微生物研究室での診断のための臨床検体からの共通の細菌性及び真菌性病原体並びに関連する抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出及び同定するための種特異的、属特異的及び普遍的プローブ及びプライマー
【課題】細菌DNAを検出、同定又は定量するための新規な方法の提供。
【解決手段】（ｉ）試験サンプル中の、任意の細菌、（ii）エンテロコッカス・フェシウム 、リステリア・モノサイトゲネス、ナイセリア・メニンギチティス、スタフィロコッカス・サプロフィテカス、ストレプトコッカス・アガラクチア及びキャンディダ・アルビカンスの種、並びに、（iii ）エンテロコッカス、ナイセリア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びキャンディダの属からのDNA を検出し、同定し及び定量するために増幅プライマー又はプローブを用いる、DNA に基く方法が開示される。
【解決手段】（ｉ）試験サンプル中の、任意の細菌、（ii）エンテロコッカス・フェシウム 、リステリア・モノサイトゲネス、ナイセリア・メニンギチティス、スタフィロコッカス・サプロフィテカス、ストレプトコッカス・アガラクチア及びキャンディダ・アルビカンスの種、並びに、（iii ）エンテロコッカス、ナイセリア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びキャンディダの属からのDNA を検出し、同定し及び定量するために増幅プライマー又はプローブを用いる、DNA に基く方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌DNAを検出、同定又は定量するための新規な方法のに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌の同定及び感受性テストのための古典的方法細菌は、古典的には、AP120EＴＭ系（bio Merieux)のごとき生化学試験の使用により炭素源及び窒素源として種々の物質を資化する能力により同定される。感受性試験のためには、臨床微生物研究室は、ディスク拡散、寒天希釈及びグロスマイクロ希釈を含む方法を用いる。生化学試験及び抗細菌感受性試験に基く同定は安価であるが、臨床検体からの細菌を同定しそして抗微生物剤に対するそれらの感受性を決定するために２回続けての一夜インキュベーションが必要であるため予備的結果を得るのに少なくとも２日間が必要である。
【０００３】
より速い微生物同定及び感受性試験のために複雑で且つ高価な装置を使用する幾つかの商業的に入手可能な自動化されたシステム（すなわち、Dade Divynortic Corp. からのMicro Scan system 、及びbio Merieux からのVitek system) が存在する（Stager and Davis, 1992, Clin. Microbiol. Rev. 5 : 302-327)。これらのシステムはより短いインキュベーション期間を必要とし、このためほとんどの細菌同定及び感受性試験が６時間未満で行われることを可能にする。それにも拘らず、これらのより速いシステムは常に細菌を純粋な培養物として一次単離することは必要とし、この工程は純粋培養のために少なくとも18時間又は混合培養のために少なくとも２日間を必要とする。
【０００４】
最も迅速な同定システムである auto SCAN-Walk-AwayＴＭ システム（Dade Divynostics Corp.) は標準的接種物からのグラム−陰性及びグラム陽性の再細菌種を２時間という短時間で同定しそして 5.5時間でほとんどの抗生物質に対する感受性パターンを提供する。しかしながら、この系は、エンテロバクテリアセー（Enterobacteriaceae) 以外の細菌種について特に高い比率（すなわち、 3.3〜40.5％の結論的でない同定をもたらす（Croize J. 1995, Lett. Infectiol. 10 : 109-113 ; Yorkら、1992, J. Clin. Microbiol. 30 : 2903-2910) 。エンテロバクテリアセーについては、結論的でない同定は 2.7〜11.4％である。
【０００５】
広範囲の種類の細菌及び真菌が、微生物研究室の臨床検体から日常的に単離されそして同定される。表１及び表２は、種々のタイプの臨床検体から最も一般的に単離される細菌及び真菌病原体の頻度を示す。これらの病原体は最もしばしば鼻科及び地域社会からのヒトの感染と関連しており、そしてそれ故に臨床的に最も重要であると考えられる。
【０００６】
臨床微生物研究室で試験される臨床検体
臨床微生物研究室で受理されるほとんどの臨床検体は尿及び血流サンプルである。ラバル大学中央部病院（Centre Hospitalier deI'Universite Laval ; CHUL)の微生物研究室では、尿及び血流が、受理される検体のそれぞれ約55％及び約30％を占める（表３）。臨床検体の残りの15％は、唾液、膿、脳脊椎液、滑液などを含めての種々の生物学的流体を含む（表３）。尿管、呼吸気管及び血流の感染は通常細菌が原因のものであり、そして抗微生物療法を必要とする。事実、臨床微生物研究室で受理されるすべての臨床サンプルは日常的に細菌の同定及び感受性試験について試験される。
【０００７】
臨床検体からの従来の病原体同定
尿検体
尿検体中の病原体のサーチは日常的微生物学研究室において支配的であるため、無数の試験法が開発されている。しかしながら、最終的な基準（gold Standard)は古典的な平定量的平板培養法のままであり、この方法においては１μＬの尿がプレート上にストリークされ、そして18〜24時間インキュベートされる。次にコロニーを計数して尿１リットル当りのコロニー形成ユニット(CFU) の合計数を決定する。尿管の細菌感染は通常、尿中の10７CFU／Ｌ以上の細菌カウント数と関連している。
【０００８】
しかしながら、尿中10７CFU／Ｌ未満の感染も特に、多数の疾患を有する患者又はカテーテルが挿入された患者においては、可能性がある（Stark and Maki, 1984, N. Engl. J. Med. 311 : 560-564) 。重要なことには、臨床微生物研究室において試験される尿検体の約80％が陰性（すなわち10７CFU／Ｌ未満の細菌カウント；表３）と考えられる。培養により陽性と見出された尿検体はさらに細菌病原体を同定するために標準的生化学試験により特徴付けられ、そして抗生物質に対する感受性について試験される。生化学的試験及び感受性試験は通常18〜24時間のインキュベーションを必要とする。
【０００９】
細菌病原体についての迅速且つ正確な尿スクリーニング方法は陰性の検体の一層速い同定並びに患者の一層効果的な治療及びケアー管理を可能にするであろう。幾つかの迅速な同定法(UriscreenTM，UTI screenTM，Flash TrackTM DNA probes 等）が、細菌病原体の培養に基礎を置くより遅い標準的生化学的方法と比較されている。これらの迅速試験法は、非常に迅速ではあるが、低い感度及び貧弱な特異性並びに多数の誤った陰性及び誤った陽性結果を示した（Koening ら、1992, J. Clin. Microbiol. 30 : 342-345 ; Pezzlo ら、1992, J. Clin. Microbiol. 30 : 640-684) 。
【００１０】
血液検体
微生物研究室で受理される血液検体は常に培養に付される。血液培養系は手動的であり、半自動的であり、又は完全に自動化されていてもよい。BACTECシステム（Becton Dickinson) 及びBacTAlertシステム（organo Teknika Corporation) が２つの最も広く使用されている自動血液培養系である。これらの系では、血液培養ビンを、細菌増殖のための最適条件下でインキュベートする。細菌増殖を連続的にモニターし、高感度細菌増殖検出器を用いて早期の陽性を検出する。
【００１１】
一旦増殖が検出されれば、血液培養物から直接にグラム染色を行い、そして次に栄養寒天培地への接種のために使用される。次に、前記のごとき自動化されたシステムを用いて、単離された細菌コロニーからの細菌同定及び感受性試験を行う。６〜７時間のインキュベーションの後に増殖が検出されなければ、前記のビンは通常、陰性として報告される。通常、ほとんどの血液培養物は陰性として報告される。例えば1994年２月〜1995年１月の間でCHULの微生物研究室で陰性の血液培養の比率は93.1％であった（表３）。
【００１２】
他の臨床サンプル
臨床微生物研究室による受理の後、血液及び尿以外の、通常無菌である部位（すなわち、脳脊椎、滑膜、肋膜、心膜及びその他）からのすべての体液は直接顕微鏡試験、及びそれに続く培養のために処理される。やはり、ほとんどの臨床サンプルは培養について陰性である（表３）。
【００１３】
無菌的部位からではない臨床検体、例えば唾液及び糞便検体については、通常菌そうによる汚染のため、培養による実験室診断は一層問題である。潜在的に感染と関連している細菌性病原体は、汚染物を除去した後に前記のようにして同定される。いうまでもなく、これらの非無菌的部位での細菌感染の診断のためには、細菌の普遍的検出法は有用ではないであろう。他方、これらの検体からの、種又は属の検出及び同定のため、並びに抗生物質耐性遺伝子の検出のためのDNA に基く測定は古典的同定及び感受性試験法に比べて非常に有用であり、そして幾つかの利点を提供するであろう。
【００１４】
臨床検体のDNA に基く測定
臨床検体から直接に細菌を検出しそして同定するための迅速かつ正確な診断試験法の明瞭な必要性が存在する。DNA に基く技法は迅速であり且つ正確であり、そして感染性疾患の診断を改善する大きな可能性を提供する（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Societyfor Microbiology, Washington, D.C.) 。本発明の対象であるDNAプローブ及び増幅プライマーは、任意の臨床検体、例えば血液培養物、血液、尿、唾液、脳脊椎液、膿及び他のタイプの検体からの直接的な細菌又は真菌検出及び同定のために適当である（表３）。
【００１５】
本発明において提案されるDNA に基く試験法は、微生物研究室において任意の臨床検体からの日常的診断のために今日使用されている標準的生化学的方法に比べて迅速さ及び正確さの両方の点で優ている。これらの試験におよそわずか１時間で行われるので、これらは臨床医に、抗微生物剤を用いる療法の効率を向上させるのに寄与する新規な診断手段を提供する。これらの測定法により、ヒト以外の生物体（例えば、他の霊長類、トリ、植物、哺乳類、農業動物、家畜 及びその他の生物）からの臨床検体も試験することができる。
【００１６】
培養陰性検体の高いパーセンテージ
日常的診断のために受理されるすべての臨床検体の内、尿検体のおよそ80％及び他のタイプの臨床検体のそれより多く（およそ95％）は細菌病原体の存在について陰性である（表３）。所与の検体における種又は属レベルで細菌を同定するのに加えて、あらゆる細菌の存在を検出する試験（すなわち、普遍的細菌検出）により陰性の高い比率の臨床検出をスクリーニングすることが望ましいであろう。このようなスクリーニング試験は、すべての細菌において見出される高度に保存されている遺伝子標的のPCR によるDNA 増幅に基くであろう。細菌について陰性である抗体はこの測定法において増幅されないであろう。他方、細菌について陽性である検体はこの測定法において陽性の増幅シグナルを提供するであろう。
【００１７】
DNA に基く迅速臨床試験法に向けて
迅速臨床試験法は感染の管理にかなりのインパクトを与えるであろう。DNA プローブ及びDNA 増幅技術は、臨床サンプルからの病原体及び抗生物質耐性遺伝子の同定のための従来の方法を越える幾つかの利点を提供するであろう（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, AmericanSociety for Microbiology, Washington, D.C. ; Ehrich and Greenbery, 1994, PCR-based Diognostics in Infections Disense, Blackwell Scientific Publications, Baston, MA)。臨床サンプルから生物体を直接に検体することができるので細菌病原体の培養の必要がなく、これにより病原体の単離及び同定に関連する時間が短縮される。
【００１８】
さらに、生化学的試験に基く今日用いられている表現型同定系に比べて、DNA に基く測定は細菌同定について正確である。商業的に利用可能なDNA に基く技法は今日臨床微生物研究室において、主として扱いにくい細菌性病原体、例えばミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis) 、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis)、ナイセリア・ゴノルホエア（Neisseria gonnrrhoeae)の検出及び同定のため、並びに種々のウイルスの検出のために使用される（Podzorski and Persing, Molecular detection and idetification of microorganisms ; In : P. Murray ら、1995, Manual of Clinical Microbiology, ASM press, Washington D.C.)。培養確認測定のために使用される他の商業的に入手可能なDNA に基く測定法も存在する。
【００１９】
他の者は、本発明の対象である細菌性病原体、例えばスタフィロコッカス spp. (Staphylococcus spp.) （米国特許出願 No. 5,437,978) 、ナイセリア spp. (Neisseria spp.)（米国特許出願 No. 5162199及びヨーロッパ特許出願 No. EPO 337,896,131) 及びリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogeres) （米国特許出願 No. 5,389,513及び No. 5,087,386) の検出及び同定のためのDNA に基く試験法を開発している。しかしながら、これらの特許に記載されている診断試験法は、本発明に記載されるものとは異るrRNA遺伝子又は遺伝標的のいずれかに基いている。
【００２０】
臨床微生物研究室においてすでに使用されている診断キット又は方法が存在するが、一般に遭遇される細菌感染の診断の正確さ及びスピードを改善するために従来の培養同定法に代る有利な方法の必要性がなお存在する。DNA に基く診断試験は、一層迅速であることに加えて、診断のために現在使用されている標準的生化学的試験に比べて一層正確である。なぜなら、細菌遺伝子型（例えばDNA レベル）は細菌の表現型（例えば、代謝レベル）に比べて安定だからである。
【００２１】
データーベースから入手可能な配列の数から証明される通り、細菌及び真菌種の遺伝子配列の知識は増加し続けている。データーベースから容易に入手できる配列から、診断目的のためのそれらの可能性についての指示は存在しない。診断目的のための良好な候補を決定するために、（ｉ）通常遭遇される細菌又は真菌病原体の種特異的検出及び同定、（ii）通常遭遇される細菌又は真菌病原体の属特異的検出及び同定、（iii ）細菌又は真空病原体の普遍的検出、及び／又は（iv）抗生物質耐性遺伝子の特異的検出及び同定、のためのDNA に基く測定のために配列を選択することができよう。上記のすべてのタイプのDNA に基く測定はあらゆるタイプの臨床検体又は微生物培養物から直接に行うことができる。
【００２２】
本発明者らの係属中の米国（N.S 08/526,840) 及びPCT (PCT/CA/95/00528) 特許出願において、本発明者らは、（ｉ）12の臨床的に重要な細菌性病原体の種特異的検出及び同定、（ii）細菌の普遍的検出、並びに（ii）17の抗生物質耐性遺伝子のために適するDNA 配列を記載している。この係属中の出願は独占的DNA 配列及びデーターベースから選択されたDNA 配列（このいずれの場合にも、少なくとも 100塩基対の断片）並びにこれらの配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブ及び増幅プライマーを記載している。この特許出願に記載されているすべての核酸配列は、ａ）細菌の存在の検出、ｂ）12の細菌種及び17の抗生物質耐性遺伝子の存在の特異的検出、を可能にする診断キット及び方法の組合せを含む。
【００２３】
しかしながら、これらの方法及びキットは改良される必要がある。なぜなら、理想的なキット及び方法は微生物病原体及び抗生物質耐性遺伝子の 100％近くを診断することが可能であるべきだからである。例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus fuecicum)により惹起される感染は、多くの抗生物質に対するそれらの耐性のために臨床的問題となっている。これらの細菌の検出及びそれらの耐性プロフィールの評価のいずれも望ましい。これに加えて、さらなる標的遺伝子の検出を目的として、及び本発明者らの先の特許出願を補促するため、同一の又は他の微生物病原体及び同一の又は追加の抗生物質耐性遺伝子認識することができる新規なDNA 配列（プローブ及びプライマー）も望ましい。
【発明の概要】
【００２４】
本発明の記載
本発明の目的の１つは、
◎ ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)、ストレプトコッカス・アガラクティー（Streptococcus agalactiae) 、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、スタフィロコッカス・サプロフィディカス（Staphylococcus saprophyficus) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、ナイセリア・メニンギティデス（Neisseria meningitidis) 、リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes) 、キャンディダ・スペーシス（Candida species)及びキャンディダ・アルビカンス（Candidaalbicans) から成る群から選択された特定の微生物種又は属；
【００２５】
◎ blatem， blarob， blashv， blaoxa，blaZ，andB，aaC1，aacC2 ，aacC3 ，aacA4 ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，mecA，vanA, vanB, vanC, satA, aac(6')-aph(2'')，aad(6') ，vat, vga, msrA, sul 及びint から成る群から選択された抗生物質耐性遺伝子；並びに場合によっては、
◎ 任意の細菌種；
からの核酸であって、該核酸を含有していると疑われる任意のサンプル中にあるものの存在及び／又は量を決定するための、プローブ及び／又は増幅プライマーを使用する特異的で、偏在する、鋭敏な方法を提供することであり、この方法においては、前記核酸又はその変異体もしくは部分のそれぞれが前記プローブ又はプライマーとハイブリダイズすることができる選択された標的領域を含んで成り、この方法は、前記サンプルを前記プローブ又はプライマーと接触せしめ、そして前記いずれかの細菌種、特定の微生物種又は属、及び抗生物質耐性遺伝子の存在及び／又は量を検出する段階を含んで成る。
【００２６】
具体的な態様において、各特定の微生物種又は属の検出及び同定、抗生物質耐性遺伝子の検出、及び普遍的細菌検出に別々に向けられた類似の方法が提供される。
さらなる具体的な態様において、この方法は、標的とされる細菌又は真菌核酸を鋭敏に、特異的に且つ偏在的に検出するそれらの能力について選択されたDNA 断片（独占的断片及びデーターベースから得られる断片）を使用する。
【００２７】
特に好ましい態様においては、12ヌクレオチド長以上のオリゴヌクレオチドがより長いDNA 断片から誘導され、そして本発明においてプローブ又は増幅プライマーとして使用される。
独占的オリゴヌクレオチド（プローブ及びプライマー）もまた本発明の対象である。
【００２８】
ストレプトコッカス・スペーシス、ストレプトコッカス・アグラクティア、スタフィロコッカス・スペーシス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、エンテロコッカス・スペーシス、エンテロコッカス・フェシウム、ナイセリア・スペーシス、ナイセリア・メニンギティディス、リステリア・モノサイトゲネス、キャンディダ・スペーシス及びキャンディダ・アルビカンスから成る群から選択された微生物種又は属の検出のためのプローブ又は増幅プライマーを含んで成る診断キットも本発明の対象である。
【００２９】
さらに、 blatem， blarob， blashv， blaoxa，blaZ，andB，aaC1，aacC2 ，aacC3 ，aacA4 ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，mecA，vanA, vanB, vanC, satA, aac(6')-aph(2'')，aad(6'')，vat, vga, msrA, sul 及びint から成る群から選択された抗生物質耐性遺伝子の検出のためのプローブ又は増幅プライマーをさらに含んで成る診断キットも本発明の対象である。
【００３０】
さらに、任意の細菌又は真菌種の検出のためのプローブ又は増幅プライマーを含んで成り、上記の特定の微生物種又は属の検出のためのそれらを含むか又は含まず、そしてさらに上記の抗生物質耐性遺伝子のためのプローブ及びプライマーを含むか又は含まない診断キットも本発明の対象である。
好ましい態様において、このようなキットは、上記の微生物種又は属、抗生物質耐性遺伝子及び任意の細菌の別々の又は同時の検出及び同定を可能にする。
【００３１】
上記の方法及びキットにおいて、増幅反応はａ）ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 、ｂ）リアーゼ連鎖反応、ｃ）核酸配列に基く増幅、ｄ）自己−支持配列複製（selfsustaired sequence replicntion)、ｅ）鎖置換増幅（Strand displucement anplification)、ｆ）分岐DNA シグナル増幅（branched DNA signal amplification)、ｇ）転写介在増幅（transcription-mediatel amplification) 、ｈ）サイクリングプローブ法(CPT) 、ｉ）入れ子 PCR (mested PCR) 、又はｊ）マルチプレックス（multiplex) PCRが含まれる。
好ましい態様において、PCR プロトコールが増幅反応として使用される。
【００３２】
特に好ましい態様において、各増幅サイクルのために、45〜50℃にて30秒間のアニーリング段階、及び95℃にてわずか１秒間の変性段階を含んで成り、延長段階のためだけの時間を許容しないPCR プロトコールが提供される。このPCR プロトコールは、すべての選択されたプライマー対を用いるPCR 反応にとって適当であるように標準化されており、このことは試験を大いに促進する。なぜなら、各臨床サンプルは均一なサイクリング条件下で普遍的、種特異的、属特異的及び抗生物質耐性遺伝子PCR プライマーを用いて試験され得るからである。
【００３３】
細菌細胞について陰性であるすべてのサンプルをすぐに廃棄し、そして次に上記の細菌及び／又は真菌種及び属を検出及び同定し、そして抗生物質に対する細菌の耐性を迅速に決定するための迅速試験法及びキットを開発することを本発明者らはめざしている。選択された抗生物質耐性遺伝子からの配列はデーターベースから入手可能であり、そしてそれらの検出のためにDNA に基く試験を開発するために用いられているが、本発明者らのアプローチは、細菌培養に基く現在の重要な標準的（gold standand)診断法を越える大きな改良を示すので、ユニークである。
【００３４】
同時的細菌検出及び同定並びに抗生物質耐性遺伝子検出のための増幅法を用いる場合、試験に先立って臨床サンプルを培養する必要がない。均一な増幅条件下でおよそ１時間ですべての標的DNA 配列を検出するために改変PCR プロトコールが開発されている。この方法は、処理を最適化することにより時間を節約し、少い抗生物質が処方されるので抗生物質耐性が少なくし、高価な広範囲の種類の抗生物質の使用が少なくし、そして臨床研究室試験に関連する時間とコストを下げるであろう。
【００３５】
以下に記載する方法及びキットにおいては、オリゴヌクレオチドプローブ及び増幅プライマーはより長い配列（例えば、100 塩基対以上のDNA 断片）に由来する。すべてのDNA 断片は、本発明の断片又はデーターベースから得られた。データーベースから選択されたDNA 断片は、それらの診断的可能性のために選択されているので、本発明の検出方法においてあらたに使用される。
【００３６】
（ｉ）普遍的細菌検出、（ii）前記の微生物種及び属の検出及び同定、並びに（iii ）アネックスIII に挙げるもの以外の抗生物質耐性遺伝子の検出のために適当な他のオリゴヌクレオチド配列が本発明の配列又は選択されたデーターベース配列から誘導され得ることは当業者にとって明らかであろう。例えば、オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、本発明者らが選択したそれよりも短かくしても又は長くしてもよく、それらは、また、本発明の他のDNA 断片又はデーターベースから選択された配列中から選択され得；それらはまた同じオリゴヌクレオチドの変形体(variant) であってもよい。
【００３７】
標的DNA 又はその変形体が所与のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすれば、又は標的DNA 又はその変形体が所与のオリゴヌクレオチドPCR プライマー対により増幅され得るならば、その逆も真であり；所与の標的DNA は変形体オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることができ、又は変形体オリゴヌクレオチドPCR プライマーにより増幅され得るであろう。あるいは、オリゴヌクレオチドは、PCR 以外の増幅方法において使用するために任意のDNA 断片配列から設計することができる。
【００３８】
従って、本発明の中心は、特異的又は普遍的オリゴヌクレオチドプローブ及び／又は増幅プライマーの源として使用される、普遍的、種特異的、属特異的及び耐性遺伝子特異的ゲノム性又は非ゲノム性DNA 断片を同定することである。診断目的のために適当なオリゴヌクレオチドの選択及び評価は多くの努力を必要とするが、当業者が、選択されたDNA 断片から、診断目的のために適当なアネックスVIに挙げられたもの以外のオリゴヌクレオチドを誘導することは大いに可能である。本発明の断片又はデーターベース配列がその特異性及び普遍性のために選択される場合、そのサブセット（subset) も特異的及び普遍的である可能性が増大する。
【００３９】
高い比率の臨床検体が細菌について陰性である（表３）ので、普遍的オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの選択の高い可能性を有するDNA 断片が本発明の配列及びデーターベース配列から選択された。増幅プライマーは細菌及び真菌に高度に保存された遺伝子から選択され、そして、臨床検体が細菌について陽性であるか陰性であるかを迅速に（およそ１時間で）決定するために臨床検体中の細菌病原体の存在を検出するために使用される。tuf と称される選択された遺伝子は、蛋白質合成の間の翻訳過程に関与する蛋白質（EF−Ta) をコードする。
【００４０】
普遍（ユニバーサル）プライマーを導くために使用されるtuf 遺伝子配列の整列（aligment) は本発明の配列及びデーターベースの配列を含む（実施例１及びアネックスＩ）。この方策は、細菌学的試験のために提供された多くの陰性臨床検体（受理された検体の約80％、表３を参照のこと）の迅速スクリーニングを可能にする。表４，５及び６は、PCR プライマー及びDNAプローブの特異性を試験するために細菌及び真菌種のリストを提供する。表７は、本発明の対象である種特異的、属特異的及び普遍的増幅測定の短い説明を提供する。表８，９及び10は、診断目的のために選択された本発明の配列及びデーターベース配列についての幾らかの有意義な情報を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の詳細な説明
微生物についての、種特異的、属特異的、普遍的及び抗生物質耐性遺伝子特異的プローブ及び増幅プライマーの開発診断目的のために適切な配列のデーターベースからの選択
細菌又は真菌の種特異的又は属特異的検出及び同定のため、あるいは細菌の普遍的検出のために適当な配列を選択するために、データーベース配列（Gen Bank, EMBL、及びSwiss-Prot) を、それらの配列について行われた配列情報及びコンピューター分析に従って、診断目的のためのそれらの可能性に基いて選択した。配列情報に基いて、及びGenetics Computer Group (GCG、ワシントン）プログラムを用いて行われた他の微生物種又は属における対応する遺伝子との比較に基いて、診断目的のために最も有望であると思われる遺伝子配列を、PCR による試験のために選択した。
【００４２】
OligoＴＭ 4.0プライマー分析ソフトウェアー（National Biosciences Inc. Plymoth, Minn.) の助けにより、選択されたデーターベース配列より最適なPCR 増幅プライマーを選択した。選択されたプライマーを、標的微生物種又は属についての特異性及び普遍性についてPCR 測定において試験した。一般に、種特異的又は属特異的検出及び同定のために適当な増幅プライマーをそこから選択するためのデーターベース配列の同定は、標的微生物種又は属について特異的及び普遍的であるプライマーの対を得るのに先立って、幾つかの候補遺伝子配列のコンピューター解析及びPCR 試験を含む。アネックスVIは、選択された特異的及び普遍的PCR プライマーのリストを提供する。アネックスＩ〜Ｖ及び実施例１〜４は、tuf 配列から又はrecA遺伝子から属特異的、種特異的及び普遍的PCR プライマーを選択するために用いたストラテジーを例示する。
【００４３】
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの設計及び合成
本発明者らにより配列決定されたDNA 断片及びデーターベース（Gen Bank及びEMBL）から選択されたDNA 断片を、診断目的のためのオリゴヌクレオチド源として用いた。このストラテジーのため、データーベースから選択された種々のゲノムDNA 断片（100bp より大きなサイズの）に由来する適当な一連のプライマー又はプローブを、それらの特異性及び普遍性について、PCR 及びハイブリダイゼーション測定において、後記のようにして試験した。データーベース配列は、入手可能な配列情報及び広範な解析に従って細菌又は真菌の検出についての種特異的、属特異的又は普遍的であるそれらの可能性に基いて選択されたこと、並びに一般に、望ましい特異性、普遍性及び感受性を得るために幾つかの候補データーベース配列が試験されたこと、に注目することが重要である。
【００４４】
データーベース配列から選択された種特異的断片に由来するオリゴヌクレオチドプローブ及び増幅プライマーは、自動化されたDNA合成機（Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Division)を用いて合成された。合成に先立って、すべてのオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションのためのプローブ、及びDNA 増幅のためのプライマー）は、ハイブリダイゼーション又はDNA 増幅のためのそれらの適切さについて、標準的プログラム（すなわち、Genetics Computer Group (GCG) プログラム及びプライマー解析ソフトウェアー(OligoＴＭ 4.0) を用いるコンピューター解析により評価された。PCR プライマー対の潜在的な適切さはまた、その合成に先立って、不所望の性質、例えば１ヌクレオチドの長いストレッチ及び３’−末端におけるＧ又はＣ残基の高い比率、の不存在を確認することにより評価された（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Society forMicrobiology, Washington, D.C.) 。
【００４５】
オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは２本鎖DNA のいずれの鎖に由来してもよい。プライマー又はプローブに塩基Ａ．Ｇ．ＣもしくはＴ、又はその類似体から成り、そしてそれらは１又は複数の選択されたヌクレオチド位置において縮重（degere rate)していてもよい。プライマー又はプローブは任意の適当な長さを有し、そして、（ｉ）細菌の普遍的検出、（ii）エンテロコッカス・フェシウム、リステリア・モノサイトゲネス、ナイセリア・メニンギティディス、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・アゲラクチア及びキャンディダ・アルビカンスの種特異的検出及び同定、（iii ）ストレプトコッカス・スペーシス、エンテロコッカス・スペーシス、スタフィロコッカス・スペーシス及びナイセリア・スペーシスの属特異的検出、又は（iv）前記26の臨床的に重要な抗生物質耐性遺伝子の検出、のために適当な本発明の断片から又は選択されたデーターベース配列からのDNA 配列中のいずれかの場所から選択され得る。
【００４６】
所与の標的細菌遺伝子の変形体は天然に生じ、そして進化の過程でのその遺伝子内の配列の変化によるものである（Watsonら、1987, Molecular Biology of the Gene ４編、The Benjamin／Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA ; Lewin, 1989, Genes IV, John Wiley & Sons, New York, NY) 。例えば、同じ細菌種の異る株はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション部位に１又は複数のヌクレオチド変化を有するであろう。当業者は、特異の遺伝子について変形体の細菌又は真菌DNA 配列が存在すること、及び配列変化の頻度は所与の遺伝子産物に対する進化の過程での選択圧に依存することを知っているであろう。
【００４７】
２個のPCR プライマー間の領域中の変形体配列の検出は、増幅生成物の配列決定により示すことができる。プライマーハイブリダイゼーション部位における配列変形体の存在を示すためには、ハイブリダイゼーション部位の外側のPCRプライマーを用いてより大きなDNA 標的を増幅しなければならない。このより大きな断片の配列決定が、その部位における配列変化の検出を可能にするであろう。同様のストラテジーが、プローブのハイブリダイゼーション部位における変形を示すために適用され得る。標的配列又はその部分の多様性が増幅プライマー又はプローブの特異性及び普遍性に影響を与えない限り、変形体細菌DNA は本発明の範囲内にある。選択されたプライマー又はプローブの変形体はまた、変形体DNA の増幅又はそれへのハイブリダイゼーションのために使用することができる。
【００４８】
種々の細菌及び真菌種からのtuf 配列の配列決定
種々の細菌及び真菌種について、tuf 遺伝子の一部分のヌクレオチド配列を決定した。細菌tuf 配列の決定のため、約 880bpのtuf遺伝子の部分を増幅する配列番号：107 及び108 の増幅プライマーを用いた。真菌tuf 配列の決定のため、約 830bpのtuf 遺伝子の部分を増幅する配列番号：109 及び172 の増幅プライマーを用いた。両プライマー対はtufA及びtufB遺伝子を増幅することができる。これらの遺伝子はほとんど同じであるから、上記のことは驚くべきことではない。例えば、大腸菌からの完全なtufA遺伝子及びtufB遺伝子はわずか13のヌクレオチド位置において異るのみである（Neidhardt ら、1996, Escherichia coli and Salmonella : Cellular and Molecular Biology, 2nd ed., American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)。
【００４９】
これらの増幅プライマーは、広範囲のtuf 配列の増幅を許容するため、幾つかのヌクレオチド位置で縮重（degenerate) しておりそしてイノシンを含有する。これらの増幅プライマーを選択するために使用されるストラテジーは、普遍（ユニバーサル）プライマーの選択についてアネックスＩに示したものと類似している。配列番号：107 及び108 の増幅プライマーは、任意の細菌種からのtuf 遺伝子を増幅するために使用することができる。配列番号：109 及び172 の増幅プライマーは、任意の真菌種のtug 遺伝子を増幅するために使用することができる。
【００５０】
tug 遺伝子は、次の増幅プロトコールを用いて細菌又は酵母培養物から直接増幅された。１μＬの細胞懸濁液を直接に、50mM KCl,10mM Tris-HCl (pH9.0), 0.1％ Triton X-100, 2.5mM MgCl2, １μMづつの２プライマー、 200μMづつの４種数の dNTP, 0.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ（Promega Corp. Madison, WI)を含有するPCT 反応混合物19μＬに加えた。PCR 反応は、96℃にて３分間、それに続き、変性段階のための72℃にて１分間、アニーリング段階のための30〜50℃にて１分間及び延長段階のための72℃にて１分間の30〜35サイクルを用いて、MJ Research PTC-200 themal cycler(MJ Research Inc. Wartertown Mass.) を用いるサイクリングにかけた。
【００５１】
次に、20マイクロリッターのPCR 増幅混合物を 1.5％アガロースゲル中での電気泳動により分離した。次に、ゲルをメチレンブルーによる染色により可視化した（Floresら、1992, Biotechniques, 13 : 203-205)。増幅生成物のサイズを、100-bp分子量ラダーとの比較により推定した。特定の増幅生成物（すなわち、細菌又は真菌tuf 配列についてそれぞれ890 又は830bp)に対応するバンドをアガロースゲルから切り出し、そしてQIAquickTMゲル抽出キット（QIAGEN Inc. Chntsworth, CA) を用いて精製した。tuf 遺伝子増幅生成物の両方の鎖を、Applied Biosystemsの自動化されたDNA 配列決定機（モデル373A）及びその PRISMTM Sequence（Ｒ） Terminator Double-stranded DNA Sequencing Kit (Perkin-Elmer Corp. Applied Biosystems Division, Forter City, CA) を用いて、ジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法により配列決定した。
【００５２】
配列決定反応はすべて、増幅プライマー（配列番号： 107〜109及び172)及び反応当り 100ngのゲル精製された増幅物（アンプリコン）を用いて行った。決定された配列がPCR 人工物（artifact) の配列決定による誤りを含まないことを保証するため、本発明者らは、２つの独立したPCR 増幅から生じたゲル精製されたtuf 増幅生成物の２個の調製物を配列決定した。すべての標的微生物種について、両増幅調製物から決定された配列は同一であった。さらに、両鎖の配列は 100％相補的であり、これにより決定された配列の高い正確さが確認された。上記のストラテジーにより決定されたtuf 配列はすべて配列表（すなわち、配列番号： 118〜146)に記載されている。表13は、配列表中の各tuf 配列のものと微生物種及び由来を示す。
【００５３】
本発明者らにより決定された、又はデーターベースから選択されたtuf 配列の整列は、tuf 遺伝子の配列決定された部分の長さが多様であることを明瞭に示す。幾つかのアミノ酸の挿入又は欠失が存在するであろう。これは、配列決定されたtuf 増幅生成物のサイズが、細菌種及び真菌種の両方について多様である理由を説明するものである。本発明者らのグループにより決定されたtuf 配列間で、５アミノ酸まで、又は15ヌクレオチドまでの挿入及び欠失を本発明者らは見出した。従って、アネックスＩ〜Ｖのそれぞれの上部に示されるヌクレオチド位置は、挿入又は欠失を有するtuf 配列については対応しない。
【００５４】
本発明者らにより決定された種々のtuf 配列は、時々、縮重（degenerescence) を含むことに注目する必要がある。これらの縮重された(degererated) ヌクレオチド配列はtufA遺伝子tufB遺伝子間の配列変形に相当する。なぜなら、増幅プライマーは両tuf 遺伝子を増幅するからである。これらのヌクレオチド変化はtaq DNA ポリメラーゼによるヌクレオチドの誤った取り込みによるものではない。なぜなら、両鎖は同じであり、そしてゲル精製されたtuf 配列の両調製物について決定された配列は同一であったからである。
【００５５】
tuf 配列からの増幅プライマーの選択
ストレプトコッカスの５種を含む種々の細菌種からのrecA遺伝子のヌクレオチド配列の比較がスタフィロコッカス−特異的PCR プライマーの選択を可能にした。recAからのPCR プライマーの選択についての更なる詳細は実施例４及びアネックスＶを参照のこと。
【００５６】
任意にプライムされるPCR によるスタフィロコッカス・サプロフィテクスからのDNA 断片の単離
スタフィロコッカス・サプロフィティカスの種特異的検出及び同定のための可能性ある未知のDNA コート配列を、任意プライムド PCR (AP−PCR)法により得た。
【００５７】
AP−PCR は、微生物のための特異的DNA プローブを生成させるために使用することができる方法である（Faniら、1993, Mol. Ecol. 2 : 243-250) 。スタフィロコッカス・サプロフィチカスからの種特異的ゲノムDNA 断片を単離するために使用されたAP−PCR の記載は次の通りである。10ヌクレオチド長の20個の異るオリゴヌクレオチドプライマー（すべて、AP−PCR キットOPAD (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) に含まれる）を、スタフィロコッカス・サプロフィティカスの３細菌種（すべてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ATCC）：No. 15305, 35552及び43867 から得られる）からのDNA 、及びスタフィロコッカスの他の４種（スタフィロコッカス・アウレウムATCC 25923、スタフィロコッカス・エピデルミディスATCC 14990、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Staphylococcus haemelyticus) ATCC 29970 及びスタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis) ATCC 35982) からのDNA を用いて組織的に試験した。
【００５８】
すべての細菌種について、約 1.5×108 細菌／mLに相当する標準0.5 McF arlandに調整した細菌懸濁液から増幅を行った。１μLの標準化された細菌懸濁液を直接に、50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH9.0), 0.1％ Triton X-100, 2.5mM MgCl2, 1.1μMの20の異るAP−PCR プライマーOPADの内の１つ、 200μMづつの４種類のdNTP及び 0.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ（Promega Corp, Madison, WI)を含有するPCR 反応混合物19μＬに加えた。PCR 反応は、MJ Reseanch PCR-200 サーマルサイクラー（MJ Reseanch Inc.) を用いるサイクリングに従って次のようにして行った：96℃にて３分間、これに続き、変性段階のための95℃にて１分間、アニーリング段階のための32℃にて１分間、及び延長段階のための72℃にて１分間から成る35サイクル。次に、20マイクロリッターのPCR 増幅混合物を、0.25μｇ／mLの臭化エチジウムを含有する２％アガロースでの電気泳動により分離した。増幅生成物のサイズを、50-bp 分子量ラダーとの比較により推定した。
【００５９】
スタフィロコッカス・サプロフィティカスについて特異的な増幅パターンがAP−PCR プライマーOPAD-9（配列番号：25）により観察された。このプライマーによる増幅は一貫して、試験されたすべてのスタフィロコッカス・サプロフィティカスについての約 450bpのDNA 断片に相当するが、試験された他のスタフィロコッカス種のいずれにも相当しないバンドを示した。この種特異的パターンは、CHULの微生物研究室の培養集収物から選択されたら、サプロフィティカスのさらなる10個の臨床単離体及び表５に示すグラム陽性細菌種から選択された株を試験することにより確認された。
【００６０】
AP−PCR に基いてＳ．サプロフィティカスについて特異的であり且つ普遍的である約 450bpのアンプリコンに相当するバンドをアガロースゲルから切り出し、そしてQIAquickTMゲル抽出キット（QIAGEN Inc.)を用いて精製した。このゲル精製されたDNA 断片を、T4 DNAリガーゼ（Neu England BioLabs)を用いて、pCR 2.1TMプラスミドベクター（Invitron Inc.)のT/Aクローニング部位にクローニングした。組換えプラスミドを、標準的手順により、大腸菌DH5αコンピテント細胞に形質転換した。小規模調製物のためのBirnboin及びDolyの方法（Nucleic Acids Res. 7 : 1513-1523) によりプラスミドDNA の単離を行った。組換えプラスミドへの約 450bp AP−PCR 挿入の存在を確認するため、すべてのプラスミドDNA 調製物をEcoRＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化した。次に、AP−PCR挿入部を把持することが示された２個の選択されたクローンから、QIAGENプラスミド精製キットを用いて、大規模な高度に精製されたプラスミドDNA の調製を行った。
【００６１】
２個の選択されたクローンからのAP−PCR 挿入体の両鎖を、SP6及びT7配列決定プライマーにより、前記のApplied Biosystemsの自動化されたDNA 配列決定機を用いて、ジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法により配列決定した。得られた配列の解析により、各クローンからの両鎖のDNA 配列が 100％相補的であることが示された。さらに、各クローンについて決定された全配列が同一であることが示された。これらの配列決定データーは、決定された 438bpの配列（配列番号：29）の 100％の正確さを確認するものである。
【００６２】
プライマー解析ソフトウェアー OligoTM 4.0の助けにより、配列決定されたAP−PCR スタフィロコッカス・サプロフィティカスDNA断片から、任意的増幅プライマーを選択した。選択されたプライマー配列を、それらの特異性及び普遍性を確認するために、PCR 測定により試験した（表７）。表４及び表５から選択されたＳ．サプロフィティカス以外の細菌種からのDNA を用いて増幅が生じなかったので、前記のPCR プライマーは特異的であった。さらに、Ｓ．サプロフィティカスの 260種中 245種がこのPCR 測定により効果的に増幅されたので、この測定は普遍的であつた。本発明者らの係属中の米国特許出願（N.S. 08/526,840)及びPCT 出願（PCT/CA/95/00528)の対象である他のＳ．サプロフィティカス特異的PCR 測定と組合せた場合、普遍性は 260株につき 100％に達する。
DNA 増幅
広く使用されているPCR(ポリメラーゼ連鎖反応）によるDNA の増幅のため、本発明のDNA 断片又はデーターベース配列からプライマー対を導いた。合成に先立って、それらがPCR 増幅のための良好な候補であることを確認するため、 OligoTM 4.0ソフトウェアーを用いて、可能性あるプライマー対を解析した。
【００６３】
PCR によるDNA の増幅の間、細菌ゲノムからの熱変性された標的DNA の各鎖に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標的DNA を各サイクルにおけるインビトロで指数的に、DNA の変性、プライマーのアニーリング及び新たな標的配列の合成を可能にする逐次熱サイクルにより増幅する（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.) 。
【００６４】
要約すれば、PCR プロトコールは次の通りであった。処理された臨床検体又は標準化された細菌又は真菌懸濁液（下記参照）を、50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH9.0), 2.5mM MgCl2, 0.4μＭづつの各プライマー、 200μMづつの４種類の各dNTP及び 0.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ(Promega) を含む20μＬのPCR 反応混合物(Taq StartＴＭ抗体（Clontech Laboratories Inc. Palo Alto, CA) と組合わせて）中で増幅させた。増幅の特異性及び感受性を増強するため、すべてのPCR 反応に、Taq DNA ポリメラーゼに対する中和モノクローナル抗体である Taq StartTM抗体を加えた。組成及び要求される感度レベルが各検体タイプにより異るため、臨床検体の処理は試験される検体のタイプにより異る。
【００６５】
この処理は、迅速プロトコールにおいて、細菌細胞を溶解し、そしてPCR 阻害効果を除去することから成る（尿検体の調製について実施例11を参照のこと）。細菌又は真菌培養物からの増幅のためには、なんらの前処理を行うことなく、サンプルを直接PCR 増幅混合物に加える（実施例10を参照のこと）。すべてのPCR 反応について内部対照を提供するために細菌リボソーム16Ｓ RNA遺伝子の高度に保存された領域に由来するプライマー配列を用いた。あるいは、内部標準に微生物又はヒトゲノム中には見出されない配列から導いた。内部対照は、PCR 測定の効率を確認するため、及び有意なPCR 阻害が存在しないことを確認するため、すべてのPCR 反応に導入した。rRHNに由来する内部対象は、細菌溶解プロトコールの効率をモニターするためにも有用であった。
【００６６】
次に、PCR 反応物を、PTC-200 thermal cycler (MJ Reseanch Inc.）を用いて熱サイクリング（95℃にて３分間、及びそれに続く、変性段階のための95℃にて１分間、及びアニーリング−延長段階のための55℃にて30秒間の30サイクル）にかけ、そして次に標準的臭化エチレン染色アガロースゲル電気泳動により分析した。PCR 測定のために行われるサイクル数は要求される感度レベルにより異る。例えば、臨床検体からの直接の微生物検出のために要求される感度レベルは、血液検体のためには尿検体よりも高い。なぜなら、敗血症に関連する微生物の濃度は尿管感染に関連するそれよりもはるかに低いからである。従って、血液検体からの直接検出のためには、より多数の熱サイクルを用いるより感度の高いPCR 測定が必要である。同様に、細菌又は真菌培養物から直接行われるPCR 測定は臨床検体から直接行われるPCR 測定される低感度でよい。なぜなら、標的生物の数は、微生物培養物中よりも臨床検体中で非常に低いからである。
【００６７】
より迅速でありそして日常的診断のためにより実際的である特定の増幅生成物の検出のための他の方法が使用し得ることが明らかである。このような方法は、増幅後の蛍光検出に基ずくことができる（例えば、Perkin ElmerからのTaqManTM系、又はBiotronicsからの AmplisensorTM）。蛍光に基く方法は一般に、非常に迅速であり、定量的であり、そして自動化できるので、日常的診断において使用するのに特に有望である（実施例14）。
【００６８】
微生物病原体の検出及び同定は、増幅生成物にハイブリダイズする種特異的内部DNA プローブを用いて固体支持体上での又は液体中でのハイブリダイゼーションにより行うことができる。このようなプローブは、本発明の対象である任意の種特異的又は属特異的DNA増幅生成物から生じさせることができる。あるいは、種又は属の検出及び同定のための内部プローブは、ユニバーサル増幅測定により生成されたアンプリコンから導くことができる。オリゴヌクレオチドプローブはビオチンもしくはジゴキシゲニンにより、又は他のレポーター分子によりラベルすることができる。
【００６９】
PCR の効率を確実にするためグリセロール、ジメチルスルホキシド（DMSO) 又は他の関連溶剤を用いて、PCR の感度を増強し、そして高いGC含量を有し又は強い二次構造を形成する標的DNA の増幅に関連する問題を克服することができる（Dieffen bach and Dveksler, 1995, PCR Primer : A Laberatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plrinview, New York)。グリセロール及びDMSOの濃度範囲はそれぞれ１〜15％（ｖ／ｖ）及び３〜10％（v/v）である。
【００７０】
PCR 反応混合物のため、増幅プライマー及びMgCl2 の濃度はそれぞれ 0.1〜1.5 μＭ及び 1.5〜3.5mM である。外部プライマー及び入れ子プライマーを用いる（すなわち入れ子PCR)又は複数のプライマー対を用いる（すなわち、マルチプレックス（multiplex) PCR) 標準的PCR プロトコールの変法を用いることもできる（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.) PCR プロトコール及びアンプリコン検出法のさらなる詳細は実施例９〜14を参照のこと。
【００７１】
DNA 増幅における当業者は他の迅速増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応(LCR) 、転写介在増幅(TMA) 、自己保持配列複製（３SR) 、核酸配列に基く増幅（NA SBA) 、鎖置換増幅(SDA) 、分岐DNA (bDNA)及びサイクリングプローブ法(CPT) (Leeら、1997, Nucleic Acit Amplification Technologies : Application to Disease Diugnosis, Eaton Pablishiay, Boston, MA ; Persingら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.) の存在を知っている。
【００７２】
本発明の範囲は、PCR による増幅の使用に限定されず、むしろ試験の迅速性及び感度を向上させるために使用し得る任意の迅速核酸増幅法又は任意の他の方法の使用を含む。PCR 以外のアプローによる、及び種特異的、属特異的及び普遍的DNA 配列に由来する、並びに本明細書に含まれる選択された抗生物質耐性遺伝子配列からの、核酸の増幅のために適当な任意のオリゴヌクレオチド本発明の範囲内である。
【００７３】
オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション測定
ハイブリダイゼーション実験において、１本鎖オリゴヌクレオチド（100 ヌクレオチド未満のサイズの）は、細菌の検出のためのDNA 断片プローブと比べて幾つかの利点、例えば多量の合成の容易さ、バッチ間の結果の一貫性、及び化学的安定性を有する。要約すれば、ハイブリダイゼーションのためには、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Pharmacia) を用いて、放射性核種γ−３２Ｐ（dATP) により５’−末端においてラベルされた（Sambrookら、1987, MolecularCloning : A Laboratory Manual, 2ｎｄ ed., Cold Spring Harbor Labortory Press, Cold Spring Harbor, NY) 。
【００７４】
組込まれなかった放射性核種はラベルされたオリゴヌクレオチドを Sephadex Ｇ−50ＴＭカラムに通すことにより除去される。あるいは、オリゴヌクレオチドビオチンにより、3'−末端に化学的にラベルされ又は合成の間に5'−末端に直接組み込みにより、あるいはジゴキシンによりラベルされた。上記３種類のラベル以外の手段が用いられ得ることは当業者にとって明らかである。
【００７５】
次に、各オリゴヌクレオチドプローブは、表４，５及び６から選択された種々の細菌及び真菌種からのDNA へのハイブリダイゼーションによりその特異性について試験される。試験された細菌又は真菌種のすべてが、臨床検体から単離され得る可能性ある汚染又は一般的感染に関連する病原体のようであった。各標的DNA は細菌細胞から細胞を溶解するための標準的化学的処理を用いて放出された（Sambrookら、1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ｎｄ ed., Cold Spring Harbor Labortory Press, Cold Spring Harbor, NY) 。
【００７６】
次に、DNA を常法により変性し、そして次に固体支持体（例えば、ナイロン又はニトロセルロース膜）に非可逆的に固定し、あるいは溶液中に遊離状態にした。次に、固定された１本鎖標的DNA をオリゴヌクレオチドプローブ細胞とハイブリダイズさせた（Sambrookら、1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ｎｄ ed., Cold Spring Harbor Labortory Press, Cold Spring Harbor, NY) 。プレハイブリダイゼーション条件は１Ｍ NaCl ＋10％硫酸デキストラン＋１％ SDS＋100 μg/mLサケ精子DNA 中、65℃にて15分間であった。
【００７７】
ハイブリダイゼーションは、ラベルされたプローブを含有する新鮮なプレハイブリダイゼーション溶液中で65℃にて一夜行われた。ハイブリダイゼーション後洗浄条件は次の通りであった：１％ SDSを含有する３×SSC 中で２回、１％ SDSを含有する１×SSC 中で２回（これらの洗浄のすべては65℃にて15分間行われた）、及び１％ SDSを含有する 0.1×SSC の最終洗浄であった。洗浄されたフィルターのオートラジオグラフィーが、選択的にハイブリダイズしたプローブの検出を可能にした。特異的標的DNA へのハイブリダイゼーションが、洗浄の高ストリンジエンシーのためこれら２つのDNA 配列のヌクレオチド配列間での高い類似性を示した。
【００７８】
オリゴヌクレオチドは、それが単離された種又は属からのDNA にのみハイブリダイズする場合のみ、特異的であると考えられる。特異的であることが見出されたオリゴヌクレオチドプローブは、次に、ATCC株を含めて注目の種又は属の臨床単離株からの微生物DNA へのハイブリダイゼーションによりそれらの普遍性について試験された（すなわち、普遍的プローブは標的種又は属のほとんど又はすべての単離株を認識した）。標的種又は属の株からのDNA を変性せしめ、ナイロン膜上に固定し、そして上記のようにしてハイブリダイズさせた。プローブが標的種又は属の単離株の80％以上からのDNAと特異的にハイブリダイズする場合、それらのプローブは普遍的であると考えられる。
【００７９】
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの特異性及び普遍性試験
本発明者らにより配列決定されたDNA 断片又はデーターベースから選択されたDNA 断片のいずれかに由来するオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの特異性を、表４，５及び６に記載する種から選択された細菌又は真菌種のDNA の増幅により又はそれとのハイブリダイゼーションにより、前の２つの項に記載したようにして試験した。次に、特異的であることが見出されたオリゴヌクレオチドを、標的種又は属の単離株からの細菌DNA の増幅（プライマーについて）又はそれとのハイブリダイゼーション（プローブについて）により、それらの普遍性について試験した。オリゴヌクレオチドプライマーを用いての特異性試験及び普遍性試験の結果を表７に示す。選択された増幅でライマー対を用いてのPCR 測定の特異性及び普遍性を、細菌又は真菌種の培養物（実施例９及び10を参照のこと）から直接試験した。
【００８０】
本発明の対象である種々の種特異的及び属特異的PCR 測定はすべて特異的である。細菌種又は属に特異的なPCR 測定については、これは、標的種又は属からの種以外の、及び表４及び５から選択された種々の細菌株から単離されたDNA が増幅され得なかったことを意味する。キャンディダアルビカンスに特異的なPCR 測定については、それは、表６に記載の真菌種並びに表４及び５から選択された種々の細菌種からのゲノムDNA を用いて増幅が生じなかったことを意味する。
【００８１】
本発明の対象である種々の種特異的及び属特異的PCR 測定はすべて普遍的である（表７）。（ｉ）Ｅ．フェシウム、Ｌ．モノサイトゲネス、Ｓ．サプロフィティカス、Ｓ．アガラクチア及びＣ．アルビカンスについての種特異的PCR 測定は、種々の源から得られたそして各標的種内での多様性を代表する試験された標的種のすべて又はほとんどからのゲノムDNA を増幅した。これらの株のすべての種の同定は、臨床微生物研究室で日常的に使用される古典的生化学的方法に基いていた。（ii）エンテロコッカス spp. スタフィロコッカス spp. ストレプトコッカス pss. 及びナイセリア sppについての属特異的PCR 測定は、各標的属についてすべての臨床的に重要な細菌種を代表する、試験された標的属のすべての又はほとんどの株からのゲノムDNA を増幅した。
【００８２】
これらの株は種々の源から得られたものであり、そして各標的属内の多様性を代表するものである。やはり、これらの株のすべての種の同定は、臨床実験室において日常的に使用される古典的生化学的方法に基いた。さらに具体的には、４つの属特異的PCR 測定は次の種を増幅した：
【００８３】
（１）エンテロコッカス−特異的測定は、Ｅ．アビウム（E. avium) 、Ｅ．カッセリフラバス（E. casseliflavus) 、Ｅ．デイスパー（E. disper)、Ｅ．ドランス（E. durans)、Ｅ．フェカリス（E. faecalis)、Ｅ．フェシウム（E. faecium) 、Ｅ．フラベッセンス（E. flavescens)、Ｅ．ガリナルム（E. gallinarum)、Ｅ．ヒレア（E. hirae) 、Ｅ．ムンドチー（E. mundtii) 及びＥ．ラフィノサス（E. raffinosus)を含む試験したエンテロコッカスの11の種のすべてからのDNA を効果的に増幅した。
【００８４】
（２）ナイセリア−特異的測定は、Ｎ．カニス（N. canis) 、Ｎ．シネレア（N. cinerea) 、Ｎ．エロンガタ（N. elongata)、Ｎ．クラベッセンス（N. flavescens)、Ｎ．ゴノルホエア（N. gonorrhoeae) 、Ｎ．ラクタミカ（N. lactamica) 、Ｎ．メニンギチディス（N. meningitidis)、Ｎ．ムコサ（N. mucosa)、Ｎ．ポリサッカレア（N. polysaccharea) 、Ｎ．シッカ（N. sicca) 、Ｎ．スブフラバ（N. subflava)及びＮ．ワーベリ（N. weaveri) を含む試験したナイセリアの12種のすべてからのDNA を効率的に増幅した。
【００８５】
（３）スタフィロコッカス−特異的測定は、Ｓ．アウレウス（S. aureus)、Ｓ．アウリクラリス（S. auricularis) 、Ｓ．カピチス（S. capitis) 、Ｓ．コーニー（S. cohnii)、Ｓ．エピデルミディス（S. epidermidis) 、Ｓ．ヘモフィリス（S. haemolyticus)、Ｓ．ホミニス（S. hominis) 、Ｓ．ルグドゥネンシス（S. lugdunensis) 、Ｓ．サプロフィチカス（S. saprophyticus) 、Ｓ．シュライフェリ（S. schleiferi)、Ｓ．シムランス（S. simulans)、Ｓ．ワルネリ（S. warneri) 及びＳ．キシロサス（S. xylosus) を含むスタフィロコッカスの14種の内13種からのDNA を効率的に増幅した。
【００８６】
（４）最後に、スタフィロコッカス−特異的測定は、Ｓ．アガラクチア（S. agalactiae)、Ｓ．アンギノサス（S. anginosus) 、Ｓ．ボビス（S. bovis) 、Ｓ．コンステラツス（S. constellatus)、Ｓ．クリスタ（S. crista)、Ｓ．ディスガラクチア（S. dysgalactiae)、Ｓ．エクイ（S. equi)、Ｓ．ゴルドニ（S. gordonii)、Ｓ．インターメディウム（S. intermedius) 、Ｓ．ミチス（S. mitis) 、Ｓ．ムタンス（S. mutans)、Ｓ．オラリス（S. oralis)、Ｓ．パラサングイス（S. parasanguis) 、Ｓ．ニューモニア（S. pneumonia) 、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes)、Ｓ．サリバリウス（S. salivarium)、Ｓ．サングイス（S. sanguis) 、Ｓ．サブリヌス（S. sabrinus)、Ｓ．スイス（S. suis)、Ｓ．ウベリス（S. uberis)、Ｓ．ベスチブラリス（S. vestibularis)及びＳ．ビリダンス（S. viridans)を含む試験したストレプトコッカスの22種のすべてからのDNA を効果的に増幅した。
【００８７】
他方、スタフィロコッカス−特異的測定は、Ｓ．ムタンス（S. mutans)の９株の内３株及びＳ．サリバリウス（S. salivarius)の23株の内１株を増幅せず、これによりこれら２つのストレプトコッカスの種について普遍性がわずかに欠けることが示された。
【００８８】
研究された各標的微生物種もしくは属又は抗生物質耐性遺伝子のためのすべての特異的及び普遍的増幅プライマーをアネックスVIに示す。配列決定されたDNA 断片の配列又はその部分の多様性がプローブ及び増幅プライマーの特異性に影響を与えない限り、配列決定されたDNA 断片の多様性は生じてもよい。
【００８９】
アネックスVIに挙げられるPCR 増幅プライマーはすべて、参照株及び種々の地域からの臨床単離株を用いて、それらの特異性及び普遍性について試験された。増幅及びハイブリダイゼーション測定を試験するために使用された351 の参照株（表４，５及び６）は（ｉ）American Type Culture Collection) (ATCC) : 85％，（ii）Laboratoire de sante publique du Quebec (LSPQ) : 10％，（iii ）Centers for Disiese Contral and Prevention (CDC) : ３％，（iv）Natronal Culture Type Collection (NCTC) : １％，及び（ｖ）世界中の幾つかの他の参照研究室：１％、から得られた。これらの参照株は、（ｉ）90種のグラム陰性細菌(169株；表４）、（ii）97種のグラム陽性細菌(154株、表５）及び（iii ）12種の真菌（28株；表６）を代表する。
【００９０】
抗生物質耐性遺伝子
抗生物質耐性はしばしば治療を複雑化し、そして治療を失敗に導く。さらに、抗生物質の過剰使用は必然的に細菌耐性の発生を導く。本発明の目的は、臨床医におよそ１時間以内に、最適な治療を処方するために必要な情報を提供することである。普遍的な細菌検出のためのDNA に基く試験による陰性の臨床検体の迅速な同定、並びに種特異的及び／又は属特異的なDNA に基く試験による陽性検体中の特定の病原体の存在の同定のほかに、臨床医は、抗生物質治療に対抗する細菌性病原体の能力についてのタイムリーな情報を必要とする。抗生物質に対する細菌耐性を迅速に評価するための最も効果的な方策は、最も共通的な且つ臨床的に最も重要な抗生物質耐性遺伝子を臨床検体から直接検出すること（すなわち、抗生物質耐性遺伝子の検出のためのDNA に基く試験）であると本発明者らは感じる。
【００９１】
最も重要な且つ一般的な細菌抗生物質耐性遺伝子の配列はデーターベースから入手できるので、本発明者らのストラテジーは、DNAに基く迅速試験法の開発のための基礎として使用されるであろう特異的オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを設計するために耐性遺伝子の一部分又は全体からの配列を使用することであった。臨床的意義（すなわち、高い頻度及び重要性）に基いて選択された抗生物質耐性遺伝子のそれぞれからの配列を配列表に示す。表９及び表10は、選択された抗生物質耐性遺伝子の幾つかの特徴を要約する。抗生物質耐性遺伝子の検出並びに細菌の検出及び同定が１つのPCR 増幅条件下で同時に行われる（実施例13）ので、本発明者らのアプローチはユニークである。
【００９２】
アネックスVIは、PCR 測定により試験された、26の臨床的に重要な抗生物質耐性遺伝子から選択されたすべての増幅プライマーのリストを提供する。抗生物質耐性遺伝子の検出及び同定のための種々のPCR 測定が、標的遺伝子を担持することが知られている、多くの国から得られた幾つかの耐性細菌株を試験することにより評価された。すべての測定が特異的であることを確認するために、標的耐性遺伝子を把持しない多数の株の試験も行った。今まで、抗生物質耐性遺伝子についてのすべてのPCR 試験は高度に特異的であり、そして標的遺伝子を担持することが知られているすべての対照耐性細菌株を検出した。抗生物質耐性遺伝子の検出及び同定のための一連のPCR 測定を評価するための幾つかの臨床研究の結果は、これらのDNA に基く測定を標準的抗生物質感受性試験法と関連するものであり、表11及び12に示される。
【００９３】
普遍的細菌検出
日常の微生物学研究室において、細菌同定のために送られてくる臨床検体の多くが培養により陰性である（表４）。特異的同定に先立って細菌の存在を検出するためにユニバーサル増幅プライマー又はユニバーサルプローブを用いて臨床検体を試験し、そして多くの陰性の検体を篩い除くことは重要である。なぜなら、これはコストを下げ、そして患者の臨床管理を迅速に指示するからである。従って、幾つかの増幅プライマー及びプローブが、tuf 遺伝子からの細菌配列の高度に保存された部分から合成された（表８）。ユニバーサルプライマーの選択は、実施例１及びアネックスＩに記載される利用可能なデーターベース配列から選択され又は本発明者らにより決定された配列から構成された多数の配列の整列(alignment) に基いた。
【００９４】
細菌の普遍的検出のために適当なデーターベース配列の同定のため、本発明者らは、２つの遠縁の微生物（すなわち、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium)及びヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae))の完全なゲノム配列が利用できることを利用した。これらの遠縁の２種類の微生物のゲノムによりコードされているすべての蛋白質のアミノ酸配列の比較が高度に相同な蛋白質の同定を導いた。これらの相同な蛋白質の解析が、細菌の検出のための普遍的なDNA に基く測定法の開発のための幾つかの有望な候補の選択を可能にした。
【００９５】
他の幾つかの微生物ゲノムの完全なヌクレオチド配列がデーターベースから入手可能であるので、当業者は、マイコプラズマ・ゲニタリウム及びヘモフィルス・インフルエンザのゲノム配列以外のゲノム配列を比較することにより同じ結論に達することができるであろう。選択されたtuf 遺伝子は、蛋白質の合成の間の翻訳過程に関連する蛋白質（FF−Tu）をコードする。従って、データーベースから得られる遺伝子配列及び前記のごとく本発明者らが決定した新規なtuf 配列を用いて、広範なヌクレオチド配列解析を行った。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列のすべてのコンピューター解析はGCG プログラムを用いて従った。次に、細菌の普遍的増幅のための最適のPCR プライマーを、 OligoＴＭプログラムにより選択した。
【００９６】
選択されたプライマーは、すべての臨床的に意義のある細菌配列の増幅を可能にするように、幾つかのヌクレオチド部位で縮重（degenerate）しており、そして幾つかのイノシンを含有する（アネックスＩ）。イノシンは、４種類のヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ又はＴのいずれとも特異的に結合することができるヌクレオチドである。縮重したオリゴヌクレオチドは、ミスマッチ部位において４種類のヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ又はＴの２以上を有するオリゴヌクレオチドの混合物から成る。増幅プライマー中にイノシン及び／又は縮重を含めることにより、ミスマッチに耐えることができるようになり、これにより、より広い範囲の標的ヌクレオチド配列の増幅が可能になる（Dieffenbach and Dveksler,1995, PCR Primer : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labortory Press, Plainview, NY)。
【００９７】
ユニバーサルプライマーを用いての増幅条件は、アニーリング温度が55℃ではなく50℃であったことを除き、種特異的及び属特異的増幅測定のためのそれと同じであった。このユニバーサルPCR 測定は、細菌の検出のために特異的であり、そしてほぼ普遍的であった。細菌についての特異性は、表６に示す12種の真菌から単離されたゲノムDNA 並びに、ライシュマニア・ドノバニ（Leishmania donovani)、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisine) 及びヒトリンパ球からのゲノムDNA を増幅させることにより確認された。
【００９８】
上記真核生物DNA 調製物のいずれもユニバーサル測定により増幅され得ず、これによりこの試験が細菌について特異的であることが示唆された。このユニバーサル測定の普遍性は、95の最も臨床的に意味のある細菌種を代表する116 の参照株からのゲノムDNAを増幅することにより証明された。これらの種は、表４及び表５に示す細菌種から選択された。本発明者らは、116 株の内104 株が増幅されたことを見出した。増幅され得なかった細菌種はコリネバクテリウム（Corynebacterium) (11種）及びステノトロホモナス（Stenotrophomonas) （１種）に属する。これらの細菌種からのtuf 遺伝子の配列決定は最近行われている。
【００９９】
この配列決定データーが一層普遍的である新規なユニバーサルプライマーを選択するために使用された。本発明者らはまた、効果的な増幅を得るために幾つかの種についてはアニーリング温度を45℃に低下させなければならないことを観察した。これらの細菌種には、ゲメラ・モルビブラム（Gemella morbibrum)、リステリア・spp 及びガーデネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis)が含まれる。ユニバーサン測定の普遍性を試験するために表４及び表５から選択された95の細菌種は、地域社会で又は病院で得られる種々のヒトの感染（病院内感染）に関連する臨床的に最も意味のある細菌種のすべてを含むことに注目することが重要である。臨床的に最も重要な細菌及び真菌病原体を表１及び表２に挙げる。
【０１００】
実施例及びアネックス
下記の実施例及びアネックスは本発明の種々の方法及び化合物を例示することを意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
種々のアネックスは、tuf 配列から又はrecA遺伝子からの増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを示す：（ｉ）アネックスＩは、tuf 配列からのユニバーサル増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを例示する。（ii）アネックスIIは、tuf 配列からのエンテロコッカス属に特異的な増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを示す。
【０１０１】
（iii ）アネックスIII はtuf 配列からのスタフィロコッカス属に特異的な増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを例示する。（iv）アネックスＶは、tuf 配列からのキャンディダ・アルビカンスに特異的な増幅プライマーの選択に使用されたストラテジーを示す。（ｖ）アネックスｖは、recA配列からのストレプトコッカス属に特異的な増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを例示する。（vi）アネックスVIは、すべての選択されたプライマー対のリストを提供する。これらのアネックスに示されるように、選択された増幅プライマーはイノシン及び／又は縮重を含むことができる。
【０１０２】
イノシンは、４種類のヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ又はＴのいずれとも特異的に結合するヌクレオチド類似体である。あるいは、ミスマッチ部位において４種類のヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ又はＴの２又はそれ以上を有するオリゴヌクレオチド混合物から成る縮重(degenerated) オリゴヌクレオチドが使用された。増幅プライマーにイノシン及び／又は縮重を含めることにより、ミスマッチに対する寛容性が許容され、それによって、より広範囲の標的ヌクレオチド配列の増幅が可能となる（Dieffenbach and Dveksler, 1995, PCR Primer : A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
【実施例】
【０１０３】
実施例１．tuf 配列からのユニバーサルPCR プライマーの選択
アネックスＩに示すように、種々の細菌及び真菌種からのtuf 配列の比較により、細菌の検出のためにユニバーサル（普遍的）なPCR プライマーの選択が可能となった。PCR プライマーを設計するために使用されたストラテジーは、種々のtuf 配列の多数配列整列の解析に基いた。この多数配列整列は、本発明者らにより決定されたか又はデーターベースから選択された。38個の細菌種及び３個の真菌種からのtuf 配列を含む（表13）。この多数配列整列の注意深い解析により、ユーバクテリア（eubacteria) 内で保存されているが真核生物からの配列を区別するプライマー配列の選択が可能となり、これにより細菌の普遍的検出が可能となった。
【０１０４】
アネックスＩに示すように、選択されたプライマーはイノシン及び縮重を含む。これは、tuf 遺伝子は高度に保存されているにも拘らず、細菌tuf 配列間に比較的高い多形性（polymorphism) が存在するので、必要である。事実、本発明者らが決定したtuf 配列間に、本発明者らは多くのヌクレオチド変化並びにアミノ酸の幾つかの欠失及び／又は挿入を見出した。選択されたユニバーサルプライマーは細菌について特異的であり且つ普遍的であった（表７）。試験された臨床的に最も重要である細菌種の内、12種は増幅されなかった。これらの種はコリネバクテリウム属（11種）及びステノトロホモナス（Stenotrophomonas) （１種）に属する。ユニバーサルプライマーは、ヒト及び他のタイプの真核生物DNA を含めて、非細菌源のDNA を増幅しなかった。
【０１０５】
実施例２．tuf 配列からの属特異的PCR プライマーの選択
アネックス２及び３に示すように、種々の細菌種からのtuf 配列の比較により、エンテロコッカス spp. 又はスタフィロコッカス spp. について特異的なPCR プライマーの選択が可能であった。PCRプライマーを設計するために用いられたストラテジーは、種々のtuf 配列の多数配列整列の解析に基いた。これらの多数配列整列は、各標的属から選択された４種の代表的な細菌のtuf 配列、及び他の類縁の細菌の属の種からのtuf 配列を含む。これらの整列の注意深い解析により、標的属内で保存されているがしかし他の類縁属からの配列を区別するオリゴヌクレオチド配列の選択が可能となり、これにより標的細菌属の属−特異的且つ普遍的検出及び同定が可能となった。
【０１０６】
エンテロコッカス sppについて特異的なプライマーの選択（アネックスII）のため、本発明者らは、エンテロコッカス・アビウム、Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェシウム、及びＥ．ガリナルムのtuf 遺伝子の約 890bpの部分の配列を決定した。整列において用いた他のすべてのtuf 配列は本発明者らにより配列決定されたか、又はデーターベースから選択された。この配列整列の解析が、エンテロコッカス spp. について特異的であり且つ普遍的であるプライマー対の選択を導いた（表７）。試験した11種のエンテロコッカスのすべてが効率的に増幅され、そして他の属の細菌種からのゲノムDNA の増幅は存在しなかった。
【０１０７】
スタフィロコッカス spp. について特異的なプライマーの選択のため（アネックスIII ）、本発明者らはまた、スタフィロコッカス・アウレウス、Ｓ．エピデルミディス、Ｓ．サプロフィティカム及びＳ．シムランスのtuf 遺伝子の約 890bpの部分を配列決定した。整列において使用した他のすべてのtuf 配列は、本発明者らにより配列決定されたか、又はデーターベースから選択された。この配列整列の解析がスタフィロコッカス spp．について特異的であり且つ普遍的である２個のプライマー対の選択を導いた（表７）。
【０１０８】
アネックスIII は、これら２個のPCR プライマー対の１つを選択するために用いられたストラテジーを示す。これと同じストラテジーが他方のプライマー対を選択するためにも使用された。試験された14種のスタフィロコッカスの内、１種（Ｓ．スシウム（S. scium) は、上記２組のプライマー対のいずれを使用したスタフィロコッカス特異的PCR 測定によっても増幅され得なかった。上記２個のプライマー対のいずれか一方を用いるPCR 測定において、他の細菌属の種からのDNA の増幅は存在しなかった。
【０１０９】
実施例３．キャンディダ・アルビカンスについて特異的なPCR プライマーのtuf 配列からの選択
アネックスIVに示すように、種々の細菌種及び真核生物種からのtuf 配列の比較により、キャンディダ・アルビカンスについて特異的なPCR プライマーの選択が可能になった。PCR プライマーを設計するために用いられたストラテジーは、種々のtuf 配列の多数配列整列の解析に基いた。この多数配列整列は、本発明者のグループにより決定されたキャンディダ属から選択された５種の代表的な真菌（すなわち、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．グラブラタ（C. glabrata)、Ｃ．クルセイ（C. kusei) 、Ｃ．パラプシロシス（C. parapsilosis)、及びＣ．トロピカリス（C. tropicalis)) のtuf 配列、並びに類縁の真菌種からのtuf 配列を含む。種々の細菌種からのtuf 配列をも含めた。
【０１１０】
この配列整列の注意深い解析により、Ｃ．アルビカンスのtuf 配列からのプライマーの選択が可能になった。これらのプライマーは、他の類縁のキャンディダの種及び他の真菌種からの配列を区別し、これによりＣ．アルビカンスの種特異的及び普遍的検出及び同定が可能となる（表７）。試験されたキャンディダ・アルビカンスの88株のすべてが効率的に増幅され、そして他の真菌又は菌種からのゲノムDNA の増幅は存在しなかった。
【０１１１】
実施例４．スタフィロコッカスについて特異的なPCR プライマーのrecAからの選択
アネックスＶに示すように、細菌ストレプトコッカス属について特異的及び普遍的なPCR プライマーの選択のための基礎として、データーベース（Gen Bank及びEMBL) から入手可能な種々の細菌recA遺伝子配列の比較を用いた。recA遺伝子の配列はスタフィロコッカスの５種を含めて多くの細菌種について入手可能であるので、スタフィロコッカス属内でよく保存されているが他の細菌属のrecA配列から区別される配列を選択することができた。
【０１１２】
スタフィロコッカスの５種からのrecA配列間にミスマッチが存在する場合、プライマーにイノシン残基を導入した（アネックスＶ）。それぞれが１個のイノシンを含有し、縮重を含まない、選択されたプライマーはスタフィロコッカス種について特異的且つ普遍的であった（表７）。このPCR 測定は、ストレプトコッカスの試験された22種のすべてを増幅した。しかしながら、このストレプトコッカス−特異的測定は、Ｓ．ミュタンス（S. mutans)の９株の内３株、及びＳ．サリバリウム（S. salivarius)の３株の内の１株からのDNA を増幅しなかった。
他の細菌属からのゲノムDNA の増幅は存在しなかった（表７）。
【０１１３】
実施例５．DNA 断片のヌクレオチド配列の決定
種々の細菌又は真菌種からのtuf 遺伝子の部分のヌクレオチド配列は、ジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション配列決定法（Sangerら、1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 : 5463-5467) を用いて決定された。Applied Biosystemsの自動DNA 配列決定株（モデル373A）とその PRISMＴＭ Sequenase（Ｒ） Terminator Double-stranded DNA Sequencing Kit (Perkin-Elmer Corp., Applrid Biosystem Division, Foster City, CA) を用いて行った。配列決定プライマーは細菌tuf 遺伝子tufA及びtufBの両方に効果的にハイブリダイズするので、この配列決定ストラテジーはtufA遺伝子とtufB遺伝子とを区別しない。これらのDNA 配列を配列表（配列番号： 118〜146)に示す。本発明者らのグループにより決定された種々のtuf 配列（表13）中の幾つかの縮重したヌクレオチドの存在は、tufAとtufBとの間の配列変化に対応する。
【０１１４】
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの選択
オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、 OligoＴＭプログラムを用いて本発明のDNA 断片又はデーターベース配列から選択され、そしてホスホルアミダイト法を用いて自動化されたABI DNA 合成機（Model 391, Perkin-Elmer Corp. Applied Biosystems Division)により合成された。
【０１１５】
実施例６．ハイブリダイゼーション測定のためのオリゴヌクレオチドのラベル化
各オリゴヌクレオチドは、前記のごとく、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Pharmacia) により、γ−32Ｐ（dATP）を用いて５'−末端ラベルされた。ラベルは非放射性であってもよい。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドプローブのための特異性試験
すべてのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブは、前記のごとく、表４，５及び６から選択された種々の細菌及び真菌種からのDNA とのハイブリダイゼーションにより試験した。種特異的又は属特異的プローブは、それが単離された微生物種又は属からのDNA とのみハイブリダイズするものである。特異的であることが見出されたオリゴヌクレオチドプローブは、次の普遍性試験にかけた。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドプローブのための普遍性試験
次に、特異的オリゴヌクレオチドプローブは、各標的種又は属内での多様性を代表する、他の多くの国から得られた株及び参照株を含めての標的種又は属の株を用いて、普遍性試験にかけた。単離株からの染色体DNA をナイロン膜上に移し、そして特異性試験について上記したラベルされたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。各標的種又は属について作成された単離株の組は、参照ATCC株並びに種々の由来から得られた種々の臨床単離株を含む。普遍的プローブとは、標的種又は属の臨床単離株の組からのDNA の80％以上にハイブリダイズするプローブである。
【０１１８】
実施例７．
（ｉ）感度を上昇せしめそして 100％の普遍性を保証するために、又は（ii）複数の種及び／又は属を同時に同定するために、複数のオリゴヌクレオチドプローブのプールを微生物の同定のために用いた点を除き、実施例６と同じである。微生物の同定は微生物培養物から、又は任意の臨床検体から直接に行うことができた。
【０１１９】
実施例８．
細菌又は真菌を臨床検体から直接検出した点を除き実施例６と同じである。いずれかの生物学的サンプルをドットブロット装置に直接に付加し、そして細胞をその場で、細菌又は真菌検出及び同定のために溶解した。ドットブロット装置への便利な付加を妨害する凝集を防止するために、血液サンプルはヘパリン処理すべきである。
【０１２０】
実施例９．
PCR 増幅
測定の感度及び迅速性を向上させるためにPCR 法を用いた。プライマーの特異性及び普遍性を決定するため、直接細菌コロニーから又は標的化された細菌懸濁液から（実施例10を参照のこと）行われるPCR 測定においてプライマーのセットを試験した（表７）。特異的及び普遍的PCR プライマーの例をアネックスVIに示す。
【０１２１】
増幅プライマーのための特異性及び普遍性試験
すべての選択されたPCR プライマー対の特異性を、前記のごとく、表４，５及び６から選択された種々の細菌又は真菌種からのDNAに対して試験した。各種又は属に対して特異的であることが見出されたプライマー対は次に、標的種又は属の単離株の組からのDNA の90％以上を各プライマーセットが増幅することができることを保証する普遍性について試験した。各種について作製された単離株の組は、各種又は属内での多様性を代表する、世界中からの種々の臨床単離株及び参照ACCC株を含む。誤まった陽性（false poritive) のPCR 結果を防止するために標準的な注意が払われるべきである（Kwok and Higuchi, 1989, Natue, 239 : 237-238) 。PCR のキャリーオーバーをコントロールするために、ウラシル−Ｎ−グリコシダーゼによる不活性化のごときPCR 増幅生成物不活性化する方法を用いるべきである。
【０１２２】
実施例10．細菌又は酵母培養物からの直接増幅
PCR 測定を直接に細菌コロニーから又は細菌懸濁液から行った。後者は、標準McF orland 0.5（およそ 1.5×10８ 細菌／mLに相当する）に調整した。コロニーからの直接増幅の場合、コロニーの一部分をプラスチック棒を用いて直接に、50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH9.0), 0.1％ Triton X-100, 2.5mM MgCl2, 0.4μMづつの各プライマー、 200μMづつの４種類のdNTP及び 0.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ、並びに Taq StartTM（Clontech Laboratories Inc.) を含有する20μLのPCR 反応混合物に移した。細菌懸濁液については、１μLの細胞懸濁液を19μLの同じPCR 反応混合物に加えた。酵母培養物からの同定のためには、１μLの標準McF orland 1.0（約 3.0×108 細菌／mMに相当する）を直接にPCR 反応に加えた。酵母細胞についてのMcF orland 0.5は、細菌細胞のMcF orland 0.5よりも細胞数が 200倍少ないから、上記の酵母細胞についての濃縮段階を行った。
【０１２３】
次に、PCR 反応混合物を、PTC-200 themal cycler を用いて熱サイクリング（95℃にて３分間、これに続き、変性段階のための95℃にて１秒間及びアニーリング−延長段階のための55℃にて30秒間の30サイクル）にかけた。次に、PCR 増幅生成物を標準的アガロースゲル（２％）電気泳動により分析した。増幅生成物は、0.25μｇ／mLの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル中、 254nmのUVのもとで可視化した。約１時間で完全なPCR 測定を完了することができた。
【０１２４】
すべてのPCR 反応のための内部対照を提供するため、細菌16ＳリボソームRNA 遺伝子の高度に保存された領域に由来するプライマー配列を用いた。あるいは、内部対照は、微生物又はヒトゲノムに見出されない配列から導いた。PCR 測定の効率を確認し、そして有意なPCR 阻害が存在しなかったことを保証するために、内部対照をすべての増幅反応に導入した。rRNA由来の内部対照は細菌の細菌溶解プロトコールの効率をモニターするためにも有用であった。内部対照及び種特異的又は属特異的増幅はマルチプレックス(multiplex)PCR 測定において同時に行った。
【０１２５】
実施例11．尿検体からの直接増幅
尿検体から直接行うPCR 増幅のため、１μLの尿を、500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH9.0), 1％ Triton X-100 を含有する細胞溶解溶液４μＬと混合した。室温にて15分間以上のインキュベーションの後、１μLの処理された尿検体を19μLのPCR 反応混合物に直接加えた。PCR 試薬の最終濃度は50mM KCl 10mM Tris (pH9.0), 0.1％ Triton X-100, 2.5mM MgCl2, 0.4μＭづつのプライマー、 200μＭづつの４種類のdNTPであった。さらに、各20μＬの反応混合物は、 Taq StartＴＭ抗体（Clontech Laborotories Inc.) と組合わせて 0.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ(Promega) を含有した。
内部対照、PCR 増幅及びアンプリコンのアガロースゲル検出のストラテジーは実施例10に記載した通りである。
【０１２６】
実施例12．抗生物質耐性遺伝子の検出
しばしば遭遇されそして臨床的に意味のある特定の抗生物質耐性遺伝子の存在は、前記のPCR 増幅及びハイブリダイゼーションプロトコールにより同定される。DNA に基く試験の基礎として使用される特異的オリゴヌクレオチドは、抗生物質遺伝子配列から選択される。抗菌剤に対する細菌の耐性の迅速な評価を可能にするこれらの試験は、臨床検体から、標準化された細菌懸濁液から又は細菌のコロニーから直接に行うことができ、そして細菌の普遍的（ユニバーサル）検出並びに種特異的及び属特異的微生物検出及び同定のための診断試験を補完すべきである。
【０１２７】
実施例13．
特定の標的病原体について 100％の普遍性を達成するためにマルチプレックスPCR(すなわち、単一のPCR 反応において複数対のプライマーを用いる）により測定を行った点を除き、実施例10及び11と同じであった。さらに不均一な微生物種又は属のためには、標的種又は属のすべての代表を検出及び同定するために複数のPCR プライマー対の組合せが必要であろう。
【０１２８】
マルティプレックスPCR 測定は、（ｉ）複数の微生物種及び／又は属を同時に検出するため、あるいは（ii）臨床検体又は細菌培養物からの、細菌及び／又は真菌病原体検出及び同定、並びに特定の抗生物質耐性遺伝子の検出を同時に行うためにも使用することができる。
【０１２９】
これらの用途のため、アンプリコン検出法は、生成される種々のアンプリコンを区別するように適合されるべきである。標準的ゲル電気泳動はアンプリコンをそのサイズに基いて区別するので、これを用いることができた。この目的のための他の有用なストラテジーは、異る波長で放射する種々の蛍光色素を使用する検出法であろう。蛍光色素は、増幅中に分解して蛍光色素を遊離する蛍光減衰剤（fluorescence qurencher) に連結された特異的のオリゴヌクレオチドと結合されてもよい（例えば Taq ManTM，Perkin Elmer) 。
【０１３０】
実施例14．増幅生成物の検出
増幅生成物の表示のために標準的アガロースゲル電気泳動（実施例10）以外の方法が使用できることを当業者は理解するであろう。このような方法は、蛍光の分極（fluorescence polarization 又は増幅後の蛍光の検出に基くことができ（例えば、 AmplisencerTM，Biotronics ; Taq ManTM，Perkin-Elmer Corp.) あるいは他のラベル、例えばビオチンを使用することができる（SHARP SignalTMシステム、Digene Diagnosis) ことができる。これらの方法は定量的であり、そして自動化することができる。種特異的、属特異的又はユニバーサルDNA 断片に由来するアンプリコンに特異的な増幅プライマー又は内部オリゴヌクレオチドプローブの１つが蛍光色素又は他の任意のラベルに連結される。蛍光の検出に基く方法は、異る波長で放射する蛍光色素を利用することができるので、迅速であり且つ柔軟性があるので、診断試験のために特に適当である。
【０１３１】
実施例15．
種特異的、属特異的、ユニバーサル及び抗生物質耐性遺伝子増幅プライマーは、他の迅速増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応(LCR) 、転写−介存増幅(TMA）、自己保持複製（３SR）、核酸配列に基く増幅（NA SBA）、鎖置換増幅(SDA) 、サイクリングプローブ法(CPT)及び分岐DNA (bDNA)又は試験の感度を向上させる他の任意の方法において使用することができる。増幅は単離された細菌培養物から、又は任意の臨床検体から直接に行うことができる。従って本発明の範囲は、PCR のための配列表からのDNA 配列の使用に限定されず、試験の迅速性及び感度の向上のために使用することができ、細菌DNA を特異的に検出するあらゆる方法の使用を含む。
【０１３２】
実施例16．
試験キットは、各微生物種又は属に特異的なプローブのセット、及びユニバーサルプローブのセットを含むであろう。キットは、非放射性ラベルによりユニバーサルプローブのセット、並びに特定のタイプの臨床サンプル中の注目の病原体の検出のためのラベルされた種特異的又は属特異的プローブから成る試験要素の形態で提供されるであろう。キットはまた、プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄段階及びハイブリドの検出を行うのに必要な試験試薬を含むであろう。最後に、既知の抗生物質耐性遺伝子（又はその誘導体）の検出のための試験要素も含まれるであろう。言うまでもなく、キットは各ハイブリダイゼーション試験のための陰性対照及び陽性対照として使用されるべき標準サンプルを含むであろう。
【０１３３】
キットに含まれるべき要素は、各検体のタイプに、及びその検体タイプにおいて一般に遭遇される病原体を検出するために適合されるであろう。細菌の普遍的（ユニバーサル）検出のための試薬もまた含まれるであろう。感染の部位に基いて、病原体の特異的検出のために下記のキットが開発されるであろう。
【０１３４】
◎ 微生物ゲノムの高度に保存された領域に対して特異的なセットを含む、すべての臨床検体からの細菌又は真菌病原体のユニバーサル検出のためのキット。
◎ ５種の特異的試験要素（エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・スペーシス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、スタフィロコッカス・スペーシス及びキャンディダ・アルビカンスの検出のためのプローブのセット）を含む、尿サンプルから回収された微生物病原体の検出のためのキット。
【０１３５】
◎ ３種の試験要素（スタフィロコッカス・スペーシス、エンテロコッカス・スペーシス及びキャンディダ・アルビカンスの検出のためのプローブのセット）を含む、呼吸器病原体の検出のためのキット。
◎ 10種類の特異的試験要素（ストレプトコッカス・スペーシス、ストレプトコッカス・アガラクチア、スタフィロコッカス・スペーシス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、エンテロコッカス・スペーシス、エンテロコッカス・フェシウム、ナイセリア・スペーシス、ナイセリア、メニンギチディス、リステリア・モノサイトゲネス、及びキャンディダ・アルビカンスの検出のためのプローブのセット）を含む、血液サンプルから回収された病原体の検出のためのキット。このキットは、血液培養物の直接検出及び同定のためにも適用することができる。
【０１３６】
◎ ５種類の特異的試験要素（ストレプトコッカス・スペーシス、リステリア・モノサイトゲネス、ナイセリア・メニンギチディス、ナイセリア・スペーシス及びスタフィロコッカス・スペーシスの検出のためのプローブのセット）を含む、メニンギチス（meningitis) を生じさせる病原体の検出のためのキット。
【０１３７】
◎ 抗生物質耐性に関連する次の26の遺伝子、 blatem， blarob， blashv， blaoxa，blaZ，aadB，aacC1, aacC2，aacC3, aacA4， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，mecA，vanA, vanB, vanC,satA, aac(6')-aph(2'')，aad(6') ，vat, vga, msrA, sul 及びint の少なくとも１つの特異的検出のためのプローブのセットを含む、臨床的に重要な抗生物質耐性遺伝子の検出のためのキット。
◎ 皮膚、腹部創傷又は他の臨床的に意味のある感染からの病原体の検出のために適合された他のキット。
【０１３８】
実施例17．
試験キットが、DNA 増幅測定に必要なすべての試薬及び対照を含む点を除き、実施例16と同じとした。診断キットは臨床検体から又は微生物培養物から直接行われるPCR(又は他の増幅法）による増幅に適合されるであろう。（ｉ）ユニバーサル細菌検出、（ii）種特異的及び属特異的細菌及び／又は真菌検出及び同定、並びに（iii ）抗生物質耐性遺伝子の検出、のために必要な要素が含まれるであろう。
【０１３９】
増幅測定は、チューブ又は多数のウエルを有するミクロタイタープレート中で行うことができる。プレートでの測定のため、ウエルは特異的増幅プライマー及び対照DNA を含有し、そして増幅生成物の検出は自動化されるであろう。普遍的（ユニバーサル）細菌検出のための試験及び増幅プライマーは、臨床検体から直接に行われる試験のキットに含まれるであろう。種特異的及び属特異的細菌及び／又は真菌検出及び同定のため並びに同時的抗生物質耐性遺伝子検出のために必要な要素は、細菌又は真菌培養物から直接試験するためのキット並びに任意のタイプの臨床検体から直接試験するためのキットに含まれるであろう。
キットは、ハイブリダイゼーションに基く診断キットについての実施例16に記載された各タイプの検体の使用のために適合されるであろう。
【０１４０】
実施例18．
細菌及び／又は真菌の検出及び同定のための本発明において記載されるプローブ及び増幅プライマーの使用は、臨床的微生物学的適用に限定されない。事実、本発明者らは、他の分野は、これらの新技術から利益を得ると考える。例えば、これらの試験は、食品、水、医薬製剤又は微生物学的管理を必要とする他の製品の品質管理のために産業界により利用され得る。これらの試験はまた、ヒト以外の生物（例えば、他の霊長類、トリ、植物、哺乳類、農業動物、家畜及び他の生物）からの生物学的サンプル中の細菌又は真菌を検出及び同定するためにも適用され得る。これらの診断的道具は、臨床試験及び疫学研究を含めての研究目的のためにも非常に有用である。
【０１４１】
本発明は以上のように記載され、本発明の本質を逸脱することなく変更を行うことができることは明らかである。これらの変更は、請求の範囲に記載された本発明の範囲で行うことができる。
【０１４２】
【表１】
【０１４３】
【表２】
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
【表４】
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
【表７】
【０１４９】
【表８】
【０１５０】
【表９】
【０１５１】
【表１０】
【０１５２】
【表１１】
【０１５３】
【表１２】
【０１５４】
【表１３】
【０１５５】
【表１４】
【０１５６】
【表１５】
【０１５７】
【表１６】
【０１５８】
【表１７】
【０１５９】
【表１８】
【０１６０】
【表１９】
【０１６１】
【表２０】
【０１６２】
【表２１】
【０１６３】
【表２２】
【０１６４】
【表２３】
【０１６５】
【表２４】
【０１６６】
【表２５】
【０１６７】
【表２６】
【０１６８】
【表２７】
【０１６９】
【表２８】
【０１７０】
【表２９】
【０１７１】
【表３０】
【０１７２】
【表３１】
【０１７３】
【表３２】
【０１７４】
【表３３】
【０１７５】
【表３４】
【０１７６】
【表３５】
【０１７７】
【表３６】
【０１７８】
【表３７】
【０１７９】
【表３８】
【０１８０】
【表３９】
【０１８１】
【表４０】
【０１８２】
【表４１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌DNAを検出、同定又は定量するための新規な方法のに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌の同定及び感受性テストのための古典的方法細菌は、古典的には、AP120EＴＭ系（bio Merieux)のごとき生化学試験の使用により炭素源及び窒素源として種々の物質を資化する能力により同定される。感受性試験のためには、臨床微生物研究室は、ディスク拡散、寒天希釈及びグロスマイクロ希釈を含む方法を用いる。生化学試験及び抗細菌感受性試験に基く同定は安価であるが、臨床検体からの細菌を同定しそして抗微生物剤に対するそれらの感受性を決定するために２回続けての一夜インキュベーションが必要であるため予備的結果を得るのに少なくとも２日間が必要である。
【０００３】
より速い微生物同定及び感受性試験のために複雑で且つ高価な装置を使用する幾つかの商業的に入手可能な自動化されたシステム（すなわち、Dade Divynortic Corp. からのMicro Scan system 、及びbio Merieux からのVitek system) が存在する（Stager and Davis, 1992, Clin. Microbiol. Rev. 5 : 302-327)。これらのシステムはより短いインキュベーション期間を必要とし、このためほとんどの細菌同定及び感受性試験が６時間未満で行われることを可能にする。それにも拘らず、これらのより速いシステムは常に細菌を純粋な培養物として一次単離することは必要とし、この工程は純粋培養のために少なくとも18時間又は混合培養のために少なくとも２日間を必要とする。
【０００４】
最も迅速な同定システムである auto SCAN-Walk-AwayＴＭ システム（Dade Divynostics Corp.) は標準的接種物からのグラム−陰性及びグラム陽性の再細菌種を２時間という短時間で同定しそして 5.5時間でほとんどの抗生物質に対する感受性パターンを提供する。しかしながら、この系は、エンテロバクテリアセー（Enterobacteriaceae) 以外の細菌種について特に高い比率（すなわち、 3.3〜40.5％の結論的でない同定をもたらす（Croize J. 1995, Lett. Infectiol. 10 : 109-113 ; Yorkら、1992, J. Clin. Microbiol. 30 : 2903-2910) 。エンテロバクテリアセーについては、結論的でない同定は 2.7〜11.4％である。
【０００５】
広範囲の種類の細菌及び真菌が、微生物研究室の臨床検体から日常的に単離されそして同定される。表１及び表２は、種々のタイプの臨床検体から最も一般的に単離される細菌及び真菌病原体の頻度を示す。これらの病原体は最もしばしば鼻科及び地域社会からのヒトの感染と関連しており、そしてそれ故に臨床的に最も重要であると考えられる。
【０００６】
臨床微生物研究室で試験される臨床検体
臨床微生物研究室で受理されるほとんどの臨床検体は尿及び血流サンプルである。ラバル大学中央部病院（Centre Hospitalier deI'Universite Laval ; CHUL)の微生物研究室では、尿及び血流が、受理される検体のそれぞれ約55％及び約30％を占める（表３）。臨床検体の残りの15％は、唾液、膿、脳脊椎液、滑液などを含めての種々の生物学的流体を含む（表３）。尿管、呼吸気管及び血流の感染は通常細菌が原因のものであり、そして抗微生物療法を必要とする。事実、臨床微生物研究室で受理されるすべての臨床サンプルは日常的に細菌の同定及び感受性試験について試験される。
【０００７】
臨床検体からの従来の病原体同定
尿検体
尿検体中の病原体のサーチは日常的微生物学研究室において支配的であるため、無数の試験法が開発されている。しかしながら、最終的な基準（gold Standard)は古典的な平定量的平板培養法のままであり、この方法においては１μＬの尿がプレート上にストリークされ、そして18〜24時間インキュベートされる。次にコロニーを計数して尿１リットル当りのコロニー形成ユニット(CFU) の合計数を決定する。尿管の細菌感染は通常、尿中の10７CFU／Ｌ以上の細菌カウント数と関連している。
【０００８】
しかしながら、尿中10７CFU／Ｌ未満の感染も特に、多数の疾患を有する患者又はカテーテルが挿入された患者においては、可能性がある（Stark and Maki, 1984, N. Engl. J. Med. 311 : 560-564) 。重要なことには、臨床微生物研究室において試験される尿検体の約80％が陰性（すなわち10７CFU／Ｌ未満の細菌カウント；表３）と考えられる。培養により陽性と見出された尿検体はさらに細菌病原体を同定するために標準的生化学試験により特徴付けられ、そして抗生物質に対する感受性について試験される。生化学的試験及び感受性試験は通常18〜24時間のインキュベーションを必要とする。
【０００９】
細菌病原体についての迅速且つ正確な尿スクリーニング方法は陰性の検体の一層速い同定並びに患者の一層効果的な治療及びケアー管理を可能にするであろう。幾つかの迅速な同定法(UriscreenTM，UTI screenTM，Flash TrackTM DNA probes 等）が、細菌病原体の培養に基礎を置くより遅い標準的生化学的方法と比較されている。これらの迅速試験法は、非常に迅速ではあるが、低い感度及び貧弱な特異性並びに多数の誤った陰性及び誤った陽性結果を示した（Koening ら、1992, J. Clin. Microbiol. 30 : 342-345 ; Pezzlo ら、1992, J. Clin. Microbiol. 30 : 640-684) 。
【００１０】
血液検体
微生物研究室で受理される血液検体は常に培養に付される。血液培養系は手動的であり、半自動的であり、又は完全に自動化されていてもよい。BACTECシステム（Becton Dickinson) 及びBacTAlertシステム（organo Teknika Corporation) が２つの最も広く使用されている自動血液培養系である。これらの系では、血液培養ビンを、細菌増殖のための最適条件下でインキュベートする。細菌増殖を連続的にモニターし、高感度細菌増殖検出器を用いて早期の陽性を検出する。
【００１１】
一旦増殖が検出されれば、血液培養物から直接にグラム染色を行い、そして次に栄養寒天培地への接種のために使用される。次に、前記のごとき自動化されたシステムを用いて、単離された細菌コロニーからの細菌同定及び感受性試験を行う。６〜７時間のインキュベーションの後に増殖が検出されなければ、前記のビンは通常、陰性として報告される。通常、ほとんどの血液培養物は陰性として報告される。例えば1994年２月〜1995年１月の間でCHULの微生物研究室で陰性の血液培養の比率は93.1％であった（表３）。
【００１２】
他の臨床サンプル
臨床微生物研究室による受理の後、血液及び尿以外の、通常無菌である部位（すなわち、脳脊椎、滑膜、肋膜、心膜及びその他）からのすべての体液は直接顕微鏡試験、及びそれに続く培養のために処理される。やはり、ほとんどの臨床サンプルは培養について陰性である（表３）。
【００１３】
無菌的部位からではない臨床検体、例えば唾液及び糞便検体については、通常菌そうによる汚染のため、培養による実験室診断は一層問題である。潜在的に感染と関連している細菌性病原体は、汚染物を除去した後に前記のようにして同定される。いうまでもなく、これらの非無菌的部位での細菌感染の診断のためには、細菌の普遍的検出法は有用ではないであろう。他方、これらの検体からの、種又は属の検出及び同定のため、並びに抗生物質耐性遺伝子の検出のためのDNA に基く測定は古典的同定及び感受性試験法に比べて非常に有用であり、そして幾つかの利点を提供するであろう。
【００１４】
臨床検体のDNA に基く測定
臨床検体から直接に細菌を検出しそして同定するための迅速かつ正確な診断試験法の明瞭な必要性が存在する。DNA に基く技法は迅速であり且つ正確であり、そして感染性疾患の診断を改善する大きな可能性を提供する（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Societyfor Microbiology, Washington, D.C.) 。本発明の対象であるDNAプローブ及び増幅プライマーは、任意の臨床検体、例えば血液培養物、血液、尿、唾液、脳脊椎液、膿及び他のタイプの検体からの直接的な細菌又は真菌検出及び同定のために適当である（表３）。
【００１５】
本発明において提案されるDNA に基く試験法は、微生物研究室において任意の臨床検体からの日常的診断のために今日使用されている標準的生化学的方法に比べて迅速さ及び正確さの両方の点で優ている。これらの試験におよそわずか１時間で行われるので、これらは臨床医に、抗微生物剤を用いる療法の効率を向上させるのに寄与する新規な診断手段を提供する。これらの測定法により、ヒト以外の生物体（例えば、他の霊長類、トリ、植物、哺乳類、農業動物、家畜 及びその他の生物）からの臨床検体も試験することができる。
【００１６】
培養陰性検体の高いパーセンテージ
日常的診断のために受理されるすべての臨床検体の内、尿検体のおよそ80％及び他のタイプの臨床検体のそれより多く（およそ95％）は細菌病原体の存在について陰性である（表３）。所与の検体における種又は属レベルで細菌を同定するのに加えて、あらゆる細菌の存在を検出する試験（すなわち、普遍的細菌検出）により陰性の高い比率の臨床検出をスクリーニングすることが望ましいであろう。このようなスクリーニング試験は、すべての細菌において見出される高度に保存されている遺伝子標的のPCR によるDNA 増幅に基くであろう。細菌について陰性である抗体はこの測定法において増幅されないであろう。他方、細菌について陽性である検体はこの測定法において陽性の増幅シグナルを提供するであろう。
【００１７】
DNA に基く迅速臨床試験法に向けて
迅速臨床試験法は感染の管理にかなりのインパクトを与えるであろう。DNA プローブ及びDNA 増幅技術は、臨床サンプルからの病原体及び抗生物質耐性遺伝子の同定のための従来の方法を越える幾つかの利点を提供するであろう（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, AmericanSociety for Microbiology, Washington, D.C. ; Ehrich and Greenbery, 1994, PCR-based Diognostics in Infections Disense, Blackwell Scientific Publications, Baston, MA)。臨床サンプルから生物体を直接に検体することができるので細菌病原体の培養の必要がなく、これにより病原体の単離及び同定に関連する時間が短縮される。
【００１８】
さらに、生化学的試験に基く今日用いられている表現型同定系に比べて、DNA に基く測定は細菌同定について正確である。商業的に利用可能なDNA に基く技法は今日臨床微生物研究室において、主として扱いにくい細菌性病原体、例えばミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis) 、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis)、ナイセリア・ゴノルホエア（Neisseria gonnrrhoeae)の検出及び同定のため、並びに種々のウイルスの検出のために使用される（Podzorski and Persing, Molecular detection and idetification of microorganisms ; In : P. Murray ら、1995, Manual of Clinical Microbiology, ASM press, Washington D.C.)。培養確認測定のために使用される他の商業的に入手可能なDNA に基く測定法も存在する。
【００１９】
他の者は、本発明の対象である細菌性病原体、例えばスタフィロコッカス spp. (Staphylococcus spp.) （米国特許出願 No. 5,437,978) 、ナイセリア spp. (Neisseria spp.)（米国特許出願 No. 5162199及びヨーロッパ特許出願 No. EPO 337,896,131) 及びリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogeres) （米国特許出願 No. 5,389,513及び No. 5,087,386) の検出及び同定のためのDNA に基く試験法を開発している。しかしながら、これらの特許に記載されている診断試験法は、本発明に記載されるものとは異るrRNA遺伝子又は遺伝標的のいずれかに基いている。
【００２０】
臨床微生物研究室においてすでに使用されている診断キット又は方法が存在するが、一般に遭遇される細菌感染の診断の正確さ及びスピードを改善するために従来の培養同定法に代る有利な方法の必要性がなお存在する。DNA に基く診断試験は、一層迅速であることに加えて、診断のために現在使用されている標準的生化学的試験に比べて一層正確である。なぜなら、細菌遺伝子型（例えばDNA レベル）は細菌の表現型（例えば、代謝レベル）に比べて安定だからである。
【００２１】
データーベースから入手可能な配列の数から証明される通り、細菌及び真菌種の遺伝子配列の知識は増加し続けている。データーベースから容易に入手できる配列から、診断目的のためのそれらの可能性についての指示は存在しない。診断目的のための良好な候補を決定するために、（ｉ）通常遭遇される細菌又は真菌病原体の種特異的検出及び同定、（ii）通常遭遇される細菌又は真菌病原体の属特異的検出及び同定、（iii ）細菌又は真空病原体の普遍的検出、及び／又は（iv）抗生物質耐性遺伝子の特異的検出及び同定、のためのDNA に基く測定のために配列を選択することができよう。上記のすべてのタイプのDNA に基く測定はあらゆるタイプの臨床検体又は微生物培養物から直接に行うことができる。
【００２２】
本発明者らの係属中の米国（N.S 08/526,840) 及びPCT (PCT/CA/95/00528) 特許出願において、本発明者らは、（ｉ）12の臨床的に重要な細菌性病原体の種特異的検出及び同定、（ii）細菌の普遍的検出、並びに（ii）17の抗生物質耐性遺伝子のために適するDNA 配列を記載している。この係属中の出願は独占的DNA 配列及びデーターベースから選択されたDNA 配列（このいずれの場合にも、少なくとも 100塩基対の断片）並びにこれらの配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブ及び増幅プライマーを記載している。この特許出願に記載されているすべての核酸配列は、ａ）細菌の存在の検出、ｂ）12の細菌種及び17の抗生物質耐性遺伝子の存在の特異的検出、を可能にする診断キット及び方法の組合せを含む。
【００２３】
しかしながら、これらの方法及びキットは改良される必要がある。なぜなら、理想的なキット及び方法は微生物病原体及び抗生物質耐性遺伝子の 100％近くを診断することが可能であるべきだからである。例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus fuecicum)により惹起される感染は、多くの抗生物質に対するそれらの耐性のために臨床的問題となっている。これらの細菌の検出及びそれらの耐性プロフィールの評価のいずれも望ましい。これに加えて、さらなる標的遺伝子の検出を目的として、及び本発明者らの先の特許出願を補促するため、同一の又は他の微生物病原体及び同一の又は追加の抗生物質耐性遺伝子認識することができる新規なDNA 配列（プローブ及びプライマー）も望ましい。
【発明の概要】
【００２４】
本発明の記載
本発明の目的の１つは、
◎ ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)、ストレプトコッカス・アガラクティー（Streptococcus agalactiae) 、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、スタフィロコッカス・サプロフィディカス（Staphylococcus saprophyficus) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、ナイセリア・メニンギティデス（Neisseria meningitidis) 、リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes) 、キャンディダ・スペーシス（Candida species)及びキャンディダ・アルビカンス（Candidaalbicans) から成る群から選択された特定の微生物種又は属；
【００２５】
◎ blatem， blarob， blashv， blaoxa，blaZ，andB，aaC1，aacC2 ，aacC3 ，aacA4 ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，mecA，vanA, vanB, vanC, satA, aac(6')-aph(2'')，aad(6') ，vat, vga, msrA, sul 及びint から成る群から選択された抗生物質耐性遺伝子；並びに場合によっては、
◎ 任意の細菌種；
からの核酸であって、該核酸を含有していると疑われる任意のサンプル中にあるものの存在及び／又は量を決定するための、プローブ及び／又は増幅プライマーを使用する特異的で、偏在する、鋭敏な方法を提供することであり、この方法においては、前記核酸又はその変異体もしくは部分のそれぞれが前記プローブ又はプライマーとハイブリダイズすることができる選択された標的領域を含んで成り、この方法は、前記サンプルを前記プローブ又はプライマーと接触せしめ、そして前記いずれかの細菌種、特定の微生物種又は属、及び抗生物質耐性遺伝子の存在及び／又は量を検出する段階を含んで成る。
【００２６】
具体的な態様において、各特定の微生物種又は属の検出及び同定、抗生物質耐性遺伝子の検出、及び普遍的細菌検出に別々に向けられた類似の方法が提供される。
さらなる具体的な態様において、この方法は、標的とされる細菌又は真菌核酸を鋭敏に、特異的に且つ偏在的に検出するそれらの能力について選択されたDNA 断片（独占的断片及びデーターベースから得られる断片）を使用する。
【００２７】
特に好ましい態様においては、12ヌクレオチド長以上のオリゴヌクレオチドがより長いDNA 断片から誘導され、そして本発明においてプローブ又は増幅プライマーとして使用される。
独占的オリゴヌクレオチド（プローブ及びプライマー）もまた本発明の対象である。
【００２８】
ストレプトコッカス・スペーシス、ストレプトコッカス・アグラクティア、スタフィロコッカス・スペーシス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、エンテロコッカス・スペーシス、エンテロコッカス・フェシウム、ナイセリア・スペーシス、ナイセリア・メニンギティディス、リステリア・モノサイトゲネス、キャンディダ・スペーシス及びキャンディダ・アルビカンスから成る群から選択された微生物種又は属の検出のためのプローブ又は増幅プライマーを含んで成る診断キットも本発明の対象である。
【００２９】
さらに、 blatem， blarob， blashv， blaoxa，blaZ，andB，aaC1，aacC2 ，aacC3 ，aacA4 ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，mecA，vanA, vanB, vanC, satA, aac(6')-aph(2'')，aad(6'')，vat, vga, msrA, sul 及びint から成る群から選択された抗生物質耐性遺伝子の検出のためのプローブ又は増幅プライマーをさらに含んで成る診断キットも本発明の対象である。
【００３０】
さらに、任意の細菌又は真菌種の検出のためのプローブ又は増幅プライマーを含んで成り、上記の特定の微生物種又は属の検出のためのそれらを含むか又は含まず、そしてさらに上記の抗生物質耐性遺伝子のためのプローブ及びプライマーを含むか又は含まない診断キットも本発明の対象である。
好ましい態様において、このようなキットは、上記の微生物種又は属、抗生物質耐性遺伝子及び任意の細菌の別々の又は同時の検出及び同定を可能にする。
【００３１】
上記の方法及びキットにおいて、増幅反応はａ）ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 、ｂ）リアーゼ連鎖反応、ｃ）核酸配列に基く増幅、ｄ）自己−支持配列複製（selfsustaired sequence replicntion)、ｅ）鎖置換増幅（Strand displucement anplification)、ｆ）分岐DNA シグナル増幅（branched DNA signal amplification)、ｇ）転写介在増幅（transcription-mediatel amplification) 、ｈ）サイクリングプローブ法(CPT) 、ｉ）入れ子 PCR (mested PCR) 、又はｊ）マルチプレックス（multiplex) PCRが含まれる。
好ましい態様において、PCR プロトコールが増幅反応として使用される。
【００３２】
特に好ましい態様において、各増幅サイクルのために、45〜50℃にて30秒間のアニーリング段階、及び95℃にてわずか１秒間の変性段階を含んで成り、延長段階のためだけの時間を許容しないPCR プロトコールが提供される。このPCR プロトコールは、すべての選択されたプライマー対を用いるPCR 反応にとって適当であるように標準化されており、このことは試験を大いに促進する。なぜなら、各臨床サンプルは均一なサイクリング条件下で普遍的、種特異的、属特異的及び抗生物質耐性遺伝子PCR プライマーを用いて試験され得るからである。
【００３３】
細菌細胞について陰性であるすべてのサンプルをすぐに廃棄し、そして次に上記の細菌及び／又は真菌種及び属を検出及び同定し、そして抗生物質に対する細菌の耐性を迅速に決定するための迅速試験法及びキットを開発することを本発明者らはめざしている。選択された抗生物質耐性遺伝子からの配列はデーターベースから入手可能であり、そしてそれらの検出のためにDNA に基く試験を開発するために用いられているが、本発明者らのアプローチは、細菌培養に基く現在の重要な標準的（gold standand)診断法を越える大きな改良を示すので、ユニークである。
【００３４】
同時的細菌検出及び同定並びに抗生物質耐性遺伝子検出のための増幅法を用いる場合、試験に先立って臨床サンプルを培養する必要がない。均一な増幅条件下でおよそ１時間ですべての標的DNA 配列を検出するために改変PCR プロトコールが開発されている。この方法は、処理を最適化することにより時間を節約し、少い抗生物質が処方されるので抗生物質耐性が少なくし、高価な広範囲の種類の抗生物質の使用が少なくし、そして臨床研究室試験に関連する時間とコストを下げるであろう。
【００３５】
以下に記載する方法及びキットにおいては、オリゴヌクレオチドプローブ及び増幅プライマーはより長い配列（例えば、100 塩基対以上のDNA 断片）に由来する。すべてのDNA 断片は、本発明の断片又はデーターベースから得られた。データーベースから選択されたDNA 断片は、それらの診断的可能性のために選択されているので、本発明の検出方法においてあらたに使用される。
【００３６】
（ｉ）普遍的細菌検出、（ii）前記の微生物種及び属の検出及び同定、並びに（iii ）アネックスIII に挙げるもの以外の抗生物質耐性遺伝子の検出のために適当な他のオリゴヌクレオチド配列が本発明の配列又は選択されたデーターベース配列から誘導され得ることは当業者にとって明らかであろう。例えば、オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、本発明者らが選択したそれよりも短かくしても又は長くしてもよく、それらは、また、本発明の他のDNA 断片又はデーターベースから選択された配列中から選択され得；それらはまた同じオリゴヌクレオチドの変形体(variant) であってもよい。
【００３７】
標的DNA 又はその変形体が所与のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすれば、又は標的DNA 又はその変形体が所与のオリゴヌクレオチドPCR プライマー対により増幅され得るならば、その逆も真であり；所与の標的DNA は変形体オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることができ、又は変形体オリゴヌクレオチドPCR プライマーにより増幅され得るであろう。あるいは、オリゴヌクレオチドは、PCR 以外の増幅方法において使用するために任意のDNA 断片配列から設計することができる。
【００３８】
従って、本発明の中心は、特異的又は普遍的オリゴヌクレオチドプローブ及び／又は増幅プライマーの源として使用される、普遍的、種特異的、属特異的及び耐性遺伝子特異的ゲノム性又は非ゲノム性DNA 断片を同定することである。診断目的のために適当なオリゴヌクレオチドの選択及び評価は多くの努力を必要とするが、当業者が、選択されたDNA 断片から、診断目的のために適当なアネックスVIに挙げられたもの以外のオリゴヌクレオチドを誘導することは大いに可能である。本発明の断片又はデーターベース配列がその特異性及び普遍性のために選択される場合、そのサブセット（subset) も特異的及び普遍的である可能性が増大する。
【００３９】
高い比率の臨床検体が細菌について陰性である（表３）ので、普遍的オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの選択の高い可能性を有するDNA 断片が本発明の配列及びデーターベース配列から選択された。増幅プライマーは細菌及び真菌に高度に保存された遺伝子から選択され、そして、臨床検体が細菌について陽性であるか陰性であるかを迅速に（およそ１時間で）決定するために臨床検体中の細菌病原体の存在を検出するために使用される。tuf と称される選択された遺伝子は、蛋白質合成の間の翻訳過程に関与する蛋白質（EF−Ta) をコードする。
【００４０】
普遍（ユニバーサル）プライマーを導くために使用されるtuf 遺伝子配列の整列（aligment) は本発明の配列及びデーターベースの配列を含む（実施例１及びアネックスＩ）。この方策は、細菌学的試験のために提供された多くの陰性臨床検体（受理された検体の約80％、表３を参照のこと）の迅速スクリーニングを可能にする。表４，５及び６は、PCR プライマー及びDNAプローブの特異性を試験するために細菌及び真菌種のリストを提供する。表７は、本発明の対象である種特異的、属特異的及び普遍的増幅測定の短い説明を提供する。表８，９及び10は、診断目的のために選択された本発明の配列及びデーターベース配列についての幾らかの有意義な情報を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の詳細な説明
微生物についての、種特異的、属特異的、普遍的及び抗生物質耐性遺伝子特異的プローブ及び増幅プライマーの開発診断目的のために適切な配列のデーターベースからの選択
細菌又は真菌の種特異的又は属特異的検出及び同定のため、あるいは細菌の普遍的検出のために適当な配列を選択するために、データーベース配列（Gen Bank, EMBL、及びSwiss-Prot) を、それらの配列について行われた配列情報及びコンピューター分析に従って、診断目的のためのそれらの可能性に基いて選択した。配列情報に基いて、及びGenetics Computer Group (GCG、ワシントン）プログラムを用いて行われた他の微生物種又は属における対応する遺伝子との比較に基いて、診断目的のために最も有望であると思われる遺伝子配列を、PCR による試験のために選択した。
【００４２】
OligoＴＭ 4.0プライマー分析ソフトウェアー（National Biosciences Inc. Plymoth, Minn.) の助けにより、選択されたデーターベース配列より最適なPCR 増幅プライマーを選択した。選択されたプライマーを、標的微生物種又は属についての特異性及び普遍性についてPCR 測定において試験した。一般に、種特異的又は属特異的検出及び同定のために適当な増幅プライマーをそこから選択するためのデーターベース配列の同定は、標的微生物種又は属について特異的及び普遍的であるプライマーの対を得るのに先立って、幾つかの候補遺伝子配列のコンピューター解析及びPCR 試験を含む。アネックスVIは、選択された特異的及び普遍的PCR プライマーのリストを提供する。アネックスＩ〜Ｖ及び実施例１〜４は、tuf 配列から又はrecA遺伝子から属特異的、種特異的及び普遍的PCR プライマーを選択するために用いたストラテジーを例示する。
【００４３】
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの設計及び合成
本発明者らにより配列決定されたDNA 断片及びデーターベース（Gen Bank及びEMBL）から選択されたDNA 断片を、診断目的のためのオリゴヌクレオチド源として用いた。このストラテジーのため、データーベースから選択された種々のゲノムDNA 断片（100bp より大きなサイズの）に由来する適当な一連のプライマー又はプローブを、それらの特異性及び普遍性について、PCR 及びハイブリダイゼーション測定において、後記のようにして試験した。データーベース配列は、入手可能な配列情報及び広範な解析に従って細菌又は真菌の検出についての種特異的、属特異的又は普遍的であるそれらの可能性に基いて選択されたこと、並びに一般に、望ましい特異性、普遍性及び感受性を得るために幾つかの候補データーベース配列が試験されたこと、に注目することが重要である。
【００４４】
データーベース配列から選択された種特異的断片に由来するオリゴヌクレオチドプローブ及び増幅プライマーは、自動化されたDNA合成機（Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Division)を用いて合成された。合成に先立って、すべてのオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションのためのプローブ、及びDNA 増幅のためのプライマー）は、ハイブリダイゼーション又はDNA 増幅のためのそれらの適切さについて、標準的プログラム（すなわち、Genetics Computer Group (GCG) プログラム及びプライマー解析ソフトウェアー(OligoＴＭ 4.0) を用いるコンピューター解析により評価された。PCR プライマー対の潜在的な適切さはまた、その合成に先立って、不所望の性質、例えば１ヌクレオチドの長いストレッチ及び３’−末端におけるＧ又はＣ残基の高い比率、の不存在を確認することにより評価された（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Society forMicrobiology, Washington, D.C.) 。
【００４５】
オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは２本鎖DNA のいずれの鎖に由来してもよい。プライマー又はプローブに塩基Ａ．Ｇ．ＣもしくはＴ、又はその類似体から成り、そしてそれらは１又は複数の選択されたヌクレオチド位置において縮重（degere rate)していてもよい。プライマー又はプローブは任意の適当な長さを有し、そして、（ｉ）細菌の普遍的検出、（ii）エンテロコッカス・フェシウム、リステリア・モノサイトゲネス、ナイセリア・メニンギティディス、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・アゲラクチア及びキャンディダ・アルビカンスの種特異的検出及び同定、（iii ）ストレプトコッカス・スペーシス、エンテロコッカス・スペーシス、スタフィロコッカス・スペーシス及びナイセリア・スペーシスの属特異的検出、又は（iv）前記26の臨床的に重要な抗生物質耐性遺伝子の検出、のために適当な本発明の断片から又は選択されたデーターベース配列からのDNA 配列中のいずれかの場所から選択され得る。
【００４６】
所与の標的細菌遺伝子の変形体は天然に生じ、そして進化の過程でのその遺伝子内の配列の変化によるものである（Watsonら、1987, Molecular Biology of the Gene ４編、The Benjamin／Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA ; Lewin, 1989, Genes IV, John Wiley & Sons, New York, NY) 。例えば、同じ細菌種の異る株はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション部位に１又は複数のヌクレオチド変化を有するであろう。当業者は、特異の遺伝子について変形体の細菌又は真菌DNA 配列が存在すること、及び配列変化の頻度は所与の遺伝子産物に対する進化の過程での選択圧に依存することを知っているであろう。
【００４７】
２個のPCR プライマー間の領域中の変形体配列の検出は、増幅生成物の配列決定により示すことができる。プライマーハイブリダイゼーション部位における配列変形体の存在を示すためには、ハイブリダイゼーション部位の外側のPCRプライマーを用いてより大きなDNA 標的を増幅しなければならない。このより大きな断片の配列決定が、その部位における配列変化の検出を可能にするであろう。同様のストラテジーが、プローブのハイブリダイゼーション部位における変形を示すために適用され得る。標的配列又はその部分の多様性が増幅プライマー又はプローブの特異性及び普遍性に影響を与えない限り、変形体細菌DNA は本発明の範囲内にある。選択されたプライマー又はプローブの変形体はまた、変形体DNA の増幅又はそれへのハイブリダイゼーションのために使用することができる。
【００４８】
種々の細菌及び真菌種からのtuf 配列の配列決定
種々の細菌及び真菌種について、tuf 遺伝子の一部分のヌクレオチド配列を決定した。細菌tuf 配列の決定のため、約 880bpのtuf遺伝子の部分を増幅する配列番号：107 及び108 の増幅プライマーを用いた。真菌tuf 配列の決定のため、約 830bpのtuf 遺伝子の部分を増幅する配列番号：109 及び172 の増幅プライマーを用いた。両プライマー対はtufA及びtufB遺伝子を増幅することができる。これらの遺伝子はほとんど同じであるから、上記のことは驚くべきことではない。例えば、大腸菌からの完全なtufA遺伝子及びtufB遺伝子はわずか13のヌクレオチド位置において異るのみである（Neidhardt ら、1996, Escherichia coli and Salmonella : Cellular and Molecular Biology, 2nd ed., American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)。
【００４９】
これらの増幅プライマーは、広範囲のtuf 配列の増幅を許容するため、幾つかのヌクレオチド位置で縮重（degenerate) しておりそしてイノシンを含有する。これらの増幅プライマーを選択するために使用されるストラテジーは、普遍（ユニバーサル）プライマーの選択についてアネックスＩに示したものと類似している。配列番号：107 及び108 の増幅プライマーは、任意の細菌種からのtuf 遺伝子を増幅するために使用することができる。配列番号：109 及び172 の増幅プライマーは、任意の真菌種のtug 遺伝子を増幅するために使用することができる。
【００５０】
tug 遺伝子は、次の増幅プロトコールを用いて細菌又は酵母培養物から直接増幅された。１μＬの細胞懸濁液を直接に、50mM KCl,10mM Tris-HCl (pH9.0), 0.1％ Triton X-100, 2.5mM MgCl2, １μMづつの２プライマー、 200μMづつの４種数の dNTP, 0.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ（Promega Corp. Madison, WI)を含有するPCT 反応混合物19μＬに加えた。PCR 反応は、96℃にて３分間、それに続き、変性段階のための72℃にて１分間、アニーリング段階のための30〜50℃にて１分間及び延長段階のための72℃にて１分間の30〜35サイクルを用いて、MJ Research PTC-200 themal cycler(MJ Research Inc. Wartertown Mass.) を用いるサイクリングにかけた。
【００５１】
次に、20マイクロリッターのPCR 増幅混合物を 1.5％アガロースゲル中での電気泳動により分離した。次に、ゲルをメチレンブルーによる染色により可視化した（Floresら、1992, Biotechniques, 13 : 203-205)。増幅生成物のサイズを、100-bp分子量ラダーとの比較により推定した。特定の増幅生成物（すなわち、細菌又は真菌tuf 配列についてそれぞれ890 又は830bp)に対応するバンドをアガロースゲルから切り出し、そしてQIAquickTMゲル抽出キット（QIAGEN Inc. Chntsworth, CA) を用いて精製した。tuf 遺伝子増幅生成物の両方の鎖を、Applied Biosystemsの自動化されたDNA 配列決定機（モデル373A）及びその PRISMTM Sequence（Ｒ） Terminator Double-stranded DNA Sequencing Kit (Perkin-Elmer Corp. Applied Biosystems Division, Forter City, CA) を用いて、ジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法により配列決定した。
【００５２】
配列決定反応はすべて、増幅プライマー（配列番号： 107〜109及び172)及び反応当り 100ngのゲル精製された増幅物（アンプリコン）を用いて行った。決定された配列がPCR 人工物（artifact) の配列決定による誤りを含まないことを保証するため、本発明者らは、２つの独立したPCR 増幅から生じたゲル精製されたtuf 増幅生成物の２個の調製物を配列決定した。すべての標的微生物種について、両増幅調製物から決定された配列は同一であった。さらに、両鎖の配列は 100％相補的であり、これにより決定された配列の高い正確さが確認された。上記のストラテジーにより決定されたtuf 配列はすべて配列表（すなわち、配列番号： 118〜146)に記載されている。表13は、配列表中の各tuf 配列のものと微生物種及び由来を示す。
【００５３】
本発明者らにより決定された、又はデーターベースから選択されたtuf 配列の整列は、tuf 遺伝子の配列決定された部分の長さが多様であることを明瞭に示す。幾つかのアミノ酸の挿入又は欠失が存在するであろう。これは、配列決定されたtuf 増幅生成物のサイズが、細菌種及び真菌種の両方について多様である理由を説明するものである。本発明者らのグループにより決定されたtuf 配列間で、５アミノ酸まで、又は15ヌクレオチドまでの挿入及び欠失を本発明者らは見出した。従って、アネックスＩ〜Ｖのそれぞれの上部に示されるヌクレオチド位置は、挿入又は欠失を有するtuf 配列については対応しない。
【００５４】
本発明者らにより決定された種々のtuf 配列は、時々、縮重（degenerescence) を含むことに注目する必要がある。これらの縮重された(degererated) ヌクレオチド配列はtufA遺伝子tufB遺伝子間の配列変形に相当する。なぜなら、増幅プライマーは両tuf 遺伝子を増幅するからである。これらのヌクレオチド変化はtaq DNA ポリメラーゼによるヌクレオチドの誤った取り込みによるものではない。なぜなら、両鎖は同じであり、そしてゲル精製されたtuf 配列の両調製物について決定された配列は同一であったからである。
【００５５】
tuf 配列からの増幅プライマーの選択
ストレプトコッカスの５種を含む種々の細菌種からのrecA遺伝子のヌクレオチド配列の比較がスタフィロコッカス−特異的PCR プライマーの選択を可能にした。recAからのPCR プライマーの選択についての更なる詳細は実施例４及びアネックスＶを参照のこと。
【００５６】
任意にプライムされるPCR によるスタフィロコッカス・サプロフィテクスからのDNA 断片の単離
スタフィロコッカス・サプロフィティカスの種特異的検出及び同定のための可能性ある未知のDNA コート配列を、任意プライムド PCR (AP−PCR)法により得た。
【００５７】
AP−PCR は、微生物のための特異的DNA プローブを生成させるために使用することができる方法である（Faniら、1993, Mol. Ecol. 2 : 243-250) 。スタフィロコッカス・サプロフィチカスからの種特異的ゲノムDNA 断片を単離するために使用されたAP−PCR の記載は次の通りである。10ヌクレオチド長の20個の異るオリゴヌクレオチドプライマー（すべて、AP−PCR キットOPAD (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) に含まれる）を、スタフィロコッカス・サプロフィティカスの３細菌種（すべてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ATCC）：No. 15305, 35552及び43867 から得られる）からのDNA 、及びスタフィロコッカスの他の４種（スタフィロコッカス・アウレウムATCC 25923、スタフィロコッカス・エピデルミディスATCC 14990、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Staphylococcus haemelyticus) ATCC 29970 及びスタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis) ATCC 35982) からのDNA を用いて組織的に試験した。
【００５８】
すべての細菌種について、約 1.5×108 細菌／mLに相当する標準0.5 McF arlandに調整した細菌懸濁液から増幅を行った。１μLの標準化された細菌懸濁液を直接に、50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH9.0), 0.1％ Triton X-100, 2.5mM MgCl2, 1.1μMの20の異るAP−PCR プライマーOPADの内の１つ、 200μMづつの４種類のdNTP及び 0.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ（Promega Corp, Madison, WI)を含有するPCR 反応混合物19μＬに加えた。PCR 反応は、MJ Reseanch PCR-200 サーマルサイクラー（MJ Reseanch Inc.) を用いるサイクリングに従って次のようにして行った：96℃にて３分間、これに続き、変性段階のための95℃にて１分間、アニーリング段階のための32℃にて１分間、及び延長段階のための72℃にて１分間から成る35サイクル。次に、20マイクロリッターのPCR 増幅混合物を、0.25μｇ／mLの臭化エチジウムを含有する２％アガロースでの電気泳動により分離した。増幅生成物のサイズを、50-bp 分子量ラダーとの比較により推定した。
【００５９】
スタフィロコッカス・サプロフィティカスについて特異的な増幅パターンがAP−PCR プライマーOPAD-9（配列番号：25）により観察された。このプライマーによる増幅は一貫して、試験されたすべてのスタフィロコッカス・サプロフィティカスについての約 450bpのDNA 断片に相当するが、試験された他のスタフィロコッカス種のいずれにも相当しないバンドを示した。この種特異的パターンは、CHULの微生物研究室の培養集収物から選択されたら、サプロフィティカスのさらなる10個の臨床単離体及び表５に示すグラム陽性細菌種から選択された株を試験することにより確認された。
【００６０】
AP−PCR に基いてＳ．サプロフィティカスについて特異的であり且つ普遍的である約 450bpのアンプリコンに相当するバンドをアガロースゲルから切り出し、そしてQIAquickTMゲル抽出キット（QIAGEN Inc.)を用いて精製した。このゲル精製されたDNA 断片を、T4 DNAリガーゼ（Neu England BioLabs)を用いて、pCR 2.1TMプラスミドベクター（Invitron Inc.)のT/Aクローニング部位にクローニングした。組換えプラスミドを、標準的手順により、大腸菌DH5αコンピテント細胞に形質転換した。小規模調製物のためのBirnboin及びDolyの方法（Nucleic Acids Res. 7 : 1513-1523) によりプラスミドDNA の単離を行った。組換えプラスミドへの約 450bp AP−PCR 挿入の存在を確認するため、すべてのプラスミドDNA 調製物をEcoRＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化した。次に、AP−PCR挿入部を把持することが示された２個の選択されたクローンから、QIAGENプラスミド精製キットを用いて、大規模な高度に精製されたプラスミドDNA の調製を行った。
【００６１】
２個の選択されたクローンからのAP−PCR 挿入体の両鎖を、SP6及びT7配列決定プライマーにより、前記のApplied Biosystemsの自動化されたDNA 配列決定機を用いて、ジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法により配列決定した。得られた配列の解析により、各クローンからの両鎖のDNA 配列が 100％相補的であることが示された。さらに、各クローンについて決定された全配列が同一であることが示された。これらの配列決定データーは、決定された 438bpの配列（配列番号：29）の 100％の正確さを確認するものである。
【００６２】
プライマー解析ソフトウェアー OligoTM 4.0の助けにより、配列決定されたAP−PCR スタフィロコッカス・サプロフィティカスDNA断片から、任意的増幅プライマーを選択した。選択されたプライマー配列を、それらの特異性及び普遍性を確認するために、PCR 測定により試験した（表７）。表４及び表５から選択されたＳ．サプロフィティカス以外の細菌種からのDNA を用いて増幅が生じなかったので、前記のPCR プライマーは特異的であった。さらに、Ｓ．サプロフィティカスの 260種中 245種がこのPCR 測定により効果的に増幅されたので、この測定は普遍的であつた。本発明者らの係属中の米国特許出願（N.S. 08/526,840)及びPCT 出願（PCT/CA/95/00528)の対象である他のＳ．サプロフィティカス特異的PCR 測定と組合せた場合、普遍性は 260株につき 100％に達する。
DNA 増幅
広く使用されているPCR(ポリメラーゼ連鎖反応）によるDNA の増幅のため、本発明のDNA 断片又はデーターベース配列からプライマー対を導いた。合成に先立って、それらがPCR 増幅のための良好な候補であることを確認するため、 OligoTM 4.0ソフトウェアーを用いて、可能性あるプライマー対を解析した。
【００６３】
PCR によるDNA の増幅の間、細菌ゲノムからの熱変性された標的DNA の各鎖に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標的DNA を各サイクルにおけるインビトロで指数的に、DNA の変性、プライマーのアニーリング及び新たな標的配列の合成を可能にする逐次熱サイクルにより増幅する（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.) 。
【００６４】
要約すれば、PCR プロトコールは次の通りであった。処理された臨床検体又は標準化された細菌又は真菌懸濁液（下記参照）を、50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH9.0), 2.5mM MgCl2, 0.4μＭづつの各プライマー、 200μMづつの４種類の各dNTP及び 0.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ(Promega) を含む20μＬのPCR 反応混合物(Taq StartＴＭ抗体（Clontech Laboratories Inc. Palo Alto, CA) と組合わせて）中で増幅させた。増幅の特異性及び感受性を増強するため、すべてのPCR 反応に、Taq DNA ポリメラーゼに対する中和モノクローナル抗体である Taq StartTM抗体を加えた。組成及び要求される感度レベルが各検体タイプにより異るため、臨床検体の処理は試験される検体のタイプにより異る。
【００６５】
この処理は、迅速プロトコールにおいて、細菌細胞を溶解し、そしてPCR 阻害効果を除去することから成る（尿検体の調製について実施例11を参照のこと）。細菌又は真菌培養物からの増幅のためには、なんらの前処理を行うことなく、サンプルを直接PCR 増幅混合物に加える（実施例10を参照のこと）。すべてのPCR 反応について内部対照を提供するために細菌リボソーム16Ｓ RNA遺伝子の高度に保存された領域に由来するプライマー配列を用いた。あるいは、内部標準に微生物又はヒトゲノム中には見出されない配列から導いた。内部対照は、PCR 測定の効率を確認するため、及び有意なPCR 阻害が存在しないことを確認するため、すべてのPCR 反応に導入した。rRHNに由来する内部対象は、細菌溶解プロトコールの効率をモニターするためにも有用であった。
【００６６】
次に、PCR 反応物を、PTC-200 thermal cycler (MJ Reseanch Inc.）を用いて熱サイクリング（95℃にて３分間、及びそれに続く、変性段階のための95℃にて１分間、及びアニーリング−延長段階のための55℃にて30秒間の30サイクル）にかけ、そして次に標準的臭化エチレン染色アガロースゲル電気泳動により分析した。PCR 測定のために行われるサイクル数は要求される感度レベルにより異る。例えば、臨床検体からの直接の微生物検出のために要求される感度レベルは、血液検体のためには尿検体よりも高い。なぜなら、敗血症に関連する微生物の濃度は尿管感染に関連するそれよりもはるかに低いからである。従って、血液検体からの直接検出のためには、より多数の熱サイクルを用いるより感度の高いPCR 測定が必要である。同様に、細菌又は真菌培養物から直接行われるPCR 測定は臨床検体から直接行われるPCR 測定される低感度でよい。なぜなら、標的生物の数は、微生物培養物中よりも臨床検体中で非常に低いからである。
【００６７】
より迅速でありそして日常的診断のためにより実際的である特定の増幅生成物の検出のための他の方法が使用し得ることが明らかである。このような方法は、増幅後の蛍光検出に基ずくことができる（例えば、Perkin ElmerからのTaqManTM系、又はBiotronicsからの AmplisensorTM）。蛍光に基く方法は一般に、非常に迅速であり、定量的であり、そして自動化できるので、日常的診断において使用するのに特に有望である（実施例14）。
【００６８】
微生物病原体の検出及び同定は、増幅生成物にハイブリダイズする種特異的内部DNA プローブを用いて固体支持体上での又は液体中でのハイブリダイゼーションにより行うことができる。このようなプローブは、本発明の対象である任意の種特異的又は属特異的DNA増幅生成物から生じさせることができる。あるいは、種又は属の検出及び同定のための内部プローブは、ユニバーサル増幅測定により生成されたアンプリコンから導くことができる。オリゴヌクレオチドプローブはビオチンもしくはジゴキシゲニンにより、又は他のレポーター分子によりラベルすることができる。
【００６９】
PCR の効率を確実にするためグリセロール、ジメチルスルホキシド（DMSO) 又は他の関連溶剤を用いて、PCR の感度を増強し、そして高いGC含量を有し又は強い二次構造を形成する標的DNA の増幅に関連する問題を克服することができる（Dieffen bach and Dveksler, 1995, PCR Primer : A Laberatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plrinview, New York)。グリセロール及びDMSOの濃度範囲はそれぞれ１〜15％（ｖ／ｖ）及び３〜10％（v/v）である。
【００７０】
PCR 反応混合物のため、増幅プライマー及びMgCl2 の濃度はそれぞれ 0.1〜1.5 μＭ及び 1.5〜3.5mM である。外部プライマー及び入れ子プライマーを用いる（すなわち入れ子PCR)又は複数のプライマー対を用いる（すなわち、マルチプレックス（multiplex) PCR) 標準的PCR プロトコールの変法を用いることもできる（Persing ら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.) PCR プロトコール及びアンプリコン検出法のさらなる詳細は実施例９〜14を参照のこと。
【００７１】
DNA 増幅における当業者は他の迅速増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応(LCR) 、転写介在増幅(TMA) 、自己保持配列複製（３SR) 、核酸配列に基く増幅（NA SBA) 、鎖置換増幅(SDA) 、分岐DNA (bDNA)及びサイクリングプローブ法(CPT) (Leeら、1997, Nucleic Acit Amplification Technologies : Application to Disease Diugnosis, Eaton Pablishiay, Boston, MA ; Persingら、1993, Diognostic Molecular Microbiology ; Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.) の存在を知っている。
【００７２】
本発明の範囲は、PCR による増幅の使用に限定されず、むしろ試験の迅速性及び感度を向上させるために使用し得る任意の迅速核酸増幅法又は任意の他の方法の使用を含む。PCR 以外のアプローによる、及び種特異的、属特異的及び普遍的DNA 配列に由来する、並びに本明細書に含まれる選択された抗生物質耐性遺伝子配列からの、核酸の増幅のために適当な任意のオリゴヌクレオチド本発明の範囲内である。
【００７３】
オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション測定
ハイブリダイゼーション実験において、１本鎖オリゴヌクレオチド（100 ヌクレオチド未満のサイズの）は、細菌の検出のためのDNA 断片プローブと比べて幾つかの利点、例えば多量の合成の容易さ、バッチ間の結果の一貫性、及び化学的安定性を有する。要約すれば、ハイブリダイゼーションのためには、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Pharmacia) を用いて、放射性核種γ−３２Ｐ（dATP) により５’−末端においてラベルされた（Sambrookら、1987, MolecularCloning : A Laboratory Manual, 2ｎｄ ed., Cold Spring Harbor Labortory Press, Cold Spring Harbor, NY) 。
【００７４】
組込まれなかった放射性核種はラベルされたオリゴヌクレオチドを Sephadex Ｇ−50ＴＭカラムに通すことにより除去される。あるいは、オリゴヌクレオチドビオチンにより、3'−末端に化学的にラベルされ又は合成の間に5'−末端に直接組み込みにより、あるいはジゴキシンによりラベルされた。上記３種類のラベル以外の手段が用いられ得ることは当業者にとって明らかである。
【００７５】
次に、各オリゴヌクレオチドプローブは、表４，５及び６から選択された種々の細菌及び真菌種からのDNA へのハイブリダイゼーションによりその特異性について試験される。試験された細菌又は真菌種のすべてが、臨床検体から単離され得る可能性ある汚染又は一般的感染に関連する病原体のようであった。各標的DNA は細菌細胞から細胞を溶解するための標準的化学的処理を用いて放出された（Sambrookら、1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ｎｄ ed., Cold Spring Harbor Labortory Press, Cold Spring Harbor, NY) 。
【００７６】
次に、DNA を常法により変性し、そして次に固体支持体（例えば、ナイロン又はニトロセルロース膜）に非可逆的に固定し、あるいは溶液中に遊離状態にした。次に、固定された１本鎖標的DNA をオリゴヌクレオチドプローブ細胞とハイブリダイズさせた（Sambrookら、1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ｎｄ ed., Cold Spring Harbor Labortory Press, Cold Spring Harbor, NY) 。プレハイブリダイゼーション条件は１Ｍ NaCl ＋10％硫酸デキストラン＋１％ SDS＋100 μg/mLサケ精子DNA 中、65℃にて15分間であった。
【００７７】
ハイブリダイゼーションは、ラベルされたプローブを含有する新鮮なプレハイブリダイゼーション溶液中で65℃にて一夜行われた。ハイブリダイゼーション後洗浄条件は次の通りであった：１％ SDSを含有する３×SSC 中で２回、１％ SDSを含有する１×SSC 中で２回（これらの洗浄のすべては65℃にて15分間行われた）、及び１％ SDSを含有する 0.1×SSC の最終洗浄であった。洗浄されたフィルターのオートラジオグラフィーが、選択的にハイブリダイズしたプローブの検出を可能にした。特異的標的DNA へのハイブリダイゼーションが、洗浄の高ストリンジエンシーのためこれら２つのDNA 配列のヌクレオチド配列間での高い類似性を示した。
【００７８】
オリゴヌクレオチドは、それが単離された種又は属からのDNA にのみハイブリダイズする場合のみ、特異的であると考えられる。特異的であることが見出されたオリゴヌクレオチドプローブは、次に、ATCC株を含めて注目の種又は属の臨床単離株からの微生物DNA へのハイブリダイゼーションによりそれらの普遍性について試験された（すなわち、普遍的プローブは標的種又は属のほとんど又はすべての単離株を認識した）。標的種又は属の株からのDNA を変性せしめ、ナイロン膜上に固定し、そして上記のようにしてハイブリダイズさせた。プローブが標的種又は属の単離株の80％以上からのDNAと特異的にハイブリダイズする場合、それらのプローブは普遍的であると考えられる。
【００７９】
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの特異性及び普遍性試験
本発明者らにより配列決定されたDNA 断片又はデーターベースから選択されたDNA 断片のいずれかに由来するオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの特異性を、表４，５及び６に記載する種から選択された細菌又は真菌種のDNA の増幅により又はそれとのハイブリダイゼーションにより、前の２つの項に記載したようにして試験した。次に、特異的であることが見出されたオリゴヌクレオチドを、標的種又は属の単離株からの細菌DNA の増幅（プライマーについて）又はそれとのハイブリダイゼーション（プローブについて）により、それらの普遍性について試験した。オリゴヌクレオチドプライマーを用いての特異性試験及び普遍性試験の結果を表７に示す。選択された増幅でライマー対を用いてのPCR 測定の特異性及び普遍性を、細菌又は真菌種の培養物（実施例９及び10を参照のこと）から直接試験した。
【００８０】
本発明の対象である種々の種特異的及び属特異的PCR 測定はすべて特異的である。細菌種又は属に特異的なPCR 測定については、これは、標的種又は属からの種以外の、及び表４及び５から選択された種々の細菌株から単離されたDNA が増幅され得なかったことを意味する。キャンディダアルビカンスに特異的なPCR 測定については、それは、表６に記載の真菌種並びに表４及び５から選択された種々の細菌種からのゲノムDNA を用いて増幅が生じなかったことを意味する。
【００８１】
本発明の対象である種々の種特異的及び属特異的PCR 測定はすべて普遍的である（表７）。（ｉ）Ｅ．フェシウム、Ｌ．モノサイトゲネス、Ｓ．サプロフィティカス、Ｓ．アガラクチア及びＣ．アルビカンスについての種特異的PCR 測定は、種々の源から得られたそして各標的種内での多様性を代表する試験された標的種のすべて又はほとんどからのゲノムDNA を増幅した。これらの株のすべての種の同定は、臨床微生物研究室で日常的に使用される古典的生化学的方法に基いていた。（ii）エンテロコッカス spp. スタフィロコッカス spp. ストレプトコッカス pss. 及びナイセリア sppについての属特異的PCR 測定は、各標的属についてすべての臨床的に重要な細菌種を代表する、試験された標的属のすべての又はほとんどの株からのゲノムDNA を増幅した。
【００８２】
これらの株は種々の源から得られたものであり、そして各標的属内の多様性を代表するものである。やはり、これらの株のすべての種の同定は、臨床実験室において日常的に使用される古典的生化学的方法に基いた。さらに具体的には、４つの属特異的PCR 測定は次の種を増幅した：
【００８３】
（１）エンテロコッカス−特異的測定は、Ｅ．アビウム（E. avium) 、Ｅ．カッセリフラバス（E. casseliflavus) 、Ｅ．デイスパー（E. disper)、Ｅ．ドランス（E. durans)、Ｅ．フェカリス（E. faecalis)、Ｅ．フェシウム（E. faecium) 、Ｅ．フラベッセンス（E. flavescens)、Ｅ．ガリナルム（E. gallinarum)、Ｅ．ヒレア（E. hirae) 、Ｅ．ムンドチー（E. mundtii) 及びＥ．ラフィノサス（E. raffinosus)を含む試験したエンテロコッカスの11の種のすべてからのDNA を効果的に増幅した。
【００８４】
（２）ナイセリア−特異的測定は、Ｎ．カニス（N. canis) 、Ｎ．シネレア（N. cinerea) 、Ｎ．エロンガタ（N. elongata)、Ｎ．クラベッセンス（N. flavescens)、Ｎ．ゴノルホエア（N. gonorrhoeae) 、Ｎ．ラクタミカ（N. lactamica) 、Ｎ．メニンギチディス（N. meningitidis)、Ｎ．ムコサ（N. mucosa)、Ｎ．ポリサッカレア（N. polysaccharea) 、Ｎ．シッカ（N. sicca) 、Ｎ．スブフラバ（N. subflava)及びＮ．ワーベリ（N. weaveri) を含む試験したナイセリアの12種のすべてからのDNA を効率的に増幅した。
【００８５】
（３）スタフィロコッカス−特異的測定は、Ｓ．アウレウス（S. aureus)、Ｓ．アウリクラリス（S. auricularis) 、Ｓ．カピチス（S. capitis) 、Ｓ．コーニー（S. cohnii)、Ｓ．エピデルミディス（S. epidermidis) 、Ｓ．ヘモフィリス（S. haemolyticus)、Ｓ．ホミニス（S. hominis) 、Ｓ．ルグドゥネンシス（S. lugdunensis) 、Ｓ．サプロフィチカス（S. saprophyticus) 、Ｓ．シュライフェリ（S. schleiferi)、Ｓ．シムランス（S. simulans)、Ｓ．ワルネリ（S. warneri) 及びＳ．キシロサス（S. xylosus) を含むスタフィロコッカスの14種の内13種からのDNA を効率的に増幅した。
【００８６】
（４）最後に、スタフィロコッカス−特異的測定は、Ｓ．アガラクチア（S. agalactiae)、Ｓ．アンギノサス（S. anginosus) 、Ｓ．ボビス（S. bovis) 、Ｓ．コンステラツス（S. constellatus)、Ｓ．クリスタ（S. crista)、Ｓ．ディスガラクチア（S. dysgalactiae)、Ｓ．エクイ（S. equi)、Ｓ．ゴルドニ（S. gordonii)、Ｓ．インターメディウム（S. intermedius) 、Ｓ．ミチス（S. mitis) 、Ｓ．ムタンス（S. mutans)、Ｓ．オラリス（S. oralis)、Ｓ．パラサングイス（S. parasanguis) 、Ｓ．ニューモニア（S. pneumonia) 、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes)、Ｓ．サリバリウス（S. salivarium)、Ｓ．サングイス（S. sanguis) 、Ｓ．サブリヌス（S. sabrinus)、Ｓ．スイス（S. suis)、Ｓ．ウベリス（S. uberis)、Ｓ．ベスチブラリス（S. vestibularis)及びＳ．ビリダンス（S. viridans)を含む試験したストレプトコッカスの22種のすべてからのDNA を効果的に増幅した。
【００８７】
他方、スタフィロコッカス−特異的測定は、Ｓ．ムタンス（S. mutans)の９株の内３株及びＳ．サリバリウス（S. salivarius)の23株の内１株を増幅せず、これによりこれら２つのストレプトコッカスの種について普遍性がわずかに欠けることが示された。
【００８８】
研究された各標的微生物種もしくは属又は抗生物質耐性遺伝子のためのすべての特異的及び普遍的増幅プライマーをアネックスVIに示す。配列決定されたDNA 断片の配列又はその部分の多様性がプローブ及び増幅プライマーの特異性に影響を与えない限り、配列決定されたDNA 断片の多様性は生じてもよい。
【００８９】
アネックスVIに挙げられるPCR 増幅プライマーはすべて、参照株及び種々の地域からの臨床単離株を用いて、それらの特異性及び普遍性について試験された。増幅及びハイブリダイゼーション測定を試験するために使用された351 の参照株（表４，５及び６）は（ｉ）American Type Culture Collection) (ATCC) : 85％，（ii）Laboratoire de sante publique du Quebec (LSPQ) : 10％，（iii ）Centers for Disiese Contral and Prevention (CDC) : ３％，（iv）Natronal Culture Type Collection (NCTC) : １％，及び（ｖ）世界中の幾つかの他の参照研究室：１％、から得られた。これらの参照株は、（ｉ）90種のグラム陰性細菌(169株；表４）、（ii）97種のグラム陽性細菌(154株、表５）及び（iii ）12種の真菌（28株；表６）を代表する。
【００９０】
抗生物質耐性遺伝子
抗生物質耐性はしばしば治療を複雑化し、そして治療を失敗に導く。さらに、抗生物質の過剰使用は必然的に細菌耐性の発生を導く。本発明の目的は、臨床医におよそ１時間以内に、最適な治療を処方するために必要な情報を提供することである。普遍的な細菌検出のためのDNA に基く試験による陰性の臨床検体の迅速な同定、並びに種特異的及び／又は属特異的なDNA に基く試験による陽性検体中の特定の病原体の存在の同定のほかに、臨床医は、抗生物質治療に対抗する細菌性病原体の能力についてのタイムリーな情報を必要とする。抗生物質に対する細菌耐性を迅速に評価するための最も効果的な方策は、最も共通的な且つ臨床的に最も重要な抗生物質耐性遺伝子を臨床検体から直接検出すること（すなわち、抗生物質耐性遺伝子の検出のためのDNA に基く試験）であると本発明者らは感じる。
【００９１】
最も重要な且つ一般的な細菌抗生物質耐性遺伝子の配列はデーターベースから入手できるので、本発明者らのストラテジーは、DNAに基く迅速試験法の開発のための基礎として使用されるであろう特異的オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを設計するために耐性遺伝子の一部分又は全体からの配列を使用することであった。臨床的意義（すなわち、高い頻度及び重要性）に基いて選択された抗生物質耐性遺伝子のそれぞれからの配列を配列表に示す。表９及び表10は、選択された抗生物質耐性遺伝子の幾つかの特徴を要約する。抗生物質耐性遺伝子の検出並びに細菌の検出及び同定が１つのPCR 増幅条件下で同時に行われる（実施例13）ので、本発明者らのアプローチはユニークである。
【００９２】
アネックスVIは、PCR 測定により試験された、26の臨床的に重要な抗生物質耐性遺伝子から選択されたすべての増幅プライマーのリストを提供する。抗生物質耐性遺伝子の検出及び同定のための種々のPCR 測定が、標的遺伝子を担持することが知られている、多くの国から得られた幾つかの耐性細菌株を試験することにより評価された。すべての測定が特異的であることを確認するために、標的耐性遺伝子を把持しない多数の株の試験も行った。今まで、抗生物質耐性遺伝子についてのすべてのPCR 試験は高度に特異的であり、そして標的遺伝子を担持することが知られているすべての対照耐性細菌株を検出した。抗生物質耐性遺伝子の検出及び同定のための一連のPCR 測定を評価するための幾つかの臨床研究の結果は、これらのDNA に基く測定を標準的抗生物質感受性試験法と関連するものであり、表11及び12に示される。
【００９３】
普遍的細菌検出
日常の微生物学研究室において、細菌同定のために送られてくる臨床検体の多くが培養により陰性である（表４）。特異的同定に先立って細菌の存在を検出するためにユニバーサル増幅プライマー又はユニバーサルプローブを用いて臨床検体を試験し、そして多くの陰性の検体を篩い除くことは重要である。なぜなら、これはコストを下げ、そして患者の臨床管理を迅速に指示するからである。従って、幾つかの増幅プライマー及びプローブが、tuf 遺伝子からの細菌配列の高度に保存された部分から合成された（表８）。ユニバーサルプライマーの選択は、実施例１及びアネックスＩに記載される利用可能なデーターベース配列から選択され又は本発明者らにより決定された配列から構成された多数の配列の整列(alignment) に基いた。
【００９４】
細菌の普遍的検出のために適当なデーターベース配列の同定のため、本発明者らは、２つの遠縁の微生物（すなわち、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium)及びヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae))の完全なゲノム配列が利用できることを利用した。これらの遠縁の２種類の微生物のゲノムによりコードされているすべての蛋白質のアミノ酸配列の比較が高度に相同な蛋白質の同定を導いた。これらの相同な蛋白質の解析が、細菌の検出のための普遍的なDNA に基く測定法の開発のための幾つかの有望な候補の選択を可能にした。
【００９５】
他の幾つかの微生物ゲノムの完全なヌクレオチド配列がデーターベースから入手可能であるので、当業者は、マイコプラズマ・ゲニタリウム及びヘモフィルス・インフルエンザのゲノム配列以外のゲノム配列を比較することにより同じ結論に達することができるであろう。選択されたtuf 遺伝子は、蛋白質の合成の間の翻訳過程に関連する蛋白質（FF−Tu）をコードする。従って、データーベースから得られる遺伝子配列及び前記のごとく本発明者らが決定した新規なtuf 配列を用いて、広範なヌクレオチド配列解析を行った。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列のすべてのコンピューター解析はGCG プログラムを用いて従った。次に、細菌の普遍的増幅のための最適のPCR プライマーを、 OligoＴＭプログラムにより選択した。
【００９６】
選択されたプライマーは、すべての臨床的に意義のある細菌配列の増幅を可能にするように、幾つかのヌクレオチド部位で縮重（degenerate）しており、そして幾つかのイノシンを含有する（アネックスＩ）。イノシンは、４種類のヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ又はＴのいずれとも特異的に結合することができるヌクレオチドである。縮重したオリゴヌクレオチドは、ミスマッチ部位において４種類のヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ又はＴの２以上を有するオリゴヌクレオチドの混合物から成る。増幅プライマー中にイノシン及び／又は縮重を含めることにより、ミスマッチに耐えることができるようになり、これにより、より広い範囲の標的ヌクレオチド配列の増幅が可能になる（Dieffenbach and Dveksler,1995, PCR Primer : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labortory Press, Plainview, NY)。
【００９７】
ユニバーサルプライマーを用いての増幅条件は、アニーリング温度が55℃ではなく50℃であったことを除き、種特異的及び属特異的増幅測定のためのそれと同じであった。このユニバーサルPCR 測定は、細菌の検出のために特異的であり、そしてほぼ普遍的であった。細菌についての特異性は、表６に示す12種の真菌から単離されたゲノムDNA 並びに、ライシュマニア・ドノバニ（Leishmania donovani)、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisine) 及びヒトリンパ球からのゲノムDNA を増幅させることにより確認された。
【００９８】
上記真核生物DNA 調製物のいずれもユニバーサル測定により増幅され得ず、これによりこの試験が細菌について特異的であることが示唆された。このユニバーサル測定の普遍性は、95の最も臨床的に意味のある細菌種を代表する116 の参照株からのゲノムDNAを増幅することにより証明された。これらの種は、表４及び表５に示す細菌種から選択された。本発明者らは、116 株の内104 株が増幅されたことを見出した。増幅され得なかった細菌種はコリネバクテリウム（Corynebacterium) (11種）及びステノトロホモナス（Stenotrophomonas) （１種）に属する。これらの細菌種からのtuf 遺伝子の配列決定は最近行われている。
【００９９】
この配列決定データーが一層普遍的である新規なユニバーサルプライマーを選択するために使用された。本発明者らはまた、効果的な増幅を得るために幾つかの種についてはアニーリング温度を45℃に低下させなければならないことを観察した。これらの細菌種には、ゲメラ・モルビブラム（Gemella morbibrum)、リステリア・spp 及びガーデネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis)が含まれる。ユニバーサン測定の普遍性を試験するために表４及び表５から選択された95の細菌種は、地域社会で又は病院で得られる種々のヒトの感染（病院内感染）に関連する臨床的に最も意味のある細菌種のすべてを含むことに注目することが重要である。臨床的に最も重要な細菌及び真菌病原体を表１及び表２に挙げる。
【０１００】
実施例及びアネックス
下記の実施例及びアネックスは本発明の種々の方法及び化合物を例示することを意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
種々のアネックスは、tuf 配列から又はrecA遺伝子からの増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを示す：（ｉ）アネックスＩは、tuf 配列からのユニバーサル増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを例示する。（ii）アネックスIIは、tuf 配列からのエンテロコッカス属に特異的な増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを示す。
【０１０１】
（iii ）アネックスIII はtuf 配列からのスタフィロコッカス属に特異的な増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを例示する。（iv）アネックスＶは、tuf 配列からのキャンディダ・アルビカンスに特異的な増幅プライマーの選択に使用されたストラテジーを示す。（ｖ）アネックスｖは、recA配列からのストレプトコッカス属に特異的な増幅プライマーの選択のために使用されたストラテジーを例示する。（vi）アネックスVIは、すべての選択されたプライマー対のリストを提供する。これらのアネックスに示されるように、選択された増幅プライマーはイノシン及び／又は縮重を含むことができる。
【０１０２】
イノシンは、４種類のヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ又はＴのいずれとも特異的に結合するヌクレオチド類似体である。あるいは、ミスマッチ部位において４種類のヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ又はＴの２又はそれ以上を有するオリゴヌクレオチド混合物から成る縮重(degenerated) オリゴヌクレオチドが使用された。増幅プライマーにイノシン及び／又は縮重を含めることにより、ミスマッチに対する寛容性が許容され、それによって、より広範囲の標的ヌクレオチド配列の増幅が可能となる（Dieffenbach and Dveksler, 1995, PCR Primer : A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
【実施例】
【０１０３】
実施例１．tuf 配列からのユニバーサルPCR プライマーの選択
アネックスＩに示すように、種々の細菌及び真菌種からのtuf 配列の比較により、細菌の検出のためにユニバーサル（普遍的）なPCR プライマーの選択が可能となった。PCR プライマーを設計するために使用されたストラテジーは、種々のtuf 配列の多数配列整列の解析に基いた。この多数配列整列は、本発明者らにより決定されたか又はデーターベースから選択された。38個の細菌種及び３個の真菌種からのtuf 配列を含む（表13）。この多数配列整列の注意深い解析により、ユーバクテリア（eubacteria) 内で保存されているが真核生物からの配列を区別するプライマー配列の選択が可能となり、これにより細菌の普遍的検出が可能となった。
【０１０４】
アネックスＩに示すように、選択されたプライマーはイノシン及び縮重を含む。これは、tuf 遺伝子は高度に保存されているにも拘らず、細菌tuf 配列間に比較的高い多形性（polymorphism) が存在するので、必要である。事実、本発明者らが決定したtuf 配列間に、本発明者らは多くのヌクレオチド変化並びにアミノ酸の幾つかの欠失及び／又は挿入を見出した。選択されたユニバーサルプライマーは細菌について特異的であり且つ普遍的であった（表７）。試験された臨床的に最も重要である細菌種の内、12種は増幅されなかった。これらの種はコリネバクテリウム属（11種）及びステノトロホモナス（Stenotrophomonas) （１種）に属する。ユニバーサルプライマーは、ヒト及び他のタイプの真核生物DNA を含めて、非細菌源のDNA を増幅しなかった。
【０１０５】
実施例２．tuf 配列からの属特異的PCR プライマーの選択
アネックス２及び３に示すように、種々の細菌種からのtuf 配列の比較により、エンテロコッカス spp. 又はスタフィロコッカス spp. について特異的なPCR プライマーの選択が可能であった。PCRプライマーを設計するために用いられたストラテジーは、種々のtuf 配列の多数配列整列の解析に基いた。これらの多数配列整列は、各標的属から選択された４種の代表的な細菌のtuf 配列、及び他の類縁の細菌の属の種からのtuf 配列を含む。これらの整列の注意深い解析により、標的属内で保存されているがしかし他の類縁属からの配列を区別するオリゴヌクレオチド配列の選択が可能となり、これにより標的細菌属の属−特異的且つ普遍的検出及び同定が可能となった。
【０１０６】
エンテロコッカス sppについて特異的なプライマーの選択（アネックスII）のため、本発明者らは、エンテロコッカス・アビウム、Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェシウム、及びＥ．ガリナルムのtuf 遺伝子の約 890bpの部分の配列を決定した。整列において用いた他のすべてのtuf 配列は本発明者らにより配列決定されたか、又はデーターベースから選択された。この配列整列の解析が、エンテロコッカス spp. について特異的であり且つ普遍的であるプライマー対の選択を導いた（表７）。試験した11種のエンテロコッカスのすべてが効率的に増幅され、そして他の属の細菌種からのゲノムDNA の増幅は存在しなかった。
【０１０７】
スタフィロコッカス spp. について特異的なプライマーの選択のため（アネックスIII ）、本発明者らはまた、スタフィロコッカス・アウレウス、Ｓ．エピデルミディス、Ｓ．サプロフィティカム及びＳ．シムランスのtuf 遺伝子の約 890bpの部分を配列決定した。整列において使用した他のすべてのtuf 配列は、本発明者らにより配列決定されたか、又はデーターベースから選択された。この配列整列の解析がスタフィロコッカス spp．について特異的であり且つ普遍的である２個のプライマー対の選択を導いた（表７）。
【０１０８】
アネックスIII は、これら２個のPCR プライマー対の１つを選択するために用いられたストラテジーを示す。これと同じストラテジーが他方のプライマー対を選択するためにも使用された。試験された14種のスタフィロコッカスの内、１種（Ｓ．スシウム（S. scium) は、上記２組のプライマー対のいずれを使用したスタフィロコッカス特異的PCR 測定によっても増幅され得なかった。上記２個のプライマー対のいずれか一方を用いるPCR 測定において、他の細菌属の種からのDNA の増幅は存在しなかった。
【０１０９】
実施例３．キャンディダ・アルビカンスについて特異的なPCR プライマーのtuf 配列からの選択
アネックスIVに示すように、種々の細菌種及び真核生物種からのtuf 配列の比較により、キャンディダ・アルビカンスについて特異的なPCR プライマーの選択が可能になった。PCR プライマーを設計するために用いられたストラテジーは、種々のtuf 配列の多数配列整列の解析に基いた。この多数配列整列は、本発明者のグループにより決定されたキャンディダ属から選択された５種の代表的な真菌（すなわち、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．グラブラタ（C. glabrata)、Ｃ．クルセイ（C. kusei) 、Ｃ．パラプシロシス（C. parapsilosis)、及びＣ．トロピカリス（C. tropicalis)) のtuf 配列、並びに類縁の真菌種からのtuf 配列を含む。種々の細菌種からのtuf 配列をも含めた。
【０１１０】
この配列整列の注意深い解析により、Ｃ．アルビカンスのtuf 配列からのプライマーの選択が可能になった。これらのプライマーは、他の類縁のキャンディダの種及び他の真菌種からの配列を区別し、これによりＣ．アルビカンスの種特異的及び普遍的検出及び同定が可能となる（表７）。試験されたキャンディダ・アルビカンスの88株のすべてが効率的に増幅され、そして他の真菌又は菌種からのゲノムDNA の増幅は存在しなかった。
【０１１１】
実施例４．スタフィロコッカスについて特異的なPCR プライマーのrecAからの選択
アネックスＶに示すように、細菌ストレプトコッカス属について特異的及び普遍的なPCR プライマーの選択のための基礎として、データーベース（Gen Bank及びEMBL) から入手可能な種々の細菌recA遺伝子配列の比較を用いた。recA遺伝子の配列はスタフィロコッカスの５種を含めて多くの細菌種について入手可能であるので、スタフィロコッカス属内でよく保存されているが他の細菌属のrecA配列から区別される配列を選択することができた。
【０１１２】
スタフィロコッカスの５種からのrecA配列間にミスマッチが存在する場合、プライマーにイノシン残基を導入した（アネックスＶ）。それぞれが１個のイノシンを含有し、縮重を含まない、選択されたプライマーはスタフィロコッカス種について特異的且つ普遍的であった（表７）。このPCR 測定は、ストレプトコッカスの試験された22種のすべてを増幅した。しかしながら、このストレプトコッカス−特異的測定は、Ｓ．ミュタンス（S. mutans)の９株の内３株、及びＳ．サリバリウム（S. salivarius)の３株の内の１株からのDNA を増幅しなかった。
他の細菌属からのゲノムDNA の増幅は存在しなかった（表７）。
【０１１３】
実施例５．DNA 断片のヌクレオチド配列の決定
種々の細菌又は真菌種からのtuf 遺伝子の部分のヌクレオチド配列は、ジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション配列決定法（Sangerら、1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 : 5463-5467) を用いて決定された。Applied Biosystemsの自動DNA 配列決定株（モデル373A）とその PRISMＴＭ Sequenase（Ｒ） Terminator Double-stranded DNA Sequencing Kit (Perkin-Elmer Corp., Applrid Biosystem Division, Foster City, CA) を用いて行った。配列決定プライマーは細菌tuf 遺伝子tufA及びtufBの両方に効果的にハイブリダイズするので、この配列決定ストラテジーはtufA遺伝子とtufB遺伝子とを区別しない。これらのDNA 配列を配列表（配列番号： 118〜146)に示す。本発明者らのグループにより決定された種々のtuf 配列（表13）中の幾つかの縮重したヌクレオチドの存在は、tufAとtufBとの間の配列変化に対応する。
【０１１４】
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの選択
オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、 OligoＴＭプログラムを用いて本発明のDNA 断片又はデーターベース配列から選択され、そしてホスホルアミダイト法を用いて自動化されたABI DNA 合成機（Model 391, Perkin-Elmer Corp. Applied Biosystems Division)により合成された。
【０１１５】
実施例６．ハイブリダイゼーション測定のためのオリゴヌクレオチドのラベル化
各オリゴヌクレオチドは、前記のごとく、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Pharmacia) により、γ−32Ｐ（dATP）を用いて５'−末端ラベルされた。ラベルは非放射性であってもよい。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドプローブのための特異性試験
すべてのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブは、前記のごとく、表４，５及び６から選択された種々の細菌及び真菌種からのDNA とのハイブリダイゼーションにより試験した。種特異的又は属特異的プローブは、それが単離された微生物種又は属からのDNA とのみハイブリダイズするものである。特異的であることが見出されたオリゴヌクレオチドプローブは、次の普遍性試験にかけた。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドプローブのための普遍性試験
次に、特異的オリゴヌクレオチドプローブは、各標的種又は属内での多様性を代表する、他の多くの国から得られた株及び参照株を含めての標的種又は属の株を用いて、普遍性試験にかけた。単離株からの染色体DNA をナイロン膜上に移し、そして特異性試験について上記したラベルされたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。各標的種又は属について作成された単離株の組は、参照ATCC株並びに種々の由来から得られた種々の臨床単離株を含む。普遍的プローブとは、標的種又は属の臨床単離株の組からのDNA の80％以上にハイブリダイズするプローブである。
【０１１８】
実施例７．
（ｉ）感度を上昇せしめそして 100％の普遍性を保証するために、又は（ii）複数の種及び／又は属を同時に同定するために、複数のオリゴヌクレオチドプローブのプールを微生物の同定のために用いた点を除き、実施例６と同じである。微生物の同定は微生物培養物から、又は任意の臨床検体から直接に行うことができた。
【０１１９】
実施例８．
細菌又は真菌を臨床検体から直接検出した点を除き実施例６と同じである。いずれかの生物学的サンプルをドットブロット装置に直接に付加し、そして細胞をその場で、細菌又は真菌検出及び同定のために溶解した。ドットブロット装置への便利な付加を妨害する凝集を防止するために、血液サンプルはヘパリン処理すべきである。
【０１２０】
実施例９．
PCR 増幅
測定の感度及び迅速性を向上させるためにPCR 法を用いた。プライマーの特異性及び普遍性を決定するため、直接細菌コロニーから又は標的化された細菌懸濁液から（実施例10を参照のこと）行われるPCR 測定においてプライマーのセットを試験した（表７）。特異的及び普遍的PCR プライマーの例をアネックスVIに示す。
【０１２１】
増幅プライマーのための特異性及び普遍性試験
すべての選択されたPCR プライマー対の特異性を、前記のごとく、表４，５及び６から選択された種々の細菌又は真菌種からのDNAに対して試験した。各種又は属に対して特異的であることが見出されたプライマー対は次に、標的種又は属の単離株の組からのDNA の90％以上を各プライマーセットが増幅することができることを保証する普遍性について試験した。各種について作製された単離株の組は、各種又は属内での多様性を代表する、世界中からの種々の臨床単離株及び参照ACCC株を含む。誤まった陽性（false poritive) のPCR 結果を防止するために標準的な注意が払われるべきである（Kwok and Higuchi, 1989, Natue, 239 : 237-238) 。PCR のキャリーオーバーをコントロールするために、ウラシル−Ｎ−グリコシダーゼによる不活性化のごときPCR 増幅生成物不活性化する方法を用いるべきである。
【０１２２】
実施例10．細菌又は酵母培養物からの直接増幅
PCR 測定を直接に細菌コロニーから又は細菌懸濁液から行った。後者は、標準McF orland 0.5（およそ 1.5×10８ 細菌／mLに相当する）に調整した。コロニーからの直接増幅の場合、コロニーの一部分をプラスチック棒を用いて直接に、50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH9.0), 0.1％ Triton X-100, 2.5mM MgCl2, 0.4μMづつの各プライマー、 200μMづつの４種類のdNTP及び 0.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ、並びに Taq StartTM（Clontech Laboratories Inc.) を含有する20μLのPCR 反応混合物に移した。細菌懸濁液については、１μLの細胞懸濁液を19μLの同じPCR 反応混合物に加えた。酵母培養物からの同定のためには、１μLの標準McF orland 1.0（約 3.0×108 細菌／mMに相当する）を直接にPCR 反応に加えた。酵母細胞についてのMcF orland 0.5は、細菌細胞のMcF orland 0.5よりも細胞数が 200倍少ないから、上記の酵母細胞についての濃縮段階を行った。
【０１２３】
次に、PCR 反応混合物を、PTC-200 themal cycler を用いて熱サイクリング（95℃にて３分間、これに続き、変性段階のための95℃にて１秒間及びアニーリング−延長段階のための55℃にて30秒間の30サイクル）にかけた。次に、PCR 増幅生成物を標準的アガロースゲル（２％）電気泳動により分析した。増幅生成物は、0.25μｇ／mLの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル中、 254nmのUVのもとで可視化した。約１時間で完全なPCR 測定を完了することができた。
【０１２４】
すべてのPCR 反応のための内部対照を提供するため、細菌16ＳリボソームRNA 遺伝子の高度に保存された領域に由来するプライマー配列を用いた。あるいは、内部対照は、微生物又はヒトゲノムに見出されない配列から導いた。PCR 測定の効率を確認し、そして有意なPCR 阻害が存在しなかったことを保証するために、内部対照をすべての増幅反応に導入した。rRNA由来の内部対照は細菌の細菌溶解プロトコールの効率をモニターするためにも有用であった。内部対照及び種特異的又は属特異的増幅はマルチプレックス(multiplex)PCR 測定において同時に行った。
【０１２５】
実施例11．尿検体からの直接増幅
尿検体から直接行うPCR 増幅のため、１μLの尿を、500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH9.0), 1％ Triton X-100 を含有する細胞溶解溶液４μＬと混合した。室温にて15分間以上のインキュベーションの後、１μLの処理された尿検体を19μLのPCR 反応混合物に直接加えた。PCR 試薬の最終濃度は50mM KCl 10mM Tris (pH9.0), 0.1％ Triton X-100, 2.5mM MgCl2, 0.4μＭづつのプライマー、 200μＭづつの４種類のdNTPであった。さらに、各20μＬの反応混合物は、 Taq StartＴＭ抗体（Clontech Laborotories Inc.) と組合わせて 0.5ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ(Promega) を含有した。
内部対照、PCR 増幅及びアンプリコンのアガロースゲル検出のストラテジーは実施例10に記載した通りである。
【０１２６】
実施例12．抗生物質耐性遺伝子の検出
しばしば遭遇されそして臨床的に意味のある特定の抗生物質耐性遺伝子の存在は、前記のPCR 増幅及びハイブリダイゼーションプロトコールにより同定される。DNA に基く試験の基礎として使用される特異的オリゴヌクレオチドは、抗生物質遺伝子配列から選択される。抗菌剤に対する細菌の耐性の迅速な評価を可能にするこれらの試験は、臨床検体から、標準化された細菌懸濁液から又は細菌のコロニーから直接に行うことができ、そして細菌の普遍的（ユニバーサル）検出並びに種特異的及び属特異的微生物検出及び同定のための診断試験を補完すべきである。
【０１２７】
実施例13．
特定の標的病原体について 100％の普遍性を達成するためにマルチプレックスPCR(すなわち、単一のPCR 反応において複数対のプライマーを用いる）により測定を行った点を除き、実施例10及び11と同じであった。さらに不均一な微生物種又は属のためには、標的種又は属のすべての代表を検出及び同定するために複数のPCR プライマー対の組合せが必要であろう。
【０１２８】
マルティプレックスPCR 測定は、（ｉ）複数の微生物種及び／又は属を同時に検出するため、あるいは（ii）臨床検体又は細菌培養物からの、細菌及び／又は真菌病原体検出及び同定、並びに特定の抗生物質耐性遺伝子の検出を同時に行うためにも使用することができる。
【０１２９】
これらの用途のため、アンプリコン検出法は、生成される種々のアンプリコンを区別するように適合されるべきである。標準的ゲル電気泳動はアンプリコンをそのサイズに基いて区別するので、これを用いることができた。この目的のための他の有用なストラテジーは、異る波長で放射する種々の蛍光色素を使用する検出法であろう。蛍光色素は、増幅中に分解して蛍光色素を遊離する蛍光減衰剤（fluorescence qurencher) に連結された特異的のオリゴヌクレオチドと結合されてもよい（例えば Taq ManTM，Perkin Elmer) 。
【０１３０】
実施例14．増幅生成物の検出
増幅生成物の表示のために標準的アガロースゲル電気泳動（実施例10）以外の方法が使用できることを当業者は理解するであろう。このような方法は、蛍光の分極（fluorescence polarization 又は増幅後の蛍光の検出に基くことができ（例えば、 AmplisencerTM，Biotronics ; Taq ManTM，Perkin-Elmer Corp.) あるいは他のラベル、例えばビオチンを使用することができる（SHARP SignalTMシステム、Digene Diagnosis) ことができる。これらの方法は定量的であり、そして自動化することができる。種特異的、属特異的又はユニバーサルDNA 断片に由来するアンプリコンに特異的な増幅プライマー又は内部オリゴヌクレオチドプローブの１つが蛍光色素又は他の任意のラベルに連結される。蛍光の検出に基く方法は、異る波長で放射する蛍光色素を利用することができるので、迅速であり且つ柔軟性があるので、診断試験のために特に適当である。
【０１３１】
実施例15．
種特異的、属特異的、ユニバーサル及び抗生物質耐性遺伝子増幅プライマーは、他の迅速増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応(LCR) 、転写−介存増幅(TMA）、自己保持複製（３SR）、核酸配列に基く増幅（NA SBA）、鎖置換増幅(SDA) 、サイクリングプローブ法(CPT)及び分岐DNA (bDNA)又は試験の感度を向上させる他の任意の方法において使用することができる。増幅は単離された細菌培養物から、又は任意の臨床検体から直接に行うことができる。従って本発明の範囲は、PCR のための配列表からのDNA 配列の使用に限定されず、試験の迅速性及び感度の向上のために使用することができ、細菌DNA を特異的に検出するあらゆる方法の使用を含む。
【０１３２】
実施例16．
試験キットは、各微生物種又は属に特異的なプローブのセット、及びユニバーサルプローブのセットを含むであろう。キットは、非放射性ラベルによりユニバーサルプローブのセット、並びに特定のタイプの臨床サンプル中の注目の病原体の検出のためのラベルされた種特異的又は属特異的プローブから成る試験要素の形態で提供されるであろう。キットはまた、プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄段階及びハイブリドの検出を行うのに必要な試験試薬を含むであろう。最後に、既知の抗生物質耐性遺伝子（又はその誘導体）の検出のための試験要素も含まれるであろう。言うまでもなく、キットは各ハイブリダイゼーション試験のための陰性対照及び陽性対照として使用されるべき標準サンプルを含むであろう。
【０１３３】
キットに含まれるべき要素は、各検体のタイプに、及びその検体タイプにおいて一般に遭遇される病原体を検出するために適合されるであろう。細菌の普遍的（ユニバーサル）検出のための試薬もまた含まれるであろう。感染の部位に基いて、病原体の特異的検出のために下記のキットが開発されるであろう。
【０１３４】
◎ 微生物ゲノムの高度に保存された領域に対して特異的なセットを含む、すべての臨床検体からの細菌又は真菌病原体のユニバーサル検出のためのキット。
◎ ５種の特異的試験要素（エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・スペーシス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、スタフィロコッカス・スペーシス及びキャンディダ・アルビカンスの検出のためのプローブのセット）を含む、尿サンプルから回収された微生物病原体の検出のためのキット。
【０１３５】
◎ ３種の試験要素（スタフィロコッカス・スペーシス、エンテロコッカス・スペーシス及びキャンディダ・アルビカンスの検出のためのプローブのセット）を含む、呼吸器病原体の検出のためのキット。
◎ 10種類の特異的試験要素（ストレプトコッカス・スペーシス、ストレプトコッカス・アガラクチア、スタフィロコッカス・スペーシス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、エンテロコッカス・スペーシス、エンテロコッカス・フェシウム、ナイセリア・スペーシス、ナイセリア、メニンギチディス、リステリア・モノサイトゲネス、及びキャンディダ・アルビカンスの検出のためのプローブのセット）を含む、血液サンプルから回収された病原体の検出のためのキット。このキットは、血液培養物の直接検出及び同定のためにも適用することができる。
【０１３６】
◎ ５種類の特異的試験要素（ストレプトコッカス・スペーシス、リステリア・モノサイトゲネス、ナイセリア・メニンギチディス、ナイセリア・スペーシス及びスタフィロコッカス・スペーシスの検出のためのプローブのセット）を含む、メニンギチス（meningitis) を生じさせる病原体の検出のためのキット。
【０１３７】
◎ 抗生物質耐性に関連する次の26の遺伝子、 blatem， blarob， blashv， blaoxa，blaZ，aadB，aacC1, aacC2，aacC3, aacA4， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，mecA，vanA, vanB, vanC,satA, aac(6')-aph(2'')，aad(6') ，vat, vga, msrA, sul 及びint の少なくとも１つの特異的検出のためのプローブのセットを含む、臨床的に重要な抗生物質耐性遺伝子の検出のためのキット。
◎ 皮膚、腹部創傷又は他の臨床的に意味のある感染からの病原体の検出のために適合された他のキット。
【０１３８】
実施例17．
試験キットが、DNA 増幅測定に必要なすべての試薬及び対照を含む点を除き、実施例16と同じとした。診断キットは臨床検体から又は微生物培養物から直接行われるPCR(又は他の増幅法）による増幅に適合されるであろう。（ｉ）ユニバーサル細菌検出、（ii）種特異的及び属特異的細菌及び／又は真菌検出及び同定、並びに（iii ）抗生物質耐性遺伝子の検出、のために必要な要素が含まれるであろう。
【０１３９】
増幅測定は、チューブ又は多数のウエルを有するミクロタイタープレート中で行うことができる。プレートでの測定のため、ウエルは特異的増幅プライマー及び対照DNA を含有し、そして増幅生成物の検出は自動化されるであろう。普遍的（ユニバーサル）細菌検出のための試験及び増幅プライマーは、臨床検体から直接に行われる試験のキットに含まれるであろう。種特異的及び属特異的細菌及び／又は真菌検出及び同定のため並びに同時的抗生物質耐性遺伝子検出のために必要な要素は、細菌又は真菌培養物から直接試験するためのキット並びに任意のタイプの臨床検体から直接試験するためのキットに含まれるであろう。
キットは、ハイブリダイゼーションに基く診断キットについての実施例16に記載された各タイプの検体の使用のために適合されるであろう。
【０１４０】
実施例18．
細菌及び／又は真菌の検出及び同定のための本発明において記載されるプローブ及び増幅プライマーの使用は、臨床的微生物学的適用に限定されない。事実、本発明者らは、他の分野は、これらの新技術から利益を得ると考える。例えば、これらの試験は、食品、水、医薬製剤又は微生物学的管理を必要とする他の製品の品質管理のために産業界により利用され得る。これらの試験はまた、ヒト以外の生物（例えば、他の霊長類、トリ、植物、哺乳類、農業動物、家畜及び他の生物）からの生物学的サンプル中の細菌又は真菌を検出及び同定するためにも適用され得る。これらの診断的道具は、臨床試験及び疫学研究を含めての研究目的のためにも非常に有用である。
【０１４１】
本発明は以上のように記載され、本発明の本質を逸脱することなく変更を行うことができることは明らかである。これらの変更は、請求の範囲に記載された本発明の範囲で行うことができる。
【０１４２】
【表１】
【０１４３】
【表２】
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
【表４】
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
【表７】
【０１４９】
【表８】
【０１５０】
【表９】
【０１５１】
【表１０】
【０１５２】
【表１１】
【０１５３】
【表１２】
【０１５４】
【表１３】
【０１５５】
【表１４】
【０１５６】
【表１５】
【０１５７】
【表１６】
【０１５８】
【表１７】
【０１５９】
【表１８】
【０１６０】
【表１９】
【０１６１】
【表２０】
【０１６２】
【表２１】
【０１６３】
【表２２】
【０１６４】
【表２３】
【０１６５】
【表２４】
【０１６６】
【表２５】
【０１６７】
【表２６】
【０１６８】
【表２７】
【０１６９】
【表２８】
【０１７０】
【表２９】
【０１７１】
【表３０】
【０１７２】
【表３１】
【０１７３】
【表３２】
【０１７４】
【表３３】
【０１７５】
【表３４】
【０１７６】
【表３５】
【０１７７】
【表３６】
【０１７８】
【表３７】
【０１７９】
【表３８】
【０１８０】
【表３９】
【０１８１】
【表４０】
【０１８２】
【表４１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の存在又は量を決定するために特異的、普遍的及び高感度のプローブ及び／又は増幅プライマーを使用する方法であって、
前記核酸が、 blatem， blashv， blarob， blaoxa，blaZ，andB，aacC1, aacC2, aacC3, aac6'−IIａ，aacAA, aub(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA, aac(6')-aph(2'')，vat, vga, ermA, ermB, ermC, mecA, int 及びsul から成る群から選択された抗生物質耐性遺伝子からのもの、並びにエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseriameningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)から成る群から選択された特定の細菌又は真菌種からのものであって、前記細菌種及び／又は真菌種を含有すると疑がわれるサンプル中に存在するものであり、
ここで、前記核酸もしくはその変形体又はその部が、前記プローブ又はプライマーとハイブリダイズすることができる選択された標的領域を含んでなり、
前記方法が、前記サンプルを前記プローブ又はプライマーに接触せしめ、そして前記特定の細菌及び／又は真菌種並びに細菌抗生物質耐性遺伝子の存在及び／又は量を示すものとしてのハイブリダイズしたプローブ又は増幅された生成物の存在及び／又は量を検出する、段階を含んである方法。
【請求項２】
さらに、任意の細菌又は真菌からの核酸の存在及び／又は量を決定するための特異的、普遍的及び感受性のプローブ及び／又はプライマーを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験サンプルから直接に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細菌及び／又は真菌培養物及び／又は懸濁液から成る試験サンプルから直接に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸のすべてが同じハイブリダイゼーション又は増幅条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、
ｂ）リガーゼ連鎖反応 (LCR)、
ｃ）核酸配列に基く増幅（NASBA)、
ｄ）自己保持配列複製（３SR）、
ｅ）標準置換増幅（SDA)、
ｆ）分岐DNA シグナル増幅（bDNA) 、
ｇ）転写−介在増幅（TMA)、
ｈ）サイクリングプローブ法（CPT)、
ｉ）入れ子PCR 、及び
ｊ）マルティプレックス（moltiplex) PCR
から成る群から選択された方法により増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がPCR により増幅される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記PCR のプロトコールが１時間以内に１つの増幅条件下で行われ、前記核酸の存在の決定が、45〜55℃で30秒間のアニーリング段階及び95℃にて１秒間の変性段階からなり延長段階のためのみの時間を含まない増幅サイクルにより行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試験サンプル、あるいは細菌及び／又は真菌培養物から直接に、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae)、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)から成る群から選択された微生物を、検出、同定及び／又は定量するための方法であって、
ａ）前記サンプルの、又は前記サンプルから単離された前記微生物の実質的に均一な集団の前記微生DNA を、不活性支持体に付着又は固定し、あるいは溶液中に置き、あるいは前記サンプル、又は前記サンプルから単離された微生物の実質的に均一な集団を不活性抗体上に接種し、そしてその場で、前記接種されたサンプル又は前記単離された微生物を細胞溶解して、前記微生物DNA を放出せしめ
前記微生物DNA は実質的に一本鎖型され；
ｂ）前記一本鎖DNA をプローブと接触せしめ、このプローブは配列番号：26, 27, 28, 29, 30, 120, 131〜134, 31, 140〜143, 23〜36, 120〜124 、これらの相補配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するこれらの部分、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つの一本鎖を含んで成り、前記配列は、それぞれ、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species)、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)の株又はそれらを代表する株と特異的及び普遍的にアニールするものであり、このアニールは前記プローブの核酸が前記微生物DNA とハイブリダイズすることができるものであり、これによりハイブリダイゼーション複合体が形成され；そして
ｃ）前記試験サンプル中の前記微生物の存在及び／又は量を示すものとして、前記不活性支持体上又は前記溶液中の前記ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１０】
試験サンプル中の、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)から成る群から選択された微生物の存在及び／又は量を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記微生物DNA の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができるものであり、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができるものであり、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるようなものであり、前記少なくとも１対のプライマーは、前記微生物に関してそれぞれ配列番号：26, 27, 28, 29, 30, 120, 131〜134, 31, 140〜143, 32〜36, 120〜124 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群内のヌクレオチド配列から選択され；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記サンプル中の前記微生物の存在及び／又は量を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１１】
前記プライマー対が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candidaalbicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)のそれぞれについて、それぞれ、配列番号：１と２，３と４，５と６，７と８，９と10，11と12，13と14，15と16，17〜21，21と22に定義されるものである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
試験サンプル、あるいは細菌培養物から直接に、細菌の存在及び／又は量を決定する方法において、
ａ）前記サンプルの、又は前記サンプルから単離された前記微生物の実質的に均一な集団の前記微生DNA を、不活性支持体に付着又は固定し、あるいは溶液中に置き、あるいは前記サンプル、又は前記サンプルから単離された微生物の実質的に均一な集団を不活性抗体上に接種し、そしてその場で、前記接種されたサンプル又は前記単離された微生物を細胞溶解して、前記微生物DNA を放出せしめ
前記微生物DNA は実質的に一本鎖型され；
ｂ）前記一本鎖DNA をプローブと接触せしめ、このプローブは配列番号：118, 119, 125〜171 、これらの相補配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するこれらの部分、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つの一本鎖を含んで成り、前記配列は、それぞれ、細菌種の株又はそれらを代表する株と特異的及び普遍的にアニールするものであり、このアニールは前記プローブの核酸が前記微生物DNA とハイブリダイズすることができるものであり、これによりハイブリダイゼーション複合体が形成され；そして
ｃ）前記試験サンプル中の前記微生物の存在及び／又は量を示すものとして、前記不活性支持体上又は前記溶液中の前記ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１３】
試験サンプル中の細菌の存在及び／又は量を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記微生物DNA の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができる、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるようなものであり、前記少なくとも１対のプライマーは、前記微生物に関してそれぞれ配列番号：118, 119, 125〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群内のヌクレオチド配列から選択され；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記サンプル中の前記微生物の存在及び／又は量を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１４】
前記プライマー対が配列番号：23及び24により定義される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
試験サンプル又は細菌培養物から直接に細菌のtuf 配列を得る方法であって、
ａ）前記サンプルを、配列番号：107 及び108 に定義するヌクレオチド配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するその部分、それに対して相補的な配列及びその変形体内で選択された配列を有するプライマー対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記微生物DNA の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；
ｃ）前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出し；そして
ｄ）DNA 配列決定法により前記増幅された標的配列のヌクレオチド配列を決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１６】
試験サンプル又は真菌培養物から直接に真菌の存在及び／又は量を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルの、又は前記サンプルから単離された前記真菌の実質的に均一な集団の前記真菌DNA を、不活性支持体に付着又は固定し、あるいは溶液中に置き、あるいは前記サンプル、又は前記サンプルから単離された真菌の実質的に均一な集団を不活性抗体上に接種し、そしてその場で、前記接種されたサンプル又は前記単離された真菌を細胞溶解して、前記真菌DNA を放出せしめ
前記真菌DNA は実質的に一本鎖型され；
ｂ）前記一本鎖DNA をプローブと接触せしめ、このプローブは配列番号： 120〜124 、これらの相補配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するこれらの部分、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つの一本鎖を含んで成り、前記配列は、真菌の株又はそれらを代表する株と特異的及び普遍的にアニールするものであり、このアニールは前記プローブの核酸が前記真菌DNA とハイブリダイズすることができるものであり、これによりハイブリダイゼーション複合体が形成され；そして
ｃ）前記試験サンプル中の前記真菌の存在及び／又は量を示すものとして、前記不活性支持体上又は前記溶液中の前記ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１７】
試験サンプル中の真菌の存在及び／又は量を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記真菌DNA の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり、前記少なくとも１対のプライマーは、配列番号： 120〜124 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群内のヌクレオチド配列から選択され；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記サンプル中の前記真菌の存在及び／又は量を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１８】
試験サンプル又は真菌培養物から直接に真菌のtuf 配列を得るための方法であって、
ａ）前記サンプルを、配列番号：109 及び172 、少なくとも12ヌクレオチド長を有するその部分、それらの配列に対して相補的な配列、及びそれらの変形体内で選択された配列を有するプライマー対を含んで成る水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記真菌tuf 遺伝子の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；
ｃ）前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出し；そして
ｄ）DNA 配列決定法により前記増幅された標的配列のヌクレオチド配列を決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１９】
試験サンプル又は細菌培養物から直接に、 blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択された細菌抗生物質耐性遺伝子により介在される細菌耐性の存在を評価することを含んで成る請求項１に記載の方法であって、
ａ）前記サンプルの、又は前記サンプルから単離された前記細菌の実質的に均一な集団の前記細菌DNA を、不活性支持体に付着又は固定し、あるいは溶液中に置き、あるいは前記サンプル、又は前記サンプルから単離された細菌の実質的に均一な集団を不活性抗体上に接種し、そしてその場で、前記接種されたサンプル又は前記単離された細菌を細胞溶解して、前記細菌DNA を放出せしめ
前記細菌DNA は実質的に一本鎖型され；
ｂ）前記一本鎖DNA をプローブと接触せしめ、このプローブは配列番号：110, 111, 112, 113, 114, 115，116, 117、これらの相補配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するこれらの部分、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つの一本鎖を含んで成り、前記配列は、それぞれ、前記細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるものであり；そして
ｃ）前記細菌抗生物質耐性遺伝子の１つにより介在される細菌耐性を示すものとして、ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２０】
試験サンプル又は細菌培養物から直接に、 blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択された細菌抗生物質耐性遺伝子により介在される細菌耐性の存在を評価することを含んで成る、請求項１に記載の方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり、前記少なくとも１対のプライマーは、前記細菌抗生物質耐性遺伝子に関してそれぞれ配列番号：110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群内のヌクレオチド配列から選択され；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記細菌抗生物質耐性遺伝子の１つにより介在される細菌耐性を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２１】
試験サンプル又は細菌培養物から直接に、 blatem， blashv， blarob， blaoxa，blaZ，andB，aacC1, aacC2, aacC3, aac6'−IIａ，aacAA, aub(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA, aac(6')-aph(2'')，vat, vga, ermA, ermB, ermC, mecA, int 及びsulから成る群から選択された抗生物質耐性遺伝子の存在を評価することを含んで成る、請求項１に記載の方法であって、
１）前記サンプルを、配列番号：37〜40, 41〜44, 45〜48, 49及び50, 51及び52, 53及び54, 55及び56, 57及び58, 59〜60, 61〜64, 65及び66, 173及び174, 67〜70, 71〜47, 75及び76, 77〜80, 81及び82, 83〜86, 87及び88, 89及び90, 91及び92, 93及び94, 95及び96, 97及び98, 99〜102, 103〜106 、少なくとも12ヌクレオチド長を有するその部分、それらに対して相補的な配列、それらの変形体、及びそれらの混合物から成る群から選択された配列を有するプライマーの少なくとも１つを含んで成る水溶液により処理し、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、
前記プライマーの一方は、標的配列を含有する各細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記細菌抗生物質耐性遺伝子の１つにより介在される細菌耐性を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２２】
プローブ又はプライマーとしての、配列番号：26〜36, 111〜171 のいずれか１つのヌクレオチド配列、その部分、それに相補的な配列又はその変形体を有し、一本鎖形のとき、標的細菌又は真菌DNA に普遍的に及び特異的にハイブリダイズする核酸。
【請求項２３】
プローブ又はプライマーとしての、配列番号：１〜25，37〜109, 172〜174 のいずれか１つのヌクレオチド配列、その部分、それと相補的な配列又はその変形体を有し、標的細菌又は真菌DNA と普遍的に及び特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項22に記載の核酸を含んで成る組換えプラスミド。
【請求項２５】
請求項24に記載の組換えプラスミドにより形質転換された組換え宿主。
【請求項２６】
大腸菌である、請求項25に記載の組換え宿主。
【請求項２７】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candidaspecies)から成る群から選択された微生物種及び／又は属のいずれかの組合せの検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：26〜36, 120〜124, 131〜134, 140〜143 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの適当な組合せ、を含んで成るキット。
【請求項２８】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candidaspecies)から成る群から選択された微生物種及び／又は属のいずれかの組合せの検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：26〜36, 120〜124, 131〜134, 140〜143 、これらに相補的な配列及びこれらの変形体から成る群から選択されたプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項２９】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species)及びストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)から成る群から選択された微生物種及び／又は属のいずれかの組合せの検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：１〜22、少なくとも12ヌクレオチドの長さを有するその部分、これらに相補的な配列及びこれらの変形体から成る群から選択されたプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３０】
blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択された細菌耐性遺伝子の任意の組合せ核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号： 110〜117 、これらに相補的な配列及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３１】
blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選ばれた細菌耐性遺伝子の任意の組合せ核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号： 110〜117 、これらの配列に対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３２】
blatem， blashv， blarob， blaoxa，blaZ，andB，aacC1, aacC2, aacC3, aac6'−IIａ，aacAA, aub(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA, aac(6')-aph(2'')，vat, vga, ermA, ermB, ermC, mecA, int 及びsul から成る群から選択された細菌耐性遺伝子の任意の組合せの核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：37〜106, 173及び174 、それらに対して相補的な配列、及びそれらの変形体から成る群から選ばれたプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３３】
細菌及び／又は真菌の核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであり、配列番号： 118〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３４】
細菌及び／又は真菌の核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号： 118〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３５】
細菌の核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：23及び24、少なくとも12ヌクレオチド長のこれらの部分、これらの相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された配列を有するプライマー対を含んで成るキット。
【請求項３６】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のための、配列番号： 118〜171 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体を含んで成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの任意の組合せをさらに含んで成る、請求項27に記載の診断キット。
【請求項３７】
細菌及び／又は真菌の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項28に記載の診断キット。
【請求項３８】
細菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号：23及び24、少なくとも12ヌクレオチド長のこれらの部分、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列のプライマー対をさらに含んで成る請求項29に記載の診断キット。
【請求項３９】
blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択されたいずれかの細菌抗生物質耐性遺伝子の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 110〜117 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの任意の組合せをさらに含んで成る、請求項27に記載の診断キット。
【請求項４０】
blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択された任意の細菌抗生物質耐性遺伝子の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 110〜117 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列中の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項28に記載の診断キット。
【請求項４１】
blatem, blashv， blarob， blaoxa，blaZ，andB，aacC1, aacC2, aacC3, aac6'−IIａ，aacAA, aub(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA, aac(6')-aph(2'')，vat, vga, ermA, ermB, ermC, mecA, int 及びsul から成る群から選択された任意の細菌抗生物質耐性遺伝子の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号：37〜106, 173及び174 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列内の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、遺伝子29に記載の診断キット。
【請求項４２】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された配列内の少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項30に記載の診断キット。
【請求項４３】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列中の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項31に記載の診断キット。
【請求項４４】
細菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号：23及び24、少なくとも12ヌクレオチド長のこれらの部分、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド内のプライマーの任意の組合せをさらに含んで成る、請求項32に記載の診断キット。
【請求項４５】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列中の少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの任意の組合せをさらに含んで成る、請求項39に記載の診断キット。
【請求項４６】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列内の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項40に記載の診断キット。
【請求項４７】
細菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号：23及び24、少なくとも12ヌクレオチド長のこれらの部分、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド内のプライマー対をさらに含んで成る、請求項41に記載の診断キット。
【請求項１】
核酸の存在又は量を決定するために特異的、普遍的及び高感度のプローブ及び／又は増幅プライマーを使用する方法であって、
前記核酸が、 blatem， blashv， blarob， blaoxa，blaZ，andB，aacC1, aacC2, aacC3, aac6'−IIａ，aacAA, aub(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA, aac(6')-aph(2'')，vat, vga, ermA, ermB, ermC, mecA, int 及びsul から成る群から選択された抗生物質耐性遺伝子からのもの、並びにエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseriameningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)から成る群から選択された特定の細菌又は真菌種からのものであって、前記細菌種及び／又は真菌種を含有すると疑がわれるサンプル中に存在するものであり、
ここで、前記核酸もしくはその変形体又はその部が、前記プローブ又はプライマーとハイブリダイズすることができる選択された標的領域を含んでなり、
前記方法が、前記サンプルを前記プローブ又はプライマーに接触せしめ、そして前記特定の細菌及び／又は真菌種並びに細菌抗生物質耐性遺伝子の存在及び／又は量を示すものとしてのハイブリダイズしたプローブ又は増幅された生成物の存在及び／又は量を検出する、段階を含んである方法。
【請求項２】
さらに、任意の細菌又は真菌からの核酸の存在及び／又は量を決定するための特異的、普遍的及び感受性のプローブ及び／又はプライマーを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験サンプルから直接に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細菌及び／又は真菌培養物及び／又は懸濁液から成る試験サンプルから直接に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸のすべてが同じハイブリダイゼーション又は増幅条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、
ｂ）リガーゼ連鎖反応 (LCR)、
ｃ）核酸配列に基く増幅（NASBA)、
ｄ）自己保持配列複製（３SR）、
ｅ）標準置換増幅（SDA)、
ｆ）分岐DNA シグナル増幅（bDNA) 、
ｇ）転写−介在増幅（TMA)、
ｈ）サイクリングプローブ法（CPT)、
ｉ）入れ子PCR 、及び
ｊ）マルティプレックス（moltiplex) PCR
から成る群から選択された方法により増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がPCR により増幅される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記PCR のプロトコールが１時間以内に１つの増幅条件下で行われ、前記核酸の存在の決定が、45〜55℃で30秒間のアニーリング段階及び95℃にて１秒間の変性段階からなり延長段階のためのみの時間を含まない増幅サイクルにより行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試験サンプル、あるいは細菌及び／又は真菌培養物から直接に、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae)、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)から成る群から選択された微生物を、検出、同定及び／又は定量するための方法であって、
ａ）前記サンプルの、又は前記サンプルから単離された前記微生物の実質的に均一な集団の前記微生DNA を、不活性支持体に付着又は固定し、あるいは溶液中に置き、あるいは前記サンプル、又は前記サンプルから単離された微生物の実質的に均一な集団を不活性抗体上に接種し、そしてその場で、前記接種されたサンプル又は前記単離された微生物を細胞溶解して、前記微生物DNA を放出せしめ
前記微生物DNA は実質的に一本鎖型され；
ｂ）前記一本鎖DNA をプローブと接触せしめ、このプローブは配列番号：26, 27, 28, 29, 30, 120, 131〜134, 31, 140〜143, 23〜36, 120〜124 、これらの相補配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するこれらの部分、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つの一本鎖を含んで成り、前記配列は、それぞれ、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species)、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)の株又はそれらを代表する株と特異的及び普遍的にアニールするものであり、このアニールは前記プローブの核酸が前記微生物DNA とハイブリダイズすることができるものであり、これによりハイブリダイゼーション複合体が形成され；そして
ｃ）前記試験サンプル中の前記微生物の存在及び／又は量を示すものとして、前記不活性支持体上又は前記溶液中の前記ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１０】
試験サンプル中の、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)から成る群から選択された微生物の存在及び／又は量を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記微生物DNA の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができるものであり、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができるものであり、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるようなものであり、前記少なくとも１対のプライマーは、前記微生物に関してそれぞれ配列番号：26, 27, 28, 29, 30, 120, 131〜134, 31, 140〜143, 32〜36, 120〜124 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群内のヌクレオチド配列から選択され；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記サンプル中の前記微生物の存在及び／又は量を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１１】
前記プライマー対が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus) 、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candidaalbicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candida species)のそれぞれについて、それぞれ、配列番号：１と２，３と４，５と６，７と８，９と10，11と12，13と14，15と16，17〜21，21と22に定義されるものである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
試験サンプル、あるいは細菌培養物から直接に、細菌の存在及び／又は量を決定する方法において、
ａ）前記サンプルの、又は前記サンプルから単離された前記微生物の実質的に均一な集団の前記微生DNA を、不活性支持体に付着又は固定し、あるいは溶液中に置き、あるいは前記サンプル、又は前記サンプルから単離された微生物の実質的に均一な集団を不活性抗体上に接種し、そしてその場で、前記接種されたサンプル又は前記単離された微生物を細胞溶解して、前記微生物DNA を放出せしめ
前記微生物DNA は実質的に一本鎖型され；
ｂ）前記一本鎖DNA をプローブと接触せしめ、このプローブは配列番号：118, 119, 125〜171 、これらの相補配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するこれらの部分、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つの一本鎖を含んで成り、前記配列は、それぞれ、細菌種の株又はそれらを代表する株と特異的及び普遍的にアニールするものであり、このアニールは前記プローブの核酸が前記微生物DNA とハイブリダイズすることができるものであり、これによりハイブリダイゼーション複合体が形成され；そして
ｃ）前記試験サンプル中の前記微生物の存在及び／又は量を示すものとして、前記不活性支持体上又は前記溶液中の前記ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１３】
試験サンプル中の細菌の存在及び／又は量を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記微生物DNA の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができる、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるようなものであり、前記少なくとも１対のプライマーは、前記微生物に関してそれぞれ配列番号：118, 119, 125〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群内のヌクレオチド配列から選択され；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記サンプル中の前記微生物の存在及び／又は量を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１４】
前記プライマー対が配列番号：23及び24により定義される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
試験サンプル又は細菌培養物から直接に細菌のtuf 配列を得る方法であって、
ａ）前記サンプルを、配列番号：107 及び108 に定義するヌクレオチド配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するその部分、それに対して相補的な配列及びその変形体内で選択された配列を有するプライマー対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記微生物DNA の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；
ｃ）前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出し；そして
ｄ）DNA 配列決定法により前記増幅された標的配列のヌクレオチド配列を決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１６】
試験サンプル又は真菌培養物から直接に真菌の存在及び／又は量を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルの、又は前記サンプルから単離された前記真菌の実質的に均一な集団の前記真菌DNA を、不活性支持体に付着又は固定し、あるいは溶液中に置き、あるいは前記サンプル、又は前記サンプルから単離された真菌の実質的に均一な集団を不活性抗体上に接種し、そしてその場で、前記接種されたサンプル又は前記単離された真菌を細胞溶解して、前記真菌DNA を放出せしめ
前記真菌DNA は実質的に一本鎖型され；
ｂ）前記一本鎖DNA をプローブと接触せしめ、このプローブは配列番号： 120〜124 、これらの相補配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するこれらの部分、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つの一本鎖を含んで成り、前記配列は、真菌の株又はそれらを代表する株と特異的及び普遍的にアニールするものであり、このアニールは前記プローブの核酸が前記真菌DNA とハイブリダイズすることができるものであり、これによりハイブリダイゼーション複合体が形成され；そして
ｃ）前記試験サンプル中の前記真菌の存在及び／又は量を示すものとして、前記不活性支持体上又は前記溶液中の前記ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１７】
試験サンプル中の真菌の存在及び／又は量を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記真菌DNA の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり、前記少なくとも１対のプライマーは、配列番号： 120〜124 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群内のヌクレオチド配列から選択され；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記サンプル中の前記真菌の存在及び／又は量を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１８】
試験サンプル又は真菌培養物から直接に真菌のtuf 配列を得るための方法であって、
ａ）前記サンプルを、配列番号：109 及び172 、少なくとも12ヌクレオチド長を有するその部分、それらの配列に対して相補的な配列、及びそれらの変形体内で選択された配列を有するプライマー対を含んで成る水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記真菌tuf 遺伝子の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；
ｃ）前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出し；そして
ｄ）DNA 配列決定法により前記増幅された標的配列のヌクレオチド配列を決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１９】
試験サンプル又は細菌培養物から直接に、 blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択された細菌抗生物質耐性遺伝子により介在される細菌耐性の存在を評価することを含んで成る請求項１に記載の方法であって、
ａ）前記サンプルの、又は前記サンプルから単離された前記細菌の実質的に均一な集団の前記細菌DNA を、不活性支持体に付着又は固定し、あるいは溶液中に置き、あるいは前記サンプル、又は前記サンプルから単離された細菌の実質的に均一な集団を不活性抗体上に接種し、そしてその場で、前記接種されたサンプル又は前記単離された細菌を細胞溶解して、前記細菌DNA を放出せしめ
前記細菌DNA は実質的に一本鎖型され；
ｂ）前記一本鎖DNA をプローブと接触せしめ、このプローブは配列番号：110, 111, 112, 113, 114, 115，116, 117、これらの相補配列、少なくとも12ヌクレオチド長を有するこれらの部分、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つの一本鎖を含んで成り、前記配列は、それぞれ、前記細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるものであり；そして
ｃ）前記細菌抗生物質耐性遺伝子の１つにより介在される細菌耐性を示すものとして、ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２０】
試験サンプル又は細菌培養物から直接に、 blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択された細菌抗生物質耐性遺伝子により介在される細菌耐性の存在を評価することを含んで成る、請求項１に記載の方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、前記プライマーの一方は、標的配列を含有する前記細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり、前記少なくとも１対のプライマーは、前記細菌抗生物質耐性遺伝子に関してそれぞれ配列番号：110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群内のヌクレオチド配列から選択され；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記細菌抗生物質耐性遺伝子の１つにより介在される細菌耐性を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２１】
試験サンプル又は細菌培養物から直接に、 blatem， blashv， blarob， blaoxa，blaZ，andB，aacC1, aacC2, aacC3, aac6'−IIａ，aacAA, aub(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA, aac(6')-aph(2'')，vat, vga, ermA, ermB, ermC, mecA, int 及びsulから成る群から選択された抗生物質耐性遺伝子の存在を評価することを含んで成る、請求項１に記載の方法であって、
１）前記サンプルを、配列番号：37〜40, 41〜44, 45〜48, 49及び50, 51及び52, 53及び54, 55及び56, 57及び58, 59〜60, 61〜64, 65及び66, 173及び174, 67〜70, 71〜47, 75及び76, 77〜80, 81及び82, 83〜86, 87及び88, 89及び90, 91及び92, 93及び94, 95及び96, 97及び98, 99〜102, 103〜106 、少なくとも12ヌクレオチド長を有するその部分、それらに対して相補的な配列、それらの変形体、及びそれらの混合物から成る群から選択された配列を有するプライマーの少なくとも１つを含んで成る水溶液により処理し、少なくとも12ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対を含有する水溶液により処理し、
前記プライマーの一方は、標的配列を含有する各細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補的な鎖の一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前記プライマーの他方は、前記鎖の他方とハイブリダイズすることができ、こうして前記標的配列を含有する延長生成物が生成されるものであり；
ｂ）前記各プライマーの延長生成物を合成し、この延長生成物は標的配列を含有しており、そしてもし存在すればこの標的配列を検出可能なレベルに増幅し；そして
ｃ）前記細菌抗生物質耐性遺伝子の１つにより介在される細菌耐性を示すものとして、前記増幅された標的配列の存在及び／又は量を検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２２】
プローブ又はプライマーとしての、配列番号：26〜36, 111〜171 のいずれか１つのヌクレオチド配列、その部分、それに相補的な配列又はその変形体を有し、一本鎖形のとき、標的細菌又は真菌DNA に普遍的に及び特異的にハイブリダイズする核酸。
【請求項２３】
プローブ又はプライマーとしての、配列番号：１〜25，37〜109, 172〜174 のいずれか１つのヌクレオチド配列、その部分、それと相補的な配列又はその変形体を有し、標的細菌又は真菌DNA と普遍的に及び特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項22に記載の核酸を含んで成る組換えプラスミド。
【請求項２５】
請求項24に記載の組換えプラスミドにより形質転換された組換え宿主。
【請求項２６】
大腸菌である、請求項25に記載の組換え宿主。
【請求項２７】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candidaspecies)から成る群から選択された微生物種及び／又は属のいずれかの組合せの検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：26〜36, 120〜124, 131〜134, 140〜143 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの適当な組合せ、を含んで成るキット。
【請求項２８】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species) 、ストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)及びキャンディダ・スペーシス（Candidaspecies)から成る群から選択された微生物種及び／又は属のいずれかの組合せの検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：26〜36, 120〜124, 131〜134, 140〜143 、これらに相補的な配列及びこれらの変形体から成る群から選択されたプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項２９】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium) 、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ナイセリア・メニンギチティス（Neisseria meningitidis) 、スタフィロコッカス・サプロフィテカス（Staphylococcus saprophyficus)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae) 、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans) 、エンテロコッカス・スペーシス（Enterococcus species) 、ナイセリア・スペーシス（Neisseria species)、スタフィロコッカス・スペーシス（Staphylococcus species)及びストレプトコッカス・スペーシス（Streptococcus species)から成る群から選択された微生物種及び／又は属のいずれかの組合せの検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：１〜22、少なくとも12ヌクレオチドの長さを有するその部分、これらに相補的な配列及びこれらの変形体から成る群から選択されたプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３０】
blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択された細菌耐性遺伝子の任意の組合せ核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号： 110〜117 、これらに相補的な配列及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３１】
blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選ばれた細菌耐性遺伝子の任意の組合せ核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号： 110〜117 、これらの配列に対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３２】
blatem， blashv， blarob， blaoxa，blaZ，andB，aacC1, aacC2, aacC3, aac6'−IIａ，aacAA, aub(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA, aac(6')-aph(2'')，vat, vga, ermA, ermB, ermC, mecA, int 及びsul から成る群から選択された細菌耐性遺伝子の任意の組合せの核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：37〜106, 173及び174 、それらに対して相補的な配列、及びそれらの変形体から成る群から選ばれたプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３３】
細菌及び／又は真菌の核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであり、配列番号： 118〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３４】
細菌及び／又は真菌の核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号： 118〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せを含んで成るキット。
【請求項３５】
細菌の核酸の検出及び／又は定量のための診断キットであって、配列番号：23及び24、少なくとも12ヌクレオチド長のこれらの部分、これらの相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された配列を有するプライマー対を含んで成るキット。
【請求項３６】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のための、配列番号： 118〜171 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体を含んで成る群から選択された少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの任意の組合せをさらに含んで成る、請求項27に記載の診断キット。
【請求項３７】
細菌及び／又は真菌の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項28に記載の診断キット。
【請求項３８】
細菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号：23及び24、少なくとも12ヌクレオチド長のこれらの部分、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列のプライマー対をさらに含んで成る請求項29に記載の診断キット。
【請求項３９】
blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択されたいずれかの細菌抗生物質耐性遺伝子の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 110〜117 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの任意の組合せをさらに含んで成る、請求項27に記載の診断キット。
【請求項４０】
blaoxa，blaZ， aac6'−IIａ，ermA，ermB，ermC，vanB, vanCから成る群から選択された任意の細菌抗生物質耐性遺伝子の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 110〜117 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列中の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項28に記載の診断キット。
【請求項４１】
blatem, blashv， blarob， blaoxa，blaZ，andB，aacC1, aacC2, aacC3, aac6'−IIａ，aacAA, aub(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA, aac(6')-aph(2'')，vat, vga, ermA, ermB, ermC, mecA, int 及びsul から成る群から選択された任意の細菌抗生物質耐性遺伝子の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号：37〜106, 173及び174 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列内の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、遺伝子29に記載の診断キット。
【請求項４２】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択された配列内の少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項30に記載の診断キット。
【請求項４３】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列中の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項31に記載の診断キット。
【請求項４４】
細菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号：23及び24、少なくとも12ヌクレオチド長のこれらの部分、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド内のプライマーの任意の組合せをさらに含んで成る、請求項32に記載の診断キット。
【請求項４５】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列中の少なくとも12ヌクレオチド長のプローブの任意の組合せをさらに含んで成る、請求項39に記載の診断キット。
【請求項４６】
細菌及び／又は真菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号： 118〜171 、これらに対して相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド配列内の少なくとも12ヌクレオチド長のプライマーの適当な組合せをさらに含んで成る、請求項40に記載の診断キット。
【請求項４７】
細菌の核酸の同時的検出及び／又は定量のために、配列番号：23及び24、少なくとも12ヌクレオチド長のこれらの部分、これらに相補的な配列、及びこれらの変形体から成る群から選択されたヌクレオチド内のプライマー対をさらに含んで成る、請求項41に記載の診断キット。
【公開番号】特開２０１０−９４１３３（Ｐ２０１０−９４１３３Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−２９０６８３（Ｐ２００９−２９０６８３）
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【分割の表示】特願２００８−１５９６４６（Ｐ２００８−１５９６４６）の分割
【原出願日】平成９年１１月４日（１９９７．１１．４）
【出願人】（５０２１５５９７６）ジェネオーム サイエンシズ カナダ インコーポレイティド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９０６８３（Ｐ２００９−２９０６８３）
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【分割の表示】特願２００８−１５９６４６（Ｐ２００８−１５９６４６）の分割
【原出願日】平成９年１１月４日（１９９７．１１．４）
【出願人】（５０２１５５９７６）ジェネオーム サイエンシズ カナダ インコーポレイティド (2)
【Ｆターム（参考）】
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