巻貝類由来のセルラーゼ及びその製造方法
【課題】 巻貝類由来のセルラーゼの諸特性を解明し、養殖に伴なう廃棄内臓の有価資源化の実現に供し、及び巻貝類から、上記セルラーゼを用途に応じた純度で、簡易な操作で、かつ短時間で効率良く製造する方法を開発し、廃棄内臓の有価資源化の一層の促進を図ること。
【解決手段】 巻貝類に由来するアミノ酸配列からなるセルラーゼ、下記の特性を有するセルラーゼ及びその製造方法を提供すること。（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。（ｃ）分子量：６６ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）（ｄ）至適温度：３５〜４０℃（ｅ）熱安定性：４０℃以下で安定である。（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜８．０（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：１４残基のシグナルペプチドを有する。
【解決手段】 巻貝類に由来するアミノ酸配列からなるセルラーゼ、下記の特性を有するセルラーゼ及びその製造方法を提供すること。（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。（ｃ）分子量：６６ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）（ｄ）至適温度：３５〜４０℃（ｅ）熱安定性：４０℃以下で安定である。（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜８．０（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：１４残基のシグナルペプチドを有する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、巻貝類に由来する新規なセルラーゼ及び当該セルラーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】セルラーゼとは、セルロースを低分子化セルロース、セロオリゴ糖、ブドウ糖（β−Ｄ−グルコース）にまで分解する酵素の総称であり、セロオリゴ糖などの機能性オリゴ糖の生産のほか、食品、飼料、工業材料の生産、ひいてはセルロースのバイオマスエネルギー化等に有用な酵素である。このような広い用途を有するセルラーゼが工業的に利用されている主要なものは、現状では糸状菌由来のセルラーゼである。
【０００３】アワビやサザエ等の褐藻を常食としている巻貝類（軟体動物腹足類の１種）の消化液等の中には、セルラーゼやアルギナーゼなどの多糖類分解酵素が含まれていることが知られている。しかしながら、原料の軟体動物が高価であることや、資源的に大量に得るのが難しいことなどの問題があって、現在のところ産業レベルでの利用は実現していない。
【０００４】ところで、北海道においては、アワビやツブガイ等、巻貝類の養殖や水産加工に伴う不可食部分（貝殻、内臓）が、年間数千トンレベルで廃棄されている。近年では、その処理コストや廃棄場所の問題が水産加工業の経営を圧迫する原因となっており、環境への影響も社会問題化している。そのため、これらの廃棄物から高付加価値成分を生産することにより、廃棄物を有価資源化しようという試みが各方面でなされている。
【０００５】アワビやツブガイを例にとると、廃棄される内臓（廃棄内臓）等の利用可能量は、年間数百トン程度はあると思われ、セルラーゼの製造に際して、この廃棄内臓等を出発材料とすることができれば、部分精製品としてもかなりの量のセルラーゼが得られると考えられる。例えば、１０ｇの内臓から１ｍｇ程度のセルラーゼが得られるとすると、単純計算で廃棄内臓１千トンから百ｋｇ程度のセルラーゼが得られることが期待される。
【０００６】前記したように、巻貝類などの軟体動物にセルラーゼが含まれていることは知られているが、これまでは当該酵素の精製が不十分であり、したがって酵素の諸性質については詳細な検討がなされていなかった。また、巻貝類から上記セルラーゼを効率良く製造する方法についても十分に検討されていなかったため、産業上有効利用することができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、巻貝類由来のセルラーゼの諸特性を解明し、巻貝類の養殖や水産加工に伴なう廃棄内臓等の有価資源化の実現に供することを目的とするものである。また、本発明は、巻貝類から、上記セルラーゼを用途に応じた純度で、簡易な操作で、かつ短時間に効率良く製造する方法を開発し、廃棄内臓等の有価資源化の一層の促進を図ることを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するため、巻貝類のセルラーゼを抽出、精製して、その基本的諸性質を鋭意検討した。その結果、巻貝類のセルラーゼは、アミノ酸配列等の遺伝的情報の他、基質特異性、至適温度、熱安定性、ｐＨ依存性等の点において、従来知られている微生物（細菌、真菌、糸状菌）由来のセルラーゼとは異なる基本的性質を持つことを見出した。また、巻貝類のセルラーゼを抽出、精製する方法について検討する過程で、セルラーゼを効率良く製造するための製造方法をも見出した。本発明は、係る知見に基づくものである。
【０００９】請求項１に係る本発明は、巻貝類に由来し、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼを提供するものである。
【００１０】請求項２に係る本発明は、巻貝類に由来し、下記の特性を有するセルラーゼである。
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：６６ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３５〜４０℃（ｅ）熱安定性：４０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜８．０（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載の配列を有する。
【００１１】請求項３に係る本発明は、巻貝類の内臓及び／又は内臓滲出液に緩衝液又は抽出液を注入することによりセルラーゼを抽出し、必要により当該抽出操作を繰り返してセルラーゼを回収することを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法である。
【００１２】請求項４に係る本発明は、請求項３に記載の方法により回収したセルラーゼを冷水に加え、得られたセルラーゼ液に吸着剤を加えて攪拌してセルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、緩衝液を加えてセルラーゼを吸着剤から溶出させることを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳しく説明する。本発明のセルラーゼは、巻貝類に由来する酵素である。巻貝類としては、例えばアワビ、エゾボラ、ヒメエゾボラ、エゾバイ、サザエ、タマキビ等が挙げられる。これらの内、養殖に伴なう廃棄内臓等を原料として容易に入手できる点で、アワビが好ましい。本発明のセルラーゼは、これらの巻貝類の内臓や内臓滲出液、特に消化器系の内臓組織や消化液に多く分布し、中でもアワビの肝膵臓前部やここから滲出する体液である消化液等に豊富に分布している。
【００１４】請求項１に係る本発明のセルラーゼは、上記のように巻貝類に由来し、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるものである。配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｎ末端側の開始コドンに相当するメチオニン、１４残基から成るシグナルペプチド、及び５７９残基から成る成熟型酵素部分の５９４残基からなる。配列表の配列番号１には、巻貝（アワビ）由来のアミノ酸配列のほかに、これに対応する巻貝（アワビ）のセルラーゼ遺伝子の塩基配列も併せて示す。配列表の配列番号１の塩基配列２，２０７ｂｐのうち、アミノ酸への翻訳領域は、５´末端の非翻訳領域（３６４ｂｐ）及び３´末端側の非翻訳領域（５８ｂｐ）を除いた１，７８５ｂｐである。
【００１５】配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列は、例えばセルラーゼが豊富に含まれる巻貝類の内臓から常法によりｃＤＮＡライブラリーを作成し、当該ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法、ＲＡＣＥ法等を用いてセルラーゼをコードするｃＤＮＡ（配列表の配列番号１参照）を取得し、当該塩基配列からアミノ酸配列を翻訳し、確認することにより入手することができる。また、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を化学的な方法によって入手することもできる。配列表の配列番号１のアミノ酸配列、即ち、アワビ・セルラーゼの一次構造は、ヤマトシロアリ、ザリガニ、シロイヌナズナのものと、それぞれ４８％、４６％、３１％の相同性を示すことから、本発明のセルラーゼはglycosil hydrolasefamily 9 に分類されるものである。
【００１６】請求項２に係る本発明のセルラーゼも、巻貝類に由来する酵素である点では請求項１に係る本発明のセルラーゼと同様であり、更に以下に示す特性を有している。
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。
【００１７】すなわち、請求項２に係る本発明のセルラーゼは、セルラーゼとしての活性を有する。ここで、セルラーゼとは、■非晶性セルロースをエンド型で切断するエンドβ−グルカナーゼ（ＥＧ、ＣＭＣａｓｅ（カルボキシメチルセルラーゼ））としてのセルラーゼ〔cellulase ，EC.3.2.1.4〕、■セルロースの非還元末端に作用し、セロビオースを精製するエキソβ−グルカナーゼ（セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）、アビセラーゼ）としてのセルロース１，４−β−グルコシダーゼ〔glucan 1,4-glucosidase，EC 3.2.1.91 〕；■セロビオースを分解してブドウ糖を生成するβ−グルコシダーゼ（セロビアーゼ）〔β-glucosidase，EC 3.2.1.21 〕の総称であり、請求項２に係る本発明のセルラーゼは、これらの３つの酵素活性のうち■に相当する。なお、本酵素によりセルロースを分解して生成したセロオリゴ糖にβ−グルコシダーゼを作用させると、ブドウ糖（β−グルコース）が生成する。
【００１８】（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：６６ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３５〜４０℃（ｅ）熱安定性：４０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜８．０
【００１９】（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載の配列を有する。
また、請求項２に係る本発明のセルラーゼは、内部領域の部分アミノ酸配列として、配列表の配列番号３〜５に記載の配列を有する。
【００２０】請求項２に係る本発明のセルラーゼの製造は、一般的な手法に従えば良いが、例えば請求項３に示した如く、巻貝類の内臓及び／又は内臓滲出液からセルラーゼを含む抽出液を得た後、これをそのまま回収する方法などがある。また、回収したセルラーゼ含有液を精製する方法としては、請求項４に示した方法は、簡便で、しかも短時間に処理できるので好ましい方法である。
【００２１】次に、請求項３に記載のセルラーゼの製造方法について説明する。巻貝類の内臓及び／又は内臓滲出液を原料とするセルラーゼの製造は、基本的に穏やかな条件下で実施すべきである。巻貝類からセルラーゼを含む抽出液を得る場合に、ワーリングブレンダーを用いた従来のホモジェナイズによる抽出法を行うと、得られるセルラーゼ活性が著しく低下するので好ましくない。しかし、セルラーゼの用途などを考慮して従来法を採用することもできる。本発明では、貝殻に付着した状態の巻貝類の内臓の適当な部分に切り込みを入れ、この部分から内蔵内に緩衝液又は抽出液を静かに注入して内蔵各部や内臓滲出液と接触させるか、もしくは貝殻から切除した後の巻貝類の内臓や内臓滲出液に直接緩衝液又は抽出液を加えることによって、セルラーゼを洗い出すように抽出する。この抽出操作を、必要に応じて数回（２〜５回）繰り返すと、目的とするセルラーゼを含有する抽出液を効率よく回収することができる。この方法によれば、抽出に際して脂質や色素成分などの不純物の溶出量を低減させることができ、高いセルラーゼ活性を示す抽出液が得られる。
【００２２】ここで、セルラーゼの抽出に使用する緩衝液又は抽出液としては、５〜１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１〜５ｍＭ 炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）、１０〜２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）等の中性〜弱アルカリ性に緩衝能を持つ緩衝液が使用可能である。いずれも、４〜１０℃に冷却したものを用いることが好ましい。
【００２３】このようにして得た粗セルラーゼ抽出液からセルラーゼの精製を行う場合、粗セルラーゼ抽出液を冷蒸留水で１０倍に希釈し、イオン交換樹脂を加えてバッチ吸着し、これをカラムに充填してから溶出するというイオン交換クロマトグラフィーを行っても良いが、この方法はフラクションコレクターを必要とすること、試料分取のために数多くの試験管を必要とすること、クロマトグラフィーに１２時間程度を要する等の時間と手間がかかるという問題点がある。そこで、請求項４に係る本発明の方法では、上記した方法によって回収したセルラーゼを含む抽出液を冷水で希釈して得た粗セルラーゼ液、通常は４〜１０℃程度の冷水で７〜１５倍、好ましくは８〜１２倍程度に希釈した粗セルラーゼ液に、適当な吸着剤を加えて穏やかに攪拌することにより、セルラーゼを当該吸着剤に吸着させる。このとき用いる吸着剤としては、イオン交換樹脂の場合、陽イオン交換タイプのイオン交換樹脂、好ましくはCM-Toyopearl（東ソー社製）、SP-Toyopearl（東ソー社製）などがある。イオン交換樹脂を加えて５〜２０分間、好ましくは８〜１５分間攪拌することによって、当該樹脂にセルラーゼをバッチ吸着させることができる。イオン交換樹脂以外の吸着剤としては、例えばハイドロキシルアパタイト（和光純薬工業（株）製）などを使用することができる。
【００２４】セルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、中性ｐＨに調整した、イオン強度０．１〜０．１５のNaCl、KCl 、Na２HPO４ などの溶離液又は緩衝液を加えて懸濁することによって、セルラーゼを吸着剤から溶出させる。この場合、セルラーゼを吸着剤から溶出する前に、デカンテーションや吸引ろ過等によって吸着剤を回収し、非吸着画分をイオン強度０．０１程度の緩衝液で洗浄除去することが望ましい。なお、吸着剤からの溶出は、直線濃度勾配で行うと、より高純度のセルラーゼを得ることができる。次いで、ろ過、遠心分離などの固−液分離手段によりセルラーゼを溶出液中に回収する。この方法によれば、比較的高純度（通常３０〜５０％程度）のセルラーゼを１〜３時間という短時間で大量に製造することができる。例えば、中型アワビ（７０〜９０ｇ）の場合、１個体から５〜１０ｍｇ程度のセルラーゼを得ることができる。
【００２５】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳しく説明するが本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、実施例を示す前に、活性の測定法など本実施例で用いた基本的分析方法について述べる。
【００２６】（１）セルラーゼ活性（カルボキシメチルセルラーゼ活性）の測定及び検出方法（１−１）生成還元糖の定量によるセルラーゼ活性の測定セルラーゼ活性の測定には、基本的には以下の組成の反応混液を用いた。
１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
０．５％ カルボキシメチルセルロース（中粘度ＣＭＣ、ＩＣＮ製）
種々の量のセルラーゼ（測定対象試料）
【００２７】反応液量は１ｍｌとし、反応温度は３０℃、反応時間は３０分とした。反応停止は１００℃で５分間の加熱によった。生成した還元糖（還元末端）はＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法により定量した。セルラーゼ１単位（ｕｎｉｔ）は、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量と定義した。
【００２８】（１−２）ザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の検出セルラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後、ゲルをシャーレに移し５０ｍｌの１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）と２５％ イソプロパノールを含む溶液により４℃で３０分間、穏やかに振盪しながら洗浄した。この操作を３回繰り返した後、さらに１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で３回洗浄することにより酵素を再生させた。
【００２９】一方、直径１５ｃｍのガラスシャーレに０．１％のＣＭＣと１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む２％の寒天ゲルを作成しておき、ここに上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の洗浄ゲルを重層した。これを３７℃で３時間インキュベートすることにより、洗浄ゲル中の再生セルラーゼと寒天ゲル中のＣＭＣとを反応させた。反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、０．１％ クマシブリリアントブルーの５０％ メタノール溶液で染色し、一方の寒天ゲルは、０．１％ コンゴーレッド水溶液で染色した。セルラーゼ活性はコンゴーレッド非染色部として検出した。
【００３０】（２）タンパク質濃度、総タンパク質量の測定タンパク質濃度は、高濃度（ｍｇ／ｍｌオーダー）の場合は、Ｂｉｕｒｅｔ法で、低濃度（μｇ／ｍｌオーダー）の場合は、Ｌｏｗｒｙ法で定量した。総タンパク質量は、試料溶液のタンパク質濃度に試料溶液の体積を乗じることによって算出した。
【００３１】（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｐｏｒｚｉｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎの方法に従い、０．１％ＳＤＳ−１０％ゲルと０．１％ＳＤＳ−１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて行った。
【００３２】実施例１（アワビ・セルラーゼの調製）
エゾアワビ（Haliotis（Nordotis）discus hannai ）を原料として、アワビ・セルラーゼの調製を以下の手順で行った。
（１）アワビ・セルラーゼの分布アワビにおけるセルラーゼの分布を調べた。すなわち、試料として、貝殻長８×６ｃｍ、体重８０ｇの中型エゾアワビを解体し、吻＋歯舌、食道、胃、肝膵臓前部、同中部、同後部をそれぞれ切除した。アワビの体内における各内蔵組織の位置は、図１の解剖図に示す通りである。
【００３３】各内臓組織をそれぞれ５０ｍｌのビーカーに取り、そこに１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ加え、１０ｍｌの駒込ピペットで１分間に２０回程度の吸引−吐出を行う操作を氷冷下で３０分間行うことにより、可溶性成分を抽出した。抽出後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、各内臓組織の酵素液とした。また、アワビ解体の際、主に肝膵臓前部から滲出した体液を消化液として回収した。各内蔵組織の酵素液及び消化液試料について総タンパク質量とセルラーゼ活性を測定した。
【００３４】図２にアワビの各内蔵組織の酵素液及び消化液試料の総タンパク質量とセルラーゼ活性を示す。なお、図２中、黒色は総タンパク質量（ｍｇ）を、白色はセルラーゼ活性（全活性（ｕｎｉｔｓ））を示し、棒グラフの上の数値は比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を示す。図２から明らかなように、セルラーゼ活性は、吻＋歯舌と食道では低いが、肝膵臓（特に前部）の酵素液と消化液で著しく高かった。
【００３５】（２）アワビ・セルラーゼの調製■アワビ・セルラーゼ（粗酵素）の抽出前項の結果から、セルラーゼは消化液と肝膵臓前部に多く含まれていることが分かったので、アワビ・セルラーゼの調製はこれらを出発材料に用いることにした。なお、予備試験の結果、抽出の際にＰｏｔｔｅｒ型ホモジェナイザーやワーリングブレンダー等により組織を強くホモジェナイズすると、酵素活性が著しく低下することを認めた。そこで、抽出はできるだけ穏やかに行うように留意した。
【００３６】即ち、重量約８０ｇのアワビ１０個体を解体し、筋肉を除去した後、肝膵臓を貝殻に付着したまま肝膵臓前部だけをハサミで切り取り、ビーカーに移した。また、肝膵臓を切除する際滲出した消化液もここに合わせた。このようにして肝膵臓前部及び消化液の混合物が合計約６０ｇ得られた。
【００３７】次いで、肝膵臓前部と消化液の混合物に対し、４倍量（２４０ｍｌ）の抽出液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），０．２％ ＮａＮ３ ，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、ガラス棒で穏やかに攪拌しながら、氷冷下で３０分間セルラーゼを抽出した。この上清のタンパク質濃度は約５ｍｇ／ｍｌで、容量は２９０ｍｌであった。その結果、約１４７０ｍｇの粗酵素が得られた。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、粗酵素のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。
【００３８】■アワビ・セルラーゼのCM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーによる精製上記■で抽出したアワビ・セルラーゼ（粗酵素）の抽出液を、以下の手順でCM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーにより精製した。なお、粗酵素抽出液には、抽出の際に貝殻中からの海水が若干混入しており、イオン強度がやや高く、セルラーゼのCM−Toyopearl への吸着が悪いことが分かった。そこで、粗酵素抽出液を冷蒸留水で１０倍に希釈することによりイオン強度を下げた。
【００３９】次いで、この粗酵素希釈液に、あらかじめ１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したCM−Toyopearl ６５０Ｍ（東ソー（株）製）をベッド体積で５０ｍｌ加え、４℃で１０分間穏やかに攪拌することによりセルラーゼを担体に吸着させた。静置して担体を沈澱させ、デカンテーションで上清を概ね除去した後、担体を１００ｍｌの１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で再度懸濁して２．０ｃｍ×１５ｃｍのガラスカラムに充填した。このカラムを、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）１００ｍｌで洗浄した後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む０〜２００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配によりタンパク質を溶出した。各フラクションの吸光度（２８０ｎｍ）とセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ））の測定結果を図３に示す。なお、図３中、○は吸光度を示し、●は比活性を示す。
【００４０】図３から明らかなように、セルラーゼは、３つのピーク画分に溶出していることが分かった。即ち、フラクション番号７〜１０、１３〜１７、２０〜２４の３画分である。これらについては、以降それぞれを、ＣＭ−Ｉ画分、ＣＭ−II画分、ＣＭ−III 画分と呼ぶこととする。
【００４１】一方、図３中でａ〜ｋで示した画分については、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥとザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。また、前記■で得られた粗酵素についても、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとザイモグラフィーの結果を図４に示す。なお、図４左図の左端の数字は分子量マーカー（Ｍｋ）を示す。
【００４２】図４の結果によれば、セルラーゼ活性を示すタンパク質の分子サイズは、ＣＭ−Ｉ画分では６６ｋＤａ、８０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａの各成分、ＣＭ−II画分及びＣＭ−III 画分では６６ｋＤａ、８０ｋＤａ、１００ｋＤａの各成分と認められた。ＣＭ−Ｉ画分、ＣＭ−II画分及びＣＭ−III 画分の３画分のうち、最も均一性が高く総活性量も多かったのは、ＣＭ−III 画分であり、これは６６ｋＤａの成分を主成分としていた。そこで、本実施例では、ＣＭ−III 画分に含まれる６６ｋＤａのセルラーゼを完全精製することとした。
【００４３】なお、ＣＭ−III 画分の総タンパク質量は、１３．４ｍｇであった。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、このＣＭ−III 画分のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。ＣＭ−Ｉ画分及びＣＭ−II画分も十分なセルラーゼ活性を持っているので、精製品が必要でない場合は、これらの画分もアワビ・セルラーゼとして使用可能である。
【００４４】■アワビ・セルラーゼのハイドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィーによる精製上記■において、CM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーにより得たＣＭ−III 画分（フラクション番号１９〜２４、総タンパク質量１３．４ｍｇ）を、１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（和光純薬工業（株）製、カラムクロマトグラフ高流速タイプ）カラム（１．５×２０ｃｍ）に供した。ここで、緩衝液をリン酸ナトリウムからリン酸カリウムに変換した理由は、ハイドロキシアパタイト・カラムからのタンパク質の溶出に用いる高濃度のリン酸塩の溶解度が、リン酸ナトリウムよりもリン酸カリウムの方が高く、低温下の操作でも析出し難いためである。ハイドロキシアパタイトに吸着したタンパク質は、１０〜３００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）の直線濃度勾配により溶出した。溶出液は１フラクションあたり５ｍｌ分取した。各フラクションの吸光度（２８０ｎｍ）とセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ））の測定結果を図５に示す。なお、図５中、○は吸光度を示し、●は比活性を示す。
【００４５】図５から明らかなように、ハイドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィーの結果、セルラーゼの比活性は、フラクション番号４４〜４９付近にほぼ単一のピークとして溶出することが分かった。また、図５R>５のａ〜ｉで示した各画分については、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。また、前記■で得られた粗酵素及び前記■で得られたＣＭ−III についても、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとザイモグラフィーの結果を図６に示す。なお、図６左図の左端の数字は分子量マーカー（Ｍｋ）を示す。
【００４６】図６の結果によれば、フラクション４６〜４９に相当するｃ〜ｆ画分の場合には、６６ｋＤａ付近にバンドが確認されたことから、分子サイズ６６ｋＤａの成分がこのセルラーゼの本体であることが確認された。このセルラーゼ画分は、以後、ＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分と呼ぶこととする。なお、ＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分の総タンパク質量は４．１ｍｇであった。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、このＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。このＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分には、２５ｋＤａ程度の成分が少量混入していたので、さらに以下のSephacryl S −200 ゲルろ過により精製した。
【００４７】■Sephacryl S-200 ゲルろ過による精製上記■で得られたＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分を、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ ＵＫ−１０フィルター）により５ｍｌ程度まで濃縮した後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したSephacryl S-200 カラム（２．０×１４０ｃｍ、商品名：Sephacryl S-200 HR、製造元：Pharmacia Amarsham Biotech）に供し、同溶液で溶出した。溶出液は１フラクションあたり５ｍｌ分取した。
【００４８】各フラクションの吸光度（２８０ｎｍ）とセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ））の測定結果を図７に示す。なお、図７中、○は吸光度を示し、●は比活性を示す。図７から明らかなとおり、セルラーゼ活性はフラクション番号４２〜４８付近に主ピークとして溶出した。また、図７にａ〜ｈで示した各画分については、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。さらに、前記■で得られた粗酵素、前記■で得られたＣＭ−III 及び前記■で得られたＣＭ−III・Ｈｙｄ画分についても、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーの結果を図８に示す。なお、図８左図の左端の数字は分子量マーカー（Ｍｋ）を示す。
【００４９】図８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から明らかな通り、これらの画分は６６ｋＤａの単一成分から構成され、ザイモグラフィーにより、この成分がセルラーゼ本体であることが確認された。この精製セルラーゼ（６６ｋＤａ成分）の総タンパク質量は、１．１ｍｇであった。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、この精製セルラーゼ（６６ｋＤａ成分）のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。
【００５０】
【表１】第１表（アワビ・セルラーゼの調製）
【００５１】一方、フラクション番号６２〜６４付近に副ピークとしてセルラーゼ活性が認められたが、ここにはＳＤＳ−ＰＡＧＥとザイモグラフィーのいずれにおいてもタンパク質の存在が認められず、何らかの人工物（artifact) と考えられた。
【００５２】以上、中型エゾアワビの肝膵臓前部及び消化液を出発材料として、分子量サイズ６６ｋＤａのセルラーゼを完全精製することに成功した。この精製過程は、第１表に示す通りであり、分子量サイズ６６ｋＤａの精製セルラーゼは、粗酵素から約９５倍に精製されたことが分かる。一方、活性収率は７％であるが、残りの活性の多くは、前記■のCM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーにおいてＣＭ−Ｉ画分、ＣＭ−II画分、ＣＭ−III画分の非回収部分に残存している。従って、この画分は部分精製セルラーゼとして利用することが可能である。
【００５３】実施例２（アワビ・セルラーゼの基本性状）
実施例１で調製した分子量サイズ６６ｋＤａの精製セルラーゼの基本的な酵素特性を調べた。以下の実施例２において、市販の糸状菌セルラーゼ（Trichoderma viride起源、和光純薬工業（株）製）からCM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーで精製した、２３．５ｋＤａセルラーゼ成分を比較対照とした。また、部分精製品ではあるが、前記実施例１の■のCM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーにおいて得られたＣＭ−II画分についても、同様に基本性状を調べた。
【００５４】（１）セルラーゼ活性の温度依存性（至適温度）
実施例１で得た分子量サイズ６６ｋＤａの精製セルラーゼ（以下、ＣＭ−６６という。）、前記実施例１の■で得られたＣＭ−II画分のセルラーゼ（以下、ＣＭ−IIという。）及びTrichoderma viride由来の分子量サイズ２３．５ｋＤａのセルラーゼ（以下、Ｔｒｉ−２３．５という。）のセルラーゼ活性の温度依存性を測定した。
【００５５】即ち、酵素液を除く反応混液（０．９５ｍｌ）を、０〜７０℃の各温度（ＣＭ−６６及びＣＭ−IIは０〜５０℃、Ｔｒｉ−２３．５は２０〜７０℃）で、１０分間プレインキュベートした後、各反応混液にいずれかのセルラーゼを０．０５ｍｌ加えて反応を開始し、それぞれの温度で３０分間保持した後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止した。生じた還元糖はＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法で定量し、セルラーゼ活性を算出した。なお、Ｔｒｉ−２３．５の至適ｐＨは、酸性側（ｐＨ５．０）にあるので、反応混液のｐＨはリン酸ナトリウムでｐＨ５．０とした。結果を図９に示す。なお、図９の上段は比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）の温度依存性を、下段は相対的活性（％）の温度依存性を示し、○はＣＭ−６６の結果を、●はＣＭ−IIの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００５６】図９に示すように、４０℃において、Ｔｒｉ−２３．５の比活性が約１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｇであるのに対し、ＣＭ−６６は約３０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、ＣＭ−IIは約２５ｕｎｉｔｓ／ｍｇであっったことから、ＣＭ−６６及びＣＭ−IIの比活性は、Ｔｒｉ−２３．５に比べ測定した温度範囲で概ね２０倍高いことが明らかとなった。また、ＣＭ−６６及びＣＭ−IIの至適温度は、３５〜４０℃付近にあり、Ｔｒｉ−２３．５の至適温度である約５０℃よりも１０〜１５℃低かった。これらの結果から、アワビ・セルラーゼがTrichoderma viride由来のセルラーゼに比べて、より低温で高活性を示すことが示された。
【００５７】（２）セルラーゼ活性の熱安定性次に、ＣＭ−６６、ＣＭ−II、及びＴｒｉ−２３．５のセルラーゼ活性の熱安定性を測定した。即ち、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に、各酵素を０．１５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、２０〜７０℃の各温度で３０分間インキュベートした後、氷冷した。これらの加熱処理酵素の０．０５ｍｌを、あらかじめ３０℃に保温してある０．９５ｍｌの反応混液に加え、同温度で３０分間反応させた。相対的活性の結果を図１０に示す。なお、図１０中、○はＣＭ−６６の結果を、●はＣＭ−IIの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００５８】図１０によれば、ＣＭ−６６及びＣＭ−IIの活性は、加熱温度が３０℃まではほとんど変化しないが、４０℃以上になると急激に失活することが分かる。一方、比較対照のＴｒｉ−２３．５の活性は、５０℃まではほとんど失活しないが、６０℃では従来の報告通りほぼ完全に活性が失われた。このことから、アワビ・セルラーゼの熱安定性は、Trichoderma viride由来のセルラーゼよりも約１０℃低いことが明らかとなった。
【００５９】（３）セルラーゼ活性のｐＨ依存性従来知られているセルラーゼの至適ｐＨは、多くの場合酸性側（ｐＨ４．０〜６．０）にある。そこで、アワビ・セルラーゼのセルラーゼ活性のｐＨ依存性をTrichoderma viride由来のセルラーゼのそれと比較すべく、ＣＭ−６６、ＣＭ−II、及びＴｒｉ−２３．５のセルラーゼ活性のｐＨ依存性を測定した。即ち、酢酸ナトリウム（ｐＨ２．０〜５．０）、リン酸ナトリウム（ｐＨ５．０〜９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜１０．０）で反応混液のｐＨを変えて、温度３０℃における各ｐＨにおけるセルラーゼ活性を測定した。図１１に結果を示す。なお、図１１の上段は比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を、下段は相対的活性（％）を示し、○はＣＭ−６６の結果を、●はＣＭ−IIの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００６０】図１１に示すように、ＣＭ−６６及びＣＭ−IIは、ｐＨ６．５及びｐＨ７．２でそれぞれ最大活性を示し、何れの場合もｐＨ５．５〜８．０にかけて最大の７０％以上の活性値を示したことから、アワビ・セルラーゼはほぼ中性から弱アルカリ性に至適ｐＨを有することが明らかとなった。一方、比較対照に用いたＴｒｉ−２３．５の至適ｐＨは、これまで報告されている通り、ｐＨ５．０付近であった。このことから、アワビ・セルラーゼの至適ｐＨは、ほぼ中性から弱アルカリ性域にあり、Trichoderma viride由来のセルラーゼを始めとする他の糸状菌セルラーゼの至適ｐＨが酸性側にあるのとは明らかに異なるｐＨ特性を持つ酵素であることが分かった。ほぼ中性からアルカリ性領域で作用するセルラーゼは多くないことから、アワビ・セルラーゼはセルラーゼの使用可能なｐＨ範囲を広げるという点で有用性が高いと考えられる。
【００６１】（４）ＣＭ−Ｉ画分の部分アミノ酸配列の解読アワビ・セルラーゼのうち、完全精製した６６ｋＤａの成分（ＣＭ−６６）の部分アミノ酸配列を分析し、これまでに一次構造が明らかにされているセルラーゼのアミノ酸配列との差異を若干ながら検討した。まず、ＣＭ−６６についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。そして、そのＮ末端のアミノ酸配列を、パーキンエルマー−ＡＢＩ社製の４７３Ａ型プロテインシークエンサーで分析した。その結果、ＣＭ−６６のＮ末端１４残基の配列は、配列表の配列番号２に示した通りであることが明らかとなった。
【００６２】一方、ＣＭ−６６の内部領域の配列を分析するために、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に溶解した０．１４ｍｇのＣＭ−６６を、０．００２８ｍｇ（ＣＭ−６６の１／５０に相当する重量）のリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業（株）製）により３７℃で６時間消化した。得られた消化物を、０．１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＳカラム（Mightysil RP-18 GP、１５０×４．６ｍｍ）を装着した高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）（ＥＹＬＡ ＬＰ−１０００）に供し、０〜５０％アセトニトリルの直線濃度勾配によりペプチド断片を分離・溶出した。逆相ＨＰＬＣの結果を図１２に示す。
【００６３】得られたペプチド断片は、凍結乾燥後、上記プロテインシーケンサーに供した。その結果、図１２に示したカラム保持時間２３．２０分の成分（以下、Ｐ−２３．２０という。）、２８．８分の成分（以下、Ｐ−２８．８０という。）、３０．２１分の成分（以下、Ｐ−３０．２１という。）の各アミノ酸配列（配列表の配列番号３〜５参照）が、他種のセルラーゼと明らかな相同性を示すことが明らかとなった。
【００６４】図１３には、ＣＭ−６６のＮ末端及びＰ−２３．２０、Ｐ−２８．８０、Ｐ−３０．２１の各配列と相同性を示すタンパク質をＦＡＳＴＡプログラム（ＤＤＢＪを利用）により検索した結果を示す。それによれば、ＣＭ−６６のＮ末端の配列は、Cellulomonus fimi 及びStreptomyces coelicol （いずれもセルロース分解菌）のセルラーゼの分子内部領域と約４２．０％及び５０．０％の相同性を示すことが分かった。また、Ｐ−２３．２０の配列はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）・セルラーゼの６１〜６７残基部分、及びザリガニ（Cherax quadricarinatus）・セルラーゼの６７〜７３残基部分と、いずれも１００％の相同性を示した。更に、Ｐ−２８．８０の配列はオオシロアリ（Hodotermopsis japonica）・セルラーゼ及びワモンゴキブリ（Periplaneta americana ）・セルラーゼのＮ末端領域の配列と、いずれも９０．０％の相同性を示した。一方、Ｐ−３０．２１の配列はシロイヌナズナ・セルラーゼの１４２〜１６０残基部分、及びオオシロアリ・セルラーゼの７５〜９３残基部分と、それぞれ６８．４％、６３．２％の相同性を示した。これらの結果は、ＣＭ−６６が昆虫や植物のセルラーゼと比較的近い一次構造を持つ可能性を示すものである。
【００６５】実施例３（アワビ・セルラーゼｃＤＮＡのクローニングと全アミノ酸配列の解析）
この例では、実施例１で完全精製した分子量サイズ６６ｋＤａのアワビ・セルラーゼ（ＣＭ−６６）をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法及びＲＡＣＥ法により取得し、そのｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。
【００６６】（１）アワビ肝膵臓ｃＤＮＡライブラリーの作成アワビ肝膵臓１ｇからグアニジンチオシアン酸−フェノール法により、全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ約３００μｇからOligo-Tex dT (30) （ＴａＫａＲａ社製）を用いたバッチ法により、約２μｇのｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡ約０．５μｇを用いて、TaKaRa cDNA Synthesis Kit （ＴａＫａＲａ社製）によりアワビ肝膵臓ｃＤＮＡライブラリーを作成し、ＰＣＲのテンプレートとした。一方、残りのｍＲＮＡは、５´−及び３´−ＲＡＣＥ反応に用いた。
【００６７】（２）ｃＤＮＡの取得、及び、塩基配列並びにアミノ酸配列の解析■第１回目のＰＣＲＣＭ−６６のＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列番号６参照）に基づき、ＰＣＲ用の縮重フォワードプライマーＡＣＦ１（配列表の配列番号７参照）を作成した。一方、リヴァースプライマー合成のために、新たに２つのリジルエンドペプチダーゼ消化断片、即ちＬＰ４及びＬＰ５のアミノ酸配列を決定した。ＬＰ４は配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の３２３〜３４４番目の２２残基、ＬＰ５は配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の４６０〜４７３番目の１４残基からなる。これらのアミノ酸配列は、オオシロアリなどの他種生物セルラーゼの分子中央部分及びＣ末端部分のアミノ酸配列と４０〜６０％程度の相同性を示す。また、これらのアミノ酸配列中には、縮重プライマーの合成に適したコドンを持つ、芳香属アミノ酸やメチオニン（Ｍｅｔ）が含まれていた。そこで、ＬＰ４及びＬＰ５のうち、芳香族アミノ酸及びメチオニンを含む部分アミノ酸配列（それぞれ配列番号８、９参照）に基づき、ＰＣＲ用の縮重リヴァースプライマーＡＣＲ１及びＡＣＲ２を合成した（それぞれ配列表の配列番号１０、１１参照）。これらのプライマーのうち、ＡＣＦ１−ＡＣＲ１の組み合わせでＰＣＲを行った。
【００６８】その結果、約１，０００ｂｐのｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ２）が増幅された。そこで、このｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ２）をＰＣＲ−ＴＯＰＯ２．１システム（Invitrogen社製）でクローン化し、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ３１０、パーキンエルマー−ＡＢＩ社製）で塩基配列を分析した。その結果、ＮｄＥＧ ｆ２は１，００５ｂｐの塩基配列から成り、アワビ・セルラーゼのＮ末端から３３８アミノ酸残基の配列をコードしていることが明らかになった。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ２の相対位置を図１４に示す。
【００６９】■第２回目のＰＣＲ第１回目のＰＣＲにより、アワビ・セルラーゼのＮ末端領域をコードするｃＤＮＡが得られたので、該ｃＤＮＡよりＣ末端側のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを得るために、第２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲのフォワードプライマーとしては、ＮｄＥＧ ｆ２の３´−末端領域の塩基配列を持つ特異的プライマーＡＣＦ２（配列表の配列番号１２参照）を用いた。一方、リヴァースプライマーとしては、前述したように、ＬＰ５の部分アミノ酸配列に基づき合成した縮重プライマーＡＣＲ２を用いた。
【００７０】これらＡＣＦ２−ＡＣＲ２の組み合わせによりＰＣＲを行った結果、約４８０ｂｐのｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ３）が増幅された。このｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ３）を第１回目のＰＣＲと同様の条件でクローン化し、塩基配列を分析した結果、ＮｄＥＧ ｆ３は４４７ｂｐから成り、アワビ・セルラーゼのＣ末端領域１４９残基のアミノ酸配列をコードしていることが明らかとなった。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ３の相対位置を図１４に示す。
【００７１】■３´−ＲＡＣＥ−ＰＣＲＮｄＥＧ ｆ２とＮｄＥＧ ｆ３の塩基配列より、アワビ・セルラーゼのＮ末端から４６５残基部分のアミノ酸配列が明らかになったが、Ｃ末端領域の配列は不明であった。そこで、Ｃ末端領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを得るために、TaKaRa 3´-Full RACE Core Set （ＴａＫａＲａ社製）により、３´−ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行った。その際、フォワードプライマーとしてＮｄＥＧ ｆ３の３´末端領域と同一の配列を持つ特異プライマーＡＣ３ＲＡＣ１（配列表の配列番号１３参照）を用い、リヴァースプライマーとしてはキット付属の3 ´sites Adapto primer （配列表の配列番号１４参照）を用いた。
【００７２】このＰＣＲにより増幅されたｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ４）を第１回目のＰＣＲと同様の条件でクローン化し、塩基配列を分析した結果、ＮｄＥＧ ｆ４は、３´末端に５８ｂｐの非翻訳領域（１９ｂｐのポリ（Ａ）尾部を含む。）を持つ５７７ｂｐの塩基配列から成ることが明らかになった。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ４の相対位置を図１４１４に示す。
【００７３】ＮｄＥＧ ｆ４の停止コドンを除く翻訳領域５１６ｂｐの塩基配列から、１７２残基のアミノ酸配列が演繹された。このアミノ酸配列を、上述したＮ末端側領域のアミノ酸配列と連結することにより、アワビ・セルラーゼのＮ末端からＣ末端までの全５７９残基のアミノ酸配列が明らかになった（図１４参照）。なお、アミノ酸配列から計算される分子量は６３，２４１であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって見積もられた分子量約６６，０００とやや異なるが、電気泳動の移動度より算出される分子量は、一般に誤差が大きいので、この程度の違いは誤差範囲であると推測される。
【００７４】■５´−ＲＡＣＥ−ＰＣＲＮｄＥＧ ｆ２〜ＮｄＥＧ ｆ４の塩基配列から、分子量サイズ６６ｋＤａのアワビ・セルラーゼ（ＣＭ−６６）の全一次構造が明らかになった。ただし、これは成熟型酵素の一次構造であり、細胞内で合成された時点では、分泌酵素の特徴であるシグナルペプチドをそのＮ末端に持つと考えられる。そこで、５´−ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより、ｃＤＮＡの５´末端領域の塩基配列を解析し、シグナルペプチドの一次構造を解明することとした。なお、５´−ＲＡＣＥは、TaKaRa 5´-Full RACE Core Set （ＴａＫａＲａ社製）を用いて行い、逆転写反応及びＰＣＲのプライマーには、ＲＶＡＣ５ＲＡ、Ｆ１ＡＣ５ＲＡ、Ｆ２ＡＣ５ＲＡ、Ｒ１ＡＣ５ＲＡ及びＲ２ＡＣ５ＲＡ（それぞれ配列表の配列番号１５、１６、１７、１８及び１９参照）を用いた。
【００７５】増幅されたｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ１）を第１回目のＰＣＲと同様の条件でクローン化し、塩基配列を解析した結果、ＮｄＥＧ ｆ１は、３６４ｂｐの５´−非翻訳領域と、１０８ｂｐの翻訳領域の計４７２ｂｐから成ることが明らかとなった。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ１の相対位置を、図１４に示す。翻訳領域のアミノ酸配列と成熟型酵素のアミノ酸配列を比較した結果、アワビ・セルラーゼのＮ末端には、開始コドンに続く１４残基のシグナルペプチドが存在することが新たに明らかになった。
【００７６】以上、ＰＣＲ法とＲＡＣＥ法によりアワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡを取得し、合計２，２０７ｂｐの塩基配列を決定した。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡの構造模式図を図１４に示す。図１４１４から明らかなとおり、アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡのうち、翻訳領域は１，７８５ｂｐであり、ここから開始コドンに相当するメチオニン（Ｍｅｔ）、１４残基からなるシグナルペプチド、成熟型酵素部分の５７９残基部分及び停止コドンからなるアミノ酸配列が翻訳された。塩基配列及び翻訳アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示す通りである。これらの塩基配列及び翻訳アミノ酸配列は、ＤＤＢＪをはじめとするＤＮＡデータベースには登録されておらず、新規配列であることが確認された。なお、アワビ・セルラーゼｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳アミノ酸配列、即ち、アワビ・セルラーゼの一次構造は、ヤマトシロアリ、ザリガニ、シロイヌナズナのものと、それぞれ４８％、４６％、３１％の相同性を示すことから、本酵素はglycosil hydrolase family 9 に分類されることが明らかである。
【００７７】実施例４（アワビ・セルラーゼの調製）
中型アワビ（エゾアワビ（Haliotis（Nordotis）discus hannai ）、体重８０ｇ）３個体の筋肉（腹足筋）をナイフで除去した後、ハサミで吻部から中腸腺前部方向に向かって切開した。それにより、滲出した消化液をビーカーに受けた。さらに、切開部に駒込ピペットを使って５ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を吹き込み、洗浄液をビーカー中に受けた。この洗浄はさらに２回繰り返した。３個体分についてこの操作を行い、得られた粗酵素液を合わせた後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清のタンパク質濃度は、約５ｍｇ／ｍｌで、体積は５１ｍｌであった。従って、総タンパク質量は、約２５５ｍｇであった。総タンパク質量のほか、粗酵素液のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）、収率（％）の測定値を第２表に示した。
【００７８】この粗酵素液に５００ｍｌの冷蒸留水を加え、さらに、ベッド体積で２０ｍｌの１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したCM−Toyopearl を直接加えた。５分間静かに懸濁することにより、セルラーゼをCM−Toyopearl に吸着させ、グラスフィルターろ過により、CM−Toyopearl を集めた。これを、１００ｍｌのビーカーに取り、ここに、１０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＣｌ−１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を加えて静かに攪拌し、セルラーゼを溶出した。次いで、グラスフィルターでろ過し、ろ液を集めた。この担体からのセルラーゼ溶出操作は、もう一回行い、これらの溶出液を合一した。この溶出液の全タンパク質量、セルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）、収率（％）を第２表に示した。
【００７９】
【表２】第２表（セルラーゼの簡便調製法）
【００８０】第２表に示すように、本発明の方法により、比活性が２．１ｕｎｉｔｓ／ｍｇで、精製度が粗酵素の１４倍の純度２０〜３０％程度のアワビ・セルラーゼを、１〜３時間で６８％の収率で大量に（中型アワビ（７０〜９０ｇ）の場合、１個体から５〜１０ｍｇ）得られることがわかった。このセルラーゼの比活性は、従来のようにワーリングブレンダー等を用いたホモジェナイズ抽出や、先に貝殻から消化器官を切除する方法で精製したものと比較して、脂質や色素成分などの混入がなく、高い精製率のものであった。なお、CM−Toyopearl からの溶出を直線濃度勾配にすれば、より高純度のセルラーゼを得ることができる。
【００８１】比較例１中型アワビ（エゾアワビ、体重８０ｇ）３個体の肝膵臓をワーリングブレンダーでホモジェナイズし、遠心分離（１０，０００×ｇ）により得た上清を粗酵素液とした。これを硫安分画して得た画分（４０〜７０％飽和画分）及びゲルろ過によって脱塩した画分（脱塩画分）の全タンパク質量、セルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）、及び収率（％）を第３表に示した。
【００８２】
【表３】第３表（セルラーゼの従来法による調製）
【００８３】
【発明の効果】請求項１に係る本発明のセルラーゼは、新規なアミノ酸配列を有し、巻貝類由来のセルラーゼに関する遺伝的情報を提供するものである。請求項２に係る本発明のセルラーゼは、比較的低温で高活性を示し、至適ｐＨがほぼ中性から弱アルカリ性にあり、また比活性値が糸状菌のセルラーゼより高いことから、新規なセルラーゼであることが明らかである。特に、至適ｐＨの範囲が広いことから、従来のセルラーゼよりも広範な利用が期待できる。さらに、本発明のセルラーゼは、巻貝類に由来しており、その給源を養殖及び水産加工の際に廃棄される廃棄内臓に求めることができる。そのため、従来の糸状菌由来のセルラーゼと比較して低コストで、かつ大量に生産することが可能である。
【００８４】請求項１及び２に係る本発明のセルラーゼは、地球上に最も大量に存在する多糖であるセルロースの糖化利用、セロビオース、セロトリオースなどのセロオリゴ糖の生産、飼料効率を高めるための飼料添加、製紙工業における脱墨や脱色の促進、洗剤等の用途に広く利用できると共に、本発明は養殖や水産加工に伴なう廃棄内臓の有価資源化の実現に供するものである。
【００８５】また、請求項３に係る本発明の方法により、不純物である脂質や色素成分などの溶出量を最低限に抑え、活性の低下が抑制された上記請求項２に係る本発明のセルラーゼを製造することができる。しかも、本発明の方法は、加熱や激しい撹拌などの操作を必要としないので操作が簡便である。また、このセルラーゼは、抽出後に硫安分画を行わなくても、従来の抽出後に硫安分画を行って得られるセルラーゼ標品と同程度か、それ以上の純度を有している。そのため、本発明は、操作工程を省略でき、短時間で所望のセルラーゼを得ることができる有効な方法である。
【００８６】そして、請求項４に係る本発明の製造方法によれば、従来の製造方法と比較して、簡便な操作で高純度のセルラーゼを、短時間で得ることができる。それ故、請求項３及び４に係る本発明の製造方法は、上記優れた特質を有し、産業上の利用性も高い請求項２に係る本発明のセルラーゼの効率的な製造方法として極めて有用である。
【００８７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> 北海道ティー・エル・オー株式会社<120> 巻貝類由来のセルラーゼ及びその製造方法<130> P131224K<160> 19<210> 1<211> 2207<212> DNA<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 1gattatagtc acttgcctaa ggagacacaa cgtgcctcac agttgcttca ctgcggggca 60ggacagaagc cctagaaact ctcaggagtc aacctgccta acaccgtcat ctccacgacc 120atcttgatta acttcatctg atttttctct tgaaagctgt gcacagatcg acgtgccaca 180acacaatttt gactcagcat aatacttttt taaagtttct atttcgctgc acgctcattc 240gtgtatcata gccattggtg tatggaaatt ttggcttcaa gataaggccg gtgacaagtg 300aggcgaggtg gggacgacta cagcgtcttc agtagacgta ccgagtcagg acaaaggaga 360caat atg ctg gtg ttt gta ctg gcg gct cta gcg gct gcg gcc tcg gcg 409 Met Leu Val Phe Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ser Ala -15 -10 -5 -1gtg gac gtc acc atc agc aac cac tgg gac ggc ggc ttc cag ggg aag 457Val Asp Val Thr Ile Ser Asn His Trp Asp Gly Gly Phe Gln Gly Lys 1 5 10 15gcc tgc atc gcg atc acc aca gaa ctt cat agc tgg aag gcg cac ttg 505Ala Cys Ile Ala Ile Thr Thr Glu Leu His Ser Trp Lys Ala His Leu 20 25 30acg ttc tct cag gct gtt gat tct cta gat tgt ggc aca gcc aat gtc 553Thr Phe Ser Gln Ala Val Asp Ser Leu Asp Cys Gly Thr Ala Asn Val 35 40 45cag aag acg aat ggt gga aag gaa tac atc ctc acg aac aag cag tgg 601Gln Lys Thr Asn Gly Gly Lys Glu Tyr Ile Leu Thr Asn Lys Gln Trp 50 55 60aac gca gat gaa cat gct ggc gac aaa ctc tgc ctg gac ttt gtt ggt 649Asn Ala Asp Glu His Ala Gly Asp Lys Leu Cys Leu Asp Phe Val Gly 65 70 75 80cac aca agt ggt gat atc aac cct aag acc acc cta aca ata gag ggc 697His Thr Ser Gly Asp Ile Asn Pro Lys Thr Thr Leu Thr Ile Glu Gly 85 90 95gtg gct gcc ggc agt tcc cac acg ggg acc aac aca ggt acc aac act 745Val Ala Ala Gly Ser Ser His Thr Gly Thr Asn Thr Gly Thr Asn Thr 100 105 110ggt acc cac acc ggc acc cag gcc cct gtg cag gtg ccc aaa aca gga 793Gly Thr His Thr Gly Thr Gln Ala Pro Val Gln Val Pro Lys Thr Gly 115 120 125ggc ggt aca gaa aga tac aac tat ggc gag gct ctt ggc aag tcc atc 841Gly Gly Thr Glu Arg Tyr Asn Tyr Gly Glu Ala Leu Gly Lys Ser Ile 130 135 140ctg ttc tat gat gct cag aga tca ggc aaa ctt ccg gcc aac aac ccc 889Leu Phe Tyr Asp Ala Gln Arg Ser Gly Lys Leu Pro Ala Asn Asn Pro145 150 155 160atc aag tgg cga ggt gac tcc gcc ctg gga gac aag gga gac aac ggc 937Ile Lys Trp Arg Gly Asp Ser Ala Leu Gly Asp Lys Gly Asp Asn Gly 165 170 175gag gat ctg act gga ggg tgg tat gat gct ggt gac cac gtc aag ttt 985Glu Asp Leu Thr Gly Gly Trp Tyr Asp Ala Gly Asp His Val Lys Phe 180 185 190agc ttg cca atg tca agt act tcg act gtg tta ctc tgg gga tac cta 1033Ser Leu Pro Met Ser Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Trp Gly Tyr Leu 195 200 205cag tgg aaa gat gcc tat gct act act aaa caa aca gac atg ttc ttt 1081Gln Trp Lys Asp Ala Tyr Ala Thr Thr Lys Gln Thr Asp Met Phe Phe 210 215 220gac atg atc aaa tgg ccc ttg gac tac ttc ttg aag tgc tgg att cca 1129Asp Met Ile Lys Trp Pro Leu Asp Tyr Phe Leu Lys Cys Trp Ile Pro225 230 235 240aaa agt cag act ttg tat gca cag gtt gga gaa gga aat gat gac cac 1177Lys Ser Gln Thr Leu Tyr Ala Gln Val Gly Glu Gly Asn Asp Asp His 245 250 255cac ttc tgg ggc cgc gct gag gac atg aag atg gcc aga ccc gcc tac 1225His Phe Trp Gly Arg Ala Glu Asp Met Lys Met Ala Arg Pro Ala Tyr 260 265 270aaa ctc aca cca agc aaa ctt ggg tcc gat gtt gct ggg gag att gct 1273Lys Leu Thr Pro Ser Lys Leu Gly Ser Asp Val Ala Gly Glu Ile Ala 275 280 285gcc tct cta gct gct ggg tat ctg gcg ttc aaa caa aga gat gcc aaa 1321Ala Ser Leu Ala Ala Gly Tyr Leu Ala Phe Lys Gln Arg Asp Ala Lys 290 295 300tac gcc gcc aca ctt ctg tca aca tcc aag gag att tac gag ttt ggc 1369Tyr Ala Ala Thr Leu Leu Ser Thr Ser Lys Glu Ile Tyr Glu Phe Gly305 310 315 320aag aaa tat ccc ggg ata tac tcc tcc agt atc caa gat gct ggg cag 1417Lys Lys Tyr Pro Gly Ile Tyr Ser Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gly Gln 325 330 335ttc tac tca tca agt ggt tac aaa gac gag atg tgt gag ggc gcc atg 1465Phe Tyr Ser Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Glu Met Cys Glu Gly Ala Met 340 345 350tgg ctg tac aaa gca aca ggt gac aaa tcc tac ctg gcc gat gcc aag 1513Trp Leu Tyr Lys Ala Thr Gly Asp Lys Ser Tyr Leu Ala Asp Ala Lys 355 360 365gga tac cac gag aat gcc tgg gcg tgg gct cta gga tgg gac gac aag 1561Gly Tyr His Glu Asn Ala Trp Ala Trp Ala Leu Gly Trp Asp Asp Lys 370 375 380aag atc gct tgc cag ctg ctc ctg tac gaa gtt acc aaa gac act gca 1609Lys Ile Ala Cys Gln Leu Leu Leu Tyr Glu Val Thr Lys Asp Thr Ala385 390 395 400tac aag acg gag gtg gag ggc ttc ttc aag ggc tgg ctc cct ggc ggc 1657Tyr Lys Thr Glu Val Glu Gly Phe Phe Lys Gly Trp Leu Pro Gly Gly 405 410 415tcc atc act tac act cca tgc gga cag gcg tgg aga gac aag tgg ggc 1705Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Cys Gly Gln Ala Trp Arg Asp Lys Trp Gly 420 425 430tcc aac aga tat gca gcc aac tct gca ttc gcc gct ctg gtg gct gct 1753Ser Asn Arg Tyr Ala Ala Asn Ser Ala Phe Ala Ala Leu Val Ala Ala 435 440 445gat gcg ggt att gac act gta acc tac cgg aag tgg gca gtt gag cag 1801Asp Ala Gly Ile Asp Thr Val Thr Tyr Arg Lys Trp Ala Val Glu Gln 450 455 460atg aac tac atc ctc ggg gac aac aaa tac ggc atc agc tac cag att 1849Met Asn Tyr Ile Leu Gly Asp Asn Lys Tyr Gly Ile Ser Tyr Gln Ile465 470 475 480ggc ttc gga aca aaa tac ccc agg aat cca cat cac aga tcc gcc tcc 1897Gly Phe Gly Thr Lys Tyr Pro Arg Asn Pro His His Arg Ser Ala Ser 485 490 495tgc ccc gac att cca gct ccc tgc tcc gag act aac ctc cac acc gct 1945Cys Pro Asp Ile Pro Ala Pro Cys Ser Glu Thr Asn Leu His Thr Ala 500 505 510ggc ccc agc ccc cac atc ctt gtg ggc gcc att gtt gga ggt cct gat 1993Gly Pro Ser Pro His Ile Leu Val Gly Ala Ile Val Gly Gly Pro Asp 515 520 525aat gac gac tct tac aag gac aac agg gag gac tac gtc cac aac gag 2041Asn Asp Asp Ser Tyr Lys Asp Asn Arg Glu Asp Tyr Val His Asn Glu 530 535 540gtg gcc tgc gac tac aac tcc ggc ttc cag tct gct ctc gct ggt cta 2089Val Ala Cys Asp Tyr Asn Ser Gly Phe Gln Ser Ala Leu Ala Gly Leu545 550 555 560act cat ctt gca cac gcc aag gag ctg cca gcc att cct gca cca aag 2137Thr His Leu Ala His Ala Lys Glu Leu Pro Ala Ile Pro Ala Pro Lys 565 570 575tgt cac ggt taa gaaactgact gtttggaatg aaataaaata ttgaatgtta 2189Cys His Gly Stp 579aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2207<210> 2<211> 14<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 2Val Asp Val Thr Ile Ser Asn His Trp Asp Gly Gly Phe Gln 1 5 10<210> 3<211> 7<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 3Trp Arg Gly Asp Ser Ala Leu 1 5<210> 4<211> 10<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 4Gly Asp Asn Gly Glu Asp Leu Thr Gly Gly 1 5 10<210> 5<211> 25<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 5Ser Gln Thr Leu Tyr Ala Gln Val Gly Glu Gly Asn Asp Asp His His 1 5 10 15Phe Trp Gly Arg Ala Glu Asp Met Lys 20 25<210> 6<211> 7<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 6Thr Ile Ser Asn His Trp Asp 1 5<210> 7<211> 20<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai partial amino acid<220><221> unsure<222> 3<223> n=a or c or g or t<220><221> unsure<222> 9<223> n=a or c or g or t<400> 7acnathwsna aycaytggga 20<210> 8<211> 7<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 8Gln Asp Ala Gly Gln Phe Tyr 1 5<210> 9<211> 7<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 9Lys Trp Ala Val Glu Gln Met 1 5<210> 10<211> 21<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai partial amino acid<220><221> unsure<222> 10<223> n=a or c or g or t<220><221> unsure<222> 13<223> n=a or c or g or t<400> 10rtaraaytgn ccngcrtcyt g 21<210> 11<211> 21<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai partial amino acid<220><221> unsure<222> 10<223> n=a or c or g or t<220><221> unsure<222> 13<223> n=a or c or g or t<400> 11catytgytcn acngcccayt t 21<210> 12<211> 21<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 12gccacacttc tgtcaacatc c 21<210> 13<211> 21<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 13ttcttcaagg gctggctccc t 21<210> 14<211> 22<212> DNA<213> artifical sequence<400> 14ctgatctaga ggtaccggat cc 22<210> 15<211> 15<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 15gtcgccagca tgttc 15<210> 16<211> 18<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 16gtccagaaga cgaatggt 18<210> 17<211> 18<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 17atcctcacga acaagcag 18<210> 18<211> 18<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 18cgtcaagtgc gccttcca 18<210> 19<211> 18<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 19gatcgcgatg caggcctt 18
【図面の簡単な説明】
【図１】 アワビの解剖図である。
【図２】 アワビの各内臓組織におけるセルラーゼの分布を示す図である。
【符号の説明】
黒色は総タンパク質量を、白色はセルラーゼ活性を示し、棒グラフの上の数値は比活性を示す。
【図３】 CM-Toyopearlクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】 CM-Toyopearlクロマトグラフィーの結果得られた各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図５】 ＣＭ−III 画分についてハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーを行った結果を示す図である。
【図６】 ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーの結果得られた各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図７】 ＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分についてSephacryl S-200 ゲルろ過を行った結果を示す図である。
【符号の説明】
図３，図５及び図７中、○は吸光度を示し、●はセルラーゼ活性を示す。
【図８】 Sephacryl S-200 ゲルろ過の結果得られた各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図９】 セルラーゼ活性の温度依存性（至適温度）を示す図である。
【図１０】 セルラーゼ活性の熱安定性を示す図である。
【図１１】 セルラーゼ活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図１２】 セルラーゼの酵素消化物の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１３】 各種セルラーゼのアミノ酸配列の相同性を示す図である。
【図１４】 アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡの構造模式図、及び、該ｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ１〜ＮｄＥＧ ｆ４の相対位置を示す図である。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、巻貝類に由来する新規なセルラーゼ及び当該セルラーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】セルラーゼとは、セルロースを低分子化セルロース、セロオリゴ糖、ブドウ糖（β−Ｄ−グルコース）にまで分解する酵素の総称であり、セロオリゴ糖などの機能性オリゴ糖の生産のほか、食品、飼料、工業材料の生産、ひいてはセルロースのバイオマスエネルギー化等に有用な酵素である。このような広い用途を有するセルラーゼが工業的に利用されている主要なものは、現状では糸状菌由来のセルラーゼである。
【０００３】アワビやサザエ等の褐藻を常食としている巻貝類（軟体動物腹足類の１種）の消化液等の中には、セルラーゼやアルギナーゼなどの多糖類分解酵素が含まれていることが知られている。しかしながら、原料の軟体動物が高価であることや、資源的に大量に得るのが難しいことなどの問題があって、現在のところ産業レベルでの利用は実現していない。
【０００４】ところで、北海道においては、アワビやツブガイ等、巻貝類の養殖や水産加工に伴う不可食部分（貝殻、内臓）が、年間数千トンレベルで廃棄されている。近年では、その処理コストや廃棄場所の問題が水産加工業の経営を圧迫する原因となっており、環境への影響も社会問題化している。そのため、これらの廃棄物から高付加価値成分を生産することにより、廃棄物を有価資源化しようという試みが各方面でなされている。
【０００５】アワビやツブガイを例にとると、廃棄される内臓（廃棄内臓）等の利用可能量は、年間数百トン程度はあると思われ、セルラーゼの製造に際して、この廃棄内臓等を出発材料とすることができれば、部分精製品としてもかなりの量のセルラーゼが得られると考えられる。例えば、１０ｇの内臓から１ｍｇ程度のセルラーゼが得られるとすると、単純計算で廃棄内臓１千トンから百ｋｇ程度のセルラーゼが得られることが期待される。
【０００６】前記したように、巻貝類などの軟体動物にセルラーゼが含まれていることは知られているが、これまでは当該酵素の精製が不十分であり、したがって酵素の諸性質については詳細な検討がなされていなかった。また、巻貝類から上記セルラーゼを効率良く製造する方法についても十分に検討されていなかったため、産業上有効利用することができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、巻貝類由来のセルラーゼの諸特性を解明し、巻貝類の養殖や水産加工に伴なう廃棄内臓等の有価資源化の実現に供することを目的とするものである。また、本発明は、巻貝類から、上記セルラーゼを用途に応じた純度で、簡易な操作で、かつ短時間に効率良く製造する方法を開発し、廃棄内臓等の有価資源化の一層の促進を図ることを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するため、巻貝類のセルラーゼを抽出、精製して、その基本的諸性質を鋭意検討した。その結果、巻貝類のセルラーゼは、アミノ酸配列等の遺伝的情報の他、基質特異性、至適温度、熱安定性、ｐＨ依存性等の点において、従来知られている微生物（細菌、真菌、糸状菌）由来のセルラーゼとは異なる基本的性質を持つことを見出した。また、巻貝類のセルラーゼを抽出、精製する方法について検討する過程で、セルラーゼを効率良く製造するための製造方法をも見出した。本発明は、係る知見に基づくものである。
【０００９】請求項１に係る本発明は、巻貝類に由来し、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼを提供するものである。
【００１０】請求項２に係る本発明は、巻貝類に由来し、下記の特性を有するセルラーゼである。
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：６６ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３５〜４０℃（ｅ）熱安定性：４０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜８．０（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載の配列を有する。
【００１１】請求項３に係る本発明は、巻貝類の内臓及び／又は内臓滲出液に緩衝液又は抽出液を注入することによりセルラーゼを抽出し、必要により当該抽出操作を繰り返してセルラーゼを回収することを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法である。
【００１２】請求項４に係る本発明は、請求項３に記載の方法により回収したセルラーゼを冷水に加え、得られたセルラーゼ液に吸着剤を加えて攪拌してセルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、緩衝液を加えてセルラーゼを吸着剤から溶出させることを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳しく説明する。本発明のセルラーゼは、巻貝類に由来する酵素である。巻貝類としては、例えばアワビ、エゾボラ、ヒメエゾボラ、エゾバイ、サザエ、タマキビ等が挙げられる。これらの内、養殖に伴なう廃棄内臓等を原料として容易に入手できる点で、アワビが好ましい。本発明のセルラーゼは、これらの巻貝類の内臓や内臓滲出液、特に消化器系の内臓組織や消化液に多く分布し、中でもアワビの肝膵臓前部やここから滲出する体液である消化液等に豊富に分布している。
【００１４】請求項１に係る本発明のセルラーゼは、上記のように巻貝類に由来し、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるものである。配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｎ末端側の開始コドンに相当するメチオニン、１４残基から成るシグナルペプチド、及び５７９残基から成る成熟型酵素部分の５９４残基からなる。配列表の配列番号１には、巻貝（アワビ）由来のアミノ酸配列のほかに、これに対応する巻貝（アワビ）のセルラーゼ遺伝子の塩基配列も併せて示す。配列表の配列番号１の塩基配列２，２０７ｂｐのうち、アミノ酸への翻訳領域は、５´末端の非翻訳領域（３６４ｂｐ）及び３´末端側の非翻訳領域（５８ｂｐ）を除いた１，７８５ｂｐである。
【００１５】配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列は、例えばセルラーゼが豊富に含まれる巻貝類の内臓から常法によりｃＤＮＡライブラリーを作成し、当該ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法、ＲＡＣＥ法等を用いてセルラーゼをコードするｃＤＮＡ（配列表の配列番号１参照）を取得し、当該塩基配列からアミノ酸配列を翻訳し、確認することにより入手することができる。また、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を化学的な方法によって入手することもできる。配列表の配列番号１のアミノ酸配列、即ち、アワビ・セルラーゼの一次構造は、ヤマトシロアリ、ザリガニ、シロイヌナズナのものと、それぞれ４８％、４６％、３１％の相同性を示すことから、本発明のセルラーゼはglycosil hydrolasefamily 9 に分類されるものである。
【００１６】請求項２に係る本発明のセルラーゼも、巻貝類に由来する酵素である点では請求項１に係る本発明のセルラーゼと同様であり、更に以下に示す特性を有している。
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。
【００１７】すなわち、請求項２に係る本発明のセルラーゼは、セルラーゼとしての活性を有する。ここで、セルラーゼとは、
【００１８】（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：６６ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３５〜４０℃（ｅ）熱安定性：４０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜８．０
【００１９】（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載の配列を有する。
また、請求項２に係る本発明のセルラーゼは、内部領域の部分アミノ酸配列として、配列表の配列番号３〜５に記載の配列を有する。
【００２０】請求項２に係る本発明のセルラーゼの製造は、一般的な手法に従えば良いが、例えば請求項３に示した如く、巻貝類の内臓及び／又は内臓滲出液からセルラーゼを含む抽出液を得た後、これをそのまま回収する方法などがある。また、回収したセルラーゼ含有液を精製する方法としては、請求項４に示した方法は、簡便で、しかも短時間に処理できるので好ましい方法である。
【００２１】次に、請求項３に記載のセルラーゼの製造方法について説明する。巻貝類の内臓及び／又は内臓滲出液を原料とするセルラーゼの製造は、基本的に穏やかな条件下で実施すべきである。巻貝類からセルラーゼを含む抽出液を得る場合に、ワーリングブレンダーを用いた従来のホモジェナイズによる抽出法を行うと、得られるセルラーゼ活性が著しく低下するので好ましくない。しかし、セルラーゼの用途などを考慮して従来法を採用することもできる。本発明では、貝殻に付着した状態の巻貝類の内臓の適当な部分に切り込みを入れ、この部分から内蔵内に緩衝液又は抽出液を静かに注入して内蔵各部や内臓滲出液と接触させるか、もしくは貝殻から切除した後の巻貝類の内臓や内臓滲出液に直接緩衝液又は抽出液を加えることによって、セルラーゼを洗い出すように抽出する。この抽出操作を、必要に応じて数回（２〜５回）繰り返すと、目的とするセルラーゼを含有する抽出液を効率よく回収することができる。この方法によれば、抽出に際して脂質や色素成分などの不純物の溶出量を低減させることができ、高いセルラーゼ活性を示す抽出液が得られる。
【００２２】ここで、セルラーゼの抽出に使用する緩衝液又は抽出液としては、５〜１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１〜５ｍＭ 炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）、１０〜２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）等の中性〜弱アルカリ性に緩衝能を持つ緩衝液が使用可能である。いずれも、４〜１０℃に冷却したものを用いることが好ましい。
【００２３】このようにして得た粗セルラーゼ抽出液からセルラーゼの精製を行う場合、粗セルラーゼ抽出液を冷蒸留水で１０倍に希釈し、イオン交換樹脂を加えてバッチ吸着し、これをカラムに充填してから溶出するというイオン交換クロマトグラフィーを行っても良いが、この方法はフラクションコレクターを必要とすること、試料分取のために数多くの試験管を必要とすること、クロマトグラフィーに１２時間程度を要する等の時間と手間がかかるという問題点がある。そこで、請求項４に係る本発明の方法では、上記した方法によって回収したセルラーゼを含む抽出液を冷水で希釈して得た粗セルラーゼ液、通常は４〜１０℃程度の冷水で７〜１５倍、好ましくは８〜１２倍程度に希釈した粗セルラーゼ液に、適当な吸着剤を加えて穏やかに攪拌することにより、セルラーゼを当該吸着剤に吸着させる。このとき用いる吸着剤としては、イオン交換樹脂の場合、陽イオン交換タイプのイオン交換樹脂、好ましくはCM-Toyopearl（東ソー社製）、SP-Toyopearl（東ソー社製）などがある。イオン交換樹脂を加えて５〜２０分間、好ましくは８〜１５分間攪拌することによって、当該樹脂にセルラーゼをバッチ吸着させることができる。イオン交換樹脂以外の吸着剤としては、例えばハイドロキシルアパタイト（和光純薬工業（株）製）などを使用することができる。
【００２４】セルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、中性ｐＨに調整した、イオン強度０．１〜０．１５のNaCl、KCl 、Na２HPO４ などの溶離液又は緩衝液を加えて懸濁することによって、セルラーゼを吸着剤から溶出させる。この場合、セルラーゼを吸着剤から溶出する前に、デカンテーションや吸引ろ過等によって吸着剤を回収し、非吸着画分をイオン強度０．０１程度の緩衝液で洗浄除去することが望ましい。なお、吸着剤からの溶出は、直線濃度勾配で行うと、より高純度のセルラーゼを得ることができる。次いで、ろ過、遠心分離などの固−液分離手段によりセルラーゼを溶出液中に回収する。この方法によれば、比較的高純度（通常３０〜５０％程度）のセルラーゼを１〜３時間という短時間で大量に製造することができる。例えば、中型アワビ（７０〜９０ｇ）の場合、１個体から５〜１０ｍｇ程度のセルラーゼを得ることができる。
【００２５】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳しく説明するが本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、実施例を示す前に、活性の測定法など本実施例で用いた基本的分析方法について述べる。
【００２６】（１）セルラーゼ活性（カルボキシメチルセルラーゼ活性）の測定及び検出方法（１−１）生成還元糖の定量によるセルラーゼ活性の測定セルラーゼ活性の測定には、基本的には以下の組成の反応混液を用いた。
１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
０．５％ カルボキシメチルセルロース（中粘度ＣＭＣ、ＩＣＮ製）
種々の量のセルラーゼ（測定対象試料）
【００２７】反応液量は１ｍｌとし、反応温度は３０℃、反応時間は３０分とした。反応停止は１００℃で５分間の加熱によった。生成した還元糖（還元末端）はＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法により定量した。セルラーゼ１単位（ｕｎｉｔ）は、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量と定義した。
【００２８】（１−２）ザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の検出セルラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後、ゲルをシャーレに移し５０ｍｌの１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）と２５％ イソプロパノールを含む溶液により４℃で３０分間、穏やかに振盪しながら洗浄した。この操作を３回繰り返した後、さらに１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で３回洗浄することにより酵素を再生させた。
【００２９】一方、直径１５ｃｍのガラスシャーレに０．１％のＣＭＣと１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む２％の寒天ゲルを作成しておき、ここに上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の洗浄ゲルを重層した。これを３７℃で３時間インキュベートすることにより、洗浄ゲル中の再生セルラーゼと寒天ゲル中のＣＭＣとを反応させた。反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、０．１％ クマシブリリアントブルーの５０％ メタノール溶液で染色し、一方の寒天ゲルは、０．１％ コンゴーレッド水溶液で染色した。セルラーゼ活性はコンゴーレッド非染色部として検出した。
【００３０】（２）タンパク質濃度、総タンパク質量の測定タンパク質濃度は、高濃度（ｍｇ／ｍｌオーダー）の場合は、Ｂｉｕｒｅｔ法で、低濃度（μｇ／ｍｌオーダー）の場合は、Ｌｏｗｒｙ法で定量した。総タンパク質量は、試料溶液のタンパク質濃度に試料溶液の体積を乗じることによって算出した。
【００３１】（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｐｏｒｚｉｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎの方法に従い、０．１％ＳＤＳ−１０％ゲルと０．１％ＳＤＳ−１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて行った。
【００３２】実施例１（アワビ・セルラーゼの調製）
エゾアワビ（Haliotis（Nordotis）discus hannai ）を原料として、アワビ・セルラーゼの調製を以下の手順で行った。
（１）アワビ・セルラーゼの分布アワビにおけるセルラーゼの分布を調べた。すなわち、試料として、貝殻長８×６ｃｍ、体重８０ｇの中型エゾアワビを解体し、吻＋歯舌、食道、胃、肝膵臓前部、同中部、同後部をそれぞれ切除した。アワビの体内における各内蔵組織の位置は、図１の解剖図に示す通りである。
【００３３】各内臓組織をそれぞれ５０ｍｌのビーカーに取り、そこに１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ加え、１０ｍｌの駒込ピペットで１分間に２０回程度の吸引−吐出を行う操作を氷冷下で３０分間行うことにより、可溶性成分を抽出した。抽出後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、各内臓組織の酵素液とした。また、アワビ解体の際、主に肝膵臓前部から滲出した体液を消化液として回収した。各内蔵組織の酵素液及び消化液試料について総タンパク質量とセルラーゼ活性を測定した。
【００３４】図２にアワビの各内蔵組織の酵素液及び消化液試料の総タンパク質量とセルラーゼ活性を示す。なお、図２中、黒色は総タンパク質量（ｍｇ）を、白色はセルラーゼ活性（全活性（ｕｎｉｔｓ））を示し、棒グラフの上の数値は比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を示す。図２から明らかなように、セルラーゼ活性は、吻＋歯舌と食道では低いが、肝膵臓（特に前部）の酵素液と消化液で著しく高かった。
【００３５】（２）アワビ・セルラーゼの調製
【００３６】即ち、重量約８０ｇのアワビ１０個体を解体し、筋肉を除去した後、肝膵臓を貝殻に付着したまま肝膵臓前部だけをハサミで切り取り、ビーカーに移した。また、肝膵臓を切除する際滲出した消化液もここに合わせた。このようにして肝膵臓前部及び消化液の混合物が合計約６０ｇ得られた。
【００３７】次いで、肝膵臓前部と消化液の混合物に対し、４倍量（２４０ｍｌ）の抽出液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），０．２％ ＮａＮ３ ，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、ガラス棒で穏やかに攪拌しながら、氷冷下で３０分間セルラーゼを抽出した。この上清のタンパク質濃度は約５ｍｇ／ｍｌで、容量は２９０ｍｌであった。その結果、約１４７０ｍｇの粗酵素が得られた。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、粗酵素のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。
【００３８】
【００３９】次いで、この粗酵素希釈液に、あらかじめ１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したCM−Toyopearl ６５０Ｍ（東ソー（株）製）をベッド体積で５０ｍｌ加え、４℃で１０分間穏やかに攪拌することによりセルラーゼを担体に吸着させた。静置して担体を沈澱させ、デカンテーションで上清を概ね除去した後、担体を１００ｍｌの１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で再度懸濁して２．０ｃｍ×１５ｃｍのガラスカラムに充填した。このカラムを、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）１００ｍｌで洗浄した後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む０〜２００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配によりタンパク質を溶出した。各フラクションの吸光度（２８０ｎｍ）とセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ））の測定結果を図３に示す。なお、図３中、○は吸光度を示し、●は比活性を示す。
【００４０】図３から明らかなように、セルラーゼは、３つのピーク画分に溶出していることが分かった。即ち、フラクション番号７〜１０、１３〜１７、２０〜２４の３画分である。これらについては、以降それぞれを、ＣＭ−Ｉ画分、ＣＭ−II画分、ＣＭ−III 画分と呼ぶこととする。
【００４１】一方、図３中でａ〜ｋで示した画分については、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥとザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。また、前記
【００４２】図４の結果によれば、セルラーゼ活性を示すタンパク質の分子サイズは、ＣＭ−Ｉ画分では６６ｋＤａ、８０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａの各成分、ＣＭ−II画分及びＣＭ−III 画分では６６ｋＤａ、８０ｋＤａ、１００ｋＤａの各成分と認められた。ＣＭ−Ｉ画分、ＣＭ−II画分及びＣＭ−III 画分の３画分のうち、最も均一性が高く総活性量も多かったのは、ＣＭ−III 画分であり、これは６６ｋＤａの成分を主成分としていた。そこで、本実施例では、ＣＭ−III 画分に含まれる６６ｋＤａのセルラーゼを完全精製することとした。
【００４３】なお、ＣＭ−III 画分の総タンパク質量は、１３．４ｍｇであった。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、このＣＭ−III 画分のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。ＣＭ−Ｉ画分及びＣＭ−II画分も十分なセルラーゼ活性を持っているので、精製品が必要でない場合は、これらの画分もアワビ・セルラーゼとして使用可能である。
【００４４】
【００４５】図５から明らかなように、ハイドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィーの結果、セルラーゼの比活性は、フラクション番号４４〜４９付近にほぼ単一のピークとして溶出することが分かった。また、図５R>５のａ〜ｉで示した各画分については、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。また、前記
【００４６】図６の結果によれば、フラクション４６〜４９に相当するｃ〜ｆ画分の場合には、６６ｋＤａ付近にバンドが確認されたことから、分子サイズ６６ｋＤａの成分がこのセルラーゼの本体であることが確認された。このセルラーゼ画分は、以後、ＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分と呼ぶこととする。なお、ＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分の総タンパク質量は４．１ｍｇであった。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、このＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。このＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分には、２５ｋＤａ程度の成分が少量混入していたので、さらに以下のSephacryl S −200 ゲルろ過により精製した。
【００４７】
【００４８】各フラクションの吸光度（２８０ｎｍ）とセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ））の測定結果を図７に示す。なお、図７中、○は吸光度を示し、●は比活性を示す。図７から明らかなとおり、セルラーゼ活性はフラクション番号４２〜４８付近に主ピークとして溶出した。また、図７にａ〜ｈで示した各画分については、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。さらに、前記
【００４９】図８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から明らかな通り、これらの画分は６６ｋＤａの単一成分から構成され、ザイモグラフィーにより、この成分がセルラーゼ本体であることが確認された。この精製セルラーゼ（６６ｋＤａ成分）の総タンパク質量は、１．１ｍｇであった。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、この精製セルラーゼ（６６ｋＤａ成分）のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。
【００５０】
【表１】第１表（アワビ・セルラーゼの調製）
【００５１】一方、フラクション番号６２〜６４付近に副ピークとしてセルラーゼ活性が認められたが、ここにはＳＤＳ−ＰＡＧＥとザイモグラフィーのいずれにおいてもタンパク質の存在が認められず、何らかの人工物（artifact) と考えられた。
【００５２】以上、中型エゾアワビの肝膵臓前部及び消化液を出発材料として、分子量サイズ６６ｋＤａのセルラーゼを完全精製することに成功した。この精製過程は、第１表に示す通りであり、分子量サイズ６６ｋＤａの精製セルラーゼは、粗酵素から約９５倍に精製されたことが分かる。一方、活性収率は７％であるが、残りの活性の多くは、前記
【００５３】実施例２（アワビ・セルラーゼの基本性状）
実施例１で調製した分子量サイズ６６ｋＤａの精製セルラーゼの基本的な酵素特性を調べた。以下の実施例２において、市販の糸状菌セルラーゼ（Trichoderma viride起源、和光純薬工業（株）製）からCM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーで精製した、２３．５ｋＤａセルラーゼ成分を比較対照とした。また、部分精製品ではあるが、前記実施例１の
【００５４】（１）セルラーゼ活性の温度依存性（至適温度）
実施例１で得た分子量サイズ６６ｋＤａの精製セルラーゼ（以下、ＣＭ−６６という。）、前記実施例１の
【００５５】即ち、酵素液を除く反応混液（０．９５ｍｌ）を、０〜７０℃の各温度（ＣＭ−６６及びＣＭ−IIは０〜５０℃、Ｔｒｉ−２３．５は２０〜７０℃）で、１０分間プレインキュベートした後、各反応混液にいずれかのセルラーゼを０．０５ｍｌ加えて反応を開始し、それぞれの温度で３０分間保持した後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止した。生じた還元糖はＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法で定量し、セルラーゼ活性を算出した。なお、Ｔｒｉ−２３．５の至適ｐＨは、酸性側（ｐＨ５．０）にあるので、反応混液のｐＨはリン酸ナトリウムでｐＨ５．０とした。結果を図９に示す。なお、図９の上段は比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）の温度依存性を、下段は相対的活性（％）の温度依存性を示し、○はＣＭ−６６の結果を、●はＣＭ−IIの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００５６】図９に示すように、４０℃において、Ｔｒｉ−２３．５の比活性が約１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｇであるのに対し、ＣＭ−６６は約３０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、ＣＭ−IIは約２５ｕｎｉｔｓ／ｍｇであっったことから、ＣＭ−６６及びＣＭ−IIの比活性は、Ｔｒｉ−２３．５に比べ測定した温度範囲で概ね２０倍高いことが明らかとなった。また、ＣＭ−６６及びＣＭ−IIの至適温度は、３５〜４０℃付近にあり、Ｔｒｉ−２３．５の至適温度である約５０℃よりも１０〜１５℃低かった。これらの結果から、アワビ・セルラーゼがTrichoderma viride由来のセルラーゼに比べて、より低温で高活性を示すことが示された。
【００５７】（２）セルラーゼ活性の熱安定性次に、ＣＭ−６６、ＣＭ−II、及びＴｒｉ−２３．５のセルラーゼ活性の熱安定性を測定した。即ち、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に、各酵素を０．１５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、２０〜７０℃の各温度で３０分間インキュベートした後、氷冷した。これらの加熱処理酵素の０．０５ｍｌを、あらかじめ３０℃に保温してある０．９５ｍｌの反応混液に加え、同温度で３０分間反応させた。相対的活性の結果を図１０に示す。なお、図１０中、○はＣＭ−６６の結果を、●はＣＭ−IIの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００５８】図１０によれば、ＣＭ−６６及びＣＭ−IIの活性は、加熱温度が３０℃まではほとんど変化しないが、４０℃以上になると急激に失活することが分かる。一方、比較対照のＴｒｉ−２３．５の活性は、５０℃まではほとんど失活しないが、６０℃では従来の報告通りほぼ完全に活性が失われた。このことから、アワビ・セルラーゼの熱安定性は、Trichoderma viride由来のセルラーゼよりも約１０℃低いことが明らかとなった。
【００５９】（３）セルラーゼ活性のｐＨ依存性従来知られているセルラーゼの至適ｐＨは、多くの場合酸性側（ｐＨ４．０〜６．０）にある。そこで、アワビ・セルラーゼのセルラーゼ活性のｐＨ依存性をTrichoderma viride由来のセルラーゼのそれと比較すべく、ＣＭ−６６、ＣＭ−II、及びＴｒｉ−２３．５のセルラーゼ活性のｐＨ依存性を測定した。即ち、酢酸ナトリウム（ｐＨ２．０〜５．０）、リン酸ナトリウム（ｐＨ５．０〜９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜１０．０）で反応混液のｐＨを変えて、温度３０℃における各ｐＨにおけるセルラーゼ活性を測定した。図１１に結果を示す。なお、図１１の上段は比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を、下段は相対的活性（％）を示し、○はＣＭ−６６の結果を、●はＣＭ−IIの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００６０】図１１に示すように、ＣＭ−６６及びＣＭ−IIは、ｐＨ６．５及びｐＨ７．２でそれぞれ最大活性を示し、何れの場合もｐＨ５．５〜８．０にかけて最大の７０％以上の活性値を示したことから、アワビ・セルラーゼはほぼ中性から弱アルカリ性に至適ｐＨを有することが明らかとなった。一方、比較対照に用いたＴｒｉ−２３．５の至適ｐＨは、これまで報告されている通り、ｐＨ５．０付近であった。このことから、アワビ・セルラーゼの至適ｐＨは、ほぼ中性から弱アルカリ性域にあり、Trichoderma viride由来のセルラーゼを始めとする他の糸状菌セルラーゼの至適ｐＨが酸性側にあるのとは明らかに異なるｐＨ特性を持つ酵素であることが分かった。ほぼ中性からアルカリ性領域で作用するセルラーゼは多くないことから、アワビ・セルラーゼはセルラーゼの使用可能なｐＨ範囲を広げるという点で有用性が高いと考えられる。
【００６１】（４）ＣＭ−Ｉ画分の部分アミノ酸配列の解読アワビ・セルラーゼのうち、完全精製した６６ｋＤａの成分（ＣＭ−６６）の部分アミノ酸配列を分析し、これまでに一次構造が明らかにされているセルラーゼのアミノ酸配列との差異を若干ながら検討した。まず、ＣＭ−６６についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。そして、そのＮ末端のアミノ酸配列を、パーキンエルマー−ＡＢＩ社製の４７３Ａ型プロテインシークエンサーで分析した。その結果、ＣＭ−６６のＮ末端１４残基の配列は、配列表の配列番号２に示した通りであることが明らかとなった。
【００６２】一方、ＣＭ−６６の内部領域の配列を分析するために、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に溶解した０．１４ｍｇのＣＭ−６６を、０．００２８ｍｇ（ＣＭ−６６の１／５０に相当する重量）のリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業（株）製）により３７℃で６時間消化した。得られた消化物を、０．１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＳカラム（Mightysil RP-18 GP、１５０×４．６ｍｍ）を装着した高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）（ＥＹＬＡ ＬＰ−１０００）に供し、０〜５０％アセトニトリルの直線濃度勾配によりペプチド断片を分離・溶出した。逆相ＨＰＬＣの結果を図１２に示す。
【００６３】得られたペプチド断片は、凍結乾燥後、上記プロテインシーケンサーに供した。その結果、図１２に示したカラム保持時間２３．２０分の成分（以下、Ｐ−２３．２０という。）、２８．８分の成分（以下、Ｐ−２８．８０という。）、３０．２１分の成分（以下、Ｐ−３０．２１という。）の各アミノ酸配列（配列表の配列番号３〜５参照）が、他種のセルラーゼと明らかな相同性を示すことが明らかとなった。
【００６４】図１３には、ＣＭ−６６のＮ末端及びＰ−２３．２０、Ｐ−２８．８０、Ｐ−３０．２１の各配列と相同性を示すタンパク質をＦＡＳＴＡプログラム（ＤＤＢＪを利用）により検索した結果を示す。それによれば、ＣＭ−６６のＮ末端の配列は、Cellulomonus fimi 及びStreptomyces coelicol （いずれもセルロース分解菌）のセルラーゼの分子内部領域と約４２．０％及び５０．０％の相同性を示すことが分かった。また、Ｐ−２３．２０の配列はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）・セルラーゼの６１〜６７残基部分、及びザリガニ（Cherax quadricarinatus）・セルラーゼの６７〜７３残基部分と、いずれも１００％の相同性を示した。更に、Ｐ−２８．８０の配列はオオシロアリ（Hodotermopsis japonica）・セルラーゼ及びワモンゴキブリ（Periplaneta americana ）・セルラーゼのＮ末端領域の配列と、いずれも９０．０％の相同性を示した。一方、Ｐ−３０．２１の配列はシロイヌナズナ・セルラーゼの１４２〜１６０残基部分、及びオオシロアリ・セルラーゼの７５〜９３残基部分と、それぞれ６８．４％、６３．２％の相同性を示した。これらの結果は、ＣＭ−６６が昆虫や植物のセルラーゼと比較的近い一次構造を持つ可能性を示すものである。
【００６５】実施例３（アワビ・セルラーゼｃＤＮＡのクローニングと全アミノ酸配列の解析）
この例では、実施例１で完全精製した分子量サイズ６６ｋＤａのアワビ・セルラーゼ（ＣＭ−６６）をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法及びＲＡＣＥ法により取得し、そのｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。
【００６６】（１）アワビ肝膵臓ｃＤＮＡライブラリーの作成アワビ肝膵臓１ｇからグアニジンチオシアン酸−フェノール法により、全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ約３００μｇからOligo-Tex dT (30) （ＴａＫａＲａ社製）を用いたバッチ法により、約２μｇのｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡ約０．５μｇを用いて、TaKaRa cDNA Synthesis Kit （ＴａＫａＲａ社製）によりアワビ肝膵臓ｃＤＮＡライブラリーを作成し、ＰＣＲのテンプレートとした。一方、残りのｍＲＮＡは、５´−及び３´−ＲＡＣＥ反応に用いた。
【００６７】（２）ｃＤＮＡの取得、及び、塩基配列並びにアミノ酸配列の解析
【００６８】その結果、約１，０００ｂｐのｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ２）が増幅された。そこで、このｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ２）をＰＣＲ−ＴＯＰＯ２．１システム（Invitrogen社製）でクローン化し、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ３１０、パーキンエルマー−ＡＢＩ社製）で塩基配列を分析した。その結果、ＮｄＥＧ ｆ２は１，００５ｂｐの塩基配列から成り、アワビ・セルラーゼのＮ末端から３３８アミノ酸残基の配列をコードしていることが明らかになった。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ２の相対位置を図１４に示す。
【００６９】
【００７０】これらＡＣＦ２−ＡＣＲ２の組み合わせによりＰＣＲを行った結果、約４８０ｂｐのｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ３）が増幅された。このｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ３）を第１回目のＰＣＲと同様の条件でクローン化し、塩基配列を分析した結果、ＮｄＥＧ ｆ３は４４７ｂｐから成り、アワビ・セルラーゼのＣ末端領域１４９残基のアミノ酸配列をコードしていることが明らかとなった。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ３の相対位置を図１４に示す。
【００７１】
【００７２】このＰＣＲにより増幅されたｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ４）を第１回目のＰＣＲと同様の条件でクローン化し、塩基配列を分析した結果、ＮｄＥＧ ｆ４は、３´末端に５８ｂｐの非翻訳領域（１９ｂｐのポリ（Ａ）尾部を含む。）を持つ５７７ｂｐの塩基配列から成ることが明らかになった。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ４の相対位置を図１４１４に示す。
【００７３】ＮｄＥＧ ｆ４の停止コドンを除く翻訳領域５１６ｂｐの塩基配列から、１７２残基のアミノ酸配列が演繹された。このアミノ酸配列を、上述したＮ末端側領域のアミノ酸配列と連結することにより、アワビ・セルラーゼのＮ末端からＣ末端までの全５７９残基のアミノ酸配列が明らかになった（図１４参照）。なお、アミノ酸配列から計算される分子量は６３，２４１であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって見積もられた分子量約６６，０００とやや異なるが、電気泳動の移動度より算出される分子量は、一般に誤差が大きいので、この程度の違いは誤差範囲であると推測される。
【００７４】
【００７５】増幅されたｃＤＮＡ（ＮｄＥＧ ｆ１）を第１回目のＰＣＲと同様の条件でクローン化し、塩基配列を解析した結果、ＮｄＥＧ ｆ１は、３６４ｂｐの５´−非翻訳領域と、１０８ｂｐの翻訳領域の計４７２ｂｐから成ることが明らかとなった。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ１の相対位置を、図１４に示す。翻訳領域のアミノ酸配列と成熟型酵素のアミノ酸配列を比較した結果、アワビ・セルラーゼのＮ末端には、開始コドンに続く１４残基のシグナルペプチドが存在することが新たに明らかになった。
【００７６】以上、ＰＣＲ法とＲＡＣＥ法によりアワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡを取得し、合計２，２０７ｂｐの塩基配列を決定した。アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡの構造模式図を図１４に示す。図１４１４から明らかなとおり、アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡのうち、翻訳領域は１，７８５ｂｐであり、ここから開始コドンに相当するメチオニン（Ｍｅｔ）、１４残基からなるシグナルペプチド、成熟型酵素部分の５７９残基部分及び停止コドンからなるアミノ酸配列が翻訳された。塩基配列及び翻訳アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示す通りである。これらの塩基配列及び翻訳アミノ酸配列は、ＤＤＢＪをはじめとするＤＮＡデータベースには登録されておらず、新規配列であることが確認された。なお、アワビ・セルラーゼｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳アミノ酸配列、即ち、アワビ・セルラーゼの一次構造は、ヤマトシロアリ、ザリガニ、シロイヌナズナのものと、それぞれ４８％、４６％、３１％の相同性を示すことから、本酵素はglycosil hydrolase family 9 に分類されることが明らかである。
【００７７】実施例４（アワビ・セルラーゼの調製）
中型アワビ（エゾアワビ（Haliotis（Nordotis）discus hannai ）、体重８０ｇ）３個体の筋肉（腹足筋）をナイフで除去した後、ハサミで吻部から中腸腺前部方向に向かって切開した。それにより、滲出した消化液をビーカーに受けた。さらに、切開部に駒込ピペットを使って５ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を吹き込み、洗浄液をビーカー中に受けた。この洗浄はさらに２回繰り返した。３個体分についてこの操作を行い、得られた粗酵素液を合わせた後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清のタンパク質濃度は、約５ｍｇ／ｍｌで、体積は５１ｍｌであった。従って、総タンパク質量は、約２５５ｍｇであった。総タンパク質量のほか、粗酵素液のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）、収率（％）の測定値を第２表に示した。
【００７８】この粗酵素液に５００ｍｌの冷蒸留水を加え、さらに、ベッド体積で２０ｍｌの１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したCM−Toyopearl を直接加えた。５分間静かに懸濁することにより、セルラーゼをCM−Toyopearl に吸着させ、グラスフィルターろ過により、CM−Toyopearl を集めた。これを、１００ｍｌのビーカーに取り、ここに、１０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＣｌ−１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を加えて静かに攪拌し、セルラーゼを溶出した。次いで、グラスフィルターでろ過し、ろ液を集めた。この担体からのセルラーゼ溶出操作は、もう一回行い、これらの溶出液を合一した。この溶出液の全タンパク質量、セルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）、収率（％）を第２表に示した。
【００７９】
【表２】第２表（セルラーゼの簡便調製法）
【００８０】第２表に示すように、本発明の方法により、比活性が２．１ｕｎｉｔｓ／ｍｇで、精製度が粗酵素の１４倍の純度２０〜３０％程度のアワビ・セルラーゼを、１〜３時間で６８％の収率で大量に（中型アワビ（７０〜９０ｇ）の場合、１個体から５〜１０ｍｇ）得られることがわかった。このセルラーゼの比活性は、従来のようにワーリングブレンダー等を用いたホモジェナイズ抽出や、先に貝殻から消化器官を切除する方法で精製したものと比較して、脂質や色素成分などの混入がなく、高い精製率のものであった。なお、CM−Toyopearl からの溶出を直線濃度勾配にすれば、より高純度のセルラーゼを得ることができる。
【００８１】比較例１中型アワビ（エゾアワビ、体重８０ｇ）３個体の肝膵臓をワーリングブレンダーでホモジェナイズし、遠心分離（１０，０００×ｇ）により得た上清を粗酵素液とした。これを硫安分画して得た画分（４０〜７０％飽和画分）及びゲルろ過によって脱塩した画分（脱塩画分）の全タンパク質量、セルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）、及び収率（％）を第３表に示した。
【００８２】
【表３】第３表（セルラーゼの従来法による調製）
【００８３】
【発明の効果】請求項１に係る本発明のセルラーゼは、新規なアミノ酸配列を有し、巻貝類由来のセルラーゼに関する遺伝的情報を提供するものである。請求項２に係る本発明のセルラーゼは、比較的低温で高活性を示し、至適ｐＨがほぼ中性から弱アルカリ性にあり、また比活性値が糸状菌のセルラーゼより高いことから、新規なセルラーゼであることが明らかである。特に、至適ｐＨの範囲が広いことから、従来のセルラーゼよりも広範な利用が期待できる。さらに、本発明のセルラーゼは、巻貝類に由来しており、その給源を養殖及び水産加工の際に廃棄される廃棄内臓に求めることができる。そのため、従来の糸状菌由来のセルラーゼと比較して低コストで、かつ大量に生産することが可能である。
【００８４】請求項１及び２に係る本発明のセルラーゼは、地球上に最も大量に存在する多糖であるセルロースの糖化利用、セロビオース、セロトリオースなどのセロオリゴ糖の生産、飼料効率を高めるための飼料添加、製紙工業における脱墨や脱色の促進、洗剤等の用途に広く利用できると共に、本発明は養殖や水産加工に伴なう廃棄内臓の有価資源化の実現に供するものである。
【００８５】また、請求項３に係る本発明の方法により、不純物である脂質や色素成分などの溶出量を最低限に抑え、活性の低下が抑制された上記請求項２に係る本発明のセルラーゼを製造することができる。しかも、本発明の方法は、加熱や激しい撹拌などの操作を必要としないので操作が簡便である。また、このセルラーゼは、抽出後に硫安分画を行わなくても、従来の抽出後に硫安分画を行って得られるセルラーゼ標品と同程度か、それ以上の純度を有している。そのため、本発明は、操作工程を省略でき、短時間で所望のセルラーゼを得ることができる有効な方法である。
【００８６】そして、請求項４に係る本発明の製造方法によれば、従来の製造方法と比較して、簡便な操作で高純度のセルラーゼを、短時間で得ることができる。それ故、請求項３及び４に係る本発明の製造方法は、上記優れた特質を有し、産業上の利用性も高い請求項２に係る本発明のセルラーゼの効率的な製造方法として極めて有用である。
【００８７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> 北海道ティー・エル・オー株式会社<120> 巻貝類由来のセルラーゼ及びその製造方法<130> P131224K<160> 19<210> 1<211> 2207<212> DNA<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 1gattatagtc acttgcctaa ggagacacaa cgtgcctcac agttgcttca ctgcggggca 60ggacagaagc cctagaaact ctcaggagtc aacctgccta acaccgtcat ctccacgacc 120atcttgatta acttcatctg atttttctct tgaaagctgt gcacagatcg acgtgccaca 180acacaatttt gactcagcat aatacttttt taaagtttct atttcgctgc acgctcattc 240gtgtatcata gccattggtg tatggaaatt ttggcttcaa gataaggccg gtgacaagtg 300aggcgaggtg gggacgacta cagcgtcttc agtagacgta ccgagtcagg acaaaggaga 360caat atg ctg gtg ttt gta ctg gcg gct cta gcg gct gcg gcc tcg gcg 409 Met Leu Val Phe Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ser Ala -15 -10 -5 -1gtg gac gtc acc atc agc aac cac tgg gac ggc ggc ttc cag ggg aag 457Val Asp Val Thr Ile Ser Asn His Trp Asp Gly Gly Phe Gln Gly Lys 1 5 10 15gcc tgc atc gcg atc acc aca gaa ctt cat agc tgg aag gcg cac ttg 505Ala Cys Ile Ala Ile Thr Thr Glu Leu His Ser Trp Lys Ala His Leu 20 25 30acg ttc tct cag gct gtt gat tct cta gat tgt ggc aca gcc aat gtc 553Thr Phe Ser Gln Ala Val Asp Ser Leu Asp Cys Gly Thr Ala Asn Val 35 40 45cag aag acg aat ggt gga aag gaa tac atc ctc acg aac aag cag tgg 601Gln Lys Thr Asn Gly Gly Lys Glu Tyr Ile Leu Thr Asn Lys Gln Trp 50 55 60aac gca gat gaa cat gct ggc gac aaa ctc tgc ctg gac ttt gtt ggt 649Asn Ala Asp Glu His Ala Gly Asp Lys Leu Cys Leu Asp Phe Val Gly 65 70 75 80cac aca agt ggt gat atc aac cct aag acc acc cta aca ata gag ggc 697His Thr Ser Gly Asp Ile Asn Pro Lys Thr Thr Leu Thr Ile Glu Gly 85 90 95gtg gct gcc ggc agt tcc cac acg ggg acc aac aca ggt acc aac act 745Val Ala Ala Gly Ser Ser His Thr Gly Thr Asn Thr Gly Thr Asn Thr 100 105 110ggt acc cac acc ggc acc cag gcc cct gtg cag gtg ccc aaa aca gga 793Gly Thr His Thr Gly Thr Gln Ala Pro Val Gln Val Pro Lys Thr Gly 115 120 125ggc ggt aca gaa aga tac aac tat ggc gag gct ctt ggc aag tcc atc 841Gly Gly Thr Glu Arg Tyr Asn Tyr Gly Glu Ala Leu Gly Lys Ser Ile 130 135 140ctg ttc tat gat gct cag aga tca ggc aaa ctt ccg gcc aac aac ccc 889Leu Phe Tyr Asp Ala Gln Arg Ser Gly Lys Leu Pro Ala Asn Asn Pro145 150 155 160atc aag tgg cga ggt gac tcc gcc ctg gga gac aag gga gac aac ggc 937Ile Lys Trp Arg Gly Asp Ser Ala Leu Gly Asp Lys Gly Asp Asn Gly 165 170 175gag gat ctg act gga ggg tgg tat gat gct ggt gac cac gtc aag ttt 985Glu Asp Leu Thr Gly Gly Trp Tyr Asp Ala Gly Asp His Val Lys Phe 180 185 190agc ttg cca atg tca agt act tcg act gtg tta ctc tgg gga tac cta 1033Ser Leu Pro Met Ser Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Trp Gly Tyr Leu 195 200 205cag tgg aaa gat gcc tat gct act act aaa caa aca gac atg ttc ttt 1081Gln Trp Lys Asp Ala Tyr Ala Thr Thr Lys Gln Thr Asp Met Phe Phe 210 215 220gac atg atc aaa tgg ccc ttg gac tac ttc ttg aag tgc tgg att cca 1129Asp Met Ile Lys Trp Pro Leu Asp Tyr Phe Leu Lys Cys Trp Ile Pro225 230 235 240aaa agt cag act ttg tat gca cag gtt gga gaa gga aat gat gac cac 1177Lys Ser Gln Thr Leu Tyr Ala Gln Val Gly Glu Gly Asn Asp Asp His 245 250 255cac ttc tgg ggc cgc gct gag gac atg aag atg gcc aga ccc gcc tac 1225His Phe Trp Gly Arg Ala Glu Asp Met Lys Met Ala Arg Pro Ala Tyr 260 265 270aaa ctc aca cca agc aaa ctt ggg tcc gat gtt gct ggg gag att gct 1273Lys Leu Thr Pro Ser Lys Leu Gly Ser Asp Val Ala Gly Glu Ile Ala 275 280 285gcc tct cta gct gct ggg tat ctg gcg ttc aaa caa aga gat gcc aaa 1321Ala Ser Leu Ala Ala Gly Tyr Leu Ala Phe Lys Gln Arg Asp Ala Lys 290 295 300tac gcc gcc aca ctt ctg tca aca tcc aag gag att tac gag ttt ggc 1369Tyr Ala Ala Thr Leu Leu Ser Thr Ser Lys Glu Ile Tyr Glu Phe Gly305 310 315 320aag aaa tat ccc ggg ata tac tcc tcc agt atc caa gat gct ggg cag 1417Lys Lys Tyr Pro Gly Ile Tyr Ser Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gly Gln 325 330 335ttc tac tca tca agt ggt tac aaa gac gag atg tgt gag ggc gcc atg 1465Phe Tyr Ser Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Glu Met Cys Glu Gly Ala Met 340 345 350tgg ctg tac aaa gca aca ggt gac aaa tcc tac ctg gcc gat gcc aag 1513Trp Leu Tyr Lys Ala Thr Gly Asp Lys Ser Tyr Leu Ala Asp Ala Lys 355 360 365gga tac cac gag aat gcc tgg gcg tgg gct cta gga tgg gac gac aag 1561Gly Tyr His Glu Asn Ala Trp Ala Trp Ala Leu Gly Trp Asp Asp Lys 370 375 380aag atc gct tgc cag ctg ctc ctg tac gaa gtt acc aaa gac act gca 1609Lys Ile Ala Cys Gln Leu Leu Leu Tyr Glu Val Thr Lys Asp Thr Ala385 390 395 400tac aag acg gag gtg gag ggc ttc ttc aag ggc tgg ctc cct ggc ggc 1657Tyr Lys Thr Glu Val Glu Gly Phe Phe Lys Gly Trp Leu Pro Gly Gly 405 410 415tcc atc act tac act cca tgc gga cag gcg tgg aga gac aag tgg ggc 1705Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Cys Gly Gln Ala Trp Arg Asp Lys Trp Gly 420 425 430tcc aac aga tat gca gcc aac tct gca ttc gcc gct ctg gtg gct gct 1753Ser Asn Arg Tyr Ala Ala Asn Ser Ala Phe Ala Ala Leu Val Ala Ala 435 440 445gat gcg ggt att gac act gta acc tac cgg aag tgg gca gtt gag cag 1801Asp Ala Gly Ile Asp Thr Val Thr Tyr Arg Lys Trp Ala Val Glu Gln 450 455 460atg aac tac atc ctc ggg gac aac aaa tac ggc atc agc tac cag att 1849Met Asn Tyr Ile Leu Gly Asp Asn Lys Tyr Gly Ile Ser Tyr Gln Ile465 470 475 480ggc ttc gga aca aaa tac ccc agg aat cca cat cac aga tcc gcc tcc 1897Gly Phe Gly Thr Lys Tyr Pro Arg Asn Pro His His Arg Ser Ala Ser 485 490 495tgc ccc gac att cca gct ccc tgc tcc gag act aac ctc cac acc gct 1945Cys Pro Asp Ile Pro Ala Pro Cys Ser Glu Thr Asn Leu His Thr Ala 500 505 510ggc ccc agc ccc cac atc ctt gtg ggc gcc att gtt gga ggt cct gat 1993Gly Pro Ser Pro His Ile Leu Val Gly Ala Ile Val Gly Gly Pro Asp 515 520 525aat gac gac tct tac aag gac aac agg gag gac tac gtc cac aac gag 2041Asn Asp Asp Ser Tyr Lys Asp Asn Arg Glu Asp Tyr Val His Asn Glu 530 535 540gtg gcc tgc gac tac aac tcc ggc ttc cag tct gct ctc gct ggt cta 2089Val Ala Cys Asp Tyr Asn Ser Gly Phe Gln Ser Ala Leu Ala Gly Leu545 550 555 560act cat ctt gca cac gcc aag gag ctg cca gcc att cct gca cca aag 2137Thr His Leu Ala His Ala Lys Glu Leu Pro Ala Ile Pro Ala Pro Lys 565 570 575tgt cac ggt taa gaaactgact gtttggaatg aaataaaata ttgaatgtta 2189Cys His Gly Stp 579aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2207<210> 2<211> 14<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 2Val Asp Val Thr Ile Ser Asn His Trp Asp Gly Gly Phe Gln 1 5 10<210> 3<211> 7<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 3Trp Arg Gly Asp Ser Ala Leu 1 5<210> 4<211> 10<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 4Gly Asp Asn Gly Glu Asp Leu Thr Gly Gly 1 5 10<210> 5<211> 25<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 5Ser Gln Thr Leu Tyr Ala Gln Val Gly Glu Gly Asn Asp Asp His His 1 5 10 15Phe Trp Gly Arg Ala Glu Asp Met Lys 20 25<210> 6<211> 7<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 6Thr Ile Ser Asn His Trp Asp 1 5<210> 7<211> 20<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai partial amino acid<220><221> unsure<222> 3<223> n=a or c or g or t<220><221> unsure<222> 9<223> n=a or c or g or t<400> 7acnathwsna aycaytggga 20<210> 8<211> 7<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 8Gln Asp Ala Gly Gln Phe Tyr 1 5<210> 9<211> 7<212> PRT<213> Haliotis（Nordotis）discus hannai<400> 9Lys Trp Ala Val Glu Gln Met 1 5<210> 10<211> 21<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai partial amino acid<220><221> unsure<222> 10<223> n=a or c or g or t<220><221> unsure<222> 13<223> n=a or c or g or t<400> 10rtaraaytgn ccngcrtcyt g 21<210> 11<211> 21<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai partial amino acid<220><221> unsure<222> 10<223> n=a or c or g or t<220><221> unsure<222> 13<223> n=a or c or g or t<400> 11catytgytcn acngcccayt t 21<210> 12<211> 21<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 12gccacacttc tgtcaacatc c 21<210> 13<211> 21<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 13ttcttcaagg gctggctccc t 21<210> 14<211> 22<212> DNA<213> artifical sequence<400> 14ctgatctaga ggtaccggat cc 22<210> 15<211> 15<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 15gtcgccagca tgttc 15<210> 16<211> 18<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 16gtccagaaga cgaatggt 18<210> 17<211> 18<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 17atcctcacga acaagcag 18<210> 18<211> 18<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 18cgtcaagtgc gccttcca 18<210> 19<211> 18<212> DNA<213> artifical sequence<220><223> Designed on the basis of Haliotis（Nordotis）discus hannai DNA sequence<400> 19gatcgcgatg caggcctt 18
【図面の簡単な説明】
【図１】 アワビの解剖図である。
【図２】 アワビの各内臓組織におけるセルラーゼの分布を示す図である。
【符号の説明】
黒色は総タンパク質量を、白色はセルラーゼ活性を示し、棒グラフの上の数値は比活性を示す。
【図３】 CM-Toyopearlクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】 CM-Toyopearlクロマトグラフィーの結果得られた各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図５】 ＣＭ−III 画分についてハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーを行った結果を示す図である。
【図６】 ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーの結果得られた各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図７】 ＣＭ−III ・Ｈｙｄ画分についてSephacryl S-200 ゲルろ過を行った結果を示す図である。
【符号の説明】
図３，図５及び図７中、○は吸光度を示し、●はセルラーゼ活性を示す。
【図８】 Sephacryl S-200 ゲルろ過の結果得られた各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図９】 セルラーゼ活性の温度依存性（至適温度）を示す図である。
【図１０】 セルラーゼ活性の熱安定性を示す図である。
【図１１】 セルラーゼ活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図１２】 セルラーゼの酵素消化物の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１３】 各種セルラーゼのアミノ酸配列の相同性を示す図である。
【図１４】 アワビ・セルラーゼをコードするｃＤＮＡの構造模式図、及び、該ｃＤＮＡにおけるＮｄＥＧ ｆ１〜ＮｄＥＧ ｆ４の相対位置を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 巻貝類に由来し、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼ。
【請求項２】 巻貝類に由来し、下記の特性を有するセルラーゼ。
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：６６ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３５〜４０℃（ｅ）熱安定性：４０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜８．０（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載の配列を有する。
【請求項３】 巻貝類の内臓及び／又は内臓滲出液に緩衝液又は抽出液を注入することによりセルラーゼを抽出し、必要により当該抽出操作を繰り返してセルラーゼを回収することを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項４】 請求項３に記載の方法により回収したセルラーゼを冷水に加え、得られたセルラーゼ液に吸着剤を加えて攪拌してセルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、緩衝液を加えてセルラーゼを吸着剤から溶出させることを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項１】 巻貝類に由来し、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼ。
【請求項２】 巻貝類に由来し、下記の特性を有するセルラーゼ。
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：６６ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３５〜４０℃（ｅ）熱安定性：４０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜８．０（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載の配列を有する。
【請求項３】 巻貝類の内臓及び／又は内臓滲出液に緩衝液又は抽出液を注入することによりセルラーゼを抽出し、必要により当該抽出操作を繰り返してセルラーゼを回収することを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項４】 請求項３に記載の方法により回収したセルラーゼを冷水に加え、得られたセルラーゼ液に吸着剤を加えて攪拌してセルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、緩衝液を加えてセルラーゼを吸着剤から溶出させることを特徴とする請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００３−２３５５５２（Ｐ２００３−２３５５５２Ａ）
【公開日】平成１５年８月２６日（２００３．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００２−３４８５２（Ｐ２００２−３４８５２）
【出願日】平成１４年２月１３日（２００２．２．１３）
【出願人】（８００００００２４）北海道ティー・エル・オー株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１５年８月２６日（２００３．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年２月１３日（２００２．２．１３）
【出願人】（８００００００２４）北海道ティー・エル・オー株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]