微小電極アレイデバイス、その製造方法及びバイオアッセイ法
【課題】細胞群中の細胞について一細胞毎に電位を計測できる微小電極アレイデバイス、その製造方法及び該デバイスを用いたバイオアッセイ法を提供する。
【解決手段】絶縁基板上に微小電極１７と、該微小電極１７の配線と、前記微小電極１７を露出させるように該絶縁基板上を被覆する絶縁膜１５とを備え、前記絶縁膜１５上の所定領域にはさらに非細胞接着層１９が設けられると共に、該非細胞接着層１９が設けられず、前記微小電極１７とその近傍の絶縁膜１５とが露出された絶縁基板上の領域が細胞配置部１０ａとされていることを特徴とする微小電極アレイデバイス１。
【解決手段】絶縁基板上に微小電極１７と、該微小電極１７の配線と、前記微小電極１７を露出させるように該絶縁基板上を被覆する絶縁膜１５とを備え、前記絶縁膜１５上の所定領域にはさらに非細胞接着層１９が設けられると共に、該非細胞接着層１９が設けられず、前記微小電極１７とその近傍の絶縁膜１５とが露出された絶縁基板上の領域が細胞配置部１０ａとされていることを特徴とする微小電極アレイデバイス１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞電位を計測するための微小電極アレイデバイス、その製造方法及び該デバイスを用いたバイオアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノム計画の発展や生体分子の構造解析学の進展に伴い、分子生化学的に生命現象を理解し、産業に応用しようとする動きが活発化している。その一方で、よりｉｎ ｖｉｖｏに近い生体情報を取得するために、細胞を使用したバイオアッセイ法が注目されている。このような細胞を使用した解析により、細胞の機能、細胞間の相互作用、細胞と化学物質との相互作用等に関する情報を取得でき、例えば、生命現象、有用物質の生産、物質の生理活性や毒性等に関する新たな知見が得られる。
【０００３】
細胞の解析方法としては、例えば、細胞表面に存在するタンパク質や糖鎖を蛍光標識抗体で修飾したり、解析対象の物質に特異的に結合する蛍光標識プローブを細胞内に導入することで得られる蛍光像を解析する方法、蛍光試薬等の指示薬を細胞内に導入して、細胞内のカルシウムやｐＨを計測する方法が挙げられる。しかしこれらの方法では、標識物質や指示薬によって、細胞が刺激や損傷を受けて少なからずダメージを受けることがあり、精度良く解析できないことがある。そこで、非侵襲的に細胞を解析する技術として、生命活動に伴い活動電位が変化する神経細胞、心筋細胞、筋肉細胞等の細胞を微小電極上で培養し、その時の活動電位の変化を計測する方法が提案されている（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１参照）。細胞の活動電位の変化は、細胞膜内外におけるイオン濃度の変化により生じるものであり、電極を使用して細胞近傍のイオン濃度の変化をイオン電流として電位測定することで計測でき、これにより細胞活動を検出できる。
【０００４】
一方、上記のような解析方法をはじめとする従来の方法では、複数細胞からなる細胞群を解析対象とし、解析して得られたデータの平均値をあたかも一細胞毎の特性であるかのように扱ってきた。しかし実際には、細胞群の中で細胞周期やサーカディアンリズム（概日リズム）が同調している事はまれであり、細胞毎に異なった周期で遺伝子及びタンパク質を発現している。このため、得られた解析結果には、細胞群を扱うが故の揺らぎの問題が付きまとい、高精度な解析結果が得られない。そこで、このような問題点を解決するために、同調培養等の手法が開発され利用されているが、常時同一ステージの細胞を供給し続けなければならないという問題点があった。そこで、このような問題点を解決するために、複数個の細胞を一つずつ個別に培養すると共に、各細胞のネットワークを形成して細胞群とし、その中の細胞について一細胞毎に情報を取得することで、より精度の高い解析を行おうとする動きが活発化してきている。
上記したように、細胞を恣意的に配置してネットワークを形成するための手法も提案されている。例えば、高さが１０μｍ以上である障壁を有する空間内で細胞を培養することで、細胞の伸長や移動を制御する技術が開示されている（例えば、非特許文献２参照）。また、ラミリン等の細胞接着性物質でパターンを形成すると、神経細胞の突起がそのパターンに沿って伸長することが報告されており（非特許文献３参照）、これらの手段を併用することで、細胞を所定の空間内に配置してネットワークを構築することが可能となる。
【特許文献１】特開平６−０７８８８９号公報
【特許文献２】特開平１１−１８７８６５号公報
【非特許文献１】Ｊｉｍｂｏ Ｙ．，Ｔａｔｅｎｏ Ｔ.，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｈ.Ｐ.Ｃ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ７６，６７０−６７８（１９９９）
【非特許文献２】Ｓｔｏｐａｋ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，９０，３８３−３９８（１９８２）
【非特許文献３】Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ Ｐ．Ｃ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，６６，１８３−１９６（１９７５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような、細胞を微小電極上で培養し、その時の活動電位の変化を計測する手法は、細胞を長期間継続して解析する手法として有用である。しかし、従来提案されている手法では、微小電極アレー基板を使用して、組織断片又は培養細胞を計測対象とし、上記のように複数細胞に関する平均的なデータを取得して解析していたので、高精度に解析できないという問題点があった。例えば、薬剤や電気的刺激に対する応答をより高精度に解析するためには、一細胞毎に情報を解析することが必要である。しかし、一細胞を単独で培養して情報を解析しても、解析結果に細胞間の相互作用による影響が反映されず、細胞群からなる組織としての機能を正確に解析できない。
したがって、細胞を使用して解析を高精度に行うためには、細胞同士が相互作用している細胞群を構築し、該細胞群中の細胞を一細胞毎に解析する手法が必要とされる。そこで、このような解析を可能とする新規なデバイスの開発が強く望まれている。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、細胞群中の細胞について一細胞毎に電位を計測できる微小電極アレイデバイス、その製造方法及び該デバイスを用いたバイオアッセイ法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は細胞電位を計測するための微小電極アレイデバイスであって、
絶縁基板上に微小電極と、該微小電極の配線と、前記微小電極を露出させるように該絶縁基板上を被覆する絶縁膜とを備え、前記絶縁膜上の所定領域にはさらに非細胞接着層が設けられると共に、該非細胞接着層が設けられず、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とが露出された絶縁基板上の領域が細胞配置部とされていることを特徴とする微小電極アレイデバイスである。
請求項２に記載の発明は、前記微小電極及び／又は非細胞接着層が光透過性を有する材質からなることを特徴とする請求項１に記載の微小電極アレイデバイスである。
請求項３に記載の発明は、複数個の前記細胞配置部が、前記非細胞接着層が設けられず前記絶縁膜が露出されてなる細胞連結部により連結されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の微小電極アレイデバイスである。
請求項４に記載の発明は、前記非細胞接着層が、パーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を有する化合物を前記絶縁膜上に結合させて形成されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスである。
請求項５に記載の発明は、前記化合物が、下記一般式（１）又は（２）で表されることを特徴とする請求項４に記載の微小電極アレイデバイスである。
【０００８】
【化１】
【０００９】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；Ｙは式「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−」で表される基又はカルボニル基であり、複数のＹは互いに同一でも異なっていても良く；Ｚは、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良いアルキル基又はアルキルオキシアルキル基に、一つの水素原子が置換されたエチレンオキシ基であり、複数のＺは互いに同一でも異なっていても良く；ｊ及びｋはそれぞれ独立して０又は１であり、複数のｊ又はｋは互いに同一でも異なっていても良く；ｌ及びｍはそれぞれ独立して０以上の整数であり、複数のｌ又はｍは互いに同一でも異なっていても良く；ｌが２以上の整数である場合にはｌ個のＺは互いに同一でも異なっていても良い。）
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
請求項６に記載の発明は、前記一般式（１）又は（２）で表される化合物が、下記一般式（３）又は（４）で表されることを特徴とする請求項５に記載の微小電極アレイデバイスである。
【００１２】
【化３】
【００１３】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；ｍは０以上の整数であり、複数のｍは互いに同一でも異なっていても良い。）
【００１４】
【化４】
【００１５】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
請求項７に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法であって、絶縁基板上に微小電極及び該微小電極の配線を形成する工程と、前記微小電極を露出させるように前記絶縁基板上に絶縁膜をパターニングする工程と、前記絶縁基板上の絶縁膜がパターニングされた面を非細胞接着層で被覆する工程と、前記非細胞接着層上に感光性樹脂をパターニングし、該感光性樹脂をマスクとしてエッチングにより前記非細胞接着層の所定部位を除去し、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを露出させて細胞配置部を形成し、次いで前記感光性樹脂を除去する工程と、を有することを特徴とする微小電極アレイデバイスの製造方法である。
請求項８に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法であって、絶縁基板上に微小電極及び該微小電極の配線を形成する工程と、前記微小電極を露出させるように前記絶縁基板上に絶縁膜をパターニングする工程と、前記絶縁基板上の絶縁膜がパターニングされた面において、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを被覆するように感光性樹脂をパターニングする工程と、前記絶縁基板上の感光性樹脂がパターニングされた面を非細胞接着層で被覆する工程と、前記感光性樹脂上の非細胞接着層を、該非細胞接着層で被覆されている感光性樹脂と共に除去して、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを露出させて細胞配置部を形成する工程と、を有することを特徴とする微小電極アレイデバイスの製造方法である。
請求項９に記載の発明は、前記細胞配置部と共に、さらに、該細胞配置部同士を連結する所定領域において絶縁膜が露出されてなる細胞連結部を形成するように、前記感光性樹脂をパターニングすることを特徴とする請求項７又は８に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法である。
請求項１０に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスを用いたバイオアッセイ法であって、前記微小電極アレイデバイス上の細胞配置部に計測対象の細胞を配置し、微小電極により該細胞の電位を計測する工程を有することを特徴とするバイオアッセイ法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、細胞群中の細胞について一細胞毎に電位を計測できる。これにより、細胞を非侵襲的に高精度に解析でき、例えば、種々の化学物質を使用したバイオアッセイにも適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜微小電極アレイデバイス＞
本発明の微小電極アレイデバイス（以下、デバイスと略記することがある）は、細胞電位を計測するための微小電極アレイデバイスであって、絶縁基板上に微小電極と、該微小電極の配線と、前記微小電極を露出させるように該絶縁基板上を被覆する絶縁膜とを備え、前記絶縁膜上の所定領域にはさらに非細胞接着層が設けられると共に、該非細胞接着層が設けられず、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とが露出された絶縁基板上の領域が細胞配置部とされていることを特徴とする。
本発明において計測対象の細胞は、目的に応じて適宜選択でき特に限定されない。そして、培養によって増殖可能なものも好適である。なかでも動物細胞が好ましく、特に好ましいものとして具体的には、神経芽細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞等が例示できる。また、分化可能な細胞、例えば胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｉＰＳ細胞）を使用しても良い。
【００１８】
（第一の実施形態）
図１は、本発明の第一の実施形態に係るデバイスを例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は斜視図である。
絶縁基板１１上には、電極１２がパターニングされている。電極１２は、デバイス１と計測器（図示略）との電気的な接点となる第一の接続部１２ａと、参照電極１３又は細胞計測用の微小電極と前記第一の接続部１２ａとを電気的に接続する第二の接続部１２ｂとからなる。微小電極は、後記するように微小電極配置部１４中に複数個が配置されている。
そして、前記電極１２の第二の接続部１２ｂを被覆するように、絶縁基板１１上には、絶縁膜１５が設けられ、さらに該絶縁膜１５上において、前記参照電極１３及び微小電極配置部１４を包囲するように、隔壁１６が立設されている。
【００１９】
絶縁基板１１の材質は、公知のものから適宜選択すれば良い。なかでも透明なものが好ましく、具体的には、ガラス、樹脂等が例示でき、ガラスが特に好ましい。
絶縁基板１１の厚さ及び上面の大きさは、目的に応じて適宜選定すれば良い。例えば厚さであれば、通常、０．１〜１０ｍｍであることが好ましく、０．３〜１．５ｍｍであることがより好ましい。このような範囲であれば、絶縁基板１１の加工性やデバイス１の使用性に特に優れたものとなる。
【００２０】
電極１２の材質も、公知のものから適宜選択すれば良い。例えば、電極に通常使用される材質として、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、クロム（Ｃｒ）、白金（Ｐｔ）、白金黒（ＰＴ−Ｃ）が例示できる。ただし本発明においては、光透過性を有する材質が好ましい。ここで「光透過性を有する」とは、「少なくとも可視光に対して透過性を有する」ことを指し、透明ガラスや二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）と同等の透明度であることが好ましい。光透過性を有する材質からなる電極を使用することで、顕微鏡等を使用して計測対象の細胞を光学的に解析する際に、効果的にノイズを低減でき、より高感度に解析できる。特に、顕微鏡観察下でレーザを照射し、通常光ピンセットと呼ばれる技術を適用したり、細胞に光刺激を与えて解析するのに好適である。このような好ましい材質として具体的には、スズドープ酸化インジウム（以下、ＩＴＯと略記する）、銀ドープＩＴＯ、酸化インジウム・酸化亜鉛、酸化インジウム・酸化チタン、アルミニウムドープ酸化亜鉛、ガリウムドープ酸化亜鉛、カドミウムドープ酸化亜鉛、アンチモンドープ酸化スズ、フッ素ドープ酸化スズ、ニオブドープ酸化チタンが例示できる。
また、電極１２の屈折率は、透明ガラスや二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）と同等であることが好ましく、１．４〜１．６であることが好ましい。電極１２がこのような好ましい物性を有することで、細胞をより高感度に光学的に解析できる。
【００２１】
電極１２のうち第一の接続部１２ａは帯状であり、計測器との接続部である。その幅はデバイスの大きさを考慮して設定することが好ましく、通常は、０．１〜２．０ｍｍであることが好ましい。また、第二の接続部１２ｂは屈曲部を有し、微小電極配置部１４へ向けて幅が減じる部位を有する帯状である。その幅は特に限定されないが、通常は、第一の接続部１２ａの幅以下であることが好ましい。
ここでは、第一の接続部１２ａ及び第二の接続部１２ｂとして帯状のものを例示しているが、これに限定されず他の形状でも良い。ただし、細長形状であることが好ましい。
また、電極１２は、後記する微小電極と同様の厚さであることが好ましい。
【００２２】
参照電極１３は、電極１２と同様の材質からなるもので良い。
そして、参照電極１３は、略正方形状であり、後記する微小電極よりも十分大きいことが好ましく、通常は、１．０×１０−８〜１．０×１０−６ｍ２であることが好ましく、１．０×１０−８〜２．５×１０−７ｍ２であることがより好ましい。
ここでは、参照電極１３として略正方形状のものを例示しているが、これに限定されず他の形状でも良い。
また、参照電極１３は、後記する微小電極と同様の厚さであることが好ましい。
ここでは、参照電極を四つ有する例を示しているが、参照電極の数は微小電極の数等に応じて適宜調整すれば良い。
【００２３】
絶縁膜１５の材質は、公知のものから適宜選択すれば良い。好ましいものとしては、各種樹脂類及び酸化ケイ素が例示できる。前記樹脂として好ましいものとしては、フォトレジスト等の感光性樹脂が例示できる。
絶縁膜１５の上面の大きさは、絶縁基板１１の大きさに応じて適宜設定すれば良い。絶縁膜１５の厚さは、電気的に確実に絶縁できるだけでなく、細胞配置部に配置された細胞にストレスを与えない厚さ、具体的には、細胞の高さに対して同等以下の厚さであることが好ましい。このような観点から、絶縁膜１５の厚さは、０．１〜３０μｍであることが好ましく、０．５〜５μｍであることがより好ましい。
【００２４】
隔壁１６は、後記するように、デバイス１の参照電極１３及び微小電極配置部１４を含む所定領域上に細胞培養液を保持するためのものである。保持した細胞培養液を供給することで、計測対象の細胞を生存させることができる。細胞培養液は、計測対象の細胞の種類に応じて適宜選択すれば良い。
隔壁１６は、平面視にて中空部が略正方形の角筒状である。
また、隔壁１６の材質は、保持した細胞培養液に対して安定なものが好ましく、電極１２の場合と同様の理由により、光透過性を有する材質が好ましい。特に好ましいものとしてガラスが例示できる。
隔壁１６で包囲される包囲面の大きさは、参照電極１３及び微小電極配置部１４の配置形態によって、適宜調整することが好ましい。隔壁１６の高さは、保持する細胞培養液の液量に応じて適宜調整すれば良く、特に限定されない。
隔壁１６は、ここに例示するように、絶縁基板１１と同心状に配置されていることが好ましい。
隔壁１６は、ここでは角筒状のものを例示しているが、これに限定されず、丸筒状等他の形状でも良く、適宜選択できる。
【００２５】
微小電極配置部１４は、計測対象の細胞を配置する細胞配置部及び配置した細胞の電位を計測する微小電極を備える。微小電極配置部１４は、デバイス１の電極１２が設けられている面上に配置されており、ここに例示するように、絶縁基板１１と同心状に配置されていることが好ましい。
【００２６】
図２は、微小電極配置部１４を拡大して例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）の一部をさらに拡大して例示する平面図である。
微小電極配置部１４においては、略正方形状である複数個の微小電極１７が配置されている。そして、これら複数個の微小電極１７が露出するように、絶縁基板１１上には絶縁膜１５が被覆されている。さらに絶縁膜１５上には、露出された前記微小電極１７と、該微小電極１７近傍でこれを包囲する所定領域とからなる略円形状領域、及びこれら略円形状領域を連結する帯状領域からなる非積層領域１０を除いて、非細胞接着層１９が設けられている。前記略円形状領域は、計測対象の細胞を配置する細胞配置部１０ａであり、微小電極１７及び絶縁膜１５が露出されている。また、隣接する細胞配置部１０ａ同士を連結する帯状領域は、配置された細胞同士を連結させる細胞連結部１０ｂであり、絶縁膜１５が露出されている。
【００２７】
非細胞接着層１９は、非細胞接着性を有する物質（以下、非接着性物質と略記する）を含み、その露出面（以下、非接着面と略記する）において、培養時及び非培養時のいずれにおいても細胞の接着を阻害するものである。そして、非細胞接着層１９は、非接着性物質の前駆体を前記絶縁膜上に結合させることで形成できる。すなわち、非接着性物質の前駆体とは、絶縁膜への結合能を有する官能基を含む物質である。
非細胞接着層１９として、具体的には、撥液性を有するものが例示できる。ここで言う「撥液」とは、「撥水」又は「撥油」を指す。
【００２８】
前記非接着面は、水の接触角が１００°以上である撥水性を有することが好ましく、ヘキサデカンの接触角が３０°以上である撥油性を有することが好ましい。撥水性及び撥油性の大きさは、非接着性物質の前駆体の種類により調整できる。
このように、非接着面が撥液性を有することにより、非接着面においては生体物質の吸着が抑制されるので、細胞が吸着する際の足場が形成されない。その結果、計測対象の細胞がデバイス１中の細胞配置部１０ａに選択的に吸着され、固定される。
【００２９】
また、非細胞接着層１９は、電極１２の場合と同様の理由により、光透過性を有するものが好ましい。非細胞接着層１９を光透過性とするためには、非接着性物質等の含有成分を、光透過性を有するものとすれば良い。
【００３０】
なかでも非細胞接着層１９としては、撥液性及び光透過性を有する材質からなるものが好ましい。
そして、このような非細胞接着層１９として、より具体的には、前記非接着性物質として撥液性及び光透過性を有するフッ素含有化合物を含むものが例示できる。
【００３１】
前記フッ素含有化合物の前駆体としては、パーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を分子の一端に有する化合物が好ましく、より好ましいものとして、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物（以下、それぞれ化合物（１）、化合物（２）と略記する）が例示できる。
【００３２】
【化５】
【００３３】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；Ｙは式「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−」で表される基又はカルボニル基であり、複数のＹは互いに同一でも異なっていても良く；Ｚは、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良いアルキル基又はアルキルオキシアルキル基に、一つの水素原子が置換されたエチレンオキシ基であり、複数のＺは互いに同一でも異なっていても良く；ｊ及びｋはそれぞれ独立して０又は１であり、複数のｊ又はｋは互いに同一でも異なっていても良く；ｌ及びｍはそれぞれ独立して０以上の整数であり、複数のｌ又はｍは互いに同一でも異なっていても良く；ｌが２以上の整数である場合にはｌ個のＺは互いに同一でも異なっていても良い。）
【００３４】
【化６】
【００３５】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
【００３６】
Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基である。ここで「パーフルオロアルキル基」とは、「アルキル基の水素原子がすべてフッ素原子に置換されたもの」を指す。また、「パーフルオロアルキルエーテル基」とは、「前記パーフルオロアルキル基が酸素原子に結合した一価の基」を指す。
Ｒ１における前記アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシルが例示できる。
Ｒ１の炭素数は、３〜１２であることが好ましく、６〜１０であることがより好ましい。
また、Ｒ１は直鎖状であることが好ましく、パーフルオロアルキル基であることが好ましい。
【００３７】
Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表す。具体的には、前記Ｒ１から一つのフッ素原子を除いた二価の基が例示できる。Ｒ１’の炭素数が２以上である場合には、前記Ｒ１の「Ｚ」に結合している炭素原子とは反対側の末端の炭素原子に結合しているフッ素原子を一つ除いた二価の基が好ましい。
【００３８】
Ｒ２は前記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかである。そして、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く、例えば、化合物（２）における両分子末端のＲ２は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＲ２と化合物（２）におけるＲ２とは互いに同一でも異なっていても良い。
【００３９】
Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表す。
Ｒ３の水酸基に置換可能な原子としては、好ましいものとしてフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられ、なかでも塩素原子が特に好ましい。
また、水酸基に置換可能な基としては、好ましいものとして、炭素数が１〜６のアルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基及びアシルオキシ基が挙げられる。
炭素数が１〜６のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペントキシ基及びヘキシルオキシ基が例示できる。
アリールオキシ基としては、フェノキシ基及びナフトキシ基が例示できる。
アラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基及びフェネチルオキシ基が例示できる。
アシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基、バレリルオキシ基、ピバロイルオキシ基及びベンゾイルオキシ基が例示できる。
これらのなかでもＲ３としては、塩素原子、メトキシ基及びエトキシ基がより好ましく、塩素原子が特に好ましい。
【００４０】
Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表す。
Ｒ４の１価の炭化水素基は特に限定されず、鎖状構造及び環状構造のいずれでも良く、飽和及び不飽和のいずれでも良い。鎖状構造の場合には、直鎖状及び分岐鎖状のいずれでも良く、環状構造である場合には、単環構造及び多環構造のいずれでも良い。
なかでも、好ましいものとして、炭素数が１〜６のアルキル基、アリール基及びアラルキル基が挙げられる。
炭素数が１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基及びヘキシル基が例示できる。
アリール基としては、フェニル基及びナフチル基が例示できる。
アラルキル基としては、ベンジル基及びフェネチル基が例示できる。
これらのなかでもＲ４としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基及びイソプロピル基がより好ましく、メチル基が特に好ましい。
【００４１】
Ｙは式「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−」で表される基又はカルボニル基である。すなわち、隣り合うメチレン基及び酸素原子とは、以下のように結合する。
「−（ＣＨ２）ｍ−（ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ））ｊ−（Ｏ）ｋ−」
「−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ（＝Ｏ））ｊ−（Ｏ）ｋ−」
そして、複数のＹは互いに同一でも異なっていても良く、例えば、化合物（２）において「Ｒ１’」を挟んで対峙しているＹ同士は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＹと化合物（２）におけるＹとは互いに同一でも異なっていても良い。
【００４２】
Ｚは、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良いアルキル基又はアルキルオキシアルキル基に、一つの水素原子が置換されたエチレンオキシ基である。前記エチレンオキシ基の末端の酸素原子が隣り合うＲ１に結合する。
前記エチレンオキシ基の置換されていても良い水素原子の数は、一つであることが好ましい。また、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良い前記アルキル基又はアルキルオキシアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であることが好ましく、直鎖状であることがより好ましい。そして、炭素数は１〜１６であることが好ましい。
そして、複数のＺは互いに同一でも異なっていても良く、例えば、化合物（２）において「Ｒ１’」を挟んで対峙しているＺ同士は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＺと化合物（２）におけるＺとは互いに同一でも異なっていても良い。
【００４３】
ｊ及びｋはそれぞれ独立して０又は１であり、０であることが特に好ましい。また、複数のｊ又はｋは互いに同一でも異なっていても良い。例えば、化合物（２）において「Ｒ１’」を挟んで対峙しているＹにかかるｊ同士は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＹにかかるｊと化合物（２）におけるＹにかかるｊとは互いに同一でも異なっていても良い。ｋについても同様である。
【００４４】
ｌ及びｍはそれぞれ独立して０以上の整数である。
そして、ｌは０であることが特に好ましい。
ｍは０〜３であることが好ましく、１又は２であることがより好ましく、２であることが特に好ましい。
また、複数のｌ又はｍは互いに同一でも異なっていても良い。例えば、化合物（２）において「Ｒ１’」を挟んで対峙しているＺにかかるｌ同士は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＺにかかるｌと化合物（２）におけるＺにかかるｌとは互いに同一でも異なっていても良い。ｍについても同様である。
さらに、ｌが２以上の整数である場合には、ｌ個のＺは互いに同一でも異なっていても良い。
【００４５】
ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合には、ｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く、ｎが１である場合には、２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。
【００４６】
化合物（１）又は（２）としては、より好ましいものとして、下記一般式（３）又は（４）で表されるものが挙げられる。
【００４７】
【化７】
【００４８】
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、ｍは前記と同様である。）
【００４９】
また、前記一般式（１）又は（２）において、Ｚが「−（ＣＨＲ５−ＣＨＲ６−Ｏ）ｌ’−（ＣＨＲ７−ＣＨＲ８−Ｏ）ｌ’’」で表される化合物も、より好ましいものとして挙げられる。
ここで、Ｒ５及びＲ６の一方は水素原子を表し、他方はメチル基の一つの水素原子が、炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のフルオロアルキル基又はフルオロアルキルエーテル基に置換された基を表す。ここで「フルオロアルキルエーテル基」とは、「前記炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のフルオロアルキル基が酸素原子に結合した一価の基」を指す。
また、Ｒ７及びＲ８の一方は水素原子を表し、他方は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基又はアルキルエーテル基を表す。ここで「アルキルエーテル基」とは、「前記炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基が酸素原子に結合した一価の基」を指す。
【００５０】
ｌ’は、２以上の整数であり、２〜２０であることが好ましく、５〜１０であることがより好ましい。
ｌ’’は、０以上の整数であり、０〜２０であることが好ましく、０であることがより好ましい。
【００５１】
Ｒ５及びＲ６における、メチル基の一つの水素原子が置換された前記フルオロアルキル基としては、ＣＦ３−、ＣＨＦ２−、ＣＣｌＦ２−、Ｃ２Ｆ５−、ＣＨＦ２ＣＦ２−、ＣＣｌＦ２ＣＦ２−、（ＣＦ３）２ＣＦ−、ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２−、（ＣＨＦ２）２ＣＦ−、（ＣＦ３）（ＣＨＦ２）ＣＦ−、（ＣＦ３）２ＣＦＣＦ２ＣＦ２−、（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２ＣＦ２）２−、ＣＦ３（ＣＦ２）３−、ＣＦ３（ＣＦ２）５−、ＣＦ３（ＣＦ２）７−、ＣＦ３（ＣＦ２）９−、ＣＦ３（ＣＦ２）１１−、ＣＦ３（ＣＦ２）１３−、ＣＦ３（ＣＦ２）１５−が例示できる。
そしてＲ５及びＲ６における、メチル基の一つの水素原子が置換された前記フルオロアルキルエーテル基としては、これらフルオロアルキル基が酸素原子に結合した一価の基が例示できる。
【００５２】
Ｒ７及びＲ８における前記アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシルが例示できる。
そしてＲ７及びＲ８における前記アルキルエーテル基としては、これらアルキル基が酸素原子に結合した一価の基が例示できる。
【００５３】
非細胞接着層１９は、上記のように、非接着性物質の前駆体を前記絶縁膜１５上に結合させることで形成できる。非接着性物質の前駆体としては、市販品を使用しても良い。
例えば、絶縁膜１５が水酸基を有する場合には、前記化合物（１）又は（２）として、Ｒ２が前記式（１１）、（１２）又は（１６）等で表される基を有するものを使用することが好ましい。
なかでも、前記式（１６）等で表される有機シリル基を有する化合物（１）又は（２）は、市販品の入手が容易であり好適である。このような市販品としては、例えば、サイトップシリーズ（商標、旭硝子株式会社製）、メガファック（商標、大日本インキ化学工業株式会社製）、ディックガード（商標、大日本インキ化学工業株式会社製）、ＦＰＸ−３０Ｇ（商標、ＪＳＲ株式会社製）、ノベックＥＧＣ−１７２０（商標、住友スリーエム株式会社製）、Ｐａｔｉｎａｌシリーズ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ＷＲ１，ＷＲ２，ＷＲ３）（商標、メルク株式会社製）、オプツールＤＳＸ（商標、ダイキン工業株式会社製）が例示できる。
【００５４】
また、Ｒ２が前記式（１１）、（１２）及び（１６）以外の基、例えば、前記式（１３）、（１４）又は（１５）等で表される基を有するものである場合には、これらの基と反応可能な官能基を有するように絶縁膜を処理しても良い。
例えば、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２，６８６−６９４（２００１）（Ｂｅｎｔｅｒｓ Ｒ． Ｅｔ ａｌ．）に記載の方法によれば、Ｒ２として前記式（１４）で表される基（すなわち、アミノ基）を有する化合物（１）又は（２）を、絶縁膜に結合させることができる。
また、例えば、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン等のアミノ基を有する有機シラン化合物を絶縁膜表面に結合させておけば、Ｒ２として前記式（１３）で表される基（すなわち、カルボキシル基）又は前記式（１５）で表される基（すなわち、エポキシ基）を有する化合物（１）あるいは（２）を、絶縁膜に結合させることができる。前記有機シラン化合物は、入手も容易である。
【００５５】
非細胞接着層１９において、非接着性物質は、少なくとも分子の一部、好ましくは分子の一端が絶縁膜１５上の特定の原子や官能基と結合している一方、撥液性を有する部位がデバイス１の外側へ向けて露出するように配向すると推測される。例えば、非接着性物質の前駆体として前記化合物（１）を使用した場合には、そのＲ２が絶縁膜と結合する一方、Ｒ１がデバイス１の外側へ向けて露出するように配向する。また、前記化合物（２）を使用した場合には、その一つ又は二つのＲ２が絶縁膜と結合する一方、Ｒ１’がデバイス１の外側へ向けて露出するように配向すると推測される。
このように、撥液性を有する部位が配向することで、非細胞接着層１９は細胞に対する非接着性を発現すると推測される。したがって、前記化合物（１）又は（２）のように、パーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を有する化合物を使用することで、デバイス１により高い非接着効果を発現させることが可能となる。
【００５６】
また、前記化合物（１）又は（２）を使用して形成した非細胞接着層１９は、従来のポリテトラフオロエチレンなどを含む層よりも、透明度に優れ、薄い単層薄膜とするのに好適であり、パターニングや除去などの微細加工性に優れる。透明度が優れているので、細胞や細胞に作用する物質を光学的に検出する場合には、ノイズの大幅な低減が可能であり、高感度な解析が可能である。また、微細加工性に優れているので、後記するように絶縁基板１１上に微小サイズの細胞配置部１０ａや細胞連結部１０ｂを多数形成でき、絶縁基板１１上の細胞の配置密度を高くできるので、高い効率で解析できる。
【００５７】
非細胞接着層１９中の非接着性物質は一種でも良いし、二種以上でも良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率等は目的に応じて適宜選択できる。
また、非細胞接着層１９は、本発明の効果を妨げない範囲で、非接着性物質以外の如何なる成分を含んでいても良い。
【００５８】
非細胞接着層１９の厚さは、計測対象の細胞の種類等に応じて適宜調整することが好ましい。通常は、５０００ｎｍ以下であることが好ましく、１０００ｎｍ以下であることがより好ましく、２００ｎｍ以下であることが特に好ましい。特に、化合物（１）を使用して非接着性物質の単分子膜を形成させ、非細胞接着層１９とした場合には、５〜１００ｎｍの厚さのものが好適に得られる。
上記範囲の厚さであれば、非細胞接着層１９は加工性にも優れる。
【００５９】
細胞配置部１０ａは、いずれも直径Ｄの略円形状である。そして、絶縁基板１１上において、互いに直交する二方向に等間隔で合計１６個の細胞配置部１０ａが配置されており、細胞配置部１０ａ一つあたり一つの微小電極１７が配置されている。
一方、細胞連結部１０ｂは、いずれも幅がＷの帯状である。各細胞連結部は、連結対象である各細胞配置部を最短距離で連結するように配置されるのが好ましく、図２においては、連結される細胞配置部の略中心部を結ぶ線に重なるように細胞連結部１０ｂが配置されている。連結距離Ｓは、連結される細胞配置部１０ａ同士の中心間距離に相当する。
すなわち、細胞配置部１０ａは頂点を、細胞連結部１０ｂは辺をそれぞれ構成するように升目状に配置されている。
【００６０】
細胞配置部１０ａの面積は、配置する細胞の種類や数、その他目的に応じて適宜調整すれば良い。例えば、配置する細胞数が細胞配置部一つにつき一つである場合には、細胞配置部の面積は通常、２．０×１０−１１〜４．０×１０−８ｍ２であることが好ましく、１．８×１０−１０〜２．３×１０−８ｍ２であることがより好ましい。このような好ましい面積とするためには、細胞配置部１０ａの直径Ｄをこの面積に対応するように調整すれば良く、好ましくは５〜２２５μｍ、より好ましくは１５〜１５０μｍとすると良い。直径Ｄが小さいほど、基板１上の接着面１３１の数を増やせる点で好ましい。
細胞連結部１０ｂの幅Ｗ及び連結距離Ｓも、配置する細胞の種類や数、その他目的に応じて適宜調整すれば良い。上記と同様に、配置する細胞数が細胞配置部１０ａ一つにつき一つである場合には、通常、幅Ｗは、３０μｍ以下であることが好ましく、８μｍ以下であることがより好ましい。連結距離Ｓは、細胞によって異なるが、通常は直径Ｄに応じて調整することが好ましく、Ｄ＋５〜Ｄ＋３５０μｍであることが好ましく、Ｄ＋２０〜Ｄ＋２５０μｍであることがより好ましい。
【００６１】
ここでは、微小電極配置部１４に１６個の細胞配置部１０ａが配置された例を示しているが、細胞配置部の数は、絶縁基板の大きさや、計測に供する細胞の数等を考慮して、適宜調整すれば良い。そして、細胞配置部の数が多いほど、デバイスを多様な解析に使用できる点で好ましい。
また、細胞配置部として略円形状のものを例示しているが、これに限定されず、多角形状等、他の形状でも良い。
そして、細胞配置部の形状や大きさは、ここに示すように、必ずしもすべて同じである必要性はないが、同じである方がデバイスの作製が容易である点で好ましい。
また、ここでは絶縁基板上において、細胞配置部が互いに直交する二方向に等間隔で配置された例を示しているが、配置方向及び間隔はこれに限定されず、目的に応じて適宜選択できる。
【００６２】
ここでは、細胞連結部として帯状のものを例示しているが、これに限定されず他の形状でも良い。ただし、細長形状のものが好ましい。
また、細胞連結部の数も、細胞配置部の数や、目的に応じて適宜調整すれば良い。
そして、細胞連結部の形状や大きさは、ここに示すように、必ずしもすべて同じである必要性はないが、同じである方がデバイスの作製が容易である点で好ましい。
また、ここでは、細胞配置部は頂点を、細胞連結部は辺をそれぞれ構成するように升目状に配置された例を示しているが、例えば、細胞連結部は升目の辺だけでなく対角線に重なるように配置されていても良く、対角線のみに重なるように配置されていても良いし、これらのいずれでなくても良い。
【００６３】
微小電極１７の材質は、公知のものから適宜選択すれば良く、前記電極１２と同様のものが例示できる。そして、前記電極１２の場合と同様の理由により、光透過性を有する材質が好ましい。
微小電極１７の大きさは、計測対象の細胞の種類に応じて適宜調整することが好ましいが、通常は、電極面の面積が１．０×１０−１１〜５．０×１０−９ｍ２であることが好ましく、３．０×１０−１１〜２．０×１０−９ｍ２であることがより好ましい。微小電極１７の厚さは、５０〜１０００ｎｍであることが好ましく、１００〜４００ｎｍであることがより好ましい。
【００６４】
ここでは、微小電極配置部１４に１６個の微小電極１７が配置された例を示しているが、微小電極の数は、計測に供する細胞の数等を考慮して、適宜調整すれば良い。例えば、微小電極配置部に微小電極が一つだけ設けられたものでも、細胞電位を計測できるが、微小電極が複数個設けられたものであれば、複数個の細胞の電位を同時に計測でき、例えば、細胞群ネットワークにおける特定細胞の機能や、細胞間の相互作用等、種々の解析が可能となる。
また、ここでは、細胞配置部１０ａ一つあたり一つの微小電極１７が配置された例を示しているが、細胞配置部一つ当たりに配置される微小電極の数は複数でも良い。複数配置した場合には、例えば、一細胞あたり複数箇所（例えば、核近傍とそれ以外の部位）の電位を計測して比較することにより、イオンを選択的に細胞内外に透過させるイオンチャネル分子の分布に関する情報が得られるなど、一層高度な解析が可能となる。
また、必ずしもすべての細胞配置部に微小電極が配置されていなくても良く、目的に応じて、適宜選択すれば良い。微小電極が配置されていない細胞配置部を併設した場合には、例えば、細胞電位が変化しない異種細胞を併用した解析や、微小電極の総数を削減したことによる解析装置の負荷軽減に好適である。
【００６５】
一方、微小電極１７として、ここでは略正方形状のものを例示しているが、これに限定されず、その他の多角形状、円形状等、他の形状でも良い。
そして、微小電極の形状は、ここに示すように、必ずしもすべて同じである必要性はないが、同じである方がデバイスの作製が容易である点で好ましい。
微小電極１７は、必ずしも露出された絶縁膜１５で包囲されていなくても良く、例えば、周縁部の一部が非細胞接着層１９に接していても良い。ただし、細胞を細胞配置部により安定して配置できることから、微小電極１７は露出された絶縁膜１５で包囲されていることが好ましい。そして、ここに例示するように、微小電極１７は細胞配置部１０ａと同心状に配置されていることが好ましい。
【００６６】
図３は、図２（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における縦断面図である。
配線１８は帯状であり、前記電極１２のうちの第二の接続部１２ｂと微小電極１７とを電気的に接続するものである。したがって通常は、電極１２、配線１８及び微小電極１７は同数となる。このような構成により、微小電極１７は、デバイス１が接続される外部の計測器（図示略）と電気的に接続される。
配線１８は、後記するデバイスの製造方法における説明のように、微小電極１７と同時に形成することを考慮すると、微小電極１７と同じ厚さとすることが好ましい。
配線１８の幅は、微小電極１７の大きさ等を考慮して適宜調整すれば良いが、通常は、２〜７０μｍであることが好ましく、３〜２０μｍであることがより好ましい。
ここでは、配線として帯状のものを例示しているが、これに限定されず他の形状でも良い。ただし、細長形状のものが好ましい。
【００６７】
計測対象の細胞は、微小電極１７に接触するようにして細胞配置部１０ａに配置する。この時、細胞配置部１０ａ、すなわち絶縁基板１１上の微小電極１７が露出された凹部内に、細胞全体が収容されるようにしても良いし、細胞の一部分が前記凹部内に収容されていなくても良い。細胞全体が前記凹部内に収容されていなくても、細胞全体は、細胞配置部１０ａを包囲する非細胞接着層１９により配置位置が固定されるからである。
【００６８】
本発明においては、非細胞接着層１９及び微小電極１７の少なくとも一方が光透過性を有するものが好ましく、非細胞接着層１９及び微小電極１７が共に光透過性を有するものがより好ましい。
【００６９】
ここまでは、デバイスとして、微小電極の配線がすべて絶縁膜で被覆されているものを例示しているが、例えば、配線の一部が絶縁膜で被覆されずに露出されているものでも良い。ただし、配線の劣化を抑制するために、配線の露出部は少ないほど好ましい。
【００７０】
本発明においては、必ずしも細胞連結部が設けられていなくても良いが、ここで例示するように細胞連結部が設けられていることにより、細胞同士が連結部で互いに容易に結合し、細胞間でネットワークを構築して細胞群を形成するようになる。その結果、細胞群中の細胞について一細胞毎に電位を計測でき、高精度に細胞の機能を解析できる。また、細胞間の相互作用、細胞と化学物質との相互作用等に関する高精度な情報を取得できる。
【００７１】
（第二の実施形態）
図４は、本発明の第二の実施形態に係るデバイスを例示する平面図である。
ここに例示するデバイス２は、細胞配置部及び隔壁の形態が第一の実施形態と異なっており、第一の実施形態と同一の構成要素については同一の符号を付し、その詳細な説明は省略する。
【００７２】
デバイス２においては、微小電極配置部２４中の微小電極の配置形態に応じて、絶縁基板１１上にパターニングされている電極１２及び参照電極１３の数が、第一の実施形態と異なっている。
また、隔壁２６は、平面視にて中空部が略円形の丸筒状であり、その他の点では、第一の実施形態における隔壁１６と同様である。
【００７３】
図５は、微小電極配置部２４を拡大して例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）の平面図の一部をさらに拡大して例示する平面図である。
微小電極配置部２４においては、略円形状である複数個の微小電極２７が配置されている。微小電極２７は、形状が異なる点以外は、第一の実施形態における微小電極１７と同様である。
そして、これら複数個の微小電極２７が露出するように、絶縁基板１１上には絶縁膜１５が被覆されている。さらに、露出された前記微小電極２７と、該微小電極２７近傍でこれを包囲する所定領域とからなる略円形状の細胞配置部２０ａ、及びこれら細胞配置部２０ａを連結する帯状の細胞連結部２０ｂからなる非積層領域２０を除いて、絶縁膜１５上には、非細胞接着層１９が設けられている。
【００７４】
図６は、図５（ａ）のＩＶ−ＩＶ線における縦断面図である。
配線２８は、前記電極１２のうちの第二の接続部１２ｂと微小電極２７とを電気的に接続するものである。したがって通常は、電極１２、配線２８及び微小電極２７は同数となる。このような構成により、微小電極２７は、デバイス１が接続される外部の計測器（図示略）と電気的に接続される。
配線２８は、微小電極２７の配置形態に応じて数が異なる点以外は、第一の実施形態における配線１８と同様である。
【００７５】
細胞配置部２０ａは、いずれも直径Ｄ’の略円形状である。そして、絶縁基板１１上において、互いに直交する二方向に等間隔で合計１０個の細胞配置部２０ａが配置されており、細胞配置部２０ａ一つあたりの微小電極２７の配置数は、０又は１である。
一方、細胞連結部２０ｂは、いずれも幅がＷ’の帯状である。各細胞連結部は、連結対象である各細胞配置部を最短距離で連結するように配置されるのが好ましく、図５においては、連結される細胞配置部の略中心部を結ぶ線に重なるように細胞連結部２０ｂが配置されている。連結距離Ｓ’は、連結される細胞配置部２０ａ同士の中心間距離に相当する。
細胞配置部２０ａの面積は、第一の実施形態における細胞配置部１０ａと同様である。そして、Ｄ’、Ｗ’及びＳ’の大きさも、第一の実施形態におけるＤ、Ｗ及びＳと同様である。
【００７６】
本発明のデバイスは、微小電極配置部において、細胞配置部及び細胞連結部以外は非細胞接着層で被覆されているので、計測対象の細胞をアプライした時に、細胞が細胞配置部以外の領域に付着しても容易に除去できる。そして、細胞配置部に細胞を安定して保持できる。
また、特に前記化合物（１）又は（２）を使用して形成した非細胞接着層は、薄い単層薄膜とするのに好適であり、微細加工性に優れ、細胞配置部及び細胞連結部を従来よりも高精細且つ高精度に形成でき、しかも加工精度が損なわれることが無い。したがって、細胞の配置密度を高くできるので、高い効率で計測できる。さらに、透明度に優れ、細胞や細胞に作用する物質を光学的に検出する場合には、ノイズの大幅な低減が可能である。したがって、解析時のＳ／Ｎ比が従来よりも大幅に向上するので、より高精度に解析できる。
【００７７】
本発明のデバイスを使用することで、細胞群中の細胞について一細胞毎にその機能を高精度に解析でき、その機能を利用する種々の解析や物質生産等も高い効率で行うことができる。一例を挙げれば、異種細胞間のコミュニティーエフェクトを利用して、種々の環境下で細胞が受ける影響を客観的に解析できる。より具体的には、例えば、種々の化学物質を使用してバイオアッセイを行うこともでき、毒性検査試験等にも応用できる。これにより、例えば、医薬品や化学物質の投与が生体に及ぼす影響を、従来は体調の良・不良という主観的な表現で評価していたのに対し、具体的な数値比較により評価できるようになる。
そして、これら解析や物質生産を行う場合には、本発明のデバイスを使用すること以外は、従来のバイオチップやデバイス等を使用する場合と同様の方法を適用すれば良い。
【００７８】
＜微小電極アレイデバイスの製造方法＞
上記本発明のデバイスは、以下のように製造できる。
（製造方法１）
図７〜９は、図１〜３に例示する本発明のデバイスの製造工程を例示する図である。以下においては、特に微小電極配置部１４を図示しながら説明する。
まず、絶縁基板１１の片面全面に、電極１２、参照電極１３、微小電極１７及び配線１８の材質となる材料で成膜した後、パターニングすることで、電極１２、参照電極１３、並びに図７（ａ）及び（ｂ）に示すように微小電極１７及び配線１８をそれぞれ形成する。図７（ａ）は微小電極配置部１４の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線における縦断面図である。成膜方法は公知の方法から適宜選択すれば良いが、スパッタリングが好ましい。成膜後のパターニング方法も公知の方法から適宜選択すれば良いが、ウェットエッチング又はリフトオフ加工が好ましい。
【００７９】
次いで、電極１２のうちの第二の接続部１２ｂ、参照電極１３、微小電極１７及び配線１８が形成された絶縁基板１１上の所定領域に、前記参照電極１３、並びに図８（ａ）及び（ｂ）に示すように微小電極１７がそれぞれ露出するように、絶縁膜１５をパターニングする。図８（ａ）は微小電極配置部１４の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における縦断面図である。絶縁膜１５のパターニング方法は、絶縁膜１５の材質に応じて公知の方法から適宜選択すれば良い。例えば、絶縁膜として感光性樹脂を使用する場合には、フォトリソグラフィーによりパターニングすれば良い。また、絶縁膜として酸化ケイ素膜を使用する場合には、プラズマＣＶＤ法等により酸化ケイ素膜を成膜した後、該酸化ケイ素膜上にフォトレジスト等の感光性樹脂を積層させ、これをフォトリソグラフィーによりパターニングした後、パターニングされた感光性樹脂をマスクとしてエッチングを行うことで、参照電極１３及び微小電極１７が露出するように酸化ケイ素膜をパターニングすれば良い。この時のエッチングはウェットエッチングが好ましい。
【００８０】
次いで、絶縁基板１１上の絶縁膜１５がパターニングされた面、具体的には、絶縁膜１５、参照電極１３及び微小電極１７を、非接着性物質の前駆体で被覆し、非細胞接着層１９を形成する。この時の被覆方法としては、ディップ塗布法、真空蒸着法、ＣＶＤ（化学気相蒸着）法、プラズマ重合法が例示できる。例えば、ディップ塗布法の場合は、非接着性物質の前駆体を含有する被覆処理溶液を調製し、これを塗布して、塗布後は乾燥により前記処理溶液中の溶媒成分を除去することが好ましい。非細胞接着層１９の厚さは、前記前駆体の分子の大きさや使用量で調整できる。
【００８１】
次いで、非細胞接着層１９が形成された絶縁基板１１を洗浄し、乾燥させると良い。洗浄は、メタノールやエタノール等のアルコールを使用しても良いし、被覆処理溶液がフッ素系溶媒を含有する場合には、フッ素系溶媒を使用しても良い。
【００８２】
次いで、非細胞接着層１９上の、参照電極１３、細胞配置部１０ａ及び細胞連結部１０ｂに相当する領域以外の領域をフォトリソグラフィーにより感光性樹脂で被覆し、該樹脂をマスクとして非細胞接着層１９をエッチングする。この時のエッチング方法は如何なる方法でも良いが、ドライエッチングが好ましく、より具体的には、酸素、アルゴン及び塩素からなる群から選択される一種のガスから生成されるプラズマを用いたエッチングが好ましい。また、紫外光又はオゾン照射でエッチングしても良い。
エッチングにより、感光性樹脂でマスクされていない非細胞接着層１９が除去されて、非細胞接着層１９がパターニングされる。その結果、参照電極１３及び微小電極１７が露出され、細胞配置部１０ａ及び細胞連結部１０ｂに相当する領域では、絶縁膜１５が露出される。
【００８３】
次いで、絶縁基板１１上に残っている感光性樹脂をすべて除去することで、参照電極１３が露出し、図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、微小電極配置部１４に非細胞接着層１９がパターニングされ、細胞配置部１０ａ及び細胞連結部１０ｂが形成された絶縁基板１１が得られる。図９（ａ）は微小電極配置部１４の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における縦断面図である。
【００８４】
次いで、絶縁膜１５上の所定領域に、参照電極１３及び微小電極配置部１４を包囲するように、隔壁１６を固定することで、デバイス１が得られる。隔壁１６は、接着剤を使用して固定するのが好ましい。接着剤は、絶縁膜１５及び隔壁１６の材質に応じて、公知のものから適宜選択すれば良い。
【００８５】
（製造方法２）
本発明のデバイスは、以下の方法でも製造できる。
前記製造方法１と同様の方法で、参照電極１３、並びに図８（ａ）及び（ｂ）に示すように微小電極１７がそれぞれ露出するように、絶縁基板１１上の所定領域に絶縁膜１５をパターニングする。
次いで、絶縁基板１１上の絶縁膜１５がパターニングされた面において、参照電極１３、微小電極１７、微小電極１７近傍でこれを包囲する領域の絶縁膜１５、前記微小電極１７を包囲する領域同士を連結する所定領域の絶縁膜１５を、それぞれフォトリソグラフィーにより感光性樹脂９で被覆してパターニングする。ここで、「微小電極１７近傍でこれを包囲する領域」とは、細胞配置部１０ａに相当する領域であり、「微小電極１７を包囲する領域同士を連結する所定領域」とは、細胞連結部１０ｂに相当する領域である。
次いで、絶縁基板１１上の感光性樹脂９がパターニングされた面、具体的には、被覆した感光性樹脂９及び絶縁膜１５を非接着性物質の前駆体で被覆し、図１０（ａ）及び（ｂ）に示すように、非細胞接着層１９を形成する。図１０（ａ）は微小電極配置部１４の平面図、（ｂ）は（ａ）のＶ−Ｖ線における縦断面図である。非接着性物質の前駆体の被覆方法は、製造方法１と同様で良い。
次いで、感光性樹脂９上の非細胞接着層１９を、該非細胞接着層１９で被覆されている感光性樹脂９と共に除去する。これにより、参照電極１３及び微小電極１７が露出され、細胞配置部１０ａ及び細胞連結部１０ｂに相当する領域では、絶縁膜１５が露出される。その結果、製造方法１の場合と同様に、図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、微小電極配置部１４に非細胞接着層１９がパターニングされた絶縁基板１１が得られる。
次いで、製造方法１と同様の方法で、絶縁膜１５上の所定領域に、参照電極１３及び微小電極配置部１４を包囲するように、隔壁１６を固定することで、デバイス１が得られる。
【００８６】
ここでは、図１〜３に例示する、本発明の第一の実施形態に係るデバイス１の製造方法について説明したが、例えば、図４〜６に例示するデバイス２等、他の実施形態に係るデバイスも、同様に製造できることは言うまでもない。例えば、細胞配置部及び／又は細胞連結部を異なる形状で形成したい場合には、非細胞接着層の除去に使用する前記感光性樹脂を所望のものとなるようにパターニングすれば良い。そして、細胞連結部が不要である場合には、参照電極が露出され、且つ細胞配置部だけが形成されるように、前記感光性樹脂をパターニングすれば良い。
【実施例】
【００８７】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
前記製造方法１により、図１〜３に例示するデバイスを作製した。
すなわち、パイレックス（登録商標）（コード７０５９、コーニングインターナショナル株式会社製）のガラス基板（厚さ；０．５ｍｍ）の片面全面に、ＩＴＯを厚さが２００ｎｍとなるようにスパッタリングにより成膜し、さらにウェットエッチングによりパターニングすることで、電極、参照電極、微小電極及び配線を形成した。
電極のうち第一の接続部は幅が０．８ｍｍの帯状とし、第二の接続部は幅が０．８〜０．０１ｍｍの範囲で減じる帯状とした。また、参照電極は一辺が０．２ｍｍの正方形状とした。さらに、微小電極は一辺が１０μｍの正方形状とし、配線は幅が７．５μｍの帯状とした。
次いで、ガラス基板上の所定領域に、絶縁膜としてフォトレジストを厚さが１．２μｍとなるようにフォトリソグラフィーによりパターニングし、該パターニング面、参照電極及び微小電極に、オプツールＤＳＸ（商標、ダイキン工業株式会社製）をディップ塗布した。そして、一晩乾燥させた後、１００℃で１時間加熱し、フッ素系溶媒であるノベックＨＦＥ（商標、住友スリーエム株式会社製）を使用して洗浄することで、非細胞接着層を形成した。
次いで、非細胞接着層上の所定領域をフォトリソグラフィーによりフォトレジストで被覆し、該樹脂をマスクとして非細胞接着層を酸素プラズマで５分間エッチングして、非細胞接着層をパターニングした。
次いで、絶縁基板上のフォトレジストをすべて除去することで、細胞配置部及び細胞連結部を形成した。細胞配置部の直径Ｄは２５μｍ、細胞連結部の幅Ｗは１μｍ、連結距離Ｓは５０μｍであった。なお、非細胞接着層の厚さは１２nmであった。
次いで、厚さが０．７ｍｍのガラス板からなり、高さが２．０ｍｍであり、平面視にて中空部が一辺２．５ｍｍの正方形である角筒状の隔壁を、絶縁膜上の所定領域に接着して固定することで、本発明のデバイスを得た。
【００８８】
このデバイスを使用して、下記手順にしたがって、ラット心筋細胞の活動電位を計測した。
まず、濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるようにＣｅｌｌ Ｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ（新田ゼラチン社製）をｐＨ３の希塩酸水溶液に溶解させて得たコラーゲン溶液を、培養液として隔壁内にアプライし、１０分間静置後、ｐＨ３の希塩酸水溶液で洗浄した。
次いで、コラーゲン溶液をアプライした隔壁内に、ラット心筋初代培養細胞（北海道システム・サイエンス株式会社製）をアプライし、赤外レーザによる光ピンセットを使用して、細胞配置部に前記細胞を一つずつ配置して吸着させた。
微小電極及び非細胞接着層が共に透明なので、細胞配置部が明りょうに視認でき、その結果、前記細胞を非細胞接着層上に配置することなく、容易に細胞配置部に配置できた。さらに図１１に示すように、前記細胞同士が連結部で互いに結合し、拍動が同期する様子を確認できた。図１１は、この時の微小電極配置部１４を模式的に示す平面図であり、符号１１０が配置された細胞である。また、図１２は、この時の配置された一つの細胞の活動電位の測定結果である。図１２中、横軸は時間を、縦軸は電位（Ｖ）を示す。図１２（ａ）に示すように、培養液中での前記細胞の拍動に伴う電位変化が、０．４４秒ごとに確認された。次に、心筋の拍動を速くする薬理効果を有することが知られているエピネフリンを隔壁内の培養液中へ添加したところ、図１２（ｂ）に示すように、電位変化が０．２０秒ごとに見られるようになり、心筋の拍動が速くなっていることが確かに確認された。
以上により、細胞の活動電位を単一細胞ごとに高精度に計測できることが確認された。
【００８９】
（実施例２）
オプツールＤＳＸ（商標、ダイキン工業株式会社製）の代わりに、濃度が０．０２ｍｏｌ／ＬであるＣＦ３−（ＣＦ２）７−（ＣＨ２）２−ＳｉＣｌ３のノベックＨＦＥ（商標、住友スリーエム株式会社製）溶液を使用したこと以外は、実施例１と同様の方法でデバイスを得た。
得られたデバイスを使用して、実施例１と同様の方法でラット心筋初代培養細胞の活動電位を計測したところ、実施例１と同様の結果が得られた。
【００９０】
（実施例３）
前記製造方法２により、図４〜６に例示するデバイスを作製した。
すなわち、パイレックス（登録商標）（コード７０５９、コーニングインターナショナル株式会社製）のガラス基板（厚さ；０．５ｍｍ）の片面全面に、クロム薄膜をスパッタリングによって１００ｎｍの厚さで成膜し、該クロム薄膜上にさらに、プラチナ薄膜をスパッタリングによって２００ｎｍの厚さで成膜して、リフトオフ加工によりパターニングすることで、電極、参照電極、微小電極及び配線を形成した。
電極のうち第一の接続部は幅が１ｍｍの帯状とし、第二の接続部は幅が１〜０．０１５ｍｍの範囲で減じる帯状とした。また、参照電極は一辺が０．３ｍｍの正方形状とした。さらに、微小電極は一辺が３０μｍの正方形状とし、配線は幅が１５μｍの帯状とした。
次いで、得られた絶縁基板上にプラズマＣＶＤ法により、テトラエトキシシランを蒸着源として二酸化ケイ素膜を５００ｎｍの厚さで成膜し、該二酸化ケイ素膜上にフォトリソグラフィーによりフォトレジストをパターニングした後、これをマスクとしてフッ化水素酸によりウェットエッチングを行うことで、参照電極及び微小電極が露出するように酸化ケイ素膜をパターニングした。
次いで、絶縁基板上の所定領域をフォトリソグラフィーによりフォトレジストで被覆し、さらに、被覆したフォトレジスト及び絶縁膜上に、ＷＲ１ Ｐａｒｔｉｎａｌ（商品名、メルク株式会社製）を蒸着源とした真空蒸着法にて、非接着性物質の前駆体を被覆させ、非細胞接着層を形成した。この時、蒸着源の温度は３６０℃から４５０℃とし、１０−３Ｐａの真空度で３０秒間蒸着した。
次いで、フォトレジスト上の非細胞接着層を、該非細胞接着層で被覆されているフォトレジストと共にアセトンを使用して除去することで、細胞配置部及び細胞連結部を形成した。細胞配置部の直径Ｄ’は３０μｍ、細胞連結部の幅Ｗ’は０．７５μｍ、連結距離Ｓ’は１００μｍであった。
次いで、厚さが０．７ｍｍのガラス板からなり、高さが２．５ｍｍであり、平面視にて中空部が直径３ｍｍの円形である丸筒状の隔壁を、絶縁膜上の所定領域に接着して固定することで、本発明のデバイスを得た。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、細胞機能の研究、細胞を用いるバイオアッセイや物質生産などの分野に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の第一の実施形態に係るデバイスを例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は斜視図である。
【図２】本発明の第一の実施形態に係るデバイス上の微小電極配置部を拡大して例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）の一部をさらに拡大して例示する平面図である。
【図３】図２（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における縦断面図である。
【図４】本発明の第二の実施形態に係るデバイスを例示する平面図である。
【図５】本発明の第二の実施形態に係るデバイス上の微小電極配置部を拡大して例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）の一部をさらに拡大して例示する平面図である。
【図６】図５（ａ）のＩＶ−ＩＶ線における縦断面図である。
【図７】本発明の第一の実施形態に係るデバイスの製造工程を例示する図であり、（ａ）は微小電極配置部の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線における縦断面図である。
【図８】本発明の第一の実施形態に係るデバイスの製造工程を例示する図であり、（ａ）は微小電極配置部の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における縦断面図である。
【図９】本発明の第一の実施形態に係るデバイスの製造工程を例示する図であり、（ａ）は微小電極配置部の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における縦断面図である。
【図１０】本発明の第一の実施形態に係るデバイスの製造工程の他の例を示す図であり、（ａ）は微小電極配置部の平面図、（ｂ）は（ａ）のＶ−Ｖ線における縦断面図である。
【図１１】実施例１における微小電極配置部中の細胞の配置状態を模式的に示す平面図である。
【図１２】実施例１における細胞の活動電位の測定結果であり、（ａ）はエピネフリン添加前の測定結果、（ｂ）はエピネフリン添加後の測定結果である。
【符号の説明】
【００９３】
１，２・・・微小電極アレイデバイス、１１・・・絶縁基板、１７，２７・・・微小電極、１８，２８・・・配線、１５・・・絶縁膜、１９・・・非細胞接着層、１０，２０・・・非積層領域、１０ａ，２０ａ・・・細胞配置部、１０ｂ，２０ｂ・・・細胞連結部、９・・・感光性樹脂、１４，２４・・・微小電極配置部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞電位を計測するための微小電極アレイデバイス、その製造方法及び該デバイスを用いたバイオアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノム計画の発展や生体分子の構造解析学の進展に伴い、分子生化学的に生命現象を理解し、産業に応用しようとする動きが活発化している。その一方で、よりｉｎ ｖｉｖｏに近い生体情報を取得するために、細胞を使用したバイオアッセイ法が注目されている。このような細胞を使用した解析により、細胞の機能、細胞間の相互作用、細胞と化学物質との相互作用等に関する情報を取得でき、例えば、生命現象、有用物質の生産、物質の生理活性や毒性等に関する新たな知見が得られる。
【０００３】
細胞の解析方法としては、例えば、細胞表面に存在するタンパク質や糖鎖を蛍光標識抗体で修飾したり、解析対象の物質に特異的に結合する蛍光標識プローブを細胞内に導入することで得られる蛍光像を解析する方法、蛍光試薬等の指示薬を細胞内に導入して、細胞内のカルシウムやｐＨを計測する方法が挙げられる。しかしこれらの方法では、標識物質や指示薬によって、細胞が刺激や損傷を受けて少なからずダメージを受けることがあり、精度良く解析できないことがある。そこで、非侵襲的に細胞を解析する技術として、生命活動に伴い活動電位が変化する神経細胞、心筋細胞、筋肉細胞等の細胞を微小電極上で培養し、その時の活動電位の変化を計測する方法が提案されている（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１参照）。細胞の活動電位の変化は、細胞膜内外におけるイオン濃度の変化により生じるものであり、電極を使用して細胞近傍のイオン濃度の変化をイオン電流として電位測定することで計測でき、これにより細胞活動を検出できる。
【０００４】
一方、上記のような解析方法をはじめとする従来の方法では、複数細胞からなる細胞群を解析対象とし、解析して得られたデータの平均値をあたかも一細胞毎の特性であるかのように扱ってきた。しかし実際には、細胞群の中で細胞周期やサーカディアンリズム（概日リズム）が同調している事はまれであり、細胞毎に異なった周期で遺伝子及びタンパク質を発現している。このため、得られた解析結果には、細胞群を扱うが故の揺らぎの問題が付きまとい、高精度な解析結果が得られない。そこで、このような問題点を解決するために、同調培養等の手法が開発され利用されているが、常時同一ステージの細胞を供給し続けなければならないという問題点があった。そこで、このような問題点を解決するために、複数個の細胞を一つずつ個別に培養すると共に、各細胞のネットワークを形成して細胞群とし、その中の細胞について一細胞毎に情報を取得することで、より精度の高い解析を行おうとする動きが活発化してきている。
上記したように、細胞を恣意的に配置してネットワークを形成するための手法も提案されている。例えば、高さが１０μｍ以上である障壁を有する空間内で細胞を培養することで、細胞の伸長や移動を制御する技術が開示されている（例えば、非特許文献２参照）。また、ラミリン等の細胞接着性物質でパターンを形成すると、神経細胞の突起がそのパターンに沿って伸長することが報告されており（非特許文献３参照）、これらの手段を併用することで、細胞を所定の空間内に配置してネットワークを構築することが可能となる。
【特許文献１】特開平６−０７８８８９号公報
【特許文献２】特開平１１−１８７８６５号公報
【非特許文献１】Ｊｉｍｂｏ Ｙ．，Ｔａｔｅｎｏ Ｔ.，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｈ.Ｐ.Ｃ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ７６，６７０−６７８（１９９９）
【非特許文献２】Ｓｔｏｐａｋ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，９０，３８３−３９８（１９８２）
【非特許文献３】Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ Ｐ．Ｃ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，６６，１８３−１９６（１９７５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような、細胞を微小電極上で培養し、その時の活動電位の変化を計測する手法は、細胞を長期間継続して解析する手法として有用である。しかし、従来提案されている手法では、微小電極アレー基板を使用して、組織断片又は培養細胞を計測対象とし、上記のように複数細胞に関する平均的なデータを取得して解析していたので、高精度に解析できないという問題点があった。例えば、薬剤や電気的刺激に対する応答をより高精度に解析するためには、一細胞毎に情報を解析することが必要である。しかし、一細胞を単独で培養して情報を解析しても、解析結果に細胞間の相互作用による影響が反映されず、細胞群からなる組織としての機能を正確に解析できない。
したがって、細胞を使用して解析を高精度に行うためには、細胞同士が相互作用している細胞群を構築し、該細胞群中の細胞を一細胞毎に解析する手法が必要とされる。そこで、このような解析を可能とする新規なデバイスの開発が強く望まれている。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、細胞群中の細胞について一細胞毎に電位を計測できる微小電極アレイデバイス、その製造方法及び該デバイスを用いたバイオアッセイ法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は細胞電位を計測するための微小電極アレイデバイスであって、
絶縁基板上に微小電極と、該微小電極の配線と、前記微小電極を露出させるように該絶縁基板上を被覆する絶縁膜とを備え、前記絶縁膜上の所定領域にはさらに非細胞接着層が設けられると共に、該非細胞接着層が設けられず、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とが露出された絶縁基板上の領域が細胞配置部とされていることを特徴とする微小電極アレイデバイスである。
請求項２に記載の発明は、前記微小電極及び／又は非細胞接着層が光透過性を有する材質からなることを特徴とする請求項１に記載の微小電極アレイデバイスである。
請求項３に記載の発明は、複数個の前記細胞配置部が、前記非細胞接着層が設けられず前記絶縁膜が露出されてなる細胞連結部により連結されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の微小電極アレイデバイスである。
請求項４に記載の発明は、前記非細胞接着層が、パーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を有する化合物を前記絶縁膜上に結合させて形成されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスである。
請求項５に記載の発明は、前記化合物が、下記一般式（１）又は（２）で表されることを特徴とする請求項４に記載の微小電極アレイデバイスである。
【０００８】
【化１】
【０００９】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；Ｙは式「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−」で表される基又はカルボニル基であり、複数のＹは互いに同一でも異なっていても良く；Ｚは、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良いアルキル基又はアルキルオキシアルキル基に、一つの水素原子が置換されたエチレンオキシ基であり、複数のＺは互いに同一でも異なっていても良く；ｊ及びｋはそれぞれ独立して０又は１であり、複数のｊ又はｋは互いに同一でも異なっていても良く；ｌ及びｍはそれぞれ独立して０以上の整数であり、複数のｌ又はｍは互いに同一でも異なっていても良く；ｌが２以上の整数である場合にはｌ個のＺは互いに同一でも異なっていても良い。）
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
請求項６に記載の発明は、前記一般式（１）又は（２）で表される化合物が、下記一般式（３）又は（４）で表されることを特徴とする請求項５に記載の微小電極アレイデバイスである。
【００１２】
【化３】
【００１３】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；ｍは０以上の整数であり、複数のｍは互いに同一でも異なっていても良い。）
【００１４】
【化４】
【００１５】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
請求項７に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法であって、絶縁基板上に微小電極及び該微小電極の配線を形成する工程と、前記微小電極を露出させるように前記絶縁基板上に絶縁膜をパターニングする工程と、前記絶縁基板上の絶縁膜がパターニングされた面を非細胞接着層で被覆する工程と、前記非細胞接着層上に感光性樹脂をパターニングし、該感光性樹脂をマスクとしてエッチングにより前記非細胞接着層の所定部位を除去し、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを露出させて細胞配置部を形成し、次いで前記感光性樹脂を除去する工程と、を有することを特徴とする微小電極アレイデバイスの製造方法である。
請求項８に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法であって、絶縁基板上に微小電極及び該微小電極の配線を形成する工程と、前記微小電極を露出させるように前記絶縁基板上に絶縁膜をパターニングする工程と、前記絶縁基板上の絶縁膜がパターニングされた面において、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを被覆するように感光性樹脂をパターニングする工程と、前記絶縁基板上の感光性樹脂がパターニングされた面を非細胞接着層で被覆する工程と、前記感光性樹脂上の非細胞接着層を、該非細胞接着層で被覆されている感光性樹脂と共に除去して、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを露出させて細胞配置部を形成する工程と、を有することを特徴とする微小電極アレイデバイスの製造方法である。
請求項９に記載の発明は、前記細胞配置部と共に、さらに、該細胞配置部同士を連結する所定領域において絶縁膜が露出されてなる細胞連結部を形成するように、前記感光性樹脂をパターニングすることを特徴とする請求項７又は８に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法である。
請求項１０に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスを用いたバイオアッセイ法であって、前記微小電極アレイデバイス上の細胞配置部に計測対象の細胞を配置し、微小電極により該細胞の電位を計測する工程を有することを特徴とするバイオアッセイ法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、細胞群中の細胞について一細胞毎に電位を計測できる。これにより、細胞を非侵襲的に高精度に解析でき、例えば、種々の化学物質を使用したバイオアッセイにも適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜微小電極アレイデバイス＞
本発明の微小電極アレイデバイス（以下、デバイスと略記することがある）は、細胞電位を計測するための微小電極アレイデバイスであって、絶縁基板上に微小電極と、該微小電極の配線と、前記微小電極を露出させるように該絶縁基板上を被覆する絶縁膜とを備え、前記絶縁膜上の所定領域にはさらに非細胞接着層が設けられると共に、該非細胞接着層が設けられず、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とが露出された絶縁基板上の領域が細胞配置部とされていることを特徴とする。
本発明において計測対象の細胞は、目的に応じて適宜選択でき特に限定されない。そして、培養によって増殖可能なものも好適である。なかでも動物細胞が好ましく、特に好ましいものとして具体的には、神経芽細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞等が例示できる。また、分化可能な細胞、例えば胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｉＰＳ細胞）を使用しても良い。
【００１８】
（第一の実施形態）
図１は、本発明の第一の実施形態に係るデバイスを例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は斜視図である。
絶縁基板１１上には、電極１２がパターニングされている。電極１２は、デバイス１と計測器（図示略）との電気的な接点となる第一の接続部１２ａと、参照電極１３又は細胞計測用の微小電極と前記第一の接続部１２ａとを電気的に接続する第二の接続部１２ｂとからなる。微小電極は、後記するように微小電極配置部１４中に複数個が配置されている。
そして、前記電極１２の第二の接続部１２ｂを被覆するように、絶縁基板１１上には、絶縁膜１５が設けられ、さらに該絶縁膜１５上において、前記参照電極１３及び微小電極配置部１４を包囲するように、隔壁１６が立設されている。
【００１９】
絶縁基板１１の材質は、公知のものから適宜選択すれば良い。なかでも透明なものが好ましく、具体的には、ガラス、樹脂等が例示でき、ガラスが特に好ましい。
絶縁基板１１の厚さ及び上面の大きさは、目的に応じて適宜選定すれば良い。例えば厚さであれば、通常、０．１〜１０ｍｍであることが好ましく、０．３〜１．５ｍｍであることがより好ましい。このような範囲であれば、絶縁基板１１の加工性やデバイス１の使用性に特に優れたものとなる。
【００２０】
電極１２の材質も、公知のものから適宜選択すれば良い。例えば、電極に通常使用される材質として、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、クロム（Ｃｒ）、白金（Ｐｔ）、白金黒（ＰＴ−Ｃ）が例示できる。ただし本発明においては、光透過性を有する材質が好ましい。ここで「光透過性を有する」とは、「少なくとも可視光に対して透過性を有する」ことを指し、透明ガラスや二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）と同等の透明度であることが好ましい。光透過性を有する材質からなる電極を使用することで、顕微鏡等を使用して計測対象の細胞を光学的に解析する際に、効果的にノイズを低減でき、より高感度に解析できる。特に、顕微鏡観察下でレーザを照射し、通常光ピンセットと呼ばれる技術を適用したり、細胞に光刺激を与えて解析するのに好適である。このような好ましい材質として具体的には、スズドープ酸化インジウム（以下、ＩＴＯと略記する）、銀ドープＩＴＯ、酸化インジウム・酸化亜鉛、酸化インジウム・酸化チタン、アルミニウムドープ酸化亜鉛、ガリウムドープ酸化亜鉛、カドミウムドープ酸化亜鉛、アンチモンドープ酸化スズ、フッ素ドープ酸化スズ、ニオブドープ酸化チタンが例示できる。
また、電極１２の屈折率は、透明ガラスや二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）と同等であることが好ましく、１．４〜１．６であることが好ましい。電極１２がこのような好ましい物性を有することで、細胞をより高感度に光学的に解析できる。
【００２１】
電極１２のうち第一の接続部１２ａは帯状であり、計測器との接続部である。その幅はデバイスの大きさを考慮して設定することが好ましく、通常は、０．１〜２．０ｍｍであることが好ましい。また、第二の接続部１２ｂは屈曲部を有し、微小電極配置部１４へ向けて幅が減じる部位を有する帯状である。その幅は特に限定されないが、通常は、第一の接続部１２ａの幅以下であることが好ましい。
ここでは、第一の接続部１２ａ及び第二の接続部１２ｂとして帯状のものを例示しているが、これに限定されず他の形状でも良い。ただし、細長形状であることが好ましい。
また、電極１２は、後記する微小電極と同様の厚さであることが好ましい。
【００２２】
参照電極１３は、電極１２と同様の材質からなるもので良い。
そして、参照電極１３は、略正方形状であり、後記する微小電極よりも十分大きいことが好ましく、通常は、１．０×１０−８〜１．０×１０−６ｍ２であることが好ましく、１．０×１０−８〜２．５×１０−７ｍ２であることがより好ましい。
ここでは、参照電極１３として略正方形状のものを例示しているが、これに限定されず他の形状でも良い。
また、参照電極１３は、後記する微小電極と同様の厚さであることが好ましい。
ここでは、参照電極を四つ有する例を示しているが、参照電極の数は微小電極の数等に応じて適宜調整すれば良い。
【００２３】
絶縁膜１５の材質は、公知のものから適宜選択すれば良い。好ましいものとしては、各種樹脂類及び酸化ケイ素が例示できる。前記樹脂として好ましいものとしては、フォトレジスト等の感光性樹脂が例示できる。
絶縁膜１５の上面の大きさは、絶縁基板１１の大きさに応じて適宜設定すれば良い。絶縁膜１５の厚さは、電気的に確実に絶縁できるだけでなく、細胞配置部に配置された細胞にストレスを与えない厚さ、具体的には、細胞の高さに対して同等以下の厚さであることが好ましい。このような観点から、絶縁膜１５の厚さは、０．１〜３０μｍであることが好ましく、０．５〜５μｍであることがより好ましい。
【００２４】
隔壁１６は、後記するように、デバイス１の参照電極１３及び微小電極配置部１４を含む所定領域上に細胞培養液を保持するためのものである。保持した細胞培養液を供給することで、計測対象の細胞を生存させることができる。細胞培養液は、計測対象の細胞の種類に応じて適宜選択すれば良い。
隔壁１６は、平面視にて中空部が略正方形の角筒状である。
また、隔壁１６の材質は、保持した細胞培養液に対して安定なものが好ましく、電極１２の場合と同様の理由により、光透過性を有する材質が好ましい。特に好ましいものとしてガラスが例示できる。
隔壁１６で包囲される包囲面の大きさは、参照電極１３及び微小電極配置部１４の配置形態によって、適宜調整することが好ましい。隔壁１６の高さは、保持する細胞培養液の液量に応じて適宜調整すれば良く、特に限定されない。
隔壁１６は、ここに例示するように、絶縁基板１１と同心状に配置されていることが好ましい。
隔壁１６は、ここでは角筒状のものを例示しているが、これに限定されず、丸筒状等他の形状でも良く、適宜選択できる。
【００２５】
微小電極配置部１４は、計測対象の細胞を配置する細胞配置部及び配置した細胞の電位を計測する微小電極を備える。微小電極配置部１４は、デバイス１の電極１２が設けられている面上に配置されており、ここに例示するように、絶縁基板１１と同心状に配置されていることが好ましい。
【００２６】
図２は、微小電極配置部１４を拡大して例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）の一部をさらに拡大して例示する平面図である。
微小電極配置部１４においては、略正方形状である複数個の微小電極１７が配置されている。そして、これら複数個の微小電極１７が露出するように、絶縁基板１１上には絶縁膜１５が被覆されている。さらに絶縁膜１５上には、露出された前記微小電極１７と、該微小電極１７近傍でこれを包囲する所定領域とからなる略円形状領域、及びこれら略円形状領域を連結する帯状領域からなる非積層領域１０を除いて、非細胞接着層１９が設けられている。前記略円形状領域は、計測対象の細胞を配置する細胞配置部１０ａであり、微小電極１７及び絶縁膜１５が露出されている。また、隣接する細胞配置部１０ａ同士を連結する帯状領域は、配置された細胞同士を連結させる細胞連結部１０ｂであり、絶縁膜１５が露出されている。
【００２７】
非細胞接着層１９は、非細胞接着性を有する物質（以下、非接着性物質と略記する）を含み、その露出面（以下、非接着面と略記する）において、培養時及び非培養時のいずれにおいても細胞の接着を阻害するものである。そして、非細胞接着層１９は、非接着性物質の前駆体を前記絶縁膜上に結合させることで形成できる。すなわち、非接着性物質の前駆体とは、絶縁膜への結合能を有する官能基を含む物質である。
非細胞接着層１９として、具体的には、撥液性を有するものが例示できる。ここで言う「撥液」とは、「撥水」又は「撥油」を指す。
【００２８】
前記非接着面は、水の接触角が１００°以上である撥水性を有することが好ましく、ヘキサデカンの接触角が３０°以上である撥油性を有することが好ましい。撥水性及び撥油性の大きさは、非接着性物質の前駆体の種類により調整できる。
このように、非接着面が撥液性を有することにより、非接着面においては生体物質の吸着が抑制されるので、細胞が吸着する際の足場が形成されない。その結果、計測対象の細胞がデバイス１中の細胞配置部１０ａに選択的に吸着され、固定される。
【００２９】
また、非細胞接着層１９は、電極１２の場合と同様の理由により、光透過性を有するものが好ましい。非細胞接着層１９を光透過性とするためには、非接着性物質等の含有成分を、光透過性を有するものとすれば良い。
【００３０】
なかでも非細胞接着層１９としては、撥液性及び光透過性を有する材質からなるものが好ましい。
そして、このような非細胞接着層１９として、より具体的には、前記非接着性物質として撥液性及び光透過性を有するフッ素含有化合物を含むものが例示できる。
【００３１】
前記フッ素含有化合物の前駆体としては、パーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を分子の一端に有する化合物が好ましく、より好ましいものとして、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物（以下、それぞれ化合物（１）、化合物（２）と略記する）が例示できる。
【００３２】
【化５】
【００３３】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；Ｙは式「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−」で表される基又はカルボニル基であり、複数のＹは互いに同一でも異なっていても良く；Ｚは、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良いアルキル基又はアルキルオキシアルキル基に、一つの水素原子が置換されたエチレンオキシ基であり、複数のＺは互いに同一でも異なっていても良く；ｊ及びｋはそれぞれ独立して０又は１であり、複数のｊ又はｋは互いに同一でも異なっていても良く；ｌ及びｍはそれぞれ独立して０以上の整数であり、複数のｌ又はｍは互いに同一でも異なっていても良く；ｌが２以上の整数である場合にはｌ個のＺは互いに同一でも異なっていても良い。）
【００３４】
【化６】
【００３５】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
【００３６】
Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基である。ここで「パーフルオロアルキル基」とは、「アルキル基の水素原子がすべてフッ素原子に置換されたもの」を指す。また、「パーフルオロアルキルエーテル基」とは、「前記パーフルオロアルキル基が酸素原子に結合した一価の基」を指す。
Ｒ１における前記アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシルが例示できる。
Ｒ１の炭素数は、３〜１２であることが好ましく、６〜１０であることがより好ましい。
また、Ｒ１は直鎖状であることが好ましく、パーフルオロアルキル基であることが好ましい。
【００３７】
Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表す。具体的には、前記Ｒ１から一つのフッ素原子を除いた二価の基が例示できる。Ｒ１’の炭素数が２以上である場合には、前記Ｒ１の「Ｚ」に結合している炭素原子とは反対側の末端の炭素原子に結合しているフッ素原子を一つ除いた二価の基が好ましい。
【００３８】
Ｒ２は前記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかである。そして、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く、例えば、化合物（２）における両分子末端のＲ２は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＲ２と化合物（２）におけるＲ２とは互いに同一でも異なっていても良い。
【００３９】
Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表す。
Ｒ３の水酸基に置換可能な原子としては、好ましいものとしてフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられ、なかでも塩素原子が特に好ましい。
また、水酸基に置換可能な基としては、好ましいものとして、炭素数が１〜６のアルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基及びアシルオキシ基が挙げられる。
炭素数が１〜６のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペントキシ基及びヘキシルオキシ基が例示できる。
アリールオキシ基としては、フェノキシ基及びナフトキシ基が例示できる。
アラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基及びフェネチルオキシ基が例示できる。
アシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基、バレリルオキシ基、ピバロイルオキシ基及びベンゾイルオキシ基が例示できる。
これらのなかでもＲ３としては、塩素原子、メトキシ基及びエトキシ基がより好ましく、塩素原子が特に好ましい。
【００４０】
Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表す。
Ｒ４の１価の炭化水素基は特に限定されず、鎖状構造及び環状構造のいずれでも良く、飽和及び不飽和のいずれでも良い。鎖状構造の場合には、直鎖状及び分岐鎖状のいずれでも良く、環状構造である場合には、単環構造及び多環構造のいずれでも良い。
なかでも、好ましいものとして、炭素数が１〜６のアルキル基、アリール基及びアラルキル基が挙げられる。
炭素数が１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基及びヘキシル基が例示できる。
アリール基としては、フェニル基及びナフチル基が例示できる。
アラルキル基としては、ベンジル基及びフェネチル基が例示できる。
これらのなかでもＲ４としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基及びイソプロピル基がより好ましく、メチル基が特に好ましい。
【００４１】
Ｙは式「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−」で表される基又はカルボニル基である。すなわち、隣り合うメチレン基及び酸素原子とは、以下のように結合する。
「−（ＣＨ２）ｍ−（ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ））ｊ−（Ｏ）ｋ−」
「−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ（＝Ｏ））ｊ−（Ｏ）ｋ−」
そして、複数のＹは互いに同一でも異なっていても良く、例えば、化合物（２）において「Ｒ１’」を挟んで対峙しているＹ同士は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＹと化合物（２）におけるＹとは互いに同一でも異なっていても良い。
【００４２】
Ｚは、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良いアルキル基又はアルキルオキシアルキル基に、一つの水素原子が置換されたエチレンオキシ基である。前記エチレンオキシ基の末端の酸素原子が隣り合うＲ１に結合する。
前記エチレンオキシ基の置換されていても良い水素原子の数は、一つであることが好ましい。また、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良い前記アルキル基又はアルキルオキシアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であることが好ましく、直鎖状であることがより好ましい。そして、炭素数は１〜１６であることが好ましい。
そして、複数のＺは互いに同一でも異なっていても良く、例えば、化合物（２）において「Ｒ１’」を挟んで対峙しているＺ同士は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＺと化合物（２）におけるＺとは互いに同一でも異なっていても良い。
【００４３】
ｊ及びｋはそれぞれ独立して０又は１であり、０であることが特に好ましい。また、複数のｊ又はｋは互いに同一でも異なっていても良い。例えば、化合物（２）において「Ｒ１’」を挟んで対峙しているＹにかかるｊ同士は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＹにかかるｊと化合物（２）におけるＹにかかるｊとは互いに同一でも異なっていても良い。ｋについても同様である。
【００４４】
ｌ及びｍはそれぞれ独立して０以上の整数である。
そして、ｌは０であることが特に好ましい。
ｍは０〜３であることが好ましく、１又は２であることがより好ましく、２であることが特に好ましい。
また、複数のｌ又はｍは互いに同一でも異なっていても良い。例えば、化合物（２）において「Ｒ１’」を挟んで対峙しているＺにかかるｌ同士は互いに同一でも異なっていても良いし、化合物（１）におけるＺにかかるｌと化合物（２）におけるＺにかかるｌとは互いに同一でも異なっていても良い。ｍについても同様である。
さらに、ｌが２以上の整数である場合には、ｌ個のＺは互いに同一でも異なっていても良い。
【００４５】
ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合には、ｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く、ｎが１である場合には、２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。
【００４６】
化合物（１）又は（２）としては、より好ましいものとして、下記一般式（３）又は（４）で表されるものが挙げられる。
【００４７】
【化７】
【００４８】
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、ｍは前記と同様である。）
【００４９】
また、前記一般式（１）又は（２）において、Ｚが「−（ＣＨＲ５−ＣＨＲ６−Ｏ）ｌ’−（ＣＨＲ７−ＣＨＲ８−Ｏ）ｌ’’」で表される化合物も、より好ましいものとして挙げられる。
ここで、Ｒ５及びＲ６の一方は水素原子を表し、他方はメチル基の一つの水素原子が、炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のフルオロアルキル基又はフルオロアルキルエーテル基に置換された基を表す。ここで「フルオロアルキルエーテル基」とは、「前記炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のフルオロアルキル基が酸素原子に結合した一価の基」を指す。
また、Ｒ７及びＲ８の一方は水素原子を表し、他方は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基又はアルキルエーテル基を表す。ここで「アルキルエーテル基」とは、「前記炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基が酸素原子に結合した一価の基」を指す。
【００５０】
ｌ’は、２以上の整数であり、２〜２０であることが好ましく、５〜１０であることがより好ましい。
ｌ’’は、０以上の整数であり、０〜２０であることが好ましく、０であることがより好ましい。
【００５１】
Ｒ５及びＲ６における、メチル基の一つの水素原子が置換された前記フルオロアルキル基としては、ＣＦ３−、ＣＨＦ２−、ＣＣｌＦ２−、Ｃ２Ｆ５−、ＣＨＦ２ＣＦ２−、ＣＣｌＦ２ＣＦ２−、（ＣＦ３）２ＣＦ−、ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２−、（ＣＨＦ２）２ＣＦ−、（ＣＦ３）（ＣＨＦ２）ＣＦ−、（ＣＦ３）２ＣＦＣＦ２ＣＦ２−、（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２ＣＦ２）２−、ＣＦ３（ＣＦ２）３−、ＣＦ３（ＣＦ２）５−、ＣＦ３（ＣＦ２）７−、ＣＦ３（ＣＦ２）９−、ＣＦ３（ＣＦ２）１１−、ＣＦ３（ＣＦ２）１３−、ＣＦ３（ＣＦ２）１５−が例示できる。
そしてＲ５及びＲ６における、メチル基の一つの水素原子が置換された前記フルオロアルキルエーテル基としては、これらフルオロアルキル基が酸素原子に結合した一価の基が例示できる。
【００５２】
Ｒ７及びＲ８における前記アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシルが例示できる。
そしてＲ７及びＲ８における前記アルキルエーテル基としては、これらアルキル基が酸素原子に結合した一価の基が例示できる。
【００５３】
非細胞接着層１９は、上記のように、非接着性物質の前駆体を前記絶縁膜１５上に結合させることで形成できる。非接着性物質の前駆体としては、市販品を使用しても良い。
例えば、絶縁膜１５が水酸基を有する場合には、前記化合物（１）又は（２）として、Ｒ２が前記式（１１）、（１２）又は（１６）等で表される基を有するものを使用することが好ましい。
なかでも、前記式（１６）等で表される有機シリル基を有する化合物（１）又は（２）は、市販品の入手が容易であり好適である。このような市販品としては、例えば、サイトップシリーズ（商標、旭硝子株式会社製）、メガファック（商標、大日本インキ化学工業株式会社製）、ディックガード（商標、大日本インキ化学工業株式会社製）、ＦＰＸ−３０Ｇ（商標、ＪＳＲ株式会社製）、ノベックＥＧＣ−１７２０（商標、住友スリーエム株式会社製）、Ｐａｔｉｎａｌシリーズ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ＷＲ１，ＷＲ２，ＷＲ３）（商標、メルク株式会社製）、オプツールＤＳＸ（商標、ダイキン工業株式会社製）が例示できる。
【００５４】
また、Ｒ２が前記式（１１）、（１２）及び（１６）以外の基、例えば、前記式（１３）、（１４）又は（１５）等で表される基を有するものである場合には、これらの基と反応可能な官能基を有するように絶縁膜を処理しても良い。
例えば、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２，６８６−６９４（２００１）（Ｂｅｎｔｅｒｓ Ｒ． Ｅｔ ａｌ．）に記載の方法によれば、Ｒ２として前記式（１４）で表される基（すなわち、アミノ基）を有する化合物（１）又は（２）を、絶縁膜に結合させることができる。
また、例えば、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン等のアミノ基を有する有機シラン化合物を絶縁膜表面に結合させておけば、Ｒ２として前記式（１３）で表される基（すなわち、カルボキシル基）又は前記式（１５）で表される基（すなわち、エポキシ基）を有する化合物（１）あるいは（２）を、絶縁膜に結合させることができる。前記有機シラン化合物は、入手も容易である。
【００５５】
非細胞接着層１９において、非接着性物質は、少なくとも分子の一部、好ましくは分子の一端が絶縁膜１５上の特定の原子や官能基と結合している一方、撥液性を有する部位がデバイス１の外側へ向けて露出するように配向すると推測される。例えば、非接着性物質の前駆体として前記化合物（１）を使用した場合には、そのＲ２が絶縁膜と結合する一方、Ｒ１がデバイス１の外側へ向けて露出するように配向する。また、前記化合物（２）を使用した場合には、その一つ又は二つのＲ２が絶縁膜と結合する一方、Ｒ１’がデバイス１の外側へ向けて露出するように配向すると推測される。
このように、撥液性を有する部位が配向することで、非細胞接着層１９は細胞に対する非接着性を発現すると推測される。したがって、前記化合物（１）又は（２）のように、パーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を有する化合物を使用することで、デバイス１により高い非接着効果を発現させることが可能となる。
【００５６】
また、前記化合物（１）又は（２）を使用して形成した非細胞接着層１９は、従来のポリテトラフオロエチレンなどを含む層よりも、透明度に優れ、薄い単層薄膜とするのに好適であり、パターニングや除去などの微細加工性に優れる。透明度が優れているので、細胞や細胞に作用する物質を光学的に検出する場合には、ノイズの大幅な低減が可能であり、高感度な解析が可能である。また、微細加工性に優れているので、後記するように絶縁基板１１上に微小サイズの細胞配置部１０ａや細胞連結部１０ｂを多数形成でき、絶縁基板１１上の細胞の配置密度を高くできるので、高い効率で解析できる。
【００５７】
非細胞接着層１９中の非接着性物質は一種でも良いし、二種以上でも良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率等は目的に応じて適宜選択できる。
また、非細胞接着層１９は、本発明の効果を妨げない範囲で、非接着性物質以外の如何なる成分を含んでいても良い。
【００５８】
非細胞接着層１９の厚さは、計測対象の細胞の種類等に応じて適宜調整することが好ましい。通常は、５０００ｎｍ以下であることが好ましく、１０００ｎｍ以下であることがより好ましく、２００ｎｍ以下であることが特に好ましい。特に、化合物（１）を使用して非接着性物質の単分子膜を形成させ、非細胞接着層１９とした場合には、５〜１００ｎｍの厚さのものが好適に得られる。
上記範囲の厚さであれば、非細胞接着層１９は加工性にも優れる。
【００５９】
細胞配置部１０ａは、いずれも直径Ｄの略円形状である。そして、絶縁基板１１上において、互いに直交する二方向に等間隔で合計１６個の細胞配置部１０ａが配置されており、細胞配置部１０ａ一つあたり一つの微小電極１７が配置されている。
一方、細胞連結部１０ｂは、いずれも幅がＷの帯状である。各細胞連結部は、連結対象である各細胞配置部を最短距離で連結するように配置されるのが好ましく、図２においては、連結される細胞配置部の略中心部を結ぶ線に重なるように細胞連結部１０ｂが配置されている。連結距離Ｓは、連結される細胞配置部１０ａ同士の中心間距離に相当する。
すなわち、細胞配置部１０ａは頂点を、細胞連結部１０ｂは辺をそれぞれ構成するように升目状に配置されている。
【００６０】
細胞配置部１０ａの面積は、配置する細胞の種類や数、その他目的に応じて適宜調整すれば良い。例えば、配置する細胞数が細胞配置部一つにつき一つである場合には、細胞配置部の面積は通常、２．０×１０−１１〜４．０×１０−８ｍ２であることが好ましく、１．８×１０−１０〜２．３×１０−８ｍ２であることがより好ましい。このような好ましい面積とするためには、細胞配置部１０ａの直径Ｄをこの面積に対応するように調整すれば良く、好ましくは５〜２２５μｍ、より好ましくは１５〜１５０μｍとすると良い。直径Ｄが小さいほど、基板１上の接着面１３１の数を増やせる点で好ましい。
細胞連結部１０ｂの幅Ｗ及び連結距離Ｓも、配置する細胞の種類や数、その他目的に応じて適宜調整すれば良い。上記と同様に、配置する細胞数が細胞配置部１０ａ一つにつき一つである場合には、通常、幅Ｗは、３０μｍ以下であることが好ましく、８μｍ以下であることがより好ましい。連結距離Ｓは、細胞によって異なるが、通常は直径Ｄに応じて調整することが好ましく、Ｄ＋５〜Ｄ＋３５０μｍであることが好ましく、Ｄ＋２０〜Ｄ＋２５０μｍであることがより好ましい。
【００６１】
ここでは、微小電極配置部１４に１６個の細胞配置部１０ａが配置された例を示しているが、細胞配置部の数は、絶縁基板の大きさや、計測に供する細胞の数等を考慮して、適宜調整すれば良い。そして、細胞配置部の数が多いほど、デバイスを多様な解析に使用できる点で好ましい。
また、細胞配置部として略円形状のものを例示しているが、これに限定されず、多角形状等、他の形状でも良い。
そして、細胞配置部の形状や大きさは、ここに示すように、必ずしもすべて同じである必要性はないが、同じである方がデバイスの作製が容易である点で好ましい。
また、ここでは絶縁基板上において、細胞配置部が互いに直交する二方向に等間隔で配置された例を示しているが、配置方向及び間隔はこれに限定されず、目的に応じて適宜選択できる。
【００６２】
ここでは、細胞連結部として帯状のものを例示しているが、これに限定されず他の形状でも良い。ただし、細長形状のものが好ましい。
また、細胞連結部の数も、細胞配置部の数や、目的に応じて適宜調整すれば良い。
そして、細胞連結部の形状や大きさは、ここに示すように、必ずしもすべて同じである必要性はないが、同じである方がデバイスの作製が容易である点で好ましい。
また、ここでは、細胞配置部は頂点を、細胞連結部は辺をそれぞれ構成するように升目状に配置された例を示しているが、例えば、細胞連結部は升目の辺だけでなく対角線に重なるように配置されていても良く、対角線のみに重なるように配置されていても良いし、これらのいずれでなくても良い。
【００６３】
微小電極１７の材質は、公知のものから適宜選択すれば良く、前記電極１２と同様のものが例示できる。そして、前記電極１２の場合と同様の理由により、光透過性を有する材質が好ましい。
微小電極１７の大きさは、計測対象の細胞の種類に応じて適宜調整することが好ましいが、通常は、電極面の面積が１．０×１０−１１〜５．０×１０−９ｍ２であることが好ましく、３．０×１０−１１〜２．０×１０−９ｍ２であることがより好ましい。微小電極１７の厚さは、５０〜１０００ｎｍであることが好ましく、１００〜４００ｎｍであることがより好ましい。
【００６４】
ここでは、微小電極配置部１４に１６個の微小電極１７が配置された例を示しているが、微小電極の数は、計測に供する細胞の数等を考慮して、適宜調整すれば良い。例えば、微小電極配置部に微小電極が一つだけ設けられたものでも、細胞電位を計測できるが、微小電極が複数個設けられたものであれば、複数個の細胞の電位を同時に計測でき、例えば、細胞群ネットワークにおける特定細胞の機能や、細胞間の相互作用等、種々の解析が可能となる。
また、ここでは、細胞配置部１０ａ一つあたり一つの微小電極１７が配置された例を示しているが、細胞配置部一つ当たりに配置される微小電極の数は複数でも良い。複数配置した場合には、例えば、一細胞あたり複数箇所（例えば、核近傍とそれ以外の部位）の電位を計測して比較することにより、イオンを選択的に細胞内外に透過させるイオンチャネル分子の分布に関する情報が得られるなど、一層高度な解析が可能となる。
また、必ずしもすべての細胞配置部に微小電極が配置されていなくても良く、目的に応じて、適宜選択すれば良い。微小電極が配置されていない細胞配置部を併設した場合には、例えば、細胞電位が変化しない異種細胞を併用した解析や、微小電極の総数を削減したことによる解析装置の負荷軽減に好適である。
【００６５】
一方、微小電極１７として、ここでは略正方形状のものを例示しているが、これに限定されず、その他の多角形状、円形状等、他の形状でも良い。
そして、微小電極の形状は、ここに示すように、必ずしもすべて同じである必要性はないが、同じである方がデバイスの作製が容易である点で好ましい。
微小電極１７は、必ずしも露出された絶縁膜１５で包囲されていなくても良く、例えば、周縁部の一部が非細胞接着層１９に接していても良い。ただし、細胞を細胞配置部により安定して配置できることから、微小電極１７は露出された絶縁膜１５で包囲されていることが好ましい。そして、ここに例示するように、微小電極１７は細胞配置部１０ａと同心状に配置されていることが好ましい。
【００６６】
図３は、図２（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における縦断面図である。
配線１８は帯状であり、前記電極１２のうちの第二の接続部１２ｂと微小電極１７とを電気的に接続するものである。したがって通常は、電極１２、配線１８及び微小電極１７は同数となる。このような構成により、微小電極１７は、デバイス１が接続される外部の計測器（図示略）と電気的に接続される。
配線１８は、後記するデバイスの製造方法における説明のように、微小電極１７と同時に形成することを考慮すると、微小電極１７と同じ厚さとすることが好ましい。
配線１８の幅は、微小電極１７の大きさ等を考慮して適宜調整すれば良いが、通常は、２〜７０μｍであることが好ましく、３〜２０μｍであることがより好ましい。
ここでは、配線として帯状のものを例示しているが、これに限定されず他の形状でも良い。ただし、細長形状のものが好ましい。
【００６７】
計測対象の細胞は、微小電極１７に接触するようにして細胞配置部１０ａに配置する。この時、細胞配置部１０ａ、すなわち絶縁基板１１上の微小電極１７が露出された凹部内に、細胞全体が収容されるようにしても良いし、細胞の一部分が前記凹部内に収容されていなくても良い。細胞全体が前記凹部内に収容されていなくても、細胞全体は、細胞配置部１０ａを包囲する非細胞接着層１９により配置位置が固定されるからである。
【００６８】
本発明においては、非細胞接着層１９及び微小電極１７の少なくとも一方が光透過性を有するものが好ましく、非細胞接着層１９及び微小電極１７が共に光透過性を有するものがより好ましい。
【００６９】
ここまでは、デバイスとして、微小電極の配線がすべて絶縁膜で被覆されているものを例示しているが、例えば、配線の一部が絶縁膜で被覆されずに露出されているものでも良い。ただし、配線の劣化を抑制するために、配線の露出部は少ないほど好ましい。
【００７０】
本発明においては、必ずしも細胞連結部が設けられていなくても良いが、ここで例示するように細胞連結部が設けられていることにより、細胞同士が連結部で互いに容易に結合し、細胞間でネットワークを構築して細胞群を形成するようになる。その結果、細胞群中の細胞について一細胞毎に電位を計測でき、高精度に細胞の機能を解析できる。また、細胞間の相互作用、細胞と化学物質との相互作用等に関する高精度な情報を取得できる。
【００７１】
（第二の実施形態）
図４は、本発明の第二の実施形態に係るデバイスを例示する平面図である。
ここに例示するデバイス２は、細胞配置部及び隔壁の形態が第一の実施形態と異なっており、第一の実施形態と同一の構成要素については同一の符号を付し、その詳細な説明は省略する。
【００７２】
デバイス２においては、微小電極配置部２４中の微小電極の配置形態に応じて、絶縁基板１１上にパターニングされている電極１２及び参照電極１３の数が、第一の実施形態と異なっている。
また、隔壁２６は、平面視にて中空部が略円形の丸筒状であり、その他の点では、第一の実施形態における隔壁１６と同様である。
【００７３】
図５は、微小電極配置部２４を拡大して例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）の平面図の一部をさらに拡大して例示する平面図である。
微小電極配置部２４においては、略円形状である複数個の微小電極２７が配置されている。微小電極２７は、形状が異なる点以外は、第一の実施形態における微小電極１７と同様である。
そして、これら複数個の微小電極２７が露出するように、絶縁基板１１上には絶縁膜１５が被覆されている。さらに、露出された前記微小電極２７と、該微小電極２７近傍でこれを包囲する所定領域とからなる略円形状の細胞配置部２０ａ、及びこれら細胞配置部２０ａを連結する帯状の細胞連結部２０ｂからなる非積層領域２０を除いて、絶縁膜１５上には、非細胞接着層１９が設けられている。
【００７４】
図６は、図５（ａ）のＩＶ−ＩＶ線における縦断面図である。
配線２８は、前記電極１２のうちの第二の接続部１２ｂと微小電極２７とを電気的に接続するものである。したがって通常は、電極１２、配線２８及び微小電極２７は同数となる。このような構成により、微小電極２７は、デバイス１が接続される外部の計測器（図示略）と電気的に接続される。
配線２８は、微小電極２７の配置形態に応じて数が異なる点以外は、第一の実施形態における配線１８と同様である。
【００７５】
細胞配置部２０ａは、いずれも直径Ｄ’の略円形状である。そして、絶縁基板１１上において、互いに直交する二方向に等間隔で合計１０個の細胞配置部２０ａが配置されており、細胞配置部２０ａ一つあたりの微小電極２７の配置数は、０又は１である。
一方、細胞連結部２０ｂは、いずれも幅がＷ’の帯状である。各細胞連結部は、連結対象である各細胞配置部を最短距離で連結するように配置されるのが好ましく、図５においては、連結される細胞配置部の略中心部を結ぶ線に重なるように細胞連結部２０ｂが配置されている。連結距離Ｓ’は、連結される細胞配置部２０ａ同士の中心間距離に相当する。
細胞配置部２０ａの面積は、第一の実施形態における細胞配置部１０ａと同様である。そして、Ｄ’、Ｗ’及びＳ’の大きさも、第一の実施形態におけるＤ、Ｗ及びＳと同様である。
【００７６】
本発明のデバイスは、微小電極配置部において、細胞配置部及び細胞連結部以外は非細胞接着層で被覆されているので、計測対象の細胞をアプライした時に、細胞が細胞配置部以外の領域に付着しても容易に除去できる。そして、細胞配置部に細胞を安定して保持できる。
また、特に前記化合物（１）又は（２）を使用して形成した非細胞接着層は、薄い単層薄膜とするのに好適であり、微細加工性に優れ、細胞配置部及び細胞連結部を従来よりも高精細且つ高精度に形成でき、しかも加工精度が損なわれることが無い。したがって、細胞の配置密度を高くできるので、高い効率で計測できる。さらに、透明度に優れ、細胞や細胞に作用する物質を光学的に検出する場合には、ノイズの大幅な低減が可能である。したがって、解析時のＳ／Ｎ比が従来よりも大幅に向上するので、より高精度に解析できる。
【００７７】
本発明のデバイスを使用することで、細胞群中の細胞について一細胞毎にその機能を高精度に解析でき、その機能を利用する種々の解析や物質生産等も高い効率で行うことができる。一例を挙げれば、異種細胞間のコミュニティーエフェクトを利用して、種々の環境下で細胞が受ける影響を客観的に解析できる。より具体的には、例えば、種々の化学物質を使用してバイオアッセイを行うこともでき、毒性検査試験等にも応用できる。これにより、例えば、医薬品や化学物質の投与が生体に及ぼす影響を、従来は体調の良・不良という主観的な表現で評価していたのに対し、具体的な数値比較により評価できるようになる。
そして、これら解析や物質生産を行う場合には、本発明のデバイスを使用すること以外は、従来のバイオチップやデバイス等を使用する場合と同様の方法を適用すれば良い。
【００７８】
＜微小電極アレイデバイスの製造方法＞
上記本発明のデバイスは、以下のように製造できる。
（製造方法１）
図７〜９は、図１〜３に例示する本発明のデバイスの製造工程を例示する図である。以下においては、特に微小電極配置部１４を図示しながら説明する。
まず、絶縁基板１１の片面全面に、電極１２、参照電極１３、微小電極１７及び配線１８の材質となる材料で成膜した後、パターニングすることで、電極１２、参照電極１３、並びに図７（ａ）及び（ｂ）に示すように微小電極１７及び配線１８をそれぞれ形成する。図７（ａ）は微小電極配置部１４の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線における縦断面図である。成膜方法は公知の方法から適宜選択すれば良いが、スパッタリングが好ましい。成膜後のパターニング方法も公知の方法から適宜選択すれば良いが、ウェットエッチング又はリフトオフ加工が好ましい。
【００７９】
次いで、電極１２のうちの第二の接続部１２ｂ、参照電極１３、微小電極１７及び配線１８が形成された絶縁基板１１上の所定領域に、前記参照電極１３、並びに図８（ａ）及び（ｂ）に示すように微小電極１７がそれぞれ露出するように、絶縁膜１５をパターニングする。図８（ａ）は微小電極配置部１４の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における縦断面図である。絶縁膜１５のパターニング方法は、絶縁膜１５の材質に応じて公知の方法から適宜選択すれば良い。例えば、絶縁膜として感光性樹脂を使用する場合には、フォトリソグラフィーによりパターニングすれば良い。また、絶縁膜として酸化ケイ素膜を使用する場合には、プラズマＣＶＤ法等により酸化ケイ素膜を成膜した後、該酸化ケイ素膜上にフォトレジスト等の感光性樹脂を積層させ、これをフォトリソグラフィーによりパターニングした後、パターニングされた感光性樹脂をマスクとしてエッチングを行うことで、参照電極１３及び微小電極１７が露出するように酸化ケイ素膜をパターニングすれば良い。この時のエッチングはウェットエッチングが好ましい。
【００８０】
次いで、絶縁基板１１上の絶縁膜１５がパターニングされた面、具体的には、絶縁膜１５、参照電極１３及び微小電極１７を、非接着性物質の前駆体で被覆し、非細胞接着層１９を形成する。この時の被覆方法としては、ディップ塗布法、真空蒸着法、ＣＶＤ（化学気相蒸着）法、プラズマ重合法が例示できる。例えば、ディップ塗布法の場合は、非接着性物質の前駆体を含有する被覆処理溶液を調製し、これを塗布して、塗布後は乾燥により前記処理溶液中の溶媒成分を除去することが好ましい。非細胞接着層１９の厚さは、前記前駆体の分子の大きさや使用量で調整できる。
【００８１】
次いで、非細胞接着層１９が形成された絶縁基板１１を洗浄し、乾燥させると良い。洗浄は、メタノールやエタノール等のアルコールを使用しても良いし、被覆処理溶液がフッ素系溶媒を含有する場合には、フッ素系溶媒を使用しても良い。
【００８２】
次いで、非細胞接着層１９上の、参照電極１３、細胞配置部１０ａ及び細胞連結部１０ｂに相当する領域以外の領域をフォトリソグラフィーにより感光性樹脂で被覆し、該樹脂をマスクとして非細胞接着層１９をエッチングする。この時のエッチング方法は如何なる方法でも良いが、ドライエッチングが好ましく、より具体的には、酸素、アルゴン及び塩素からなる群から選択される一種のガスから生成されるプラズマを用いたエッチングが好ましい。また、紫外光又はオゾン照射でエッチングしても良い。
エッチングにより、感光性樹脂でマスクされていない非細胞接着層１９が除去されて、非細胞接着層１９がパターニングされる。その結果、参照電極１３及び微小電極１７が露出され、細胞配置部１０ａ及び細胞連結部１０ｂに相当する領域では、絶縁膜１５が露出される。
【００８３】
次いで、絶縁基板１１上に残っている感光性樹脂をすべて除去することで、参照電極１３が露出し、図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、微小電極配置部１４に非細胞接着層１９がパターニングされ、細胞配置部１０ａ及び細胞連結部１０ｂが形成された絶縁基板１１が得られる。図９（ａ）は微小電極配置部１４の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における縦断面図である。
【００８４】
次いで、絶縁膜１５上の所定領域に、参照電極１３及び微小電極配置部１４を包囲するように、隔壁１６を固定することで、デバイス１が得られる。隔壁１６は、接着剤を使用して固定するのが好ましい。接着剤は、絶縁膜１５及び隔壁１６の材質に応じて、公知のものから適宜選択すれば良い。
【００８５】
（製造方法２）
本発明のデバイスは、以下の方法でも製造できる。
前記製造方法１と同様の方法で、参照電極１３、並びに図８（ａ）及び（ｂ）に示すように微小電極１７がそれぞれ露出するように、絶縁基板１１上の所定領域に絶縁膜１５をパターニングする。
次いで、絶縁基板１１上の絶縁膜１５がパターニングされた面において、参照電極１３、微小電極１７、微小電極１７近傍でこれを包囲する領域の絶縁膜１５、前記微小電極１７を包囲する領域同士を連結する所定領域の絶縁膜１５を、それぞれフォトリソグラフィーにより感光性樹脂９で被覆してパターニングする。ここで、「微小電極１７近傍でこれを包囲する領域」とは、細胞配置部１０ａに相当する領域であり、「微小電極１７を包囲する領域同士を連結する所定領域」とは、細胞連結部１０ｂに相当する領域である。
次いで、絶縁基板１１上の感光性樹脂９がパターニングされた面、具体的には、被覆した感光性樹脂９及び絶縁膜１５を非接着性物質の前駆体で被覆し、図１０（ａ）及び（ｂ）に示すように、非細胞接着層１９を形成する。図１０（ａ）は微小電極配置部１４の平面図、（ｂ）は（ａ）のＶ−Ｖ線における縦断面図である。非接着性物質の前駆体の被覆方法は、製造方法１と同様で良い。
次いで、感光性樹脂９上の非細胞接着層１９を、該非細胞接着層１９で被覆されている感光性樹脂９と共に除去する。これにより、参照電極１３及び微小電極１７が露出され、細胞配置部１０ａ及び細胞連結部１０ｂに相当する領域では、絶縁膜１５が露出される。その結果、製造方法１の場合と同様に、図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、微小電極配置部１４に非細胞接着層１９がパターニングされた絶縁基板１１が得られる。
次いで、製造方法１と同様の方法で、絶縁膜１５上の所定領域に、参照電極１３及び微小電極配置部１４を包囲するように、隔壁１６を固定することで、デバイス１が得られる。
【００８６】
ここでは、図１〜３に例示する、本発明の第一の実施形態に係るデバイス１の製造方法について説明したが、例えば、図４〜６に例示するデバイス２等、他の実施形態に係るデバイスも、同様に製造できることは言うまでもない。例えば、細胞配置部及び／又は細胞連結部を異なる形状で形成したい場合には、非細胞接着層の除去に使用する前記感光性樹脂を所望のものとなるようにパターニングすれば良い。そして、細胞連結部が不要である場合には、参照電極が露出され、且つ細胞配置部だけが形成されるように、前記感光性樹脂をパターニングすれば良い。
【実施例】
【００８７】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
前記製造方法１により、図１〜３に例示するデバイスを作製した。
すなわち、パイレックス（登録商標）（コード７０５９、コーニングインターナショナル株式会社製）のガラス基板（厚さ；０．５ｍｍ）の片面全面に、ＩＴＯを厚さが２００ｎｍとなるようにスパッタリングにより成膜し、さらにウェットエッチングによりパターニングすることで、電極、参照電極、微小電極及び配線を形成した。
電極のうち第一の接続部は幅が０．８ｍｍの帯状とし、第二の接続部は幅が０．８〜０．０１ｍｍの範囲で減じる帯状とした。また、参照電極は一辺が０．２ｍｍの正方形状とした。さらに、微小電極は一辺が１０μｍの正方形状とし、配線は幅が７．５μｍの帯状とした。
次いで、ガラス基板上の所定領域に、絶縁膜としてフォトレジストを厚さが１．２μｍとなるようにフォトリソグラフィーによりパターニングし、該パターニング面、参照電極及び微小電極に、オプツールＤＳＸ（商標、ダイキン工業株式会社製）をディップ塗布した。そして、一晩乾燥させた後、１００℃で１時間加熱し、フッ素系溶媒であるノベックＨＦＥ（商標、住友スリーエム株式会社製）を使用して洗浄することで、非細胞接着層を形成した。
次いで、非細胞接着層上の所定領域をフォトリソグラフィーによりフォトレジストで被覆し、該樹脂をマスクとして非細胞接着層を酸素プラズマで５分間エッチングして、非細胞接着層をパターニングした。
次いで、絶縁基板上のフォトレジストをすべて除去することで、細胞配置部及び細胞連結部を形成した。細胞配置部の直径Ｄは２５μｍ、細胞連結部の幅Ｗは１μｍ、連結距離Ｓは５０μｍであった。なお、非細胞接着層の厚さは１２nmであった。
次いで、厚さが０．７ｍｍのガラス板からなり、高さが２．０ｍｍであり、平面視にて中空部が一辺２．５ｍｍの正方形である角筒状の隔壁を、絶縁膜上の所定領域に接着して固定することで、本発明のデバイスを得た。
【００８８】
このデバイスを使用して、下記手順にしたがって、ラット心筋細胞の活動電位を計測した。
まず、濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるようにＣｅｌｌ Ｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ（新田ゼラチン社製）をｐＨ３の希塩酸水溶液に溶解させて得たコラーゲン溶液を、培養液として隔壁内にアプライし、１０分間静置後、ｐＨ３の希塩酸水溶液で洗浄した。
次いで、コラーゲン溶液をアプライした隔壁内に、ラット心筋初代培養細胞（北海道システム・サイエンス株式会社製）をアプライし、赤外レーザによる光ピンセットを使用して、細胞配置部に前記細胞を一つずつ配置して吸着させた。
微小電極及び非細胞接着層が共に透明なので、細胞配置部が明りょうに視認でき、その結果、前記細胞を非細胞接着層上に配置することなく、容易に細胞配置部に配置できた。さらに図１１に示すように、前記細胞同士が連結部で互いに結合し、拍動が同期する様子を確認できた。図１１は、この時の微小電極配置部１４を模式的に示す平面図であり、符号１１０が配置された細胞である。また、図１２は、この時の配置された一つの細胞の活動電位の測定結果である。図１２中、横軸は時間を、縦軸は電位（Ｖ）を示す。図１２（ａ）に示すように、培養液中での前記細胞の拍動に伴う電位変化が、０．４４秒ごとに確認された。次に、心筋の拍動を速くする薬理効果を有することが知られているエピネフリンを隔壁内の培養液中へ添加したところ、図１２（ｂ）に示すように、電位変化が０．２０秒ごとに見られるようになり、心筋の拍動が速くなっていることが確かに確認された。
以上により、細胞の活動電位を単一細胞ごとに高精度に計測できることが確認された。
【００８９】
（実施例２）
オプツールＤＳＸ（商標、ダイキン工業株式会社製）の代わりに、濃度が０．０２ｍｏｌ／ＬであるＣＦ３−（ＣＦ２）７−（ＣＨ２）２−ＳｉＣｌ３のノベックＨＦＥ（商標、住友スリーエム株式会社製）溶液を使用したこと以外は、実施例１と同様の方法でデバイスを得た。
得られたデバイスを使用して、実施例１と同様の方法でラット心筋初代培養細胞の活動電位を計測したところ、実施例１と同様の結果が得られた。
【００９０】
（実施例３）
前記製造方法２により、図４〜６に例示するデバイスを作製した。
すなわち、パイレックス（登録商標）（コード７０５９、コーニングインターナショナル株式会社製）のガラス基板（厚さ；０．５ｍｍ）の片面全面に、クロム薄膜をスパッタリングによって１００ｎｍの厚さで成膜し、該クロム薄膜上にさらに、プラチナ薄膜をスパッタリングによって２００ｎｍの厚さで成膜して、リフトオフ加工によりパターニングすることで、電極、参照電極、微小電極及び配線を形成した。
電極のうち第一の接続部は幅が１ｍｍの帯状とし、第二の接続部は幅が１〜０．０１５ｍｍの範囲で減じる帯状とした。また、参照電極は一辺が０．３ｍｍの正方形状とした。さらに、微小電極は一辺が３０μｍの正方形状とし、配線は幅が１５μｍの帯状とした。
次いで、得られた絶縁基板上にプラズマＣＶＤ法により、テトラエトキシシランを蒸着源として二酸化ケイ素膜を５００ｎｍの厚さで成膜し、該二酸化ケイ素膜上にフォトリソグラフィーによりフォトレジストをパターニングした後、これをマスクとしてフッ化水素酸によりウェットエッチングを行うことで、参照電極及び微小電極が露出するように酸化ケイ素膜をパターニングした。
次いで、絶縁基板上の所定領域をフォトリソグラフィーによりフォトレジストで被覆し、さらに、被覆したフォトレジスト及び絶縁膜上に、ＷＲ１ Ｐａｒｔｉｎａｌ（商品名、メルク株式会社製）を蒸着源とした真空蒸着法にて、非接着性物質の前駆体を被覆させ、非細胞接着層を形成した。この時、蒸着源の温度は３６０℃から４５０℃とし、１０−３Ｐａの真空度で３０秒間蒸着した。
次いで、フォトレジスト上の非細胞接着層を、該非細胞接着層で被覆されているフォトレジストと共にアセトンを使用して除去することで、細胞配置部及び細胞連結部を形成した。細胞配置部の直径Ｄ’は３０μｍ、細胞連結部の幅Ｗ’は０．７５μｍ、連結距離Ｓ’は１００μｍであった。
次いで、厚さが０．７ｍｍのガラス板からなり、高さが２．５ｍｍであり、平面視にて中空部が直径３ｍｍの円形である丸筒状の隔壁を、絶縁膜上の所定領域に接着して固定することで、本発明のデバイスを得た。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、細胞機能の研究、細胞を用いるバイオアッセイや物質生産などの分野に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の第一の実施形態に係るデバイスを例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は斜視図である。
【図２】本発明の第一の実施形態に係るデバイス上の微小電極配置部を拡大して例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）の一部をさらに拡大して例示する平面図である。
【図３】図２（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における縦断面図である。
【図４】本発明の第二の実施形態に係るデバイスを例示する平面図である。
【図５】本発明の第二の実施形態に係るデバイス上の微小電極配置部を拡大して例示する図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）の一部をさらに拡大して例示する平面図である。
【図６】図５（ａ）のＩＶ−ＩＶ線における縦断面図である。
【図７】本発明の第一の実施形態に係るデバイスの製造工程を例示する図であり、（ａ）は微小電極配置部の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線における縦断面図である。
【図８】本発明の第一の実施形態に係るデバイスの製造工程を例示する図であり、（ａ）は微小電極配置部の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における縦断面図である。
【図９】本発明の第一の実施形態に係るデバイスの製造工程を例示する図であり、（ａ）は微小電極配置部の平面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における縦断面図である。
【図１０】本発明の第一の実施形態に係るデバイスの製造工程の他の例を示す図であり、（ａ）は微小電極配置部の平面図、（ｂ）は（ａ）のＶ−Ｖ線における縦断面図である。
【図１１】実施例１における微小電極配置部中の細胞の配置状態を模式的に示す平面図である。
【図１２】実施例１における細胞の活動電位の測定結果であり、（ａ）はエピネフリン添加前の測定結果、（ｂ）はエピネフリン添加後の測定結果である。
【符号の説明】
【００９３】
１，２・・・微小電極アレイデバイス、１１・・・絶縁基板、１７，２７・・・微小電極、１８，２８・・・配線、１５・・・絶縁膜、１９・・・非細胞接着層、１０，２０・・・非積層領域、１０ａ，２０ａ・・・細胞配置部、１０ｂ，２０ｂ・・・細胞連結部、９・・・感光性樹脂、１４，２４・・・微小電極配置部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞電位を計測するための微小電極アレイデバイスであって、
絶縁基板上に微小電極と、該微小電極の配線と、前記微小電極を露出させるように該絶縁基板上を被覆する絶縁膜とを備え、
前記絶縁膜上の所定領域にはさらに非細胞接着層が設けられると共に、該非細胞接着層が設けられず、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とが露出された絶縁基板上の領域が細胞配置部とされていることを特徴とする微小電極アレイデバイス。
【請求項２】
前記微小電極及び／又は非細胞接着層が光透過性を有する材質からなることを特徴とする請求項１に記載の微小電極アレイデバイス。
【請求項３】
複数個の前記細胞配置部が、前記非細胞接着層が設けられず前記絶縁膜が露出されてなる細胞連結部により連結されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の微小電極アレイデバイス。
【請求項４】
前記非細胞接着層が、パーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を有する化合物を前記絶縁膜上に結合させて形成されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイス。
【請求項５】
前記化合物が、下記一般式（１）又は（２）で表されることを特徴とする請求項４に記載の微小電極アレイデバイス。
【化１】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；Ｙは式「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−」で表される基又はカルボニル基であり、複数のＹは互いに同一でも異なっていても良く；Ｚは、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良いアルキル基又はアルキルオキシアルキル基に、一つの水素原子が置換されたエチレンオキシ基であり、複数のＺは互いに同一でも異なっていても良く；ｊ及びｋはそれぞれ独立して０又は１であり、複数のｊ又はｋは互いに同一でも異なっていても良く；ｌ及びｍはそれぞれ独立して０以上の整数であり、複数のｌ又はｍは互いに同一でも異なっていても良く；ｌが２以上の整数である場合にはｌ個のＺは互いに同一でも異なっていても良い。）
【化２】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
【請求項６】
前記一般式（１）又は（２）で表される化合物が、下記一般式（３）又は（４）で表されることを特徴とする請求項５に記載の微小電極アレイデバイス。
【化３】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；ｍは０以上の整数であり、複数のｍは互いに同一でも異なっていても良い。）
【化４】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法であって、
絶縁基板上に微小電極及び該微小電極の配線を形成する工程と、
前記微小電極を露出させるように前記絶縁基板上に絶縁膜をパターニングする工程と、
前記絶縁基板上の絶縁膜がパターニングされた面を非細胞接着層で被覆する工程と、
前記非細胞接着層上に感光性樹脂をパターニングし、該感光性樹脂をマスクとしてエッチングにより前記非細胞接着層の所定部位を除去し、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを露出させて細胞配置部を形成し、次いで前記感光性樹脂を除去する工程と、
を有することを特徴とする微小電極アレイデバイスの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法であって、
絶縁基板上に微小電極及び該微小電極の配線を形成する工程と、
前記微小電極を露出させるように前記絶縁基板上に絶縁膜をパターニングする工程と、
前記絶縁基板上の絶縁膜がパターニングされた面において、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを被覆するように感光性樹脂をパターニングする工程と、
前記絶縁基板上の感光性樹脂がパターニングされた面を非細胞接着層で被覆する工程と、
前記感光性樹脂上の非細胞接着層を、該非細胞接着層で被覆されている感光性樹脂と共に除去して、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを露出させて細胞配置部を形成する工程と、
を有することを特徴とする微小電極アレイデバイスの製造方法。
【請求項９】
前記細胞配置部と共に、さらに、該細胞配置部同士を連結する所定領域において絶縁膜が露出されてなる細胞連結部を形成するように、前記感光性樹脂をパターニングすることを特徴とする請求項７又は８に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスを用いたバイオアッセイ法であって、
前記微小電極アレイデバイス上の細胞配置部に計測対象の細胞を配置し、微小電極により該細胞の電位を計測する工程を有することを特徴とするバイオアッセイ法。
【請求項１】
細胞電位を計測するための微小電極アレイデバイスであって、
絶縁基板上に微小電極と、該微小電極の配線と、前記微小電極を露出させるように該絶縁基板上を被覆する絶縁膜とを備え、
前記絶縁膜上の所定領域にはさらに非細胞接着層が設けられると共に、該非細胞接着層が設けられず、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とが露出された絶縁基板上の領域が細胞配置部とされていることを特徴とする微小電極アレイデバイス。
【請求項２】
前記微小電極及び／又は非細胞接着層が光透過性を有する材質からなることを特徴とする請求項１に記載の微小電極アレイデバイス。
【請求項３】
複数個の前記細胞配置部が、前記非細胞接着層が設けられず前記絶縁膜が露出されてなる細胞連結部により連結されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の微小電極アレイデバイス。
【請求項４】
前記非細胞接着層が、パーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を有する化合物を前記絶縁膜上に結合させて形成されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイス。
【請求項５】
前記化合物が、下記一般式（１）又は（２）で表されることを特徴とする請求項４に記載の微小電極アレイデバイス。
【化１】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；Ｙは式「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−」で表される基又はカルボニル基であり、複数のＹは互いに同一でも異なっていても良く；Ｚは、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されていても良いアルキル基又はアルキルオキシアルキル基に、一つの水素原子が置換されたエチレンオキシ基であり、複数のＺは互いに同一でも異なっていても良く；ｊ及びｋはそれぞれ独立して０又は１であり、複数のｊ又はｋは互いに同一でも異なっていても良く；ｌ及びｍはそれぞれ独立して０以上の整数であり、複数のｌ又はｍは互いに同一でも異なっていても良く；ｌが２以上の整数である場合にはｌ個のＺは互いに同一でも異なっていても良い。）
【化２】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
【請求項６】
前記一般式（１）又は（２）で表される化合物が、下記一般式（３）又は（４）で表されることを特徴とする請求項５に記載の微小電極アレイデバイス。
【化３】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基を表し；Ｒ１’は炭素数１〜１６の直鎖状若しくは分岐鎖状のパーフルオロアルキル基又はパーフルオロアルキルエーテル基から一つのフッ素原子を除いた基を表し；Ｒ２は下記式（１１）〜（１６）で表される基のいずれかであり、複数のＲ２は互いに同一でも異なっていても良く；ｍは０以上の整数であり、複数のｍは互いに同一でも異なっていても良い。）
【化４】
（式中、Ｒ３は水酸基あるいは水酸基に置換可能な原子又は基を表し；Ｒ４は水素原子又は１価の炭化水素基を表し；ｎは１、２又は３であり、ｎが２又は３である場合にはｎ個のＲ３は互いに同一でも異なっていても良く；ｎが１である場合には２個のＲ４は互いに同一でも異なっていても良い。）
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法であって、
絶縁基板上に微小電極及び該微小電極の配線を形成する工程と、
前記微小電極を露出させるように前記絶縁基板上に絶縁膜をパターニングする工程と、
前記絶縁基板上の絶縁膜がパターニングされた面を非細胞接着層で被覆する工程と、
前記非細胞接着層上に感光性樹脂をパターニングし、該感光性樹脂をマスクとしてエッチングにより前記非細胞接着層の所定部位を除去し、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを露出させて細胞配置部を形成し、次いで前記感光性樹脂を除去する工程と、
を有することを特徴とする微小電極アレイデバイスの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法であって、
絶縁基板上に微小電極及び該微小電極の配線を形成する工程と、
前記微小電極を露出させるように前記絶縁基板上に絶縁膜をパターニングする工程と、
前記絶縁基板上の絶縁膜がパターニングされた面において、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを被覆するように感光性樹脂をパターニングする工程と、
前記絶縁基板上の感光性樹脂がパターニングされた面を非細胞接着層で被覆する工程と、
前記感光性樹脂上の非細胞接着層を、該非細胞接着層で被覆されている感光性樹脂と共に除去して、前記微小電極とその近傍の絶縁膜とを露出させて細胞配置部を形成する工程と、
を有することを特徴とする微小電極アレイデバイスの製造方法。
【請求項９】
前記細胞配置部と共に、さらに、該細胞配置部同士を連結する所定領域において絶縁膜が露出されてなる細胞連結部を形成するように、前記感光性樹脂をパターニングすることを特徴とする請求項７又は８に記載の微小電極アレイデバイスの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小電極アレイデバイスを用いたバイオアッセイ法であって、
前記微小電極アレイデバイス上の細胞配置部に計測対象の細胞を配置し、微小電極により該細胞の電位を計測する工程を有することを特徴とするバイオアッセイ法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００９−２８７９３４（Ｐ２００９−２８７９３４Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３７７０５（Ｐ２００８−１３７７０５）
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【出願人】（０００２３１４６４）株式会社アルバック (1,740)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【出願人】（０００２３１４６４）株式会社アルバック (1,740)
【Ｆターム（参考）】
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