微量セルの温度校正方法
【課題】微量セル内の測定対象試料の温度を正確に測定するための方法を提供する。
【解決手段】角セル内の温度（Ｔ１、Ｔ２・・・）を変化させ（Ｓ１０）、その温度毎にスペクトルが作成される（Ｓ１２）。スペクトルの主成分スコアを特性値（Ａ１、Ａ２・・・）として算出する（Ｓ１４、Ｓ１６）。キャピラリーセル内の温度とスコアとの値をプロットし検量線とする（Ｓ１８）。キャピラリーホルダ内の温度（Ｔ１、Ｔ２・・・）を変化させ（Ｓ２０）、その温度毎にスペクトルが作成される（Ｓ２２）。同様の手順で特性値（Ａ１、Ａ２・・・）を算出し（Ｓ２４）、検量線（検量式）を用いることによりキャピラリーセル内の温度（Ｔ０１、Ｔ０２・・・）を求める（Ｓ２６）。キャピラリーセル内の温度とキャピラリーホルダ内の温度とをプロットして校正曲線（校正式）とする。
【解決手段】角セル内の温度（Ｔ１、Ｔ２・・・）を変化させ（Ｓ１０）、その温度毎にスペクトルが作成される（Ｓ１２）。スペクトルの主成分スコアを特性値（Ａ１、Ａ２・・・）として算出する（Ｓ１４、Ｓ１６）。キャピラリーセル内の温度とスコアとの値をプロットし検量線とする（Ｓ１８）。キャピラリーホルダ内の温度（Ｔ１、Ｔ２・・・）を変化させ（Ｓ２０）、その温度毎にスペクトルが作成される（Ｓ２２）。同様の手順で特性値（Ａ１、Ａ２・・・）を算出し（Ｓ２４）、検量線（検量式）を用いることによりキャピラリーセル内の温度（Ｔ０１、Ｔ０２・・・）を求める（Ｓ２６）。キャピラリーセル内の温度とキャピラリーホルダ内の温度とをプロットして校正曲線（校正式）とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキャピラリーセル内の測定対象試料の温度校正方法、特に、容積が小さく温度センサーの挿入不能なキャピラリーセル内の測定対象試料の温度を、キャピラリーホルダ内の温度を校正することにより求める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分光光度計を用いた測定方法に温度変化測定、温度変化スペクトル測定と呼ばれている測定方法がある。この測定方法は、測定対象試料の温度を変化させながら、その吸光度あるいは吸収スペクトルを測定し、温度変化によって引き起こされる平衡状態の変化、構造の変化、あるいは電子状態の変化を調べる目的で実施されている。特に、ＤＮＡやタンパク質などの生体機能性高分子については、温度の上昇によってＤＮＡ鎖の二重らせん構造がとけるＤＮＡメルティングやタンパク質の熱変性を解析する研究目的のために広く行われている。
【０００３】
通常、この測定のためには分光光度計に付属品としてペルチェ恒温セルホルダを組み合わせた装置が用いられる。ペルチェ恒温セルホルダはセル内の測定対象試料の温度を変化させ、温度を変化させた後も測定対象試料の温度を一定に保つことができる。測定の際は測定対象試料を角セルに入れてこのペルチェ恒温セルホルダにセットし、その中に温度センサープローブ（以下、温度センサー）を入れて、測定対象試料の温度を直接測定しながら吸光度や吸収スペクトルを測定し、温度と吸光度あるいは温度と吸収スペクトルを測定し、温度と吸光度あるいは温度と吸収スペクトルを対にして取得する。この装置においては、測定対象試料の温度は測定対象試料の中に浸した温度センサーによって実測されるので、その正確さは温度センサーの校正のレベルで保証される。
【０００４】
ところが、測定対象試料のＤＮＡやタンパク質は、一般的には量を確保することが非常に困難である。これらの微小量しか確保できない測定対象試料について吸光度や吸収スペクトルだけを測定する場合には、内容積数十から十数μｌのミクロセル（微量セル）を用いることが極めて多い。そして、さらに微量の測定対象試料で測定ができるように工夫されたのが、内径１ｍｍ以下の細い石英管を試料容器として利用するキャピラリーセル測定である。キャピラリーセルは形状が円筒であるため照射位置が異なると光路長が変化し、得られた吸光度に不確かさが含まれるものの、検量線を用いた定量やスペクトルの形状を見るだけの分析には十分実用に耐えると評価されている。
【０００５】
このキャピラリーセルを温度変化測定や温度変化スペクトル測定にも利用することが求められている。そのために、角セルと同じ外形寸法を持ち、真中にキャピラリーセルを差し込んで固定する円筒形の穴を開け、さらにそのキャピラリーセルに測定光を通す光の通路を形成したキャピラリーホルダを作り、測定対象試料をキャピラリーセルの中に入れ、それをキャピラリーホルダに入れ、それをペルチェ恒温セルホルダにセットして測定を行うことが考えられる。
【０００６】
しかし、この装置ではキャピラリーセル内の温度を正確に測れないという重大な問題がある。通常温度を正確に測るためには、温度センサープローブをその測定対象試料の中に入れることが必要である。ところが、小さな内容積のセルの中の測定対象試料に測定光を邪魔しないようにプローブを差し込むことは非常に困難である。また、それにもまして内径１ｍｍ以下の細い管の中の測定対象試料にプローブを差し込むこと自体不可能である。
そのため、温度センサーをキャピラリーセルに差し込むことなくキャピラリーセル内の温度測定をしなくてはならない。
【０００７】
その代案として、キャピラリーホルダに温度センサーを差し込んでキャピラリーホルダの温度を測定し、それをもって測定対象試料の温度とみなす、あるいはそのキャピラリーホルダの温度から測定対象試料の温度を見積もるという方法をとることが考えられる。
【０００８】
そこで、発明者らは前者の方法でラムダファージのＤＮＡのメルティング測定を行った。
角セルを使った測定ではメルティング温度が８９．０７℃と得られたが、キャピラリーセルで行った測定では、９１．７２℃となり、２．６５℃の食い違いが生じた。これはキャピラリーセル内の温度がキャピラリーホルダ内の温度と一致していないことを示している。この偏りは、キャピラリーセルが石英製で温度が伝わりにくいためキャピラリーホルダの温度がキャピラリーセルに十分伝わりきれないか、あるいはキャピラリーセルの形状が非常に細い円筒状の形状であるため周囲の空気の影響を受けやすく、温度が伝わる過程で変わってしまったことなどによる系統誤差である。
【０００９】
また、後者の方法として、この誤差は温度に依存することから、このメルティング測定で得られた２．６５℃の偏りを補正値として使ってキャピラリーセルの温度に補正することも考えられるが十分な正確さが得られないので適切ではない。また、キャピラリーセルの位置に別の温度センサーを置き、キャピラリーホルダの温度を変えながら、キャピラリーセルの位置とキャピラリーホルダの両方の温度を同時に測定し、それらの間の関係を求めるという補正方法も考えられるが、そのような温度センサーとキャピラリーセルでは熱容量など熱的な特性が異なるために、この方法ではキャピラリーセルの温度の正確な測定が期待できない。
【００１０】
このような事情があって、どうしても温度を正確に測りたいという場合には、角セルで測るために必要となる量の測定対象試料を確保するために多大な努力がなされていた。また、十分な測定対象試料が確保できない場合には、温度の不確かさを無視して他の測定対象試料を用いて相対的に解析することが行われていた。
【００１１】
そこで、キャピラリーセルなどの容積が小さく温度センサーを挿入することのできない微量セルの中に温度センサーを差し込むことなく、微量セル内の測定対象試料の温度を正確に測定することのできる測定方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は前記従来技術に鑑みてなされたものであり、その目的は温度センサーを微量セル内に差し込むことなく微量セル内の測定対象試料の温度を正確に測定するため、精度の高い方法で微量セルが差し込まれたキャピラリーホルダ内の温度を校正することにより微量セル内の温度を求める方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、キャピラリーセル等の微量セルの中の温度を測定するために、サーモクロミズム特性を示す試料を使うことを考案した。この試料は温度によって色が変化するので、これを微量セル内に入れて試料の色変化を観察することにした。サーモクロミズム特性を示す試料による色彩の変化をスペクトルとして測定し、得られたスペクトルを分析することにより微量セル内の温度を測定することができる。
【００１４】
微量セルとしてキャピラリーセルを使用する場合は、例えば、図１のように１０ｍｍの角セルと同じ外形寸法を持ち、真中にキャピラリーセルを挿入できる構造を持たせたキャピラリーホルダを用いる。このキャピラリーホルダ１２をペルチェ恒温セルホルダの角セルの位置に入れ、キャピラリーホルダ１２にキャピラリーセル１０を嵌入し、温度センサーはキャピラリーホルダ１２に設けた穴１４に嵌入する。このようにすることにより、キャピラリーセルと温度センサーはキャピラリーホルダにより固定され、キャピラリーセル１０内の温度はキャピラリーホルダ１２に取り付けたセンサープローブにより間接的にモニタされる。
そして、キャピラリーホルダの温度を徐々に変化させていき、そのつど、本発明に係る測定方法を用いてキャピラリーセル（微量セル）内の温度を測定し、キャピラリーホルダ内の温度とキャピラリーセル内の温度とを、温度及び測定値（吸光度）を軸としたＸ−Ｙ平面上にプロットしていくことにより校正曲線が得られる。この校正曲線を利用すれば、キャピラリーホルダ内の温度を校正し、キャピラリーセル内の温度を求めることができる。
【００１５】
すなわち、請求項１に記載されているように、本発明に係る温度校正方法は、以下のように行われる。
容積が小さく直接容器内に温度センサーが挿入不能な微量セルと、該微量セル及び温度センサーを固定するキャピラリーホルダと、該キャピラリーホルダ内の温度を計測する温度センサーとを内部に含んだ試料室を備えた測定装置を用いた温度校正方法において、
前記微量セル内に温度変化に伴い色彩が変化するサーモクロミズム特性を示す試料を入れ、前記キャピラリーホルダ内の温度を複数回変化させ、温度を変化させる毎に該サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルを測定して該スペクトルを分析することにより前記微量セル内の温度を測定し、
前記キャピラリーホルダ内の温度と前記微量セル内の温度との相関関係により校正曲線を作成し、該校正曲線を用いて前記キャピラリーホルダ内の温度を前記微量セル内の温度に校正することを特徴としている。
【００１６】
また、キャピラリーホルダ内の温度を微量セル内の温度に校正するときに、計算処理により自動で校正を行うためには、キャピラリーホルダ内の温度から微量セル内の温度を計算するための校正式を求める必要がある。そのために、本発明に係る方法により作成された校正曲線を表示し、それと同時に多項式で表現される曲線を多項式の係数を調整することにより校正曲線にフィッティングし、多項式を校正曲線に近似することにより係数を求める。
【００１７】
すなわち、請求項２に記載されているように、本発明に係る温度校正方法は、
多項式の変数に前記キャピラリーホルダ内の温度を変化させたときの温度を従属変数とし、温度と前記スペクトルとを関連付ける特性値を独立変数としてそれぞれ代入し、
前記多項式の各項の係数を調整して前記校正曲線に近似させることにより校正式を得て、該校正式を用いて前記キャピラリーホルダ内の温度を前記微量セル内の温度に校正するのが好適である。
【００１８】
本発明はサーモクロミズム特性を示す試料を分光学的に分析することにより微量セル内の温度を測定している。サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルを温度に関連付けるためにスペクトルの特性値を計算することにした。この特性値はスペクトルの形状を反映したものとしなくてはならない。
特性値の算出方法としては、例えば、スペクトルの所定の波長範囲にベースラインを設定し、所定の波長間隔でスペクトルからベースラインを差し引くことによりスペクトルの数値データを得る。これらのスペクトル値列を主成分分析し、固有ベクトルと各ベクトルとの内積により主成分スコアを計算してそれを特性値として設定する。そして、この特性値とサーモクロミズム特性を示す試料の温度をプロットすることにより検量線を得る。
【００１９】
すなわち、請求項３に記載されているように、本発明に係る温度校正方法は、
温度センサーが挿入可能な光学セル内に前記サーモクロミズム特性を示す試料を入れてスペクトル測定し、
サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルの所定の波長又は波数範囲にベースラインを設定し、所定の間隔で該スペクトルから該ベースラインを差し引くことによりスペクトル値を得て、これらのスペクトル値列を主成分分析し、主成分スコアを計算して前記スペクトルの特性値としており、
前記サーモクロミズム特性を示す試料の温度を複数回変化させ、前記サーモクロミズム特性を示す試料の温度を変える毎に同様の手順により主成分スコアを計算して特性値を計算し、検量線を表示するためのＸ−Ｙ平面上の一つの軸をサーモクロミズム特性を示す試料の温度とし、もう一つの軸を対応する主成分スコアとしてプロットすることにより検量線を得て、該検量線を用いてサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルからサーモクロミズム特性を示す試料の温度を測定するのが好適である。
【００２０】
また、計算処理により自動でこの特性値から温度を知るためには、この検量線を表示し、それに多項式の係数を調整することにより近似させた検量式を求めておくことが必要となる。
【００２１】
すなわち、請求項４に記載されているように、本発明に係る温度校正方法は、
多項式の変数に前記容器内の温度を変化させたときの温度を従属変数とし、主成分スコアを独立変数としてそれぞれ代入し、
前記多項式の各項の係数を調整して前記検量線に近似させることにより検量式を得て、該検量式を用いてサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルからサーモクロミズム特性を示す試料の温度を測定するのが好適である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって、分光学的な測定を実施している最中に実施できなかった微小なセル内の温度が、校正によって正確に知ることができるようになり、数ｕｌの極めて微量な測定対象試料量で正確な温度変化測定、温度変化スペクトル測定ができるようになった。これによって微量の測定対象試料量しか確保できないＤＮＡやタンパク質などの生体機能性高分子の正確なメルティング測定や熱変性解析が可能になった。
【００２３】
また、スペクトルから得られるベクトル等の値を主成分分析し、温度とサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルとを関連付ける特性値を主成分スコアとしたことによりスペクトルの特徴が適切に反映されるので、スペクトルの温度以外が原因となる変動・偏りは排除され、サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルから算出される微量セル内の温度の精度についての信頼性を高めている。
【００２４】
また、特性値（主成分スコア）とサーモクロミズムを示す試料の温度の関係を表した検量線と、ホルダ内の温度と微量セル内の温度の関係を表した校正曲線を、それぞれ多項式の係数を調整することによりフィッティングして近似したものを検量式・校正式としたので、この検量式・校正式を使うことにより自動で計算処理することが可能となり、読み取り誤差をなくすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の方法を用いた光学的装置の構成を示した全体図である。
【図２】塩化コバルト水溶液の温度を２０℃と１００℃としたときのスペクトルをそれぞれ示した図である。
【図３】塩化コバルト水溶液の温度を２０℃と１００℃としたときの解析用のデータ点列を設定したときの操作の様子を示した説明図である。
【図４】解析用のデータ点列（スペクトルとベースラインの差分）に主成分分析を適用し、第１主軸をＸ軸、第２主軸をＹ軸にとって各データをプロットしたときの図である。
【図５】スペクトルの特性値と温度の関係を示す検量線を示した図である。
【図６】検量線について５次式を当てはめた場合の各項の係数を示した図である。
【図７】キャピラリーホルダ内の温度からキャピラリーセル内の温度に校正する校正曲線を示した図である。
【図８】校正曲線について５次式を当てはめた場合の各項の係数を示した図である。
【図９】本発明に係る方法の処理フローを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、キャピラリーセル内の温度を測定するためにキャピラリーセル内にサーモクロミズム特性を示す試料として塩化コバルトを液体温度計として使用し、本発明の方法により検量式を求めた。
なお、塩化コバルトは２つの化学種の間の化学平衡の移動によってスペクトルが変化する性質を持ち、肉眼では室温付近では赤色、高温では青色を示す。
【００２７】
（光学的装置の構成）
本発明の方法を用いた光学的装置の構成について説明する。
本発明の方法を用いた光学的装置は、試料室内に図１に示された細い円筒状の容器であるキャピラリーセル１０と、キャピラリーセル１０と温度センサーとを固定するキャピラリーホルダ１２と、温度センサーを挿入するための温度センサー用挿入口１４と、キャピラリーセル１０内の塩化コバルトへ光源からの光を透過させるための光路上に設けられた光路窓１６とを備える。
【００２８】
（スペクトル測定）
次に塩化コバルト水溶液の吸収スペクトルの測定について説明する。０．１ｍｏｌの硫酸コバルトと４．５ｍｏｌの塩化ナトリウムを含む１Ｌの水溶液を調整し、これを石英製の２ｍｍの角セルに入れ、分光光度計＋ペルチェ恒温セルホルダの装置にセットし、２０℃から１１０℃まで０．５℃/分の速さで温度を上げながら１℃ごとに可視部の吸収スペクトルを測定した。
このとき塩化コバルト水溶液の温度を角セル内に温度センサーを入れて測定した。得られた９１本のスペクトルのうち、２０℃と１００℃のものを図２に示した。温度が変化することによりスペクトルの形状と大きさが顕著に変化していることがわかる。
【００２９】
（特性値の算出）
次にこれらのスペクトルを温度と関連づけるための、スペクトルの「特性値」を計算した。特性値としてはスペクトルの特徴を反映し、温度と関連づけられるものなら様々な方法で算出することができる。例えば、短波長側（例えば５００ｎｍ付近）と長波長側（６８０ｎｍ付近）のピーク比、短波長側（例えば５００ｎｍ付近）と長波長側（６８０ｎｍ付近）の面積比、スペクトル面積、スペクトルの重心波長などが考えられる。ただし、スペクトルには温度とは直接関係していない変動、偏りなども含まれる可能性があり、特性値の選び方によっては信頼性に差が生じる。また、変動、偏りとして、スペクトルのベースラインの変動、水溶液の濃度の変化に起因する大きさの変動などが考えられる。
【００３０】
特性値に極力温度と関係のない変動や偏りが含まれないよう、特性値を以下の方法により算出した。
各スペクトルで４１０ｎｍと７８０ｎｍを直線で結んでベースラインとして差引き、ついで４５０ｎｍから７００ｎｍまでを５ｎｍ毎に平均し、できた５１個のスペクトルデータに対して５１／（データ値の総和）をかけて規格化して解析用のデータ点列とした。この操作の様子を図３に示した。上図が２０℃の場合で、下図が１００℃の場合を示している。
【００３１】
こうして作成された各温度に対応する９１個のスペクトル値に主成分分析を適用した。第１主軸をＸ軸、第２主軸をＹ軸にとって各データをプロットすると図４のようになる。Ｘ軸方向に広く分布しているので、ほとんどの場合第１主成分だけで温度が説明できることが図より確認できる。
【００３２】
（検量線の作成）
そこで、第１主成分の固有ベクトルと各ベクトルとの内積により主成分スコアを計算し、これを特性値とすることにした。この主成分スコアと実測の温度に対してプロットしたものが、スペクトルと温度の関係を示した検量線となる。このときの検量線を図５に示した。
【００３３】
（検量式の算出）
この検量線を使うと、塩化コバルト水溶液のスペクトルからその温度を求めることができる。ただし、毎回図から温度を読み取るのは面倒で手間がかかり、読み取り誤差が含まれることもあるので、多項式でフィッティングし、コンピュータ上で計算できるようにした。多項式としては５次式程度が好適である。図５の検量線について５次式を当てはめた場合の各項の係数を図６に示した。
【００３４】
（校正曲線の作成）
次に、キャピラリーホルダの温度からキャピラリーセル内の温度に換算する校正曲線を作成する。そのためにキャピラリーセルに全く同じ塩化コバルト水溶液を入れ、同じ測定をした。このとき温度センサーはキャピラリーホルダに取付け、その温度を測定する。また、得られた各温度でのスペクトルに検量線を作成したときと同様の操作をおこない、ベクトルを取り出した。それらと第１主成分の固有ベクトルとの内積をとって主成分スコアを算出した。そして、この主成分スコアを検量式に代入して温度を算出した。このようにして算出されたキャピラリーセル内の温度と、そのときのキャピラリーホルダ内の温度とをそれぞれ軸としてＸ−Ｙ平面上にプロットすることにより、キャピラリーホルダの温度からキャピラリーセル内の温度に校正する校正曲線が作成される。そのときの校正曲線を図７に示した。
【００３５】
（校正式の算出）
毎回図から温度を読み取るのは面倒で手間がかかり、読み取り誤差が含まれることもあるので、検量式と同様に多項式でフィッティングし、コンピュータ上で計算できるようにした。こちらも多項式としては５次程度が好適である。
図７の校正曲線について５次式を当てはめた場合の各項の係数を図８に示した。
【００３６】
（本発明に係る方法の処理フロー）
図９に本発明に係る方法の処理フローを示した。
本発明の方法における処理フローは大きく分けて２つに分けられる。角セルでの測定ではサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルと角セル内の温度との関係から検量線（検量式）が求められる。
また、キャピラリーセルでの測定では作成された検量線（検量式）を用いて、ホルダ内の温度とキャピラリーセル内の温度との関係を示す校正曲線（校正式）が求められる。
【００３７】
角セルでの測定では、角セル内の温度（Ｔ１、Ｔ２・・・）を変化させていき（Ｓ１０）、その温度毎にサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルが作成される（Ｓ１２）。スペクトルの特徴を表すものとして、例えば、ある波長の吸光度（Ａｂｓ）や２波長のＡｂｓ比等を主成分分析して、主成分スコアを特性値（Ａ１、Ａ２・・・）として算出する（Ｓ１４、Ｓ１６）。そして、キャピラリーセル内の温度と主成分スコアとの値をＸ−Ｙ平面上にプロットし検量線とする（Ｓ１８）。
【００３８】
キャピラリーセル内の測定では、キャピラリーホルダ内の温度（Ｔ１、Ｔ２・・・）を変化させていき（Ｓ２０）、その温度毎にキャピラリーセルのサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルが作成される（Ｓ２２）。角セルでの測定と同様の手順で特性値（Ａ１、Ａ２・・・）を算出し（Ｓ２４）、検量線（検量式）を用いることによりキャピラリーセル内の温度（Ｔ０１、Ｔ０２・・・）を求める（Ｓ２６）。キャピラリーセル内の温度とキャピラリーホルダ内の温度とをプロットすることにより、両者の関係を示した校正曲線（校正式）とする。
【符号の説明】
【００３９】
１０・・・キャピラリーセル
１２・・・キャピラリーホルダ
１４・・・温度センサー用挿入口
１６・・・光路窓
１８ａ、１８ｂ・・・レンズ
【技術分野】
【０００１】
本発明はキャピラリーセル内の測定対象試料の温度校正方法、特に、容積が小さく温度センサーの挿入不能なキャピラリーセル内の測定対象試料の温度を、キャピラリーホルダ内の温度を校正することにより求める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分光光度計を用いた測定方法に温度変化測定、温度変化スペクトル測定と呼ばれている測定方法がある。この測定方法は、測定対象試料の温度を変化させながら、その吸光度あるいは吸収スペクトルを測定し、温度変化によって引き起こされる平衡状態の変化、構造の変化、あるいは電子状態の変化を調べる目的で実施されている。特に、ＤＮＡやタンパク質などの生体機能性高分子については、温度の上昇によってＤＮＡ鎖の二重らせん構造がとけるＤＮＡメルティングやタンパク質の熱変性を解析する研究目的のために広く行われている。
【０００３】
通常、この測定のためには分光光度計に付属品としてペルチェ恒温セルホルダを組み合わせた装置が用いられる。ペルチェ恒温セルホルダはセル内の測定対象試料の温度を変化させ、温度を変化させた後も測定対象試料の温度を一定に保つことができる。測定の際は測定対象試料を角セルに入れてこのペルチェ恒温セルホルダにセットし、その中に温度センサープローブ（以下、温度センサー）を入れて、測定対象試料の温度を直接測定しながら吸光度や吸収スペクトルを測定し、温度と吸光度あるいは温度と吸収スペクトルを測定し、温度と吸光度あるいは温度と吸収スペクトルを対にして取得する。この装置においては、測定対象試料の温度は測定対象試料の中に浸した温度センサーによって実測されるので、その正確さは温度センサーの校正のレベルで保証される。
【０００４】
ところが、測定対象試料のＤＮＡやタンパク質は、一般的には量を確保することが非常に困難である。これらの微小量しか確保できない測定対象試料について吸光度や吸収スペクトルだけを測定する場合には、内容積数十から十数μｌのミクロセル（微量セル）を用いることが極めて多い。そして、さらに微量の測定対象試料で測定ができるように工夫されたのが、内径１ｍｍ以下の細い石英管を試料容器として利用するキャピラリーセル測定である。キャピラリーセルは形状が円筒であるため照射位置が異なると光路長が変化し、得られた吸光度に不確かさが含まれるものの、検量線を用いた定量やスペクトルの形状を見るだけの分析には十分実用に耐えると評価されている。
【０００５】
このキャピラリーセルを温度変化測定や温度変化スペクトル測定にも利用することが求められている。そのために、角セルと同じ外形寸法を持ち、真中にキャピラリーセルを差し込んで固定する円筒形の穴を開け、さらにそのキャピラリーセルに測定光を通す光の通路を形成したキャピラリーホルダを作り、測定対象試料をキャピラリーセルの中に入れ、それをキャピラリーホルダに入れ、それをペルチェ恒温セルホルダにセットして測定を行うことが考えられる。
【０００６】
しかし、この装置ではキャピラリーセル内の温度を正確に測れないという重大な問題がある。通常温度を正確に測るためには、温度センサープローブをその測定対象試料の中に入れることが必要である。ところが、小さな内容積のセルの中の測定対象試料に測定光を邪魔しないようにプローブを差し込むことは非常に困難である。また、それにもまして内径１ｍｍ以下の細い管の中の測定対象試料にプローブを差し込むこと自体不可能である。
そのため、温度センサーをキャピラリーセルに差し込むことなくキャピラリーセル内の温度測定をしなくてはならない。
【０００７】
その代案として、キャピラリーホルダに温度センサーを差し込んでキャピラリーホルダの温度を測定し、それをもって測定対象試料の温度とみなす、あるいはそのキャピラリーホルダの温度から測定対象試料の温度を見積もるという方法をとることが考えられる。
【０００８】
そこで、発明者らは前者の方法でラムダファージのＤＮＡのメルティング測定を行った。
角セルを使った測定ではメルティング温度が８９．０７℃と得られたが、キャピラリーセルで行った測定では、９１．７２℃となり、２．６５℃の食い違いが生じた。これはキャピラリーセル内の温度がキャピラリーホルダ内の温度と一致していないことを示している。この偏りは、キャピラリーセルが石英製で温度が伝わりにくいためキャピラリーホルダの温度がキャピラリーセルに十分伝わりきれないか、あるいはキャピラリーセルの形状が非常に細い円筒状の形状であるため周囲の空気の影響を受けやすく、温度が伝わる過程で変わってしまったことなどによる系統誤差である。
【０００９】
また、後者の方法として、この誤差は温度に依存することから、このメルティング測定で得られた２．６５℃の偏りを補正値として使ってキャピラリーセルの温度に補正することも考えられるが十分な正確さが得られないので適切ではない。また、キャピラリーセルの位置に別の温度センサーを置き、キャピラリーホルダの温度を変えながら、キャピラリーセルの位置とキャピラリーホルダの両方の温度を同時に測定し、それらの間の関係を求めるという補正方法も考えられるが、そのような温度センサーとキャピラリーセルでは熱容量など熱的な特性が異なるために、この方法ではキャピラリーセルの温度の正確な測定が期待できない。
【００１０】
このような事情があって、どうしても温度を正確に測りたいという場合には、角セルで測るために必要となる量の測定対象試料を確保するために多大な努力がなされていた。また、十分な測定対象試料が確保できない場合には、温度の不確かさを無視して他の測定対象試料を用いて相対的に解析することが行われていた。
【００１１】
そこで、キャピラリーセルなどの容積が小さく温度センサーを挿入することのできない微量セルの中に温度センサーを差し込むことなく、微量セル内の測定対象試料の温度を正確に測定することのできる測定方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は前記従来技術に鑑みてなされたものであり、その目的は温度センサーを微量セル内に差し込むことなく微量セル内の測定対象試料の温度を正確に測定するため、精度の高い方法で微量セルが差し込まれたキャピラリーホルダ内の温度を校正することにより微量セル内の温度を求める方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、キャピラリーセル等の微量セルの中の温度を測定するために、サーモクロミズム特性を示す試料を使うことを考案した。この試料は温度によって色が変化するので、これを微量セル内に入れて試料の色変化を観察することにした。サーモクロミズム特性を示す試料による色彩の変化をスペクトルとして測定し、得られたスペクトルを分析することにより微量セル内の温度を測定することができる。
【００１４】
微量セルとしてキャピラリーセルを使用する場合は、例えば、図１のように１０ｍｍの角セルと同じ外形寸法を持ち、真中にキャピラリーセルを挿入できる構造を持たせたキャピラリーホルダを用いる。このキャピラリーホルダ１２をペルチェ恒温セルホルダの角セルの位置に入れ、キャピラリーホルダ１２にキャピラリーセル１０を嵌入し、温度センサーはキャピラリーホルダ１２に設けた穴１４に嵌入する。このようにすることにより、キャピラリーセルと温度センサーはキャピラリーホルダにより固定され、キャピラリーセル１０内の温度はキャピラリーホルダ１２に取り付けたセンサープローブにより間接的にモニタされる。
そして、キャピラリーホルダの温度を徐々に変化させていき、そのつど、本発明に係る測定方法を用いてキャピラリーセル（微量セル）内の温度を測定し、キャピラリーホルダ内の温度とキャピラリーセル内の温度とを、温度及び測定値（吸光度）を軸としたＸ−Ｙ平面上にプロットしていくことにより校正曲線が得られる。この校正曲線を利用すれば、キャピラリーホルダ内の温度を校正し、キャピラリーセル内の温度を求めることができる。
【００１５】
すなわち、請求項１に記載されているように、本発明に係る温度校正方法は、以下のように行われる。
容積が小さく直接容器内に温度センサーが挿入不能な微量セルと、該微量セル及び温度センサーを固定するキャピラリーホルダと、該キャピラリーホルダ内の温度を計測する温度センサーとを内部に含んだ試料室を備えた測定装置を用いた温度校正方法において、
前記微量セル内に温度変化に伴い色彩が変化するサーモクロミズム特性を示す試料を入れ、前記キャピラリーホルダ内の温度を複数回変化させ、温度を変化させる毎に該サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルを測定して該スペクトルを分析することにより前記微量セル内の温度を測定し、
前記キャピラリーホルダ内の温度と前記微量セル内の温度との相関関係により校正曲線を作成し、該校正曲線を用いて前記キャピラリーホルダ内の温度を前記微量セル内の温度に校正することを特徴としている。
【００１６】
また、キャピラリーホルダ内の温度を微量セル内の温度に校正するときに、計算処理により自動で校正を行うためには、キャピラリーホルダ内の温度から微量セル内の温度を計算するための校正式を求める必要がある。そのために、本発明に係る方法により作成された校正曲線を表示し、それと同時に多項式で表現される曲線を多項式の係数を調整することにより校正曲線にフィッティングし、多項式を校正曲線に近似することにより係数を求める。
【００１７】
すなわち、請求項２に記載されているように、本発明に係る温度校正方法は、
多項式の変数に前記キャピラリーホルダ内の温度を変化させたときの温度を従属変数とし、温度と前記スペクトルとを関連付ける特性値を独立変数としてそれぞれ代入し、
前記多項式の各項の係数を調整して前記校正曲線に近似させることにより校正式を得て、該校正式を用いて前記キャピラリーホルダ内の温度を前記微量セル内の温度に校正するのが好適である。
【００１８】
本発明はサーモクロミズム特性を示す試料を分光学的に分析することにより微量セル内の温度を測定している。サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルを温度に関連付けるためにスペクトルの特性値を計算することにした。この特性値はスペクトルの形状を反映したものとしなくてはならない。
特性値の算出方法としては、例えば、スペクトルの所定の波長範囲にベースラインを設定し、所定の波長間隔でスペクトルからベースラインを差し引くことによりスペクトルの数値データを得る。これらのスペクトル値列を主成分分析し、固有ベクトルと各ベクトルとの内積により主成分スコアを計算してそれを特性値として設定する。そして、この特性値とサーモクロミズム特性を示す試料の温度をプロットすることにより検量線を得る。
【００１９】
すなわち、請求項３に記載されているように、本発明に係る温度校正方法は、
温度センサーが挿入可能な光学セル内に前記サーモクロミズム特性を示す試料を入れてスペクトル測定し、
サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルの所定の波長又は波数範囲にベースラインを設定し、所定の間隔で該スペクトルから該ベースラインを差し引くことによりスペクトル値を得て、これらのスペクトル値列を主成分分析し、主成分スコアを計算して前記スペクトルの特性値としており、
前記サーモクロミズム特性を示す試料の温度を複数回変化させ、前記サーモクロミズム特性を示す試料の温度を変える毎に同様の手順により主成分スコアを計算して特性値を計算し、検量線を表示するためのＸ−Ｙ平面上の一つの軸をサーモクロミズム特性を示す試料の温度とし、もう一つの軸を対応する主成分スコアとしてプロットすることにより検量線を得て、該検量線を用いてサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルからサーモクロミズム特性を示す試料の温度を測定するのが好適である。
【００２０】
また、計算処理により自動でこの特性値から温度を知るためには、この検量線を表示し、それに多項式の係数を調整することにより近似させた検量式を求めておくことが必要となる。
【００２１】
すなわち、請求項４に記載されているように、本発明に係る温度校正方法は、
多項式の変数に前記容器内の温度を変化させたときの温度を従属変数とし、主成分スコアを独立変数としてそれぞれ代入し、
前記多項式の各項の係数を調整して前記検量線に近似させることにより検量式を得て、該検量式を用いてサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルからサーモクロミズム特性を示す試料の温度を測定するのが好適である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって、分光学的な測定を実施している最中に実施できなかった微小なセル内の温度が、校正によって正確に知ることができるようになり、数ｕｌの極めて微量な測定対象試料量で正確な温度変化測定、温度変化スペクトル測定ができるようになった。これによって微量の測定対象試料量しか確保できないＤＮＡやタンパク質などの生体機能性高分子の正確なメルティング測定や熱変性解析が可能になった。
【００２３】
また、スペクトルから得られるベクトル等の値を主成分分析し、温度とサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルとを関連付ける特性値を主成分スコアとしたことによりスペクトルの特徴が適切に反映されるので、スペクトルの温度以外が原因となる変動・偏りは排除され、サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルから算出される微量セル内の温度の精度についての信頼性を高めている。
【００２４】
また、特性値（主成分スコア）とサーモクロミズムを示す試料の温度の関係を表した検量線と、ホルダ内の温度と微量セル内の温度の関係を表した校正曲線を、それぞれ多項式の係数を調整することによりフィッティングして近似したものを検量式・校正式としたので、この検量式・校正式を使うことにより自動で計算処理することが可能となり、読み取り誤差をなくすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の方法を用いた光学的装置の構成を示した全体図である。
【図２】塩化コバルト水溶液の温度を２０℃と１００℃としたときのスペクトルをそれぞれ示した図である。
【図３】塩化コバルト水溶液の温度を２０℃と１００℃としたときの解析用のデータ点列を設定したときの操作の様子を示した説明図である。
【図４】解析用のデータ点列（スペクトルとベースラインの差分）に主成分分析を適用し、第１主軸をＸ軸、第２主軸をＹ軸にとって各データをプロットしたときの図である。
【図５】スペクトルの特性値と温度の関係を示す検量線を示した図である。
【図６】検量線について５次式を当てはめた場合の各項の係数を示した図である。
【図７】キャピラリーホルダ内の温度からキャピラリーセル内の温度に校正する校正曲線を示した図である。
【図８】校正曲線について５次式を当てはめた場合の各項の係数を示した図である。
【図９】本発明に係る方法の処理フローを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、キャピラリーセル内の温度を測定するためにキャピラリーセル内にサーモクロミズム特性を示す試料として塩化コバルトを液体温度計として使用し、本発明の方法により検量式を求めた。
なお、塩化コバルトは２つの化学種の間の化学平衡の移動によってスペクトルが変化する性質を持ち、肉眼では室温付近では赤色、高温では青色を示す。
【００２７】
（光学的装置の構成）
本発明の方法を用いた光学的装置の構成について説明する。
本発明の方法を用いた光学的装置は、試料室内に図１に示された細い円筒状の容器であるキャピラリーセル１０と、キャピラリーセル１０と温度センサーとを固定するキャピラリーホルダ１２と、温度センサーを挿入するための温度センサー用挿入口１４と、キャピラリーセル１０内の塩化コバルトへ光源からの光を透過させるための光路上に設けられた光路窓１６とを備える。
【００２８】
（スペクトル測定）
次に塩化コバルト水溶液の吸収スペクトルの測定について説明する。０．１ｍｏｌの硫酸コバルトと４．５ｍｏｌの塩化ナトリウムを含む１Ｌの水溶液を調整し、これを石英製の２ｍｍの角セルに入れ、分光光度計＋ペルチェ恒温セルホルダの装置にセットし、２０℃から１１０℃まで０．５℃/分の速さで温度を上げながら１℃ごとに可視部の吸収スペクトルを測定した。
このとき塩化コバルト水溶液の温度を角セル内に温度センサーを入れて測定した。得られた９１本のスペクトルのうち、２０℃と１００℃のものを図２に示した。温度が変化することによりスペクトルの形状と大きさが顕著に変化していることがわかる。
【００２９】
（特性値の算出）
次にこれらのスペクトルを温度と関連づけるための、スペクトルの「特性値」を計算した。特性値としてはスペクトルの特徴を反映し、温度と関連づけられるものなら様々な方法で算出することができる。例えば、短波長側（例えば５００ｎｍ付近）と長波長側（６８０ｎｍ付近）のピーク比、短波長側（例えば５００ｎｍ付近）と長波長側（６８０ｎｍ付近）の面積比、スペクトル面積、スペクトルの重心波長などが考えられる。ただし、スペクトルには温度とは直接関係していない変動、偏りなども含まれる可能性があり、特性値の選び方によっては信頼性に差が生じる。また、変動、偏りとして、スペクトルのベースラインの変動、水溶液の濃度の変化に起因する大きさの変動などが考えられる。
【００３０】
特性値に極力温度と関係のない変動や偏りが含まれないよう、特性値を以下の方法により算出した。
各スペクトルで４１０ｎｍと７８０ｎｍを直線で結んでベースラインとして差引き、ついで４５０ｎｍから７００ｎｍまでを５ｎｍ毎に平均し、できた５１個のスペクトルデータに対して５１／（データ値の総和）をかけて規格化して解析用のデータ点列とした。この操作の様子を図３に示した。上図が２０℃の場合で、下図が１００℃の場合を示している。
【００３１】
こうして作成された各温度に対応する９１個のスペクトル値に主成分分析を適用した。第１主軸をＸ軸、第２主軸をＹ軸にとって各データをプロットすると図４のようになる。Ｘ軸方向に広く分布しているので、ほとんどの場合第１主成分だけで温度が説明できることが図より確認できる。
【００３２】
（検量線の作成）
そこで、第１主成分の固有ベクトルと各ベクトルとの内積により主成分スコアを計算し、これを特性値とすることにした。この主成分スコアと実測の温度に対してプロットしたものが、スペクトルと温度の関係を示した検量線となる。このときの検量線を図５に示した。
【００３３】
（検量式の算出）
この検量線を使うと、塩化コバルト水溶液のスペクトルからその温度を求めることができる。ただし、毎回図から温度を読み取るのは面倒で手間がかかり、読み取り誤差が含まれることもあるので、多項式でフィッティングし、コンピュータ上で計算できるようにした。多項式としては５次式程度が好適である。図５の検量線について５次式を当てはめた場合の各項の係数を図６に示した。
【００３４】
（校正曲線の作成）
次に、キャピラリーホルダの温度からキャピラリーセル内の温度に換算する校正曲線を作成する。そのためにキャピラリーセルに全く同じ塩化コバルト水溶液を入れ、同じ測定をした。このとき温度センサーはキャピラリーホルダに取付け、その温度を測定する。また、得られた各温度でのスペクトルに検量線を作成したときと同様の操作をおこない、ベクトルを取り出した。それらと第１主成分の固有ベクトルとの内積をとって主成分スコアを算出した。そして、この主成分スコアを検量式に代入して温度を算出した。このようにして算出されたキャピラリーセル内の温度と、そのときのキャピラリーホルダ内の温度とをそれぞれ軸としてＸ−Ｙ平面上にプロットすることにより、キャピラリーホルダの温度からキャピラリーセル内の温度に校正する校正曲線が作成される。そのときの校正曲線を図７に示した。
【００３５】
（校正式の算出）
毎回図から温度を読み取るのは面倒で手間がかかり、読み取り誤差が含まれることもあるので、検量式と同様に多項式でフィッティングし、コンピュータ上で計算できるようにした。こちらも多項式としては５次程度が好適である。
図７の校正曲線について５次式を当てはめた場合の各項の係数を図８に示した。
【００３６】
（本発明に係る方法の処理フロー）
図９に本発明に係る方法の処理フローを示した。
本発明の方法における処理フローは大きく分けて２つに分けられる。角セルでの測定ではサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルと角セル内の温度との関係から検量線（検量式）が求められる。
また、キャピラリーセルでの測定では作成された検量線（検量式）を用いて、ホルダ内の温度とキャピラリーセル内の温度との関係を示す校正曲線（校正式）が求められる。
【００３７】
角セルでの測定では、角セル内の温度（Ｔ１、Ｔ２・・・）を変化させていき（Ｓ１０）、その温度毎にサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルが作成される（Ｓ１２）。スペクトルの特徴を表すものとして、例えば、ある波長の吸光度（Ａｂｓ）や２波長のＡｂｓ比等を主成分分析して、主成分スコアを特性値（Ａ１、Ａ２・・・）として算出する（Ｓ１４、Ｓ１６）。そして、キャピラリーセル内の温度と主成分スコアとの値をＸ−Ｙ平面上にプロットし検量線とする（Ｓ１８）。
【００３８】
キャピラリーセル内の測定では、キャピラリーホルダ内の温度（Ｔ１、Ｔ２・・・）を変化させていき（Ｓ２０）、その温度毎にキャピラリーセルのサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルが作成される（Ｓ２２）。角セルでの測定と同様の手順で特性値（Ａ１、Ａ２・・・）を算出し（Ｓ２４）、検量線（検量式）を用いることによりキャピラリーセル内の温度（Ｔ０１、Ｔ０２・・・）を求める（Ｓ２６）。キャピラリーセル内の温度とキャピラリーホルダ内の温度とをプロットすることにより、両者の関係を示した校正曲線（校正式）とする。
【符号の説明】
【００３９】
１０・・・キャピラリーセル
１２・・・キャピラリーホルダ
１４・・・温度センサー用挿入口
１６・・・光路窓
１８ａ、１８ｂ・・・レンズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容積が小さく直接容器内に温度センサーが挿入不能な微量セルと、該微量セル及び温度センサーを固定するキャピラリーホルダと、該キャピラリーホルダ内の温度を計測する温度センサーとを内部に含んだ試料室を備えた測定装置を用いた温度校正方法において、
前記微量セル内に温度変化に伴い色彩が変化するサーモクロミズム特性を示す試料を入れ、前記キャピラリーホルダ内の温度を複数回変化させ、温度を変化させる毎に該サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルを測定して該スペクトルを分析することにより前記微量セル内の温度を測定し、
前記キャピラリーホルダ内の温度と前記微量セル内の温度との相関関係により校正曲線を作成し、該校正曲線を用いて前記キャピラリーホルダ内の温度を前記微量セル内の温度に校正することを特徴とする温度校正方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
多項式の変数に前記キャピラリーホルダ内の温度を変化させたときの温度を従属変数とし、温度と前記スペクトルとを関連付ける特性値を独立変数としてそれぞれ代入し、
前記多項式の各項の係数を調整して前記校正曲線に近似させることにより校正式を得て、該校正式を用いて前記キャピラリーホルダ内の温度を前記微量セル内の温度に校正することを特徴とする温度校正方法。
【請求項３】
請求項１の方法において、
温度センサーが挿入可能な光学セル内に前記サーモクロミズム特性を示す試料を入れてスペクトル測定し、
サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルの所定の波長又は波数範囲にベースラインを設定し、所定の間隔で該スペクトルから該ベースラインを差し引くことによりスペクトル値を得て、これらのスペクトル値列を主成分分析し、主成分スコアを計算して前記スペクトルの特性値としており、
前記サーモクロミズム特性を示す試料の温度を複数回変化させ、前記サーモクロミズム特性を示す試料の温度を変える毎に同様の手順により主成分スコアを計算して特性値を計算し、検量線を表示するためのＸ−Ｙ平面上の一つの軸をサーモクロミズム特性を示す試料の温度とし、もう一つの軸を対応する主成分スコアとしてプロットすることにより検量線を得て、該検量線を用いてサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルからサーモクロミズム特性を示す試料の温度を測定することを特徴とする温度校正方法。
【請求項４】
請求項３の方法において、
多項式の変数に前記容器内の温度を変化させたときの温度を従属変数とし、主成分スコアを独立変数としてそれぞれ代入し、
前記多項式の各項の係数を調整して前記検量線に近似させることにより検量式を得て、該検量式を用いてサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルからサーモクロミズム特性を示す試料の温度を測定することを特徴とする温度校正方法。
【請求項１】
容積が小さく直接容器内に温度センサーが挿入不能な微量セルと、該微量セル及び温度センサーを固定するキャピラリーホルダと、該キャピラリーホルダ内の温度を計測する温度センサーとを内部に含んだ試料室を備えた測定装置を用いた温度校正方法において、
前記微量セル内に温度変化に伴い色彩が変化するサーモクロミズム特性を示す試料を入れ、前記キャピラリーホルダ内の温度を複数回変化させ、温度を変化させる毎に該サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルを測定して該スペクトルを分析することにより前記微量セル内の温度を測定し、
前記キャピラリーホルダ内の温度と前記微量セル内の温度との相関関係により校正曲線を作成し、該校正曲線を用いて前記キャピラリーホルダ内の温度を前記微量セル内の温度に校正することを特徴とする温度校正方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
多項式の変数に前記キャピラリーホルダ内の温度を変化させたときの温度を従属変数とし、温度と前記スペクトルとを関連付ける特性値を独立変数としてそれぞれ代入し、
前記多項式の各項の係数を調整して前記校正曲線に近似させることにより校正式を得て、該校正式を用いて前記キャピラリーホルダ内の温度を前記微量セル内の温度に校正することを特徴とする温度校正方法。
【請求項３】
請求項１の方法において、
温度センサーが挿入可能な光学セル内に前記サーモクロミズム特性を示す試料を入れてスペクトル測定し、
サーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルの所定の波長又は波数範囲にベースラインを設定し、所定の間隔で該スペクトルから該ベースラインを差し引くことによりスペクトル値を得て、これらのスペクトル値列を主成分分析し、主成分スコアを計算して前記スペクトルの特性値としており、
前記サーモクロミズム特性を示す試料の温度を複数回変化させ、前記サーモクロミズム特性を示す試料の温度を変える毎に同様の手順により主成分スコアを計算して特性値を計算し、検量線を表示するためのＸ−Ｙ平面上の一つの軸をサーモクロミズム特性を示す試料の温度とし、もう一つの軸を対応する主成分スコアとしてプロットすることにより検量線を得て、該検量線を用いてサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルからサーモクロミズム特性を示す試料の温度を測定することを特徴とする温度校正方法。
【請求項４】
請求項３の方法において、
多項式の変数に前記容器内の温度を変化させたときの温度を従属変数とし、主成分スコアを独立変数としてそれぞれ代入し、
前記多項式の各項の係数を調整して前記検量線に近似させることにより検量式を得て、該検量式を用いてサーモクロミズム特性を示す試料のスペクトルからサーモクロミズム特性を示す試料の温度を測定することを特徴とする温度校正方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−５２８３０（Ｐ２０１２−５２８３０Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９３５４９（Ｐ２０１０−１９３５４９）
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（０００２３２６８９）日本分光株式会社 (87)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（０００２３２６８９）日本分光株式会社 (87)
【Ｆターム（参考）】
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