巨大分子用アフィニティ・リガンドの設計
【課題】供給流中の特定の製品標的の精製または特定の標的不純物の除去に適する、特異性が高くあつらえたようなリガンドを得るための方法を提供する。
【解決手段】設計されたアフィニティ・リガンドは予め選択した結合条件で標的と高い特異性で結合し、予め選択した溶出条件で標的を放出する。このリガンドは、結合ドメイン候補の構造の多様化を通して誘導した多様なポリペプチドに標的を接触させることによって分離され、所望の結合条件下での標的との結合と溶出条件下での標的の放出に好適なポリペプチドを含むこの変化体（即ち類似体）を含み、この結合条件と溶出条件とはｐＨ、温度、塩濃度または有機溶媒の体積百分率などの１個以上のパラメータによって異なる。
【解決手段】設計されたアフィニティ・リガンドは予め選択した結合条件で標的と高い特異性で結合し、予め選択した溶出条件で標的を放出する。このリガンドは、結合ドメイン候補の構造の多様化を通して誘導した多様なポリペプチドに標的を接触させることによって分離され、所望の結合条件下での標的との結合と溶出条件下での標的の放出に好適なポリペプチドを含むこの変化体（即ち類似体）を含み、この結合条件と溶出条件とはｐＨ、温度、塩濃度または有機溶媒の体積百分率などの１個以上のパラメータによって異なる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子精製の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は特定の標的生体分子用アフィニティ・リガンドの発見と分離に関する。かかるアフィニティ・リガンドは、所望の分離条件下で標的生体分子を精製するのに有用である。
発明の背景
【０００２】
タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、脂質、核酸など、医学上あるいは工学的に重要な生体分子の製造法は多岐にわたり、それには化学合成法、自然発生または組換え形質転換した細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞などにより培地中に放出させる方法、培養細胞（例えば封入小体等）への蓄積、遺伝子組換え生物体から（例えばトランスジェニック哺乳動物の乳汁中に）分泌させる方法、尿、血液、乳汁、植物浸出液、真菌抽出物などの生体材料から回収する方法等が含まれる。しかし、こうして製造した生体分子がそのまま有用であることは稀で、製造に用いた溶液中の他の成分（即ち不純物）から分離したり、その溶液に占める割合がずっと高くなるように生体分子を濃縮したりする必要がある。
【０００３】
クロマトグラフィは、生体分子標的の大量分離に使用する主流の精製・濃縮技術である。正しく組まれた一連のクロマトグラフィ段階によると、無機塩をはじめ、折りたたみ方が不正確であったり一部が分解した形の標的巨大分子それ自体に至るまで、広範囲の夾雑物が混入した複雑な混合物から生体分子の単一成分を分離することができる。同時に、クロマトグラフィによる精製が生体分子製品の製造原価に占める割合は大きい（単独トップであることも珍しくない）。代表的な生物療法の精製では、２ないし６段階以上のクロマトグラフィを要し、各段階でサイズ排除法、イオン交換法、疎水相互作用法、アフィニティ・クロマトグラフ法などが利用される。
【０００４】
サイズ排除法は緩衝液の交換に、あるいは凝集質を取り除くために、最終段階として使用することが多い。イオン交換法と疎水相互作用法は製品を濃縮し不純物の大半を取り除くのに有用であるが、これらのクロマトグラフィはいずれもアフィニティ・クロマトグラフィの使用により達成される劇的な純度上昇に迫ることができない。例えばNarayanan（1994年）は、アフィニティ・クロマトグラフィの一段精製によって純度が３０００倍上昇したことを報告している。
【０００５】
しかし、アフィニティ・クロマトグラフィの技術を生体分子の大量産生に使用することは一般的ではない。理想的なアフィニティ・クロマトグラフィ・リガンドの必須条件は、容認できるコストで（１）標的生体分子捕捉の親和性が高く、容量が大きく、特異性が高く、選択性が高いこと、（２）他の分子種（不純物）を捕捉しないか、あるいは分別溶出が可能であること、（３）標的の保存条件（即ち分解・変性しない条件）下で放出の制御が可能であること、（４）クロマトグラフィ・マトリクスの殺菌、再使用が可能であること、（５）あらゆる病原体を除去あるいは不活化できることなどである。しかしながら、コストが容認できる高親和性リガンドで医薬品製造に要求される洗浄・殺菌プロトコルに耐えるものを見つけ出すのは困難であることが判明した（Knight、1990年参照）。
【０００６】
理想からは遠いが、染料（シバクロンブルー等）や親和性既知のタンパク質（プロテインＡ等）がアフィニティ・クロマトグラフィに広範に用いられてきた。しかし、これらの材料は新規の標的に適用できないため柔軟性に欠け、使用範囲を広げることができない。
マウス単クローン抗体（ＭＡｂ）もアフィニティ・リガンドとして使用される。ＭＡｂは作成が容易であり、新規標的分子に特異的な新規ＭＡｂリガンドが得られるので、ＭＡｂ技術は特定の製造業者の個別的要求を満たすに足る、ある程度の柔軟性を有する。その一方で、単クローン抗体はアフィニティ・クロマトグラフィ分野での欠点が無いわけではない。ＭＡｂは製造費が高価であり、また、生体分子の精製に伴う洗浄、殺菌処理手順中に脱離、分解する傾向があることから、それに基づくアフィニティ・マトリクスの失活が速くなる（Narayanan 、1994年、Boschett、1994年参照）。しかも、ＭＡｂは標的に対して特異性を高くすることができるが、その特異性は標的と近縁の不純物を捕捉しないようにするには不十分であることが多い。さらに、ＭＡｂの結合特性は免疫した動物の免疫グロブリン・レパートリによって決定されるため、実行者はその動物の免疫系によって付与された結合特性に甘んずる他はなく、即ちＭＡｂ技術を使用するだけでは特定の結合や溶出特性を最適化、選択する余地がほとんどない。最後に、ＭＡｂの結合部位１つ当たりの分子量（２５ｋＤａ〜７５ｋＤａ）、さらにはＭＡｂフラグメントであっても分子量が極めて大きい。
【０００７】
このように、従来よりも高価でなく、もっと役に立ち、さらにぴったり合う特定生体分子標的用アフィニティ・リガンドを開発することが継続的に求められている。特に、上記の理想的なアフィニティ・リガンドの特性にさらに近く、所与の標的分子と高い親和性で結合するばかりか標的を所望の、あるいは選択した条件下で放出し、標的と標的が存在する溶液中の他成分とを識別することができ、洗浄、殺菌処理手順に耐えて再生、再使用可能なクロマトグラフィ・マトリクスを提供するアフィニティ・リガンドに対する需要がある。
かかるアフィニティ・リガンドと、それを得る方法とを本明細書中に提供する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、対象とする特定の生体分子標的用であって、所望の、あるいは選択した結合特性および放出特性を示すアフィニティ・リガンドを得る方法を提供する。そのもっとも広い態様では、本発明は、ほぼすべての標的分子についてそれを含む溶液から分離するのに有用なアフィニティ・リガンドであって、アフィニティ・クロマトグラフィに有利な結合特性だけでなく所望の放出（溶出）特性と、安定性、分解耐性、耐久性、再使用性、製造しやすさ等、他の所望の特性とを示すように設計したリガンドを得る方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は特異的不純物（または近縁グループの不純物）を極めて高い親和性で結合して標的を含む溶液からその（あるいはそれらの）不純物のほぼすべてを取り除くアフィニティ・リガンドを得る方法をも提供する。この場合、無傷で不純物を放出することは（標的の精製に関しては）重要ではないが、もしリガンドを含むアフィニティ・マトリクスを再生、再使用できれば経済的に有利である。
また、本発明は第一特定溶液セットの条件下で特定の標的と結合し、第二特定溶液セットの条件下でその標的を放出する能力のあるアフィニティ・リガンドを分離する方法をも提供する。
【００１０】
このように、本発明は標的分子を含む溶液から標的分子を変性させないで分離するのに適したアフィニティ・リガンドを分離する方法であって、
（ａ）標的分子に関して、アフィニティ・リガンドが前記標的分子と結合することが望まれる第一溶液条件（即ち結合条件）を選択する段階と、
（ｂ）標的分子に関して、前記標的分子と前記アフィニティ・リガンドとのアフィニティ複合体が解離する第二溶液条件（即ち結合条件）を選択する段階であって、前記第二溶液が前記第一溶液と異なる段階と、
（ｃ）前記第一溶液条件および第二溶液条件下で安定な前記標的分子用ポリペプチド結合ドメイン候補を選択する段階と、
（ｄ）前記ポリペプチド結合ドメイン候補中のアミノ酸位置（好ましくはドメイン表面上の位置、もっとも好ましくはドメイン中で互いに近接した位置）を変更可能な位置として選択する段階と、
（ｅ）前記結合ドメイン候補を提供する段階であって、選択した１個以上の変更可能なアミノ酸の位置における異なるアミノ酸の置換において各類似体が前記結合ドメイン候補と異なる段階と、
（ｆ）前記類似体ライブラリを第一溶液条件で前記標的分子を含む溶液と類似体／標的結合複合体を形成するのに十分な時間接触させる段階と、
（ｇ）第一溶液条件下で結合しなかった類似体を除去する段階と、
（ｈ）接触段階（ｆ）の溶液条件を第二溶液条件に変更する段階と、
（ｉ）第二溶液条件下で放出される結合類似体候補を回収する段階であって、回収した類似体が分離アフィニティ・リガンドを同定する段階と
を含む方法に関する。
【００１１】
ある状況、例えば標的分子の性質が実行者によく分からないか未知であったり、標的の精製に係わる特徴（標的を産生した溶液の量、溶液中の残留不純物の性質、標的の生物学的活性、標的の産生源等）のため、標的分子が常に安定な溶液条件の範囲に関して不確かさが残る場合では、標的分子を含む溶液から標的分子を分離するのに適したアフィニティ・リガンドを得るための本発明による好ましい方法は
（ａ’）温度、ｐＨ、イオン強度、誘電率、溶質濃度（例えばカオトロピック試薬濃度、有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、アセトン、メチルエチルケトン等）濃度）、金属イオン（例えばＺｎ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋）やキレート剤（例えばＥＤＴＡ）の有無から選択した複数のパラメータに関して標的分子が安定する範囲を確かめることによって前記標的分子の安定性範囲（エンベロープ）を画定する段階と、
（ａ）標的分子に関して、標的分子の安定性エンベロープの範囲内に所望の結合条件を選択する段階と、
（ｂ）標的分子に関して、標的分子の安定性エンベロープの範囲内に所望の放出条件を選択する段階であって、前記放出条件が少なくとも１個のパラメータに関して前記結合条件と異なる段階と、
（ｃ）前記結合条件下および放出条件下の両方で安定な前記標的分子のポリペプチド結合ドメイン候補を選択する段階と、
（ｄ）前記結合ドメイン候補の表面のアミノ酸位置を変更可能な位置として選択する段階と、
（ｅ）前記結合ドメイン候補の類似体ライブラリ（例えばポリペプチド結合ドメイン類似体の多彩なセットがバクテリオファージ表面に表示されるファージ表示ライブラリ）を提供する段階であって、段階（ｄ）で示した１個以上のアミノ酸位置における異なるアミノ酸の置換において各類似体が前記結合ドメイン候補と異なる段階と、
（ｆ）前記類似体ライブラリを第一溶液条件で前記標的分子を含む溶液と類似体／標的結合複合体を形成するのに十分な時間接触させる段階と、
（ｇ）第一溶液条件下で結合しなかった類似体を除去する段階と、
（ｈ）接触段階（ｆ）の溶液条件を第二溶液条件に変更する段階と、
（ｉ）放出条件下で放出される結合類似体候補を回収する段階であって、ここでは回収した類似体が単離されたアフィニティ・リガンドを確認する段階、
とを含む。
【００１２】
回収した類似体から、特性の組合せが最高の、タンパク質結合ドメインを選択することができる。あるいは、追加のライブラリからの選択をさらに一巡して行うこと（上記の段階（ｅ）〜（ｉ））によって、回収リガンド中に所望の特性を有するリガンドが多くなるようにすることができる。標的、標的の製造、標的の溶液からの分離に係わる因子に関する実行者の知識によれば、結合ドメイン候補の選択、変更可能なアミノ酸の指定、変更可能な位置で置換するアミノ酸の選択を、最終アフィニティ・リガンドで望ましい特性に寄与するようにできるであろう。あるいは、もし多彩な結合ドメイン・ライブラリ候補を予め調製してあれば、選択段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す必要がなく、実行者は結合および放出条件を選択する段階からライブラリおよび標的を接触させる段階へ直接移行することができる。
【００１３】
多数のアフィニティ結合ドメインが可能となり、その内いくつかが結合条件下で標的と結合し放出条件下で標的を放出するようにポリペプチド類似体ライブラリを作出することに類似タンパク質をバクテリオファージなどの遺伝子パッケージ表面に表示する技術を利用することは特に好ましい。かかる技術は米国特許第５２２３４０９号（Ladnerら）に公表され、参照により本明細書の一部とする。これらの強力な技術を使用することにより、構造が類似した多数（例えば１０７ ）のポリペプチドを本発明の方法に使用するため容易に製造することができる。
【００１４】
本発明によって調製したアフィニティ・リガンドは、特定の標的生体分子分離の目的に特にぴったり合うように調整される。このように、特性の釣合いが最適であり、標的結合のアフィニティ、標的特異性、特定条件下での標的放出、殺菌条件下での耐久性、その他選択したあらゆる所望の特性の点から、特定の標的の分離にほとんど理想的なアフィニティ・リガンドが本発明によって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】組織プラスミノーゲン活性化因子即ち「ｔＰＡ」（１ｍｇ／ｍＬ ｔＰＡ ２５μＬ）を固定化ｔＰＡアフィニティ・リガンド（ＣＭＴＩ誘導体Ｎｏ．１０９、実施例１６に記載）を有するアフィニティ・クロマトグラフィ・カラムにかけ、ｐＨ７〜ｐＨ３のグラジエント溶出を行ったときのクロマトグラムを示す。１５分のピークは注入したｔＰＡの約９０％を含むと概算される。
【図２】凝集標準液（１０倍希釈）をｔＰＡアフィニティ・カラム（ＣＭＴＩ誘導体Ｎｏ．１０９）にかけ、上記の溶出を行ったときのクロマトグラムを示す。１５．６分の小ピークはグラジエントの人為結果であることが分かった。
【図３】２５μＬのｔＰＡを加えた２５μＬの凝集標準液（１０倍希釈）からなる混合物についてｐＨ７〜ｐＨ３のグラジエント溶出を行ったときのクロマトグラムを示す。１分のピークは血漿タンパク質の集まりであり、１５．４分のピークはｔＰＡである。
【図４】第３図に示したクロマトグラムの縦軸の目盛を拡大したクロマトグラムを示す。
【図５】ＣＭＴＩファージ分離物Ｃ３、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３およびＴＮ−６／Ｉファージ分離物Ｔ４９（実施例１８、下記参照）のｐＨ７での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ２での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ７での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ２での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。このＥＬＩＳＡによると、ヤギ抗体を含む供給流から人体に適応させた抗体を分離するのに有用なアフィニティ・リガンドの確認がなされる。
【図６】ＴＮ−６／Ｉファージ分離物Ｔ４１、Ｔ４２、Ｔ４８、Ｔ５２、Ｔ７４（実施例１８、下記参照）のｐＨ７での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ２での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ７での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ２での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。このＥＬＩＳＡによると、ヤギ抗体を含む供給流からヒト化抗体を分離するのに有用なアフィニティ・リガンドの同定がなされる。
【図７】ＴＮ−１０／Ｖファージ分離物Ｔ６１、Ｔ６４、Ｔ６６、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｔ７５（実施例１８、下記参照）のｐＨ７での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ２での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ７での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ２での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図８】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＴＮ−６／Ｉファージ分離物、即ちＴＵ３３、ＴＵ３４、ＴＵ３６、ＴＵ３７、ＴＵ３９、ＴＵ４２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ２での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ７での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ２での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。このＥＬＩＳＡにより、尿などの供給流からウロキナーゼを分離するのに有用なアフィニティ・リガンドの確認がなされる。
【図９】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＴＮ−１０／ＶＩＩＩａ ファージ分離物のいくつか、即ちＴＵ５１、ＴＵ５３、ＴＵ５６、ＴＵ５８、ＴＵ６０、ＴＵ６２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ２での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ７での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ２での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。このＥＬＩＳＡによると、尿などの供給流からウロキナーゼを分離するのに有用であるアフィニティ・リガンドの同定がなされる。
【図１０Ａ】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＣＭＴＩファージ分離物のいくつか、即ちＣＵ２２、ＣＵ２９、ＣＵ３２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ２での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ７での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ２での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１０Ｂ】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＣＭＴＩファージ分離物のいくつか、即ちＣＵ２５、ＣＵ２７、ＣＵ２８、ＣＵ３１、ＣＵ３２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ２での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ７での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ２での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。この試験の判定基準によれば、これらの分離物にアフィニティ・リガンドに適するものはなかった。
【図１１Ａ】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＬＡＣＩ／Ｆファージ分離物のいくつか、即ちＬＵ２、ＬＵ５、ＬＵ９、ＬＵ１２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合およびｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｂ】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＬＡＣＩ／Ｆファージ分離物のいくつか、即ちＬＵ２、ＬＵ４、ＬＵ１０、ＬＵ１２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合およびｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。この試験の判定基準によれば、これらの分離物にアフィニティ・リガンドに適するものはなかった。
【００１６】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明によると、アフィニティ・クロマトグラフィによる標的生体分子の効率よい精製が可能になる。本明細書において使用するとき、「標的」の語は、特定のタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、脂質、リポ多糖類、核酸、もしくはそれに対して特異的なリガンドが求められるこれらのクラスの組合せを示す。標的はタンパク質の活性フラグメントや複合体や１個以上のタンパク質の凝集塊であってよい。標的は天然の生体分子に限定されず、合成有機分子や、特に１個以上のキラル中心を含む分子であってよい。標的はそれよりも大きい構造体、例えばウイルスなどの生物体の表面分子として存在してよい。それどころか、標的は細胞やウイルス粒子であってもよい。
【００１７】
標的生体分子は、あらゆる公知の方法で生産され、それには化学合成法、天然に存在するまたは組換え形質転換した、細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞などにより培地中に放出させる方法、遺伝子組換え生物体（例えばトランスジェニック哺乳動物）から分泌させる方法、尿、血液、乳汁等の生物の体液や組織中のもの等が含まれる。初期に産生されたものとして粗製標的を含む溶液（即ち産生溶液）を「供給流」と呼ぶことがある。本発明が第一に照準を合わせたのは、標的が産生された溶液から標的分子を回収することであるが、本発明は産生供給流からの回収に限定されず、本発明により開発されるアフィニティ・リガンドは、標的をあらゆる溶液から回収することに使用できる。
【００１８】
標的生体分子を産生する各方法は、標的と（標的に関する）数種類の不純物を含む供給流中に標的を産する。本発明の１つの目的は、標的を迅速かつ極めて特異的に精製することが可能になるようなアフィニティ・リガンドおよび（クロマトグラフィ媒体などの）調製物を提供することである。本明細書において得られるアフィニティ・リガンドは、高い親和性で（好ましくは実質的に供給流中の他分子全てを排除して）標的と結合する。さらに、このアフィニティ・リガンドは、溶媒条件が変わると標的を無傷で活性型のまま放出する。放出条件が標的に悪影響を及ぼさないことは重要である。このアフィニティ・リガンドが供給流中に低濃度で存在するときでも標的と結合し、高濃度で標的を放出できることが好ましい。それなら、一段精製によって多くの不純物の除去と標的の濃縮が両方行われる。活性型で結合、放出すべき標的を「製品標的」と呼ぶことがある。
【００１９】
本発明の別の一態様は、特異的不純物（または近種グループの不純物）と極めて高い親和性で結合して、ほぼ全てのその（あるいはそれらの）不純物を分離することによって、それ（それら）から他の分子を取り除くことを可能にするアフィニティ・リガンドを提供することである。この場合、不純物を無傷で放出することは重要ではないが、リガンドを再利用できれば経済的に有利である。最高の親和性で捕捉すべきであるが、その放出は重要でない標的を「不純物標的」と呼ぶ。
【００２０】
標的の特性決定
精製の分野では、標的について既知の、あるいは見出された事実のほとんど全てを駆使して標的の分離を目的とする精製スキームを改良する。標的用に設計したアフィニティ・リガンドを得るために本発明の方法を実施する場合、標的が安定となる溶液条件、即ち生体分子が活性を保ち、変性しない条件を知ること、あるいはそれを決定することは必要不可欠である。本発明による方法の最初の段階は、標的精製工程中の一組の条件を選択する段階と、そのアフィニティ・リガンドへの結合が終了して、標的の放出と溶出が起きることが望まれる異なる一組の条件を選択する段階とを含む。これらの条件は、究極的に得られるリガンドが無傷の、活性のある標的に対する親和性を有するように、両方とも標的が安定である条件でなければならない。
【００２１】
標的の安定性に影響を及ぼす因子の理解に加えて、標的を分離すべき溶液中の標的濃度、標的の結合活性または酵素活性、標的の凝集状態（即ち標的が単量体か多量体か）標的のおよその大きさ（分子量）、標的を含む溶液や供給流の組成など、標的の他の特性を知ることも有用である。かかる因子は実行者が（ａ）１つ又はそれ以上のタンパク質リガンドが標的と結合することが期待される結合条件、（ｂ）少なくともタンパク質リガンドのいくつかは標的を変性や損傷を起こすことなく放出するであろう、可能な条件変更、（ｃ）そこから適切なリガンドを分離できる、可能結合タンパク質またはドメインのライブラリ（１つ又はそれ以上）の組成、を選択するのに有用である。
【００２２】
標的の安定条件
どんな生体分子でも、いくつかの溶液条件で安定であるが、溶液中の標的の安定性は溶液の条件に影響を受け、その条件は溶液の温度、ｐＨ、イオン強度、誘電率、および［Ｈ＋ ］、［Ｎａ＋ ］、［Ｃｌ− ］、［尿素］、［グアニジン＋ ］、［ＳＯ４− ］、［ＨＳＯ４− ］、［ＰＯ４− ］、［ＨＰＯ４− ］、［Ｈ２ＰＯ４− ］、［ＣｌＯ− ］、［ＮＨ４＋ ］、［ＯＨ− ］、［Ｈ２Ｏ２］、［Ｍｇ＋＋］、［Ｋ＋ ］、［Ｚｎ＋＋］、［Ｃａ＋＋］、［Ｌｉ＋ ］、［ＮＯ３−］、［洗浄剤、例えばトライトンＸ−１００］、［ラウリル硫酸イオン］、［グルコース］、［クエン酸イオン］、［安息香酸イオン］、［エタノール］、［メタノール］、［アセトン］、［酢酸イオン］、［クロロ酢酸イオン］、［ジクロロ酢酸イオン］、［トリクロロ酢酸イオン］、［ギ酸イオン］、［Ｎ−メチルホルムアミド］、［ホルムアミド］、［ジメチルホルムアミド］、［ジメチルスルホキシド］、［メチルエチルケトン］、［プロピオン酸イオン］、ＥＤＴＡ等、他の溶質の濃度を含む。これらのパラメータの各々と、特定の供給流について既知の、あるいは決定された他のいかなるパラメータに対して、標的はある範囲内、即ちある温度範囲内、あるｐＨ範囲内等で安定である。この安定範囲を外れると標的は変性する。ひとまとめにして、特定の標的の安定性に影響を及ぼす全パラメータの範囲はその供給流の「安定性エンベロープ」を決定し、溶液の条件を安定性エンベロープの範囲内に維持する限り、標的は安定であり続けることが期待される。同一の供給流中でも、異なる標的は異なる安定性エンベロープを有することが期待される。
【００２３】
所与の標的をアフィニティ分離するのに適したアフィニティ・リガンド獲得の最初の段階は、標的が安定であるような結合条件と所望の放出条件を選択する段階である。実行者が結合条件を選択するには標的分子の安定条件に関して知っている情報が不十分な場合、以前の決定を参照するか、経験に基づいて１個以上のパラメータに関して安定範囲を決定するか、そのいずれかによって安定条件を確かめることができる。
【００２４】
所望の結合条件を選択するために、標的の安定性を試験したり標的の安定性エンベロープの全てにわたって決定したりする必要はない。実行者は経験に基づいて単に安定条件を推測し、適切に一組の結合条件を選択してよい。例えば、およそ安定性を有するタンパク質であれば、ほとんどがｐＨ７、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌで安定である（即ち、通常ｐＨ７、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌは所与のタンパク質の安定性のエンベロープの範囲内である）。結合条件にｐＨ７、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌを選択し、放出条件は１個以上のパラメータを変化させることによって（例えばｐＨ４、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌを）これに関連して選択してよい。これらの条件のいずれかが標的の安定性エンベロープの範囲外である場合、この方法では標的を溶液から分離できるいかなるアフィニティ・リガンドはなにも確認できず、安定性エンベロープをもっと正確に決定するか、エンベロープの境界について別の推測をしてからいずれかにこの方法を繰り返すことになる。より広い例として、温度範囲０℃〜３５℃、ｐＨ８〜９からｐＨ４〜５までの範囲、［ＮａＣｌ］範囲としては０Ｍ〜１Ｍで極めて多くのタンパク質が安定である。従って、結合条件ｐＨ８、０℃、１０ｍＭ ＮａＣｌと放出条件ｐＨ６、３０℃、０．５Ｍ ＮａＣｌはほとんどのタンパク質標的に選択することができる。この推定安定性エンベロープに基づく結合及び放出条件の他の組合せは（１）結合：ｐＨ６、２５℃、０．５Ｍ ＮａＣｌ、溶出：ｐＨ８、０℃、１０ｍＭ ＮａＣｌ、（２）結合：ｐＨ７、０℃、１０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出：ｐＨ７、３５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４Ｍ尿素、（３）結合：ｐＨ８、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出：ｐＨ６、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むであろう。
【００２５】
結合条件および放出条件を適当に選択するために、供給流中の特定の標的に関する情報をさらに確かめなければならない場合、１個以上のパラメータの範囲にわたる安定性を容易に決定することができる。ある標的について有用な安定性エンベロープを確立する実例試験を以下に説明する。有用な安定性データをもたらすかかる試験は多くの修正が可能であり、かかる修正は当業者には自ずと示唆されるであろう。安定性の境界を高精度で決定することは重要ではなく、標的が安定で（結合用と放出用の）２つのはっきりと異なる条件を決めることができる、条件の範囲を画定する必要があるだけである。特定の標的の安定条件が極めて狭い場合、アフィニティ精製を行うのに必要な時間にわたって標的が変性してはならないことを常に心に留めておくべきである。境界安定条件下でさえ、標的の回収後には、さらに加工する前に産物を安定性の高い溶液に戻す。
【００２６】
標的の安定性エンベロープを確立するための実例試験
温度安定性
まず、標的分子が変性するか活性をほぼ失う温度ＴｍをｐＨ７、塩濃度１５０ｍＭの溶液中で測定する。このＴｍは、例えば走査熱量計を使用して決定することができる。Ｔｍはかなり急な変移を示すが、やや低い温度（安定性温度範囲の上限）で長くインキュベートすると失活する可能性があることを理解すべきである。従って、安定性エンベロープの境界温度はＴｍによって画定される限界よりも数℃低く設定することが好ましい。あるいは、一定時間（例えば１５分間から２４時間まで）２５℃、３７℃、４５℃、５５℃、６５℃などの一組の温度でインキュベートした後に標的試料の活性を測定することによって温度安定性を決定することができる。標的がある温度で失活せず、次の温度でかなり失活した場合、１点以上の中間温度で活性を測定することによって、温度範囲の境界を所望の確度で決定することができる。次に、１５０ｍＭ食塩水の氷結点までの低温で標的がバラバラになる（離解）するか沈殿するかを判定することができる。
【００２７】
ｐＨ安定性
標的が活性を保持するｐＨ範囲を数点の温度（例えば４℃、２５℃、３７℃、５０℃、）で決定する。これは走査熱量計中で種々のｐＨ値に対するＴｍを測定することによってできる。ここで、Ｔｍは与えられたｐＨにおける安定性の上限を画定するものであって、安定性のエンベロープは各ｐＨについて数℃低く設定すべきであることに注意する。例えば、境界が決定されるまでｐＨ７、６、８、５、９、４、１０等々ｐＨを変えてＴｍを測定することができる。あるいは、標的試料を特定の温度（２５℃、３７℃、５０℃）とｐＨ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２で（２０分間などの）適当な時間インキュベートし、ｐＨを活性の決定に適した値に調整した後に活性を測定することができる。この範囲の温度依存性が強い場合、ｐＨ範囲は追加の温度（例えば１５℃、３０℃、４３℃、６０℃）で標的が活性を保持する範囲について決定する。
【００２８】
標的が可溶かつ安定なイオン強度範囲
これは２点または３点の温度で測定するのが有利である。例えば、有用な温度は４℃（または標的が沈殿、離解しない最低温度）、２５℃、Ｔｍ より５℃下（または標的がそれほど失活を示さない最高温度）であろう。Ｔｍ は走査熱量計中で１ｍＭ、５ｍｍＭ、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍ、３ＭなどのＮａＣｌ濃度に対して測定する。ｐＨを特定の値、例えばｐＨ７とかｐＨ８に保つためにそれぞれの場合に適した緩衝液を加えるべきである。
【００２９】
ほとんどのタンパク質はいくらか塩を含んだ水に可溶である。塩濃度があまり高かったり低かったりすると、タンパク質は沈殿や結晶化をきたすことが多い。タンパク質の沈殿に使用される塩類はＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、酢酸アンモニウム、ＫＣｌ、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４）等を含む。標的の溶解度が急激に下がる点（高塩濃度および低塩濃度）をＮａＣｌ、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの２、３の塩類について決定することが好ましい。
【００３０】
カオトロピック試薬に関する標的の安定性および溶解性
尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、グアニジンチオシアネート等はタンパク質と他の分子との相互作用を分断することが知られている。また、これらの試薬は折りたたまれたタンパク質を開かせることもできる。標的の安定性は、尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、イソチオシアン酸ナトリウム、Ｎ−メチル尿素等のうちの１個以上の濃度上昇に関して測定することが好ましい。典型的な場合では、あるタンパク質の熱変性に対する安定性は尿素その他のカオトロピック試薬による変性に対する安定性と平行している。
【００３１】
標的の安定性に特定のイオンが必要かどうか
タンパク質には（Ｍｇ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃａ＋＋などの）金属イオンと結合するものがある。例えばＥＤＴＡなどのキレート剤に曝すことによって、この金属イオンを取り除くと、場合によってはタンパク質が変性することがある。標的が金属イオンを含むかどうかは元素分析によって決定される。標的が金属イオンを含む場合、ＥＤＴＡへの曝露か蒸留水に対する透析のどちらによって標的が失活するかを判定する。
【００３２】
有機溶媒および有機溶質中の標的の安定性と溶解性
標的の安定性と溶解性を有機溶媒、水と有機溶媒の混合物、有機溶質を添加した水中について決定することが好ましい。例えば、標的の安定性と溶解性を、アセトニトリル（ＡＣＮ）および水／ＡＣＮ混合物、メタノール（ＭｅＯＨ）および水／ＭｅＯＨ混合物、エタノール（ＥｔＯＨ）および水／ＥｔＯＨ混合物、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）および水／ＩＰＡ混合物、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および水／ＤＭＦ混合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水／ＤＭＳＯ混合物、第二級ブチルアルコール（ＳＢＡ）および水／ＳＢＡ混合物、アセトンおよび水／アセトン混合物等のうち、一種類以上の中で測定する。加えて、標的の安定性と溶解性について、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド等の有機溶質を種々の量添加した水中で試験を行う。
【００３３】
ファージ提示および有機溶媒
標的と結合する選択的リガンドを得るための好ましい一方法は、Ｍ１３などのファージ上に提示されたタンパク質のライブラリから選択することである。従って、ファージ提示ライブラリを使用した場合、有機溶媒がファージを傷めるかどうかを判定することに関心が持たれる。ＡＣＮ、ＭｅＯＨ、ＤＭＳＯは、Ｍ１３ファージに悪影響をもたらさないので特に好ましい。特に、次の条件によるとＭ１３はほぼ間違いなく生存する。
【表１】
８０％ＥｔＯＨ、ＩＰＡまたはＤＭＦと共に２０分間インキュベートすると生存するファージはなかった。これらの溶媒をファージと共に使用するときは低濃度にする。
標的の知識から、役立ちそうな他の取り扱い可能な溶液条件も示唆される。例えば、糖結合タンパク質の安定性はタンパク質が結合する糖の濃度の影響を受ける。
【００３４】
アフィニティ・リガンドの分離
結合条件と放出条件の選択
提案されている、あるいは経験的に決定した標的分子用安定性エンベロープを使用して、二種類の溶液条件、即ち結合条件と放出条件を選択する。結合条件はその条件下で発見されたアフィニティ・リガンドが標的と結合することが望まれる一組の溶液条件であり、放出条件はその条件下では発見されたアフィニティ・リガンドが標的と結合しないことが望まれる一組の溶液条件である。この二種類の条件は条件達成の容易さ、他の精製工程との互換性、他のアフィニティ媒体と比較して条件変更コストの低さ等、実行者のあらゆる基準を満たすように選択される。この二種類の条件は（ａ）十分に安定性エンベロープの境界内であることと、（ｂ）少なくとも１つの溶液パラメータに関して遠く隔たっていることが好ましい。例えば標的が広いｐＨ範囲で安定な場合、好適な結合条件がｐＨ１１、塩濃度１５０ｍＭ、２５℃で好適な放出条件がｐＨ３、塩濃度１５０ｍＭ、２５℃などである。ｐＨ安定性の範囲が狭いが（例えばｐＨ６．２〜７．８）広範囲の塩濃度にわたって安定な別の標的に対しては、二種類の有用な条件は、結合条件がｐＨ７．２、３Ｍ ＮａＣｌ、２５℃で放出条件がｐＨ７．２、２ｍＭ ＮａＣｌ、２５℃などである。３番目の標的はｐＨ範囲が狭いがアセトニトリルに対する安定性の範囲が広いものである。この３番目の仮定上の標的に対して有用な条件は、結合条件としてｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、２５℃、および放出条件としてｐＨ７．０、５ｎＭ ＮａＣｌ、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、などである。
【００３５】
結合ドメイン候補の選択
標的の所望の結合と放出のための特定の溶液条件の選択に関連して、所望の結合能と放出能を示すよう設計したアフィニティ・リガンド用の構造テンプレートとして結合ドメイン候補を選択しなければならない。この結合ドメインは天然のタンパク質または合成タンパク質、あるいはあるタンパク質の領域またはドメインである。結合ドメイン候補は既知の結合ドメイン候補と標的間の相互作用の知識に基づいて選択するが、これは決定的ではない。実際、結合ドメイン候補がどれほど標的への親和性を有するかということは重要ではない。それの目的は、それから多数（ライブラリ）の類似体を作り出せる構造を提供することである。この多数の類似体は所望の結合特性と放出特性（および選択した他のあらゆる特性）を現す類似体を１個以上含む。従って、以下に論ずる結合条件と放出条件は、結合ドメイン候補として働く正確なポリペプチドの知識または結合ドメイン候補が属するタンパク質かドメインのクラスの知識によって、選択することもできるし、あるいは結合ドメイン候補の選択とまったく無関係に選択することもできる。同様に、結合条件および放出条件あるいはそのいずれか一方は、結合ドメイン−標的間の既知の相互作用を考慮して、例えば１つまたは両方の溶液条件下での相互作用に有利となるように選択するか、あるいはかような既知の相互作用とは関係なく選択する。同じく、結合条件および放出条件あるいはそのいずれか一方を考慮に入れて、あるいは入れないで結合ドメイン候補を選択することができる。もっとも、結合条件または放出条件下で結合ドメイン類似体が不安定ならば、有用なアフィニティ・リガンドが得られないことは認めなければならない。
【００３６】
結合ドメイン候補を選択する目的は、構造が類似した類似体ドメインのライブラリを作るためのテンプレートまたは親構造物を提供することである。この類似体ライブラリは、ライブラリを作成するための基本ドメインの多様化がアフィニティ・リガンドに望まれる特性にとって有利になるように行われるという点で（無作為に作成したライブラリに対して）偏りのあるライブラリであることが好ましい。
【００３７】
結合ドメイン候補の性質は、標的分子に対して試験することになる得られたタンパク質（類似体）の特性に大きく影響を及ぼす。結合ドメイン候補の選択でもっとも重要な考察は類似体ドメインが標的にどのようにして提供されるか、即ち標的と類似体がいかなる立体配座で接触するようになるかということである。例えば、好ましい実施形態では、例えば米国特許第５４０３４８４号（Ladnerら）や米国特許第５２２３４０９号（Ladnerら）など（参照により本明細書の一部とする）に記載された技術を使用して、類似体は類似体をコードする合成ＤＮＡを複製可能な遺伝子パッケージに挿入することによってつくられ、その結果、Ｍ１３ファージなどの微生物表面にドメインが提示される。
【００３８】
結合ドメイン候補として構造化ポリペプチドは非構造化ポリペプチドと比較して多くの利点がある。通常、タンパク質中の表面残基の変異はタンパク質の全体構造や一般的特性（サイズ、安定性、変性温度など）にほとんど影響がないが、表面残基の変異は同時にタンパク質の結合特性に強い影響を及ぼす。これは、例えばＢＰＴＩ相同Kunitzドメインについて十分に記録されている（Ladner、1995年参照）。タンパク質または構造化ドメイン上の残基を変異させると、類似体にとって非構造ペプチドの変異によって得られるよりも特性の多様性が増す可能性がある。それは、タンパク質の枠組みまたはドメインの構造が残基ごとに、および枠組みにより異なる立体配座中に変異された残基を保持しているからである。これは、構造物中に束縛しないと埋没してしまう疎水性側鎖基にとって特に重要である。ペプチド・セグメント（ドメイン）に対する束縛がきつくければきついほど、いかなる特定の標的とも結合する可能性は低くなる。しかし、結合するならば、その結合はより緊密で、特異性が高くなるであろう。従って、結合ドメイン候補と、ついでペプチド類似体のドメインもまた、ある程度剛性のある枠組み内に束縛されたものを選択することが好ましい。あるいは、類似体のライブラリ・サイズを大きくするため、および標的に提示するための多様化構造をさらに導入するため、１個以上の結合ドメイン候補を選択することができる。ライブラリ・サイズが大きくなり、調製される類似体の数がさらに多く構造が多様になると、有用な枠組みと提示された機能性基が含まれる確率は、ほとんどどのような標的に対しても高親和性リガンドを見つけられるほどに高くなる。
【００３９】
結合ドメイン候補のサイズも重要な考慮事項である。小さいタンパク質またはペプチドは単クローン抗体などの大きいタンパク質よりも有利な点がいくつかある（Ladner、1995年参照）。第一に、結合部位あたりの質量が軽減される。分子量が小さい高安定性タンパク質ドメイン、例えばKunitzドメイン（約７ｋＤａ）やKazalドメイン（約７ｋＤａ）、Cucurbida maximaトリプシン阻害因子（ＣＭＴＩ）ドメイン（約３．５ｋＤａ）、エンドセリン（約２ｋＤａ）は、抗体（１５０ｋＤａ）や一本鎖抗体（３０ｋＤａ）よりもずっと高いグラム当たりの結合率を示し得る。
【００４０】
第二に、接触表面が少なくなるので、非特異的結合の可能性が低くなる。
第三に、小さいタンパク質またはペプチドは抗体には不可能な仕方で独特のつなぎ部位を有するように設計できる。例えば、小さいタンパク質は（例えばクロマトグラフィ・マトリクスに）つなぐのに適した部位のみにリシンを有するように設計できるが、これは抗体では実行できない。固定化した抗体の一部しか活性がないことがよくあるが、おそらくこれは担体への結合が不適切だからであろう。
【００４１】
小さいタンパク質またはポリペプチドのうちジスルフィドによって安定化されるもののほとんどは、ジスルフィドを形成していないシステインを含まない。これは、タンパク質を安定化させるためのジスルフィド形成をもたらす酸化条件によって、それ以外の条件では対にならないシステインもジスルフィドを形成するからである。従って、安定化ジスルフィドと奇数のシステインを有する小さいタンパク質はジスルフィド結合二量体（例えばホモ二量体やヘテロ二量体）を形成する傾向がある。ドメイン−ドメイン間のジスルフィド数はドメイン内の安定化ジスルフィドよりも還元されやすい。従って、選択的還元によって単一の遊離チオールを有する単量体ジスルフィド安定化ドメインを得ることができる。かようなチオールは、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸または類似したα−ヨードカルボン酸基とのチオエーテルの形成によって、これらのドメインを高度に安定固定化するのに使用できる。
【００４２】
小さいタンパク質またはポリペプチドのドメインは化学合成も可能であり、これによって標的との結合を妨げないように特定の固定化用基を組み込むことができる。例えば、ジスルフィドを含む小さいタンパク質を化学合成した場合、アミノ酸配列の他の場所にある他のシステインとは異なった仕方でブロックされたチオールを持つ特別のシステイン残基を追加することによって、その配列を変更することができる。選択したチオールは脱ブロック化してジスルフィドを形成させた後、追加したシステインを脱ブロック化し、固定化ＮＨ２−ＣＯ−ＣＨ２Ｉを含む基体などの適当な材料と反応させることによって、分子を固定化することができる。
【００４３】
第四に、構造ドメインと共に１つの枠組みからもう１つの枠組みへ無傷で移すとき、束縛されたポリペプチド構造物のほうが機能性を保持しやすい。例えば、結合ドメイン構造物は、ライブラリの中で提示する（例えばファージ上に提示する）のに使用する枠組みから取り出した独立タンパク質や、クロマトグラフィ基体に固定化した独立タンパク質へ提示枠組みから移しやすい。
【００４４】
結合ドメイン候補として使用するのに適した小さく安定なタンパク質ドメインは多数存在し、それにとって有用な次の情報が利用できる。（１）アミノ酸配列、（２）数個の類似ドメインの配列、（３）三次構造、（４）ｐＨ、温度、塩濃度、有機溶媒、酸化剤濃度の範囲にわたる安定性データ。実例としては、Kunitzドメイン（５８アミノ酸、３スルフィド結合）、Cucurbida maximaトリプシン・インヒビタ・ドメイン（３１アミノ酸、３ジスルフィド結合）、グアニリンに関係するドメイン（１４アミノ酸、２ジスルフィド結合）、グラム陰性菌からの熱安定エンテロトキシンＩＡに関係するドメイン（１８アミノ酸、３ジスルフィド結合）ＥＧＦドメイン（５０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、クリングル（kringle）ドメイン（６０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、真菌の炭水化物結合ドメイン（３５アミノ酸、２ジスルフィド結合）、エンドセリン・ドメイン（１８アミノ酸、２ジスルフィド結合）、連鎖球菌Ｇ ＩｇＧ結合ドメイン（３５アミノ酸、ジスルフィド結合なし）などがある。これらの全てではないが、そのほとんどが構造物を堅固に安定にするジスルフィド結合を含む。これらドメインのそれぞれに基づくライブラリ、好ましくはファージその他の遺伝子パッケージ上に提示されるライブラリは構築が容易であり、結合類似体の選択に使用しやすい。
【００４５】
結合ドメイン候補ライブラリの提供
一旦結合ドメイン候補を選択したなら、アフィニティ・リガンドになる可能性があるもののライブラリを作り、結合条件と放出（溶出）条件で標的に対してスクリーニングする。このライブラリは、ドメインの配列に１個以上のアミノ酸置換があることを除いて結合ドメイン候補と相同な一連の類似体を作成することによって作出する。このアミノ酸置換は、少なくともほとんどの置換体について、構造を大きく変えないでドメインの結合特性を変化させることが期待される。多様化のために選択したアミノ酸位置（可変アミノ酸位置）が表面アミノ酸位置、即ちドメインがもっとも安定な立体配座をとるとき、ドメインの外表面（即ち溶液に曝される表面）に現れる、ドメインのアミノ酸配列中の位置であることが好ましい。置換の効果が最大になるように、この変化させるべきアミノ酸位置が隣接または相互に近接していることがもっとも好ましい。その上、特別のアミノ酸を結合ドメイン候補の構造中に追加することができる。好ましい実施形態、特に標的の三次構造、または標的の他の分子、特に結合ドメイン候補との相互作用に関して大量の情報が利用できる場合では、類似体ライブラリ構築の過程で結合相互作用に必須のアミノ酸位置が決定され保存される（すなわち結合に必須のアミノ酸は変えない）。
類似体ライブラリ作出の目的は標的との反応においてアフィニティ・リガンドとなる可能性のあるものを多数提供することであり、一般に、ライブラリ中の類似体数が多いほど、そのライブラリの構成要員が標的に結合し、かつ放出に望ましい予め選択した条件下でそれを放出する確度が高くなる。一方、無作為置換では、アミノ酸配列中のたった６個の位置でも類似体が６千万を超え、これはファージ提示ほど強力なスクリーニング技術を利用しても、実際には限界に近いライブラリ・サイズである。従って、多様化のために指定するアミノ酸位置は類似体の結合特性に及ぼす置換の効果が最大になるように考慮され、置換に使用できるまたは意図されたアミノ酸残基は類似体を結合条件から放出条件に溶液条件が変るのに反応するようにさせるだろうものに限定されている、偏りのあるライブラリを作出することが好ましい。
【００４６】
前に示したように、米国特許第５２２３４０９号で論じられた技術は選択した結合ドメイン候補に対応する類似体ライブラリの調製に特に有用であり、これらの類似体は標的分子について多数の類似体を大規模にスクリーニングするのに適した形で提供される。複製可能な遺伝子パッケージ、もっとも好ましくはファージ提示を使用することは新規なポリペプチドの結合性実体を生成させる強力な方法であり、これには新規ＤＮＡセグメントをバクテリオファージのゲノム（または他の増幅可能な遺伝子パッケージ）に導入して、この新規ＤＮＡがコードするポリペプチドがファージ表面に出現するようにさせる方法が含まれる。この新規ＤＮＡの配列に多様性がある場合、１つの受容体ファージはＤＮＡがコードする最初の（即ち「親」）アミノ酸配列の変異体を１つ提示し、ファージの集団（ライブラリ）は莫大な数の異なっているが類縁のアミノ酸配列を提示する。
【００４７】
ファージのライブラリを標的分子に接触させて結合させ、結合しなかったものを結合したものから分離する。結合したファージは様々な方法で標的から遊離され、増幅される。ファージは細菌の細胞に感染させることで増幅できるので、結合実体をコードする遺伝子配列を明らかにするには少数の結合ファージでも十分である。これらの技術を使用すると集団中の約２千万分の１の結合ファージを回収することができる。各１千万〜２千万以上の可能結合ポリペプチドを提示する１個以上のライブラリを迅速にスクリーニングして高親和性リガンドを見つけだすことができる。この選択工程が機能すると、集団の多様性は各回ごとに減少し良好な結合体だけが残る。即ちこの工程は収束する。典型的な場合では、ファージ提示ライブラリは数個の非常に近縁な結合体（１千万のうち結合体１０ないし５０個）を含む。ファージの単位によって測定される結合の増加と近縁配列の回収により収束が示される。最初の結合ポリペプチドの組が確認されると、配列情報を使用してさらなる所望の特性、例えば極めて類似した二分子の識別力などをさらに有する構成要員に偏らせた他のライブラリが設計できる。
【００４８】
かような技術によると、多数の類似体のスクリーニングだけではなく、結合／溶出サイクルの繰返しの実用化および最初の基準に合致した類似体提示パッケージのスクリーニングに対して偏りのある第二のライブラリの構築も可能になる。従って、本発明の実行では、（１）結合ドメイン類似体のライブラリをファージなどの複製可能な遺伝子パッケージ上に提示できるように作成すること、（２）スクリーニング法の結合条件が所望のアフィニティ・リガンド用に予め選択した結合条件と同一にして、このライブラリを標的分子と結合する遺伝子パッケージについてスクリーニングすること、（３）遺伝子パッケージをアフィニティ・リガンド用に予め選択した放出条件下での溶出によって獲得し、増殖させること、（４）極めて破壊的な条件（提示された結合ドメイン類似体のいくつかと標的との極めて高い親和性会合に打ち勝つため、例えばｐＨ２以下、８Ｍ尿素、飽和チオシアン酸グアニジン等）下で溶出することによって追加の遺伝子パッケージを獲得し、増殖させること、（５）（３）または（４）で得られた増殖した遺伝子パッケージを別々に、もしくは組み合わせて（２）および（３）または（４）の工程を１回以上（例えば１ないし５回）追加循環させること、（６）かようなサイクルから回収した遺伝子パッケージ中に発現した類似体について高親和性結合体のコンセンサス配列を決定すること、（７）元の枠組み（結合ドメイン候補）に基づいて偏りのあるライブラリをさらに構築し、各可変アミノ酸位置で高親和性コンセンサスを可能にし、さらに他のアミノ酸タイプを結合条件から放出条件への変化に対して特に感受性があると思われるアミノ酸を含むように選択すること、（８）（ａ）結合条件下で強固に（即ち高い親和性で）結合し、（ｂ）放出条件下できれいに放出する（即ち標的から容易に解離する）構成要員をこの偏りのあるライブラリからスクリーニングすることがもっとも好ましい。
【００４９】
アフィニティ・リガンドのクロマトグラフィへの使用
結合条件下で所望の親和性で結合し、放出条件下で望むように放出する１個以上のライブラリの構成要員を分離した後、公知の方法でこのアフィニティ・リガンドの分離を達成できる。例えば、類似体ライブラリがファージ上に提示された有望なアフィニティ・リガンドからなる場合、放出されたファージを回収、増殖し、類似体をコードする合成ＤＮＡ挿入断片を分離、増幅し、このＤＮＡ配列を解析し、あらゆる所望の量のリガンドを、例えばポリペプチドの直接合成、分離ＤＮＡや等価のコード配列の組換え発現などによって調製することができる。
【００５０】
本明細書に記載する以下の同様の工程によって、放出特性をリガンドに入れて設計したのと同様の方法で、リガンドにとって望ましい特性をさらに類似体リガンドに組み入れて設計することができる。
【００５１】
こうして分離したアフィニティ・リガンドは、アフィニティ・クロマトグラフ法による標的分子の分離に極めて有用である。従来のクロマトグラフ法はどれでも使用できる。本発明のアフィニティ・リガンドは、例えばクロマトグラフィ・カラムなどに適した固体担体上に固定することが好ましい。次いで固定化アフィニティ・リガンドにリガンド／標的複合体の形成に好適な条件下で供給流を負荷もしくは接触させ、非結合物質を洗浄して除いた後、標的をリガンド／標的複合体から放出するのに好適な条件下で溶出することができる。あるいは、供給流と適当にタグを付けたアフィニティ・リガンドとを反応容器に共に添加した後、タグ（例えば、複合体形成後にリガンドを結合するのに使用できるポリＨｉｓアフィニティ・タグ）を使用することで標的とリガンドの複合体を分離し、最後に非結合物質を除去した後に標的を複合体から放出させることによってバルク・クロマトグラフィを行うことができる。
【００５２】
アフィニティ・リガンドは、厳密な結合特性および放出特性を組み込んで設計してあるが、アフィニティ精製で使用する際に、分離されたアフィニティ・リガンドが機能するのに一層最適な結合条件及び放出条件が明らかになる可能性があることに注意すべきである。従って、本発明による分離後に、ライブラリからアフィニティ・リガンドを分離した結合条件及び放出条件だけを常に使用しなければならないということはない。
【００５３】
親和性定数
およそ３０００ダルトン（約３ｋＤａ）の分子量を有するアフィニティ・リガンドが分離されたと仮定する（例えばＣＭＴＩ誘導体、下記参照）。また、このリガンドを３ｍＭ（即ち約１０ｇ／Ｌ）の有効濃度で適当なクロマトグラフィ用担体に負荷できると仮定する。
分子量が５０ｋＤａで細胞培養培地から１０ｍｇ／Ｌで産生された標的を仮定する。タンパク質濃度は（０．０１ｇ／Ｌ）÷（５×１０４ｇ／モル）＝０．２μＭ。リガンドが３ｍＭで存在する場合、１Ｌの親和性材料は３ミリモル（１６７ｇ）の標的を捕捉できる。
このリガンドが単純な質量作用の式（１）に従って標的と結合すると仮定する。
（１）ＫＤ／［リガンド］＝［標的］／［複合体］≡ (１／Ｘ)１０
捕捉できる標的の割合は式（２）で与えられる。
（２）結合した標的の割合＝１／｛１＋（１／Ｘ）｝
従って、結合した標的の割合は解離定数ＫＤと担体につけたリガンド量によって制御できる。ＫＤは溶液条件の関数であるが、アフィニティ・リガンド分子に固有の値である。結合条件下でのＫＤの値はＫＤＢＣであり、溶出条件下でのＫＤの値はＫＤＥＣである。
【表２】
上の表に、結合した標的の割合が［リガンド］／ＫＤの比にともなってどのように変化するかを示す。満足できる捕捉は０．９より大きいと仮定されるが、本発明はいかなる捕捉レベルにも限定されない。［リガンド］がおよそ３ｍＭの場合、満足できる捕捉は３００μＭ以下のＫＤＢＣで得られる。［リガンド］／ＫＤＢＣ≧１００では、より効果的な捕捉が得られ、これらの比較的高い値が好ましい。［リガンド］／ＫＤＢＣの値は高いほどよいが、ただし標的の回収に十分なほど［リガンド］／ＫＤＥＣが小さくなければならない。３ｍＭより高濃度のアフィニティ・リガンドを担体につけることができればＫＤの値が一層高いリガンドを使用できる。
【００５４】
満足できる溶出には［リガンド］／ＫＤＥＣ＜１０が必要であり、［リガンド］／ＫＤＥＣの値は低い方が好ましい。［リガンド］／ＫＤＥＣ＜０．１は特に好ましく、［リガンド］／ＫＤＥＣ＜０．０１はさらに好ましい。［リガンド］／ＫＤＥＣは低いほどよく、制限はない。［リガンド］／ＫＤＥＣの比を０．００１よりも低くしても、平衡放出で得るものはほとんど無いが、極めて高いＫＤを有するリガンドはオフ比が高く、標的を極めて迅速に放出できるので実際上は優れている。
【００５５】
従って、効率よい捕捉と溶出を得るためには、理論によると（ＫＤＥＣ／ＫＤＢＣ）を１０００以上にするべきである。この比は高いほどよい。少なくとも１０％の結合物質を溶出条件下で遊離できる場合、（ＫＤＥＣ／ＫＤＢＣ）＞１０であればこの工程は申し分ない。しかし、本発明は（ＫＤＥＣ／ＫＤＢＣ）のいかなる特定の値にも限定されない。標的に対して極めて高い親和性を有するリガンドの方が高い特異性を与えることができよう。特に、親和性が比較的低い不純物を押し出すために親和性物質を標的よりも僅かに多く負荷してある場合にそうである。極めて高親和性のリガンドにとり、不純物を押し出すために必要な過剰量は少ない。
【００５６】
ＫＤＥＣはＫＤＢＣと同様に重要である。ＫＤＥＣは０．１より大きくないことが好ましく、０．０１より大きくないことがさらに好ましい。それにもかかわらず、理論的に結合物質の５０％を放出させるＫＤＥＣ＝１でもアフィニティ精製は機能する。平衡洗浄を４回行うと（即ち５０％＋２５％＋１２．５％＋６．２５％）、結合条件下で捕捉された物質の９４％が回収される。
【００５７】
仮定に基づけば、ＫＤＢＣ＝１μＭを有し、担体に３ｍＭで結合した固定化リガンド１Ｌは、約１５，０００Ｌの０．２μＭ溶液（１０ｍｇ／Ｌの５０ｋＤａ標的分子）から標的の９９％を捕捉することができる。
適当な担体に結合したアフィニティ・リガンドは、標的を捕捉するために、他段階平衡クロマトグラフィの実施形態などの多様な方法で使用できることが理解されよう。例えば、リガンド担体をカラムに充填し、標的を含む溶液をカラムに流し、（任意選択で）ほぼ全ての標的が結合するかリガンド担体が標的で飽和するまで再循環させる。あるいは、結合が完了するまでリガンド担体を標的含有溶液と混合（振とうまたは撹拌）してもよい。
【００５８】
ＫＤＥＣが３ｍＭでリガンド負荷が３ｍＭの場合、１Ｌの平衡洗浄を４回行うと４Ｌ中に２．８２ミリモル（３ｍＭの９４％）が回収でき、６７０μＭの標的溶液、即ち供給流と比較して３３５０倍濃度の標的が得られる。さらに、大部分の不純物が除去されると予想される。
ＫＤＥＣが３０ｍＭでリガンド負荷が３ｍＭの場合、１Ｌの平衡洗浄を２回行うと２Ｌ中に２．９８ミリモル（３ｍＭの９９％）まで回収でき、１．４９ｍＭの標的溶液、即ち供給流と比較して７４５０倍濃度の標的が得られる。一方、ＫＤＥＣが０．３ｍＭでリガンド負荷が３ｍＭの場合、１Ｌの平衡洗浄を２４回行うと２４Ｌ中に２．７０ミリモル（３ｍＭの９０％）まで回収でき、１１２μＭ標的溶液、即ち供給流と比較して５６０倍濃度の標的が得られるが、これはさほど望ましくない。従って、担体上のリガンドの実際的な限界は［リガンド］／ＫＤＥＣ≒１０であり、低い値のほうが好ましい。
【００５９】
担体のリガンド結合レベルが支配するのは（ａ）供給流から捕捉される標的の割合、（ｂ）捕捉される標的の絶対量、（ｃ）捕捉される不純物の量の３因子である。最初の２因子の理論的挙動が報告されている。供給流中の不純物は複雑で特有であるため［リガンド］と不純物の結合および溶出との相互作用は経験則によって最適化される。
【００６０】
特定のアフィニティ・リガンドが与えられると、最適な分離に適した充填を計算することができる。ＫＤＢＣが３ｍＭでＫＤＥＣが３μＭのアフィニティ・リガンドを仮定すると、３ｍＭで担体に充填すれば標的の捕捉は完全になるであろう。しかし、溶出条件下では＞１％しか溶出されない。このリガンドを３μＭで充填すれば標的を捕捉することができ、標的はＸ＝１で放出される。あるいは、さらに適した（即ちより低い）親和性を有するものが１個以上得られるように結合領域中またはその付近のアミノ酸を変更して、選択したアフィニティ・リガンドの別形を調製することができるであろう。
【００６１】
上記の考察はバッチ結合および溶出に関するものであった。これに代わるアプローチは平衡段階が多い定組成クロマトグラフィである。高いオン比およびオフ比を有するアフィニティ・リガンドはクロマトグラフ法ではより効果的である。クロマトグラフ法にとり、リガンドのもっとも重要な属性は標的に対し適度な親和性（１μＭないし１ｍＭ）を有し供給流の他のあらゆる成分に対する親和性がずっと低いことである。
【００６２】
比較的低い親和性を有する結合類似体を回収する確度を高めるには、特にスクリーニングの初期段階では、例えば洗浄などによる非結合類似体の除去（段階（ｇ）、上記参照）を極めて短くすることであろう。例えば、ＫＤ＝３μＭの結合ドメインはＫｏｎ＝１０３／モル／秒およびＫｏｆｆ＝１０−３／秒を有するであろう。これはτ１／２＝６９４秒≒１２分に相当する。元々ライブラリに１０７個の異なる類似体が含まれている場合、１０１１個の試料にはライブラリの各構成要員が１０，０００個ずつ存在する。ある類似体５，０００個が標的と結合し、半交換時間τ１／２の３倍（約３５分間）洗浄した場合、６２５個の類似体が捕捉されるであろう。洗浄を短縮すると非特異的類似体のバックグラウンドが高くなるにもかかわらず、オン、オフの速い構成要員が次の回へ持ち越されることを確実にする方が好ましい。
【００６３】
以上から、必ずしも親和性がもっとも高いリガンドが制御可能で経済的な標的分子の回収にとって最適であるわけではないことが分かる。本発明の方法によると、予測可能で制御された標的のきれいな放出と対になった標的の特異的な結合、有用な充填特性、許容できる程度に完全な溶出、再使用性／再生利用性等、特定の標的の分離を模索する実行者にとって重要な、多様な所望の特性を有するリガンドを選択することができる。
【００６４】
近縁不純物の除去
本発明によると、標的分子と極めて類似した他の分子とを識別できるアフィニティ・リガンドの選択も可能になる。ここで、「標的」とはアフィニティ・リガンドが結合すべき分子であり、「特異的不純物」とはそれが結合することを最小限にすることが望まれる分子である。
【００６５】
本発明の方法を使用すると、Ａｓｎ残基を含むタンパク質と、Ａｓｎが化学的にＡｓｐに変換された脱アミド誘導体とを識別できるアフィニティ・リガンドを見つけだすことができる。同様に、異性有機化合物のＲ体をＳ体から分離するのに有用なアフィニティ・リガンドを見つけだすことができる。
【００６６】
この種の特異性を達成する方法は少なくとも３通りある。１番目は、標的と結合するアフィニティ・リガンドを多数獲得し特異的不純物への結合をクローン分離物として試験することであろう。２番目は、特異的不純物を固定化し、特異的不純物に対して高い親和性を有するライブラリの構成要員を取り除けるであろう。次いでこの「除去ライブラリ」を標的に結合するものについてスクリーニングする。３番目は、固定化した標的への結合について可能アフィニティ・リガンドのライブラリのスクリーニングを行う際に、結合緩衝液中に１種類（または複数）の特異的不純物を存在させ、その濃度を標的と特異的不純物の両方に対して親和性を有するあらゆる構成要員が固定化標的よりも特異的不純物の方と結合するような濃度にするとができるであろう。このように、標的と結合した構成要員を特異的不純物に対する親和性がないことを示すように「設計」する。３番目の方法が好ましい。
３通りの方法の全てにおいて、特異的不純物が標的をほぼ完全に含まないことが重要である。特異的不純物中の標的濃度ができるだけ低いことが好ましい。
【００６７】
３番目の方法では、特異的不純物は、溶液中に遊離した標的がライブラリの各標的結合成分の大部分に結合しないような濃度で添加する。従って、ライブラリのスクリーニングを行うために結合／洗浄／溶出／増幅を数回繰り返すのにつれて、残っているライブラリの構成要員の各濃度が上昇する一方で構成要員の数が減少するため、特異的不純物の濃度を上げる。特異的不純物を含む調製物中に含まれるどの標的も有用である可能性のあるアフィニティ・リガンドの全部と結合することはあり得ないので、有用なアフィニティ・リガンドのいくつかは固定化標的によって捕捉され、次の回へ繰り越される。以下の計算によると、使用すべき特異的不純物の適量が示唆されるが、本発明はいかなる特定レベルの特異的不純物の使用にも、あるいはいかなる特定の結合、競合理論にも限定されない。
【００６８】
複雑度１０６のファージ提示ライブラリ（即ち１０６種類の可能アフィニティ・リガンド・ペプチドが提示されている）の中では、ライブラリの力価は１０１３ファージ／ｍＬ、即ち各タイプのファージが１０７／ｍＬであると想定される。標的が５０μＭで効果的に存在し、特異的不純物が標的の０．５％存在する場合、特異的不純物を１，０００μＭまで添加し、遊離標的を５μＭにするがこの濃度は、特異的不純物が存在する状態でも標的と結合できるアフィニティ・リガンドの捕捉を完全に阻害することはないだろう。
【００６９】
ラウンド間で増幅を行わずにライブラリをスクリーニングするときは、結合段階の１つで特異的不純物を追加するだけで十分なことがある。特異的不純物を追加する最適の段階が、早期の結合段階か後期の結合段階かは実験で決定すべきである。
本発明によるアフィニティ・リガンドの単離については、下記でさらに例示する。以下の例に含まれる特定のパラメータは本発明の実施を例示するためのものであり、いかなる形においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
実施例１〜１５
他のタンパク質に結合するタンパク質には、遊離タンパク質では露出していて、複合体の形になると埋没する１個以上の疎水側鎖基があることが多い。アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓには疎水側鎖基がある。Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ（ジスルフィドの一部のとき）は常に疎水性である。ＴｒｙとＣｙｓ（ジスルフィドの一部でないとき）は高いｐＨでイオン化できる。Ｈｉｓは中性または酸性のｐＨでイオン化が可能である。露出疎水領域を有する可能性が高いタンパク質には、タンパク質ホルモン、タンパク質ホルモンの受容体、受容体、結合分子、抗体等が含まれる。酵素および極めて豊富な貯蔵や輸送のタンパク質（トリプシン、ミオグロビン、ヘモグロビンなど）には、表面に広い疎水領域が全くない。
【００７１】
標的が露出疎水領域を有することが既知であるか、露出疎水領域を有する可能性が高い場合、好ましいアプローチは高塩濃度（疎水性相互作用に有利）および３７℃で結合し、４℃（疎水性相互作用に不利）及び／または５０％（v/v）アセトニトリル（疎水性相互作用に不利）と１０ｍＭ ＮａＣｌ（低塩濃度）で放出するリガンドを選別することである。
標的タンパク質がイオン基を多数有する場合（アミノ酸組成またはアミノ酸配列から決定できるようにＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど）、好ましいアプローチは１つのｐＨで結合し、別のｐＨで放出するリガンドを選別することである。例えば、ｐＨ３．０からｐＨ９．５の間で安定な標的に対しては、ｐＨ８．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０℃で結合しｐＨ４．０、１Ｍ ＮａＣｌ、３０℃で放出するリガンドを選別することが有利である。低温、低塩濃度はイオン性相互作用に有利である一方、比較的高い塩濃度と温度はイオン基の結合力を低下させる。あるいは、ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌ、３０℃で結合しｐＨ４．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０℃、１０％（v/v）ＭｅＯＨで放出するリガンドを選別することができるであろう。
【００７２】
水溶性標的は、極めて少数のイオン基（即ちタンパク質ではＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど）を有するときに多くの中性極性基（即ちタンパク質ではＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒなど）を有する可能性が高い。多くの糖類はこのクラスに含まれる。このような中性極性基（ヒドロキシル、アミド、エーテル、エステル等）は水素結合を形成することができる。このように、多くの位置で許容される水素結合形成アミノ酸を有するタイプのライブラリには、有用な親和力でこの種類の分子と特異的に結合する構成要員が含まれる。水素結合をつくる側鎖基を有するアミノ酸には、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）が含まれる。水素結合はｐＨ、イオン強度、溶媒の誘電率、および尿素やグアニジンイオンなどのカオトロピック試薬の影響を強く受ける。水素結合は、高温では結合力を失う。従って、適切な結合条件は低塩濃度、低誘電率を有する一方、溶出条件は高塩濃度、高誘電率、結合条件のｐＨと好ましくは少なくとも１ｐＨ単位異なるｐＨを有するであろう。例えば、結合条件をｐＨ８、１０ｍＭ ＮａＣｌ、４℃とする一方で溶出条件をｐＨ６、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３５℃とすることができる。あるいは、ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌ、３０℃で結合しｐＨ４．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０℃、１０％（v/v）ＭｅＯＨで放出するリガンドを選別することができるであろう。
【００７３】
もっとも容易かつ経済的に変更できる溶液条件はｐＨである。アミノ酸のイオン化を分子間界面内で変化させることで分子の結合を著しく阻害できることが知られている。従って、標的への類似体の結合がｐＨ変化に高い感受性をもつ確度を高めるため、ほとんどの、あるいは全ての変更位置で、少なくともＨｉｓを、好ましくはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓも許容するように設計することができる。他のタイプのアミノ酸も許容できることは理解すべきである。例えば、各変更位置で｛Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ｝の組が許容されるライブラリは、高いｐＨ感受性で標的と結合するリガンドを含む可能性が極めて高いであろう。｛Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ｝の組だけが許容されるライブラリも機能する可能性が高いが、さらにその他のアミノ酸のタイプが許容されると、第一の溶液条件下で結合がおきる確度が高くなる。界面内でイオン化状態を変化させる基が１、２個あれば第二の溶媒条件の組での結合が阻害される。表２に示すように、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、ＬｙｓのｐＫａは３．５〜１１の範囲、即ちタンパク質の多くが安定なｐＨの範囲内である。しかし、タンパク質では各側基の位置決定が実際のｐＫａに影響を与える可能性がある。例えば、Ａｒｇと近接して保持されたＬｙｓは、そうではないＬｙｓと比較して低いｐＫａを示す可能性がある。
【００７４】
アミノ酸側鎖の活性とアミノ酸基が溶液中のタンパク質に与えている可能性のある性質を示す表２および表３のタイプ情報を使用すると、アフィニティ分離法が有効であることが望まれる場合に特定の種類の溶媒条件の変化（結合条件から溶出条件への移行）に対して感受性がある結合ドメイン候補を含む確度が高いライブラリの設計に必要なアミノ酸置換を選別することができる。
【表３】
（Crieghton、タンパク質：構造および分子の性質、第２版(W.H.Freeman and Co.、ニューヨーク、1993年）、p.6）
表３に、記載した溶媒条件の変化に対して感受性のある結合をタンパク質に与える可能性のあるアミノ酸タイプの種類を示す。本発明の好ましい結合ドメイン類似体候補には、構造を安定化させることでドメインが高い親和性、特異性、安定性を示せるようにするジスルフィド結合が含まれる。
【表４】
【表５】
【００７５】
実施例１は、結合ドメイン類似体ライブラリ用に提案した結合条件および放出条件を説明するが、この条件ではヒスチジンが多数の、あるいは全ての変更可能な位置に来ることができる。ｐＨ＞７では、Ｈｉｓは電荷を帯びず、側基は水素結合の供与と受容が可能であるが疎水性である。塩濃度と温度が高くなると、イオン相互作用の結合エネルギーへの寄与が低下する。従って、高塩濃度および高温で結合させると、強いイオン相互作用を有する結合体が得られる可能性が低くなり、疎水相互作用を有するリガンドが得られる可能性が高まる。放出条件が低塩濃度および低温であると、イオン相互作用の重要性、特に不適当なイオン相互作用の効果の重要性が高まる。従って、結合界面に１個以上のＨｉｓ残基を有する複合体は酸性ｐＨと低塩濃度で不安定になりやすい。
【００７６】
実施例２は、多くの、あるいは全ての変更可能な位置にＨｉｓが許容されたライブラリからの選別を説明する。結合条件および放出条件の選択は、標的との結合がｐＨ８．０では強いがｐＨの低下には極めて敏感であるような結合ドメインを１つ以上分離できるように行う。
【００７７】
ヒスチジンだけがｐＨ感受性相互作用の可能なアミノ酸ではない。実施例３に示すアミノ酸はすべて、多くのタンパク質が安定なｐＨ範囲でイオン化が可能である。イオン化が起きるｐＨはコンテクスト依存性が高いことが多い。従って、タンパク質−標的界面内のアスパラギン酸側鎖基のｐＫａは表２に示した範囲内にはない可能性がある。タンパク質−標的界面内の基によってイオン化状態が変化すると、複合体の安定性が強力に変更を受けるのはかなり確実である。従って、複合体が、１つのｐＨで安定であってもｐＨが界面内の基によってイオン化状態が変化するのに十分なだけ異なると安定である可能性が低い。かような移行が起きるｐＨは計算が困難であり、表２に示したｐＫａの１つであるとは限らない。
【００７８】
実施例４は、多くのＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、不対Ｃｙｓ残基を有する類似体のライブラリがｐＨ３．５、４℃、５０ｍＭ ＮａＣｌで標的と結合しｐＨ７．５で放出する構成要員を含む可能性が高いことを説明する。
実施例５は、低塩濃度を使用するとイオン相互作用による結合が促進され、高塩濃度、異なるｐＨで溶出すると、この相互作用が破壊されることを説明する。
実施例６は、ｐＨ８．２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５℃で結合しｐＨ５．７、１Ｍ ＮａＣｌで放出すると、高いイオン強度とより低いｐＨに感受性の結合ドメインが放出されやすいことを説明する。
【００７９】
イオン強度もタンパク質−標的の結合に強く影響する可能性がある。一般に、疎水相互作用によって結合した複合体は高塩濃度のほうが安定性が高く、一方イオン相互作用によって結合した複合体は低塩濃度よりも高塩濃度のほうが安定性が低い。実施例７ではこれを活用し、イオン基が豊富なライブラリを使用することによって、低塩濃度を結合に、高塩濃度を放出に利用している。実施例８は、ライブラリを５ｍＭ ＫＣｌで結合し飽和ＫＣｌで放出することによってこの効果が見られることを説明する。あるいは、ライブラリが少なくとも数個の疎水基を許容する場合、結合条件と放出条件は実施例９に示すように逆にできる。実施例８と実施例９の結合条件と溶出条件によると、同一のライブラリから同一の標的に対する別の結合ドメインが得られることが期待される。
【００８０】
実施例１０は、疎水基を結合ドメイン候補の多くの、あるいは全ての変更可能な位置に許容するライブラリは１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中でしっかりと結合するが５０体積％のＡＣＮ／水、塩類なしで放出する構成要員を有する可能性が高いことを説明する。これは、疎水相互作用が有機溶媒によって分断されるためである。
実施例１１は、列記されているグループのアミノ酸を数個結合界面中に有するドメインが水中では結合し、塩を幾分加えた３０％ＭｅＯＨ中では放出することが期待されることを教える。
【００８１】
まず疎水相互作用によって結合するタンパク質複合体は「低温変性」することが知られている。従って、列記されている疎水残基を変更可能な位置の多くで許容する実施例１２のライブラリは３３℃、高塩濃度で標的と結合し低温（例えば０℃）、低塩濃度で放出する構成要員を含む可能性が高い。
【００８２】
カオトロピック試薬その他の溶質も標的への安定なドメインの結合を極めて感受性にする可能性がある。一般に、尿素は水素結合によって相互作用を行う基同士の相互作用を断ち切る。Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓは特に好ましく、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇも尿素による分断に感受性の相互作用をしやすい（実施例１３参照）。
【００８３】
ＡｓｐおよびＧｌｕの側鎖基は二価または三価の金属イオン、特にＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋等のキレート化をとおして他の酸性基と相互作用することができる。タンパク質主鎖およびＡｓｎやＧｌｎの側鎖基中のカルボニル酸素や、タンパク質主鎖及びＡｓｎやＧｌｎのアミド窒素もある種の金属イオンとの結合を形成する。金属イオンもＥＤＴＡなどのキレート剤によって可溶状態にとどめておける。従って、表面の数カ所にＡｓｐおよびＧｌｕを許容するライブラリには、溶液中に二価または三価の金属イオンが存在する場合に限り、酸性基を含む（かつ安定性が多価金属イオンとの結合に依存しない）標的と結合する構成要員が存在する可能性が高い（実施例１４参照）。かような構成要員の放出はＥＤＴＡその他のキレート剤によって起こすことができる。
【００８４】
塩基性側鎖基は塩素イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、クエン酸イオン、乳酸イオンなどの陰イオンと相互作用することができる。多価陰イオンでは、複数の側鎖基が１個のイオンと相互作用が可能である。かような相互作用は結合をさほど安定化させないとしても、多価イオンは反発力を遮蔽して、そうでなければ不安定な複合体の形成を可能にする。実施例１５に説明するように、多価イオンを取り除くと複合体の解離が起こるであろう。
【００８５】
表４に、類似体の列記した溶液パラメータの変化にたいする応答性に寄与すると思われるアミノ酸のグループを、例えば結合ドメイン候補をファージに提示させたライブラリ中などに、発生させるのに適したコドンをまとめる。
【表６】
【００８６】
実施例１６
上記の技術を組み換えヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）用のアフィニティ・リガンドの分離に用いた。ｔＰＡアフィニティ・リガンド作成の方法は一般的な３段階を含み、それは（１）ｔＰＡと結合させるための安定な親タンパク質ドメインの変形体およそ千百万個のスクリーニングし、（２）もっとも興味が持たれるリガンドの少量生産し、（３）血漿を加えた試料からｔＰＡをアフィニティ精製するための活性化ビーズと結合した１種のリガンドのクロマトグラフィ試験である。
【００８７】
この作業のため、ｔＰＡをCalBiochem（No.612200）から購入し、Marklandら（1996年）記載の方法でPierce Chemical CompanyのReactiGelＴＭアガロース・ビーズに固定した。およそ２００μｇのｔＰＡが２００μＬのReactiGelＴＭスラリーに結合した。
ファージに提示されたタンパク質のライブラリ４組をスクリーニング工程用に選び出した。３組はリポタンパク質随伴凝集阻害因子の第１Kunitzドメイン（ＬＡＣＩ−Ｋ１）に基づき、Ｌｉｂ No.１、Ｌｉｂ No.３、Ｌｉｂ No.５と呼ばれ、１組はCucurbida maximaトリプシン阻害因子Ｉ（ＣＭＴＩ−Ｉ）に基づくものであった。ＣＭＴＩ−Ｉはカボチャ種子中にあるタンパク質で、消化管の酸性条件およびタンパク質分解条件に耐えることができる。これらのタンパク質はそれぞれ３個のジスルフィド架橋を有し、そのため非常に動きが束縛されかつ安定になっている。これらのタンパク質ファミリーのメンバーは、顕著な熱安定性（＞８０℃で失活せず）、顕著なｐＨ安定性（ｐＨ２、３７℃での終夜インキュベーションまたはｐＨ１２、３７℃への１時間曝露で失活せず）、顕著な酸化安定性を有することが示されている。各ライブラリ中の可能アミノ酸配列数を下の表５に示す。
【表７】
この作業中でｔＰＡに対してスクリーニングしたファージ提示ライブラリの総多様度はおよそ千百万と推定される。KunitzドメインおよびＣＭＴＩドメインは、その表面のほかの部分を変更することによってさらにずっと高い多様度を示すであろう。
【００８８】
「緩速スクリーニング」と「迅速スクリーニング」の２種類のスクリーニング・プロトコルを使用した。緩速スクリーニングでは、各回ごとに得られたファージを次の回の前に大腸菌中で増幅した。迅速スクリーニングでは、増幅は行わなず、ある回で標的から回収したファージを次の回に投入した。迅速スクリーニングでは、数回を経ると、ファージの投入量と回収量が急速に低下した。投入量は、緩速スクリーニングでは一定に保つことができる。緩速スクリーニングでは投入量が一定であることから、各回の比較が可能になり、選別や選別されていないことを提示できるが、迅速スクリーニングの各回の比較は解釈が難しい。迅速スクリーニングによると、無関係な性質（例えば感染性や増殖率）よりも結合で選別される確度が高くなる。
【００８９】
記載したファージ・ライブラリについてｔＰＡへの結合に関して４回スクリーニングを行った。１回目は、ｐＨ７のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で別々の反応でｔＰＡアガロース・ビーズとファージ・ライブラリを混合した。非特異的結合を少なくするため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．１％添加した。結合しなかったファージをｐＨ７で洗浄して除き、１回目のスクリーニングだけは結合したファージをｐＨ２で溶出した。次の３回の迅速スクリーニングは溶出プロトコルが異なり、１回目のスクリーニングのプール・アウトプットを使用した。プールＡはＣＭＴＩライブラリおよびＬｉｂ No.１ライブラリからのアウトプットをあわせたものからなり、プールＢはＬｉｂ No.3ライブラリおよびＬｉｂ No.5ライブラリからのアウトプットをあわせたものからなるようにした。プール・ライブラリの結合はｐＨ７で行ったが、結合ファージを取り出すための１回目の溶出はｐＨ５で行い、その後の溶出はｐＨ５〜ｐＨ２の範囲で放出されるファージを溶出するためｐＨ２で行った。これをさらに２回繰り返し、全部で４回の選別を行った。
【００９０】
最後の３回のスクリーニングから得たファージの力価を下の表６に示した。１回のアウトプットは次の回の投入量であった。
【表８】
ファージの力価からみて、プールＡは収束して強く結合するファージを含むが、プールＢは収束も有意でなく強く結合するファージも含まないようである。
【００９１】
さらに分析するため、３回目の迅速スクリーニングで選別したファージからファージのクローン４０個を、ｐＨ５のプールから２０個、ｐＨ２のプールから２０個選び出した。ＣＭＴＩまたはＬＡＣＩ由来の遺伝子フラグメントが存在するかどうかを判定するためにＰＣＲを使用してこのファージのＤＮＡを増幅した。
【００９２】
プールＡの迅速スクリーニングから分離した４０個のファージのうち３８個にＣＭＴＩ由来の構築物が見つかった。残りの分離ファージはＰＣＲ生成物を作らず、遺伝子欠失が示された。プールＢの迅速スクリーニングで分離されたファージ４０個のうち１０個だけが好適な構築物を含み、探索が成功しなかったことが別に示された。
【００９３】
特定のファージ提示タンパク質が標的分子に対して高い親和性を有する１つのしるしは、それが繰り返し見つかることである。ｐＨ２で放出したＣＭＴＩ由来ファージ分離物１８個から１個の配列が５回見つかり、２個目の配列は４回、残りの２個は３回見つかった。この１８個の配列は選別された分子の近縁ファミリーをなし、探索が成功裏に収束したことがさらに示された。
【００９４】
表７に、観察された配列の違いを、許容された多様性と選別ｐＨの関数として示す。親ＣＴＭＩタンパク質のシステイン３とシステイン１０の間に表面露出ループを規定するコドンに組合せ配列の多様性を導入することによってＣＭＴＩライブラリを構築した。このシステインは構造の重要部分をなしているため、変更しなかった。
【表９】
【表１０】
これにより９．１３×１０６個のタンパク質配列と１６．８×１０６個の配列が与えられる。
【００９５】
表７はＣＭＴＩライブラリのＤＮＡ配列を示す。残基Ｆ−５および残基Ｙ−４は受容ファージ設計の元となったＭ１３ｍｐ１８のシグナル配列中の残基１４および残基１５に対応する。シグナルペプチダーゼＩ（ＳＰ−Ｉ）による開裂はＡ−１とＲ１の間に起きると推定される。１００〜１１３で指定される残基はＣＭＴＩ異形体と残基Ａ２０１から始まる成熟ＩＩＩの間でのリンカーとなる。アミノ酸配列Ｙ１０４ＩＥＧＲＩＶはリンカーがＲ１０８とＩ１０９の間でウシ第Ｘａ因子により特異的に切断されることを許容しなくてはならない。このライブラリを構築するＭ１３関連ファージはアンピシリン耐性遺伝子（ＡｐＲ）を保有しているため、ライブラリ・ファージに感染した細胞はＡｐ耐性になる。各可変アミノ酸位置で、野生型アミノ酸残基を下線で示した。表７に示したアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と表される。それらの配列中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸１〜２９はＣＭＴＩ由来ポリペプチド類似体を表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド１６〜１０２はＣＭＴＩ由来ポリペプチドをコードする。
【００９６】
ｐＨ５選別手順から得た分離物はｐＨ２選別物よりも大きい配列多様性を示した（表８）。配列多様性がより大きいにもかかわらず、ｐＨ５選別物は近縁タンパク質配列を含んでいた。各位置で観察されるアミノ酸タイプの全ての組合せを作ると、元の個体数の０．１５％の１３，４００（＝２×４×３×４×７×５×４）通りにしかならない。決定した２０個の配列中に１回以上現れた配列は４個あり、これは実際の多様度が１３，４００よりも低いことを示唆する。ｐＨ５選別配列のファミリーはｐＨ２選別ファミリーとはっきりと関連性があるが、これら２つの配列集団で配列が同一だった例は１つしかなかった。
【表１１】
【００９７】
位置６および位置７で、許容されるアミノ酸タイプのほとんど（１５個のうち１２個）がｐＨ２選別物中では拒絶された。選別した配列にとり、位置６および位置７で選ばれたアミノ酸が結合に寄与したのか、単にこれらの位置では許容できないものが排除されたことを表すだけなのかは明らかではない。
【００９８】
選別工程の強力な収束は、多くのアミノ酸タイプが生じる可能性があるのに１種類のアミノ酸タイプしか見つからなかった位置２、位置４、位置８でのｐＨ２選別物について特に顕著である。これは、この特定のアミノ酸が結合にとって決定的であるという強い示唆である。これらの位置のそれぞれで、ただ１つ選ばれたｐＨ２群のタイプはｐＨ５群中のその位置でももっとも普通のタイプであった。ｐＨ２プールの各位置で全ての観察されたアミノ酸タイプを許容しても、最初の個体数の０．０００４％に過ぎない３６個の配列しか得られない。１回以上現れた数個の配列は、ｐＨ２プール中に存在する異なる配列の数が３６よりも多くないことを示唆する。
【００９９】
表９は配列決定したＣＭＴＩ−Ｉの類似体３８個に対する多様化領域（アミノ酸位置１〜１２）のアミノ酸配列を示す。変更が指示されていない位置（位置１１）でのメチオニン残基の出現はライブラリの形成におけるＤＮＡ合成の間違いを示す。
【表１２】
【０１００】
表９では、ｐＨ５での溶出によって１０１〜１２０と名付けた配列を有する類似体が得られ、ｐＨ２での分画によって２２１〜２３８と名付けた配列を有する類似体が得られた。
他の固定化タンパク質に対する親和性を決定することによってファージ−結合リガンド候補の特異性を試験した。ファージ−結合タンパク質は、ビーズに結合した関連ヒト血清タンパク質分解酵素、プラスミンおよびトロンビンに対して親和性を示さなかった（データ示さず）。また、ファージ分離株について実験を行い、固定化ｔＰＡに対する相対親和性とそれからの放出特性を決定した。
【０１０１】
ｐＨ５放出ファージ分離株の場合、大部分のファージはｐＨ５で放出され、さらにｐＨを２に下げることによって１桁少ない量が放出される。これはｐＨを５に下げると比較的きれいに放出する好適なアフィニティ・リガンドであることを示す。ｐＨ２放出分離物の場合、分離株Ｎｏ．２３２のみがｐＨ５では真に選択的に結合しており、それからｐＨ２で放出された。
【０１０２】
リガンドの合成と固定化
次に、ファージ分離株のＤＮＡから決定した配列情報を使用して遊離ＣＭＴＩ由来ポリペプチドを合成した。ＣＭＴＩ誘導体（類似体）は容易に化学合成できるが、このポリペプチドを酵母中で発現させることにした。Pichia pastoris中で発現させるため、ｐＨ５放出分離株の１つ、Ｎｏ．１０９（表９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２と提示）と、ｐＨ２放出分離物の１つ、Ｎｏ．２３２（表９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５と提示）とを選択した。４および８の位置では、分離株Ｎｏ．１０９はｐＨ２選別物に見られるものと同じアミノ酸タイプであり、２の位置では、分離株Ｎｏ．１０９はｐＨ２選別物とは異なっている。
【０１０３】
適当な遺伝子構築体を合成し、Pichia pastoris発現系（Vedvickら、1991年およびWagnerら、1992年）に挿入して産生株を作成した。各株について５リットル発酵を行わせた結果、高濃度で発現された。タンパク質は１ｇ／Ｌより多く発酵ブロス中に分泌された。粗製発酵懸濁液を遠心と０．２μｍ精密ろ過によって清澄化した。この０．２μｍろ液を３０ｋＤａＮＭＷＬカットオフのＰＴＴＫカセットを使用する限外ろ過法によって精製した。リガンドはMacro-Prep High S陽イオン交換用担体（BioRad社）による陽イオン交換クロマトグラフィによって限外ろ過液から精製し、次いで逆相分離を２段階行った。この逆相分離には０．１％ＴＦＡを含む水で開始し、アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）を９０分間で５０％まで上昇させる直線グラジエントを使用した。この結果得られたタンパク質は、５μｍ逆相カラム上のＰＤＡ分光分析によって測定したところ、９５％以上の純度であった。
【０１０４】
使用説明書に従って、このリガンド候補をジアミノプロピルアミド（Emphaze UltralinkＴＭ、Pierce Chemical社）を固定したビス−アクリルアミド／アズラクトン共重合体担体に固定した。ＣＭＴＩ類似体Ｎｏ．１０９約３０ｍｇが活性化クロマトグラフィ用担体１ｍＬに結合した。
【０１０５】
カラムの試験
ウォーターズのＡＰミニカラム、公称寸法５．０ｃｍ×内径０．５ｃｍに流量アダプタを取り付けて変更を加え、カラム長を２．５ｃｍに短くすることができた。推奨のプロトコルを使用してこのカラムにＮｏ．１０９Emphaze UltralinkＴＭビーズを充填し、洗浄液のＮａＣｌ濃度を１Ｍまで徐々に上げながらｐＨ７で洗浄した。
【０１０６】
Ｎｏ．１０９アフィニティ・カラムの最初の試験では、製品仕様書に従ってCalBiochemから入手した組織型プラスミノーゲン活性化因子をｔＰＡ１ｍｇ／ｍＬ溶液に調製した。凝集標準液（Sigma Diagnostics社の凝集対照レベル１、カタログNo.C-7916）凍結乾燥ヒト・プラズマを使用説明書に従って再構成した後、１０倍希釈してｔＰＡを添加した。この試料をカラムに負荷し溶出するのは全緩衝液中に１Ｍ ＮａＣｌが存在する状態で行ったが、この条件ではカラムへのタンパク質の非特異的結合が十分に抑制され、ｐＨ制御されたｔＰＡの結合および放出が可能であった。明瞭なピークが２本あった。１本目は（カラムに保持されなかった）血清タンパク質を含み、ｐＨを下げた後に得られた２本目はｔＰＡを含んでいて、血清成分はまったく混入していなかった。結果を銀染色ゲル（示さず）によって確認した。ｔＰＡ製品の９０％が回収された。
【０１０７】
ＥＡＨセファロース４ＢＴＭアガロース・ビーズ（ファルマシア、スウェーデン国ウプサラ）をクロマトグラフィ用担体に用いてＮｏ．１０９ＣＭＴＩ類似体を使用したアフィニティ・カラムを作成した。分離はウォーターズ（マサチューセッツ州ミルフォード）製のＨＰＬＣシステムで行った。システムの構成は、モデル７１８自動注入装置、送液能力毎分２０ｍＬのポンプ・ヘッド付きモデル６００送液システム、モデル９９６フォトダイオード・アレイ検出器であった。装置は全て製品仕様書に従って設置した。システムはデル社提供のペンティアム（登録商標）１３３ＩＢＭ互換コンピュータによって制御した。このコンピュータは１ギガバイトのハードディスク・ドライブ、１６メガバイトのＲＡＭ、カラーモニタを装備し、ウォーターズ提供のソフト「ミレニアム」をロードした。
【０１０８】
２００ｎｍから３００ｎｍの範囲のスペクトル・データを分解能１．２ｎｍで収集した。第１図、第２図、第３図、第４図は２８０ｎｍで収集した。このクロマトグラフィ作業の移動相は緩衝液Ａと緩衝液Ｂであった。緩衝液Ａの組成は２５ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭアルギニン、１２５ｍＭ ＮａＣｌで、水酸化カリウムでｐＨ７の緩衝液とした。緩衝液Ｂの組成は５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌで、リン酸でｐＨ３の緩衝液とした。どの場合でも、１００％の緩衝液Ａ中に試料を注入した後、ｔ＝０からｔ＝２分まで１００％の緩衝液Ａで洗浄した。ｔ＝２からｔ＝８分までは１００％の緩衝液Ｂで溶出した。ｔ＝８分以降は１００％の緩衝液Ａで溶出した。このＨＰＬＣシステムの勾配遅延体積はおよそ４ｍＬ、流速は毎分０．５ｍＬであった。
【０１０９】
別の販売元から入手したｔＰＡを製品仕様書に従って１ｍｇ／ｍＬ溶液とした。凝集標準液（Sigma Diagnostics社の凝集対照レベル１、カタログNo.C-7916）、凍結乾燥ヒト・プラズマを使用説明書に従って再構成した。この溶液を１０：１で希釈して吸光度がｔＰＡ溶液のおおよそ１０倍の溶液を得た。
【０１１０】
第１図に示した試験では、純ｔＰＡの試料（１ｍｇ／ｍＬのｔＰＡを２５μＬ）をＮｏ．１０９ＣＭＴＩ誘導体含有カラムにかけ、上記のように溶出した。クロマトグラムは１５分後の約９０％ｔＰＡ物質の切れのよい溶出を示した。第２図に示した試験では、凝集標準液の試料（１０倍希釈）を上記の溶出条件でＮｏ．１０９ＣＭＴＩ誘導体含有カラムにかけた。ほぼ全ての物質がカラムから速やかに溶出した（保持されなかった）。第３図および第４図に示した試験では、ヒト血漿標準液に添加したｔＰＡをカラムに負荷し、上記のように溶出を行った。第３図および第４図から分かるようにｔＰＡは保持され、血漿タンパク質は空隙（ボイド）体積で溶出した。結合したｔＰＡは約１５．４分に放出された。ｔＰＡは約ｐＨ４で放出されたと推定された。ｔＰＡのピークを集め、銀染色、還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて試験を行い、出発材料と比較したとき純度＞９５％であることが分かった。
【０１１１】
実施例１７
ｔＰＡに同様に結合するドメインの候補をさらに設計するため、ＣＭＴＩライブラリから分離したｔＰＡアフィニティ・リガンドをさらに試験した。
上で言及したように、ＣＭＴＩライブラリの構築に使用したアミノ酸のほとんど全ての変化はＣＭＴＩ−Ｉの３および１０の位置にある２個のシステインの間に生じた（表３参照）。親ＣＭＴＩタンパク質では、これらのシステインはそのタンパク質の他の場所にある他のシステイン残基とジスルフィド結合を形成するが（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１参照）。しかしＣＭＴＩライブラリからアフィニティ・リガンドを分離することに成功すると、分離物Ｎｏ．１０９の端を切り取った１５アミノ酸断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸１〜１５参照）に基づく第二のライブラリを概念化した。これらの構成要員のＣ３システインおよびＣ１０システインがジスルフィド結合を形成した場合、ｔＰＡ結合特性を有する束縛ループが得られる可能性がある。クロマトグラフィ用担体に結合したアフィニティ・リガンド分離物Ｎｏ．１０９由来の１５アミノ酸断片についての初期の研究から、Ｃ３−Ｃ１０ループが形成され、固定化ループがｔＰＡと結合したことが示された。
【０１１２】
上記の実験は、本発明による２つの新しい分離されたｔＰＡアフィニティ・リガンドファミリーを示し、このファミリーは次の配列を含むポリペプチドを含む。
Ａｒｇ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ−Ｘ８−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）および
Ａｒｇ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ−Ｘ８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）
ここで、Ｘ１はＴｒｐまたはＬｅｕ、Ｘ２はＰｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＩｌｅ、Ｘ３はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｈｒ、Ｘ４はＳｅｒ、Ｔｙｒ、ＴｈｒまたはＡｌａ、Ｘ５はＳｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＴｈｒ、Ｘ６はＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＬｙｓ、Ｘ７はＧｌｕ、ＧｌｙまたはＡｒｇ、Ｘ８は少なくともＬｙｓまたはＭｅｔである。配列中の位置１１のＭｅｔの存在は予定外であったがｔＰＡへの結合に好適であることが分かり、位置１１を他のアミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐなどの他の非極性アミノ酸で置換するとさらにｔＰＡ結合類似体を提供する可能性が高い。
【０１１３】
実施例１８
この実施例は標的ヒト化単クローン抗体の清澄化ヤギ乳汁からの分離に有用なアフィニティ・リガンドの分離を説明する。
ＩｇＧアイソタイプで特異性未知の標的精製ヒト化単クローン抗体が生産者から供給され、５０μＬＰＢＳ中に５００μｇずつ分けて−７０℃で保存した。ポリクローン・ヤギＩｇＧはCappelから購入した。
ＰＢＳで１００μＬにした種々の量（即ち１μｇ、５００μｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇおよび０μｇ）のヒト化単クローン抗体（ｈＭＡｂ）を各々Immulon２プレートの３ウェルに加え、４℃で終夜インキュベーションを行った。このウェルを０．１％非イオン性洗浄剤（Tween２０）を含むＰＢＳ２００μＬで３回洗浄した後、１ウェルにつき１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬで４℃、１時間ブロックした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（CalBiochem）を用いてプレートを試験し、ＯＰＤ基質溶液（SigmaFastNo.9187、Sigma Chemical社）で発色させ、４Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を止めて、Bio-Tekマイクロタイタ・プレート・リーダーでＡ４９０読み取りを行った。
【０１１４】
スクリーニングのため、競合結合剤としてポリクローン・ヤギＩｇＧを使用した。このスクリーニングを３個のファージ提示ライブラリ、即ちＣＭＴＩ、ＴＮ−６／Ｉ、ＴＮ−１０／Ｖを用いて行った。ＣＭＴＩの構造は上に示した（表７）。ＴＮ−６／ＩおよびＴＮ−１０／Ｖのペプチド構造は下に示した（それぞれ表１０および表１１）。以下の表に多様化された、ファージ提示ポリペプチド・ドメインがコードするアミノ酸を示す。ポリペプチドをコードするＤＮＡをＣＭＴＩライブラリに関して上に記載したのと同様にしてＭ１３遺伝子ｉｉｉに挿入した。
【表１３】
このライブラリ設計により８．５５×１０６個のタンパク質配列と１７×１０６個のＤＮＡ配列が与えられる。
【表１４】
このライブラリ設計により８．２×１０８個のタンパク質配列と１．１×１０９個のＤＮＡ配列が与えられる。
【０１１５】
４回のスクリーニングを完了した。結合スクリーニングはｐＨを中性とし、競合結合剤として結合溶液中におよそ１％多クローン・ヤギＩｇＧを含む８０ｍＭ ＮａＣｌを入れて行った。溶出はｐＨを変えることによって行った。
全ての回で共通の結合条件は、１／２倍ＰＢＳ（１／２濃度のＰＢＳ）、０．１％ＢＳＡ、１％ヤギＩｇＧ中での室温（ＲＴ）で２時間のインキュベーションであった。各回の洗浄条件と溶出条件を表１２にまとめた。
【表１５】
【０１１６】
各回後に、溶出されたファージ数を計測した後、形質導入によって増幅した。ｐＨ２の溶出液とｐＨ５の溶出液は、２回目後に別々に増幅し、その後のスクリーニングの間も分けておいたので、ｐＨ２の溶出液ではｐＨ５では放出しない候補が選別された。下の表１３は、ｐＨ２でのＴＮ−６／Ｉ、ｐＨ２でのＴＮ−１０／Ｖ、ｐＨ２でのＣＭＴＩ、ｐＨ５でのＣＭＴＩでは、４回にわたるスクリーニングで収束することを示す。
【表１６】
【０１１７】
４回の収束スクリーニングの各回から、およそ１２個のファージ分離物が予備配列決定用に選別された。ＴＮ−１０／Ｖ以外の全ての分離物で選別物間の有意な相同性が見られた。例えば、配列決定用に選別した１２個のＣＭＴＩ ｐＨ５分離物は最終的に３個のＤＮＡ配列と２個のアミノ酸配列になってしまった。で配列決定した選別物から１６個の候補を選び、相対結合親和性、特異性、ｐＨ２での放出試験で標的ｈＭＡｂに対するファージ−結合タンパク質のｐＨ放出特性を決定した。この試験の構成は、標的ｈＭＡｂ、多クローン・ヤギＩｇＧ、ＢＳＡのマイクロタイタ・プレートへの固定化後、5 Prime→3 Prime社（米国コロラド州ボールダー）のビオチニル化ヒツジ抗Ｍ１３抗体ＥＬＩＳＡキットを用いてファージの相対結合度を測定する操作を含む。
試験したファージ分離物の名称は
・ＴＮ−６／Ｉ、ｐＨ２放出から：Ｔ４１、Ｔ４２、Ｔ４８、Ｔ４９、Ｔ５２
・ＴＮ−１０／Ｖ、ｐＨ２放出から：Ｔ６１、Ｔ６４、Ｔ６６、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｔ７４、Ｔ７５
・ＣＭＴＩ、ｐＨ５放出から：Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３
・ＣＭＴＩ、ｐＨ２放出から：Ｃ３
であった。
【０１１８】
個々の分離ファージは固定化ｈＭＡｂ、ヤギＩｇＧ、ＢＳＡへの結合について試験した。あわせて親ファージ対照のｈＭＡｂ、ヤギＩｇＧ、ＢＳＡ、抗Ｍ１３抗体への結合も試験した。ｈＭＡｂ、ヤギＩｇＧ、ＢＳＡへの結合は、１／２倍ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ溶液中に０．５％ヤギＩｇＧが存在する状態で、ｐＨ７およびｐＨ２の−２通りのｐＨ条件下で行った。ストレプトアビジン複合アルカリホスファターゼを使用してビオチニル化検出抗Ｍ１３抗体を視覚化した。マイクロタイタ・プレートは、Bio-Tekマイクロタイタ・プレート・リーダーにより４０５ｎｍで読み取りを行った。その結果を第５図、第６図、第７図に示す。これらのファージのうち「ＣＭＴＩ」、［ＭＡＥＸ］、「ＭＫＴＮ」は「親」結合ドメイン候補を提示する対照ファージである。即ちＣＭＴＩ対照は野生ＣＭＴＩ−Ｉ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を持ち、ＭＡＥＸはＴＮ−６／Ｉライブラリから無作為に選ばれた非結合性メンバーで、ＭＫＴＮはＴＮ−１０／Ｖライブラリから無作為に選ばれた非結合性メンバーである。可能アフィニティ・リガンドの同定は、（１）標的ｈＭＡｂに対して対照ファージより有意に高い結合親和性を持つこと、（２）溶出条件（ｐＨ２）よりも結合条件（ｐＨ７）下で標的に対して有意に高い結合親和性を持つこと、（３）ヤギＩｇＧへの結合がほとんどないか、全くないことを指標に行った。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡの結果から、Ｃ３，Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３（Ｃ２２と同じアミノ酸配列）、Ｔ４２、Ｔ４９、Ｔ５２の７個の（６個の結合ポリペプチドをコードする）ＤＮＡ分離物がアフィニティ・リガンドとして使用するのに適していた。ＣＭＴＩ−Ｉ ｐＨ５分離物およびＴＮ−６／Ｉ ｐＨ２分離物における多様性の低下を下の表１４、表１５に示す。
【表１７】
【表１８】
【０１２０】
ＣＭＴＩ類似体中のいろいろななアミノ酸位置５、６、７、９およびＴＮ−６／Ｉ類似体中のいろいろなアミノ酸位置４、６、７、９、１０でのアミノ酸タイプが単一であることから、これらのライブラリ由来のコンセンサス・ペプチドの収束が強力であることが示される。これらの類似体運搬ファージを増幅し、コードされる挿入ＤＮＡを分離、配列決定すると、ｈＭＡｂ精製用の特異的アフィニティ・リガンド候補が明らかになる。
【０１２１】
実施例１９
この実施例は、天然ウロキナーゼの分離に有用なアフィニティ・リガンドの分離を説明する。
分子量が大きい人尿由来のウロキナーゼをMarklandら（1996年）記載の方法で４℃でReactiGelＴＭアガロース・ビーズ（Pierce Chemical社）に固定した。
【０１２２】
スクリーニングは、ＣＭＴＩ、ＴＮ−６／Ｉ、ＴＮ−１０／ＶＩＩＩａ、ＬＡＣＩ／Ｆの４個のファージ提示ライブラリを用いて行った。ＣＭＴＩの構築は 前に（表７）示した。ＴＮ−６／Ｉの構築は前に示した（表１０）。ＴＮ−１０／ＶＩＩＩａおよびＬＡＣＩ／Ｆのペプチド構築は下に示す（それぞれ表１６および表１７）。下表に、多様化ファージ提示ポリペプチド・ドメインがコードするアミノ酸を示す。ＣＭＴＩライブラリに関して上に記載したように（実施例１６、表７）、このポリペプチドをコードするＤＮＡを遺伝子ＩＩＩに挿入した。
【表１９】
このライブラリ設計により２．３×１０７個のタンパク質配列と１．３×１０８個のＤＮＡ配列が与えられる。
【表２０】
【表２１】
このライブラリ設計により３．１２×１０４個のタンパク質配列が与えられる。
【０１２３】
スクリーニングの前に、固定化ウロキナーゼ・アガロース・ビーズをそれぞれ親結合ドメイン・ポリペプチドを提示する純粋クローンファージ調製物で試験して、スクリーニング条件下では回収されるファージは低いバックグラウンド・レベルにあることを確認した。親ポリペプチドの各々について、回収されたファージの投入ファージに対する割合は１×１０−５以下であり、十分に低いバックグラウンド・レベルの結合であった。
【０１２４】
スクリーニングは４回行った。各回の構成は、結合段階、洗浄処理、１段階以上の溶出段階であった。全回共通の結合条件は、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Tween８０中での４℃、２０時間のインキュベーションであった。各回の洗浄条件および溶出条件を表１８にまとめた。
【表２２】
【０１２５】
各回後に、溶出されたファージ数を計測した後、形質導入によって増幅した。
ｐＨ２の溶出液とｐＨ５の溶出液は、２回目後に別々に増幅し、その後のスクリーニングの間も分けておいたので、ｐＨ２の溶出液ではｐＨ５では放出しない候補が選別された。下の表１８は、各ライブラリが４回にわたるスクリーニングで収束することを示す。
【表２３】
【０１２６】
収束性スクリーニングは回数を重ねると投入分に対する割合が大きくなるスクリーニングであり、これはファージ・ライブラリの多様性が小さくなっていることを示している。これは固定化標的分子に対するリガンド候補が集団から選別されているかもしれないことを示すので、望ましい結果である。上表は、全てのライブラリで２回目と４回目との間にいくらか収束があることを示している。もっともはっきりした結果はＴＮ−６／Ｉ（ｐＨ２）およびＣＭＴＩ（ｐＨ５）の場合である。
【０１２７】
４回の収束スクリーニングの各回から、およそ１２個のファージ分離物を配列決定用に選んだ。配列決定を行った全ての分離物において相互の相同性がいくらか見られた。最大の相同性はＴＮ−６／Ｉの配列間およびＣＭＴＩの配列間に見られ、スクリーニング中、これらのライブラリの濃縮がもっとも大きかったという知見と一致している。例えば、ＴＮ−６／Ｉ分離物のうち９個が同一のＤＮＡおよびアミノ酸配列を有することが分かった。
【０１２８】
候補を選んで、相対結合親和性、特異性、ｐＨ２での放出試験によるファージ−結合タンパク質のｐＨ放出特性の特性決定を行った。この試験の構成には、ウロキナーゼおよびＢＳＡのImmulon 2マイクロタイタ・プレートへの固定化と、5 Prime→3 Prime社（米国コロラド州ボールダー）のビオチニル化ヒツジ抗Ｍ１３抗体ＥＬＩＳＡキットを用いたファージの相対結合度を測定する操作が含まれる。
試験したファージ分離物の名称は
・ＴＮ−６／Ｉ、ｐＨ２放出から：ＴＵ３３、ＴＵ３４、ＴＵ３６、ＴＵ３７、ＴＵ３９、ＴＵ４２
・ＴＮ−１０／ＶＩＩＩａ、ｐＨ２放出から：ＴＵ５０、ＴＵ５１、ＴＵ５３、ＴＵ５４、ＴＵ５５、ＴＵ５６、ＴＵ５７、ＴＵ５８、ＴＵ６０、ＴＵ６２、ＴＵ６３
・ＣＭＴＩ、ｐＨ５放出から：ＣＵ２２、ＣＵ２５、ＣＵ２７、ＣＵ２８、ＣＵ２９、ＣＵ３１、ＣＵ３２
・ＬＡＣＩ／Ｆ、ｐＨ２放出から：ＬＵ２、ＬＵ４、ＬＵ５，ＬＵ９、ＬＵ１０、ＬＵ１２
であった。
【０１２９】
個々の分離ファージの固定化ウロキナーゼまたはＢＳＡへの結合を試験した。ウロキナーゼはｔＰＡに対する配列の相同性が高いので、ｔＰＡ結合についても候補を試験した。その結果を第８図、第９図、第１０図、第１１図に示す。可能アフィニティ・リガンドは、（１）標的ウロキナーゼに対して対照ファージより有意に高い結合親和性を持つこと、（２）溶出条件（ｐＨ２）よりも結合条件（ｐＨ７）下で標的に対して有意に高い結合親和性を持つこと、（３）ＢＳＡへの結合がほとんどないか、全くないことを指標として同定された。
【０１３０】
ＥＬＩＳＡの結果から、ＴＵ３３，ＴＵ３６、ＴＵ３９、ＴＵ４２、ＴＵ５３、ＴＵ５６、ＴＵ５８の７個のＤＮＡ分離物（４個はＴＮ−６／Ｉから、３個はＴＮ−１０／ＶＩＩＩａから）がアフィニティ・リガンドとして使用するのに適していた。７個の分離物全てがｐＨ７でウロキナーゼに対する高い親和性を示し、ｐＨ２で低い親和性を示した。ＣＭＴＩライブラリとＬＡＣＩ／Ｆライブラリのどちらからもウロキナーゼに対する親和性が親提示ファージよりも高いリガンド候補は発見されなかった。ＣＭＴＩ−Ｉ ｐＨ５分離物間およびＴＮ−６／Ｉ ｐＨ２分離物間の多様性の低下を下の表２１、表２２に示す。
【表２４】
【表２５】
【０１３１】
ＴＮ−６／Ｉ類似体中の様々なアミノ酸位置７、８、１１でのアミノ酸タイプが単一であること、およびＴＮ−１０／ＶＩＩＩａ類似体中の様々なアミノ酸位置７、９、１１、１４でのアミノ酸の多様性の急激な低下から、これらのライブラリ由来のコンセンサス・ペプチドの収束が強力であることが示される。これらの類似体を担うファージを増幅し、コードされる挿入ＤＮＡを分離、配列決定すると、ウロキナーゼ精製用の特異的アフィニティ・リガンド候補が明らかになる。
【０１３２】
上記の記載に従うと、あらゆる供給流から標的を分離するために重要な特性を、設計されたライブラリの結合ドメインに組み込むことが可能であり、そのため、本発明の方法によると所望の結合条件と放出条件下で標的を分離するのに有用な数個のアフィニティ・リガンド候補が必ず得られる。標的製品の失活や破壊なしに、高い純度で、近縁の不純物までも除去して、容認できるコストで、材料を再使用、再生利用して、標的の高い収率を達成するという全てが本発明によると可能である。本発明のさらなる実施形態および特定の標的にあわせた別法は以上の記載を研究すれば明らかとなろう。かような実施形態及び別法はすべて以下の請求の範囲によって定義した本発明の範囲内であるとする。
【０１３３】
［参考文献］
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Kunitz-type protease inhibitor domain of protease Nexin-2/amyloid β-
protein precursor」, Biochem. Biphys. Res. Comm., 186: 1138-1145（1992年）
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子精製の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は特定の標的生体分子用アフィニティ・リガンドの発見と分離に関する。かかるアフィニティ・リガンドは、所望の分離条件下で標的生体分子を精製するのに有用である。
発明の背景
【０００２】
タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、脂質、核酸など、医学上あるいは工学的に重要な生体分子の製造法は多岐にわたり、それには化学合成法、自然発生または組換え形質転換した細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞などにより培地中に放出させる方法、培養細胞（例えば封入小体等）への蓄積、遺伝子組換え生物体から（例えばトランスジェニック哺乳動物の乳汁中に）分泌させる方法、尿、血液、乳汁、植物浸出液、真菌抽出物などの生体材料から回収する方法等が含まれる。しかし、こうして製造した生体分子がそのまま有用であることは稀で、製造に用いた溶液中の他の成分（即ち不純物）から分離したり、その溶液に占める割合がずっと高くなるように生体分子を濃縮したりする必要がある。
【０００３】
クロマトグラフィは、生体分子標的の大量分離に使用する主流の精製・濃縮技術である。正しく組まれた一連のクロマトグラフィ段階によると、無機塩をはじめ、折りたたみ方が不正確であったり一部が分解した形の標的巨大分子それ自体に至るまで、広範囲の夾雑物が混入した複雑な混合物から生体分子の単一成分を分離することができる。同時に、クロマトグラフィによる精製が生体分子製品の製造原価に占める割合は大きい（単独トップであることも珍しくない）。代表的な生物療法の精製では、２ないし６段階以上のクロマトグラフィを要し、各段階でサイズ排除法、イオン交換法、疎水相互作用法、アフィニティ・クロマトグラフ法などが利用される。
【０００４】
サイズ排除法は緩衝液の交換に、あるいは凝集質を取り除くために、最終段階として使用することが多い。イオン交換法と疎水相互作用法は製品を濃縮し不純物の大半を取り除くのに有用であるが、これらのクロマトグラフィはいずれもアフィニティ・クロマトグラフィの使用により達成される劇的な純度上昇に迫ることができない。例えばNarayanan（1994年）は、アフィニティ・クロマトグラフィの一段精製によって純度が３０００倍上昇したことを報告している。
【０００５】
しかし、アフィニティ・クロマトグラフィの技術を生体分子の大量産生に使用することは一般的ではない。理想的なアフィニティ・クロマトグラフィ・リガンドの必須条件は、容認できるコストで（１）標的生体分子捕捉の親和性が高く、容量が大きく、特異性が高く、選択性が高いこと、（２）他の分子種（不純物）を捕捉しないか、あるいは分別溶出が可能であること、（３）標的の保存条件（即ち分解・変性しない条件）下で放出の制御が可能であること、（４）クロマトグラフィ・マトリクスの殺菌、再使用が可能であること、（５）あらゆる病原体を除去あるいは不活化できることなどである。しかしながら、コストが容認できる高親和性リガンドで医薬品製造に要求される洗浄・殺菌プロトコルに耐えるものを見つけ出すのは困難であることが判明した（Knight、1990年参照）。
【０００６】
理想からは遠いが、染料（シバクロンブルー等）や親和性既知のタンパク質（プロテインＡ等）がアフィニティ・クロマトグラフィに広範に用いられてきた。しかし、これらの材料は新規の標的に適用できないため柔軟性に欠け、使用範囲を広げることができない。
マウス単クローン抗体（ＭＡｂ）もアフィニティ・リガンドとして使用される。ＭＡｂは作成が容易であり、新規標的分子に特異的な新規ＭＡｂリガンドが得られるので、ＭＡｂ技術は特定の製造業者の個別的要求を満たすに足る、ある程度の柔軟性を有する。その一方で、単クローン抗体はアフィニティ・クロマトグラフィ分野での欠点が無いわけではない。ＭＡｂは製造費が高価であり、また、生体分子の精製に伴う洗浄、殺菌処理手順中に脱離、分解する傾向があることから、それに基づくアフィニティ・マトリクスの失活が速くなる（Narayanan 、1994年、Boschett、1994年参照）。しかも、ＭＡｂは標的に対して特異性を高くすることができるが、その特異性は標的と近縁の不純物を捕捉しないようにするには不十分であることが多い。さらに、ＭＡｂの結合特性は免疫した動物の免疫グロブリン・レパートリによって決定されるため、実行者はその動物の免疫系によって付与された結合特性に甘んずる他はなく、即ちＭＡｂ技術を使用するだけでは特定の結合や溶出特性を最適化、選択する余地がほとんどない。最後に、ＭＡｂの結合部位１つ当たりの分子量（２５ｋＤａ〜７５ｋＤａ）、さらにはＭＡｂフラグメントであっても分子量が極めて大きい。
【０００７】
このように、従来よりも高価でなく、もっと役に立ち、さらにぴったり合う特定生体分子標的用アフィニティ・リガンドを開発することが継続的に求められている。特に、上記の理想的なアフィニティ・リガンドの特性にさらに近く、所与の標的分子と高い親和性で結合するばかりか標的を所望の、あるいは選択した条件下で放出し、標的と標的が存在する溶液中の他成分とを識別することができ、洗浄、殺菌処理手順に耐えて再生、再使用可能なクロマトグラフィ・マトリクスを提供するアフィニティ・リガンドに対する需要がある。
かかるアフィニティ・リガンドと、それを得る方法とを本明細書中に提供する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、対象とする特定の生体分子標的用であって、所望の、あるいは選択した結合特性および放出特性を示すアフィニティ・リガンドを得る方法を提供する。そのもっとも広い態様では、本発明は、ほぼすべての標的分子についてそれを含む溶液から分離するのに有用なアフィニティ・リガンドであって、アフィニティ・クロマトグラフィに有利な結合特性だけでなく所望の放出（溶出）特性と、安定性、分解耐性、耐久性、再使用性、製造しやすさ等、他の所望の特性とを示すように設計したリガンドを得る方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は特異的不純物（または近縁グループの不純物）を極めて高い親和性で結合して標的を含む溶液からその（あるいはそれらの）不純物のほぼすべてを取り除くアフィニティ・リガンドを得る方法をも提供する。この場合、無傷で不純物を放出することは（標的の精製に関しては）重要ではないが、もしリガンドを含むアフィニティ・マトリクスを再生、再使用できれば経済的に有利である。
また、本発明は第一特定溶液セットの条件下で特定の標的と結合し、第二特定溶液セットの条件下でその標的を放出する能力のあるアフィニティ・リガンドを分離する方法をも提供する。
【００１０】
このように、本発明は標的分子を含む溶液から標的分子を変性させないで分離するのに適したアフィニティ・リガンドを分離する方法であって、
（ａ）標的分子に関して、アフィニティ・リガンドが前記標的分子と結合することが望まれる第一溶液条件（即ち結合条件）を選択する段階と、
（ｂ）標的分子に関して、前記標的分子と前記アフィニティ・リガンドとのアフィニティ複合体が解離する第二溶液条件（即ち結合条件）を選択する段階であって、前記第二溶液が前記第一溶液と異なる段階と、
（ｃ）前記第一溶液条件および第二溶液条件下で安定な前記標的分子用ポリペプチド結合ドメイン候補を選択する段階と、
（ｄ）前記ポリペプチド結合ドメイン候補中のアミノ酸位置（好ましくはドメイン表面上の位置、もっとも好ましくはドメイン中で互いに近接した位置）を変更可能な位置として選択する段階と、
（ｅ）前記結合ドメイン候補を提供する段階であって、選択した１個以上の変更可能なアミノ酸の位置における異なるアミノ酸の置換において各類似体が前記結合ドメイン候補と異なる段階と、
（ｆ）前記類似体ライブラリを第一溶液条件で前記標的分子を含む溶液と類似体／標的結合複合体を形成するのに十分な時間接触させる段階と、
（ｇ）第一溶液条件下で結合しなかった類似体を除去する段階と、
（ｈ）接触段階（ｆ）の溶液条件を第二溶液条件に変更する段階と、
（ｉ）第二溶液条件下で放出される結合類似体候補を回収する段階であって、回収した類似体が分離アフィニティ・リガンドを同定する段階と
を含む方法に関する。
【００１１】
ある状況、例えば標的分子の性質が実行者によく分からないか未知であったり、標的の精製に係わる特徴（標的を産生した溶液の量、溶液中の残留不純物の性質、標的の生物学的活性、標的の産生源等）のため、標的分子が常に安定な溶液条件の範囲に関して不確かさが残る場合では、標的分子を含む溶液から標的分子を分離するのに適したアフィニティ・リガンドを得るための本発明による好ましい方法は
（ａ’）温度、ｐＨ、イオン強度、誘電率、溶質濃度（例えばカオトロピック試薬濃度、有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、アセトン、メチルエチルケトン等）濃度）、金属イオン（例えばＺｎ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋）やキレート剤（例えばＥＤＴＡ）の有無から選択した複数のパラメータに関して標的分子が安定する範囲を確かめることによって前記標的分子の安定性範囲（エンベロープ）を画定する段階と、
（ａ）標的分子に関して、標的分子の安定性エンベロープの範囲内に所望の結合条件を選択する段階と、
（ｂ）標的分子に関して、標的分子の安定性エンベロープの範囲内に所望の放出条件を選択する段階であって、前記放出条件が少なくとも１個のパラメータに関して前記結合条件と異なる段階と、
（ｃ）前記結合条件下および放出条件下の両方で安定な前記標的分子のポリペプチド結合ドメイン候補を選択する段階と、
（ｄ）前記結合ドメイン候補の表面のアミノ酸位置を変更可能な位置として選択する段階と、
（ｅ）前記結合ドメイン候補の類似体ライブラリ（例えばポリペプチド結合ドメイン類似体の多彩なセットがバクテリオファージ表面に表示されるファージ表示ライブラリ）を提供する段階であって、段階（ｄ）で示した１個以上のアミノ酸位置における異なるアミノ酸の置換において各類似体が前記結合ドメイン候補と異なる段階と、
（ｆ）前記類似体ライブラリを第一溶液条件で前記標的分子を含む溶液と類似体／標的結合複合体を形成するのに十分な時間接触させる段階と、
（ｇ）第一溶液条件下で結合しなかった類似体を除去する段階と、
（ｈ）接触段階（ｆ）の溶液条件を第二溶液条件に変更する段階と、
（ｉ）放出条件下で放出される結合類似体候補を回収する段階であって、ここでは回収した類似体が単離されたアフィニティ・リガンドを確認する段階、
とを含む。
【００１２】
回収した類似体から、特性の組合せが最高の、タンパク質結合ドメインを選択することができる。あるいは、追加のライブラリからの選択をさらに一巡して行うこと（上記の段階（ｅ）〜（ｉ））によって、回収リガンド中に所望の特性を有するリガンドが多くなるようにすることができる。標的、標的の製造、標的の溶液からの分離に係わる因子に関する実行者の知識によれば、結合ドメイン候補の選択、変更可能なアミノ酸の指定、変更可能な位置で置換するアミノ酸の選択を、最終アフィニティ・リガンドで望ましい特性に寄与するようにできるであろう。あるいは、もし多彩な結合ドメイン・ライブラリ候補を予め調製してあれば、選択段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す必要がなく、実行者は結合および放出条件を選択する段階からライブラリおよび標的を接触させる段階へ直接移行することができる。
【００１３】
多数のアフィニティ結合ドメインが可能となり、その内いくつかが結合条件下で標的と結合し放出条件下で標的を放出するようにポリペプチド類似体ライブラリを作出することに類似タンパク質をバクテリオファージなどの遺伝子パッケージ表面に表示する技術を利用することは特に好ましい。かかる技術は米国特許第５２２３４０９号（Ladnerら）に公表され、参照により本明細書の一部とする。これらの強力な技術を使用することにより、構造が類似した多数（例えば１０７ ）のポリペプチドを本発明の方法に使用するため容易に製造することができる。
【００１４】
本発明によって調製したアフィニティ・リガンドは、特定の標的生体分子分離の目的に特にぴったり合うように調整される。このように、特性の釣合いが最適であり、標的結合のアフィニティ、標的特異性、特定条件下での標的放出、殺菌条件下での耐久性、その他選択したあらゆる所望の特性の点から、特定の標的の分離にほとんど理想的なアフィニティ・リガンドが本発明によって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】組織プラスミノーゲン活性化因子即ち「ｔＰＡ」（１ｍｇ／ｍＬ ｔＰＡ ２５μＬ）を固定化ｔＰＡアフィニティ・リガンド（ＣＭＴＩ誘導体Ｎｏ．１０９、実施例１６に記載）を有するアフィニティ・クロマトグラフィ・カラムにかけ、ｐＨ７〜ｐＨ３のグラジエント溶出を行ったときのクロマトグラムを示す。１５分のピークは注入したｔＰＡの約９０％を含むと概算される。
【図２】凝集標準液（１０倍希釈）をｔＰＡアフィニティ・カラム（ＣＭＴＩ誘導体Ｎｏ．１０９）にかけ、上記の溶出を行ったときのクロマトグラムを示す。１５．６分の小ピークはグラジエントの人為結果であることが分かった。
【図３】２５μＬのｔＰＡを加えた２５μＬの凝集標準液（１０倍希釈）からなる混合物についてｐＨ７〜ｐＨ３のグラジエント溶出を行ったときのクロマトグラムを示す。１分のピークは血漿タンパク質の集まりであり、１５．４分のピークはｔＰＡである。
【図４】第３図に示したクロマトグラムの縦軸の目盛を拡大したクロマトグラムを示す。
【図５】ＣＭＴＩファージ分離物Ｃ３、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３およびＴＮ−６／Ｉファージ分離物Ｔ４９（実施例１８、下記参照）のｐＨ７での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ２での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ７での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ２での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。このＥＬＩＳＡによると、ヤギ抗体を含む供給流から人体に適応させた抗体を分離するのに有用なアフィニティ・リガンドの確認がなされる。
【図６】ＴＮ−６／Ｉファージ分離物Ｔ４１、Ｔ４２、Ｔ４８、Ｔ５２、Ｔ７４（実施例１８、下記参照）のｐＨ７での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ２での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ７での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ２での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。このＥＬＩＳＡによると、ヤギ抗体を含む供給流からヒト化抗体を分離するのに有用なアフィニティ・リガンドの同定がなされる。
【図７】ＴＮ−１０／Ｖファージ分離物Ｔ６１、Ｔ６４、Ｔ６６、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｔ７５（実施例１８、下記参照）のｐＨ７での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ２での固定化ヒト単クローン抗体標的への結合、ｐＨ７での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ２での固定化ヤギＩｇＧへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図８】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＴＮ−６／Ｉファージ分離物、即ちＴＵ３３、ＴＵ３４、ＴＵ３６、ＴＵ３７、ＴＵ３９、ＴＵ４２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ２での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ７での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ２での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。このＥＬＩＳＡにより、尿などの供給流からウロキナーゼを分離するのに有用なアフィニティ・リガンドの確認がなされる。
【図９】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＴＮ−１０／ＶＩＩＩａ ファージ分離物のいくつか、即ちＴＵ５１、ＴＵ５３、ＴＵ５６、ＴＵ５８、ＴＵ６０、ＴＵ６２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ２での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ７での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ２での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。このＥＬＩＳＡによると、尿などの供給流からウロキナーゼを分離するのに有用であるアフィニティ・リガンドの同定がなされる。
【図１０Ａ】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＣＭＴＩファージ分離物のいくつか、即ちＣＵ２２、ＣＵ２９、ＣＵ３２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ２での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ７での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ２での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１０Ｂ】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＣＭＴＩファージ分離物のいくつか、即ちＣＵ２５、ＣＵ２７、ＣＵ２８、ＣＵ３１、ＣＵ３２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ２での固定化ウロキナーゼへの結合、ｐＨ７での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ２での固定化ｔＰＡへの結合、ｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合、およびｐＨ２での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。この試験の判定基準によれば、これらの分離物にアフィニティ・リガンドに適するものはなかった。
【図１１Ａ】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＬＡＣＩ／Ｆファージ分離物のいくつか、即ちＬＵ２、ＬＵ５、ＬＵ９、ＬＵ１２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合およびｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ｂ】４回のスクリーニングから得られたウロキナーゼ結合親和性を有するＬＡＣＩ／Ｆファージ分離物のいくつか、即ちＬＵ２、ＬＵ４、ＬＵ１０、ＬＵ１２（実施例１９、下記参照）のｐＨ７での固定化ウロキナーゼへの結合およびｐＨ７での固定化ＢＳＡへの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を示す。この試験の判定基準によれば、これらの分離物にアフィニティ・リガンドに適するものはなかった。
【００１６】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明によると、アフィニティ・クロマトグラフィによる標的生体分子の効率よい精製が可能になる。本明細書において使用するとき、「標的」の語は、特定のタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、脂質、リポ多糖類、核酸、もしくはそれに対して特異的なリガンドが求められるこれらのクラスの組合せを示す。標的はタンパク質の活性フラグメントや複合体や１個以上のタンパク質の凝集塊であってよい。標的は天然の生体分子に限定されず、合成有機分子や、特に１個以上のキラル中心を含む分子であってよい。標的はそれよりも大きい構造体、例えばウイルスなどの生物体の表面分子として存在してよい。それどころか、標的は細胞やウイルス粒子であってもよい。
【００１７】
標的生体分子は、あらゆる公知の方法で生産され、それには化学合成法、天然に存在するまたは組換え形質転換した、細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞などにより培地中に放出させる方法、遺伝子組換え生物体（例えばトランスジェニック哺乳動物）から分泌させる方法、尿、血液、乳汁等の生物の体液や組織中のもの等が含まれる。初期に産生されたものとして粗製標的を含む溶液（即ち産生溶液）を「供給流」と呼ぶことがある。本発明が第一に照準を合わせたのは、標的が産生された溶液から標的分子を回収することであるが、本発明は産生供給流からの回収に限定されず、本発明により開発されるアフィニティ・リガンドは、標的をあらゆる溶液から回収することに使用できる。
【００１８】
標的生体分子を産生する各方法は、標的と（標的に関する）数種類の不純物を含む供給流中に標的を産する。本発明の１つの目的は、標的を迅速かつ極めて特異的に精製することが可能になるようなアフィニティ・リガンドおよび（クロマトグラフィ媒体などの）調製物を提供することである。本明細書において得られるアフィニティ・リガンドは、高い親和性で（好ましくは実質的に供給流中の他分子全てを排除して）標的と結合する。さらに、このアフィニティ・リガンドは、溶媒条件が変わると標的を無傷で活性型のまま放出する。放出条件が標的に悪影響を及ぼさないことは重要である。このアフィニティ・リガンドが供給流中に低濃度で存在するときでも標的と結合し、高濃度で標的を放出できることが好ましい。それなら、一段精製によって多くの不純物の除去と標的の濃縮が両方行われる。活性型で結合、放出すべき標的を「製品標的」と呼ぶことがある。
【００１９】
本発明の別の一態様は、特異的不純物（または近種グループの不純物）と極めて高い親和性で結合して、ほぼ全てのその（あるいはそれらの）不純物を分離することによって、それ（それら）から他の分子を取り除くことを可能にするアフィニティ・リガンドを提供することである。この場合、不純物を無傷で放出することは重要ではないが、リガンドを再利用できれば経済的に有利である。最高の親和性で捕捉すべきであるが、その放出は重要でない標的を「不純物標的」と呼ぶ。
【００２０】
標的の特性決定
精製の分野では、標的について既知の、あるいは見出された事実のほとんど全てを駆使して標的の分離を目的とする精製スキームを改良する。標的用に設計したアフィニティ・リガンドを得るために本発明の方法を実施する場合、標的が安定となる溶液条件、即ち生体分子が活性を保ち、変性しない条件を知ること、あるいはそれを決定することは必要不可欠である。本発明による方法の最初の段階は、標的精製工程中の一組の条件を選択する段階と、そのアフィニティ・リガンドへの結合が終了して、標的の放出と溶出が起きることが望まれる異なる一組の条件を選択する段階とを含む。これらの条件は、究極的に得られるリガンドが無傷の、活性のある標的に対する親和性を有するように、両方とも標的が安定である条件でなければならない。
【００２１】
標的の安定性に影響を及ぼす因子の理解に加えて、標的を分離すべき溶液中の標的濃度、標的の結合活性または酵素活性、標的の凝集状態（即ち標的が単量体か多量体か）標的のおよその大きさ（分子量）、標的を含む溶液や供給流の組成など、標的の他の特性を知ることも有用である。かかる因子は実行者が（ａ）１つ又はそれ以上のタンパク質リガンドが標的と結合することが期待される結合条件、（ｂ）少なくともタンパク質リガンドのいくつかは標的を変性や損傷を起こすことなく放出するであろう、可能な条件変更、（ｃ）そこから適切なリガンドを分離できる、可能結合タンパク質またはドメインのライブラリ（１つ又はそれ以上）の組成、を選択するのに有用である。
【００２２】
標的の安定条件
どんな生体分子でも、いくつかの溶液条件で安定であるが、溶液中の標的の安定性は溶液の条件に影響を受け、その条件は溶液の温度、ｐＨ、イオン強度、誘電率、および［Ｈ＋ ］、［Ｎａ＋ ］、［Ｃｌ− ］、［尿素］、［グアニジン＋ ］、［ＳＯ４− ］、［ＨＳＯ４− ］、［ＰＯ４− ］、［ＨＰＯ４− ］、［Ｈ２ＰＯ４− ］、［ＣｌＯ− ］、［ＮＨ４＋ ］、［ＯＨ− ］、［Ｈ２Ｏ２］、［Ｍｇ＋＋］、［Ｋ＋ ］、［Ｚｎ＋＋］、［Ｃａ＋＋］、［Ｌｉ＋ ］、［ＮＯ３−］、［洗浄剤、例えばトライトンＸ−１００］、［ラウリル硫酸イオン］、［グルコース］、［クエン酸イオン］、［安息香酸イオン］、［エタノール］、［メタノール］、［アセトン］、［酢酸イオン］、［クロロ酢酸イオン］、［ジクロロ酢酸イオン］、［トリクロロ酢酸イオン］、［ギ酸イオン］、［Ｎ−メチルホルムアミド］、［ホルムアミド］、［ジメチルホルムアミド］、［ジメチルスルホキシド］、［メチルエチルケトン］、［プロピオン酸イオン］、ＥＤＴＡ等、他の溶質の濃度を含む。これらのパラメータの各々と、特定の供給流について既知の、あるいは決定された他のいかなるパラメータに対して、標的はある範囲内、即ちある温度範囲内、あるｐＨ範囲内等で安定である。この安定範囲を外れると標的は変性する。ひとまとめにして、特定の標的の安定性に影響を及ぼす全パラメータの範囲はその供給流の「安定性エンベロープ」を決定し、溶液の条件を安定性エンベロープの範囲内に維持する限り、標的は安定であり続けることが期待される。同一の供給流中でも、異なる標的は異なる安定性エンベロープを有することが期待される。
【００２３】
所与の標的をアフィニティ分離するのに適したアフィニティ・リガンド獲得の最初の段階は、標的が安定であるような結合条件と所望の放出条件を選択する段階である。実行者が結合条件を選択するには標的分子の安定条件に関して知っている情報が不十分な場合、以前の決定を参照するか、経験に基づいて１個以上のパラメータに関して安定範囲を決定するか、そのいずれかによって安定条件を確かめることができる。
【００２４】
所望の結合条件を選択するために、標的の安定性を試験したり標的の安定性エンベロープの全てにわたって決定したりする必要はない。実行者は経験に基づいて単に安定条件を推測し、適切に一組の結合条件を選択してよい。例えば、およそ安定性を有するタンパク質であれば、ほとんどがｐＨ７、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌで安定である（即ち、通常ｐＨ７、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌは所与のタンパク質の安定性のエンベロープの範囲内である）。結合条件にｐＨ７、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌを選択し、放出条件は１個以上のパラメータを変化させることによって（例えばｐＨ４、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌを）これに関連して選択してよい。これらの条件のいずれかが標的の安定性エンベロープの範囲外である場合、この方法では標的を溶液から分離できるいかなるアフィニティ・リガンドはなにも確認できず、安定性エンベロープをもっと正確に決定するか、エンベロープの境界について別の推測をしてからいずれかにこの方法を繰り返すことになる。より広い例として、温度範囲０℃〜３５℃、ｐＨ８〜９からｐＨ４〜５までの範囲、［ＮａＣｌ］範囲としては０Ｍ〜１Ｍで極めて多くのタンパク質が安定である。従って、結合条件ｐＨ８、０℃、１０ｍＭ ＮａＣｌと放出条件ｐＨ６、３０℃、０．５Ｍ ＮａＣｌはほとんどのタンパク質標的に選択することができる。この推定安定性エンベロープに基づく結合及び放出条件の他の組合せは（１）結合：ｐＨ６、２５℃、０．５Ｍ ＮａＣｌ、溶出：ｐＨ８、０℃、１０ｍＭ ＮａＣｌ、（２）結合：ｐＨ７、０℃、１０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出：ｐＨ７、３５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４Ｍ尿素、（３）結合：ｐＨ８、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出：ｐＨ６、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むであろう。
【００２５】
結合条件および放出条件を適当に選択するために、供給流中の特定の標的に関する情報をさらに確かめなければならない場合、１個以上のパラメータの範囲にわたる安定性を容易に決定することができる。ある標的について有用な安定性エンベロープを確立する実例試験を以下に説明する。有用な安定性データをもたらすかかる試験は多くの修正が可能であり、かかる修正は当業者には自ずと示唆されるであろう。安定性の境界を高精度で決定することは重要ではなく、標的が安定で（結合用と放出用の）２つのはっきりと異なる条件を決めることができる、条件の範囲を画定する必要があるだけである。特定の標的の安定条件が極めて狭い場合、アフィニティ精製を行うのに必要な時間にわたって標的が変性してはならないことを常に心に留めておくべきである。境界安定条件下でさえ、標的の回収後には、さらに加工する前に産物を安定性の高い溶液に戻す。
【００２６】
標的の安定性エンベロープを確立するための実例試験
温度安定性
まず、標的分子が変性するか活性をほぼ失う温度ＴｍをｐＨ７、塩濃度１５０ｍＭの溶液中で測定する。このＴｍは、例えば走査熱量計を使用して決定することができる。Ｔｍはかなり急な変移を示すが、やや低い温度（安定性温度範囲の上限）で長くインキュベートすると失活する可能性があることを理解すべきである。従って、安定性エンベロープの境界温度はＴｍによって画定される限界よりも数℃低く設定することが好ましい。あるいは、一定時間（例えば１５分間から２４時間まで）２５℃、３７℃、４５℃、５５℃、６５℃などの一組の温度でインキュベートした後に標的試料の活性を測定することによって温度安定性を決定することができる。標的がある温度で失活せず、次の温度でかなり失活した場合、１点以上の中間温度で活性を測定することによって、温度範囲の境界を所望の確度で決定することができる。次に、１５０ｍＭ食塩水の氷結点までの低温で標的がバラバラになる（離解）するか沈殿するかを判定することができる。
【００２７】
ｐＨ安定性
標的が活性を保持するｐＨ範囲を数点の温度（例えば４℃、２５℃、３７℃、５０℃、）で決定する。これは走査熱量計中で種々のｐＨ値に対するＴｍを測定することによってできる。ここで、Ｔｍは与えられたｐＨにおける安定性の上限を画定するものであって、安定性のエンベロープは各ｐＨについて数℃低く設定すべきであることに注意する。例えば、境界が決定されるまでｐＨ７、６、８、５、９、４、１０等々ｐＨを変えてＴｍを測定することができる。あるいは、標的試料を特定の温度（２５℃、３７℃、５０℃）とｐＨ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２で（２０分間などの）適当な時間インキュベートし、ｐＨを活性の決定に適した値に調整した後に活性を測定することができる。この範囲の温度依存性が強い場合、ｐＨ範囲は追加の温度（例えば１５℃、３０℃、４３℃、６０℃）で標的が活性を保持する範囲について決定する。
【００２８】
標的が可溶かつ安定なイオン強度範囲
これは２点または３点の温度で測定するのが有利である。例えば、有用な温度は４℃（または標的が沈殿、離解しない最低温度）、２５℃、Ｔｍ より５℃下（または標的がそれほど失活を示さない最高温度）であろう。Ｔｍ は走査熱量計中で１ｍＭ、５ｍｍＭ、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍ、３ＭなどのＮａＣｌ濃度に対して測定する。ｐＨを特定の値、例えばｐＨ７とかｐＨ８に保つためにそれぞれの場合に適した緩衝液を加えるべきである。
【００２９】
ほとんどのタンパク質はいくらか塩を含んだ水に可溶である。塩濃度があまり高かったり低かったりすると、タンパク質は沈殿や結晶化をきたすことが多い。タンパク質の沈殿に使用される塩類はＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、酢酸アンモニウム、ＫＣｌ、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４）等を含む。標的の溶解度が急激に下がる点（高塩濃度および低塩濃度）をＮａＣｌ、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの２、３の塩類について決定することが好ましい。
【００３０】
カオトロピック試薬に関する標的の安定性および溶解性
尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、グアニジンチオシアネート等はタンパク質と他の分子との相互作用を分断することが知られている。また、これらの試薬は折りたたまれたタンパク質を開かせることもできる。標的の安定性は、尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、イソチオシアン酸ナトリウム、Ｎ−メチル尿素等のうちの１個以上の濃度上昇に関して測定することが好ましい。典型的な場合では、あるタンパク質の熱変性に対する安定性は尿素その他のカオトロピック試薬による変性に対する安定性と平行している。
【００３１】
標的の安定性に特定のイオンが必要かどうか
タンパク質には（Ｍｇ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃａ＋＋などの）金属イオンと結合するものがある。例えばＥＤＴＡなどのキレート剤に曝すことによって、この金属イオンを取り除くと、場合によってはタンパク質が変性することがある。標的が金属イオンを含むかどうかは元素分析によって決定される。標的が金属イオンを含む場合、ＥＤＴＡへの曝露か蒸留水に対する透析のどちらによって標的が失活するかを判定する。
【００３２】
有機溶媒および有機溶質中の標的の安定性と溶解性
標的の安定性と溶解性を有機溶媒、水と有機溶媒の混合物、有機溶質を添加した水中について決定することが好ましい。例えば、標的の安定性と溶解性を、アセトニトリル（ＡＣＮ）および水／ＡＣＮ混合物、メタノール（ＭｅＯＨ）および水／ＭｅＯＨ混合物、エタノール（ＥｔＯＨ）および水／ＥｔＯＨ混合物、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）および水／ＩＰＡ混合物、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および水／ＤＭＦ混合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水／ＤＭＳＯ混合物、第二級ブチルアルコール（ＳＢＡ）および水／ＳＢＡ混合物、アセトンおよび水／アセトン混合物等のうち、一種類以上の中で測定する。加えて、標的の安定性と溶解性について、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド等の有機溶質を種々の量添加した水中で試験を行う。
【００３３】
ファージ提示および有機溶媒
標的と結合する選択的リガンドを得るための好ましい一方法は、Ｍ１３などのファージ上に提示されたタンパク質のライブラリから選択することである。従って、ファージ提示ライブラリを使用した場合、有機溶媒がファージを傷めるかどうかを判定することに関心が持たれる。ＡＣＮ、ＭｅＯＨ、ＤＭＳＯは、Ｍ１３ファージに悪影響をもたらさないので特に好ましい。特に、次の条件によるとＭ１３はほぼ間違いなく生存する。
【表１】
８０％ＥｔＯＨ、ＩＰＡまたはＤＭＦと共に２０分間インキュベートすると生存するファージはなかった。これらの溶媒をファージと共に使用するときは低濃度にする。
標的の知識から、役立ちそうな他の取り扱い可能な溶液条件も示唆される。例えば、糖結合タンパク質の安定性はタンパク質が結合する糖の濃度の影響を受ける。
【００３４】
アフィニティ・リガンドの分離
結合条件と放出条件の選択
提案されている、あるいは経験的に決定した標的分子用安定性エンベロープを使用して、二種類の溶液条件、即ち結合条件と放出条件を選択する。結合条件はその条件下で発見されたアフィニティ・リガンドが標的と結合することが望まれる一組の溶液条件であり、放出条件はその条件下では発見されたアフィニティ・リガンドが標的と結合しないことが望まれる一組の溶液条件である。この二種類の条件は条件達成の容易さ、他の精製工程との互換性、他のアフィニティ媒体と比較して条件変更コストの低さ等、実行者のあらゆる基準を満たすように選択される。この二種類の条件は（ａ）十分に安定性エンベロープの境界内であることと、（ｂ）少なくとも１つの溶液パラメータに関して遠く隔たっていることが好ましい。例えば標的が広いｐＨ範囲で安定な場合、好適な結合条件がｐＨ１１、塩濃度１５０ｍＭ、２５℃で好適な放出条件がｐＨ３、塩濃度１５０ｍＭ、２５℃などである。ｐＨ安定性の範囲が狭いが（例えばｐＨ６．２〜７．８）広範囲の塩濃度にわたって安定な別の標的に対しては、二種類の有用な条件は、結合条件がｐＨ７．２、３Ｍ ＮａＣｌ、２５℃で放出条件がｐＨ７．２、２ｍＭ ＮａＣｌ、２５℃などである。３番目の標的はｐＨ範囲が狭いがアセトニトリルに対する安定性の範囲が広いものである。この３番目の仮定上の標的に対して有用な条件は、結合条件としてｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、２５℃、および放出条件としてｐＨ７．０、５ｎＭ ＮａＣｌ、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、などである。
【００３５】
結合ドメイン候補の選択
標的の所望の結合と放出のための特定の溶液条件の選択に関連して、所望の結合能と放出能を示すよう設計したアフィニティ・リガンド用の構造テンプレートとして結合ドメイン候補を選択しなければならない。この結合ドメインは天然のタンパク質または合成タンパク質、あるいはあるタンパク質の領域またはドメインである。結合ドメイン候補は既知の結合ドメイン候補と標的間の相互作用の知識に基づいて選択するが、これは決定的ではない。実際、結合ドメイン候補がどれほど標的への親和性を有するかということは重要ではない。それの目的は、それから多数（ライブラリ）の類似体を作り出せる構造を提供することである。この多数の類似体は所望の結合特性と放出特性（および選択した他のあらゆる特性）を現す類似体を１個以上含む。従って、以下に論ずる結合条件と放出条件は、結合ドメイン候補として働く正確なポリペプチドの知識または結合ドメイン候補が属するタンパク質かドメインのクラスの知識によって、選択することもできるし、あるいは結合ドメイン候補の選択とまったく無関係に選択することもできる。同様に、結合条件および放出条件あるいはそのいずれか一方は、結合ドメイン−標的間の既知の相互作用を考慮して、例えば１つまたは両方の溶液条件下での相互作用に有利となるように選択するか、あるいはかような既知の相互作用とは関係なく選択する。同じく、結合条件および放出条件あるいはそのいずれか一方を考慮に入れて、あるいは入れないで結合ドメイン候補を選択することができる。もっとも、結合条件または放出条件下で結合ドメイン類似体が不安定ならば、有用なアフィニティ・リガンドが得られないことは認めなければならない。
【００３６】
結合ドメイン候補を選択する目的は、構造が類似した類似体ドメインのライブラリを作るためのテンプレートまたは親構造物を提供することである。この類似体ライブラリは、ライブラリを作成するための基本ドメインの多様化がアフィニティ・リガンドに望まれる特性にとって有利になるように行われるという点で（無作為に作成したライブラリに対して）偏りのあるライブラリであることが好ましい。
【００３７】
結合ドメイン候補の性質は、標的分子に対して試験することになる得られたタンパク質（類似体）の特性に大きく影響を及ぼす。結合ドメイン候補の選択でもっとも重要な考察は類似体ドメインが標的にどのようにして提供されるか、即ち標的と類似体がいかなる立体配座で接触するようになるかということである。例えば、好ましい実施形態では、例えば米国特許第５４０３４８４号（Ladnerら）や米国特許第５２２３４０９号（Ladnerら）など（参照により本明細書の一部とする）に記載された技術を使用して、類似体は類似体をコードする合成ＤＮＡを複製可能な遺伝子パッケージに挿入することによってつくられ、その結果、Ｍ１３ファージなどの微生物表面にドメインが提示される。
【００３８】
結合ドメイン候補として構造化ポリペプチドは非構造化ポリペプチドと比較して多くの利点がある。通常、タンパク質中の表面残基の変異はタンパク質の全体構造や一般的特性（サイズ、安定性、変性温度など）にほとんど影響がないが、表面残基の変異は同時にタンパク質の結合特性に強い影響を及ぼす。これは、例えばＢＰＴＩ相同Kunitzドメインについて十分に記録されている（Ladner、1995年参照）。タンパク質または構造化ドメイン上の残基を変異させると、類似体にとって非構造ペプチドの変異によって得られるよりも特性の多様性が増す可能性がある。それは、タンパク質の枠組みまたはドメインの構造が残基ごとに、および枠組みにより異なる立体配座中に変異された残基を保持しているからである。これは、構造物中に束縛しないと埋没してしまう疎水性側鎖基にとって特に重要である。ペプチド・セグメント（ドメイン）に対する束縛がきつくければきついほど、いかなる特定の標的とも結合する可能性は低くなる。しかし、結合するならば、その結合はより緊密で、特異性が高くなるであろう。従って、結合ドメイン候補と、ついでペプチド類似体のドメインもまた、ある程度剛性のある枠組み内に束縛されたものを選択することが好ましい。あるいは、類似体のライブラリ・サイズを大きくするため、および標的に提示するための多様化構造をさらに導入するため、１個以上の結合ドメイン候補を選択することができる。ライブラリ・サイズが大きくなり、調製される類似体の数がさらに多く構造が多様になると、有用な枠組みと提示された機能性基が含まれる確率は、ほとんどどのような標的に対しても高親和性リガンドを見つけられるほどに高くなる。
【００３９】
結合ドメイン候補のサイズも重要な考慮事項である。小さいタンパク質またはペプチドは単クローン抗体などの大きいタンパク質よりも有利な点がいくつかある（Ladner、1995年参照）。第一に、結合部位あたりの質量が軽減される。分子量が小さい高安定性タンパク質ドメイン、例えばKunitzドメイン（約７ｋＤａ）やKazalドメイン（約７ｋＤａ）、Cucurbida maximaトリプシン阻害因子（ＣＭＴＩ）ドメイン（約３．５ｋＤａ）、エンドセリン（約２ｋＤａ）は、抗体（１５０ｋＤａ）や一本鎖抗体（３０ｋＤａ）よりもずっと高いグラム当たりの結合率を示し得る。
【００４０】
第二に、接触表面が少なくなるので、非特異的結合の可能性が低くなる。
第三に、小さいタンパク質またはペプチドは抗体には不可能な仕方で独特のつなぎ部位を有するように設計できる。例えば、小さいタンパク質は（例えばクロマトグラフィ・マトリクスに）つなぐのに適した部位のみにリシンを有するように設計できるが、これは抗体では実行できない。固定化した抗体の一部しか活性がないことがよくあるが、おそらくこれは担体への結合が不適切だからであろう。
【００４１】
小さいタンパク質またはポリペプチドのうちジスルフィドによって安定化されるもののほとんどは、ジスルフィドを形成していないシステインを含まない。これは、タンパク質を安定化させるためのジスルフィド形成をもたらす酸化条件によって、それ以外の条件では対にならないシステインもジスルフィドを形成するからである。従って、安定化ジスルフィドと奇数のシステインを有する小さいタンパク質はジスルフィド結合二量体（例えばホモ二量体やヘテロ二量体）を形成する傾向がある。ドメイン−ドメイン間のジスルフィド数はドメイン内の安定化ジスルフィドよりも還元されやすい。従って、選択的還元によって単一の遊離チオールを有する単量体ジスルフィド安定化ドメインを得ることができる。かようなチオールは、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸または類似したα−ヨードカルボン酸基とのチオエーテルの形成によって、これらのドメインを高度に安定固定化するのに使用できる。
【００４２】
小さいタンパク質またはポリペプチドのドメインは化学合成も可能であり、これによって標的との結合を妨げないように特定の固定化用基を組み込むことができる。例えば、ジスルフィドを含む小さいタンパク質を化学合成した場合、アミノ酸配列の他の場所にある他のシステインとは異なった仕方でブロックされたチオールを持つ特別のシステイン残基を追加することによって、その配列を変更することができる。選択したチオールは脱ブロック化してジスルフィドを形成させた後、追加したシステインを脱ブロック化し、固定化ＮＨ２−ＣＯ−ＣＨ２Ｉを含む基体などの適当な材料と反応させることによって、分子を固定化することができる。
【００４３】
第四に、構造ドメインと共に１つの枠組みからもう１つの枠組みへ無傷で移すとき、束縛されたポリペプチド構造物のほうが機能性を保持しやすい。例えば、結合ドメイン構造物は、ライブラリの中で提示する（例えばファージ上に提示する）のに使用する枠組みから取り出した独立タンパク質や、クロマトグラフィ基体に固定化した独立タンパク質へ提示枠組みから移しやすい。
【００４４】
結合ドメイン候補として使用するのに適した小さく安定なタンパク質ドメインは多数存在し、それにとって有用な次の情報が利用できる。（１）アミノ酸配列、（２）数個の類似ドメインの配列、（３）三次構造、（４）ｐＨ、温度、塩濃度、有機溶媒、酸化剤濃度の範囲にわたる安定性データ。実例としては、Kunitzドメイン（５８アミノ酸、３スルフィド結合）、Cucurbida maximaトリプシン・インヒビタ・ドメイン（３１アミノ酸、３ジスルフィド結合）、グアニリンに関係するドメイン（１４アミノ酸、２ジスルフィド結合）、グラム陰性菌からの熱安定エンテロトキシンＩＡに関係するドメイン（１８アミノ酸、３ジスルフィド結合）ＥＧＦドメイン（５０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、クリングル（kringle）ドメイン（６０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、真菌の炭水化物結合ドメイン（３５アミノ酸、２ジスルフィド結合）、エンドセリン・ドメイン（１８アミノ酸、２ジスルフィド結合）、連鎖球菌Ｇ ＩｇＧ結合ドメイン（３５アミノ酸、ジスルフィド結合なし）などがある。これらの全てではないが、そのほとんどが構造物を堅固に安定にするジスルフィド結合を含む。これらドメインのそれぞれに基づくライブラリ、好ましくはファージその他の遺伝子パッケージ上に提示されるライブラリは構築が容易であり、結合類似体の選択に使用しやすい。
【００４５】
結合ドメイン候補ライブラリの提供
一旦結合ドメイン候補を選択したなら、アフィニティ・リガンドになる可能性があるもののライブラリを作り、結合条件と放出（溶出）条件で標的に対してスクリーニングする。このライブラリは、ドメインの配列に１個以上のアミノ酸置換があることを除いて結合ドメイン候補と相同な一連の類似体を作成することによって作出する。このアミノ酸置換は、少なくともほとんどの置換体について、構造を大きく変えないでドメインの結合特性を変化させることが期待される。多様化のために選択したアミノ酸位置（可変アミノ酸位置）が表面アミノ酸位置、即ちドメインがもっとも安定な立体配座をとるとき、ドメインの外表面（即ち溶液に曝される表面）に現れる、ドメインのアミノ酸配列中の位置であることが好ましい。置換の効果が最大になるように、この変化させるべきアミノ酸位置が隣接または相互に近接していることがもっとも好ましい。その上、特別のアミノ酸を結合ドメイン候補の構造中に追加することができる。好ましい実施形態、特に標的の三次構造、または標的の他の分子、特に結合ドメイン候補との相互作用に関して大量の情報が利用できる場合では、類似体ライブラリ構築の過程で結合相互作用に必須のアミノ酸位置が決定され保存される（すなわち結合に必須のアミノ酸は変えない）。
類似体ライブラリ作出の目的は標的との反応においてアフィニティ・リガンドとなる可能性のあるものを多数提供することであり、一般に、ライブラリ中の類似体数が多いほど、そのライブラリの構成要員が標的に結合し、かつ放出に望ましい予め選択した条件下でそれを放出する確度が高くなる。一方、無作為置換では、アミノ酸配列中のたった６個の位置でも類似体が６千万を超え、これはファージ提示ほど強力なスクリーニング技術を利用しても、実際には限界に近いライブラリ・サイズである。従って、多様化のために指定するアミノ酸位置は類似体の結合特性に及ぼす置換の効果が最大になるように考慮され、置換に使用できるまたは意図されたアミノ酸残基は類似体を結合条件から放出条件に溶液条件が変るのに反応するようにさせるだろうものに限定されている、偏りのあるライブラリを作出することが好ましい。
【００４６】
前に示したように、米国特許第５２２３４０９号で論じられた技術は選択した結合ドメイン候補に対応する類似体ライブラリの調製に特に有用であり、これらの類似体は標的分子について多数の類似体を大規模にスクリーニングするのに適した形で提供される。複製可能な遺伝子パッケージ、もっとも好ましくはファージ提示を使用することは新規なポリペプチドの結合性実体を生成させる強力な方法であり、これには新規ＤＮＡセグメントをバクテリオファージのゲノム（または他の増幅可能な遺伝子パッケージ）に導入して、この新規ＤＮＡがコードするポリペプチドがファージ表面に出現するようにさせる方法が含まれる。この新規ＤＮＡの配列に多様性がある場合、１つの受容体ファージはＤＮＡがコードする最初の（即ち「親」）アミノ酸配列の変異体を１つ提示し、ファージの集団（ライブラリ）は莫大な数の異なっているが類縁のアミノ酸配列を提示する。
【００４７】
ファージのライブラリを標的分子に接触させて結合させ、結合しなかったものを結合したものから分離する。結合したファージは様々な方法で標的から遊離され、増幅される。ファージは細菌の細胞に感染させることで増幅できるので、結合実体をコードする遺伝子配列を明らかにするには少数の結合ファージでも十分である。これらの技術を使用すると集団中の約２千万分の１の結合ファージを回収することができる。各１千万〜２千万以上の可能結合ポリペプチドを提示する１個以上のライブラリを迅速にスクリーニングして高親和性リガンドを見つけだすことができる。この選択工程が機能すると、集団の多様性は各回ごとに減少し良好な結合体だけが残る。即ちこの工程は収束する。典型的な場合では、ファージ提示ライブラリは数個の非常に近縁な結合体（１千万のうち結合体１０ないし５０個）を含む。ファージの単位によって測定される結合の増加と近縁配列の回収により収束が示される。最初の結合ポリペプチドの組が確認されると、配列情報を使用してさらなる所望の特性、例えば極めて類似した二分子の識別力などをさらに有する構成要員に偏らせた他のライブラリが設計できる。
【００４８】
かような技術によると、多数の類似体のスクリーニングだけではなく、結合／溶出サイクルの繰返しの実用化および最初の基準に合致した類似体提示パッケージのスクリーニングに対して偏りのある第二のライブラリの構築も可能になる。従って、本発明の実行では、（１）結合ドメイン類似体のライブラリをファージなどの複製可能な遺伝子パッケージ上に提示できるように作成すること、（２）スクリーニング法の結合条件が所望のアフィニティ・リガンド用に予め選択した結合条件と同一にして、このライブラリを標的分子と結合する遺伝子パッケージについてスクリーニングすること、（３）遺伝子パッケージをアフィニティ・リガンド用に予め選択した放出条件下での溶出によって獲得し、増殖させること、（４）極めて破壊的な条件（提示された結合ドメイン類似体のいくつかと標的との極めて高い親和性会合に打ち勝つため、例えばｐＨ２以下、８Ｍ尿素、飽和チオシアン酸グアニジン等）下で溶出することによって追加の遺伝子パッケージを獲得し、増殖させること、（５）（３）または（４）で得られた増殖した遺伝子パッケージを別々に、もしくは組み合わせて（２）および（３）または（４）の工程を１回以上（例えば１ないし５回）追加循環させること、（６）かようなサイクルから回収した遺伝子パッケージ中に発現した類似体について高親和性結合体のコンセンサス配列を決定すること、（７）元の枠組み（結合ドメイン候補）に基づいて偏りのあるライブラリをさらに構築し、各可変アミノ酸位置で高親和性コンセンサスを可能にし、さらに他のアミノ酸タイプを結合条件から放出条件への変化に対して特に感受性があると思われるアミノ酸を含むように選択すること、（８）（ａ）結合条件下で強固に（即ち高い親和性で）結合し、（ｂ）放出条件下できれいに放出する（即ち標的から容易に解離する）構成要員をこの偏りのあるライブラリからスクリーニングすることがもっとも好ましい。
【００４９】
アフィニティ・リガンドのクロマトグラフィへの使用
結合条件下で所望の親和性で結合し、放出条件下で望むように放出する１個以上のライブラリの構成要員を分離した後、公知の方法でこのアフィニティ・リガンドの分離を達成できる。例えば、類似体ライブラリがファージ上に提示された有望なアフィニティ・リガンドからなる場合、放出されたファージを回収、増殖し、類似体をコードする合成ＤＮＡ挿入断片を分離、増幅し、このＤＮＡ配列を解析し、あらゆる所望の量のリガンドを、例えばポリペプチドの直接合成、分離ＤＮＡや等価のコード配列の組換え発現などによって調製することができる。
【００５０】
本明細書に記載する以下の同様の工程によって、放出特性をリガンドに入れて設計したのと同様の方法で、リガンドにとって望ましい特性をさらに類似体リガンドに組み入れて設計することができる。
【００５１】
こうして分離したアフィニティ・リガンドは、アフィニティ・クロマトグラフ法による標的分子の分離に極めて有用である。従来のクロマトグラフ法はどれでも使用できる。本発明のアフィニティ・リガンドは、例えばクロマトグラフィ・カラムなどに適した固体担体上に固定することが好ましい。次いで固定化アフィニティ・リガンドにリガンド／標的複合体の形成に好適な条件下で供給流を負荷もしくは接触させ、非結合物質を洗浄して除いた後、標的をリガンド／標的複合体から放出するのに好適な条件下で溶出することができる。あるいは、供給流と適当にタグを付けたアフィニティ・リガンドとを反応容器に共に添加した後、タグ（例えば、複合体形成後にリガンドを結合するのに使用できるポリＨｉｓアフィニティ・タグ）を使用することで標的とリガンドの複合体を分離し、最後に非結合物質を除去した後に標的を複合体から放出させることによってバルク・クロマトグラフィを行うことができる。
【００５２】
アフィニティ・リガンドは、厳密な結合特性および放出特性を組み込んで設計してあるが、アフィニティ精製で使用する際に、分離されたアフィニティ・リガンドが機能するのに一層最適な結合条件及び放出条件が明らかになる可能性があることに注意すべきである。従って、本発明による分離後に、ライブラリからアフィニティ・リガンドを分離した結合条件及び放出条件だけを常に使用しなければならないということはない。
【００５３】
親和性定数
およそ３０００ダルトン（約３ｋＤａ）の分子量を有するアフィニティ・リガンドが分離されたと仮定する（例えばＣＭＴＩ誘導体、下記参照）。また、このリガンドを３ｍＭ（即ち約１０ｇ／Ｌ）の有効濃度で適当なクロマトグラフィ用担体に負荷できると仮定する。
分子量が５０ｋＤａで細胞培養培地から１０ｍｇ／Ｌで産生された標的を仮定する。タンパク質濃度は（０．０１ｇ／Ｌ）÷（５×１０４ｇ／モル）＝０．２μＭ。リガンドが３ｍＭで存在する場合、１Ｌの親和性材料は３ミリモル（１６７ｇ）の標的を捕捉できる。
このリガンドが単純な質量作用の式（１）に従って標的と結合すると仮定する。
（１）ＫＤ／［リガンド］＝［標的］／［複合体］≡ (１／Ｘ)１０
捕捉できる標的の割合は式（２）で与えられる。
（２）結合した標的の割合＝１／｛１＋（１／Ｘ）｝
従って、結合した標的の割合は解離定数ＫＤと担体につけたリガンド量によって制御できる。ＫＤは溶液条件の関数であるが、アフィニティ・リガンド分子に固有の値である。結合条件下でのＫＤの値はＫＤＢＣであり、溶出条件下でのＫＤの値はＫＤＥＣである。
【表２】
上の表に、結合した標的の割合が［リガンド］／ＫＤの比にともなってどのように変化するかを示す。満足できる捕捉は０．９より大きいと仮定されるが、本発明はいかなる捕捉レベルにも限定されない。［リガンド］がおよそ３ｍＭの場合、満足できる捕捉は３００μＭ以下のＫＤＢＣで得られる。［リガンド］／ＫＤＢＣ≧１００では、より効果的な捕捉が得られ、これらの比較的高い値が好ましい。［リガンド］／ＫＤＢＣの値は高いほどよいが、ただし標的の回収に十分なほど［リガンド］／ＫＤＥＣが小さくなければならない。３ｍＭより高濃度のアフィニティ・リガンドを担体につけることができればＫＤの値が一層高いリガンドを使用できる。
【００５４】
満足できる溶出には［リガンド］／ＫＤＥＣ＜１０が必要であり、［リガンド］／ＫＤＥＣの値は低い方が好ましい。［リガンド］／ＫＤＥＣ＜０．１は特に好ましく、［リガンド］／ＫＤＥＣ＜０．０１はさらに好ましい。［リガンド］／ＫＤＥＣは低いほどよく、制限はない。［リガンド］／ＫＤＥＣの比を０．００１よりも低くしても、平衡放出で得るものはほとんど無いが、極めて高いＫＤを有するリガンドはオフ比が高く、標的を極めて迅速に放出できるので実際上は優れている。
【００５５】
従って、効率よい捕捉と溶出を得るためには、理論によると（ＫＤＥＣ／ＫＤＢＣ）を１０００以上にするべきである。この比は高いほどよい。少なくとも１０％の結合物質を溶出条件下で遊離できる場合、（ＫＤＥＣ／ＫＤＢＣ）＞１０であればこの工程は申し分ない。しかし、本発明は（ＫＤＥＣ／ＫＤＢＣ）のいかなる特定の値にも限定されない。標的に対して極めて高い親和性を有するリガンドの方が高い特異性を与えることができよう。特に、親和性が比較的低い不純物を押し出すために親和性物質を標的よりも僅かに多く負荷してある場合にそうである。極めて高親和性のリガンドにとり、不純物を押し出すために必要な過剰量は少ない。
【００５６】
ＫＤＥＣはＫＤＢＣと同様に重要である。ＫＤＥＣは０．１より大きくないことが好ましく、０．０１より大きくないことがさらに好ましい。それにもかかわらず、理論的に結合物質の５０％を放出させるＫＤＥＣ＝１でもアフィニティ精製は機能する。平衡洗浄を４回行うと（即ち５０％＋２５％＋１２．５％＋６．２５％）、結合条件下で捕捉された物質の９４％が回収される。
【００５７】
仮定に基づけば、ＫＤＢＣ＝１μＭを有し、担体に３ｍＭで結合した固定化リガンド１Ｌは、約１５，０００Ｌの０．２μＭ溶液（１０ｍｇ／Ｌの５０ｋＤａ標的分子）から標的の９９％を捕捉することができる。
適当な担体に結合したアフィニティ・リガンドは、標的を捕捉するために、他段階平衡クロマトグラフィの実施形態などの多様な方法で使用できることが理解されよう。例えば、リガンド担体をカラムに充填し、標的を含む溶液をカラムに流し、（任意選択で）ほぼ全ての標的が結合するかリガンド担体が標的で飽和するまで再循環させる。あるいは、結合が完了するまでリガンド担体を標的含有溶液と混合（振とうまたは撹拌）してもよい。
【００５８】
ＫＤＥＣが３ｍＭでリガンド負荷が３ｍＭの場合、１Ｌの平衡洗浄を４回行うと４Ｌ中に２．８２ミリモル（３ｍＭの９４％）が回収でき、６７０μＭの標的溶液、即ち供給流と比較して３３５０倍濃度の標的が得られる。さらに、大部分の不純物が除去されると予想される。
ＫＤＥＣが３０ｍＭでリガンド負荷が３ｍＭの場合、１Ｌの平衡洗浄を２回行うと２Ｌ中に２．９８ミリモル（３ｍＭの９９％）まで回収でき、１．４９ｍＭの標的溶液、即ち供給流と比較して７４５０倍濃度の標的が得られる。一方、ＫＤＥＣが０．３ｍＭでリガンド負荷が３ｍＭの場合、１Ｌの平衡洗浄を２４回行うと２４Ｌ中に２．７０ミリモル（３ｍＭの９０％）まで回収でき、１１２μＭ標的溶液、即ち供給流と比較して５６０倍濃度の標的が得られるが、これはさほど望ましくない。従って、担体上のリガンドの実際的な限界は［リガンド］／ＫＤＥＣ≒１０であり、低い値のほうが好ましい。
【００５９】
担体のリガンド結合レベルが支配するのは（ａ）供給流から捕捉される標的の割合、（ｂ）捕捉される標的の絶対量、（ｃ）捕捉される不純物の量の３因子である。最初の２因子の理論的挙動が報告されている。供給流中の不純物は複雑で特有であるため［リガンド］と不純物の結合および溶出との相互作用は経験則によって最適化される。
【００６０】
特定のアフィニティ・リガンドが与えられると、最適な分離に適した充填を計算することができる。ＫＤＢＣが３ｍＭでＫＤＥＣが３μＭのアフィニティ・リガンドを仮定すると、３ｍＭで担体に充填すれば標的の捕捉は完全になるであろう。しかし、溶出条件下では＞１％しか溶出されない。このリガンドを３μＭで充填すれば標的を捕捉することができ、標的はＸ＝１で放出される。あるいは、さらに適した（即ちより低い）親和性を有するものが１個以上得られるように結合領域中またはその付近のアミノ酸を変更して、選択したアフィニティ・リガンドの別形を調製することができるであろう。
【００６１】
上記の考察はバッチ結合および溶出に関するものであった。これに代わるアプローチは平衡段階が多い定組成クロマトグラフィである。高いオン比およびオフ比を有するアフィニティ・リガンドはクロマトグラフ法ではより効果的である。クロマトグラフ法にとり、リガンドのもっとも重要な属性は標的に対し適度な親和性（１μＭないし１ｍＭ）を有し供給流の他のあらゆる成分に対する親和性がずっと低いことである。
【００６２】
比較的低い親和性を有する結合類似体を回収する確度を高めるには、特にスクリーニングの初期段階では、例えば洗浄などによる非結合類似体の除去（段階（ｇ）、上記参照）を極めて短くすることであろう。例えば、ＫＤ＝３μＭの結合ドメインはＫｏｎ＝１０３／モル／秒およびＫｏｆｆ＝１０−３／秒を有するであろう。これはτ１／２＝６９４秒≒１２分に相当する。元々ライブラリに１０７個の異なる類似体が含まれている場合、１０１１個の試料にはライブラリの各構成要員が１０，０００個ずつ存在する。ある類似体５，０００個が標的と結合し、半交換時間τ１／２の３倍（約３５分間）洗浄した場合、６２５個の類似体が捕捉されるであろう。洗浄を短縮すると非特異的類似体のバックグラウンドが高くなるにもかかわらず、オン、オフの速い構成要員が次の回へ持ち越されることを確実にする方が好ましい。
【００６３】
以上から、必ずしも親和性がもっとも高いリガンドが制御可能で経済的な標的分子の回収にとって最適であるわけではないことが分かる。本発明の方法によると、予測可能で制御された標的のきれいな放出と対になった標的の特異的な結合、有用な充填特性、許容できる程度に完全な溶出、再使用性／再生利用性等、特定の標的の分離を模索する実行者にとって重要な、多様な所望の特性を有するリガンドを選択することができる。
【００６４】
近縁不純物の除去
本発明によると、標的分子と極めて類似した他の分子とを識別できるアフィニティ・リガンドの選択も可能になる。ここで、「標的」とはアフィニティ・リガンドが結合すべき分子であり、「特異的不純物」とはそれが結合することを最小限にすることが望まれる分子である。
【００６５】
本発明の方法を使用すると、Ａｓｎ残基を含むタンパク質と、Ａｓｎが化学的にＡｓｐに変換された脱アミド誘導体とを識別できるアフィニティ・リガンドを見つけだすことができる。同様に、異性有機化合物のＲ体をＳ体から分離するのに有用なアフィニティ・リガンドを見つけだすことができる。
【００６６】
この種の特異性を達成する方法は少なくとも３通りある。１番目は、標的と結合するアフィニティ・リガンドを多数獲得し特異的不純物への結合をクローン分離物として試験することであろう。２番目は、特異的不純物を固定化し、特異的不純物に対して高い親和性を有するライブラリの構成要員を取り除けるであろう。次いでこの「除去ライブラリ」を標的に結合するものについてスクリーニングする。３番目は、固定化した標的への結合について可能アフィニティ・リガンドのライブラリのスクリーニングを行う際に、結合緩衝液中に１種類（または複数）の特異的不純物を存在させ、その濃度を標的と特異的不純物の両方に対して親和性を有するあらゆる構成要員が固定化標的よりも特異的不純物の方と結合するような濃度にするとができるであろう。このように、標的と結合した構成要員を特異的不純物に対する親和性がないことを示すように「設計」する。３番目の方法が好ましい。
３通りの方法の全てにおいて、特異的不純物が標的をほぼ完全に含まないことが重要である。特異的不純物中の標的濃度ができるだけ低いことが好ましい。
【００６７】
３番目の方法では、特異的不純物は、溶液中に遊離した標的がライブラリの各標的結合成分の大部分に結合しないような濃度で添加する。従って、ライブラリのスクリーニングを行うために結合／洗浄／溶出／増幅を数回繰り返すのにつれて、残っているライブラリの構成要員の各濃度が上昇する一方で構成要員の数が減少するため、特異的不純物の濃度を上げる。特異的不純物を含む調製物中に含まれるどの標的も有用である可能性のあるアフィニティ・リガンドの全部と結合することはあり得ないので、有用なアフィニティ・リガンドのいくつかは固定化標的によって捕捉され、次の回へ繰り越される。以下の計算によると、使用すべき特異的不純物の適量が示唆されるが、本発明はいかなる特定レベルの特異的不純物の使用にも、あるいはいかなる特定の結合、競合理論にも限定されない。
【００６８】
複雑度１０６のファージ提示ライブラリ（即ち１０６種類の可能アフィニティ・リガンド・ペプチドが提示されている）の中では、ライブラリの力価は１０１３ファージ／ｍＬ、即ち各タイプのファージが１０７／ｍＬであると想定される。標的が５０μＭで効果的に存在し、特異的不純物が標的の０．５％存在する場合、特異的不純物を１，０００μＭまで添加し、遊離標的を５μＭにするがこの濃度は、特異的不純物が存在する状態でも標的と結合できるアフィニティ・リガンドの捕捉を完全に阻害することはないだろう。
【００６９】
ラウンド間で増幅を行わずにライブラリをスクリーニングするときは、結合段階の１つで特異的不純物を追加するだけで十分なことがある。特異的不純物を追加する最適の段階が、早期の結合段階か後期の結合段階かは実験で決定すべきである。
本発明によるアフィニティ・リガンドの単離については、下記でさらに例示する。以下の例に含まれる特定のパラメータは本発明の実施を例示するためのものであり、いかなる形においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
実施例１〜１５
他のタンパク質に結合するタンパク質には、遊離タンパク質では露出していて、複合体の形になると埋没する１個以上の疎水側鎖基があることが多い。アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓには疎水側鎖基がある。Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ（ジスルフィドの一部のとき）は常に疎水性である。ＴｒｙとＣｙｓ（ジスルフィドの一部でないとき）は高いｐＨでイオン化できる。Ｈｉｓは中性または酸性のｐＨでイオン化が可能である。露出疎水領域を有する可能性が高いタンパク質には、タンパク質ホルモン、タンパク質ホルモンの受容体、受容体、結合分子、抗体等が含まれる。酵素および極めて豊富な貯蔵や輸送のタンパク質（トリプシン、ミオグロビン、ヘモグロビンなど）には、表面に広い疎水領域が全くない。
【００７１】
標的が露出疎水領域を有することが既知であるか、露出疎水領域を有する可能性が高い場合、好ましいアプローチは高塩濃度（疎水性相互作用に有利）および３７℃で結合し、４℃（疎水性相互作用に不利）及び／または５０％（v/v）アセトニトリル（疎水性相互作用に不利）と１０ｍＭ ＮａＣｌ（低塩濃度）で放出するリガンドを選別することである。
標的タンパク質がイオン基を多数有する場合（アミノ酸組成またはアミノ酸配列から決定できるようにＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど）、好ましいアプローチは１つのｐＨで結合し、別のｐＨで放出するリガンドを選別することである。例えば、ｐＨ３．０からｐＨ９．５の間で安定な標的に対しては、ｐＨ８．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０℃で結合しｐＨ４．０、１Ｍ ＮａＣｌ、３０℃で放出するリガンドを選別することが有利である。低温、低塩濃度はイオン性相互作用に有利である一方、比較的高い塩濃度と温度はイオン基の結合力を低下させる。あるいは、ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌ、３０℃で結合しｐＨ４．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０℃、１０％（v/v）ＭｅＯＨで放出するリガンドを選別することができるであろう。
【００７２】
水溶性標的は、極めて少数のイオン基（即ちタンパク質ではＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど）を有するときに多くの中性極性基（即ちタンパク質ではＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒなど）を有する可能性が高い。多くの糖類はこのクラスに含まれる。このような中性極性基（ヒドロキシル、アミド、エーテル、エステル等）は水素結合を形成することができる。このように、多くの位置で許容される水素結合形成アミノ酸を有するタイプのライブラリには、有用な親和力でこの種類の分子と特異的に結合する構成要員が含まれる。水素結合をつくる側鎖基を有するアミノ酸には、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）が含まれる。水素結合はｐＨ、イオン強度、溶媒の誘電率、および尿素やグアニジンイオンなどのカオトロピック試薬の影響を強く受ける。水素結合は、高温では結合力を失う。従って、適切な結合条件は低塩濃度、低誘電率を有する一方、溶出条件は高塩濃度、高誘電率、結合条件のｐＨと好ましくは少なくとも１ｐＨ単位異なるｐＨを有するであろう。例えば、結合条件をｐＨ８、１０ｍＭ ＮａＣｌ、４℃とする一方で溶出条件をｐＨ６、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３５℃とすることができる。あるいは、ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌ、３０℃で結合しｐＨ４．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０℃、１０％（v/v）ＭｅＯＨで放出するリガンドを選別することができるであろう。
【００７３】
もっとも容易かつ経済的に変更できる溶液条件はｐＨである。アミノ酸のイオン化を分子間界面内で変化させることで分子の結合を著しく阻害できることが知られている。従って、標的への類似体の結合がｐＨ変化に高い感受性をもつ確度を高めるため、ほとんどの、あるいは全ての変更位置で、少なくともＨｉｓを、好ましくはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓも許容するように設計することができる。他のタイプのアミノ酸も許容できることは理解すべきである。例えば、各変更位置で｛Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ｝の組が許容されるライブラリは、高いｐＨ感受性で標的と結合するリガンドを含む可能性が極めて高いであろう。｛Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ｝の組だけが許容されるライブラリも機能する可能性が高いが、さらにその他のアミノ酸のタイプが許容されると、第一の溶液条件下で結合がおきる確度が高くなる。界面内でイオン化状態を変化させる基が１、２個あれば第二の溶媒条件の組での結合が阻害される。表２に示すように、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、ＬｙｓのｐＫａは３．５〜１１の範囲、即ちタンパク質の多くが安定なｐＨの範囲内である。しかし、タンパク質では各側基の位置決定が実際のｐＫａに影響を与える可能性がある。例えば、Ａｒｇと近接して保持されたＬｙｓは、そうではないＬｙｓと比較して低いｐＫａを示す可能性がある。
【００７４】
アミノ酸側鎖の活性とアミノ酸基が溶液中のタンパク質に与えている可能性のある性質を示す表２および表３のタイプ情報を使用すると、アフィニティ分離法が有効であることが望まれる場合に特定の種類の溶媒条件の変化（結合条件から溶出条件への移行）に対して感受性がある結合ドメイン候補を含む確度が高いライブラリの設計に必要なアミノ酸置換を選別することができる。
【表３】
（Crieghton、タンパク質：構造および分子の性質、第２版(W.H.Freeman and Co.、ニューヨーク、1993年）、p.6）
表３に、記載した溶媒条件の変化に対して感受性のある結合をタンパク質に与える可能性のあるアミノ酸タイプの種類を示す。本発明の好ましい結合ドメイン類似体候補には、構造を安定化させることでドメインが高い親和性、特異性、安定性を示せるようにするジスルフィド結合が含まれる。
【表４】
【表５】
【００７５】
実施例１は、結合ドメイン類似体ライブラリ用に提案した結合条件および放出条件を説明するが、この条件ではヒスチジンが多数の、あるいは全ての変更可能な位置に来ることができる。ｐＨ＞７では、Ｈｉｓは電荷を帯びず、側基は水素結合の供与と受容が可能であるが疎水性である。塩濃度と温度が高くなると、イオン相互作用の結合エネルギーへの寄与が低下する。従って、高塩濃度および高温で結合させると、強いイオン相互作用を有する結合体が得られる可能性が低くなり、疎水相互作用を有するリガンドが得られる可能性が高まる。放出条件が低塩濃度および低温であると、イオン相互作用の重要性、特に不適当なイオン相互作用の効果の重要性が高まる。従って、結合界面に１個以上のＨｉｓ残基を有する複合体は酸性ｐＨと低塩濃度で不安定になりやすい。
【００７６】
実施例２は、多くの、あるいは全ての変更可能な位置にＨｉｓが許容されたライブラリからの選別を説明する。結合条件および放出条件の選択は、標的との結合がｐＨ８．０では強いがｐＨの低下には極めて敏感であるような結合ドメインを１つ以上分離できるように行う。
【００７７】
ヒスチジンだけがｐＨ感受性相互作用の可能なアミノ酸ではない。実施例３に示すアミノ酸はすべて、多くのタンパク質が安定なｐＨ範囲でイオン化が可能である。イオン化が起きるｐＨはコンテクスト依存性が高いことが多い。従って、タンパク質−標的界面内のアスパラギン酸側鎖基のｐＫａは表２に示した範囲内にはない可能性がある。タンパク質−標的界面内の基によってイオン化状態が変化すると、複合体の安定性が強力に変更を受けるのはかなり確実である。従って、複合体が、１つのｐＨで安定であってもｐＨが界面内の基によってイオン化状態が変化するのに十分なだけ異なると安定である可能性が低い。かような移行が起きるｐＨは計算が困難であり、表２に示したｐＫａの１つであるとは限らない。
【００７８】
実施例４は、多くのＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、不対Ｃｙｓ残基を有する類似体のライブラリがｐＨ３．５、４℃、５０ｍＭ ＮａＣｌで標的と結合しｐＨ７．５で放出する構成要員を含む可能性が高いことを説明する。
実施例５は、低塩濃度を使用するとイオン相互作用による結合が促進され、高塩濃度、異なるｐＨで溶出すると、この相互作用が破壊されることを説明する。
実施例６は、ｐＨ８．２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５℃で結合しｐＨ５．７、１Ｍ ＮａＣｌで放出すると、高いイオン強度とより低いｐＨに感受性の結合ドメインが放出されやすいことを説明する。
【００７９】
イオン強度もタンパク質−標的の結合に強く影響する可能性がある。一般に、疎水相互作用によって結合した複合体は高塩濃度のほうが安定性が高く、一方イオン相互作用によって結合した複合体は低塩濃度よりも高塩濃度のほうが安定性が低い。実施例７ではこれを活用し、イオン基が豊富なライブラリを使用することによって、低塩濃度を結合に、高塩濃度を放出に利用している。実施例８は、ライブラリを５ｍＭ ＫＣｌで結合し飽和ＫＣｌで放出することによってこの効果が見られることを説明する。あるいは、ライブラリが少なくとも数個の疎水基を許容する場合、結合条件と放出条件は実施例９に示すように逆にできる。実施例８と実施例９の結合条件と溶出条件によると、同一のライブラリから同一の標的に対する別の結合ドメインが得られることが期待される。
【００８０】
実施例１０は、疎水基を結合ドメイン候補の多くの、あるいは全ての変更可能な位置に許容するライブラリは１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中でしっかりと結合するが５０体積％のＡＣＮ／水、塩類なしで放出する構成要員を有する可能性が高いことを説明する。これは、疎水相互作用が有機溶媒によって分断されるためである。
実施例１１は、列記されているグループのアミノ酸を数個結合界面中に有するドメインが水中では結合し、塩を幾分加えた３０％ＭｅＯＨ中では放出することが期待されることを教える。
【００８１】
まず疎水相互作用によって結合するタンパク質複合体は「低温変性」することが知られている。従って、列記されている疎水残基を変更可能な位置の多くで許容する実施例１２のライブラリは３３℃、高塩濃度で標的と結合し低温（例えば０℃）、低塩濃度で放出する構成要員を含む可能性が高い。
【００８２】
カオトロピック試薬その他の溶質も標的への安定なドメインの結合を極めて感受性にする可能性がある。一般に、尿素は水素結合によって相互作用を行う基同士の相互作用を断ち切る。Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓは特に好ましく、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇも尿素による分断に感受性の相互作用をしやすい（実施例１３参照）。
【００８３】
ＡｓｐおよびＧｌｕの側鎖基は二価または三価の金属イオン、特にＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋等のキレート化をとおして他の酸性基と相互作用することができる。タンパク質主鎖およびＡｓｎやＧｌｎの側鎖基中のカルボニル酸素や、タンパク質主鎖及びＡｓｎやＧｌｎのアミド窒素もある種の金属イオンとの結合を形成する。金属イオンもＥＤＴＡなどのキレート剤によって可溶状態にとどめておける。従って、表面の数カ所にＡｓｐおよびＧｌｕを許容するライブラリには、溶液中に二価または三価の金属イオンが存在する場合に限り、酸性基を含む（かつ安定性が多価金属イオンとの結合に依存しない）標的と結合する構成要員が存在する可能性が高い（実施例１４参照）。かような構成要員の放出はＥＤＴＡその他のキレート剤によって起こすことができる。
【００８４】
塩基性側鎖基は塩素イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、クエン酸イオン、乳酸イオンなどの陰イオンと相互作用することができる。多価陰イオンでは、複数の側鎖基が１個のイオンと相互作用が可能である。かような相互作用は結合をさほど安定化させないとしても、多価イオンは反発力を遮蔽して、そうでなければ不安定な複合体の形成を可能にする。実施例１５に説明するように、多価イオンを取り除くと複合体の解離が起こるであろう。
【００８５】
表４に、類似体の列記した溶液パラメータの変化にたいする応答性に寄与すると思われるアミノ酸のグループを、例えば結合ドメイン候補をファージに提示させたライブラリ中などに、発生させるのに適したコドンをまとめる。
【表６】
【００８６】
実施例１６
上記の技術を組み換えヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）用のアフィニティ・リガンドの分離に用いた。ｔＰＡアフィニティ・リガンド作成の方法は一般的な３段階を含み、それは（１）ｔＰＡと結合させるための安定な親タンパク質ドメインの変形体およそ千百万個のスクリーニングし、（２）もっとも興味が持たれるリガンドの少量生産し、（３）血漿を加えた試料からｔＰＡをアフィニティ精製するための活性化ビーズと結合した１種のリガンドのクロマトグラフィ試験である。
【００８７】
この作業のため、ｔＰＡをCalBiochem（No.612200）から購入し、Marklandら（1996年）記載の方法でPierce Chemical CompanyのReactiGelＴＭアガロース・ビーズに固定した。およそ２００μｇのｔＰＡが２００μＬのReactiGelＴＭスラリーに結合した。
ファージに提示されたタンパク質のライブラリ４組をスクリーニング工程用に選び出した。３組はリポタンパク質随伴凝集阻害因子の第１Kunitzドメイン（ＬＡＣＩ−Ｋ１）に基づき、Ｌｉｂ No.１、Ｌｉｂ No.３、Ｌｉｂ No.５と呼ばれ、１組はCucurbida maximaトリプシン阻害因子Ｉ（ＣＭＴＩ−Ｉ）に基づくものであった。ＣＭＴＩ−Ｉはカボチャ種子中にあるタンパク質で、消化管の酸性条件およびタンパク質分解条件に耐えることができる。これらのタンパク質はそれぞれ３個のジスルフィド架橋を有し、そのため非常に動きが束縛されかつ安定になっている。これらのタンパク質ファミリーのメンバーは、顕著な熱安定性（＞８０℃で失活せず）、顕著なｐＨ安定性（ｐＨ２、３７℃での終夜インキュベーションまたはｐＨ１２、３７℃への１時間曝露で失活せず）、顕著な酸化安定性を有することが示されている。各ライブラリ中の可能アミノ酸配列数を下の表５に示す。
【表７】
この作業中でｔＰＡに対してスクリーニングしたファージ提示ライブラリの総多様度はおよそ千百万と推定される。KunitzドメインおよびＣＭＴＩドメインは、その表面のほかの部分を変更することによってさらにずっと高い多様度を示すであろう。
【００８８】
「緩速スクリーニング」と「迅速スクリーニング」の２種類のスクリーニング・プロトコルを使用した。緩速スクリーニングでは、各回ごとに得られたファージを次の回の前に大腸菌中で増幅した。迅速スクリーニングでは、増幅は行わなず、ある回で標的から回収したファージを次の回に投入した。迅速スクリーニングでは、数回を経ると、ファージの投入量と回収量が急速に低下した。投入量は、緩速スクリーニングでは一定に保つことができる。緩速スクリーニングでは投入量が一定であることから、各回の比較が可能になり、選別や選別されていないことを提示できるが、迅速スクリーニングの各回の比較は解釈が難しい。迅速スクリーニングによると、無関係な性質（例えば感染性や増殖率）よりも結合で選別される確度が高くなる。
【００８９】
記載したファージ・ライブラリについてｔＰＡへの結合に関して４回スクリーニングを行った。１回目は、ｐＨ７のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で別々の反応でｔＰＡアガロース・ビーズとファージ・ライブラリを混合した。非特異的結合を少なくするため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．１％添加した。結合しなかったファージをｐＨ７で洗浄して除き、１回目のスクリーニングだけは結合したファージをｐＨ２で溶出した。次の３回の迅速スクリーニングは溶出プロトコルが異なり、１回目のスクリーニングのプール・アウトプットを使用した。プールＡはＣＭＴＩライブラリおよびＬｉｂ No.１ライブラリからのアウトプットをあわせたものからなり、プールＢはＬｉｂ No.3ライブラリおよびＬｉｂ No.5ライブラリからのアウトプットをあわせたものからなるようにした。プール・ライブラリの結合はｐＨ７で行ったが、結合ファージを取り出すための１回目の溶出はｐＨ５で行い、その後の溶出はｐＨ５〜ｐＨ２の範囲で放出されるファージを溶出するためｐＨ２で行った。これをさらに２回繰り返し、全部で４回の選別を行った。
【００９０】
最後の３回のスクリーニングから得たファージの力価を下の表６に示した。１回のアウトプットは次の回の投入量であった。
【表８】
ファージの力価からみて、プールＡは収束して強く結合するファージを含むが、プールＢは収束も有意でなく強く結合するファージも含まないようである。
【００９１】
さらに分析するため、３回目の迅速スクリーニングで選別したファージからファージのクローン４０個を、ｐＨ５のプールから２０個、ｐＨ２のプールから２０個選び出した。ＣＭＴＩまたはＬＡＣＩ由来の遺伝子フラグメントが存在するかどうかを判定するためにＰＣＲを使用してこのファージのＤＮＡを増幅した。
【００９２】
プールＡの迅速スクリーニングから分離した４０個のファージのうち３８個にＣＭＴＩ由来の構築物が見つかった。残りの分離ファージはＰＣＲ生成物を作らず、遺伝子欠失が示された。プールＢの迅速スクリーニングで分離されたファージ４０個のうち１０個だけが好適な構築物を含み、探索が成功しなかったことが別に示された。
【００９３】
特定のファージ提示タンパク質が標的分子に対して高い親和性を有する１つのしるしは、それが繰り返し見つかることである。ｐＨ２で放出したＣＭＴＩ由来ファージ分離物１８個から１個の配列が５回見つかり、２個目の配列は４回、残りの２個は３回見つかった。この１８個の配列は選別された分子の近縁ファミリーをなし、探索が成功裏に収束したことがさらに示された。
【００９４】
表７に、観察された配列の違いを、許容された多様性と選別ｐＨの関数として示す。親ＣＴＭＩタンパク質のシステイン３とシステイン１０の間に表面露出ループを規定するコドンに組合せ配列の多様性を導入することによってＣＭＴＩライブラリを構築した。このシステインは構造の重要部分をなしているため、変更しなかった。
【表９】
【表１０】
これにより９．１３×１０６個のタンパク質配列と１６．８×１０６個の配列が与えられる。
【００９５】
表７はＣＭＴＩライブラリのＤＮＡ配列を示す。残基Ｆ−５および残基Ｙ−４は受容ファージ設計の元となったＭ１３ｍｐ１８のシグナル配列中の残基１４および残基１５に対応する。シグナルペプチダーゼＩ（ＳＰ−Ｉ）による開裂はＡ−１とＲ１の間に起きると推定される。１００〜１１３で指定される残基はＣＭＴＩ異形体と残基Ａ２０１から始まる成熟ＩＩＩの間でのリンカーとなる。アミノ酸配列Ｙ１０４ＩＥＧＲＩＶはリンカーがＲ１０８とＩ１０９の間でウシ第Ｘａ因子により特異的に切断されることを許容しなくてはならない。このライブラリを構築するＭ１３関連ファージはアンピシリン耐性遺伝子（ＡｐＲ）を保有しているため、ライブラリ・ファージに感染した細胞はＡｐ耐性になる。各可変アミノ酸位置で、野生型アミノ酸残基を下線で示した。表７に示したアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と表される。それらの配列中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸１〜２９はＣＭＴＩ由来ポリペプチド類似体を表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド１６〜１０２はＣＭＴＩ由来ポリペプチドをコードする。
【００９６】
ｐＨ５選別手順から得た分離物はｐＨ２選別物よりも大きい配列多様性を示した（表８）。配列多様性がより大きいにもかかわらず、ｐＨ５選別物は近縁タンパク質配列を含んでいた。各位置で観察されるアミノ酸タイプの全ての組合せを作ると、元の個体数の０．１５％の１３，４００（＝２×４×３×４×７×５×４）通りにしかならない。決定した２０個の配列中に１回以上現れた配列は４個あり、これは実際の多様度が１３，４００よりも低いことを示唆する。ｐＨ５選別配列のファミリーはｐＨ２選別ファミリーとはっきりと関連性があるが、これら２つの配列集団で配列が同一だった例は１つしかなかった。
【表１１】
【００９７】
位置６および位置７で、許容されるアミノ酸タイプのほとんど（１５個のうち１２個）がｐＨ２選別物中では拒絶された。選別した配列にとり、位置６および位置７で選ばれたアミノ酸が結合に寄与したのか、単にこれらの位置では許容できないものが排除されたことを表すだけなのかは明らかではない。
【００９８】
選別工程の強力な収束は、多くのアミノ酸タイプが生じる可能性があるのに１種類のアミノ酸タイプしか見つからなかった位置２、位置４、位置８でのｐＨ２選別物について特に顕著である。これは、この特定のアミノ酸が結合にとって決定的であるという強い示唆である。これらの位置のそれぞれで、ただ１つ選ばれたｐＨ２群のタイプはｐＨ５群中のその位置でももっとも普通のタイプであった。ｐＨ２プールの各位置で全ての観察されたアミノ酸タイプを許容しても、最初の個体数の０．０００４％に過ぎない３６個の配列しか得られない。１回以上現れた数個の配列は、ｐＨ２プール中に存在する異なる配列の数が３６よりも多くないことを示唆する。
【００９９】
表９は配列決定したＣＭＴＩ−Ｉの類似体３８個に対する多様化領域（アミノ酸位置１〜１２）のアミノ酸配列を示す。変更が指示されていない位置（位置１１）でのメチオニン残基の出現はライブラリの形成におけるＤＮＡ合成の間違いを示す。
【表１２】
【０１００】
表９では、ｐＨ５での溶出によって１０１〜１２０と名付けた配列を有する類似体が得られ、ｐＨ２での分画によって２２１〜２３８と名付けた配列を有する類似体が得られた。
他の固定化タンパク質に対する親和性を決定することによってファージ−結合リガンド候補の特異性を試験した。ファージ−結合タンパク質は、ビーズに結合した関連ヒト血清タンパク質分解酵素、プラスミンおよびトロンビンに対して親和性を示さなかった（データ示さず）。また、ファージ分離株について実験を行い、固定化ｔＰＡに対する相対親和性とそれからの放出特性を決定した。
【０１０１】
ｐＨ５放出ファージ分離株の場合、大部分のファージはｐＨ５で放出され、さらにｐＨを２に下げることによって１桁少ない量が放出される。これはｐＨを５に下げると比較的きれいに放出する好適なアフィニティ・リガンドであることを示す。ｐＨ２放出分離物の場合、分離株Ｎｏ．２３２のみがｐＨ５では真に選択的に結合しており、それからｐＨ２で放出された。
【０１０２】
リガンドの合成と固定化
次に、ファージ分離株のＤＮＡから決定した配列情報を使用して遊離ＣＭＴＩ由来ポリペプチドを合成した。ＣＭＴＩ誘導体（類似体）は容易に化学合成できるが、このポリペプチドを酵母中で発現させることにした。Pichia pastoris中で発現させるため、ｐＨ５放出分離株の１つ、Ｎｏ．１０９（表９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２と提示）と、ｐＨ２放出分離物の１つ、Ｎｏ．２３２（表９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５と提示）とを選択した。４および８の位置では、分離株Ｎｏ．１０９はｐＨ２選別物に見られるものと同じアミノ酸タイプであり、２の位置では、分離株Ｎｏ．１０９はｐＨ２選別物とは異なっている。
【０１０３】
適当な遺伝子構築体を合成し、Pichia pastoris発現系（Vedvickら、1991年およびWagnerら、1992年）に挿入して産生株を作成した。各株について５リットル発酵を行わせた結果、高濃度で発現された。タンパク質は１ｇ／Ｌより多く発酵ブロス中に分泌された。粗製発酵懸濁液を遠心と０．２μｍ精密ろ過によって清澄化した。この０．２μｍろ液を３０ｋＤａＮＭＷＬカットオフのＰＴＴＫカセットを使用する限外ろ過法によって精製した。リガンドはMacro-Prep High S陽イオン交換用担体（BioRad社）による陽イオン交換クロマトグラフィによって限外ろ過液から精製し、次いで逆相分離を２段階行った。この逆相分離には０．１％ＴＦＡを含む水で開始し、アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）を９０分間で５０％まで上昇させる直線グラジエントを使用した。この結果得られたタンパク質は、５μｍ逆相カラム上のＰＤＡ分光分析によって測定したところ、９５％以上の純度であった。
【０１０４】
使用説明書に従って、このリガンド候補をジアミノプロピルアミド（Emphaze UltralinkＴＭ、Pierce Chemical社）を固定したビス−アクリルアミド／アズラクトン共重合体担体に固定した。ＣＭＴＩ類似体Ｎｏ．１０９約３０ｍｇが活性化クロマトグラフィ用担体１ｍＬに結合した。
【０１０５】
カラムの試験
ウォーターズのＡＰミニカラム、公称寸法５．０ｃｍ×内径０．５ｃｍに流量アダプタを取り付けて変更を加え、カラム長を２．５ｃｍに短くすることができた。推奨のプロトコルを使用してこのカラムにＮｏ．１０９Emphaze UltralinkＴＭビーズを充填し、洗浄液のＮａＣｌ濃度を１Ｍまで徐々に上げながらｐＨ７で洗浄した。
【０１０６】
Ｎｏ．１０９アフィニティ・カラムの最初の試験では、製品仕様書に従ってCalBiochemから入手した組織型プラスミノーゲン活性化因子をｔＰＡ１ｍｇ／ｍＬ溶液に調製した。凝集標準液（Sigma Diagnostics社の凝集対照レベル１、カタログNo.C-7916）凍結乾燥ヒト・プラズマを使用説明書に従って再構成した後、１０倍希釈してｔＰＡを添加した。この試料をカラムに負荷し溶出するのは全緩衝液中に１Ｍ ＮａＣｌが存在する状態で行ったが、この条件ではカラムへのタンパク質の非特異的結合が十分に抑制され、ｐＨ制御されたｔＰＡの結合および放出が可能であった。明瞭なピークが２本あった。１本目は（カラムに保持されなかった）血清タンパク質を含み、ｐＨを下げた後に得られた２本目はｔＰＡを含んでいて、血清成分はまったく混入していなかった。結果を銀染色ゲル（示さず）によって確認した。ｔＰＡ製品の９０％が回収された。
【０１０７】
ＥＡＨセファロース４ＢＴＭアガロース・ビーズ（ファルマシア、スウェーデン国ウプサラ）をクロマトグラフィ用担体に用いてＮｏ．１０９ＣＭＴＩ類似体を使用したアフィニティ・カラムを作成した。分離はウォーターズ（マサチューセッツ州ミルフォード）製のＨＰＬＣシステムで行った。システムの構成は、モデル７１８自動注入装置、送液能力毎分２０ｍＬのポンプ・ヘッド付きモデル６００送液システム、モデル９９６フォトダイオード・アレイ検出器であった。装置は全て製品仕様書に従って設置した。システムはデル社提供のペンティアム（登録商標）１３３ＩＢＭ互換コンピュータによって制御した。このコンピュータは１ギガバイトのハードディスク・ドライブ、１６メガバイトのＲＡＭ、カラーモニタを装備し、ウォーターズ提供のソフト「ミレニアム」をロードした。
【０１０８】
２００ｎｍから３００ｎｍの範囲のスペクトル・データを分解能１．２ｎｍで収集した。第１図、第２図、第３図、第４図は２８０ｎｍで収集した。このクロマトグラフィ作業の移動相は緩衝液Ａと緩衝液Ｂであった。緩衝液Ａの組成は２５ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭアルギニン、１２５ｍＭ ＮａＣｌで、水酸化カリウムでｐＨ７の緩衝液とした。緩衝液Ｂの組成は５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌで、リン酸でｐＨ３の緩衝液とした。どの場合でも、１００％の緩衝液Ａ中に試料を注入した後、ｔ＝０からｔ＝２分まで１００％の緩衝液Ａで洗浄した。ｔ＝２からｔ＝８分までは１００％の緩衝液Ｂで溶出した。ｔ＝８分以降は１００％の緩衝液Ａで溶出した。このＨＰＬＣシステムの勾配遅延体積はおよそ４ｍＬ、流速は毎分０．５ｍＬであった。
【０１０９】
別の販売元から入手したｔＰＡを製品仕様書に従って１ｍｇ／ｍＬ溶液とした。凝集標準液（Sigma Diagnostics社の凝集対照レベル１、カタログNo.C-7916）、凍結乾燥ヒト・プラズマを使用説明書に従って再構成した。この溶液を１０：１で希釈して吸光度がｔＰＡ溶液のおおよそ１０倍の溶液を得た。
【０１１０】
第１図に示した試験では、純ｔＰＡの試料（１ｍｇ／ｍＬのｔＰＡを２５μＬ）をＮｏ．１０９ＣＭＴＩ誘導体含有カラムにかけ、上記のように溶出した。クロマトグラムは１５分後の約９０％ｔＰＡ物質の切れのよい溶出を示した。第２図に示した試験では、凝集標準液の試料（１０倍希釈）を上記の溶出条件でＮｏ．１０９ＣＭＴＩ誘導体含有カラムにかけた。ほぼ全ての物質がカラムから速やかに溶出した（保持されなかった）。第３図および第４図に示した試験では、ヒト血漿標準液に添加したｔＰＡをカラムに負荷し、上記のように溶出を行った。第３図および第４図から分かるようにｔＰＡは保持され、血漿タンパク質は空隙（ボイド）体積で溶出した。結合したｔＰＡは約１５．４分に放出された。ｔＰＡは約ｐＨ４で放出されたと推定された。ｔＰＡのピークを集め、銀染色、還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて試験を行い、出発材料と比較したとき純度＞９５％であることが分かった。
【０１１１】
実施例１７
ｔＰＡに同様に結合するドメインの候補をさらに設計するため、ＣＭＴＩライブラリから分離したｔＰＡアフィニティ・リガンドをさらに試験した。
上で言及したように、ＣＭＴＩライブラリの構築に使用したアミノ酸のほとんど全ての変化はＣＭＴＩ−Ｉの３および１０の位置にある２個のシステインの間に生じた（表３参照）。親ＣＭＴＩタンパク質では、これらのシステインはそのタンパク質の他の場所にある他のシステイン残基とジスルフィド結合を形成するが（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１参照）。しかしＣＭＴＩライブラリからアフィニティ・リガンドを分離することに成功すると、分離物Ｎｏ．１０９の端を切り取った１５アミノ酸断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸１〜１５参照）に基づく第二のライブラリを概念化した。これらの構成要員のＣ３システインおよびＣ１０システインがジスルフィド結合を形成した場合、ｔＰＡ結合特性を有する束縛ループが得られる可能性がある。クロマトグラフィ用担体に結合したアフィニティ・リガンド分離物Ｎｏ．１０９由来の１５アミノ酸断片についての初期の研究から、Ｃ３−Ｃ１０ループが形成され、固定化ループがｔＰＡと結合したことが示された。
【０１１２】
上記の実験は、本発明による２つの新しい分離されたｔＰＡアフィニティ・リガンドファミリーを示し、このファミリーは次の配列を含むポリペプチドを含む。
Ａｒｇ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ−Ｘ８−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）および
Ａｒｇ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ−Ｘ８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）
ここで、Ｘ１はＴｒｐまたはＬｅｕ、Ｘ２はＰｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＩｌｅ、Ｘ３はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｈｒ、Ｘ４はＳｅｒ、Ｔｙｒ、ＴｈｒまたはＡｌａ、Ｘ５はＳｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＴｈｒ、Ｘ６はＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＬｙｓ、Ｘ７はＧｌｕ、ＧｌｙまたはＡｒｇ、Ｘ８は少なくともＬｙｓまたはＭｅｔである。配列中の位置１１のＭｅｔの存在は予定外であったがｔＰＡへの結合に好適であることが分かり、位置１１を他のアミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐなどの他の非極性アミノ酸で置換するとさらにｔＰＡ結合類似体を提供する可能性が高い。
【０１１３】
実施例１８
この実施例は標的ヒト化単クローン抗体の清澄化ヤギ乳汁からの分離に有用なアフィニティ・リガンドの分離を説明する。
ＩｇＧアイソタイプで特異性未知の標的精製ヒト化単クローン抗体が生産者から供給され、５０μＬＰＢＳ中に５００μｇずつ分けて−７０℃で保存した。ポリクローン・ヤギＩｇＧはCappelから購入した。
ＰＢＳで１００μＬにした種々の量（即ち１μｇ、５００μｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇおよび０μｇ）のヒト化単クローン抗体（ｈＭＡｂ）を各々Immulon２プレートの３ウェルに加え、４℃で終夜インキュベーションを行った。このウェルを０．１％非イオン性洗浄剤（Tween２０）を含むＰＢＳ２００μＬで３回洗浄した後、１ウェルにつき１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬで４℃、１時間ブロックした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（CalBiochem）を用いてプレートを試験し、ＯＰＤ基質溶液（SigmaFastNo.9187、Sigma Chemical社）で発色させ、４Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を止めて、Bio-Tekマイクロタイタ・プレート・リーダーでＡ４９０読み取りを行った。
【０１１４】
スクリーニングのため、競合結合剤としてポリクローン・ヤギＩｇＧを使用した。このスクリーニングを３個のファージ提示ライブラリ、即ちＣＭＴＩ、ＴＮ−６／Ｉ、ＴＮ−１０／Ｖを用いて行った。ＣＭＴＩの構造は上に示した（表７）。ＴＮ−６／ＩおよびＴＮ−１０／Ｖのペプチド構造は下に示した（それぞれ表１０および表１１）。以下の表に多様化された、ファージ提示ポリペプチド・ドメインがコードするアミノ酸を示す。ポリペプチドをコードするＤＮＡをＣＭＴＩライブラリに関して上に記載したのと同様にしてＭ１３遺伝子ｉｉｉに挿入した。
【表１３】
このライブラリ設計により８．５５×１０６個のタンパク質配列と１７×１０６個のＤＮＡ配列が与えられる。
【表１４】
このライブラリ設計により８．２×１０８個のタンパク質配列と１．１×１０９個のＤＮＡ配列が与えられる。
【０１１５】
４回のスクリーニングを完了した。結合スクリーニングはｐＨを中性とし、競合結合剤として結合溶液中におよそ１％多クローン・ヤギＩｇＧを含む８０ｍＭ ＮａＣｌを入れて行った。溶出はｐＨを変えることによって行った。
全ての回で共通の結合条件は、１／２倍ＰＢＳ（１／２濃度のＰＢＳ）、０．１％ＢＳＡ、１％ヤギＩｇＧ中での室温（ＲＴ）で２時間のインキュベーションであった。各回の洗浄条件と溶出条件を表１２にまとめた。
【表１５】
【０１１６】
各回後に、溶出されたファージ数を計測した後、形質導入によって増幅した。ｐＨ２の溶出液とｐＨ５の溶出液は、２回目後に別々に増幅し、その後のスクリーニングの間も分けておいたので、ｐＨ２の溶出液ではｐＨ５では放出しない候補が選別された。下の表１３は、ｐＨ２でのＴＮ−６／Ｉ、ｐＨ２でのＴＮ−１０／Ｖ、ｐＨ２でのＣＭＴＩ、ｐＨ５でのＣＭＴＩでは、４回にわたるスクリーニングで収束することを示す。
【表１６】
【０１１７】
４回の収束スクリーニングの各回から、およそ１２個のファージ分離物が予備配列決定用に選別された。ＴＮ−１０／Ｖ以外の全ての分離物で選別物間の有意な相同性が見られた。例えば、配列決定用に選別した１２個のＣＭＴＩ ｐＨ５分離物は最終的に３個のＤＮＡ配列と２個のアミノ酸配列になってしまった。で配列決定した選別物から１６個の候補を選び、相対結合親和性、特異性、ｐＨ２での放出試験で標的ｈＭＡｂに対するファージ−結合タンパク質のｐＨ放出特性を決定した。この試験の構成は、標的ｈＭＡｂ、多クローン・ヤギＩｇＧ、ＢＳＡのマイクロタイタ・プレートへの固定化後、5 Prime→3 Prime社（米国コロラド州ボールダー）のビオチニル化ヒツジ抗Ｍ１３抗体ＥＬＩＳＡキットを用いてファージの相対結合度を測定する操作を含む。
試験したファージ分離物の名称は
・ＴＮ−６／Ｉ、ｐＨ２放出から：Ｔ４１、Ｔ４２、Ｔ４８、Ｔ４９、Ｔ５２
・ＴＮ−１０／Ｖ、ｐＨ２放出から：Ｔ６１、Ｔ６４、Ｔ６６、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｔ７４、Ｔ７５
・ＣＭＴＩ、ｐＨ５放出から：Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３
・ＣＭＴＩ、ｐＨ２放出から：Ｃ３
であった。
【０１１８】
個々の分離ファージは固定化ｈＭＡｂ、ヤギＩｇＧ、ＢＳＡへの結合について試験した。あわせて親ファージ対照のｈＭＡｂ、ヤギＩｇＧ、ＢＳＡ、抗Ｍ１３抗体への結合も試験した。ｈＭＡｂ、ヤギＩｇＧ、ＢＳＡへの結合は、１／２倍ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ溶液中に０．５％ヤギＩｇＧが存在する状態で、ｐＨ７およびｐＨ２の−２通りのｐＨ条件下で行った。ストレプトアビジン複合アルカリホスファターゼを使用してビオチニル化検出抗Ｍ１３抗体を視覚化した。マイクロタイタ・プレートは、Bio-Tekマイクロタイタ・プレート・リーダーにより４０５ｎｍで読み取りを行った。その結果を第５図、第６図、第７図に示す。これらのファージのうち「ＣＭＴＩ」、［ＭＡＥＸ］、「ＭＫＴＮ」は「親」結合ドメイン候補を提示する対照ファージである。即ちＣＭＴＩ対照は野生ＣＭＴＩ−Ｉ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を持ち、ＭＡＥＸはＴＮ−６／Ｉライブラリから無作為に選ばれた非結合性メンバーで、ＭＫＴＮはＴＮ−１０／Ｖライブラリから無作為に選ばれた非結合性メンバーである。可能アフィニティ・リガンドの同定は、（１）標的ｈＭＡｂに対して対照ファージより有意に高い結合親和性を持つこと、（２）溶出条件（ｐＨ２）よりも結合条件（ｐＨ７）下で標的に対して有意に高い結合親和性を持つこと、（３）ヤギＩｇＧへの結合がほとんどないか、全くないことを指標に行った。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡの結果から、Ｃ３，Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３（Ｃ２２と同じアミノ酸配列）、Ｔ４２、Ｔ４９、Ｔ５２の７個の（６個の結合ポリペプチドをコードする）ＤＮＡ分離物がアフィニティ・リガンドとして使用するのに適していた。ＣＭＴＩ−Ｉ ｐＨ５分離物およびＴＮ−６／Ｉ ｐＨ２分離物における多様性の低下を下の表１４、表１５に示す。
【表１７】
【表１８】
【０１２０】
ＣＭＴＩ類似体中のいろいろななアミノ酸位置５、６、７、９およびＴＮ−６／Ｉ類似体中のいろいろなアミノ酸位置４、６、７、９、１０でのアミノ酸タイプが単一であることから、これらのライブラリ由来のコンセンサス・ペプチドの収束が強力であることが示される。これらの類似体運搬ファージを増幅し、コードされる挿入ＤＮＡを分離、配列決定すると、ｈＭＡｂ精製用の特異的アフィニティ・リガンド候補が明らかになる。
【０１２１】
実施例１９
この実施例は、天然ウロキナーゼの分離に有用なアフィニティ・リガンドの分離を説明する。
分子量が大きい人尿由来のウロキナーゼをMarklandら（1996年）記載の方法で４℃でReactiGelＴＭアガロース・ビーズ（Pierce Chemical社）に固定した。
【０１２２】
スクリーニングは、ＣＭＴＩ、ＴＮ−６／Ｉ、ＴＮ−１０／ＶＩＩＩａ、ＬＡＣＩ／Ｆの４個のファージ提示ライブラリを用いて行った。ＣＭＴＩの構築は 前に（表７）示した。ＴＮ−６／Ｉの構築は前に示した（表１０）。ＴＮ−１０／ＶＩＩＩａおよびＬＡＣＩ／Ｆのペプチド構築は下に示す（それぞれ表１６および表１７）。下表に、多様化ファージ提示ポリペプチド・ドメインがコードするアミノ酸を示す。ＣＭＴＩライブラリに関して上に記載したように（実施例１６、表７）、このポリペプチドをコードするＤＮＡを遺伝子ＩＩＩに挿入した。
【表１９】
このライブラリ設計により２．３×１０７個のタンパク質配列と１．３×１０８個のＤＮＡ配列が与えられる。
【表２０】
【表２１】
このライブラリ設計により３．１２×１０４個のタンパク質配列が与えられる。
【０１２３】
スクリーニングの前に、固定化ウロキナーゼ・アガロース・ビーズをそれぞれ親結合ドメイン・ポリペプチドを提示する純粋クローンファージ調製物で試験して、スクリーニング条件下では回収されるファージは低いバックグラウンド・レベルにあることを確認した。親ポリペプチドの各々について、回収されたファージの投入ファージに対する割合は１×１０−５以下であり、十分に低いバックグラウンド・レベルの結合であった。
【０１２４】
スクリーニングは４回行った。各回の構成は、結合段階、洗浄処理、１段階以上の溶出段階であった。全回共通の結合条件は、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Tween８０中での４℃、２０時間のインキュベーションであった。各回の洗浄条件および溶出条件を表１８にまとめた。
【表２２】
【０１２５】
各回後に、溶出されたファージ数を計測した後、形質導入によって増幅した。
ｐＨ２の溶出液とｐＨ５の溶出液は、２回目後に別々に増幅し、その後のスクリーニングの間も分けておいたので、ｐＨ２の溶出液ではｐＨ５では放出しない候補が選別された。下の表１８は、各ライブラリが４回にわたるスクリーニングで収束することを示す。
【表２３】
【０１２６】
収束性スクリーニングは回数を重ねると投入分に対する割合が大きくなるスクリーニングであり、これはファージ・ライブラリの多様性が小さくなっていることを示している。これは固定化標的分子に対するリガンド候補が集団から選別されているかもしれないことを示すので、望ましい結果である。上表は、全てのライブラリで２回目と４回目との間にいくらか収束があることを示している。もっともはっきりした結果はＴＮ−６／Ｉ（ｐＨ２）およびＣＭＴＩ（ｐＨ５）の場合である。
【０１２７】
４回の収束スクリーニングの各回から、およそ１２個のファージ分離物を配列決定用に選んだ。配列決定を行った全ての分離物において相互の相同性がいくらか見られた。最大の相同性はＴＮ−６／Ｉの配列間およびＣＭＴＩの配列間に見られ、スクリーニング中、これらのライブラリの濃縮がもっとも大きかったという知見と一致している。例えば、ＴＮ−６／Ｉ分離物のうち９個が同一のＤＮＡおよびアミノ酸配列を有することが分かった。
【０１２８】
候補を選んで、相対結合親和性、特異性、ｐＨ２での放出試験によるファージ−結合タンパク質のｐＨ放出特性の特性決定を行った。この試験の構成には、ウロキナーゼおよびＢＳＡのImmulon 2マイクロタイタ・プレートへの固定化と、5 Prime→3 Prime社（米国コロラド州ボールダー）のビオチニル化ヒツジ抗Ｍ１３抗体ＥＬＩＳＡキットを用いたファージの相対結合度を測定する操作が含まれる。
試験したファージ分離物の名称は
・ＴＮ−６／Ｉ、ｐＨ２放出から：ＴＵ３３、ＴＵ３４、ＴＵ３６、ＴＵ３７、ＴＵ３９、ＴＵ４２
・ＴＮ−１０／ＶＩＩＩａ、ｐＨ２放出から：ＴＵ５０、ＴＵ５１、ＴＵ５３、ＴＵ５４、ＴＵ５５、ＴＵ５６、ＴＵ５７、ＴＵ５８、ＴＵ６０、ＴＵ６２、ＴＵ６３
・ＣＭＴＩ、ｐＨ５放出から：ＣＵ２２、ＣＵ２５、ＣＵ２７、ＣＵ２８、ＣＵ２９、ＣＵ３１、ＣＵ３２
・ＬＡＣＩ／Ｆ、ｐＨ２放出から：ＬＵ２、ＬＵ４、ＬＵ５，ＬＵ９、ＬＵ１０、ＬＵ１２
であった。
【０１２９】
個々の分離ファージの固定化ウロキナーゼまたはＢＳＡへの結合を試験した。ウロキナーゼはｔＰＡに対する配列の相同性が高いので、ｔＰＡ結合についても候補を試験した。その結果を第８図、第９図、第１０図、第１１図に示す。可能アフィニティ・リガンドは、（１）標的ウロキナーゼに対して対照ファージより有意に高い結合親和性を持つこと、（２）溶出条件（ｐＨ２）よりも結合条件（ｐＨ７）下で標的に対して有意に高い結合親和性を持つこと、（３）ＢＳＡへの結合がほとんどないか、全くないことを指標として同定された。
【０１３０】
ＥＬＩＳＡの結果から、ＴＵ３３，ＴＵ３６、ＴＵ３９、ＴＵ４２、ＴＵ５３、ＴＵ５６、ＴＵ５８の７個のＤＮＡ分離物（４個はＴＮ−６／Ｉから、３個はＴＮ−１０／ＶＩＩＩａから）がアフィニティ・リガンドとして使用するのに適していた。７個の分離物全てがｐＨ７でウロキナーゼに対する高い親和性を示し、ｐＨ２で低い親和性を示した。ＣＭＴＩライブラリとＬＡＣＩ／Ｆライブラリのどちらからもウロキナーゼに対する親和性が親提示ファージよりも高いリガンド候補は発見されなかった。ＣＭＴＩ−Ｉ ｐＨ５分離物間およびＴＮ−６／Ｉ ｐＨ２分離物間の多様性の低下を下の表２１、表２２に示す。
【表２４】
【表２５】
【０１３１】
ＴＮ−６／Ｉ類似体中の様々なアミノ酸位置７、８、１１でのアミノ酸タイプが単一であること、およびＴＮ−１０／ＶＩＩＩａ類似体中の様々なアミノ酸位置７、９、１１、１４でのアミノ酸の多様性の急激な低下から、これらのライブラリ由来のコンセンサス・ペプチドの収束が強力であることが示される。これらの類似体を担うファージを増幅し、コードされる挿入ＤＮＡを分離、配列決定すると、ウロキナーゼ精製用の特異的アフィニティ・リガンド候補が明らかになる。
【０１３２】
上記の記載に従うと、あらゆる供給流から標的を分離するために重要な特性を、設計されたライブラリの結合ドメインに組み込むことが可能であり、そのため、本発明の方法によると所望の結合条件と放出条件下で標的を分離するのに有用な数個のアフィニティ・リガンド候補が必ず得られる。標的製品の失活や破壊なしに、高い純度で、近縁の不純物までも除去して、容認できるコストで、材料を再使用、再生利用して、標的の高い収率を達成するという全てが本発明によると可能である。本発明のさらなる実施形態および特定の標的にあわせた別法は以上の記載を研究すれば明らかとなろう。かような実施形態及び別法はすべて以下の請求の範囲によって定義した本発明の範囲内であるとする。
【０１３３】
［参考文献］
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子を含む溶液から標的分子を分離するのに適したアフィニティ・リガンドを分離する方法であって、
（ａ）標的分子に関して、アフィニティ・リガンドが標的分子と結合することが望まれる第一の溶液条件（即ち結合条件）を選択すること、
（ｂ）標的分子に関して、標的分子とアフィニティ・リガンドとのアフィニティ複合体が解離する、第一の溶液条件と異なる第二の溶液条件（即ち結合条件）を選択すること、
（ｃ）結合ドメイン候補とはドメイン中の１又はそれ以上のアミノ酸が異なっている、結合ドメイン候補の類似体のライブラリを供給すること、
（ｄ）類似体ライブラリを第一の溶液条件で標的分子を含む溶液と類似体／標的結合複合体を形成するのに十分な時間接触させること、
（ｅ）第一の溶液条件下で結合しなかった類似体を除去すること、
（ｆ）接触段階（ｄ）の溶液条件を第二の溶液条件に変更すること、
（ｇ）第二の溶液条件下で放出される結合類似体を回収すること、ここで回収された類似体は分離アフィニティ・リガンドと同定される、
を含む方法。
【請求項２】
方法の予備段階として、標的分子を含む溶液中での標的分子の安定性の範囲を温度、ｐＨ、イオン強度、誘電率、溶質濃度、金属イオンの有無、キレート剤の有無から選択した複数のパラメータに関して確かめることによって標的分子の安定性エンベロープを画定し、第一の溶液条件および第二の溶液条件が安定性エンベロープの範囲内であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
安定性エンベロープがｐＨの範囲、塩濃度の範囲、および尿素またはＥＤＴＡの濃度範囲によって画定されることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｃ）で提供されるライブラリが、第一の溶液条件下で結合ドメイン類似体と標的分子との間の水素結合の形成を促進するよう結合ドメイン候補のなかのアミノ酸位置で置換をおこすことによって設計され、この置換アミノ酸がＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹからなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｃ）で提供されるライブラリが、第一の溶液条件と第二の溶液条件との間のｐＨ変化に対する標的と類似体との結合の感受性を増すよう結合ドメイン候補内のアミノ酸位置でアミノ酸を置換することによって設計され、変化させたアミノ酸位置のいずれかにおけるこの置換アミノ酸にはＨ、Ｅ、Ｄ、ＹおよびＫが含まれることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｃ）でライブラリが、第一の溶液条件での類似体の標的分子への結合親和性を促進し、または第二の溶液条件での結合親和性の低下を促進するよう、ある位置に挿入されたアミノ酸を含む点で結合ドメイン候補と異なる類似体を含むことを特徴とする請求項の範囲第１項に記載の方法。
【請求項７】
結合ドメイン候補の類似体をその標的への親和性がｐＨの変化、塩濃度、尿素の濃度またはＥＤＴＡの濃度に基づいて変わるように調製し、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ｈ、Ｑからなるグループから選択するアミノ酸にドメイン内の１個以上のアミノ酸位置で置換することによって類似体のライブラリを結合ドメイン候補とは異なる類似体を含むように作成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】
一組のアミノ酸をコードする多様化ＤＮＡコドンを用いることによって類似体のライブラリを作成し、多様化ＤＮＡコドンを
アミノ酸の組Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇを許容するＲＮＳ、
アミノ酸の組Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｄを許容するＮＡＴ、
アミノ酸の組Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅを許容するＮＡＳ、
アミノ酸の組Ｙ、Ｃ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、Ｓ、Ｄ、Ｇを許容するＮＲＴおよび
アミノ酸の組Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｇを許容するＲＲＳ
から選択することを特徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
標的分子がｐＨの範囲、温度範囲および塩濃度の範囲によって画定される安定性エンベロープ内で安定であり、
Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ
Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅおよび
Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｔ
のグループから選択されるアミノ酸で、ドメイン内の１個以上のアミノ酸位置を置き換えることによって類似体のライブラリを結合ドメイン候補とは異なる類似体を含むように作成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１０】
標的分子が有機溶媒中での溶解度、温度範囲および塩濃度の範囲によって画定される安定性エンベロープ内で安定であり、第一の溶液条件下での結合ドメイン候補類似体と標的分子との疎水相互作用を促進するように選択するアミノ酸で、ドメイン内の１個以上のアミノ酸位置を置き換えることによって類似体のライブラリを結合ドメイン候補と異なる類似体を含むように作成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１１】
置換にＨ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷおよびＹからなるグループから選択する１個以上のアミノ酸を使用することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
一組のアミノ酸をコードする多様化ＤＮＡコドンを使用することによって類似体のライブラリを作成し、多様化ＤＮＡコドンを
アミノ酸の組Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖを許容するＮＹＴ、
アミノ酸の組Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖを許容するＮＴＴおよび
アミノ酸の組Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｗを許容するＴＮＳ
から選択することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１３】
標的分子が温度範囲によって部分的に画定される定性エンベロープ内で安定であり、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｈｒからなるグループから選択されるアミノ酸でドメイン内の１個以上のアミノ酸位置が置換されることにより結合ドメイン候補と異なる類似体を含むように類似体ライブラリを作成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１４】
標的分子が
１）ｐＨ２〜ｐＨ１１の範囲、
２）１ｍＭ〜２５０ｍＭ ＮａＣｌの範囲および
３）４℃〜４０℃の範囲
の条件下で安定であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１５】
第一の溶液条件がｐＨ７、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２２℃であり、第二の溶液条件がｐＨ５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２２℃であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
標的分子が
１）ｐＨ６．２〜ｐＨ７．８の範囲、
２）１００ｍＭ〜５Ｍ ＮａＣｌの範囲および
３）４℃〜４０℃の範囲
の条件下で安定であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１７】
第一の溶液条件がｐＨ７．２、３Ｍ ＮａＣｌおよび２２℃であり、第二の溶液条件がｐＨ７．２、２Ｍ ＮａＣｌおよび２２℃であることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１８】
標的分子が
１）ｐＨ６．２〜ｐＨ７．８の範囲、
２）１ｎＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの範囲、
３）１ｎＭ〜１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４の範囲、
２）０〜６０体積％のアセトニトリルの範囲および
３）０℃〜４０℃の範囲
の条件下で安定であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１９】
第一の溶液条件がｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４および３７℃であり、第二の溶液条件がｐＨ７．２、５ｎＭ ＮａＣｌ、３７℃および５０体積％のアセトニトリルであることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項２０】
標的分子が最高５０体積％までの有機溶媒が存在する状態で安定であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２１】
有機溶媒をエタノール、メタノールおよびイソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、エチルアセトン、アセトニトリルおよびＣＨ２Ｃｌ２からなるグループから選択することを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の方法。
【請求項２２】
第一の溶液条件および第二の溶液条件がアセトニトリル、エタノール、アセトン、ヘキサン、メタン、イソプロピルアルコール、エチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、水およびこのような溶媒の混合物からなるグループから選択される溶媒を要求し、第一の溶液条件での溶媒の濃度が第二の溶液条件での濃度と少なくとも１０体積％異なることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２３】
第一の溶液条件および第二の溶液条件がアセトニトリル、エタノール、アセトン、ヘキサン、メタン、イソプロピルアルコール、エチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、水およびこのような溶媒の混合物からなるグループから選択される溶媒を要求し、第一条件での溶液の誘電率と第二条件での溶液の誘電率とが少なくとも１０％異なることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２４】
第一の溶液条件および第二の溶液条件がアセトニトリル、エタノール、アセトン、ヘキサン、メタン、イソプロピルアルコール、エチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、水およびこのような溶媒の混合物からなるグループから選択される溶媒を要求し、第一の条件での溶媒の濃度が第二の条件での濃度と表面張力を少なくとも１０％変えるのに十分なだけ異なることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｊ）で同定される１個またはそれ以上のアフィニティ・リガンドを結合ドメイン候補として使用し、段階（ｃ）から段階（ｇ）までを反復することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２６】
各類似体をコードする合成ＤＮＡを複製可能な遺伝子パッケージ中に挿入することによって類似体のライブラリを調製する結果、発現に際して類似体結合ドメインを遺伝子パッケージの表面に提示することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２７】
複製可能な遺伝子パッケージがバクテリオファージであることを特徴とする請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２８】
バクテリオファージがＭ１３であり合成ＤＮＡを遺伝子ｉｉｉに挿入することを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の方法。
【請求項２９】
接触段階（ｃ）の前に標的を固定することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３０】
第一の溶液条件下で高い特異性で標的分子と結合し、第二の溶液条件下で標的分子を放出する設計されたアフィニティ・リガンドをコードするＤＮＡを得る方法であって、
（ａ）請求の範囲第２５項に記載の方法によって複製可能な遺伝子パッケージ表面に発現した１個以上のアフィニティ・リガンドを得ることと、
（ｂ）遺伝子パッケージを増殖させることと、
（ｃ）増幅した遺伝子パッケージから合成ＤＮＡを分離することと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
（ａ）請求の範囲第３０項に記載の方法によって遺伝子発現システム中に分離した合成ＤＮＡを発現して設計されたアフィニティ・リガンドを作成することと、
（ｂ）設計したアフィニティ・リガンドを回収すること、
とを含むことを特徴とする、ほぼ純粋な設計されたアフィニティ・リガンドを得る方法。
【請求項３２】
（ａ）請求の範囲第１項に記載の方法によって得られた設計されたアフィニティ・リガンドを固定化することと、
（ｂ）標的分子のアフィニティ・リガンドへの結合が可能になる条件下で溶液を固定化アフィニティ・リガンドに接触させることと、
（ｃ）結合した標的分子を溶出すること
とを含むことを特徴とする、標的分子を含む溶液から標的分子を精製する方法。
【請求項３３】
段階（ｃ）で、第二の溶液条件を用いて標的分子を溶出することを特徴とする請求の範囲第３２項に記載の方法。
【請求項３４】
段階（ｂ）で、第一の溶液条件を用いて標的分子と接触させることを特徴とする請求の範囲第３２項に記載の方法。
【請求項３５】
所望の結合特性および放出特性を結合ドメイン候補と類似した構造を有するポリペプチド・アフィニティ・リガンドに持たせて、標的分子を含む溶液から標的分子を分離するのに有用な設計したアフィニティ・リガンドを作成する方法であって、方法が
（ａ）標的分子に関して、設計したアフィニティ・リガンドが標的分子と結合することが望まれる第一溶液条件を選択することと、
（ｂ）標的分子に関して、設計したアフィニティ・リガンドが標的分子と結合しないことが望まれる、第一の溶液条件とは異なる第二の溶液条件を選択することと、
（ｃ）ドメイン内の１個以上のアミノ酸位置で結合ドメイン候補のアミノ酸配列を変化させることによって各類似体が結合ドメイン候補と異なる、結合ドメイン候補由来の多様なポリペプチド類似体を提供することと、
（ｄ）多様な類似体を第一の溶液条件で類似体／標的結合複合体が形成されるのに十分な時間標的分子を含む溶液と接触させることと、
（ｅ）第一の溶液条件下で標的と結合しない類似体を除去することと、
（ｆ）接触段階（ｄ）の条件を第二の溶液条件に変更することと、
（ｇ）第二の溶液条件下で放出された類似体を回収することであって、ここで回収された類似体が設計されたアフィニティ・リガンドを同定すること
とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
多様な類似体が少なくとも１０６個の類似体に達することを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の方法。
【請求項３７】
多様な類似体が、各類似体をコードする合成ＤＮＡを複製可能な遺伝子パッケージに挿入し、その結果発現に際して類似体結合ドメインが遺伝子パッケージの表面に提示されることにより調製されることを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の方法。
【請求項３８】
複製可能な遺伝子パッケージがバクテリオファージであることを特徴とする請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項３９】
バクテリオファージがＭ１３であり合成ＤＮＡを遺伝子ｉｉｉに挿入することを特徴とする請求の範囲第３８項に記載の方法。
【請求項４０】
接触段階（ｄ）の前に標的を固定化することを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の方法。
【請求項４１】
第一の溶液条件で標的分子と結合する親和性を有し、第二の溶液条件では標的分子と結合する親和性が実質的に低下する、合成の設計されたアフィニティ・リガンドであって、該アフィニティ・リガンドが
既知の結合ドメイン候補に類似したアミノ酸配列を有する設計されたポリプペチド結合ドメインを含み、
設計されたポリプペチド結合ドメインのアミノ酸配列は結合ドメイン候補のアミノ酸配列とが、結合ドメイン候補の１個以上のアミノ酸位置のアミノ酸が、設計されたポリプペチド結合ドメインに第二の溶液条件では結合親和性が低下するような特性を付与するアミノ酸に置換されている点で異なる
ことを特徴とする設計したアフィニティ・リガンド。
【請求項４２】
立体配座の束縛をうけていることを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンドであって、該立体配座の束縛は、結合ドメインのアミノ酸をペプチド結合以外の科学結合によって結合することによって与えられ、少なくとも４０℃の融点を有する構造中で十分に安定であることを特徴とするアフィニティ・リガンド。
【請求項４３】
請求の範囲第４１項に記載の設計したアフィニティ・リガンドであって、置換アミノ酸を特定の性質を付与する下記アミノ酸のグループから選択することを特徴とするアフィニティ・リガンド。
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化と有機溶媒および塩の存在に対して応答性にする、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｄ、ＥおよびG；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化に対して応答性にする、Ｙ、Ｈ、ＮおよびＤ；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化に対して応答性にするＹ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、ＤおよびＥ；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化と有機溶媒および塩の存在に対して応答性にする、Ｙ、Ｃ、Ｒ、Ｎ、Ｓ、ＤおよびＧ；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化と有機溶媒および塩の存在に対して応答性にする、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、ＥおよびＧ；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化と有機溶媒および塩の存在に対して応答性にする、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｌ、ＩおよびＶ；
アフィニティ・リガンドを有機溶媒または塩の濃度変化に対して応答性にする、Ｆ、Ｌ、ＩおよびＶ；
アフィニティ・リガンドを有機溶媒または塩の濃度変化に対して応答性にする、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、およびＷ。
【請求項４４】
予め選択したｐＨで標的分子と結合し、別の予め選択したｐＨで標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４５】
予め選択した塩濃度で標的分子と結合し、別の予め選択した塩濃度で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４６】
予め選択した尿素の濃度で標的分子と結合し、別の予め選択した尿素の濃度で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４７】
予め選択したＥＤＴＡの濃度で標的分子と結合し、別の予め選択したＥＤＴＡの濃度で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４８】
予め選択した体積百分率の有機溶媒溶液で標的分子と結合し、別の予め選択した体積百分率の有機溶媒溶液で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４９】
予め選択した温度で標的分子と結合し、別の予め選択した温度で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項１】
標的分子を含む溶液から標的分子を分離するのに適したアフィニティ・リガンドを分離する方法であって、
（ａ）標的分子に関して、アフィニティ・リガンドが標的分子と結合することが望まれる第一の溶液条件（即ち結合条件）を選択すること、
（ｂ）標的分子に関して、標的分子とアフィニティ・リガンドとのアフィニティ複合体が解離する、第一の溶液条件と異なる第二の溶液条件（即ち結合条件）を選択すること、
（ｃ）結合ドメイン候補とはドメイン中の１又はそれ以上のアミノ酸が異なっている、結合ドメイン候補の類似体のライブラリを供給すること、
（ｄ）類似体ライブラリを第一の溶液条件で標的分子を含む溶液と類似体／標的結合複合体を形成するのに十分な時間接触させること、
（ｅ）第一の溶液条件下で結合しなかった類似体を除去すること、
（ｆ）接触段階（ｄ）の溶液条件を第二の溶液条件に変更すること、
（ｇ）第二の溶液条件下で放出される結合類似体を回収すること、ここで回収された類似体は分離アフィニティ・リガンドと同定される、
を含む方法。
【請求項２】
方法の予備段階として、標的分子を含む溶液中での標的分子の安定性の範囲を温度、ｐＨ、イオン強度、誘電率、溶質濃度、金属イオンの有無、キレート剤の有無から選択した複数のパラメータに関して確かめることによって標的分子の安定性エンベロープを画定し、第一の溶液条件および第二の溶液条件が安定性エンベロープの範囲内であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
安定性エンベロープがｐＨの範囲、塩濃度の範囲、および尿素またはＥＤＴＡの濃度範囲によって画定されることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｃ）で提供されるライブラリが、第一の溶液条件下で結合ドメイン類似体と標的分子との間の水素結合の形成を促進するよう結合ドメイン候補のなかのアミノ酸位置で置換をおこすことによって設計され、この置換アミノ酸がＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹからなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｃ）で提供されるライブラリが、第一の溶液条件と第二の溶液条件との間のｐＨ変化に対する標的と類似体との結合の感受性を増すよう結合ドメイン候補内のアミノ酸位置でアミノ酸を置換することによって設計され、変化させたアミノ酸位置のいずれかにおけるこの置換アミノ酸にはＨ、Ｅ、Ｄ、ＹおよびＫが含まれることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｃ）でライブラリが、第一の溶液条件での類似体の標的分子への結合親和性を促進し、または第二の溶液条件での結合親和性の低下を促進するよう、ある位置に挿入されたアミノ酸を含む点で結合ドメイン候補と異なる類似体を含むことを特徴とする請求項の範囲第１項に記載の方法。
【請求項７】
結合ドメイン候補の類似体をその標的への親和性がｐＨの変化、塩濃度、尿素の濃度またはＥＤＴＡの濃度に基づいて変わるように調製し、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ｈ、Ｑからなるグループから選択するアミノ酸にドメイン内の１個以上のアミノ酸位置で置換することによって類似体のライブラリを結合ドメイン候補とは異なる類似体を含むように作成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】
一組のアミノ酸をコードする多様化ＤＮＡコドンを用いることによって類似体のライブラリを作成し、多様化ＤＮＡコドンを
アミノ酸の組Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇを許容するＲＮＳ、
アミノ酸の組Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｄを許容するＮＡＴ、
アミノ酸の組Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅを許容するＮＡＳ、
アミノ酸の組Ｙ、Ｃ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、Ｓ、Ｄ、Ｇを許容するＮＲＴおよび
アミノ酸の組Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｇを許容するＲＲＳ
から選択することを特徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
標的分子がｐＨの範囲、温度範囲および塩濃度の範囲によって画定される安定性エンベロープ内で安定であり、
Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ
Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅおよび
Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｔ
のグループから選択されるアミノ酸で、ドメイン内の１個以上のアミノ酸位置を置き換えることによって類似体のライブラリを結合ドメイン候補とは異なる類似体を含むように作成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１０】
標的分子が有機溶媒中での溶解度、温度範囲および塩濃度の範囲によって画定される安定性エンベロープ内で安定であり、第一の溶液条件下での結合ドメイン候補類似体と標的分子との疎水相互作用を促進するように選択するアミノ酸で、ドメイン内の１個以上のアミノ酸位置を置き換えることによって類似体のライブラリを結合ドメイン候補と異なる類似体を含むように作成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１１】
置換にＨ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷおよびＹからなるグループから選択する１個以上のアミノ酸を使用することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
一組のアミノ酸をコードする多様化ＤＮＡコドンを使用することによって類似体のライブラリを作成し、多様化ＤＮＡコドンを
アミノ酸の組Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖを許容するＮＹＴ、
アミノ酸の組Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖを許容するＮＴＴおよび
アミノ酸の組Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｗを許容するＴＮＳ
から選択することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１３】
標的分子が温度範囲によって部分的に画定される定性エンベロープ内で安定であり、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｈｒからなるグループから選択されるアミノ酸でドメイン内の１個以上のアミノ酸位置が置換されることにより結合ドメイン候補と異なる類似体を含むように類似体ライブラリを作成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１４】
標的分子が
１）ｐＨ２〜ｐＨ１１の範囲、
２）１ｍＭ〜２５０ｍＭ ＮａＣｌの範囲および
３）４℃〜４０℃の範囲
の条件下で安定であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１５】
第一の溶液条件がｐＨ７、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２２℃であり、第二の溶液条件がｐＨ５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２２℃であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
標的分子が
１）ｐＨ６．２〜ｐＨ７．８の範囲、
２）１００ｍＭ〜５Ｍ ＮａＣｌの範囲および
３）４℃〜４０℃の範囲
の条件下で安定であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１７】
第一の溶液条件がｐＨ７．２、３Ｍ ＮａＣｌおよび２２℃であり、第二の溶液条件がｐＨ７．２、２Ｍ ＮａＣｌおよび２２℃であることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１８】
標的分子が
１）ｐＨ６．２〜ｐＨ７．８の範囲、
２）１ｎＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの範囲、
３）１ｎＭ〜１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４の範囲、
２）０〜６０体積％のアセトニトリルの範囲および
３）０℃〜４０℃の範囲
の条件下で安定であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１９】
第一の溶液条件がｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４および３７℃であり、第二の溶液条件がｐＨ７．２、５ｎＭ ＮａＣｌ、３７℃および５０体積％のアセトニトリルであることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項２０】
標的分子が最高５０体積％までの有機溶媒が存在する状態で安定であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２１】
有機溶媒をエタノール、メタノールおよびイソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、エチルアセトン、アセトニトリルおよびＣＨ２Ｃｌ２からなるグループから選択することを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の方法。
【請求項２２】
第一の溶液条件および第二の溶液条件がアセトニトリル、エタノール、アセトン、ヘキサン、メタン、イソプロピルアルコール、エチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、水およびこのような溶媒の混合物からなるグループから選択される溶媒を要求し、第一の溶液条件での溶媒の濃度が第二の溶液条件での濃度と少なくとも１０体積％異なることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２３】
第一の溶液条件および第二の溶液条件がアセトニトリル、エタノール、アセトン、ヘキサン、メタン、イソプロピルアルコール、エチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、水およびこのような溶媒の混合物からなるグループから選択される溶媒を要求し、第一条件での溶液の誘電率と第二条件での溶液の誘電率とが少なくとも１０％異なることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２４】
第一の溶液条件および第二の溶液条件がアセトニトリル、エタノール、アセトン、ヘキサン、メタン、イソプロピルアルコール、エチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、水およびこのような溶媒の混合物からなるグループから選択される溶媒を要求し、第一の条件での溶媒の濃度が第二の条件での濃度と表面張力を少なくとも１０％変えるのに十分なだけ異なることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｊ）で同定される１個またはそれ以上のアフィニティ・リガンドを結合ドメイン候補として使用し、段階（ｃ）から段階（ｇ）までを反復することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２６】
各類似体をコードする合成ＤＮＡを複製可能な遺伝子パッケージ中に挿入することによって類似体のライブラリを調製する結果、発現に際して類似体結合ドメインを遺伝子パッケージの表面に提示することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２７】
複製可能な遺伝子パッケージがバクテリオファージであることを特徴とする請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２８】
バクテリオファージがＭ１３であり合成ＤＮＡを遺伝子ｉｉｉに挿入することを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の方法。
【請求項２９】
接触段階（ｃ）の前に標的を固定することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３０】
第一の溶液条件下で高い特異性で標的分子と結合し、第二の溶液条件下で標的分子を放出する設計されたアフィニティ・リガンドをコードするＤＮＡを得る方法であって、
（ａ）請求の範囲第２５項に記載の方法によって複製可能な遺伝子パッケージ表面に発現した１個以上のアフィニティ・リガンドを得ることと、
（ｂ）遺伝子パッケージを増殖させることと、
（ｃ）増幅した遺伝子パッケージから合成ＤＮＡを分離することと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
（ａ）請求の範囲第３０項に記載の方法によって遺伝子発現システム中に分離した合成ＤＮＡを発現して設計されたアフィニティ・リガンドを作成することと、
（ｂ）設計したアフィニティ・リガンドを回収すること、
とを含むことを特徴とする、ほぼ純粋な設計されたアフィニティ・リガンドを得る方法。
【請求項３２】
（ａ）請求の範囲第１項に記載の方法によって得られた設計されたアフィニティ・リガンドを固定化することと、
（ｂ）標的分子のアフィニティ・リガンドへの結合が可能になる条件下で溶液を固定化アフィニティ・リガンドに接触させることと、
（ｃ）結合した標的分子を溶出すること
とを含むことを特徴とする、標的分子を含む溶液から標的分子を精製する方法。
【請求項３３】
段階（ｃ）で、第二の溶液条件を用いて標的分子を溶出することを特徴とする請求の範囲第３２項に記載の方法。
【請求項３４】
段階（ｂ）で、第一の溶液条件を用いて標的分子と接触させることを特徴とする請求の範囲第３２項に記載の方法。
【請求項３５】
所望の結合特性および放出特性を結合ドメイン候補と類似した構造を有するポリペプチド・アフィニティ・リガンドに持たせて、標的分子を含む溶液から標的分子を分離するのに有用な設計したアフィニティ・リガンドを作成する方法であって、方法が
（ａ）標的分子に関して、設計したアフィニティ・リガンドが標的分子と結合することが望まれる第一溶液条件を選択することと、
（ｂ）標的分子に関して、設計したアフィニティ・リガンドが標的分子と結合しないことが望まれる、第一の溶液条件とは異なる第二の溶液条件を選択することと、
（ｃ）ドメイン内の１個以上のアミノ酸位置で結合ドメイン候補のアミノ酸配列を変化させることによって各類似体が結合ドメイン候補と異なる、結合ドメイン候補由来の多様なポリペプチド類似体を提供することと、
（ｄ）多様な類似体を第一の溶液条件で類似体／標的結合複合体が形成されるのに十分な時間標的分子を含む溶液と接触させることと、
（ｅ）第一の溶液条件下で標的と結合しない類似体を除去することと、
（ｆ）接触段階（ｄ）の条件を第二の溶液条件に変更することと、
（ｇ）第二の溶液条件下で放出された類似体を回収することであって、ここで回収された類似体が設計されたアフィニティ・リガンドを同定すること
とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
多様な類似体が少なくとも１０６個の類似体に達することを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の方法。
【請求項３７】
多様な類似体が、各類似体をコードする合成ＤＮＡを複製可能な遺伝子パッケージに挿入し、その結果発現に際して類似体結合ドメインが遺伝子パッケージの表面に提示されることにより調製されることを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の方法。
【請求項３８】
複製可能な遺伝子パッケージがバクテリオファージであることを特徴とする請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項３９】
バクテリオファージがＭ１３であり合成ＤＮＡを遺伝子ｉｉｉに挿入することを特徴とする請求の範囲第３８項に記載の方法。
【請求項４０】
接触段階（ｄ）の前に標的を固定化することを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の方法。
【請求項４１】
第一の溶液条件で標的分子と結合する親和性を有し、第二の溶液条件では標的分子と結合する親和性が実質的に低下する、合成の設計されたアフィニティ・リガンドであって、該アフィニティ・リガンドが
既知の結合ドメイン候補に類似したアミノ酸配列を有する設計されたポリプペチド結合ドメインを含み、
設計されたポリプペチド結合ドメインのアミノ酸配列は結合ドメイン候補のアミノ酸配列とが、結合ドメイン候補の１個以上のアミノ酸位置のアミノ酸が、設計されたポリプペチド結合ドメインに第二の溶液条件では結合親和性が低下するような特性を付与するアミノ酸に置換されている点で異なる
ことを特徴とする設計したアフィニティ・リガンド。
【請求項４２】
立体配座の束縛をうけていることを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンドであって、該立体配座の束縛は、結合ドメインのアミノ酸をペプチド結合以外の科学結合によって結合することによって与えられ、少なくとも４０℃の融点を有する構造中で十分に安定であることを特徴とするアフィニティ・リガンド。
【請求項４３】
請求の範囲第４１項に記載の設計したアフィニティ・リガンドであって、置換アミノ酸を特定の性質を付与する下記アミノ酸のグループから選択することを特徴とするアフィニティ・リガンド。
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化と有機溶媒および塩の存在に対して応答性にする、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｄ、ＥおよびG；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化に対して応答性にする、Ｙ、Ｈ、ＮおよびＤ；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化に対して応答性にするＹ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、ＤおよびＥ；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化と有機溶媒および塩の存在に対して応答性にする、Ｙ、Ｃ、Ｒ、Ｎ、Ｓ、ＤおよびＧ；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化と有機溶媒および塩の存在に対して応答性にする、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、ＥおよびＧ；
アフィニティ・リガンドをｐＨの変化と有機溶媒および塩の存在に対して応答性にする、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｌ、ＩおよびＶ；
アフィニティ・リガンドを有機溶媒または塩の濃度変化に対して応答性にする、Ｆ、Ｌ、ＩおよびＶ；
アフィニティ・リガンドを有機溶媒または塩の濃度変化に対して応答性にする、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、およびＷ。
【請求項４４】
予め選択したｐＨで標的分子と結合し、別の予め選択したｐＨで標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４５】
予め選択した塩濃度で標的分子と結合し、別の予め選択した塩濃度で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４６】
予め選択した尿素の濃度で標的分子と結合し、別の予め選択した尿素の濃度で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４７】
予め選択したＥＤＴＡの濃度で標的分子と結合し、別の予め選択したＥＤＴＡの濃度で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４８】
予め選択した体積百分率の有機溶媒溶液で標的分子と結合し、別の予め選択した体積百分率の有機溶媒溶液で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【請求項４９】
予め選択した温度で標的分子と結合し、別の予め選択した温度で標的分子を放出することを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の設計されたアフィニティ・リガンド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【公開番号】特開２００９−２１３４８５（Ｐ２００９−２１３４８５Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１４６９２（Ｐ２００９−１１４６９２）
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【分割の表示】特願平９−５３３６７６の分割
【原出願日】平成９年３月２０日（１９９７．３．２０）
【出願人】（５００２１４４３９）
【氏名又は名称原語表記】ＤＹＡＸ ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【分割の表示】特願平９−５３３６７６の分割
【原出願日】平成９年３月２０日（１９９７．３．２０）
【出願人】（５００２１４４３９）
【氏名又は名称原語表記】ＤＹＡＸ ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
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