微生物検知システム
【課題】捕集から遺伝子分析に至るまでの操作性を良好とし、短時間で、かつ精度よく微生物の検知を可能にするシステムの提供。
【解決手段】捕集チップ２００を分析装置４００にセットした状態で微生物の芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う分析装置４００と、試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、試料注入口と、チップポートと、を有した分析チップ３００と、を備え、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までの処理を行う、微生物検知システム。
【解決手段】捕集チップ２００を分析装置４００にセットした状態で微生物の芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う分析装置４００と、試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、試料注入口と、チップポートと、を有した分析チップ３００と、を備え、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までの処理を行う、微生物検知システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大気中に浮遊する微生物を捕集し、微生物中の遺伝子を抽出して微生物の遺伝子分析を行う微生物検知システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
大気中に浮遊する微生物を捕集するため、ポータブル型空中浮遊菌サンプラを用いて大気を吸引し、シャーレに設けた培地に微生物を高速で衝突させて培地上に微生物を捕集することが知られ、例えば特許文献１に記載されている。
【０００３】
また、取り扱いが容易で安価、かつ試料から遺伝子の抽出・分析までが一括して自動化可能とするため、遺伝子を含む試料が供給される注入口と、注入口に供給された試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、試料と溶解液とを混合した液が導入され、遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、溶離液により溶離された遺伝子が導入される反応部と、を備えた遺伝子処理チップを用いることが、特許文献２に記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−１２５８４３号公報
【特許文献２】特開２００５−６５６０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載のものは、微生物の組織・細胞の培養に使用する培地の上に捕集した微生物の分析を行うことについては述べられてなく、培地上で微生物を培養して微生物が増殖するかを観察する、いわゆる培養法による検知方法を用いたとしても微生物の培養に２〜７日間を要する。
【０００６】
また、特許文献２に記載のものでは、遺伝子を含む試料を注入口より供給しなければならないので、遺伝子処理チップとして試料を捕集するときから用いることができず、捕集から遺伝子処理へ移行する使い勝手が良いものではなかった。
さらに、一つの遺伝子処理チップで全ての遺伝子処理工程を行うものであるため、遺伝子処理チップが大型化し、分析装置の大型化を招くと共に、高価になる恐れがあった。そして、同一試料および同一の分析装置を用いて複数回の分析を行って分析精度の向上を図ろうとすると、全処理工程を再度行うことが必要となり、分析に長時間を要するばかりでなく、遺伝子処理チップを複数用いることになるので、コストアップとなる。
【０００７】
本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決し、捕集から遺伝子分析に至るまでの操作性を良好とし、短時間で、かつ精度よく微生物の検知を可能なものとすることにある。
また、他の目的は使用する機器を小型で安価にし、安全性を確保することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明は、大気中に浮遊する微生物を捕集機により吸引して捕集し、微生物中の遺伝子分析を行う微生物検知システムにおいて、前記捕集機に設置され捕集材に前記微生物を捕集した後、前記捕集機から取り出し分析装置にセットされる捕集チップと、前記捕集チップを前記分析装置にセットした状態で、前記捕集チップ内の試薬を送液し、前記捕集チップの中で前記微生物の芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う分析装置と、試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、正面に開口された試料注入口と、背面に開口されたチップポートと、を有した分析チップと、を備え、前記捕集チップで処理された液の一部が前記分析チップへ移され、前記分析装置の送液手段により前記分析チップの中で遺伝子の抽出から検出までの処理が行われるものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、微生物の捕集から遺伝子の検出までを安全かつ短時間にチップ上で簡易に行うことができる分析システムを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
近年では微生物の遺伝子を増幅し、その遺伝子を検出することで目的微生物の有無を判別する遺伝子検査法も取り入れられ、例えば、炭そ菌やセレウス菌などの細菌は、周囲に水分が少なく、栄養が枯渇した状況になると数時間内で芽胞を形成する。この芽胞は非常に固い殻状の物質で、熱，化学物質，紫外線等に強い抵抗力を持つため、適切な芽胞の処理が必要である。しかしながら、芽胞処理や細菌からの遺伝子抽出の工程が、従来はすべて手操作で行われていた。そして、操作が非常に煩雑で検査者が限定される上に検査者に感染の恐れがあること、さらには手操作で使用する反応容器やピペット等がすべて汚染された廃棄物となり、二次汚染の恐れも懸念されると共に、分析精度の不安定化を招く恐れがあった。
【００１１】
芽胞を形成した細菌を大気中から捕集し、芽胞を処理した後に細菌から遺伝子を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子を増幅させることで、対象の細菌が存在するか否かを検出する例を説明する。芽胞を形成する細菌とは、バチルス属菌，クロストリディウム属菌等の細菌である。
【００１２】
（細菌検知の流れ）
細菌検知は大きく分けて、細菌の捕集工程、細菌芽胞に発芽促進剤を添加して細菌芽胞を発芽させる工程と、発芽した細菌から遺伝子を抽出する工程、遺伝子を増幅・検出する工程とからなる。遺伝子の抽出は、一般的に知られる固相抽出法により行う。固相抽出法とは、まず固体表面に遺伝子を特異的に結合させ、次に他物質と区別して遺伝子のみを水溶液に溶離させることで抽出する方法である。
【００１３】
図１を参照して、細菌の検知方法を説明する。
ステップ１・・・衝突法による細菌の捕集
衝突法は、ノズルの上から空気を吸引してノズル下方に高速で噴出させ、ノズルの下に設けた衝突板に細菌を捕集する方法である。空気中の細菌はその粒径の２乗に比例した慣性力を得て、衝突板に付着する。フィルタ法のように目詰まりを起さず、細菌が濃縮されて集まるという利点がある。
ステップ２・・・芽胞の発芽
細菌芽胞に発芽促進剤を加え、一定時間を経過すると細菌芽胞が発芽を開始する。発芽する段階で、細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。
ステップ３・・・細胞膜の溶解
試料にカオトロピックイオン（分子の直径が大きい−１価の陰イオン）を含む溶液を混合し、細菌の細胞膜をカオトロピックイオンの働きにより破壊する。またカオトロピックイオンは、同時に試料中に含まれる多くの蛋白質を変性し、ヌクレアーゼ（核酸を分解する酵素）の働きを阻害する。
ステップ４・・・遺伝子の捕獲
溶解後の混合物にシリカが加わると、カオトロピックイオンの働きにより、遺伝子とシリカが特異的に結合する。一般的には混合物をガラスフィルタに通す方法が用いられる。
ステップ５・・・遺伝子の洗浄
試料に含まれる蛋白質や、カオトロピックイオンが抽出物に混入すると、遺伝子増幅による遺伝子の検出を阻害するので、遺伝子−シリカを洗浄する操作が必要となる。通常では高濃度のエタノールにより洗浄する。遺伝子はこれらの溶液に溶解しにくい性質を持っているため、シリカに吸着している遺伝子はこの過程で溶離しない。
ステップ６・・・遺伝子の溶離
洗浄後、水もしくは低塩濃度の溶液を遺伝子−シリカに加え、遺伝子をシリカから溶離する。
ステップ７・・・遺伝子の検出
溶離した遺伝子にプライマ（目的とするＤＮＡ領域の両末端の２０塩基ほどと同じ塩基配列をもつ一本鎖ＤＮＡ），ＤＮＡ合成酵素（ポリメラーゼ）と四種類の基質(ｄＮＴＰ)等を加え、温度サイクル「熱変性−アニーリング−相補鎖の合成」をかけることで遺伝子は増幅する（ポリメラーゼ連鎖反応）。ここで上記試薬に加え、蛍光色素を予め注入しておき、励起光を照射しながら温度サイクルをかけることで、遺伝子の増幅をリアルタイムに検出することができる。
【００１４】
（分析システムの構成）
図２は、分析システムの構成を示し、分析システムは捕集機１００，捕集チップ２００，分析装置４００，分析チップ３００の４つから構成される。大気中に浮遊する細菌を捕集機１００により吸引し、捕集機１００に設置された捕集チップ２００の捕集材２０１
（図５および図６参照）に細菌を捕集する。捕集チップ２００を捕集機１００から取り出し、捕集チップ２００の捕集材収納部２０３（図５および図６参照）の開口をシール材で閉塞し、あるいは捕集チップ２００の開口をシール材で閉塞してから捕集機１００から取り出し、分析装置４００にセットする。
捕集材に微生物が付着した状態で前記開口部をシール材で封止してなる捕集チップ200を分析装置４００にセットする。捕集チップ２００の開口をシール材で閉塞して取り扱うことにより、捕集チップ２００を安全に取り扱うことができる。分析装置４００には送液手段が備えられており、捕集チップ２００を分析装置４００にセットした状態で、捕集チップ２００内の試薬を送液し、捕集チップ２００の中で細菌芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う。複数の試薬が予め内蔵された捕集チップ２００を用いて細菌を捕集し、細菌を捕集した捕集チップ２００をそのまま用いて次の複数の微生物検知処理に移行できるので、使い勝手良く捕集から微生物検知処理まで移行できる。
【００１５】
次いで、捕集チップ２００を分析装置４００から取り出し、捕集チップ２００で処理された液（既に細菌は溶解して破壊されているため、触れても汚染されることはない）の一部を分析チップ３００に移す。
分析チップ３００を分析装置４００にセットする。この時、分析チップ３００は捕集チップ２００がセットされた部位と同じ場所にセットされるようになっている。分析チップ３００には図１のステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までの試薬が予め内蔵されている。分析チップ３００を分析装置４００にセットした状態で、分析装置４００の送液手段により分析チップ３００内の試薬を送液し、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までを行う。そして分析終了後、分析チップ３００を分析装置
４００から取り出し、分析チップ３００を廃棄する。
【００１６】
２種類の微生物検知チップ（捕集チップ２００，分析チップ３００）の中に、細菌の前処理から検出に至るまでの工程に必要な試薬が全て内蔵されており、煩雑な試薬操作を省略することができる。すなわち、従来の分析では、試料である細菌に試薬を加えて処理をしたのちに別の容器に移し、といった具合に試料がいくつもの容器を介して動いていくため、煩雑かつ検査者に汚染の恐れがあった。しかしながら、２種類のチップ２００，300間での試料の受け渡しの工程以外は、試料がチップから出ることはなく、閉じられた系において分析がおこなわれるため、非常に安全である。
また廃棄物はチップ２００，３００のみとすることができ、このチップ２００，３００を焼却可能な素材にしておくことで、二次汚染の危険性を低減することができる。さらに、２種類のチップ２００，３００に内蔵される試薬は、一検査分のみであり、チップ200，３００は使い切りとすることができることから、屋外で簡便に遺伝子レベルの高精度な細菌検査を行うことができる。
試薬を内蔵した２種類のチップ２００，３００を細菌の捕集から溶解までを処理する捕集チップ２００とそれ以降の分析処理をする分析チップ３００とに分けているので、捕集から溶解までの処理が同一である試料を用いて複数回の分析が容易となり、安全性を確保しつつ、分析精度の向上を容易に図ることができる。
【００１７】
（捕集機の構成）
図３，図４を参照して本発明による捕集機の例を説明する。図３は本例の捕集機１００の透視斜視図、図４（ａ）は本例の捕集機１００の蓋部１１０およびチップ支持部１３０を開いた状態を示す図、図４（ｂ）は図４（ａ）から捕集チップ２００を装着して支持部１３０を閉じた状態を示す図である。
【００１８】
捕集機１００は、蓋部１１０，ノズル部１２０，一次フィルタ１２１，チップ支持部
１３０，二次フィルタ１４０，支持板１５０，ファンモータ１６０，排出口１７０，制御部１８０，表示部１８１，バッテリ１８５およびケーシング１９０を有する。
蓋部１１０はノズル部１２０を有する正方形または短形の部材からなり、両側面に固定手段を有する。ノズル部１２０の内径は捕集効率に大きく関係し、ノズルの内径を１０
［mm］より小さくするほど、細菌を濃縮して捕集することができるが、ノズル部１２０を通過する空気流速が増大するため、圧力損失が増加する。圧力損失は、空気流速の２乗に比例して増加するので、ファンモータ１６０の負荷が増加し、バッテリ１８５の電圧が低下する。例えば、ノズル部１２０の内径を３mm以下とすると、可搬型の細菌捕集機１００に搭載可能なバッテリ１８５（リチウム−水素）で駆動可能な仕事量を超える。従って、ノズル部１２０の内径Ｗは４〜１５mmが適当である。より好ましくは、ノズル部１２０の内径Ｗを８〜１２mmにすると良い。これにより、高い捕集効率を得ながら、ノズル部120の直下に細菌を濃縮して捕集することができる。
ノズル部１２０には一次フィルタ１２１が装着されている。一次フィルタ１２１は、大気中の粗大粒子をトラップするために設ける。したがって、その目開きは１００〜２００μｍが望ましい。花粉の飛散量が増加する時期には、目開きが１０〜１００μｍであることが望ましい。それにより、粒子径１０μｍ以上の花粉と粒子径１０μｍ未満の細菌とを簡便に分級することができる。一次フィルタ１２１は、蓋部１１０から着脱可能で、洗浄と高温滅菌が容易なステンレス製または弗素樹脂製が好ましい。
【００１９】
チップ支持部１３０は二次フィルタ１４０の上（前方）に設置される。チップ支持部
１３０は開閉式になっており（図４）、捕集チップ２００を挟んで蓋を閉めることで捕集チップ２００を容易に捕集機１００にセットすることができる。チップ支持部１３０は捕集チップ２００のいわば外周に相当するため、細菌が付着しやすい。よって、チップ支持部１３０は二次フィルタ１４０から着脱可能で、洗浄と高温滅菌が容易なステンレス製または弗素樹脂製が好ましい。
二次フィルタ１４０は支持板１５０に設置され、捕集チップ２００で捕集できなかった細菌等の微粒子が排出口１７０から大気中に放出されることを防止するために設ける。二次フィルタ１４０には、０.３μｍ以上の微粒子を９９.９７％以上捕集可能なＨＥＰＡ
（High Efficiency Particulate Air）フィルタを使用することが好ましい。また、０.１〜０.２μｍの微粒子を９９.９９９％以上捕集可能なＵＬＰＡ（Ultra Low Penetration Air）フィルタを使用することが更に好ましい。ＵＬＰＡを用いることにより、排出口
１７０から大気に放出する空気の清浄度を更に上げることができる。なお、ケーシング
１９０内には、制御部１８０，表示部１８１、およびバッテリ１８５が設けられている。ケーシング１９０の上面には掴み部１９１が設けられている。
次に、本例の捕集機１００の動作を説明する。
ファンモータ１６０を駆動すると、大気はノズル部１２０に吸引される。吸引された大気はノズルによって加速され、一次フィルタ１２１を通過する。このとき、一次フィルタ１２１によって空気中の粗大粒子が除去される。蓋部１１０内に導入された空気中の微粒子は、捕集チップ２００の中央に設けた捕集材に慣性衝突して付着する。蓋部１１０内に導入された空気は二次フィルタ１４０を通過し、ファンモータ１６０の下部の排出口170より外部へ排出される。二次フィルタ１４０によって、捕集チップ２００に捕集されなかった微粒子が除去される。
【００２０】
（捕集チップの構成，動作）
図５、図６を参照して捕集チップ２００の例を説明する。図５は捕集チップ２００の正面図、図６は捕集チップ２００の縦断面図である。
捕集チップ２００は、図１におけるステップ１（細菌の捕集）からステップ３（細胞膜の溶解）までを担う。すなわち、まず捕集チップ２００を捕集機１００にセットして細菌を捕集したのち（ステップ１）、捕集チップ２００を捕集機１００から取り外し、捕集チップ２００を後述の分析装置４００にセットして、ステップ２（芽胞の発芽）からステップ３（細胞膜の溶解）までの工程を行う。
捕集チップ２００は、チップの構成要素をかたどる凹凸パターンをフォトリソグラフィー技術により作製し、このパターンを樹脂に転写成形して成型したものである。２枚の樹脂を張り合わせることで、樹脂に刻まれたパターンが流路となる。チップの材料として、加工費用が高く、また割れやすいガラスよりも、廃棄処理性に優れる樹脂が好ましい。樹脂の種類は特に限定されるものではないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：ダウコーニングアジア社製，シルポット１８４）を使用することが良く、本チップには以下の特性を備えることが好ましい。
・生体適合性良好（通常のシリコンゴムは生理的に不活性）
・サブミクロンの精度で型の転写が可能（硬化前は低粘度で流動性に富むため、複雑な形状の細部まで良好に浸透）
・低コスト（８円／１グラム。従来の汎用マイクロデバイス材料であるガラス材は１ｋ円／１グラムであり１／１００以下）
・焼却により容易に廃棄可能
捕集チップ２００は、大気中から微生物（本実施例では芽胞を形成した細菌）を付着して捕集する捕集材２０１と、捕集材２０１を装着した薄い板状の基板とを備えている。この捕集チップ２００は、捕集材２０１を収納する捕集材収納部と、複数の試薬保管槽
（２１０，２２０，２３０，２４０）、チップ背面に開口されたチップポート２１１，
２２１，２３１，２４１と、チップ正面に開口された空気穴２５０とを有している。
複数の試薬保管槽は、発芽促進剤を保管する発芽促進剤保管槽２１０と、２種類の細胞壁溶解液を保管する酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピックイオンを保管するカオトロピック保管槽２４０とを有している。そして、複数の試薬保管槽
２１０〜２４０は、捕集材収納部の周囲を取り囲むように配置されている。これにより、捕集チップ２００をコンパクトなものとすることができる。
【００２１】
試薬保管槽２１０〜２４０は細長い流路によって構成され、いずれの試薬保管槽も、流路を持った形状が好ましい。試薬保管槽内２１０〜２４０の試薬を送液するためには、試薬保管槽２１０〜２４０の背後から気体を試薬保管槽２１０〜２４０に送る。試薬保管槽２１０〜２４０が細長い流路形状でなかった場合、気体の通り抜けやすい部位のみ試薬が押し出され、その他の部位の試薬が試薬保管槽に残ることになる。消費する試薬の量を減らすために、試薬保管槽２１０〜２４０を流路形状にするのが効果的である。
流路の断面形状は、横／縦１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、流路天井部の樹脂がたわんで流路の矩形構造が崩れ、送液の障害となる恐れがある。試薬保管槽
２１０〜２４０の細長い流路は、蛇行状に形成し、基板における流路の占有面積を小さなものとしつつ、流路における試薬の保管容量を確保することができる。
【００２２】
試薬保管槽２１０〜２４０の一端は捕集材収納部２０３に接続され、試薬保管槽２１０〜２４０の他端にはチップポート（２１１〜２４１）が連通して接続されている。試薬保管槽２１０〜２４０の一端側および他端側にそれぞれ堰２０４が設けられている。これにより、各試薬保管槽２１０〜２４０の保管される試薬の流出をより確実に防止することができる。
チップポート２１１〜２４１は、外部の流路との接点を構成する。発芽促進剤保管槽
２１０と、酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピック保管槽２４０はいずれも、捕集材収納部２０３と連通している。従って、捕集材収納部２０３は、発芽促進剤保管槽２１０と、酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピック保管槽２４０、およびチップポート２１１〜２４１を介して外部の流路に接続されている。なお、試薬保管槽２１０〜２４０の流路幅を５０〜１００μｍまで狭めることで、捕集材収納部２０３の側からの空気の流入を防ぐことができる。
【００２３】
発芽促進剤保管槽２１０の体積は２０〜１００μＬ、酵素Ａ保管槽２２０の体積は２０〜１００μＬ、酵素Ｂ保管槽２３０の体積は５〜２０μＬ、カオトロピック保管槽２４０の体積は４００〜８００μＬが好ましい。カオトロピックイオンの体積が、発芽促進剤と２種類の細胞壁溶解液の体積和の２倍以上とすることで、細胞膜の破壊が促進される。より好ましくは４倍以上、最適なのは、８倍以上である。
【００２４】
捕集材２０１としてゲル表面の自由水（ゲル網目間の水）由来の「付着性」を有する寒天が好適であり、寒天濃度は２〜５％にするのが良く、寒天濃度３〜４％が最適である。寒天濃度が２％未満では水分が多いため、高速の空気が当たり続ける捕集材２０１として強度不足である。一方、寒天濃度が６％より大きいと、寒天表面の水分（自由水）が少なくなり、付着性が著しく低下する。
寒天の強度を上げ、かつ水分の蒸発を防止するため、アルコール類を添加すると良く、凍結防止，乾燥防止，ゲル強化剤として作用する。具体的には、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、１，３−ブタンジオール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどが挙げられる。アルコール類の添加量は、寒天の４０〜８０％、好ましくは５０〜７０％が好ましい。アルコール類が４０％未満では、水分の蒸発防止が十分でない。また、８０％を超えると寒天表面の水分（自由水）が少なくなり、付着性が低下する。
【００２５】
捕集チップ２００の使用方法の一例を説明する。
捕集チップ２００を捕集機１００のチップ支持台に取り付けて、一定時間大気を吸引する。大気の吸引量は、例えば約１０００Ｌである。大気中の細菌は捕集チップ２００の捕集材２０１表面に付着する。次に、捕集チップ２００をチップ支持台から外し、捕集チップ２００の捕集材収納部２０３の開口面をシールで封止した後に捕集チップ２００を分析装置４００にセットする。捕集材収納部２０３の封止は、手動でも良いが、捕集機にシール機構がついていることがより好ましい。捕集材収納部２０３の封止により、細菌が捕集チップ２００の外部に露出することがなくなり、より安全となる。
捕集チップ２００の試薬保管槽２１０〜２４０はチップポート（２１１〜２４１）を介して分析装置４００の流路と接続されているので、分析装置４００の流路側から所定の制御動作で気体をチップポート２１１〜２４１を介して供給することにより、試薬保管槽
２１０〜２４０に予め封入された発芽促進剤，細胞壁溶解液，細胞膜溶解液、およびカオトロピックイオンが所定時間ごとに捕集材収納部２０３内（捕集材２０１上）に送液される。捕集材収納部２０３の上正面は封止されているが、空気穴２５０が捕集材収納部203の一部に連通しており、空気穴２５０は大気開放となっているので、試薬の送液の際に捕集材２０１の上に存在する空気は空気穴２５０より放出される。
【００２６】
試薬保管槽２１０〜２４０から捕集材２０１へ試薬を送液することについての詳細を説明する。
捕集材２０１に発芽促進剤を１００μＬ送液する。ここで発芽促進剤としては、アラニン，アデノシン，グルコースを含むブイヨンが好ましい。特にＬ−アラニンを１ｍＭ〜
１０ｍＭ含有するブイヨンが最適である。そして１０分以上を経過すると細菌芽胞が発芽を開始し、３０分間経過すると、全体の５０％以上が発芽する。よって、芽胞の発芽処理は３０分以上が好ましい。細菌芽胞を発芽させるのにより好ましいのは３５〜４０℃であり、最も好ましいのは３５〜３７℃である。細菌芽胞が発芽する段階で細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。
次に、細菌の細胞壁を壊す２種類の蛋白質変性酵素を順次捕集材２０１に送液し、至適温度に一定時間保持する。酵素処理の時間はそれぞれ１０分以上が望ましく、３０分が好適である。ここで蛋白質変性酵素としては、リゾチーム（至適温度：３７℃）１００μＬとプロテアーゼＫ（至適温度：５５〜６０℃）２０μＬが好適である。これらの酵素処理により、捕集チップ２００内の細菌は細胞膜がむき出しの状態になる。なお、発芽促進剤とリゾチームは同じタイミングで注入して処理することも可能であるが、リゾチームとプロテアーゼＫを同時に添加することは酵素活性が低下するため好ましくない。
【００２７】
最後に、カオトロピックイオン８００μＬを捕集材２０１に送液すると、細菌の細胞膜が破壊され、細菌の遺伝子が細胞外部に放出される。ここでカオトロピックイオンとしては、グアニジンチオシアン酸塩，グアニジン塩酸，ヨウ化ナトリウム，臭化カリウムが挙げられる。チップの使用方法として、チップの冷蔵あるいは冷凍により試薬の活性を長期間維持する方法が考えられる。よって、チップに封入し、冷蔵あるいは冷凍をした際に組成の変化が極めて少ないグアニジン塩酸が好適である。
またカオトロピック塩に界面活性剤や緩衝剤を含有させることが好ましい。界面活性剤として特に限定はされないが、ツイーン−２０やトリトンＸ−１００等が挙げられる。緩衝剤として特に限定はされないが、トリス−塩酸塩，リン酸２水素カリウム−４ホウ酸ナトリウム等が挙げられる。
以上の工程により、捕集チップ２００に捕集した細菌の芽胞および細胞壁を処理することができる。すなわち、図１におけるステップ２〜３までをチップ上で自動化することができるため、試薬の分注操作を省略することができる。捕集チップ２００は細菌の捕集から前処理までの工程を担い、分析チップ３００は細菌遺伝子の分析工程を担う。分析の精度を上げるために、同一の試料に対して複数回の分析、或いはターゲットの細菌を複数設定するためには、１枚の捕集チップ２００で処理したサンプルを複数の分析チップ３００に分配したほうが好適であり、２種類のチップ２００，３００を供している。
【００２８】
なお、この捕集チップ２００を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で捕集チップ２００を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。
【００２９】
（分析チップの構成，動作）
図７から図１０を参照して分析チップ３００を具体的に説明する。図７は分析チップ
３００の正面図、図８は図７のＡ−Ａ′断面図である。なお、図８は分析チップ３００を縦置きにしたときの断面図である。
分析チップ３００は、図１におけるステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までを担う。捕集チップで処理された液の一部を移した状態の分析チップ分析装置４００にセットする。分析チップ３００には、図１のステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までの処理に用いられる試薬が予め内蔵されている。分析チップ３００を分析装置４００にセットした状態で、分析装置４００には送液手段を動作させて分析チップ３００内の試薬を送液し、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までの処理を行う。なお、分析チップ３００の素材は捕集チップ２００と同様の樹脂である。
【００３０】
分析チップ３００にはチップ正面に開口された試料注入口３１０と、試料溜め３１５と、遺伝子結合担体を流路に充填した遺伝子抽出エリア３２０と、廃液槽３３０と、洗浄液Ａを保管する洗浄液Ａ保管槽３４０と、洗浄液Ｂを保管する洗浄液Ｂ保管槽３５０と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽３６０と、遺伝子増幅試薬Ａを保管する遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０と、遺伝子増幅試薬Ｂを保管する遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽３９０と、チップ背面に開口されたチップポート３１１，３３１，３４１，３５１，３６１，３７１，３８１とを有している。これらの試薬保管槽３４０〜３８０の断面形状は、捕集チップと同様に横／縦１０以下が好ましく、横２mm，縦３mmで形成されている。一方、試薬保管槽３４０〜３８０以外の流路の断面は、試薬保管槽３４０〜３８０よりも小さいことが好ましく断面積として１／４以下が好ましい。分析チップ３００は、光造形法によって作成した樹脂の型から転写して作成する。光造形法によって作成する樹脂は滑らかな曲線で構成するのが困難であるため、矩形構造を基本としている。よって、矩形構造の樹脂型から転写される分析チップの流路断面も必然と矩形となる。矩形の流路に試薬を流すと、流路の四隅に試薬が付着しやすく、残存する。流路に残存した試薬が次に流れてきた試薬と混じっていくため、分析精度を悪化させていく。よって、流路の断面を小さくすることで、流路壁面への試薬の付着を抑制し、試薬のキャリーオーバーを防止するため、横０.５mm，縦０.５mmで形成した。なお、分析チップを縦置きにした時、試薬保管槽３４０〜３８０内の試薬が自然流出しないように、試薬保管槽をＵの字にする、もしくは試薬保管槽から連通する流路を一度上方に向けるのが良い。
【００３１】
試料溜め３１５，廃液槽３３０、および試薬保管槽３４０〜３８０の一端にはチップポート３１１〜３８１が形成されている。チップポート３１１〜３８１は、外部である分析装置４００の流路との接点となる。試薬保管槽３４０〜３８０内の試薬を送液するために、チップポート３４１〜３８１を介してチップの外部である分析装置４００から気体を試薬保管槽３４０〜３８０に送る。気体としては、酸素は試薬を酸化させ、また二酸化炭素は試薬のｐＨを変化させる恐れがあることから、不活性な窒素，ヘリウム，アルゴン等が望ましい。
試料溜め３１５と、洗浄液Ａ保管槽３４０と、洗浄液Ｂ保管槽３５０と、溶離液保管槽３６０はいずれも遺伝子抽出エリア３２０に連通している。溶離液に試料や洗浄液Ａが混入すると遺伝子の検出に阻害をおこすため、溶離液保管槽３６０は試料溜め３１５と洗浄液Ａ保管槽３４０から離れた位置に配置することが好ましい。
【００３２】
遺伝子増幅試薬保管槽Ａと、遺伝子増幅試薬保管槽Ｂは反応槽３９０に連通している。遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０から反応槽３９０に送られた遺伝子増幅試薬Ａ、および遺伝子増幅試薬保管槽Ｂから反応槽３９０に送られた遺伝子増幅試薬Ｂが一度反応槽３９０に入ったのち、反応槽から逆流しないように、遺伝子増幅試薬保管槽Ａおよび遺伝子増幅試薬保管槽Ｂは反応槽３９０の上方から連通している。
試料溜め３１５の体積は１００〜２００μＬ、遺伝子抽出エリア３２０の体積は１００〜２００μＬ、洗浄液Ａ保管槽３４０の体積は２００〜３００μＬ、洗浄液Ｂ保管槽350の体積は５０〜１００μＬ、溶離液保管槽３６０の体積は１０〜２０μＬ、遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０の体積は２０〜４０μＬ、遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０の体積は１０〜２０μＬが好ましい。
【００３３】
遺伝子抽出エリア３２０に充填する遺伝子結合担体として、石英ウール，ガラスウール，ガラスファイバー，ガラスビーズが適用可能である。ガラスビーズ適用の際は、接触面積を大きくするためにビーズサイズを５０μｍ以下とするのが好ましく、流路への堰き止めを考慮すると２０〜３０μｍが最適である。遺伝子保持担体を堰きとめるために、遺伝子抽出エリア３２０を構成する流路中に１箇所以上の堰３２５を設けるのが好ましい。図９に、堰の構成の一例を示す。遺伝子抽出エリア３２０の流路中、流路幅を数箇所１５〜２０μｍまで狭めることで、狭められた流路が遺伝子結合担体に対して堰となる。流路を１０μｍ未満にすると流体抵抗が大きく流体制御が困難になる。よって、堰３２５としての流路幅は１５〜５０μｍが好適である。
廃液槽３３０に廃液として流れ込むのは試料，洗浄液Ａ、および洗浄液Ｂである。これらの液は直接的に人体に影響を及ぼすものではないが、廃液槽３３０から外部に出ない構造とする必要がある。図１０に、廃液槽の構成の一例を示す。廃液槽３３０内に、２種類の吸収剤３３２，３３３を充填した例を示している。吸収剤３３２としては体積膨張が殆どなく、また安価なコットン，和紙等が好適である。また二番目の吸収剤３３３として、アクリルアミドがさらに最適である。アクリルアミドはコットン，和紙に比べてややコスト高であるが、吸収能力が非常に高く、アクリルアミドは吸液と共に著しく体積膨張する特性を有している。すなわち、アクリルアミドは廃液槽内の廃液を吸収しながら体積膨張し、廃液槽の容積を狭めて廃液槽内の圧力を高めていく。分析チップは、後述のように廃液槽の直前で試薬を分岐させる部分がある。廃液槽に試薬が入らないようにするために、分岐側の流路よりも圧力を高める必要がある。すなわち、廃液槽に吸収剤を充填するのは、分析チップから廃液がチップ外に漏れ出さないよう吸収するのみならず、廃液槽内の圧力を吸収剤の体積膨張により積極的に調整する役割を果たす。その意味で、吸収剤３３２に比べて少量のアクリルアミドを吸収剤３３３とするのが好ましい。
【００３４】
さらに、廃液槽３３０からの廃液漏れを抑制する手段として、廃液槽３３０内部を親水処理することが有効である。チップの材料である樹脂素材は元来疎水性であることから、廃液槽３３０に入った廃液は廃液槽３３０内部の壁面ではじかれ、廃液槽３３０の全てを廃液で満たすことは困難である。そこで、廃液槽３３０内部を親水処理することで液の濡れ性が良好となり、廃液槽３３０の底部から廃液を満たすことができる。分析チップの作成時に廃液槽３３０にプラズマを照射することで樹脂表面が改質され、簡便に親水性とすることが可能である。
【００３５】
（分析装置の構成，動作）
図１１から図１３を参照して分析装置４００の構成，動作を具体的に説明する。図１１は分析装置４００の主要な構成を、図１２は分析装置４００の断面構成、図１３は分析装置４００の基板４１０を示す図である。
分析装置４００は大きくわけて、チップ設置部，流体系，温調系、そして光学検出系の４つから構成される。まず捕集チップ２００および分析チップ３００がセットされるのは、前蓋４０１の内側に設けられた基板４１０である。両チップを縦置きにセットするので、基板４１０の下部には、チップを止めるチップストッパ４１１が備えられる。チップを基板４１０にセットして前蓋４０１を閉めると、チップは基板４１０とチップホールダ
４２０の間に固定される。基板４１０とチップホールダ４２０には、チップの温度を最適化するための温度制御機構４１５が内蔵されている。温度制御機構４１５としては、発熱体としてペルチェが良く、印加電流の向きを変えるだけでチップの昇温・冷却操作を簡便に行うことができる。
チップをセットする基板４１０には、基板流路４１２が設置されており、基板流路412の一端はチップのポートに連通し、基板流路４１２の他端は装置内流路４０２に連通している。基板４１０に予め複数の基板流路４１２が設置されることで、捕集チップ２００および分析チップ３００のいずれのチップポートにも対応することでき、分析装置４００は捕集チップ２００と分析チップ３００のプラットフォームとなり得る。
【００３６】
装置内流路４０２は、それぞれバルブ４３０を介してポンプ４４０に接続される。チップ内のある試薬槽の試薬を送液するには、バルブ４３０を切り替えてその試薬槽に連通する流路のみに送風を行う。ポンプ４４０によって送られた気体は選択された装置内流路
４０２および基板４１０流路を経てチップ内に到達し、試薬槽の試薬を送液する。試薬槽に予め所定量の試薬のみ内蔵されているので、試薬槽内の試薬をすべて時間管理で排出するのみでよく、ポンプ４４０の送液精度は求められない。よって、ポンプ４４０は、送風のみで吸引を行わない、簡素で小型なものを使用することができる。
流体を制御するバルブ４３０をチップの内部ではなく、分析装置４００側に設けることが好ましい。これにより、チップ１０１には機械部品がなくなり、小型化・ディスポーザブル化を実現することができる。
【００３７】
光検出系は、チップ反応槽３９０内の遺伝子に励起光を照射する光源４５０と、励起光の特定の波長のみを透過する励起フィルタ４５５と、チップ反応槽３９０から生じた蛍光の光路を変更するミラー４６０と、蛍光の特定の波長のみを透過する検出フィルタ４７５と蛍光を測定する光検出器４７０から構成される。光源４５０は様々な波長領域のものが使用可能であるが、波長領域の広いキセノンランプを用いる。また波長が限定される場合には、ＬＥＤを使うことでも良い。光検出器４７０としてはＣＣＤカメラ，光電子倍増管，フォトダイオード等を使用できるが、装置を小型化するにはフォトダイオードが好ましい。光検出器４７０によって検出された遺伝子の光信号は光信号変換機４８０によってデジタル化され、データ表示画面４９０に信号強度が表示される。
分析装置４００には各制御を行う制御機構を備える。分析装置４００に、バルブ４３０を制御するバルブ制御機構４３１，ポンプ４４０を制御するポンプ制御機構４４１，光源４５０を制御する光源制御機構４５１，光検出器４７０を制御する光検出器制御機構471が搭載される。機械部品を内蔵しない小型の分析チップを基板上に置いて簡便な光検出器を組み合わせるだけの、小型で可搬の分析装置を提供することが出来る。
【００３８】
（分析の手順）
分析チップ３００と分析装置４００を用いた分析の手順を図７，図１２，図１４を参照しながら説明する。図１４は流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
分析チップ３００を用いた分析の手順としては、主に以下の手順を有する。
まず、捕集チップ２００で細胞壁が溶解された細菌試料を分析チップ３００に注入し、分析チップ３００内においてこの細菌試料を遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。そして、試料に含まれる蛋白質等を洗浄する洗浄液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。
次に、遺伝子保持担体に吸着された遺伝子を溶離する溶離液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液し、さらに遺伝子を検出する反応槽へと送液する。
【００３９】
その後、分析対象の遺伝子の有無を検出する。以下に一例を具体的に説明する。
初めに、５種類の試薬、すなわち洗浄液Ａ，洗浄液Ｂ，遺伝子溶離液，遺伝子増幅試薬Ａ，遺伝子増幅試薬Ｂがそれぞれ洗浄液Ａ保管槽３４０，洗浄液Ｂ保管槽３５０，溶離液保管槽３６０，遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０，遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０に内蔵され、冷蔵あるいは冷凍保存しておいた分析を室温で解凍する。分析チップ３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵してユーザーに提供することで、分析チップ３００を１検査の使い切りとしても試薬の無駄がなく、経済性が向上する。またユーザーは試薬を各試薬保存槽に分注する手間を省くことができ、時間が短縮されるだけでなく、汚染を防ぐことも出来る。さらに、この分析チップ３００を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で分析チップ３００を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、
−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。このように、使い捨て可能な分析チップ３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵し、分析チップ
３００を冷蔵あるいは冷凍した状態でユーザーに提供することで、簡便な分析環境を作ることができる（ステップ１０１）。
【００４０】
分析チップ３００の解凍後、捕集チップ２００の処理液を分析チップ３００の試料注入口３１０に約１００μＬ移す。（ステップ１０２）
そして試料注入口３１０にカバーをして穴を塞ぐ。カバーは、分析チップ３００と同素材の薄い樹脂シートが好ましい。樹脂同士の密着性が良く、また安価であるため使い捨てに好適である。試料注入口３１０をカバーする工程は、手動でもよいが、分析装置４００側に試料注入口３１０を覆う機構が備わっているとより好ましい。（ステップ１０３）
【００４１】
次に、分析装置４００の前蓋４０１を開いて、前蓋４０１に設けられたチップガイドに沿って分析チップ３００を分析装置４００にセットした後、分析装置４００の前蓋４０１を閉める。これにより、分析チップ３００が基板４１０に固定され、チップポートと装置内流路４０２が連通する。なお分析チップ３００は横置き，縦置きいずれでも可能であるが、ここでは縦置きの場合について述べる。（ステップ１０４）
【００４２】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えて試料ポート３１１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３１１，３３１：開、他のポート：閉）。使用する流体は空気や窒素など試薬と接した時に試薬の活性が損なわれない気体であればよい。試料溜め３１５内の試料は遺伝子抽出エリア３２０に移動する。試料中のカオトロピックイオンの働きにより、試料中の細菌遺伝子は、遺伝子抽出エリア３２０に充填された遺伝子結合担体に結合する。細菌遺伝子と遺伝子結合担体との結合を促進するために、試料が遺伝子抽出エリア３２０を通過する時間は１０分以上が好ましい。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した試料は廃液槽３３０に貯まる。送液用の気体は、廃液ポート３３１に抜ける。なお、チップを縦置きにすることで、試料が廃液ポート３３１から漏れるのを防ぐことができる。（ステップ１０５）
【００４３】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３１１を閉じ、洗浄液Ａポート
３４１を開く。そして洗浄液Ａポート３４１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１，３４１：開、他のポート：閉）。洗浄液Ａ保管槽３４０内の洗浄液Ａ２００μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。洗浄液Ａとしては、グアニジンチオシアン酸塩，グアニジン塩化水素，ヨウ化ナトリウム，臭化カリウム等のカオトロピックイオンが好ましい。この洗浄液Ａにより、遺伝子抽出エリア３２０に残留する蛋白質が除去される。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液Ａは廃液槽３３０に貯まる。（ステップ１０６）
【００４４】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３４１を閉じ、洗浄液Ｂポート
３５１を開く。そして洗浄液Ｂポート３５１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１，３５１：開、他のポート：閉）。洗浄液Ｂ保管槽３５０内の洗浄液Ｂ５０μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。洗浄液Ｂとしては、５０％以上の高濃度エタノールや酢酸カリウム溶液が好ましい。洗浄液Ｂにより、遺伝子抽出エリア
３２０に残留するカオトロピックイオンが除去される。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液Ｂは廃液槽３３０に貯まる。（ステップ１０７）
【００４５】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３３１，ポート３５１を閉じ、溶離液ポート３６１および反応槽ポート３９１を開く。そして溶離液ポート３６１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３６１，３９１：開、他のポート：閉）。溶離液保管槽３６０内の溶離液１０μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。ここで溶離液としては、滅菌蒸留水，ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡやＴＲＩＳ−アセテート等のバッファ溶液が使用可能である。溶離液により、遺伝子抽出エリア３２０の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離する。溶離した遺伝子は反応槽３９０に送液される。
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えて、ポート３６１を閉じ、遺伝子増幅試薬Ａポート３７１を開く。そして遺伝子増幅試薬Ａポート３７１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３７１，３９１：開、他のポート：閉）。遺伝子増幅試薬Ａ保管槽370内の遺伝子増幅試薬Ａ１０μＬは、流体によって反応槽３９０に送液される。
【００４６】
遺伝子増幅試薬Ａとしては、４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰ），バッファ（ＴＲＩＳ塩酸，ＫＣｌ，ＭｇＣｌ2 など）、プライマなどから構成される。送液用の気体は、反応槽ポート３９１に抜ける。（ステップ１０８）
【００４７】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３７１を閉じ、遺伝子増幅試薬Ｂポート３８１を開く。そして遺伝子増幅試薬Ｂポート３８１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３８１，３９１：開、他のポート：閉）。遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０内の遺伝子増幅試薬Ｂ３０μＬは、流体によって反応槽３９０に送液される。遺伝子増幅試薬Ｂとしては、ＤＮＡ合成酵素（TaqＤＮＡポリメラーゼ，TthＤＮＡポリメラーゼ，
VentＤＮＡポリメラーゼ，サーモシーケナーゼなど），蛍光色素（エチジウムブロマイド，SYBR GREEN（Molecular Probe 製），ＦＡＭ，ＲＯＸなど）などから構成される。（ステップ１０９）
【００４８】
次に、（ステップ１１０）
以上の手順により、分析チップ３００の反応槽３９０に細菌遺伝子と２種類の遺伝子増幅試薬が導入される。
【００４９】
反応槽３９０内の細菌遺伝子を増幅・検出するために、温度制御機構４１５を駆動し、反応槽３９０の温度が下記の２種類の設定値を往復するように温度サイクルをかける。
（ステップ１１１）
【００５０】
温度サイクル例としては、下記の程度を実施する
「９０〜９５℃１０〜３０秒⇔６５〜７０℃１０〜３０秒」×３０〜４５回
好ましい一例として、以下の温度サイクルを実施する。
「９４℃３０秒⇔６８℃３０秒」×４５回
温度サイクルをかけながら、光源４５０からの励起光を反応槽３９０に照射する。遺伝子は、２本鎖の内部にインターカレートした蛍光色素を有すると、吸収した光源４５０の光エネルギーを蛍光色素に渡す（エネルギー転移）。その結果、蛍光色素は励起されて蛍光を発する。試料中に目的遺伝子が存在した場合、遺伝子が増幅するに従って発する蛍光量が増加する。よって、温度サイクルの間、光検出器４７５により反応槽３９０内の蛍光量をモニタすることで、図７に示されるように、目的遺伝子の有無をリアルタイムに検出可能となる。なお、分析チップ３００を分析装置４００に縦置きにセットすることにより、温度サイクル中の反応物質の一部が蒸発し、蒸気が反応槽３９０上部に滞留しても、蛍光を検出する反応槽３９０の側面は蒸気によって曇らない、よって検出感度が低下しない、という長所を有する。（ステップ１１２）
【００５１】
分析が完了した時、分析チップ３００を分析装置４００から取り出し、廃棄する（ステップ１１３）。試料や試薬の後処理が必要ない上に、反応検出部の洗浄操作が必要ないため、簡便・迅速な分析を提供することができる。
【００５２】
捕集チップおよび分析チップと、捕集機および分析装置を組み合わせて使用することで、細菌の捕集から細菌の検出までの工程が２種類の小型のチップ内で自動化される。細菌芽胞の処理や遺伝子抽出工程に人手を一切介さないため、誰でも安全に分析が可能である。さらに、細チップ内にバルブ等の機械部品が含まれないので、使い捨て用途に好適なチップが提供できる。また、反応槽や流路を微細加工により作製し容積を微小化した結果、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速，混合が迅速，反応が均一といった長所が得られる。さらにディスポーザブルなチップに予め１検査分のみの試薬を内蔵し、チップを冷蔵・冷凍した状態でユーザーに提供することで、極めて簡便・迅速な遺伝子の検出が可能、かつ分析後に試薬と共に処分しうる分析チップとすることができる。
【００５３】
実施例１において、分析チップ３００内の反応槽３９０の個数が１個の例を示した。しかし、検査する対象他に応じる等の観点で、反応槽３９０が複数個であってもよい。その場合、検査対象の各細菌に対応したプライマが必要となるため、プライマを包含する遺伝子増幅試薬Ａの保管槽も複数個必要となる。さらに、複数の反応槽３９０内の反応を検出するために光源４５０からの励起光の照射位置を反応槽３９０に対して切り替える必要があるが、１枚の分析チップ上で複数の細菌を同時に検査できる長所を有する。
【００５４】
実施例１において、捕集チップ２００と分析チップ３００をセットするチップ設置部が一つの例を示した。しかし、捕集チップ２００の処理と分析チップ３００の処理を同時に平行して行うために、チップ設置部を２箇所設けることも可能である。捕集チップ２００の処理工程では、光学検出系が不要のため、流体系，温調系を２系統にすることで２つのチップ設置部を設けることができる。装置のサイズが若干大きくなるが、捕集チップと分析チップを同時処理することで、多検体の処理時間を短縮することができる。
【００５５】
実施例１に対して、分析チップ３００の底部に、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子を設置する。圧電素子は、その電極上に付着した重さを発振周波数の変化に定量的に変換することから、微量な質量変化を反応雰囲気下で連続的に測定できる。そこで、所定の予め塩基配列が既知の様々なヌクレオチドを圧電素子に固定しておく。固定方法は次のようにすることが良い。
【００５６】
圧電素子の電極上にスパッタリング，蒸着などの方法でガラス薄膜を形成する。ガラスとしては、電極素材であるクロムやチタンと最も接着性のよいＳｉＯ2 を主成分としたものが好ましい。このガラス薄膜にアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）を添加し、１２０〜１６０℃程度でベークすると、ガラス薄膜の表面にアミノ基が固定される。ここで、電極とガラス薄膜の厚みがそれぞれ０.１ 〜１μｍであることが好ましい。双方の厚みが１μｍを超えると、圧電素子の周波数応答が悪くなるためである。さらに、アミノ基がコーティングされたガラス薄膜にヌクレオチドを塗布し、恒温恒湿槽内で３７℃、湿度９０％で１時間保温する。その後、ＵＶクロスリンカーを用いて６０ｍＪ／cm2 の紫外線を圧電素子に照射することで、ヌクレオチドは圧電素子に強固に固定される。
【００５７】
試料から遺伝子を抽出するまでの工程は実施例１と同じである。そして反応槽３９０に送液された遺伝子を温度制御機構４１３により９４℃付近まで昇温すると、遺伝子は熱変性して一本鎖となる。この一本鎖遺伝子とチップ底部上に固定されたヌクレオチドが結合したとき、圧電素子の発振周波数が変化する。よって、この周波数変化を測定することにより、固定したヌクレオチドと相補的な遺伝子の配列を読み取りが可能となる。
【００５８】
液中で圧電素子を使用した場合、液温が１℃変化すると周波数は１５〜３０Ｈｚ変化するため液温の正確な制御が必須となるが、本実施例では、遺伝子増幅試薬が不要となり、また温度サイクルが要らないため検出時間が短くなる長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の一実施の形態である細菌検知の手順を示すフローチャート図である。
【図２】一実施の形態である細菌検知システムの構成を示す図である。
【図３】捕集機の主要部の構成を示す図である。
【図４】捕集機の前端部の構成を示す図である。
【図５】捕集チップの平面構成を示す図である。
【図６】捕集チップの断面構成を示す図である。
【図７】分析チップの平面構成を示す図である。
【図８】分析チップの断面構成を示す図である。
【図９】分析チップの遺伝子抽出エリアの堰を示す図である。
【図１０】分析チップの廃液槽の構成を示す図である。
【図１１】分析装置の主要部の構成を示す図である。
【図１２】分析装置の断面構成を示す図である。
【図１３】分析装置の基板の構成を示す図である。
【図１４】流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
【符号の説明】
【００６０】
１００…捕集機、１１０…蓋部、１２０…ノズル部、１３０…チップ支持部、１５０…支持板、１６０…ファンモータ、１７０…排出口、１８０…制御部、１８１…表示部、
１８５…バッテリ、１９０…ケーシング、１９１…掴み部、２００…捕集チップ、２０１…捕集材、２４１…チップポート、３００…分析チップ、３１０…試料注入口、３１５…試料溜め、３２０…遺伝子抽出エリア、３３０…廃液槽、３４０…洗浄液Ａ保管槽、350…洗浄液Ｂ保管槽、３６０…溶離液保管槽、３７０…遺伝子増幅試薬Ａ保管槽、３８０…遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽、３９０…反応槽、４００…分析装置。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大気中に浮遊する微生物を捕集し、微生物中の遺伝子を抽出して微生物の遺伝子分析を行う微生物検知システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
大気中に浮遊する微生物を捕集するため、ポータブル型空中浮遊菌サンプラを用いて大気を吸引し、シャーレに設けた培地に微生物を高速で衝突させて培地上に微生物を捕集することが知られ、例えば特許文献１に記載されている。
【０００３】
また、取り扱いが容易で安価、かつ試料から遺伝子の抽出・分析までが一括して自動化可能とするため、遺伝子を含む試料が供給される注入口と、注入口に供給された試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、試料と溶解液とを混合した液が導入され、遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、溶離液により溶離された遺伝子が導入される反応部と、を備えた遺伝子処理チップを用いることが、特許文献２に記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−１２５８４３号公報
【特許文献２】特開２００５−６５６０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載のものは、微生物の組織・細胞の培養に使用する培地の上に捕集した微生物の分析を行うことについては述べられてなく、培地上で微生物を培養して微生物が増殖するかを観察する、いわゆる培養法による検知方法を用いたとしても微生物の培養に２〜７日間を要する。
【０００６】
また、特許文献２に記載のものでは、遺伝子を含む試料を注入口より供給しなければならないので、遺伝子処理チップとして試料を捕集するときから用いることができず、捕集から遺伝子処理へ移行する使い勝手が良いものではなかった。
さらに、一つの遺伝子処理チップで全ての遺伝子処理工程を行うものであるため、遺伝子処理チップが大型化し、分析装置の大型化を招くと共に、高価になる恐れがあった。そして、同一試料および同一の分析装置を用いて複数回の分析を行って分析精度の向上を図ろうとすると、全処理工程を再度行うことが必要となり、分析に長時間を要するばかりでなく、遺伝子処理チップを複数用いることになるので、コストアップとなる。
【０００７】
本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決し、捕集から遺伝子分析に至るまでの操作性を良好とし、短時間で、かつ精度よく微生物の検知を可能なものとすることにある。
また、他の目的は使用する機器を小型で安価にし、安全性を確保することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明は、大気中に浮遊する微生物を捕集機により吸引して捕集し、微生物中の遺伝子分析を行う微生物検知システムにおいて、前記捕集機に設置され捕集材に前記微生物を捕集した後、前記捕集機から取り出し分析装置にセットされる捕集チップと、前記捕集チップを前記分析装置にセットした状態で、前記捕集チップ内の試薬を送液し、前記捕集チップの中で前記微生物の芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う分析装置と、試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、正面に開口された試料注入口と、背面に開口されたチップポートと、を有した分析チップと、を備え、前記捕集チップで処理された液の一部が前記分析チップへ移され、前記分析装置の送液手段により前記分析チップの中で遺伝子の抽出から検出までの処理が行われるものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、微生物の捕集から遺伝子の検出までを安全かつ短時間にチップ上で簡易に行うことができる分析システムを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
近年では微生物の遺伝子を増幅し、その遺伝子を検出することで目的微生物の有無を判別する遺伝子検査法も取り入れられ、例えば、炭そ菌やセレウス菌などの細菌は、周囲に水分が少なく、栄養が枯渇した状況になると数時間内で芽胞を形成する。この芽胞は非常に固い殻状の物質で、熱，化学物質，紫外線等に強い抵抗力を持つため、適切な芽胞の処理が必要である。しかしながら、芽胞処理や細菌からの遺伝子抽出の工程が、従来はすべて手操作で行われていた。そして、操作が非常に煩雑で検査者が限定される上に検査者に感染の恐れがあること、さらには手操作で使用する反応容器やピペット等がすべて汚染された廃棄物となり、二次汚染の恐れも懸念されると共に、分析精度の不安定化を招く恐れがあった。
【００１１】
芽胞を形成した細菌を大気中から捕集し、芽胞を処理した後に細菌から遺伝子を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子を増幅させることで、対象の細菌が存在するか否かを検出する例を説明する。芽胞を形成する細菌とは、バチルス属菌，クロストリディウム属菌等の細菌である。
【００１２】
（細菌検知の流れ）
細菌検知は大きく分けて、細菌の捕集工程、細菌芽胞に発芽促進剤を添加して細菌芽胞を発芽させる工程と、発芽した細菌から遺伝子を抽出する工程、遺伝子を増幅・検出する工程とからなる。遺伝子の抽出は、一般的に知られる固相抽出法により行う。固相抽出法とは、まず固体表面に遺伝子を特異的に結合させ、次に他物質と区別して遺伝子のみを水溶液に溶離させることで抽出する方法である。
【００１３】
図１を参照して、細菌の検知方法を説明する。
ステップ１・・・衝突法による細菌の捕集
衝突法は、ノズルの上から空気を吸引してノズル下方に高速で噴出させ、ノズルの下に設けた衝突板に細菌を捕集する方法である。空気中の細菌はその粒径の２乗に比例した慣性力を得て、衝突板に付着する。フィルタ法のように目詰まりを起さず、細菌が濃縮されて集まるという利点がある。
ステップ２・・・芽胞の発芽
細菌芽胞に発芽促進剤を加え、一定時間を経過すると細菌芽胞が発芽を開始する。発芽する段階で、細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。
ステップ３・・・細胞膜の溶解
試料にカオトロピックイオン（分子の直径が大きい−１価の陰イオン）を含む溶液を混合し、細菌の細胞膜をカオトロピックイオンの働きにより破壊する。またカオトロピックイオンは、同時に試料中に含まれる多くの蛋白質を変性し、ヌクレアーゼ（核酸を分解する酵素）の働きを阻害する。
ステップ４・・・遺伝子の捕獲
溶解後の混合物にシリカが加わると、カオトロピックイオンの働きにより、遺伝子とシリカが特異的に結合する。一般的には混合物をガラスフィルタに通す方法が用いられる。
ステップ５・・・遺伝子の洗浄
試料に含まれる蛋白質や、カオトロピックイオンが抽出物に混入すると、遺伝子増幅による遺伝子の検出を阻害するので、遺伝子−シリカを洗浄する操作が必要となる。通常では高濃度のエタノールにより洗浄する。遺伝子はこれらの溶液に溶解しにくい性質を持っているため、シリカに吸着している遺伝子はこの過程で溶離しない。
ステップ６・・・遺伝子の溶離
洗浄後、水もしくは低塩濃度の溶液を遺伝子−シリカに加え、遺伝子をシリカから溶離する。
ステップ７・・・遺伝子の検出
溶離した遺伝子にプライマ（目的とするＤＮＡ領域の両末端の２０塩基ほどと同じ塩基配列をもつ一本鎖ＤＮＡ），ＤＮＡ合成酵素（ポリメラーゼ）と四種類の基質(ｄＮＴＰ)等を加え、温度サイクル「熱変性−アニーリング−相補鎖の合成」をかけることで遺伝子は増幅する（ポリメラーゼ連鎖反応）。ここで上記試薬に加え、蛍光色素を予め注入しておき、励起光を照射しながら温度サイクルをかけることで、遺伝子の増幅をリアルタイムに検出することができる。
【００１４】
（分析システムの構成）
図２は、分析システムの構成を示し、分析システムは捕集機１００，捕集チップ２００，分析装置４００，分析チップ３００の４つから構成される。大気中に浮遊する細菌を捕集機１００により吸引し、捕集機１００に設置された捕集チップ２００の捕集材２０１
（図５および図６参照）に細菌を捕集する。捕集チップ２００を捕集機１００から取り出し、捕集チップ２００の捕集材収納部２０３（図５および図６参照）の開口をシール材で閉塞し、あるいは捕集チップ２００の開口をシール材で閉塞してから捕集機１００から取り出し、分析装置４００にセットする。
捕集材に微生物が付着した状態で前記開口部をシール材で封止してなる捕集チップ200を分析装置４００にセットする。捕集チップ２００の開口をシール材で閉塞して取り扱うことにより、捕集チップ２００を安全に取り扱うことができる。分析装置４００には送液手段が備えられており、捕集チップ２００を分析装置４００にセットした状態で、捕集チップ２００内の試薬を送液し、捕集チップ２００の中で細菌芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う。複数の試薬が予め内蔵された捕集チップ２００を用いて細菌を捕集し、細菌を捕集した捕集チップ２００をそのまま用いて次の複数の微生物検知処理に移行できるので、使い勝手良く捕集から微生物検知処理まで移行できる。
【００１５】
次いで、捕集チップ２００を分析装置４００から取り出し、捕集チップ２００で処理された液（既に細菌は溶解して破壊されているため、触れても汚染されることはない）の一部を分析チップ３００に移す。
分析チップ３００を分析装置４００にセットする。この時、分析チップ３００は捕集チップ２００がセットされた部位と同じ場所にセットされるようになっている。分析チップ３００には図１のステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までの試薬が予め内蔵されている。分析チップ３００を分析装置４００にセットした状態で、分析装置４００の送液手段により分析チップ３００内の試薬を送液し、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までを行う。そして分析終了後、分析チップ３００を分析装置
４００から取り出し、分析チップ３００を廃棄する。
【００１６】
２種類の微生物検知チップ（捕集チップ２００，分析チップ３００）の中に、細菌の前処理から検出に至るまでの工程に必要な試薬が全て内蔵されており、煩雑な試薬操作を省略することができる。すなわち、従来の分析では、試料である細菌に試薬を加えて処理をしたのちに別の容器に移し、といった具合に試料がいくつもの容器を介して動いていくため、煩雑かつ検査者に汚染の恐れがあった。しかしながら、２種類のチップ２００，300間での試料の受け渡しの工程以外は、試料がチップから出ることはなく、閉じられた系において分析がおこなわれるため、非常に安全である。
また廃棄物はチップ２００，３００のみとすることができ、このチップ２００，３００を焼却可能な素材にしておくことで、二次汚染の危険性を低減することができる。さらに、２種類のチップ２００，３００に内蔵される試薬は、一検査分のみであり、チップ200，３００は使い切りとすることができることから、屋外で簡便に遺伝子レベルの高精度な細菌検査を行うことができる。
試薬を内蔵した２種類のチップ２００，３００を細菌の捕集から溶解までを処理する捕集チップ２００とそれ以降の分析処理をする分析チップ３００とに分けているので、捕集から溶解までの処理が同一である試料を用いて複数回の分析が容易となり、安全性を確保しつつ、分析精度の向上を容易に図ることができる。
【００１７】
（捕集機の構成）
図３，図４を参照して本発明による捕集機の例を説明する。図３は本例の捕集機１００の透視斜視図、図４（ａ）は本例の捕集機１００の蓋部１１０およびチップ支持部１３０を開いた状態を示す図、図４（ｂ）は図４（ａ）から捕集チップ２００を装着して支持部１３０を閉じた状態を示す図である。
【００１８】
捕集機１００は、蓋部１１０，ノズル部１２０，一次フィルタ１２１，チップ支持部
１３０，二次フィルタ１４０，支持板１５０，ファンモータ１６０，排出口１７０，制御部１８０，表示部１８１，バッテリ１８５およびケーシング１９０を有する。
蓋部１１０はノズル部１２０を有する正方形または短形の部材からなり、両側面に固定手段を有する。ノズル部１２０の内径は捕集効率に大きく関係し、ノズルの内径を１０
［mm］より小さくするほど、細菌を濃縮して捕集することができるが、ノズル部１２０を通過する空気流速が増大するため、圧力損失が増加する。圧力損失は、空気流速の２乗に比例して増加するので、ファンモータ１６０の負荷が増加し、バッテリ１８５の電圧が低下する。例えば、ノズル部１２０の内径を３mm以下とすると、可搬型の細菌捕集機１００に搭載可能なバッテリ１８５（リチウム−水素）で駆動可能な仕事量を超える。従って、ノズル部１２０の内径Ｗは４〜１５mmが適当である。より好ましくは、ノズル部１２０の内径Ｗを８〜１２mmにすると良い。これにより、高い捕集効率を得ながら、ノズル部120の直下に細菌を濃縮して捕集することができる。
ノズル部１２０には一次フィルタ１２１が装着されている。一次フィルタ１２１は、大気中の粗大粒子をトラップするために設ける。したがって、その目開きは１００〜２００μｍが望ましい。花粉の飛散量が増加する時期には、目開きが１０〜１００μｍであることが望ましい。それにより、粒子径１０μｍ以上の花粉と粒子径１０μｍ未満の細菌とを簡便に分級することができる。一次フィルタ１２１は、蓋部１１０から着脱可能で、洗浄と高温滅菌が容易なステンレス製または弗素樹脂製が好ましい。
【００１９】
チップ支持部１３０は二次フィルタ１４０の上（前方）に設置される。チップ支持部
１３０は開閉式になっており（図４）、捕集チップ２００を挟んで蓋を閉めることで捕集チップ２００を容易に捕集機１００にセットすることができる。チップ支持部１３０は捕集チップ２００のいわば外周に相当するため、細菌が付着しやすい。よって、チップ支持部１３０は二次フィルタ１４０から着脱可能で、洗浄と高温滅菌が容易なステンレス製または弗素樹脂製が好ましい。
二次フィルタ１４０は支持板１５０に設置され、捕集チップ２００で捕集できなかった細菌等の微粒子が排出口１７０から大気中に放出されることを防止するために設ける。二次フィルタ１４０には、０.３μｍ以上の微粒子を９９.９７％以上捕集可能なＨＥＰＡ
（High Efficiency Particulate Air）フィルタを使用することが好ましい。また、０.１〜０.２μｍの微粒子を９９.９９９％以上捕集可能なＵＬＰＡ（Ultra Low Penetration Air）フィルタを使用することが更に好ましい。ＵＬＰＡを用いることにより、排出口
１７０から大気に放出する空気の清浄度を更に上げることができる。なお、ケーシング
１９０内には、制御部１８０，表示部１８１、およびバッテリ１８５が設けられている。ケーシング１９０の上面には掴み部１９１が設けられている。
次に、本例の捕集機１００の動作を説明する。
ファンモータ１６０を駆動すると、大気はノズル部１２０に吸引される。吸引された大気はノズルによって加速され、一次フィルタ１２１を通過する。このとき、一次フィルタ１２１によって空気中の粗大粒子が除去される。蓋部１１０内に導入された空気中の微粒子は、捕集チップ２００の中央に設けた捕集材に慣性衝突して付着する。蓋部１１０内に導入された空気は二次フィルタ１４０を通過し、ファンモータ１６０の下部の排出口170より外部へ排出される。二次フィルタ１４０によって、捕集チップ２００に捕集されなかった微粒子が除去される。
【００２０】
（捕集チップの構成，動作）
図５、図６を参照して捕集チップ２００の例を説明する。図５は捕集チップ２００の正面図、図６は捕集チップ２００の縦断面図である。
捕集チップ２００は、図１におけるステップ１（細菌の捕集）からステップ３（細胞膜の溶解）までを担う。すなわち、まず捕集チップ２００を捕集機１００にセットして細菌を捕集したのち（ステップ１）、捕集チップ２００を捕集機１００から取り外し、捕集チップ２００を後述の分析装置４００にセットして、ステップ２（芽胞の発芽）からステップ３（細胞膜の溶解）までの工程を行う。
捕集チップ２００は、チップの構成要素をかたどる凹凸パターンをフォトリソグラフィー技術により作製し、このパターンを樹脂に転写成形して成型したものである。２枚の樹脂を張り合わせることで、樹脂に刻まれたパターンが流路となる。チップの材料として、加工費用が高く、また割れやすいガラスよりも、廃棄処理性に優れる樹脂が好ましい。樹脂の種類は特に限定されるものではないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：ダウコーニングアジア社製，シルポット１８４）を使用することが良く、本チップには以下の特性を備えることが好ましい。
・生体適合性良好（通常のシリコンゴムは生理的に不活性）
・サブミクロンの精度で型の転写が可能（硬化前は低粘度で流動性に富むため、複雑な形状の細部まで良好に浸透）
・低コスト（８円／１グラム。従来の汎用マイクロデバイス材料であるガラス材は１ｋ円／１グラムであり１／１００以下）
・焼却により容易に廃棄可能
捕集チップ２００は、大気中から微生物（本実施例では芽胞を形成した細菌）を付着して捕集する捕集材２０１と、捕集材２０１を装着した薄い板状の基板とを備えている。この捕集チップ２００は、捕集材２０１を収納する捕集材収納部と、複数の試薬保管槽
（２１０，２２０，２３０，２４０）、チップ背面に開口されたチップポート２１１，
２２１，２３１，２４１と、チップ正面に開口された空気穴２５０とを有している。
複数の試薬保管槽は、発芽促進剤を保管する発芽促進剤保管槽２１０と、２種類の細胞壁溶解液を保管する酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピックイオンを保管するカオトロピック保管槽２４０とを有している。そして、複数の試薬保管槽
２１０〜２４０は、捕集材収納部の周囲を取り囲むように配置されている。これにより、捕集チップ２００をコンパクトなものとすることができる。
【００２１】
試薬保管槽２１０〜２４０は細長い流路によって構成され、いずれの試薬保管槽も、流路を持った形状が好ましい。試薬保管槽内２１０〜２４０の試薬を送液するためには、試薬保管槽２１０〜２４０の背後から気体を試薬保管槽２１０〜２４０に送る。試薬保管槽２１０〜２４０が細長い流路形状でなかった場合、気体の通り抜けやすい部位のみ試薬が押し出され、その他の部位の試薬が試薬保管槽に残ることになる。消費する試薬の量を減らすために、試薬保管槽２１０〜２４０を流路形状にするのが効果的である。
流路の断面形状は、横／縦１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、流路天井部の樹脂がたわんで流路の矩形構造が崩れ、送液の障害となる恐れがある。試薬保管槽
２１０〜２４０の細長い流路は、蛇行状に形成し、基板における流路の占有面積を小さなものとしつつ、流路における試薬の保管容量を確保することができる。
【００２２】
試薬保管槽２１０〜２４０の一端は捕集材収納部２０３に接続され、試薬保管槽２１０〜２４０の他端にはチップポート（２１１〜２４１）が連通して接続されている。試薬保管槽２１０〜２４０の一端側および他端側にそれぞれ堰２０４が設けられている。これにより、各試薬保管槽２１０〜２４０の保管される試薬の流出をより確実に防止することができる。
チップポート２１１〜２４１は、外部の流路との接点を構成する。発芽促進剤保管槽
２１０と、酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピック保管槽２４０はいずれも、捕集材収納部２０３と連通している。従って、捕集材収納部２０３は、発芽促進剤保管槽２１０と、酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピック保管槽２４０、およびチップポート２１１〜２４１を介して外部の流路に接続されている。なお、試薬保管槽２１０〜２４０の流路幅を５０〜１００μｍまで狭めることで、捕集材収納部２０３の側からの空気の流入を防ぐことができる。
【００２３】
発芽促進剤保管槽２１０の体積は２０〜１００μＬ、酵素Ａ保管槽２２０の体積は２０〜１００μＬ、酵素Ｂ保管槽２３０の体積は５〜２０μＬ、カオトロピック保管槽２４０の体積は４００〜８００μＬが好ましい。カオトロピックイオンの体積が、発芽促進剤と２種類の細胞壁溶解液の体積和の２倍以上とすることで、細胞膜の破壊が促進される。より好ましくは４倍以上、最適なのは、８倍以上である。
【００２４】
捕集材２０１としてゲル表面の自由水（ゲル網目間の水）由来の「付着性」を有する寒天が好適であり、寒天濃度は２〜５％にするのが良く、寒天濃度３〜４％が最適である。寒天濃度が２％未満では水分が多いため、高速の空気が当たり続ける捕集材２０１として強度不足である。一方、寒天濃度が６％より大きいと、寒天表面の水分（自由水）が少なくなり、付着性が著しく低下する。
寒天の強度を上げ、かつ水分の蒸発を防止するため、アルコール類を添加すると良く、凍結防止，乾燥防止，ゲル強化剤として作用する。具体的には、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、１，３−ブタンジオール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどが挙げられる。アルコール類の添加量は、寒天の４０〜８０％、好ましくは５０〜７０％が好ましい。アルコール類が４０％未満では、水分の蒸発防止が十分でない。また、８０％を超えると寒天表面の水分（自由水）が少なくなり、付着性が低下する。
【００２５】
捕集チップ２００の使用方法の一例を説明する。
捕集チップ２００を捕集機１００のチップ支持台に取り付けて、一定時間大気を吸引する。大気の吸引量は、例えば約１０００Ｌである。大気中の細菌は捕集チップ２００の捕集材２０１表面に付着する。次に、捕集チップ２００をチップ支持台から外し、捕集チップ２００の捕集材収納部２０３の開口面をシールで封止した後に捕集チップ２００を分析装置４００にセットする。捕集材収納部２０３の封止は、手動でも良いが、捕集機にシール機構がついていることがより好ましい。捕集材収納部２０３の封止により、細菌が捕集チップ２００の外部に露出することがなくなり、より安全となる。
捕集チップ２００の試薬保管槽２１０〜２４０はチップポート（２１１〜２４１）を介して分析装置４００の流路と接続されているので、分析装置４００の流路側から所定の制御動作で気体をチップポート２１１〜２４１を介して供給することにより、試薬保管槽
２１０〜２４０に予め封入された発芽促進剤，細胞壁溶解液，細胞膜溶解液、およびカオトロピックイオンが所定時間ごとに捕集材収納部２０３内（捕集材２０１上）に送液される。捕集材収納部２０３の上正面は封止されているが、空気穴２５０が捕集材収納部203の一部に連通しており、空気穴２５０は大気開放となっているので、試薬の送液の際に捕集材２０１の上に存在する空気は空気穴２５０より放出される。
【００２６】
試薬保管槽２１０〜２４０から捕集材２０１へ試薬を送液することについての詳細を説明する。
捕集材２０１に発芽促進剤を１００μＬ送液する。ここで発芽促進剤としては、アラニン，アデノシン，グルコースを含むブイヨンが好ましい。特にＬ−アラニンを１ｍＭ〜
１０ｍＭ含有するブイヨンが最適である。そして１０分以上を経過すると細菌芽胞が発芽を開始し、３０分間経過すると、全体の５０％以上が発芽する。よって、芽胞の発芽処理は３０分以上が好ましい。細菌芽胞を発芽させるのにより好ましいのは３５〜４０℃であり、最も好ましいのは３５〜３７℃である。細菌芽胞が発芽する段階で細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。
次に、細菌の細胞壁を壊す２種類の蛋白質変性酵素を順次捕集材２０１に送液し、至適温度に一定時間保持する。酵素処理の時間はそれぞれ１０分以上が望ましく、３０分が好適である。ここで蛋白質変性酵素としては、リゾチーム（至適温度：３７℃）１００μＬとプロテアーゼＫ（至適温度：５５〜６０℃）２０μＬが好適である。これらの酵素処理により、捕集チップ２００内の細菌は細胞膜がむき出しの状態になる。なお、発芽促進剤とリゾチームは同じタイミングで注入して処理することも可能であるが、リゾチームとプロテアーゼＫを同時に添加することは酵素活性が低下するため好ましくない。
【００２７】
最後に、カオトロピックイオン８００μＬを捕集材２０１に送液すると、細菌の細胞膜が破壊され、細菌の遺伝子が細胞外部に放出される。ここでカオトロピックイオンとしては、グアニジンチオシアン酸塩，グアニジン塩酸，ヨウ化ナトリウム，臭化カリウムが挙げられる。チップの使用方法として、チップの冷蔵あるいは冷凍により試薬の活性を長期間維持する方法が考えられる。よって、チップに封入し、冷蔵あるいは冷凍をした際に組成の変化が極めて少ないグアニジン塩酸が好適である。
またカオトロピック塩に界面活性剤や緩衝剤を含有させることが好ましい。界面活性剤として特に限定はされないが、ツイーン−２０やトリトンＸ−１００等が挙げられる。緩衝剤として特に限定はされないが、トリス−塩酸塩，リン酸２水素カリウム−４ホウ酸ナトリウム等が挙げられる。
以上の工程により、捕集チップ２００に捕集した細菌の芽胞および細胞壁を処理することができる。すなわち、図１におけるステップ２〜３までをチップ上で自動化することができるため、試薬の分注操作を省略することができる。捕集チップ２００は細菌の捕集から前処理までの工程を担い、分析チップ３００は細菌遺伝子の分析工程を担う。分析の精度を上げるために、同一の試料に対して複数回の分析、或いはターゲットの細菌を複数設定するためには、１枚の捕集チップ２００で処理したサンプルを複数の分析チップ３００に分配したほうが好適であり、２種類のチップ２００，３００を供している。
【００２８】
なお、この捕集チップ２００を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で捕集チップ２００を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。
【００２９】
（分析チップの構成，動作）
図７から図１０を参照して分析チップ３００を具体的に説明する。図７は分析チップ
３００の正面図、図８は図７のＡ−Ａ′断面図である。なお、図８は分析チップ３００を縦置きにしたときの断面図である。
分析チップ３００は、図１におけるステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までを担う。捕集チップで処理された液の一部を移した状態の分析チップ分析装置４００にセットする。分析チップ３００には、図１のステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までの処理に用いられる試薬が予め内蔵されている。分析チップ３００を分析装置４００にセットした状態で、分析装置４００には送液手段を動作させて分析チップ３００内の試薬を送液し、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までの処理を行う。なお、分析チップ３００の素材は捕集チップ２００と同様の樹脂である。
【００３０】
分析チップ３００にはチップ正面に開口された試料注入口３１０と、試料溜め３１５と、遺伝子結合担体を流路に充填した遺伝子抽出エリア３２０と、廃液槽３３０と、洗浄液Ａを保管する洗浄液Ａ保管槽３４０と、洗浄液Ｂを保管する洗浄液Ｂ保管槽３５０と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽３６０と、遺伝子増幅試薬Ａを保管する遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０と、遺伝子増幅試薬Ｂを保管する遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽３９０と、チップ背面に開口されたチップポート３１１，３３１，３４１，３５１，３６１，３７１，３８１とを有している。これらの試薬保管槽３４０〜３８０の断面形状は、捕集チップと同様に横／縦１０以下が好ましく、横２mm，縦３mmで形成されている。一方、試薬保管槽３４０〜３８０以外の流路の断面は、試薬保管槽３４０〜３８０よりも小さいことが好ましく断面積として１／４以下が好ましい。分析チップ３００は、光造形法によって作成した樹脂の型から転写して作成する。光造形法によって作成する樹脂は滑らかな曲線で構成するのが困難であるため、矩形構造を基本としている。よって、矩形構造の樹脂型から転写される分析チップの流路断面も必然と矩形となる。矩形の流路に試薬を流すと、流路の四隅に試薬が付着しやすく、残存する。流路に残存した試薬が次に流れてきた試薬と混じっていくため、分析精度を悪化させていく。よって、流路の断面を小さくすることで、流路壁面への試薬の付着を抑制し、試薬のキャリーオーバーを防止するため、横０.５mm，縦０.５mmで形成した。なお、分析チップを縦置きにした時、試薬保管槽３４０〜３８０内の試薬が自然流出しないように、試薬保管槽をＵの字にする、もしくは試薬保管槽から連通する流路を一度上方に向けるのが良い。
【００３１】
試料溜め３１５，廃液槽３３０、および試薬保管槽３４０〜３８０の一端にはチップポート３１１〜３８１が形成されている。チップポート３１１〜３８１は、外部である分析装置４００の流路との接点となる。試薬保管槽３４０〜３８０内の試薬を送液するために、チップポート３４１〜３８１を介してチップの外部である分析装置４００から気体を試薬保管槽３４０〜３８０に送る。気体としては、酸素は試薬を酸化させ、また二酸化炭素は試薬のｐＨを変化させる恐れがあることから、不活性な窒素，ヘリウム，アルゴン等が望ましい。
試料溜め３１５と、洗浄液Ａ保管槽３４０と、洗浄液Ｂ保管槽３５０と、溶離液保管槽３６０はいずれも遺伝子抽出エリア３２０に連通している。溶離液に試料や洗浄液Ａが混入すると遺伝子の検出に阻害をおこすため、溶離液保管槽３６０は試料溜め３１５と洗浄液Ａ保管槽３４０から離れた位置に配置することが好ましい。
【００３２】
遺伝子増幅試薬保管槽Ａと、遺伝子増幅試薬保管槽Ｂは反応槽３９０に連通している。遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０から反応槽３９０に送られた遺伝子増幅試薬Ａ、および遺伝子増幅試薬保管槽Ｂから反応槽３９０に送られた遺伝子増幅試薬Ｂが一度反応槽３９０に入ったのち、反応槽から逆流しないように、遺伝子増幅試薬保管槽Ａおよび遺伝子増幅試薬保管槽Ｂは反応槽３９０の上方から連通している。
試料溜め３１５の体積は１００〜２００μＬ、遺伝子抽出エリア３２０の体積は１００〜２００μＬ、洗浄液Ａ保管槽３４０の体積は２００〜３００μＬ、洗浄液Ｂ保管槽350の体積は５０〜１００μＬ、溶離液保管槽３６０の体積は１０〜２０μＬ、遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０の体積は２０〜４０μＬ、遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０の体積は１０〜２０μＬが好ましい。
【００３３】
遺伝子抽出エリア３２０に充填する遺伝子結合担体として、石英ウール，ガラスウール，ガラスファイバー，ガラスビーズが適用可能である。ガラスビーズ適用の際は、接触面積を大きくするためにビーズサイズを５０μｍ以下とするのが好ましく、流路への堰き止めを考慮すると２０〜３０μｍが最適である。遺伝子保持担体を堰きとめるために、遺伝子抽出エリア３２０を構成する流路中に１箇所以上の堰３２５を設けるのが好ましい。図９に、堰の構成の一例を示す。遺伝子抽出エリア３２０の流路中、流路幅を数箇所１５〜２０μｍまで狭めることで、狭められた流路が遺伝子結合担体に対して堰となる。流路を１０μｍ未満にすると流体抵抗が大きく流体制御が困難になる。よって、堰３２５としての流路幅は１５〜５０μｍが好適である。
廃液槽３３０に廃液として流れ込むのは試料，洗浄液Ａ、および洗浄液Ｂである。これらの液は直接的に人体に影響を及ぼすものではないが、廃液槽３３０から外部に出ない構造とする必要がある。図１０に、廃液槽の構成の一例を示す。廃液槽３３０内に、２種類の吸収剤３３２，３３３を充填した例を示している。吸収剤３３２としては体積膨張が殆どなく、また安価なコットン，和紙等が好適である。また二番目の吸収剤３３３として、アクリルアミドがさらに最適である。アクリルアミドはコットン，和紙に比べてややコスト高であるが、吸収能力が非常に高く、アクリルアミドは吸液と共に著しく体積膨張する特性を有している。すなわち、アクリルアミドは廃液槽内の廃液を吸収しながら体積膨張し、廃液槽の容積を狭めて廃液槽内の圧力を高めていく。分析チップは、後述のように廃液槽の直前で試薬を分岐させる部分がある。廃液槽に試薬が入らないようにするために、分岐側の流路よりも圧力を高める必要がある。すなわち、廃液槽に吸収剤を充填するのは、分析チップから廃液がチップ外に漏れ出さないよう吸収するのみならず、廃液槽内の圧力を吸収剤の体積膨張により積極的に調整する役割を果たす。その意味で、吸収剤３３２に比べて少量のアクリルアミドを吸収剤３３３とするのが好ましい。
【００３４】
さらに、廃液槽３３０からの廃液漏れを抑制する手段として、廃液槽３３０内部を親水処理することが有効である。チップの材料である樹脂素材は元来疎水性であることから、廃液槽３３０に入った廃液は廃液槽３３０内部の壁面ではじかれ、廃液槽３３０の全てを廃液で満たすことは困難である。そこで、廃液槽３３０内部を親水処理することで液の濡れ性が良好となり、廃液槽３３０の底部から廃液を満たすことができる。分析チップの作成時に廃液槽３３０にプラズマを照射することで樹脂表面が改質され、簡便に親水性とすることが可能である。
【００３５】
（分析装置の構成，動作）
図１１から図１３を参照して分析装置４００の構成，動作を具体的に説明する。図１１は分析装置４００の主要な構成を、図１２は分析装置４００の断面構成、図１３は分析装置４００の基板４１０を示す図である。
分析装置４００は大きくわけて、チップ設置部，流体系，温調系、そして光学検出系の４つから構成される。まず捕集チップ２００および分析チップ３００がセットされるのは、前蓋４０１の内側に設けられた基板４１０である。両チップを縦置きにセットするので、基板４１０の下部には、チップを止めるチップストッパ４１１が備えられる。チップを基板４１０にセットして前蓋４０１を閉めると、チップは基板４１０とチップホールダ
４２０の間に固定される。基板４１０とチップホールダ４２０には、チップの温度を最適化するための温度制御機構４１５が内蔵されている。温度制御機構４１５としては、発熱体としてペルチェが良く、印加電流の向きを変えるだけでチップの昇温・冷却操作を簡便に行うことができる。
チップをセットする基板４１０には、基板流路４１２が設置されており、基板流路412の一端はチップのポートに連通し、基板流路４１２の他端は装置内流路４０２に連通している。基板４１０に予め複数の基板流路４１２が設置されることで、捕集チップ２００および分析チップ３００のいずれのチップポートにも対応することでき、分析装置４００は捕集チップ２００と分析チップ３００のプラットフォームとなり得る。
【００３６】
装置内流路４０２は、それぞれバルブ４３０を介してポンプ４４０に接続される。チップ内のある試薬槽の試薬を送液するには、バルブ４３０を切り替えてその試薬槽に連通する流路のみに送風を行う。ポンプ４４０によって送られた気体は選択された装置内流路
４０２および基板４１０流路を経てチップ内に到達し、試薬槽の試薬を送液する。試薬槽に予め所定量の試薬のみ内蔵されているので、試薬槽内の試薬をすべて時間管理で排出するのみでよく、ポンプ４４０の送液精度は求められない。よって、ポンプ４４０は、送風のみで吸引を行わない、簡素で小型なものを使用することができる。
流体を制御するバルブ４３０をチップの内部ではなく、分析装置４００側に設けることが好ましい。これにより、チップ１０１には機械部品がなくなり、小型化・ディスポーザブル化を実現することができる。
【００３７】
光検出系は、チップ反応槽３９０内の遺伝子に励起光を照射する光源４５０と、励起光の特定の波長のみを透過する励起フィルタ４５５と、チップ反応槽３９０から生じた蛍光の光路を変更するミラー４６０と、蛍光の特定の波長のみを透過する検出フィルタ４７５と蛍光を測定する光検出器４７０から構成される。光源４５０は様々な波長領域のものが使用可能であるが、波長領域の広いキセノンランプを用いる。また波長が限定される場合には、ＬＥＤを使うことでも良い。光検出器４７０としてはＣＣＤカメラ，光電子倍増管，フォトダイオード等を使用できるが、装置を小型化するにはフォトダイオードが好ましい。光検出器４７０によって検出された遺伝子の光信号は光信号変換機４８０によってデジタル化され、データ表示画面４９０に信号強度が表示される。
分析装置４００には各制御を行う制御機構を備える。分析装置４００に、バルブ４３０を制御するバルブ制御機構４３１，ポンプ４４０を制御するポンプ制御機構４４１，光源４５０を制御する光源制御機構４５１，光検出器４７０を制御する光検出器制御機構471が搭載される。機械部品を内蔵しない小型の分析チップを基板上に置いて簡便な光検出器を組み合わせるだけの、小型で可搬の分析装置を提供することが出来る。
【００３８】
（分析の手順）
分析チップ３００と分析装置４００を用いた分析の手順を図７，図１２，図１４を参照しながら説明する。図１４は流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
分析チップ３００を用いた分析の手順としては、主に以下の手順を有する。
まず、捕集チップ２００で細胞壁が溶解された細菌試料を分析チップ３００に注入し、分析チップ３００内においてこの細菌試料を遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。そして、試料に含まれる蛋白質等を洗浄する洗浄液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。
次に、遺伝子保持担体に吸着された遺伝子を溶離する溶離液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液し、さらに遺伝子を検出する反応槽へと送液する。
【００３９】
その後、分析対象の遺伝子の有無を検出する。以下に一例を具体的に説明する。
初めに、５種類の試薬、すなわち洗浄液Ａ，洗浄液Ｂ，遺伝子溶離液，遺伝子増幅試薬Ａ，遺伝子増幅試薬Ｂがそれぞれ洗浄液Ａ保管槽３４０，洗浄液Ｂ保管槽３５０，溶離液保管槽３６０，遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０，遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０に内蔵され、冷蔵あるいは冷凍保存しておいた分析を室温で解凍する。分析チップ３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵してユーザーに提供することで、分析チップ３００を１検査の使い切りとしても試薬の無駄がなく、経済性が向上する。またユーザーは試薬を各試薬保存槽に分注する手間を省くことができ、時間が短縮されるだけでなく、汚染を防ぐことも出来る。さらに、この分析チップ３００を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で分析チップ３００を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、
−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。このように、使い捨て可能な分析チップ３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵し、分析チップ
３００を冷蔵あるいは冷凍した状態でユーザーに提供することで、簡便な分析環境を作ることができる（ステップ１０１）。
【００４０】
分析チップ３００の解凍後、捕集チップ２００の処理液を分析チップ３００の試料注入口３１０に約１００μＬ移す。（ステップ１０２）
そして試料注入口３１０にカバーをして穴を塞ぐ。カバーは、分析チップ３００と同素材の薄い樹脂シートが好ましい。樹脂同士の密着性が良く、また安価であるため使い捨てに好適である。試料注入口３１０をカバーする工程は、手動でもよいが、分析装置４００側に試料注入口３１０を覆う機構が備わっているとより好ましい。（ステップ１０３）
【００４１】
次に、分析装置４００の前蓋４０１を開いて、前蓋４０１に設けられたチップガイドに沿って分析チップ３００を分析装置４００にセットした後、分析装置４００の前蓋４０１を閉める。これにより、分析チップ３００が基板４１０に固定され、チップポートと装置内流路４０２が連通する。なお分析チップ３００は横置き，縦置きいずれでも可能であるが、ここでは縦置きの場合について述べる。（ステップ１０４）
【００４２】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えて試料ポート３１１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３１１，３３１：開、他のポート：閉）。使用する流体は空気や窒素など試薬と接した時に試薬の活性が損なわれない気体であればよい。試料溜め３１５内の試料は遺伝子抽出エリア３２０に移動する。試料中のカオトロピックイオンの働きにより、試料中の細菌遺伝子は、遺伝子抽出エリア３２０に充填された遺伝子結合担体に結合する。細菌遺伝子と遺伝子結合担体との結合を促進するために、試料が遺伝子抽出エリア３２０を通過する時間は１０分以上が好ましい。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した試料は廃液槽３３０に貯まる。送液用の気体は、廃液ポート３３１に抜ける。なお、チップを縦置きにすることで、試料が廃液ポート３３１から漏れるのを防ぐことができる。（ステップ１０５）
【００４３】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３１１を閉じ、洗浄液Ａポート
３４１を開く。そして洗浄液Ａポート３４１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１，３４１：開、他のポート：閉）。洗浄液Ａ保管槽３４０内の洗浄液Ａ２００μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。洗浄液Ａとしては、グアニジンチオシアン酸塩，グアニジン塩化水素，ヨウ化ナトリウム，臭化カリウム等のカオトロピックイオンが好ましい。この洗浄液Ａにより、遺伝子抽出エリア３２０に残留する蛋白質が除去される。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液Ａは廃液槽３３０に貯まる。（ステップ１０６）
【００４４】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３４１を閉じ、洗浄液Ｂポート
３５１を開く。そして洗浄液Ｂポート３５１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１，３５１：開、他のポート：閉）。洗浄液Ｂ保管槽３５０内の洗浄液Ｂ５０μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。洗浄液Ｂとしては、５０％以上の高濃度エタノールや酢酸カリウム溶液が好ましい。洗浄液Ｂにより、遺伝子抽出エリア
３２０に残留するカオトロピックイオンが除去される。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液Ｂは廃液槽３３０に貯まる。（ステップ１０７）
【００４５】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３３１，ポート３５１を閉じ、溶離液ポート３６１および反応槽ポート３９１を開く。そして溶離液ポート３６１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３６１，３９１：開、他のポート：閉）。溶離液保管槽３６０内の溶離液１０μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。ここで溶離液としては、滅菌蒸留水，ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡやＴＲＩＳ−アセテート等のバッファ溶液が使用可能である。溶離液により、遺伝子抽出エリア３２０の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離する。溶離した遺伝子は反応槽３９０に送液される。
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えて、ポート３６１を閉じ、遺伝子増幅試薬Ａポート３７１を開く。そして遺伝子増幅試薬Ａポート３７１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３７１，３９１：開、他のポート：閉）。遺伝子増幅試薬Ａ保管槽370内の遺伝子増幅試薬Ａ１０μＬは、流体によって反応槽３９０に送液される。
【００４６】
遺伝子増幅試薬Ａとしては、４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰ），バッファ（ＴＲＩＳ塩酸，ＫＣｌ，ＭｇＣｌ2 など）、プライマなどから構成される。送液用の気体は、反応槽ポート３９１に抜ける。（ステップ１０８）
【００４７】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３７１を閉じ、遺伝子増幅試薬Ｂポート３８１を開く。そして遺伝子増幅試薬Ｂポート３８１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３８１，３９１：開、他のポート：閉）。遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０内の遺伝子増幅試薬Ｂ３０μＬは、流体によって反応槽３９０に送液される。遺伝子増幅試薬Ｂとしては、ＤＮＡ合成酵素（TaqＤＮＡポリメラーゼ，TthＤＮＡポリメラーゼ，
VentＤＮＡポリメラーゼ，サーモシーケナーゼなど），蛍光色素（エチジウムブロマイド，SYBR GREEN（Molecular Probe 製），ＦＡＭ，ＲＯＸなど）などから構成される。（ステップ１０９）
【００４８】
次に、（ステップ１１０）
以上の手順により、分析チップ３００の反応槽３９０に細菌遺伝子と２種類の遺伝子増幅試薬が導入される。
【００４９】
反応槽３９０内の細菌遺伝子を増幅・検出するために、温度制御機構４１５を駆動し、反応槽３９０の温度が下記の２種類の設定値を往復するように温度サイクルをかける。
（ステップ１１１）
【００５０】
温度サイクル例としては、下記の程度を実施する
「９０〜９５℃１０〜３０秒⇔６５〜７０℃１０〜３０秒」×３０〜４５回
好ましい一例として、以下の温度サイクルを実施する。
「９４℃３０秒⇔６８℃３０秒」×４５回
温度サイクルをかけながら、光源４５０からの励起光を反応槽３９０に照射する。遺伝子は、２本鎖の内部にインターカレートした蛍光色素を有すると、吸収した光源４５０の光エネルギーを蛍光色素に渡す（エネルギー転移）。その結果、蛍光色素は励起されて蛍光を発する。試料中に目的遺伝子が存在した場合、遺伝子が増幅するに従って発する蛍光量が増加する。よって、温度サイクルの間、光検出器４７５により反応槽３９０内の蛍光量をモニタすることで、図７に示されるように、目的遺伝子の有無をリアルタイムに検出可能となる。なお、分析チップ３００を分析装置４００に縦置きにセットすることにより、温度サイクル中の反応物質の一部が蒸発し、蒸気が反応槽３９０上部に滞留しても、蛍光を検出する反応槽３９０の側面は蒸気によって曇らない、よって検出感度が低下しない、という長所を有する。（ステップ１１２）
【００５１】
分析が完了した時、分析チップ３００を分析装置４００から取り出し、廃棄する（ステップ１１３）。試料や試薬の後処理が必要ない上に、反応検出部の洗浄操作が必要ないため、簡便・迅速な分析を提供することができる。
【００５２】
捕集チップおよび分析チップと、捕集機および分析装置を組み合わせて使用することで、細菌の捕集から細菌の検出までの工程が２種類の小型のチップ内で自動化される。細菌芽胞の処理や遺伝子抽出工程に人手を一切介さないため、誰でも安全に分析が可能である。さらに、細チップ内にバルブ等の機械部品が含まれないので、使い捨て用途に好適なチップが提供できる。また、反応槽や流路を微細加工により作製し容積を微小化した結果、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速，混合が迅速，反応が均一といった長所が得られる。さらにディスポーザブルなチップに予め１検査分のみの試薬を内蔵し、チップを冷蔵・冷凍した状態でユーザーに提供することで、極めて簡便・迅速な遺伝子の検出が可能、かつ分析後に試薬と共に処分しうる分析チップとすることができる。
【００５３】
実施例１において、分析チップ３００内の反応槽３９０の個数が１個の例を示した。しかし、検査する対象他に応じる等の観点で、反応槽３９０が複数個であってもよい。その場合、検査対象の各細菌に対応したプライマが必要となるため、プライマを包含する遺伝子増幅試薬Ａの保管槽も複数個必要となる。さらに、複数の反応槽３９０内の反応を検出するために光源４５０からの励起光の照射位置を反応槽３９０に対して切り替える必要があるが、１枚の分析チップ上で複数の細菌を同時に検査できる長所を有する。
【００５４】
実施例１において、捕集チップ２００と分析チップ３００をセットするチップ設置部が一つの例を示した。しかし、捕集チップ２００の処理と分析チップ３００の処理を同時に平行して行うために、チップ設置部を２箇所設けることも可能である。捕集チップ２００の処理工程では、光学検出系が不要のため、流体系，温調系を２系統にすることで２つのチップ設置部を設けることができる。装置のサイズが若干大きくなるが、捕集チップと分析チップを同時処理することで、多検体の処理時間を短縮することができる。
【００５５】
実施例１に対して、分析チップ３００の底部に、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子を設置する。圧電素子は、その電極上に付着した重さを発振周波数の変化に定量的に変換することから、微量な質量変化を反応雰囲気下で連続的に測定できる。そこで、所定の予め塩基配列が既知の様々なヌクレオチドを圧電素子に固定しておく。固定方法は次のようにすることが良い。
【００５６】
圧電素子の電極上にスパッタリング，蒸着などの方法でガラス薄膜を形成する。ガラスとしては、電極素材であるクロムやチタンと最も接着性のよいＳｉＯ2 を主成分としたものが好ましい。このガラス薄膜にアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）を添加し、１２０〜１６０℃程度でベークすると、ガラス薄膜の表面にアミノ基が固定される。ここで、電極とガラス薄膜の厚みがそれぞれ０.１ 〜１μｍであることが好ましい。双方の厚みが１μｍを超えると、圧電素子の周波数応答が悪くなるためである。さらに、アミノ基がコーティングされたガラス薄膜にヌクレオチドを塗布し、恒温恒湿槽内で３７℃、湿度９０％で１時間保温する。その後、ＵＶクロスリンカーを用いて６０ｍＪ／cm2 の紫外線を圧電素子に照射することで、ヌクレオチドは圧電素子に強固に固定される。
【００５７】
試料から遺伝子を抽出するまでの工程は実施例１と同じである。そして反応槽３９０に送液された遺伝子を温度制御機構４１３により９４℃付近まで昇温すると、遺伝子は熱変性して一本鎖となる。この一本鎖遺伝子とチップ底部上に固定されたヌクレオチドが結合したとき、圧電素子の発振周波数が変化する。よって、この周波数変化を測定することにより、固定したヌクレオチドと相補的な遺伝子の配列を読み取りが可能となる。
【００５８】
液中で圧電素子を使用した場合、液温が１℃変化すると周波数は１５〜３０Ｈｚ変化するため液温の正確な制御が必須となるが、本実施例では、遺伝子増幅試薬が不要となり、また温度サイクルが要らないため検出時間が短くなる長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の一実施の形態である細菌検知の手順を示すフローチャート図である。
【図２】一実施の形態である細菌検知システムの構成を示す図である。
【図３】捕集機の主要部の構成を示す図である。
【図４】捕集機の前端部の構成を示す図である。
【図５】捕集チップの平面構成を示す図である。
【図６】捕集チップの断面構成を示す図である。
【図７】分析チップの平面構成を示す図である。
【図８】分析チップの断面構成を示す図である。
【図９】分析チップの遺伝子抽出エリアの堰を示す図である。
【図１０】分析チップの廃液槽の構成を示す図である。
【図１１】分析装置の主要部の構成を示す図である。
【図１２】分析装置の断面構成を示す図である。
【図１３】分析装置の基板の構成を示す図である。
【図１４】流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
【符号の説明】
【００６０】
１００…捕集機、１１０…蓋部、１２０…ノズル部、１３０…チップ支持部、１５０…支持板、１６０…ファンモータ、１７０…排出口、１８０…制御部、１８１…表示部、
１８５…バッテリ、１９０…ケーシング、１９１…掴み部、２００…捕集チップ、２０１…捕集材、２４１…チップポート、３００…分析チップ、３１０…試料注入口、３１５…試料溜め、３２０…遺伝子抽出エリア、３３０…廃液槽、３４０…洗浄液Ａ保管槽、350…洗浄液Ｂ保管槽、３６０…溶離液保管槽、３７０…遺伝子増幅試薬Ａ保管槽、３８０…遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽、３９０…反応槽、４００…分析装置。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大気中に浮遊する微生物を捕集機により吸引して捕集し、微生物中の遺伝子分析を行う微生物検知システムにおいて、
前記捕集機に設置され捕集材に前記微生物を捕集した後、前記捕集機から取り出し分析装置にセットされる捕集チップと、
前記捕集チップを前記分析装置にセットした状態で、前記捕集チップ内の試薬を送液し、前記捕集チップの中で前記微生物の芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う分析装置と、
試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、正面に開口された試料注入口と、背面に開口されたチップポートと、を有した分析チップと、
を備え、前記捕集チップで処理された液の一部が前記分析チップへ移され、前記分析装置の送液手段により前記分析チップの中で遺伝子の抽出から検出までの処理が行われることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項２】
請求項１に記載のものにおいて、前記廃液槽の内側を親水処理したことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項３】
請求項１に記載のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽以外の流路断面積は、前記遺伝子増幅試薬保管槽よりも小さいことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項４】
請求項１に記載のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽以外の流路断面積は、前記遺伝子増幅試薬保管槽の流路断面積の１／４以下であることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項５】
請求項１に記載のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽の流路形状はＵ字状にされたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項６】
請求項１に記載のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽は、前記試料溜め及び前記洗浄液保管槽よりも上流の位置に配置されたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項７】
請求項１に記載のものにおいて、送液を行うために前記分析チップ内に不活性な窒素，ヘリウム，アルゴンのいずれかのガスが注入されることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項８】
請求項１に記載のものにおいて、前記廃液槽内に、２種類の吸収剤が充填されることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項９】
請求項１に記載のものにおいて、前記廃液槽の内側はプラズマ照射されることで樹脂表面が改質されていることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項１】
大気中に浮遊する微生物を捕集機により吸引して捕集し、微生物中の遺伝子分析を行う微生物検知システムにおいて、
前記捕集機に設置され捕集材に前記微生物を捕集した後、前記捕集機から取り出し分析装置にセットされる捕集チップと、
前記捕集チップを前記分析装置にセットした状態で、前記捕集チップ内の試薬を送液し、前記捕集チップの中で前記微生物の芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う分析装置と、
試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、正面に開口された試料注入口と、背面に開口されたチップポートと、を有した分析チップと、
を備え、前記捕集チップで処理された液の一部が前記分析チップへ移され、前記分析装置の送液手段により前記分析チップの中で遺伝子の抽出から検出までの処理が行われることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項２】
請求項１に記載のものにおいて、前記廃液槽の内側を親水処理したことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項３】
請求項１に記載のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽以外の流路断面積は、前記遺伝子増幅試薬保管槽よりも小さいことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項４】
請求項１に記載のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽以外の流路断面積は、前記遺伝子増幅試薬保管槽の流路断面積の１／４以下であることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項５】
請求項１に記載のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽の流路形状はＵ字状にされたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項６】
請求項１に記載のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽は、前記試料溜め及び前記洗浄液保管槽よりも上流の位置に配置されたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項７】
請求項１に記載のものにおいて、送液を行うために前記分析チップ内に不活性な窒素，ヘリウム，アルゴンのいずれかのガスが注入されることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項８】
請求項１に記載のものにおいて、前記廃液槽内に、２種類の吸収剤が充填されることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項９】
請求項１に記載のものにおいて、前記廃液槽の内側はプラズマ照射されることで樹脂表面が改質されていることを特徴とする微生物検知システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００７−２０９２２３（Ｐ２００７−２０９２２３Ａ）
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０３９１（Ｐ２００６−３０３９１）
【出願日】平成１８年２月８日（２００６．２．８）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月８日（２００６．２．８）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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