懸滴装置、懸滴システム、および／または懸滴方法
本開示内容は、装置、システム、およびこのような装置を流体の懸滴の生成および取扱に使用する方法に広く関連する。また、本開示内容は、細胞培養用装置と、この細胞培養用装置の使用方法および／またはシステムと、例えば研究およびハイスループットのスクリーニングのための、この細胞培養用装置の利用とにも関連する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は米国特許出願Ｎｏ．６１／２９９，０１１号（出願日：２０１０年１月２８日）に基づく優先権を主張するものであり、上記米国特許出願を参照することによりその全開示内容を援用する。さらに、本願は、Sambrook, J. et al.によるマニュアル“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp.16.9-16.15”を援用することによりその全開示内容を援用する。
【０００２】
［技術分野］
本開示内容は、装置、システム、および懸滴の発生および取扱においてそのような装置を使用する方法に広く関連する。また、本開示内容は、細胞培養装置、システム、およびこのような装置を使用する方法にも広く関連する。また、本開示内容は、上記細胞培養装置の研究およびハイスループット・スクリーニング（high throughput screening）のための使用用途にも広く関連する。
【０００３】
［背景技術］
薬剤物検査およびスクリーニング（screening）実験用のインビトロ（in vitro）細胞モデルおよびインビトロ組織モデルは、製薬産業における新規の治療学の発展の中核をしばし成している。現在、ほとんどのインビトロ研究は従来の２次元（２Ｄ）細胞培養系の下で実施されているが、こうした２次元細胞培養系は機能性組織および腫瘍の生理学的モデルではない場合が多い。よって、このようなモデルを使用する薬剤研究では、正確な読み出し情報（read out）が得られないことがある。より有意義な結果を得るために、動物を使用するインビボ（in vivo）研究がしばしば利用される。一方で、インビボ研究の明らかな欠点の１つとして、多大な時間を必要とすることと、実験の費用が高くなることが挙げられる。従来の非生理的な２Ｄモデルとインビボ実験との間のギャップを埋めるために、製薬産業における薬剤検査とスクリーニングの治療予測的且つ生理学的に適切な結果を提供する３次元（３Ｄ）のインビトロモデルが必要とされている。３Ｄ細胞培養モデルを作製する１つの方法として、スフェロイド（spheroid）、または３Ｄの細胞集合または細胞集合体を介して行う作製方法がある。
【０００４】
ハイスループット・スクリーニングおよび試験など特定の用途に適した方法によるスフェロイド培養物の成長は幾つかの欠点を抱えている。従来のスフェロイド形成は、ペトリ皿の蓋部の裏面の懸滴中で細胞浮遊液を培養することを含んでいる。この処理では、液滴の配置後に上記蓋部を反転させることが必要である。その結果、上記液滴が摂動の影響を受けやすくなり、落下、広がり、および隣接する滴との融合を起こす。この方法は、費用は高くないが、大きな労働力を必要とし、効率的なスケーラブル（scalable）生産が不可能であり、ハイスループット・スクリーニング用の自動化器具に対応しないものである。上記スフェロイドを損傷させずに培地を交換するのは難しいため、この方法は通常、上記スフェロイドを人手によって１つずつ長期培養、処理、分析、および収集（ハーベスト）のためにマルチウェル培養プレートへ移す他の労働集約的な工程を必要とする。
【０００５】
代わりの方法としては、スピナーフラスコおよび回転型の培養容器などの生物反応器内で細胞懸濁液を、連続攪拌する条件下でスフェロイドの形成を誘発する。この方法では、大量の培地を消費することが必要である。また、この方法は特殊な器具を必要とし、上記スフェロイドのサイズと均一性を制御することが困難である。スフェロイドの変動性は高く、スフェロイドを多くの用途に使用することができない。
【０００６】
３次元のミクロウェル（micro well）構造と平面状の微細パターンを使用してスフェロイドを産出する方法も可能である。しかし、これらの方法は、上記ミクロウェル構造と上記微細パターンを発生させる特殊な器具と高価な器具と必要とする。さらに、複数のスフェロイドを１つの流体区内で培養するため、上記スフェロイドを個別にモニタリングや操作することが不可能であり、試験化合物で個別に処理することも不可能である。また、処理の前後に個々のスフェロイドを分析することが困難なので、上記方法は、例えば、薬剤試験用途およびスクリーニング用途など特定の用途に不適当である。
【０００７】
他の最近の進歩は、スフェロイドを発生および操作するように設計された微小流体素子を含む。しかし、これらの素子は設計および作製するには費用が高い。また、これらの素子はスフェロイドの長期的な培養には適しておらず、特定の薬剤と化学的に対応しておらず、ハイスループット・スクリーニングを行う自動化器具とも対応していない。
【０００８】
上述の技術における問題に対処するために、本願に開示する装置、方法、および／またはシステムが必要とされている。
【０００９】
［発明の概要］
本開示内容は、装置、システム、および流体の懸滴およびその取扱にそのような装置を使用する方法に広く関連する。また、本開示内容は、このような装置を使用する細胞培養装置、システム、および方法にも広く関連する。また、本開示内容は、研究用途とハイスループット・スクリーニング用途への細胞培養装置の利用にも広く関連する。
【００１０】
例えば、一部の実施形態では、本開示内容は、（ａ）上面と、底面と、複数の孔とを有している少なくとも１つのアレイプレート（array plate）であって、上記複数の孔の各々は上部と底部とを有し、該少なくとも１つアレイプレートの上記底面は上記複数の孔のうち少なくとも１つ以上の底部に実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー（plateau）部を有している少なくとも１つのアレイプレートを備え；（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートは複数の懸滴を収容するように構成され、各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下して、上記孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成されている孔の数以下であるシステムを提供する。特定の実施形態では、上記システムが、上記少なくとも１つのアレイプレートの下方に配置された少なくとも１つの第２のプレートを更に備えている。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている。特定の実施形態では、上記複数の懸滴のうち１つ以上が下記の１つ以上を含んでいる：複数の細胞；少なくとも１つの複合組織または有機体；生体物質および／または化学物質を含んでいる水性の流体；１つ以上のタンパク質；１つ以上のナノ粒子；１つ以上の試験化合物；１つ以上の薬剤；水性の液体からなる固形物またはゲル；または、これらの組み合わせ。特定の実施形態では、対応する処理面の特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部を処理する。特定の実施形態では、上記システムが、米国規格協会（American National Standard Institute）および／または生体分子化学規格協会（Society for Biomolecular Science）に準拠している。特定の実施形態では、上記システムがハイスループット・スクリーニングに適合可能である。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の配置を安定させるように構成されている。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面上に設けた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の位置を安定させるように構成されている。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の懸滴の測定可能な特性を安定および保持するように構成されている。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備え、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記孔への液体の輸送および／または上記孔からの液体の輸送を向上するように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、実質的に安定している湿度を保持するように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、上記複数の懸滴の環境の測定可能な特性を保持するように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、少量の流体を取り扱うように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、上記複数の懸滴の１つ以上において複数の細胞の長期的培養を可能とするように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、以下の１つ以上を可能とするように構成されている：複数の細胞の長期的培養、保持、分析、および／または試験；少なくとも１つの複合組織または有機体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；生体物質および／または化学物質を含む液体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のタンパク質の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のナノ粒子の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の試験化合物の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の薬剤の長期的培養、保持、分析、および／または試験；または、これらの組み合わせ。
【００１１】
例えば、特定の実施形態は、複数の懸滴をシステム内へと導入する工程を含む方法であって、上記システムは、（ａ）上面と、底面と、複数の孔とを有する少なくとも１つのアレイプレートを備え、上記複数の孔のそれぞれは上部と底部を有し、上記アレイプレートの上記底面は、上記複数の孔のうち少なくとも１つの孔の底部と実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を備え、（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートが複数の懸滴を収容するように構成され、上記複数の懸滴の各々は、上記複数の孔のうち対応する１つの孔から懸下し、上記対応する１つの孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる上記複数の懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成された上記複数の孔の数以下であり、上記複数の懸滴のうち１つ以上に対して、培養と、保持と、分析と、試験との何れか、またはそれらの組み合わせを行う方法である。
【００１２】
例えば、特定の実施形態は、上面と底面とを有するアレイプレートを備え、上記アレイプレートには複数の孔が形成され、上記複数の孔の各々は上面と底面を有し、上記アレイプレートの上面は、上記複数の孔のうち１つ以上の上面に隣接または実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を備えている装置である。
【００１３】
例えば、特定の実施形態は、上面および底面を有している１つ以上のアレイプレートと、このアレイプレートの下方に配置されている貯水プレート（例えば、９６ウェルプレート）とを備えている装置であって、（ａ）上記アレイプレートは、複数の行列状に配置された複数の孔を有し、上記複数の孔のそれぞれは上面と底面を有し、上記アレイプレートの上記底面は、上記複数の孔のそれぞれの底面に隣接しているプラトー部を備え、（ｂ）上記貯水プレートは上記アレイプレートの端部（例えば、端部のみ）と接触し、上記複数の孔とは接触していない装置を提供する。一部の実施形態では、上記装置が上記装置のためのカバーを含み、上記カバーが上記アレイプレートの上に配置され、上記カバーが上記複数の孔と接触していない。一部の実施形態では、上記貯水部が水性の流体を含んでいる。一部の実施形態では、上記装置がポリマー・プラスチック（polymer plastic）（例えば、ポリスチレン）から作製されている。一部の実施形態では、上記アレイプレートが３８４個の孔を有している。一部の実施形態では、上記複数の孔の直径が約１．６ｍｍである。一部の実施形態では、上記複数の孔は互いから約４．５ｍｍ離れている。一部の実施形態では、上記装置が、上記複数の孔の少なくとも片側（例えば、両側）の上部および／または底部に隣接または実質的に隣接している追加のプラトー部または環状構造を更に備えている。一部の実施形態では、上記プラトー部の端部は（例えば液滴を安定させるために）環状構造を備えている。一部の実施形態では、上記装置の１つ以上の要素に対して表面処理（例えば、コーティング、プラズマ処理など）を行っている。
【００１４】
特定の実施形態では、以下のように構成したシステムを提供する。すなわち、（ａ）上面および底面を有する１つ以上のアレイプレートを備え、上記１つ以上のアレイプレートの各々は、複数の行列状に配置された孔を有し、上記孔の各々は上面と底面を有し、上記アレイプレートの底面は、上記孔の各々の底面に実質的に隣接しているプラトー部を備え、（ｂ）上記貯水プレートは上記アレイプレートの端部（例えば、端部のみ）に接触し、上記孔には接触せず、ｃ）上記流体の液滴が上記孔のうち１つ以上から懸下し、上記孔の下方で広がるシステム。一部の実施形態では、上記懸滴が複数の細胞を含んでいる。一部の実施形態では、上記細胞が懸濁液中にある。一部の実施形態では、上記細胞が凝集体、クラスター（cluster）、またはスフェロイドを形成している。一部の実施形態では、上記細胞が、例えば、胚、組織、微小有機体、蠕虫などの複合組織または複合有機体である。他の実施形態では、上記懸滴は、生体物質および／または化学物質、または、これらの組み合わせを含む水性の流体である。例えば、上記物質として、タンパク質、ナノ粒子、ヒドロゲル（hydrogel）が挙げられる。一部の実施形態では、上記細胞は癌細胞（例えば、スフェロイドに成長した細胞）である。一部の実施形態では、上記システムが試験化合物（例えば、抗癌剤）を更に備えている。一部の実施形態では、上記システムが更に蓋部を備え、上記蓋部が上記細胞に接触せずに上記アレイプレートを覆う。一部の実施形態では、上記アレイプレート、上記貯水部、および上記カバーは、水分の喪失を防止または抑制するフィルムで巻かれている。一部の実施形態では、上記システムは１つ以上のハイスループット試料取扱装置（例えば、試料取扱用ロボット装置またはプレート読取器）を更に備えている。
【００１５】
本開示内容は更に、以下の肯定を含む方法を提供する。すなわち、（ａ）複数の懸滴を装置に流入させる工程であって、上記装置は、ｉ）上記１つ以上のアレイプレートの各々は上面および底面を有し、上記１つ以上のアレイプレートの各々は複数の行列状に配置された孔を有し、上記アレイプレートの底面は、上記孔の各々の底面に実質的に隣接するプラトー部を備え、ｉｉ）上記貯水プレートは上記アレイプレートの下方に位置しており、上記貯水プレートは上記アレイプレートの端部（例えば、端部のみ）と接触する一方で、上記孔とは接触せず、上記液滴が上記アレイプレートに形成された上記孔のうち１つ以上から懸下して、この１つ以上の孔の下方で広がる装置である工程と、（ｂ）懸滴中において、細胞が成長および／または生存を保守する条件下で細胞を培養する工程。一部の実施形態では、上記細胞は癌細胞、胚幹細胞、肝細胞など（例えば、スフェロイド状に成長している細胞）である、一部の実施形態では、上記方法は、上記細胞を試験化合物（例えば、薬剤、化学物質、気体、生体分子、またはナノ粒子）に接触させ、上記細胞の成長または他の特性に対する上記試験細胞の効果を分析（アッセイ（assay））する工程を更に備えている。一部の実施形態では、懸滴が、上記アレイプレートの上方側または下方側から上記孔または上記孔の１つの開口部を介して配置される。一部の実施形態では、上記方法が、上記液体を上記孔または上記孔の１つの開口部に供給して、追加の液体および／または細胞を上記懸滴に添加する工程を更に備えている。一部の実施形態では、上記方法は、上記液体および／または細胞を、上記孔を介して除去する工程を更に備えている。一部の実施形態では、上記アレイプレートの異なる部位（例えば、異なる懸滴または異なる細胞集団）を異なる試験化合物および／または成長条件下に曝す。
【００１６】
特定の実施形態は、以下のシステムに関する。すなわち、アレイプレートと、蓋部と、トレイとを備えているシステムであって、上記アレイプレートが上面および底面と、貯水部と、複数の孔またはアクセス孔とを有し、上記複数のアクセス孔の各々は上面と底面とを有し、上記アレイプレートの上記底面は、上記複数のアクセス孔の底面に隣接または実質的に隣接している１つ以上のプラトー構造を備え、上記アレイプレートの上面は、上記複数のアクセス孔の上面に隣接または実質的に隣接している１つまたは複数の第２のプラトー構造を備えているシステム。システムの特定の実施形態では、上記蓋部と上記トレイによって上記アレイプレートが取り囲まれ、細胞培養が外部環境および外部物質から隔離される。特定の実施形態では、上記アレイプレート、上記蓋部、および上記トレイが同じ材料から形成される。他の実施形態では、上記アレイプレートと、上記蓋部と、上記トレイとの１つ以上が異なる材料から形成されている。一部の実施形態では、上記システムは実質的に密閉されている。他の実施形態では、上記システムは、上記システムの内と外との間でのガス交換および／または上記システム内の湿度の保持を可能にするのに十分な程度に密閉されている。一部の実施形態では、上記アレイプレートと上記トレイの一方または両方が、水性の液体を収容している貯水部を備えている。一部の実施形態では、上記液体は、上記システム内の湿度を保つように気体を提供する。他の実施形態では、上記貯水部は他の物質を収容している。一部の実施形態では、上記トレイの底面は、実質的に、光学的に透明である。一部の実施形態では、実質的に光学的に透明な上記トレイの底面は実質的に平坦であり、光学的イメージングおよび光学的分析（顕微鏡法のイメージングおよび測定、比色法のイメージングおよび測定、蛍光法のイメージングおよび測定、発光法のイメージングおよび測定など）を行う場合、細胞培養の様子を実質的に妨げられることなく観察できる。一部の実施形態では、上記システム（または複数の上記システム）は、例えば、ＡＮＳＩ／ＳＢＳ（米国規格協会／生体分子化学規格協会）による現行の標準規格などの標準規格と適合する配置および測定を有しているので、上記システムが、研究開発（例えば、ハイスループット・スクリーニング）で使用されている主流の撮像システムおよび自動化装置と適合可能になる。
【００１７】
追加の実施形態を以下に説明する。
【００１８】
［図面の説明］
添付図面により、この技術の一例である各実施形態の理解が容易になるであろう。
【００１９】
図１は、本開示内容のある実施形態に係る装置の例を示し、（ａ）は本発明の実施形態で使用される３８４−ウェル仕様の細胞スフェロイド培養用アレイプレートを示す断面図であり、（ｂ）は上記アレイプレートの写真および上記アレイプレートの寸法を示し、（ｃ）は９６箇所の細胞培養部位を同時にピペット操作可能な液体取扱ロボットによって作動される上記アレイプレートの写真を示し、（ｄ）は加湿室の図を示す。
【００２０】
図２の（ａ）はある実施形態に係る、細胞集団の異なるＣＯＳ７細胞スフェロイドと、ｍＥＳ細胞スフェロイドと、Ａ４３１．Ｈ９細胞スフェロイドとについて、７日間を超え１２日間までの培養中における重量オスモル濃度を示し、ある実施形態に係る、（ｂ）は染色した生／死ＣＯＳ７細胞スフェロイドと生／死ｍＥＳ細胞スフェロイドとについて、１２日間の培養中の様子を写した蛍光画像を示し、（ｃ）は細胞の開始数に対するＡ４３１．Ｈ９スフェロイドのサイズ（直径）を示し、（ｄ）は、ある実施形態について、様々な開始数の細胞／スフェロイドの培養時間に対するＡ４３１．Ｈ９スフェロイドのサイズ（体積）を示す。
【００２１】
図３は、特定の実施形態におけるＴＰＺを使用する薬剤処理の結果を示し、異なる濃度におけるＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの経時画像と、全てのスフェロイドサイズと従来の２Ｄ培養条件について、薬剤処理から９６時間後の対照細胞の生存率（％）を異なる濃度毎に概説する棒グラフとを示す。
【００２２】
図４は、特定の実施形態における５−ＦＵを使用する薬剤処理の結果を示し、異なる濃度におけるＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの経時画像と、全てのスフェロイドサイズと従来の２Ｄ培養条件について、薬剤処理から９６時間後の対照細胞の生存率（％）を異なる濃度毎に概説する棒グラフとを示す。
【００２３】
図５は、特定の実施形態で使用する装置例の概略図を示す。
【００２４】
図６は、特定の実施形態で使用する装置例の概略図を示す。
【００２５】
図７は、特定の実施形態で使用する装置例の詳細図を示す。
【００２６】
図８は、特定の実施形態で使用する装置例の詳細図を示す。
【００２７】
図９は、特定の実施形態に係るプラトー部の図を示す。
【００２８】
図１０は、特定の実施形態に係る装置に細胞と液体を加え、この装置から上記細胞と液体を除去する方法例の概略図を示す。
【００２９】
図１１は、特定の実施形態に係る方法を使用して培養したｍＥＳスフェロイドを示す。
【００３０】
図１２は、特定の実施形態に係る方法を使用して培養したｍＥＳスフェロイドを示す。
【００３１】
図１３は、特定の実施形態に係る方法を使用して培養した肝細胞スフェロイドを示す。
【００３２】
図１４は、特定の実施形態で使用する装置例の概略図を示す。Ａ：全体図。Ｂ：環状構造の拡大図。
【００３３】
図１５は、特定の実施形態において異なる濃度で測定した蛍光分析と吸光分析とのＺファクタ（Z-factors）を示す。
【００３４】
図１６のＡ−Ｆは、特定の実施形態におけるアレイプレートの例を示す。図１６のＡは上面図を示し；図１６のＢは上方からの等角図を示し；図１６のＣは側面図を示し；図１６のＤは端面図を示し；図１６のＥは、図１６のＡに示すＭ−Ｍ切断線に沿った断面図を示し；図１６のＦは、図１６のＣに示すＬ−Ｌ切断線に沿ったアレイプレートの断面図を示す。
【００３５】
図１７のＡ−Ｄは、特定に実施形態に係るプラトー構造の例を示す。図１７のＡは上面図を示し；図１７のＢは上方からの等角図を示し；図１７のＣは底面図を示し；図１７のＤは底面からの等角図を示す。
【００３６】
図１８は、特定の実施形態に係るアクセス孔構造の例の上面図、断面図、および底面図を示す。
【００３７】
図１９は、特定の実施形態に係るアクセス孔の配列例の断面描写と、上面および底面からの等角３Ｄ描写とを示す。
【００３８】
図２０のＡ−Ｆは、特定の実施形態に係る、図１６に示すアレイプレートと共に使用されるトレイの例を示す。図２０のＡは上面図を示し；図２０のＢは上面からの等角図を示し；図２０のＣは側面図を示し；図２０のＤは端面図を示し；図２０のＥは、図２０のＡに示すＰ−Ｐ切断線に沿う断面図を示し；図２０のＦは、図２０のＣに示すＮ−Ｎ切断線に沿ったトレイの断面図を示す。
【００３９】
図２１のＡ−Ｆは、特定の実施形態に係る、図１６に示すアレイプレートと共に使用される蓋部の例を示す。図２１のＡは上面図を示し；図２１のＢは上面からの等角図を示し；図２１のＣは側面図を示し；図２１のＤは端面図を示し；図２１のＥは、図２１のＡに示すＲ−Ｒ切断線に沿う断面図を示し；図２１のＦは、図２１のＣに示すＴ−Ｔ切断線に沿った蓋部の断面図を示す。
【００４０】
図２２のＡ−Ｆは、特定の実施形態に係る、アレイプレートと、トレイと、蓋部とを組み合わせた組立部の例を示す。図２２のＡは上面図を示し；図２２のＢは等角図を示し；図２２のＣは側面図を示し；図２２のＤは端面図を示し；図２２のＥは、図２２のＡに示すＶ−Ｖ切断線に沿う断面図を示し；図２２のＦは、図２２のＣに示すＵ−Ｕ切断線に沿った上記組立部の断面図を示す。
【００４１】
図２３のＡ−Ｂは、特定の実施形態に係る、図２２のＡ−Ｆに示す上記組立部の積み重ねの例を示す。図２３のＡは側面図を示し、図２３のＢは端面図を示す。
【００４２】
図２４のＡ−Ｄは、特定の実施形態に係る、アクセス孔構造の変形例を示す。図２４のＡは、高くて薄いプラトー構造が上面に設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＢは、短くて薄いプラトー構造が上部に設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＣは、高くて厚いプラトー構造が上部に設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＤは、高くて薄いプラトー構造が上部に設けられ、インジェクション形成用の異なる分割線が設けられたアクセス孔構造の例を示す。
【００４３】
［定義］
本開示内容の理解を容易にするために、以下に多くのタームとフレーズの定義を示すが、タームの定義を本開示内容の他の箇所に示すこともある。
【００４４】
“試料”は、係るタームの最も広義の意味で使用する。一方では、“試料”は標本（specimen）または培養物を含む。他方では、“試料”は生体試料と環境試料との両方を含む。
【００４５】
生体試料は、ヒトを含む動物、流体、固体（例えば排泄物）または組織であってよく、乳製品、植物性食品、食用肉および食肉処理された獣の肉以外の有用物、および廃棄物などの液体状および固体状の食料と飼料と、その成分とであってもよい。生体試料は、多様な族を含む家畜および野生動物から得ることができる。このような動物としては、有蹄動物、熊、魚、重歯目、齧歯目などの動物、または、これらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
【００４６】
環境試料は、表面試料、土壌試料、水試料、および工業試料などの環境物質を含み、食品・乳製品加工器具、装置、機器、用具、使い捨て用品および廃棄不可能用品、またはこれらの組み合わせを使用して得られる試料をも含む。これらの例は、本開示内容に利用可能な試料のタイプを限定するものではない。
【００４７】
本開示内容で使用するように、“細胞”は、インビトロ、インビボ、およびそれらの組み合わせの何れにあるのかに関わらず、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、E. coliなどの細菌性細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚細胞、昆虫細胞）を指す。また、“細胞”は、懸濁液中、細胞集合または細胞集合体中に１つ以上の細胞を含む液体または溶液をも指す。
【００４８】
本開示内容で使用するように、“細胞培養”は任意のインビトロ細胞培養を指す。そして、“細胞培養”に含まれるものは、連続継代細胞系（例えば、不死化表現型の連続継代細胞系）、細胞初代培養、形質転換細胞系、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、インビトロで操作を行った他の細胞集団、または、これらの組み合わせである。
【００４９】
本開示内容で使用する“トランスフェクション（transfection）”は、外来核酸の真核細胞への導入を指す。トランスフェクションは、本技術に公知の多様な手段によって行ってもよい。これら手段としては、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション法、ポリブレン媒介トランスフェクション法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合、リポフェクション、原形質融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃法が挙げられる。
【００５０】
本開示内容で使用するように、“選択可能なマーカー”は、成長に必須の栄養素が不足している培地中においても成長できる能力を付与する酵素活性をエンコードする遺伝子（例えば、酵母細胞のＨＩＳ３遺伝子）の使用を指す。さらに、選択可能なマーカーは、上記選択可能なマーカーを発現する細胞に、抗生物質と薬剤との何れかに対する耐性を付与してもよい。選択可能なマーカーは“優性”でもよく、すなわち、任意の真核細胞系内で検出できる酵素活性をエンコードする選択可能な優性マーカーでもよい。例えば、選択可能な優性マーカーとしては、哺乳類細胞において薬剤Ｇ４１８に対する耐性を付与する細菌アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子（neo gene）とも称する）と、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子とミコフェノール酸の存在下で成長する成長能力を付与する細菌キサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも称する）とが挙げられる。他の選択可能なマーカーとしては、関連酵素活性の欠如した細胞系と併せて使用する必要があるという点において、優性以外のマーカーでもよい。例えば、選択可能な非優性マーカーとして、ｔｋ−細胞系と併せて使用するチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子と、ＣＡＤ欠失細胞と併せて使用するＣＡＤ遺伝子と、ｈｐｒｔ−細胞系と併せて使用する哺乳類ヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子とが挙げられる。哺乳類細胞系内での選択可能なマーカーの使用の再検討は、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp.16.9-16.15）に提供されている。
【００５１】
本開示内で使用するように、“真核生物”は、“原核生物”と区別可能な有機体を指す。“真核生物”としては、真核生物の一般的な特性を示す細胞を有する有機体が含まれ、このような特性としては、核膜によって包まれた、染色体を内部に有する真核の存在と、膜結合性の細胞小器官の存在と、真核生物に共通して確認される他の特性とが挙げられる。したがって、“真核生物”は、菌類、原生動物類、獣類（例えば、ヒト）などの有機体を含むが、これに限定されない。
【００５２】
本開示内容で使用するように、“インビトロ”は、人工環境と、人工環境内で生じる処理または反応とを指す。インビトロ環境は、試験管および／または細胞培養とからなるものであればよいが、これに限定されない。“インビボ”は、自然環境（例えば、動物または細胞）と、自然環境内で生じる処理または反応とを指す。
【００５３】
“試験化合物”と“候補化合物”は、任意の化学物質、調合剤、薬剤など、身体機能の疾患、疾病、病気、または障害の治療と予防の何れかの用途に利用する化合物の候補を指す。試験化合物は、公知の治療化合物と潜在的な治療化合物の両方を含む。試験化合物は、本開示内容のスクリーニング方法、装置、および／またはシステムを使用するスクリーニングによって、治療効果を有するものであると定めてもよい。本開示内容の幾つかの実施形態では、試験化合物は、アンチセンス化合物、ｓｉＲＮＡ化合物、および／またはｓｈＲＮＡ化合物を含むものでよい。
【００５４】
“スフェロイド”は、細胞集合または細胞集合体の何れか、および／または細胞群体を指す。スフェロイドは、例えば、初代細胞、細胞系、腫瘍細胞、幹細胞などの多様な種類の細胞から構成されてよい。また、スフェロイドは、スフェロイド状の形状または不規則状の形状を有するものでもよい。スフェロイドは、細胞、細胞の種類、異なる状態の細胞の不均一集団を含んでよく、例えば増殖細胞、静止細胞、および壊死細胞などを含んでよい。
【００５５】
［詳細な説明］
共通の特性と特徴を有する幾つかの実施形態に関して、以下の説明を行う。ある実施形態の１つまたは複数の特徴が他の実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせ可能であることは理解されるであろう。さらに、任意の実施形態の単一の特徴または複数の特徴の組み合わせによって、さらなる実施形態を構成してもよい。
【００５６】
本明細書の“含んでいる・構成される（comprising）”は“非制限的”な意味の語（すなわち、“含む（including）”の意味）であり、“制限的”な意味の語（すなわち、“それらのみで構成される”の意味）ではないことは理解されるであろう。また、“含む・構成する（comprise）”および“含まれた・構成された（comprised）”などの対応語を使用する箇所についても、対応する意味を割り当てるものとする。
【００５７】
詳細な説明で使用する見出しは、本明細書の読者の参照を容易にするためのものであり、本開示内容または特許請求の範囲を通じて見られる発明特定事項を限定するものではない。上記見出しは、特許請求の範囲または請求項に記載の限定事項を解釈するものとしては使用していない。
【００５８】
ある実施形態では、上記装置は２Ｄ細胞培養法と３Ｄ細胞培養法とを組み合わせている。例えば、ある実施形態では、一部の細胞はアクセス孔の内壁で培養され（２Ｄ細胞培養法）、他の細胞は、上記アクセス孔の底面の懸滴中で、スフェロイドとして培養される（３Ｄ細胞培養）。例えば、ある実施形態では、上記装置が、従来のマルチウェルプレートにおいて見られるアクセス孔とウェル構造を含み、同一装置内で細胞の３Ｄ培養と２Ｄ培養との両方を行えるようにしている。他の実施形態では、上記アクセス孔の内部と上記ウェルの内部とは接続し、上記アクセス孔内の細胞と上記ウェル内の細胞とが、細胞生産物（例えば、化学分子または生体分子）の分泌および／または検出により相互作用を行えるようにしてもよい。
【００５９】
スフェロイドは、腫瘍組織および／または機能性組織用の優れた３Ｄモデルとして役立つ。スフェロイドは、細胞−細胞間の相互作用が細胞−基板間の相互作用に対して優位性を有する場合に、自己組織化によって形成される細胞群体の球状の集合である。スフェロイドは、通常、細胞の集合または集合体、および／または、細胞−細胞間の相互作用が細胞−基板間の相互作用に対して優位性を有する場合に自己組織化によって形成される、細胞群体の集合または集合体として定義されることがある。スフェロイドは、例えば、初代細胞、細胞系、腫瘍細胞、幹細胞などの多様な種類の細胞から形成されてよい。スフェロイドは球状の形状または不規則な形状を有してもよい。スフェロイドは、複数種の細胞や異なる状態の細胞（増殖細胞、静止細胞、および壊死細胞など）からなる混成群を含んでよい。スフェロイドは腫瘍を模倣してもよく、信頼性および重要性がより高められた治療上の情報を提供することが知られた、優れた生理学的な腫瘍モデルとして役立つものでよい。スフェロイドは、一貫した、および／または、再現可能な結果および／または測定を提供してもよい。例えば、同一の実験または同一の実験を複製した実験において、同一の処理が行われた試料は、一貫した測定結果または許容可能な標準偏差範囲内（例えば、１０％から３０％の範囲内）の測定結果をもたらす。他の許容可能な数値範囲も意図する。スフェロイドのこれらの利点は認められていたが、形成、保持、溶液交換、および細胞と液体のミクロスケール操作に要求される退屈で困難な処置のため、十分に有効なスフェロイド組織モデルが産業界で幅広く使用されることが阻害されている。さらに、３Ｄモデルの複雑性のため、スクリーニングと他の検査用途のために高ハイスループットな手法において３Ｄ培養を拡大するのが困難である。
【００６０】
一般的なスフェロイド形成方法としては、懸滴法、非接着性の表面上での細胞培養法、スピナーフラスコ培養法、およびＮＡＳＡ回転細胞培養システムが挙げられる。しかし、これら従来のスフェロイド形成および培養システムは、多くの場合単調であり、スループットが高くなく、取扱が難しい。スフェロイド形成効率を高めるために、多様なミクロ流体（スフェロイド・オン・チップ（spheroid on chip））デバイスも開発されてきた。しかし、これらの技術の多くが、長期培養および機器の薬剤に対する融和性などの問題を抱えている。さらに、これらのマイクロ流体デバイスの多数が、既存の多様なハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）システムとの融和性を有していないため、製薬剤産業を益するように商品化できない。
【００６１】
本開示内容のある実施形態を構築している過程で行われた実験の結果、サイズの均一なスフェロイドの効率的な形成、および／または、市販されている多様なＨＴＳシステムとの融和性を有する標準プレート仕様でのスフェロイドの長期的培養を可能にするハイスループットの懸滴用アレイシステムが開発され、これにより上記システムが幅広い使用用途への商品化に最適となった。
【００６２】
本開示内容に記載の装置、方法、および／またはシステムの特定の実施形態では、例えば、液滴のロバスト処理の障害を克服する。このような障害としては、例えば、ピペット位置決めの不正確さに起因して、液体が上記プレートの他の部分に広がることなく、上記プレートにおいて液体が送られるべき領域へと液体を確実に操作することの困難性、例えば、振動や運動により、液体が上記プレートの所望の領域を越えて広がること、濡れ特性により液体が広がること、およびそれらの組み合わせがあげられる。例えば、特定の実施形態では、懸滴の拡散を防止または最小限に抑えつつ、高度に再現性のある形状とサイズを有する懸滴を、限定された位置で形成可能な上記プレート底面のプラトー構造を１つの要因として、より確固とした液滴操作を得られる。他の実施形態では、再現可能な量の流体の、アクセス孔内への流入およびアクセス孔内からの流出が容易に行われる。他の実施形態では、ピペットチップまたはピペットピンなどの液体操作装置をより簡単に、より早く、且つより正確に、アクセス孔に対して配置することができる。
【００６３】
特定の実施形態は、以下の１つまたは複数を含む流体の懸滴の操作および／または生成を対象としている：細胞懸濁液および／または細胞集合体；複合生体構造（例えば、１つまたは複数の胚、組織試料、小さい有機体、蠕虫など、または、それらの組み合わせ）；物理的物質と、化学物質と、および／または生体物質、または、それらの組み合わせを含む流体。特定の実施形態は、流体の懸滴の操作および／または生成を対象とし、上記懸滴は細胞懸濁液および／または細胞集合体を含む。特定の実施形態は、流体の懸滴の操作および／または生成を対象とし、上記懸滴は複合生体構造（例えば、１つまたは複数の胚、組織試料、小さい有機体、蠕虫など、または、それらの組み合わせ）を含む。特定の実施形態は、流体の懸滴の操作および／または生成を対象とし、上記懸滴は、物理的物質、化学物質、および／または生体物質、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６４】
特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、細胞懸濁液および／または細胞集合体の成長、検査、分析、または、それらの組み合わせを行ってもよく；１種類または複数種類のタンパク質が懸濁液の蒸発によって結晶化および／または、分析されてもよく；ナノ粒子を上記懸濁液中で観察および／または分析してもよく；上記懸濁液が、化学変化、物理変化、および／または生体変化を生じさせる反応器として役目を果たしてもよく；これらの組み合わせが行われてもよい。特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、細胞懸濁液および／または細胞集合体の成長、検査、分析、または、それらの組み合わせを行ってもよい。特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、懸濁液の蒸発による１種類または複数種類のタンパク質の結晶化、１種類または複数種類のタンパク質の分析、および／または、これらの組み合わせを行ってよい。特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、ナノ粒子を上記懸濁液中での観察および／または分析を行ってもよい。特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、上記懸滴液が、化学変化、物理変化、生体変化を生じさせる反応器としての役目を果たしてもよく、これらの組み合わせであってもよい。
【００６５】
開示された特定の実施形態では、液体輸送の簡便性を向上させている。例えば、特定の実施形態では、液体処理を人手および自動化システムの何れで行うかに関わらず、上記アクセス孔上面のプラトー構造が、液体輸送中にピペットチップまたは輸送ピンを上記アクセス孔に対して配列することを容易にする。また、上記上面に設けられた上記プラトー構造は、ひとつのアクセス孔から他のアクセス孔へ溢れ出たり、広がったりすることも防止する。
【００６６】
通常、細胞は３Ｄ状態で成長する。したがって、正確で有益な治療上の情報を取得するために、製薬剤業界および他の業界においては、ミクロの生理環境をハイスループットな仕方で模倣する、新規の３Ｄスクリーニングおよび検査のプラットフォーム（例えば、３Ｄスフェロイド培養法）が有用である。“正確で有益”とは、例えば、得られる結果および／または測定が、調査対象に関連し、且つ、調査対象にとって貴重であることを意図する。例えば、試料は、インビボ実験、動物実験、および／または人体実験から得られる結果と密接に類似した結果および／または測定をもたらしうる。これは、インビボ実験、動物実験、および／または人体実験から得られる結果に対し、同様の傾向を示すか、または許容可能な数値範囲内（例えば、１０％〜３０％の範囲内）にある定量的結果および定性的結果を含んでもよい。他の許容可能な数値範囲も意図し、この数値範囲は算出対象の測定に依存する。
【００６７】
ミクロの生理環境において効率的および／またはハイスループットの細胞培養を提供する複雑な装置が開発されてきた。しかし、学術研究所で開発されてきた上記複雑な装置の大半は、産業界で広い用途に利用されるように商品化できるものではない。本開示内容の特定の実施形態の開発過程で実施された実験により、多様なスフェロイド形成と、ハイスループットのスフェロイド形成および長期的培養を行うために市販されている多様なＨＴＳ器具と道具に対して融和性を有する培養懸滴用アレイプレートとが開発された。上記システムは、薬剤スクリーニングおよび薬剤検査、細胞に基づいた他の用途、または、それらの組合せのための優れた３Ｄ生理モデル（組織モデルと腫瘍モデル）として、スフェロイドを効率的に形成する。特定の実施形態では、通常、長期培養は、従来のスフェロイド培養方法よりも長い期間（例えば、１週間〜６週間、または、それより長い期間）、細胞および／または細胞集合を生存状態で保持できることを意味する。本開示内容に開示するが、他のタイムフレーム（time frame）も意図される。このことは、人手によるピペット操作および／または自動化された液体操作システムを使用して、スフェロイドの成長および生存に適切な条件（栄養水準など）を保持する上記アクセス孔を介して、培地を容易に交換できるために可能となる。これにより、培地中の限られた栄養によって上記スフェロイドが特定のサイズまたは特定の培養時間を越えた後に、上記スフェロイドを分離容器に移さずに、スフェロイドを上記アレイプレート上で継続的に培養することが可能になる。
【００６８】
通常、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）法は、上記実施形態が、創薬剤分野とこれに関連する化学分野および生物学分野とにおいて使用される顕微鏡法システム、分析システム、および／または自動化システムに対して融和性を有することを意味している。１つのシステム（または上記システムの組み合わせ）により、研究者が1日の間に多くの検査（例えば、１００回〜１００，０００回の検査）を行うことが可能になる。特定の実施形態では、一日の間に行える検査の回数は、１００回〜１０，０００回、５００回〜１０，０００回、１００回〜２０，０００回、１，０００回〜３０，０００回、１，０００回〜５０，０００回、１０，０００回〜８０，０００回などである。ＨＴＳ法では、研究者が関連する化学物質と生体物質を同定し、生体プロセスの理解を得ることが可能である。ＨＴＳ機器の主流は、ＡＮＳＩ／ＳＢＢ規格仕様のミクロタイタープレート（microtiter plate）に含まれている試料に対して、液体操作、撮像、顕微鏡の使用、光学的探知などの動作または仕事を行うように設計されている。幾つかの実施形態では、上記装置（アレイプレート、または、蓋部および底面プレートを含むアレイプレートの組み合わせ）が、例えば、現行のＡＮＳＩ／ＳＢＳ規格などの規格仕様であるため、上記装置をＨＴＳ機器と併せて使用することができる。すなわち、懸滴またはスフェロイドの生成と評価を容易にスケールアップすることが可能である。
【００６９】
特定の実施形態では、容易な操作性および培地変換方法を提供する懸滴用多重アレイプレート（例えば、１５３６、３８４、９６など）を提供する。他の実施形態では、上記アクセス孔を、他の適当な多重構成に行列状（例えば、３×６＝１８個、５×５＝２５個、６×１２＝７２個、１０×１０＝１００個、２５×２５＝６２５個など）に配置している。例えば、ＡＮＳＩ／ＳＢＳ（米国規格協会／生体分子科学協会）規定の現行規格などの規格に適合する標準化された（例えば、１６×２４＝３８４ウェル、８×１２＝９６ウェル）フォーマットの使用は、市販品を最も利用可能なＨＴＳ機器への適合性を提供する。図ｌのｃに、懸滴形成、およびそれに続く液体取扱ロボットを使用する培地変換処置を示す。本開示内容に記載する上記懸滴用アレイプレートは、例えば、多様な用途に利用可能な、ハイスループットの３Ｄスクリーニング／検査プラットフォームとして使用できる。
【００７０】
本開示内容の特定の実施形態に係る上記装置、方法、および／またはシステムは、現在利用可能な装置に優る１つまたは複数の利点を持つ。この利点の一部として、以下が挙げられるが、これに限定されない：均一かつ調整可能な細胞凝集体サイズ（例えば、細胞凝集体のサイズ／体積は、プレート構造の幾何学形状、細胞の播種数、または培養時間によって制御される）の細胞を成長させる能力；液体操作システムおよびプレート読取器などの現存のハイスループット・スクリーニング用機器との適合性；生理的に適切なモデル（例えば、固形腫瘍内と固形組織内に存在する細胞の酸素勾配、拡散輸送、および分布を模倣して生理的に適切化したモデル）形成への適合性；ハイスループット・スクリーニングへの適合性；細胞凝集体の大量生産への適合性；細胞凝集体の長期培養への適合性；培養液滴とガスとの間に生ずる最大表面接触に起因する効率的なガス交換の提供；細胞播種中、培地変換中、および試薬剤の添加および除去中における、上記プレートへの／からの、内容物の効率的な輸送（ピペッティング（pipetting））；実験中の異なる時点での、細胞と、培地と、試薬剤と、他の内容物との添加および除去の容易性；上記プレートの上面と底面からの細胞凝集体の収集（ハーベスト）；作業、時間、およびコスト、またはこれらの組み合わせの減少。細胞凝集体の分析は、同じプレートで実施され、簡単に実施することができるので、例えば細胞凝集体の成長と検査と、形成と、保持とを効率化および簡略化することでコスト削減が実現される。または、細胞凝集体を効率的に形成することでコスト削減が実現される（例えば、標準化３８４ウェル仕様は、試験化合物と試薬剤の消費とを減少させ、また複合ウェル仕様は、液体の分注時間が短縮し、終点の数を一定としたときのプレート操作の回数が減少することを意味する）。または、上記の２通りの方法によってコスト削減が実現される。
【００７１】
特定の実施形態の他の利点は、培地の消費を最小限に抑えられること、および／または、細胞の処理に必要な薬剤または他の試験化合物の量を最小限に抑えられることである。上記スフェロイドは、体積の小さい培養培地の個々の液滴中（例えば、２０μｌ〜１００μｌ以下）で成長するため、スフェロイド培養に必要な培養培地を大幅に減少できる。したがって、上記細胞の処理に必要となる薬剤と試験化合物を大幅に減少し、液滴中の薬剤濃度が望ましい値になる。特定の実施形態では、上記液滴の体積は、２００μｌ未満、１２５μｌ未満、１００μｌ未満、８０μｌ未満、６０μｌ未満、４０μｌ未満、２０μｌ未満、または１０μｌ未満としてもよい。特定の実施形態では、上記液滴の体積は、１０μｌ〜２５０μｌの範囲、１０μｌ〜２００μｌの範囲、２０μｌ〜２００μｌの範囲、２０μｌ〜１００μｌの範囲、または、１００μｌ〜２５０μｌの範囲であってよい。
【００７２】
例えば、特定の実施形態は、均一で調整可能な細胞凝集体サイズの細胞を成長させる能力を提供する。一部の実施形態では、均一なサイズとは、スフェロイドのサイズまたは体積のバラツキが、上記培養の期間中、小さな範囲内（３％〜５％など）に保たれることを意味する。一部の実施形態では、調整可能なサイズとは、細胞の播種数、培養期間の長さ、および／または他のパラメータによって、スフェロイドの最終的なサイズまたは体積を制御できることを意味する。特定の実施形態では、均一なサイズとは、スフェロイドのサイズまたは体積のバラツキを、上記培養期間中または上記培養期間のうちの十分な部分期間中、１％〜１０％、２％〜８％、２％〜５％、３％〜８％、４％〜１０％、５％〜１０％などの範囲内に保たれることを意味する。特定の実施形態では、調整可能なサイズとは、細胞の播種数、培養期間の長さ、および／または他のパラメータによって、スフェロイドの最終的なサイズまたは体積を制御できることを意味する。
【００７３】
特定の実施形態は、例えば、液体操作システムおよびプレート読取器などの既存のハイスループット・スクリーニング機器と適合可能である。顕微鏡法システム、液体操作などの自動化装置、検出、および／またはハイスループット・スクリーニングおよびハイコンテント・スクリーニングで使用される撮像システムとの適合性は、本開示内容が取り組む必須の利点である。特定のシステムの実施形態は、主流機器に合った規格（例えば、現行のＡＮＳＩ／ＳＢＳ規格）に適合するマルチウェルプレート形式で設計されている。自動化装置を使用した場合、本開示内容に開示している多重アレイプレートを使用して、スフェロイドの生成および／またはアセスメントをスケールアップすることができる。上記アクセス孔は、スフェロイドの保持および処理のために上記水滴へ液体を簡易に輸送すること、および、この水滴から液体を簡易に輸送することを可能にする。ハイスループット機器を使用した場合、多重アレイプレートを使用して、スフェロイドの生成およびアセスメントを簡単にスケールアップすることができる。
【００７４】
特定の実施形態は、生理学的に適切なモデル（例えば、固形腫瘍内と固形組織内に存在する細胞の酸素勾配、拡散輸送、および分布を模倣して生理的に適切化したモデル）の形成に好適である。例えば、特定の試験化合物は、細胞による酸素消費が活発であり、また／または拡散性の酸素運搬が制限されている、固形腫瘍に似たスフェロイドの低酸素コア内に存在する細胞に対してより効果的である。例えば、特定の試験化合物は、通常はスフェロイドの内部に存在しており、また２Ｄ細胞培養法では複製が困難である静止細胞の成長を抑制する点に関してはあまり効果的ではない。よって、２Ｄ培養内のより増殖性の強い細胞について行われた試験からは、生理学的に正確性の劣る結果が得られた。
【００７５】
特定の実施形態は、細胞凝集体の大量生産に好適であるかもしれない。一部の実施形態では、各装置が懸滴中で３８４スフェロイドの形成を可能にする。自動化システムと複数の装置を使用することで、スフェロイドを形成する細胞をそれぞれ含む、例えば１，０００〜１００，０００の懸滴を、妥当な時間（例えば、５分、１５分、１時間、２時間、５時間、１０時間、または２４時間）内に形成することができる。
【００７６】
特定の実施形態は、細胞凝集体の長期培養に好適である。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間の間培養してもよい。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を１週間〜６週間の間、１週間〜２週間の間、１週間〜４週間の間、または２週間〜５週間の間培養してもよい。
【００７７】
特定の実施形態は、細胞凝集体をより短い期間で培養することにも好適である。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を少なくとも３０分間、１時間、２時間、３時間、５時間、８時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、または６日間の間培養してもよい。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を最長で３０分間、１時間、２時間、３時間、５時間、８時間、１２時間２４時間、２日間、３日間、６日間、または７日間まで培養してもよい。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を３０分間から７日間の間、２時間から２４時間の間、３０分間から４８時間の間、１時間から５日間、または１時間から７日間培養してもよい。
【００７８】
特定の実施形態は、培養液滴とガスとの表面接触が最大であることを１つの要因として、効率的なガス交換を提供する。例えば、ガス交換が生じるように液体体積の上面を空気に曝している従来のマルチウェルプレート中の液体と比較して、特定の実施形態で形成される懸滴は、ガス交換されるように空気に曝されている表面面積の割合が大幅に増大されている（上記アクセス孔と上記アクセス孔の上部開口の下に位置する液滴の表面全体）。効率的なガス交換は、特定のガス状成分（例えば、酸素）の濃度が細胞行動の核心に関連する研究では有用である。
【００７９】
特定の実施形態は、細部播種の間、培地交換の間、および／または試薬剤の添加・除去の間における、上記プレートへおよび上記プレートからのコンテントの効率的な移動（ピペット操作）；実験の異なる期間における、細胞、培地、試薬剤、および／またはコンテントの添加と除去との容易化；上記プレートの上記上面および上記底面から細胞凝集体を収集し；作業、時間、およびコストの低下；または、これらの組み合わせをもたらす。
【００８０】
個別のスフェロイドのモニタリングおよび／または操作は、開示される特定の実施形態の他の利点である。処置の前後に個別のスフェロイドを分析できることも、開示される特定の実施形態の利点である。各スフェロイドはそれぞれの水滴中に分離させられて成長するので、上記スフェロイドに対して、化合物を使用して個別に処理すること、顕微鏡検査技術および分析手法を使用して個別にモニタリングおよび分析すること、更なる処理のために個別に収集すること、または、こられの組み合わせを行うことを可能にする。さらには、１週間から６週間の期間に亘り、スフェロイドを個別に長期培養することと、スフェロイドに個別にアセスメントを行うことが可能である。他の長さの期間も意図される。手動ピペット操作または自動化液体制御システムを利用することで、上記アクセス孔を介して上記培養培地を簡単に変換して、スフェロイドの成長と生存にとって適切な栄養水準を保持できる。これにより、スフェロイドが一定サイズを超えて大きくなった後または一定の培養時間が経過した後、培地内の栄養が限られることに起因して、スフェロイドをより大きな容器に移動させる必要がなくなる。
【００８１】
特定の実施形態では、例えば、細胞凝集体の成長および試験の合理化と簡易化、形成、（細胞凝集体の分析は上記培養を行ったのと同じプレートで実施でき、分析自体も簡単に行えるため）保持によってコストが削減され、細胞凝集体の効率的な形成（例えば、標準規格の３８４ウェル形式は試験化合物と試薬剤の消費を抑え、マルチウェル形式は液体を分注している時間が短縮されることと、エンドポイントの定数に対するプレート操作数も減少されることを意味する）、または、これらの組み合わせによってコストが削減される。例えば、各試料（各ウェル）が２００μｌの細胞培養用培地を必要とするような従来の９６ウェルプレートを使用して行われる標準検査と比較して、特定の実施形態では、各試料に必要な培地は２０μｌのみであり、培養培地の量およびコストを削減している。同様に、幾つかの実施形態では、各試料において従来と同じ処理濃度を実現するために必要な試験化合物の量が、１０分の１にまで減少される。前臨床実験および臨床実験で使用される多くの薬剤は製薬剤費が高く、極めて少量で製薬剤されるので、幾つかの実施形態で得られる上述の効果は特筆すべきことである。従来の方法を使用してペトリ皿の上方側に形成した懸滴と比較して、特定の実施形態では、自動化システムを使用した３８４スフェロイドの生成は、１秒から１５秒の範囲の僅かな時間（および労力）で行われるが、従来の方法では５分から１５分が必要である。
【００８２】
幾つかの実施形態では、上記装置は、上記プレートの上面および／または底面から細胞を収集する能力、および上記懸滴用プレートと下層プレートとの１つまたは両方に貯蔵部（例えば、貯水部）を備えている能力；製造中にモールディングと鋳型の取り外しとを簡単に行えるシンプルなプレート設計と、細胞凝集体および化学物質をプレート上で分析（on-plate analysis）する能力（例えば、分析をおこなうために、上記プレートの内容物を採取して、他のプレート、容器、または装置に移動させる必要が無く；内容物を含む上記プレートをプレート読取器などの標準化ハイスループット・スクリーニング機器内に配置することで、上記内容物の分析（比色分析、蛍光分析、光測定（lumniometric）分析など）を行うことが可能であり、従来のマルチウェルプレートと異なり、上記試料の下方に可塑材が設けられていないため、培養後の上記液滴の光信号を直接照射および検出することが可能である）、または、これらの組み合わせにより区別される。他の実施形態では、上記下層プレートは、実質的に、光学的に透明であって、上記液滴を妨げられることなく見ることができ、上記アレイプレートを上記下層プレート上に置いたまま、上記液滴の光信号の照射および検出が可能である。
【００８３】
特定の実施形態によれば、上記下層プレートでは上記スフェロイドを妨げられるこなく視認できるので、撮像および分析が簡易になっている。特定の実施形態によれば、上記下層プレートでは、上記スフェロイドの便利な撮像と光学分析を行えるように、上記アレイプレート上のスフェロイドの妨げのない視認を提供する。
【００８４】
特定の実施形態では、長期間を含む異なる期間に亘ってスフェロイドを培養するために、上記懸滴中の上記細胞培養液の重量オスモル濃度を、比較的安定している範囲内に保持することが好ましい。特定の実施形態では、比較的安定している範囲は、上記懸滴の所望のパラメータを、所望のまたは上記のパラメータの±１％、±３％、±５％、±８％、±１０％、±１５％、±２０％、または±２５％に保持してもよい。特定の実施形態では、比較的安定している範囲は、上記懸滴の所望または記載のパラメータを、上記培養の最終結果が達成できるか、または、実質的に達成できるような、十分に多様な範囲に保持してもよい。特定の実施形態では、上記懸滴中の上記細胞培養液の重量オスモル濃度は比較的安定している範囲内に保持される。例えば、重量オスモル濃度の当初測定の１０％から２０％。他の例では、重量オスモル濃度の当初測定の３％〜２０％、５％〜１５％、５％〜２５％、５％〜１０％、または１５％〜２０％の範囲内である。特定の実施形態では、スフェロイドの培養を１週間〜６週間に亘って安定範囲内に保持できる。例えば、特定の実施形態では、スフェロイドの培養を少なくとも３０分間、１時間、２時間、３時間、５時間、８時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、または６日間に亘って安定範囲に保持できる。例えば、特定の実施形態では、スフェロイドの培養を３０分間〜７日間の間、２時間〜２４時間の間、３０分間から４８時間の間、１時間〜５日間の間、または１時間〜７日間の間に亘って安定範囲に保持できる。また、他の範囲も含むものとする。
【００８５】
特定の実施形態は、懸滴中においてスフェロイド形成の高い再現性を生み出す能力を提供する。実質的に同一の初期細胞数を使用してスフェロイドを形成でき、またスフェロイドをそれぞれ独立した体積を有するように成長させるため、スフェロイドの成長の再現性が高く、個々のスフェロイド間の接触が避けられるため、サイズのバラツキの原因となる隣接するスフェロイド同士の融合が避けられる。特定の実施形態では、スフェロイドのサイズのバラツキを、上記培養期間を通して３％〜５％の範囲内に抑えられる。特定の実施形態では、上記培養期間を通して、スフェロイドのサイズのバラツキを３％〜５％、２％〜６％、１％〜６％、または３％〜６％の範囲内に抑えられる。特定の実施形態では、上記培養期間の一部を通して、スフェロイドのサイズのバラツキを３％〜５％、２％〜６％、１％〜６％、または３％〜６％の範囲内に抑えられる。
【００８６】
特定の実施形態では、上記アクセス孔底面のプラトー構造を１つの要因として、液滴の安定性を向上させてもよい。上記液滴を既定のサイズと位置で安定化および保持することで、上記液滴の拡散を実質的に制限している。
【００８７】
上記懸滴の量は少ないため、蒸発により培地の重量オスモル濃度が変化する。幾つかの実施形態では、蒸発による培地の重量オスモル濃度の変化を防止するために、または、これを実質的に防止するために、スフェロイドの培養期間中、ウェルプレートの蓋部と蒸留水または他の水溶液を満たしたプレート（例えば、９６ウェルプレート）とによって、上記懸滴用アレイプレートを挟み、これら全ての機構をパラフィルムまたは他のシーリング材で覆う。懸滴の底部に設けられた、上記蒸留水で満たした上記プレート（または上記水溶液で満たしたプレート）は、上記懸滴を加湿する。幾つかの実施形態では、上記プレートの周縁部に設けられた貯水部または貯水溶液部（例えば、図１ｂと１ｄに示すような貯水溶液部）は、パラフィルムと共同して、懸滴からの大規模な蒸発を防ぎ、特に、液滴がより蒸発しやすい上記プレートの側面の近傍にある水滴からの蒸発を防ぐ。このような機構の使用と一日おきの培地変換とにより、ｍＥＳ細胞と、Ｃｏｓ−７細胞と、Ａ４３１．Ｈ９細胞培地との重量オスモル濃度を、３００ｍｍｏｌ／ｋｇ〜３６０ｍｍｏｌ／ｋｇ（図２（ａ）の安定した範囲内に保持することができる。なお、上記範囲は、細胞培養にとって最適な範囲内に含まれる範囲である。特定の実施形態では、懸滴中の細胞培地の重量オスモル濃度を比較的安定した範囲内に保持する。例えば、このような範囲として、重量オスモル濃度の初期測定値の１０％〜２０％以内の範囲が挙げられる。生細胞／死細胞の染色画像は、大半の細胞は２週間の培養後において生存していたことを更に示す。さらに、異なる様々なサイズのＡ４３１．Ｈ９スフェロイドが、１週間の期間を通して増殖しているように見られた（図２ｃ）。懸滴の統合性のローバスト性と共同して、上記懸滴アレイプレートシステムは、従来の懸滴システムまたは懸滴方法では不可能だったスフェロイドの長期培養を実現する。
【００８８】
実施形態の例に基づいて薬剤スクリーニングを説明するために、Ａ４３１．Ｈ９細胞を対象にして、２つの薬剤（非従来的な低酸素感受性薬剤であるチラパザミン（ＴＰＺ）と従来の抗癌剤である５−フルオロウシル（５−Ｆｕ）））を２Ｄ培養条件および３Ｄ培養条件下で検査した。ＴＰＺは、低酸素性のサイトトキシンであり、低酸素条件下でのみ活性化されるので、代謝産物がＤＮＡに損傷を与える。ＴＰＺは、細胞内レダクターゼによって、低酸素条件下でＤＮＡの一本鎖切断および二本鎖切断と、塩基損傷と、染色体異常とを生じさせる細胞傷害性のラジカルに変換される。通常の条件下において、酸素は、ＴＰＺラジカルを非毒性の親化合物へと酸化（back-oxidation）させ、これにより細胞毒性を著しく減少させる。３８４懸滴アレイプレートを使用して、従来の２Ｄ条件および３Ｄスフェロイド下で、吸着細胞として培養したＡ４３１．Ｈ９細胞に対するＴＰＺの効果を検査した。その結果、２Ｄ条件のＩＣ５０（〜５０μＭ）が３Ｄ条件のＩＣ５０（〜８μＭ）よりも大きいことが判明した。したがって、大半の薬剤試験に反して、Ａ４３１．Ｈ９細胞は、従来の２Ｄ条件下で培養された場合、３Ｄスフェロイドと比較してＴＰＺに対してより高い耐性を示した。これは、主に、３Ｄスフェロイド内に存在する先天的な酸素勾配によるものである。拡散限界のため、直径が５００μｍより大きいスフェロイドは、通常、その中心部に低酸素性の核を有し、外面方向の対応する酸素勾配を有する。ＴＰＺは低酸素条件下でより一層細胞傷害性が高くなる低酸素性の薬剤であるため、酸素勾配の存在しない２Ｄで培養されたものと比較して、３Ｄスフェロイドとして培養されたＡ４３１．Ｈ９細胞に対してより敏感である。２つの異なる培養条件下で行われた同一の薬剤検査から得られた上記ＩＣ５０間のこの明白な差異は、薬剤スクリーニング目的および試験目的のための３Ｄモデルの使用の有用性を示している。スフェロイドと同様に、充実性腫瘍にも先天的な酸素勾配が存在する。よって、３Ｄ腫瘍モデルは、より一層正確で有意義な治療用の読出し情報をもたらす。３Ｄ腫瘍モデルは、腫瘍の低酸素性の内部にある静止細胞を標的にする薬剤のスクリーニングに有用である。
【００８９】
５−Ｆは、細胞増殖を抑制する従来の抗癌薬剤である。５−ＦＵの場合、３Ｄ（〜１から１００μＭ）条件下では、２Ｄ条件下（〜０．１μＭ）と比較して、ＩＣ５０が増大することが判明した。予期されたように、Ａ４３１．Ｈ９細胞を３Ｄスフェロイドとして培養した場合、このＡ４３１．Ｈ９細胞の５−Ｆに対する耐性が、２Ｄ条件下で培養した場合よりも高くなった。スフェロイドの３Ｄの統合性により、５−ＦＵにとって、中心細胞集団内に侵入し、拡散することがより困難であったと推測される。さらに、５−ＦＵは増殖細胞を特異的に標的にし、これによりスフェロイドの内部の静止細胞を死滅させられなかった可能性がある。しかし、これは、薬剤試験途用途とスクリーニング用途における３Ｄモデルの重要性を示している。Ａ４３１．Ｈ９細胞について、２Ｄ試験プラットフォームと３Ｄ試験プラットフォームからの５−ＦＵのＩＣ５０から判明したことは著しく異なるものであった。
【００９０】
生理的な３Ｄモデルによって、大局的には時間および資材を節約する、より一層正確で有意義な結果をもたらす。本開示内容の実施形態の開発過程で行われた実験は、市販の多様なハイスループット・スクリーニング機器と適合可能な標準化フォーマットで懸滴用アレイプレートを開発することで、長期的な３Ｄ細胞培養をハイスループットする方法をスケールアップすることの困難性を克服した。
【００９１】
〔Ｉ.装置とシステム〕
以下、本開示内容の実施形態の装置例を詳細に説明する。以下に説明する装置は一例であり、本開示内容の実施形態を限定するものではない。本願の開示内容は、以下に記載する装置例に限定されるものではない。
【００９２】
図５にアッセイプレート１の例を示す。図６に他のアッセイプレート４を示す。アッセイプレート１と４のそれぞれが、複数のウェル３を有している。しかし、本開示内容は特定の構成に限定されないことは理解されるであろう。アッセイプレートは、任意の数のウェルを有していても良い。ある実施形態では、１２×８、２４×１６、または他の構成を採用している。ある実施形態では、複数のアレイプレート（例えば、２４×１６の構成のアレイプレート）の分析を使用してもよい。また、アッセイプレート１と４が、上記プレートの１つまたは複数の端部（例えば、４つ全ての端部）に沿って貯水部２を備えている。
【００９３】
図７と８にアッセイプレート１の断面を示す。上記断面には、底面９と上面１０とを有している孔６を有するウェル３が示されている。ある実施形態では、上記孔６の直径は約１．６ｍｍである。また、ある実施形態では、上記孔６間の距離は約４．５ｍｍである。また、ある実施形態では、上記ウェルは、上記孔６の近傍に設けられた突出部、プラトー部、または、リング部５を更に備えている。また、ある実施形態では、上記突出部５の高さは約０．５ｍｍである。図７に、蓋部１とマイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート）８とを示す上記アッセイプレート１の断面を示す。上記マイクロタイタープレート８はウェル３の下方に設けられている。ある実施形態では、上記プレートは、上記プレートのウェル内に液体（例えば、水）を有している。また、ある実施形態では、上記マイクロタイタープレート８の上記貯水部が端部の周辺または他の領域に設けられている。ある実施形態では、１つまたは複数の貯水部が、上記プレートの周辺の１つまたは複数の端部に設けられている。他の実施形態では、１つまたは複数の貯水部が、上記アクセス孔の設置位置に干渉しない、または、実質的に干渉しない位置に配置されている。ある実施形態では、上記貯水部が流体を含んでいる。他の実施形態では、上記貯水部が、流体と違ってこぼれにくく、加湿用の気体を供給できるヒドロゲル（アガロース・ゲルなど）を含んでいる。他の実施形態では、上記貯水部が、例えば、試験化合物として気化する化学物資などの個体物を含んでいる。
【００９４】
図１４に上記装置の追加の実施形態を示す。一部の実施形態では、上記装置が上記孔６の上方および／または下方の設けられた追加の環１１を備えている。一部の実施形態では、上記環の幅は０．２５μＭであるが、他のサイズも意図されている。一部の実施形態では、上記プレートの上面または上記プラトー部の底面から測定した上記環１１の高さは約０．５μＭである。一部の実施形態では、上記孔の上方に配置された環１１が、液体が上記上面の上に広がるのを防止するように機能する。一部の実施形態では、上記プラトー部の底部に配置された環１１が液滴の安定性を向上させる。
【００９５】
一部の実施形態では、上記プレート８が、水、他の流体、ゲル、試験化合物、収着剤、またはそれらの組み合わせを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、図１のＡに示すように、液滴が上記底面９から滴下し、ウェル６の底部の下方において突出部５まで広がるように、液滴を上記孔６の上記上面１０を介して上記穴６内へと挿入している。一部の実施形態では、上記ウェル８内の液体と上記蓋部７とを組み合わせて、上記液滴用の加湿室を提供している。また、一部の実施形態では、上記アッセイプレートと、加湿室と、カバーとを備えている上記装置をＰＡＲＦＩＬＭラップなどの実験用ラップで覆い、蒸発を更に防止している。
【００９７】
一部の実施形態では、装置が、上記蓋部または他の構成要素とアクセス孔、懸滴液、および端部との間に（例えば、細胞と試薬剤をプレートへ輸送するため、および、プレートから輸送するために）多少の接触、接触、または実質的な接触がある構成を含んでいる。
【００９８】
一部の実施形態では、上記プレート８がマルチウェルプレートである。一方、他の実施形態では追加構成が利用されており、これら追加構成としては、アッセイブロック、容器、ゲルからなるベッドなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００９９】
図１６−２４に追加の実施形態を示す。一部の実施形態では、上記装置が、アッセイプレート１６１と、トレイ２０１と、蓋部２１１とを備えている。アッセイプレート１６１は、複数のウェル１６３と、上記プレートの１つまたは複数（例えば、４つ全て）の端部に沿った貯水部１６２とを備えている。一部の実施形態では、上記アッセイプレート１６１の底部の寸法は８５．４９ｍｍ×１２７.７７ｍｍである。図１７のＡ−Ｄに、アッセイプレート１６１上にアレイ状に配置されたウェル１６３の様々な図を示す。ウェル１６３は、上面１７２と底面１７３とを有する孔１７１を備えている。一部の実施形態では、上記孔１７１の直径は約１．６ｍｍである。一部の実施形態では、孔１７１間の距離は約４．５ｍｍである。一部の実施形態では、上記孔１７１が、上記上面１７２の上に複数の上層プラトー構造１７４を備えている。一部の実施形態では、上記孔１７１が、上記上面１７３の上に複数の下層プラトー構造１７５を備えている。一部の実施形態では、上記上層プラトー構造１７４は、液体操作用の装置を上記孔１７１に対して位置合わせするのを補助し、および／または、液体が１つのウェルから他のウェルへ広がらないようにすることを補助する。一部の実施形態では、下記下層プラトー構造１７５が、実質的に、懸滴を特定の領域内および幾何学形状に閉じ込め、および／または、懸滴が隣接するウェルに広がることを防止する。
【０１００】
一部の実施形態では、上記上層プラトー構造１７４および／または上記下層プラトー構造１７５を、上記アッセイプレート１６１と実質的に同じ材料および／または工程を使用して作製している。他の実施形態では、上記上層プラトー構造１７４および／または上記下層プラトー構造１７５を、上記アッセイプレート１６１とは実質的に異なる工程および／または材料を使用して作製している。一部の実施形態では、上記プラトー構造は、３Ｄプロトタイプ方法を使用して作製したプラスチックである。他の実施形態では、上記プラトー構造は、化学物質、生体物質、またはこれらの組み合わせの印刷構造である。
【０１０１】
図１８に１つのウェル１６３の上面図、断面図、および底面図を示す。また、図１９にアレイ状に配列されたウェル１６３の断面図と３Ｄ描写を示す。
【０１０２】
図２０のＡ−Ｆにトレイ２０１の様々な図を示す。図２１のＡ−Ｆに蓋部２１１の様々な図を示す。図２２のＡ−Ｆに、上記アッセイプレート１６１と、上記トレイ２０１と、上記蓋部２１１とから構成される上記組立部２２１の様々な図を示す。上記蓋部２１１は、上記アッセイプレート１６１の上面を覆い、アッセイプレート１６１の上面の上に位置する。上記アッセイプレート１６１は上記トレイ２０１の上に位置する。一部の実施形態では、アッセイプレート１６１は、トレイ２０１と蓋部２１１によって実質的に囲われている。
【０１０３】
一部の実施形態では、上記トレイが、当該プレートの１つまたは複数（例えば、４つ全て）の端部に沿って貯水部２０２を有するプレートを備えている。他の実施形態では、上記貯水部が１つまたは複数の領域に設けられている。一部の実施形態では、撮像および分析を間単にするような、ウェル１６３が遮られずに視認される場所に、１つまたは複数の貯水部が配置されている。特定の実施形態では、上記トレイ２０１は、実質的に、光学的に透明であるので、上記懸滴を撮像および光学分析するのに好都合である。一部の実施形態では、上記貯水部が水性の流体を蓄えている。一部の実施形態では、上記貯水部２０２が湿度の保持に実質的に貢献している。一部の実施形態では、水性の流体のようにこぼれにくくかつ加湿性を有する蒸気を提供する、アガロースゲル（agarose gel）などのヒドロゲルが、上記貯水部に含まれていてもよい。他の実施形態では、上記貯水部が固形物（例えば、試験化合物として蒸発する薬剤品）を含んでいる。
【０１０４】
一部の実施形態では、上記組立部２２１の１つまたは複数の構成要素は、実質的に、光学的に透明である。一部の実施形態では、上記組立部は、上記組立部の内部と外部との間のガス交換を可能にするのに十分な程度に気密されている。一部の実施形態では、上記組立部は、上記組立部内の湿度の維持を向上させている。一部の実施形態では、上記組立部の構成要素を実質的に隙間無く適合し、操作中に上記構成要素が他の構成要素の上に確実に配置されることを可能にしている。
【０１０５】
図２３のＡとＢに、３つの組立部２２１を積み重ねた構造の側面図と正面図を示す。一部の実施形態では、上記トレイが構造２０３を備え、上記蓋部が構造２１２を備え、上記構造２１２は、組立部２２１の上に他の組立部２２1を実質的にしっかりと積み重ね、操作中にその状態を保たせることができる。
【０１０６】
図２４のＡ−Ｄに、特定の実施形態に係るアクセス孔構造の変形例を示す。射出成形法の製造用の潜在的な分割線を腺２４１によって示す。上記分割線を他の場所に配してもよい。図２４のＡに、上記上面に高くて薄いプラトー構造が設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＢに、上記上部に短くて薄いプラトー構造が設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＣに、上記上部に高くて厚いプラトー構造が設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＤに、上記上部に高くて薄いプラトー構造が設けられたアクセス孔構造の例を示す。
【０１０７】
一部の実施形態では、アクセス孔は、行列状の多層型またはマルチウェル型に形成されている。他の実施形態では、代わりとなる幾何学形状構成（例えば、円形の構成、不規則パターンなど）を利用している。一部の実施形態では、各プレートにおいて、アクセス孔とプラトー部のサイズ、幾何学形状構成、および／または設計が互いに同じものでもよい。一部の実施形態では、各プレートにおける、アクセス孔とプラトー部のサイズ、幾何学形状構成、および／または設計が互いに実質的に同じである。他の実施形態では、上記アクセス孔とプラトー部のサイズおよび／または形状が異なってもよい。一部の実施形態では、アクセス孔の構造／幾何学形状を他の装置（例えば、分析装置）に取り入れてもよい。
【０１０８】
装置は、好適な材料またはその組み合わせによって構成されてもよい。例えば、上記材料としては、プラスチック（例えば、生体適合性プラスチック、ポリスチレン、または他のポリマー・プラスチック（polymeric plastic））、紙、金属、ガラス、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。一部の実施形態では、射出成形法を使用して装置を作製する。他の実施形態では、好適な方法または方法の組み合わせを使用して装置を作製する。例えば、上記方法としては、成形法（例えば、射出成形法）、ラピッドプロトタイピング（rapid prototyping）法（ステレオリソグラフィー法、３Ｄ印刷法、選択的レーザ焼結法、熱溶解積層法など）、リソグラフィー法（ソフトリソグラフィー法）、印刷法、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。一部の形態では、装置の一部または複数部が、実質的に異なる材料および／または処理を使用して作製される。
【０１０９】
一部の実施形態では、プレートは、例えば、細胞行動、液滴サイズ、幾何学形状、幾何学形状などを制御するように処理（例えば化学的方法、物理的方法、生物学的方法、テクスチャ方法）が行われている。表面処理の方法としては、ＤＮＡおよびタンパク質などの化学物質および／または生体物質の、化学的修飾法、物理的修飾法、プラズマ処理法、蒸着法、吸着法および／またはコーティング法、および、これらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。一部の実施形態では、以下の１つ以上をもたらすように処理を行う：上記アレイプレートの表面性質（例えば、疎水性、タンパク質付着、化学組成、生物学的組成など、または、これらの組み合わせ）の変更；上記懸滴の特性（液滴サイズ、幾何学形状、配列など、または、これらの組み合わせ）の操作；細胞行動（増殖速度および／または分化速度、分化系統、特定のタンパク質と代謝産物の生成など）の制御。他の実施形態では、化学物質および／または生体物質を上記液滴および／または細胞に対して放出および／または輸送を行うことを可能にするために、例えばコーティングなどにより表面処理を行う。他の実施形態では、上記液滴および／または細胞の特性の変化を、抗体結合および／または抗原結合などのメカニズムを介して検出するコーティングを施すように表面処理を行う。他の実施形態では、コーティングの結果、上記コーティングの光学的特質、電気的特質、または他の測定可能な特質の変性による変化が示される。例えば、一部の実施形態では、作製およびパターニングなどを行った後に、親水性皮膜を使用して装置をコーティングする。
【０１１０】
一部の実施形態では、使用前または凝縮前にプレートを殺菌している。殺菌は、上記プレートの材料と使用（例えば、熱、高圧、薬剤品、照射、またはこれらの組み合わせ）に好適な任意の方法を使用して行われる。
【０１１１】
一部の実施形態では、上記プレートは、酸素濃度、温度、湿度などを制御するための室／筐体（例えば、環境制御装置）と一体化されている。
【０１１２】
一部の実施形態では、湿度の保全性は向上している。例えば、上記アレイプレートおよび／または上記下層プレートが、閉鎖系内の空気を加湿するのを助けるための貯水部を備えている。
【０１１３】
一部の実施形態では、本開示内容は、装置（例えば、アッセイプレート、貯水部、およびカバー）を単独で備えているか、または、このような装置（例えば、細胞、バッファ、成長培地、試験化合物、対照物など）を使用して細胞の培養と特徴付けとを行う他の試薬剤を併せて備えているシステムおよび／またはキットを提供する。一部の実施形態では、システムおよびキットが、ハイスループット分析用のロボット工学（例えば、試料の取扱と分析（例えば、プレート読取器）を行うための機器）を備えている。
【０１１４】
〔ＩＩ.用途〕
本開示内容の特定の実施形態に係る上記アッセイプレート装置は、多様な用途に利用できる。一部の実施形態では、本開示内容に記載する装置をスフェロイド（例えば、癌細胞株スフェロイド）などの細胞または他の微生物または生体分子の培養に使用している。一部の実施形態では、スフェロイドを本開示内容に記載する懸滴中で培養している。培養後の上記スフェロイドまたは他の細胞は、様々な研究用途およびスクリーニング用途に利用される。
【０１１５】
一部の実施形態では、懸滴を形成するために、細胞懸濁液を上記上側から上記孔を介して移動（例えば、ピペットを使用して）させる。一部の実施形態では、ピペットチップの端部と他の液体移動装置の端部の何れかを上記穴に差し込んで、上記試料液体を上記底面へと案内する（例えば、図１０ｃ参照）。上記下層面に液滴が形成されると、上記孔を通過するピペットチップ、ピンディスペンサー、または他の道具の何れも使用することなく、上記上面の孔に接触させるだけで、更なる液体（例えば、成長培地、試験化合物など）の添加を行うことができる。下方の液滴がより大きいので、表面張力によって流体が上記上面から上記下層面の液滴へ流れる。これにより、その後の液体の取扱時に、上記懸滴中の細胞の乱れを最小限に抑えることができる。一部の実施形態では、培地が変換され、細胞の処理がプレートの上記上面を介した吸引によって、または、毛管作用および／または微小流体作用および／または装置を利用して行われる。
【０１１６】
本開示内容の特定の実施形態の装置は、時間と、スフェロイド化と、スフェロイド組成物（例えば、細胞の種類、細胞の組成、細胞の物理的分布）と、処理（例えば、試験化合物、スケジュール、継続期間、濃度）と、環境（例えば、温度、酸素濃度、湿度など）との何れか、または、それらの組み合わせを制御できるという利点を有する。
【０１１７】
上記液体または細胞試料は、例えば、ピペットまたはスロットピン（V&P Scientific社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して、上記液体から上記アクセス孔を介して除去できる。また、懸滴内では、固いウェルの底部が無く、流体容積に応じて位置を変える液滴−空気界面が存在するので、ピペットの先端が、硬質壁に対して上記細胞またはスフェロイドを衝突させ押しつぶすという心配をする必要が無く、上記細胞をピペットによって取り出すことができる。上記液滴から細胞を除去する追加の方法としては、上記プレートの上面から吸引を行う方法と、下側のプレート、装置、または容器へと洗い流す方法と、上記液滴に接触して、下側のプレート、装置、または容器へ移動させる方法と、下側のプレート、装置、または容器（例えば、空の容器、または、更なる成長と分化の何れかの発生または分析用の回収を行うために試薬剤とゲルの何れかを備えている容器）へ遠心分離させる方法と、毛管作用および／または微小流体作用を利用して、別のプレート、装置、容器などに移動させる方法との何れか、または、これら方法の組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１８】
上記懸滴のサイズは、少なくとも一部分において、上記底面上の上記プラトー部の直径によって限定されている。その結果、上記培養プロセス中、上記懸滴の幾何学形状は広がること無く、一貫したものまたは実質的に一貫したものに保たれる。これによって、従来の平坦な懸滴用基板では不可能であった、ローバスト性と安定性がより増大した培養条件が得られる。従来の懸滴方法は、ペトリ皿の蓋部の内側に液滴を供給した後、上記ペトリ皿の蓋部をひっくり返すことを含んでいた。しかし、こうした上記ペトリ皿の蓋部のひっくり返しによる動きと、各液滴を閉じ込める物理的構造の欠如とによって、上記液滴の広がり、融合、落下、および他の変化が生じ、その結果、上記液滴中の上記スフェロイドのサイズ、幾何学形状、生存率、および他の測定可能な特性のバラツキが生じる。
【０１１９】
本開示内容の実施形態の装置は、研究用途、臨床用途、スクリーニング用途などの多様な用途に利用される。例えば、研究、創薬剤、毒性検査を行うための細胞凝集体の形成；胚、組織切片、微小有機体、および蠕虫（例えば、c. elegans）の培養；細菌の培養（表面との接触を最小に抑えることにより、多種の細菌にとって重要な、生物膜形成の防止とガス交換の増大を行う）；環境モニタリング；ガス状物質の毒性研究；水質検査；種子の発芽化；例えば、細胞、ナノ粒子、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡなどの生体物質と化学物質の自己組織化；化学種の結晶化；段階的な蒸発による水溶液の濃縮、撮像（例えば、上述のプロセスの撮像）；インビトロでの生化学分析（例えば、酵素的分析と、受容体のタンパク質−タンパク質相互作用の分析）；測定（例えば、比色測定、蛍光測定、発光測定、放射測定など）；細胞播種など、または、これらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。特定の用途例を本明細書に説明する。
【０１２０】
一部の実施形態では、細胞播種の用途に装置を使用する。一部の実施形態では、水性媒体／試薬剤またはゲルに細胞を播種する。一部の実施形態では、化学物質、生体分子、および／または粒子（例えば、ナノ粒子、ミクロスフェア（microsphere）など）と併せて細胞を播種する。一部の実施形態では、細胞分散液または個別の細胞または細胞凝集体の何れかとして細胞を播種する。本開示内容は、特定の細胞源に限定されない。一部の実施形態では、細胞は多様な源（例えば、ヒト、ラット、マウスなど）に由来し、異なる形態（例えば、一次細胞、細胞系、幹細胞、誘導性の多能性幹細胞など）を使用してもよい。一部の実施形態では、細胞の共培養（例えば、一度に播種された多細胞種の混合、または、連続的に播種された単一の多細胞種または多細胞種の混合）を実現するように、多細胞種を播種する。一部の実施形態では、生きている細胞、成長している細胞、休眠している細胞、または、化学処理を行った細胞（例えば、化学固定剤を使用して固定した細胞）を使用してもよい。
【０１２１】
一部の実施形態では、本開示内容の装置と方法を使用して培養した細胞またはスフェロイドを薬剤スクリーニングの用途に使用する。例えば、一部の実施形態では、培養癌細胞系のスフェロイドと他の細胞の何れかに抗癌剤または他の試験薬剤を接触させる。一部の実施形態では、化学物質、気体（例えば、ナフタレン）、生体分子、またはナノ粒子などの試験化合物または試験条件を（例えば、単独または薬剤と結合させた状態で）使用する。その後、（例えば、生存状態を染色する顔料とプレート読取器を使用して）上記細胞の生存率をモニタリングする。
【０１２２】
一部の実施形態では、幹細胞（例えば、癌が発生している幹細胞）の維持に上記装置を使用する。一部の実施形態では、腫瘍のインビボ環境を再現するために、癌が発生している細胞をスフェロイドと共に共培養する。このような方法を使用して培養させた、癌が発生している細胞は、研究用途および薬剤スクリーニングの用途に使用される。
【０１２３】
特定の実施形態に基づくアレイ装置の使用は、ハイスループットのスクリーニングの用途と研究用途への利用を可能にする。一部の実施形態では、装置が９６ウェル型、３８４ウェル型、または他のサイズのウェル配列を有していてもよい。標準化サイズの配置の使用する場合、既存のロボット設備（例えば、液体取扱器やプレート読取器などの市販の設備）のハイスループット・スクリーニング用途への利用が可能になる。本開示内容の特定の装置の実施形態は、積み重ねることができるように変更可能でもある。
【０１２４】
［実験］
本開示内容の特定の好適な実施形態および様態を示し、更に説明するために以下の実施例を説明する。また、以下の実施例は本開示内容の範囲を限定するものではない。
【０１２５】
〔実施例１〕
（Ａ．方法）
(装置設計：）
図１のａに懸滴細胞培養技術に基づくスフェロイド培養装置を示す。上記装置は、ポリスチレン樹脂を使用する射出成形によって作製した。上記懸滴方法の液体の取扱における欠点を克服するために、各細胞培養部位は、底面上にプラトー部が設けられた基板を貫通するように形成されたアクセス孔で構成されている。これらの細胞培養部位は３８４ウェル型プレートのフォーマット（図１のｂと１のｃに示すように、１６行×２４列で、双方向に４．５ｍｍ離間）で配列され、これにより、生物医学研究所で一般に使用されている市販のハイスループット・スクリーニング用機器（例えば流体操作ロボットとプレート読取器）を使用することが可能である。さらに、上記プレートの寸法は通常の３８４ウェル型プレートと同じように設計され、他のウェルプレートを重ねることができる。上記懸滴の体積が小さい（数十μｌ）ことに起因して一般的に直面される蒸発問題を緩和するために、上記培養部位の外周の周辺に貯水部を形成した。
【０１２６】
上記プレートの使用前に、上記装置の表面全体に親水性皮膜（Pluronic F108、０．１％）を１時間塗布した。その後、上記プレートを蒸留水で洗浄し、窒素ガスを使用して乾燥させ、紫外線に半時間曝して殺菌した。懸滴を形成するために、単一チャンネルのピペットと複数チャンネルのピペットと液体取扱用の自動化ロボットとの何れかを使用して、細胞懸濁液をアクセス孔内にピペットで取り出した。なお、各ピペットの先端部を上記アクセス孔内に差し込み、上記試料液体を上記底面へと案内した。上記液体試料または上記細胞試料を、ピペットまたはスロットピンのレプリケータ（V&P Scientific社）を使用してアクセス孔を通し、液滴中から除去することができる。その結果、上記試料取扱プロセスの全体を上記プレートの上記上面から遂行することができる。これによって、従来の懸滴方法で採用されていたペトリ皿の面倒な反転作業を避けることができる。さらに、この液体取扱スキームにより、上記装置がハイスループット・スクリーニング用の自動化機器と完全に適合可能となり、スフェロイド実験のスケールアップを実現可能にする。さらに、上記懸滴のサイズは上記底面上の上記プラトー部の直径によって制限された。その結果、上記懸滴の幾何学形状は、広がりを見せることなく、上記培養プロセスに沿って一貫性のあるものに保持できる。これにより、ローバスト性と安定性がより高い培養条件が得られる。
【０１２７】
（方法：）
上記設計したアレイプレートを使用する長期のスフェロイドの懸滴培養の安定性を調べるため、３種類の細胞（腎臓線維芽細胞（ＣＯＳ７）、マウス胚幹（ｍＥＳ）細胞（ＥＳ−Ｄ３）、メソテリンを安定的に発現するヒト癌細胞（Ａ４３１．Ｈ９））を培養する一方で重量オスモル濃度の測定を行った。上記プレートを使用して懸滴培養を行う前に、０．１％ｗ／ｖブタゲル（Sigma- Aldrich社）を塗布したディッシュ内でＥＳ−Ｄ３細胞を培養し、１５％ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco 10082、 Invitrogen社）と、４ｍＭのL-グルタミン（Invitrogen社）と、０．１ｍＭの２−メルカプトーエタノール（Sigma-Aldrich社）と、０．０２％ｖ／ｖのピルビン酸ナトリウム（Sigma- Aldrich社）と、１００Ｕｍｌ−１のペニシリン（Invitrogen社）と、１００Ｕｍｌ−１のストレプトマイシン（Invitrogen社）と、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む１００Ｕｍｌ−１のＥＳＧＲ０（Invitrogen社）とを含むDulbecco's Modified Eagle's培地（ＤＥＥＭ）（Gibco 11960、Invitrogen社）からなる培地内に保持した。１０％ｖ／ｖのＦＢＳ（Gibco 10082、Invitrogen社）と１％ｖ／ｖのantibiotic-antimicotic（Gibco 15240、Invitrogen社）を含めたＤＭＥＭ（Gibco 11965、Invitrogen社）内で、ＣＯＳ７細胞とＡ４３１．Ｈ９細胞を培養した。加湿した培養器（５％ＣＯ２大気で３７℃）内で、上記全細胞の培養を行った。上記懸滴実験用の細胞懸濁液は、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco 25200、Invitrogen社）で細胞を解離し、解離細胞を室温下で１時間遠心（１０００ｒｐｍ）し、成長培地内に再度懸濁することで調製した。血球計算板を使用して細胞密度を見積もった。
【０１２８】
スフェロイドの培養用プレート上で、１５μｌの細胞懸濁液を各細胞培養部位のアクセス孔の内部へ供給して、懸滴を形成した。蒸発を防ぐために、４ｍｌの蒸留水を周辺貯水部に加えた。さらに、上記プレートをウェルプレートの蓋部と蒸留水で満たした９６ウェル型プレートとで挟み、パラフィルムで覆った。液滴から５μリットルの溶液を採取し、７μｌの新しい成長培地を液滴に添加して、上記成長培地を一日おきに交換した。重量オスモル濃度の測定には、１０μｌの試料液を液滴からピペットで取り出し、分析のために蒸気圧浸透圧計（Vapro Model 5520、Wesco社）へ移動させた。
【０１２９】
抗癌剤感受性の検査を実演するために、３つの異なるサイズのＡ４３１．Ｈ９スフェロイド（細胞数が３００、１５００、７５００のスフェロイド）を２種類の薬剤（tirapazamine（ＴＰＺ）（Toronto Research Chemicals社）と５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（Sigma- Aldrich社））の影響下で検査した。上述の手順では、上記指定の細胞数のＡ４３１．Ｈ９スフェロイドを形成し、それらの成長培地を一日おきに交換した。最終試験濃度の４倍の濃度になるようにＴＰＺと５−ＦＵの原液（０、０．１、１、１０、１００、１０００、５０００μＭ）をDulbecco'sリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（Gibco 14190、Invitrogen社）内で初期調整した。その後、Ａ４３１．Ｈ９スフェロイドの培養２日目に、Ａ４３１．Ｈ９細胞懸滴の各１５μｌに対して、上記適切な濃度のＴＰＺ（または５−ＦＵ）原液を５μｌずつ添加した。alamarBlue（Invitrogen社）を使用する薬剤培養の２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後に、細胞の生存率をモニタリングした。製造者の手順に従って、２μｌ（各懸滴試料の体積の１０分の１）のalamarBlueを各Ａ４３１．Ｈ９懸滴スフェロイド試料に添加し、２時間インキュベート（保温培養）した。このインキュベーション後、プレート読取器（FLx800 Fluorescence Microplate Reader、Biotek社）を使用して、５２５ｎｍの励起と５９０ｎｍの発光状態で、各Ａ４３１．Ｈ９懸滴スフェロイド試料用プレートの読取を行うことによって、蛍光強度の読取を行った。AlamarBlueの蛍光強度が細胞数に正比例するので、０μＭの未処理の対照スフェロイドに標準化することで、各薬剤物濃度に対する細胞生存率の平均値を簡単に求められる。２Ｄ制御条件下での抗癌剤感受性実験を、９６ウェル型プレート（Corning Costar 3596）を使用し、それ以外は上記３Ｄスフェロイド実験と同様とした標準組織培養に対して行った。培養培地の５０％を一日おきに新しい培地と交換した。
【０１３０】
（Ｂ．結果）
図１のａに、上記懸滴用の３８４ウェル型アレイプレートの概略図を示す。図１のｂに、交互に配列された１９２個の懸滴を有する上記プレートの図を示す。上記スフェロイドの懸滴培養部位は、１６行×２４列で、互いから双方向に４．５ｍｍ離間されている標準化３８４ウェルプレートのフォーマットで配置されている。上記プレートの外環に設計された貯水部は、４ｍＬまでの水分を更に保持して、蒸発を緩和させている。図１のａの拡大図に、液体の滴が滴下し、かつ上記底面上の上記プラトー部の直径によって制限されている、上記プレートの上記上面の上記アクセス孔を示す。このようなオーダーメードのポリスチレンプレートは、ハイスループットのアレイフォーマットで懸滴が効率的に形成されることを可能にする。図１のｃは、市販の液体取器（CyBi-Well）による３８４懸滴用アレイプレートでの上記懸滴の形成プロセスを示すスナップ写真であり、このプレートをハイスループット可能に使用して、スフェロイドの懸滴培養をスケールアップすることの有用性を示している。
【０１３１】
図２のａに、上記ＣＯＳ７細胞の培地と、上記ｍＥＳ細胞の培地と、上記Ａ４３１．Ｈ９細胞の培地との平均重量オスモル濃度の５日間の間の変化をプロットした図を示す。−５０％の培地変換を一日おきに行った場合、上記細胞の培地の重量オスモル濃度は２週間の間比較的安定している。図２のｂに上記ＣＯＳ７細胞のスフェロイドと上記ｍＥＳ細胞のスフェロイドの生死写真を示す。これによると、大半の細胞が１２時間の培養後に生存していたことが示されている。図２のｃにＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのサイズ（直径）と細胞数との関係を示す。上記３８４懸滴用アレイプレートで培養したスフェロイドが適切に成長しているか否かを調査するために、上記スフェロイドのサイズを毎日測定した。また、図２のｃに１週間の間のＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの平均サイズも示す。上記プロットは、異なるサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドが７日間の培養期間の間増殖していることを明示している。上記培地の重量オスモル濃度の安定性と上記スフェロイドの適切な成長との組み合わせは、上記３８４懸滴用アレイプレートがスフェロイドの培養に好適な環境を提供することを示している。上記懸滴培養の条件の安定性と、広がりを伴わない上記懸滴の幾何学形状のローバスト性とが、スフェロイドの簡単な長期培養を可能にする。
【０１３２】
上記３８４懸滴用アレイプレートでの抗癌剤感受性の試験の実証として、ＴＰＺと５−ＦＵの２種類の抗癌剤を試験した。図３のａ−ｃに、０μＭ、１０μＭ、５０００μＭのＴＰＺを使用して処理した異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイド（細胞数３００、１５００、７５００のスフェロイド）の経時画像を示す。上記処理を行っていないＡ４３１．Ｈ９細胞の異なる３つのサイズの対照スフェロイドは、薬剤処理の期間中でも成長し、適切に増殖する。一方、１０μＭのＴＰＺを使用して処理した上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのサイズは、上記薬剤処理の期間中比較的安定しており、スフェロイド成長の阻害を示した。最後に、５０００μＭのＴＰＺを使用して処理した異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドについては、９６時間の薬剤処理期間中に低い生存率が次第に示され、薬剤の毒性を示した。図３のｄに、上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのそれぞれと２Ｄ培養条件とについて、様々なＴＰＺ濃度における、初期薬剤処理の９６時間後の細胞の生存率（％）を概説する棒グラフを示す。従来の２Ｄ条件で培養したＡ４３１．Ｈ９細胞のＩＣ５０は約５０μＭであり、３Ｄ条件で培養した上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのＩＣ５０は約８μＭである。大半の抗癌剤に反して、ＴＰＺを使用して処理したＡ４３１．Ｈ９細胞は、２Ｄ条件で培養された場合に、３Ｄ条件で培養された場合よりも高い耐性をしめした。
【０１３３】
同様に、図４のａ−ｃに、０μＭ、１０μＭ、５０００μＭの５−ＦＵを使用して処理した異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイド（細胞数３００、１５００、７５００のスフェロイド）の経時画像を示す。上記処理を行っていない異なる３つのサイズの対照Ａ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの全ては健康を示し、薬剤処理期間中に適切に増殖している。しかし、Ａ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドを１０μＭの５−ＦＵを使用して処理した場合、上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドは上記薬剤処理後の９６時間に徐々に小さくなり、スフェロイド成長の阻害が示された。最後に、Ａ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドを、５０００μＭの５−ＦＵを使用して処理した場合、上記異なる３つのサイズ全てについて、薬剤処理の４８時間後に細胞が解離し始め、スフェロイドの全体性が毀損された。Ａ４３１．Ｈ９細胞のかなりの部分は、薬剤処理後から９６時間までに、Ａ４３１．Ｈ９スフェロイドから既に解離しており、薬剤の毒性が示された。図４のｄは、上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドと従来の２Ｄ培養条件とについて、異なる５−ＦＵ濃度において、細胞の薬剤処理から９６時間後の生存率（％）を概説する棒グラフの結果を要約するものである。従来の２Ｄ条件下で培養したＡ４３１．Ｈ９細胞のＩＣ５０は約０．１μＭであり、３Ｄ条件で培養した上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのＩＣ５０は、それぞれ、約３μＭ（細胞数が３００のスフェロイド）、約１μＭ（細胞数が１５００のスフェロイド）、約９０μＭ（細胞数が７５００のスフェロイド）である。大半の抗癌剤で予期していたように、５−ＦＵを使用して処理を行っていたＡ４３１．Ｈ９細胞は、３Ｄ条件で培養された場合、２Ｄ条件で培養された場合よりも高い耐性を示す。
【０１３４】
〔実施例２〕
（付加的なプレート設計）
本開示内容の特定の実施形態の装置は、懸滴をローバスト性高く形成でき、この懸滴を保持でき、上記懸滴に流体を添加および／または除去する能力を提供し、または、これらの組み合わせを実現することが可能である。各アクセス孔は懸滴を適切な位置にしっかりと保持するように構成されているので、大量の懸滴を再生可能に形成することができる。特定の実施形態では、各アクセス孔は実質的に同一である。上記アレイプレートの上面に開口部を有する上記アクセス孔は、流体を回収または添加して懸滴を形成することと、既に形成された懸滴からの流体の回収または既に形成された懸滴への流体の添加を行うことの何れかを可能にする。これは、上記懸滴および／または上記懸滴の内容物の測定可能な特性を、操作および／または保持するように、流体を実験の間中回収または添加できることを意味する。この実施例は、上記液滴を安定的に閉じ込める追加の局所的な障壁を提供する装置（例えば、図１４に説明するような装置）を説明する。上記障壁を図１４Ｂに示す。上記装置は、上記孔の上部と下部の両方に設けられた付加的な環（幅：０．２５μＭ、上記プラトー部の上面または底面からの高さ：０．５μＭ）を備えている。液体が当該孔を介して上方および下方に移動できる貫通孔であって、上記環が当該孔の表面ではなく端部に設けられている貫通孔内に存在する上記液滴を安定させるために、上記障壁を使用してもよい。
【０１３５】
Ｚ因子分析によって上記装置の性能を分析した。上記Ｚ因子は、スクリーニング検定において、信号反応のダイナミックレンジおよびそのバラツキを最適化するために使用される分析用の性能測定器具である。上記Ｚ因子が０．５より大きくなる場合は、典型的に、上記分析結果は“良”とされる。しかし、特定の用途では、より低い値のＺ因子でも十分である。
【０１３６】
３８４懸滴用プレートと標準化３８４ウェルプレートでの蛍光ベース分析と吸収ベース分析のためのＺ因子は以下のように算出される。フルオレセインまたは黄色食品色素の幅を有する濃縮を上記３８４懸滴用プレートと３８４標準化ウェルプレートに配置した。プレート読取器を使用して読取の測定を行った。Ｚ因子は、各種プレートの各濃縮度で得られた値に基づいて算出した。この結果を図１５に示す。ほとんどの濃縮においては、上記Ｚ因子は０．５を越えている。上記３８４懸滴用プレートのＺ因子は、上記標準化３８４ウェルプレートにおけるＺ因子に匹敵する。
【０１３７】
〔実施例３〕
本実施例は、本開示内容の特定の実施形態をさらに説明する方法例、システム例、および装置例を提供する。なお、上記特定の実施形態は本開示内容を限定するものではない。
【０１３８】
例１．（ａ）上面および底面を有し、かつそれらに複数の孔が形成されている少なくとも１つのアレイプレートであって、上記複数の孔の各々は上部と底部とを有しており、該アレイプレートの上記底面は上記複数の孔のうち少なくとも１つ底部に対して実質的に隣接する少なくとも１つのプラトー部を有しているアレイプレートを備え、
（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートは複数の懸滴を収容するように構成され、各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つの孔から懸下して上記孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成される孔の数以下であるシステム。
【０１３９】
２．上記少なくとも１つのアレイプレートの下方に配置された少なくとも１つの第２のプレートを更に備えている例１に記載のシステム。
【０１４０】
３．上記少なくとも１つのアレイプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えていることを特徴とする例１または２のシステム。
【０１４１】
４．上記少なくとも１つの第２のプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えていることを特徴とする例１、２、または３のシステム。
【０１４２】
５．上記少なくとも１つのアレイプレートと上記少なくとも１つの第２のプレートとの両方が少なくとも１つの貯水部を備えていることを特徴とする例１−３または４のシステム。
【０１４３】
６．下記の１つまたは複数を備えている例１−４または５のシステム：上記少なくとも１つのアレイプレート内に設けられた１つまたは複数の貯水部；上記少なくとも１つの第２のプレートを備えている１つまたは複数の貯水部；上記少なくとも１つのアレイプレートに設けられた１つまたは複数の貯水部。一方、上記少なくとも１つの第２のプレートに貯水部は設けられない；位置合わせした上記第２のプレートに設けられた１つまたは複数の貯水部。一方、上記少なくとも１つのアレイプレートに貯水部は設けられない；または、上記少なくとも１つのアレイプレートと上記少なくとも１つの第２のプレートの両方に設けられた１つまたは複数の貯水部。
【０１４４】
７．各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下し、上記孔の下方で広がる、例１−５または６のシステム。
【０１４５】
８．上記少なくとも１つの第２のプレートが、上記少なくとも１つのアレイプレートの端部の少なくとも一部に接触し、上記少なくとも１つの第２のプレートが、上記懸滴の１つまたは複数と実質的に接触してない、例１−６または７のシステム。
【０１４６】
９．上記少なくとも１つのアレイプレートのための少なくとも１つの蓋部を更に備え、上記少なくとも１つの蓋部は１つまたは複数の上記少なくとも１つのアレイプレートの上面上に設置され、また上記少なくとも１つの蓋部は上記複数の懸滴を収容するように構成された上記複数の孔の部分に接触していない、例１−７または８のシステム。
【０１４７】
１０．上記１つまたは複数の貯水部が１つまたは複数の物質を有する例１−８または９のシステム。
【０１４８】
１１．上記複数の懸滴の１つ以上が以下の１つ以上を含む、例１−９または１０のシステム：複数の細胞；少なくとも１つの複合組織または有機体；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体；１つ以上のタンパク質；１つ以上のナノ粒子、１つ以上の試験化合物；１つ以上の薬剤；水性の流体によって構成された固形物またはゲル；または、これらの組み合わせ。
【０１４９】
１２．上記孔の直径は約１．６ｍｍである、例１−１０または１１のシステム。
【０１５０】
１３．上記孔は互いから約４．５ｍｍ離間している、例１−１１または１２のシステム。
【０１５１】
１４．上記アレイプレートが上記孔の複数の行および列を有している、例１−１２または１３のシステム。
【０１５２】
１５．上記少なくとも１つのプラトー部の端部が少なくとも１つの環状構造を備えている、例１−１０または１１のシステム。
【０１５３】
１６．上記少なくとも１つのアレイプレートの特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレートを処理する、例１−１４または１６のシステム。
【０１５４】
１７．上記少なくとも１つのアレイプレートの物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレートを処理する、例１−１５または１６のシステム。
【０１５５】
１８．上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部のうち、１つまたは複数について、対応する処理面の特性を変更するように処理する、例１−１６または１７のシステム。
【０１５６】
１９．上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部について、対応する処理面の物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように処理する、例１−１７または１８のシステム。
【０１５７】
２０．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成されている上記孔の１つまたは複数の上面に実質的に隣接しているか、または隣接している第２のプラトー部を備えている、例１−１８または１９のシステム。
【０１５８】
２１．米国規格協会および／または生体分子化学規格協会に準拠している、例１−１９または２０のシステム。
【０１５９】
２２．上記少なくとも１つのアッセイプレートと、上記少なくとも１つの他のプレートと、上記少なくとも１つの蓋部とのうち１つ以上が光学的に透明であり、光学的イメージングおよび／または光学的分析用に実質的に遮るものがない視界を提供する、例１−２０または２１のシステム。
【０１６０】
２３．ハイスループット・スクリーニングに適合する、例１−２１または２２のシステム。
【０１６１】
２４．積み重ね可能である、１−２２または２３のシステム。
【０１６２】
２５．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の幾何学形状を安定させるように構成されている、例１−２３または２４のシステム。
【０１６３】
２６．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の位置を安定させるように構成されている、例１−２４または２５のシステム。
【０１６４】
２７．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の懸滴の測定可能な特性を安定および保持するように構成されている、例１−２５または２６のシステム。
【０１６５】
２８．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備えている、例１−２６または２７のシステム。
【０１６６】
２９．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備え、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面の上記少なくとも１つのプラトー部が、上記孔への液体の輸送および／または上記孔からの液体の輸送を向上するように構成されている、例１−２７または２８のシステム。
【０１６７】
３０．実質的に安定している湿度を保持する、例１−２８または２９のシステム。
【０１６８】
３１．上記複数の懸滴の環境の測定可能な特性を保持するように構成されている、例１−２９または３０のシステム。
【０１６９】
３２．少量の流体を取り扱うように構成されている、例１−３０または３１のシステム。
【０１７０】
３３．上記複数の懸滴の１つ以上における複数の細胞の長期培養を可能とするように構成されている、例１−３１または３２のシステム。
【０１７１】
３４．以下の１つ以上を可能とするように構成されている、例１−３２または３３のシステム：複数の細胞の長期的培養、保持、分析、および／または試験；少なくとも１つの複合組織または有機体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のタンパク質の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のナノ粒子の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の試験化合物の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の薬剤の長期的培養、保持、分析、および／または試験；または、これらの組み合わせ。
【０１７２】
３５．上記複数の細胞が球状に成長している、例１−３３または３４のシステム。
【０１７３】
３６．試料取扱ロボット装置とプレート読取器とからなる一群から選択される１つ以上のハイスループット試料取扱装置を更に備えている、例１−３４または３５のシステム。
【０１７４】
３７．例１−３５または３６のシステムを１つ以上使用する方法。
【０１７５】
３８．複数の懸滴をシステム内へと導入する工程を含む方法であって、
（ａ）上面と、底面と、複数の孔とを有し、上記複数の孔の各々は上部および底部を有し、上記アレイプレートの上記底面は、上記複数の孔のうち少なくとも１つの底部と実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を有している、少なくとも１つのアレイプレートを備え；
（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートが、複数の懸滴を収容するように構成され、上記複数の懸滴の各々は、上記複数の孔のうち対応する１つから滴下し、上記対応する１つの孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる上記複数の懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレート内にある上記複数の孔の数以下であり；そして、
上記複数の懸滴の１つ以上に対して、培養、保持、分析、試験、またはそれらの組み合わせを行う方法。
【０１７６】
３９．上記各液滴が、上記少なくとも１つのアレイプレートの上側または下側から上記孔を介して注入される、例３８の方法。
【０１７７】
４０．上記懸滴を上記孔を介して除去する工程を更に含んだ、例３８または３９の方法。
【０１７８】
４１．少なくとも１つ以上の懸滴から流体を除去、または、少なくとも１つ以上の懸滴に流体を添加する工程を更に含んだ、例３８、３９、または４０の方法。
【０１７９】
４２．上記少なくとも１つのアレイプレートの下に配置された少なくとも１つの第２のプレートを更に備えている、例３８−４０または４１の方法。
【０１８０】
４３．上記少なくとも１つのアレイプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている、例３８−４１または４２の方法。
【０１８１】
４４．上記少なくとも１つの第２のプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている、例３８−４２または４３の方法。
【０１８２】
４５．上記少なくとも１つのアレイプレートと上記少なくとも１つの第２のプレートとの両方が少なくとも１つの貯水部を備えている、例３８−４３または４４の方法。
【０１８３】
４６．各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下し、上記孔の下方で広がる、例３８−４４または４５の方法。
【０１８４】
４７．上記複数の懸滴の１つ以上が以下の１つ以上を含んでいる、例３８−４５または４６の方法：複数の細胞；少なくとも１つの複合組織または有機体；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体；１つ以上のタンパク質；１つ以上のナノ粒子、１つ以上の試験化合物；１つ以上の薬剤；または、これらの組み合わせ。
【０１８５】
４８．上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの他のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部の１つまたは複数について、対応する処理面の特性を変更するように処理する、例３８−４６または４７の方法。
【０１８６】
４９．上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの他のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部について、対応する処理面の物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように処理する、例３８−４７または４８の方法。
【０１８７】
５０．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面が、１つまたは複数の上記孔の上面と実質的に隣接しているかまたは隣接している少なくとも１つの第２のプラトー部を備えている、例３８−４８または４９に記載の方法。
【０１８８】
５１．米国規格協会および／または生体分子化学規格協会に準拠している、例３８−４９または５０の方法。
【０１８９】
５２．上記少なくとも１つのアッセイプレートと、上記少なくとも１つの第２のプレートと、上記少なくとも１つの蓋部とのうち１つ以上が光学的に透明であり、光学的イメージングおよび／または光学的分析のための実質的に遮るものがない視界を提供する、例３８−５０または５１の方法。
【０１９０】
５３．ハイスループット・スクリーニングに対応する、例３８−５１または５２の方法。
【０１９１】
５４．上記システムが積み重ね可能である、例３８から５２または５３の方法。
【０１９２】
５５．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の幾何学形状を安定させるように構成されている、例３８−５３または５４の方法。
【０１９３】
５６．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の位置を安定させるように構成されている、例３８−５４または５５の方法。
【０１９４】
５７．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の懸滴の測定可能な特性を安定および保持するように構成されている、例３８−５５または５６の方法。
【０１９５】
５８．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つ上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備えている、例３８−５６または５７の方法。
【０１９６】
５９．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つの孔の上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備え、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面に設けた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記孔への液体の輸送および／または上記孔からの液体の輸送を向上するように構成されている、例３８−５７または５８の方法。
【０１９７】
６０．実質的に安定した湿度を保持するように構成されている、例３８−５８または５９の方法。
【０１９８】
６１．上記複数の懸滴の環境の測定可能な特性を保持するように構成されている、例３８−５９または６０の方法。
【０１９９】
６２．少量の液体を取り扱うように構成されている、例３８−６０または６１の方法。
【０２００】
６３．上記複数の懸滴の１つ以上において複数の細胞の長期培養を可能とするように構成されている、例３８−６１または６２の方法。
【０２０１】
６４．以下の１つ以上を可能とするように構成されている、例３８−６２または６３の方法：複数の細胞の長期的培養、保持、分析、および／または試験；少なくとも１つの複合組織または有機体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；生体物質および／または化学物質を含む水性野流体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のタンパク質の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のナノ粒子の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の試験化合物の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の薬剤の長期的培養、保持、分析、および／または試験；または、これらの組み合わせ。
【０２０２】
６５．試料取扱ロボット装置とプレート読取器とからなる一群から選択される１つ以上のハイスループットな試料取扱装置を更に備えている、例３８−６３または６４の方法。
【０２０３】
以下の追加実施例に、本開示内容の装置の特定の実施形態を説明する。なお、本開示内容はこの実施形態に限定されない。
【０２０４】
装置例１．上面と底面とを有するアレイプレートであって、該アレイプレートには複数の孔が形成され、上記複数の孔の各々は上面と底面とを有し、該アレイプレートの上面は、上記孔のうち１つ以上の底面に隣接しているかまたは実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を備えているアレイプレートを備えている装置。
【０２０５】
２．貯水プレートを更に備え、上記貯水プレートが上記アレイプレートの端部と実質的に接触し、上記貯水プレートが１つ以上の上記孔と実質的に接触していない、例１の装置。
【０２０６】
３．上記貯水プレートが、上記アレイプレートの端部とのみ接触している、例１または２の装置。
【０２０７】
４．上記アレイプレートのためのカバーを更に備え、上記カバーが上記アレイプレートの上面に配置され、上記カバーが１つ以上の上記孔と実質的に接触していない、例１、２、または３の装置。
【０２０８】
５．上記貯水部が加湿物質を更に備えている、例１−３または４の装置。
【０２０９】
６．上記貯水プレートが上記アレイプレートの実質的に下方に配置されている、例１−４または５の装置。
【０２１０】
７．上記貯水プレートが、上記アレイプレートの上記複数の孔に接触していない、例１−５または６の装置。
【０２１１】
８．上記アレイプレートが３８４個の孔を有している、例１−６または７の装置。
【０２１２】
９．上記孔の直径は約１．６ｍｍである、例１−７または８の装置。
【０２１３】
１０．上記孔は互いから約４．５ｍｍ離間している、例１−８または９の装置。
【０２１４】
１１．上記アレイプレートが複数の行および列の上記孔を有している、例１−９または１０の装置。
【０２１５】
１２．上記少なくとも１つのプラトー部の端部が、少なくとも１つの環状構造を有している、例１−１０または１１の装置。
【０２１６】
１３．上記アレイプレートの上記底面が、少なくとも１つの表面処理材料によってコーティングされている、例１−１１または１２の装置。
【０２１７】
１４．上記アレイプレートの上記上面が、上記孔のうち１つ以上の上面と実質的に隣接している少なくとも１つの第２のプラトー部を備えている、例１−１２または１３の装置。
【０２１８】
１５．米国規格協会および／または生体分子化学規格協会に準拠している、例１−１３または１４の装置。
【０２１９】
１６．上記貯水プレートが、光学的に透明な底面部を更に有し、光学的イメージングおよび／または光学的分析のための、遮えられることのない視界を提供する、例１−１４または１５の装置。
【０２２０】
１７．ハイスループットなスクリーニングに適合可能である、例１−１５または１６の装置。
【０２２１】
１８．積み重ねることが可能である、例１−１６または１７の装置。
【０２２２】
上記明細書に記載した刊行物および特許は、参照することによりその全開示内容が本願に援用される。本開示内容に記載の装置、方法、および／またはシステムを本開示内容の範囲および精神から逸脱することなく多様に変更および変形できることは、当業者にとって明らかであろう。本願の発明を特定の好適な実施形態に関連して説明したが、特許請求を行う発明がこれら特定の実施形態に不当に限定されないことは理解されるものであろう。実際には、本願発明を行うための上述の様態の、当業者にとって明らかな多様な変更様態も、下記の特許請求に範囲に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】本開示内容のある実施形態に係る装置の例を示し、（ａ）は本発明の実施形態で使用される３８４−ウェル仕様の細胞スフェロイド培養用アレイプレートを示す断面図であり、（ｂ）は上記アレイプレートの写真および上記アレイプレートの寸法を示し、（ｃ）は９６箇所の細胞培養部位を同時にピペット操作可能な液体取扱ロボットによって作動される上記アレイプレートの写真を示し、（ｄ）は加湿室の図を示す。
【図２】（ａ）はある実施形態に係る、細胞集団の異なるＣＯＳ７細胞スフェロイドと、ｍＥＳ細胞スフェロイドと、Ａ４３１．Ｈ９細胞スフェロイドとについて、７日間を超え１２日間までの培養中における重量オスモル濃度を示し、ある実施形態に係る、（ｂ）は染色した生／死ＣＯＳ７細胞スフェロイドと生／死ｍＥＳ細胞スフェロイドとについて、１２日間の培養中の様子を写した蛍光画像を示し、（ｃ）は細胞の開始数に対するＡ４３１．Ｈ９スフェロイドのサイズ（直径）を示し、（ｄ）は、ある実施形態について、様々な開始数の細胞／スフェロイドの培養時間に対するＡ４３１．Ｈ９スフェロイドのサイズ（体積）を示す。
【図３】特定の実施形態におけるＴＰＺを使用する薬剤処理の結果を示し、異なる濃度におけるＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの経時画像と、全てのスフェロイドサイズと従来の２Ｄ培養条件について、薬剤処理から９６時間後の対照細胞の生存率（％）を異なる濃度毎に概説する棒グラフとを示す。
【図４】特定の実施形態における５−ＦＵを使用する薬剤処理の結果を示し、異なる濃度におけるＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの経時画像と、全てのスフェロイドサイズと従来の２Ｄ培養条件について、薬剤処理から９６時間後の対照細胞の生存率（％）を異なる濃度毎に概説する棒グラフとを示す。
【図５】特定の実施形態で使用する装置例の概略図である。
【図６】特定の実施形態で使用する装置例の概略図である。
【図７】特定の実施形態で使用する装置例の詳細図である。
【図８】特定の実施形態で使用する装置例の詳細図である。
【図９】特定の実施形態に係るプラトー部の図である。
【図１０】特定の実施形態に係る装置に細胞と液体を加え、この装置から上記細胞と液体を除去する方法例の概略図である。
【図１１】特定の実施形態に係る方法を使用して培養したｍＥＳスフェロイドである。
【図１２】特定の実施形態に係る方法を使用して培養したｍＥＳスフェロイドである。
【図１３】特定の実施形態に係る方法を使用して培養した肝細胞スフェロイドである。
【図１４】特定の実施形態で使用する装置例の概略図を示すものであり、Ａは全体図、Ｂは環状構造の拡大図である。
【図１５】特定の実施形態において異なる濃度で測定した蛍光分析と吸光分析とのＺファクタ（Z-factors）である。
【図１６】Ａ−Ｆは、特定の実施形態におけるアレイプレートの例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは上方からの等角図を示し；Ｃは側面図を示し；Ｄは端面図を示し；Ｅは、Ａに示すＭ−Ｍ切断線に沿った断面図を示し；Ｆは、Ｃに示すＬ−Ｌ切断線に沿ったアレイプレートの断面図を示す。
【図１７】特定に実施形態に係るプラトー構造の例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは上方からの等角図を示し；Ｃは底面図を示し；Ｄは底面からの等角図を示す。
【図１８】特定の実施形態に係るアクセス孔構造の例の上面図、断面図、および底面図である。
【図１９】特定の実施形態に係るアクセス孔の配列例の断面描写と、上面および底面からの等角３Ｄ描写である。
【図２０】Ａ−Ｆは、特定の実施形態に係る、図１６に示すアレイプレートと共に使用されるトレイの例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは上面からの等角図を示し；Ｃは側面図を示し；Ｄは端面図を示し；Ｅは、Ａに示すＰ−Ｐ切断線に沿う断面図を示し；Ｆは、Ｃに示すＮーＮ切断線に沿ったトレイの断面図を示す。
【図２１】Ａ−Ｆは、特定の実施形態に係る、図１６に示すアレイプレートと共に使用される蓋部の例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは上面からの等角図を示し；Ｃは側面図を示し；Ｄは端面図を示し；Ｅは、Ａに示すＲ−Ｒ切断線に沿う断面図を示し；Ｆは、Ｃに示すＴ−Ｔ切断線に沿った蓋部の断面図を示す。
【図２２】Ａ−Ｆは、特定の実施形態に係る、アレイプレートと、トレイと、蓋部とを組み合わせた組立部の例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは等角図を示し；Ｃは側面図を示し；Ｄは端面図を示し；Ｅは、Ａに示すＶ−Ｖ切断線に沿う断面図を示し；Ｆは、Ｃに示すＵ−Ｕ切断線に沿った上記組立部の断面図を示す。
【図２３】Ａ−Ｂは、特定の実施形態に係る、図２２のＡ−Ｆに示す上記組立部の積み重ねの例を示すものであり、Ａは側面図を示し、Ｂは端面図を示す。
【図２４】Ａ−Ｄは、特定の実施形態に係る、アクセス孔構造の変形例を示すものであり、Ａは、高くて薄いプラトー構造が上面に設けられたアクセス孔構造の例を示し、Ｂは、短くて薄いプラトー構造が上部に設けられたアクセス孔構造の例を示し、Ｃは、高くて厚いプラトー構造が上部に設けられたアクセス孔構造の例を示し、Ｄは、高くて薄いプラトー構造が上部に設けられ、インジェクション形成用の異なる分割線が設けられたアクセス孔構造の例を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は米国特許出願Ｎｏ．６１／２９９，０１１号（出願日：２０１０年１月２８日）に基づく優先権を主張するものであり、上記米国特許出願を参照することによりその全開示内容を援用する。さらに、本願は、Sambrook, J. et al.によるマニュアル“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp.16.9-16.15”を援用することによりその全開示内容を援用する。
【０００２】
［技術分野］
本開示内容は、装置、システム、および懸滴の発生および取扱においてそのような装置を使用する方法に広く関連する。また、本開示内容は、細胞培養装置、システム、およびこのような装置を使用する方法にも広く関連する。また、本開示内容は、上記細胞培養装置の研究およびハイスループット・スクリーニング（high throughput screening）のための使用用途にも広く関連する。
【０００３】
［背景技術］
薬剤物検査およびスクリーニング（screening）実験用のインビトロ（in vitro）細胞モデルおよびインビトロ組織モデルは、製薬産業における新規の治療学の発展の中核をしばし成している。現在、ほとんどのインビトロ研究は従来の２次元（２Ｄ）細胞培養系の下で実施されているが、こうした２次元細胞培養系は機能性組織および腫瘍の生理学的モデルではない場合が多い。よって、このようなモデルを使用する薬剤研究では、正確な読み出し情報（read out）が得られないことがある。より有意義な結果を得るために、動物を使用するインビボ（in vivo）研究がしばしば利用される。一方で、インビボ研究の明らかな欠点の１つとして、多大な時間を必要とすることと、実験の費用が高くなることが挙げられる。従来の非生理的な２Ｄモデルとインビボ実験との間のギャップを埋めるために、製薬産業における薬剤検査とスクリーニングの治療予測的且つ生理学的に適切な結果を提供する３次元（３Ｄ）のインビトロモデルが必要とされている。３Ｄ細胞培養モデルを作製する１つの方法として、スフェロイド（spheroid）、または３Ｄの細胞集合または細胞集合体を介して行う作製方法がある。
【０００４】
ハイスループット・スクリーニングおよび試験など特定の用途に適した方法によるスフェロイド培養物の成長は幾つかの欠点を抱えている。従来のスフェロイド形成は、ペトリ皿の蓋部の裏面の懸滴中で細胞浮遊液を培養することを含んでいる。この処理では、液滴の配置後に上記蓋部を反転させることが必要である。その結果、上記液滴が摂動の影響を受けやすくなり、落下、広がり、および隣接する滴との融合を起こす。この方法は、費用は高くないが、大きな労働力を必要とし、効率的なスケーラブル（scalable）生産が不可能であり、ハイスループット・スクリーニング用の自動化器具に対応しないものである。上記スフェロイドを損傷させずに培地を交換するのは難しいため、この方法は通常、上記スフェロイドを人手によって１つずつ長期培養、処理、分析、および収集（ハーベスト）のためにマルチウェル培養プレートへ移す他の労働集約的な工程を必要とする。
【０００５】
代わりの方法としては、スピナーフラスコおよび回転型の培養容器などの生物反応器内で細胞懸濁液を、連続攪拌する条件下でスフェロイドの形成を誘発する。この方法では、大量の培地を消費することが必要である。また、この方法は特殊な器具を必要とし、上記スフェロイドのサイズと均一性を制御することが困難である。スフェロイドの変動性は高く、スフェロイドを多くの用途に使用することができない。
【０００６】
３次元のミクロウェル（micro well）構造と平面状の微細パターンを使用してスフェロイドを産出する方法も可能である。しかし、これらの方法は、上記ミクロウェル構造と上記微細パターンを発生させる特殊な器具と高価な器具と必要とする。さらに、複数のスフェロイドを１つの流体区内で培養するため、上記スフェロイドを個別にモニタリングや操作することが不可能であり、試験化合物で個別に処理することも不可能である。また、処理の前後に個々のスフェロイドを分析することが困難なので、上記方法は、例えば、薬剤試験用途およびスクリーニング用途など特定の用途に不適当である。
【０００７】
他の最近の進歩は、スフェロイドを発生および操作するように設計された微小流体素子を含む。しかし、これらの素子は設計および作製するには費用が高い。また、これらの素子はスフェロイドの長期的な培養には適しておらず、特定の薬剤と化学的に対応しておらず、ハイスループット・スクリーニングを行う自動化器具とも対応していない。
【０００８】
上述の技術における問題に対処するために、本願に開示する装置、方法、および／またはシステムが必要とされている。
【０００９】
［発明の概要］
本開示内容は、装置、システム、および流体の懸滴およびその取扱にそのような装置を使用する方法に広く関連する。また、本開示内容は、このような装置を使用する細胞培養装置、システム、および方法にも広く関連する。また、本開示内容は、研究用途とハイスループット・スクリーニング用途への細胞培養装置の利用にも広く関連する。
【００１０】
例えば、一部の実施形態では、本開示内容は、（ａ）上面と、底面と、複数の孔とを有している少なくとも１つのアレイプレート（array plate）であって、上記複数の孔の各々は上部と底部とを有し、該少なくとも１つアレイプレートの上記底面は上記複数の孔のうち少なくとも１つ以上の底部に実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー（plateau）部を有している少なくとも１つのアレイプレートを備え；（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートは複数の懸滴を収容するように構成され、各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下して、上記孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成されている孔の数以下であるシステムを提供する。特定の実施形態では、上記システムが、上記少なくとも１つのアレイプレートの下方に配置された少なくとも１つの第２のプレートを更に備えている。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている。特定の実施形態では、上記複数の懸滴のうち１つ以上が下記の１つ以上を含んでいる：複数の細胞；少なくとも１つの複合組織または有機体；生体物質および／または化学物質を含んでいる水性の流体；１つ以上のタンパク質；１つ以上のナノ粒子；１つ以上の試験化合物；１つ以上の薬剤；水性の液体からなる固形物またはゲル；または、これらの組み合わせ。特定の実施形態では、対応する処理面の特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部を処理する。特定の実施形態では、上記システムが、米国規格協会（American National Standard Institute）および／または生体分子化学規格協会（Society for Biomolecular Science）に準拠している。特定の実施形態では、上記システムがハイスループット・スクリーニングに適合可能である。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の配置を安定させるように構成されている。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面上に設けた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の位置を安定させるように構成されている。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の懸滴の測定可能な特性を安定および保持するように構成されている。特定の実施形態では、上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備え、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記孔への液体の輸送および／または上記孔からの液体の輸送を向上するように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、実質的に安定している湿度を保持するように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、上記複数の懸滴の環境の測定可能な特性を保持するように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、少量の流体を取り扱うように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、上記複数の懸滴の１つ以上において複数の細胞の長期的培養を可能とするように構成されている。特定の実施形態では、上記システムが、以下の１つ以上を可能とするように構成されている：複数の細胞の長期的培養、保持、分析、および／または試験；少なくとも１つの複合組織または有機体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；生体物質および／または化学物質を含む液体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のタンパク質の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のナノ粒子の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の試験化合物の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の薬剤の長期的培養、保持、分析、および／または試験；または、これらの組み合わせ。
【００１１】
例えば、特定の実施形態は、複数の懸滴をシステム内へと導入する工程を含む方法であって、上記システムは、（ａ）上面と、底面と、複数の孔とを有する少なくとも１つのアレイプレートを備え、上記複数の孔のそれぞれは上部と底部を有し、上記アレイプレートの上記底面は、上記複数の孔のうち少なくとも１つの孔の底部と実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を備え、（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートが複数の懸滴を収容するように構成され、上記複数の懸滴の各々は、上記複数の孔のうち対応する１つの孔から懸下し、上記対応する１つの孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる上記複数の懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成された上記複数の孔の数以下であり、上記複数の懸滴のうち１つ以上に対して、培養と、保持と、分析と、試験との何れか、またはそれらの組み合わせを行う方法である。
【００１２】
例えば、特定の実施形態は、上面と底面とを有するアレイプレートを備え、上記アレイプレートには複数の孔が形成され、上記複数の孔の各々は上面と底面を有し、上記アレイプレートの上面は、上記複数の孔のうち１つ以上の上面に隣接または実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を備えている装置である。
【００１３】
例えば、特定の実施形態は、上面および底面を有している１つ以上のアレイプレートと、このアレイプレートの下方に配置されている貯水プレート（例えば、９６ウェルプレート）とを備えている装置であって、（ａ）上記アレイプレートは、複数の行列状に配置された複数の孔を有し、上記複数の孔のそれぞれは上面と底面を有し、上記アレイプレートの上記底面は、上記複数の孔のそれぞれの底面に隣接しているプラトー部を備え、（ｂ）上記貯水プレートは上記アレイプレートの端部（例えば、端部のみ）と接触し、上記複数の孔とは接触していない装置を提供する。一部の実施形態では、上記装置が上記装置のためのカバーを含み、上記カバーが上記アレイプレートの上に配置され、上記カバーが上記複数の孔と接触していない。一部の実施形態では、上記貯水部が水性の流体を含んでいる。一部の実施形態では、上記装置がポリマー・プラスチック（polymer plastic）（例えば、ポリスチレン）から作製されている。一部の実施形態では、上記アレイプレートが３８４個の孔を有している。一部の実施形態では、上記複数の孔の直径が約１．６ｍｍである。一部の実施形態では、上記複数の孔は互いから約４．５ｍｍ離れている。一部の実施形態では、上記装置が、上記複数の孔の少なくとも片側（例えば、両側）の上部および／または底部に隣接または実質的に隣接している追加のプラトー部または環状構造を更に備えている。一部の実施形態では、上記プラトー部の端部は（例えば液滴を安定させるために）環状構造を備えている。一部の実施形態では、上記装置の１つ以上の要素に対して表面処理（例えば、コーティング、プラズマ処理など）を行っている。
【００１４】
特定の実施形態では、以下のように構成したシステムを提供する。すなわち、（ａ）上面および底面を有する１つ以上のアレイプレートを備え、上記１つ以上のアレイプレートの各々は、複数の行列状に配置された孔を有し、上記孔の各々は上面と底面を有し、上記アレイプレートの底面は、上記孔の各々の底面に実質的に隣接しているプラトー部を備え、（ｂ）上記貯水プレートは上記アレイプレートの端部（例えば、端部のみ）に接触し、上記孔には接触せず、ｃ）上記流体の液滴が上記孔のうち１つ以上から懸下し、上記孔の下方で広がるシステム。一部の実施形態では、上記懸滴が複数の細胞を含んでいる。一部の実施形態では、上記細胞が懸濁液中にある。一部の実施形態では、上記細胞が凝集体、クラスター（cluster）、またはスフェロイドを形成している。一部の実施形態では、上記細胞が、例えば、胚、組織、微小有機体、蠕虫などの複合組織または複合有機体である。他の実施形態では、上記懸滴は、生体物質および／または化学物質、または、これらの組み合わせを含む水性の流体である。例えば、上記物質として、タンパク質、ナノ粒子、ヒドロゲル（hydrogel）が挙げられる。一部の実施形態では、上記細胞は癌細胞（例えば、スフェロイドに成長した細胞）である。一部の実施形態では、上記システムが試験化合物（例えば、抗癌剤）を更に備えている。一部の実施形態では、上記システムが更に蓋部を備え、上記蓋部が上記細胞に接触せずに上記アレイプレートを覆う。一部の実施形態では、上記アレイプレート、上記貯水部、および上記カバーは、水分の喪失を防止または抑制するフィルムで巻かれている。一部の実施形態では、上記システムは１つ以上のハイスループット試料取扱装置（例えば、試料取扱用ロボット装置またはプレート読取器）を更に備えている。
【００１５】
本開示内容は更に、以下の肯定を含む方法を提供する。すなわち、（ａ）複数の懸滴を装置に流入させる工程であって、上記装置は、ｉ）上記１つ以上のアレイプレートの各々は上面および底面を有し、上記１つ以上のアレイプレートの各々は複数の行列状に配置された孔を有し、上記アレイプレートの底面は、上記孔の各々の底面に実質的に隣接するプラトー部を備え、ｉｉ）上記貯水プレートは上記アレイプレートの下方に位置しており、上記貯水プレートは上記アレイプレートの端部（例えば、端部のみ）と接触する一方で、上記孔とは接触せず、上記液滴が上記アレイプレートに形成された上記孔のうち１つ以上から懸下して、この１つ以上の孔の下方で広がる装置である工程と、（ｂ）懸滴中において、細胞が成長および／または生存を保守する条件下で細胞を培養する工程。一部の実施形態では、上記細胞は癌細胞、胚幹細胞、肝細胞など（例えば、スフェロイド状に成長している細胞）である、一部の実施形態では、上記方法は、上記細胞を試験化合物（例えば、薬剤、化学物質、気体、生体分子、またはナノ粒子）に接触させ、上記細胞の成長または他の特性に対する上記試験細胞の効果を分析（アッセイ（assay））する工程を更に備えている。一部の実施形態では、懸滴が、上記アレイプレートの上方側または下方側から上記孔または上記孔の１つの開口部を介して配置される。一部の実施形態では、上記方法が、上記液体を上記孔または上記孔の１つの開口部に供給して、追加の液体および／または細胞を上記懸滴に添加する工程を更に備えている。一部の実施形態では、上記方法は、上記液体および／または細胞を、上記孔を介して除去する工程を更に備えている。一部の実施形態では、上記アレイプレートの異なる部位（例えば、異なる懸滴または異なる細胞集団）を異なる試験化合物および／または成長条件下に曝す。
【００１６】
特定の実施形態は、以下のシステムに関する。すなわち、アレイプレートと、蓋部と、トレイとを備えているシステムであって、上記アレイプレートが上面および底面と、貯水部と、複数の孔またはアクセス孔とを有し、上記複数のアクセス孔の各々は上面と底面とを有し、上記アレイプレートの上記底面は、上記複数のアクセス孔の底面に隣接または実質的に隣接している１つ以上のプラトー構造を備え、上記アレイプレートの上面は、上記複数のアクセス孔の上面に隣接または実質的に隣接している１つまたは複数の第２のプラトー構造を備えているシステム。システムの特定の実施形態では、上記蓋部と上記トレイによって上記アレイプレートが取り囲まれ、細胞培養が外部環境および外部物質から隔離される。特定の実施形態では、上記アレイプレート、上記蓋部、および上記トレイが同じ材料から形成される。他の実施形態では、上記アレイプレートと、上記蓋部と、上記トレイとの１つ以上が異なる材料から形成されている。一部の実施形態では、上記システムは実質的に密閉されている。他の実施形態では、上記システムは、上記システムの内と外との間でのガス交換および／または上記システム内の湿度の保持を可能にするのに十分な程度に密閉されている。一部の実施形態では、上記アレイプレートと上記トレイの一方または両方が、水性の液体を収容している貯水部を備えている。一部の実施形態では、上記液体は、上記システム内の湿度を保つように気体を提供する。他の実施形態では、上記貯水部は他の物質を収容している。一部の実施形態では、上記トレイの底面は、実質的に、光学的に透明である。一部の実施形態では、実質的に光学的に透明な上記トレイの底面は実質的に平坦であり、光学的イメージングおよび光学的分析（顕微鏡法のイメージングおよび測定、比色法のイメージングおよび測定、蛍光法のイメージングおよび測定、発光法のイメージングおよび測定など）を行う場合、細胞培養の様子を実質的に妨げられることなく観察できる。一部の実施形態では、上記システム（または複数の上記システム）は、例えば、ＡＮＳＩ／ＳＢＳ（米国規格協会／生体分子化学規格協会）による現行の標準規格などの標準規格と適合する配置および測定を有しているので、上記システムが、研究開発（例えば、ハイスループット・スクリーニング）で使用されている主流の撮像システムおよび自動化装置と適合可能になる。
【００１７】
追加の実施形態を以下に説明する。
【００１８】
［図面の説明］
添付図面により、この技術の一例である各実施形態の理解が容易になるであろう。
【００１９】
図１は、本開示内容のある実施形態に係る装置の例を示し、（ａ）は本発明の実施形態で使用される３８４−ウェル仕様の細胞スフェロイド培養用アレイプレートを示す断面図であり、（ｂ）は上記アレイプレートの写真および上記アレイプレートの寸法を示し、（ｃ）は９６箇所の細胞培養部位を同時にピペット操作可能な液体取扱ロボットによって作動される上記アレイプレートの写真を示し、（ｄ）は加湿室の図を示す。
【００２０】
図２の（ａ）はある実施形態に係る、細胞集団の異なるＣＯＳ７細胞スフェロイドと、ｍＥＳ細胞スフェロイドと、Ａ４３１．Ｈ９細胞スフェロイドとについて、７日間を超え１２日間までの培養中における重量オスモル濃度を示し、ある実施形態に係る、（ｂ）は染色した生／死ＣＯＳ７細胞スフェロイドと生／死ｍＥＳ細胞スフェロイドとについて、１２日間の培養中の様子を写した蛍光画像を示し、（ｃ）は細胞の開始数に対するＡ４３１．Ｈ９スフェロイドのサイズ（直径）を示し、（ｄ）は、ある実施形態について、様々な開始数の細胞／スフェロイドの培養時間に対するＡ４３１．Ｈ９スフェロイドのサイズ（体積）を示す。
【００２１】
図３は、特定の実施形態におけるＴＰＺを使用する薬剤処理の結果を示し、異なる濃度におけるＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの経時画像と、全てのスフェロイドサイズと従来の２Ｄ培養条件について、薬剤処理から９６時間後の対照細胞の生存率（％）を異なる濃度毎に概説する棒グラフとを示す。
【００２２】
図４は、特定の実施形態における５−ＦＵを使用する薬剤処理の結果を示し、異なる濃度におけるＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの経時画像と、全てのスフェロイドサイズと従来の２Ｄ培養条件について、薬剤処理から９６時間後の対照細胞の生存率（％）を異なる濃度毎に概説する棒グラフとを示す。
【００２３】
図５は、特定の実施形態で使用する装置例の概略図を示す。
【００２４】
図６は、特定の実施形態で使用する装置例の概略図を示す。
【００２５】
図７は、特定の実施形態で使用する装置例の詳細図を示す。
【００２６】
図８は、特定の実施形態で使用する装置例の詳細図を示す。
【００２７】
図９は、特定の実施形態に係るプラトー部の図を示す。
【００２８】
図１０は、特定の実施形態に係る装置に細胞と液体を加え、この装置から上記細胞と液体を除去する方法例の概略図を示す。
【００２９】
図１１は、特定の実施形態に係る方法を使用して培養したｍＥＳスフェロイドを示す。
【００３０】
図１２は、特定の実施形態に係る方法を使用して培養したｍＥＳスフェロイドを示す。
【００３１】
図１３は、特定の実施形態に係る方法を使用して培養した肝細胞スフェロイドを示す。
【００３２】
図１４は、特定の実施形態で使用する装置例の概略図を示す。Ａ：全体図。Ｂ：環状構造の拡大図。
【００３３】
図１５は、特定の実施形態において異なる濃度で測定した蛍光分析と吸光分析とのＺファクタ（Z-factors）を示す。
【００３４】
図１６のＡ−Ｆは、特定の実施形態におけるアレイプレートの例を示す。図１６のＡは上面図を示し；図１６のＢは上方からの等角図を示し；図１６のＣは側面図を示し；図１６のＤは端面図を示し；図１６のＥは、図１６のＡに示すＭ−Ｍ切断線に沿った断面図を示し；図１６のＦは、図１６のＣに示すＬ−Ｌ切断線に沿ったアレイプレートの断面図を示す。
【００３５】
図１７のＡ−Ｄは、特定に実施形態に係るプラトー構造の例を示す。図１７のＡは上面図を示し；図１７のＢは上方からの等角図を示し；図１７のＣは底面図を示し；図１７のＤは底面からの等角図を示す。
【００３６】
図１８は、特定の実施形態に係るアクセス孔構造の例の上面図、断面図、および底面図を示す。
【００３７】
図１９は、特定の実施形態に係るアクセス孔の配列例の断面描写と、上面および底面からの等角３Ｄ描写とを示す。
【００３８】
図２０のＡ−Ｆは、特定の実施形態に係る、図１６に示すアレイプレートと共に使用されるトレイの例を示す。図２０のＡは上面図を示し；図２０のＢは上面からの等角図を示し；図２０のＣは側面図を示し；図２０のＤは端面図を示し；図２０のＥは、図２０のＡに示すＰ−Ｐ切断線に沿う断面図を示し；図２０のＦは、図２０のＣに示すＮ−Ｎ切断線に沿ったトレイの断面図を示す。
【００３９】
図２１のＡ−Ｆは、特定の実施形態に係る、図１６に示すアレイプレートと共に使用される蓋部の例を示す。図２１のＡは上面図を示し；図２１のＢは上面からの等角図を示し；図２１のＣは側面図を示し；図２１のＤは端面図を示し；図２１のＥは、図２１のＡに示すＲ−Ｒ切断線に沿う断面図を示し；図２１のＦは、図２１のＣに示すＴ−Ｔ切断線に沿った蓋部の断面図を示す。
【００４０】
図２２のＡ−Ｆは、特定の実施形態に係る、アレイプレートと、トレイと、蓋部とを組み合わせた組立部の例を示す。図２２のＡは上面図を示し；図２２のＢは等角図を示し；図２２のＣは側面図を示し；図２２のＤは端面図を示し；図２２のＥは、図２２のＡに示すＶ−Ｖ切断線に沿う断面図を示し；図２２のＦは、図２２のＣに示すＵ−Ｕ切断線に沿った上記組立部の断面図を示す。
【００４１】
図２３のＡ−Ｂは、特定の実施形態に係る、図２２のＡ−Ｆに示す上記組立部の積み重ねの例を示す。図２３のＡは側面図を示し、図２３のＢは端面図を示す。
【００４２】
図２４のＡ−Ｄは、特定の実施形態に係る、アクセス孔構造の変形例を示す。図２４のＡは、高くて薄いプラトー構造が上面に設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＢは、短くて薄いプラトー構造が上部に設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＣは、高くて厚いプラトー構造が上部に設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＤは、高くて薄いプラトー構造が上部に設けられ、インジェクション形成用の異なる分割線が設けられたアクセス孔構造の例を示す。
【００４３】
［定義］
本開示内容の理解を容易にするために、以下に多くのタームとフレーズの定義を示すが、タームの定義を本開示内容の他の箇所に示すこともある。
【００４４】
“試料”は、係るタームの最も広義の意味で使用する。一方では、“試料”は標本（specimen）または培養物を含む。他方では、“試料”は生体試料と環境試料との両方を含む。
【００４５】
生体試料は、ヒトを含む動物、流体、固体（例えば排泄物）または組織であってよく、乳製品、植物性食品、食用肉および食肉処理された獣の肉以外の有用物、および廃棄物などの液体状および固体状の食料と飼料と、その成分とであってもよい。生体試料は、多様な族を含む家畜および野生動物から得ることができる。このような動物としては、有蹄動物、熊、魚、重歯目、齧歯目などの動物、または、これらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
【００４６】
環境試料は、表面試料、土壌試料、水試料、および工業試料などの環境物質を含み、食品・乳製品加工器具、装置、機器、用具、使い捨て用品および廃棄不可能用品、またはこれらの組み合わせを使用して得られる試料をも含む。これらの例は、本開示内容に利用可能な試料のタイプを限定するものではない。
【００４７】
本開示内容で使用するように、“細胞”は、インビトロ、インビボ、およびそれらの組み合わせの何れにあるのかに関わらず、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、E. coliなどの細菌性細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚細胞、昆虫細胞）を指す。また、“細胞”は、懸濁液中、細胞集合または細胞集合体中に１つ以上の細胞を含む液体または溶液をも指す。
【００４８】
本開示内容で使用するように、“細胞培養”は任意のインビトロ細胞培養を指す。そして、“細胞培養”に含まれるものは、連続継代細胞系（例えば、不死化表現型の連続継代細胞系）、細胞初代培養、形質転換細胞系、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、インビトロで操作を行った他の細胞集団、または、これらの組み合わせである。
【００４９】
本開示内容で使用する“トランスフェクション（transfection）”は、外来核酸の真核細胞への導入を指す。トランスフェクションは、本技術に公知の多様な手段によって行ってもよい。これら手段としては、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション法、ポリブレン媒介トランスフェクション法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合、リポフェクション、原形質融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃法が挙げられる。
【００５０】
本開示内容で使用するように、“選択可能なマーカー”は、成長に必須の栄養素が不足している培地中においても成長できる能力を付与する酵素活性をエンコードする遺伝子（例えば、酵母細胞のＨＩＳ３遺伝子）の使用を指す。さらに、選択可能なマーカーは、上記選択可能なマーカーを発現する細胞に、抗生物質と薬剤との何れかに対する耐性を付与してもよい。選択可能なマーカーは“優性”でもよく、すなわち、任意の真核細胞系内で検出できる酵素活性をエンコードする選択可能な優性マーカーでもよい。例えば、選択可能な優性マーカーとしては、哺乳類細胞において薬剤Ｇ４１８に対する耐性を付与する細菌アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子（neo gene）とも称する）と、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子とミコフェノール酸の存在下で成長する成長能力を付与する細菌キサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも称する）とが挙げられる。他の選択可能なマーカーとしては、関連酵素活性の欠如した細胞系と併せて使用する必要があるという点において、優性以外のマーカーでもよい。例えば、選択可能な非優性マーカーとして、ｔｋ−細胞系と併せて使用するチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子と、ＣＡＤ欠失細胞と併せて使用するＣＡＤ遺伝子と、ｈｐｒｔ−細胞系と併せて使用する哺乳類ヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子とが挙げられる。哺乳類細胞系内での選択可能なマーカーの使用の再検討は、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp.16.9-16.15）に提供されている。
【００５１】
本開示内で使用するように、“真核生物”は、“原核生物”と区別可能な有機体を指す。“真核生物”としては、真核生物の一般的な特性を示す細胞を有する有機体が含まれ、このような特性としては、核膜によって包まれた、染色体を内部に有する真核の存在と、膜結合性の細胞小器官の存在と、真核生物に共通して確認される他の特性とが挙げられる。したがって、“真核生物”は、菌類、原生動物類、獣類（例えば、ヒト）などの有機体を含むが、これに限定されない。
【００５２】
本開示内容で使用するように、“インビトロ”は、人工環境と、人工環境内で生じる処理または反応とを指す。インビトロ環境は、試験管および／または細胞培養とからなるものであればよいが、これに限定されない。“インビボ”は、自然環境（例えば、動物または細胞）と、自然環境内で生じる処理または反応とを指す。
【００５３】
“試験化合物”と“候補化合物”は、任意の化学物質、調合剤、薬剤など、身体機能の疾患、疾病、病気、または障害の治療と予防の何れかの用途に利用する化合物の候補を指す。試験化合物は、公知の治療化合物と潜在的な治療化合物の両方を含む。試験化合物は、本開示内容のスクリーニング方法、装置、および／またはシステムを使用するスクリーニングによって、治療効果を有するものであると定めてもよい。本開示内容の幾つかの実施形態では、試験化合物は、アンチセンス化合物、ｓｉＲＮＡ化合物、および／またはｓｈＲＮＡ化合物を含むものでよい。
【００５４】
“スフェロイド”は、細胞集合または細胞集合体の何れか、および／または細胞群体を指す。スフェロイドは、例えば、初代細胞、細胞系、腫瘍細胞、幹細胞などの多様な種類の細胞から構成されてよい。また、スフェロイドは、スフェロイド状の形状または不規則状の形状を有するものでもよい。スフェロイドは、細胞、細胞の種類、異なる状態の細胞の不均一集団を含んでよく、例えば増殖細胞、静止細胞、および壊死細胞などを含んでよい。
【００５５】
［詳細な説明］
共通の特性と特徴を有する幾つかの実施形態に関して、以下の説明を行う。ある実施形態の１つまたは複数の特徴が他の実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせ可能であることは理解されるであろう。さらに、任意の実施形態の単一の特徴または複数の特徴の組み合わせによって、さらなる実施形態を構成してもよい。
【００５６】
本明細書の“含んでいる・構成される（comprising）”は“非制限的”な意味の語（すなわち、“含む（including）”の意味）であり、“制限的”な意味の語（すなわち、“それらのみで構成される”の意味）ではないことは理解されるであろう。また、“含む・構成する（comprise）”および“含まれた・構成された（comprised）”などの対応語を使用する箇所についても、対応する意味を割り当てるものとする。
【００５７】
詳細な説明で使用する見出しは、本明細書の読者の参照を容易にするためのものであり、本開示内容または特許請求の範囲を通じて見られる発明特定事項を限定するものではない。上記見出しは、特許請求の範囲または請求項に記載の限定事項を解釈するものとしては使用していない。
【００５８】
ある実施形態では、上記装置は２Ｄ細胞培養法と３Ｄ細胞培養法とを組み合わせている。例えば、ある実施形態では、一部の細胞はアクセス孔の内壁で培養され（２Ｄ細胞培養法）、他の細胞は、上記アクセス孔の底面の懸滴中で、スフェロイドとして培養される（３Ｄ細胞培養）。例えば、ある実施形態では、上記装置が、従来のマルチウェルプレートにおいて見られるアクセス孔とウェル構造を含み、同一装置内で細胞の３Ｄ培養と２Ｄ培養との両方を行えるようにしている。他の実施形態では、上記アクセス孔の内部と上記ウェルの内部とは接続し、上記アクセス孔内の細胞と上記ウェル内の細胞とが、細胞生産物（例えば、化学分子または生体分子）の分泌および／または検出により相互作用を行えるようにしてもよい。
【００５９】
スフェロイドは、腫瘍組織および／または機能性組織用の優れた３Ｄモデルとして役立つ。スフェロイドは、細胞−細胞間の相互作用が細胞−基板間の相互作用に対して優位性を有する場合に、自己組織化によって形成される細胞群体の球状の集合である。スフェロイドは、通常、細胞の集合または集合体、および／または、細胞−細胞間の相互作用が細胞−基板間の相互作用に対して優位性を有する場合に自己組織化によって形成される、細胞群体の集合または集合体として定義されることがある。スフェロイドは、例えば、初代細胞、細胞系、腫瘍細胞、幹細胞などの多様な種類の細胞から形成されてよい。スフェロイドは球状の形状または不規則な形状を有してもよい。スフェロイドは、複数種の細胞や異なる状態の細胞（増殖細胞、静止細胞、および壊死細胞など）からなる混成群を含んでよい。スフェロイドは腫瘍を模倣してもよく、信頼性および重要性がより高められた治療上の情報を提供することが知られた、優れた生理学的な腫瘍モデルとして役立つものでよい。スフェロイドは、一貫した、および／または、再現可能な結果および／または測定を提供してもよい。例えば、同一の実験または同一の実験を複製した実験において、同一の処理が行われた試料は、一貫した測定結果または許容可能な標準偏差範囲内（例えば、１０％から３０％の範囲内）の測定結果をもたらす。他の許容可能な数値範囲も意図する。スフェロイドのこれらの利点は認められていたが、形成、保持、溶液交換、および細胞と液体のミクロスケール操作に要求される退屈で困難な処置のため、十分に有効なスフェロイド組織モデルが産業界で幅広く使用されることが阻害されている。さらに、３Ｄモデルの複雑性のため、スクリーニングと他の検査用途のために高ハイスループットな手法において３Ｄ培養を拡大するのが困難である。
【００６０】
一般的なスフェロイド形成方法としては、懸滴法、非接着性の表面上での細胞培養法、スピナーフラスコ培養法、およびＮＡＳＡ回転細胞培養システムが挙げられる。しかし、これら従来のスフェロイド形成および培養システムは、多くの場合単調であり、スループットが高くなく、取扱が難しい。スフェロイド形成効率を高めるために、多様なミクロ流体（スフェロイド・オン・チップ（spheroid on chip））デバイスも開発されてきた。しかし、これらの技術の多くが、長期培養および機器の薬剤に対する融和性などの問題を抱えている。さらに、これらのマイクロ流体デバイスの多数が、既存の多様なハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）システムとの融和性を有していないため、製薬剤産業を益するように商品化できない。
【００６１】
本開示内容のある実施形態を構築している過程で行われた実験の結果、サイズの均一なスフェロイドの効率的な形成、および／または、市販されている多様なＨＴＳシステムとの融和性を有する標準プレート仕様でのスフェロイドの長期的培養を可能にするハイスループットの懸滴用アレイシステムが開発され、これにより上記システムが幅広い使用用途への商品化に最適となった。
【００６２】
本開示内容に記載の装置、方法、および／またはシステムの特定の実施形態では、例えば、液滴のロバスト処理の障害を克服する。このような障害としては、例えば、ピペット位置決めの不正確さに起因して、液体が上記プレートの他の部分に広がることなく、上記プレートにおいて液体が送られるべき領域へと液体を確実に操作することの困難性、例えば、振動や運動により、液体が上記プレートの所望の領域を越えて広がること、濡れ特性により液体が広がること、およびそれらの組み合わせがあげられる。例えば、特定の実施形態では、懸滴の拡散を防止または最小限に抑えつつ、高度に再現性のある形状とサイズを有する懸滴を、限定された位置で形成可能な上記プレート底面のプラトー構造を１つの要因として、より確固とした液滴操作を得られる。他の実施形態では、再現可能な量の流体の、アクセス孔内への流入およびアクセス孔内からの流出が容易に行われる。他の実施形態では、ピペットチップまたはピペットピンなどの液体操作装置をより簡単に、より早く、且つより正確に、アクセス孔に対して配置することができる。
【００６３】
特定の実施形態は、以下の１つまたは複数を含む流体の懸滴の操作および／または生成を対象としている：細胞懸濁液および／または細胞集合体；複合生体構造（例えば、１つまたは複数の胚、組織試料、小さい有機体、蠕虫など、または、それらの組み合わせ）；物理的物質と、化学物質と、および／または生体物質、または、それらの組み合わせを含む流体。特定の実施形態は、流体の懸滴の操作および／または生成を対象とし、上記懸滴は細胞懸濁液および／または細胞集合体を含む。特定の実施形態は、流体の懸滴の操作および／または生成を対象とし、上記懸滴は複合生体構造（例えば、１つまたは複数の胚、組織試料、小さい有機体、蠕虫など、または、それらの組み合わせ）を含む。特定の実施形態は、流体の懸滴の操作および／または生成を対象とし、上記懸滴は、物理的物質、化学物質、および／または生体物質、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６４】
特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、細胞懸濁液および／または細胞集合体の成長、検査、分析、または、それらの組み合わせを行ってもよく；１種類または複数種類のタンパク質が懸濁液の蒸発によって結晶化および／または、分析されてもよく；ナノ粒子を上記懸濁液中で観察および／または分析してもよく；上記懸濁液が、化学変化、物理変化、および／または生体変化を生じさせる反応器として役目を果たしてもよく；これらの組み合わせが行われてもよい。特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、細胞懸濁液および／または細胞集合体の成長、検査、分析、または、それらの組み合わせを行ってもよい。特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、懸濁液の蒸発による１種類または複数種類のタンパク質の結晶化、１種類または複数種類のタンパク質の分析、および／または、これらの組み合わせを行ってよい。特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、ナノ粒子を上記懸濁液中での観察および／または分析を行ってもよい。特定の実施形態は、流体の操作および／または懸滴液の生成を対象とし、上記懸滴液が、化学変化、物理変化、生体変化を生じさせる反応器としての役目を果たしてもよく、これらの組み合わせであってもよい。
【００６５】
開示された特定の実施形態では、液体輸送の簡便性を向上させている。例えば、特定の実施形態では、液体処理を人手および自動化システムの何れで行うかに関わらず、上記アクセス孔上面のプラトー構造が、液体輸送中にピペットチップまたは輸送ピンを上記アクセス孔に対して配列することを容易にする。また、上記上面に設けられた上記プラトー構造は、ひとつのアクセス孔から他のアクセス孔へ溢れ出たり、広がったりすることも防止する。
【００６６】
通常、細胞は３Ｄ状態で成長する。したがって、正確で有益な治療上の情報を取得するために、製薬剤業界および他の業界においては、ミクロの生理環境をハイスループットな仕方で模倣する、新規の３Ｄスクリーニングおよび検査のプラットフォーム（例えば、３Ｄスフェロイド培養法）が有用である。“正確で有益”とは、例えば、得られる結果および／または測定が、調査対象に関連し、且つ、調査対象にとって貴重であることを意図する。例えば、試料は、インビボ実験、動物実験、および／または人体実験から得られる結果と密接に類似した結果および／または測定をもたらしうる。これは、インビボ実験、動物実験、および／または人体実験から得られる結果に対し、同様の傾向を示すか、または許容可能な数値範囲内（例えば、１０％〜３０％の範囲内）にある定量的結果および定性的結果を含んでもよい。他の許容可能な数値範囲も意図し、この数値範囲は算出対象の測定に依存する。
【００６７】
ミクロの生理環境において効率的および／またはハイスループットの細胞培養を提供する複雑な装置が開発されてきた。しかし、学術研究所で開発されてきた上記複雑な装置の大半は、産業界で広い用途に利用されるように商品化できるものではない。本開示内容の特定の実施形態の開発過程で実施された実験により、多様なスフェロイド形成と、ハイスループットのスフェロイド形成および長期的培養を行うために市販されている多様なＨＴＳ器具と道具に対して融和性を有する培養懸滴用アレイプレートとが開発された。上記システムは、薬剤スクリーニングおよび薬剤検査、細胞に基づいた他の用途、または、それらの組合せのための優れた３Ｄ生理モデル（組織モデルと腫瘍モデル）として、スフェロイドを効率的に形成する。特定の実施形態では、通常、長期培養は、従来のスフェロイド培養方法よりも長い期間（例えば、１週間〜６週間、または、それより長い期間）、細胞および／または細胞集合を生存状態で保持できることを意味する。本開示内容に開示するが、他のタイムフレーム（time frame）も意図される。このことは、人手によるピペット操作および／または自動化された液体操作システムを使用して、スフェロイドの成長および生存に適切な条件（栄養水準など）を保持する上記アクセス孔を介して、培地を容易に交換できるために可能となる。これにより、培地中の限られた栄養によって上記スフェロイドが特定のサイズまたは特定の培養時間を越えた後に、上記スフェロイドを分離容器に移さずに、スフェロイドを上記アレイプレート上で継続的に培養することが可能になる。
【００６８】
通常、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）法は、上記実施形態が、創薬剤分野とこれに関連する化学分野および生物学分野とにおいて使用される顕微鏡法システム、分析システム、および／または自動化システムに対して融和性を有することを意味している。１つのシステム（または上記システムの組み合わせ）により、研究者が1日の間に多くの検査（例えば、１００回〜１００，０００回の検査）を行うことが可能になる。特定の実施形態では、一日の間に行える検査の回数は、１００回〜１０，０００回、５００回〜１０，０００回、１００回〜２０，０００回、１，０００回〜３０，０００回、１，０００回〜５０，０００回、１０，０００回〜８０，０００回などである。ＨＴＳ法では、研究者が関連する化学物質と生体物質を同定し、生体プロセスの理解を得ることが可能である。ＨＴＳ機器の主流は、ＡＮＳＩ／ＳＢＢ規格仕様のミクロタイタープレート（microtiter plate）に含まれている試料に対して、液体操作、撮像、顕微鏡の使用、光学的探知などの動作または仕事を行うように設計されている。幾つかの実施形態では、上記装置（アレイプレート、または、蓋部および底面プレートを含むアレイプレートの組み合わせ）が、例えば、現行のＡＮＳＩ／ＳＢＳ規格などの規格仕様であるため、上記装置をＨＴＳ機器と併せて使用することができる。すなわち、懸滴またはスフェロイドの生成と評価を容易にスケールアップすることが可能である。
【００６９】
特定の実施形態では、容易な操作性および培地変換方法を提供する懸滴用多重アレイプレート（例えば、１５３６、３８４、９６など）を提供する。他の実施形態では、上記アクセス孔を、他の適当な多重構成に行列状（例えば、３×６＝１８個、５×５＝２５個、６×１２＝７２個、１０×１０＝１００個、２５×２５＝６２５個など）に配置している。例えば、ＡＮＳＩ／ＳＢＳ（米国規格協会／生体分子科学協会）規定の現行規格などの規格に適合する標準化された（例えば、１６×２４＝３８４ウェル、８×１２＝９６ウェル）フォーマットの使用は、市販品を最も利用可能なＨＴＳ機器への適合性を提供する。図ｌのｃに、懸滴形成、およびそれに続く液体取扱ロボットを使用する培地変換処置を示す。本開示内容に記載する上記懸滴用アレイプレートは、例えば、多様な用途に利用可能な、ハイスループットの３Ｄスクリーニング／検査プラットフォームとして使用できる。
【００７０】
本開示内容の特定の実施形態に係る上記装置、方法、および／またはシステムは、現在利用可能な装置に優る１つまたは複数の利点を持つ。この利点の一部として、以下が挙げられるが、これに限定されない：均一かつ調整可能な細胞凝集体サイズ（例えば、細胞凝集体のサイズ／体積は、プレート構造の幾何学形状、細胞の播種数、または培養時間によって制御される）の細胞を成長させる能力；液体操作システムおよびプレート読取器などの現存のハイスループット・スクリーニング用機器との適合性；生理的に適切なモデル（例えば、固形腫瘍内と固形組織内に存在する細胞の酸素勾配、拡散輸送、および分布を模倣して生理的に適切化したモデル）形成への適合性；ハイスループット・スクリーニングへの適合性；細胞凝集体の大量生産への適合性；細胞凝集体の長期培養への適合性；培養液滴とガスとの間に生ずる最大表面接触に起因する効率的なガス交換の提供；細胞播種中、培地変換中、および試薬剤の添加および除去中における、上記プレートへの／からの、内容物の効率的な輸送（ピペッティング（pipetting））；実験中の異なる時点での、細胞と、培地と、試薬剤と、他の内容物との添加および除去の容易性；上記プレートの上面と底面からの細胞凝集体の収集（ハーベスト）；作業、時間、およびコスト、またはこれらの組み合わせの減少。細胞凝集体の分析は、同じプレートで実施され、簡単に実施することができるので、例えば細胞凝集体の成長と検査と、形成と、保持とを効率化および簡略化することでコスト削減が実現される。または、細胞凝集体を効率的に形成することでコスト削減が実現される（例えば、標準化３８４ウェル仕様は、試験化合物と試薬剤の消費とを減少させ、また複合ウェル仕様は、液体の分注時間が短縮し、終点の数を一定としたときのプレート操作の回数が減少することを意味する）。または、上記の２通りの方法によってコスト削減が実現される。
【００７１】
特定の実施形態の他の利点は、培地の消費を最小限に抑えられること、および／または、細胞の処理に必要な薬剤または他の試験化合物の量を最小限に抑えられることである。上記スフェロイドは、体積の小さい培養培地の個々の液滴中（例えば、２０μｌ〜１００μｌ以下）で成長するため、スフェロイド培養に必要な培養培地を大幅に減少できる。したがって、上記細胞の処理に必要となる薬剤と試験化合物を大幅に減少し、液滴中の薬剤濃度が望ましい値になる。特定の実施形態では、上記液滴の体積は、２００μｌ未満、１２５μｌ未満、１００μｌ未満、８０μｌ未満、６０μｌ未満、４０μｌ未満、２０μｌ未満、または１０μｌ未満としてもよい。特定の実施形態では、上記液滴の体積は、１０μｌ〜２５０μｌの範囲、１０μｌ〜２００μｌの範囲、２０μｌ〜２００μｌの範囲、２０μｌ〜１００μｌの範囲、または、１００μｌ〜２５０μｌの範囲であってよい。
【００７２】
例えば、特定の実施形態は、均一で調整可能な細胞凝集体サイズの細胞を成長させる能力を提供する。一部の実施形態では、均一なサイズとは、スフェロイドのサイズまたは体積のバラツキが、上記培養の期間中、小さな範囲内（３％〜５％など）に保たれることを意味する。一部の実施形態では、調整可能なサイズとは、細胞の播種数、培養期間の長さ、および／または他のパラメータによって、スフェロイドの最終的なサイズまたは体積を制御できることを意味する。特定の実施形態では、均一なサイズとは、スフェロイドのサイズまたは体積のバラツキを、上記培養期間中または上記培養期間のうちの十分な部分期間中、１％〜１０％、２％〜８％、２％〜５％、３％〜８％、４％〜１０％、５％〜１０％などの範囲内に保たれることを意味する。特定の実施形態では、調整可能なサイズとは、細胞の播種数、培養期間の長さ、および／または他のパラメータによって、スフェロイドの最終的なサイズまたは体積を制御できることを意味する。
【００７３】
特定の実施形態は、例えば、液体操作システムおよびプレート読取器などの既存のハイスループット・スクリーニング機器と適合可能である。顕微鏡法システム、液体操作などの自動化装置、検出、および／またはハイスループット・スクリーニングおよびハイコンテント・スクリーニングで使用される撮像システムとの適合性は、本開示内容が取り組む必須の利点である。特定のシステムの実施形態は、主流機器に合った規格（例えば、現行のＡＮＳＩ／ＳＢＳ規格）に適合するマルチウェルプレート形式で設計されている。自動化装置を使用した場合、本開示内容に開示している多重アレイプレートを使用して、スフェロイドの生成および／またはアセスメントをスケールアップすることができる。上記アクセス孔は、スフェロイドの保持および処理のために上記水滴へ液体を簡易に輸送すること、および、この水滴から液体を簡易に輸送することを可能にする。ハイスループット機器を使用した場合、多重アレイプレートを使用して、スフェロイドの生成およびアセスメントを簡単にスケールアップすることができる。
【００７４】
特定の実施形態は、生理学的に適切なモデル（例えば、固形腫瘍内と固形組織内に存在する細胞の酸素勾配、拡散輸送、および分布を模倣して生理的に適切化したモデル）の形成に好適である。例えば、特定の試験化合物は、細胞による酸素消費が活発であり、また／または拡散性の酸素運搬が制限されている、固形腫瘍に似たスフェロイドの低酸素コア内に存在する細胞に対してより効果的である。例えば、特定の試験化合物は、通常はスフェロイドの内部に存在しており、また２Ｄ細胞培養法では複製が困難である静止細胞の成長を抑制する点に関してはあまり効果的ではない。よって、２Ｄ培養内のより増殖性の強い細胞について行われた試験からは、生理学的に正確性の劣る結果が得られた。
【００７５】
特定の実施形態は、細胞凝集体の大量生産に好適であるかもしれない。一部の実施形態では、各装置が懸滴中で３８４スフェロイドの形成を可能にする。自動化システムと複数の装置を使用することで、スフェロイドを形成する細胞をそれぞれ含む、例えば１，０００〜１００，０００の懸滴を、妥当な時間（例えば、５分、１５分、１時間、２時間、５時間、１０時間、または２４時間）内に形成することができる。
【００７６】
特定の実施形態は、細胞凝集体の長期培養に好適である。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間の間培養してもよい。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を１週間〜６週間の間、１週間〜２週間の間、１週間〜４週間の間、または２週間〜５週間の間培養してもよい。
【００７７】
特定の実施形態は、細胞凝集体をより短い期間で培養することにも好適である。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を少なくとも３０分間、１時間、２時間、３時間、５時間、８時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、または６日間の間培養してもよい。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を最長で３０分間、１時間、２時間、３時間、５時間、８時間、１２時間２４時間、２日間、３日間、６日間、または７日間まで培養してもよい。例えば、特定の実施形態では、細胞凝集体を３０分間から７日間の間、２時間から２４時間の間、３０分間から４８時間の間、１時間から５日間、または１時間から７日間培養してもよい。
【００７８】
特定の実施形態は、培養液滴とガスとの表面接触が最大であることを１つの要因として、効率的なガス交換を提供する。例えば、ガス交換が生じるように液体体積の上面を空気に曝している従来のマルチウェルプレート中の液体と比較して、特定の実施形態で形成される懸滴は、ガス交換されるように空気に曝されている表面面積の割合が大幅に増大されている（上記アクセス孔と上記アクセス孔の上部開口の下に位置する液滴の表面全体）。効率的なガス交換は、特定のガス状成分（例えば、酸素）の濃度が細胞行動の核心に関連する研究では有用である。
【００７９】
特定の実施形態は、細部播種の間、培地交換の間、および／または試薬剤の添加・除去の間における、上記プレートへおよび上記プレートからのコンテントの効率的な移動（ピペット操作）；実験の異なる期間における、細胞、培地、試薬剤、および／またはコンテントの添加と除去との容易化；上記プレートの上記上面および上記底面から細胞凝集体を収集し；作業、時間、およびコストの低下；または、これらの組み合わせをもたらす。
【００８０】
個別のスフェロイドのモニタリングおよび／または操作は、開示される特定の実施形態の他の利点である。処置の前後に個別のスフェロイドを分析できることも、開示される特定の実施形態の利点である。各スフェロイドはそれぞれの水滴中に分離させられて成長するので、上記スフェロイドに対して、化合物を使用して個別に処理すること、顕微鏡検査技術および分析手法を使用して個別にモニタリングおよび分析すること、更なる処理のために個別に収集すること、または、こられの組み合わせを行うことを可能にする。さらには、１週間から６週間の期間に亘り、スフェロイドを個別に長期培養することと、スフェロイドに個別にアセスメントを行うことが可能である。他の長さの期間も意図される。手動ピペット操作または自動化液体制御システムを利用することで、上記アクセス孔を介して上記培養培地を簡単に変換して、スフェロイドの成長と生存にとって適切な栄養水準を保持できる。これにより、スフェロイドが一定サイズを超えて大きくなった後または一定の培養時間が経過した後、培地内の栄養が限られることに起因して、スフェロイドをより大きな容器に移動させる必要がなくなる。
【００８１】
特定の実施形態では、例えば、細胞凝集体の成長および試験の合理化と簡易化、形成、（細胞凝集体の分析は上記培養を行ったのと同じプレートで実施でき、分析自体も簡単に行えるため）保持によってコストが削減され、細胞凝集体の効率的な形成（例えば、標準規格の３８４ウェル形式は試験化合物と試薬剤の消費を抑え、マルチウェル形式は液体を分注している時間が短縮されることと、エンドポイントの定数に対するプレート操作数も減少されることを意味する）、または、これらの組み合わせによってコストが削減される。例えば、各試料（各ウェル）が２００μｌの細胞培養用培地を必要とするような従来の９６ウェルプレートを使用して行われる標準検査と比較して、特定の実施形態では、各試料に必要な培地は２０μｌのみであり、培養培地の量およびコストを削減している。同様に、幾つかの実施形態では、各試料において従来と同じ処理濃度を実現するために必要な試験化合物の量が、１０分の１にまで減少される。前臨床実験および臨床実験で使用される多くの薬剤は製薬剤費が高く、極めて少量で製薬剤されるので、幾つかの実施形態で得られる上述の効果は特筆すべきことである。従来の方法を使用してペトリ皿の上方側に形成した懸滴と比較して、特定の実施形態では、自動化システムを使用した３８４スフェロイドの生成は、１秒から１５秒の範囲の僅かな時間（および労力）で行われるが、従来の方法では５分から１５分が必要である。
【００８２】
幾つかの実施形態では、上記装置は、上記プレートの上面および／または底面から細胞を収集する能力、および上記懸滴用プレートと下層プレートとの１つまたは両方に貯蔵部（例えば、貯水部）を備えている能力；製造中にモールディングと鋳型の取り外しとを簡単に行えるシンプルなプレート設計と、細胞凝集体および化学物質をプレート上で分析（on-plate analysis）する能力（例えば、分析をおこなうために、上記プレートの内容物を採取して、他のプレート、容器、または装置に移動させる必要が無く；内容物を含む上記プレートをプレート読取器などの標準化ハイスループット・スクリーニング機器内に配置することで、上記内容物の分析（比色分析、蛍光分析、光測定（lumniometric）分析など）を行うことが可能であり、従来のマルチウェルプレートと異なり、上記試料の下方に可塑材が設けられていないため、培養後の上記液滴の光信号を直接照射および検出することが可能である）、または、これらの組み合わせにより区別される。他の実施形態では、上記下層プレートは、実質的に、光学的に透明であって、上記液滴を妨げられることなく見ることができ、上記アレイプレートを上記下層プレート上に置いたまま、上記液滴の光信号の照射および検出が可能である。
【００８３】
特定の実施形態によれば、上記下層プレートでは上記スフェロイドを妨げられるこなく視認できるので、撮像および分析が簡易になっている。特定の実施形態によれば、上記下層プレートでは、上記スフェロイドの便利な撮像と光学分析を行えるように、上記アレイプレート上のスフェロイドの妨げのない視認を提供する。
【００８４】
特定の実施形態では、長期間を含む異なる期間に亘ってスフェロイドを培養するために、上記懸滴中の上記細胞培養液の重量オスモル濃度を、比較的安定している範囲内に保持することが好ましい。特定の実施形態では、比較的安定している範囲は、上記懸滴の所望のパラメータを、所望のまたは上記のパラメータの±１％、±３％、±５％、±８％、±１０％、±１５％、±２０％、または±２５％に保持してもよい。特定の実施形態では、比較的安定している範囲は、上記懸滴の所望または記載のパラメータを、上記培養の最終結果が達成できるか、または、実質的に達成できるような、十分に多様な範囲に保持してもよい。特定の実施形態では、上記懸滴中の上記細胞培養液の重量オスモル濃度は比較的安定している範囲内に保持される。例えば、重量オスモル濃度の当初測定の１０％から２０％。他の例では、重量オスモル濃度の当初測定の３％〜２０％、５％〜１５％、５％〜２５％、５％〜１０％、または１５％〜２０％の範囲内である。特定の実施形態では、スフェロイドの培養を１週間〜６週間に亘って安定範囲内に保持できる。例えば、特定の実施形態では、スフェロイドの培養を少なくとも３０分間、１時間、２時間、３時間、５時間、８時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、または６日間に亘って安定範囲に保持できる。例えば、特定の実施形態では、スフェロイドの培養を３０分間〜７日間の間、２時間〜２４時間の間、３０分間から４８時間の間、１時間〜５日間の間、または１時間〜７日間の間に亘って安定範囲に保持できる。また、他の範囲も含むものとする。
【００８５】
特定の実施形態は、懸滴中においてスフェロイド形成の高い再現性を生み出す能力を提供する。実質的に同一の初期細胞数を使用してスフェロイドを形成でき、またスフェロイドをそれぞれ独立した体積を有するように成長させるため、スフェロイドの成長の再現性が高く、個々のスフェロイド間の接触が避けられるため、サイズのバラツキの原因となる隣接するスフェロイド同士の融合が避けられる。特定の実施形態では、スフェロイドのサイズのバラツキを、上記培養期間を通して３％〜５％の範囲内に抑えられる。特定の実施形態では、上記培養期間を通して、スフェロイドのサイズのバラツキを３％〜５％、２％〜６％、１％〜６％、または３％〜６％の範囲内に抑えられる。特定の実施形態では、上記培養期間の一部を通して、スフェロイドのサイズのバラツキを３％〜５％、２％〜６％、１％〜６％、または３％〜６％の範囲内に抑えられる。
【００８６】
特定の実施形態では、上記アクセス孔底面のプラトー構造を１つの要因として、液滴の安定性を向上させてもよい。上記液滴を既定のサイズと位置で安定化および保持することで、上記液滴の拡散を実質的に制限している。
【００８７】
上記懸滴の量は少ないため、蒸発により培地の重量オスモル濃度が変化する。幾つかの実施形態では、蒸発による培地の重量オスモル濃度の変化を防止するために、または、これを実質的に防止するために、スフェロイドの培養期間中、ウェルプレートの蓋部と蒸留水または他の水溶液を満たしたプレート（例えば、９６ウェルプレート）とによって、上記懸滴用アレイプレートを挟み、これら全ての機構をパラフィルムまたは他のシーリング材で覆う。懸滴の底部に設けられた、上記蒸留水で満たした上記プレート（または上記水溶液で満たしたプレート）は、上記懸滴を加湿する。幾つかの実施形態では、上記プレートの周縁部に設けられた貯水部または貯水溶液部（例えば、図１ｂと１ｄに示すような貯水溶液部）は、パラフィルムと共同して、懸滴からの大規模な蒸発を防ぎ、特に、液滴がより蒸発しやすい上記プレートの側面の近傍にある水滴からの蒸発を防ぐ。このような機構の使用と一日おきの培地変換とにより、ｍＥＳ細胞と、Ｃｏｓ−７細胞と、Ａ４３１．Ｈ９細胞培地との重量オスモル濃度を、３００ｍｍｏｌ／ｋｇ〜３６０ｍｍｏｌ／ｋｇ（図２（ａ）の安定した範囲内に保持することができる。なお、上記範囲は、細胞培養にとって最適な範囲内に含まれる範囲である。特定の実施形態では、懸滴中の細胞培地の重量オスモル濃度を比較的安定した範囲内に保持する。例えば、このような範囲として、重量オスモル濃度の初期測定値の１０％〜２０％以内の範囲が挙げられる。生細胞／死細胞の染色画像は、大半の細胞は２週間の培養後において生存していたことを更に示す。さらに、異なる様々なサイズのＡ４３１．Ｈ９スフェロイドが、１週間の期間を通して増殖しているように見られた（図２ｃ）。懸滴の統合性のローバスト性と共同して、上記懸滴アレイプレートシステムは、従来の懸滴システムまたは懸滴方法では不可能だったスフェロイドの長期培養を実現する。
【００８８】
実施形態の例に基づいて薬剤スクリーニングを説明するために、Ａ４３１．Ｈ９細胞を対象にして、２つの薬剤（非従来的な低酸素感受性薬剤であるチラパザミン（ＴＰＺ）と従来の抗癌剤である５−フルオロウシル（５−Ｆｕ）））を２Ｄ培養条件および３Ｄ培養条件下で検査した。ＴＰＺは、低酸素性のサイトトキシンであり、低酸素条件下でのみ活性化されるので、代謝産物がＤＮＡに損傷を与える。ＴＰＺは、細胞内レダクターゼによって、低酸素条件下でＤＮＡの一本鎖切断および二本鎖切断と、塩基損傷と、染色体異常とを生じさせる細胞傷害性のラジカルに変換される。通常の条件下において、酸素は、ＴＰＺラジカルを非毒性の親化合物へと酸化（back-oxidation）させ、これにより細胞毒性を著しく減少させる。３８４懸滴アレイプレートを使用して、従来の２Ｄ条件および３Ｄスフェロイド下で、吸着細胞として培養したＡ４３１．Ｈ９細胞に対するＴＰＺの効果を検査した。その結果、２Ｄ条件のＩＣ５０（〜５０μＭ）が３Ｄ条件のＩＣ５０（〜８μＭ）よりも大きいことが判明した。したがって、大半の薬剤試験に反して、Ａ４３１．Ｈ９細胞は、従来の２Ｄ条件下で培養された場合、３Ｄスフェロイドと比較してＴＰＺに対してより高い耐性を示した。これは、主に、３Ｄスフェロイド内に存在する先天的な酸素勾配によるものである。拡散限界のため、直径が５００μｍより大きいスフェロイドは、通常、その中心部に低酸素性の核を有し、外面方向の対応する酸素勾配を有する。ＴＰＺは低酸素条件下でより一層細胞傷害性が高くなる低酸素性の薬剤であるため、酸素勾配の存在しない２Ｄで培養されたものと比較して、３Ｄスフェロイドとして培養されたＡ４３１．Ｈ９細胞に対してより敏感である。２つの異なる培養条件下で行われた同一の薬剤検査から得られた上記ＩＣ５０間のこの明白な差異は、薬剤スクリーニング目的および試験目的のための３Ｄモデルの使用の有用性を示している。スフェロイドと同様に、充実性腫瘍にも先天的な酸素勾配が存在する。よって、３Ｄ腫瘍モデルは、より一層正確で有意義な治療用の読出し情報をもたらす。３Ｄ腫瘍モデルは、腫瘍の低酸素性の内部にある静止細胞を標的にする薬剤のスクリーニングに有用である。
【００８９】
５−Ｆは、細胞増殖を抑制する従来の抗癌薬剤である。５−ＦＵの場合、３Ｄ（〜１から１００μＭ）条件下では、２Ｄ条件下（〜０．１μＭ）と比較して、ＩＣ５０が増大することが判明した。予期されたように、Ａ４３１．Ｈ９細胞を３Ｄスフェロイドとして培養した場合、このＡ４３１．Ｈ９細胞の５−Ｆに対する耐性が、２Ｄ条件下で培養した場合よりも高くなった。スフェロイドの３Ｄの統合性により、５−ＦＵにとって、中心細胞集団内に侵入し、拡散することがより困難であったと推測される。さらに、５−ＦＵは増殖細胞を特異的に標的にし、これによりスフェロイドの内部の静止細胞を死滅させられなかった可能性がある。しかし、これは、薬剤試験途用途とスクリーニング用途における３Ｄモデルの重要性を示している。Ａ４３１．Ｈ９細胞について、２Ｄ試験プラットフォームと３Ｄ試験プラットフォームからの５−ＦＵのＩＣ５０から判明したことは著しく異なるものであった。
【００９０】
生理的な３Ｄモデルによって、大局的には時間および資材を節約する、より一層正確で有意義な結果をもたらす。本開示内容の実施形態の開発過程で行われた実験は、市販の多様なハイスループット・スクリーニング機器と適合可能な標準化フォーマットで懸滴用アレイプレートを開発することで、長期的な３Ｄ細胞培養をハイスループットする方法をスケールアップすることの困難性を克服した。
【００９１】
〔Ｉ.装置とシステム〕
以下、本開示内容の実施形態の装置例を詳細に説明する。以下に説明する装置は一例であり、本開示内容の実施形態を限定するものではない。本願の開示内容は、以下に記載する装置例に限定されるものではない。
【００９２】
図５にアッセイプレート１の例を示す。図６に他のアッセイプレート４を示す。アッセイプレート１と４のそれぞれが、複数のウェル３を有している。しかし、本開示内容は特定の構成に限定されないことは理解されるであろう。アッセイプレートは、任意の数のウェルを有していても良い。ある実施形態では、１２×８、２４×１６、または他の構成を採用している。ある実施形態では、複数のアレイプレート（例えば、２４×１６の構成のアレイプレート）の分析を使用してもよい。また、アッセイプレート１と４が、上記プレートの１つまたは複数の端部（例えば、４つ全ての端部）に沿って貯水部２を備えている。
【００９３】
図７と８にアッセイプレート１の断面を示す。上記断面には、底面９と上面１０とを有している孔６を有するウェル３が示されている。ある実施形態では、上記孔６の直径は約１．６ｍｍである。また、ある実施形態では、上記孔６間の距離は約４．５ｍｍである。また、ある実施形態では、上記ウェルは、上記孔６の近傍に設けられた突出部、プラトー部、または、リング部５を更に備えている。また、ある実施形態では、上記突出部５の高さは約０．５ｍｍである。図７に、蓋部１とマイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート）８とを示す上記アッセイプレート１の断面を示す。上記マイクロタイタープレート８はウェル３の下方に設けられている。ある実施形態では、上記プレートは、上記プレートのウェル内に液体（例えば、水）を有している。また、ある実施形態では、上記マイクロタイタープレート８の上記貯水部が端部の周辺または他の領域に設けられている。ある実施形態では、１つまたは複数の貯水部が、上記プレートの周辺の１つまたは複数の端部に設けられている。他の実施形態では、１つまたは複数の貯水部が、上記アクセス孔の設置位置に干渉しない、または、実質的に干渉しない位置に配置されている。ある実施形態では、上記貯水部が流体を含んでいる。他の実施形態では、上記貯水部が、流体と違ってこぼれにくく、加湿用の気体を供給できるヒドロゲル（アガロース・ゲルなど）を含んでいる。他の実施形態では、上記貯水部が、例えば、試験化合物として気化する化学物資などの個体物を含んでいる。
【００９４】
図１４に上記装置の追加の実施形態を示す。一部の実施形態では、上記装置が上記孔６の上方および／または下方の設けられた追加の環１１を備えている。一部の実施形態では、上記環の幅は０．２５μＭであるが、他のサイズも意図されている。一部の実施形態では、上記プレートの上面または上記プラトー部の底面から測定した上記環１１の高さは約０．５μＭである。一部の実施形態では、上記孔の上方に配置された環１１が、液体が上記上面の上に広がるのを防止するように機能する。一部の実施形態では、上記プラトー部の底部に配置された環１１が液滴の安定性を向上させる。
【００９５】
一部の実施形態では、上記プレート８が、水、他の流体、ゲル、試験化合物、収着剤、またはそれらの組み合わせを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、図１のＡに示すように、液滴が上記底面９から滴下し、ウェル６の底部の下方において突出部５まで広がるように、液滴を上記孔６の上記上面１０を介して上記穴６内へと挿入している。一部の実施形態では、上記ウェル８内の液体と上記蓋部７とを組み合わせて、上記液滴用の加湿室を提供している。また、一部の実施形態では、上記アッセイプレートと、加湿室と、カバーとを備えている上記装置をＰＡＲＦＩＬＭラップなどの実験用ラップで覆い、蒸発を更に防止している。
【００９７】
一部の実施形態では、装置が、上記蓋部または他の構成要素とアクセス孔、懸滴液、および端部との間に（例えば、細胞と試薬剤をプレートへ輸送するため、および、プレートから輸送するために）多少の接触、接触、または実質的な接触がある構成を含んでいる。
【００９８】
一部の実施形態では、上記プレート８がマルチウェルプレートである。一方、他の実施形態では追加構成が利用されており、これら追加構成としては、アッセイブロック、容器、ゲルからなるベッドなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００９９】
図１６−２４に追加の実施形態を示す。一部の実施形態では、上記装置が、アッセイプレート１６１と、トレイ２０１と、蓋部２１１とを備えている。アッセイプレート１６１は、複数のウェル１６３と、上記プレートの１つまたは複数（例えば、４つ全て）の端部に沿った貯水部１６２とを備えている。一部の実施形態では、上記アッセイプレート１６１の底部の寸法は８５．４９ｍｍ×１２７.７７ｍｍである。図１７のＡ−Ｄに、アッセイプレート１６１上にアレイ状に配置されたウェル１６３の様々な図を示す。ウェル１６３は、上面１７２と底面１７３とを有する孔１７１を備えている。一部の実施形態では、上記孔１７１の直径は約１．６ｍｍである。一部の実施形態では、孔１７１間の距離は約４．５ｍｍである。一部の実施形態では、上記孔１７１が、上記上面１７２の上に複数の上層プラトー構造１７４を備えている。一部の実施形態では、上記孔１７１が、上記上面１７３の上に複数の下層プラトー構造１７５を備えている。一部の実施形態では、上記上層プラトー構造１７４は、液体操作用の装置を上記孔１７１に対して位置合わせするのを補助し、および／または、液体が１つのウェルから他のウェルへ広がらないようにすることを補助する。一部の実施形態では、下記下層プラトー構造１７５が、実質的に、懸滴を特定の領域内および幾何学形状に閉じ込め、および／または、懸滴が隣接するウェルに広がることを防止する。
【０１００】
一部の実施形態では、上記上層プラトー構造１７４および／または上記下層プラトー構造１７５を、上記アッセイプレート１６１と実質的に同じ材料および／または工程を使用して作製している。他の実施形態では、上記上層プラトー構造１７４および／または上記下層プラトー構造１７５を、上記アッセイプレート１６１とは実質的に異なる工程および／または材料を使用して作製している。一部の実施形態では、上記プラトー構造は、３Ｄプロトタイプ方法を使用して作製したプラスチックである。他の実施形態では、上記プラトー構造は、化学物質、生体物質、またはこれらの組み合わせの印刷構造である。
【０１０１】
図１８に１つのウェル１６３の上面図、断面図、および底面図を示す。また、図１９にアレイ状に配列されたウェル１６３の断面図と３Ｄ描写を示す。
【０１０２】
図２０のＡ−Ｆにトレイ２０１の様々な図を示す。図２１のＡ−Ｆに蓋部２１１の様々な図を示す。図２２のＡ−Ｆに、上記アッセイプレート１６１と、上記トレイ２０１と、上記蓋部２１１とから構成される上記組立部２２１の様々な図を示す。上記蓋部２１１は、上記アッセイプレート１６１の上面を覆い、アッセイプレート１６１の上面の上に位置する。上記アッセイプレート１６１は上記トレイ２０１の上に位置する。一部の実施形態では、アッセイプレート１６１は、トレイ２０１と蓋部２１１によって実質的に囲われている。
【０１０３】
一部の実施形態では、上記トレイが、当該プレートの１つまたは複数（例えば、４つ全て）の端部に沿って貯水部２０２を有するプレートを備えている。他の実施形態では、上記貯水部が１つまたは複数の領域に設けられている。一部の実施形態では、撮像および分析を間単にするような、ウェル１６３が遮られずに視認される場所に、１つまたは複数の貯水部が配置されている。特定の実施形態では、上記トレイ２０１は、実質的に、光学的に透明であるので、上記懸滴を撮像および光学分析するのに好都合である。一部の実施形態では、上記貯水部が水性の流体を蓄えている。一部の実施形態では、上記貯水部２０２が湿度の保持に実質的に貢献している。一部の実施形態では、水性の流体のようにこぼれにくくかつ加湿性を有する蒸気を提供する、アガロースゲル（agarose gel）などのヒドロゲルが、上記貯水部に含まれていてもよい。他の実施形態では、上記貯水部が固形物（例えば、試験化合物として蒸発する薬剤品）を含んでいる。
【０１０４】
一部の実施形態では、上記組立部２２１の１つまたは複数の構成要素は、実質的に、光学的に透明である。一部の実施形態では、上記組立部は、上記組立部の内部と外部との間のガス交換を可能にするのに十分な程度に気密されている。一部の実施形態では、上記組立部は、上記組立部内の湿度の維持を向上させている。一部の実施形態では、上記組立部の構成要素を実質的に隙間無く適合し、操作中に上記構成要素が他の構成要素の上に確実に配置されることを可能にしている。
【０１０５】
図２３のＡとＢに、３つの組立部２２１を積み重ねた構造の側面図と正面図を示す。一部の実施形態では、上記トレイが構造２０３を備え、上記蓋部が構造２１２を備え、上記構造２１２は、組立部２２１の上に他の組立部２２1を実質的にしっかりと積み重ね、操作中にその状態を保たせることができる。
【０１０６】
図２４のＡ−Ｄに、特定の実施形態に係るアクセス孔構造の変形例を示す。射出成形法の製造用の潜在的な分割線を腺２４１によって示す。上記分割線を他の場所に配してもよい。図２４のＡに、上記上面に高くて薄いプラトー構造が設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＢに、上記上部に短くて薄いプラトー構造が設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＣに、上記上部に高くて厚いプラトー構造が設けられたアクセス孔構造の例を示す。図２４のＤに、上記上部に高くて薄いプラトー構造が設けられたアクセス孔構造の例を示す。
【０１０７】
一部の実施形態では、アクセス孔は、行列状の多層型またはマルチウェル型に形成されている。他の実施形態では、代わりとなる幾何学形状構成（例えば、円形の構成、不規則パターンなど）を利用している。一部の実施形態では、各プレートにおいて、アクセス孔とプラトー部のサイズ、幾何学形状構成、および／または設計が互いに同じものでもよい。一部の実施形態では、各プレートにおける、アクセス孔とプラトー部のサイズ、幾何学形状構成、および／または設計が互いに実質的に同じである。他の実施形態では、上記アクセス孔とプラトー部のサイズおよび／または形状が異なってもよい。一部の実施形態では、アクセス孔の構造／幾何学形状を他の装置（例えば、分析装置）に取り入れてもよい。
【０１０８】
装置は、好適な材料またはその組み合わせによって構成されてもよい。例えば、上記材料としては、プラスチック（例えば、生体適合性プラスチック、ポリスチレン、または他のポリマー・プラスチック（polymeric plastic））、紙、金属、ガラス、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。一部の実施形態では、射出成形法を使用して装置を作製する。他の実施形態では、好適な方法または方法の組み合わせを使用して装置を作製する。例えば、上記方法としては、成形法（例えば、射出成形法）、ラピッドプロトタイピング（rapid prototyping）法（ステレオリソグラフィー法、３Ｄ印刷法、選択的レーザ焼結法、熱溶解積層法など）、リソグラフィー法（ソフトリソグラフィー法）、印刷法、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。一部の形態では、装置の一部または複数部が、実質的に異なる材料および／または処理を使用して作製される。
【０１０９】
一部の実施形態では、プレートは、例えば、細胞行動、液滴サイズ、幾何学形状、幾何学形状などを制御するように処理（例えば化学的方法、物理的方法、生物学的方法、テクスチャ方法）が行われている。表面処理の方法としては、ＤＮＡおよびタンパク質などの化学物質および／または生体物質の、化学的修飾法、物理的修飾法、プラズマ処理法、蒸着法、吸着法および／またはコーティング法、および、これらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。一部の実施形態では、以下の１つ以上をもたらすように処理を行う：上記アレイプレートの表面性質（例えば、疎水性、タンパク質付着、化学組成、生物学的組成など、または、これらの組み合わせ）の変更；上記懸滴の特性（液滴サイズ、幾何学形状、配列など、または、これらの組み合わせ）の操作；細胞行動（増殖速度および／または分化速度、分化系統、特定のタンパク質と代謝産物の生成など）の制御。他の実施形態では、化学物質および／または生体物質を上記液滴および／または細胞に対して放出および／または輸送を行うことを可能にするために、例えばコーティングなどにより表面処理を行う。他の実施形態では、上記液滴および／または細胞の特性の変化を、抗体結合および／または抗原結合などのメカニズムを介して検出するコーティングを施すように表面処理を行う。他の実施形態では、コーティングの結果、上記コーティングの光学的特質、電気的特質、または他の測定可能な特質の変性による変化が示される。例えば、一部の実施形態では、作製およびパターニングなどを行った後に、親水性皮膜を使用して装置をコーティングする。
【０１１０】
一部の実施形態では、使用前または凝縮前にプレートを殺菌している。殺菌は、上記プレートの材料と使用（例えば、熱、高圧、薬剤品、照射、またはこれらの組み合わせ）に好適な任意の方法を使用して行われる。
【０１１１】
一部の実施形態では、上記プレートは、酸素濃度、温度、湿度などを制御するための室／筐体（例えば、環境制御装置）と一体化されている。
【０１１２】
一部の実施形態では、湿度の保全性は向上している。例えば、上記アレイプレートおよび／または上記下層プレートが、閉鎖系内の空気を加湿するのを助けるための貯水部を備えている。
【０１１３】
一部の実施形態では、本開示内容は、装置（例えば、アッセイプレート、貯水部、およびカバー）を単独で備えているか、または、このような装置（例えば、細胞、バッファ、成長培地、試験化合物、対照物など）を使用して細胞の培養と特徴付けとを行う他の試薬剤を併せて備えているシステムおよび／またはキットを提供する。一部の実施形態では、システムおよびキットが、ハイスループット分析用のロボット工学（例えば、試料の取扱と分析（例えば、プレート読取器）を行うための機器）を備えている。
【０１１４】
〔ＩＩ.用途〕
本開示内容の特定の実施形態に係る上記アッセイプレート装置は、多様な用途に利用できる。一部の実施形態では、本開示内容に記載する装置をスフェロイド（例えば、癌細胞株スフェロイド）などの細胞または他の微生物または生体分子の培養に使用している。一部の実施形態では、スフェロイドを本開示内容に記載する懸滴中で培養している。培養後の上記スフェロイドまたは他の細胞は、様々な研究用途およびスクリーニング用途に利用される。
【０１１５】
一部の実施形態では、懸滴を形成するために、細胞懸濁液を上記上側から上記孔を介して移動（例えば、ピペットを使用して）させる。一部の実施形態では、ピペットチップの端部と他の液体移動装置の端部の何れかを上記穴に差し込んで、上記試料液体を上記底面へと案内する（例えば、図１０ｃ参照）。上記下層面に液滴が形成されると、上記孔を通過するピペットチップ、ピンディスペンサー、または他の道具の何れも使用することなく、上記上面の孔に接触させるだけで、更なる液体（例えば、成長培地、試験化合物など）の添加を行うことができる。下方の液滴がより大きいので、表面張力によって流体が上記上面から上記下層面の液滴へ流れる。これにより、その後の液体の取扱時に、上記懸滴中の細胞の乱れを最小限に抑えることができる。一部の実施形態では、培地が変換され、細胞の処理がプレートの上記上面を介した吸引によって、または、毛管作用および／または微小流体作用および／または装置を利用して行われる。
【０１１６】
本開示内容の特定の実施形態の装置は、時間と、スフェロイド化と、スフェロイド組成物（例えば、細胞の種類、細胞の組成、細胞の物理的分布）と、処理（例えば、試験化合物、スケジュール、継続期間、濃度）と、環境（例えば、温度、酸素濃度、湿度など）との何れか、または、それらの組み合わせを制御できるという利点を有する。
【０１１７】
上記液体または細胞試料は、例えば、ピペットまたはスロットピン（V&P Scientific社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して、上記液体から上記アクセス孔を介して除去できる。また、懸滴内では、固いウェルの底部が無く、流体容積に応じて位置を変える液滴−空気界面が存在するので、ピペットの先端が、硬質壁に対して上記細胞またはスフェロイドを衝突させ押しつぶすという心配をする必要が無く、上記細胞をピペットによって取り出すことができる。上記液滴から細胞を除去する追加の方法としては、上記プレートの上面から吸引を行う方法と、下側のプレート、装置、または容器へと洗い流す方法と、上記液滴に接触して、下側のプレート、装置、または容器へ移動させる方法と、下側のプレート、装置、または容器（例えば、空の容器、または、更なる成長と分化の何れかの発生または分析用の回収を行うために試薬剤とゲルの何れかを備えている容器）へ遠心分離させる方法と、毛管作用および／または微小流体作用を利用して、別のプレート、装置、容器などに移動させる方法との何れか、または、これら方法の組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１８】
上記懸滴のサイズは、少なくとも一部分において、上記底面上の上記プラトー部の直径によって限定されている。その結果、上記培養プロセス中、上記懸滴の幾何学形状は広がること無く、一貫したものまたは実質的に一貫したものに保たれる。これによって、従来の平坦な懸滴用基板では不可能であった、ローバスト性と安定性がより増大した培養条件が得られる。従来の懸滴方法は、ペトリ皿の蓋部の内側に液滴を供給した後、上記ペトリ皿の蓋部をひっくり返すことを含んでいた。しかし、こうした上記ペトリ皿の蓋部のひっくり返しによる動きと、各液滴を閉じ込める物理的構造の欠如とによって、上記液滴の広がり、融合、落下、および他の変化が生じ、その結果、上記液滴中の上記スフェロイドのサイズ、幾何学形状、生存率、および他の測定可能な特性のバラツキが生じる。
【０１１９】
本開示内容の実施形態の装置は、研究用途、臨床用途、スクリーニング用途などの多様な用途に利用される。例えば、研究、創薬剤、毒性検査を行うための細胞凝集体の形成；胚、組織切片、微小有機体、および蠕虫（例えば、c. elegans）の培養；細菌の培養（表面との接触を最小に抑えることにより、多種の細菌にとって重要な、生物膜形成の防止とガス交換の増大を行う）；環境モニタリング；ガス状物質の毒性研究；水質検査；種子の発芽化；例えば、細胞、ナノ粒子、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡなどの生体物質と化学物質の自己組織化；化学種の結晶化；段階的な蒸発による水溶液の濃縮、撮像（例えば、上述のプロセスの撮像）；インビトロでの生化学分析（例えば、酵素的分析と、受容体のタンパク質−タンパク質相互作用の分析）；測定（例えば、比色測定、蛍光測定、発光測定、放射測定など）；細胞播種など、または、これらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。特定の用途例を本明細書に説明する。
【０１２０】
一部の実施形態では、細胞播種の用途に装置を使用する。一部の実施形態では、水性媒体／試薬剤またはゲルに細胞を播種する。一部の実施形態では、化学物質、生体分子、および／または粒子（例えば、ナノ粒子、ミクロスフェア（microsphere）など）と併せて細胞を播種する。一部の実施形態では、細胞分散液または個別の細胞または細胞凝集体の何れかとして細胞を播種する。本開示内容は、特定の細胞源に限定されない。一部の実施形態では、細胞は多様な源（例えば、ヒト、ラット、マウスなど）に由来し、異なる形態（例えば、一次細胞、細胞系、幹細胞、誘導性の多能性幹細胞など）を使用してもよい。一部の実施形態では、細胞の共培養（例えば、一度に播種された多細胞種の混合、または、連続的に播種された単一の多細胞種または多細胞種の混合）を実現するように、多細胞種を播種する。一部の実施形態では、生きている細胞、成長している細胞、休眠している細胞、または、化学処理を行った細胞（例えば、化学固定剤を使用して固定した細胞）を使用してもよい。
【０１２１】
一部の実施形態では、本開示内容の装置と方法を使用して培養した細胞またはスフェロイドを薬剤スクリーニングの用途に使用する。例えば、一部の実施形態では、培養癌細胞系のスフェロイドと他の細胞の何れかに抗癌剤または他の試験薬剤を接触させる。一部の実施形態では、化学物質、気体（例えば、ナフタレン）、生体分子、またはナノ粒子などの試験化合物または試験条件を（例えば、単独または薬剤と結合させた状態で）使用する。その後、（例えば、生存状態を染色する顔料とプレート読取器を使用して）上記細胞の生存率をモニタリングする。
【０１２２】
一部の実施形態では、幹細胞（例えば、癌が発生している幹細胞）の維持に上記装置を使用する。一部の実施形態では、腫瘍のインビボ環境を再現するために、癌が発生している細胞をスフェロイドと共に共培養する。このような方法を使用して培養させた、癌が発生している細胞は、研究用途および薬剤スクリーニングの用途に使用される。
【０１２３】
特定の実施形態に基づくアレイ装置の使用は、ハイスループットのスクリーニングの用途と研究用途への利用を可能にする。一部の実施形態では、装置が９６ウェル型、３８４ウェル型、または他のサイズのウェル配列を有していてもよい。標準化サイズの配置の使用する場合、既存のロボット設備（例えば、液体取扱器やプレート読取器などの市販の設備）のハイスループット・スクリーニング用途への利用が可能になる。本開示内容の特定の装置の実施形態は、積み重ねることができるように変更可能でもある。
【０１２４】
［実験］
本開示内容の特定の好適な実施形態および様態を示し、更に説明するために以下の実施例を説明する。また、以下の実施例は本開示内容の範囲を限定するものではない。
【０１２５】
〔実施例１〕
（Ａ．方法）
(装置設計：）
図１のａに懸滴細胞培養技術に基づくスフェロイド培養装置を示す。上記装置は、ポリスチレン樹脂を使用する射出成形によって作製した。上記懸滴方法の液体の取扱における欠点を克服するために、各細胞培養部位は、底面上にプラトー部が設けられた基板を貫通するように形成されたアクセス孔で構成されている。これらの細胞培養部位は３８４ウェル型プレートのフォーマット（図１のｂと１のｃに示すように、１６行×２４列で、双方向に４．５ｍｍ離間）で配列され、これにより、生物医学研究所で一般に使用されている市販のハイスループット・スクリーニング用機器（例えば流体操作ロボットとプレート読取器）を使用することが可能である。さらに、上記プレートの寸法は通常の３８４ウェル型プレートと同じように設計され、他のウェルプレートを重ねることができる。上記懸滴の体積が小さい（数十μｌ）ことに起因して一般的に直面される蒸発問題を緩和するために、上記培養部位の外周の周辺に貯水部を形成した。
【０１２６】
上記プレートの使用前に、上記装置の表面全体に親水性皮膜（Pluronic F108、０．１％）を１時間塗布した。その後、上記プレートを蒸留水で洗浄し、窒素ガスを使用して乾燥させ、紫外線に半時間曝して殺菌した。懸滴を形成するために、単一チャンネルのピペットと複数チャンネルのピペットと液体取扱用の自動化ロボットとの何れかを使用して、細胞懸濁液をアクセス孔内にピペットで取り出した。なお、各ピペットの先端部を上記アクセス孔内に差し込み、上記試料液体を上記底面へと案内した。上記液体試料または上記細胞試料を、ピペットまたはスロットピンのレプリケータ（V&P Scientific社）を使用してアクセス孔を通し、液滴中から除去することができる。その結果、上記試料取扱プロセスの全体を上記プレートの上記上面から遂行することができる。これによって、従来の懸滴方法で採用されていたペトリ皿の面倒な反転作業を避けることができる。さらに、この液体取扱スキームにより、上記装置がハイスループット・スクリーニング用の自動化機器と完全に適合可能となり、スフェロイド実験のスケールアップを実現可能にする。さらに、上記懸滴のサイズは上記底面上の上記プラトー部の直径によって制限された。その結果、上記懸滴の幾何学形状は、広がりを見せることなく、上記培養プロセスに沿って一貫性のあるものに保持できる。これにより、ローバスト性と安定性がより高い培養条件が得られる。
【０１２７】
（方法：）
上記設計したアレイプレートを使用する長期のスフェロイドの懸滴培養の安定性を調べるため、３種類の細胞（腎臓線維芽細胞（ＣＯＳ７）、マウス胚幹（ｍＥＳ）細胞（ＥＳ−Ｄ３）、メソテリンを安定的に発現するヒト癌細胞（Ａ４３１．Ｈ９））を培養する一方で重量オスモル濃度の測定を行った。上記プレートを使用して懸滴培養を行う前に、０．１％ｗ／ｖブタゲル（Sigma- Aldrich社）を塗布したディッシュ内でＥＳ−Ｄ３細胞を培養し、１５％ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco 10082、 Invitrogen社）と、４ｍＭのL-グルタミン（Invitrogen社）と、０．１ｍＭの２−メルカプトーエタノール（Sigma-Aldrich社）と、０．０２％ｖ／ｖのピルビン酸ナトリウム（Sigma- Aldrich社）と、１００Ｕｍｌ−１のペニシリン（Invitrogen社）と、１００Ｕｍｌ−１のストレプトマイシン（Invitrogen社）と、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む１００Ｕｍｌ−１のＥＳＧＲ０（Invitrogen社）とを含むDulbecco's Modified Eagle's培地（ＤＥＥＭ）（Gibco 11960、Invitrogen社）からなる培地内に保持した。１０％ｖ／ｖのＦＢＳ（Gibco 10082、Invitrogen社）と１％ｖ／ｖのantibiotic-antimicotic（Gibco 15240、Invitrogen社）を含めたＤＭＥＭ（Gibco 11965、Invitrogen社）内で、ＣＯＳ７細胞とＡ４３１．Ｈ９細胞を培養した。加湿した培養器（５％ＣＯ２大気で３７℃）内で、上記全細胞の培養を行った。上記懸滴実験用の細胞懸濁液は、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco 25200、Invitrogen社）で細胞を解離し、解離細胞を室温下で１時間遠心（１０００ｒｐｍ）し、成長培地内に再度懸濁することで調製した。血球計算板を使用して細胞密度を見積もった。
【０１２８】
スフェロイドの培養用プレート上で、１５μｌの細胞懸濁液を各細胞培養部位のアクセス孔の内部へ供給して、懸滴を形成した。蒸発を防ぐために、４ｍｌの蒸留水を周辺貯水部に加えた。さらに、上記プレートをウェルプレートの蓋部と蒸留水で満たした９６ウェル型プレートとで挟み、パラフィルムで覆った。液滴から５μリットルの溶液を採取し、７μｌの新しい成長培地を液滴に添加して、上記成長培地を一日おきに交換した。重量オスモル濃度の測定には、１０μｌの試料液を液滴からピペットで取り出し、分析のために蒸気圧浸透圧計（Vapro Model 5520、Wesco社）へ移動させた。
【０１２９】
抗癌剤感受性の検査を実演するために、３つの異なるサイズのＡ４３１．Ｈ９スフェロイド（細胞数が３００、１５００、７５００のスフェロイド）を２種類の薬剤（tirapazamine（ＴＰＺ）（Toronto Research Chemicals社）と５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（Sigma- Aldrich社））の影響下で検査した。上述の手順では、上記指定の細胞数のＡ４３１．Ｈ９スフェロイドを形成し、それらの成長培地を一日おきに交換した。最終試験濃度の４倍の濃度になるようにＴＰＺと５−ＦＵの原液（０、０．１、１、１０、１００、１０００、５０００μＭ）をDulbecco'sリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（Gibco 14190、Invitrogen社）内で初期調整した。その後、Ａ４３１．Ｈ９スフェロイドの培養２日目に、Ａ４３１．Ｈ９細胞懸滴の各１５μｌに対して、上記適切な濃度のＴＰＺ（または５−ＦＵ）原液を５μｌずつ添加した。alamarBlue（Invitrogen社）を使用する薬剤培養の２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後に、細胞の生存率をモニタリングした。製造者の手順に従って、２μｌ（各懸滴試料の体積の１０分の１）のalamarBlueを各Ａ４３１．Ｈ９懸滴スフェロイド試料に添加し、２時間インキュベート（保温培養）した。このインキュベーション後、プレート読取器（FLx800 Fluorescence Microplate Reader、Biotek社）を使用して、５２５ｎｍの励起と５９０ｎｍの発光状態で、各Ａ４３１．Ｈ９懸滴スフェロイド試料用プレートの読取を行うことによって、蛍光強度の読取を行った。AlamarBlueの蛍光強度が細胞数に正比例するので、０μＭの未処理の対照スフェロイドに標準化することで、各薬剤物濃度に対する細胞生存率の平均値を簡単に求められる。２Ｄ制御条件下での抗癌剤感受性実験を、９６ウェル型プレート（Corning Costar 3596）を使用し、それ以外は上記３Ｄスフェロイド実験と同様とした標準組織培養に対して行った。培養培地の５０％を一日おきに新しい培地と交換した。
【０１３０】
（Ｂ．結果）
図１のａに、上記懸滴用の３８４ウェル型アレイプレートの概略図を示す。図１のｂに、交互に配列された１９２個の懸滴を有する上記プレートの図を示す。上記スフェロイドの懸滴培養部位は、１６行×２４列で、互いから双方向に４．５ｍｍ離間されている標準化３８４ウェルプレートのフォーマットで配置されている。上記プレートの外環に設計された貯水部は、４ｍＬまでの水分を更に保持して、蒸発を緩和させている。図１のａの拡大図に、液体の滴が滴下し、かつ上記底面上の上記プラトー部の直径によって制限されている、上記プレートの上記上面の上記アクセス孔を示す。このようなオーダーメードのポリスチレンプレートは、ハイスループットのアレイフォーマットで懸滴が効率的に形成されることを可能にする。図１のｃは、市販の液体取器（CyBi-Well）による３８４懸滴用アレイプレートでの上記懸滴の形成プロセスを示すスナップ写真であり、このプレートをハイスループット可能に使用して、スフェロイドの懸滴培養をスケールアップすることの有用性を示している。
【０１３１】
図２のａに、上記ＣＯＳ７細胞の培地と、上記ｍＥＳ細胞の培地と、上記Ａ４３１．Ｈ９細胞の培地との平均重量オスモル濃度の５日間の間の変化をプロットした図を示す。−５０％の培地変換を一日おきに行った場合、上記細胞の培地の重量オスモル濃度は２週間の間比較的安定している。図２のｂに上記ＣＯＳ７細胞のスフェロイドと上記ｍＥＳ細胞のスフェロイドの生死写真を示す。これによると、大半の細胞が１２時間の培養後に生存していたことが示されている。図２のｃにＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのサイズ（直径）と細胞数との関係を示す。上記３８４懸滴用アレイプレートで培養したスフェロイドが適切に成長しているか否かを調査するために、上記スフェロイドのサイズを毎日測定した。また、図２のｃに１週間の間のＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの平均サイズも示す。上記プロットは、異なるサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドが７日間の培養期間の間増殖していることを明示している。上記培地の重量オスモル濃度の安定性と上記スフェロイドの適切な成長との組み合わせは、上記３８４懸滴用アレイプレートがスフェロイドの培養に好適な環境を提供することを示している。上記懸滴培養の条件の安定性と、広がりを伴わない上記懸滴の幾何学形状のローバスト性とが、スフェロイドの簡単な長期培養を可能にする。
【０１３２】
上記３８４懸滴用アレイプレートでの抗癌剤感受性の試験の実証として、ＴＰＺと５−ＦＵの２種類の抗癌剤を試験した。図３のａ−ｃに、０μＭ、１０μＭ、５０００μＭのＴＰＺを使用して処理した異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイド（細胞数３００、１５００、７５００のスフェロイド）の経時画像を示す。上記処理を行っていないＡ４３１．Ｈ９細胞の異なる３つのサイズの対照スフェロイドは、薬剤処理の期間中でも成長し、適切に増殖する。一方、１０μＭのＴＰＺを使用して処理した上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのサイズは、上記薬剤処理の期間中比較的安定しており、スフェロイド成長の阻害を示した。最後に、５０００μＭのＴＰＺを使用して処理した異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドについては、９６時間の薬剤処理期間中に低い生存率が次第に示され、薬剤の毒性を示した。図３のｄに、上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのそれぞれと２Ｄ培養条件とについて、様々なＴＰＺ濃度における、初期薬剤処理の９６時間後の細胞の生存率（％）を概説する棒グラフを示す。従来の２Ｄ条件で培養したＡ４３１．Ｈ９細胞のＩＣ５０は約５０μＭであり、３Ｄ条件で培養した上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのＩＣ５０は約８μＭである。大半の抗癌剤に反して、ＴＰＺを使用して処理したＡ４３１．Ｈ９細胞は、２Ｄ条件で培養された場合に、３Ｄ条件で培養された場合よりも高い耐性をしめした。
【０１３３】
同様に、図４のａ−ｃに、０μＭ、１０μＭ、５０００μＭの５−ＦＵを使用して処理した異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイド（細胞数３００、１５００、７５００のスフェロイド）の経時画像を示す。上記処理を行っていない異なる３つのサイズの対照Ａ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの全ては健康を示し、薬剤処理期間中に適切に増殖している。しかし、Ａ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドを１０μＭの５−ＦＵを使用して処理した場合、上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドは上記薬剤処理後の９６時間に徐々に小さくなり、スフェロイド成長の阻害が示された。最後に、Ａ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドを、５０００μＭの５−ＦＵを使用して処理した場合、上記異なる３つのサイズ全てについて、薬剤処理の４８時間後に細胞が解離し始め、スフェロイドの全体性が毀損された。Ａ４３１．Ｈ９細胞のかなりの部分は、薬剤処理後から９６時間までに、Ａ４３１．Ｈ９スフェロイドから既に解離しており、薬剤の毒性が示された。図４のｄは、上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドと従来の２Ｄ培養条件とについて、異なる５−ＦＵ濃度において、細胞の薬剤処理から９６時間後の生存率（％）を概説する棒グラフの結果を要約するものである。従来の２Ｄ条件下で培養したＡ４３１．Ｈ９細胞のＩＣ５０は約０．１μＭであり、３Ｄ条件で培養した上記異なる３つのサイズのＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドのＩＣ５０は、それぞれ、約３μＭ（細胞数が３００のスフェロイド）、約１μＭ（細胞数が１５００のスフェロイド）、約９０μＭ（細胞数が７５００のスフェロイド）である。大半の抗癌剤で予期していたように、５−ＦＵを使用して処理を行っていたＡ４３１．Ｈ９細胞は、３Ｄ条件で培養された場合、２Ｄ条件で培養された場合よりも高い耐性を示す。
【０１３４】
〔実施例２〕
（付加的なプレート設計）
本開示内容の特定の実施形態の装置は、懸滴をローバスト性高く形成でき、この懸滴を保持でき、上記懸滴に流体を添加および／または除去する能力を提供し、または、これらの組み合わせを実現することが可能である。各アクセス孔は懸滴を適切な位置にしっかりと保持するように構成されているので、大量の懸滴を再生可能に形成することができる。特定の実施形態では、各アクセス孔は実質的に同一である。上記アレイプレートの上面に開口部を有する上記アクセス孔は、流体を回収または添加して懸滴を形成することと、既に形成された懸滴からの流体の回収または既に形成された懸滴への流体の添加を行うことの何れかを可能にする。これは、上記懸滴および／または上記懸滴の内容物の測定可能な特性を、操作および／または保持するように、流体を実験の間中回収または添加できることを意味する。この実施例は、上記液滴を安定的に閉じ込める追加の局所的な障壁を提供する装置（例えば、図１４に説明するような装置）を説明する。上記障壁を図１４Ｂに示す。上記装置は、上記孔の上部と下部の両方に設けられた付加的な環（幅：０．２５μＭ、上記プラトー部の上面または底面からの高さ：０．５μＭ）を備えている。液体が当該孔を介して上方および下方に移動できる貫通孔であって、上記環が当該孔の表面ではなく端部に設けられている貫通孔内に存在する上記液滴を安定させるために、上記障壁を使用してもよい。
【０１３５】
Ｚ因子分析によって上記装置の性能を分析した。上記Ｚ因子は、スクリーニング検定において、信号反応のダイナミックレンジおよびそのバラツキを最適化するために使用される分析用の性能測定器具である。上記Ｚ因子が０．５より大きくなる場合は、典型的に、上記分析結果は“良”とされる。しかし、特定の用途では、より低い値のＺ因子でも十分である。
【０１３６】
３８４懸滴用プレートと標準化３８４ウェルプレートでの蛍光ベース分析と吸収ベース分析のためのＺ因子は以下のように算出される。フルオレセインまたは黄色食品色素の幅を有する濃縮を上記３８４懸滴用プレートと３８４標準化ウェルプレートに配置した。プレート読取器を使用して読取の測定を行った。Ｚ因子は、各種プレートの各濃縮度で得られた値に基づいて算出した。この結果を図１５に示す。ほとんどの濃縮においては、上記Ｚ因子は０．５を越えている。上記３８４懸滴用プレートのＺ因子は、上記標準化３８４ウェルプレートにおけるＺ因子に匹敵する。
【０１３７】
〔実施例３〕
本実施例は、本開示内容の特定の実施形態をさらに説明する方法例、システム例、および装置例を提供する。なお、上記特定の実施形態は本開示内容を限定するものではない。
【０１３８】
例１．（ａ）上面および底面を有し、かつそれらに複数の孔が形成されている少なくとも１つのアレイプレートであって、上記複数の孔の各々は上部と底部とを有しており、該アレイプレートの上記底面は上記複数の孔のうち少なくとも１つ底部に対して実質的に隣接する少なくとも１つのプラトー部を有しているアレイプレートを備え、
（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートは複数の懸滴を収容するように構成され、各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つの孔から懸下して上記孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成される孔の数以下であるシステム。
【０１３９】
２．上記少なくとも１つのアレイプレートの下方に配置された少なくとも１つの第２のプレートを更に備えている例１に記載のシステム。
【０１４０】
３．上記少なくとも１つのアレイプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えていることを特徴とする例１または２のシステム。
【０１４１】
４．上記少なくとも１つの第２のプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えていることを特徴とする例１、２、または３のシステム。
【０１４２】
５．上記少なくとも１つのアレイプレートと上記少なくとも１つの第２のプレートとの両方が少なくとも１つの貯水部を備えていることを特徴とする例１−３または４のシステム。
【０１４３】
６．下記の１つまたは複数を備えている例１−４または５のシステム：上記少なくとも１つのアレイプレート内に設けられた１つまたは複数の貯水部；上記少なくとも１つの第２のプレートを備えている１つまたは複数の貯水部；上記少なくとも１つのアレイプレートに設けられた１つまたは複数の貯水部。一方、上記少なくとも１つの第２のプレートに貯水部は設けられない；位置合わせした上記第２のプレートに設けられた１つまたは複数の貯水部。一方、上記少なくとも１つのアレイプレートに貯水部は設けられない；または、上記少なくとも１つのアレイプレートと上記少なくとも１つの第２のプレートの両方に設けられた１つまたは複数の貯水部。
【０１４４】
７．各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下し、上記孔の下方で広がる、例１−５または６のシステム。
【０１４５】
８．上記少なくとも１つの第２のプレートが、上記少なくとも１つのアレイプレートの端部の少なくとも一部に接触し、上記少なくとも１つの第２のプレートが、上記懸滴の１つまたは複数と実質的に接触してない、例１−６または７のシステム。
【０１４６】
９．上記少なくとも１つのアレイプレートのための少なくとも１つの蓋部を更に備え、上記少なくとも１つの蓋部は１つまたは複数の上記少なくとも１つのアレイプレートの上面上に設置され、また上記少なくとも１つの蓋部は上記複数の懸滴を収容するように構成された上記複数の孔の部分に接触していない、例１−７または８のシステム。
【０１４７】
１０．上記１つまたは複数の貯水部が１つまたは複数の物質を有する例１−８または９のシステム。
【０１４８】
１１．上記複数の懸滴の１つ以上が以下の１つ以上を含む、例１−９または１０のシステム：複数の細胞；少なくとも１つの複合組織または有機体；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体；１つ以上のタンパク質；１つ以上のナノ粒子、１つ以上の試験化合物；１つ以上の薬剤；水性の流体によって構成された固形物またはゲル；または、これらの組み合わせ。
【０１４９】
１２．上記孔の直径は約１．６ｍｍである、例１−１０または１１のシステム。
【０１５０】
１３．上記孔は互いから約４．５ｍｍ離間している、例１−１１または１２のシステム。
【０１５１】
１４．上記アレイプレートが上記孔の複数の行および列を有している、例１−１２または１３のシステム。
【０１５２】
１５．上記少なくとも１つのプラトー部の端部が少なくとも１つの環状構造を備えている、例１−１０または１１のシステム。
【０１５３】
１６．上記少なくとも１つのアレイプレートの特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレートを処理する、例１−１４または１６のシステム。
【０１５４】
１７．上記少なくとも１つのアレイプレートの物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレートを処理する、例１−１５または１６のシステム。
【０１５５】
１８．上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部のうち、１つまたは複数について、対応する処理面の特性を変更するように処理する、例１−１６または１７のシステム。
【０１５６】
１９．上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部について、対応する処理面の物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように処理する、例１−１７または１８のシステム。
【０１５７】
２０．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成されている上記孔の１つまたは複数の上面に実質的に隣接しているか、または隣接している第２のプラトー部を備えている、例１−１８または１９のシステム。
【０１５８】
２１．米国規格協会および／または生体分子化学規格協会に準拠している、例１−１９または２０のシステム。
【０１５９】
２２．上記少なくとも１つのアッセイプレートと、上記少なくとも１つの他のプレートと、上記少なくとも１つの蓋部とのうち１つ以上が光学的に透明であり、光学的イメージングおよび／または光学的分析用に実質的に遮るものがない視界を提供する、例１−２０または２１のシステム。
【０１６０】
２３．ハイスループット・スクリーニングに適合する、例１−２１または２２のシステム。
【０１６１】
２４．積み重ね可能である、１−２２または２３のシステム。
【０１６２】
２５．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の幾何学形状を安定させるように構成されている、例１−２３または２４のシステム。
【０１６３】
２６．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の位置を安定させるように構成されている、例１−２４または２５のシステム。
【０１６４】
２７．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の懸滴の測定可能な特性を安定および保持するように構成されている、例１−２５または２６のシステム。
【０１６５】
２８．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備えている、例１−２６または２７のシステム。
【０１６６】
２９．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備え、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面の上記少なくとも１つのプラトー部が、上記孔への液体の輸送および／または上記孔からの液体の輸送を向上するように構成されている、例１−２７または２８のシステム。
【０１６７】
３０．実質的に安定している湿度を保持する、例１−２８または２９のシステム。
【０１６８】
３１．上記複数の懸滴の環境の測定可能な特性を保持するように構成されている、例１−２９または３０のシステム。
【０１６９】
３２．少量の流体を取り扱うように構成されている、例１−３０または３１のシステム。
【０１７０】
３３．上記複数の懸滴の１つ以上における複数の細胞の長期培養を可能とするように構成されている、例１−３１または３２のシステム。
【０１７１】
３４．以下の１つ以上を可能とするように構成されている、例１−３２または３３のシステム：複数の細胞の長期的培養、保持、分析、および／または試験；少なくとも１つの複合組織または有機体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のタンパク質の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のナノ粒子の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の試験化合物の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の薬剤の長期的培養、保持、分析、および／または試験；または、これらの組み合わせ。
【０１７２】
３５．上記複数の細胞が球状に成長している、例１−３３または３４のシステム。
【０１７３】
３６．試料取扱ロボット装置とプレート読取器とからなる一群から選択される１つ以上のハイスループット試料取扱装置を更に備えている、例１−３４または３５のシステム。
【０１７４】
３７．例１−３５または３６のシステムを１つ以上使用する方法。
【０１７５】
３８．複数の懸滴をシステム内へと導入する工程を含む方法であって、
（ａ）上面と、底面と、複数の孔とを有し、上記複数の孔の各々は上部および底部を有し、上記アレイプレートの上記底面は、上記複数の孔のうち少なくとも１つの底部と実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を有している、少なくとも１つのアレイプレートを備え；
（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートが、複数の懸滴を収容するように構成され、上記複数の懸滴の各々は、上記複数の孔のうち対応する１つから滴下し、上記対応する１つの孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる上記複数の懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレート内にある上記複数の孔の数以下であり；そして、
上記複数の懸滴の１つ以上に対して、培養、保持、分析、試験、またはそれらの組み合わせを行う方法。
【０１７６】
３９．上記各液滴が、上記少なくとも１つのアレイプレートの上側または下側から上記孔を介して注入される、例３８の方法。
【０１７７】
４０．上記懸滴を上記孔を介して除去する工程を更に含んだ、例３８または３９の方法。
【０１７８】
４１．少なくとも１つ以上の懸滴から流体を除去、または、少なくとも１つ以上の懸滴に流体を添加する工程を更に含んだ、例３８、３９、または４０の方法。
【０１７９】
４２．上記少なくとも１つのアレイプレートの下に配置された少なくとも１つの第２のプレートを更に備えている、例３８−４０または４１の方法。
【０１８０】
４３．上記少なくとも１つのアレイプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている、例３８−４１または４２の方法。
【０１８１】
４４．上記少なくとも１つの第２のプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている、例３８−４２または４３の方法。
【０１８２】
４５．上記少なくとも１つのアレイプレートと上記少なくとも１つの第２のプレートとの両方が少なくとも１つの貯水部を備えている、例３８−４３または４４の方法。
【０１８３】
４６．各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下し、上記孔の下方で広がる、例３８−４４または４５の方法。
【０１８４】
４７．上記複数の懸滴の１つ以上が以下の１つ以上を含んでいる、例３８−４５または４６の方法：複数の細胞；少なくとも１つの複合組織または有機体；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体；１つ以上のタンパク質；１つ以上のナノ粒子、１つ以上の試験化合物；１つ以上の薬剤；または、これらの組み合わせ。
【０１８５】
４８．上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの他のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部の１つまたは複数について、対応する処理面の特性を変更するように処理する、例３８−４６または４７の方法。
【０１８６】
４９．上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの他のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部について、対応する処理面の物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように処理する、例３８−４７または４８の方法。
【０１８７】
５０．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面が、１つまたは複数の上記孔の上面と実質的に隣接しているかまたは隣接している少なくとも１つの第２のプラトー部を備えている、例３８−４８または４９に記載の方法。
【０１８８】
５１．米国規格協会および／または生体分子化学規格協会に準拠している、例３８−４９または５０の方法。
【０１８９】
５２．上記少なくとも１つのアッセイプレートと、上記少なくとも１つの第２のプレートと、上記少なくとも１つの蓋部とのうち１つ以上が光学的に透明であり、光学的イメージングおよび／または光学的分析のための実質的に遮るものがない視界を提供する、例３８−５０または５１の方法。
【０１９０】
５３．ハイスループット・スクリーニングに対応する、例３８−５１または５２の方法。
【０１９１】
５４．上記システムが積み重ね可能である、例３８から５２または５３の方法。
【０１９２】
５５．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の幾何学形状を安定させるように構成されている、例３８−５３または５４の方法。
【０１９３】
５６．上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の位置を安定させるように構成されている、例３８−５４または５５の方法。
【０１９４】
５７．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の懸滴の測定可能な特性を安定および保持するように構成されている、例３８−５５または５６の方法。
【０１９５】
５８．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つ上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備えている、例３８−５６または５７の方法。
【０１９６】
５９．上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の孔のうち少なくとも１つの孔の上部に実質的に隣接している上記上面に設けられた少なくとも１つのプラトー部を更に備え、上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面に設けた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記孔への液体の輸送および／または上記孔からの液体の輸送を向上するように構成されている、例３８−５７または５８の方法。
【０１９７】
６０．実質的に安定した湿度を保持するように構成されている、例３８−５８または５９の方法。
【０１９８】
６１．上記複数の懸滴の環境の測定可能な特性を保持するように構成されている、例３８−５９または６０の方法。
【０１９９】
６２．少量の液体を取り扱うように構成されている、例３８−６０または６１の方法。
【０２００】
６３．上記複数の懸滴の１つ以上において複数の細胞の長期培養を可能とするように構成されている、例３８−６１または６２の方法。
【０２０１】
６４．以下の１つ以上を可能とするように構成されている、例３８−６２または６３の方法：複数の細胞の長期的培養、保持、分析、および／または試験；少なくとも１つの複合組織または有機体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；生体物質および／または化学物質を含む水性野流体の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のタンパク質の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のナノ粒子の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の試験化合物の長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の薬剤の長期的培養、保持、分析、および／または試験；または、これらの組み合わせ。
【０２０２】
６５．試料取扱ロボット装置とプレート読取器とからなる一群から選択される１つ以上のハイスループットな試料取扱装置を更に備えている、例３８−６３または６４の方法。
【０２０３】
以下の追加実施例に、本開示内容の装置の特定の実施形態を説明する。なお、本開示内容はこの実施形態に限定されない。
【０２０４】
装置例１．上面と底面とを有するアレイプレートであって、該アレイプレートには複数の孔が形成され、上記複数の孔の各々は上面と底面とを有し、該アレイプレートの上面は、上記孔のうち１つ以上の底面に隣接しているかまたは実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を備えているアレイプレートを備えている装置。
【０２０５】
２．貯水プレートを更に備え、上記貯水プレートが上記アレイプレートの端部と実質的に接触し、上記貯水プレートが１つ以上の上記孔と実質的に接触していない、例１の装置。
【０２０６】
３．上記貯水プレートが、上記アレイプレートの端部とのみ接触している、例１または２の装置。
【０２０７】
４．上記アレイプレートのためのカバーを更に備え、上記カバーが上記アレイプレートの上面に配置され、上記カバーが１つ以上の上記孔と実質的に接触していない、例１、２、または３の装置。
【０２０８】
５．上記貯水部が加湿物質を更に備えている、例１−３または４の装置。
【０２０９】
６．上記貯水プレートが上記アレイプレートの実質的に下方に配置されている、例１−４または５の装置。
【０２１０】
７．上記貯水プレートが、上記アレイプレートの上記複数の孔に接触していない、例１−５または６の装置。
【０２１１】
８．上記アレイプレートが３８４個の孔を有している、例１−６または７の装置。
【０２１２】
９．上記孔の直径は約１．６ｍｍである、例１−７または８の装置。
【０２１３】
１０．上記孔は互いから約４．５ｍｍ離間している、例１−８または９の装置。
【０２１４】
１１．上記アレイプレートが複数の行および列の上記孔を有している、例１−９または１０の装置。
【０２１５】
１２．上記少なくとも１つのプラトー部の端部が、少なくとも１つの環状構造を有している、例１−１０または１１の装置。
【０２１６】
１３．上記アレイプレートの上記底面が、少なくとも１つの表面処理材料によってコーティングされている、例１−１１または１２の装置。
【０２１７】
１４．上記アレイプレートの上記上面が、上記孔のうち１つ以上の上面と実質的に隣接している少なくとも１つの第２のプラトー部を備えている、例１−１２または１３の装置。
【０２１８】
１５．米国規格協会および／または生体分子化学規格協会に準拠している、例１−１３または１４の装置。
【０２１９】
１６．上記貯水プレートが、光学的に透明な底面部を更に有し、光学的イメージングおよび／または光学的分析のための、遮えられることのない視界を提供する、例１−１４または１５の装置。
【０２２０】
１７．ハイスループットなスクリーニングに適合可能である、例１−１５または１６の装置。
【０２２１】
１８．積み重ねることが可能である、例１−１６または１７の装置。
【０２２２】
上記明細書に記載した刊行物および特許は、参照することによりその全開示内容が本願に援用される。本開示内容に記載の装置、方法、および／またはシステムを本開示内容の範囲および精神から逸脱することなく多様に変更および変形できることは、当業者にとって明らかであろう。本願の発明を特定の好適な実施形態に関連して説明したが、特許請求を行う発明がこれら特定の実施形態に不当に限定されないことは理解されるものであろう。実際には、本願発明を行うための上述の様態の、当業者にとって明らかな多様な変更様態も、下記の特許請求に範囲に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】本開示内容のある実施形態に係る装置の例を示し、（ａ）は本発明の実施形態で使用される３８４−ウェル仕様の細胞スフェロイド培養用アレイプレートを示す断面図であり、（ｂ）は上記アレイプレートの写真および上記アレイプレートの寸法を示し、（ｃ）は９６箇所の細胞培養部位を同時にピペット操作可能な液体取扱ロボットによって作動される上記アレイプレートの写真を示し、（ｄ）は加湿室の図を示す。
【図２】（ａ）はある実施形態に係る、細胞集団の異なるＣＯＳ７細胞スフェロイドと、ｍＥＳ細胞スフェロイドと、Ａ４３１．Ｈ９細胞スフェロイドとについて、７日間を超え１２日間までの培養中における重量オスモル濃度を示し、ある実施形態に係る、（ｂ）は染色した生／死ＣＯＳ７細胞スフェロイドと生／死ｍＥＳ細胞スフェロイドとについて、１２日間の培養中の様子を写した蛍光画像を示し、（ｃ）は細胞の開始数に対するＡ４３１．Ｈ９スフェロイドのサイズ（直径）を示し、（ｄ）は、ある実施形態について、様々な開始数の細胞／スフェロイドの培養時間に対するＡ４３１．Ｈ９スフェロイドのサイズ（体積）を示す。
【図３】特定の実施形態におけるＴＰＺを使用する薬剤処理の結果を示し、異なる濃度におけるＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの経時画像と、全てのスフェロイドサイズと従来の２Ｄ培養条件について、薬剤処理から９６時間後の対照細胞の生存率（％）を異なる濃度毎に概説する棒グラフとを示す。
【図４】特定の実施形態における５−ＦＵを使用する薬剤処理の結果を示し、異なる濃度におけるＡ４３１．Ｈ９細胞のスフェロイドの経時画像と、全てのスフェロイドサイズと従来の２Ｄ培養条件について、薬剤処理から９６時間後の対照細胞の生存率（％）を異なる濃度毎に概説する棒グラフとを示す。
【図５】特定の実施形態で使用する装置例の概略図である。
【図６】特定の実施形態で使用する装置例の概略図である。
【図７】特定の実施形態で使用する装置例の詳細図である。
【図８】特定の実施形態で使用する装置例の詳細図である。
【図９】特定の実施形態に係るプラトー部の図である。
【図１０】特定の実施形態に係る装置に細胞と液体を加え、この装置から上記細胞と液体を除去する方法例の概略図である。
【図１１】特定の実施形態に係る方法を使用して培養したｍＥＳスフェロイドである。
【図１２】特定の実施形態に係る方法を使用して培養したｍＥＳスフェロイドである。
【図１３】特定の実施形態に係る方法を使用して培養した肝細胞スフェロイドである。
【図１４】特定の実施形態で使用する装置例の概略図を示すものであり、Ａは全体図、Ｂは環状構造の拡大図である。
【図１５】特定の実施形態において異なる濃度で測定した蛍光分析と吸光分析とのＺファクタ（Z-factors）である。
【図１６】Ａ−Ｆは、特定の実施形態におけるアレイプレートの例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは上方からの等角図を示し；Ｃは側面図を示し；Ｄは端面図を示し；Ｅは、Ａに示すＭ−Ｍ切断線に沿った断面図を示し；Ｆは、Ｃに示すＬ−Ｌ切断線に沿ったアレイプレートの断面図を示す。
【図１７】特定に実施形態に係るプラトー構造の例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは上方からの等角図を示し；Ｃは底面図を示し；Ｄは底面からの等角図を示す。
【図１８】特定の実施形態に係るアクセス孔構造の例の上面図、断面図、および底面図である。
【図１９】特定の実施形態に係るアクセス孔の配列例の断面描写と、上面および底面からの等角３Ｄ描写である。
【図２０】Ａ−Ｆは、特定の実施形態に係る、図１６に示すアレイプレートと共に使用されるトレイの例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは上面からの等角図を示し；Ｃは側面図を示し；Ｄは端面図を示し；Ｅは、Ａに示すＰ−Ｐ切断線に沿う断面図を示し；Ｆは、Ｃに示すＮーＮ切断線に沿ったトレイの断面図を示す。
【図２１】Ａ−Ｆは、特定の実施形態に係る、図１６に示すアレイプレートと共に使用される蓋部の例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは上面からの等角図を示し；Ｃは側面図を示し；Ｄは端面図を示し；Ｅは、Ａに示すＲ−Ｒ切断線に沿う断面図を示し；Ｆは、Ｃに示すＴ−Ｔ切断線に沿った蓋部の断面図を示す。
【図２２】Ａ−Ｆは、特定の実施形態に係る、アレイプレートと、トレイと、蓋部とを組み合わせた組立部の例を示すものであり、Ａは上面図を示し；Ｂは等角図を示し；Ｃは側面図を示し；Ｄは端面図を示し；Ｅは、Ａに示すＶ−Ｖ切断線に沿う断面図を示し；Ｆは、Ｃに示すＵ−Ｕ切断線に沿った上記組立部の断面図を示す。
【図２３】Ａ−Ｂは、特定の実施形態に係る、図２２のＡ−Ｆに示す上記組立部の積み重ねの例を示すものであり、Ａは側面図を示し、Ｂは端面図を示す。
【図２４】Ａ−Ｄは、特定の実施形態に係る、アクセス孔構造の変形例を示すものであり、Ａは、高くて薄いプラトー構造が上面に設けられたアクセス孔構造の例を示し、Ｂは、短くて薄いプラトー構造が上部に設けられたアクセス孔構造の例を示し、Ｃは、高くて厚いプラトー構造が上部に設けられたアクセス孔構造の例を示し、Ｄは、高くて薄いプラトー構造が上部に設けられ、インジェクション形成用の異なる分割線が設けられたアクセス孔構造の例を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）上面と、底面と、複数の孔とを有しており、上記複数の孔の各々は上部と底部とを有し、上記底面は上記複数の孔のうち少なくとも１つ以上の底部に実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を有している少なくとも１つのアレイプレートを備え、
（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートは複数の懸滴を収容するように構成され、各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下して、上記孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成されている孔の数以下であるシステム。
【請求項２】
上記少なくとも１つのアレイプレートの下方に配置された少なくとも１つの第２のプレートを更に備えている請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
上記少なくとも１つのアレイプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
上記少なくとも１つの第２のプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている請求項１〜３の何れか１項に記載のシステム。
【請求項５】
上記少なくとも１つのアレイプレートおよび上記少なくとも１つの第２のプレートの両方が、少なくとも１つの貯水部を備えている請求項１〜４の何れか１項に記載のシステム。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のシステムであって、
上記少なくとも１つのアレイプレート内に設けられた１つまたは複数の貯水部；上記少なくとも１つの第２のプレートに設けられた１つまたは複数の貯水部；上記少なくとも１つのアレイプレートに１つまたは複数の貯水部が設けられている一方、上記少なくとも１つの第２のプレートには貯水部が設けられていない構成；位置決めした上記第２のプレートに１つまたは複数の貯水部が設けられている一方、上記少なくとも１つのアレイプレートには貯水部が設けられていない構成；または、上記少なくとも１つのアレイプレートおよび上記少なくとも１つの第２のプレートの両方に設けられた１つまたは複数の貯水部；のうち１つまたは複数を備えているシステム。
【請求項７】
各液滴は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下し、上記対応する１つの孔の下方で広がる請求項１〜６の何れか１項に記載のシステム。
【請求項８】
上記少なくとも１つの第２のプレートが、上記少なくとも１つのアレイプレートの端部の少なくとも一部に接触し、上記少なくとも１つの第２のプレートが、上記懸滴の１つまたは複数と実質的に接触してない請求項１〜７の何れか１項に記載のシステム。
【請求項９】
上記少なくとも１つのアレイプレートのための少なくとも１つの蓋部を更に備え、
上記少なくとも１つの蓋部は、上記少なくとも１つのアレイプレートの１つまたは複数の上面に設置され、上記複数の懸滴を収容するように構成された上記複数の孔の部分に接触しない請求項１〜８の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
上記１つまたは複数の貯水部が１つまたは複数の物質を更に含んでいる請求項１〜９の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のシステムであって、
複数の細胞；少なくとも１つの複合組織または有機体；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体；１つ以上のタンパク質；１つ以上のナノ粒子、１つ以上の試験化合物；１つ以上の薬剤；水性の液体で形成された固形物またはゲル；または、これらの組み合わせ；のうち１つ以上を、上記複数の懸滴の１つ以上が有しているシステム。
【請求項１２】
上記孔の直径は約１．６ｍｍである請求項１〜１１の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
上記孔は互いから約４．５ｍｍ離間している請求項１〜１２の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
上記アレイプレートが複数の行および列の上記孔を備えている請求項１〜１３の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
上記少なくとも１つのプラトー部の端部が少なくとも１つの環状構造を備えている請求項１〜１１の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
上記少なくとも１つのアレイプレートの特性を変更するように、該少なくとも１つのアレイプレートを処理する請求項１〜１５の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
上記少なくとも１つのアレイプレートの物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように、該少なくとも１つのアレイプレートを処理する請求項１〜１６の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
対応する処理面の特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部のうち１つ以上を処理する請求項１〜１７の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１９】
対応する処理面の物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部を処理する請求項１〜１８の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２０】
上記少なくとも１つのアレイプレートの上面が、該少なくとも１つのアレイプレートに形成された上記孔の１つ以上の上面に隣接または実質的に隣接して設けられた少なくとも１つの第２のプラトー部を備えている請求項１〜１９の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２１】
米国規格協会および／または生体分子化学規格協会に準拠している請求項１〜２０の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２２】
上記少なくとも１つのアッセイプレートの１つ以上と、上記少なくとも１つの第２のプレートと、上記少なくとも１つの蓋部とが光学的に透明であり、光学的イメージングおよび／または光学的分析のための、実質的に遮えられることのない視界を提供する請求項１〜２１の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
ハイスループットなスクリーニングに適合可能である請求項１〜２２の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２４】
積み重ねることが可能である請求項１〜２３の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の幾何学形状を安定させるように構成されている請求項１〜２４の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２６】
上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面の上に設けた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の位置を安定させるように構成されていることを特徴とする請求項１〜２５の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２７】
上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の懸滴の測定可能な特性を安定および保持するように構成されている請求項１〜２６の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２８】
上記少なくとも１つのアレイプレートが、その上面に、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を更に備えている請求項１〜２７の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２９】
上記少なくとも１つのアレイプレートが、その上面に、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を更に備え、
上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面にある上記少なくとも１つのプラトー部が、上記孔への液体の輸送および／または上記孔からの液体の輸送を向上するように構成されている請求項１〜２８の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３０】
実質的に安定している湿度を保持するように構成されている請求項１〜２９の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３１】
上記複数の懸滴の環境の測定可能な特性を保持するように構成されている請求項１〜３０の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３２】
少量の流体を取り扱うように構成されている請求項１〜３１の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３３】
上記複数の懸滴の１つ以上において、複数の細胞の長期的培養を可能とするように構成されている請求項１〜３２の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３４】
請求項１〜３３の何れか１項に記載のシステムであって、
複数の細胞の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；少なくとも１つの複合組織または有機体の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のタンパク質の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のナノ粒子の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の試験化合物の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の薬剤の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；または、これらの組み合わせ；のうち１つ以上を可能とするように構成されているシステム。
【請求項３５】
上記複数の細胞がスフェロイド状に成長している請求項１〜３４の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３６】
試料取扱ロボット装置とプレート読取器とからなる一群から選択される１つ以上のハイスループットな試料取扱装置を更に備えている請求項１〜３５の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３７】
請求項１〜３６の何れか１項に記載のシステムを１つ以上使用する方法。
【請求項１】
（ａ）上面と、底面と、複数の孔とを有しており、上記複数の孔の各々は上部と底部とを有し、上記底面は上記複数の孔のうち少なくとも１つ以上の底部に実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を有している少なくとも１つのアレイプレートを備え、
（ｂ）上記少なくとも１つのアレイプレートは複数の懸滴を収容するように構成され、各滴液は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下して、上記孔の下方で広がり、上記少なくとも１つのアレイプレートが収容できる懸滴の数は、上記少なくとも１つのアレイプレートに形成されている孔の数以下であるシステム。
【請求項２】
上記少なくとも１つのアレイプレートの下方に配置された少なくとも１つの第２のプレートを更に備えている請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
上記少なくとも１つのアレイプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
上記少なくとも１つの第２のプレートが少なくとも１つの貯水部を更に備えている請求項１〜３の何れか１項に記載のシステム。
【請求項５】
上記少なくとも１つのアレイプレートおよび上記少なくとも１つの第２のプレートの両方が、少なくとも１つの貯水部を備えている請求項１〜４の何れか１項に記載のシステム。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のシステムであって、
上記少なくとも１つのアレイプレート内に設けられた１つまたは複数の貯水部；上記少なくとも１つの第２のプレートに設けられた１つまたは複数の貯水部；上記少なくとも１つのアレイプレートに１つまたは複数の貯水部が設けられている一方、上記少なくとも１つの第２のプレートには貯水部が設けられていない構成；位置決めした上記第２のプレートに１つまたは複数の貯水部が設けられている一方、上記少なくとも１つのアレイプレートには貯水部が設けられていない構成；または、上記少なくとも１つのアレイプレートおよび上記少なくとも１つの第２のプレートの両方に設けられた１つまたは複数の貯水部；のうち１つまたは複数を備えているシステム。
【請求項７】
各液滴は上記複数の孔のうち対応する１つから懸下し、上記対応する１つの孔の下方で広がる請求項１〜６の何れか１項に記載のシステム。
【請求項８】
上記少なくとも１つの第２のプレートが、上記少なくとも１つのアレイプレートの端部の少なくとも一部に接触し、上記少なくとも１つの第２のプレートが、上記懸滴の１つまたは複数と実質的に接触してない請求項１〜７の何れか１項に記載のシステム。
【請求項９】
上記少なくとも１つのアレイプレートのための少なくとも１つの蓋部を更に備え、
上記少なくとも１つの蓋部は、上記少なくとも１つのアレイプレートの１つまたは複数の上面に設置され、上記複数の懸滴を収容するように構成された上記複数の孔の部分に接触しない請求項１〜８の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
上記１つまたは複数の貯水部が１つまたは複数の物質を更に含んでいる請求項１〜９の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のシステムであって、
複数の細胞；少なくとも１つの複合組織または有機体；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体；１つ以上のタンパク質；１つ以上のナノ粒子、１つ以上の試験化合物；１つ以上の薬剤；水性の液体で形成された固形物またはゲル；または、これらの組み合わせ；のうち１つ以上を、上記複数の懸滴の１つ以上が有しているシステム。
【請求項１２】
上記孔の直径は約１．６ｍｍである請求項１〜１１の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
上記孔は互いから約４．５ｍｍ離間している請求項１〜１２の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
上記アレイプレートが複数の行および列の上記孔を備えている請求項１〜１３の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
上記少なくとも１つのプラトー部の端部が少なくとも１つの環状構造を備えている請求項１〜１１の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
上記少なくとも１つのアレイプレートの特性を変更するように、該少なくとも１つのアレイプレートを処理する請求項１〜１５の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
上記少なくとも１つのアレイプレートの物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように、該少なくとも１つのアレイプレートを処理する請求項１〜１６の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
対応する処理面の特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部のうち１つ以上を処理する請求項１〜１７の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１９】
対応する処理面の物理的特性、化学的特性、および／または生物学的特性を変更するように、上記少なくとも１つのアレイプレート、上記少なくとも１つの第２のプレート、および／または上記少なくとも１つの蓋部を処理する請求項１〜１８の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２０】
上記少なくとも１つのアレイプレートの上面が、該少なくとも１つのアレイプレートに形成された上記孔の１つ以上の上面に隣接または実質的に隣接して設けられた少なくとも１つの第２のプラトー部を備えている請求項１〜１９の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２１】
米国規格協会および／または生体分子化学規格協会に準拠している請求項１〜２０の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２２】
上記少なくとも１つのアッセイプレートの１つ以上と、上記少なくとも１つの第２のプレートと、上記少なくとも１つの蓋部とが光学的に透明であり、光学的イメージングおよび／または光学的分析のための、実質的に遮えられることのない視界を提供する請求項１〜２１の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
ハイスループットなスクリーニングに適合可能である請求項１〜２２の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２４】
積み重ねることが可能である請求項１〜２３の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面に設けられた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の幾何学形状を安定させるように構成されている請求項１〜２４の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２６】
上記少なくとも１つのアレイプレートの上記底面の上に設けた上記少なくとも１つのプラトー部が、上記複数の懸滴の位置を安定させるように構成されていることを特徴とする請求項１〜２５の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２７】
上記少なくとも１つのアレイプレートが、上記複数の懸滴の測定可能な特性を安定および保持するように構成されている請求項１〜２６の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２８】
上記少なくとも１つのアレイプレートが、その上面に、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を更に備えている請求項１〜２７の何れか１項に記載のシステム。
【請求項２９】
上記少なくとも１つのアレイプレートが、その上面に、上記複数の孔のうち少なくとも１つの上部に実質的に隣接している少なくとも１つのプラトー部を更に備え、
上記少なくとも１つのアレイプレートの上記上面にある上記少なくとも１つのプラトー部が、上記孔への液体の輸送および／または上記孔からの液体の輸送を向上するように構成されている請求項１〜２８の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３０】
実質的に安定している湿度を保持するように構成されている請求項１〜２９の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３１】
上記複数の懸滴の環境の測定可能な特性を保持するように構成されている請求項１〜３０の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３２】
少量の流体を取り扱うように構成されている請求項１〜３１の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３３】
上記複数の懸滴の１つ以上において、複数の細胞の長期的培養を可能とするように構成されている請求項１〜３２の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３４】
請求項１〜３３の何れか１項に記載のシステムであって、
複数の細胞の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；少なくとも１つの複合組織または有機体の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；生体物質および／または化学物質を含む水性の流体の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のタンパク質の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上のナノ粒子の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の試験化合物の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；１つ以上の薬剤の、長期的培養、保持、分析、および／または試験；または、これらの組み合わせ；のうち１つ以上を可能とするように構成されているシステム。
【請求項３５】
上記複数の細胞がスフェロイド状に成長している請求項１〜３４の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３６】
試料取扱ロボット装置とプレート読取器とからなる一群から選択される１つ以上のハイスループットな試料取扱装置を更に備えている請求項１〜３５の何れか１項に記載のシステム。
【請求項３７】
請求項１〜３６の何れか１項に記載のシステムを１つ以上使用する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１６Ｆ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２０Ｄ】
【図２０Ｅ】
【図２０Ｆ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２１Ｅ】
【図２１Ｆ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２２Ｄ】
【図２２Ｅ】
【図２２Ｆ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｅ】
【図１６Ｆ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２０Ｄ】
【図２０Ｅ】
【図２０Ｆ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２１Ｅ】
【図２１Ｆ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２２Ｄ】
【図２２Ｅ】
【図２２Ｆ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【公表番号】特表２０１３−５１７８０９（Ｐ２０１３−５１７８０９Ａ）
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５１３３７（Ｐ２０１２−５５１３３７）
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２９６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９４５７２
【国際公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【出願人】（５０６２７７４１０）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン (19)
【出願人】（５１２１９８９５８）スリーディー バイオマトリックス，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】３Ｄ ＢＩＯＭＡＴＲＩＸ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１６００ Ｈｕｒｏｎ Ｐａｒｋｗａｙ Ｂｕｉｌｉｄｉｎｇ ５２０，２ｎｄ Ｆｌｏｏｒ ＡｎｎＡｒｂｏｒ， ＭＩ ４８１０９−２５９０，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２９６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９４５７２
【国際公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【出願人】（５０６２７７４１０）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン (19)
【出願人】（５１２１９８９５８）スリーディー バイオマトリックス，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】３Ｄ ＢＩＯＭＡＴＲＩＸ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１６００ Ｈｕｒｏｎ Ｐａｒｋｗａｙ Ｂｕｉｌｉｄｉｎｇ ５２０，２ｎｄ Ｆｌｏｏｒ ＡｎｎＡｒｂｏｒ， ＭＩ ４８１０９−２５９０，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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