微生物検出方法及び装置
【課題】 微生物の検出のために、磁性微粒子を微生物に結合させ、その微生物・磁性微粒子複合体の発光を検出する技術において、簡易な手段によって効率的な検出を行うことができる方法及び装置を提供する。
【解決手段】 光ファイバー３の前端面３１に、微生物と磁性微粒子が結合し、かつ発光酵素又は蛍光色素を標識された微生物・磁性微粒子複合体を磁気的に吸着させるために、光ファイバー前端面３１に磁力を発生させる手段５，７発光酵素又は蛍光色素を発光させる手段、微生物・磁性微粒子複合体から発する光を同一の光ファイバー３を通して集光し、その光を検出する手段８を備える。
【解決手段】 光ファイバー３の前端面３１に、微生物と磁性微粒子が結合し、かつ発光酵素又は蛍光色素を標識された微生物・磁性微粒子複合体を磁気的に吸着させるために、光ファイバー前端面３１に磁力を発生させる手段５，７発光酵素又は蛍光色素を発光させる手段、微生物・磁性微粒子複合体から発する光を同一の光ファイバー３を通して集光し、その光を検出する手段８を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を検出するための方法及びそのための装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物を検出する技術はその重要性を増しており、特に、食品や飲料などにおいて、大腸菌等の各種の細菌を検出することが、食の安全、衛生管理の確保の面から欠くことのできないものである。従来、これらの微生物、特に細菌の検出は平板寒天培地上で生育させたコロニーの検出や各種の顕微鏡を用いた観察によってなされてきた。
近年になって、直径約１ｍｍ以下の磁性微粒子に予め抗体やレクチンのようなタンパクを固定させておき、それらによる微生物表面抗原との特異的な結合を利用して、検出しようとする微生物を結合させて、磁力によって目的の微生物を捕集することが、一部の生物分析化学において用いられるようになってきた。
また、微生物を発光させることで、その光から微生物の有無や微生物の量を検出する技術も開発されている。
例えば、特許文献１では、食品等の試料中における特定の大腸菌に磁性微粒子を結合させた後、これらの複合体を磁力によって捕集し、捕集したもののうちの当該特定大腸菌に蛍光分子を結合させ、その発する蛍光における特有の蛍光偏向度を検出することで、特定大腸菌の有無を検出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−２１１０００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の技術においては、微生物の磁力による捕集と、微生物からの発光を集光して微生物を検出することがそれぞれ別の手段によってなされており、そのため、装置も各種必要になるとともに、各工程の操作においても時間がかかり効率的とはいえなかった。
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたもので、微生物の検出のために、磁性微粒子を微生物に結合させ、その微生物・磁性微粒子複合体を検出する技術において、簡易な手段によって効率的な検出を行うことができる方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る微生物検出方法は、微生物と磁性微粒子を結合させる工程、微生物に発光酵素又は蛍光色素を標識する工程、光ファイバー前端面に磁力を発生させ、微生物と磁性微粒子が結合した微生物・磁性微粒子複合体を光ファイバー前端面に磁気的に吸着させる工程、微生物・磁性微粒子複合体の発光酵素又は蛍光色素を発光させ、その光を前記同一の光ファイバーを通して集光し、その光を検出する工程、を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明によれば、所定の微生物に磁性微粒子を結合させて微生物・磁性微粒子複合体を形成させ、また、微生物には発光酵素又は蛍光色素を標識する。
そして、光ファイバーの前端面に磁力を発生させることで、検出しようとする微生物と磁性微粒子との複合体を光ファイバー前端面に磁気的に吸着させ、目的とする微生物を選択的に捕集することができる。
さらに、光ファイバー前端面に吸着されている微生物・磁性微粒子複合体の発光酵素又は蛍光色素を発光させて、その光を同じ光ファイバーを通して集光し、その光を検出することで、検出対象の微生物の有無やその量を検出することができる。
その際、微生物・磁性微粒子複合体を磁力によって吸着させて捕集することと、微生物・磁性微粒子複合体からの集光は、同一の光ファイバーによってなされ、また、磁性微粒子の磁性体としての機能も光の検出工程において、そのまま微生物の保持のために用いられることから、効率的な微生物検出の工程とすることができる。
【０００７】
また、本発明は、微生物と磁性微粒子の結合、及び微生物への発光酵素又は蛍光色素の標識は、抗体、レクチン、又はポリミキシンＢを介してなされることを特徴とする。
本発明によれば、微生物と磁性微粒子との結合、及び微生物と発光酵素又は蛍光色素との結合は、抗体抗原反応による結合又はレクチンの糖鎖結合に基づく、特異的な結合を利用していることから、容易に目的とする微生物との間での磁性微粒子、発光酵素又は蛍光色素との複合体を形成できる。
そして、その複合体を、同一光ファイバーを用いた微生物の捕集と検出・定量に用いることができる。
【０００８】
また、発光酵素の発光は、光ファイバー前端面に吸着された微生物・磁性微粒子複合体を、発光反応液に浸漬することでなされることを特徴とする。
本発明によれば、光ファイバー前端面に吸着された微生物・磁性微粒子複合体が、発光反応液に浸漬されるだけで、発光させられ、そのまま同一の光ファイバーを通して微生物・磁性微粒子複合体から発光する光を集光し、その光を検出することで、微生物の有無やその量を検出することができる。
【０００９】
また、本発明は、蛍光色素の発光は、光ファイバー前端面に吸着された微生物・磁性微粒子複合体に励起光を照射することでなされることを特徴とする。
本発明によれば、光ファイバー前端面に吸着された微生物・磁性微粒子複合体に対して励起光を照射されることで、発光させられ、そのまま同一の光ファイバーを通して微生物・磁性微粒子複合体から発光する光を集光し、その光を検出することで、検出対象の微生物の有無やその量を検出することができる。
【００１０】
また、本発明に係る微生物検出装置は、光ファイバー前端面に、微生物と磁性微粒子が結合し、かつ発光酵素又は蛍光色素を標識された微生物・磁性微粒子複合体を磁気的に吸着させるために、光ファイバー前端面に磁力を発生させる手段、発光酵素又は蛍光色素を発光させる手段、微生物・磁性微粒子複合体から発する光を前記同一の光ファイバーを通して集光し、その光を検出する手段を備えることを特徴とする。
本発明によれば、光ファイバー前端面に磁力を発生させ、そこに目的とする微生物に磁性微粒子を結合させた微生物・磁性微粒子複合体を吸着させ、そのままの状態で同じ光ファイバーを通して微生物・磁性微粒子複合体から発する光を集光し、その光を検出することで、検出対象の微生物の有無やその量を容易に検出することができる。
このように、微生物・磁性微粒子複合体の捕集とその後の光検出において、同一の光ファイバーと、磁性微粒子がともに機能することができる。
【００１１】
また、光ファイバー前端面に磁力を発生させる手段が、光ファイバーの外周面に巻いた導電性コイルと、導電性コイルへの電力供給手段を備える場合は、光ファイバーの外周面に巻いた導電性コイルに通電することで、光ファイバー前端面に磁力を発生させることができる。このような簡易でコンパクトな構成によって、同じ光ファイバーに微生物・磁性微粒子複合体の選別捕集と集光との機能を持たせることができる。
【００１２】
また、光ファイバーの前端近傍の外周面に、磁気遮蔽材を配置させる場合は、光ファイバーの前端近傍の外周面に、微生物・磁性微粒子複合体が磁力によって吸着されることを防止でき、光ファイバー前端面での微生物の検出に支障を来たすことを防止できる。
【００１３】
また、光ファイバーに、微生物・磁性微粒子複合体から発する光を集光するとともに、微生物・磁性微粒子複合体へ励起光を照射する手段を備える場合は、同じ光ファイバーに、微生物・磁性微粒子複合体の選別捕集と集光との機能に加えて、励起光照射の機能までも持たせることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、目的とする微生物の検出のために、磁性微粒子を微生物に結合させ、その微生物・磁性微粒子複合体を捕集する技術において、簡易な手段によって効率的な微生物の検出を行うことができる方法及び装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明における微生物・磁性微粒子複合体１の概念図である。
【図２】本発明の第１の実施形態における微生物検出装置の概念図である。
【図３】本発明の第１の実施形態における微生物検出方法の説明図である。
【図４】本発明の第２の実施形態における微生物検出装置の概念図である。
【図５】本発明における光ファイバーの斜視図である。
【図６】本発明における光ファイバーでの確認試験の結果を示す図である。
【図７】本発明における光ファイバーでの確認試験の説明図である。
【図８】本発明の第１の実施形態の実施例の概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態に係る微生物検出の方法及び装置について、添付の図面に基づいて説明する。なお、説明において、同一要素には同一符号を用い、重複する説明は省略する。
本実施形態において検出対象とする微生物は、細菌やウィルス等であって、磁性微粒子と結合できるものであればよいが、代表的には、食品、飲料中の大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ菌などの細菌である。一方、磁性微粒子としては、磁性体を主成分とする粒子であって、直径約１ｍｍ以下、好ましくは直径１００μｍ以下、さらに好ましくは直径１０μｍ以下のもので、市販のものであってもよい。例えば、磁性体の成分として、Ｆｅ３Ｏ４、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｃｏ−γ−Ｆｅ２Ｏ３等がある。
【００１７】
図１は、このような微生物、特には細菌Ａと磁性微粒子Ｂ１を結合させるとともに、細菌Ａに発光酵素Ｃ１を結合させた微生物・磁性微粒子複合体１を示している。
先ず、例えば食品や飲料中での特定の細菌Ａを検出しようとする場合、食品が固形物であれば適宜の液を加えて液体化し、また、液体状のものであっても不純物が多いものであれば、それらを取り除いた上で水溶液にして試料とする。
こうした試料中において、磁性微粒子Ｂ１、発光酵素Ｃ１とそれらを細菌Ａに結合させるための抗体等を加えることにより、仮に、検出しようとする細菌Ａが存在した場合には、微生物・磁性微粒子複合体１が構成されるものである。
磁性微粒子Ｂ１には、検出対象である細菌Ａの表面抗原ａと相補性を有して、特異的に結合する第１抗体Ｂ２が固定化され、第１抗体結合磁性微粒子Bを構成している。
そこで、第１抗体結合磁性微粒子Ｂを検出対象の細菌Ａと、抗原抗体反応によって結合させる。
次に、パーオキシダーゼ等の発光酵素Ｃ１と第２抗体Ｃ２とが結合した第２抗体・発光酵素複合体Ｃを、同様に抗原抗体反応によって細菌Ａに結合させて、細菌Ａに発光酵素Ｃ１を標識する。
【００１８】
また、第１抗体、第２抗体においては、抗体に替えて、細菌Ａの表面抗原ａとの間で、糖鎖による特異的な結合活性をもつレクチンのようなタンパクであってもよい。
また、第１抗体が結合する表面抗原ａと、第２抗体が結合する表面抗体ａとは、同一細菌における別種類の表面抗原としてもよい。その場合、検出対象の細菌Ａの表面抗原ａが、磁性微粒子Ｂ１又は発光酵素Ｃ１のどちらかとの結合だけで飽和して、他との結合が不能となって、細菌Ａの検出が阻害されることを防止できる。
また、第１抗体Ｂ２、第２抗体Ｃ２やこれに替わるレクチンでの結合は、それぞれが、１段階での結合に限らず、後記の実施例のように、多段階での結合にしてもよい。
また、発光酵素Ｃ１に替えて、市販の蛍光ナノ粒子等の蛍光色素を用いて、蛍光色素を標識した第２抗体Ｃ２を細菌Aと結合させてもよい。
【００１９】
次に、このようにして、食品、飲料の水溶液試料中での細菌Ａを検出するための、微生物検出装置２の第１実施形態について、図２，３によって説明する。
この実施形態は、検出する光の発光源として、発光酵素Ｃ１を用いた場合の装置構成である。
光ファイバー３の先端部に鉄管４を装着する。光ファイバー３は、特に制限はないが、前端面３１に検出対象物を吸着させて捕集することから、ある程度直径が大きいものが望ましく、直径２ｍｍ〜２０ｍｍが好ましい。そのためには、ファイバー素線を束ねたバンドルファイバーが望ましい。
また、鉄管４の先端は、図示では光ファイバー３の前端面３１まで達しているが、それより短くしてもよく、鉄管４先端は試料の水溶液中に浸漬されない長さに制限してもよい。
この鉄管４の上から、導線を巻回してコイル５を形成する。コイル５は一層でも多層に巻いてもよく、また長さについても、光ファイバー３の前端面３１で必要な磁束密度を得ることができるように適宜設計できる。
コイル５は、電力供給手段７に接続されており、通電されたときに、コイル５と鉄管４によって磁界が形成されて、光ファイバー３の前端面３１に磁力が生じる。
【００２０】
また、光ファイバー３の先端部外周には、磁気遮蔽材６として珪素鋼の円筒が装着されている。これによって、例えば、大きな電力を印加して大きな磁力が生じる等によって、光ファイバー３の前端面３１から外れた先端外周にも磁力が発生した場合であっても、微生物・磁性微粒子複合体１が前端面３１以外の外周面に吸着されることを防止できる。もっとも、上記のような恐れがない場合には、この磁気遮蔽材６は必ずしも必要ではない。
光ファイバー３の後端は、光検出手段８に光学的に接続されている。光検出手段８としては、光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトダイオード、フォトンカウンティング等の光検出デバイスであり、光ファイバー３からの光Ｌを受光し検出する。
光検出手段８によって検出された信号は、記録・判定手段９に送信されて、検出された強度等が記録される。また、一定の試験条件の下での検出した光強度と細菌Ａの数量との対応関係を予め得ておき、その対応関係から、細菌Ａの数量を判定することができる。
【００２１】
次に、図２の装置を用いた細菌Ａの検出の操作を図３によって説明する。
図３（Ａ）図のように、試料水溶液中に磁性微粒子Ｂ１や発光酵素Ｃ１標識の抗体Ｃ２等を懸濁させた懸濁液Ｄにおいて、検出対象の細菌Ａが存在している場合に限って、その細菌Ａの表面抗原ａによって、細菌Ａ−磁性微粒子Ｂ１−発光酵素Ｃ１の３つを含む微生物・磁性微粒子複合体１が形成されている。なお、白丸で示しているには、対象外の微生物等である。
そこで、（Ｂ）図のように、光ファイバー３の先端を容器内の懸濁液Ｄに浸漬し、コイル５に電流を流す。そうすると、光ファイバー３の前端面３１には磁力が発生し、磁性微粒子Ｂ１が磁力によって前端面３１に吸着され、磁性微粒子Ｂ１を含んである微生物・磁性微粒子複合体１全体が、前端面３１に吸着されることになる。
【００２２】
次に、（Ｃ）図のとおり、コイル５に電流を流して前端面３１に磁力が発生している光ファイバー３の先端部を、発光酵素Ｃ１に反応して発光させる、例えばルミノール反応液等の発光反応液Ｅに浸漬する。
光ファイバー３の前端面３１に微生物・磁性微粒子複合体１が吸着されている場合には、その発光酵素Ｃ１と発光反応液Ｅとの反応によって、光Ｌを生じることから、図２に示す光検出手段８での検出が行われる。なお、光ファイバー３の前端面３１には、細菌Ａと結合していない磁性微粒子Ｂ１が吸着されている可能性があるが、その場合、発光酵素Ｃ１とは結合していないことから、発光することがなく、細菌Ａと誤認することはない。
この図３（Ｃ）図での発光反応液Ｅを入れた容器と光ファイバー３の先端部は、暗環境とするためのダークボックス内に収納して、外部操作で光ファイバー３先端の発光反応液Ｅへの浸漬を行うことが、光検出のためには望ましい。
【００２３】
次に、第２実施形態として、発光酵素Ｃ１に替えて蛍光色素を用いる場合の微生物検出装置２について、図４によって説明する。
蛍光色素の場合は、使用する蛍光色素に対して所定の波長の励起光を照射すると、蛍光色素が特定波長の蛍光を発する。
そのため、光ファイバー３の一部分は励起光源１１からの励起光ＬＡを通過させて、光ファイバー３の前端面３１に吸着されている微生物・磁性微粒子複合体１における蛍光色素に励起光ＬＡを照射する構成とされている。そして、蛍光色素から発光される蛍光ＬＢは、光ファイバー３の他の部分を通って、出射されて光検出手段８で受光される。励起光ＬＡと蛍光ＬＢとを分離して、所定ルートに導くために、光路にはビームスプリッター１０が配設されている。
装置の構成において、これら以外の点については、第１の実施形態の説明と同様である。
この第２実施形態においては、用いる蛍光色素の種類によって生じる蛍光の波長がかなり異なり、可視光の範囲を外れている場合、暗環境でなくとも光を検出するのに差し支えないこともある。
また、第２実施形態では、光ファイバー３を発光反応液の槽に移動させることなく、微生物・磁性微粒子複合体１を吸着した段階で、励起光ＬＡを照射して検出操作が可能である。
もっとも、第１実施形態、第２実施形態とも、一旦、磁力によって微生物・磁性微粒子複合体１を吸着して採集した後に、微生物・磁性微粒子複合体１の洗浄を行い、再度、光ファイバー３の前端面３１によって微生物・磁性微粒子複合体１を磁力で吸着し、その状態で、発光酵素又は蛍光色素を発光させて光検出を行ってもよい。
【実施例１】
【００２４】
「確認試験」
図５に示すような光ファイバー装置によって、その前端面３１に磁力を発生させて磁性微粒子を吸着できることを確かめた確認試験を説明する。
内径７ mm、外径１２ mmの鉄管４を用意し、その中にバンドル光ファイバー３を先端部が突出する状態で挿入した。そして、それらを塩ビ製の管１２（内径１２mm外径１４mm）に、同じく光ファイバー３の先端部が突出する状態で挿入した。
この塩ビ管１２の外周にニクロム線（直径０．７mm）を約５０回巻き、それを2重にした。
このニクロム線の各々の端を定電流電源のプラス、マイナス端に接続し、一定の直流電流を印加した。そして、光ファイバー３の前端面３１での磁束密度をガウスメーター（GM-301、電子磁気工業製）で測定した。
測定した結果は、図６のとおりであって、光ファイバー３の前端面３１において、所定の磁束密度が得られた。また、コイル１層巻きにおいても２層巻きにおいても、図示のとおり、実験範囲では印加電流と発生する磁場との間に比例関係が認められた。
【００２５】
次に、微生物捕集にしばしば用いられる市販の磁性微粒子（Dynabeads M−280）を０．１Ｍのリン酸緩衝液（phosphatebuffer、pH 7.0)に懸濁し，この磁性微粒子の光ファイバー３の前端面３１への吸着、解離が可能であることを実験的に確認した。
その際の概念図を図７に示す。
使用した懸濁液Dの濃度は２×１０８ビーズ／ml（1ml当たりの磁性微粒子の個数）であり、この懸濁液２mlを直径約２０ｍｍのビーカーに入れて、磁性微粒子Ｂ１が均一になるように攪拌し、静置後、すぐに光ファイバー３の前端面３１が１mmほど液面下となるように懸濁液Ｄに浸漬した後、コイル５に電流を印加した。
その結果、５０ mT（500 G）以上の磁場が光ファイバー前端面３１にあれば、懸濁液中の磁性微粒子Ｂ１は光ファイバー前端面３１にほぼ均一に集積してくることが分かった。しかも、この測定範囲内においては、磁性微粒子Ｂ１は、液中以外のファイバー部、鉄管４、塩ビ管１２のいずれの部分にも集積してこなかった。
また、電流の供給を停止すると磁性微粒子Ｂ１はスムーズに解離した。なお、鉄管４には、残留磁化が残るが、解離には問題にならなかった。
【００２６】
「実施例」
第１実施形態の具体例を、図８の概念図により、以下に説明する。
市販の牛挽肉５０ｇに、０．１mMのＭｎＳＯ４と０．１ mMのＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液(pH７．０)５００mlを加えて、ブレンダーで破砕後、遠心分離（1,000×g、１分）を行って得られた抽出液に大腸菌（Escherichia coliATCC 12740）を添加（104 cells／ml）する。これを食品から抽出した水溶液としてのモデル試料とする。
【００２７】
次に、磁性微粒子であるダイナビーズＲ−280（Dynabeads R−280 Tosyl-activated）と抗生物質であるポリミキシンＢ（polymyxinB）との結合体（polymyxin B−conjugated Dynabeads R-280，Pol-R beads）を懸濁させた、同様のリン酸緩衝液１．０ml（２×１０８ビーズ／ml）を、上記のモデル試料１．０mlに加え、室温下で２時間攪拌する。なお、ConＡ−Ｒbeadsの詳細な調製方法は、製品添付のマニュアルに従った。
これによって、図８において、磁性微粒子Ｂ１としてのDynabeads R−280に結合しているＢ２としてのポリミキシンＢが、特定の大腸菌Ａの外膜（outermembrane）部Ｐ１と結合した複合体が形成される。
【００２８】
次に、このように形成された複合体（以下「ビーズ」ともいう。）を磁石によって取得し、残渣は廃棄する。得られたビーズは、上記と同様のリン酸緩衝液で洗浄する。
次に、図８において、特定の上記大腸菌Ａの表面抗原ａ２であるＯ127ａ抗原と結合する抗体Ｃ２１としてのアンチO127aIgG (ラビット由来)を濃度４μg／mlで含む５０mMのリン酸緩衝液（ブロッキング剤としての３％ウシ血清アルブミン，０．２％Tween20を含む）１．０mlに、上記の得られたビーズを懸濁させ、室温下で１時間攪拌する。なお、アンチO127aIgG (ラビット由来)溶液の調製については、本発明の発明者等による文献「Masuko, M., Kataoka, T., Sugiyama, N.,Uchiyama, S., Sugiyama, H., Tarui, K., Kamiya, K. & Kawai, T. (1992)Photochem Photobiol, 56, 107−111」に述べられているとおりである。
これによって、図８における、磁性微粒子Ｂ１−ポリミキシンＢ Ｂ２−大腸菌Ａ−抗体Ｃ２１までの複合体が形成される。
【００２９】
次に、このように形成されたビーズを磁石によって取得し、溶液は廃棄する。そして、ビーズを５０mMのリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄する。
次に、発光酵素Ｃ１としての市販のホースラディッシュ、パーオキシターゼが結合している抗体Ｃ２２としてのアンチラビットIgG抗体の溶液（２００倍希釈、緩衝液は５０mMのリン酸緩衝液（ブロッキング剤としての３％ウシ血清アルブミン，０．２％Tween20を含む））に、得られたビーズを添加して、室温下で１時間攪拌する。なお、このような溶液の調製については、上記の文献「Masuko,M., Kataoka, T., Sugiyama, N., Uchiyama, S., Sugiyama, H., Tarui, K., Kamiya,K. & Kawai, T. (1992) Photochem Photobiol, 56, 107−111」に述べられているとおりである。
【００３０】
これによって、図８における、磁性微粒子Ｂ１−ポリミキシンＢ Ｂ２−大腸菌Ａ−抗体Ｃ２１−抗体Ｃ２２−発光酵素Ｃ１までの微生物・磁性微粒子複合体１が完成する。
次に、このように形成されたビーズを磁石によって取得し、５０mMのリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄する。
それから、これを、発光反応液Ｅとしての市販のルミノール反応液（RP2106，GEHealthcare）２．０mlに懸濁させ、光ファイバー３の前端面３１に吸着されたビーズにおけるパーオキシダーゼＣ１を発光させて、暗黒下において、図３（Ｃ）のとおりの光Ｌの測定を一定時間行う。その場合の発光反応液Ｅ中における概念図が図８のとおりである。
このように、微生物・磁性微粒子複合体１を光ファイバー３の前端面３１に吸着、捕集した状態で、磁性微粒子を除去する等なく、光検出の際の微生物の保持のために、磁性体としての機能を維持させたままで、かつ同一の光ファイバーによって、細菌検出のための光測定を行うことができる。
【符号の説明】
【００３１】
１‥微生物・磁性微粒子複合体、Ａ‥細菌、ａ‥表面抗原、Ｂ‥第１抗体結合磁性微粒子、Ｂ１‥磁性微粒子、Ｂ２‥ポリミキシンＢ、Ｃ‥第２抗体・発光酵素複合体、Ｃ１‥発光酵素、Ｃ２‥第２抗体、Ｄ‥懸濁液、Ｅ‥発光反応液、Ｌ‥光、ＬＡ‥励起光、ＬＢ‥蛍光、２‥微生物検出装置、３‥光ファイバー、３１‥光ファイバー前端面、４‥鉄管、５‥コイル、６‥磁気遮蔽材、７‥電力供給手段、８‥光検出手段、９‥記録・判定手段、１０‥ビームスプリッター、１１‥励起光源、１２‥塩ビ管
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を検出するための方法及びそのための装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物を検出する技術はその重要性を増しており、特に、食品や飲料などにおいて、大腸菌等の各種の細菌を検出することが、食の安全、衛生管理の確保の面から欠くことのできないものである。従来、これらの微生物、特に細菌の検出は平板寒天培地上で生育させたコロニーの検出や各種の顕微鏡を用いた観察によってなされてきた。
近年になって、直径約１ｍｍ以下の磁性微粒子に予め抗体やレクチンのようなタンパクを固定させておき、それらによる微生物表面抗原との特異的な結合を利用して、検出しようとする微生物を結合させて、磁力によって目的の微生物を捕集することが、一部の生物分析化学において用いられるようになってきた。
また、微生物を発光させることで、その光から微生物の有無や微生物の量を検出する技術も開発されている。
例えば、特許文献１では、食品等の試料中における特定の大腸菌に磁性微粒子を結合させた後、これらの複合体を磁力によって捕集し、捕集したもののうちの当該特定大腸菌に蛍光分子を結合させ、その発する蛍光における特有の蛍光偏向度を検出することで、特定大腸菌の有無を検出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−２１１０００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の技術においては、微生物の磁力による捕集と、微生物からの発光を集光して微生物を検出することがそれぞれ別の手段によってなされており、そのため、装置も各種必要になるとともに、各工程の操作においても時間がかかり効率的とはいえなかった。
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたもので、微生物の検出のために、磁性微粒子を微生物に結合させ、その微生物・磁性微粒子複合体を検出する技術において、簡易な手段によって効率的な検出を行うことができる方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る微生物検出方法は、微生物と磁性微粒子を結合させる工程、微生物に発光酵素又は蛍光色素を標識する工程、光ファイバー前端面に磁力を発生させ、微生物と磁性微粒子が結合した微生物・磁性微粒子複合体を光ファイバー前端面に磁気的に吸着させる工程、微生物・磁性微粒子複合体の発光酵素又は蛍光色素を発光させ、その光を前記同一の光ファイバーを通して集光し、その光を検出する工程、を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明によれば、所定の微生物に磁性微粒子を結合させて微生物・磁性微粒子複合体を形成させ、また、微生物には発光酵素又は蛍光色素を標識する。
そして、光ファイバーの前端面に磁力を発生させることで、検出しようとする微生物と磁性微粒子との複合体を光ファイバー前端面に磁気的に吸着させ、目的とする微生物を選択的に捕集することができる。
さらに、光ファイバー前端面に吸着されている微生物・磁性微粒子複合体の発光酵素又は蛍光色素を発光させて、その光を同じ光ファイバーを通して集光し、その光を検出することで、検出対象の微生物の有無やその量を検出することができる。
その際、微生物・磁性微粒子複合体を磁力によって吸着させて捕集することと、微生物・磁性微粒子複合体からの集光は、同一の光ファイバーによってなされ、また、磁性微粒子の磁性体としての機能も光の検出工程において、そのまま微生物の保持のために用いられることから、効率的な微生物検出の工程とすることができる。
【０００７】
また、本発明は、微生物と磁性微粒子の結合、及び微生物への発光酵素又は蛍光色素の標識は、抗体、レクチン、又はポリミキシンＢを介してなされることを特徴とする。
本発明によれば、微生物と磁性微粒子との結合、及び微生物と発光酵素又は蛍光色素との結合は、抗体抗原反応による結合又はレクチンの糖鎖結合に基づく、特異的な結合を利用していることから、容易に目的とする微生物との間での磁性微粒子、発光酵素又は蛍光色素との複合体を形成できる。
そして、その複合体を、同一光ファイバーを用いた微生物の捕集と検出・定量に用いることができる。
【０００８】
また、発光酵素の発光は、光ファイバー前端面に吸着された微生物・磁性微粒子複合体を、発光反応液に浸漬することでなされることを特徴とする。
本発明によれば、光ファイバー前端面に吸着された微生物・磁性微粒子複合体が、発光反応液に浸漬されるだけで、発光させられ、そのまま同一の光ファイバーを通して微生物・磁性微粒子複合体から発光する光を集光し、その光を検出することで、微生物の有無やその量を検出することができる。
【０００９】
また、本発明は、蛍光色素の発光は、光ファイバー前端面に吸着された微生物・磁性微粒子複合体に励起光を照射することでなされることを特徴とする。
本発明によれば、光ファイバー前端面に吸着された微生物・磁性微粒子複合体に対して励起光を照射されることで、発光させられ、そのまま同一の光ファイバーを通して微生物・磁性微粒子複合体から発光する光を集光し、その光を検出することで、検出対象の微生物の有無やその量を検出することができる。
【００１０】
また、本発明に係る微生物検出装置は、光ファイバー前端面に、微生物と磁性微粒子が結合し、かつ発光酵素又は蛍光色素を標識された微生物・磁性微粒子複合体を磁気的に吸着させるために、光ファイバー前端面に磁力を発生させる手段、発光酵素又は蛍光色素を発光させる手段、微生物・磁性微粒子複合体から発する光を前記同一の光ファイバーを通して集光し、その光を検出する手段を備えることを特徴とする。
本発明によれば、光ファイバー前端面に磁力を発生させ、そこに目的とする微生物に磁性微粒子を結合させた微生物・磁性微粒子複合体を吸着させ、そのままの状態で同じ光ファイバーを通して微生物・磁性微粒子複合体から発する光を集光し、その光を検出することで、検出対象の微生物の有無やその量を容易に検出することができる。
このように、微生物・磁性微粒子複合体の捕集とその後の光検出において、同一の光ファイバーと、磁性微粒子がともに機能することができる。
【００１１】
また、光ファイバー前端面に磁力を発生させる手段が、光ファイバーの外周面に巻いた導電性コイルと、導電性コイルへの電力供給手段を備える場合は、光ファイバーの外周面に巻いた導電性コイルに通電することで、光ファイバー前端面に磁力を発生させることができる。このような簡易でコンパクトな構成によって、同じ光ファイバーに微生物・磁性微粒子複合体の選別捕集と集光との機能を持たせることができる。
【００１２】
また、光ファイバーの前端近傍の外周面に、磁気遮蔽材を配置させる場合は、光ファイバーの前端近傍の外周面に、微生物・磁性微粒子複合体が磁力によって吸着されることを防止でき、光ファイバー前端面での微生物の検出に支障を来たすことを防止できる。
【００１３】
また、光ファイバーに、微生物・磁性微粒子複合体から発する光を集光するとともに、微生物・磁性微粒子複合体へ励起光を照射する手段を備える場合は、同じ光ファイバーに、微生物・磁性微粒子複合体の選別捕集と集光との機能に加えて、励起光照射の機能までも持たせることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、目的とする微生物の検出のために、磁性微粒子を微生物に結合させ、その微生物・磁性微粒子複合体を捕集する技術において、簡易な手段によって効率的な微生物の検出を行うことができる方法及び装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明における微生物・磁性微粒子複合体１の概念図である。
【図２】本発明の第１の実施形態における微生物検出装置の概念図である。
【図３】本発明の第１の実施形態における微生物検出方法の説明図である。
【図４】本発明の第２の実施形態における微生物検出装置の概念図である。
【図５】本発明における光ファイバーの斜視図である。
【図６】本発明における光ファイバーでの確認試験の結果を示す図である。
【図７】本発明における光ファイバーでの確認試験の説明図である。
【図８】本発明の第１の実施形態の実施例の概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態に係る微生物検出の方法及び装置について、添付の図面に基づいて説明する。なお、説明において、同一要素には同一符号を用い、重複する説明は省略する。
本実施形態において検出対象とする微生物は、細菌やウィルス等であって、磁性微粒子と結合できるものであればよいが、代表的には、食品、飲料中の大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ菌などの細菌である。一方、磁性微粒子としては、磁性体を主成分とする粒子であって、直径約１ｍｍ以下、好ましくは直径１００μｍ以下、さらに好ましくは直径１０μｍ以下のもので、市販のものであってもよい。例えば、磁性体の成分として、Ｆｅ３Ｏ４、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｃｏ−γ−Ｆｅ２Ｏ３等がある。
【００１７】
図１は、このような微生物、特には細菌Ａと磁性微粒子Ｂ１を結合させるとともに、細菌Ａに発光酵素Ｃ１を結合させた微生物・磁性微粒子複合体１を示している。
先ず、例えば食品や飲料中での特定の細菌Ａを検出しようとする場合、食品が固形物であれば適宜の液を加えて液体化し、また、液体状のものであっても不純物が多いものであれば、それらを取り除いた上で水溶液にして試料とする。
こうした試料中において、磁性微粒子Ｂ１、発光酵素Ｃ１とそれらを細菌Ａに結合させるための抗体等を加えることにより、仮に、検出しようとする細菌Ａが存在した場合には、微生物・磁性微粒子複合体１が構成されるものである。
磁性微粒子Ｂ１には、検出対象である細菌Ａの表面抗原ａと相補性を有して、特異的に結合する第１抗体Ｂ２が固定化され、第１抗体結合磁性微粒子Bを構成している。
そこで、第１抗体結合磁性微粒子Ｂを検出対象の細菌Ａと、抗原抗体反応によって結合させる。
次に、パーオキシダーゼ等の発光酵素Ｃ１と第２抗体Ｃ２とが結合した第２抗体・発光酵素複合体Ｃを、同様に抗原抗体反応によって細菌Ａに結合させて、細菌Ａに発光酵素Ｃ１を標識する。
【００１８】
また、第１抗体、第２抗体においては、抗体に替えて、細菌Ａの表面抗原ａとの間で、糖鎖による特異的な結合活性をもつレクチンのようなタンパクであってもよい。
また、第１抗体が結合する表面抗原ａと、第２抗体が結合する表面抗体ａとは、同一細菌における別種類の表面抗原としてもよい。その場合、検出対象の細菌Ａの表面抗原ａが、磁性微粒子Ｂ１又は発光酵素Ｃ１のどちらかとの結合だけで飽和して、他との結合が不能となって、細菌Ａの検出が阻害されることを防止できる。
また、第１抗体Ｂ２、第２抗体Ｃ２やこれに替わるレクチンでの結合は、それぞれが、１段階での結合に限らず、後記の実施例のように、多段階での結合にしてもよい。
また、発光酵素Ｃ１に替えて、市販の蛍光ナノ粒子等の蛍光色素を用いて、蛍光色素を標識した第２抗体Ｃ２を細菌Aと結合させてもよい。
【００１９】
次に、このようにして、食品、飲料の水溶液試料中での細菌Ａを検出するための、微生物検出装置２の第１実施形態について、図２，３によって説明する。
この実施形態は、検出する光の発光源として、発光酵素Ｃ１を用いた場合の装置構成である。
光ファイバー３の先端部に鉄管４を装着する。光ファイバー３は、特に制限はないが、前端面３１に検出対象物を吸着させて捕集することから、ある程度直径が大きいものが望ましく、直径２ｍｍ〜２０ｍｍが好ましい。そのためには、ファイバー素線を束ねたバンドルファイバーが望ましい。
また、鉄管４の先端は、図示では光ファイバー３の前端面３１まで達しているが、それより短くしてもよく、鉄管４先端は試料の水溶液中に浸漬されない長さに制限してもよい。
この鉄管４の上から、導線を巻回してコイル５を形成する。コイル５は一層でも多層に巻いてもよく、また長さについても、光ファイバー３の前端面３１で必要な磁束密度を得ることができるように適宜設計できる。
コイル５は、電力供給手段７に接続されており、通電されたときに、コイル５と鉄管４によって磁界が形成されて、光ファイバー３の前端面３１に磁力が生じる。
【００２０】
また、光ファイバー３の先端部外周には、磁気遮蔽材６として珪素鋼の円筒が装着されている。これによって、例えば、大きな電力を印加して大きな磁力が生じる等によって、光ファイバー３の前端面３１から外れた先端外周にも磁力が発生した場合であっても、微生物・磁性微粒子複合体１が前端面３１以外の外周面に吸着されることを防止できる。もっとも、上記のような恐れがない場合には、この磁気遮蔽材６は必ずしも必要ではない。
光ファイバー３の後端は、光検出手段８に光学的に接続されている。光検出手段８としては、光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトダイオード、フォトンカウンティング等の光検出デバイスであり、光ファイバー３からの光Ｌを受光し検出する。
光検出手段８によって検出された信号は、記録・判定手段９に送信されて、検出された強度等が記録される。また、一定の試験条件の下での検出した光強度と細菌Ａの数量との対応関係を予め得ておき、その対応関係から、細菌Ａの数量を判定することができる。
【００２１】
次に、図２の装置を用いた細菌Ａの検出の操作を図３によって説明する。
図３（Ａ）図のように、試料水溶液中に磁性微粒子Ｂ１や発光酵素Ｃ１標識の抗体Ｃ２等を懸濁させた懸濁液Ｄにおいて、検出対象の細菌Ａが存在している場合に限って、その細菌Ａの表面抗原ａによって、細菌Ａ−磁性微粒子Ｂ１−発光酵素Ｃ１の３つを含む微生物・磁性微粒子複合体１が形成されている。なお、白丸で示しているには、対象外の微生物等である。
そこで、（Ｂ）図のように、光ファイバー３の先端を容器内の懸濁液Ｄに浸漬し、コイル５に電流を流す。そうすると、光ファイバー３の前端面３１には磁力が発生し、磁性微粒子Ｂ１が磁力によって前端面３１に吸着され、磁性微粒子Ｂ１を含んである微生物・磁性微粒子複合体１全体が、前端面３１に吸着されることになる。
【００２２】
次に、（Ｃ）図のとおり、コイル５に電流を流して前端面３１に磁力が発生している光ファイバー３の先端部を、発光酵素Ｃ１に反応して発光させる、例えばルミノール反応液等の発光反応液Ｅに浸漬する。
光ファイバー３の前端面３１に微生物・磁性微粒子複合体１が吸着されている場合には、その発光酵素Ｃ１と発光反応液Ｅとの反応によって、光Ｌを生じることから、図２に示す光検出手段８での検出が行われる。なお、光ファイバー３の前端面３１には、細菌Ａと結合していない磁性微粒子Ｂ１が吸着されている可能性があるが、その場合、発光酵素Ｃ１とは結合していないことから、発光することがなく、細菌Ａと誤認することはない。
この図３（Ｃ）図での発光反応液Ｅを入れた容器と光ファイバー３の先端部は、暗環境とするためのダークボックス内に収納して、外部操作で光ファイバー３先端の発光反応液Ｅへの浸漬を行うことが、光検出のためには望ましい。
【００２３】
次に、第２実施形態として、発光酵素Ｃ１に替えて蛍光色素を用いる場合の微生物検出装置２について、図４によって説明する。
蛍光色素の場合は、使用する蛍光色素に対して所定の波長の励起光を照射すると、蛍光色素が特定波長の蛍光を発する。
そのため、光ファイバー３の一部分は励起光源１１からの励起光ＬＡを通過させて、光ファイバー３の前端面３１に吸着されている微生物・磁性微粒子複合体１における蛍光色素に励起光ＬＡを照射する構成とされている。そして、蛍光色素から発光される蛍光ＬＢは、光ファイバー３の他の部分を通って、出射されて光検出手段８で受光される。励起光ＬＡと蛍光ＬＢとを分離して、所定ルートに導くために、光路にはビームスプリッター１０が配設されている。
装置の構成において、これら以外の点については、第１の実施形態の説明と同様である。
この第２実施形態においては、用いる蛍光色素の種類によって生じる蛍光の波長がかなり異なり、可視光の範囲を外れている場合、暗環境でなくとも光を検出するのに差し支えないこともある。
また、第２実施形態では、光ファイバー３を発光反応液の槽に移動させることなく、微生物・磁性微粒子複合体１を吸着した段階で、励起光ＬＡを照射して検出操作が可能である。
もっとも、第１実施形態、第２実施形態とも、一旦、磁力によって微生物・磁性微粒子複合体１を吸着して採集した後に、微生物・磁性微粒子複合体１の洗浄を行い、再度、光ファイバー３の前端面３１によって微生物・磁性微粒子複合体１を磁力で吸着し、その状態で、発光酵素又は蛍光色素を発光させて光検出を行ってもよい。
【実施例１】
【００２４】
「確認試験」
図５に示すような光ファイバー装置によって、その前端面３１に磁力を発生させて磁性微粒子を吸着できることを確かめた確認試験を説明する。
内径７ mm、外径１２ mmの鉄管４を用意し、その中にバンドル光ファイバー３を先端部が突出する状態で挿入した。そして、それらを塩ビ製の管１２（内径１２mm外径１４mm）に、同じく光ファイバー３の先端部が突出する状態で挿入した。
この塩ビ管１２の外周にニクロム線（直径０．７mm）を約５０回巻き、それを2重にした。
このニクロム線の各々の端を定電流電源のプラス、マイナス端に接続し、一定の直流電流を印加した。そして、光ファイバー３の前端面３１での磁束密度をガウスメーター（GM-301、電子磁気工業製）で測定した。
測定した結果は、図６のとおりであって、光ファイバー３の前端面３１において、所定の磁束密度が得られた。また、コイル１層巻きにおいても２層巻きにおいても、図示のとおり、実験範囲では印加電流と発生する磁場との間に比例関係が認められた。
【００２５】
次に、微生物捕集にしばしば用いられる市販の磁性微粒子（Dynabeads M−280）を０．１Ｍのリン酸緩衝液（phosphatebuffer、pH 7.0)に懸濁し，この磁性微粒子の光ファイバー３の前端面３１への吸着、解離が可能であることを実験的に確認した。
その際の概念図を図７に示す。
使用した懸濁液Dの濃度は２×１０８ビーズ／ml（1ml当たりの磁性微粒子の個数）であり、この懸濁液２mlを直径約２０ｍｍのビーカーに入れて、磁性微粒子Ｂ１が均一になるように攪拌し、静置後、すぐに光ファイバー３の前端面３１が１mmほど液面下となるように懸濁液Ｄに浸漬した後、コイル５に電流を印加した。
その結果、５０ mT（500 G）以上の磁場が光ファイバー前端面３１にあれば、懸濁液中の磁性微粒子Ｂ１は光ファイバー前端面３１にほぼ均一に集積してくることが分かった。しかも、この測定範囲内においては、磁性微粒子Ｂ１は、液中以外のファイバー部、鉄管４、塩ビ管１２のいずれの部分にも集積してこなかった。
また、電流の供給を停止すると磁性微粒子Ｂ１はスムーズに解離した。なお、鉄管４には、残留磁化が残るが、解離には問題にならなかった。
【００２６】
「実施例」
第１実施形態の具体例を、図８の概念図により、以下に説明する。
市販の牛挽肉５０ｇに、０．１mMのＭｎＳＯ４と０．１ mMのＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液(pH７．０)５００mlを加えて、ブレンダーで破砕後、遠心分離（1,000×g、１分）を行って得られた抽出液に大腸菌（Escherichia coliATCC 12740）を添加（104 cells／ml）する。これを食品から抽出した水溶液としてのモデル試料とする。
【００２７】
次に、磁性微粒子であるダイナビーズＲ−280（Dynabeads R−280 Tosyl-activated）と抗生物質であるポリミキシンＢ（polymyxinB）との結合体（polymyxin B−conjugated Dynabeads R-280，Pol-R beads）を懸濁させた、同様のリン酸緩衝液１．０ml（２×１０８ビーズ／ml）を、上記のモデル試料１．０mlに加え、室温下で２時間攪拌する。なお、ConＡ−Ｒbeadsの詳細な調製方法は、製品添付のマニュアルに従った。
これによって、図８において、磁性微粒子Ｂ１としてのDynabeads R−280に結合しているＢ２としてのポリミキシンＢが、特定の大腸菌Ａの外膜（outermembrane）部Ｐ１と結合した複合体が形成される。
【００２８】
次に、このように形成された複合体（以下「ビーズ」ともいう。）を磁石によって取得し、残渣は廃棄する。得られたビーズは、上記と同様のリン酸緩衝液で洗浄する。
次に、図８において、特定の上記大腸菌Ａの表面抗原ａ２であるＯ127ａ抗原と結合する抗体Ｃ２１としてのアンチO127aIgG (ラビット由来)を濃度４μg／mlで含む５０mMのリン酸緩衝液（ブロッキング剤としての３％ウシ血清アルブミン，０．２％Tween20を含む）１．０mlに、上記の得られたビーズを懸濁させ、室温下で１時間攪拌する。なお、アンチO127aIgG (ラビット由来)溶液の調製については、本発明の発明者等による文献「Masuko, M., Kataoka, T., Sugiyama, N.,Uchiyama, S., Sugiyama, H., Tarui, K., Kamiya, K. & Kawai, T. (1992)Photochem Photobiol, 56, 107−111」に述べられているとおりである。
これによって、図８における、磁性微粒子Ｂ１−ポリミキシンＢ Ｂ２−大腸菌Ａ−抗体Ｃ２１までの複合体が形成される。
【００２９】
次に、このように形成されたビーズを磁石によって取得し、溶液は廃棄する。そして、ビーズを５０mMのリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄する。
次に、発光酵素Ｃ１としての市販のホースラディッシュ、パーオキシターゼが結合している抗体Ｃ２２としてのアンチラビットIgG抗体の溶液（２００倍希釈、緩衝液は５０mMのリン酸緩衝液（ブロッキング剤としての３％ウシ血清アルブミン，０．２％Tween20を含む））に、得られたビーズを添加して、室温下で１時間攪拌する。なお、このような溶液の調製については、上記の文献「Masuko,M., Kataoka, T., Sugiyama, N., Uchiyama, S., Sugiyama, H., Tarui, K., Kamiya,K. & Kawai, T. (1992) Photochem Photobiol, 56, 107−111」に述べられているとおりである。
【００３０】
これによって、図８における、磁性微粒子Ｂ１−ポリミキシンＢ Ｂ２−大腸菌Ａ−抗体Ｃ２１−抗体Ｃ２２−発光酵素Ｃ１までの微生物・磁性微粒子複合体１が完成する。
次に、このように形成されたビーズを磁石によって取得し、５０mMのリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄する。
それから、これを、発光反応液Ｅとしての市販のルミノール反応液（RP2106，GEHealthcare）２．０mlに懸濁させ、光ファイバー３の前端面３１に吸着されたビーズにおけるパーオキシダーゼＣ１を発光させて、暗黒下において、図３（Ｃ）のとおりの光Ｌの測定を一定時間行う。その場合の発光反応液Ｅ中における概念図が図８のとおりである。
このように、微生物・磁性微粒子複合体１を光ファイバー３の前端面３１に吸着、捕集した状態で、磁性微粒子を除去する等なく、光検出の際の微生物の保持のために、磁性体としての機能を維持させたままで、かつ同一の光ファイバーによって、細菌検出のための光測定を行うことができる。
【符号の説明】
【００３１】
１‥微生物・磁性微粒子複合体、Ａ‥細菌、ａ‥表面抗原、Ｂ‥第１抗体結合磁性微粒子、Ｂ１‥磁性微粒子、Ｂ２‥ポリミキシンＢ、Ｃ‥第２抗体・発光酵素複合体、Ｃ１‥発光酵素、Ｃ２‥第２抗体、Ｄ‥懸濁液、Ｅ‥発光反応液、Ｌ‥光、ＬＡ‥励起光、ＬＢ‥蛍光、２‥微生物検出装置、３‥光ファイバー、３１‥光ファイバー前端面、４‥鉄管、５‥コイル、６‥磁気遮蔽材、７‥電力供給手段、８‥光検出手段、９‥記録・判定手段、１０‥ビームスプリッター、１１‥励起光源、１２‥塩ビ管
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物と磁性微粒子を結合させる工程、
前記微生物に発光酵素又は蛍光色素を標識する工程、
光ファイバー前端面に磁力を発生させ、前記微生物と前記磁性微粒子が結合した微生物・磁性微粒子複合体を前記光ファイバー前端面に磁気的に吸着させる工程、
前記微生物・磁性微粒子複合体の前記発光酵素又は前記蛍光色素を発光させ、その光を前記同一の光ファイバーを通して集光し、その光を検出する工程、
を含むことを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
前記微生物と磁性微粒子の結合、及び前記微生物への発光酵素又は蛍光色素の標識は、抗体、レクチン、又はポリミキシンＢを介してなされることを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記発光酵素の発光は、前記光ファイバー前端面に吸着された前記微生物・磁性微粒子複合体を、発光反応液に浸漬することでなされることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記蛍光色素の発光は、前記光ファイバー前端面に吸着された前記微生物・磁性微粒子複合体に励起光を照射することでなされることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物検出方法。
【請求項５】
光ファイバー前端面に、微生物と磁性微粒子が結合し、かつ発光酵素又は蛍光色素を標識された微生物・磁性微粒子複合体を磁気的に吸着させるために、前記光ファイバー前端面に磁力を発生させる手段、
前記発光酵素又は前記蛍光色素を発光させる手段、
前記微生物・磁性微粒子複合体から発する光を前記同一の光ファイバーを通して集光し、その光を検出する手段、
を備えることを特徴とする微生物検出装置。
【請求項６】
前記光ファイバー前端面に磁力を発生させる手段は、前記光ファイバーの外周面に巻いた導電性コイルと、前記導電性コイルへの電力供給手段を備えることを特徴とする請求項５に記載の微生物検出装置。
【請求項７】
前記光ファイバーの前端近傍の外周面には、磁気遮蔽材が配置されていることを特徴とする請求項５又は６に記載の微生物検出装置。
【請求項８】
前記光ファイバーには、前記微生物・磁性微粒子複合体から発する光を集光するとともに、前記微生物・磁性微粒子複合体へ励起光を照射する手段を備えることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
【請求項１】
微生物と磁性微粒子を結合させる工程、
前記微生物に発光酵素又は蛍光色素を標識する工程、
光ファイバー前端面に磁力を発生させ、前記微生物と前記磁性微粒子が結合した微生物・磁性微粒子複合体を前記光ファイバー前端面に磁気的に吸着させる工程、
前記微生物・磁性微粒子複合体の前記発光酵素又は前記蛍光色素を発光させ、その光を前記同一の光ファイバーを通して集光し、その光を検出する工程、
を含むことを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
前記微生物と磁性微粒子の結合、及び前記微生物への発光酵素又は蛍光色素の標識は、抗体、レクチン、又はポリミキシンＢを介してなされることを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記発光酵素の発光は、前記光ファイバー前端面に吸着された前記微生物・磁性微粒子複合体を、発光反応液に浸漬することでなされることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記蛍光色素の発光は、前記光ファイバー前端面に吸着された前記微生物・磁性微粒子複合体に励起光を照射することでなされることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物検出方法。
【請求項５】
光ファイバー前端面に、微生物と磁性微粒子が結合し、かつ発光酵素又は蛍光色素を標識された微生物・磁性微粒子複合体を磁気的に吸着させるために、前記光ファイバー前端面に磁力を発生させる手段、
前記発光酵素又は前記蛍光色素を発光させる手段、
前記微生物・磁性微粒子複合体から発する光を前記同一の光ファイバーを通して集光し、その光を検出する手段、
を備えることを特徴とする微生物検出装置。
【請求項６】
前記光ファイバー前端面に磁力を発生させる手段は、前記光ファイバーの外周面に巻いた導電性コイルと、前記導電性コイルへの電力供給手段を備えることを特徴とする請求項５に記載の微生物検出装置。
【請求項７】
前記光ファイバーの前端近傍の外周面には、磁気遮蔽材が配置されていることを特徴とする請求項５又は６に記載の微生物検出装置。
【請求項８】
前記光ファイバーには、前記微生物・磁性微粒子複合体から発する光を集光するとともに、前記微生物・磁性微粒子複合体へ励起光を照射する手段を備えることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２７９３３５（Ｐ２０１０−２７９３３５Ａ）
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３７５２６（Ｐ２００９−１３７５２６）
【出願日】平成２１年６月８日（２００９．６．８）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月８日（２００９．６．８）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
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