徐放性製剤の製造法
【課題】生理活性ポリペプチドの取り込み率を高め、投与後初期の漏出を抑制し、かつ長期間にわたり一定した放出速度を示す徐放性製剤およびその製造法を提供する。
【解決手段】生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ成形することによる徐放性製剤およびその製造法。該徐放性製剤としては、０．１〜３００μｍの微粒子であり、注射剤であることが好ましい。該生体内分解性高分子重合物としては、脂肪族ポリエステル、特にα−ヒドロキシカルボン酸重合物であることが好ましい。該生理活性ポリペプチドとしては、ホルモン類（特に、インスリン、成長ホルモン）、サイトカイン（特に、インターフェロン）であることが好ましい。
【解決手段】生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ成形することによる徐放性製剤およびその製造法。該徐放性製剤としては、０．１〜３００μｍの微粒子であり、注射剤であることが好ましい。該生体内分解性高分子重合物としては、脂肪族ポリエステル、特にα−ヒドロキシカルボン酸重合物であることが好ましい。該生理活性ポリペプチドとしては、ホルモン類（特に、インスリン、成長ホルモン）、サイトカイン（特に、インターフェロン）であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとを含んでなる徐放性製剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性ポリペプチドまたはその誘導体は、生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、このうちいくつかについては遺伝子工学、細胞工学の手法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞あるいはハムスターなどの生体を用いて大量に生産され、医薬品としての応用が図られている。しかしながら、これらの生理活性ポリペプチドは一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり、注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。この問題を解決するために生理活性ポリペプチドを含有する徐放製剤を開発する種々の試みがなされている。
特許文献１および特許文献２には、水溶性生理活性ポリペプチド、生体内分解性高分子重合物及び脂肪酸塩を有機溶媒に溶解し、ｏ／ｗ型エマルションとすることにより水溶性生理活性ペプチドの取り込み率を高めた徐放性製剤の製造法が開示されている。
【特許文献１】特開平４−４６１１６号公報
【特許文献２】特開平６−６５０６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前記のように生理活性ポリペプチドの生理活性を保持しながら徐放性製剤を製造する種々の試みがなされているものの、生体内分解性高分子重合物への生理活性ポリペプチドの取り込み率、投与後初期の漏出抑制、長時間にわたる生理活性ポリペプチドの一定した放出速度などの点で、まだ臨床上満足すべき徐放性製剤は得られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは前記の問題点を解決するため鋭意研究を行ったところ、あらかじめ金属塩とした生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ、成形すると、予想外にも生理活性ポリペプチドの取り込み率が飛躍的に向上し、投与後初期の漏出が抑制され、かつ長期間にわたり一定した放出速度を示すなど徐放性製剤として優れた性質を有するものが得られることを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は
（１）生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ、成形することを特徴とする徐放性製剤の製造法、
（２）金属塩が多価金属塩である前記（１）記載の製造法、
（３）金属塩が亜鉛塩またはカルシウム塩である前記（１）記載の製造法、
（４）有機溶媒液中の有機溶媒がハロゲン化炭化水素およびアセトニトリルあるいはアルコール類との混合溶液である前記（１）記載の製造法、
（５）ハロゲン化炭化水素とアセトニトリルあるいはアルコール類との体積比が約４０：１〜約１：１である前記（４）記載の製造法、
（６）生理活性ポリペプチドがホルモンである前記（１）記載の製造法、
（７）ホルモンがインスリンである前記（６）記載の製造法、
（８）ホルモンが成長ホルモンである前記（６）記載の製造法、
（９）生理活性ポリペプチドがサイトカインである前記（１）記載の製造法、
（１０）サイトカインがインターフェロンである前記（９）記載の製造法、
（１１）生体内分解性高分子重合物が脂肪族ポリエステルである前記（１）記載の製造法、
（１２）脂肪族ポリエステルがα−ヒドロキシカルボン酸重合物である前記（１１）記載の製造法、
（１３）脂肪族ポリエステルが乳酸−グリコール酸共重合物である前記（１１）記載の製造法、
（１４）乳酸−グリコール酸共重合物の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が約１００／０〜約４０／６０で、重量平均分子量が約３０００〜約２００００である前記（１３）記載の製造法、
（１５）徐放性製剤が微粒子である前記（１）記載の製造法、
（１６）微粒子の平均粒子径が約０．１〜約３００μｍである前記（１５）記載の製造法、
（１７）徐放性製剤が注射剤である前記（１）記載の製造法、
（１８）生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させた分散液、
（１９）脂肪酸の金属塩を実質上含まない前記（１８）記載の分散液、
（２０）前記（１）記載の製造法により製造される徐放性製剤、
（２１）生体内分解性高分子重合物の金属塩の金属含量が約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）である前記（２０）記載の徐放性製剤、
（２２）生理活性ポリペプチドの含量が約０．００１〜約３０％（ｗ／ｗ）である前記（２０）記載の徐放性製剤、及び
（２３）生体内分解性高分子重合物の亜鉛塩を含む有機溶媒液に成長ホルモンを分散させ、成型することにより得られる前記（２０）記載の徐放性製剤等に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、生理活性ポリペプチドの取り込み率を高め、投与後初期の漏出を抑制し、かつ長期間にわたり一定した放出速度を示す徐放性製剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明において生体内分解性高分子重合物としては、水に難溶または不溶である重合物、例えば脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、バリン酸、ロイシン酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された重合物、共重合物あるいはこれらの混合物〕、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル（例、ポリ−α−シアノアクリル酸メチルエステル、ポリ−α−シアノアクリル酸エチルエステル、ポリ−α−シアノアクリル酸ブチルエステル等）、ポリアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）あるいはこれらの混合物が用いられる。これら生体内分解性高分子重合物の重合の形式はランダム、ブロック、グラフトの何れでもよい。生体内分解性高分子重合物は、好ましくは脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された重合物、共重合物、あるいはこれらの混合物〕である。
【０００７】
前記した脂肪族ポリエステル中、α−ヒドロキシカルボン酸類の１種以上から合成された重合物、共重合物が確実な生体内分解性および生体適合性の観点から好ましい。脂肪族ポリエステルは、特に好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類の２種以上から製造される共重合物である。また、これらの共重合物は混合して使用されてもよい。
前記α−ヒドロキシカルボン酸類は、該α−ヒドロキシカルボン酸類がキラル化合物である場合、Ｄ−体、Ｌ−体およびＤ，Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜約２５／７５の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜約３０／７０の範囲のα−ヒドロキシカルボン酸である。
前記α−ヒドロキシカルボン酸類の重合物の例としては、例えば乳酸の重合物等（以下、ポリ乳酸と称することもある）が用いられる。
前記α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合物の例としては、例えばグリコール酸と他のα−ヒドロキシカルボン酸類との共重合物が挙げられ、該α−ヒドロキシカルボン酸としては乳酸、２−ヒドロキシ酪酸が好ましい。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合物は、好ましくは乳酸−グリコール酸共重合物または２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物である。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合物は、特に好ましくは乳酸−グリコール酸共重合物である。
【０００８】
前記ポリ乳酸としては、Ｄ−体、Ｌ−体およびこれらの混合物の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜約２０／８０の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜約２５／７５の範囲のポリ乳酸である。特に好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約５５／４５〜約２５／７５の範囲のポリ乳酸である。
該ポリ乳酸は、重量平均分子量が約１，５００〜約１０，０００のものが好ましく、さらに好ましくは、重量平均分子量が約２，０００〜約８，０００である。特に好ましくは、重量平均分子量が約３，０００〜約６，０００の範囲のポリ乳酸である。また、ポリ乳酸の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、好ましくは約１．２〜約４．０であり、特に好ましくは、約１．５〜約３．５である。
ポリ乳酸は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法）に従って製造できる。該ポリ乳酸は無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。
【０００９】
該乳酸−グリコール酸共重合物において、その組成比（乳酸／グリコール酸、モル％）は、約１００／０〜約４０／６０が好ましい、さらに好ましくは約９０／１０〜約４５／５５である。該組成比は、特に好ましくは約６０／４０〜約４０／６０である。前記グリコール酸と乳酸の共重合物の重量平均分子量は、約３，０００〜約２０，０００が好ましく、さらに好ましくは約４，０００〜約１５，０００である。また、乳酸−グリコール酸共重合物の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、約１．２〜約４．０が好ましい。さらに好ましくは、約１．５〜約３．５である。
乳酸−グリコール酸共重合物は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法）に従って製造できる。該共重合物は無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。
【００１０】
本発明において、組成比および重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸共重合物を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、例えば組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約６，０００の乳酸−グリコール酸共重合物と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約４，０００の乳酸−グリコール酸共重合物との混合物などが用いられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５〜約７５／２５である。
【００１１】
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物において、その組成比はグリコール酸が約１０〜約７５モル％、残りが２−ヒドロキシ酪酸である場合が好ましく、さらに好ましくはグリコール酸が約２０〜約７５モル％である場合、特に好ましくはグリコール酸が約３０〜約７０モル％である場合である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物の重量平均分子量は、好ましくは約２，０００〜約３０，０００であり、さらに好ましくは約３，０００〜約２０，０００である。重量平均分子量は、特に好ましくは約４，０００〜約１５，０００である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、好ましくは約１．２〜約４．０であり、特に好ましくは約１．５〜約３．５である。
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法）に従って製造される。該共重合物は、無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。
【００１２】
前記グリコール酸共重合物（例、乳酸−グリコール酸共重合物、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物等）は、さらにポリ乳酸と混合して使用してもよい。グリコール酸共重合物とポリ乳酸を混合して使用する場合、その混合比（グリコール酸共重合物／ポリ乳酸、重量％）は、例えば約１０／９０〜約９０／１０である。該混合比は、好ましくは約２０／８０〜約８０／２０である場合、さらに好ましくは約３０／７０〜約７０／３０である場合である。
【００１３】
本明細書中、重量平均分子量及び数平均分子量とは、重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の重量平均分子量および数平均分子量を意味する。測定は、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ ２（昭和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いることにより行った。
【００１４】
本発明において、無触媒脱水重縮合で製造される生体内分解性高分子重合物は、末端に遊離のカルボキシル基を有する。
末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性高分子重合物とは、末端基定量法による数平均分子量と、分子量既知の標準ポリスチレンを用いたＧＰＣ測定法による数平均分子量とがほぼ一致する重合物である。
【００１５】
末端基定量法による数平均分子量は、以下のようにして算出される。
約１ｇ〜３ｇの生体内分解性高分子重合物をアセトン（２５ｍｌ）とメタノール（５ｍｌ）との混合溶媒に溶解し、室温（約０〜約３０℃）で撹拌下、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０．０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で速やかに滴定し、次式により末端基定量による数平均分子量を算出した。
末端基定量法による数平均分子量＝２００００ Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性高分子重合物の質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０．０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液（ｍｌ）
例えば１種類以上のα−ヒドロキシ酸類から無触媒脱水重縮合法で製造され、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性重合物では、ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、α−ヒドロキシ酸の環状二量体から触媒を用いて開環重合法で製造され、末端に遊離カルボキシル基を本質的には有しない生体内分解性重合物では、末端基定量法による数平均分子量がＧＰＣ測定法による数平均分子量を大きく上回る。この相違によって、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性重合物は、末端に遊離カルボキシル基を有しない生体内分解性重合物と明確に区別することができる。
【００１６】
末端基定量法による数平均分子量が絶対値であるのに対し、ＧＰＣ測定法による数平均分子量は各種分析、解析条件（例えば移動相の種類，カラムの種類，基準物質，スライス幅の選択，ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、例えばＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とがほぼ一致するとは、末端基定量法による数平均分子量がＧＰＣ測定法による数平均分子量の約０．５倍〜約２倍の範囲内であることをいう。好ましくは、約０．８倍〜約１．５倍の範囲内であることをいう。また、末端基定量法による数平均分子量がＧＰＣ測定法による数平均分子量を大きく上回るとは、末端基定量法による数平均分子量がＧＰＣ測定法による数平均分子量の約２倍を越える場合をいう。
本発明においては、ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とがほぼ一致する重合物が好ましい。
【００１７】
生体内分解性高分子重合物を金属塩にするために用いられる金属塩は、生体に悪影響をおよぼさない金属塩であれば特に限定されない。金属塩としては、例えばアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム等）などの単価金属、あるいはアルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム等）、亜鉛（ＩＩ価）、鉄（ＩＩ価、ＩＩＩ価）、銅（ＩＩ価）、スズ（ＩＩ価、ＩＶ価）、アルミニウム（ＩＩ価、ＩＩＩ価）等の多価金属と無機酸あるいは有機酸などとの塩が用いられる。
金属は、好ましくは多価金属である、さらに好ましくはアルカリ土類金属、亜鉛である。金属の特に好ましい具体例としては、例えばカルシウム、亜鉛等が挙げられる。
【００１８】
無機酸としては、例えばハロゲン化水素（例、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸等）、硫酸、硝酸、チオシアン酸等が用いられる。
有機酸としては、例えば脂肪族カルボン酸、芳香族酸等が用いられる。脂肪族カルボン酸は、好ましくは炭素数１ないし９の脂肪族カルボン酸、例えば脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂肪族トリカルボン酸などが用いられる。脂肪族カルボン酸は、飽和あるいは不飽和のいずれであってもよい。
脂肪族モノカルボン酸としては、例えば炭素数１ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸（例、炭酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族モノカルボン酸（例、アクリル酸、プロピオール酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）などが用いられる。
脂肪族ジカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等）などが用いられる。
脂肪族トリカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン酸（例、トリカルバリル酸、１，２，３−ブタントリカルボン酸等）などが用いられる。
【００１９】
前記した脂肪族カルボン酸は、水酸基を１ないし２個有していてもよく、このような例としては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙げられる。
脂肪族カルボン酸は、好ましくは脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸は、さらに好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族モノカルボン酸、特に好ましくは炭素数２ないし３の飽和脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸の特に好ましい具体例としては、例えば酢酸等が挙げられる。
芳香族酸としては、例えば安息香酸、サリチル酸、フェノールスルホン酸などが用いられる。
また、生体内分解性高分子重合物を金属塩にするためには、金属化合物として多価金属（前記と同様）のアセチルアセトナート、金属酸化物を用いてもよい。好ましくは、亜鉛アセチルアセトナート、酸化亜鉛である。
【００２０】
生体内分解性高分子重合物を金属塩にするために用いられる金属塩は、多価金属と無機酸または有機酸との塩（以下、多価金属塩と略称する）が好ましい。
多価金属塩の具体例を挙げれば、例えば亜鉛と無機酸との塩〔例、ハロゲン化亜鉛（塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛等）、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛等〕、亜鉛と有機酸との塩〔例、脂肪族カルボン酸亜鉛塩（例、炭酸亜鉛、酢酸亜鉛、グリコール酸亜鉛、乳酸亜鉛、酒石酸亜鉛等）、芳香族亜鉛塩（例、安息香酸亜鉛、サリチル酸亜鉛、フェノールスルホン酸亜鉛等）等〕などが用いられる。カルシウムと無機酸との塩〔例、ハロゲン化カルシウム（塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、フッ化カルシウム等）、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、チオシアン酸カルシウム等〕、カルシウムと有機酸との塩〔例、脂肪族カルボン酸カルシウム塩（例、炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、酒石酸カルシウム、乳酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等）、芳香族カルシウム塩（例、安息香酸カルシウム、サリチル酸カルシウム等）等〕などが用いられる。
多価金属塩は、好ましくは酢酸亜鉛、酢酸カルシウム等が用いられる。
【００２１】
本発明において生理活性ポリペプチドとしては、好ましくは分子量約１，０００〜約５０，０００、さらに好ましくは分子量約５，０００〜約４０，０００の生理活性ポリペプチドが用いられる。
生理活性ポリペプチドの活性として代表的なものとしては、ホルモン作用が挙げられる。また該生理活性ポリペプチドは天然物、合成物、半合成物のいずれでもよく、さらにそれらの誘導体でもよい。該生理活性ポリペプチドの作用機作は、作動性あるいは拮抗性のいずれでもよい。
本発明の生理活性ポリペプチドとしては、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、遊血因子、各種増殖因子、酵素などが用いられる。
【００２２】
ホルモンとしては、例えばインスリン、成長ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリンなどが用いられる。ホルモンは、好ましくはインスリン及び成長ホルモンなどである。
サイトカインとしては、例えばリンホカイン、モノカインなどが用いられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ、ベータ、ガンマ）、インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが用いられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子などが用いられる。サイトカインは、好ましくはリンホカインなどであり、更に好ましくはインターフェロンなどである。サイトカインは、特に好ましくはインターフェロンアルファなどである。
【００２３】
造血因子としては、例えばエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、血小板増殖刺激因子、メガカリオサイトポテンシエーターなどが用いられる。
各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例、ＦＧＦ−９など）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー、インスリン様成長因子（例、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２など）、骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリーなどが用いられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）、カリクレインなどが用いられる。
【００２４】
本発明において、生理活性ポリペプチドが金属を含有する場合、その金属含有量は０．１％以下が好ましく、さらに好ましくは０．０１％以下、特に好ましくは０．００１％以下であって実質的に金属を含まない生理活性ポリペプチドが最適である。たとえば結晶性インスリンは通常亜鉛、ニッケル、コバルト、カドミウムなどの少量の重金属を含んでいる。０．４％（ｗ／ｗ）亜鉛を含んでいるインスリンは６量体で存在し、それ自身で安定に存在し、生体内分解性高分子重合物の金属塩との相互作用が弱められると考えられる。
必要な場合には、生理活性ポリペプチドに含有されている金属を前もって除去しておいてもよく、金属を除去する方法としては公知の方法が用いられる。例えばインスリンの塩酸酸性水溶液を、水あるいは酢酸アンモニウム塩溶液に対して透析したのち凍結乾燥することによりアモルファス状態で金属が最小限のインスリンが得られる。
本発明においては、生体内分解性高分子重合体の金属塩以外の添加物は金属塩を形成していないことが望ましく、特に脂肪酸の金属塩を実質上含まないことがより好ましい。
【００２５】
本発明においては、生体内分解性高分子重合体の金属塩は、例えば生体内分解性高分子重合物の有機溶媒溶液に金属塩の水溶液あるいは固体の金属塩を乳化、分散することによりｗ／ｏあるいはｏ／ｗ型乳化物（エマルション）、または金属塩を含有する生体内分解性高分子重合物の有機溶媒溶液あるいは懸濁液を調製し、それらを水洗、乾燥することによって、あるいはそれらを水中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法あるいはこれらに準ずる方法に付し、次いで洗浄、乾燥することにより製造される。この製造過程において生体内分解性高分子重合物と塩を形成しない金属塩を除去しておくのがよい。
前記有機溶媒液中の有機溶媒は、沸点が１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（例、エタノール、メタノール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等）、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、アセトニトリル等が好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン等）およびアセトニトリルあるいはアルコール類（例、メタノール、エタノール等）の組み合わせが好ましい。特に、ジクロロメタンとアセトニトリルとの組み合わせが汎用される。ハロゲン化炭化水素とアセトニトリルあるいはアルコール類との混合比（体積比）は約４０：１〜約１：１であり、好ましくは約２０：１〜約１：１である。
生体内分解性高分子重合物の金属塩中の金属含量は、好ましくは約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０．０５〜約７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）である。なお、生体内分解性高分子重合物の金属塩中の金属含量は、例えば原子吸光法等の方法により定量される。
以下に、生体内分解性高分子重合物の金属塩の製造法、例えば水中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法などについて記述する。
【００２６】
（Ａ）水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）
本法においては、まず生体内分解性高分子重合物を有機溶媒に溶かして有機溶媒液（以下、油相と称することもある）を製造する。この際、有機溶媒液中の生体内分解性高分子重合物の濃度は、生体内分解性高分子重合物の分子量、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば約０．０１〜約９０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０．１〜約８０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約１〜約７０％（ｗ／ｗ）である。内水相として、金属塩を水に溶かした水溶液を使用する。金属塩の濃度は、各金属塩の水に対する溶解度によって異なるが、例えば約１０〜約９０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約２０〜約８０％（ｗ／ｖ）である。 前記した金属塩の水溶液を、生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に乳化、分散し、ｗ／ｏ型エマルションを製造する。金属塩の水溶液と生体内分解性高分子重合物有機溶媒液との比率（容量比）は、約１：１，０００〜約１：１、好ましくは約１：１００〜約１：２、特に好ましくは約１：５０〜約１：３である。乳化方法は公知の乳化操作により行われる。乳化操作は、例えばタービン型撹拌機、ホモジナイザー等を用いて行われる。ついで、このようにして調製されたｗ／ｏ型エマルションをさらに水相（外水相）中に加えて、ｗ／ｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、油相溶媒を蒸発させ生体内分解性高分子重合物の金属塩を製造する。この際の外水相体積は、例えば油相体積の約１〜約１０，０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２〜約５，０００倍、特に好ましくは、約５〜約２，０００倍から選ばれる。溶媒を除去する方法は、公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、例えばプロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラーなどで撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧して溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーターなどを用いて真空度を調節しながら溶媒を蒸発させる方法などが用いられる。
【００２７】
前記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なｗ／ｏ／ｗ型エマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが用いられる。該乳化剤は、好ましくはポリビニルアルコールが用いられる。該乳化剤は、１種類または２種以上を組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は、外水相に対し約０．００１〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０．０５％〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。
【００２８】
また、外水相中に内水相で用いた金属塩と同一または異なった金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の金属塩の濃度が約０．０１〜約２０％（ｗ／ｗ）、特に約０．１〜約１０％（ｗ／ｗ）となるように脂肪酸金属塩を添加することが好ましい。外水相中の金属塩の濃度を変えることにより、内水相で用いた金属塩が、生体内分解性高分子重合物から外水相へ溶出するのを防ぐこともできる。このようにして得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩を遠心分離あるいは濾過して分取した後、生体内分解性高分子重合物の金属塩の表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。
【００２９】
（Ｂ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）
本法においては、まず前記（Ａ）と同様にして生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液を製造する。ついで、生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液中に金属塩を添加、分散または溶解させる。この際、金属塩の添加量は、金属塩：生体内分解性高分子重合物の重量比が約５：１〜約１：１００、好ましくは約２：１〜約１：５０、さらに好ましくは約１：１〜約１：１０となるようにする。
このようにして調製された有機溶媒液をさらに水相中に加えて、タービン型撹拌機などを用いてｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、前記（Ａ）と同様にして油相溶媒を蒸発させ、生体内分解性高分子重合物の金属塩を製造する。この際の水相体積は、例えば油相体積の約１倍〜約１０，０００倍、さらに好ましくは、約２倍〜約５，０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５倍〜約２，０００倍から選ばれる。前記水相中に、前記（Ａ）と同様に乳化剤を加えてもよい。水相中に、前記（Ａ）と同様に油相中に添加、分散または溶解した金属塩と同一または異なった金属塩を加えてもよい。このようにして得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩は、前記（Ａ）と同様にして分取、洗浄、凍結乾燥する。
【００３０】
（Ｃ）相分離法（コアセルベーション法）
本法により生体内分解性高分子重合物の金属塩を製造する場合には、前記（Ａ）に記載したｗ／ｏ型エマルションあるいは（Ｂ）に記載した金属塩を含む生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加え、生体内分解性高分子重合物の金属塩を析出、固化させる。該コアセルベーション剤は、ｗ／ｏ型エマルションあるいは生体内分解性高分子重合物の有機溶媒溶液の体積の約０．０１倍〜約１，０００倍の体積量が加えられる。さらに好ましくは、約０．０５倍〜約５００倍の体積量である。特に好ましくは、約０．１倍〜約２００倍の体積量である。コアセルベーション剤としては、生体内分解性高分子重合物を溶かす有機溶媒と混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で、高分子重合物を溶解しないものであればよい。具体的には、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンなどが用いられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩を濾過して分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄し、コアセルベーション剤を除去する。さらに、前記（Ａ）と同様にして洗浄を行い、ついで凍結乾燥する。
【００３１】
水中乾燥法およびコアセルベーション法での生体内分解性高分子重合物の金属塩の製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこれのアルカリ金属塩などの水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが適量用いられる。
【００３２】
（Ｄ）噴霧乾燥法
本法によって生体内分解性高分子重合物の金属塩を製造する場合には、金属塩の水溶液と生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液とのｗ／ｏ型エマルションあるいは金属塩を含有する生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液あるいは懸濁液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、微粒状の生体内分解性高分子重合物の金属塩を調製する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。この際、所望によってｗ／ｏ型エマルションあるいは金属塩を含有する生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液あるいは懸濁液と同時に、生体内分解性高分子重合物の金属塩の凝集防止を目的として前記凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。このようにして得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩は、前記（Ａ）と同様にして洗浄し、必要であれば加温・減圧下、水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
【００３３】
本発明の徐放性製剤は、生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ、成形することによって製造される。本発明の製造法としては、例えば前記（Ａ）水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）、（Ｂ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）、（Ｃ）相分離法（コアセルベーション法）および（Ｄ）噴霧乾燥法に準じた方法などが用いられる。前記有機溶媒液中の有機溶媒は、沸点が１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（例、エタノール、メタノール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等）、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、アセトニトリル等が好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン等）およびアセトニトリルあるいはアルコール類（例、メタノール、エタノール等）の組み合わせが好ましい。特に、ジクロロメタンとアセトニトリルとの組み合わせが汎用される。ハロゲン化炭化水素とアセトニトリルあるいはアルコール類との混合比（体積比）は約４０：１〜約１：１であり、好ましくは約２０：１〜約１：１である。以下に、徐放性製剤として、例えばマイクロカプセルを製造する場合の製造方法について記述する。
（ａ）水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）
本法によれば、まず前記（Ａ）に準じた方法で生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液を製造する。この際、生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液中の濃度は、生体内分解性高分子重合物の金属塩の種類、分子量、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば約０．０１〜約８０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０．１〜約７０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約１〜約６０％（ｗ／ｗ）である。内水相として生理活性ポリペプチドの水溶液を使用する。生理活性ポリペプチドの水溶液中での濃度は、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５００％（ｗ／ｖ）である。好ましくは約１％（ｗ／ｖ）〜約４００％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）〜約３００％（ｗ／ｖ）である。この際、該水溶液中にｐＨ調節剤（例、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等）、安定化剤（例、血清アルブミン、ゼラチン、硫酸プロタミン等）、保存剤（例、パラオキシ安息香酸類等）等を加えてもよい。このようにして得られた水溶液を生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液中に乳化、分散しｗ／ｏ型エマルションを製造する。
【００３４】
生理活性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液との比率（容量比）は約１：１，０００〜約１：１、好ましくは約１：１００〜約１：５、特に好ましくは約１：５０〜約１：５である。ついで、このようにして調製されたｗ／ｏ型エマルションをさらに外水相中に加えて、ｗ／ｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を蒸発させマイクロカプセルを調製する。該外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なｗ／ｏ／ｗ型エマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが用いられる。該乳化剤は、好ましくはポリビニルアルコールが用いられる。該乳化剤は、１種類または２種以上を組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は、外水相に対し約０．００１〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０．０５％〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。また、外水相中に内水相で用いた金属塩と同一または異なった金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の金属塩の濃度が約０．０１〜約２０％（ｗ／ｗ）、特に約０．１〜約１０％（ｗ／ｗ）となるように脂肪酸金属塩を添加することが好ましい。外水相中の金属塩の濃度を変えることにより、内水相で用いた金属塩が、生体内分解性高分子重合物から外水相へ溶出するのを防ぐこともできる。
【００３５】
このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過して分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。その後、必要であれば、減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。加温条件としては、生体内分解性高分子重合物のガラス転移温度以上で、マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。好ましくは、生体内分解性高分子重合物のガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度の範囲で加熱乾燥する。ここにおいて、ガラス転移温度とは、示差走査熱量計を用い、加温速度毎分１０ないし２０℃で昇温した際に得られる中間点ガラス転移温度をいう。
【００３６】
（ｂ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）
本法においては、まず前記（Ａ）に準じた方法で生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液を製造する。この際、生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液中での濃度は、前記（ａ）と同様な濃度が用いられる。次いで得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを加え、溶解または分散させ生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとの有機溶媒液または懸濁液を製造する。この時、生理活性ポリペプチドが生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に溶解しない、すなわち混濁するような場合、生理活性ポリペプチドはあらかじめ有機溶媒中に分散させておく方が好ましい。該有機溶媒中には、例えば安定化剤（例、血清アルブミン、ゼラチン、硫酸プロタミン等）を加えてもよい。生理活性ポリペプチドを有機溶媒中に均一に分散させるには、外部物理的エネルギーを加える必要がある。その方法とは、例えば超音波照射、タービン型撹拌器、ホモジナイザー等が挙げられる。このときの生理活性ポリペプチドの有機溶媒中での粒子サイズとしては、約０．０１〜約１００μｍ、好ましくは約０．５〜約５０μｍ、さらに好ましくは約０．１〜約１０μｍであることが望まれる。また、このときの生理活性ポリペプチドの有機溶媒中での濃度は約１〜約５０％、好ましくは約２〜約２０％である。このような処理を行うことで、有機溶媒中における生理活性ポリペプチドの粒子サイズをそろえることができ、生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液中に均一に分散させることが可能となる。また、生理活性ポリペプチドは、生体内分解性高分子重合物の金属塩とは独立して有機溶媒に分散させてもよい。この場合、用いる有機溶媒は生体内分解性高分子重合物の金属塩を溶解した有機溶媒と同一の組成でもよいし異なっていてもよい。例えば、生体内分解性高分子重合物の金属塩をジクロロメタンに溶解し、生理活性ポリペプチドをアセトニトリルに分散させ、両者を混合してもよい。この際、生理活性ポリペプチドと生体内分解性高分子重合物の金属塩との比率（重量比）は、例えば約１：１０００〜約１：１、好ましくは約１：２００〜約１：５、特に好ましくは約１：１００〜約１：５である。ついで、このようにして調製された生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとの有機溶媒液をさらに水相中に加えて、ｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を蒸発させマイクロカプセルを製造する。このようにして得られたマイクロカプセルは前記（ａ）と同様にして分取、洗浄し、凍結乾燥する。その後、必要であれば、前記（ａ）と同様にして減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
【００３７】
（ｃ）相分離法
本法によりマイクロカプセルを製造する場合には、前記（ａ）のｗ／ｏ型エマルションあるいは前記（ｂ）の生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとを含む有機溶媒液に前記（Ｃ）と同様な方法でコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加え、マイクロカプセルを析出、固化させる。このようにして得られたマイクロカプセルは前記（Ｃ）と同様にして分取、洗浄し、コアセルベーション剤および遊離生理活性ポリペプチドを除去する。その後、必要であれば、前記（ａ）と同様にして減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。水中乾燥法および相分離法での製造では、粒子同士の凝集を防ぐために前記（Ｃ）と同様に凝集防止剤を加えてもよい。
【００３８】
（ｄ）噴霧乾燥法
本法によってマイクロカプセルを製造する場合には、前記（ａ）のｗ／ｏ型エマルションあるいは前記（ｂ）の生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとを含む有機溶媒液を、前記（Ｄ）と同様にして噴霧しマイクロカプセルを製造する。このようにして得られたマイクロカプセルは、必要であれば、前記（ａ）と同様にして減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
【００３９】
本発明において、生体内分解性高分子重合物の金属塩への生理活性ポリペプチドの取り込み率は約５０％以上であることが望ましい。
本発明の徐放性製剤に含まれる生理活性ポリペプチドの含量は、例えば約０．００１〜約３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、約０．０２〜約２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０．１〜約１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは、約０．５〜約５％（ｗ／ｗ）である。
本発明の徐放性製剤は、例えば前記で得られたマイクロカプセルをそのままで、あるいはこのマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形、例えば非経口剤（例、筋肉内、皮下、臓器などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮などへの経粘膜剤等）、経口剤（例、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）などとして投与することができる。
本発明の徐放性製剤は、特に注射剤であることが好ましい。前記方法で得られたマイクロカプセルを注射剤とするには、マイクロカプセルを分散剤（例、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＨＣＯ−６０等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等の多糖類、硫酸プロタミン、ポリエチレングリコール４００など）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、局所麻酔剤（塩酸キシロカイン、クロロブタノールなど）等と共に水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油あるいはこれにレシチンなどのリン脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例、ミグリオール８１２等）と共に分散して油性懸濁剤として徐放性注射剤とする。
【００４０】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、微粒子であることが特に好ましい。マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば、平均粒子径として約０．１〜約３００μｍの範囲が挙げられる。粒子径は、好ましくは、約１〜約１５０μｍ、さらに好ましくは、約２〜約１００μｍの範囲の粒子径である。
前記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００４１】
徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
徐放性製剤の適応は、使用する生理活性ポリペプチドにより異なる。徐放性製剤は、該生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病など、成長ホルモンである場合には成長ホルモン分泌不全症およびターナー症候群など、インターフェロン−アルファである場合には、ウイルス性肝炎（例、Ｃ型肝炎、ＨＢｅ抗原陽性活動性肝炎など）、癌（例、腎癌、多発性骨髄腫など）など、エリスロポエチンの場合には貧血（例、腎透析時貧血など）など、Ｇ−ＣＳＦの場合には好中球減少症（例、制ガン剤治療時）、感染症など、ＩＬ−２の場合には癌（例、血管内皮腫など）など、ＦＧＦの場合には消化管潰瘍など、ＦＧＦ−９の場合には血小板減少症など、ＮＧＦの場合には老人性痴呆、神経病（ニューロパシー）など、ＴＰＡの場合には血栓症など、腫瘍壊死因子の場合には癌などの治療または予防に有効である。
【００４２】
徐放性製剤の投与量は、生理活性ポリペプチドの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、該生理活性ポリペプチドの有効濃度が体内で保持される量であればよい。該生理活性ポリペプチドの投与量としては、例えば徐放性製剤が１週間型製剤である場合、好ましくは、成人１人当たり約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０．０００５〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回等、該生理活性ポリペプチドの種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病の成人に対する投与量は、有効成分として通常、約０．００１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。また、成長ホルモンである場合には、下垂体性小人症の患者に対する投与量は、有効成分として通常、約０．００４ｍｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０４ｍｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与することが好ましい。あるいは約０．００８ｍｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０８ｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、２週間に１回投与することが好ましい。
徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存することが好ましい。徐放性製剤は、冷所に保存することがさらに好ましい。ここでいう常温あるいは冷所とは、日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５〜２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。
【実施例】
【００４３】
以下に参考例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
参考例１
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量６０００〕４ｇをジクロロメタン４ｍｌに溶解した。この溶液に４３８ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合しｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションをあらかじめ１８℃に調節しておいた０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液８００ｍｌに注入しタービン型ホモミキサーを使用してｗ／ｏ／ｗ型エマルションを得た。この後、ｗ／ｏ／ｗ型エマルションを室温で撹拌しつつジクロロメタンを揮散させて乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し上清を捨てた。次いで蒸留水６００ｍｌにて２回洗浄後、凍結乾燥して粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ１．３６％（ｗ／ｗ）であった。
【００４４】
参考例２
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１００００〕４ｇをジクロロメタン４ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し小型ホモジナイザーで混合しｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションを参考例１と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ１．１％（ｗ／ｗ）であった。
【００４５】
参考例３
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００〕４ｇをジクロロメタン４ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し小型ホモジナイザーで混合しｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションを参考例１と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ０．９９％であった。
【００４６】
参考例４
組み換え型ヒトインスリン（和光純薬製、亜鉛含量０．３５％）１ｇを０．０１Ｎ塩酸溶液２００ｍｌに溶解した。この溶液を分子量分画６０００の半透膜〔スペクトラポア（SpectraporTM）７ ＭＷＣＯ １０００、スペクトラムメディカルインダストリーズ社製、米国〕を用い０．０１Ｎ塩酸溶液１０Ｌ中で３回透析した。さらに、３０Ｌの０．２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液にて１回、３０Ｌの０．０２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液にて１回、３０Ｌの蒸留水にて１回ずつ透析をした後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥インスリン粉末中の亜鉛含量は０．０００１％（ｗ／ｗ）以下であった。
【００４７】
参考例５
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量６０００〕８ｇをジクロロメタン８ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合して、ｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションをあらかじめ１８℃に調節しておいた０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液１８００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサーを使用してｗ／ｏ／ｗ型エマルションを得た。このエマルションを参考例１と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ、１．１５％であった。
【００４８】
参考例６
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量６０００〕８ｇをジクロロメタン８ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合して、ｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションを参考例４と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ、１．２４％であった。
【００４９】
参考例７
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００〕８ｇをジクロロメタン８ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．２ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合して、ｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションを参考例４と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ、０．９６％であった。
【００５０】
参考例８
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量８０００〕８ｇをジクロロメタン８ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合して、ｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションをあらかじめ１８℃に調節しておいた０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液１８００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサーを使用してｗ／ｏ／ｗ型エマルションを得た。この後、ｗ／ｏ／ｗ型エマルションを室温にて撹拌しつつ、ジクロロメタンを揮散させて、乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し、上清を捨てた。ついで蒸留水１２００ｍｌで２回洗浄した。以上の操作をもう１度繰り返して得られたものと、先に調整したものを混合した後、凍結乾燥して粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩１１．８ｇを得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ１．１９％（ｗ／ｗ）であった。
【００５１】
実施例１
参考例１で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９００ｍｇをジクロロメタン１ｍｌに溶解した。この溶液に参考例４で得られたＺｎ不含インスリン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加しボルテックスミキサーにて混合し、小型ホモジナイザーで混合して、インスリンと乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩とを含む有機溶媒溶液を得た。この有機溶媒溶液をあらかじめ１８℃に調節しておいた０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液８００ｍｌに注入しタービン型ホモミキサーを使用してｏ／ｗ型エマルションとした。このｏ／ｗ型エマルションを室温で撹拌しつつジクロロメタンを揮散させ、マイクロカプセルを得た。得られたマイクロカプセルを遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し上清を捨てた。次いで蒸留水６００ｍｌにて２回洗浄後、凍結乾燥して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル５２０ｍｇを得た。
【００５２】
実施例２
参考例２で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９００ｍｇをジクロロメタン１ｍｌに溶解した。この溶液に参考例４で得られたＺｎ不含インスリン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル４５０ｍｇを得た。
【００５３】
実施例３
参考例３で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９００ｍｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した。この溶液に参考例４で得られたＺｎ不含インスリン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル５０３ｍｇを得た。
【００５４】
実施例４
参考例１で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９５０ｍｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した。この溶液中にヒト成長ホルモン（ジェノトロピンＴＭ １６ＩＵ／アンプル、住友製薬株式会社製）の８本（１２８ＩＵ）の粉末を添加し実施例１と同様に処理し、成長ホルモン含有マイクロカプセル５００ｍｇを得た。
【００５５】
実施例５
参考例５で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９５０ｍｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５０ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状の成長ホルモン含有マイクロカプセル５１７ｍｇを得た。
【００５６】
実施例６
参考例３で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９５０ｍｇをジクロロメタン３ｍｌに溶解した。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５０ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状の成長ホルモン含有マイクロカプセル４１５ｍｇを得た。
【００５７】
実施例７
参考例６で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩４７５ｍｇと乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量６０００〕４７５ｍｇをジクロロメタン−エタノール混合溶媒〔ジクロロメタン／エタノール＝２／１（容積比）〕１．５ｍｌに溶解した。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５０ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状の成長ホルモン含有マイクロカプセル２４９ｍｇを得た。
【００５８】
実施例８
参考例７で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩４７５ｍｇと乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００〕４７５ｍｇをジクロロメタン−エタノール混合溶媒〔ジクロロメタン／エタノール＝２／１（容積比）〕３ｍｌに溶解した。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５０ｍｇを添加し、実施例１と同様にして粉末状の成長ホルモン含有マイクロカプセル４４７ｍｇを得た。
【００５９】
実施例９
参考例８で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩２．１２ｇをジクロロメタン３．４５ｍｌに溶解した。次に、参考例４で得られた亜鉛不含インスリン凍結乾燥粉末１６０ｍｇをジクロロメタン２ｍｌに添加し、５分間の超音波照射を行い、インスリン懸濁液を調製した。この懸濁液に、先に得られた乳酸−グリコール酸共重合物のジクロロメタン溶液（乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩として１．８４ｇを含有する量）を添加し、ボルテックスミキサーにて混合後、小型ホモジナイザーで混合してインスリンと乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩とを含む有機溶媒溶液を得た。この有機溶媒溶液をあらかじめ１８℃に調製しておいた１．４％酢酸亜鉛二水和物含有０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液２０００ｍｌに注入し、タービン型ホモジナイザーを使用してｏ／ｗ型エマルションとした。このｏ／ｗ型エマルションを室温にて撹拌しつつジクロロメタンを揮散させ、マイクロカプセルを得た。得られたマイクロカプセルを遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し、上清を捨てた。次いで蒸留水１２００ｍｌで２回洗浄した後、マンニトール２５０ｍｇを添加し、凍結乾燥して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル１．５３ｇを得た。
【００６０】
実施例１０
参考例８で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩１．０６ｇをジクロロメタン／アセトニトリルの混合溶液（容積比１０／１）２．３ｍｌに溶解した。次に、参考例４で得られた亜鉛不含インスリン凍結乾燥粉末８０ｍｇをジクロロメタン／アセトニトリルの混合液（容積比１０／１）１ｍｌに添加し、５分間の超音波照射を行い、インスリン懸濁液を調製した。この懸濁液に、先に得られた乳酸−グリコール酸共重合物のジクロロメタン溶液（乳酸−グリコール酸尿重合物の亜鉛塩として０．９２ｇを含有する量）を添加し、ボルテックスミキサーにて混合後、小型ホモジナイザーで混合してインスリンと乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩とを含む有機溶媒液を得た。この有機溶媒液をあらかじめ１８℃に調製しておいた０．７％酢酸亜鉛二水和物含有０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液１０００ｍｌに注入し、タービン型ホモジナイザーを使用してｏ／ｗ型エマルションとした。このｏ／ｗ型エマルションを室温にて撹拌しつつジクロロメタンを揮散させ、マイクロカプセルを得た。得られたマイクロカプセルを遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し、上清を捨てた。次いで蒸留水６００ｍｌで２回洗浄した後、マンニトール１００ｍｇを添加し、凍結乾燥して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル０．７３４ｇを得た。
【００６１】
実験例１
実施例１で得られたインスリン含有マイクロカプセル１４７ｍｇを分散媒〔マンニトール ５％（ｗ／ｖ），カルボキシメチルセルロース ０．５％（ｗ／ｖ），ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０ ０．１％（ｗ／ｖ），酢酸でｐＨ６．８に調整〕１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（インスリン１００Ｕを含有）をエーテル麻酔下にてストレプトゾトシン感作高血糖誘発ラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採血し血清を分取した。得られた血清中のインスリン濃度を２抗体サンドイッチ法を応用した酵素免疫測定法にて定量した。対照として、インスリン溶液および市販のインスリン徐放剤であるノボリンＴＭＵ（ノボノルディスク社製、デンマーク）（それぞれインスリン１００Ｕ相当を含有）を投与した。その結果、〔表１〕に示すようにインスリン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群のインスリン血清中濃度はインスリン溶液およびノボリンＴＭＵに比べ有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６２】
【表１】
【００６３】
実験例２
実施例６で得られた成長ホルモン含有マイクロカプセル２６１ｍｇを分散媒１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（成長ホルモン３ｍｇを含有）をエーテル麻酔下にてラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採決し、血清を分取した。得られた血清中の成長ホルモン濃度をラジオイムノアッセイ（ＡｂビーズＨＧＨ、栄研化学株式会社製）にて定量した。対照として成長ホルモン溶液（成長ホルモン３ｍｇを含有）を投与した。その結果、〔表２〕に示すように成長ホルモン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群の成長ホルモン血清中濃度は成長ホルモン溶液投与群に比べて有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６４】
実験例３
実施例７で得られた成長ホルモン含有マイクロカプセル２１１ｍｇを分散媒１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（成長ホルモン３ｍｇを含有）をエーテル麻酔下にてラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採血し、血清を分取した。得られた血清中の成長ホルモン濃度をラジオイムノアッセイ（ＡｂビーズＨＧＨ、栄研化学株式会社製）にて定量した。その結果、〔表２〕に示すように成長ホルモン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群の成長ホルモン血清濃度は成長ホルモン溶液投与群に比べて投与後初期の漏出を著しく抑制し、かつ有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６５】
【表２】
【００６６】
実験例４
実施例９で得られたインスリン含有マイクロカプセル２３６．６ｍｇを分散媒１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（インスリン１００Ｕを含む）をエーテル麻酔下にてラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採血し、血清を分取した。得られた血清中のインスリン濃度をエンザイム−イムノアッセイにて定量した。その結果、〔表３〕に示すようにインスリン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群のインスリン血清中濃度はインスリン溶液投与群に比べ、投与後初期の漏出を著しく抑制し、かつ有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６７】
実験例５
実施例１０で得られたインスリン含有マイクロカプセル２１６．４ｍｇを分散媒１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（インスリン１００Ｕを含有）をエーテル麻酔下にてラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採血し、血清を分取した。得られた血清中のインスリン濃度をエンザイム−イムノアッセイにて定量した。その結果、〔表３〕に示すようにインスリン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群に比べ、投与後初期の漏出を著しく抑制し、かつ有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６８】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとを含んでなる徐放性製剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性ポリペプチドまたはその誘導体は、生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、このうちいくつかについては遺伝子工学、細胞工学の手法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞あるいはハムスターなどの生体を用いて大量に生産され、医薬品としての応用が図られている。しかしながら、これらの生理活性ポリペプチドは一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり、注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。この問題を解決するために生理活性ポリペプチドを含有する徐放製剤を開発する種々の試みがなされている。
特許文献１および特許文献２には、水溶性生理活性ポリペプチド、生体内分解性高分子重合物及び脂肪酸塩を有機溶媒に溶解し、ｏ／ｗ型エマルションとすることにより水溶性生理活性ペプチドの取り込み率を高めた徐放性製剤の製造法が開示されている。
【特許文献１】特開平４−４６１１６号公報
【特許文献２】特開平６−６５０６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前記のように生理活性ポリペプチドの生理活性を保持しながら徐放性製剤を製造する種々の試みがなされているものの、生体内分解性高分子重合物への生理活性ポリペプチドの取り込み率、投与後初期の漏出抑制、長時間にわたる生理活性ポリペプチドの一定した放出速度などの点で、まだ臨床上満足すべき徐放性製剤は得られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは前記の問題点を解決するため鋭意研究を行ったところ、あらかじめ金属塩とした生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ、成形すると、予想外にも生理活性ポリペプチドの取り込み率が飛躍的に向上し、投与後初期の漏出が抑制され、かつ長期間にわたり一定した放出速度を示すなど徐放性製剤として優れた性質を有するものが得られることを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は
（１）生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ、成形することを特徴とする徐放性製剤の製造法、
（２）金属塩が多価金属塩である前記（１）記載の製造法、
（３）金属塩が亜鉛塩またはカルシウム塩である前記（１）記載の製造法、
（４）有機溶媒液中の有機溶媒がハロゲン化炭化水素およびアセトニトリルあるいはアルコール類との混合溶液である前記（１）記載の製造法、
（５）ハロゲン化炭化水素とアセトニトリルあるいはアルコール類との体積比が約４０：１〜約１：１である前記（４）記載の製造法、
（６）生理活性ポリペプチドがホルモンである前記（１）記載の製造法、
（７）ホルモンがインスリンである前記（６）記載の製造法、
（８）ホルモンが成長ホルモンである前記（６）記載の製造法、
（９）生理活性ポリペプチドがサイトカインである前記（１）記載の製造法、
（１０）サイトカインがインターフェロンである前記（９）記載の製造法、
（１１）生体内分解性高分子重合物が脂肪族ポリエステルである前記（１）記載の製造法、
（１２）脂肪族ポリエステルがα−ヒドロキシカルボン酸重合物である前記（１１）記載の製造法、
（１３）脂肪族ポリエステルが乳酸−グリコール酸共重合物である前記（１１）記載の製造法、
（１４）乳酸−グリコール酸共重合物の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が約１００／０〜約４０／６０で、重量平均分子量が約３０００〜約２００００である前記（１３）記載の製造法、
（１５）徐放性製剤が微粒子である前記（１）記載の製造法、
（１６）微粒子の平均粒子径が約０．１〜約３００μｍである前記（１５）記載の製造法、
（１７）徐放性製剤が注射剤である前記（１）記載の製造法、
（１８）生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させた分散液、
（１９）脂肪酸の金属塩を実質上含まない前記（１８）記載の分散液、
（２０）前記（１）記載の製造法により製造される徐放性製剤、
（２１）生体内分解性高分子重合物の金属塩の金属含量が約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）である前記（２０）記載の徐放性製剤、
（２２）生理活性ポリペプチドの含量が約０．００１〜約３０％（ｗ／ｗ）である前記（２０）記載の徐放性製剤、及び
（２３）生体内分解性高分子重合物の亜鉛塩を含む有機溶媒液に成長ホルモンを分散させ、成型することにより得られる前記（２０）記載の徐放性製剤等に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、生理活性ポリペプチドの取り込み率を高め、投与後初期の漏出を抑制し、かつ長期間にわたり一定した放出速度を示す徐放性製剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明において生体内分解性高分子重合物としては、水に難溶または不溶である重合物、例えば脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、バリン酸、ロイシン酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された重合物、共重合物あるいはこれらの混合物〕、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル（例、ポリ−α−シアノアクリル酸メチルエステル、ポリ−α−シアノアクリル酸エチルエステル、ポリ−α−シアノアクリル酸ブチルエステル等）、ポリアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）あるいはこれらの混合物が用いられる。これら生体内分解性高分子重合物の重合の形式はランダム、ブロック、グラフトの何れでもよい。生体内分解性高分子重合物は、好ましくは脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された重合物、共重合物、あるいはこれらの混合物〕である。
【０００７】
前記した脂肪族ポリエステル中、α−ヒドロキシカルボン酸類の１種以上から合成された重合物、共重合物が確実な生体内分解性および生体適合性の観点から好ましい。脂肪族ポリエステルは、特に好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類の２種以上から製造される共重合物である。また、これらの共重合物は混合して使用されてもよい。
前記α−ヒドロキシカルボン酸類は、該α−ヒドロキシカルボン酸類がキラル化合物である場合、Ｄ−体、Ｌ−体およびＤ，Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜約２５／７５の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜約３０／７０の範囲のα−ヒドロキシカルボン酸である。
前記α−ヒドロキシカルボン酸類の重合物の例としては、例えば乳酸の重合物等（以下、ポリ乳酸と称することもある）が用いられる。
前記α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合物の例としては、例えばグリコール酸と他のα−ヒドロキシカルボン酸類との共重合物が挙げられ、該α−ヒドロキシカルボン酸としては乳酸、２−ヒドロキシ酪酸が好ましい。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合物は、好ましくは乳酸−グリコール酸共重合物または２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物である。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合物は、特に好ましくは乳酸−グリコール酸共重合物である。
【０００８】
前記ポリ乳酸としては、Ｄ−体、Ｌ−体およびこれらの混合物の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜約２０／８０の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜約２５／７５の範囲のポリ乳酸である。特に好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約５５／４５〜約２５／７５の範囲のポリ乳酸である。
該ポリ乳酸は、重量平均分子量が約１，５００〜約１０，０００のものが好ましく、さらに好ましくは、重量平均分子量が約２，０００〜約８，０００である。特に好ましくは、重量平均分子量が約３，０００〜約６，０００の範囲のポリ乳酸である。また、ポリ乳酸の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、好ましくは約１．２〜約４．０であり、特に好ましくは、約１．５〜約３．５である。
ポリ乳酸は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法）に従って製造できる。該ポリ乳酸は無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。
【０００９】
該乳酸−グリコール酸共重合物において、その組成比（乳酸／グリコール酸、モル％）は、約１００／０〜約４０／６０が好ましい、さらに好ましくは約９０／１０〜約４５／５５である。該組成比は、特に好ましくは約６０／４０〜約４０／６０である。前記グリコール酸と乳酸の共重合物の重量平均分子量は、約３，０００〜約２０，０００が好ましく、さらに好ましくは約４，０００〜約１５，０００である。また、乳酸−グリコール酸共重合物の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、約１．２〜約４．０が好ましい。さらに好ましくは、約１．５〜約３．５である。
乳酸−グリコール酸共重合物は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法）に従って製造できる。該共重合物は無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。
【００１０】
本発明において、組成比および重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸共重合物を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、例えば組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約６，０００の乳酸−グリコール酸共重合物と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約４，０００の乳酸−グリコール酸共重合物との混合物などが用いられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５〜約７５／２５である。
【００１１】
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物において、その組成比はグリコール酸が約１０〜約７５モル％、残りが２−ヒドロキシ酪酸である場合が好ましく、さらに好ましくはグリコール酸が約２０〜約７５モル％である場合、特に好ましくはグリコール酸が約３０〜約７０モル％である場合である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物の重量平均分子量は、好ましくは約２，０００〜約３０，０００であり、さらに好ましくは約３，０００〜約２０，０００である。重量平均分子量は、特に好ましくは約４，０００〜約１５，０００である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、好ましくは約１．２〜約４．０であり、特に好ましくは約１．５〜約３．５である。
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法）に従って製造される。該共重合物は、無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。
【００１２】
前記グリコール酸共重合物（例、乳酸−グリコール酸共重合物、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合物等）は、さらにポリ乳酸と混合して使用してもよい。グリコール酸共重合物とポリ乳酸を混合して使用する場合、その混合比（グリコール酸共重合物／ポリ乳酸、重量％）は、例えば約１０／９０〜約９０／１０である。該混合比は、好ましくは約２０／８０〜約８０／２０である場合、さらに好ましくは約３０／７０〜約７０／３０である場合である。
【００１３】
本明細書中、重量平均分子量及び数平均分子量とは、重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の重量平均分子量および数平均分子量を意味する。測定は、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ ２（昭和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いることにより行った。
【００１４】
本発明において、無触媒脱水重縮合で製造される生体内分解性高分子重合物は、末端に遊離のカルボキシル基を有する。
末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性高分子重合物とは、末端基定量法による数平均分子量と、分子量既知の標準ポリスチレンを用いたＧＰＣ測定法による数平均分子量とがほぼ一致する重合物である。
【００１５】
末端基定量法による数平均分子量は、以下のようにして算出される。
約１ｇ〜３ｇの生体内分解性高分子重合物をアセトン（２５ｍｌ）とメタノール（５ｍｌ）との混合溶媒に溶解し、室温（約０〜約３０℃）で撹拌下、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０．０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で速やかに滴定し、次式により末端基定量による数平均分子量を算出した。
末端基定量法による数平均分子量＝２００００ Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性高分子重合物の質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０．０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液（ｍｌ）
例えば１種類以上のα−ヒドロキシ酸類から無触媒脱水重縮合法で製造され、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性重合物では、ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、α−ヒドロキシ酸の環状二量体から触媒を用いて開環重合法で製造され、末端に遊離カルボキシル基を本質的には有しない生体内分解性重合物では、末端基定量法による数平均分子量がＧＰＣ測定法による数平均分子量を大きく上回る。この相違によって、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性重合物は、末端に遊離カルボキシル基を有しない生体内分解性重合物と明確に区別することができる。
【００１６】
末端基定量法による数平均分子量が絶対値であるのに対し、ＧＰＣ測定法による数平均分子量は各種分析、解析条件（例えば移動相の種類，カラムの種類，基準物質，スライス幅の選択，ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、例えばＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とがほぼ一致するとは、末端基定量法による数平均分子量がＧＰＣ測定法による数平均分子量の約０．５倍〜約２倍の範囲内であることをいう。好ましくは、約０．８倍〜約１．５倍の範囲内であることをいう。また、末端基定量法による数平均分子量がＧＰＣ測定法による数平均分子量を大きく上回るとは、末端基定量法による数平均分子量がＧＰＣ測定法による数平均分子量の約２倍を越える場合をいう。
本発明においては、ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とがほぼ一致する重合物が好ましい。
【００１７】
生体内分解性高分子重合物を金属塩にするために用いられる金属塩は、生体に悪影響をおよぼさない金属塩であれば特に限定されない。金属塩としては、例えばアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム等）などの単価金属、あるいはアルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム等）、亜鉛（ＩＩ価）、鉄（ＩＩ価、ＩＩＩ価）、銅（ＩＩ価）、スズ（ＩＩ価、ＩＶ価）、アルミニウム（ＩＩ価、ＩＩＩ価）等の多価金属と無機酸あるいは有機酸などとの塩が用いられる。
金属は、好ましくは多価金属である、さらに好ましくはアルカリ土類金属、亜鉛である。金属の特に好ましい具体例としては、例えばカルシウム、亜鉛等が挙げられる。
【００１８】
無機酸としては、例えばハロゲン化水素（例、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸等）、硫酸、硝酸、チオシアン酸等が用いられる。
有機酸としては、例えば脂肪族カルボン酸、芳香族酸等が用いられる。脂肪族カルボン酸は、好ましくは炭素数１ないし９の脂肪族カルボン酸、例えば脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂肪族トリカルボン酸などが用いられる。脂肪族カルボン酸は、飽和あるいは不飽和のいずれであってもよい。
脂肪族モノカルボン酸としては、例えば炭素数１ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸（例、炭酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族モノカルボン酸（例、アクリル酸、プロピオール酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）などが用いられる。
脂肪族ジカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等）などが用いられる。
脂肪族トリカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン酸（例、トリカルバリル酸、１，２，３−ブタントリカルボン酸等）などが用いられる。
【００１９】
前記した脂肪族カルボン酸は、水酸基を１ないし２個有していてもよく、このような例としては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙げられる。
脂肪族カルボン酸は、好ましくは脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸は、さらに好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族モノカルボン酸、特に好ましくは炭素数２ないし３の飽和脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸の特に好ましい具体例としては、例えば酢酸等が挙げられる。
芳香族酸としては、例えば安息香酸、サリチル酸、フェノールスルホン酸などが用いられる。
また、生体内分解性高分子重合物を金属塩にするためには、金属化合物として多価金属（前記と同様）のアセチルアセトナート、金属酸化物を用いてもよい。好ましくは、亜鉛アセチルアセトナート、酸化亜鉛である。
【００２０】
生体内分解性高分子重合物を金属塩にするために用いられる金属塩は、多価金属と無機酸または有機酸との塩（以下、多価金属塩と略称する）が好ましい。
多価金属塩の具体例を挙げれば、例えば亜鉛と無機酸との塩〔例、ハロゲン化亜鉛（塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛等）、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛等〕、亜鉛と有機酸との塩〔例、脂肪族カルボン酸亜鉛塩（例、炭酸亜鉛、酢酸亜鉛、グリコール酸亜鉛、乳酸亜鉛、酒石酸亜鉛等）、芳香族亜鉛塩（例、安息香酸亜鉛、サリチル酸亜鉛、フェノールスルホン酸亜鉛等）等〕などが用いられる。カルシウムと無機酸との塩〔例、ハロゲン化カルシウム（塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、フッ化カルシウム等）、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、チオシアン酸カルシウム等〕、カルシウムと有機酸との塩〔例、脂肪族カルボン酸カルシウム塩（例、炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、酒石酸カルシウム、乳酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等）、芳香族カルシウム塩（例、安息香酸カルシウム、サリチル酸カルシウム等）等〕などが用いられる。
多価金属塩は、好ましくは酢酸亜鉛、酢酸カルシウム等が用いられる。
【００２１】
本発明において生理活性ポリペプチドとしては、好ましくは分子量約１，０００〜約５０，０００、さらに好ましくは分子量約５，０００〜約４０，０００の生理活性ポリペプチドが用いられる。
生理活性ポリペプチドの活性として代表的なものとしては、ホルモン作用が挙げられる。また該生理活性ポリペプチドは天然物、合成物、半合成物のいずれでもよく、さらにそれらの誘導体でもよい。該生理活性ポリペプチドの作用機作は、作動性あるいは拮抗性のいずれでもよい。
本発明の生理活性ポリペプチドとしては、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、遊血因子、各種増殖因子、酵素などが用いられる。
【００２２】
ホルモンとしては、例えばインスリン、成長ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリンなどが用いられる。ホルモンは、好ましくはインスリン及び成長ホルモンなどである。
サイトカインとしては、例えばリンホカイン、モノカインなどが用いられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ、ベータ、ガンマ）、インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが用いられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子などが用いられる。サイトカインは、好ましくはリンホカインなどであり、更に好ましくはインターフェロンなどである。サイトカインは、特に好ましくはインターフェロンアルファなどである。
【００２３】
造血因子としては、例えばエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、血小板増殖刺激因子、メガカリオサイトポテンシエーターなどが用いられる。
各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例、ＦＧＦ−９など）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー、インスリン様成長因子（例、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２など）、骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリーなどが用いられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）、カリクレインなどが用いられる。
【００２４】
本発明において、生理活性ポリペプチドが金属を含有する場合、その金属含有量は０．１％以下が好ましく、さらに好ましくは０．０１％以下、特に好ましくは０．００１％以下であって実質的に金属を含まない生理活性ポリペプチドが最適である。たとえば結晶性インスリンは通常亜鉛、ニッケル、コバルト、カドミウムなどの少量の重金属を含んでいる。０．４％（ｗ／ｗ）亜鉛を含んでいるインスリンは６量体で存在し、それ自身で安定に存在し、生体内分解性高分子重合物の金属塩との相互作用が弱められると考えられる。
必要な場合には、生理活性ポリペプチドに含有されている金属を前もって除去しておいてもよく、金属を除去する方法としては公知の方法が用いられる。例えばインスリンの塩酸酸性水溶液を、水あるいは酢酸アンモニウム塩溶液に対して透析したのち凍結乾燥することによりアモルファス状態で金属が最小限のインスリンが得られる。
本発明においては、生体内分解性高分子重合体の金属塩以外の添加物は金属塩を形成していないことが望ましく、特に脂肪酸の金属塩を実質上含まないことがより好ましい。
【００２５】
本発明においては、生体内分解性高分子重合体の金属塩は、例えば生体内分解性高分子重合物の有機溶媒溶液に金属塩の水溶液あるいは固体の金属塩を乳化、分散することによりｗ／ｏあるいはｏ／ｗ型乳化物（エマルション）、または金属塩を含有する生体内分解性高分子重合物の有機溶媒溶液あるいは懸濁液を調製し、それらを水洗、乾燥することによって、あるいはそれらを水中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法あるいはこれらに準ずる方法に付し、次いで洗浄、乾燥することにより製造される。この製造過程において生体内分解性高分子重合物と塩を形成しない金属塩を除去しておくのがよい。
前記有機溶媒液中の有機溶媒は、沸点が１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（例、エタノール、メタノール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等）、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、アセトニトリル等が好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン等）およびアセトニトリルあるいはアルコール類（例、メタノール、エタノール等）の組み合わせが好ましい。特に、ジクロロメタンとアセトニトリルとの組み合わせが汎用される。ハロゲン化炭化水素とアセトニトリルあるいはアルコール類との混合比（体積比）は約４０：１〜約１：１であり、好ましくは約２０：１〜約１：１である。
生体内分解性高分子重合物の金属塩中の金属含量は、好ましくは約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０．０５〜約７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）である。なお、生体内分解性高分子重合物の金属塩中の金属含量は、例えば原子吸光法等の方法により定量される。
以下に、生体内分解性高分子重合物の金属塩の製造法、例えば水中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法などについて記述する。
【００２６】
（Ａ）水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）
本法においては、まず生体内分解性高分子重合物を有機溶媒に溶かして有機溶媒液（以下、油相と称することもある）を製造する。この際、有機溶媒液中の生体内分解性高分子重合物の濃度は、生体内分解性高分子重合物の分子量、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば約０．０１〜約９０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０．１〜約８０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約１〜約７０％（ｗ／ｗ）である。内水相として、金属塩を水に溶かした水溶液を使用する。金属塩の濃度は、各金属塩の水に対する溶解度によって異なるが、例えば約１０〜約９０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約２０〜約８０％（ｗ／ｖ）である。 前記した金属塩の水溶液を、生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に乳化、分散し、ｗ／ｏ型エマルションを製造する。金属塩の水溶液と生体内分解性高分子重合物有機溶媒液との比率（容量比）は、約１：１，０００〜約１：１、好ましくは約１：１００〜約１：２、特に好ましくは約１：５０〜約１：３である。乳化方法は公知の乳化操作により行われる。乳化操作は、例えばタービン型撹拌機、ホモジナイザー等を用いて行われる。ついで、このようにして調製されたｗ／ｏ型エマルションをさらに水相（外水相）中に加えて、ｗ／ｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、油相溶媒を蒸発させ生体内分解性高分子重合物の金属塩を製造する。この際の外水相体積は、例えば油相体積の約１〜約１０，０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２〜約５，０００倍、特に好ましくは、約５〜約２，０００倍から選ばれる。溶媒を除去する方法は、公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、例えばプロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラーなどで撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧して溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーターなどを用いて真空度を調節しながら溶媒を蒸発させる方法などが用いられる。
【００２７】
前記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なｗ／ｏ／ｗ型エマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが用いられる。該乳化剤は、好ましくはポリビニルアルコールが用いられる。該乳化剤は、１種類または２種以上を組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は、外水相に対し約０．００１〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０．０５％〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。
【００２８】
また、外水相中に内水相で用いた金属塩と同一または異なった金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の金属塩の濃度が約０．０１〜約２０％（ｗ／ｗ）、特に約０．１〜約１０％（ｗ／ｗ）となるように脂肪酸金属塩を添加することが好ましい。外水相中の金属塩の濃度を変えることにより、内水相で用いた金属塩が、生体内分解性高分子重合物から外水相へ溶出するのを防ぐこともできる。このようにして得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩を遠心分離あるいは濾過して分取した後、生体内分解性高分子重合物の金属塩の表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。
【００２９】
（Ｂ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）
本法においては、まず前記（Ａ）と同様にして生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液を製造する。ついで、生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液中に金属塩を添加、分散または溶解させる。この際、金属塩の添加量は、金属塩：生体内分解性高分子重合物の重量比が約５：１〜約１：１００、好ましくは約２：１〜約１：５０、さらに好ましくは約１：１〜約１：１０となるようにする。
このようにして調製された有機溶媒液をさらに水相中に加えて、タービン型撹拌機などを用いてｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、前記（Ａ）と同様にして油相溶媒を蒸発させ、生体内分解性高分子重合物の金属塩を製造する。この際の水相体積は、例えば油相体積の約１倍〜約１０，０００倍、さらに好ましくは、約２倍〜約５，０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５倍〜約２，０００倍から選ばれる。前記水相中に、前記（Ａ）と同様に乳化剤を加えてもよい。水相中に、前記（Ａ）と同様に油相中に添加、分散または溶解した金属塩と同一または異なった金属塩を加えてもよい。このようにして得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩は、前記（Ａ）と同様にして分取、洗浄、凍結乾燥する。
【００３０】
（Ｃ）相分離法（コアセルベーション法）
本法により生体内分解性高分子重合物の金属塩を製造する場合には、前記（Ａ）に記載したｗ／ｏ型エマルションあるいは（Ｂ）に記載した金属塩を含む生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加え、生体内分解性高分子重合物の金属塩を析出、固化させる。該コアセルベーション剤は、ｗ／ｏ型エマルションあるいは生体内分解性高分子重合物の有機溶媒溶液の体積の約０．０１倍〜約１，０００倍の体積量が加えられる。さらに好ましくは、約０．０５倍〜約５００倍の体積量である。特に好ましくは、約０．１倍〜約２００倍の体積量である。コアセルベーション剤としては、生体内分解性高分子重合物を溶かす有機溶媒と混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で、高分子重合物を溶解しないものであればよい。具体的には、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンなどが用いられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩を濾過して分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄し、コアセルベーション剤を除去する。さらに、前記（Ａ）と同様にして洗浄を行い、ついで凍結乾燥する。
【００３１】
水中乾燥法およびコアセルベーション法での生体内分解性高分子重合物の金属塩の製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこれのアルカリ金属塩などの水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが適量用いられる。
【００３２】
（Ｄ）噴霧乾燥法
本法によって生体内分解性高分子重合物の金属塩を製造する場合には、金属塩の水溶液と生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液とのｗ／ｏ型エマルションあるいは金属塩を含有する生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液あるいは懸濁液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、微粒状の生体内分解性高分子重合物の金属塩を調製する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。この際、所望によってｗ／ｏ型エマルションあるいは金属塩を含有する生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液あるいは懸濁液と同時に、生体内分解性高分子重合物の金属塩の凝集防止を目的として前記凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。このようにして得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩は、前記（Ａ）と同様にして洗浄し、必要であれば加温・減圧下、水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
【００３３】
本発明の徐放性製剤は、生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ、成形することによって製造される。本発明の製造法としては、例えば前記（Ａ）水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）、（Ｂ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）、（Ｃ）相分離法（コアセルベーション法）および（Ｄ）噴霧乾燥法に準じた方法などが用いられる。前記有機溶媒液中の有機溶媒は、沸点が１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（例、エタノール、メタノール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等）、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、アセトニトリル等が好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン等）およびアセトニトリルあるいはアルコール類（例、メタノール、エタノール等）の組み合わせが好ましい。特に、ジクロロメタンとアセトニトリルとの組み合わせが汎用される。ハロゲン化炭化水素とアセトニトリルあるいはアルコール類との混合比（体積比）は約４０：１〜約１：１であり、好ましくは約２０：１〜約１：１である。以下に、徐放性製剤として、例えばマイクロカプセルを製造する場合の製造方法について記述する。
（ａ）水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）
本法によれば、まず前記（Ａ）に準じた方法で生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液を製造する。この際、生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液中の濃度は、生体内分解性高分子重合物の金属塩の種類、分子量、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば約０．０１〜約８０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０．１〜約７０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約１〜約６０％（ｗ／ｗ）である。内水相として生理活性ポリペプチドの水溶液を使用する。生理活性ポリペプチドの水溶液中での濃度は、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５００％（ｗ／ｖ）である。好ましくは約１％（ｗ／ｖ）〜約４００％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）〜約３００％（ｗ／ｖ）である。この際、該水溶液中にｐＨ調節剤（例、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等）、安定化剤（例、血清アルブミン、ゼラチン、硫酸プロタミン等）、保存剤（例、パラオキシ安息香酸類等）等を加えてもよい。このようにして得られた水溶液を生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液中に乳化、分散しｗ／ｏ型エマルションを製造する。
【００３４】
生理活性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液との比率（容量比）は約１：１，０００〜約１：１、好ましくは約１：１００〜約１：５、特に好ましくは約１：５０〜約１：５である。ついで、このようにして調製されたｗ／ｏ型エマルションをさらに外水相中に加えて、ｗ／ｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を蒸発させマイクロカプセルを調製する。該外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なｗ／ｏ／ｗ型エマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが用いられる。該乳化剤は、好ましくはポリビニルアルコールが用いられる。該乳化剤は、１種類または２種以上を組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は、外水相に対し約０．００１〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０．０５％〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。また、外水相中に内水相で用いた金属塩と同一または異なった金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の金属塩の濃度が約０．０１〜約２０％（ｗ／ｗ）、特に約０．１〜約１０％（ｗ／ｗ）となるように脂肪酸金属塩を添加することが好ましい。外水相中の金属塩の濃度を変えることにより、内水相で用いた金属塩が、生体内分解性高分子重合物から外水相へ溶出するのを防ぐこともできる。
【００３５】
このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過して分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。その後、必要であれば、減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。加温条件としては、生体内分解性高分子重合物のガラス転移温度以上で、マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。好ましくは、生体内分解性高分子重合物のガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度の範囲で加熱乾燥する。ここにおいて、ガラス転移温度とは、示差走査熱量計を用い、加温速度毎分１０ないし２０℃で昇温した際に得られる中間点ガラス転移温度をいう。
【００３６】
（ｂ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）
本法においては、まず前記（Ａ）に準じた方法で生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液を製造する。この際、生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液中での濃度は、前記（ａ）と同様な濃度が用いられる。次いで得られた生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを加え、溶解または分散させ生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとの有機溶媒液または懸濁液を製造する。この時、生理活性ポリペプチドが生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に溶解しない、すなわち混濁するような場合、生理活性ポリペプチドはあらかじめ有機溶媒中に分散させておく方が好ましい。該有機溶媒中には、例えば安定化剤（例、血清アルブミン、ゼラチン、硫酸プロタミン等）を加えてもよい。生理活性ポリペプチドを有機溶媒中に均一に分散させるには、外部物理的エネルギーを加える必要がある。その方法とは、例えば超音波照射、タービン型撹拌器、ホモジナイザー等が挙げられる。このときの生理活性ポリペプチドの有機溶媒中での粒子サイズとしては、約０．０１〜約１００μｍ、好ましくは約０．５〜約５０μｍ、さらに好ましくは約０．１〜約１０μｍであることが望まれる。また、このときの生理活性ポリペプチドの有機溶媒中での濃度は約１〜約５０％、好ましくは約２〜約２０％である。このような処理を行うことで、有機溶媒中における生理活性ポリペプチドの粒子サイズをそろえることができ、生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液中に均一に分散させることが可能となる。また、生理活性ポリペプチドは、生体内分解性高分子重合物の金属塩とは独立して有機溶媒に分散させてもよい。この場合、用いる有機溶媒は生体内分解性高分子重合物の金属塩を溶解した有機溶媒と同一の組成でもよいし異なっていてもよい。例えば、生体内分解性高分子重合物の金属塩をジクロロメタンに溶解し、生理活性ポリペプチドをアセトニトリルに分散させ、両者を混合してもよい。この際、生理活性ポリペプチドと生体内分解性高分子重合物の金属塩との比率（重量比）は、例えば約１：１０００〜約１：１、好ましくは約１：２００〜約１：５、特に好ましくは約１：１００〜約１：５である。ついで、このようにして調製された生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとの有機溶媒液をさらに水相中に加えて、ｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を蒸発させマイクロカプセルを製造する。このようにして得られたマイクロカプセルは前記（ａ）と同様にして分取、洗浄し、凍結乾燥する。その後、必要であれば、前記（ａ）と同様にして減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
【００３７】
（ｃ）相分離法
本法によりマイクロカプセルを製造する場合には、前記（ａ）のｗ／ｏ型エマルションあるいは前記（ｂ）の生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとを含む有機溶媒液に前記（Ｃ）と同様な方法でコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加え、マイクロカプセルを析出、固化させる。このようにして得られたマイクロカプセルは前記（Ｃ）と同様にして分取、洗浄し、コアセルベーション剤および遊離生理活性ポリペプチドを除去する。その後、必要であれば、前記（ａ）と同様にして減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。水中乾燥法および相分離法での製造では、粒子同士の凝集を防ぐために前記（Ｃ）と同様に凝集防止剤を加えてもよい。
【００３８】
（ｄ）噴霧乾燥法
本法によってマイクロカプセルを製造する場合には、前記（ａ）のｗ／ｏ型エマルションあるいは前記（ｂ）の生体内分解性高分子重合物の金属塩と生理活性ポリペプチドとを含む有機溶媒液を、前記（Ｄ）と同様にして噴霧しマイクロカプセルを製造する。このようにして得られたマイクロカプセルは、必要であれば、前記（ａ）と同様にして減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
【００３９】
本発明において、生体内分解性高分子重合物の金属塩への生理活性ポリペプチドの取り込み率は約５０％以上であることが望ましい。
本発明の徐放性製剤に含まれる生理活性ポリペプチドの含量は、例えば約０．００１〜約３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、約０．０２〜約２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０．１〜約１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは、約０．５〜約５％（ｗ／ｗ）である。
本発明の徐放性製剤は、例えば前記で得られたマイクロカプセルをそのままで、あるいはこのマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形、例えば非経口剤（例、筋肉内、皮下、臓器などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮などへの経粘膜剤等）、経口剤（例、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）などとして投与することができる。
本発明の徐放性製剤は、特に注射剤であることが好ましい。前記方法で得られたマイクロカプセルを注射剤とするには、マイクロカプセルを分散剤（例、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＨＣＯ−６０等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等の多糖類、硫酸プロタミン、ポリエチレングリコール４００など）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、局所麻酔剤（塩酸キシロカイン、クロロブタノールなど）等と共に水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油あるいはこれにレシチンなどのリン脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例、ミグリオール８１２等）と共に分散して油性懸濁剤として徐放性注射剤とする。
【００４０】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、微粒子であることが特に好ましい。マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば、平均粒子径として約０．１〜約３００μｍの範囲が挙げられる。粒子径は、好ましくは、約１〜約１５０μｍ、さらに好ましくは、約２〜約１００μｍの範囲の粒子径である。
前記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００４１】
徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
徐放性製剤の適応は、使用する生理活性ポリペプチドにより異なる。徐放性製剤は、該生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病など、成長ホルモンである場合には成長ホルモン分泌不全症およびターナー症候群など、インターフェロン−アルファである場合には、ウイルス性肝炎（例、Ｃ型肝炎、ＨＢｅ抗原陽性活動性肝炎など）、癌（例、腎癌、多発性骨髄腫など）など、エリスロポエチンの場合には貧血（例、腎透析時貧血など）など、Ｇ−ＣＳＦの場合には好中球減少症（例、制ガン剤治療時）、感染症など、ＩＬ−２の場合には癌（例、血管内皮腫など）など、ＦＧＦの場合には消化管潰瘍など、ＦＧＦ−９の場合には血小板減少症など、ＮＧＦの場合には老人性痴呆、神経病（ニューロパシー）など、ＴＰＡの場合には血栓症など、腫瘍壊死因子の場合には癌などの治療または予防に有効である。
【００４２】
徐放性製剤の投与量は、生理活性ポリペプチドの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、該生理活性ポリペプチドの有効濃度が体内で保持される量であればよい。該生理活性ポリペプチドの投与量としては、例えば徐放性製剤が１週間型製剤である場合、好ましくは、成人１人当たり約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０．０００５〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回等、該生理活性ポリペプチドの種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病の成人に対する投与量は、有効成分として通常、約０．００１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。また、成長ホルモンである場合には、下垂体性小人症の患者に対する投与量は、有効成分として通常、約０．００４ｍｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０４ｍｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与することが好ましい。あるいは約０．００８ｍｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０８ｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、２週間に１回投与することが好ましい。
徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存することが好ましい。徐放性製剤は、冷所に保存することがさらに好ましい。ここでいう常温あるいは冷所とは、日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５〜２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。
【実施例】
【００４３】
以下に参考例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
参考例１
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量６０００〕４ｇをジクロロメタン４ｍｌに溶解した。この溶液に４３８ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合しｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションをあらかじめ１８℃に調節しておいた０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液８００ｍｌに注入しタービン型ホモミキサーを使用してｗ／ｏ／ｗ型エマルションを得た。この後、ｗ／ｏ／ｗ型エマルションを室温で撹拌しつつジクロロメタンを揮散させて乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し上清を捨てた。次いで蒸留水６００ｍｌにて２回洗浄後、凍結乾燥して粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ１．３６％（ｗ／ｗ）であった。
【００４４】
参考例２
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１００００〕４ｇをジクロロメタン４ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し小型ホモジナイザーで混合しｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションを参考例１と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ１．１％（ｗ／ｗ）であった。
【００４５】
参考例３
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００〕４ｇをジクロロメタン４ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し小型ホモジナイザーで混合しｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションを参考例１と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ０．９９％であった。
【００４６】
参考例４
組み換え型ヒトインスリン（和光純薬製、亜鉛含量０．３５％）１ｇを０．０１Ｎ塩酸溶液２００ｍｌに溶解した。この溶液を分子量分画６０００の半透膜〔スペクトラポア（SpectraporTM）７ ＭＷＣＯ １０００、スペクトラムメディカルインダストリーズ社製、米国〕を用い０．０１Ｎ塩酸溶液１０Ｌ中で３回透析した。さらに、３０Ｌの０．２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液にて１回、３０Ｌの０．０２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液にて１回、３０Ｌの蒸留水にて１回ずつ透析をした後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥インスリン粉末中の亜鉛含量は０．０００１％（ｗ／ｗ）以下であった。
【００４７】
参考例５
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量６０００〕８ｇをジクロロメタン８ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合して、ｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションをあらかじめ１８℃に調節しておいた０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液１８００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサーを使用してｗ／ｏ／ｗ型エマルションを得た。このエマルションを参考例１と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ、１．１５％であった。
【００４８】
参考例６
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量６０００〕８ｇをジクロロメタン８ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合して、ｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションを参考例４と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ、１．２４％であった。
【００４９】
参考例７
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００〕８ｇをジクロロメタン８ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．２ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合して、ｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションを参考例４と同様に処理し、粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ、０．９６％であった。
【００５０】
参考例８
乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量８０００〕８ｇをジクロロメタン８ｍｌに溶解した。この溶液に２９２ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛水溶液１．５ｍｌを添加し、小型ホモジナイザーで混合して、ｗ／ｏ型エマルションを得た。このエマルションをあらかじめ１８℃に調節しておいた０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液１８００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサーを使用してｗ／ｏ／ｗ型エマルションを得た。この後、ｗ／ｏ／ｗ型エマルションを室温にて撹拌しつつ、ジクロロメタンを揮散させて、乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を得た。得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩を遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し、上清を捨てた。ついで蒸留水１２００ｍｌで２回洗浄した。以上の操作をもう１度繰り返して得られたものと、先に調整したものを混合した後、凍結乾燥して粉末状の乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩１１．８ｇを得た。この乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩の亜鉛含量を原子吸光法により測定したところ１．１９％（ｗ／ｗ）であった。
【００５１】
実施例１
参考例１で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９００ｍｇをジクロロメタン１ｍｌに溶解した。この溶液に参考例４で得られたＺｎ不含インスリン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加しボルテックスミキサーにて混合し、小型ホモジナイザーで混合して、インスリンと乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩とを含む有機溶媒溶液を得た。この有機溶媒溶液をあらかじめ１８℃に調節しておいた０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液８００ｍｌに注入しタービン型ホモミキサーを使用してｏ／ｗ型エマルションとした。このｏ／ｗ型エマルションを室温で撹拌しつつジクロロメタンを揮散させ、マイクロカプセルを得た。得られたマイクロカプセルを遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し上清を捨てた。次いで蒸留水６００ｍｌにて２回洗浄後、凍結乾燥して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル５２０ｍｇを得た。
【００５２】
実施例２
参考例２で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９００ｍｇをジクロロメタン１ｍｌに溶解した。この溶液に参考例４で得られたＺｎ不含インスリン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル４５０ｍｇを得た。
【００５３】
実施例３
参考例３で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９００ｍｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した。この溶液に参考例４で得られたＺｎ不含インスリン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル５０３ｍｇを得た。
【００５４】
実施例４
参考例１で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９５０ｍｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した。この溶液中にヒト成長ホルモン（ジェノトロピンＴＭ １６ＩＵ／アンプル、住友製薬株式会社製）の８本（１２８ＩＵ）の粉末を添加し実施例１と同様に処理し、成長ホルモン含有マイクロカプセル５００ｍｇを得た。
【００５５】
実施例５
参考例５で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９５０ｍｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５０ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状の成長ホルモン含有マイクロカプセル５１７ｍｇを得た。
【００５６】
実施例６
参考例３で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩９５０ｍｇをジクロロメタン３ｍｌに溶解した。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５０ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状の成長ホルモン含有マイクロカプセル４１５ｍｇを得た。
【００５７】
実施例７
参考例６で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩４７５ｍｇと乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量６０００〕４７５ｍｇをジクロロメタン−エタノール混合溶媒〔ジクロロメタン／エタノール＝２／１（容積比）〕１．５ｍｌに溶解した。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５０ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状の成長ホルモン含有マイクロカプセル２４９ｍｇを得た。
【００５８】
実施例８
参考例７で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩４７５ｍｇと乳酸−グリコール酸共重合物〔乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００〕４７５ｍｇをジクロロメタン−エタノール混合溶媒〔ジクロロメタン／エタノール＝２／１（容積比）〕３ｍｌに溶解した。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５０ｍｇを添加し、実施例１と同様にして粉末状の成長ホルモン含有マイクロカプセル４４７ｍｇを得た。
【００５９】
実施例９
参考例８で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩２．１２ｇをジクロロメタン３．４５ｍｌに溶解した。次に、参考例４で得られた亜鉛不含インスリン凍結乾燥粉末１６０ｍｇをジクロロメタン２ｍｌに添加し、５分間の超音波照射を行い、インスリン懸濁液を調製した。この懸濁液に、先に得られた乳酸−グリコール酸共重合物のジクロロメタン溶液（乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩として１．８４ｇを含有する量）を添加し、ボルテックスミキサーにて混合後、小型ホモジナイザーで混合してインスリンと乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩とを含む有機溶媒溶液を得た。この有機溶媒溶液をあらかじめ１８℃に調製しておいた１．４％酢酸亜鉛二水和物含有０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液２０００ｍｌに注入し、タービン型ホモジナイザーを使用してｏ／ｗ型エマルションとした。このｏ／ｗ型エマルションを室温にて撹拌しつつジクロロメタンを揮散させ、マイクロカプセルを得た。得られたマイクロカプセルを遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し、上清を捨てた。次いで蒸留水１２００ｍｌで２回洗浄した後、マンニトール２５０ｍｇを添加し、凍結乾燥して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル１．５３ｇを得た。
【００６０】
実施例１０
参考例８で得られた乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩１．０６ｇをジクロロメタン／アセトニトリルの混合溶液（容積比１０／１）２．３ｍｌに溶解した。次に、参考例４で得られた亜鉛不含インスリン凍結乾燥粉末８０ｍｇをジクロロメタン／アセトニトリルの混合液（容積比１０／１）１ｍｌに添加し、５分間の超音波照射を行い、インスリン懸濁液を調製した。この懸濁液に、先に得られた乳酸−グリコール酸共重合物のジクロロメタン溶液（乳酸−グリコール酸尿重合物の亜鉛塩として０．９２ｇを含有する量）を添加し、ボルテックスミキサーにて混合後、小型ホモジナイザーで混合してインスリンと乳酸−グリコール酸共重合物の亜鉛塩とを含む有機溶媒液を得た。この有機溶媒液をあらかじめ１８℃に調製しておいた０．７％酢酸亜鉛二水和物含有０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液１０００ｍｌに注入し、タービン型ホモジナイザーを使用してｏ／ｗ型エマルションとした。このｏ／ｗ型エマルションを室温にて撹拌しつつジクロロメタンを揮散させ、マイクロカプセルを得た。得られたマイクロカプセルを遠心分離操作（約１０００ｒｐｍ）により分取し、上清を捨てた。次いで蒸留水６００ｍｌで２回洗浄した後、マンニトール１００ｍｇを添加し、凍結乾燥して粉末状のインスリン含有マイクロカプセル０．７３４ｇを得た。
【００６１】
実験例１
実施例１で得られたインスリン含有マイクロカプセル１４７ｍｇを分散媒〔マンニトール ５％（ｗ／ｖ），カルボキシメチルセルロース ０．５％（ｗ／ｖ），ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０ ０．１％（ｗ／ｖ），酢酸でｐＨ６．８に調整〕１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（インスリン１００Ｕを含有）をエーテル麻酔下にてストレプトゾトシン感作高血糖誘発ラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採血し血清を分取した。得られた血清中のインスリン濃度を２抗体サンドイッチ法を応用した酵素免疫測定法にて定量した。対照として、インスリン溶液および市販のインスリン徐放剤であるノボリンＴＭＵ（ノボノルディスク社製、デンマーク）（それぞれインスリン１００Ｕ相当を含有）を投与した。その結果、〔表１〕に示すようにインスリン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群のインスリン血清中濃度はインスリン溶液およびノボリンＴＭＵに比べ有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６２】
【表１】
【００６３】
実験例２
実施例６で得られた成長ホルモン含有マイクロカプセル２６１ｍｇを分散媒１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（成長ホルモン３ｍｇを含有）をエーテル麻酔下にてラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採決し、血清を分取した。得られた血清中の成長ホルモン濃度をラジオイムノアッセイ（ＡｂビーズＨＧＨ、栄研化学株式会社製）にて定量した。対照として成長ホルモン溶液（成長ホルモン３ｍｇを含有）を投与した。その結果、〔表２〕に示すように成長ホルモン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群の成長ホルモン血清中濃度は成長ホルモン溶液投与群に比べて有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６４】
実験例３
実施例７で得られた成長ホルモン含有マイクロカプセル２１１ｍｇを分散媒１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（成長ホルモン３ｍｇを含有）をエーテル麻酔下にてラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採血し、血清を分取した。得られた血清中の成長ホルモン濃度をラジオイムノアッセイ（ＡｂビーズＨＧＨ、栄研化学株式会社製）にて定量した。その結果、〔表２〕に示すように成長ホルモン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群の成長ホルモン血清濃度は成長ホルモン溶液投与群に比べて投与後初期の漏出を著しく抑制し、かつ有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６５】
【表２】
【００６６】
実験例４
実施例９で得られたインスリン含有マイクロカプセル２３６．６ｍｇを分散媒１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（インスリン１００Ｕを含む）をエーテル麻酔下にてラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採血し、血清を分取した。得られた血清中のインスリン濃度をエンザイム−イムノアッセイにて定量した。その結果、〔表３〕に示すようにインスリン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群のインスリン血清中濃度はインスリン溶液投与群に比べ、投与後初期の漏出を著しく抑制し、かつ有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６７】
実験例５
実施例１０で得られたインスリン含有マイクロカプセル２１６．４ｍｇを分散媒１．７５ｍｌに分散した。得られた分散液０．５ｍｌ（インスリン１００Ｕを含有）をエーテル麻酔下にてラットの背部皮下に投与した。尾静脈より経時的に採血し、血清を分取した。得られた血清中のインスリン濃度をエンザイム−イムノアッセイにて定量した。その結果、〔表３〕に示すようにインスリン・亜鉛含有マイクロカプセル投与群に比べ、投与後初期の漏出を著しく抑制し、かつ有意に持続し、本発明の製造法により製造された徐放性製剤の優れた徐放性持続効果が確認された。
【００６８】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ、成形することを特徴とする徐放性製剤の製造法。
【請求項２】
金属塩が多価金属塩である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
金属塩が亜鉛塩またはカルシウム塩である請求項１記載の製造法。
【請求項４】
有機溶媒液中の有機溶媒がハロゲン化炭化水素およびアセトニトリルあるいはアルコール類との混合溶液である請求項１記載の製造法。
【請求項５】
ハロゲン化炭化水素とアセトニトリルあるいはアルコール類との体積比が約４０：１〜約１：１である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
生理活性ポリペプチドがホルモンである請求項１記載の製造法。
【請求項７】
ホルモンがインスリンである請求項６記載の製造法。
【請求項８】
ホルモンが成長ホルモンである請求項６記載の製造法。
【請求項９】
生理活性ポリペプチドがサイトカインである請求項１記載の製造法。
【請求項１０】
サイトカインがインターフェロンである請求項９記載の製造法。
【請求項１１】
生体内分解性高分子重合物が脂肪族ポリエステルである請求項１記載の製造法。
【請求項１２】
脂肪族ポリエステルがα−ヒドロキシカルボン酸重合物である請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
脂肪族ポリエステルが乳酸−グリコール酸共重合物である請求項１１記載の製造法。
【請求項１４】
乳酸−グリコール酸共重合物の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が約１００／０〜約４０／６０で、重量平均分子量が約３０００〜約２００００である請求項１３記載の製造法。
【請求項１５】
徐放性製剤が微粒子である請求項１記載の製造法。
【請求項１６】
微粒子の平均粒子径が約０．１〜約３００μｍである請求項１５記載の製造法。
【請求項１７】
徐放性製剤が注射剤である請求項１記載の製造法。
【請求項１８】
生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させた分散液。
【請求項１９】
脂肪酸の金属塩を実質上含まない請求項１８記載の分散液。
【請求項２０】
請求項１記載の製造法により製造される徐放性製剤。
【請求項２１】
生体内分解性高分子重合物の金属塩の金属含量が約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）である請求項２０記載の徐放性製剤。
【請求項２２】
生理活性ポリペプチドの含量が約０．００１〜約３０％（ｗ／ｗ）である請求項２０記載の徐放性製剤。
【請求項２３】
生体内分解性高分子重合物の亜鉛塩を含む有機溶媒液に成長ホルモンを分散させ、成型することにより得られる請求項２０記載の徐放性製剤。
【請求項１】
生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させ、成形することを特徴とする徐放性製剤の製造法。
【請求項２】
金属塩が多価金属塩である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
金属塩が亜鉛塩またはカルシウム塩である請求項１記載の製造法。
【請求項４】
有機溶媒液中の有機溶媒がハロゲン化炭化水素およびアセトニトリルあるいはアルコール類との混合溶液である請求項１記載の製造法。
【請求項５】
ハロゲン化炭化水素とアセトニトリルあるいはアルコール類との体積比が約４０：１〜約１：１である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
生理活性ポリペプチドがホルモンである請求項１記載の製造法。
【請求項７】
ホルモンがインスリンである請求項６記載の製造法。
【請求項８】
ホルモンが成長ホルモンである請求項６記載の製造法。
【請求項９】
生理活性ポリペプチドがサイトカインである請求項１記載の製造法。
【請求項１０】
サイトカインがインターフェロンである請求項９記載の製造法。
【請求項１１】
生体内分解性高分子重合物が脂肪族ポリエステルである請求項１記載の製造法。
【請求項１２】
脂肪族ポリエステルがα−ヒドロキシカルボン酸重合物である請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
脂肪族ポリエステルが乳酸−グリコール酸共重合物である請求項１１記載の製造法。
【請求項１４】
乳酸−グリコール酸共重合物の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が約１００／０〜約４０／６０で、重量平均分子量が約３０００〜約２００００である請求項１３記載の製造法。
【請求項１５】
徐放性製剤が微粒子である請求項１記載の製造法。
【請求項１６】
微粒子の平均粒子径が約０．１〜約３００μｍである請求項１５記載の製造法。
【請求項１７】
徐放性製剤が注射剤である請求項１記載の製造法。
【請求項１８】
生体内分解性高分子重合物の金属塩の有機溶媒液に生理活性ポリペプチドを分散させた分散液。
【請求項１９】
脂肪酸の金属塩を実質上含まない請求項１８記載の分散液。
【請求項２０】
請求項１記載の製造法により製造される徐放性製剤。
【請求項２１】
生体内分解性高分子重合物の金属塩の金属含量が約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）である請求項２０記載の徐放性製剤。
【請求項２２】
生理活性ポリペプチドの含量が約０．００１〜約３０％（ｗ／ｗ）である請求項２０記載の徐放性製剤。
【請求項２３】
生体内分解性高分子重合物の亜鉛塩を含む有機溶媒液に成長ホルモンを分散させ、成型することにより得られる請求項２０記載の徐放性製剤。
【公開番号】特開２００８−２７３９８２（Ｐ２００８−２７３９８２Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４２６８２（Ｐ２００８−１４２６８２）
【出願日】平成２０年５月３０日（２００８．５．３０）
【分割の表示】特願平８−１６７０３２の分割
【原出願日】平成８年６月２７日（１９９６．６．２７）
【出願人】（０００００２９３４）武田薬品工業株式会社 (396)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月３０日（２００８．５．３０）
【分割の表示】特願平８−１６７０３２の分割
【原出願日】平成８年６月２７日（１９９６．６．２７）
【出願人】（０００００２９３４）武田薬品工業株式会社 (396)
【Ｆターム（参考）】
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