抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体及びこの製造方法
【課題】本発明の目的は、低い免疫副反応を示し、母体モノクローナル抗体に比べて同等以上の結合親和度を有する抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体、及びファージ表面発現を用いて前記抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を製造する方法を提供するものである。
【解決手段】本発明の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体は、母体抗−ＨＧＦ／ＳＦ抗体と同等以上のＨＧＦ／ＳＦに対する結合親和度及びＨＧＦ／ＳＦとこの受容体であるｃＭＥＴの結合を抑制する中和活性を有しながらも人体内で低い免疫副反応を示すため、より效果的にＨＧＦとその受容体であるｃＭＥＴの結合によって引き起こされる様々な疾患、特に、癌の予防及び治療剤として有用である。
【解決手段】本発明の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体は、母体抗−ＨＧＦ／ＳＦ抗体と同等以上のＨＧＦ／ＳＦに対する結合親和度及びＨＧＦ／ＳＦとこの受容体であるｃＭＥＴの結合を抑制する中和活性を有しながらも人体内で低い免疫副反応を示すため、より效果的にＨＧＦとその受容体であるｃＭＥＴの結合によって引き起こされる様々な疾患、特に、癌の予防及び治療剤として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体及びこの製造方法に関するものであって、より詳しくはヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）とヒト以外の動物由来の抗−ＨＧＦ／ＳＦ抗体の重鎖可変領域相補性決定部位（ＨＣＤＲ）が移植されたヒト抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の組合わせからなる抗−ＨＧＦ／ＳＦキメラＦａｂライブラリをファージ表面発現させて製造された抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＧＦ／ＳＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ；肝細胞成長因子／分散因子）は、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）により生産される多機能性ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）ポリペプチドであって、Ｎ末端ドメインとセリンプロテアーゼ類似ベータ−チェーンＣ末端ドメインに共有結合で連結された４個のクリングルドメイン（ＮＫ４）を含むアルファ−チェーンからなっている。また、ヒトＨＧＦ／ＳＦは、生物学的に不活性である単鎖体形態の７２８個のアミノ酸を有する前駆体として合成されて、Ｒ４９４残基が特異的血清セリンプロテアーゼにより切断されて生物学的に活性なＨＧＦ／ＳＦになり、この活性ＨＧＦ／ＳＦは、６９ｋＤａのアルファ−チェーンと３４ｋＤａのベータ−チェーンが二硫化結合で連結されたヘテロ二量体である。
【０００３】
ＨＧＦ／ＳＦがその受容体であるｃＭＥＴに結合すれば、多様な細胞類型の成長及び分散を誘導し、上皮間葉転移及び細管（ｔｕｂｕｌｅ）と内腔（ｌｕｍｅｎ）の形成を媒介し、血管形成を促進する。ｃＭＥＴとＨＧＦ／ＳＦが共にノックアウット（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）されたマウスは胚芽段階で死亡率が高く、胎盤、胎児の肝及び手足／筋肉形成において分化欠陥を示す（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ９８（１３）：７４４３−７４４８、２００１；Ｇｍｙｒｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５９（２）：５７９−５９０、 ２００１）。また、ｃＭｅｔは、肝、前立腺、大腸、乳房、脳及び皮膚癌などの多様なヒト癌において過発現すると報告されている（Ｍａｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１３（１）、４１−５９、２００２）。従って、ｃＭＥＴ活性化は、血管新生、 細胞運動性及び細胞表面タンパク質分解酵素調節などの過程に刺激的な影響を及ぼし癌の転移を著しく増加させるので、癌を予防及び治療するための標的因子として関心の対象になって来た（Ｗｉｅｌｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５７（５）、１５６３−１５７３、２０００）。
【０００４】
モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）は、治療剤としての潜在力を有しているが、このような非ヒト抗体は、人体内では外来抗原として見なされて免疫反応を誘発し、半減期が短いのでその治療效果が制限的である。
従って、このような問題を解決するため、抗原と直接結合する母体モノクローナル抗体の可変領域の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）をヒト抗体に移植することによって（ＣＤＲ−移植方法）“ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）”を開発する研究が多様行われてきた。このようにして得られたヒト化抗体は母体抗体の親和度及び特異性を維持しながら人体内での免疫反応を減らし、半減期を延長させる（Ｂａｓｅｌｇａ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、１４、７３７−７４４、１９９６）。しかし、このようなＣＤＲ−移植方法は、時々母体モノクローナル抗体より抗原結合力が弱いヒト化抗体を生産するという問題がある（Ｃａｒｔｅｒ、Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９、４２８５−４４２８、１９９２；Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１８、４９−６２、１９９４；及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３−７７８、１９９１１）。
【０００５】
そこで、母体モノクローナル抗体の親和度を維持するヒト化抗体を提供するためにＣＤＲルーフ（ｌｏｏｐ）形成に影響を与えるヒト抗体骨格部位領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）に存在する主なアミノ酸残基をこれに対応する母体モノクローナル抗体のアミノ酸残基で代替することが報じられた（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、８７７−８８８、１９８９）。しかし、抗原結合に関与する骨格部位の残基を見つけることは非常に難しいため、これを利用した抗体のヒト化方法は非常に時間がかかる。
【０００６】
本発明者たちは、ＨＧＦ／ＳＦとこの受容体であるｃＭＥＴの結合を抑制する中和活性を有する抗−ＨＧＦ／ＳＦのヒト化抗体及びこの效果的な製造方法に対する研究を続けた結果、ヒト抗体の軽鎖可変領域と人間以外の動物来由の抗−ＨＧＦ／ＳＦ抗体の重鎖可変領域相補性決定部位（ＨＣＤＲ）が移植されたヒト抗体の重鎖可変領域で構成された組合わせ抗体ライブラリのファージ表面発現を利用すれば、母体抗体に比べて同等以上の活性を有しながらもモノクローナル抗体により誘導される人体内の免疫副反応が低いヒト化抗体を迅速に製造できることを見つけることで本発明を完成した。
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ．、９８（１３）、７４４３−７４４８、２００１
【非特許文献２】Ｇｍｙｒｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５９（２）、５７９−５９０、２００１
【非特許文献３】Ｍａｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１３（１）、４１−５９、２００２
【非特許文献４】Ｗｉｅｌｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５７（５）、１５６３−１５７３、２０００
【非特許文献５】Ｂａｓｅｌｇａ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、１４、７３７−７４４、１９９６
【非特許文献６】Ｃａｒｔｅｒ、Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９、４２８５−４４２８、１９９２
【非特許文献７】Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ、 Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１８、４９−６２、１９９４
【非特許文献８】Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３−７７８、１９９１１
【非特許文献９】Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、８７７−８８８、１９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、低い免疫副反応を示し、母体モノクローナル抗体に比べて同等または高い結合親和度を有する抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を提供することである。
本発明の他の目的は、ファージ表面発現を用いて前記抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記のような目的を果たすために、本発明は、
ａ）相補性決定部位（ＣＤＲ）にそれぞれ下記アミノ酸配列を有するヒト抗体の重鎖可変領域；
ＴＹＹＭＳ ＹＩＧＴＳＳＧＴＴＹＹＡＮＳＶＫＧ ＧＬＧＲＩＮＬ（配列番号１〜３）
ｂ）ヒト抗体の軽鎖可変領域と同一の軽鎖可変領域；
ｃ）ヒト抗体の重鎖不変領域と同一の重鎖不変領域；及び
ｄ）ヒト抗体の軽鎖不変領域と同一の軽鎖不変領域
を有することを特徴とする抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を提供する。
前記他の目的を果たすために、本発明は相補性決定部位にそれぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域との組合わせからなるキメラＦａｂライブラリを製造した後、これをファージ表面発現させる段階を含むことを特徴とする前記抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
完全にヒト化された軽鎖可変領域、及び移植された重鎖可変領域相補性決定部位及び骨格部位の一部残基を除き、全てヒト化された重鎖可変領域を有する本発明の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体は、母体抗体と同等なまたは高いＨＧＦ／ＳＦに対する結合親和度を有し、ＨＧＦ／ＳＦとこの受容体であるｃＭＥＴの結合を抑制する中和活性を有しながらも人体内で低い免疫副反応を示すので、より效果的にＨＧＦとその受容体であるｃＭＥＴの結合により引き起こされる多様な疾患、特に癌の予防及び治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明でキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体は、抗体可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）又はこのＣＤＲが抗体の残りの部分と相違した動物から由来する抗体を指す。このような抗体は、例えば、抗体可変領域は人間以外の動物（例えば、マウス、ラビット、家擒類など）から由来し、抗体不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ）は人間から由来した抗体であり得る。このようなキメラ抗体は、当業界で公知の遺伝子再組合わせなどの方法で製造されることができる。
【００１２】
本発明でヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、動物由来モノクローナル抗体の高い親和度と特異性を維持しながらも人体内での免疫副反応を減少させるために、動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲをヒト抗体に移植させて製造される抗体を意味する。
【００１３】
本発明で重鎖は、抗原に対する特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全体長さ重鎖及びこの断片を指す。
軽鎖は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全体長さ軽鎖及びこの断片を指す。
【００１４】
また、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。
【００１５】
本発明のヒト化抗体は、ヒト抗体の軽鎖可変領域、人間以外の動物来由の抗−ＨＧＦ／ＳＦ抗体の重鎖可変領域相補性決定部位（ＨＣＤＲ）が移植されたヒト抗体の重鎖可変領域及びヒト抗体の重鎖及び軽鎖不変領域で構成される。
【００１６】
前記重鎖可変領域に移植される相補性決定部位は、相補性決定部位に配列番号１〜３のアミノ酸配列を有する人間以外のすべての動物の抗体重鎖から由来することができ、望ましくは配列番号２０のアミノ酸配列を有する、抗−ＨＧＦ／ＳＦラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８（大韓民国特許登録第５５６６６０号）の重鎖可変領域から由来する。
【００１７】
本発明の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体は、断片または全体形態の抗体であり得、望ましくはＦａｂの形態を有する。
【００１８】
また、本発明のヒト化抗体は、ＨＧＦ／ＳＦに対して１×１０−９〜５×１０−８Ｍの結合親和度（ＫＤ）を有する。
【００１９】
本発明では、抗原との結合力を高めるために、相補性決定部位が由来した母体抗体でＣＤＲルーフの形態に影響を与える骨格部位領域のアミノ酸残基が追加に移植されたヒト抗体の重鎖可変領域を含むことができ、前記アミノ酸残基は配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域の２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基中の一つ以上であることが望ましい。本発明でアミノ酸残基番号は、カバット番号付与体系（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）により指定した。
【００２０】
本発明の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体は、次のような方法に製造され得る。
まず、人間骨髓から抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した後、これを鋳型として縮退プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）の組合わせを用いてＰＣＲを行ってヒト抗体の軽鎖可変領域を合成し、ヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃκ）を重畳延長ＰＣＲで結合させて軽鎖遺伝子を製造する。
【００２１】
配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ、例えば、ラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８のＨＣＤＲが移植されたヒト抗体の重鎖可変領域を増幅するために、先に配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域のＨＣＤＲ １（アミノ酸３１−３５）、ＨＣＤＲ２（アミノ酸５０−６５）またはＨＣＤＲ３（アミノ酸９５−１０２）を移植するように設計されたプライマーを用いて、骨格部位ＦＲ１（ＨＣＤＲ１を含む）、ＦＲ２（ＨＣＤＲ２を含む）、ＦＲ３（ＨＣＤＲ３を含む）及びＦＲ４（ヒト抗体重鎖不変領域ＣＨ１を含む）を合成するためのＰＣＲをそれぞれ行う。
【００２２】
この時、製造される抗体の抗原との結合力を高めるために骨格部位領域の任意の位置にこれに対応するＳＦＮ ６８のアミノ酸残基を追加的に移植するように設計されたプライマーを利用できる。この時、追加的に移植される骨格部位領域のアミノ酸残基は、ラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８の重鎖アミノ酸配列及びこれと類似性が高い人間重鎖のアミノ酸配列を比較してラビットと人間の骨格部位領域の差からＣＤＲ ループの形態に影響を与える骨格部位領域のアミノ酸残基を確認することで決めることができ、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域の２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基中の一つ以上であることが望ましい。
【００２３】
前記で得たＦＲ１〜ＦＲ４に対するＰＣＲ産物を重畳延長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）で結合させてラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８のＨＣＤＲが移植されたヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の重鎖不変領域（ＣＨ１）に組合わされた重鎖遺伝子を製造する。この時用いられるプライマーは、效果的な結合のために各ＨＣＤＲに対応する塩基を２０個以上有するように設計される。
【００２４】
本発明では前記で得た重鎖及び軽鎖遺伝子を重畳延長ＰＣＲで結合させてラビット／ヒトキメラＦａｂ抗体のＤＮＡライブラリを製造する。
【００２５】
本発明では前記ライブラリのＤＮＡ切片をベクターに挿入した後、このベクターで大膓菌を形質変換させることでラビット／ヒトキメラＦａｂ抗体ライブラリを製造する。前記ベクターと大膓菌は、当業界で通常的に用いられるものであれば、制限なしに用いられることができるが、ベクターではファージミドベクター、例えば、ｐＣｏｍｂ３Ｘ（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）を用いるのが望ましく、大膓菌では大膓菌ＥＲ２５３７（ＮＥＢ）を用いるのが望ましい。ライブラリＤＮＡを含むファージミドベクターで大膓菌を形質変換させれば、導入したファージがファージコートタンパク質（ｐｈａｇｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるｐＩＩＩに融合タンパク質形態としてＦａｂ抗体を表面発現する。
【００２６】
以後、ＨＧＦ／ＳＦにコーティングされたＥＬＩＳＡプレート及び抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体を用いた酵素免疫法を通じて抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂを含むファージクローンを選別する。選別された抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂを含むファージクローンのうち、ＳＦＮ ６８と同等以上の親和度を示すクローンをＨＳＦＮ ６８−１３、ＨＳＦＮ ６８−１６、ＨＳＦＮ ６８−２７及びＨＳＦＮ ６８−４１とそれぞれ名付けた。
【００２７】
前記ＨＳＦＮ ６８−１３クローンはそれぞれ配列番号６及び７の塩基配列を有する ＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−１６クローンはそれぞれ配列番号１０及び１１の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−２７クローンはそれぞれ配列番号 １４及び１５の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−４１クローンはそれぞれ配列番号１８及び１９の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有する。
【００２８】
前記クローンのＶＬ及びＶＨ領域に対するアミノ酸配列を類推すると、ＨＳＦＮ ６８−１３クローンはそれぞれ配列番号４及び５のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−１６クローンはそれぞれ配列番号８及び９のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−２７クローンはそれぞれ配列番号１２及び１３のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−４１クローンはそれぞれ配列番号１６及び１７のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有する。
【００２９】
前記クローンのアミノ酸配列で骨格部位（ＦＲ）とＣＤＲを分析して見れば、各クローンのＶＬ及びＶＨ領域にはそれぞれ４個のＦＲと３個のＣＤＲが存在し（図２及び３を参照）、前記ＨＳＦＮ ６８クローンとＳＦＮ ６８の軽鎖配列類似度は７８〜８１％であり、重鎖配列類似度は８５〜９０％である。
【００３０】
本発明のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖は、コドンの縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により特定アミノ酸に対してこれをコードするいくつの他のコドンが存在するという事実は公知されているため、それらのアミノ酸配列から予測されるどのような塩基配列で特定でき、これらの塩基配列は全て本発明の範疇内に含まれる。望ましくはヒト化抗体重鎖及び軽鎖遺伝子配列は宿主細胞の一つ以上の選好コドンを含む。
【００３１】
また、本発明では選別されたクローンのファージミドＤＮＡで大膓菌を形質変換させ、抗体タンパク質を発現させた後、培養液を通常の方法で精製することによって抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を生産し得る。前記大膓菌と精製方法は、当業界で再組合わせタンパク質の生産のために通常的に用いるものであれば、制限なしに用いることができるが、大膓菌ではＨＢ２１５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いるのが望ましく、精製方法では培養液を濃縮した後、タンパク質Ｌコラム（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ ｃｏｌｕｍｎ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）で精製することが望ましい。
【００３２】
ＨＧＦ／ＳＦに対するＨＳＦＮ ６８クローンの親和度を調査した結果、ＨＳＦＮ ６８−１３クローンが前述の４個のクローンの中で一番高い親和度を示し、これは ＳＦＮ ６８より６倍も高いものである。一方、ＨＳＦＮ ６８−１６は一番弱い親和度を示し、ＨＳＦＮ ６８−２７及び４１はＳＦＮ ６８と類似した親和度を示す（表 ２を参照）。
【００３３】
また、本発明のヒト化抗体は、ＨＧＦ／ＳＦとｃＭＥＴ／Ｆｃキメラとの間の結合をＳＦＮ ６８と同等な水準で抑制し（図５を参照）、ＳＦＮ ６８と類似した中和活性を示す（図６を参照）。
【００３４】
このように、完全にヒト化された軽鎖可変領域、及び移植された重鎖可変領域相補性決定部位及び骨格部位の一部残基を除き、共にヒト化された重鎖可変領域を有する本発明によるヒト化抗体は、母体ＳＦＮ ６８と同等以上のＨＧＦ／ＳＦに対する結合親和度を有し、ＨＧＦ／ＳＦとこの受容体であるｃＭＥＴの結合を抑制する中和活性を有しながらも人体内で低い免疫副反応を示すため、より效果的にＨＧＦとその受容体であるｃＭＥＴの結合により引き起こされる多様な疾患、特に癌の予防及び治療剤として有用である。
従って、本発明では前記ヒト化抗体を有效成分で含む癌の予防・治療用組成物も提供する。本発明の組成物は薬学的に許容可能な担体を含むことができ、通常的な方法により剤形化され得る。
【００３５】
本発明の薬学組成物は、静脈及び筋肉注射を含む多様な方法で投与されることができる。活性成分の投与量は患者の状態、投与経路、年齢、性別及び体重を含む多様な関連因子、及び患者の症状により決められる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を、実施例を通じてより詳しく説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示することだけであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１
抗−ＨＧＦ／ＳＦ ラビット／ヒトキメラＦａｂを含むファージライブラリの製造
（１−１） ヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の増幅
ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、米国）を用いて人間骨髓（入手先：実験室研究員寄贈）から全体ＲＮＡを抽出した後、塩化リチウム沈澱法で精製した後、オリゴ（ｄＴ）をプライマーにし、スーパースクリプト前増幅システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｒｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。
前記ヒトｃＤＮＡを鋳型にし、下記表１の配列番号２１〜２５の縮退プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）の組合わせを用いて重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことでヒト抗体の軽鎖可変領域を合成した。
【表１】
【００３７】
各ＰＣＲ反応は、前記合成したｃＤＮＡ（約 ０．５μｇ）１μｌ、それぞれ６０ｐｍｏｌの 正方向プライマーと逆方向プライマー、０．５μｌのＴａｑ重合酵素、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液を混合し、蒸溜水を加えて１００μｌに調節し、この混合物を９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒の反応を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間定置して行った。
増幅されたＤＮＡは１％アガロースゲルで電気泳動した後、ＬａｂｏＰａｓｓＴＭゲル抽出キット（Ｃｏｓｍｏ、韓国）を用いて精製した。
【００３８】
（１−２） ヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃκ）の増幅
ヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃκ）を増幅するために、２０ｎｇのヒトＦａｂのＣκ配列を含むｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクター（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）を鋳型にして各６０ｐｍｏｌの配列番号２６及び２７に記載するプライマーを用いたことを除き、前記（１−１）と同一な方法でＰＣＲを行った。
【００３９】
（１−３） 軽鎖の増幅
前記（１−１）及び（１−２）から得たヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及びヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃκ）を重畳延長ＰＣＲを行って結合させて軽鎖遺伝子を製造した。
このＰＣＲ 反応は、それぞれ１００ｎｇのＶＬ及びＣκＰＣＲ産物、それぞれ配列番号 ２８及び２７と記載される６０ｐｍｏｌの正方向プライマーと逆方向プライマー、０．５ μｌのＴａｑ重合酵素、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液を混合し、蒸溜水を加えて１００μｌに調節し、この混合物を９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で２分の反応を１５回繰り返した後、７２℃で１０分間定置して行った。 以後増幅されたＤＮＡを前記（１−１）と同一な方法でアガロースゲル電気永同・精製した。
【００４０】
（１−４） ＳＦＮ ６８のＨＣＤＲが移植された重鎖可変領域（ＶＨ）及び人間重鎖不変領域（ＣＨ１）の増幅
前記（１−１）から得たヒトｃＤＮＡを鋳型にし、下記表２の配列番号２９〜３６のプライマーを用ってラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８（大韓民国特許登録第５５６６６０号）のＨＣＤＲが移植されたヒト抗体の重鎖骨格部位ＦＲ１（ＨＣＤＲ１を含む）、ＦＲ２（ＨＣＤＲ２を含む）及びＦＲ３（ＨＣＤＲ３を含む）をＰＣＲで合成し、ＦＲ４はヒト抗体の重鎖不変領域ＣＨ１の配列を含むように、ヒトＦａｂのＣＨ１ 配列を含むｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ発現ベクター（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）を鋳型にして下記表２の配列番号３７及び３８のプライマーを用いてＰＣＲで合成した。
【００４１】
前記各ＰＣＲは、鋳型としてそれぞれ５００ｎｇのｃＤＮＡまたは２０ｎｇのｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ発現ベクターを用いたことを除き、前記（１−１）と同一の条件で行い、増幅されたＤＮＡを前記（１−１）と同じの方法でアガロースゲル電気永同・精製した。
【表２】
【００４２】
上記ＰＣＲに用いたプライマーは、図３に示されたように、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域のＨＣＤＲ１（アミノ酸３１−３５）、ＨＣＤＲ２（アミノ酸５０−６５）またはＨＣＤＲ３（アミノ酸９５−１０２）、及び２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基の中で少なくとも一つがヒト抗体の重鎖配列の対応位置に移植されるように設計された。
【００４３】
（１−５） 重鎖の増幅
下記表３に記載の鋳型及びプライマーの組合わせを用いて前記（１−３）と同一な方法で重畳延長ＰＣＲを行うことで前記（１−４）から得たＦＲ１〜ＦＲ４に対する各ＰＣＲ産物を順に結合させてＳＦＮ ６８のＨＣＤＲが移植された重鎖可変領域（ＶＨ）及び人間重鎖不変領域（ＣＨ１）を含む重鎖を合成し、以後増幅されたＤＮＡを前記（１−１）と同一な方法でアガロースゲル電気永同・精製した。
この時、用いられたプライマーは、效果的な結合のために抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂをコーディングする塩基配列のＨＣＤＲの塩基配列に対応する塩基を２０個以上有するように設計された。
【表３】
【００４４】
（１−６） 抗−ＨＧＦ／ＳＦラビット／ヒトキメラＦａｂライブラリ遺伝子の製造
抗−ＨＧＦ／ＳＦラビット／ヒトキメラＦａｂライブラリ遺伝子を製造するために、それぞれ１００ｎｇの前記（１−３）で精製された軽鎖遺伝子産物と前記実施例（１−５）で精製された重鎖遺伝子産物、それぞれ６０ｐｍｏｌの配列番号２８及び配列番号４０と記載するプライマーを用いたことを除き、前記（１−３）と同一な方法で ＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡを前記（１−１）と同一な方法でアガロースゲル電気永同・精製した。
【００４５】
（１−７） 抗−ＨＧＦ／ＳＦ ラビット／ヒトキメラ Ｆａｂ ライブラリ遺伝子を含むファージの製造
前記（１−６）で精製されたキメラＦａｂライブラリ遺伝子を制限酵素ＳｆｉＩ（Ｒｏｃｈｅ、米国）で切断して分離した後、図１に示されているファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）に挿入した。この製造されたファージミドベクターを用いて大膓菌ＥＲ２５３７（ＮＥＢ、米国）を電気穿孔（ｅｌｅｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法で形質変換させた。
【００４６】
このように導入したファージは、ファージコートタンパク質（ｐｈａｇｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるｐIIIタンパク質形態としてＦａｂを表面発現する。
前記形質変換された菌株をＳＢ培地（１０ｇのＭＯＰＳ（３（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）、３０ｇのトリプトン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｉｆｃｏ）及び２０ｇの酵母抽出物（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｉｆｃｏ）を含む）を用いて３７℃、２５０ｒｐｍで培養した後、培養物にヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を添加してファージ救助（ｐｈａｇｅ ｒｅｓｃｕｅ）を行った（文献［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１］を参照）。一晩培養して得た培養物を４℃、１４、０００×ｇで２０分間遠心分離して細胞ペレットを取り除いた後、上層液に４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ、シグマ）及び３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加し、氷溶上で３０分間放置してファージを沈澱させた。これを４℃、１７、０００×ｇで２０分間遠心分離して得た、ペレットを３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ（ＴＢＳＢ）１ｍｌに再度溶解させた。得られたライブラリの多様性をファージの滴定法（文献［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１］を参照）及びＢｓｔＮＩフィンガープリンティング（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）（文献 ［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ.Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１］を参照）で確認した。
【００４７】
実施例２
ヒト化された抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂを含むファージクローンの選別
（２−１） バイオパニング （Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）
９６−ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、米国）の各ウェルに０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝額（ｐＨ８．６、コーティング緩衝額）に溶かした１０μｇ／ｍｌＨＧＦ／ＳＦ５０μｌを加えて４℃で一晩かけてコーティングした。各ウェルにＴＢＳＢ（５％ＢＳＡを含む）１００μｌを添加し、３７℃で２時間放置してコーティングされない部分をブロッキングした。コーティングされた各ウェルに実施例１で製造したＦａｂを表面発現しているファージをＴＢＳＢに懸濁させた溶液５０μｌを加え、２時間程度３７℃で放置した後、０．０５％ツイン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で洗滌し、ウェルに固定されているファージを０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン（ｐＨ２．２）１００μｌに湧出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．１）１６μｌを添加して中和させた。パンニングは、総４回実施し、洗滌回数は一番目パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）に１回、二番目及び三番目パンニングに５回及び四番目パンニングに１０回と増加させた。各パンニング毎に湧出されたファージで指数生長期の大膓菌ＥＲ２５３７細胞を形質変換させた後、実施例１の（１−７）と同一な方法でファージ球助を行い、インプット−アウトプットタイター（ｉｎｐｕｔ−ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）を通常の方法（文献［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、２００１］を参照）で調査した。
【００４８】
（２−２） ＥＬＩＳＡ
ＨＧＦ／ＳＦに結合するクローンを同定するために表面発現されたＦａｂを用いたＥＬＩＳＡを行った。
具体的に、前記（２−１）で最終回パンニング後のアウトプットタイタープレート（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）から４１個のクローンを無作為に選別した後、カベニシルリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＳＢ培地に前記クローンを接種して４時間を培養し、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を処理してファージ球助を行った。２時間後にカナマイシンで処理して一晩中培養して最終的に表面にＦａｂが発現されたファージを含む上層液を得た。９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルをコーティング緩衝額に溶かした１μｇ／ｍｌＨＧＦ／ＳＦを用いて４℃で一晩コーティングし、ＴＢＳＢでブロッキングした。前記で得たファージ上層液を同一体積のＴＢＳＢと混合してコーティングされた各ウェルに５０μｌずつ添加した後、３７℃で１時間放置し、ＴＢＳ−Ｔで洗滌した。 各ウェルにＡＢＴＳ（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ溶液、シグマ）を基質として用いてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたシープ（ｓｈｅｅｐ）抗−Ｍ１３ファージ多クローン抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加して３７℃で３０分間放置した後、４０５ｎｍで光学密度を測定した。
その結果、ＨＧＦ／ＳＦに対して結合活性を有する総３３個のクローンが選別され、これらに対して前記と同一な方法でＥＬＩＳＡを行ってＳＦＮ ６８と同等以上の結合親和度を示す４個のクローンを選別した。これら選別されたクローンをそれぞれＨＳＦＮ６８−１３、１６、２７及び４１と名付け、以後の実験に用いた。
【００４９】
実施例３
選別されたファージの配列分析
前記実施例２で選別された４個のクローンのＦａｂ遺伝子の塩基配列分析は文献［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、２００１］に記載されている特定プライマーを用いてジデオキシ鎖終了（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）方法で行った。シーケンシング反応の産物は、ＡＢＩプリズム３１００遺伝子分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）に分析された。
その結果、ＨＳＦＮ ６８−１３ Ｆａｂ遺伝子はそれぞれ配列番号６及び７の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−１６ Ｆａｂ遺伝子はそれぞれ配列番号１０及び１１の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ６８−２７ Ｆａｂ遺伝子はそれぞれ配列番号１４及び１５の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ６８−４１ Ｆａｂ遺伝子はそれぞれ配列番号１８及び１９の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有するということを確認した。
【００５０】
これから前記ＦａｂのＶＬ及びＶＨ領域に対するアミノ酸配列を類推した結果、ＨＳＦＮ ６８−１３ Ｆａｂはそれぞれ配列番号４及び５のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−１６ Ｆａｂはそれぞれ配列番号８及び９のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−２７ Ｆａｂはそれぞれ配列番号１２及び１３のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−４１ Ｆａｂはそれぞれ配列番号１６及び１７のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有するということを確認した。
【００５１】
前記Ｆａｂのアミノ酸配列で骨格部位（ＦＲ）とＣＤＲを公知の方法（文献［Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４（２）、ｐ３０６−３１０、１９９５］を参照）で分析した結果、図２及び３のような領域構成を有することが判明した。
また、ＨＳＦＮ ６８ Ｆａｂと ＳＦＮ ６８ Ｆａｂの軽鎖配列類似度は７８〜８１％であり、重鎖配列類似度は８５〜９０％であった。
【００５２】
実施例４
抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂの発現及び試験管内分析のための精製
前記実施例２で選別されたクローンのファージミドＤＮＡで非抑制性大膓菌ＨＢ２１５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を形質変換させた。形質変換された菌株を５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地４００ｍｌに入れ、６００ ｎｍにおけるＯ．Ｄが０．５−１．０となるまで３０℃、２５０ｒｐｍの条件で培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、３０℃で一晩培養しながら発現を誘導した。培養液の上層液をＬａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を用いて濃縮し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌコラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）を用いて精製した後、精製された５０ ＫＤａのＦａｂをクマシ染色で確認した。その結果を図４に示す。
【００５３】
実験例１
ＨＧＦ／ＳＦに対する抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂヒト化抗体の結合親和度分析
ＨＧＦ／ＳＦに対する抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂヒト化抗体の結合親和度は、ＢＩＡｃｏｒｅ器機（ＢＩＡｃｏｒｅ、スウェーデン）を用いてＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；表面プラズモン共鳴技術）で決定した。
【００５４】
具体的に、１０ｍＭソジウムアセテート緩衝溶液（ｐＨ４．０）を５μｌ／ｍｉｎの速度で流しながらアミンカップルリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）と共にキットの説明書に従ってＣＭ５（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）にＨＧＦ／ＳＦを固定させた。０．００５％ ツイン２０（シグマ）を含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）に溶かした４種類の抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂ及び対照群としてＳＦＮ ６８をそれぞれ２５℃で２分間３０μｌ／ｍｉｎの速度でチップに注入した。抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂヒト化抗体は、１．２５−２００ｎＭの濃度に希釈した。表面は、１ Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生し、分析ソフトウェア（ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて運動速度定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）と平衡解離定数（ＫＤ）を得た。その結果を表４に示す。
【表４】
【００５５】
表４に示したように、ＨＳＦＮ ６８−１３ Ｆａｂが分析された４個のＦａｂの中で最も高い親和度を示し、これは対照群として用いられたＳＦＮ ６８より６倍も高いものである。一方、ＨＳＦＮ ６８−１６は最も弱い親和度を示し、ＨＳＦＮ ６８−２７及び４１はＳＦＮ ６８と類似した親和度を示した。
実験例２
抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂの中和活性測定のための競争酵素免疫法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
９６−ウェルマイクロプレートを１μｇ／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦでコーティングし、前記実施例２の（２−２）と同一な方法でブロッキングした。２ｎＭ ｃＭＥＴ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）２５μｌとＴＢＳＢに溶かした０〜２００ｎＭのＨＳＦＮ ６８−１３またはＳＦＮ ６８ ２５μｌをＨＧＦ／ＳＦがコーティングされたウェルに添加した後、３７℃で１時間放置し、ＴＢＳ−Ｔで洗滌した。ウェルに固定されたｃＭＥＴ／Ｆｃの量は基質としてウルトラ−ＴＭＢ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＨＲＰが結合されたラビット抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した。３０分間放置した後、４５０ｎｍで光学密度を測定した。すべての実験を三度行い、これらの平均値及び標準偏差を図５に示した。
【００５６】
図５に示したように、ＨＳＦＮ ６８−１３クローンはその量の増加にともなって固定されたＨＧＦ／ＳＦとｃＭＥＴ／Ｆｃキメラとの間の結合を抑制し、このような中和活性はＳＦＮ ６８と類似した。
【００５７】
実験例３
ＭＤＣＫ分散（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分析
ＨＳＦＮ ６８ ＦａｂがＨＧＦ／ＳＦの生物学的活性を中和させるかどうかを確認するためにＨＧＦ／ＳＦ及びｃＭＥＴ信号伝逹に対する阻害剤效果の定量化に広く用いられるＭＤＣＫ分散分析（文献［Ｔｈｉｅｒｙ Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．、２、ｐ４４２−４４５、２００２］を参照）を行った。
【００５８】
ＭＤＣＫ細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｅｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）を１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。９６−ウェルプレートの各ウェル当り１．５×１０３個のＭＤＣＫ細胞を分株して２４時間放置した。１８．７５ｐＭのＨＧＦ／ＳＦを０〜 ４．７ｎＭのＨＳＦＮ ６８−１３及び０〜７００ｎｇ／ｍｌの多クローンゴート抗−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧ（シグマ）の混合物と３７℃で１時間の前培養した後、ＰＢＳで洗滌した各ウェルに添加して一晩反応させた。この際、比較するためにＳＦＮ ６８を用いて前記と同一な実験を繰り返した。また、多クローンゴート抗−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧ、または非特異的Ｆａｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ、米国）と抗−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧの混合物をＨＧＦ／ＳＦと共に処理した実験群を比較群として用いた。細胞をメタノール及びアセトン混合物（１：１（ｖ／ｖ））で固定し、１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット水溶液で染色した後、逆位光学顕微鏡で分散效果を観察した。
図６に示したように、何れの処理もしなかった対照群のＭＤＣＫ細胞（Ａ）に比べて、ＨＧＦ／ＳＦで処理されたＭＤＣＫ細胞（Ｂ）では細胞の分散が観察された。一方、多クローンゴート抗−ヒトＦａｂ抗体と共に前培養されて二量体化されたＨＳＦＮ ６８−１３またはＳＦＮ ６８を培地に添加すれば（Ｃ及びＤ）、ＨＧＦ／ＳＦによるＭＤＣＫ細胞の分散が遮断されて対照群と類似した結果を示し、この時、ＨＳＦＮ ６８−１３とＳＦＮ ６８は最小１８７．５ｐＭ濃度で１４．０６ｎｇ／ｍｌのゴート抗−ヒトＦａｂ多クローン抗体と共に中和效果を示した。一方、比較群として用いられた多クローン塩素項−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧ（Ｅ）及び非特異的Ｆａｂとゴート抗−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧの混合物（Ｆ）はＨＳＦ／ＳＦによる細胞分散に対して何れの抑制效果も示されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】抗体ライブラリ製造に用いられたファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘの概略的な遺伝子構成を図式化したことであって、ファージ表面にＦａｂを表面発現（ｄｉｓｐｌａｙ）することを示す図である。
【図２】母体抗体であるラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８と本発明のヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ比べたものである。（ここで、−は同一なアミノ酸を、太字はＰＣＲプライマーにより置き換えされるアミノ酸を、下線はプライマーをコーディングするアミノ酸を、＊はＰＣＲによりヒトｃＤＮＡからクローニングされた多様性を有する領域を示す。）
【図３】母体抗体であるラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８と本発明のヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ比べたものである。（ここで、−は同一なアミノ酸を、太字はＰＣＲプライマーにより置き換えされるアミノ酸を、下線はプライマーをコーディングするアミノ酸を、＊はＰＣＲによりヒトｃＤＮＡからクローニングされた多様性を有する領域を示す。）
【図４】実施例４で精製されたＦａｂ切片に対してクマシ染色を行ったゲル写真である。
【図５】本発明のヒト化抗体によるＨＧＦ／ＳＦとｃＭＥＴ／Ｆｃキメラの結合抑制程度を母体抗体であるＳＦＮ ６８と比べたグラフである。
【図６】ＨＧＦ／ＳＦに対する本発明のヒト化抗体と抗−ヒトＦａｂ特定ＩｇＧの混合物のＭＤＣＫ分散抑制程度を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体及びこの製造方法に関するものであって、より詳しくはヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）とヒト以外の動物由来の抗−ＨＧＦ／ＳＦ抗体の重鎖可変領域相補性決定部位（ＨＣＤＲ）が移植されたヒト抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の組合わせからなる抗−ＨＧＦ／ＳＦキメラＦａｂライブラリをファージ表面発現させて製造された抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＧＦ／ＳＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ；肝細胞成長因子／分散因子）は、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）により生産される多機能性ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）ポリペプチドであって、Ｎ末端ドメインとセリンプロテアーゼ類似ベータ−チェーンＣ末端ドメインに共有結合で連結された４個のクリングルドメイン（ＮＫ４）を含むアルファ−チェーンからなっている。また、ヒトＨＧＦ／ＳＦは、生物学的に不活性である単鎖体形態の７２８個のアミノ酸を有する前駆体として合成されて、Ｒ４９４残基が特異的血清セリンプロテアーゼにより切断されて生物学的に活性なＨＧＦ／ＳＦになり、この活性ＨＧＦ／ＳＦは、６９ｋＤａのアルファ−チェーンと３４ｋＤａのベータ−チェーンが二硫化結合で連結されたヘテロ二量体である。
【０００３】
ＨＧＦ／ＳＦがその受容体であるｃＭＥＴに結合すれば、多様な細胞類型の成長及び分散を誘導し、上皮間葉転移及び細管（ｔｕｂｕｌｅ）と内腔（ｌｕｍｅｎ）の形成を媒介し、血管形成を促進する。ｃＭＥＴとＨＧＦ／ＳＦが共にノックアウット（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）されたマウスは胚芽段階で死亡率が高く、胎盤、胎児の肝及び手足／筋肉形成において分化欠陥を示す（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ９８（１３）：７４４３−７４４８、２００１；Ｇｍｙｒｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５９（２）：５７９−５９０、 ２００１）。また、ｃＭｅｔは、肝、前立腺、大腸、乳房、脳及び皮膚癌などの多様なヒト癌において過発現すると報告されている（Ｍａｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１３（１）、４１−５９、２００２）。従って、ｃＭＥＴ活性化は、血管新生、 細胞運動性及び細胞表面タンパク質分解酵素調節などの過程に刺激的な影響を及ぼし癌の転移を著しく増加させるので、癌を予防及び治療するための標的因子として関心の対象になって来た（Ｗｉｅｌｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５７（５）、１５６３−１５７３、２０００）。
【０００４】
モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）は、治療剤としての潜在力を有しているが、このような非ヒト抗体は、人体内では外来抗原として見なされて免疫反応を誘発し、半減期が短いのでその治療效果が制限的である。
従って、このような問題を解決するため、抗原と直接結合する母体モノクローナル抗体の可変領域の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）をヒト抗体に移植することによって（ＣＤＲ−移植方法）“ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）”を開発する研究が多様行われてきた。このようにして得られたヒト化抗体は母体抗体の親和度及び特異性を維持しながら人体内での免疫反応を減らし、半減期を延長させる（Ｂａｓｅｌｇａ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、１４、７３７−７４４、１９９６）。しかし、このようなＣＤＲ−移植方法は、時々母体モノクローナル抗体より抗原結合力が弱いヒト化抗体を生産するという問題がある（Ｃａｒｔｅｒ、Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９、４２８５−４４２８、１９９２；Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１８、４９−６２、１９９４；及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３−７７８、１９９１１）。
【０００５】
そこで、母体モノクローナル抗体の親和度を維持するヒト化抗体を提供するためにＣＤＲルーフ（ｌｏｏｐ）形成に影響を与えるヒト抗体骨格部位領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）に存在する主なアミノ酸残基をこれに対応する母体モノクローナル抗体のアミノ酸残基で代替することが報じられた（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、８７７−８８８、１９８９）。しかし、抗原結合に関与する骨格部位の残基を見つけることは非常に難しいため、これを利用した抗体のヒト化方法は非常に時間がかかる。
【０００６】
本発明者たちは、ＨＧＦ／ＳＦとこの受容体であるｃＭＥＴの結合を抑制する中和活性を有する抗−ＨＧＦ／ＳＦのヒト化抗体及びこの效果的な製造方法に対する研究を続けた結果、ヒト抗体の軽鎖可変領域と人間以外の動物来由の抗−ＨＧＦ／ＳＦ抗体の重鎖可変領域相補性決定部位（ＨＣＤＲ）が移植されたヒト抗体の重鎖可変領域で構成された組合わせ抗体ライブラリのファージ表面発現を利用すれば、母体抗体に比べて同等以上の活性を有しながらもモノクローナル抗体により誘導される人体内の免疫副反応が低いヒト化抗体を迅速に製造できることを見つけることで本発明を完成した。
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ．、９８（１３）、７４４３−７４４８、２００１
【非特許文献２】Ｇｍｙｒｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５９（２）、５７９−５９０、２００１
【非特許文献３】Ｍａｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１３（１）、４１−５９、２００２
【非特許文献４】Ｗｉｅｌｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５７（５）、１５６３−１５７３、２０００
【非特許文献５】Ｂａｓｅｌｇａ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、１４、７３７−７４４、１９９６
【非特許文献６】Ｃａｒｔｅｒ、Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９、４２８５−４４２８、１９９２
【非特許文献７】Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ、 Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１８、４９−６２、１９９４
【非特許文献８】Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３−７７８、１９９１１
【非特許文献９】Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、８７７−８８８、１９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、低い免疫副反応を示し、母体モノクローナル抗体に比べて同等または高い結合親和度を有する抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を提供することである。
本発明の他の目的は、ファージ表面発現を用いて前記抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記のような目的を果たすために、本発明は、
ａ）相補性決定部位（ＣＤＲ）にそれぞれ下記アミノ酸配列を有するヒト抗体の重鎖可変領域；
ＴＹＹＭＳ ＹＩＧＴＳＳＧＴＴＹＹＡＮＳＶＫＧ ＧＬＧＲＩＮＬ（配列番号１〜３）
ｂ）ヒト抗体の軽鎖可変領域と同一の軽鎖可変領域；
ｃ）ヒト抗体の重鎖不変領域と同一の重鎖不変領域；及び
ｄ）ヒト抗体の軽鎖不変領域と同一の軽鎖不変領域
を有することを特徴とする抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を提供する。
前記他の目的を果たすために、本発明は相補性決定部位にそれぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域との組合わせからなるキメラＦａｂライブラリを製造した後、これをファージ表面発現させる段階を含むことを特徴とする前記抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
完全にヒト化された軽鎖可変領域、及び移植された重鎖可変領域相補性決定部位及び骨格部位の一部残基を除き、全てヒト化された重鎖可変領域を有する本発明の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体は、母体抗体と同等なまたは高いＨＧＦ／ＳＦに対する結合親和度を有し、ＨＧＦ／ＳＦとこの受容体であるｃＭＥＴの結合を抑制する中和活性を有しながらも人体内で低い免疫副反応を示すので、より效果的にＨＧＦとその受容体であるｃＭＥＴの結合により引き起こされる多様な疾患、特に癌の予防及び治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明でキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体は、抗体可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）又はこのＣＤＲが抗体の残りの部分と相違した動物から由来する抗体を指す。このような抗体は、例えば、抗体可変領域は人間以外の動物（例えば、マウス、ラビット、家擒類など）から由来し、抗体不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ）は人間から由来した抗体であり得る。このようなキメラ抗体は、当業界で公知の遺伝子再組合わせなどの方法で製造されることができる。
【００１２】
本発明でヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、動物由来モノクローナル抗体の高い親和度と特異性を維持しながらも人体内での免疫副反応を減少させるために、動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲをヒト抗体に移植させて製造される抗体を意味する。
【００１３】
本発明で重鎖は、抗原に対する特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全体長さ重鎖及びこの断片を指す。
軽鎖は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全体長さ軽鎖及びこの断片を指す。
【００１４】
また、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。
【００１５】
本発明のヒト化抗体は、ヒト抗体の軽鎖可変領域、人間以外の動物来由の抗−ＨＧＦ／ＳＦ抗体の重鎖可変領域相補性決定部位（ＨＣＤＲ）が移植されたヒト抗体の重鎖可変領域及びヒト抗体の重鎖及び軽鎖不変領域で構成される。
【００１６】
前記重鎖可変領域に移植される相補性決定部位は、相補性決定部位に配列番号１〜３のアミノ酸配列を有する人間以外のすべての動物の抗体重鎖から由来することができ、望ましくは配列番号２０のアミノ酸配列を有する、抗−ＨＧＦ／ＳＦラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８（大韓民国特許登録第５５６６６０号）の重鎖可変領域から由来する。
【００１７】
本発明の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体は、断片または全体形態の抗体であり得、望ましくはＦａｂの形態を有する。
【００１８】
また、本発明のヒト化抗体は、ＨＧＦ／ＳＦに対して１×１０−９〜５×１０−８Ｍの結合親和度（ＫＤ）を有する。
【００１９】
本発明では、抗原との結合力を高めるために、相補性決定部位が由来した母体抗体でＣＤＲルーフの形態に影響を与える骨格部位領域のアミノ酸残基が追加に移植されたヒト抗体の重鎖可変領域を含むことができ、前記アミノ酸残基は配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域の２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基中の一つ以上であることが望ましい。本発明でアミノ酸残基番号は、カバット番号付与体系（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）により指定した。
【００２０】
本発明の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体は、次のような方法に製造され得る。
まず、人間骨髓から抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した後、これを鋳型として縮退プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）の組合わせを用いてＰＣＲを行ってヒト抗体の軽鎖可変領域を合成し、ヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃκ）を重畳延長ＰＣＲで結合させて軽鎖遺伝子を製造する。
【００２１】
配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ、例えば、ラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８のＨＣＤＲが移植されたヒト抗体の重鎖可変領域を増幅するために、先に配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域のＨＣＤＲ １（アミノ酸３１−３５）、ＨＣＤＲ２（アミノ酸５０−６５）またはＨＣＤＲ３（アミノ酸９５−１０２）を移植するように設計されたプライマーを用いて、骨格部位ＦＲ１（ＨＣＤＲ１を含む）、ＦＲ２（ＨＣＤＲ２を含む）、ＦＲ３（ＨＣＤＲ３を含む）及びＦＲ４（ヒト抗体重鎖不変領域ＣＨ１を含む）を合成するためのＰＣＲをそれぞれ行う。
【００２２】
この時、製造される抗体の抗原との結合力を高めるために骨格部位領域の任意の位置にこれに対応するＳＦＮ ６８のアミノ酸残基を追加的に移植するように設計されたプライマーを利用できる。この時、追加的に移植される骨格部位領域のアミノ酸残基は、ラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８の重鎖アミノ酸配列及びこれと類似性が高い人間重鎖のアミノ酸配列を比較してラビットと人間の骨格部位領域の差からＣＤＲ ループの形態に影響を与える骨格部位領域のアミノ酸残基を確認することで決めることができ、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域の２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基中の一つ以上であることが望ましい。
【００２３】
前記で得たＦＲ１〜ＦＲ４に対するＰＣＲ産物を重畳延長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）で結合させてラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８のＨＣＤＲが移植されたヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の重鎖不変領域（ＣＨ１）に組合わされた重鎖遺伝子を製造する。この時用いられるプライマーは、效果的な結合のために各ＨＣＤＲに対応する塩基を２０個以上有するように設計される。
【００２４】
本発明では前記で得た重鎖及び軽鎖遺伝子を重畳延長ＰＣＲで結合させてラビット／ヒトキメラＦａｂ抗体のＤＮＡライブラリを製造する。
【００２５】
本発明では前記ライブラリのＤＮＡ切片をベクターに挿入した後、このベクターで大膓菌を形質変換させることでラビット／ヒトキメラＦａｂ抗体ライブラリを製造する。前記ベクターと大膓菌は、当業界で通常的に用いられるものであれば、制限なしに用いられることができるが、ベクターではファージミドベクター、例えば、ｐＣｏｍｂ３Ｘ（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）を用いるのが望ましく、大膓菌では大膓菌ＥＲ２５３７（ＮＥＢ）を用いるのが望ましい。ライブラリＤＮＡを含むファージミドベクターで大膓菌を形質変換させれば、導入したファージがファージコートタンパク質（ｐｈａｇｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるｐＩＩＩに融合タンパク質形態としてＦａｂ抗体を表面発現する。
【００２６】
以後、ＨＧＦ／ＳＦにコーティングされたＥＬＩＳＡプレート及び抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体を用いた酵素免疫法を通じて抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂを含むファージクローンを選別する。選別された抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂを含むファージクローンのうち、ＳＦＮ ６８と同等以上の親和度を示すクローンをＨＳＦＮ ６８−１３、ＨＳＦＮ ６８−１６、ＨＳＦＮ ６８−２７及びＨＳＦＮ ６８−４１とそれぞれ名付けた。
【００２７】
前記ＨＳＦＮ ６８−１３クローンはそれぞれ配列番号６及び７の塩基配列を有する ＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−１６クローンはそれぞれ配列番号１０及び１１の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−２７クローンはそれぞれ配列番号 １４及び１５の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−４１クローンはそれぞれ配列番号１８及び１９の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有する。
【００２８】
前記クローンのＶＬ及びＶＨ領域に対するアミノ酸配列を類推すると、ＨＳＦＮ ６８−１３クローンはそれぞれ配列番号４及び５のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−１６クローンはそれぞれ配列番号８及び９のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−２７クローンはそれぞれ配列番号１２及び１３のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−４１クローンはそれぞれ配列番号１６及び１７のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有する。
【００２９】
前記クローンのアミノ酸配列で骨格部位（ＦＲ）とＣＤＲを分析して見れば、各クローンのＶＬ及びＶＨ領域にはそれぞれ４個のＦＲと３個のＣＤＲが存在し（図２及び３を参照）、前記ＨＳＦＮ ６８クローンとＳＦＮ ６８の軽鎖配列類似度は７８〜８１％であり、重鎖配列類似度は８５〜９０％である。
【００３０】
本発明のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖は、コドンの縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により特定アミノ酸に対してこれをコードするいくつの他のコドンが存在するという事実は公知されているため、それらのアミノ酸配列から予測されるどのような塩基配列で特定でき、これらの塩基配列は全て本発明の範疇内に含まれる。望ましくはヒト化抗体重鎖及び軽鎖遺伝子配列は宿主細胞の一つ以上の選好コドンを含む。
【００３１】
また、本発明では選別されたクローンのファージミドＤＮＡで大膓菌を形質変換させ、抗体タンパク質を発現させた後、培養液を通常の方法で精製することによって抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体を生産し得る。前記大膓菌と精製方法は、当業界で再組合わせタンパク質の生産のために通常的に用いるものであれば、制限なしに用いることができるが、大膓菌ではＨＢ２１５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いるのが望ましく、精製方法では培養液を濃縮した後、タンパク質Ｌコラム（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ ｃｏｌｕｍｎ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）で精製することが望ましい。
【００３２】
ＨＧＦ／ＳＦに対するＨＳＦＮ ６８クローンの親和度を調査した結果、ＨＳＦＮ ６８−１３クローンが前述の４個のクローンの中で一番高い親和度を示し、これは ＳＦＮ ６８より６倍も高いものである。一方、ＨＳＦＮ ６８−１６は一番弱い親和度を示し、ＨＳＦＮ ６８−２７及び４１はＳＦＮ ６８と類似した親和度を示す（表 ２を参照）。
【００３３】
また、本発明のヒト化抗体は、ＨＧＦ／ＳＦとｃＭＥＴ／Ｆｃキメラとの間の結合をＳＦＮ ６８と同等な水準で抑制し（図５を参照）、ＳＦＮ ６８と類似した中和活性を示す（図６を参照）。
【００３４】
このように、完全にヒト化された軽鎖可変領域、及び移植された重鎖可変領域相補性決定部位及び骨格部位の一部残基を除き、共にヒト化された重鎖可変領域を有する本発明によるヒト化抗体は、母体ＳＦＮ ６８と同等以上のＨＧＦ／ＳＦに対する結合親和度を有し、ＨＧＦ／ＳＦとこの受容体であるｃＭＥＴの結合を抑制する中和活性を有しながらも人体内で低い免疫副反応を示すため、より效果的にＨＧＦとその受容体であるｃＭＥＴの結合により引き起こされる多様な疾患、特に癌の予防及び治療剤として有用である。
従って、本発明では前記ヒト化抗体を有效成分で含む癌の予防・治療用組成物も提供する。本発明の組成物は薬学的に許容可能な担体を含むことができ、通常的な方法により剤形化され得る。
【００３５】
本発明の薬学組成物は、静脈及び筋肉注射を含む多様な方法で投与されることができる。活性成分の投与量は患者の状態、投与経路、年齢、性別及び体重を含む多様な関連因子、及び患者の症状により決められる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を、実施例を通じてより詳しく説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示することだけであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１
抗−ＨＧＦ／ＳＦ ラビット／ヒトキメラＦａｂを含むファージライブラリの製造
（１−１） ヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の増幅
ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、米国）を用いて人間骨髓（入手先：実験室研究員寄贈）から全体ＲＮＡを抽出した後、塩化リチウム沈澱法で精製した後、オリゴ（ｄＴ）をプライマーにし、スーパースクリプト前増幅システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｒｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。
前記ヒトｃＤＮＡを鋳型にし、下記表１の配列番号２１〜２５の縮退プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）の組合わせを用いて重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことでヒト抗体の軽鎖可変領域を合成した。
【表１】
【００３７】
各ＰＣＲ反応は、前記合成したｃＤＮＡ（約 ０．５μｇ）１μｌ、それぞれ６０ｐｍｏｌの 正方向プライマーと逆方向プライマー、０．５μｌのＴａｑ重合酵素、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液を混合し、蒸溜水を加えて１００μｌに調節し、この混合物を９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒の反応を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間定置して行った。
増幅されたＤＮＡは１％アガロースゲルで電気泳動した後、ＬａｂｏＰａｓｓＴＭゲル抽出キット（Ｃｏｓｍｏ、韓国）を用いて精製した。
【００３８】
（１−２） ヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃκ）の増幅
ヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃκ）を増幅するために、２０ｎｇのヒトＦａｂのＣκ配列を含むｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクター（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）を鋳型にして各６０ｐｍｏｌの配列番号２６及び２７に記載するプライマーを用いたことを除き、前記（１−１）と同一な方法でＰＣＲを行った。
【００３９】
（１−３） 軽鎖の増幅
前記（１−１）及び（１−２）から得たヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及びヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃκ）を重畳延長ＰＣＲを行って結合させて軽鎖遺伝子を製造した。
このＰＣＲ 反応は、それぞれ１００ｎｇのＶＬ及びＣκＰＣＲ産物、それぞれ配列番号 ２８及び２７と記載される６０ｐｍｏｌの正方向プライマーと逆方向プライマー、０．５ μｌのＴａｑ重合酵素、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液を混合し、蒸溜水を加えて１００μｌに調節し、この混合物を９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で２分の反応を１５回繰り返した後、７２℃で１０分間定置して行った。 以後増幅されたＤＮＡを前記（１−１）と同一な方法でアガロースゲル電気永同・精製した。
【００４０】
（１−４） ＳＦＮ ６８のＨＣＤＲが移植された重鎖可変領域（ＶＨ）及び人間重鎖不変領域（ＣＨ１）の増幅
前記（１−１）から得たヒトｃＤＮＡを鋳型にし、下記表２の配列番号２９〜３６のプライマーを用ってラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８（大韓民国特許登録第５５６６６０号）のＨＣＤＲが移植されたヒト抗体の重鎖骨格部位ＦＲ１（ＨＣＤＲ１を含む）、ＦＲ２（ＨＣＤＲ２を含む）及びＦＲ３（ＨＣＤＲ３を含む）をＰＣＲで合成し、ＦＲ４はヒト抗体の重鎖不変領域ＣＨ１の配列を含むように、ヒトＦａｂのＣＨ１ 配列を含むｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ発現ベクター（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）を鋳型にして下記表２の配列番号３７及び３８のプライマーを用いてＰＣＲで合成した。
【００４１】
前記各ＰＣＲは、鋳型としてそれぞれ５００ｎｇのｃＤＮＡまたは２０ｎｇのｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ発現ベクターを用いたことを除き、前記（１−１）と同一の条件で行い、増幅されたＤＮＡを前記（１−１）と同じの方法でアガロースゲル電気永同・精製した。
【表２】
【００４２】
上記ＰＣＲに用いたプライマーは、図３に示されたように、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域のＨＣＤＲ１（アミノ酸３１−３５）、ＨＣＤＲ２（アミノ酸５０−６５）またはＨＣＤＲ３（アミノ酸９５−１０２）、及び２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基の中で少なくとも一つがヒト抗体の重鎖配列の対応位置に移植されるように設計された。
【００４３】
（１−５） 重鎖の増幅
下記表３に記載の鋳型及びプライマーの組合わせを用いて前記（１−３）と同一な方法で重畳延長ＰＣＲを行うことで前記（１−４）から得たＦＲ１〜ＦＲ４に対する各ＰＣＲ産物を順に結合させてＳＦＮ ６８のＨＣＤＲが移植された重鎖可変領域（ＶＨ）及び人間重鎖不変領域（ＣＨ１）を含む重鎖を合成し、以後増幅されたＤＮＡを前記（１−１）と同一な方法でアガロースゲル電気永同・精製した。
この時、用いられたプライマーは、效果的な結合のために抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂをコーディングする塩基配列のＨＣＤＲの塩基配列に対応する塩基を２０個以上有するように設計された。
【表３】
【００４４】
（１−６） 抗−ＨＧＦ／ＳＦラビット／ヒトキメラＦａｂライブラリ遺伝子の製造
抗−ＨＧＦ／ＳＦラビット／ヒトキメラＦａｂライブラリ遺伝子を製造するために、それぞれ１００ｎｇの前記（１−３）で精製された軽鎖遺伝子産物と前記実施例（１−５）で精製された重鎖遺伝子産物、それぞれ６０ｐｍｏｌの配列番号２８及び配列番号４０と記載するプライマーを用いたことを除き、前記（１−３）と同一な方法で ＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡを前記（１−１）と同一な方法でアガロースゲル電気永同・精製した。
【００４５】
（１−７） 抗−ＨＧＦ／ＳＦ ラビット／ヒトキメラ Ｆａｂ ライブラリ遺伝子を含むファージの製造
前記（１−６）で精製されたキメラＦａｂライブラリ遺伝子を制限酵素ＳｆｉＩ（Ｒｏｃｈｅ、米国）で切断して分離した後、図１に示されているファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ（ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）に挿入した。この製造されたファージミドベクターを用いて大膓菌ＥＲ２５３７（ＮＥＢ、米国）を電気穿孔（ｅｌｅｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法で形質変換させた。
【００４６】
このように導入したファージは、ファージコートタンパク質（ｐｈａｇｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるｐIIIタンパク質形態としてＦａｂを表面発現する。
前記形質変換された菌株をＳＢ培地（１０ｇのＭＯＰＳ（３（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）、３０ｇのトリプトン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｉｆｃｏ）及び２０ｇの酵母抽出物（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｉｆｃｏ）を含む）を用いて３７℃、２５０ｒｐｍで培養した後、培養物にヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を添加してファージ救助（ｐｈａｇｅ ｒｅｓｃｕｅ）を行った（文献［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１］を参照）。一晩培養して得た培養物を４℃、１４、０００×ｇで２０分間遠心分離して細胞ペレットを取り除いた後、上層液に４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ、シグマ）及び３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加し、氷溶上で３０分間放置してファージを沈澱させた。これを４℃、１７、０００×ｇで２０分間遠心分離して得た、ペレットを３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ（ＴＢＳＢ）１ｍｌに再度溶解させた。得られたライブラリの多様性をファージの滴定法（文献［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１］を参照）及びＢｓｔＮＩフィンガープリンティング（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）（文献 ［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ.Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１］を参照）で確認した。
【００４７】
実施例２
ヒト化された抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂを含むファージクローンの選別
（２−１） バイオパニング （Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）
９６−ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、米国）の各ウェルに０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝額（ｐＨ８．６、コーティング緩衝額）に溶かした１０μｇ／ｍｌＨＧＦ／ＳＦ５０μｌを加えて４℃で一晩かけてコーティングした。各ウェルにＴＢＳＢ（５％ＢＳＡを含む）１００μｌを添加し、３７℃で２時間放置してコーティングされない部分をブロッキングした。コーティングされた各ウェルに実施例１で製造したＦａｂを表面発現しているファージをＴＢＳＢに懸濁させた溶液５０μｌを加え、２時間程度３７℃で放置した後、０．０５％ツイン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で洗滌し、ウェルに固定されているファージを０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン（ｐＨ２．２）１００μｌに湧出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．１）１６μｌを添加して中和させた。パンニングは、総４回実施し、洗滌回数は一番目パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）に１回、二番目及び三番目パンニングに５回及び四番目パンニングに１０回と増加させた。各パンニング毎に湧出されたファージで指数生長期の大膓菌ＥＲ２５３７細胞を形質変換させた後、実施例１の（１−７）と同一な方法でファージ球助を行い、インプット−アウトプットタイター（ｉｎｐｕｔ−ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）を通常の方法（文献［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、２００１］を参照）で調査した。
【００４８】
（２−２） ＥＬＩＳＡ
ＨＧＦ／ＳＦに結合するクローンを同定するために表面発現されたＦａｂを用いたＥＬＩＳＡを行った。
具体的に、前記（２−１）で最終回パンニング後のアウトプットタイタープレート（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）から４１個のクローンを無作為に選別した後、カベニシルリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＳＢ培地に前記クローンを接種して４時間を培養し、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を処理してファージ球助を行った。２時間後にカナマイシンで処理して一晩中培養して最終的に表面にＦａｂが発現されたファージを含む上層液を得た。９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルをコーティング緩衝額に溶かした１μｇ／ｍｌＨＧＦ／ＳＦを用いて４℃で一晩コーティングし、ＴＢＳＢでブロッキングした。前記で得たファージ上層液を同一体積のＴＢＳＢと混合してコーティングされた各ウェルに５０μｌずつ添加した後、３７℃で１時間放置し、ＴＢＳ−Ｔで洗滌した。 各ウェルにＡＢＴＳ（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ溶液、シグマ）を基質として用いてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたシープ（ｓｈｅｅｐ）抗−Ｍ１３ファージ多クローン抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加して３７℃で３０分間放置した後、４０５ｎｍで光学密度を測定した。
その結果、ＨＧＦ／ＳＦに対して結合活性を有する総３３個のクローンが選別され、これらに対して前記と同一な方法でＥＬＩＳＡを行ってＳＦＮ ６８と同等以上の結合親和度を示す４個のクローンを選別した。これら選別されたクローンをそれぞれＨＳＦＮ６８−１３、１６、２７及び４１と名付け、以後の実験に用いた。
【００４９】
実施例３
選別されたファージの配列分析
前記実施例２で選別された４個のクローンのＦａｂ遺伝子の塩基配列分析は文献［Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、２００１］に記載されている特定プライマーを用いてジデオキシ鎖終了（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）方法で行った。シーケンシング反応の産物は、ＡＢＩプリズム３１００遺伝子分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）に分析された。
その結果、ＨＳＦＮ ６８−１３ Ｆａｂ遺伝子はそれぞれ配列番号６及び７の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−１６ Ｆａｂ遺伝子はそれぞれ配列番号１０及び１１の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ６８−２７ Ｆａｂ遺伝子はそれぞれ配列番号１４及び１５の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ６８−４１ Ｆａｂ遺伝子はそれぞれ配列番号１８及び１９の塩基配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有するということを確認した。
【００５０】
これから前記ＦａｂのＶＬ及びＶＨ領域に対するアミノ酸配列を類推した結果、ＨＳＦＮ ６８−１３ Ｆａｂはそれぞれ配列番号４及び５のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−１６ Ｆａｂはそれぞれ配列番号８及び９のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−２７ Ｆａｂはそれぞれ配列番号１２及び１３のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を、ＨＳＦＮ ６８−４１ Ｆａｂはそれぞれ配列番号１６及び１７のアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有するということを確認した。
【００５１】
前記Ｆａｂのアミノ酸配列で骨格部位（ＦＲ）とＣＤＲを公知の方法（文献［Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４（２）、ｐ３０６−３１０、１９９５］を参照）で分析した結果、図２及び３のような領域構成を有することが判明した。
また、ＨＳＦＮ ６８ Ｆａｂと ＳＦＮ ６８ Ｆａｂの軽鎖配列類似度は７８〜８１％であり、重鎖配列類似度は８５〜９０％であった。
【００５２】
実施例４
抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂの発現及び試験管内分析のための精製
前記実施例２で選別されたクローンのファージミドＤＮＡで非抑制性大膓菌ＨＢ２１５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を形質変換させた。形質変換された菌株を５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地４００ｍｌに入れ、６００ ｎｍにおけるＯ．Ｄが０．５−１．０となるまで３０℃、２５０ｒｐｍの条件で培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、３０℃で一晩培養しながら発現を誘導した。培養液の上層液をＬａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を用いて濃縮し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌコラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）を用いて精製した後、精製された５０ ＫＤａのＦａｂをクマシ染色で確認した。その結果を図４に示す。
【００５３】
実験例１
ＨＧＦ／ＳＦに対する抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂヒト化抗体の結合親和度分析
ＨＧＦ／ＳＦに対する抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂヒト化抗体の結合親和度は、ＢＩＡｃｏｒｅ器機（ＢＩＡｃｏｒｅ、スウェーデン）を用いてＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；表面プラズモン共鳴技術）で決定した。
【００５４】
具体的に、１０ｍＭソジウムアセテート緩衝溶液（ｐＨ４．０）を５μｌ／ｍｉｎの速度で流しながらアミンカップルリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）と共にキットの説明書に従ってＣＭ５（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）にＨＧＦ／ＳＦを固定させた。０．００５％ ツイン２０（シグマ）を含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）に溶かした４種類の抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂ及び対照群としてＳＦＮ ６８をそれぞれ２５℃で２分間３０μｌ／ｍｉｎの速度でチップに注入した。抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂヒト化抗体は、１．２５−２００ｎＭの濃度に希釈した。表面は、１ Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生し、分析ソフトウェア（ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて運動速度定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）と平衡解離定数（ＫＤ）を得た。その結果を表４に示す。
【表４】
【００５５】
表４に示したように、ＨＳＦＮ ６８−１３ Ｆａｂが分析された４個のＦａｂの中で最も高い親和度を示し、これは対照群として用いられたＳＦＮ ６８より６倍も高いものである。一方、ＨＳＦＮ ６８−１６は最も弱い親和度を示し、ＨＳＦＮ ６８−２７及び４１はＳＦＮ ６８と類似した親和度を示した。
実験例２
抗−ＨＧＦ／ＳＦ Ｆａｂの中和活性測定のための競争酵素免疫法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
９６−ウェルマイクロプレートを１μｇ／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦでコーティングし、前記実施例２の（２−２）と同一な方法でブロッキングした。２ｎＭ ｃＭＥＴ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）２５μｌとＴＢＳＢに溶かした０〜２００ｎＭのＨＳＦＮ ６８−１３またはＳＦＮ ６８ ２５μｌをＨＧＦ／ＳＦがコーティングされたウェルに添加した後、３７℃で１時間放置し、ＴＢＳ−Ｔで洗滌した。ウェルに固定されたｃＭＥＴ／Ｆｃの量は基質としてウルトラ−ＴＭＢ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＨＲＰが結合されたラビット抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した。３０分間放置した後、４５０ｎｍで光学密度を測定した。すべての実験を三度行い、これらの平均値及び標準偏差を図５に示した。
【００５６】
図５に示したように、ＨＳＦＮ ６８−１３クローンはその量の増加にともなって固定されたＨＧＦ／ＳＦとｃＭＥＴ／Ｆｃキメラとの間の結合を抑制し、このような中和活性はＳＦＮ ６８と類似した。
【００５７】
実験例３
ＭＤＣＫ分散（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分析
ＨＳＦＮ ６８ ＦａｂがＨＧＦ／ＳＦの生物学的活性を中和させるかどうかを確認するためにＨＧＦ／ＳＦ及びｃＭＥＴ信号伝逹に対する阻害剤效果の定量化に広く用いられるＭＤＣＫ分散分析（文献［Ｔｈｉｅｒｙ Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．、２、ｐ４４２−４４５、２００２］を参照）を行った。
【００５８】
ＭＤＣＫ細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｅｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）を１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。９６−ウェルプレートの各ウェル当り１．５×１０３個のＭＤＣＫ細胞を分株して２４時間放置した。１８．７５ｐＭのＨＧＦ／ＳＦを０〜 ４．７ｎＭのＨＳＦＮ ６８−１３及び０〜７００ｎｇ／ｍｌの多クローンゴート抗−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧ（シグマ）の混合物と３７℃で１時間の前培養した後、ＰＢＳで洗滌した各ウェルに添加して一晩反応させた。この際、比較するためにＳＦＮ ６８を用いて前記と同一な実験を繰り返した。また、多クローンゴート抗−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧ、または非特異的Ｆａｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ、米国）と抗−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧの混合物をＨＧＦ／ＳＦと共に処理した実験群を比較群として用いた。細胞をメタノール及びアセトン混合物（１：１（ｖ／ｖ））で固定し、１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット水溶液で染色した後、逆位光学顕微鏡で分散效果を観察した。
図６に示したように、何れの処理もしなかった対照群のＭＤＣＫ細胞（Ａ）に比べて、ＨＧＦ／ＳＦで処理されたＭＤＣＫ細胞（Ｂ）では細胞の分散が観察された。一方、多クローンゴート抗−ヒトＦａｂ抗体と共に前培養されて二量体化されたＨＳＦＮ ６８−１３またはＳＦＮ ６８を培地に添加すれば（Ｃ及びＤ）、ＨＧＦ／ＳＦによるＭＤＣＫ細胞の分散が遮断されて対照群と類似した結果を示し、この時、ＨＳＦＮ ６８−１３とＳＦＮ ６８は最小１８７．５ｐＭ濃度で１４．０６ｎｇ／ｍｌのゴート抗−ヒトＦａｂ多クローン抗体と共に中和效果を示した。一方、比較群として用いられた多クローン塩素項−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧ（Ｅ）及び非特異的Ｆａｂとゴート抗−ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧの混合物（Ｆ）はＨＳＦ／ＳＦによる細胞分散に対して何れの抑制效果も示されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】抗体ライブラリ製造に用いられたファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘの概略的な遺伝子構成を図式化したことであって、ファージ表面にＦａｂを表面発現（ｄｉｓｐｌａｙ）することを示す図である。
【図２】母体抗体であるラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８と本発明のヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ比べたものである。（ここで、−は同一なアミノ酸を、太字はＰＣＲプライマーにより置き換えされるアミノ酸を、下線はプライマーをコーディングするアミノ酸を、＊はＰＣＲによりヒトｃＤＮＡからクローニングされた多様性を有する領域を示す。）
【図３】母体抗体であるラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８と本発明のヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ比べたものである。（ここで、−は同一なアミノ酸を、太字はＰＣＲプライマーにより置き換えされるアミノ酸を、下線はプライマーをコーディングするアミノ酸を、＊はＰＣＲによりヒトｃＤＮＡからクローニングされた多様性を有する領域を示す。）
【図４】実施例４で精製されたＦａｂ切片に対してクマシ染色を行ったゲル写真である。
【図５】本発明のヒト化抗体によるＨＧＦ／ＳＦとｃＭＥＴ／Ｆｃキメラの結合抑制程度を母体抗体であるＳＦＮ ６８と比べたグラフである。
【図６】ＨＧＦ／ＳＦに対する本発明のヒト化抗体と抗−ヒトＦａｂ特定ＩｇＧの混合物のＭＤＣＫ分散抑制程度を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）相補性決定部位（ＣＤＲ）にそれぞれ下記アミノ酸配列を有するヒト抗体の重鎖可変領域；
ＴＹＹＭＳ ＹＩＧＴＳＳＧＴＴＹＹＡＮＳＶＫＧ ＧＬＧＲＩＮＬ
（配列番号１〜３）
ｂ）ヒト抗体の軽鎖可変領域と同一の軽鎖可変領域；
ｃ）ヒト抗体の重鎖不変領域と同一の重鎖不変領域；及び
ｄ）ヒト抗体の軽鎖不変領域と同一の軽鎖不変領域
を有することを特徴とする抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項２】
抗原に対する結合親和度（ＫＤ）が１×１０−９〜５×１０−８Ｍ以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項３】
Ｆａｂであることを特徴とする請求項１に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域に配列番号２０のアミノ酸配列を有するラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８重鎖可変領域の２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基中の一つ以上が追加に移植されたことを特徴とする請求項１に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からなる群から選ばれる軽鎖及び重鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のヒト化抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１９の塩基配列を有する重鎖可変領域をコードすることを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
相補性決定部位にそれぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域の組合わせを含むＦａｂのライブラリを製造した後、これをファージ表面発現させる段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
前記相補性決定部位がラビットから由来したことを特徴とする請求項８に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体の製造方法。
【請求項１０】
前記ヒト抗体重鎖可変領域に、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域の２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基中の一つ以上が追加的に移植されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のヒト化抗体を含む癌予防及び治療用組成物。
【請求項１】
ａ）相補性決定部位（ＣＤＲ）にそれぞれ下記アミノ酸配列を有するヒト抗体の重鎖可変領域；
ＴＹＹＭＳ ＹＩＧＴＳＳＧＴＴＹＹＡＮＳＶＫＧ ＧＬＧＲＩＮＬ
（配列番号１〜３）
ｂ）ヒト抗体の軽鎖可変領域と同一の軽鎖可変領域；
ｃ）ヒト抗体の重鎖不変領域と同一の重鎖不変領域；及び
ｄ）ヒト抗体の軽鎖不変領域と同一の軽鎖不変領域
を有することを特徴とする抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項２】
抗原に対する結合親和度（ＫＤ）が１×１０−９〜５×１０−８Ｍ以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項３】
Ｆａｂであることを特徴とする請求項１に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域に配列番号２０のアミノ酸配列を有するラビット／ヒトキメラモノクローナル抗体ＳＦＮ ６８重鎖可変領域の２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基中の一つ以上が追加に移植されたことを特徴とする請求項１に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からなる群から選ばれる軽鎖及び重鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のヒト化抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１９の塩基配列を有する重鎖可変領域をコードすることを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
相補性決定部位にそれぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域の組合わせを含むＦａｂのライブラリを製造した後、これをファージ表面発現させる段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
前記相補性決定部位がラビットから由来したことを特徴とする請求項８に記載の抗−ＨＧＦ／ＳＦヒト化抗体の製造方法。
【請求項１０】
前記ヒト抗体重鎖可変領域に、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＳＦＮ ６８重鎖可変領域の２、３７、４８、４９、７１、７５及び７８番アミノ酸残基中の一つ以上が追加的に移植されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のヒト化抗体を含む癌予防及び治療用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１７８１６（Ｐ２００８−１７８１６Ａ）
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２００８９４（Ｐ２００６−２００８９４）
【出願日】平成１８年７月２４日（２００６．７．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１月２３日ソウル大学中央図書館に学位論文として提出して発表
【出願人】（５０３３１７４８５）ソウル ナショナル ユニバーシティー インダストリー ファウンデーション (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２４日（２００６．７．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１月２３日ソウル大学中央図書館に学位論文として提出して発表
【出願人】（５０３３１７４８５）ソウル ナショナル ユニバーシティー インダストリー ファウンデーション (25)
【Ｆターム（参考）】
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