心血管疾患の予測および治療のためのオステオポンチン
心血管疾患の予測および治療のためのオステオポンチン。本発明は、心血管疾患または合併症の治療のための内皮前駆細胞（ＥＰＣ）およびオステオポンチンの使用に関する。本発明はまた、これらの心血管合併症の発症の危険性のマーカーとしてのＥＰＣオステオポンチンレベルの使用にも関する。特に、本発明は、オステオポンチンおよびオステオポンチンをコードする遺伝子に基づく組成物および方法を提供する。本発明者らは、オステオポンチン欠損が糖尿病性ＥＰＣ機能不全において機構的な役割を果たすことを示し、糖尿病性血管疾患において標的化できる新たな治療経路を同定した。同様に、本発明者らは、心血管疾患におけるＯＰＮの役割も示した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管疾患または合併症の治療のための内皮前駆細胞（ＥＰＣ）およびオステオポンチンの使用に関する。本発明はまた、これらの心血管合併症の発症の危険性のマーカーとしてのＥＰＣオステオポンチンレベルの使用にも関する。特に、本発明は、オステオポンチンおよびオステオポンチンをコードする遺伝子に基づく組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
１９９７年のAsaharaらによる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の発見は、多くの血管疾患状態（例えば、虚血、再狭窄および肺高血圧）の病因に関する見識を提供してきた１〜６（非特許文献１〜非特許文献６）。Urbichらは最近、内皮細胞へと分化変換する能力を有する高度に増殖性の非内皮細胞としてＥＰＣを規定している７。ＥＰＣは、骨髄、末梢血および臍帯血を含む種々の供給源から単離できる８〜１０。ＥＰＣには２つの表現型（初期対後期のＥＰＣ）が存在し、これらは共に別個の増殖能および血管形成能を有する８、１１。フィブロネクチンなどのマトリックス分子に接着し、ａｃＬＤＬを取り込み、レクチンを結合する能力は、依然としてＥＰＣについて一般に使用される定義であるが、種々のマーカー（例えば、造血マーカーおよび内皮マーカー）を用いたさらなるフローサイトメトリー分析および免疫染色が、ＥＰＣを規定するために益々利用されている１２〜１５。
【０００３】
１型１６および２型１７、１８の糖尿病を有する患者は、健常志願者と比較してＥＰＣの数がより少ない。末梢血管疾患を合併した２型糖尿病を有する患者は、合併症を有さない患者と比較して、ＥＰＣの数がさらに少ない１８。これらの患者におけるＥＰＣ数は、血糖コントロールと逆相関する１６〜１８。２型糖尿病を有する患者から単離されたＥＰＣでは、活性化した内皮細胞ならびにコラーゲンおよびフィブロネクチンなどのマトリックス分子との接着が低下していた１７。両方の型の糖尿病を有する患者由来のＥＰＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細管を形成する能力が損なわれている１６、１７。さらに、ストレプトゾトシン誘導された糖尿病マウス由来の骨髄単核細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＰＣにあまり効率よく分化せず、非糖尿病マウス由来の骨髄単核細胞よりも細管を形成する可能性が低い１９。１型糖尿病を有する患者から単離したＥＰＣ由来の馴化培地は、血管形成能が低く、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細管形成のインヒビターを含む可能性がある１６。１型糖尿病を有する患者由来のＥＰＣの表現型はまた、正常血糖条件での培養の後でも依然として変化しない１６。
【０００４】
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）含有糖タンパク質である。オステオポンチンは、細胞移動、細胞生存、免疫細胞機能の調節、石灰化の阻害および腫瘍細胞表現型の制御に関与する２３〜２５。オステオポンチンは、腫瘍増殖２６およびその進行を促進する２７。原発性非小細胞肺癌の状況では、ＯＰＮの過剰発現は、腫瘍の侵襲性を増加させる２８。誘導性のショートヘアピンＲＮＡベクター２９、ＲＮＡ干渉３０またはアンチセンスオリゴヌクレオチド３１のいずれかによるＯＰＮ発現の阻害は、種々の腫瘍の侵襲性を減弱させる。
【０００５】
世界中の心血管疾患（ＣＶＤ）の有病率および致死率は、現在の治療レジメンの効力が無いことの証拠である。多くの心血管疾患における基礎的要素は、機能的な心筋細胞の喪失である。アポトーシスは、多くの心血管状態（例えば、心筋梗塞および心不全）に関連するが、正確な機構は知られていない。本発明者らは、心筋細胞死およびＣＶＤの予防における治療標的としてＯＰＮを同定した。心血管疾患を有する患者における候補遺伝子の発現の管理は、患者の平均余命を大きく増加させ得る。より重要なことには、ＣＶＤの素因を有する個体におけるこれらの遺伝子の発現の調節は、この疾患の発症を予防し得る。心筋合併症において、アポトーシスは、損なわれたヒト心臓において繰り返し観察されており、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害および心筋症の間の心筋細胞死に寄与する主な要因であることが証明されている（Gottlieb RA、The Journal of Clinical Investigation １９９４年、Fliss H、CirculationResearch １９９６年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｓａｈａｒａ Ｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７５：９６４〜７
【非特許文献２】Ｋａｌｋａ Ｃら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０００）９７：３４２２〜７
【非特許文献３】Ｋｕｂｏｔａ Ｙら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００３）１２：６４７〜５７
【非特許文献４】Ｇｒｉｅｓｅ ＤＰら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００３）１０８：２７１０〜５
【非特許文献５】Ｈｅ Ｔら、Ｓｔｒｏｋｅ（２００４）３５：２３７８〜８４
【非特許文献６】Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍら、Ｔｓｓｕｅ Ｅｎｇ．（２００４）１０：７７１〜９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コントロール不良のＴ１ＤＭ心血管疾患を含む心血管疾患を有する患者由来のＥＰＣの数および機能を評価し、心血管疾患の基礎となる機構を理解することである。さらなる目的は、Ｔ１ＤＭ心血管疾患を含む心血管疾患および結果として生じる糖尿病性潰瘍などの症状の予防および治療において使用するための組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、医薬的に許容される担体または賦形剤と共にオステオポンチンを含む医薬組成物が提供される。このような組成物は、血管疾患、糖尿病関連血管疾患またはこのような疾患から生じる心血管疾患を含む合併症の治療で使用される。このような合併症の一例は足潰瘍であるが、それ以外にも多数存在する。
【０００９】
本明細書で使用する場合、用語「心血管疾患または合併症」には、心筋梗塞、虚血、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、冠血管疾患および心不全などの状態ならびにその基礎となる原因を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症が含まれる。このような疾患は、糖尿病、異脂肪血症および高血圧などのこれら血管疾患の危険因子の存在に起因し得る。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチン遺伝子発現を増大させるように改変された内皮前駆細胞（ＥＰＣ）または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、心血管合併症の治療のための組成物を提供する。心血管疾患は糖尿病に関連する場合がある。ＥＰＣまたはＭＳＣによるオステオポンチンの過剰発現は、例えばリポソームまたはＯＰＮ遺伝子をコードするアデノウイルスで細胞をトランスフェクトすることによって、当業者に公知の種々の方法で達成できる。あるいは、ＥＰＣまたはＭＳＣは、活性化されたＥＰＣまたはＭＳＣを提供するために、移植前に組換えＯＰＮとプレインキュベートすることもできる。この文脈では、活性化された幹細胞は、細管を形成する能力をより高めるＯＰＮで予め処理された幹細胞である。このようにＯＰＮ欠損細胞にＯＰＮを補充すると、それらの機能が改善される。
【００１１】
さらなる実施形態において、ＥＰＣ／ＭＳＣ投与と一緒にＯＰＮ被覆したステントを使用して、血管形成効果を促進することができる。本発明はまた、医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチンをコードする遺伝子または機能的オステオポンチンもコードするその変異体を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、被験体が、心血管疾患を有するかどうか、または心血管疾患を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法を提供し、この方法は、患者におけるオステオポンチン発現レベルを測定し、そのレベルを健康なコントロールのレベルと比較することによる。同様に、本発明は、糖尿病を有する被験体が、血管合併症を有するかどうか、または糖尿病関係血管合併症を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法を提供し、この方法は、患者におけるオステオポンチン発現レベルを測定する工程と、そのレベルを健康なコントロールのレベルと比較する工程とを含む。オステオポンチン発現レベルは、患者由来の血液、組織、ＥＰＣまたは血清のいずれかにおいて測定することができる。
【００１３】
ＯＰＮレベルは、高血糖状態で増加する。これは、この状態におけるＯＰＮの保護的役割に関連している可能性がある。ＥＰＣ中の内因性ＯＰＮレベルを測定することは有用であり得る。なぜなら、低いＯＰＮレベル（本明細書で示すような）は、これらの被験体がその合併症がまだ発症していなくても、近い将来糖尿病関係血管合併症を発症する危険性があることを暗示するが、一方で、上昇した内在性ＯＰＮレベル（Loomansの論文）は、血管合併症の存在を暗示するからである。ＯＰＮレベルは、ＥＰＣ中で増加して、治療的血管新生を促進する。しかし、ＥＰＣ数は血管合併症を有する患者において減少するので、これらのＥＰＣにおける内因性ＯＰＮ発現の増加は、治療的血管新生を強化するのに充分ではない可能性がある。内因性ＯＰＮは機能不全であり得る。外因性の機能的ＯＰＮが、ＥＰＣ機能を改善するのに必要である。ＥＰＣは、虚血傷害の領域への機能的ＯＰＮ移行のためのベクターとして機能し得る。機能的ＯＰＮを過剰発現しているかまたはＯＰＮによって活性化されたさらなるＥＰＣの使用は、Ｔ１ＤＭ関係血管合併症の非侵襲的治療のための解決法となる可能性がある。
【００１４】
本発明は心血管疾患の治療方法も提供し、この方法は、オステオポンチン、またはオステオポンチンをコードするポリヌクレオチド、オステオポンチンを発現もしくは過剰発現する内皮前駆細胞もしくは間葉系幹細胞、または活性化されたＥＰＣもしくはＭＳＣを患者に投与する工程を含む。このようなＥＰＣまたはＭＳＣおよびオステオポンチンの同時投与もまた、これらの方法で使用できる。オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドは、内皮前駆細胞または間葉系幹細胞中に取り込むことができ、こうして生成された形質転換細胞は、糖尿病関係血管合併症を含む心血管疾患の治療のための遺伝子治療技術において有用である。
【００１５】
一実施形態において、末梢血管疾患（脚の血管におけるアテローム性動脈硬化症に起因した血流の低下）を有する患者を同定することができ、そのＥＰＣを採血によって収集することができる。ＯＰＮの遺伝子を、非ウイルス性またはウイルス性の手段によってＥＰＣに送達することができ、次いでこれらの改変された細胞を患者に送達することができる。患者への送達は、デバイスを使用して脈管構造を介したものでもよく、直接的筋内送達によるものでもよい。同様に、心筋または脳を治療することができるが、後者は血管内送達のみを含む。ＥＰＣは、ウイルスにより（例えば、アデノウイルス、レンチウイルスまたはレトロウイルスを介して）改変してもよく、ウイルスによらずに（例えば、エレクトロポレーションまたはリポソーム伝達を介して）改変してもよい。
【００１６】
なおさらなる態様において、本発明は、心血管疾患の治療において有用な化合物を同定する方法を提供し、この方法は、その化合物の、そうしなければオステオポンチン発現が下方調節される細胞においてオステオポンチン発現を増大させる能力を評価する工程を含む。ＯＰＮ発現は、例えば定量リアルタイムＰＣＲまたはＥＬＩＳＡを使用して測定できる。心血管疾患の治療において有用な化合物には、糖尿病関係血管合併症の治療において有用な化合物が含まれる。
【００１７】
本発明はまた、オステオポンチンに対して惹起された抗体、およびオステオポンチンに対して惹起された抗体で被覆され、活性化されたＥＰＣなどの幹細胞で被覆され、またはオステオポンチンを過剰発現するＥＰＣなどの幹細胞で被覆された医療用デバイスを提供する。ＭＳＣも、この方法で使用できる。医療用デバイスは、ステント、縫合糸、絆創膏（ｂａｎｄａｇｅ）もしくは包帯、またはプロテーゼであってもよい。
【００１８】
本発明の方法において、組換えオステオポンチンタンパク質の使用は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用したオステオポンチンの直接投与によって達成することができ、遺伝子改変された細胞（ＥＰＣまたはＭＳＣなど）は、ウイルス的方法または非ウイルス的方法を使用してオステオポンチンを過剰発現するように操作することができる。
【００１９】
全体として、本発明者らは、オステオポンチン欠損が糖尿病性ＥＰＣ機能不全において機構的な役割を果たすことを示し、糖尿病性血管疾患において標的化できる新たな治療経路を同定した。同様に、本発明者らは、心血管疾患におけるＯＰＮの役割も示した。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｔ１ＤＭを有する患者および健常志願者におけるＥＰＣ数を示す図である。
【図２】Ｔ１ＤＭおよび健常志願者におけるコラーゲンに対する接着を示す図である。
【図３】Ｔ１ＤＭおよび健常志願者におけるフィブロネクチンに対するＥＰＣの接着を示す図である。
【図４】ヒト臍帯静脈内皮細胞に対するＥＰＣの接着を示す図である。
【図５】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、Ｔ１ＤＭを有する患者および健常志願者由来のＥＰＣによって形成された細管の数を示す図である。
【図６】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、糖尿病ウサギおよび非糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管数間の比較（９．６＋／−１．７７対１３．０＋／−０．６５：ｐ＝０．０４９）を示す図である。
【図７】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、非糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数に対するＯＰＮの効果（１３．０＋／−０．６５対１６．５＋／−１．１５：ｐ＝０．０３９；ｎ＝９）を示す図である。
【図８】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数に対するＯＰＮの効果（９．６＋／−１．７７対１６．６＋／−２．１９：ｐ＝０．０１０；ｎ＝５）を示す図である。
【図９】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数に対するＯＰＮおよびＲＧＤ／ＲＡＤの効果を示す図である。
【図１０】ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおける手術の前、ならびに直後、７日後、１４日後および２８日後の数個の時点で記録したＬＤＢＦの代表的画像である。
【図１１】ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおける虚血／非虚血ＬＤＢＦ比の定量的分析（各グループにおいてｎ＝５）を示す図である。
【図１２】ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおける片側後肢の誘導の前および３日後の、Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞の決定のための、抗Ｓｃａ−１抗体および抗ｃ−ｋｉｔ抗体を用いた二重染色を示す、代表的サイトグラムである。
【図１３】片側後肢虚血の誘導の前および３日後の、ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおけるＥＰＣ数を示す図である。
【図１４】シミュレートされた虚血に対して応答した初代新生仔ラット心筋細胞におけるＯＰＮ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
方法
被験体の採用
コントロール不良の１型糖尿病（ＨｂＡｌ／ｃ＞１０％により規定される）を有する患者であって、１年より長きにわたってインスリンを受けており、他の薬物療法をいずれも受けていない患者を、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｄａｙ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｇａｌｗａｙ、Ｉｒｅｌａｎｄから採用した。この研究の倫理的承認は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｇａｌｗａｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。微小血管または大血管合併症を有する患者は、この研究から排除した。微小血管合併症は、ミクロアルブミン尿症、糖尿病網膜症および神経障害の存在として定義した。大血管合併症は、急性冠血管症候群、末梢血管疾患および脳血管疾患の任意の以前の病歴の存在として定義した。同意書に署名した後、１型糖尿病を有する患者および健常志願者から末梢血サンプルを採取した。
【００２２】
ＥＰＣの単離
ＥＰＣを、以前に記載した技術に従って培養した。簡潔に述べると、単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌｐａｑｕｅ密度遠心分離法によって単離した。３回の洗浄工程による精製後、１０×１０６または２×１０６のＭＮＣを、フィブロネクチン被覆した６ウェルプレートまたは４ウェルのガラススライド上にそれぞれ播いた。細胞を、５％ＦＢＳ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子−２、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子−１およびアスコルビン酸からなるＥＧＭ−２シングルアリコート（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を補充した内皮細胞基本培地−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で培養した。ＥＰＣを、ＤｉＩ−アセチル化低密度リポタンパク質およびＦＩＴＣ−レクチンで二重染色することによって確認した。
【００２３】
動物研究
糖尿病を、雄性ニュージーランド白ウサギにおいて、アロキサンの静脈内注射（１５０ｍｇ／ｋｇ）を使用して誘導した。血漿グルコース＞２２のウサギを、研究に含めた。静脈切開術を、麻酔下で辺縁動脈を介して実施した。この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｒｅｌａｎｄ、Ｇａｌｗａｙ（ＮＵＩＧ）Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【００２４】
マトリックス分子に対するＥＰＣ接着
フィブロネクチン（１００ｇ／ｍＬ）で、２４ウェルプレート上を、３７℃で２時間被覆した。ウェルを、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで２時間ブロッキングし、ＥＰＣ（１×１０５）を各ウェルに添加して、１時間接着させた。接着細胞を、０．１％クリスタルバイオレットで染色し、１０％酢酸でリンスして、細胞から染色を溶出させた。培地の光学濃度を、６００ｎｍの波長でマイクロタイタープレートリーダーを用いて分析することにより、接着細胞を定量した。
【００２５】
成熟内皮細胞に対する接着
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の単層を、４ウェルガラススライドの各ウェル中に、２×１０５細胞（５〜８継代）を播くことによって、アッセイの４８時間前に調製した。ＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ−α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１ｎｇ／ｍＬ）または培地によって、１２時間にわたり前処理した。ＥＰＣをｄｉＩで標識し、１×１０５細胞を各ウェルに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。非接着細胞を、ＰＢＳを用いて穏やかに除去し、接着ＥＰＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、盲検観察者が計数した。
【００２６】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ細管アッセイ
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）を解凍し、４ウェルのガラススライド中に室温で３０分間置いて凝固させた。ｄｉＩ標識したＥＰＣ（２×１０４）を、４×１０４のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と同時に播き、５μｇ／ｍｌのＯＰＮ（ＳＩＧＭＡ）ありまたはなしで、３７℃で１２時間インキュベートした。細管形成を、その幅に対して４倍の長さを示す構造として規定した。形成した細管の数を、盲検計数者が評価した。オステオポンチンの効果がＲＧＤ依存的であるかどうかを決定するために、異なるＲＧＤ／ＲＡＤ濃度を、オステオポンチンと共にインキュベートした。
【００２７】
ＲＮＡ抽出
総ＲＮＡを、４日目のＥＰＣから、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を業者が記載したとおりに使用して、単離した。単離した総ＲＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐカウンターを使用して分析した。ＱｕａｎｔＩｔ ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔを使用して、総ＲＮＡサンプル中の任意のゲノムＤＮＡの存在を検出した。
【００２８】
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ａｒｒａｙを使用して実施した。遺伝子発現プロフィールを、健常志願者由来のＥＰＣをベースラインとし、ＭＡＳ５．１ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、コントロール不良のＴ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣと健常志願者由来のＥＰＣとの間で比較した。変化倍率を、２つのグループ間の転写物を比較することによって計算した。Ｋ平均クラスタリングを使用して、検出された（存在するまたは存在しない）コールおよび変化した（増加または減少した）コールを同定した。
【００２９】
プライマー配列
プライマーを、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して設計し、ＳＩＧＭＡ Ｇｅｎｏｓｙｓに注文した（表１）。
【００３０】
リアルタイムＰＣＲ
発現研究を、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、ＡＢｌ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、９６ウェルプレートを使用して実施した。反応を、僅かな改変を加えて製造業者の指示に従って実施した。ＰＣＲプログラムを、２５μｌのサンプル容量を使用して、逆転写工程のため５０℃で３０分間で開始し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの活性化のため９５℃で１５分間、その後９５℃で１５秒および６０℃で３０秒の４０サイクルを行った。解離曲線を、６０℃と９５℃との間の温度範囲を使用したリアルタイムＰＣＲの直後に作成した。各サンプルを３連で分析した。全ての反応をさらに、２％アガロースゲルでの電気泳動に供し、ＳｙＢｒＧｒｅｅｎ色素で染色して、予測されたＰＣＲ産物の存在を確認した。
【００３１】
マウス後肢虚血モデル
Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスおよびＯＰＮ−／ＯＰＮ−マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂおよびＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂからそれぞれ購入した。８〜１０週齢のＯＰＮ−ＫＯマウスおよびＷＴマウスを使用した。マウスを、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＥＭＥＤＩ）、ＮＣＢＥＳ、ＮＵＩＧのＡｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。全ての手順は、Ｃｒｕｅｌｔｙ ｔｏ Ａｎｉｍａｌｓ Ａｃｔ、１８７６年の下で、Ｍｉｎｉｓｔｅｒ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎにより承認された。片側後肢虚血を、以前に記載されたとおりに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＯＰＮ−／ＯＰＮ−マウスにおいて行った３２。簡潔に述べると、左後肢の中央部を覆う皮膚において切開を行った。大腿動脈の近位末端の結紮後、伏在動脈の遠位部分を結紮し、動脈ならびに全ての側方分岐を自由に解剖し、切除した。皮膚を、吸収性の縫合糸を使用して閉じた。動物はケタミンおよびキシラジンで麻酔し、イソフルランで維持したことに注目されたい。
【００３２】
レーザードップラー血流（ＬＤＢＦ）評価
後肢および足の両方の後肢血流を、レーザードップラー血流（ＬＤＢＦ）分析器（ＰｅｒｉＳｃａｎ ＰＩＭＩＩ、Ｐｅｒｉｍｅｄ Ｉｎｃ）を使用して、手術直前および手術後０日目、７日目、１４日目および２８日目に測定した。血流を、異なる色のピクセルを用い、レーザー周波数における変化として表示した。スキャン後、保存した画像を分析して血流を定量した。周囲の光および温度によって引き起こされるデータの変動を回避するために、後肢血流を、右（非虚血）ＬＤＢＦに対する左（虚血）ＬＤＢＦの比として表現した。
【００３３】
フローサイトメトリー分析
全てのサンプルを１時間以内に処理した。生きた細胞を、Ｓｃａ−Ｉ、ｃ−ｋｉｔおよびＣＤ３１に対するコンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ Ｃｏｕｌｔｅｒを使用して、ＦＡＣＳ分析を実施した。上記試薬に対して陽性な骨髄細胞の頻度を、顆粒球を排除するため適切なゲートをかけた後、異なる試薬で染色したサンプルの２次元側方散乱蛍光ドットブロット分析によって決定した。最初に、Ｓｃａ−１＋の骨髄細胞にゲートをかけ、次いで、得られた集団をｃ−ｋｉｔの二重発現について試験した。さらなる分析のために、Ｓｃａ−１＋細胞を、前駆細胞の内皮分化を反映する、フィコエリトリンコンジュゲート抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＤ３１発現について研究した。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ＣＥＬＬ Ｑｕｅｓｔソフトウェアプログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。動物の状態について盲検の１人の訓練された操作者（Ｔ．Ｂ．）が、研究を通して全てのフローサイトメトリー分析を実施した。
【００３４】
統計的分析
結果を、平均±ＳＥＭとして示す。グループ間の比較はＡＮＯＶＡによって実施した。事後分析およびペアワイズ多重比較を、Ｓｃｈｅｆｆｅ調整した両側ｔ検定を使用して実施した。＜０．０５の確率値を統計的有意とみなした。全ての分析を、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｖｅｒ．１４．０ Ｉｎｃ）を用いて実施した。
【００３５】
Ａ．ｅｘ−ｖｉｖｏ心臓のＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ処置
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２２５〜２５０ｇ）を麻酔し、心臓を迅速に切り取り、直ぐに、Tsuchidaら（Circulation Research １９９４年）から適合させたプロトコルを使用して、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流装置にカニューレ処置した。簡潔に述べると、心臓を、６０ｍｍＨｇの一定圧力でＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液を用いて灌流した。全ての灌流した心臓を、種々の処置の誘導前に、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置上で２０分間安定化した。処置グループ（ｎ＝３）当たり３つの心臓を使用した。灌流した心臓を、安定化後、１時間１５分にわたって連続して灌流した。虚血／再灌流傷害を模倣するために、プレコンディショニングしていない心臓を、連続して３０分間灌流し、その後３０分間虚血に曝し（Ｋｒｅｂ’ｓ緩衝液の流れの停止）、その後１５分間の再灌流（Ｋｒｅｂ’ｓ緩衝液の流れの再開）を行った。処置後、心臓を直ぐにＴｒｉｚｏｌ試薬に取り出し、ホモジナイズした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。２０％クロロホルムの添加後、サンプルを倒置により混合し、１２，０００×ｇで１５分間、２〜８℃で遠心分離した。ＲＮＡを取り出し、０．５ｍｌのイソプロパノールを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに添加し、激しくボルテックスをかけてＲＮＡを沈殿させた。室温で１０分間のインキュベーション後、ＲＮＡを、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離することによってペレット化し、７５％エタノール１ｍｌで洗浄した。ＲＮＡを、７，５００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清を除去し、ペレットを室温で１０分間風乾させた。引き続き、ペレットを、５０μｌのＤＥＰＣ処理した水中に再懸濁した。ＲＮＡを、２６０ｎｍ（ＵＶ吸収範囲）でのその光学濃度に基づいて、分光測定によって定量した。定量ＰＣＲを、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、２μｇのＲＮＡおよびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、オステオポンチンに対するプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）からの公開されたｍＲＮＡ配列に対して設計し、配列特異性を、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）検索を実施することによって確認した。プライマーセットは、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が合成した。
【００３６】
各遺伝子の既知数のｃＤＮＡコピーを含むｃＤＮＡ定量化標準物質を、ＱＩＡＧＥＮ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して、各遺伝子のＰＣＲ産物を精製することによって調製した。次いで、これらの精製された産物を分光分析によって定量し、適切な希釈を行った。
【００３７】
各プライマーセットについて別個の反応設定（各々、２５μｌの最終容積中に、１２．５μｌの１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１２．５ｎＭの各プライマーおよび２．５μｌのテンプレート（ｃＤＮＡの５０分の１希釈）を含む）で、増幅反応をリアルタイムで実施した。増幅反応は、ＡＢＩ ７０００で９６ウェルの光学反応プレートにおいて実施した。各施行の最後に各プライマーセットについての解離曲線を作成し、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で泳動して、産物のサイズおよびプライマーの特異性を確認した。全ての示差的に調節された遺伝子のｃＤＮＡコピー数を、それぞれの標準曲線から得、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して標準化した。増加倍率を、灌流したサンプルの発現レベルと比較して計算した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、各条件について３連で実施し、次いで結果を、一元ＡＮＯＶＡを使用し、その後、統計パッケージＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＳＰＳＳバージョン１２．０．１（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌ、ＵＳＡ）を使用するＳｃｈｅｆｆｅ検定を行って分析した。
【００３８】
Ｂ．初代新生仔心筋細胞における虚血：
新生仔心筋細胞初代培養物を、１〜４日齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットから単離した。簡潔に述べると、ラットを安楽死させ、心臓を切り取った。メスによるホモジネート化、４℃での一晩のトリプシン消化および３７℃で２０分間のコラゲナーゼ処理の後、心筋細胞を、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配遠心分離（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって富化し、０．２％ゼラチンで被覆した培養プレート上に、１０％新生仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、５％インスリントランスフェリン亜セレン酸塩（ＩＴＳ）液補充培地、１００μＭの５−ブロモ−２−デオキシウリジンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ｍｌ当たり１×１０５の密度で播いた。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【００３９】
内因性の虚血を模倣するために、１０ｍＭ ２−デオキシグルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５％ＩＴＳ液補充培地を補充した無グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用し、グルコースおよび血清の非存在下で、低酸素症ガスチャンバ（Ｒｕｓｓｋｉｎ）を使用して、培養物を低酸素条件（Ｏ２／Ｎ２／ＣＯ２、０．５：９４．５：５）に曝した。
【００４０】
細胞を、全細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｉｇｅｐａｌ−６３０、０．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１００μＭ ＰＭＳＦおよび１μｇ／ｍｌペプスタチン）中で溶解した。細胞タンパク質を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分離し、ニトロセルロースメンブレン上に転写した。ブロッキング（ＰＢＳ中５％の無脂肪乳、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）後、ブロットをオステオポンチンに対する抗体と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を１：５，０００希釈で用いて可視化した。タンパク質バンドを、Ｘ線フィルム（Ａｇｆａ）上で、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｕｌｔｒａ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出した。
【００４１】
結果
被験体の採用
１型糖尿病を有する４人の患者ならびに４人の年齢および性別が一致した健常志願者を採用した（表２）。
【００４２】
ＥＰＣ数の評価
Ｔ１ＤＭを有する患者は、健常志願者と比較して、より少ない数のＥＰＣを有する（２４４±２０対３３４±７、ｐ＝０．０２）（図１）。
【００４３】
マトリックス分子への接着
Ｔ１ＤＭを有する患者は、コラーゲンに対する正常な接着（１．００±０．１１対１．３４±０．１５、ｐ＝０．１３）（図２）およびフィブロネクチンに対する正常な接着（１．６５±０．４４対２．１３±０．２０、ｐ＝０．１６）（図３）を有する。
【００４４】
内皮細胞への接着
次に、内皮細胞へのＥＰＣ接着に対する糖尿病の効果を、静止状態の内皮細胞において、ＴＮＦ−αへの曝露後に評価した。コントロール不良のＴ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣは、静止状態の内皮細胞に対する正常な接着を実証したが（７．０１±０．９１対７．７９±０．６８、ｐ＝０．５４）、活性化された内皮細胞に対する接着は損なわれていた（１１．０５±０．０１対２１．０３±１．１３、ｐ＝０．００１）（図４）。
【００４５】
Ｔ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣを使用した細管形成：
血管形成に関与するＥＰＣの能力の測定であるｉｎ ｖｉｔｒｏの細管形成を、次に評価した。Ｔ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣは、コントロールと比較して、細管を形成する能力が損なわれていた（１．７±０．９対９．８±１．８、ｐ＝０．０１）（図５）。この欠陥は、インスリン欠損糖尿病の動物モデルでも観察され、このとき、アロキソン誘導された糖尿病ウサギ由来のＥＰＣもまた、非糖尿病のコントロールウサギ由来のＥＰＣと比較して、損なわれた細管形成能力を示した（９．６±１．７７対１３．０±０．６５：ｐ＝０．０４９）（図６）。
【００４６】
コントロール不良の糖尿病を有する患者由来のＥＰＣにおけるオステオポンチンの発現：
リアルタイムＰＣＲを使用して、ＯＰＮ発現が、健常志願者と比較して、コントロール不良の糖尿病を有する患者由来のＥＰＣで減少することが実証された。
【００４７】
細管形成に対するＯＰＮ補充の効果：
コントロール不良のＴ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣにおけるＯＰＮの発現の減少が実証されたので、ＯＰＮに対するＥＰＣの曝露がこの欠陥を逆転できるか否かを決定することが求められた。これを行うために、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＥＰＣ機能に対するＯＰＮ補充の効果を評価した。ＯＰＮとのインキュベーションは、非糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数を増加させた（１３．０±０．６５対１６．５±１．１５：ｐ＝０．０３９；図７）。ＯＰＮとのインキュベーションはまた、糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数も増加させた（９．８８±２．４８対１６．５６＋／−２．２１；ｐ＝０．０１）（図８）。
【００４８】
ＥＰＣ機能に対するＯＰＮの効果は、ＲＧＤ依存的である。
【００４９】
次に、ＯＰＮの作用機構がＲＧＤ依存的であるか否かを決定するための調査を行った。ＥＰＣを、ＯＰＮおよびＲＧＤまたはＲＡＤ（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）と同時インキュベートした。ＯＰＮおよびＲＧＤとＥＰＣの同時インキュベーションは、損なわれたＥＰＣ細管形成に関連したが、ＯＰＮおよびＲＡＤとのＥＰＣの同インキュベーションは関連しなかった。この実験の結果は、ＥＰＣ機能に対するＯＰＮの効果がＲＧＤ依存的であることを示す（図９）。
【００５０】
マイクロアレイ分析およびリアルタイムＰＣＲ
マイクロアレイ分析は、オステオポンチンが、糖尿病被験体由来のＥＰＣにおいて下方調節されることを実証した。これは、リアルタイムＰＣＲを使用してさらに立証された。平均変化倍率を、マイクロアレイ結果と比較した（表３）。
【００５１】
ＯＰＮ−ＫＯマウスにおける虚血誘導された血管形成：
ｉｎ ｖｉｖｏの血管形成におけるＯＰＮの役割を研究するために、片側後肢虚血のマウスモデルにおいて血管形成の程度を評価した。血流を、この手順の前および後に、ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおいて評価した。ＯＰＮ−ＫＯマウスにおいて、虚血肢と非虚血肢との間のＬＤＢＦ比の測定により、虚血後肢における灌流の回復が、有意に損なわれたことが示された。手術後７日目、１４日目および２８日目に、ＬＤＰＦ比は、ＯＰＮ−ＫＯマウスにおいて減少し、それぞれＷＴマウスに対して、０．３１±０．０７対０．６８±０．１１（Ｐ＝０．０２１）、０．３２±０．０３対０．５４±０．０５（ｐ＝０．００６）および０．４５±０．０６対１．０９±０．１３（Ｐ＝０．００２）（図１０および１１）であった。
【００５２】
血管形成の障害は、ＥＰＣ動員の低下に起因しない：
次に、ＯＰＮノックアウトマウスで観察された損なわれた欠陥形成の病因におけるＥＰＣ動員の役割を検討した。このために、循環ＥＰＣ数を、ＯＰＮノックアウト動物および野生型動物において後肢虚血の誘導の前および後に測定した。ＥＰＣ数のフローサイトメトリー分析を、後肢虚血の誘導の前および３日後に実施した。０日目に、両方のグループ間でＥＰＣ数に違いはなかった。さらに、ＥＰＣ数は、ＯＰＮノックアウトマウスにおいて、後肢虚血の誘導の３日後に増加した（０日目の０．３３±０．０５対３日目の０．５５±０．０５；ｐ＝０．０３６）。この結果は、ＯＰＮがＥＰＣの動員に関与しないことを示唆する。対照的に、ＥＰＣ数は、コントロールマウスにおいて、後肢虚血の誘導の３日後に増大しなかった（図１２および１３）。
【００５３】
Ａ．ｅｘ−ｖｉｖｏ心臓のＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ処置
リアルタイムＰＣＲによって決定したように、オステオポンチン発現レベルは、灌流したサンプルにおける発現レベルと比較して、虚血／再灌流ラット心臓において、５．１４分の１に減少した。
【００５４】
Ｂ．初代新生仔心筋細胞における虚血：
内因性虚血状態をシミュレートする条件に供したラット新生仔心筋細胞初代培養物において、オステオポンチンタンパク質発現レベルは、ウエスタンブロット分析において決定したとおり、正常条件下で培養した心筋細胞と比較して、減少した（図１４を参照のこと）。２時間目、８時間目、１２時間目および２４時間目に測定したオステオポンチン発現レベルは、虚血前のレベルに回復しなかった。
【００５５】
まとめると、ＯＰＮのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、虚血または虚血再灌流に応答して低下する。
【００５６】
考察
ＥＰＣの数および機能は、種々の因子によって効果を受け得る１５。減少したＥＰＣ数が、１型ＤＭおよび２型ＤＭを有する患者において実証された１６、１７。しかし、微小血管合併症は、これらの研究において排除されなかった。最近、糖尿病網膜症がＥＰＣ数を増加させることが示されている２０、２１。この理由のために、糖尿病網膜症および他の合併症を有さない均一集団を選択した。Ｔ１ＤＭを有するヒトにおいて他の混乱させる因子なしの高血糖症の効果を観察することが所望された。
【００５７】
データは、無併発性の１型糖尿病を有する患者由来のＥＰＣの数が減少していることを示した。これらの細胞は、コラーゲンおよびフィブロネクチンに対して正常な接着を示した。これらの細胞はまた、静止状態の内皮細胞に対する正常な接着を示したが、活性化された内皮細胞に対する接着は損なわれていた。Ｔ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣは、細管を形成する能力が損なわれていた。これらのデータは以前の研究と一致した１６、１７。糖尿病におけるＥＰＣの機能不全におけるＯＰＮの役割を試験した。ＯＰＮ発現は、コントロール不良のＴ１ＤＭを有する被験体から単離したＥＰＣにおいて顕著に減少していることが、初めて実証された。この結果は、マイクロアレイ分析を使用してLoomansらによって観察された効果とは反対である２２。この不一致の理由は不明であるが、研究した患者集団に起因する可能性がある。さらに、ＥＰＣの機能不全は、糖尿病動物由来の細胞を組換えＯＰＮの存在下で培養した場合に逆転することが実証されている。ＥＰＣ機能に対するＯＰＮの効果は、細管形成の増加が観察された非糖尿病動物由来の細胞においても見られた。このように、本発明は、末梢血管疾患、潰瘍、虚血性心疾患および脳血管疾患、ならびに脳動脈瘤に対して二次的なくも膜下出血および糖尿病網膜症を含む、細管形成の不良、または血管形成に関する問題点に関連する疾患の治療を可能にできる。ＥＰＣ機能に対するＯＰＮの効果は、ＲＧＤによって逆転されたがＲＡＤでは逆転されず、このことは、ＯＰＮの効果がＲＧＤ依存的であることを示す。
【００５８】
次に、血管形成におけるＯＰＮの役割を、ＯＰＮノックアウトマウスを使用して検討した。虚血後肢における灌流の回復は、ＯＰＮ−ＫＯマウスにおいて有意に損なわれることが実証された。手術後７日目、ＯＰＮ−ＫＯマウスにおけるＬＤＰＦ比は、ＷＴマウスの約半分であった。血流回復におけるこの障害は、手術後２８日目まで持続し、このことは、ＯＰＮの非存在が、片側後肢虚血のマウスモデルにおいて血管新生を損なうことを示唆している。この欠陥は、動員の低下および虚血部位における新たな血管へのＥＰＣの取り込みの障害に起因し得る。この結果は、ＯＰＮノックアウトにおける後肢虚血後のＥＰＣの循環レベルの増加が、損なわれた動員がこの機構でないことを示唆することを示す。この仮説は、糖尿病マウスにおける背側中部の皮膚創傷の誘導後７日目まで、ＯＰＮの発現がベースラインと異ならなかったことを示した、Ballardらからのデータによって支持される。ＯＰＮレベルは引き続いて、７日目に増加し、さらに４日間にわたり構成的により高いままであった。著者らは、糖尿病マウスにおけるＯＰＮの低発現が、一部、糖尿病マウスにおける創傷治癒の遅延の原因である可能性があることを示唆した３３。したがって、糖尿病ＥＰＣにおける減少したＯＰＮ発現は、糖尿病被験体の大血管合併症への傾向を説明し得る。
【００５９】
オステオポンチンは、健康な心筋において構成的に発現される分泌サイトカインまたは接着分子として存在する。その発現は、心筋梗塞後の非筋細胞において増加して、細胞生存率を保護し、適応リモデリングを助ける。オステオポンチンの喪失は、代償的な線維症および肥大化を損なって、心臓の性能を低下させる。オステオポンチン発現はまた、心筋梗塞および心不全によって、心筋細胞において顕著に増加する。オステオポンチン心臓保護の機構は、大部分未知である。オステオポンチンは、サイトカイン誘導される一酸化窒素シンターゼ発現を抑制して、一酸化窒素産生および収縮障害を防止する。細胞シグナル伝達は、細胞表面インテグリンレセプター結合を介して媒介される。インテグリンレセプターは、細胞外マトリックスにおける変化を細胞骨格に連絡する。オステオポンチンの発現増加には、肥大化の間の心臓レセプターβ１インテグリンの発現増加が伴う。抗インテグリン抗体は、抗オステオポンチン抗体によっても遮断される効果である、アンギオテンシンＩＩ誘導された心臓リモデリングを遮断し、このことは、アンギオテンシンＩＩのシグナル伝達がオステオポンチンを介して進行することを示唆している。
【００６０】
オステオポンチン欠損心臓線維芽細胞において、酸化ストレスは、アポトーシスが優勢である野生型細胞とは異なり、壊死を誘導した。この壊死は、オステオポンチンの内因性の再発現に際して減少した。しかし、心筋梗塞したマウス心臓のｉｎ ｖｉｖｏ研究により、オステオポンチン欠損心臓が、野生型心臓と同じ数のアポトーシス筋細胞を有することが示されている。
【００６１】
結論
糖尿病におけるＥＰＣの機能不全は、ＯＰＮ発現の減少と関連し、ＯＰＮ補充によって逆転でき、これは、糖尿病被験体が血管合併症になる傾向がより高い理由を説明し得る。さらに、ＯＰＮノックアウト動物における研究は、血管形成におけるＯＰＮの重要な役割を確認している。この結果は、この効果が、ＥＰＣにおけるより低いＯＰＮ発現に関連する可能性があることを示唆している。糖尿病におけるＥＰＣの機能不全は、この障害のための新たな治療標的を同定する、ＯＰＮ発現の減少に起因する。
【００６２】
単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および単語「有する／含む（ｈａｖｉｎｇ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本発明に関して本明細書中で使用する場合、記述された特徴、整数、工程または成分の存在を特定するために使用されるが、１以上の他の特徴、整数、工程、成分またはそれらの群の存在または付加を排除するものではない。
【００６３】
明確にするために、別個の実施形態に関して記載されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に関して記載されている本発明の種々の特徴は、別個にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供してもよい。
【００６４】
参考文献
【００６５】
【化１】
【００６６】
【化２】
【００６７】
【化３】
【００６８】
【表１】
表１：リアルタイムＰＣＲのためのプライマー配列
【００６９】
【表２】
表２：被験体の特徴
【００７０】
【表３】
表３：マイクロアレイ結果とリアルタイムＰＣＲ結果との間のオステオポンチン遺伝子発現（変化倍率）の比較
【００７１】
【表４】
表４：オリゴヌクレオチドプライマー
【００７２】
【表５】
表５−灌流した心臓と比較した場合の、Ｉ／Ｒに応答して変更された遺伝子発現
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管疾患または合併症の治療のための内皮前駆細胞（ＥＰＣ）およびオステオポンチンの使用に関する。本発明はまた、これらの心血管合併症の発症の危険性のマーカーとしてのＥＰＣオステオポンチンレベルの使用にも関する。特に、本発明は、オステオポンチンおよびオステオポンチンをコードする遺伝子に基づく組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
１９９７年のAsaharaらによる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の発見は、多くの血管疾患状態（例えば、虚血、再狭窄および肺高血圧）の病因に関する見識を提供してきた１〜６（非特許文献１〜非特許文献６）。Urbichらは最近、内皮細胞へと分化変換する能力を有する高度に増殖性の非内皮細胞としてＥＰＣを規定している７。ＥＰＣは、骨髄、末梢血および臍帯血を含む種々の供給源から単離できる８〜１０。ＥＰＣには２つの表現型（初期対後期のＥＰＣ）が存在し、これらは共に別個の増殖能および血管形成能を有する８、１１。フィブロネクチンなどのマトリックス分子に接着し、ａｃＬＤＬを取り込み、レクチンを結合する能力は、依然としてＥＰＣについて一般に使用される定義であるが、種々のマーカー（例えば、造血マーカーおよび内皮マーカー）を用いたさらなるフローサイトメトリー分析および免疫染色が、ＥＰＣを規定するために益々利用されている１２〜１５。
【０００３】
１型１６および２型１７、１８の糖尿病を有する患者は、健常志願者と比較してＥＰＣの数がより少ない。末梢血管疾患を合併した２型糖尿病を有する患者は、合併症を有さない患者と比較して、ＥＰＣの数がさらに少ない１８。これらの患者におけるＥＰＣ数は、血糖コントロールと逆相関する１６〜１８。２型糖尿病を有する患者から単離されたＥＰＣでは、活性化した内皮細胞ならびにコラーゲンおよびフィブロネクチンなどのマトリックス分子との接着が低下していた１７。両方の型の糖尿病を有する患者由来のＥＰＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細管を形成する能力が損なわれている１６、１７。さらに、ストレプトゾトシン誘導された糖尿病マウス由来の骨髄単核細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＰＣにあまり効率よく分化せず、非糖尿病マウス由来の骨髄単核細胞よりも細管を形成する可能性が低い１９。１型糖尿病を有する患者から単離したＥＰＣ由来の馴化培地は、血管形成能が低く、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細管形成のインヒビターを含む可能性がある１６。１型糖尿病を有する患者由来のＥＰＣの表現型はまた、正常血糖条件での培養の後でも依然として変化しない１６。
【０００４】
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）含有糖タンパク質である。オステオポンチンは、細胞移動、細胞生存、免疫細胞機能の調節、石灰化の阻害および腫瘍細胞表現型の制御に関与する２３〜２５。オステオポンチンは、腫瘍増殖２６およびその進行を促進する２７。原発性非小細胞肺癌の状況では、ＯＰＮの過剰発現は、腫瘍の侵襲性を増加させる２８。誘導性のショートヘアピンＲＮＡベクター２９、ＲＮＡ干渉３０またはアンチセンスオリゴヌクレオチド３１のいずれかによるＯＰＮ発現の阻害は、種々の腫瘍の侵襲性を減弱させる。
【０００５】
世界中の心血管疾患（ＣＶＤ）の有病率および致死率は、現在の治療レジメンの効力が無いことの証拠である。多くの心血管疾患における基礎的要素は、機能的な心筋細胞の喪失である。アポトーシスは、多くの心血管状態（例えば、心筋梗塞および心不全）に関連するが、正確な機構は知られていない。本発明者らは、心筋細胞死およびＣＶＤの予防における治療標的としてＯＰＮを同定した。心血管疾患を有する患者における候補遺伝子の発現の管理は、患者の平均余命を大きく増加させ得る。より重要なことには、ＣＶＤの素因を有する個体におけるこれらの遺伝子の発現の調節は、この疾患の発症を予防し得る。心筋合併症において、アポトーシスは、損なわれたヒト心臓において繰り返し観察されており、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害および心筋症の間の心筋細胞死に寄与する主な要因であることが証明されている（Gottlieb RA、The Journal of Clinical Investigation １９９４年、Fliss H、CirculationResearch １９９６年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｓａｈａｒａ Ｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７５：９６４〜７
【非特許文献２】Ｋａｌｋａ Ｃら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０００）９７：３４２２〜７
【非特許文献３】Ｋｕｂｏｔａ Ｙら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００３）１２：６４７〜５７
【非特許文献４】Ｇｒｉｅｓｅ ＤＰら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００３）１０８：２７１０〜５
【非特許文献５】Ｈｅ Ｔら、Ｓｔｒｏｋｅ（２００４）３５：２３７８〜８４
【非特許文献６】Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍら、Ｔｓｓｕｅ Ｅｎｇ．（２００４）１０：７７１〜９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コントロール不良のＴ１ＤＭ心血管疾患を含む心血管疾患を有する患者由来のＥＰＣの数および機能を評価し、心血管疾患の基礎となる機構を理解することである。さらなる目的は、Ｔ１ＤＭ心血管疾患を含む心血管疾患および結果として生じる糖尿病性潰瘍などの症状の予防および治療において使用するための組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、医薬的に許容される担体または賦形剤と共にオステオポンチンを含む医薬組成物が提供される。このような組成物は、血管疾患、糖尿病関連血管疾患またはこのような疾患から生じる心血管疾患を含む合併症の治療で使用される。このような合併症の一例は足潰瘍であるが、それ以外にも多数存在する。
【０００９】
本明細書で使用する場合、用語「心血管疾患または合併症」には、心筋梗塞、虚血、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、冠血管疾患および心不全などの状態ならびにその基礎となる原因を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症が含まれる。このような疾患は、糖尿病、異脂肪血症および高血圧などのこれら血管疾患の危険因子の存在に起因し得る。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチン遺伝子発現を増大させるように改変された内皮前駆細胞（ＥＰＣ）または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、心血管合併症の治療のための組成物を提供する。心血管疾患は糖尿病に関連する場合がある。ＥＰＣまたはＭＳＣによるオステオポンチンの過剰発現は、例えばリポソームまたはＯＰＮ遺伝子をコードするアデノウイルスで細胞をトランスフェクトすることによって、当業者に公知の種々の方法で達成できる。あるいは、ＥＰＣまたはＭＳＣは、活性化されたＥＰＣまたはＭＳＣを提供するために、移植前に組換えＯＰＮとプレインキュベートすることもできる。この文脈では、活性化された幹細胞は、細管を形成する能力をより高めるＯＰＮで予め処理された幹細胞である。このようにＯＰＮ欠損細胞にＯＰＮを補充すると、それらの機能が改善される。
【００１１】
さらなる実施形態において、ＥＰＣ／ＭＳＣ投与と一緒にＯＰＮ被覆したステントを使用して、血管形成効果を促進することができる。本発明はまた、医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチンをコードする遺伝子または機能的オステオポンチンもコードするその変異体を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、被験体が、心血管疾患を有するかどうか、または心血管疾患を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法を提供し、この方法は、患者におけるオステオポンチン発現レベルを測定し、そのレベルを健康なコントロールのレベルと比較することによる。同様に、本発明は、糖尿病を有する被験体が、血管合併症を有するかどうか、または糖尿病関係血管合併症を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法を提供し、この方法は、患者におけるオステオポンチン発現レベルを測定する工程と、そのレベルを健康なコントロールのレベルと比較する工程とを含む。オステオポンチン発現レベルは、患者由来の血液、組織、ＥＰＣまたは血清のいずれかにおいて測定することができる。
【００１３】
ＯＰＮレベルは、高血糖状態で増加する。これは、この状態におけるＯＰＮの保護的役割に関連している可能性がある。ＥＰＣ中の内因性ＯＰＮレベルを測定することは有用であり得る。なぜなら、低いＯＰＮレベル（本明細書で示すような）は、これらの被験体がその合併症がまだ発症していなくても、近い将来糖尿病関係血管合併症を発症する危険性があることを暗示するが、一方で、上昇した内在性ＯＰＮレベル（Loomansの論文）は、血管合併症の存在を暗示するからである。ＯＰＮレベルは、ＥＰＣ中で増加して、治療的血管新生を促進する。しかし、ＥＰＣ数は血管合併症を有する患者において減少するので、これらのＥＰＣにおける内因性ＯＰＮ発現の増加は、治療的血管新生を強化するのに充分ではない可能性がある。内因性ＯＰＮは機能不全であり得る。外因性の機能的ＯＰＮが、ＥＰＣ機能を改善するのに必要である。ＥＰＣは、虚血傷害の領域への機能的ＯＰＮ移行のためのベクターとして機能し得る。機能的ＯＰＮを過剰発現しているかまたはＯＰＮによって活性化されたさらなるＥＰＣの使用は、Ｔ１ＤＭ関係血管合併症の非侵襲的治療のための解決法となる可能性がある。
【００１４】
本発明は心血管疾患の治療方法も提供し、この方法は、オステオポンチン、またはオステオポンチンをコードするポリヌクレオチド、オステオポンチンを発現もしくは過剰発現する内皮前駆細胞もしくは間葉系幹細胞、または活性化されたＥＰＣもしくはＭＳＣを患者に投与する工程を含む。このようなＥＰＣまたはＭＳＣおよびオステオポンチンの同時投与もまた、これらの方法で使用できる。オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドは、内皮前駆細胞または間葉系幹細胞中に取り込むことができ、こうして生成された形質転換細胞は、糖尿病関係血管合併症を含む心血管疾患の治療のための遺伝子治療技術において有用である。
【００１５】
一実施形態において、末梢血管疾患（脚の血管におけるアテローム性動脈硬化症に起因した血流の低下）を有する患者を同定することができ、そのＥＰＣを採血によって収集することができる。ＯＰＮの遺伝子を、非ウイルス性またはウイルス性の手段によってＥＰＣに送達することができ、次いでこれらの改変された細胞を患者に送達することができる。患者への送達は、デバイスを使用して脈管構造を介したものでもよく、直接的筋内送達によるものでもよい。同様に、心筋または脳を治療することができるが、後者は血管内送達のみを含む。ＥＰＣは、ウイルスにより（例えば、アデノウイルス、レンチウイルスまたはレトロウイルスを介して）改変してもよく、ウイルスによらずに（例えば、エレクトロポレーションまたはリポソーム伝達を介して）改変してもよい。
【００１６】
なおさらなる態様において、本発明は、心血管疾患の治療において有用な化合物を同定する方法を提供し、この方法は、その化合物の、そうしなければオステオポンチン発現が下方調節される細胞においてオステオポンチン発現を増大させる能力を評価する工程を含む。ＯＰＮ発現は、例えば定量リアルタイムＰＣＲまたはＥＬＩＳＡを使用して測定できる。心血管疾患の治療において有用な化合物には、糖尿病関係血管合併症の治療において有用な化合物が含まれる。
【００１７】
本発明はまた、オステオポンチンに対して惹起された抗体、およびオステオポンチンに対して惹起された抗体で被覆され、活性化されたＥＰＣなどの幹細胞で被覆され、またはオステオポンチンを過剰発現するＥＰＣなどの幹細胞で被覆された医療用デバイスを提供する。ＭＳＣも、この方法で使用できる。医療用デバイスは、ステント、縫合糸、絆創膏（ｂａｎｄａｇｅ）もしくは包帯、またはプロテーゼであってもよい。
【００１８】
本発明の方法において、組換えオステオポンチンタンパク質の使用は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用したオステオポンチンの直接投与によって達成することができ、遺伝子改変された細胞（ＥＰＣまたはＭＳＣなど）は、ウイルス的方法または非ウイルス的方法を使用してオステオポンチンを過剰発現するように操作することができる。
【００１９】
全体として、本発明者らは、オステオポンチン欠損が糖尿病性ＥＰＣ機能不全において機構的な役割を果たすことを示し、糖尿病性血管疾患において標的化できる新たな治療経路を同定した。同様に、本発明者らは、心血管疾患におけるＯＰＮの役割も示した。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｔ１ＤＭを有する患者および健常志願者におけるＥＰＣ数を示す図である。
【図２】Ｔ１ＤＭおよび健常志願者におけるコラーゲンに対する接着を示す図である。
【図３】Ｔ１ＤＭおよび健常志願者におけるフィブロネクチンに対するＥＰＣの接着を示す図である。
【図４】ヒト臍帯静脈内皮細胞に対するＥＰＣの接着を示す図である。
【図５】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、Ｔ１ＤＭを有する患者および健常志願者由来のＥＰＣによって形成された細管の数を示す図である。
【図６】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、糖尿病ウサギおよび非糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管数間の比較（９．６＋／−１．７７対１３．０＋／−０．６５：ｐ＝０．０４９）を示す図である。
【図７】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、非糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数に対するＯＰＮの効果（１３．０＋／−０．６５対１６．５＋／−１．１５：ｐ＝０．０３９；ｎ＝９）を示す図である。
【図８】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数に対するＯＰＮの効果（９．６＋／−１．７７対１６．６＋／−２．１９：ｐ＝０．０１０；ｎ＝５）を示す図である。
【図９】Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイを使用した、糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数に対するＯＰＮおよびＲＧＤ／ＲＡＤの効果を示す図である。
【図１０】ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおける手術の前、ならびに直後、７日後、１４日後および２８日後の数個の時点で記録したＬＤＢＦの代表的画像である。
【図１１】ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおける虚血／非虚血ＬＤＢＦ比の定量的分析（各グループにおいてｎ＝５）を示す図である。
【図１２】ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおける片側後肢の誘導の前および３日後の、Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞の決定のための、抗Ｓｃａ−１抗体および抗ｃ−ｋｉｔ抗体を用いた二重染色を示す、代表的サイトグラムである。
【図１３】片側後肢虚血の誘導の前および３日後の、ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおけるＥＰＣ数を示す図である。
【図１４】シミュレートされた虚血に対して応答した初代新生仔ラット心筋細胞におけるＯＰＮ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
方法
被験体の採用
コントロール不良の１型糖尿病（ＨｂＡｌ／ｃ＞１０％により規定される）を有する患者であって、１年より長きにわたってインスリンを受けており、他の薬物療法をいずれも受けていない患者を、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｄａｙ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｇａｌｗａｙ、Ｉｒｅｌａｎｄから採用した。この研究の倫理的承認は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｇａｌｗａｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。微小血管または大血管合併症を有する患者は、この研究から排除した。微小血管合併症は、ミクロアルブミン尿症、糖尿病網膜症および神経障害の存在として定義した。大血管合併症は、急性冠血管症候群、末梢血管疾患および脳血管疾患の任意の以前の病歴の存在として定義した。同意書に署名した後、１型糖尿病を有する患者および健常志願者から末梢血サンプルを採取した。
【００２２】
ＥＰＣの単離
ＥＰＣを、以前に記載した技術に従って培養した。簡潔に述べると、単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌｐａｑｕｅ密度遠心分離法によって単離した。３回の洗浄工程による精製後、１０×１０６または２×１０６のＭＮＣを、フィブロネクチン被覆した６ウェルプレートまたは４ウェルのガラススライド上にそれぞれ播いた。細胞を、５％ＦＢＳ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子−２、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子−１およびアスコルビン酸からなるＥＧＭ−２シングルアリコート（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を補充した内皮細胞基本培地−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で培養した。ＥＰＣを、ＤｉＩ−アセチル化低密度リポタンパク質およびＦＩＴＣ−レクチンで二重染色することによって確認した。
【００２３】
動物研究
糖尿病を、雄性ニュージーランド白ウサギにおいて、アロキサンの静脈内注射（１５０ｍｇ／ｋｇ）を使用して誘導した。血漿グルコース＞２２のウサギを、研究に含めた。静脈切開術を、麻酔下で辺縁動脈を介して実施した。この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｒｅｌａｎｄ、Ｇａｌｗａｙ（ＮＵＩＧ）Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【００２４】
マトリックス分子に対するＥＰＣ接着
フィブロネクチン（１００ｇ／ｍＬ）で、２４ウェルプレート上を、３７℃で２時間被覆した。ウェルを、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで２時間ブロッキングし、ＥＰＣ（１×１０５）を各ウェルに添加して、１時間接着させた。接着細胞を、０．１％クリスタルバイオレットで染色し、１０％酢酸でリンスして、細胞から染色を溶出させた。培地の光学濃度を、６００ｎｍの波長でマイクロタイタープレートリーダーを用いて分析することにより、接着細胞を定量した。
【００２５】
成熟内皮細胞に対する接着
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の単層を、４ウェルガラススライドの各ウェル中に、２×１０５細胞（５〜８継代）を播くことによって、アッセイの４８時間前に調製した。ＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ−α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１ｎｇ／ｍＬ）または培地によって、１２時間にわたり前処理した。ＥＰＣをｄｉＩで標識し、１×１０５細胞を各ウェルに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。非接着細胞を、ＰＢＳを用いて穏やかに除去し、接着ＥＰＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、盲検観察者が計数した。
【００２６】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ細管アッセイ
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）を解凍し、４ウェルのガラススライド中に室温で３０分間置いて凝固させた。ｄｉＩ標識したＥＰＣ（２×１０４）を、４×１０４のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と同時に播き、５μｇ／ｍｌのＯＰＮ（ＳＩＧＭＡ）ありまたはなしで、３７℃で１２時間インキュベートした。細管形成を、その幅に対して４倍の長さを示す構造として規定した。形成した細管の数を、盲検計数者が評価した。オステオポンチンの効果がＲＧＤ依存的であるかどうかを決定するために、異なるＲＧＤ／ＲＡＤ濃度を、オステオポンチンと共にインキュベートした。
【００２７】
ＲＮＡ抽出
総ＲＮＡを、４日目のＥＰＣから、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を業者が記載したとおりに使用して、単離した。単離した総ＲＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐカウンターを使用して分析した。ＱｕａｎｔＩｔ ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔを使用して、総ＲＮＡサンプル中の任意のゲノムＤＮＡの存在を検出した。
【００２８】
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ａｒｒａｙを使用して実施した。遺伝子発現プロフィールを、健常志願者由来のＥＰＣをベースラインとし、ＭＡＳ５．１ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、コントロール不良のＴ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣと健常志願者由来のＥＰＣとの間で比較した。変化倍率を、２つのグループ間の転写物を比較することによって計算した。Ｋ平均クラスタリングを使用して、検出された（存在するまたは存在しない）コールおよび変化した（増加または減少した）コールを同定した。
【００２９】
プライマー配列
プライマーを、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して設計し、ＳＩＧＭＡ Ｇｅｎｏｓｙｓに注文した（表１）。
【００３０】
リアルタイムＰＣＲ
発現研究を、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、ＡＢｌ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、９６ウェルプレートを使用して実施した。反応を、僅かな改変を加えて製造業者の指示に従って実施した。ＰＣＲプログラムを、２５μｌのサンプル容量を使用して、逆転写工程のため５０℃で３０分間で開始し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの活性化のため９５℃で１５分間、その後９５℃で１５秒および６０℃で３０秒の４０サイクルを行った。解離曲線を、６０℃と９５℃との間の温度範囲を使用したリアルタイムＰＣＲの直後に作成した。各サンプルを３連で分析した。全ての反応をさらに、２％アガロースゲルでの電気泳動に供し、ＳｙＢｒＧｒｅｅｎ色素で染色して、予測されたＰＣＲ産物の存在を確認した。
【００３１】
マウス後肢虚血モデル
Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスおよびＯＰＮ−／ＯＰＮ−マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂおよびＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂからそれぞれ購入した。８〜１０週齢のＯＰＮ−ＫＯマウスおよびＷＴマウスを使用した。マウスを、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＥＭＥＤＩ）、ＮＣＢＥＳ、ＮＵＩＧのＡｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。全ての手順は、Ｃｒｕｅｌｔｙ ｔｏ Ａｎｉｍａｌｓ Ａｃｔ、１８７６年の下で、Ｍｉｎｉｓｔｅｒ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎにより承認された。片側後肢虚血を、以前に記載されたとおりに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＯＰＮ−／ＯＰＮ−マウスにおいて行った３２。簡潔に述べると、左後肢の中央部を覆う皮膚において切開を行った。大腿動脈の近位末端の結紮後、伏在動脈の遠位部分を結紮し、動脈ならびに全ての側方分岐を自由に解剖し、切除した。皮膚を、吸収性の縫合糸を使用して閉じた。動物はケタミンおよびキシラジンで麻酔し、イソフルランで維持したことに注目されたい。
【００３２】
レーザードップラー血流（ＬＤＢＦ）評価
後肢および足の両方の後肢血流を、レーザードップラー血流（ＬＤＢＦ）分析器（ＰｅｒｉＳｃａｎ ＰＩＭＩＩ、Ｐｅｒｉｍｅｄ Ｉｎｃ）を使用して、手術直前および手術後０日目、７日目、１４日目および２８日目に測定した。血流を、異なる色のピクセルを用い、レーザー周波数における変化として表示した。スキャン後、保存した画像を分析して血流を定量した。周囲の光および温度によって引き起こされるデータの変動を回避するために、後肢血流を、右（非虚血）ＬＤＢＦに対する左（虚血）ＬＤＢＦの比として表現した。
【００３３】
フローサイトメトリー分析
全てのサンプルを１時間以内に処理した。生きた細胞を、Ｓｃａ−Ｉ、ｃ−ｋｉｔおよびＣＤ３１に対するコンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ Ｃｏｕｌｔｅｒを使用して、ＦＡＣＳ分析を実施した。上記試薬に対して陽性な骨髄細胞の頻度を、顆粒球を排除するため適切なゲートをかけた後、異なる試薬で染色したサンプルの２次元側方散乱蛍光ドットブロット分析によって決定した。最初に、Ｓｃａ−１＋の骨髄細胞にゲートをかけ、次いで、得られた集団をｃ−ｋｉｔの二重発現について試験した。さらなる分析のために、Ｓｃａ−１＋細胞を、前駆細胞の内皮分化を反映する、フィコエリトリンコンジュゲート抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＤ３１発現について研究した。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ＣＥＬＬ Ｑｕｅｓｔソフトウェアプログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。動物の状態について盲検の１人の訓練された操作者（Ｔ．Ｂ．）が、研究を通して全てのフローサイトメトリー分析を実施した。
【００３４】
統計的分析
結果を、平均±ＳＥＭとして示す。グループ間の比較はＡＮＯＶＡによって実施した。事後分析およびペアワイズ多重比較を、Ｓｃｈｅｆｆｅ調整した両側ｔ検定を使用して実施した。＜０．０５の確率値を統計的有意とみなした。全ての分析を、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｖｅｒ．１４．０ Ｉｎｃ）を用いて実施した。
【００３５】
Ａ．ｅｘ−ｖｉｖｏ心臓のＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ処置
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２２５〜２５０ｇ）を麻酔し、心臓を迅速に切り取り、直ぐに、Tsuchidaら（Circulation Research １９９４年）から適合させたプロトコルを使用して、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流装置にカニューレ処置した。簡潔に述べると、心臓を、６０ｍｍＨｇの一定圧力でＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液を用いて灌流した。全ての灌流した心臓を、種々の処置の誘導前に、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置上で２０分間安定化した。処置グループ（ｎ＝３）当たり３つの心臓を使用した。灌流した心臓を、安定化後、１時間１５分にわたって連続して灌流した。虚血／再灌流傷害を模倣するために、プレコンディショニングしていない心臓を、連続して３０分間灌流し、その後３０分間虚血に曝し（Ｋｒｅｂ’ｓ緩衝液の流れの停止）、その後１５分間の再灌流（Ｋｒｅｂ’ｓ緩衝液の流れの再開）を行った。処置後、心臓を直ぐにＴｒｉｚｏｌ試薬に取り出し、ホモジナイズした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。２０％クロロホルムの添加後、サンプルを倒置により混合し、１２，０００×ｇで１５分間、２〜８℃で遠心分離した。ＲＮＡを取り出し、０．５ｍｌのイソプロパノールを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに添加し、激しくボルテックスをかけてＲＮＡを沈殿させた。室温で１０分間のインキュベーション後、ＲＮＡを、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離することによってペレット化し、７５％エタノール１ｍｌで洗浄した。ＲＮＡを、７，５００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清を除去し、ペレットを室温で１０分間風乾させた。引き続き、ペレットを、５０μｌのＤＥＰＣ処理した水中に再懸濁した。ＲＮＡを、２６０ｎｍ（ＵＶ吸収範囲）でのその光学濃度に基づいて、分光測定によって定量した。定量ＰＣＲを、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、２μｇのＲＮＡおよびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、オステオポンチンに対するプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）からの公開されたｍＲＮＡ配列に対して設計し、配列特異性を、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）検索を実施することによって確認した。プライマーセットは、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が合成した。
【００３６】
各遺伝子の既知数のｃＤＮＡコピーを含むｃＤＮＡ定量化標準物質を、ＱＩＡＧＥＮ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して、各遺伝子のＰＣＲ産物を精製することによって調製した。次いで、これらの精製された産物を分光分析によって定量し、適切な希釈を行った。
【００３７】
各プライマーセットについて別個の反応設定（各々、２５μｌの最終容積中に、１２．５μｌの１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１２．５ｎＭの各プライマーおよび２．５μｌのテンプレート（ｃＤＮＡの５０分の１希釈）を含む）で、増幅反応をリアルタイムで実施した。増幅反応は、ＡＢＩ ７０００で９６ウェルの光学反応プレートにおいて実施した。各施行の最後に各プライマーセットについての解離曲線を作成し、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で泳動して、産物のサイズおよびプライマーの特異性を確認した。全ての示差的に調節された遺伝子のｃＤＮＡコピー数を、それぞれの標準曲線から得、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して標準化した。増加倍率を、灌流したサンプルの発現レベルと比較して計算した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、各条件について３連で実施し、次いで結果を、一元ＡＮＯＶＡを使用し、その後、統計パッケージＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＳＰＳＳバージョン１２．０．１（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌ、ＵＳＡ）を使用するＳｃｈｅｆｆｅ検定を行って分析した。
【００３８】
Ｂ．初代新生仔心筋細胞における虚血：
新生仔心筋細胞初代培養物を、１〜４日齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットから単離した。簡潔に述べると、ラットを安楽死させ、心臓を切り取った。メスによるホモジネート化、４℃での一晩のトリプシン消化および３７℃で２０分間のコラゲナーゼ処理の後、心筋細胞を、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配遠心分離（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって富化し、０．２％ゼラチンで被覆した培養プレート上に、１０％新生仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、５％インスリントランスフェリン亜セレン酸塩（ＩＴＳ）液補充培地、１００μＭの５−ブロモ−２−デオキシウリジンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ｍｌ当たり１×１０５の密度で播いた。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【００３９】
内因性の虚血を模倣するために、１０ｍＭ ２−デオキシグルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５％ＩＴＳ液補充培地を補充した無グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用し、グルコースおよび血清の非存在下で、低酸素症ガスチャンバ（Ｒｕｓｓｋｉｎ）を使用して、培養物を低酸素条件（Ｏ２／Ｎ２／ＣＯ２、０．５：９４．５：５）に曝した。
【００４０】
細胞を、全細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｉｇｅｐａｌ−６３０、０．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１００μＭ ＰＭＳＦおよび１μｇ／ｍｌペプスタチン）中で溶解した。細胞タンパク質を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分離し、ニトロセルロースメンブレン上に転写した。ブロッキング（ＰＢＳ中５％の無脂肪乳、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）後、ブロットをオステオポンチンに対する抗体と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を１：５，０００希釈で用いて可視化した。タンパク質バンドを、Ｘ線フィルム（Ａｇｆａ）上で、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｕｌｔｒａ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出した。
【００４１】
結果
被験体の採用
１型糖尿病を有する４人の患者ならびに４人の年齢および性別が一致した健常志願者を採用した（表２）。
【００４２】
ＥＰＣ数の評価
Ｔ１ＤＭを有する患者は、健常志願者と比較して、より少ない数のＥＰＣを有する（２４４±２０対３３４±７、ｐ＝０．０２）（図１）。
【００４３】
マトリックス分子への接着
Ｔ１ＤＭを有する患者は、コラーゲンに対する正常な接着（１．００±０．１１対１．３４±０．１５、ｐ＝０．１３）（図２）およびフィブロネクチンに対する正常な接着（１．６５±０．４４対２．１３±０．２０、ｐ＝０．１６）（図３）を有する。
【００４４】
内皮細胞への接着
次に、内皮細胞へのＥＰＣ接着に対する糖尿病の効果を、静止状態の内皮細胞において、ＴＮＦ−αへの曝露後に評価した。コントロール不良のＴ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣは、静止状態の内皮細胞に対する正常な接着を実証したが（７．０１±０．９１対７．７９±０．６８、ｐ＝０．５４）、活性化された内皮細胞に対する接着は損なわれていた（１１．０５±０．０１対２１．０３±１．１３、ｐ＝０．００１）（図４）。
【００４５】
Ｔ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣを使用した細管形成：
血管形成に関与するＥＰＣの能力の測定であるｉｎ ｖｉｔｒｏの細管形成を、次に評価した。Ｔ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣは、コントロールと比較して、細管を形成する能力が損なわれていた（１．７±０．９対９．８±１．８、ｐ＝０．０１）（図５）。この欠陥は、インスリン欠損糖尿病の動物モデルでも観察され、このとき、アロキソン誘導された糖尿病ウサギ由来のＥＰＣもまた、非糖尿病のコントロールウサギ由来のＥＰＣと比較して、損なわれた細管形成能力を示した（９．６±１．７７対１３．０±０．６５：ｐ＝０．０４９）（図６）。
【００４６】
コントロール不良の糖尿病を有する患者由来のＥＰＣにおけるオステオポンチンの発現：
リアルタイムＰＣＲを使用して、ＯＰＮ発現が、健常志願者と比較して、コントロール不良の糖尿病を有する患者由来のＥＰＣで減少することが実証された。
【００４７】
細管形成に対するＯＰＮ補充の効果：
コントロール不良のＴ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣにおけるＯＰＮの発現の減少が実証されたので、ＯＰＮに対するＥＰＣの曝露がこの欠陥を逆転できるか否かを決定することが求められた。これを行うために、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＥＰＣ機能に対するＯＰＮ補充の効果を評価した。ＯＰＮとのインキュベーションは、非糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数を増加させた（１３．０±０．６５対１６．５±１．１５：ｐ＝０．０３９；図７）。ＯＰＮとのインキュベーションはまた、糖尿病ウサギ由来のＥＰＣによって形成された細管の数も増加させた（９．８８±２．４８対１６．５６＋／−２．２１；ｐ＝０．０１）（図８）。
【００４８】
ＥＰＣ機能に対するＯＰＮの効果は、ＲＧＤ依存的である。
【００４９】
次に、ＯＰＮの作用機構がＲＧＤ依存的であるか否かを決定するための調査を行った。ＥＰＣを、ＯＰＮおよびＲＧＤまたはＲＡＤ（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）と同時インキュベートした。ＯＰＮおよびＲＧＤとＥＰＣの同時インキュベーションは、損なわれたＥＰＣ細管形成に関連したが、ＯＰＮおよびＲＡＤとのＥＰＣの同インキュベーションは関連しなかった。この実験の結果は、ＥＰＣ機能に対するＯＰＮの効果がＲＧＤ依存的であることを示す（図９）。
【００５０】
マイクロアレイ分析およびリアルタイムＰＣＲ
マイクロアレイ分析は、オステオポンチンが、糖尿病被験体由来のＥＰＣにおいて下方調節されることを実証した。これは、リアルタイムＰＣＲを使用してさらに立証された。平均変化倍率を、マイクロアレイ結果と比較した（表３）。
【００５１】
ＯＰＮ−ＫＯマウスにおける虚血誘導された血管形成：
ｉｎ ｖｉｖｏの血管形成におけるＯＰＮの役割を研究するために、片側後肢虚血のマウスモデルにおいて血管形成の程度を評価した。血流を、この手順の前および後に、ＷＴマウスおよびＯＰＮ−ＫＯマウスにおいて評価した。ＯＰＮ−ＫＯマウスにおいて、虚血肢と非虚血肢との間のＬＤＢＦ比の測定により、虚血後肢における灌流の回復が、有意に損なわれたことが示された。手術後７日目、１４日目および２８日目に、ＬＤＰＦ比は、ＯＰＮ−ＫＯマウスにおいて減少し、それぞれＷＴマウスに対して、０．３１±０．０７対０．６８±０．１１（Ｐ＝０．０２１）、０．３２±０．０３対０．５４±０．０５（ｐ＝０．００６）および０．４５±０．０６対１．０９±０．１３（Ｐ＝０．００２）（図１０および１１）であった。
【００５２】
血管形成の障害は、ＥＰＣ動員の低下に起因しない：
次に、ＯＰＮノックアウトマウスで観察された損なわれた欠陥形成の病因におけるＥＰＣ動員の役割を検討した。このために、循環ＥＰＣ数を、ＯＰＮノックアウト動物および野生型動物において後肢虚血の誘導の前および後に測定した。ＥＰＣ数のフローサイトメトリー分析を、後肢虚血の誘導の前および３日後に実施した。０日目に、両方のグループ間でＥＰＣ数に違いはなかった。さらに、ＥＰＣ数は、ＯＰＮノックアウトマウスにおいて、後肢虚血の誘導の３日後に増加した（０日目の０．３３±０．０５対３日目の０．５５±０．０５；ｐ＝０．０３６）。この結果は、ＯＰＮがＥＰＣの動員に関与しないことを示唆する。対照的に、ＥＰＣ数は、コントロールマウスにおいて、後肢虚血の誘導の３日後に増大しなかった（図１２および１３）。
【００５３】
Ａ．ｅｘ−ｖｉｖｏ心臓のＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ処置
リアルタイムＰＣＲによって決定したように、オステオポンチン発現レベルは、灌流したサンプルにおける発現レベルと比較して、虚血／再灌流ラット心臓において、５．１４分の１に減少した。
【００５４】
Ｂ．初代新生仔心筋細胞における虚血：
内因性虚血状態をシミュレートする条件に供したラット新生仔心筋細胞初代培養物において、オステオポンチンタンパク質発現レベルは、ウエスタンブロット分析において決定したとおり、正常条件下で培養した心筋細胞と比較して、減少した（図１４を参照のこと）。２時間目、８時間目、１２時間目および２４時間目に測定したオステオポンチン発現レベルは、虚血前のレベルに回復しなかった。
【００５５】
まとめると、ＯＰＮのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、虚血または虚血再灌流に応答して低下する。
【００５６】
考察
ＥＰＣの数および機能は、種々の因子によって効果を受け得る１５。減少したＥＰＣ数が、１型ＤＭおよび２型ＤＭを有する患者において実証された１６、１７。しかし、微小血管合併症は、これらの研究において排除されなかった。最近、糖尿病網膜症がＥＰＣ数を増加させることが示されている２０、２１。この理由のために、糖尿病網膜症および他の合併症を有さない均一集団を選択した。Ｔ１ＤＭを有するヒトにおいて他の混乱させる因子なしの高血糖症の効果を観察することが所望された。
【００５７】
データは、無併発性の１型糖尿病を有する患者由来のＥＰＣの数が減少していることを示した。これらの細胞は、コラーゲンおよびフィブロネクチンに対して正常な接着を示した。これらの細胞はまた、静止状態の内皮細胞に対する正常な接着を示したが、活性化された内皮細胞に対する接着は損なわれていた。Ｔ１ＤＭを有する患者由来のＥＰＣは、細管を形成する能力が損なわれていた。これらのデータは以前の研究と一致した１６、１７。糖尿病におけるＥＰＣの機能不全におけるＯＰＮの役割を試験した。ＯＰＮ発現は、コントロール不良のＴ１ＤＭを有する被験体から単離したＥＰＣにおいて顕著に減少していることが、初めて実証された。この結果は、マイクロアレイ分析を使用してLoomansらによって観察された効果とは反対である２２。この不一致の理由は不明であるが、研究した患者集団に起因する可能性がある。さらに、ＥＰＣの機能不全は、糖尿病動物由来の細胞を組換えＯＰＮの存在下で培養した場合に逆転することが実証されている。ＥＰＣ機能に対するＯＰＮの効果は、細管形成の増加が観察された非糖尿病動物由来の細胞においても見られた。このように、本発明は、末梢血管疾患、潰瘍、虚血性心疾患および脳血管疾患、ならびに脳動脈瘤に対して二次的なくも膜下出血および糖尿病網膜症を含む、細管形成の不良、または血管形成に関する問題点に関連する疾患の治療を可能にできる。ＥＰＣ機能に対するＯＰＮの効果は、ＲＧＤによって逆転されたがＲＡＤでは逆転されず、このことは、ＯＰＮの効果がＲＧＤ依存的であることを示す。
【００５８】
次に、血管形成におけるＯＰＮの役割を、ＯＰＮノックアウトマウスを使用して検討した。虚血後肢における灌流の回復は、ＯＰＮ−ＫＯマウスにおいて有意に損なわれることが実証された。手術後７日目、ＯＰＮ−ＫＯマウスにおけるＬＤＰＦ比は、ＷＴマウスの約半分であった。血流回復におけるこの障害は、手術後２８日目まで持続し、このことは、ＯＰＮの非存在が、片側後肢虚血のマウスモデルにおいて血管新生を損なうことを示唆している。この欠陥は、動員の低下および虚血部位における新たな血管へのＥＰＣの取り込みの障害に起因し得る。この結果は、ＯＰＮノックアウトにおける後肢虚血後のＥＰＣの循環レベルの増加が、損なわれた動員がこの機構でないことを示唆することを示す。この仮説は、糖尿病マウスにおける背側中部の皮膚創傷の誘導後７日目まで、ＯＰＮの発現がベースラインと異ならなかったことを示した、Ballardらからのデータによって支持される。ＯＰＮレベルは引き続いて、７日目に増加し、さらに４日間にわたり構成的により高いままであった。著者らは、糖尿病マウスにおけるＯＰＮの低発現が、一部、糖尿病マウスにおける創傷治癒の遅延の原因である可能性があることを示唆した３３。したがって、糖尿病ＥＰＣにおける減少したＯＰＮ発現は、糖尿病被験体の大血管合併症への傾向を説明し得る。
【００５９】
オステオポンチンは、健康な心筋において構成的に発現される分泌サイトカインまたは接着分子として存在する。その発現は、心筋梗塞後の非筋細胞において増加して、細胞生存率を保護し、適応リモデリングを助ける。オステオポンチンの喪失は、代償的な線維症および肥大化を損なって、心臓の性能を低下させる。オステオポンチン発現はまた、心筋梗塞および心不全によって、心筋細胞において顕著に増加する。オステオポンチン心臓保護の機構は、大部分未知である。オステオポンチンは、サイトカイン誘導される一酸化窒素シンターゼ発現を抑制して、一酸化窒素産生および収縮障害を防止する。細胞シグナル伝達は、細胞表面インテグリンレセプター結合を介して媒介される。インテグリンレセプターは、細胞外マトリックスにおける変化を細胞骨格に連絡する。オステオポンチンの発現増加には、肥大化の間の心臓レセプターβ１インテグリンの発現増加が伴う。抗インテグリン抗体は、抗オステオポンチン抗体によっても遮断される効果である、アンギオテンシンＩＩ誘導された心臓リモデリングを遮断し、このことは、アンギオテンシンＩＩのシグナル伝達がオステオポンチンを介して進行することを示唆している。
【００６０】
オステオポンチン欠損心臓線維芽細胞において、酸化ストレスは、アポトーシスが優勢である野生型細胞とは異なり、壊死を誘導した。この壊死は、オステオポンチンの内因性の再発現に際して減少した。しかし、心筋梗塞したマウス心臓のｉｎ ｖｉｖｏ研究により、オステオポンチン欠損心臓が、野生型心臓と同じ数のアポトーシス筋細胞を有することが示されている。
【００６１】
結論
糖尿病におけるＥＰＣの機能不全は、ＯＰＮ発現の減少と関連し、ＯＰＮ補充によって逆転でき、これは、糖尿病被験体が血管合併症になる傾向がより高い理由を説明し得る。さらに、ＯＰＮノックアウト動物における研究は、血管形成におけるＯＰＮの重要な役割を確認している。この結果は、この効果が、ＥＰＣにおけるより低いＯＰＮ発現に関連する可能性があることを示唆している。糖尿病におけるＥＰＣの機能不全は、この障害のための新たな治療標的を同定する、ＯＰＮ発現の減少に起因する。
【００６２】
単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および単語「有する／含む（ｈａｖｉｎｇ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本発明に関して本明細書中で使用する場合、記述された特徴、整数、工程または成分の存在を特定するために使用されるが、１以上の他の特徴、整数、工程、成分またはそれらの群の存在または付加を排除するものではない。
【００６３】
明確にするために、別個の実施形態に関して記載されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に関して記載されている本発明の種々の特徴は、別個にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供してもよい。
【００６４】
参考文献
【００６５】
【化１】
【００６６】
【化２】
【００６７】
【化３】
【００６８】
【表１】
表１：リアルタイムＰＣＲのためのプライマー配列
【００６９】
【表２】
表２：被験体の特徴
【００７０】
【表３】
表３：マイクロアレイ結果とリアルタイムＰＣＲ結果との間のオステオポンチン遺伝子発現（変化倍率）の比較
【００７１】
【表４】
表４：オリゴヌクレオチドプライマー
【００７２】
【表５】
表５−灌流した心臓と比較した場合の、Ｉ／Ｒに応答して変更された遺伝子発現
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、活性化された内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
【請求項２】
医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
【請求項３】
医薬的に許容される担体または賦形剤と共にオステオポンチンを含む医薬組成物。
【請求項４】
医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチンをコードする遺伝子または機能的オステオポンチンもコードするその変異体を含む医薬組成物。
【請求項５】
活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
【請求項６】
オステオポンチンをさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞の使用。
【請求項８】
心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製におけるオステオポンチンの使用。
【請求項９】
心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、オステオポンチンをコードする遺伝子の使用。
【請求項１０】
心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞の使用。
【請求項１１】
前記心血管疾患および糖尿病関連血管合併症が、心筋梗塞、冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全から選択される、請求項７から１０に記載の使用。
【請求項１２】
オステオポンチンを発現または過剰発現する、活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
【請求項１３】
オステオポンチン遺伝子発現を増大させるように遺伝子改変された、請求項１２に記載の活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
【請求項１４】
オステオポンチンによって活性化された、請求項１２に記載の活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
【請求項１５】
糖尿病を有する被験体が、糖尿病関係血管合併症を有するかどうか、または糖尿病関係血管合併症を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法であって、該被験体におけるオステオポンチン発現レベルを測定する工程、該オステオポンチン発現レベルを、糖尿病を有さないコントロール被験体に関連するオステオポンチン発現レベルと比較する工程とを含み、より低いオステオポンチン発現レベルが、該被験体における糖尿病関連血管合併症または糖尿病関係血管合併症を発症する危険性の増加のいずれかと相関する、方法。
【請求項１６】
被験体が、心血管疾患を有するかどうか、または心血管疾患を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法であって、該被験体におけるオステオポンチン発現レベルを測定する工程と、該オステオポンチン発現レベルを、心血管疾患を有さないコントロール被験体に関連するオステオポンチン発現レベルと比較する工程とを含み、より低いオステオポンチン発現レベルが、該被験体における心血管疾患または心血管疾患を発症する危険性の増加のいずれかと相関する方法。
【請求項１７】
前記オステオポンチン発現レベルが、血液、血清、組織または細胞において測定される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子治療による心血管疾患または糖尿病関連血管合併症の治療のための医薬の製造における、オステオポンチンをコードする遺伝子の使用。
【請求項１９】
医薬的有効量のオステオポンチンを患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２０】
医薬的有効量の、オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２１】
オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２２】
オステオポンチンによって活性化された内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２３】
オステオポンチンをコードする遺伝子または機能的オステオポンチンもコードするその変異体を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２４】
前記オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子治療技術の一部として内皮前駆細胞中で投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記心血管疾患または糖尿病関係血管合併症が、冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全および心筋梗塞から選択される、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全、心筋梗塞および糖尿病関連血管合併症などの心血管疾患の治療のための化合物を同定するための方法であって、試験化合物をオステオポンチン発現が下方調節される細胞と接触させる工程と、オステオポンチン発現に対する該候補化合物の効果を決定する工程とを含む方法。
【請求項２７】
冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全、心筋梗塞および糖尿病関連血管合併症などの心血管疾患を治療するための血管形成因子としてのオステオポンチンの使用。
【請求項２８】
組換えオステオポンチンタンパク質、オステオポンチンの直接投与、またはオステオポンチンを過剰発現するように遺伝子改変されたＥＰＣもしくはＭＳＣなどの細胞、またはオステオポンチン処理によって活性化されたＥＰＣもしくはＭＳＣの使用である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
オステオポンチンに対して惹起された抗体。
【請求項３０】
オステオポンチンに対して惹起された抗体で被覆され、活性化された内皮前駆細胞もしくは活性化された間葉系幹細胞で被覆され、またはオステオポンチンを過剰発現する内皮前駆細胞もしくは間葉系で被覆された医療用デバイス。
【請求項３１】
ステント、縫合糸、絆創膏もしくは包帯、またはプロテーゼから選択される、請求項３０に記載の医療用デバイス。
【請求項１】
医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、活性化された内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
【請求項２】
医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
【請求項３】
医薬的に許容される担体または賦形剤と共にオステオポンチンを含む医薬組成物。
【請求項４】
医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチンをコードする遺伝子または機能的オステオポンチンもコードするその変異体を含む医薬組成物。
【請求項５】
活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
【請求項６】
オステオポンチンをさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞の使用。
【請求項８】
心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製におけるオステオポンチンの使用。
【請求項９】
心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、オステオポンチンをコードする遺伝子の使用。
【請求項１０】
心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞の使用。
【請求項１１】
前記心血管疾患および糖尿病関連血管合併症が、心筋梗塞、冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全から選択される、請求項７から１０に記載の使用。
【請求項１２】
オステオポンチンを発現または過剰発現する、活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
【請求項１３】
オステオポンチン遺伝子発現を増大させるように遺伝子改変された、請求項１２に記載の活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
【請求項１４】
オステオポンチンによって活性化された、請求項１２に記載の活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
【請求項１５】
糖尿病を有する被験体が、糖尿病関係血管合併症を有するかどうか、または糖尿病関係血管合併症を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法であって、該被験体におけるオステオポンチン発現レベルを測定する工程、該オステオポンチン発現レベルを、糖尿病を有さないコントロール被験体に関連するオステオポンチン発現レベルと比較する工程とを含み、より低いオステオポンチン発現レベルが、該被験体における糖尿病関連血管合併症または糖尿病関係血管合併症を発症する危険性の増加のいずれかと相関する、方法。
【請求項１６】
被験体が、心血管疾患を有するかどうか、または心血管疾患を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法であって、該被験体におけるオステオポンチン発現レベルを測定する工程と、該オステオポンチン発現レベルを、心血管疾患を有さないコントロール被験体に関連するオステオポンチン発現レベルと比較する工程とを含み、より低いオステオポンチン発現レベルが、該被験体における心血管疾患または心血管疾患を発症する危険性の増加のいずれかと相関する方法。
【請求項１７】
前記オステオポンチン発現レベルが、血液、血清、組織または細胞において測定される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子治療による心血管疾患または糖尿病関連血管合併症の治療のための医薬の製造における、オステオポンチンをコードする遺伝子の使用。
【請求項１９】
医薬的有効量のオステオポンチンを患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２０】
医薬的有効量の、オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２１】
オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２２】
オステオポンチンによって活性化された内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２３】
オステオポンチンをコードする遺伝子または機能的オステオポンチンもコードするその変異体を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
【請求項２４】
前記オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子治療技術の一部として内皮前駆細胞中で投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記心血管疾患または糖尿病関係血管合併症が、冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全および心筋梗塞から選択される、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全、心筋梗塞および糖尿病関連血管合併症などの心血管疾患の治療のための化合物を同定するための方法であって、試験化合物をオステオポンチン発現が下方調節される細胞と接触させる工程と、オステオポンチン発現に対する該候補化合物の効果を決定する工程とを含む方法。
【請求項２７】
冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全、心筋梗塞および糖尿病関連血管合併症などの心血管疾患を治療するための血管形成因子としてのオステオポンチンの使用。
【請求項２８】
組換えオステオポンチンタンパク質、オステオポンチンの直接投与、またはオステオポンチンを過剰発現するように遺伝子改変されたＥＰＣもしくはＭＳＣなどの細胞、またはオステオポンチン処理によって活性化されたＥＰＣもしくはＭＳＣの使用である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
オステオポンチンに対して惹起された抗体。
【請求項３０】
オステオポンチンに対して惹起された抗体で被覆され、活性化された内皮前駆細胞もしくは活性化された間葉系幹細胞で被覆され、またはオステオポンチンを過剰発現する内皮前駆細胞もしくは間葉系で被覆された医療用デバイス。
【請求項３１】
ステント、縫合糸、絆創膏もしくは包帯、またはプロテーゼから選択される、請求項３０に記載の医療用デバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５２０１８１（Ｐ２０１０−５２０１８１Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１２２８（Ｐ２００９−５５１２２８）
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５２５７８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０７４２２
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０６３３３９２３）ナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド・ゴルウェイ (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｇａｌｗａｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５２５７８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０７４２２
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０６３３３９２３）ナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド・ゴルウェイ (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｇａｌｗａｙ
【Ｆターム（参考）】
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