるウイルス膜融合タンパク質の指向性に依存する。
【００７２】
例えば、ＶＳＶ−Ｇは汎親和性であるので、ＶＳＶ−Ｇを含む本発明による微小胞はほぼすべての細胞をターゲティングする。気道細胞に指向性を有するウイルス膜融合タンパク質を含む微小胞が、気道細胞をターゲティングするのに好ましくは使用される。
【００７３】
好ましい態様において、本発明による微小胞は、ターゲット細胞と微小胞産生細胞との共培養によってin situで産生される。１つの特定の態様において、ターゲット細胞および微小胞産生細胞を、多孔性の壁によって隔てられた２つの異なるコンパートメント中に物理的に配置させ、前記の多孔性の壁は、真核細胞の直径よりも小さいが、対象の微小胞の直径よりは大きい直径を有する孔を有する。有利には、本発明による真核細胞によって産生されるような微小胞は、一方のコンパートメントから他方のコンパートメントへと拡散して、ターゲット細胞に到達し得、そこで対象のタンパク質を送達することができる。
【００７４】
この技術は、単離工程を必要とすることなく、ターゲット細胞へのタンパク質の送達を可能とする。
【００７５】
典型的には、いくつか（例えば、２、３、４、５、６・・・）の異なる対象のタンパク質は、ターゲット細胞を、前記のいくつかの異なる対象のタンパク質を含む本発明のいくつかの異なる微小胞と接触させることによって、ターゲット細胞に送達され得る。
【００７６】
典型的には、前記のいくつかの異なる微小胞の接触は同時または連続的であり得る。
【００７７】
複数のウイルスベクターによって成し遂げられる遺伝子送達とは対照的に、本発明による微小胞を用いてのタンパク質の送達は、多くの細胞型へのウイルスによる形質導入を制限する転写機械またはどのウイルス組込みプロセスも含むことなく、ターゲット細胞に機能を迅速に導入するためのオリジナルな方法である。本発明による微小胞は、休止細胞または完全に分化した細胞を含む実質的にあらゆる細胞型において使用され得る。
【００７８】
遺伝子トランスフェクションなどの古典的な遺伝子導入技術とは対照的に、本発明の方法は、ターゲット細胞内における転写および翻訳に依拠せず、細胞の代謝を撹乱しない。従って、本発明による方法は全くインターフェロン応答を活性化せず、それ故、ターゲット細胞に対象のタンパク質を送達するためのより特異的な方法であると考えられる。
【００７９】
本発明による微小胞によって送達される材料が少量であることおよびその非遺伝子性から、微小胞は、タンパク質の少量で一過性の存在が顕著な生物学的効果をもたらし得る適用について、すなわち、高い生物学的浸透性を有するタンパク質に有用であるようである。
【００８０】
当業者は、各々の具体的な目標に従って、対象のタンパク質／ターゲット細胞の適切な対を容易に選択するだろう。細胞、微小胞および本発明による方法の適用の非制限的な例を以後に記載する。
【００８１】
１つの局面において、本発明は、本発明による微小胞のin vitroにおける使用に関する。
【００８２】
１つの局面において、本発明は、本発明による微小胞のin vivoにおける使用に関する。
【００８３】
１つの局面において、本発明は、非治療適用のための本発明による微小胞の使用に関する。
【００８４】
典型的には、本発明による微小胞は、ターゲット細胞に対象のタンパク質をin vitroにおいて導入して、前記の対象のタンパク質の生理学的効果を研究するために使用され得る。基礎科学の調査のためのツールとしての本発明の多くの可能な適用がある。
【００８５】
例えば、細胞、微小胞および本発明による方法は、誘導発現系の誘導に必要な特定の補因子を送達するために使用され得る。典型的には、対象のタンパク質としては、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｃｒｅ／ｌｏｘ系の誘導に有用）、ｔＴＡトランス活性化因子（テトラサイクリンオペレーターの誘導に有用）が挙げられる。前記補因子はターゲット細胞に導入することが困難であることが多く、そして、対象のタンパク質の送達を正確に制御することによって誘導系の動態を正確に制御することが望ましい。
【００８６】
別の例は、in vitro細胞モデルにおける、細胞の増殖、分化または死滅を調節する細胞タンパク質の送達である。典型的には、細胞、微小胞および本発明の方法を使用して、Ｂａｘ−２などのアポトーシス促進因子を送達することができ、そしてアポトーシスをモデュレーションする分子をスクリーニングすることができる。
【００８７】
本発明はまた、療法に使用するための本発明による微小胞に関する。
【００８８】
本発明はまた、移植片拒絶の予防に使用するための本発明による微小胞に関する。
【００８９】
特定の細胞表面タンパク質が、造血幹細胞（ＨＳＣ）の遊走能または移植に影響を及ぼすことが示された。例えば、ＣＸＣＲ４の一過性送達は、ＨＳＣを使用する細胞療法において、移植プロセスを促進するためのホーミング分子として有用であり得る。遺伝子導入を使用することは望ましくなく、これにより、ＣＸＣＲ４は全ての子孫細胞に導入されることになるだろう。対照的に、本発明の方法は、移植が起こる必要がある時だけ、一過性で制御されたタンパク質の導入を可能とする。
【００９０】
本発明はまた、転写因子の送達により細胞分化を誘導または強化するための方法に関する。特に、本発明の細胞および微小胞は、巨核球分化、骨髄系細胞分化、リンパ球細胞分化、ＮＫ分化、アストロサイト分化、オリゴデンドロサイト前駆細胞の成熟、筋肉細胞分化、ケラチノサイト分化、網膜分化、赤血球細胞分化、脂肪細胞分化のために使用され得る。
【００９１】
別の可能な適用は、ウイルス（コ）レセプターをターゲット細胞に送達することによるウイルス感染の増強である。例えば、本発明の細胞および微小胞を使用して、ＨＣＶレセプターおよびコレセプター、ＨＢＶレセプター、出血熱ウイルスレセプター、ＨＩＶ−１レセプターおよびコレセプター、並びにＭＬＶ−Ｅレセプターを送達することができる。
【００９２】
特に、本発明は、レセプターの送達、例えば細胞を同種指向性ウイルス粒子に一過性に許容性とさせるレセプターの送達に関する。
【００９３】
例えば、本発明の微小胞、細胞および方法を使用して同種指向性レセプターＥｃｏＲ（例えばｍ−ＣＡＴ１）をターゲット細胞に送達して、前記ターゲット細胞を同種指向性ウイルスに対して許容性とさせることができる。その後、任意の対象の遺伝子を、適切な同種指向性ウイルス構築物を介してターゲット細胞（同種指向性レセプターを発現する）に送達することができる。
【００９４】
本明細書において使用する「同種指向性」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味を有する。同種指向性ウイルスは、それが起源とする種の宿主においてのみ複製することのできるレトロウイルスである。より具体的には、本明細書において使用する「同種指向性ウイルス」という用語は、その同族レセプターである同種指向性レセプターＥｃｏＲを発現している細胞においてのみ複製することのできるげっ歯類ウイルスを指す。
【００９５】
有利には、前記の同種指向性ウイルスは実験者にとって安全である。なぜなら、それは同種指向性ウイルスレセプターを発現している微小胞によってターゲティングされたもの以外のヒト細胞には感染できないからである。
【００９６】
典型的には、前記の同種指向性ウイルスはモロニーに基づいたレトロウイルスであり、そして前記同種指向性レセプターはｍ−ＣＡＴ１である。ｍ−ＣＡＴ１をコードする遺伝子の一例は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＣＢＩリファレンス配列ＮＭ＿００７５１３．３に示されている。
【００９７】
従って、本発明は、
− ウイルス膜融合タンパク質、例えばＶＳＶ−ＧとＥｃｏＲ同種指向性ウイルスレセプターとを含む微小胞によって、ターゲット細胞に前記ＥｃｏＲ同種指向性ウイルスレセプターを送達する工程、
− 対象のタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む同種指向性ウイルスによって、前記ターゲット細胞に前記の対象のタンパク質を送達する工程
を含む、細胞に対象のタンパク質を送達するための方法に関する。
【００９８】
さらに、本発明の細胞および微小胞は、トランス活性化されたウイルスタンパク質（ＨＣＶタンパク質、ＨＢＶタンパク質、ＨＩＶ−１／２またはＳＩＶタンパク質、出血熱ウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＥＢＶタンパク質、ＳＶ４０タンパク質）をウイルス産生細胞に送達することによって、ウイルス感染またはウイルス／ベクターの産生を増強するためのものであり得る。
【００９９】
別の可能な適用は、細胞外シグナルに対して細胞を一過性に許容性とするレセプターの送達である。
【０１００】
例えば、本発明の微小胞、細胞および方法を使用して、ターゲット細胞としてのＴ細胞に抗ウイルスＴＣＲを導入して、そして前記Ｔ細胞をその抗腫瘍特性のために使用することができる（Cohen et al., Cancer Research, 2007, 67, 3898-3903; Johnson et al. J Immunol. 2006, 177, 6548-6559およびZhao et al., J Immunol, 2005, 174, 4415-4423）。
【０１０１】
従って、本発明はまた、癌の処置において使用するための本発明による微小胞に関する。
【０１０２】
ワクチン接種の分野において、樹状細胞（ＤＣ）は免疫応答を刺激するために抗原提示細胞として使用されることが多い。
【０１０３】
しかしながら、樹状細胞は細胞株としては存在せず、そして初代培養から得なければならない。
【０１０４】
本発明は、ワクチン接種の目的に使用することのできる代替のＤＣを提供する。実際に、本発明の方法を使用して、ＭＨＣまたは共刺激因子および／または抗原を含む微小胞を産生する改変されたプロデューサー細胞株を提供することができる。前記微小胞をワクチン接種の目的のために使用することができる。
【０１０５】
また、本発明の細胞、微小胞および方法を使用して、特異的な抗原を抗原提示細胞に送達して、免疫応答を促進することができる。
【０１０６】
以下において、本発明は、以下の実施例および図面によって説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１Ａ】ＶＳＶ−Ｇを有する微小胞へのＹＦＰの取り込み。（Ａ）ｐＶＳＶ−Ｇ（レーン１）、ｐＶＳＶ−Ｇ Ｖ７２（レーン２）、ＳｗＦｌａｇＥｃｏＲ（レーン３）、ＳｗＦｌａｇＥｃｏＲおよびｐＶＳＶ−Ｇ（レーン４）によってトランスフェクションおよび偽トランスフェクション（レーン５）された２９３Ｔ−ＹＦＰによって産生された濃縮微小胞のウェスタンブロット分析。免疫染色を、ＶＳＶ−Ｇ（Ｐ５Ｄ４）、ＥｃｏＲのタグ化バージョンを示すＳｉｇｍａ ｆｌａｇ（Ｍ２）およびＹＦＰ（ＧＳＮ２４）に対して作られたモノクローナル抗体を用いて実施した。
【図１Ｂ】ＶＳＶ−Ｇを有する微小胞へのＹＦＰの取り込み。（Ｂ）ＹＦＰのみを発現する細胞からの微小胞に曝された細胞と比較した、ＶＳＶ−ＧおよびＹＦＰを発現する細胞からの微小胞に曝された細胞のＦＡＣＳ分析。
【図１Ｃ】ＶＳＶ−Ｇを有する微小胞へのＹＦＰの取り込み。（Ｃ）ＨＥＫ細胞を、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質（ｗｔ）または融合に欠陥のある突然変異体Ｗ７２Ｖをコードするプラスミドのいずれかによってトランスフェクションした（２つのＤＮＡクローンを試験した）。その外部ドメインの欠失した切断短縮形のＶＳＶ−Ｇも実験に含められた。トランスフェクションから４８時間後、上清を収集し、そして細胞をウェスタンブロット分析のために溶解した。プロデューサー細胞においては全てのタンパク質が高度に発現された。しかしながら、ｗｔ ＶＳＶ−Ｇのみが上清中に検出され、融合に欠陥のある突然変異体は検出されなかった。
【図１Ｄ】ＶＳＶ−Ｇを有する微小胞へのＹＦＰの取り込み。（Ｄ）ＨＥＫ細胞を上記のようにトランスフェクションし、そしてトランスフェクションから２０時間後に、膜に結合する蛍光親油性化合物Ｒ１８を０．２μg/ml含む培地中で６時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後、異なる細胞型からの培地を回収し、清澄化し、そして蛍光光度計によって分析して、上清中に放出された膜の量を反映するＲ１８に関連した蛍光の量を定量した。結果を、生細胞の数によって規準化したＲ１８値として示す。
【図２Ａ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析。（Ａ）２９３Ｔプロデューサー細胞上でのＣＤ８１発現。マウスＩｇＧアイソタイプ対照を使用した（影の付いた領域）。
【図２Ｂ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析。（Ｂ）処理から１時間後の濃縮微小胞に曝されたＨｅｐＧ２細胞上におけるＣＤ８１発現。非処理ＨｅｐＧ２も同様に標識した（灰色で影の付いた対照）。
【図２Ｃ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析。（Ｃ）種々の用量の微小胞を用いて処理されたＨｅｐＧ２細胞におけるＨＣＶｐｐの形質導入の増強。ＨＣＶｐｐをコードするＹＦＯを２９３細胞において産生し、そして１mlあたり８×１０４の形質導入単位（ＴＵ）のＨＵＨ７．２細胞上で前滴定した。図は、曝された微小胞の量と共に増加するＨｅｐＧ２の力価を示す。
【図２Ｄ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析。（Ｄ）ＣＤ８１を有する微小胞の密度分析。微小胞を、膜脂質を標識するフルオロフォアであるオクタデシルローダミンＢクロライド（Ｒ１８）と共に培養した２９３Ｔ細胞中で産生した。濃縮された微小胞を連続的なイオジキサノール勾配にかけ、そしてＳＷ４１ローターで４１０００rpmで１２時間遠心分離にかけた。その後、２０個の０．５ml画分を回収し、そして各画分の１／２０を半天然条件下でウェスタンブロットによって分析した。１３〜２０の画分についてのＶＳＶ−ＧおよびＣＤ８１の免疫標識が示され、そして他の画分には存在しなかった（示していない）。
【図３Ａ】ゲシクル（Gesicle）の特徴付け。（Ａ）回収した画分におけるイオジキサノール密度勾配時の膜に関連した蛍光。濃縮したＶＳＶ−Ｇゲシクルを連続的なイオジキサノール勾配にかけ、そして３時間遠心分離にかけた。２０個の５００μlの画分をチューブの底から回収し、示されるように画分１は１．４６の密度に対応し、そして画分２０は１．０７の密度に対応した。各画分の１／５（１００μl）を評量し、そして９６ウェルプレートに移し、その後、蛍光光度計で分析した。図は、５６０nmでＲ１８を励起した時の５９０nmにおける発光値を示す。
【図３Ｂ】ゲシクル（Gesicle）の特徴付け。（Ｂ）ＹＦＰおよびＣＤ８１を有するゲシクルの特徴付け。上のパネル：密度勾配時の回収した画分におけるＹＦＰに関連した蛍光の分析。ＹＦＰ陽性細胞において産生された濃縮ＶＳＶ−Ｇゲシクルを連続的なイオジキサノール勾配にかけ、そして３時間遠心分離にかけた。２０個の５００μlの画分をチューブの底から回収し、示されるように画分１は１．３の密度に対応し、そして画分２０は１．０９の密度に対応した。各画分の１／５（１００μl）を評量し、そして９６ウェルプレートに移し、その後、蛍光光度計で分析した。図は、４９５nmでＹＦＰを励起した時の５３３nmにおける発光値を示す。下のパネル：ヒト細胞におけるＹＦＰ偽形質導入の分析。各画分の１／１０を、１２ウェルプレート中で培養した１×１０５個のＨＥＫ細胞にのせた。２４時間後、細胞をＦＡＣＳによって分析した。図は、異なる画分に曝された各細胞個体群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図４Ａ】ＥｃｏＲを有するゲシクルによるヒト細胞へのＥｃｏＲの送達。（Ａ）ｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドの図解（ｐＣＭＶは初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターを意味し、ＵＳｉＴはユニバーサルなｓｉＲＮＡによってターゲティングされる３つの反復配列のコンカテマーを意味し、ＰＡはＳＩＶポリアデニル化シグナルを意味する）。下に示したｍＲＮＡは、ＵＳｉＴ配列を備え、この配列はユニバーサルなｓｉＲＮＡによって媒介される分解に高度に感受性とさせる。
【図４Ｂ】ＥｃｏＲを有するゲシクルによるヒト細胞へのＥｃｏＲの送達。（Ｂ）ｍＣＡＴ−１ゲシクルで処理された２９３Ｔ細胞上でのＭＬＶ同種指向性エンベロープを用いて偽型化されたＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターの力価。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２μg（レーン１）および４μg（レーン２）の濃縮ゲシクルを用いて３７℃で１時間かけて処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＭＬＶ同種指向性エンベロープ（レーン１、２および３）またはＶＳＶ−Ｇエンベロープ（レーン４）を用いて偽型化された１００μlのＧＦＰレンチベクターの調製物を用いて形質導入した。形質導入から３日後、細胞をＦＡＣＳによって分析し、そしてベクター調製物の力価を計算し、そして３つの異なる形質導入アッセイの平均として示す。
【図５】ｍＣＡＴ−１を有するゲシクルの生化学的および機能的分析。ゲシクルを、ＶＳＶ−Ｇおよびタグ化バージョンのｍＣＡＴ−１（マウス白血病ウイルス同種指向性株のレセプター）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションにより調製した。細胞培地を２４時間後に交換し、そして翌々日に回収した。上清を清澄化し、その後、ＳＷ４１ローターで３５０００rpmで１時間３０分間超遠心分離にかけた。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、そして凍結させ、その後、密度精製プロセスを行なった。連続的なイオジキサノール勾配を通してのレートゾーン遠心分離：未精製の濃縮した小胞を、連続的なOptiprep勾配にのせ（２１５mMスクロース、２mM ＥＤＴＡ、１０mMトリスＨＣｌｐＨ８中の６％イオジキサノール／５mMスクロース、２mM ＥＤＴＡ、１０mMトリスＨＣＬｐＨ８中の５６．４％イオジキサノール）、そしてＳＷ４１ローターで４１０００rpmで１２時間遠心分離にかけた。画分（０．５ml）を勾配の底から回収し、そして４℃で維持し、その後、ウェスタンブロット分析および機能的アッセイを行なった。１００μlの各画分を注意深く評量することによって画分の密度を測定した。画分１２〜２０のタンパク質を、ＭＯＰＳ緩衝液中で流した４〜１２％ビス−トリスＮｕＰａｇｅゲル（Invitrogen）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分離した。５μlの各画分を分析した。ニトロセルロース膜上へとエレクトロブロットした後、タンパク質を、１／１０００で希釈したＶＳＶ−Ｇ（Ｐ５Ｄ４ Sigma）に対して作られるペルオキシダーゼのコンジュゲートした抗体または１／１０００のペルオキシダーゼのコンジュゲートした抗Ｆｌａｇ（Sigma）（両方共に室温で１時間インキュベーションした）によって明らかとした。画分の生物学的活性を評価するために、３０μlの各試料を、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０５個の細胞で播種した２９３Ｔ細胞に加えた。１時間後、培地を、同種指向性エンベロープを用いて偽型化されたＧＦＰをコードするレンチベクターを含む２００μlの上清の補充された２００μlの新たな培地と交換した。形質導入から４８時間後、細胞をトリプシン処理し、蛍光値（ＭＦＩ）をＦＡＣＳによって分析した。
【図６】ゲシクルで処理したヒト細胞に導入されたｍＣＡＴ−１の消失。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃で１時間、飽和未満の用量のＥｃｏＲ−ゲシクルに曝した。２回洗浄した後、細胞を、ゲシクルへの曝露から５分後、１２時間後、２４時間後または４５時間後に、同種指向性エンベロープを用いて偽型化されたＧＦＰレンチベクターを用いて形質導入した。同じ形質導入アッセイを、ＥｃｏＲを安定に発現している２９３Ｔ細胞に対して実施して、ターゲット細胞の分裂に因る進行的なレンチベクター力価の減少を測定した。結果を、５分後の時点で得られた形質導入値（１００％）と比較した形質導入効率の比率として示す。全ての数値を、細胞分裂率に関して修正した。
【図７Ａ】ＥｃｏＲｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響を及ぼさない。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能的検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、さらにフラッグのついたｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞においてトランスフェクションした。ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞を次に、ｍＣＡＴのその発現、および同種指向性（ＥｃｏＬＶ）（黒い棒）および汎親和性対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色の棒）を用いての形質導入に対するその許容性について調べた。（Ａ）ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞におけるｍＣＡＴ−１免疫染色。
【図７Ｂ】ＥｃｏＲｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響を及ぼさない。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能的検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、さらにフラッグのついたｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞においてトランスフェクションした。ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞を次に、ｍＣＡＴのその発現、および同種指向性（ＥｃｏＬＶ）（黒い棒）および汎親和性対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色の棒）を用いての形質導入に対するその許容性について調べた。（Ｂ）ｍＣＡＴ−１によってトランスフェクションされたターゲット細胞におけるＧＦＰレンチベクターを用いての形質導入アッセイ。形質導入値を、形質導入から７２時間後にＦＡＣＳによって分析し、そしてｓｉ−ＣＴＬ細胞について１００％の効率と設定した。ＥｃｏＬＶ形質導入の７０％が、ｓｉ−ｍＣＡＴで処理された細胞において阻害されたが、ｇＬＶにより媒介される形質導入はほぼ影響を受けない（８％の阻害）。ターゲット細胞におけるｍＣＡＴ ｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって導入されたＥｃｏＲ機能に殆ど影響を及ぼさない。
【図７Ｃ】ＥｃｏＲｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響を及ぼさない。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能的検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、さらにフラッグのついたｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞においてトランスフェクションした。ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞を次に、ｍＣＡＴのその発現、および同種指向性（ＥｃｏＬＶ）（黒い棒）および汎親和性対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色の棒）を用いての形質導入に対するその許容性について調べた。（Ｃ）ｍＣＡＴゲシクルで処理されたヒト細胞におけるＧＦＰ同種指向性レンチベクターを用いての形質導入アッセイ。ｍＣＡＴ小胞によって処理されそしてｓｉ−ｍＣＡＴを有する細胞は、ＥｃｏＬＶ形質導入に対して依然として高度に許容性である（対照の８７％）。このことは、ＥｃｏＲ機能が、主に、微小胞に含まれるｍＣＡＴタンパク質によってもたらされ、コンタミしたｍＲＮＡでもプラスミドＤＮＡによってもたらされたものでもないことを示す。
【図８】ＥｃｏＲ−ゲシクルによって改変された細胞における、同種指向性レンチウイルス形質導入に対するクロロキンの効果。同種指向性エンベロープ（Ｅｃｏ）を用いて偽型化されたＹＦＰをコードするレンチウイルスベクターが、トランスデューサーＨＥＫ２９３Ｔ細胞に使用され、ｍＣＡＴ−１タンパク質が、エンドソームｐＨを上昇させる薬物であるクロロキン（ＣＱ）の存在下または非存在下においてＥｃｏＲゲシクル（ＥｃｏＲ−Ｇｅｓ）によって送達された（レーン３）。対照として、同種指向性偽型がトランスデューサー２９３Ｔ細胞に使用され、ＥｃｏＲは安定に発現される（安定なＥｃｏＲ、レーン２）。エンドソーム酸性化に対するＣＱの効果を確認するために、ＶＳＶ−Ｇレンチベクターが、薬物で処理したまたは処理していないターゲット細胞を形質導入するのに使用され、ＶＳＶ−Ｇ偽型の高いｐＨ依存性を示し（レーン１）、一方、同種指向性偽型は薬物処理時に依然として効果的である。結果は、形質導入から７２時間後にＦＡＣＳによって測定した異なる細胞型における相対的なＹＦＰ形質導入効率として示される。
【図９】ゲシクルによるｔＴａの送達。ＴＥＴトランス活性化タンパク質（ｔＴＡ ｏｆｆ）の転写機能を検出するために、本発明者らは、ＴＥＴオペレーターの制御下でｅＧＦＰを安定に発現するレポーター細胞株を作った。ｔＴＡのトランスフェクションは、偽トランスフェクションされた細胞と比較して、レポーター細胞株（ｔＴＡレーン）においてｅＧＦＰの発現を活性化した。ｔＴＡおよびＶＳＶ−Ｇ（ｗｔ）またはその融合能力のない突然変異体Ｖ７２を過剰発現する細胞において産生されたゲシクルを濃縮し、そして種々の用量でレポーター細胞株にのせた。ｗｔＶＳＶ−Ｇを有するｔＴＡゲシクルの用量の増加によりＧＦＰ発現が増強された。このシグナルは、培地へのドキシサイクリンの導入によって消失され得る。結果をゲシクルから２４時間後にＦＡＣＳによって分析したＭＦＩとして示す。
【図１０】時間の関数としてのゲシクルにより媒介されるｔＴＡ導入効率。ＨＥＫレポーター細胞株Ｔｅｏ−ＧＦＰを１２ウェルプレート（１ウェルあたり１×１０５個の細胞）に播種し、そしてｔＴＡゲシクル（５０μgの全タンパク質）で処理した。曝露時間は５分間から４時間の範囲であった。曝露した後、小胞を含む培地を廃棄し、そして細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２４時間後のＧＦＰ分析のために培養液中に維持した。ｔＴＡ導入効率は３時間までの曝露時間で次第に上昇し、３時間目が最適な曝露時間である。
【図１１】ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、２９３Ｔ細胞からの小胞の放出および対象のタンパク質の放出を増強する。膜タンパク質の放出：ＶＳＶ−Ｇを用いてまたは用いずに産生された小胞に取り込まれた複数回膜貫通タンパク質であるｍＣＡＴ−１のウェスタンブロット分析。小胞ペレットにおけるｍＣＡＴ−１の免疫標識は、ＶＳＶ−Ｇがプロデューサー細胞に導入された場合にｍＣＡＴ−１の放出が劇的に増加することを示す。細胞質タンパク質の放出：類似の生化学分析を異なるバッチの小胞調製物に対して実施して、細胞質タンパク質のアクチンの放出を調査した。本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇが偽小胞と比較してアクチンの放出を感覚的に増強することを注記する。
【図１２】３μmの孔径のインサートを通した共培養実験における、ゲシクルにより媒介されるタンパク質の導入。本発明者らは、同じ培地中で、レポーターＴｅｏ−ＧＦＰレポーター細胞株とプラスミドの種々の組合せでトランスフェクションされたＨＥＫ細胞を培養した。細胞を示したように３μmの孔径のフィルターによって、プロデューサー細胞は６ウェル皿の下に、レポーター細胞株は上のインサートに分離した。プロデューサー細胞を、ｔＴＡ発現プラスミドを用いて、さらに担体ＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドまたは融合欠陥ＶＳＶ−Ｇを用いて同時トランスフェクションした。共培養から４８時間後、インサートを除去し、そしてレポーター細胞株をトリプシン処理し、そしてＦＡＣＳによって分析して、ｔＴＡ送達を評価した。結果は、Ｔｅｏ−ＧＦＰ細胞株のＭＦＩとして示される。
【図１３Ａ】昆虫細胞由来の微小胞の特徴付け。ＧＦＰ微小胞は、Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスで７２時間かけて感染させることによって産生された。濃縮後、それらをイオジキサノール勾配にかけ、そして２１５０００ｇで１０時間遠心分離にかけて、その密度に従って小胞を沈降させた。画分をチューブの底から回収し、そしてその密度を評量によって測定した。密度勾配はグラフＡで評価され得、ｄ＝１．３からｄ＝１．０５の範囲である。全ての画分を蛍光光度計によって分析して、ＧＦＰ（励起４８５、発光５１５）を検出し、実質的に画分２１（Ａ、白い棒）で検出された。また、画分の希釈液を使用して、Ｓｆ９細胞を感染させ、バキュロウイルスがどこに沈降したかを同定した。感染から３日後、ｓｆ９細胞をＦＡＣＳによって分析し、そしてバキュロウイルスを滴定した。Ａ（黒い棒）で示された結果は、ウイルスが沈降したことを示した。
【図１３Ｂ】昆虫細胞由来の微小胞の特徴付け。ＧＦＰ微小胞は、Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスで７２時間かけて感染させることによって産生された。濃縮後、それらをイオジキサノール勾配にかけ、そして２１５０００ｇで１０時間遠心分離にかけて、その密度に従って小胞を沈降させた。画分をチューブの底から回収し、そしてその密度を評量によって測定した。密度勾配はグラフＡで評価され得、ｄ＝１．３からｄ＝１．０５の範囲である。全ての画分を蛍光光度計によって分析して、ＧＦＰ（励起４８５、発光５１５）を検出し、実質的に画分２１（Ａ、白い棒）で検出された。また、画分の希釈液を使用して、Ｓｆ９細胞を感染させ、バキュロウイルスがどこに沈降したかを同定した。感染から３日後、ｓｆ９細胞をＦＡＣＳによって分析し、そしてバキュロウイルスを滴定した。Ａ（黒い棒）で示された結果は、ウイルスが沈降したことを示した。（Ｂ）各画分のＧＦＰ導入能を分析した。それは画分１４〜１９に含まれ、ウイルスを含む画分を部分的に重複していた。
【図１４】ｔＴａ昆虫微小胞の中和アッセイ（ＮＡ）。ｔＴＡ微小胞は、ｔＴＡ−バキュロウイルスで感染させたＨｉｇｈ５細胞において産生された。小胞を濃縮し、そしてＰＢＳに再懸濁し、そして１００μlのＰＢＳ中で実施したアッセイのために１０倍希釈した。０．５等量のリン脂質ｔＴＡを、抗ｇｐ６４抗体（クローンＡｃＶ１）または対照抗体（ＧＳＴ）の連続希釈液と共に３７℃で２時間インキュベーションした。小胞を次にＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞（一旦ｔＴＡが細胞に導入されるとＧＦＰを発現する）にのせた。２４時間後、小胞に曝露された細胞をＦＡＣＳ分析し、そしてＧＦＰ発現を定量した。結果を全個体群のＭＦＩとして示す。
【図１５】ｔＴＡ微小胞を使用した用量応答。ｔＴＡ昆虫小胞を以前に記載のように濃縮および精製し、そして−８０℃で保存した。漸増用量の小胞を使用して、ＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞株にｔＴＡを送達し、その結果、小胞の添加から２４時間後にはターゲット細胞において検出されるＧＦＰシグナルが増加した。ドキシサイクリン処理細胞はバックグラウンド蛍光を示し、予期されるＴＥＴ系の誘導性を反映する。
【図１６Ａ】ヒト細胞へのｔＴＡの導入は、昆虫細胞由来の微小胞によってなされるが、コードされるバキュロウイルスによってはなされない。（Ａ）バキュロウイルス構築物。
【図１６Ｂ】ヒト細胞へのｔＴＡの導入は、昆虫細胞由来の微小胞によってなされるが、コードされるバキュロウイルスによってはなされない。（Ｂ）ｔＴＡレポーター細胞株におけるプロモーター駆動ｔＴＡのＧＦＰ発現。
【図１６Ｃ】ヒト細胞へのｔＴＡの導入は、昆虫細胞由来の微小胞によってなされるが、コードされるバキュロウイルスによってはなされない。（Ｃ）ゲシクルへのＧＰ６４およびｔＴＡの放出。
【図１６Ｄ】ヒト細胞へのｔＴＡの導入は、昆虫細胞由来の微小胞によってなされるが、コードされるバキュロウイルスによってはなされない。（Ｄ）ｐＨまたはＣＭＶ精製微小胞を用いての処理時におけるｔＴＡレポーター細胞株におけるＧＦＰ発現。
【０１０８】
実施例
実施例１
要約
本実施例は、水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）でコーティングされ、そしてヒトターゲット細胞に外来性タンパク質を送達するのに使用されるエキソーム様小胞の工学操作を記載する。これらの粒子は１．１g/mlの密度で沈降し、そして細胞質タンパク質および膜タンパク質並びに転写因子を効率的にパッケージングし得る。膜ｍＣＡＴ−１タンパク質およびｔｅｔトランス活性化因子を含むモデル分子が、微小胞による処理時にヒトターゲット細胞に効率的に送達された。小胞により媒介される偽形質導入により、一過性のタンパク質発現がなされたが、それはｍＲＮＡまたはＤＮＡの導入に起因するものではなかった。本発明者らは、エンドソームｐＨを上昇させる薬物であるクロロキンが、タンパク質導入を無効にしたことを示し、このことはＶＳＶ−Ｇにより誘導される融合が送達機序に関与していたことを示す。
【０１０９】
ＶＳＶ−Ｇ膜融合性エンベロープが偽形質導入の重要な決定要因である。
本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇの発現が、偽形質導入し得る粒子の産生をもたらし得るかどうかを試験した。ＹＦＰを安定に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−Ｙ）を、真核細胞発現ベクターであるｐＶＳＶ−Ｇによってトランスフェクションした。上清を２日後に収集し、濾過し、そして超遠心分離によって濃縮した。対照として、同じプロセスを、偽トランスフェクションした２９３Ｔ−Ｙ細胞の上清にも適用した。２つの濃縮した調製物をナイーブ２９３Ｔ細胞に加え、これを１時間曝露した後に洗浄した。２４時間後、細胞をトリプシン処理して、ＦＡＣＳによって分析して、２つの個体群の蛍光を測定した。本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇ調製物に曝されていた細胞においてはＹＦＰの偽形質導入を観察することができたが、対照調製物に曝露された細胞においては観察できなかった（図１−Ｂ)。２つの試料の生化学分析は、大量のＹＦＰがＶＳＶ−Ｇ調製物中に沈降したが（図１−Ａ レーン１）、偽トランスフェクションされた調製物においてはＹＦＰを殆ど検出できなかった（レーン５）ことを明らかにした。これらのデータは、ＶＳＶ−Ｇがプロデューサー細胞の細胞質の成分を含む沈降可能な粒子の強力な放出に関与することを示す。さらに、これらの粒子は、ターゲット細胞にこの材料を送達することができるようであった。細胞を粒子での処理時に洗浄し、そして２４時間成長させ、その後、トリプシン処理および分析したので、本発明者らは、ＹＦＰシグナルが細胞内のものであり、そして細胞の表面に吸着された蛍光粒子に起因するものではないと想定した。これらのＶＳＶ−Ｇ微小胞は、実施例１の全体を通してゲシクルと呼ばれる。
【０１１０】
さらなる観察：融合を引き起こすことのできないＶＳＶＧ単一アミノ酸突然変異体（ＶＳＶＧ７２）１４をこのシステムで試験し、そして沈降したペレットには取り込まれなかった（図１ レーン２）。別のウェスタンブロット実験は、この突然変異体がプロデューサー細胞に発現されたが、上清には検出できなかったことを示し、これは細胞および上清中の両方に検出できたｗｔ−ＶＳＶ−Ｇとは対照的であった（図１Ｃ）。このことは、ＶＳＶ−Ｇ微小胞の産生が、プロデューサー細胞において融合に適した形態のＶＳＶ−Ｇを必要とすることを実証する。
【０１１１】
ＣＤ８１テトラスパニンタンパク質の偽形質導入
濃縮調製物によるＹＦＰなどの細胞質タンパク質の細胞から細胞への導入は、２９３Ｔ−Ｙ細胞が、脂質層に囲まれ、そしておそらく、膜タンパク質のような２９３Ｔ細胞の他のタンパク質にもコーティングされた、ＹＦＰを有する小胞を産生したという考えを支持する。この仮説を試験するために、本発明者らは、２９３Ｔ細胞をＶＳＶ−Ｇを用いてトランスフェクションすることによって新しいバッチのゲシクルを調製し、そしてこの濃縮調製物を使用して、エキソームに特徴的でそして２９３Ｔ細胞上に豊富に発現されているテトラスパニンタンパク質であるＣＤ８１タンパク質の導入を調査した（図２Ａ）。得られた材料を、ＣＤ８１を欠失したヒト肝細胞株であるＨｅｐＧ２細胞に適用した。本発明者らは、ゲシクルに１時間曝されたＨｅｐＧ２細胞は、ＣＤ８１免疫標識時に陽性として染色されたことを示したが、このことは、前記タンパク質がプロデューサー細胞からターゲット細胞へと移動したことを示す（図２．Ｂ）。
【０１１２】
ＨｅｐＧ２への外来性ＣＤ８１の導入は、ＨＣＶエンベロープ（ＨＣＶｐｐ）で偽型化されたレトロウイルスベクターによるこの細胞株の形質導入を可能とすることが知られている（Zhang. et al. Journal of virology 78, 1448-1455 (2004)）。実際に、ＣＤ８１は、Ｅ２糖タンパク質によって認識されるＨＣＶレセプターの１つとして記載されている。従って、ＣＤ８１の導入をさらに検証するために、本発明者らはＨｅｐＧ２を種々の用量のゲシクルに曝し、そしてナイーブＨｅｐＧ２細胞と比較したＨＣＶｐｐにより媒介される形質導入に対するその許容性を確認した。本発明者らは、ＨＣＶｐｐ形質導入へのＨｅｐＧ２の許容性が、細胞に導入されたゲシクルの量と共に増加し（図２．Ｃ）、この実験においてＨＣＶｐｐの力価は５倍まで増加することを示した。このことは、導入されたＣＤ８１タンパク質が、ゲシクルを介して輸送および導入された後でさえもそのＨＣＶ結合能を保持することを示す。
【０１１３】
ＹＦＰおよびＣＤ８１を有するゲシクルの特徴付け
タンパク質導入に関与する材料をより良好に特徴付けるために、膜を標識する親油性フルオロフォアであるオクタデシルローダミンＢクロライド（Ｒ１８）と共に培養したヒト細胞におけるＶＳＶ−Ｇのトランスフェクションによりゲシクルが産生された。最初の濃縮工程後、Ｒ１８ゲシクルを連続的なイオジキサノール勾配にかけ、そして３時間遠心分離にかけて、その密度に従って画分を分離した。１から２０までの全ての回収した画分を、５６０nmでの励起後に５９０nmで蛍光を発光するその能力について、Ｒ１８に対する発光値および励起値について分析した。図３Ａに示したように、Ｒ１８蛍光は、１３〜２０までの画分に検出され、ピークは画分１７にあり、これは１．１１g/mlの密度に対応する。
【０１１４】
別の実験において、２９３Ｔ−Ｙで産生されたゲシクルを同じように処理し、そして勾配にのせ、その後、異なる回収した画分におけるＹＦＰに関連した蛍光の分析を行なった。図３Ｂは、ＹＦＰが、１．１０〜１．１１の密度に対応する画分１７および１８に主に検出されたことを示す。本発明者らは次に、どの画分が、偽形質導入によってＹＦＰを送達することができるかを調べた。各試料の１／１０を２９３Ｔ細胞に適用し、そして蛍光の導入を２４時間後にＦＡＣＳによって分析した。図３に示したように、偽形質導入の決定要因は、実質的に画分１７に沈降していた（ｄ＝１．１１）。別の実験において、ゲシクルを分離し、そしてウェスタンブロットによって分析した。密度−画分の分析は、ＶＳＶ−ＧおよびＣＤ８１が、明らかに画分１７および１９に濃縮され、そしてこれは１．１０および１．１１g/mlの密度に対応することを明らかとした（図２Ｄ）。ＣＤ８１分子はエキソームに対するマーカーとして記載されているので（Lamparski et al. Journal of immunological methods 270, 211-226 (2002)）、本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇを有するゲシクルは、エキソーム様小胞の特定の型であると結論づけることができる。
【０１１５】
合わせて考えると、本発明者らの所見は、ＶＳＶ−Ｇトランスフェクション時に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１．１０〜１．１１g/mlの密度で沈降できる膜に囲まれたゲシクルを産生し、そしてこれらのエキソーム様微小胞は、ターゲット細胞に送達可能なプロデューサー細胞からのＣＤ８１などのタンパク質を含むことを示す。
【０１１６】
ヒト細胞におけるゲシクルにより媒介されるｍＣＡＴ−１の導入
ＹＦＰまたは高度に発現されるＣＤ８１が、２９３Ｔ−Ｙ／２９３Ｔ細胞によって産生されるゲシクルにパッケージングされるのと同じように、本発明者らは、プロデューサー細胞に過剰発現される任意のタンパク質が、新生ゲシクルに受動的に取り込まれ得るかどうか、そして少量のこのパッケージングされた材料がヒトターゲット細胞に送達され得るかを試験した。この概念を、モデルとしてｍＣＡＴ−１タンパク質（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）同種指向性エンベロープＥｃｏＲ１のレセプターとしても知られるマウスカチオン性アミノ酸輸送体）を使用して試験した。フラッグの付いたバージョンのｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドを構築し（図４で示されるＳｗＦｌａｇ ＥｃｏＲ）、そして２９３Ｔ−Ｙ細胞においてＶＳＶ−Ｇを用いて同時トランスフェクションし、その後ヒト細胞に導入されるＥｃｏＲを有する濃縮されたゲシクルを産生した。１時間後、曝露した細胞を洗浄し、そして抗Ｆｌａｇ−ＦＩＴＣ抗体を使用したＦＡＣＳによって判明したところ、ＥｃｏＲ発現について陽性と染色された（示していない）。ｍＣＡＴ−１導入をさらに検証するために、本発明者らは、ＭＬＶ−同種指向性エンベロープを用いて偽型化されたＹＦＰをコードするレンチベクターに基づいた形質導入アッセイを開発した。この糖タンパク質の特定の指向性に因り、これらのレンチベクターは排他的にマウス／ラット細胞またはヒト細胞を形質導入し得、ｍＣＡＴ−１はトランスフェクション時に発現される。ＥｃｏＲ−ゲシクルがヒト細胞に効率的にＥｃｏＲを送達するならば、これらは同種指向性ＹＦＰレンチ形質導入に許容性となるはずである。
【０１１７】
図４で示される結果は、ＥｃｏＲゲシクルで処理したまたは処理していないヒト細胞の滴定時における同種指向性レンチベクター調製物の力価を示す。ナイーブ細胞は、同種指向性レンチベクターを用いての形質導入に対して制限されるが（レーン３）、２μg（レーン１）または４μg（レーン２）の濃縮されたゲシクルで処理された細胞は、同種指向性形質導入に高度に許容性となる。形質導入培地中での同種指向性レンチベクターへのゲシクル−Ｇタンパク質の取り込みを回避するために、ゲシクルで処理した細胞を、形質導入前に２回洗浄した。
【０１１８】
ＥｃｏＲ−ゲシクル調製物を以前に記載のように密度勾配にかけて、ｍＣＡＴ−１の導入に関与する画分を同定した。回収した画分をウェスタンブロットによって、ＥｃｏＲ導入を媒介するその能力について分析した（図５）。本実験において、本発明者らは、１．１０の密度に対応する画分１７において、ＶＳＶ−ＧおよびｍＣＡＴ−１が高度に濃縮されており、そしてこの画分が、形質導入アッセイによって明らかになったところＥｃｏＲ導入に関与する主な画分であることを示す。これらのデータは、１．１０の密度で沈降するＥｃｏＲ−ゲシクルが、ターゲット細胞の膜中にｍＣＡＴ−１タンパク質を導入し、そこで同種指向性エンベロープに対するその結合特性を保持していることを示す。
【０１１９】
さらに本発明者らは、ゲシクル含量、および特にゲシクルの膜によって生まれるタンパク質の性質が、プロデューサー細胞のトランスフェクションによって容易に制御され得ることをここで示す。
【０１２０】
ゲシクルによるＥｃｏＲ送達の機序
導入されたｍＣＡＴ−１の寿命
本発明者らは次に、ゲシクル曝露から形質導入アッセイまでの間の遅延を変化させることによって、ヒト細胞に導入されたｍＣＡＴ−１の寿命を調べる。図６に示される結果は、Ｅｃｏレセプター機能が、そのゲシクルにより媒介された導入から約５０時間後に２９３Ｔ細胞表面から消失したことを示す。この実験は、２４時間に近い導入されたｍＣＡＴ−１の寿命を改変することなく、Ｈｅｌａ、ＨＵＨ．７（示していない）を含む種々のヒト細胞型において再現された。この一過性は、ゲシクルが、ゲシクルの調製を汚染させ得るプラスミドＤＮＡではなく、タンパク質を送達するという概念を安心させる。実際に、プラスミドＤＮＡによるｍＣＡＴ−１のコーディングは、ターゲット細胞における転写工程および翻訳工程を必要とし、トランスフェクション実験で一般的に観察されるように導入から４８時間後に発現のピークに至るだろう。
【０１２１】
ＥｃｏＲ機能は、ゲシクルに取り込まれた既製のタンパク質によって提供される
ｍＣＡＴ−１小胞を用いて導入される材料の性質を調べるために、本発明者らは、ヒトターゲット細胞を、ｍＣＡＴ−１ ｍＲＮＡに対して作られるｓｉＲＮＡで処理した。小胞が、それをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡを送達するならば、それはｓｉ−ｍＣＡＴ処理細胞において容易に分解されるだろう。
【０１２２】
ｍＣＡＴ−１免疫染色によって明らかであるように（図７Ａ）、ｍＣＡＴ−１ ｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ細胞における同時トランスフェクション実験時にｍＣＡＴ発現を抑制した。さらに、ｍＣＡＴ−１プラスミドでトランスフェクションされた細胞へのこの特異的ｓｉＲＮＡの導入は、同種指向性レンチベクターを用いて形質導入される細胞の能力を強く減少させた（図７Ｂ）。ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチベクター（ｇＬＶ）はｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞の両方を効率的に形質導入したが、同種指向性レンチベクター（ＥｃｏＬＶ）を用いて達成された形質導入効率は、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞において阻害された（７０％の阻害）。これらのデータは、ｓｉ−ｍＣＡＴが、ｍＣＡＴ−１レセプター機能に対して、これがプラスミドによってコードされる場合に特に影響を及ぼすことを示す。
【０１２３】
本発明者らは次に、ｍＣＡＴ−ｓｉＲＮＡが、ｍＣＡＴ−１微小胞によって送達されるレセプター機能に影響を及ぼしたかどうかを調べた。細胞をｍＣＡＴおよび対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションし、そして４８時間後にｍＣＡＴ−１小胞で処理した。形質導入アッセイを次にＥｃｏＬＶを用いて実施して、レセプター機能を確認した（図７Ｃ）。ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞の両方がＥｃｏＬＶを用いて効率的に形質導入され、このことは、ｓｉ−ｍＣＡＴが、小胞によって送達されるレセプター機能を抑制することに大きく失敗したことを示す。このことは、微小胞が本質的にレセプター機能を、ｍＲＮＡでもコンタミしているプラスミドＤＮＡでもなく既製のタンパク質を導入することによって送達したことを示す。
【０１２４】
ゲシクルにより媒介されるＥｃｏＲの送達はｐＨ依存性である
導入されたＥｃｏＲタンパク質はウイルスレセプターとして機能的であるので、このことは、ターゲット細胞の表面におけるその存在を意味する。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇエンベロープの性質に因り、ゲシクルと細胞膜との間の融合は、内部の酸性コンパートメントで起こり、表面ではなく細胞内でＥｃｏＲタンパク質を遊離し、そこで機能的であると考えられる。
【０１２５】
ＥｃｏＲ導入の機序に洞察を得るために、本発明者らは、ゲシクルによる処理前に、エンドソームｐＨを上昇させ、ＶＳＶ−Ｇによって引き起こされる膜融合を破壊することが知られる薬物であるクロロキン（ＣＱ）で２３９Ｔターゲット細胞を処理した。図８に示されるように、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチベクターは、ＣＱ処理細胞を形質導入できなかったが（レーン１）、同種指向性レンチベクターは、ｍＣＡＴ−１を構成的に発現している薬物を付与した２９３Ｔに使用した場合には依然として効率的である（レーン２）。これらのデータはｐＨ依存性を示す。興味深いことに、本発明者らは、ＣＱが、ゲシクルによるＥｃｏＲ送達を強力に阻害することを示す（レーン３）。同種指向性レポーターレンチベクターを用いての形質導入はＣＱによって減少しないので、この結果は、表面でＥｃｏＲを送達する細胞機序におけるＣＱにより媒介される失敗を反映する。
【０１２６】
これらのデータを考慮して、本発明者らは、ゲシクルが、ターゲット細胞内に内部移行した後に、エンドソームコンパートメントに輸送され、ここでは膜の融合がＥｃｏＲの放出に必要とされるというモデルを提案する。タンパク質は、多くの内因性レセプターの運命に従って、その後、細胞膜へと向けてリサイクルされる。
【０１２７】
ゲシクルによって媒介されるＴＥＴトランス活性化因子の送達
細胞質タンパク質および膜タンパク質の送達の他に、本発明者らは、核内で古典的に発現されているタンパク質である転写因子をパッケージングおよび送達するゲシクルの能力を探索した。この目的のために、ゲシクルを、その同族プロモーター、Ｔｅｔオペレーター（ＴＥＯ）の転写を活性化する合成転写因子であるＴＥＴ ｏｆｆトランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードするプラスミドを用いて同時トランスフェクションされ、細胞培養培地へのテトラサイクリン／ドキシサイクリンの導入によってスイッチオフすることのできる２９３Ｔ細胞において産生した（Gossen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 5547-5551 (1992)）。漸増用量のｔＴＡをのせたゲシクルを次に、Ｔｅｔオペレーターの制御下にあるｅＧＦＰ遺伝子から構成される発現カセットを有するレポーター細胞にのせた。図９に示される結果は、レポーター細胞株の蛍光が、処理から２４時間後にｔＴＡゲシクルによって活性化されることを示す。蛍光シグナルはゲシクルの用量と共に増加し、そして最も高い用量では、ｔＴＡ構築物でトランスフェクションされたレポーター細胞で得られたシグナルの約５０％に達する。本発明者らは、処理細胞における転写活性化は、ドキシサイクリン処理に依然として感受性であることを注記する。このことは、ｔｅｔトランス活性化タンパク質が、ゲシクルに成功裏にパッケージングされ、そしてレポーター細胞株に導入されたことを示す。
【０１２８】
曝露時間の関数としてのゲシクルにより媒介されるｔＴＡの導入効率
ＨＥＫレポーター細胞株Ｔｅｏ−ＧＦＰを１２ウェルプレート（１０５個の細胞）に播種し、そしてｔＴＡゲシクルで処理した（１ウェルあたり５０μgの全タンパク質）。曝露時間は５分間から４時間までであった。曝露後、小胞を含む培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２４時間後のＧＦＰ分析のために培養液中に維持した。ｔＴＡ導入効率は３時間までの曝露時間まで次第に上昇し、３時間が最適の曝露時間である（図１０参照）。
【０１２９】
ゲシクルの産生および用量測定方法
ヒトＥｃｏＲゲシクルの産生および用量
ヒトゲシクルを、リン酸カルシウム法を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって産生した。細胞を１０cm皿に３×１０６個の細胞で播種し、そして１皿あたり１５μgのＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドおよび１５μgのｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドを用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクション培地をＡＴＰ（１００μM）を含む新しい培地と２４時間後に交換し、そして小胞を含む上清をトランスフェクションから４８時間後および７２時間後に回収し、プールし、０．４５μmフィルターを通して濾過し、そしてＳＷ４１ローターで２５０００rpm（１１００００ｇ）で１時間３０分超遠心分離にかけた。あるいは、４５００ｇで１０時間かけて濃縮してもよい。ペレット化材料を最終的に冷ＰＢＳ中に再懸濁し、２００倍の濃縮を得た。大量調製は、６つの１０cm皿を使用して実施され、そして約４００μlの２００個の小胞を生成した。
【０１３０】
以前にＹＦＰ発現レンチベクターによって形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において１５μgのＶＳＶ−Ｇプラスミドをトランスフェクションすることによって、ＹＦＰ／ＣＤ８１を有する小胞を産生した。
【０１３１】
沈降した微小胞におけるタンパク質の量を定量するために、本発明者らはフラッグのついたｍＣＡＴ−１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡアッセイを開発した。簡潔に言うと、小胞の連続希釈液をＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ２％に溶解し、そして９６ウェルプレート中のカーボネートでコーティングされた緩衝液中（ｐＨ９．６）中で一晩コーティングした。フラッグ−ペプチド（Sigma）の連続希釈液を、平行してトリトンを含まない緩衝液中でコーティングした。タンパク質およびペプチドを、１／１０００で希釈した抗フラッグＨＲＰ抗体（M2 Sigma）と共に洗浄したプレートを１時間インキュベーションすることで明らかとさせ、そしてＴＭＢ基質を用いて最終的に明らかとした。これらのアッセイによって本発明者らは、小胞調製物中におけるフラッグのついたタンパク質の量を測ることができた。
【０１３２】
あるいは、本発明者らは、ＨＲＰ（Ｐ５Ｄ４ Sigma）と結合させた抗ＶＳＶＧ抗体によって認識されるＶＳＶ−Ｇペプチドの連続希釈液をコーティングすることによってＶＳＶ−Ｇ Ｅｌｉｓａアッセイを工学操作した。従って、全てのＶＳＶ−Ｇ小胞が、小胞調製物１μlあたり等量のＶＳＶ−Ｇペプチドとして表現され得る。
【０１３３】
考察
本発明者らは今回、工学操作したエキソーム様小胞の使用によって、ヒト細胞に細胞質タンパク質および膜タンパク質を導入するオリジナルかつ簡単な方法を開発した。このゲシクルにより媒介されるタンパク質送達技術をさらに使用して、ヒト細胞に機能的転写因子を導入した。これらの微小胞の産生は、ＶＳＶ−Ｇを用いて同時トランスフェクションされた２９３Ｔプロデューサー細胞における対象のタンパク質の過剰発現によって達成された。ＶＳＶ−Ｇは、膜タンパク質並びに膜脂質およびアクチンの豊富な上清の分析によって明らかとなるように、２９３Ｔ細胞からの小胞の産生をブーストするようである（図１１）。さらに、微小胞の膜をコーティングすることによって、膜融合性Ｇタンパク質はターゲット細胞に接触するその能力を増強し、そして粒子と細胞膜との間の非常に効率的な融合を可能とし、これはターゲット細胞における微小胞内容物の放出に対する必要条件である。
【０１３４】
実施例２
３μmの孔径のインサートを通しての共培養実験における小胞により媒介されるタンパク質の導入
本発明者らは、同じ培地中で、Ｔｅｏ−ＧＦＰレポーター細胞株と共に種々のプラスミドの組合せによってトランスフェクションされたＨＥＫ細胞を培養した。細胞を示したように３μmの孔径のフィルターによって、プロデューサー細胞は６ウェル皿の下に、レポーター細胞株は上のインサートに分離した。プロデューサー細胞を、ｔＴＡ発現プラスミドを用いて、さらに担体ＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドまたは融合欠陥ＶＳＶ−Ｇを用いて同時トランスフェクションした。共培養から４８時間後、インサートを除去し、そしてレポーター細胞株をトリプシン処理し、そしてＦＡＣＳによって分析して、ｔＴＡ送達を評価した。結果は、Ｔｅｏ−ＧＦＰ細胞株のＭＦＩとして示される（図１２）。
【０１３５】
この技術は、濃縮工程の必要を伴わず、ターゲット細胞へのタンパク質の送達を可能とする。濃縮された小胞は、ターゲット細胞型に依存して毒性であり得る。ターゲット細胞を上または下のチャンバーで培養し、そして一定したタンパク質の送達のためにウイルス産生細胞を数日間かけて注ぐことができる。いくつかの因子を連続的に導入しなければならない場合には、別の小胞を含む浴へのインサートの容易な導入によって、連続的な注入さえも実施することができる。
【０１３６】
実施例３
昆虫細胞の微小胞の産生および用量
バキュロウイルス産生を、製造業者の指示に従って、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Invitrogen）を使用して実施した。簡潔に言うと、対象のｃＤＮＡを、ＤＨ１０−ＢＡＣ細菌において組換えする前に、ｐＦＡＳＴ−１シャトルにクローニングした。バキュロウイルスＤＮＡを次に使用してＳＦ−９細胞をトランスフェクションして、７２時間後に回収される最初のバキュロストックを生成した（継代１）。このポリクローナルストックをさらに増殖して１×１０７pfu/ml（継代２）の力価に到達させ、これを４℃で保存し、そして小胞の産生のために使用した。
【０１３７】
昆虫細胞の微小胞を、グルタミン（２０mM）およびペニシリン−ストレプトマイシン（２５Ｕのペニシリン、２５μgのストレプトマイシン/ml）の補充された１００mlのExpress-five ＳＦＭ培地中で撹拌下で３０℃で懸濁して培養した２００×１０６個のＨＩＧＨ５細胞のバキュロウイルス感染（ＭＯＩ ０．５〜１）により産生した。接種から４８時間後、培地を収集し、清澄化し、そして０．４５μmの孔径のフィルターを通して２回濾過し、その後、ＳＷ−３２ローターで２４０００rpm（１００，０００ｇ）で超遠心分離にかけた。沈降した材料を次に冷ＰＢＳ（１００倍の濃度）中で再懸濁し、そして−８０℃で保存した。
【０１３８】
より良好な精製のために、この濁った調製物を非連続的なイオジキサノール勾配にかけ、別々の密度画分の分離を可能とした。画分の生物学的な分析は、有するタンパク質を導入できる活性な小胞は、１．０９〜１．１１の密度で沈降したことを明らかとした。これらの画分をプールし、そして冷ＰＢＳで補充されたプールの最後の濃縮工程後（ＳＷ４１で３００００rpmで１時間）に高度に精製された小胞が調製された。
【０１３９】
昆虫細胞由来の小胞は、リン脂質酵素的ＰＡＰ５０検出キット（Biomerieux）および前記したＶＳＶ−Ｇ ＥＬＩＳＡを用いて定量された。
【０１４０】
昆虫細胞由来微小胞の特徴付け
ＧＦＰ微小胞は、記載のように、組換えバキュロウイルスを用いての７２時間かけてのｓｆ９細胞の感染により産生された。濃縮後、小胞をイオジキサノール勾配にかけ、そして２１５０００ｇで１０時間遠心分離にかけて、その密度に従って小胞を沈降させた。画分を次にチューブの底から回収し、そしてその密度を評量によって測定した。密度勾配は図１３Ａのグラフに認められ得、ｄ＝１．３〜１．０５の範囲である。全ての画分を蛍光光度計によって分析して、実質的に画分２１で検出されたＧＦＰ（励起４８５発光５１５）を検出した（図１３Ａ白い棒）。画分の希釈液も使用して、ｓｆ９細胞を感染させて、どこにＧＦＰバキュロウイルスが沈降したかを同定した。感染から３日後、ｓｆ９細胞をＦＡＣＳによって分析し、そしてバキュロウイルス力価を計算した。Ａ（黒い棒）で示した結果は、ウイルスが画分１３と画分２０の間で沈降し、ピークは画分１６であることを示した。本発明者らはまた、画分を使用してヒト細胞にＧＦＰを送達し、そして２４時間後に蛍光の導入について分析した（図１３Ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、ＧＦＰ導入能は、画分１４〜１９に含まれ、一部、ウイルスを含む画分に重複していることを見出した。
【０１４１】
ｔＴＡ昆虫微小胞の中和アッセイ（ＮＡ）
ｔＴＡ微小胞を、ｔＴＡバキュロウイルスで感染させたＨｉｇｈ５細胞において産生した。小胞を濃縮し、そしてＰＢＳに再懸濁し、そして１００μlのＰＢＳ中で実施されるアッセイのために１０倍に希釈した。０．５等量のリン脂質ｔＴＡを抗ｇｐ６４抗体（クローンＡｃＶ１）または対照抗体の連続希釈液と共に３７℃で２時間インキュベーションした。小胞を次にＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞（一旦ｔＴＡが細胞に導入されるとＧＦＰを発現）にのせた。２４時間後、小胞に曝した細胞をＦＡＣＳ分析し、そしてＧＦＰ発現を定量した。結果（図１４参照）は全個体群のＭＦＩとして示す。
【０１４２】
ｔＴＡ昆虫微小胞を使用した用量応答
ｔＴＡ昆虫微小胞を濃縮し、そして以前に記載されたように精製し、そして−８０℃で保存した。漸増用量の小胞を使用してＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞株へとｔＴＡを送達し、その結果、増加したＧＦＰシグナルが、小胞添加から２４時間後のターゲット細胞に検出された。ドキシサイクリン処理細胞はバックグラウンド蛍光を示し、予期されるＴＥＴ系の誘導性を反映する（図１５参照）。
【０１４３】
考察
本発明者らは、ヒト細胞由来小胞の産生が、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドおよび対象のタンパク質（ＹＦＰ、ｍＣＡＴ−１、ｔＴＡ・・・）をコードする別のプラスミドを用いてのプロデューサー細胞の同時トランスフェクションにより達成されたことを示した。産生系の能力を増加させるために、本発明者らは、ＶＳＶ−ＧおよびｔＴＡをコードする組換えバキュロウイルスを構築し、そしてバキュロウイルス感染に対して高度に許容性の昆虫細胞を感染させた。さらにＨｉｇｈ５細胞およびＳｆ９細胞は、血清を含まないまたはさらには動物の製品を欠いた合成の培地中でさえも、２×１０６個/mlまでの懸濁液中で容易に培養することができる。特に、バキュロウイルスはヒト細胞中において複製せず、そして導入遺伝子の発現を駆動するポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞に特異的であり、ヒト細胞においては活性ではない。
【０１４４】
本発明者らは、ｔＴＡおよびＶＳＶＧを用いての同時感染時に、昆虫細胞が、ヒト細胞にｔＴＡを導入することのできる微小胞を産生することを見出した。本発明者らはまた、ＶＳＶ−Ｇはこの過程において有用であるが不要であることを見出し、このことは別の融合タンパク質で置き換えることができることを示唆する。この役割は、全ての感染細胞において発現されるバキュロウイルスのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ６４によって想定され得る。中和アッセイを実施することによって、本発明者らは、昆虫微小胞によって媒介されるタンパク質の送達が、ｇｐ６４抗体によって中和され得ることを示した。
【０１４５】
昆虫細胞小胞をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ＧＦＰ昆虫小胞をイオジキサノール勾配にのせてその密度を測定した。このプロセスは、そのそれぞれの密度に従って、混合物中に存在する異なる材料の分離を可能とする。この実験は、小胞を含む画分が、バキュロウイルスを含む画分と重複していることを示した。バキュロウイルスはヒト細胞においては複製できないことが一般的に認められているが、本発明者らは、ｔＴＡをコードするバキュロウイルスの僅かな発現が、レポーターターゲット細胞におけるＧＦＰの発現を活性化するのに十分なｔＴＡを産生し得ると想像することができる。これを確認するために、本発明者らは、Ｂａｃ組換え体（図１６Ａに示した構築物）の構築に使用されたシャトルプラスミド（ｐＦＡＳＴ）においてＣＭＶまたはＥＦＩａプロモーターによって昆虫特異的ポリヘドリンプロモーター（ｐＨ）を置換した。ｐＨとは対照的に、こうしたプロモーターは、ＨＥＫ−Ｔｅｏ ＧＦＰレポーター細胞株におけるトランスフェクション実験によって判明したようにヒト細胞において高度に活性である（図１６Ｂ）。本発明者らは次に、その後増幅し、そしてｓｆ９細胞において感染するために使用した、２つの組換えバキュロウイルス（ＣＭＶ１およびＣＭＶ２）を生成するためのＣＭＶプロモーターを選択する。どちらのＣＭＶ組換え体も、ｐＨ組換え体と同じくらいの効率的にｓｆ９細胞を感染した。これはプロデューサー細胞溶解液に対して実施されたウェスタンブロット分析によって判明した（図１６Ｃ）。バキュロウイルスタンパク質ｇｐ６４は、使用したプロモーターの性質に関係なく、細胞溶解液中において明確に検出された。微小胞の調製時に、本発明者らは微小胞溶解液に対して同じ染色を実施し、そしてｇｐ６４が３つの試料中に高度に検出されることを確認し、ＣＭＶ置換は、ｓｆ９におけるバキュロウイルス感染にもウイルス放出にも有意に影響を与えなかったことを示した。予期されたように、本発明者らは、ｐＨ組換え体が、２つのＣＭＶ組換え体と比較してｓｆ９細胞においてより高いレベルのｔＴＡを発現したことを見出した。このことは、ｐＨ溶解液中にかなりより高い、微小胞に検出されるｔＴＡの量に論理的に影響を及ぼした。漸増用量のｐＨ−ｔＴＡおよびＣＭＶ−ｔＴＡ微小胞を、最終的にＨＥＫ−ＴｅｏＧＦＰ細胞株にのせた。ｔＴＡ送達の効力を反映するＭＦＩを２４時間後にＦＡＣＳによって分析し、ｐＨ組換え体を用いて産生された小胞が、ＣＭＶ組換え体を用いて産生されたものよりも１０倍以上効率的であることが判明した（図１６Ｄ）。このことは、効率的なｔＴＡ導入は、プロデューサー細胞における高いレベルのタンパク質発現と相関することを示す。これは、タンパク質それ自体がバキュロウイルスに関連した微小胞によって伝達されるという仮説を支持する。さらに、プロモーターの交換によってヒト細胞におけるｔＴＡバキュロウイルスの転写能を増加させても、ターゲットにおけるｔＴＡの到達性は増加せず、バキュロウイルスにより駆動される転写は、送達されたｔＴＡの機能に関与しない（または少ししか関与しない）ことを示す。合わせるとこれらのデータは、ヒト細胞におけるｔＴＡの導入は、昆虫細胞に由来するｇｐ６４微小胞によって達成され、コードされるバキュロウイルスによってではないことを示す。
【０１４６】
参考文献
本出願の全体を通じて、種々の参考文献が、本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、工学操作された微小胞を用いての直接的なタンパク質の送達に関する。
【０００２】
発明の背景
ターゲット細胞への対象のタンパク質の一過性導入は大きな挑戦であり、基礎研究、応用科学および治療分野において多くの適用がある。
【０００３】
何十年間も、ターゲット細胞への対象のタンパク質の導入は、トランスフェクションとして知られる、前記の対象のタンパク質をコードする遺伝子材料の導入によって間接的に行なわれてきた。
【０００４】
リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔法およびリポフェクションなどの多くのトランスフェクション技術が何年もかけて開発されてきた。
【０００５】
しかしながら、これらの技術は、その使用を制限し得るいくつかの不便がある。ターゲット細胞への対象のタンパク質をコードする遺伝子の導入は、ターゲット細胞の転写および翻訳の機械に依拠する。従って、所望のタンパク質の発現は遅く、そしていくつかの望ましくない効果が観察され得る（トランスフェクション試薬自体の毒性、インターフェロン応答の活性化など）。
【０００６】
さらに、特定の細胞型、典型的には非分裂細胞、例えばニューロンはあまり良好にトランスフェクションできない。形質導入として知られる他の遺伝子導入技術が、この欠点を回避するためにより最近になって開発された。形質導入は、ターゲット細胞に遺伝子材料を導入する際にウイルスベクターの使用に依拠する。この趣旨でレトロウイルスに基づいたシステムがしばしば使用される。しかしながら、これらの技術にはいくつかの欠点がある。第一に、レトロウイルスベクターが不活性化されていても、前記レトロウイルスベクターの使用に関連した衛生上のリスクがある。第二に、レトロウイルス粒子の産生は非常に退屈で時間がかかる。実際に、ウイルスベクター粒子の形成に必要な種々のタンパク質をコードする大量の４または５種類の異なるプラスミドの産生を含む。最後に、ターゲット細胞に観察される効果は速効性ではない。典型的には、対象のタンパク質は、少なくとも２４時間、通常４８〜７２時間の遅延の後にターゲット細胞において発現され、その間に転写および翻訳が起こる。
【０００７】
以前の研究は、レトロウイルスベクターと同時に産生されるバイスタンダード物質によるレポータータンパク質の予期せぬ導入を記載した（Liu et al., Journal of virology 70, 2497-2502 (1996); Gallardo et al., Blood 90, 952-957 (1997)）。例えば、これらの著者は、レトロウイルスにより媒介される遺伝子導入に対して非許容性であることが知られるターゲット細胞へとβ−ガラクトシダーゼを送達する、そのウイルス調製物の能力を記載した。偽形質導入と呼ばれるこの望ましくない形質導入の人工産物は、処理細胞に導入されたタンパク質を一過性に発現したが、一方、レトロウイルスによる形質導入は、送達された導入遺伝子の安定した長期の発現を確実にする。興味深いことに、これらの著者は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を用いて偽型化されたレトロウイルスベクターを使用して、偽形質導入が特に、濃縮されたＶＳＶ−Ｇでコーティングされたレトロウイルス粒子を用いて起こっていることを観察した。しかしながら、これらの研究は、このタンパク質により媒介される偽形質導入の基礎をなす決定的な機序の証拠は全く提供しておらず、そして導入されたタンパク質はウイルスエンベロープに組み込まれている可能性が最も高いと考えられた（Schnell et al., PNAS, 1996, 93, 11359-11365）。それ故、この偽形質導入は、膜タンパク質に限定されると考えられた。さらに、それは、遺伝子により媒介されるレトロウイルスによる形質導入から分離できないと考えられた。
【０００８】
ターゲット細胞に対象のタンパク質を特異的で時間制御的に送達するために、別の利用可能な技術は、ターゲット細胞へのマイクロインジェクションである。しかしながら、この技術では、マイクロインジェクション前に対象のタンパク質を得ることが必要である。ペプチドは化学合成によって得ることができるが、より大きなタンパク質は、特別な産生手順および精製手順を必要とする。従って、これらの方法は費用がかかり、そしてラージスケールの用途には良好に順応できない。
【０００９】
他の研究は、ＨＩＶ ｔａｔおよびポリアルギニンなどの、タンパク質の形質導入を媒介する短いペプチドとタンパク質をコンジュゲーションすることによる前記タンパク質の送達に焦点を当てる。しかしながら、これらの技術もまた、組換えタンパク質に依拠しているので、ラージスケールでの実行は困難である。
【００１０】
従って、ターゲット細胞に対象のタンパク質を送達するための迅速で安全で効率的な方法が当技術分野において依然として必要である。
【００１１】
発明の要約
本発明は、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞に関する。
【００１２】
本発明はまた、本発明による真核細胞によって分泌される微小胞に関し、前記微小胞は、前記ウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む。
【００１３】
本発明はまた、ターゲット細胞を、対象のタンパク質を含む本発明による微小胞と接触させることによって、前記ターゲット細胞に前記の対象のタンパク質をin vitroで送達するための方法に関する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明者らは、対象のタンパク質を発現する真核細胞におけるウイルス膜融合タンパク質の過剰発現は、前記の膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む微小胞の分泌をもたらし得ることを発見した。さらに、本発明者らは、前記の微小胞を使用して、前記タンパク質の機能を変化させることなく、ターゲット細胞に前記の対象のタンパク質を効率的に送達することができることを実証した。従って、本発明の方法は、ターゲット細胞における機能的タンパク質の一過性かつ迅速な導入に適切である。
【００１５】
従って、本発明は、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞に関する。前記真核細胞は、前記ウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む微小胞を分泌することができる。
【００１６】
１つの態様において、本発明による真核細胞は、全くウイルス構造タンパク質を発現せず、そしてこのような真核細胞によって分泌された微小胞は、全くウイルス構造タンパク質を含まない。従って、本発明による微小胞は、この点において、例えばＷＯ２００６／０５９１４１に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）（前記ＶＬＰは、ＨＩＶ１ Ｇａｇなどのウイルス構造タンパク質を含む）とは異なる。
【００１７】
本明細書において使用する「ウイルス構造タンパク質」という用語は、ウイルスのカプシドタンパク質またはコアタンパク質の全体構造に寄与するウイルスタンパク質を指す。「ウイルス構造タンパク質」という用語はさらに、ウイルスのカプシドタンパク質またはコアタンパク質の構造に寄与するこのようなウイルスタンパク質の機能的フラグメントまたは誘導体を含む。ウイルス構造タンパク質の一例はＨＩＶ１ Ｇａｇである。ウイルス膜融合タンパク質はウイルス構造タンパク質とは考えない。典型的には、前記ウイルス構造タンパク質は微小胞内に局在化している。
【００１８】
本発明者らは、実際に、全くウイルス構造タンパク質を発現しないが、膜融合タンパク質（例えばＶＳＶ−Ｇ）または他の膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞において、対象のタンパク質を含む微小胞が産生され得ることを示した。
【００１９】
さらに、本発明による微小胞は、対象のタンパク質をコードする核酸を全く含まないかもしれない。もちろん、痕跡量の核酸が、特にプロデューサー細胞からの痕跡量のｍＲＮＡ、またはさらには以前のトランスフェクションから生じたＤＮＡが前記微小胞に含まれていることは除外できない。しかしながら、本発明者らは、このような痕跡量の核酸（存在する場合）は、微小胞によるタンパク質機能の導入の少なくとも９０％については関与しないことを実証した。
【００２０】
典型的には、真核細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、ニワトリ細胞、または昆虫細胞である。適切な哺乳動物細胞の例は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞であるがそれらに限定されるわけではない。適切な昆虫細胞の例としては、Ｈｉｇｈ５細胞およびＳｆ９細胞が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。昆虫細胞はいくつかの利点を提示する。特に、それらは望ましくないヒトタンパク質に欠け、そしてその培養は動物の血清を必要としない。
【００２１】
「過剰発現する」によって、所与の細胞によって発現されるタンパク質の量を増強するための当技術分野において知られている任意の手段を意味する。実際的には、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質は、前記真核細胞において、前記真核細胞が、全くウイルス構造タンパク質を発現する必要を伴わず、前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む微小胞を分泌することができるレベルまで発現される。
【００２２】
典型的には、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質の過剰発現は、真核細胞を、ウイルス膜融合タンパク質をコードする発現ベクター、および対象のタンパク質をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクションすることによって達成され得る。
【００２３】
別の態様において、本発明による前記の真核細胞は、ウイルス膜融合タンパク質としてのＶＳＶ−Ｇおよび対象のタンパク質を過剰発現するが、他のウイルスタンパク質は全く、特にウイルス構造タンパク質は全く過剰発現しない。前記態様に従って分泌される微小胞は、ＶＳＶ−Ｇおよび前記の対象のタンパク質を含むが、ウイルス構造タンパク質は全く含まない。
【００２４】
別の特定の態様において、真核細胞は、ウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質のみを過剰発現する。この態様において、ウイルス膜融合タンパク質、例えばＶＳＶ−Ｇの発現は、細胞において過剰発現されたタンパク質の少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％を示し得る。
【００２５】
１つの態様において、前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質は２つの異なるベクターによってコードされ得る。
【００２６】
１つの態様において、前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質は、バイシストロン性発現カセットを含む単一のベクターによって保有され得る。関連する態様において、前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質は互いに共有結合されていない。
【００２７】
１つの態様において、発現ベクターは、エピソーム複製プラスミド、および例えば、ＳＶ４０ ＯＲＩまたはＥＢＶ ＯＲＩ配列などのウイルス性の起点配列を含むプラスミドを含み得る。
【００２８】
発現ベクターを介する過剰発現は、分子生物学の分野において知られている任意の遺伝子導入法を含み得る。好ましい態様において、過剰発現は外来性ＤＮＡのトランスフェクションによって得られる。適切なトランスフェクション法は、当業者に公知の古典的な方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを使用するトランスフェクション（リポフェクションとしても知られる）または電気穿孔法である。所与の細胞に対して適切なトランスフェクション法を選択することは当業者の技能の範囲内である。
【００２９】
好ましい態様において、過剰発現はウイルス形質導入によって得られる。
【００３０】
過剰発現は一過性過剰発現または安定な過剰発現であり得る。
【００３１】
一過性の過剰発現を使用する場合、細胞は、典型的には、トランスフェクションから４８時間後から７２時間後までの間に最適量のウイルス膜融合タンパク質および／または対象のタンパク質を過剰発現する。
【００３２】
「過剰発現」という用語はまた、内因性タンパク質、すなわち真核細胞によって天然に発現されるタンパク質の過剰発現を含む。過剰発現は、前記タンパク質をコードする遺伝子のさらなるコピーの導入、または内因性タンパク質の発現の刺激のいずれかに存し得る。例えば、真核細胞を、前記内因性タンパク質の発現を増強することが知られる培養条件下に置くことができる。
【００３３】
本発明の態様において、真核細胞は、２〜５つの異なる対象のタンパク質を過剰発現する。
【００３４】
典型的には、前記ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩウイルス膜融合タンパク質、例えばインフルエンザウイルスヘマグルチニン、クラスＩＩウイルス膜融合タンパク質またはクラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質である（クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質に関する総説Backovic et al, Curr Opin Struct Biol 2009, 19(2):189-96またはCourtney et al, Virology Journal 2008, 5:28を参照されたい）。
【００３５】
好ましい態様において、前記ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩウイルス膜融合タンパク質である。
【００３６】
クラスＩウイルス膜融合タンパク質の例は、バキュロウイルスＦタンパク質、特に核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質、例えばSpodoptera exiguaＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）Ｆタンパク質およびLymantria dispar ＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）Ｆタンパク質である。
【００３７】
好ましい態様において、前記ウイルス膜融合タンパク質はクラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質である。
【００３８】
クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質の例は、ラブドウイルスＧ（例えば水疱性口内炎ウイルスの膜融合タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ））、ヘルペスウイルスｇＢ（例えばヘルペス単純ウイルス１の糖タンパク質Ｂ（ＨＳＶ−１ ｇＢ））、ＥＢＶ ｇＢ、ソゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（例えばAutographa California multiple NPV (AcMNPV) gp64）、およびボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶ Ｇ）である。
【００３９】
より好ましい態様において、前記のウイルス膜融合タンパク質はＶＳＶ−Ｇまたはバキュロウイルスｇｐ６４である。１つの態様において、前記ウイルス膜融合タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ：Ｍ３５２１９．１に定義されているようなＶＳＶ−Ｇポリペプチド、または膜融合特性を保持した任意の機能的フラグメントまたはその機能的誘導体である。
【００４０】
本明細書において使用する「膜融合性」という用語は、ターゲット細胞の膜への微小胞の形質膜の融合を誘導し得るウイルスタンパク質を指す。
【００４１】
本発明の１つの態様において、本発明による真核細胞はさらに、膜発芽を誘導するタンパク質を過剰発現する。この態様において、微小胞の産生が増強される。
【００４２】
本明細書において使用する「膜発芽を誘導するタンパク質」という表現は、脂質二重層の変形を促進し得、そして小胞の形成を媒介し得る、任意のタンパク質を指す。
【００４３】
所与の試験タンパク質が膜発芽を誘導する能力は、以下のin vitroの試験「Ａ」に従って評価することができ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を試験タンパク質でトランスフェクションするか、または空ベクターを用いて偽トランスフェクションする。トランスフェクションから２０時間後、細胞培地をＲ１８含有培地（２０μg/ml）と交換する。Ｒ１８、すなわちオクタデシルローダミンＢクロライドは、膜に結合し、そして５６０nmでの励起時に５９０nmで蛍光を発する親油性化合物である。Ｒ１８を細胞膜へと取り込ませるための６時間のインキュベーション後、培地を、Ｒ１８を含まない新しい培地と交換する。トランスフェクションから７２時間後、トランスフェクションした細胞および偽トランスフェクションした細胞からの培地を回収し、清澄化し、そして蛍光光度計によって分析した。レサズリンに基づいたアッセイによって計測した生細胞の数に対して規準化した、Ｒ１８に関連した蛍光の量は、各条件において細胞によって放出される膜の量を反映する。
【００４４】
試験タンパク質は、上記の試験「Ａ」によって測定したところ、細胞あたりのＲ１８に関連する蛍光の量を増加させるならば、膜発芽を誘導すると考えられる。
【００４５】
種々の細胞タンパク質およびウイルスタンパク質が膜発芽を誘導することが知られている。
【００４６】
膜発芽を誘導する細胞タンパク質の例は、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１（Trajkovic et al. 2008 Science, vol 319, p 1244-1247）、クラスリンアダプター複合体ＡＰ１（Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203）、脂質特性を改変するタンパク質、例えばフリッパーゼ、スクランブラーゼ、非古典的経路を介して分泌を促進するタンパク質、例えばＴＳＡＰ６（Yu et al. 2006 Cancer Res vol 66, p4795-4801）およびＣＨＭＰ４Ｃ（Yu et al. 2009, FEBS J. vol 276, p2201-2212）である。
【００４７】
膜発芽を誘導するウイルスタンパク質の例は、テテリン（tetherin）／ＣＤ３１７アンタゴニスト、例えばＨＩＶのＶｐｕタンパク質（Neil et al. 2008. Nature vol451, p425-4431）および種々のウイルス構造タンパク質、例えばレトロウイルスＧＡＧ（Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203）およびエボラＶＰ４０（Timmins et al., Virology 2001）である。
【００４８】
膜発芽は、ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞の細胞培養条件、例えば温度、Ｃａ２＋、濃度などを改変することによっても誘導され得る。
【００４９】
本明細書において使用するような、前記の対象のタンパク質は、ターゲット細胞へと導入されることが望まれる任意のタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの態様において、前記の対象のタンパク質は、全くウイルス膜融合タンパク質または全く前記のウイルス膜融合タンパク質のフラグメントまたは膜融合特性を保持した誘導体を含まない。
【００５０】
典型的には、前記の対象のタンパク質は、異種タンパク質、例えば膜タンパク質、細胞質タンパク質、ウイルスタンパク質または核タンパク質であり得る。本明細書に使用するような「異種」という用語は、前記タンパク質が、前記の対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞のゲノムに天然に見られる遺伝子からは発現されないことを意味する。
【００５１】
あるいは、前記の対象のタンパク質は、内因性タンパク質、例えば特定の細胞系において高い量で天然に発現されているタンパク質であり得る。この態様において、高い量で対象のタンパク質を天然に発現する細胞株は、前記の対象のタンパク質および前記の膜融合タンパク質を含む微小胞を産生するように、ＶＳＶ−Ｇなどの膜融合タンパク質をさらに過剰発現するように工学操作されている。
【００５２】
適切な膜タンパク質の例は、膜レセプター、ＣＤ８１、ｍＣＡＴ−１（同種指向性（Ecotropic）レセプター）、ＣＸＣＲ４およびホーミングタンパク質、ＣＤ４、ＣＣＲ５、シアル酸リッチタンパク質、クローディン、ＣＤ２１、Ｔ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプター、ＣＦＴＲおよびＴＮＦＲ１である。
【００５３】
適切な細胞質タンパク質の例は、アポトーシス因子、例えばＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、ＦａｓＬおよび蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ、ＹＰＦ、Ｖｅｎｕｓ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ、Ｃｈｅｒｒｙ-Ｒｅｄ、およびＤｓＲｅｄ２である。
【００５４】
ウイルスタンパク質の例は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｇｐｌ２０、ＧＰ４１（ＨＩＶ−１／２、ＳＩＶ）、ｖｐｘ（ＳＩＶ）、ｔａｘ、ｒｅｘ（ＨＴＬＶ−１）、ＥＢ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ１、ＢＨＲＦ１（ＥＢＶ）、ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｃｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２（ＨＣＶ）、スモールＴ抗原、ラージＴ抗原（ＳＶ４０）、ＮＳ１、ノイラミニダーゼおよびＨＡ（インフルエンザ）である。
【００５５】
核タンパク質の例は、転写因子または補因子、ｔＴＡテトラサイクリントランス活性化因子、ＶＰ１６およびＶＰ１６含有融合タンパク質、ＣＲＥリコンビナーゼ、Ｃｒｅ−Ｅｒｔ２リコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼまたはフリッパーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ／ＲＡＤ５１、Ｔｒｅリコンビナーゼ、メガヌクレアーゼ、例えばＩ−Ｓｃｅ１、転写因子、例えばＧＡＴＡ−１、ＦＯＧ、ＮＦ−Ｅ２、ＴＡＬ１／ＳＣＬ、ＥＫＬＦ、ＦＢＩ−１、ＲＵＮＸ１、ＰＵ．１、レチノイン酸レセプター、ビタミンＢ３レセプター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質、イカロス、Ｐａｘ５、ヤヌスキナーゼ、Ｅ２Ａ、Ｂｃｌ−６、ＥＢＦファミリー、Ｅｇｒ２および３、ＫｌＦ５、ＴｃＦ４、ＭｙｏＤ、ＳＵＭ−１、ミオゲニン、ｍｙｆ−５、ＭＲＦ４、Ｐｉｔｘ２、Ｅｇｒ２およびＥｇｒ３、ＮＦｋＢ、ＡＰ１、ＡＰ２、ＰＯＵ因子、Ｓｐ１／Ｓｐ３、ｂＨＬＨ、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ２、Ｆｏｘｇ１、ＥＬＦ３、Ｅｒｍ、Ｏｌｆ−１、Ｐａｘ６、α−Ｐａｌ／Ｎｒｆ−１、Ｎｕｒｒ１およびＰｉｔｘ３である。
【００５６】
有利には、本発明者らは、対象のタンパク質が、一旦、ターゲット細胞に導入されると、その機能性を保持することを示した。特に、前記の対象のタンパク質はターゲット細胞においては開裂しない。例えば、前記の膜レセプターは、その対応するリガンドを認識することができるように、微小胞による送達後に細胞膜中に正しく局在する。別の態様において、前記の対象のタンパク質は、転写因子によって調節される遺伝子の転写を刺激または抑制することができるように、微小胞による送達後に核内に正しく局在する転写因子または対応する補因子である。
【００５７】
本発明の態様において、対象のタンパク質は、細胞膜に局在するように修飾されていてもよい。
【００５８】
１つの態様において、対象のタンパク質は、ウイルス膜融合タンパク質に融合している。有利には、対象のタンパク質は、酸性条件下で開裂できるタンパク質分解開裂部位を導入することによって、酸性条件下で膜から放出されるようにさらに修飾されていてもよい。酸性条件下で開裂されるタンパク質分解開裂部位の例は、ｆｌｕＨＡ開裂部位、ＮｉｐａｈウイルスＦタンパク質開裂部位またはカテプシン開裂部位である。
【００５９】
代替的な態様において、対象のタンパク質は、ウイルス膜融合タンパク質に融合していない。実際に、前記の対象のタンパク質は、ウイルス膜融合タンパク質と共に過剰発現されると、微小胞中に共局在し得ることが示された。典型的には、タンパク質のファルネシル化に関与するファルネシルモチーフおよび／またはタンパク質のミリスチル化に関与するミリスチルモチーフを導入して、タンパク質を膜へと指向させ得る。
【００６０】
１つの態様において、ウイルス膜融合タンパク質および／または対象のタンパク質は、真核細胞から放出される微小胞の精製を可能とするタグを含み得る。前記タグは、例えば、ウイルス膜融合タンパク質の外部ドメインに局在し得る。適切なタグとしては、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓ６タグが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。適切なタグおよび前記タグの適切な精製法を選択するのは当業者の技能範囲内である。適切な精製法としては、免疫沈降法、アフィニティクロマトグラフィー、および抗タグ特異的抗体でコーティングされた磁気ビーズが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【００６１】
好ましい態様において、本発明による真核細胞はウイルスを含まず、特に、前記真核細胞は、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸を全く含まない。
【００６２】
本発明はまた、本発明による真核細胞によって分泌される微小胞に関し、前記微小胞は、前記ウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む。別の態様において、前記微小胞は、前記のウイルス膜融合タンパク質に共有結合していない前記の対象のタンパク質を含む本発明による真核細胞から得られる。
【００６３】
理論によって固めたくはないが、前記微小胞はエキソソーム様であり、４０〜１５０nm、例えば４０〜１００nmのサイズ、例えば約１００nmの平均サイズであると考えられている。典型的には、本発明による微小胞は、１．０８g/ml〜１．１２g/mlの密度を有する。好ましくは、本発明による微小胞は１．０９g/ml〜１．１１g/mlの密度を有する。典型的には、前記密度は、実施例１に定義したような連続的なイオジキサノール勾配を通しての沈降によって測定され得る。
【００６４】
ウイルス膜融合タンパク質および／または対象のタンパク質の一過性過剰発現が使用される場合、微小胞は、典型的には、トランスフェクションから４８〜７２時間後の細胞上清から収集される。典型的には、本発明による微小胞は、本発明による真核細胞の細胞上清の濾過（例えば０．４５μmの孔径のフィルター）および超遠心分離、例えば１１０，０００ｇで１．５時間の超遠心分離によって単離され得る。有利には、本発明による微小胞は、ターゲット細胞へ材料を導入する能力を失うことなく−８０℃で凍結および保存され得る。
【００６５】
別の態様において、本発明による前記微小胞は、前記の対象のタンパク質をコードする核酸を全く含まない。
【００６６】
好ましい態様において、本発明による微小胞はウイルスを含まない。
【００６７】
当初は免疫系細胞について記載されたが、細胞から放出された微小胞は、in vivoにおいて多くの体液中に見出される（Simpson et al. Proteomics 8, 4083-4099 (2008)）。多くの研究が、免疫応答のモデュレーションおよび細胞間情報伝達におけるこれらの微小胞の役割を強調している。
【００６８】
理論によって固めたくはないが、本発明の微小胞はエキソーム様の小胞であり、そしてウイルス膜融合タンパク質の存在は、前記の微小胞が、前記微小胞に含まれる材料をターゲット細胞に効率的に送達することを可能としていると考えられる。
【００６９】
本発明はまた、前記のターゲット細胞を、前記の対象のタンパク質を含む本発明の微小胞と接触させることによって、対象のタンパク質をターゲット細胞にin vitroで送達するための方法に関する。
【００７０】
ターゲット細胞の例は、普通の実験細胞株、例えばＨｅｌａ細胞および誘導体、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞および誘導体、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＵＨ７細胞および誘導体、小細胞肺癌細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｌ９２９細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＴＨＰ１細胞、Ｕ９３７細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＰＣ１２細胞；骨髄から、血液から、臍帯血から精製したヒト造血細胞ＣＤ３４＋；単球からまたはＣＤ３４＋細胞から分化した樹状細胞（ＤＣ）；Ｔ細胞（ＣＤ８およびＣＤ４）、Ｂ細胞（記憶Ｂ細胞を含む）、肥満細胞、マクロファージ、ＤＣｓ、ＮＫ細胞を含む、血液から精製した初代ヒト細胞；Ｔ細胞（ＣＤ８およびＣＤ４）、Ｂ細胞（記憶Ｂ細胞を含む）、肥満細胞、マクロファージ、ＤＣｓ、ＮＫ細胞を含む、血液から精製した初代マウス細胞；ＭＲＣ５細胞、ＩＭＲ９０細胞を含む初代ヒト線維芽細胞；初代マウス線維芽細胞、およびヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ウサギ起源の胚幹細胞（ＥＳ）である。
【００７１】
本発明の微小胞の指向性は、使用されるウイルス膜融合タンパク質の指向性に依存する。
【００７２】
例えば、ＶＳＶ−Ｇは汎親和性であるので、ＶＳＶ−Ｇを含む本発明による微小胞はほぼすべての細胞をターゲティングする。気道細胞に指向性を有するウイルス膜融合タンパク質を含む微小胞が、気道細胞をターゲティングするのに好ましくは使用される。
【００７３】
好ましい態様において、本発明による微小胞は、ターゲット細胞と微小胞産生細胞との共培養によってin situで産生される。１つの特定の態様において、ターゲット細胞および微小胞産生細胞を、多孔性の壁によって隔てられた２つの異なるコンパートメント中に物理的に配置させ、前記の多孔性の壁は、真核細胞の直径よりも小さいが、対象の微小胞の直径よりは大きい直径を有する孔を有する。有利には、本発明による真核細胞によって産生されるような微小胞は、一方のコンパートメントから他方のコンパートメントへと拡散して、ターゲット細胞に到達し得、そこで対象のタンパク質を送達することができる。
【００７４】
この技術は、単離工程を必要とすることなく、ターゲット細胞へのタンパク質の送達を可能とする。
【００７５】
典型的には、いくつか（例えば、２、３、４、５、６・・・）の異なる対象のタンパク質は、ターゲット細胞を、前記のいくつかの異なる対象のタンパク質を含む本発明のいくつかの異なる微小胞と接触させることによって、ターゲット細胞に送達され得る。
【００７６】
典型的には、前記のいくつかの異なる微小胞の接触は同時または連続的であり得る。
【００７７】
複数のウイルスベクターによって成し遂げられる遺伝子送達とは対照的に、本発明による微小胞を用いてのタンパク質の送達は、多くの細胞型へのウイルスによる形質導入を制限する転写機械またはどのウイルス組込みプロセスも含むことなく、ターゲット細胞に機能を迅速に導入するためのオリジナルな方法である。本発明による微小胞は、休止細胞または完全に分化した細胞を含む実質的にあらゆる細胞型において使用され得る。
【００７８】
遺伝子トランスフェクションなどの古典的な遺伝子導入技術とは対照的に、本発明の方法は、ターゲット細胞内における転写および翻訳に依拠せず、細胞の代謝を撹乱しない。従って、本発明による方法は全くインターフェロン応答を活性化せず、それ故、ターゲット細胞に対象のタンパク質を送達するためのより特異的な方法であると考えられる。
【００７９】
本発明による微小胞によって送達される材料が少量であることおよびその非遺伝子性から、微小胞は、タンパク質の少量で一過性の存在が顕著な生物学的効果をもたらし得る適用について、すなわち、高い生物学的浸透性を有するタンパク質に有用であるようである。
【００８０】
当業者は、各々の具体的な目標に従って、対象のタンパク質／ターゲット細胞の適切な対を容易に選択するだろう。細胞、微小胞および本発明による方法の適用の非制限的な例を以後に記載する。
【００８１】
１つの局面において、本発明は、本発明による微小胞のin vitroにおける使用に関する。
【００８２】
１つの局面において、本発明は、本発明による微小胞のin vivoにおける使用に関する。
【００８３】
１つの局面において、本発明は、非治療適用のための本発明による微小胞の使用に関する。
【００８４】
典型的には、本発明による微小胞は、ターゲット細胞に対象のタンパク質をin vitroにおいて導入して、前記の対象のタンパク質の生理学的効果を研究するために使用され得る。基礎科学の調査のためのツールとしての本発明の多くの可能な適用がある。
【００８５】
例えば、細胞、微小胞および本発明による方法は、誘導発現系の誘導に必要な特定の補因子を送達するために使用され得る。典型的には、対象のタンパク質としては、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｃｒｅ／ｌｏｘ系の誘導に有用）、ｔＴＡトランス活性化因子（テトラサイクリンオペレーターの誘導に有用）が挙げられる。前記補因子はターゲット細胞に導入することが困難であることが多く、そして、対象のタンパク質の送達を正確に制御することによって誘導系の動態を正確に制御することが望ましい。
【００８６】
別の例は、in vitro細胞モデルにおける、細胞の増殖、分化または死滅を調節する細胞タンパク質の送達である。典型的には、細胞、微小胞および本発明の方法を使用して、Ｂａｘ−２などのアポトーシス促進因子を送達することができ、そしてアポトーシスをモデュレーションする分子をスクリーニングすることができる。
【００８７】
本発明はまた、療法に使用するための本発明による微小胞に関する。
【００８８】
本発明はまた、移植片拒絶の予防に使用するための本発明による微小胞に関する。
【００８９】
特定の細胞表面タンパク質が、造血幹細胞（ＨＳＣ）の遊走能または移植に影響を及ぼすことが示された。例えば、ＣＸＣＲ４の一過性送達は、ＨＳＣを使用する細胞療法において、移植プロセスを促進するためのホーミング分子として有用であり得る。遺伝子導入を使用することは望ましくなく、これにより、ＣＸＣＲ４は全ての子孫細胞に導入されることになるだろう。対照的に、本発明の方法は、移植が起こる必要がある時だけ、一過性で制御されたタンパク質の導入を可能とする。
【００９０】
本発明はまた、転写因子の送達により細胞分化を誘導または強化するための方法に関する。特に、本発明の細胞および微小胞は、巨核球分化、骨髄系細胞分化、リンパ球細胞分化、ＮＫ分化、アストロサイト分化、オリゴデンドロサイト前駆細胞の成熟、筋肉細胞分化、ケラチノサイト分化、網膜分化、赤血球細胞分化、脂肪細胞分化のために使用され得る。
【００９１】
別の可能な適用は、ウイルス（コ）レセプターをターゲット細胞に送達することによるウイルス感染の増強である。例えば、本発明の細胞および微小胞を使用して、ＨＣＶレセプターおよびコレセプター、ＨＢＶレセプター、出血熱ウイルスレセプター、ＨＩＶ−１レセプターおよびコレセプター、並びにＭＬＶ−Ｅレセプターを送達することができる。
【００９２】
特に、本発明は、レセプターの送達、例えば細胞を同種指向性ウイルス粒子に一過性に許容性とさせるレセプターの送達に関する。
【００９３】
例えば、本発明の微小胞、細胞および方法を使用して同種指向性レセプターＥｃｏＲ（例えばｍ−ＣＡＴ１）をターゲット細胞に送達して、前記ターゲット細胞を同種指向性ウイルスに対して許容性とさせることができる。その後、任意の対象の遺伝子を、適切な同種指向性ウイルス構築物を介してターゲット細胞（同種指向性レセプターを発現する）に送達することができる。
【００９４】
本明細書において使用する「同種指向性」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味を有する。同種指向性ウイルスは、それが起源とする種の宿主においてのみ複製することのできるレトロウイルスである。より具体的には、本明細書において使用する「同種指向性ウイルス」という用語は、その同族レセプターである同種指向性レセプターＥｃｏＲを発現している細胞においてのみ複製することのできるげっ歯類ウイルスを指す。
【００９５】
有利には、前記の同種指向性ウイルスは実験者にとって安全である。なぜなら、それは同種指向性ウイルスレセプターを発現している微小胞によってターゲティングされたもの以外のヒト細胞には感染できないからである。
【００９６】
典型的には、前記の同種指向性ウイルスはモロニーに基づいたレトロウイルスであり、そして前記同種指向性レセプターはｍ−ＣＡＴ１である。ｍ−ＣＡＴ１をコードする遺伝子の一例は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＣＢＩリファレンス配列ＮＭ＿００７５１３．３に示されている。
【００９７】
従って、本発明は、
− ウイルス膜融合タンパク質、例えばＶＳＶ−ＧとＥｃｏＲ同種指向性ウイルスレセプターとを含む微小胞によって、ターゲット細胞に前記ＥｃｏＲ同種指向性ウイルスレセプターを送達する工程、
− 対象のタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む同種指向性ウイルスによって、前記ターゲット細胞に前記の対象のタンパク質を送達する工程
を含む、細胞に対象のタンパク質を送達するための方法に関する。
【００９８】
さらに、本発明の細胞および微小胞は、トランス活性化されたウイルスタンパク質（ＨＣＶタンパク質、ＨＢＶタンパク質、ＨＩＶ−１／２またはＳＩＶタンパク質、出血熱ウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＥＢＶタンパク質、ＳＶ４０タンパク質）をウイルス産生細胞に送達することによって、ウイルス感染またはウイルス／ベクターの産生を増強するためのものであり得る。
【００９９】
別の可能な適用は、細胞外シグナルに対して細胞を一過性に許容性とするレセプターの送達である。
【０１００】
例えば、本発明の微小胞、細胞および方法を使用して、ターゲット細胞としてのＴ細胞に抗ウイルスＴＣＲを導入して、そして前記Ｔ細胞をその抗腫瘍特性のために使用することができる（Cohen et al., Cancer Research, 2007, 67, 3898-3903; Johnson et al. J Immunol. 2006, 177, 6548-6559およびZhao et al., J Immunol, 2005, 174, 4415-4423）。
【０１０１】
従って、本発明はまた、癌の処置において使用するための本発明による微小胞に関する。
【０１０２】
ワクチン接種の分野において、樹状細胞（ＤＣ）は免疫応答を刺激するために抗原提示細胞として使用されることが多い。
【０１０３】
しかしながら、樹状細胞は細胞株としては存在せず、そして初代培養から得なければならない。
【０１０４】
本発明は、ワクチン接種の目的に使用することのできる代替のＤＣを提供する。実際に、本発明の方法を使用して、ＭＨＣまたは共刺激因子および／または抗原を含む微小胞を産生する改変されたプロデューサー細胞株を提供することができる。前記微小胞をワクチン接種の目的のために使用することができる。
【０１０５】
また、本発明の細胞、微小胞および方法を使用して、特異的な抗原を抗原提示細胞に送達して、免疫応答を促進することができる。
【０１０６】
以下において、本発明は、以下の実施例および図面によって説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１Ａ】ＶＳＶ−Ｇを有する微小胞へのＹＦＰの取り込み。（Ａ）ｐＶＳＶ−Ｇ（レーン１）、ｐＶＳＶ−Ｇ Ｖ７２（レーン２）、ＳｗＦｌａｇＥｃｏＲ（レーン３）、ＳｗＦｌａｇＥｃｏＲおよびｐＶＳＶ−Ｇ（レーン４）によってトランスフェクションおよび偽トランスフェクション（レーン５）された２９３Ｔ−ＹＦＰによって産生された濃縮微小胞のウェスタンブロット分析。免疫染色を、ＶＳＶ−Ｇ（Ｐ５Ｄ４）、ＥｃｏＲのタグ化バージョンを示すＳｉｇｍａ ｆｌａｇ（Ｍ２）およびＹＦＰ（ＧＳＮ２４）に対して作られたモノクローナル抗体を用いて実施した。
【図１Ｂ】ＶＳＶ−Ｇを有する微小胞へのＹＦＰの取り込み。（Ｂ）ＹＦＰのみを発現する細胞からの微小胞に曝された細胞と比較した、ＶＳＶ−ＧおよびＹＦＰを発現する細胞からの微小胞に曝された細胞のＦＡＣＳ分析。
【図１Ｃ】ＶＳＶ−Ｇを有する微小胞へのＹＦＰの取り込み。（Ｃ）ＨＥＫ細胞を、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質（ｗｔ）または融合に欠陥のある突然変異体Ｗ７２Ｖをコードするプラスミドのいずれかによってトランスフェクションした（２つのＤＮＡクローンを試験した）。その外部ドメインの欠失した切断短縮形のＶＳＶ−Ｇも実験に含められた。トランスフェクションから４８時間後、上清を収集し、そして細胞をウェスタンブロット分析のために溶解した。プロデューサー細胞においては全てのタンパク質が高度に発現された。しかしながら、ｗｔ ＶＳＶ−Ｇのみが上清中に検出され、融合に欠陥のある突然変異体は検出されなかった。
【図１Ｄ】ＶＳＶ−Ｇを有する微小胞へのＹＦＰの取り込み。（Ｄ）ＨＥＫ細胞を上記のようにトランスフェクションし、そしてトランスフェクションから２０時間後に、膜に結合する蛍光親油性化合物Ｒ１８を０．２μg/ml含む培地中で６時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後、異なる細胞型からの培地を回収し、清澄化し、そして蛍光光度計によって分析して、上清中に放出された膜の量を反映するＲ１８に関連した蛍光の量を定量した。結果を、生細胞の数によって規準化したＲ１８値として示す。
【図２Ａ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析。（Ａ）２９３Ｔプロデューサー細胞上でのＣＤ８１発現。マウスＩｇＧアイソタイプ対照を使用した（影の付いた領域）。
【図２Ｂ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析。（Ｂ）処理から１時間後の濃縮微小胞に曝されたＨｅｐＧ２細胞上におけるＣＤ８１発現。非処理ＨｅｐＧ２も同様に標識した（灰色で影の付いた対照）。
【図２Ｃ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析。（Ｃ）種々の用量の微小胞を用いて処理されたＨｅｐＧ２細胞におけるＨＣＶｐｐの形質導入の増強。ＨＣＶｐｐをコードするＹＦＯを２９３細胞において産生し、そして１mlあたり８×１０４の形質導入単位（ＴＵ）のＨＵＨ７．２細胞上で前滴定した。図は、曝された微小胞の量と共に増加するＨｅｐＧ２の力価を示す。
【図２Ｄ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析。（Ｄ）ＣＤ８１を有する微小胞の密度分析。微小胞を、膜脂質を標識するフルオロフォアであるオクタデシルローダミンＢクロライド（Ｒ１８）と共に培養した２９３Ｔ細胞中で産生した。濃縮された微小胞を連続的なイオジキサノール勾配にかけ、そしてＳＷ４１ローターで４１０００rpmで１２時間遠心分離にかけた。その後、２０個の０．５ml画分を回収し、そして各画分の１／２０を半天然条件下でウェスタンブロットによって分析した。１３〜２０の画分についてのＶＳＶ−ＧおよびＣＤ８１の免疫標識が示され、そして他の画分には存在しなかった（示していない）。
【図３Ａ】ゲシクル（Gesicle）の特徴付け。（Ａ）回収した画分におけるイオジキサノール密度勾配時の膜に関連した蛍光。濃縮したＶＳＶ−Ｇゲシクルを連続的なイオジキサノール勾配にかけ、そして３時間遠心分離にかけた。２０個の５００μlの画分をチューブの底から回収し、示されるように画分１は１．４６の密度に対応し、そして画分２０は１．０７の密度に対応した。各画分の１／５（１００μl）を評量し、そして９６ウェルプレートに移し、その後、蛍光光度計で分析した。図は、５６０nmでＲ１８を励起した時の５９０nmにおける発光値を示す。
【図３Ｂ】ゲシクル（Gesicle）の特徴付け。（Ｂ）ＹＦＰおよびＣＤ８１を有するゲシクルの特徴付け。上のパネル：密度勾配時の回収した画分におけるＹＦＰに関連した蛍光の分析。ＹＦＰ陽性細胞において産生された濃縮ＶＳＶ−Ｇゲシクルを連続的なイオジキサノール勾配にかけ、そして３時間遠心分離にかけた。２０個の５００μlの画分をチューブの底から回収し、示されるように画分１は１．３の密度に対応し、そして画分２０は１．０９の密度に対応した。各画分の１／５（１００μl）を評量し、そして９６ウェルプレートに移し、その後、蛍光光度計で分析した。図は、４９５nmでＹＦＰを励起した時の５３３nmにおける発光値を示す。下のパネル：ヒト細胞におけるＹＦＰ偽形質導入の分析。各画分の１／１０を、１２ウェルプレート中で培養した１×１０５個のＨＥＫ細胞にのせた。２４時間後、細胞をＦＡＣＳによって分析した。図は、異なる画分に曝された各細胞個体群の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図４Ａ】ＥｃｏＲを有するゲシクルによるヒト細胞へのＥｃｏＲの送達。（Ａ）ｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドの図解（ｐＣＭＶは初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターを意味し、ＵＳｉＴはユニバーサルなｓｉＲＮＡによってターゲティングされる３つの反復配列のコンカテマーを意味し、ＰＡはＳＩＶポリアデニル化シグナルを意味する）。下に示したｍＲＮＡは、ＵＳｉＴ配列を備え、この配列はユニバーサルなｓｉＲＮＡによって媒介される分解に高度に感受性とさせる。
【図４Ｂ】ＥｃｏＲを有するゲシクルによるヒト細胞へのＥｃｏＲの送達。（Ｂ）ｍＣＡＴ−１ゲシクルで処理された２９３Ｔ細胞上でのＭＬＶ同種指向性エンベロープを用いて偽型化されたＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターの力価。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２μg（レーン１）および４μg（レーン２）の濃縮ゲシクルを用いて３７℃で１時間かけて処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＭＬＶ同種指向性エンベロープ（レーン１、２および３）またはＶＳＶ−Ｇエンベロープ（レーン４）を用いて偽型化された１００μlのＧＦＰレンチベクターの調製物を用いて形質導入した。形質導入から３日後、細胞をＦＡＣＳによって分析し、そしてベクター調製物の力価を計算し、そして３つの異なる形質導入アッセイの平均として示す。
【図５】ｍＣＡＴ−１を有するゲシクルの生化学的および機能的分析。ゲシクルを、ＶＳＶ−Ｇおよびタグ化バージョンのｍＣＡＴ−１（マウス白血病ウイルス同種指向性株のレセプター）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションにより調製した。細胞培地を２４時間後に交換し、そして翌々日に回収した。上清を清澄化し、その後、ＳＷ４１ローターで３５０００rpmで１時間３０分間超遠心分離にかけた。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、そして凍結させ、その後、密度精製プロセスを行なった。連続的なイオジキサノール勾配を通してのレートゾーン遠心分離：未精製の濃縮した小胞を、連続的なOptiprep勾配にのせ（２１５mMスクロース、２mM ＥＤＴＡ、１０mMトリスＨＣｌｐＨ８中の６％イオジキサノール／５mMスクロース、２mM ＥＤＴＡ、１０mMトリスＨＣＬｐＨ８中の５６．４％イオジキサノール）、そしてＳＷ４１ローターで４１０００rpmで１２時間遠心分離にかけた。画分（０．５ml）を勾配の底から回収し、そして４℃で維持し、その後、ウェスタンブロット分析および機能的アッセイを行なった。１００μlの各画分を注意深く評量することによって画分の密度を測定した。画分１２〜２０のタンパク質を、ＭＯＰＳ緩衝液中で流した４〜１２％ビス−トリスＮｕＰａｇｅゲル（Invitrogen）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分離した。５μlの各画分を分析した。ニトロセルロース膜上へとエレクトロブロットした後、タンパク質を、１／１０００で希釈したＶＳＶ−Ｇ（Ｐ５Ｄ４ Sigma）に対して作られるペルオキシダーゼのコンジュゲートした抗体または１／１０００のペルオキシダーゼのコンジュゲートした抗Ｆｌａｇ（Sigma）（両方共に室温で１時間インキュベーションした）によって明らかとした。画分の生物学的活性を評価するために、３０μlの各試料を、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０５個の細胞で播種した２９３Ｔ細胞に加えた。１時間後、培地を、同種指向性エンベロープを用いて偽型化されたＧＦＰをコードするレンチベクターを含む２００μlの上清の補充された２００μlの新たな培地と交換した。形質導入から４８時間後、細胞をトリプシン処理し、蛍光値（ＭＦＩ）をＦＡＣＳによって分析した。
【図６】ゲシクルで処理したヒト細胞に導入されたｍＣＡＴ−１の消失。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃で１時間、飽和未満の用量のＥｃｏＲ−ゲシクルに曝した。２回洗浄した後、細胞を、ゲシクルへの曝露から５分後、１２時間後、２４時間後または４５時間後に、同種指向性エンベロープを用いて偽型化されたＧＦＰレンチベクターを用いて形質導入した。同じ形質導入アッセイを、ＥｃｏＲを安定に発現している２９３Ｔ細胞に対して実施して、ターゲット細胞の分裂に因る進行的なレンチベクター力価の減少を測定した。結果を、５分後の時点で得られた形質導入値（１００％）と比較した形質導入効率の比率として示す。全ての数値を、細胞分裂率に関して修正した。
【図７Ａ】ＥｃｏＲｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響を及ぼさない。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能的検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、さらにフラッグのついたｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞においてトランスフェクションした。ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞を次に、ｍＣＡＴのその発現、および同種指向性（ＥｃｏＬＶ）（黒い棒）および汎親和性対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色の棒）を用いての形質導入に対するその許容性について調べた。（Ａ）ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞におけるｍＣＡＴ−１免疫染色。
【図７Ｂ】ＥｃｏＲｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響を及ぼさない。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能的検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、さらにフラッグのついたｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞においてトランスフェクションした。ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞を次に、ｍＣＡＴのその発現、および同種指向性（ＥｃｏＬＶ）（黒い棒）および汎親和性対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色の棒）を用いての形質導入に対するその許容性について調べた。（Ｂ）ｍＣＡＴ−１によってトランスフェクションされたターゲット細胞におけるＧＦＰレンチベクターを用いての形質導入アッセイ。形質導入値を、形質導入から７２時間後にＦＡＣＳによって分析し、そしてｓｉ−ＣＴＬ細胞について１００％の効率と設定した。ＥｃｏＬＶ形質導入の７０％が、ｓｉ−ｍＣＡＴで処理された細胞において阻害されたが、ｇＬＶにより媒介される形質導入はほぼ影響を受けない（８％の阻害）。ターゲット細胞におけるｍＣＡＴ ｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって導入されたＥｃｏＲ機能に殆ど影響を及ぼさない。
【図７Ｃ】ＥｃｏＲｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響を及ぼさない。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能的検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、さらにフラッグのついたｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞においてトランスフェクションした。ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞を次に、ｍＣＡＴのその発現、および同種指向性（ＥｃｏＬＶ）（黒い棒）および汎親和性対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色の棒）を用いての形質導入に対するその許容性について調べた。（Ｃ）ｍＣＡＴゲシクルで処理されたヒト細胞におけるＧＦＰ同種指向性レンチベクターを用いての形質導入アッセイ。ｍＣＡＴ小胞によって処理されそしてｓｉ−ｍＣＡＴを有する細胞は、ＥｃｏＬＶ形質導入に対して依然として高度に許容性である（対照の８７％）。このことは、ＥｃｏＲ機能が、主に、微小胞に含まれるｍＣＡＴタンパク質によってもたらされ、コンタミしたｍＲＮＡでもプラスミドＤＮＡによってもたらされたものでもないことを示す。
【図８】ＥｃｏＲ−ゲシクルによって改変された細胞における、同種指向性レンチウイルス形質導入に対するクロロキンの効果。同種指向性エンベロープ（Ｅｃｏ）を用いて偽型化されたＹＦＰをコードするレンチウイルスベクターが、トランスデューサーＨＥＫ２９３Ｔ細胞に使用され、ｍＣＡＴ−１タンパク質が、エンドソームｐＨを上昇させる薬物であるクロロキン（ＣＱ）の存在下または非存在下においてＥｃｏＲゲシクル（ＥｃｏＲ−Ｇｅｓ）によって送達された（レーン３）。対照として、同種指向性偽型がトランスデューサー２９３Ｔ細胞に使用され、ＥｃｏＲは安定に発現される（安定なＥｃｏＲ、レーン２）。エンドソーム酸性化に対するＣＱの効果を確認するために、ＶＳＶ−Ｇレンチベクターが、薬物で処理したまたは処理していないターゲット細胞を形質導入するのに使用され、ＶＳＶ−Ｇ偽型の高いｐＨ依存性を示し（レーン１）、一方、同種指向性偽型は薬物処理時に依然として効果的である。結果は、形質導入から７２時間後にＦＡＣＳによって測定した異なる細胞型における相対的なＹＦＰ形質導入効率として示される。
【図９】ゲシクルによるｔＴａの送達。ＴＥＴトランス活性化タンパク質（ｔＴＡ ｏｆｆ）の転写機能を検出するために、本発明者らは、ＴＥＴオペレーターの制御下でｅＧＦＰを安定に発現するレポーター細胞株を作った。ｔＴＡのトランスフェクションは、偽トランスフェクションされた細胞と比較して、レポーター細胞株（ｔＴＡレーン）においてｅＧＦＰの発現を活性化した。ｔＴＡおよびＶＳＶ−Ｇ（ｗｔ）またはその融合能力のない突然変異体Ｖ７２を過剰発現する細胞において産生されたゲシクルを濃縮し、そして種々の用量でレポーター細胞株にのせた。ｗｔＶＳＶ−Ｇを有するｔＴＡゲシクルの用量の増加によりＧＦＰ発現が増強された。このシグナルは、培地へのドキシサイクリンの導入によって消失され得る。結果をゲシクルから２４時間後にＦＡＣＳによって分析したＭＦＩとして示す。
【図１０】時間の関数としてのゲシクルにより媒介されるｔＴＡ導入効率。ＨＥＫレポーター細胞株Ｔｅｏ−ＧＦＰを１２ウェルプレート（１ウェルあたり１×１０５個の細胞）に播種し、そしてｔＴＡゲシクル（５０μgの全タンパク質）で処理した。曝露時間は５分間から４時間の範囲であった。曝露した後、小胞を含む培地を廃棄し、そして細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２４時間後のＧＦＰ分析のために培養液中に維持した。ｔＴＡ導入効率は３時間までの曝露時間で次第に上昇し、３時間目が最適な曝露時間である。
【図１１】ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、２９３Ｔ細胞からの小胞の放出および対象のタンパク質の放出を増強する。膜タンパク質の放出：ＶＳＶ−Ｇを用いてまたは用いずに産生された小胞に取り込まれた複数回膜貫通タンパク質であるｍＣＡＴ−１のウェスタンブロット分析。小胞ペレットにおけるｍＣＡＴ−１の免疫標識は、ＶＳＶ−Ｇがプロデューサー細胞に導入された場合にｍＣＡＴ−１の放出が劇的に増加することを示す。細胞質タンパク質の放出：類似の生化学分析を異なるバッチの小胞調製物に対して実施して、細胞質タンパク質のアクチンの放出を調査した。本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇが偽小胞と比較してアクチンの放出を感覚的に増強することを注記する。
【図１２】３μmの孔径のインサートを通した共培養実験における、ゲシクルにより媒介されるタンパク質の導入。本発明者らは、同じ培地中で、レポーターＴｅｏ−ＧＦＰレポーター細胞株とプラスミドの種々の組合せでトランスフェクションされたＨＥＫ細胞を培養した。細胞を示したように３μmの孔径のフィルターによって、プロデューサー細胞は６ウェル皿の下に、レポーター細胞株は上のインサートに分離した。プロデューサー細胞を、ｔＴＡ発現プラスミドを用いて、さらに担体ＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドまたは融合欠陥ＶＳＶ−Ｇを用いて同時トランスフェクションした。共培養から４８時間後、インサートを除去し、そしてレポーター細胞株をトリプシン処理し、そしてＦＡＣＳによって分析して、ｔＴＡ送達を評価した。結果は、Ｔｅｏ−ＧＦＰ細胞株のＭＦＩとして示される。
【図１３Ａ】昆虫細胞由来の微小胞の特徴付け。ＧＦＰ微小胞は、Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスで７２時間かけて感染させることによって産生された。濃縮後、それらをイオジキサノール勾配にかけ、そして２１５０００ｇで１０時間遠心分離にかけて、その密度に従って小胞を沈降させた。画分をチューブの底から回収し、そしてその密度を評量によって測定した。密度勾配はグラフＡで評価され得、ｄ＝１．３からｄ＝１．０５の範囲である。全ての画分を蛍光光度計によって分析して、ＧＦＰ（励起４８５、発光５１５）を検出し、実質的に画分２１（Ａ、白い棒）で検出された。また、画分の希釈液を使用して、Ｓｆ９細胞を感染させ、バキュロウイルスがどこに沈降したかを同定した。感染から３日後、ｓｆ９細胞をＦＡＣＳによって分析し、そしてバキュロウイルスを滴定した。Ａ（黒い棒）で示された結果は、ウイルスが沈降したことを示した。
【図１３Ｂ】昆虫細胞由来の微小胞の特徴付け。ＧＦＰ微小胞は、Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスで７２時間かけて感染させることによって産生された。濃縮後、それらをイオジキサノール勾配にかけ、そして２１５０００ｇで１０時間遠心分離にかけて、その密度に従って小胞を沈降させた。画分をチューブの底から回収し、そしてその密度を評量によって測定した。密度勾配はグラフＡで評価され得、ｄ＝１．３からｄ＝１．０５の範囲である。全ての画分を蛍光光度計によって分析して、ＧＦＰ（励起４８５、発光５１５）を検出し、実質的に画分２１（Ａ、白い棒）で検出された。また、画分の希釈液を使用して、Ｓｆ９細胞を感染させ、バキュロウイルスがどこに沈降したかを同定した。感染から３日後、ｓｆ９細胞をＦＡＣＳによって分析し、そしてバキュロウイルスを滴定した。Ａ（黒い棒）で示された結果は、ウイルスが沈降したことを示した。（Ｂ）各画分のＧＦＰ導入能を分析した。それは画分１４〜１９に含まれ、ウイルスを含む画分を部分的に重複していた。
【図１４】ｔＴａ昆虫微小胞の中和アッセイ（ＮＡ）。ｔＴＡ微小胞は、ｔＴＡ−バキュロウイルスで感染させたＨｉｇｈ５細胞において産生された。小胞を濃縮し、そしてＰＢＳに再懸濁し、そして１００μlのＰＢＳ中で実施したアッセイのために１０倍希釈した。０．５等量のリン脂質ｔＴＡを、抗ｇｐ６４抗体（クローンＡｃＶ１）または対照抗体（ＧＳＴ）の連続希釈液と共に３７℃で２時間インキュベーションした。小胞を次にＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞（一旦ｔＴＡが細胞に導入されるとＧＦＰを発現する）にのせた。２４時間後、小胞に曝露された細胞をＦＡＣＳ分析し、そしてＧＦＰ発現を定量した。結果を全個体群のＭＦＩとして示す。
【図１５】ｔＴＡ微小胞を使用した用量応答。ｔＴＡ昆虫小胞を以前に記載のように濃縮および精製し、そして−８０℃で保存した。漸増用量の小胞を使用して、ＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞株にｔＴＡを送達し、その結果、小胞の添加から２４時間後にはターゲット細胞において検出されるＧＦＰシグナルが増加した。ドキシサイクリン処理細胞はバックグラウンド蛍光を示し、予期されるＴＥＴ系の誘導性を反映する。
【図１６Ａ】ヒト細胞へのｔＴＡの導入は、昆虫細胞由来の微小胞によってなされるが、コードされるバキュロウイルスによってはなされない。（Ａ）バキュロウイルス構築物。
【図１６Ｂ】ヒト細胞へのｔＴＡの導入は、昆虫細胞由来の微小胞によってなされるが、コードされるバキュロウイルスによってはなされない。（Ｂ）ｔＴＡレポーター細胞株におけるプロモーター駆動ｔＴＡのＧＦＰ発現。
【図１６Ｃ】ヒト細胞へのｔＴＡの導入は、昆虫細胞由来の微小胞によってなされるが、コードされるバキュロウイルスによってはなされない。（Ｃ）ゲシクルへのＧＰ６４およびｔＴＡの放出。
【図１６Ｄ】ヒト細胞へのｔＴＡの導入は、昆虫細胞由来の微小胞によってなされるが、コードされるバキュロウイルスによってはなされない。（Ｄ）ｐＨまたはＣＭＶ精製微小胞を用いての処理時におけるｔＴＡレポーター細胞株におけるＧＦＰ発現。
【０１０８】
実施例
実施例１
要約
本実施例は、水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）でコーティングされ、そしてヒトターゲット細胞に外来性タンパク質を送達するのに使用されるエキソーム様小胞の工学操作を記載する。これらの粒子は１．１g/mlの密度で沈降し、そして細胞質タンパク質および膜タンパク質並びに転写因子を効率的にパッケージングし得る。膜ｍＣＡＴ−１タンパク質およびｔｅｔトランス活性化因子を含むモデル分子が、微小胞による処理時にヒトターゲット細胞に効率的に送達された。小胞により媒介される偽形質導入により、一過性のタンパク質発現がなされたが、それはｍＲＮＡまたはＤＮＡの導入に起因するものではなかった。本発明者らは、エンドソームｐＨを上昇させる薬物であるクロロキンが、タンパク質導入を無効にしたことを示し、このことはＶＳＶ−Ｇにより誘導される融合が送達機序に関与していたことを示す。
【０１０９】
ＶＳＶ−Ｇ膜融合性エンベロープが偽形質導入の重要な決定要因である。
本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇの発現が、偽形質導入し得る粒子の産生をもたらし得るかどうかを試験した。ＹＦＰを安定に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−Ｙ）を、真核細胞発現ベクターであるｐＶＳＶ−Ｇによってトランスフェクションした。上清を２日後に収集し、濾過し、そして超遠心分離によって濃縮した。対照として、同じプロセスを、偽トランスフェクションした２９３Ｔ−Ｙ細胞の上清にも適用した。２つの濃縮した調製物をナイーブ２９３Ｔ細胞に加え、これを１時間曝露した後に洗浄した。２４時間後、細胞をトリプシン処理して、ＦＡＣＳによって分析して、２つの個体群の蛍光を測定した。本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇ調製物に曝されていた細胞においてはＹＦＰの偽形質導入を観察することができたが、対照調製物に曝露された細胞においては観察できなかった（図１−Ｂ)。２つの試料の生化学分析は、大量のＹＦＰがＶＳＶ−Ｇ調製物中に沈降したが（図１−Ａ レーン１）、偽トランスフェクションされた調製物においてはＹＦＰを殆ど検出できなかった（レーン５）ことを明らかにした。これらのデータは、ＶＳＶ−Ｇがプロデューサー細胞の細胞質の成分を含む沈降可能な粒子の強力な放出に関与することを示す。さらに、これらの粒子は、ターゲット細胞にこの材料を送達することができるようであった。細胞を粒子での処理時に洗浄し、そして２４時間成長させ、その後、トリプシン処理および分析したので、本発明者らは、ＹＦＰシグナルが細胞内のものであり、そして細胞の表面に吸着された蛍光粒子に起因するものではないと想定した。これらのＶＳＶ−Ｇ微小胞は、実施例１の全体を通してゲシクルと呼ばれる。
【０１１０】
さらなる観察：融合を引き起こすことのできないＶＳＶＧ単一アミノ酸突然変異体（ＶＳＶＧ７２）１４をこのシステムで試験し、そして沈降したペレットには取り込まれなかった（図１ レーン２）。別のウェスタンブロット実験は、この突然変異体がプロデューサー細胞に発現されたが、上清には検出できなかったことを示し、これは細胞および上清中の両方に検出できたｗｔ−ＶＳＶ−Ｇとは対照的であった（図１Ｃ）。このことは、ＶＳＶ−Ｇ微小胞の産生が、プロデューサー細胞において融合に適した形態のＶＳＶ−Ｇを必要とすることを実証する。
【０１１１】
ＣＤ８１テトラスパニンタンパク質の偽形質導入
濃縮調製物によるＹＦＰなどの細胞質タンパク質の細胞から細胞への導入は、２９３Ｔ−Ｙ細胞が、脂質層に囲まれ、そしておそらく、膜タンパク質のような２９３Ｔ細胞の他のタンパク質にもコーティングされた、ＹＦＰを有する小胞を産生したという考えを支持する。この仮説を試験するために、本発明者らは、２９３Ｔ細胞をＶＳＶ−Ｇを用いてトランスフェクションすることによって新しいバッチのゲシクルを調製し、そしてこの濃縮調製物を使用して、エキソームに特徴的でそして２９３Ｔ細胞上に豊富に発現されているテトラスパニンタンパク質であるＣＤ８１タンパク質の導入を調査した（図２Ａ）。得られた材料を、ＣＤ８１を欠失したヒト肝細胞株であるＨｅｐＧ２細胞に適用した。本発明者らは、ゲシクルに１時間曝されたＨｅｐＧ２細胞は、ＣＤ８１免疫標識時に陽性として染色されたことを示したが、このことは、前記タンパク質がプロデューサー細胞からターゲット細胞へと移動したことを示す（図２．Ｂ）。
【０１１２】
ＨｅｐＧ２への外来性ＣＤ８１の導入は、ＨＣＶエンベロープ（ＨＣＶｐｐ）で偽型化されたレトロウイルスベクターによるこの細胞株の形質導入を可能とすることが知られている（Zhang. et al. Journal of virology 78, 1448-1455 (2004)）。実際に、ＣＤ８１は、Ｅ２糖タンパク質によって認識されるＨＣＶレセプターの１つとして記載されている。従って、ＣＤ８１の導入をさらに検証するために、本発明者らはＨｅｐＧ２を種々の用量のゲシクルに曝し、そしてナイーブＨｅｐＧ２細胞と比較したＨＣＶｐｐにより媒介される形質導入に対するその許容性を確認した。本発明者らは、ＨＣＶｐｐ形質導入へのＨｅｐＧ２の許容性が、細胞に導入されたゲシクルの量と共に増加し（図２．Ｃ）、この実験においてＨＣＶｐｐの力価は５倍まで増加することを示した。このことは、導入されたＣＤ８１タンパク質が、ゲシクルを介して輸送および導入された後でさえもそのＨＣＶ結合能を保持することを示す。
【０１１３】
ＹＦＰおよびＣＤ８１を有するゲシクルの特徴付け
タンパク質導入に関与する材料をより良好に特徴付けるために、膜を標識する親油性フルオロフォアであるオクタデシルローダミンＢクロライド（Ｒ１８）と共に培養したヒト細胞におけるＶＳＶ−Ｇのトランスフェクションによりゲシクルが産生された。最初の濃縮工程後、Ｒ１８ゲシクルを連続的なイオジキサノール勾配にかけ、そして３時間遠心分離にかけて、その密度に従って画分を分離した。１から２０までの全ての回収した画分を、５６０nmでの励起後に５９０nmで蛍光を発光するその能力について、Ｒ１８に対する発光値および励起値について分析した。図３Ａに示したように、Ｒ１８蛍光は、１３〜２０までの画分に検出され、ピークは画分１７にあり、これは１．１１g/mlの密度に対応する。
【０１１４】
別の実験において、２９３Ｔ−Ｙで産生されたゲシクルを同じように処理し、そして勾配にのせ、その後、異なる回収した画分におけるＹＦＰに関連した蛍光の分析を行なった。図３Ｂは、ＹＦＰが、１．１０〜１．１１の密度に対応する画分１７および１８に主に検出されたことを示す。本発明者らは次に、どの画分が、偽形質導入によってＹＦＰを送達することができるかを調べた。各試料の１／１０を２９３Ｔ細胞に適用し、そして蛍光の導入を２４時間後にＦＡＣＳによって分析した。図３に示したように、偽形質導入の決定要因は、実質的に画分１７に沈降していた（ｄ＝１．１１）。別の実験において、ゲシクルを分離し、そしてウェスタンブロットによって分析した。密度−画分の分析は、ＶＳＶ−ＧおよびＣＤ８１が、明らかに画分１７および１９に濃縮され、そしてこれは１．１０および１．１１g/mlの密度に対応することを明らかとした（図２Ｄ）。ＣＤ８１分子はエキソームに対するマーカーとして記載されているので（Lamparski et al. Journal of immunological methods 270, 211-226 (2002)）、本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇを有するゲシクルは、エキソーム様小胞の特定の型であると結論づけることができる。
【０１１５】
合わせて考えると、本発明者らの所見は、ＶＳＶ−Ｇトランスフェクション時に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１．１０〜１．１１g/mlの密度で沈降できる膜に囲まれたゲシクルを産生し、そしてこれらのエキソーム様微小胞は、ターゲット細胞に送達可能なプロデューサー細胞からのＣＤ８１などのタンパク質を含むことを示す。
【０１１６】
ヒト細胞におけるゲシクルにより媒介されるｍＣＡＴ−１の導入
ＹＦＰまたは高度に発現されるＣＤ８１が、２９３Ｔ−Ｙ／２９３Ｔ細胞によって産生されるゲシクルにパッケージングされるのと同じように、本発明者らは、プロデューサー細胞に過剰発現される任意のタンパク質が、新生ゲシクルに受動的に取り込まれ得るかどうか、そして少量のこのパッケージングされた材料がヒトターゲット細胞に送達され得るかを試験した。この概念を、モデルとしてｍＣＡＴ−１タンパク質（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）同種指向性エンベロープＥｃｏＲ１のレセプターとしても知られるマウスカチオン性アミノ酸輸送体）を使用して試験した。フラッグの付いたバージョンのｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドを構築し（図４で示されるＳｗＦｌａｇ ＥｃｏＲ）、そして２９３Ｔ−Ｙ細胞においてＶＳＶ−Ｇを用いて同時トランスフェクションし、その後ヒト細胞に導入されるＥｃｏＲを有する濃縮されたゲシクルを産生した。１時間後、曝露した細胞を洗浄し、そして抗Ｆｌａｇ−ＦＩＴＣ抗体を使用したＦＡＣＳによって判明したところ、ＥｃｏＲ発現について陽性と染色された（示していない）。ｍＣＡＴ−１導入をさらに検証するために、本発明者らは、ＭＬＶ−同種指向性エンベロープを用いて偽型化されたＹＦＰをコードするレンチベクターに基づいた形質導入アッセイを開発した。この糖タンパク質の特定の指向性に因り、これらのレンチベクターは排他的にマウス／ラット細胞またはヒト細胞を形質導入し得、ｍＣＡＴ−１はトランスフェクション時に発現される。ＥｃｏＲ−ゲシクルがヒト細胞に効率的にＥｃｏＲを送達するならば、これらは同種指向性ＹＦＰレンチ形質導入に許容性となるはずである。
【０１１７】
図４で示される結果は、ＥｃｏＲゲシクルで処理したまたは処理していないヒト細胞の滴定時における同種指向性レンチベクター調製物の力価を示す。ナイーブ細胞は、同種指向性レンチベクターを用いての形質導入に対して制限されるが（レーン３）、２μg（レーン１）または４μg（レーン２）の濃縮されたゲシクルで処理された細胞は、同種指向性形質導入に高度に許容性となる。形質導入培地中での同種指向性レンチベクターへのゲシクル−Ｇタンパク質の取り込みを回避するために、ゲシクルで処理した細胞を、形質導入前に２回洗浄した。
【０１１８】
ＥｃｏＲ−ゲシクル調製物を以前に記載のように密度勾配にかけて、ｍＣＡＴ−１の導入に関与する画分を同定した。回収した画分をウェスタンブロットによって、ＥｃｏＲ導入を媒介するその能力について分析した（図５）。本実験において、本発明者らは、１．１０の密度に対応する画分１７において、ＶＳＶ−ＧおよびｍＣＡＴ−１が高度に濃縮されており、そしてこの画分が、形質導入アッセイによって明らかになったところＥｃｏＲ導入に関与する主な画分であることを示す。これらのデータは、１．１０の密度で沈降するＥｃｏＲ−ゲシクルが、ターゲット細胞の膜中にｍＣＡＴ−１タンパク質を導入し、そこで同種指向性エンベロープに対するその結合特性を保持していることを示す。
【０１１９】
さらに本発明者らは、ゲシクル含量、および特にゲシクルの膜によって生まれるタンパク質の性質が、プロデューサー細胞のトランスフェクションによって容易に制御され得ることをここで示す。
【０１２０】
ゲシクルによるＥｃｏＲ送達の機序
導入されたｍＣＡＴ−１の寿命
本発明者らは次に、ゲシクル曝露から形質導入アッセイまでの間の遅延を変化させることによって、ヒト細胞に導入されたｍＣＡＴ−１の寿命を調べる。図６に示される結果は、Ｅｃｏレセプター機能が、そのゲシクルにより媒介された導入から約５０時間後に２９３Ｔ細胞表面から消失したことを示す。この実験は、２４時間に近い導入されたｍＣＡＴ−１の寿命を改変することなく、Ｈｅｌａ、ＨＵＨ．７（示していない）を含む種々のヒト細胞型において再現された。この一過性は、ゲシクルが、ゲシクルの調製を汚染させ得るプラスミドＤＮＡではなく、タンパク質を送達するという概念を安心させる。実際に、プラスミドＤＮＡによるｍＣＡＴ−１のコーディングは、ターゲット細胞における転写工程および翻訳工程を必要とし、トランスフェクション実験で一般的に観察されるように導入から４８時間後に発現のピークに至るだろう。
【０１２１】
ＥｃｏＲ機能は、ゲシクルに取り込まれた既製のタンパク質によって提供される
ｍＣＡＴ−１小胞を用いて導入される材料の性質を調べるために、本発明者らは、ヒトターゲット細胞を、ｍＣＡＴ−１ ｍＲＮＡに対して作られるｓｉＲＮＡで処理した。小胞が、それをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡを送達するならば、それはｓｉ−ｍＣＡＴ処理細胞において容易に分解されるだろう。
【０１２２】
ｍＣＡＴ−１免疫染色によって明らかであるように（図７Ａ）、ｍＣＡＴ−１ ｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ細胞における同時トランスフェクション実験時にｍＣＡＴ発現を抑制した。さらに、ｍＣＡＴ−１プラスミドでトランスフェクションされた細胞へのこの特異的ｓｉＲＮＡの導入は、同種指向性レンチベクターを用いて形質導入される細胞の能力を強く減少させた（図７Ｂ）。ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチベクター（ｇＬＶ）はｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞の両方を効率的に形質導入したが、同種指向性レンチベクター（ＥｃｏＬＶ）を用いて達成された形質導入効率は、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞において阻害された（７０％の阻害）。これらのデータは、ｓｉ−ｍＣＡＴが、ｍＣＡＴ−１レセプター機能に対して、これがプラスミドによってコードされる場合に特に影響を及ぼすことを示す。
【０１２３】
本発明者らは次に、ｍＣＡＴ−ｓｉＲＮＡが、ｍＣＡＴ−１微小胞によって送達されるレセプター機能に影響を及ぼしたかどうかを調べた。細胞をｍＣＡＴおよび対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションし、そして４８時間後にｍＣＡＴ−１小胞で処理した。形質導入アッセイを次にＥｃｏＬＶを用いて実施して、レセプター機能を確認した（図７Ｃ）。ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞の両方がＥｃｏＬＶを用いて効率的に形質導入され、このことは、ｓｉ−ｍＣＡＴが、小胞によって送達されるレセプター機能を抑制することに大きく失敗したことを示す。このことは、微小胞が本質的にレセプター機能を、ｍＲＮＡでもコンタミしているプラスミドＤＮＡでもなく既製のタンパク質を導入することによって送達したことを示す。
【０１２４】
ゲシクルにより媒介されるＥｃｏＲの送達はｐＨ依存性である
導入されたＥｃｏＲタンパク質はウイルスレセプターとして機能的であるので、このことは、ターゲット細胞の表面におけるその存在を意味する。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇエンベロープの性質に因り、ゲシクルと細胞膜との間の融合は、内部の酸性コンパートメントで起こり、表面ではなく細胞内でＥｃｏＲタンパク質を遊離し、そこで機能的であると考えられる。
【０１２５】
ＥｃｏＲ導入の機序に洞察を得るために、本発明者らは、ゲシクルによる処理前に、エンドソームｐＨを上昇させ、ＶＳＶ−Ｇによって引き起こされる膜融合を破壊することが知られる薬物であるクロロキン（ＣＱ）で２３９Ｔターゲット細胞を処理した。図８に示されるように、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチベクターは、ＣＱ処理細胞を形質導入できなかったが（レーン１）、同種指向性レンチベクターは、ｍＣＡＴ−１を構成的に発現している薬物を付与した２９３Ｔに使用した場合には依然として効率的である（レーン２）。これらのデータはｐＨ依存性を示す。興味深いことに、本発明者らは、ＣＱが、ゲシクルによるＥｃｏＲ送達を強力に阻害することを示す（レーン３）。同種指向性レポーターレンチベクターを用いての形質導入はＣＱによって減少しないので、この結果は、表面でＥｃｏＲを送達する細胞機序におけるＣＱにより媒介される失敗を反映する。
【０１２６】
これらのデータを考慮して、本発明者らは、ゲシクルが、ターゲット細胞内に内部移行した後に、エンドソームコンパートメントに輸送され、ここでは膜の融合がＥｃｏＲの放出に必要とされるというモデルを提案する。タンパク質は、多くの内因性レセプターの運命に従って、その後、細胞膜へと向けてリサイクルされる。
【０１２７】
ゲシクルによって媒介されるＴＥＴトランス活性化因子の送達
細胞質タンパク質および膜タンパク質の送達の他に、本発明者らは、核内で古典的に発現されているタンパク質である転写因子をパッケージングおよび送達するゲシクルの能力を探索した。この目的のために、ゲシクルを、その同族プロモーター、Ｔｅｔオペレーター（ＴＥＯ）の転写を活性化する合成転写因子であるＴＥＴ ｏｆｆトランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードするプラスミドを用いて同時トランスフェクションされ、細胞培養培地へのテトラサイクリン／ドキシサイクリンの導入によってスイッチオフすることのできる２９３Ｔ細胞において産生した（Gossen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 5547-5551 (1992)）。漸増用量のｔＴＡをのせたゲシクルを次に、Ｔｅｔオペレーターの制御下にあるｅＧＦＰ遺伝子から構成される発現カセットを有するレポーター細胞にのせた。図９に示される結果は、レポーター細胞株の蛍光が、処理から２４時間後にｔＴＡゲシクルによって活性化されることを示す。蛍光シグナルはゲシクルの用量と共に増加し、そして最も高い用量では、ｔＴＡ構築物でトランスフェクションされたレポーター細胞で得られたシグナルの約５０％に達する。本発明者らは、処理細胞における転写活性化は、ドキシサイクリン処理に依然として感受性であることを注記する。このことは、ｔｅｔトランス活性化タンパク質が、ゲシクルに成功裏にパッケージングされ、そしてレポーター細胞株に導入されたことを示す。
【０１２８】
曝露時間の関数としてのゲシクルにより媒介されるｔＴＡの導入効率
ＨＥＫレポーター細胞株Ｔｅｏ−ＧＦＰを１２ウェルプレート（１０５個の細胞）に播種し、そしてｔＴＡゲシクルで処理した（１ウェルあたり５０μgの全タンパク質）。曝露時間は５分間から４時間までであった。曝露後、小胞を含む培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２４時間後のＧＦＰ分析のために培養液中に維持した。ｔＴＡ導入効率は３時間までの曝露時間まで次第に上昇し、３時間が最適の曝露時間である（図１０参照）。
【０１２９】
ゲシクルの産生および用量測定方法
ヒトＥｃｏＲゲシクルの産生および用量
ヒトゲシクルを、リン酸カルシウム法を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって産生した。細胞を１０cm皿に３×１０６個の細胞で播種し、そして１皿あたり１５μgのＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドおよび１５μgのｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドを用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクション培地をＡＴＰ（１００μM）を含む新しい培地と２４時間後に交換し、そして小胞を含む上清をトランスフェクションから４８時間後および７２時間後に回収し、プールし、０．４５μmフィルターを通して濾過し、そしてＳＷ４１ローターで２５０００rpm（１１００００ｇ）で１時間３０分超遠心分離にかけた。あるいは、４５００ｇで１０時間かけて濃縮してもよい。ペレット化材料を最終的に冷ＰＢＳ中に再懸濁し、２００倍の濃縮を得た。大量調製は、６つの１０cm皿を使用して実施され、そして約４００μlの２００個の小胞を生成した。
【０１３０】
以前にＹＦＰ発現レンチベクターによって形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において１５μgのＶＳＶ−Ｇプラスミドをトランスフェクションすることによって、ＹＦＰ／ＣＤ８１を有する小胞を産生した。
【０１３１】
沈降した微小胞におけるタンパク質の量を定量するために、本発明者らはフラッグのついたｍＣＡＴ−１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡアッセイを開発した。簡潔に言うと、小胞の連続希釈液をＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ２％に溶解し、そして９６ウェルプレート中のカーボネートでコーティングされた緩衝液中（ｐＨ９．６）中で一晩コーティングした。フラッグ−ペプチド（Sigma）の連続希釈液を、平行してトリトンを含まない緩衝液中でコーティングした。タンパク質およびペプチドを、１／１０００で希釈した抗フラッグＨＲＰ抗体（M2 Sigma）と共に洗浄したプレートを１時間インキュベーションすることで明らかとさせ、そしてＴＭＢ基質を用いて最終的に明らかとした。これらのアッセイによって本発明者らは、小胞調製物中におけるフラッグのついたタンパク質の量を測ることができた。
【０１３２】
あるいは、本発明者らは、ＨＲＰ（Ｐ５Ｄ４ Sigma）と結合させた抗ＶＳＶＧ抗体によって認識されるＶＳＶ−Ｇペプチドの連続希釈液をコーティングすることによってＶＳＶ−Ｇ Ｅｌｉｓａアッセイを工学操作した。従って、全てのＶＳＶ−Ｇ小胞が、小胞調製物１μlあたり等量のＶＳＶ−Ｇペプチドとして表現され得る。
【０１３３】
考察
本発明者らは今回、工学操作したエキソーム様小胞の使用によって、ヒト細胞に細胞質タンパク質および膜タンパク質を導入するオリジナルかつ簡単な方法を開発した。このゲシクルにより媒介されるタンパク質送達技術をさらに使用して、ヒト細胞に機能的転写因子を導入した。これらの微小胞の産生は、ＶＳＶ−Ｇを用いて同時トランスフェクションされた２９３Ｔプロデューサー細胞における対象のタンパク質の過剰発現によって達成された。ＶＳＶ−Ｇは、膜タンパク質並びに膜脂質およびアクチンの豊富な上清の分析によって明らかとなるように、２９３Ｔ細胞からの小胞の産生をブーストするようである（図１１）。さらに、微小胞の膜をコーティングすることによって、膜融合性Ｇタンパク質はターゲット細胞に接触するその能力を増強し、そして粒子と細胞膜との間の非常に効率的な融合を可能とし、これはターゲット細胞における微小胞内容物の放出に対する必要条件である。
【０１３４】
実施例２
３μmの孔径のインサートを通しての共培養実験における小胞により媒介されるタンパク質の導入
本発明者らは、同じ培地中で、Ｔｅｏ−ＧＦＰレポーター細胞株と共に種々のプラスミドの組合せによってトランスフェクションされたＨＥＫ細胞を培養した。細胞を示したように３μmの孔径のフィルターによって、プロデューサー細胞は６ウェル皿の下に、レポーター細胞株は上のインサートに分離した。プロデューサー細胞を、ｔＴＡ発現プラスミドを用いて、さらに担体ＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドまたは融合欠陥ＶＳＶ−Ｇを用いて同時トランスフェクションした。共培養から４８時間後、インサートを除去し、そしてレポーター細胞株をトリプシン処理し、そしてＦＡＣＳによって分析して、ｔＴＡ送達を評価した。結果は、Ｔｅｏ−ＧＦＰ細胞株のＭＦＩとして示される（図１２）。
【０１３５】
この技術は、濃縮工程の必要を伴わず、ターゲット細胞へのタンパク質の送達を可能とする。濃縮された小胞は、ターゲット細胞型に依存して毒性であり得る。ターゲット細胞を上または下のチャンバーで培養し、そして一定したタンパク質の送達のためにウイルス産生細胞を数日間かけて注ぐことができる。いくつかの因子を連続的に導入しなければならない場合には、別の小胞を含む浴へのインサートの容易な導入によって、連続的な注入さえも実施することができる。
【０１３６】
実施例３
昆虫細胞の微小胞の産生および用量
バキュロウイルス産生を、製造業者の指示に従って、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Invitrogen）を使用して実施した。簡潔に言うと、対象のｃＤＮＡを、ＤＨ１０−ＢＡＣ細菌において組換えする前に、ｐＦＡＳＴ−１シャトルにクローニングした。バキュロウイルスＤＮＡを次に使用してＳＦ−９細胞をトランスフェクションして、７２時間後に回収される最初のバキュロストックを生成した（継代１）。このポリクローナルストックをさらに増殖して１×１０７pfu/ml（継代２）の力価に到達させ、これを４℃で保存し、そして小胞の産生のために使用した。
【０１３７】
昆虫細胞の微小胞を、グルタミン（２０mM）およびペニシリン−ストレプトマイシン（２５Ｕのペニシリン、２５μgのストレプトマイシン/ml）の補充された１００mlのExpress-five ＳＦＭ培地中で撹拌下で３０℃で懸濁して培養した２００×１０６個のＨＩＧＨ５細胞のバキュロウイルス感染（ＭＯＩ ０．５〜１）により産生した。接種から４８時間後、培地を収集し、清澄化し、そして０．４５μmの孔径のフィルターを通して２回濾過し、その後、ＳＷ−３２ローターで２４０００rpm（１００，０００ｇ）で超遠心分離にかけた。沈降した材料を次に冷ＰＢＳ（１００倍の濃度）中で再懸濁し、そして−８０℃で保存した。
【０１３８】
より良好な精製のために、この濁った調製物を非連続的なイオジキサノール勾配にかけ、別々の密度画分の分離を可能とした。画分の生物学的な分析は、有するタンパク質を導入できる活性な小胞は、１．０９〜１．１１の密度で沈降したことを明らかとした。これらの画分をプールし、そして冷ＰＢＳで補充されたプールの最後の濃縮工程後（ＳＷ４１で３００００rpmで１時間）に高度に精製された小胞が調製された。
【０１３９】
昆虫細胞由来の小胞は、リン脂質酵素的ＰＡＰ５０検出キット（Biomerieux）および前記したＶＳＶ−Ｇ ＥＬＩＳＡを用いて定量された。
【０１４０】
昆虫細胞由来微小胞の特徴付け
ＧＦＰ微小胞は、記載のように、組換えバキュロウイルスを用いての７２時間かけてのｓｆ９細胞の感染により産生された。濃縮後、小胞をイオジキサノール勾配にかけ、そして２１５０００ｇで１０時間遠心分離にかけて、その密度に従って小胞を沈降させた。画分を次にチューブの底から回収し、そしてその密度を評量によって測定した。密度勾配は図１３Ａのグラフに認められ得、ｄ＝１．３〜１．０５の範囲である。全ての画分を蛍光光度計によって分析して、実質的に画分２１で検出されたＧＦＰ（励起４８５発光５１５）を検出した（図１３Ａ白い棒）。画分の希釈液も使用して、ｓｆ９細胞を感染させて、どこにＧＦＰバキュロウイルスが沈降したかを同定した。感染から３日後、ｓｆ９細胞をＦＡＣＳによって分析し、そしてバキュロウイルス力価を計算した。Ａ（黒い棒）で示した結果は、ウイルスが画分１３と画分２０の間で沈降し、ピークは画分１６であることを示した。本発明者らはまた、画分を使用してヒト細胞にＧＦＰを送達し、そして２４時間後に蛍光の導入について分析した（図１３Ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、ＧＦＰ導入能は、画分１４〜１９に含まれ、一部、ウイルスを含む画分に重複していることを見出した。
【０１４１】
ｔＴＡ昆虫微小胞の中和アッセイ（ＮＡ）
ｔＴＡ微小胞を、ｔＴＡバキュロウイルスで感染させたＨｉｇｈ５細胞において産生した。小胞を濃縮し、そしてＰＢＳに再懸濁し、そして１００μlのＰＢＳ中で実施されるアッセイのために１０倍に希釈した。０．５等量のリン脂質ｔＴＡを抗ｇｐ６４抗体（クローンＡｃＶ１）または対照抗体の連続希釈液と共に３７℃で２時間インキュベーションした。小胞を次にＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞（一旦ｔＴＡが細胞に導入されるとＧＦＰを発現）にのせた。２４時間後、小胞に曝した細胞をＦＡＣＳ分析し、そしてＧＦＰ発現を定量した。結果（図１４参照）は全個体群のＭＦＩとして示す。
【０１４２】
ｔＴＡ昆虫微小胞を使用した用量応答
ｔＴＡ昆虫微小胞を濃縮し、そして以前に記載されたように精製し、そして−８０℃で保存した。漸増用量の小胞を使用してＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞株へとｔＴＡを送達し、その結果、増加したＧＦＰシグナルが、小胞添加から２４時間後のターゲット細胞に検出された。ドキシサイクリン処理細胞はバックグラウンド蛍光を示し、予期されるＴＥＴ系の誘導性を反映する（図１５参照）。
【０１４３】
考察
本発明者らは、ヒト細胞由来小胞の産生が、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドおよび対象のタンパク質（ＹＦＰ、ｍＣＡＴ−１、ｔＴＡ・・・）をコードする別のプラスミドを用いてのプロデューサー細胞の同時トランスフェクションにより達成されたことを示した。産生系の能力を増加させるために、本発明者らは、ＶＳＶ−ＧおよびｔＴＡをコードする組換えバキュロウイルスを構築し、そしてバキュロウイルス感染に対して高度に許容性の昆虫細胞を感染させた。さらにＨｉｇｈ５細胞およびＳｆ９細胞は、血清を含まないまたはさらには動物の製品を欠いた合成の培地中でさえも、２×１０６個/mlまでの懸濁液中で容易に培養することができる。特に、バキュロウイルスはヒト細胞中において複製せず、そして導入遺伝子の発現を駆動するポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞に特異的であり、ヒト細胞においては活性ではない。
【０１４４】
本発明者らは、ｔＴＡおよびＶＳＶＧを用いての同時感染時に、昆虫細胞が、ヒト細胞にｔＴＡを導入することのできる微小胞を産生することを見出した。本発明者らはまた、ＶＳＶ−Ｇはこの過程において有用であるが不要であることを見出し、このことは別の融合タンパク質で置き換えることができることを示唆する。この役割は、全ての感染細胞において発現されるバキュロウイルスのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ６４によって想定され得る。中和アッセイを実施することによって、本発明者らは、昆虫微小胞によって媒介されるタンパク質の送達が、ｇｐ６４抗体によって中和され得ることを示した。
【０１４５】
昆虫細胞小胞をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ＧＦＰ昆虫小胞をイオジキサノール勾配にのせてその密度を測定した。このプロセスは、そのそれぞれの密度に従って、混合物中に存在する異なる材料の分離を可能とする。この実験は、小胞を含む画分が、バキュロウイルスを含む画分と重複していることを示した。バキュロウイルスはヒト細胞においては複製できないことが一般的に認められているが、本発明者らは、ｔＴＡをコードするバキュロウイルスの僅かな発現が、レポーターターゲット細胞におけるＧＦＰの発現を活性化するのに十分なｔＴＡを産生し得ると想像することができる。これを確認するために、本発明者らは、Ｂａｃ組換え体（図１６Ａに示した構築物）の構築に使用されたシャトルプラスミド（ｐＦＡＳＴ）においてＣＭＶまたはＥＦＩａプロモーターによって昆虫特異的ポリヘドリンプロモーター（ｐＨ）を置換した。ｐＨとは対照的に、こうしたプロモーターは、ＨＥＫ−Ｔｅｏ ＧＦＰレポーター細胞株におけるトランスフェクション実験によって判明したようにヒト細胞において高度に活性である（図１６Ｂ）。本発明者らは次に、その後増幅し、そしてｓｆ９細胞において感染するために使用した、２つの組換えバキュロウイルス（ＣＭＶ１およびＣＭＶ２）を生成するためのＣＭＶプロモーターを選択する。どちらのＣＭＶ組換え体も、ｐＨ組換え体と同じくらいの効率的にｓｆ９細胞を感染した。これはプロデューサー細胞溶解液に対して実施されたウェスタンブロット分析によって判明した（図１６Ｃ）。バキュロウイルスタンパク質ｇｐ６４は、使用したプロモーターの性質に関係なく、細胞溶解液中において明確に検出された。微小胞の調製時に、本発明者らは微小胞溶解液に対して同じ染色を実施し、そしてｇｐ６４が３つの試料中に高度に検出されることを確認し、ＣＭＶ置換は、ｓｆ９におけるバキュロウイルス感染にもウイルス放出にも有意に影響を与えなかったことを示した。予期されたように、本発明者らは、ｐＨ組換え体が、２つのＣＭＶ組換え体と比較してｓｆ９細胞においてより高いレベルのｔＴＡを発現したことを見出した。このことは、ｐＨ溶解液中にかなりより高い、微小胞に検出されるｔＴＡの量に論理的に影響を及ぼした。漸増用量のｐＨ−ｔＴＡおよびＣＭＶ−ｔＴＡ微小胞を、最終的にＨＥＫ−ＴｅｏＧＦＰ細胞株にのせた。ｔＴＡ送達の効力を反映するＭＦＩを２４時間後にＦＡＣＳによって分析し、ｐＨ組換え体を用いて産生された小胞が、ＣＭＶ組換え体を用いて産生されたものよりも１０倍以上効率的であることが判明した（図１６Ｄ）。このことは、効率的なｔＴＡ導入は、プロデューサー細胞における高いレベルのタンパク質発現と相関することを示す。これは、タンパク質それ自体がバキュロウイルスに関連した微小胞によって伝達されるという仮説を支持する。さらに、プロモーターの交換によってヒト細胞におけるｔＴＡバキュロウイルスの転写能を増加させても、ターゲットにおけるｔＴＡの到達性は増加せず、バキュロウイルスにより駆動される転写は、送達されたｔＴＡの機能に関与しない（または少ししか関与しない）ことを示す。合わせるとこれらのデータは、ヒト細胞におけるｔＴＡの導入は、昆虫細胞に由来するｇｐ６４微小胞によって達成され、コードされるバキュロウイルスによってではないことを示す。
【０１４６】
参考文献
本出願の全体を通じて、種々の参考文献が、本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質を含む微小胞を分泌することができるような、前記膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞。
【請求項２】
前記の真核細胞が全くウイルス構造タンパク質を発現しない、請求項１記載の真核細胞。
【請求項３】
前記のウイルス膜融合タンパク質がＶＳＶ−Ｇである、請求項１または請求項２記載の真核細胞。
【請求項４】
前記の対象のタンパク質が膜タンパク質および核タンパク質からなる群より選択される異種タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項記載の真核細胞。
【請求項５】
前記の対象のタンパク質が、前記のウイルス膜融合タンパク質に共有結合していない、請求項１〜４のいずれか１項記載の真核細胞。
【請求項６】
前記の微小胞が前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の真核細胞によって分泌される微小胞。
【請求項７】
前記の微小胞が全くウイルス構造タンパク質を含まない、請求項６記載の微小胞。
【請求項８】
ターゲット細胞を請求項６または７記載の微小胞と接触させる工程を含む、前記ターゲット細胞に対象のタンパク質をin vitroで送達するための方法。
【請求項９】
請求項６または７記載の微小胞が、微小胞を産生する細胞とターゲット細胞との共培養によってin situで産生される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ターゲット細胞を、対象のいくつかの異なるタンパク質を含む請求項６または７記載のいくつかの異なる微小胞と接触させることによって、前記の対象のいくつかの異なるタンパク質がターゲット細胞に送達される、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
前記の対象のタンパク質が膜レセプターである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が転写因子である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
真核細胞において対象のタンパク質の機能を一過性に発現させるための、請求項６または７記載の微小胞の使用。
【請求項１４】
療法に使用するための、請求項６または７記載の微小胞。
【請求項１５】
請求項６または７記載の微小胞によって同種指向性ウイルスレセプター（ＥｃｏＲ）をターゲット細胞に送達する工程を含む、ターゲット細胞を同種指向性ウイルス粒子に対して一過性に許容性とするための方法であって、前記微小胞はウイルス膜融合タンパク質および前記の同種指向性ウイルスレセプター（ＥｃｏＲ）を含む、方法。
【請求項１】
ウイルス膜融合タンパク質および対象のタンパク質を含む微小胞を分泌することができるような、前記膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を過剰発現する真核細胞。
【請求項２】
前記の真核細胞が全くウイルス構造タンパク質を発現しない、請求項１記載の真核細胞。
【請求項３】
前記のウイルス膜融合タンパク質がＶＳＶ−Ｇである、請求項１または請求項２記載の真核細胞。
【請求項４】
前記の対象のタンパク質が膜タンパク質および核タンパク質からなる群より選択される異種タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項記載の真核細胞。
【請求項５】
前記の対象のタンパク質が、前記のウイルス膜融合タンパク質に共有結合していない、請求項１〜４のいずれか１項記載の真核細胞。
【請求項６】
前記の微小胞が前記のウイルス膜融合タンパク質および前記の対象のタンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の真核細胞によって分泌される微小胞。
【請求項７】
前記の微小胞が全くウイルス構造タンパク質を含まない、請求項６記載の微小胞。
【請求項８】
ターゲット細胞を請求項６または７記載の微小胞と接触させる工程を含む、前記ターゲット細胞に対象のタンパク質をin vitroで送達するための方法。
【請求項９】
請求項６または７記載の微小胞が、微小胞を産生する細胞とターゲット細胞との共培養によってin situで産生される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ターゲット細胞を、対象のいくつかの異なるタンパク質を含む請求項６または７記載のいくつかの異なる微小胞と接触させることによって、前記の対象のいくつかの異なるタンパク質がターゲット細胞に送達される、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
前記の対象のタンパク質が膜レセプターである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が転写因子である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
真核細胞において対象のタンパク質の機能を一過性に発現させるための、請求項６または７記載の微小胞の使用。
【請求項１４】
療法に使用するための、請求項６または７記載の微小胞。
【請求項１５】
請求項６または７記載の微小胞によって同種指向性ウイルスレセプター（ＥｃｏＲ）をターゲット細胞に送達する工程を含む、ターゲット細胞を同種指向性ウイルス粒子に対して一過性に許容性とするための方法であって、前記微小胞はウイルス膜融合タンパク質および前記の同種指向性ウイルスレセプター（ＥｃｏＲ）を含む、方法。
【図４Ａ】
【図１６Ａ】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ａ】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【公表番号】特表２０１３−５１０５６２（Ｐ２０１３−５１０５６２Ａ）
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３８３２１（Ｐ２０１２−５３８３２１）
【出願日】平成２２年１１月１０日（２０１０．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６７２００
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５８０５２
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１０日（２０１０．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６７２００
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５８０５２
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
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